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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS FACULDADE DE FARMÁCIA
ALEXANDRE PEREIRA DOS SANTOS
Estudo farmacognóstico, avaliação da atividade
antioxidante e da toxicidade aguda dos extratos
etanólicos brutos das cascas do caule e folhas de
Pterodon emarginatus Vogel (Fabaceae)
Goiânia 2008
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ALEXANDRE PEREIRA DOS SANTOS
Estudo farmacognóstico, avaliação da atividade
antioxidante e da toxicidade aguda dos extratos
etanólicos brutos das cascas do caule e folhas de
Pterodon emarginatus Vogel (Fabaceae)
Goiânia 2008
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás, como um dos requisitos necessários à obtenção do título em mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador : Prof. Dr. José Realino de Paula
3
Às minhas duas maiores incentivadoras, Mãe e Avó, que
me propiciaram, sem medir esforços galgar o caminho na
busca do conhecimento, Celina Santos e Maria Gomes(in
memóriam).
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus fonte perene de sabedoria e por ter-me guiado até aqui.
Ao professor Dr. José Realino de Paula, pela orientação, paciência,
dedicação e confiança, exemplo de retidão.
Aos professores Edemilson Cardoso da Conceição e Maria Teresa Bara
pelo incentivo e apoio nos momentos difíceis.
Aos professores Luiz Carlos Cunha, Marize Campos Valadares Bozinis,
Pedro Henrique Ferri, Maria do Rosário Rodrigues pela dedicação, boa-vontade,
demonstrados nas preciosas contribuições que deram a este trabalho.
Às professoras amigas Joelma Abadia Marciano de Paula, Leonice
Manrique Faustino Tresvenzol e Tatiana de Sousa Fiuza, pela ajuda, amizade e
sugestões.
A Profª. Dra. Inês Sabioni Resck do Departamento de Química da
Universidade de Brasília (UnB), pelos espectros de Ressonância Magnética
Nuclear de 1H e de 13C das substâncias isoladas.
À professora Maria Helena Rezende, pelo acesso às dependências ao
laboratório de morfologia vegetal.
Aos amigos, Gilvana, Liúba, Marcelo, Pollyana, Renê, Weuller, pela
amizade, apoio técnico, cordialidade e pelas agradáveis conversas durante os
momentos de descontração.
Em especial aos amigos, Lília Cristina e Daniel Zatta parceiros de todas as
horas e pelo companheirismo.
A CAPES que proporcionou o suporte financeiro para o desenvolvimento
deste trabalho.
Em fim, àqueles sem os quais nenhum conquista em minha vida seria
possível ou valeria a pena: Celina, Sílvia, Eduardo, Lucimir, Terezinha e amados
avós Felix e Maria.
A cada um de vocês o meu muito obrigado.
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“Do meu telescópio, eu via Deus caminhar! A maravilhosa disposição e harmonia do universo só pode ter tido origem segundo o plano de um
Ser que tudo sabe e que tudo pode. Isto fica sendo minha última e mais elevada
descoberta”.
Isaac Newton
A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao
seu tamanho original.
Albert Einstein
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RESUMO
A espécie Pterodon emarginatus Vog., conhecida popularmente como sucupira-branca, é uma espécie arbórea, nativa do Cerrado Brasileiro, sendo encontrada nos Estados de Minas Gerais, São Paulo, Goiás e Mato Grosso do Sul. Possui interesse como planta medicinal e fonte de madeira. Vários estudos com o óleo e extratos dos seus frutos demonstraram atividades cercaricida, antimicrobiana e antiinflamatória. Tendo em vista a importância da espécie P. emarginatus como fonte de medicamento o presente trabalho realizou um estudo morfo-anatômico das folhas de P. emarginatus Vog., através de microscopia óptica e de varredura, procurando estabelecer parâmetros da matéria-prima vegetal que possam ser usados futuramente para o controle de qualidade do material botânico, avaliou o perfil de toxicidade aguda oral pelo método de classes (OECD 423) do extrato etanólico bruto das cascas e folhas de P. emarginatus Vog., avaliou a atividade antioxidante in vitro dos extratos e frações da casca do caule e folha pelo método DPPH., determinou o teor de fenóis totais pelo método Hargerman e Butler, verificou possível atividade antifúngica e antibacteriana do óleo essencial de suas folhas, e buscou isolar e elucidar compostos do extrato etanólico brutos das folhas. No estudo morfo-anatômico pode-se verificar que as folhas são hipoestomáticas, apresentam numerosos tricomas tectores unicelulares, têm cavidades secretoras com valor taxonômico para a família, além de detectar a presença de nectários extraflorais e idioblastos ricos em cristais e mucilagem. No teste de atividade antioxidante os extratos e frações, com exceção da fração hexânica mostraram importante atividade antioxidante, sendo a fração diclorometânica a mais potente. O teor de fenóis totais para as amostras testadas foi moderado reforçando a atividade antioxidante observada. A avaliação da toxicidade aguda oral dos extratos etanólicos brutos das cascas do caule e folhas, em camundongos e ratos de ambos os sexos nas doses de 2000mg/kg e 5000mg/kg não promoveu óbito, nem aparecimento de sinais clínicos de toxicidade, sugerindo segurança quanto à utilização de tais extratos. Por fim a análise do óleo das folhas permitiu a identificação de 9 hidrocarbonetos sesquiterpênicos, sendo os majoritários o γ-muuroleno (48,79%) e o biciclogermacreno (22,66%). A atividade in vitro contra os isolados clínicos de Candida, não foi positiva, podendo este resultado ser atribuído à composição do óleo essencial, no teste frente às bactérias o óleo mostrou-se ativo apenas para bactérias Gram-positivas e o estudo químico do extrato das folhas permitiu o isolamento da mistura dos esteróides estigmasterol e β-sitosterol. Todos os resultados obtidos contribuem para a ampliação de informações sobre essa planta amplamente utilizada pela população, podendo afirmar que suas atividades não se restringem apenas às já descritas em literatura.
Palavras-chave : Morfo-anatomia. Atividade Antioxidante. Toxicidade Aguda. Óleo essencial.
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ABSTRACT
The specie Pterodon emarginatus Vog., known as sucupira-branca, is a tree species, native of the Brazilian Savannah, being found in the states of Minas Gerais, Sao Paulo, Goiás and Mato Grosso do Sul. It’s interest as medicinal plant and source of wood. Several studies with the oil and fruit’s extracts have been showed cercaricid, antimicrobial and antiinflamatory activities. The importance of this specie as medicaments conducted the present study to realize morpho-anatomic analysis of leaves of P. emarginatus Vog. by optical and scanning microscopy, trying to establish parameters of the botanic material that will be used in future to control of quality of botanical material, evaluated the profile acute oral toxicity by the method of classes (OECD 423) of ethanolic extract crude from leaves and bark of P. emarginatus Vog., evaluated the antioxidant activity in vitro of the extracts and fractions of the bark of the stem and leaf by the method DPPH., determined the levels of total phenols by the method Hargerman and Butler, evaluated antifungal and antibacterial activity of essential oil of their leaves, and try to isolate some compound of ethanolic extract of the leaves. In the morpho-anatomic study could be verified that the leaves are hypoetomatics, they have abundant unicellular trichomes, have secretory cavities with taxonomic value for the family, in addition to detect the presence of extrafloral nectaries and idioblasts rich in crystals and mucilage. In the test antioxidant activity of the extracts and fractions, except the fraction hexane showed significant antioxidant activity, and the fraction dicloromethane the most powerful. The content of total phenols in the samples tested was moderate strengthening the antioxidant activity observed. The evaluation of acute oral toxicity of the extracts ethanolics of the bark and leaves, in mice and rats of both sexs at doses of 2000 mg/kg and 5000 mg/kg not caused death, or appearance of clinical signs of toxicity, suggesting security as the use of such extracts. Finally the analysis of the oil from leaves allowed the identification of 9 hydrocarbons sesquiterpenics, with the majority γ-muurolene (48.79%) and biciclogermacrene (22.66%). The in vitro activity against clinical isolates of Candida, wasn’t positive, this result can be attributed to the composition of essential oil, in front of bacteria test the oil proved to be active only for Gram-positive bacteria and chemical study of the extract of the leaves allowed the isolation of the mixture of steroids stigmasterol and β-sitosterol. All results contribute to the expansion of information about this plant widely used by the population and can say that their activities are not restricted only to those described in literature. Keywords : Morfho-anatomy. Antioxidant activity. Acute toxicity. Essential oil.
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LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1 Vista geral da espécie Pterodon emarginatus Vog. ..............28
CAPÍTULO 2
Figura 1 Aspecto do ramo foliar de P. emarginatus Vog. ....................44
Figura 2 Secção paradérmica da folha de P. emarginatus Vog. A – Aspecto geral da epiderme adaxial; B – Detalhe da epiderme adaxial; C – Aspecto geral da epiderme abaxial; D – Detalhe da epiderme abaxial...........................................48
Figura 3 Microscopia de Varredura das epidermes adaxial e abaxial dos folíolo de P. emarginatus. A – Detalhe da epiderme adaxial, evidenciando tricomas tectores; B – Aspecto geral da epiderme abaxial; C – Detalhe da epiderme adaxial, evidenciando papilas e estômato.................................................................................49
Figura 4 Microscopia de Varredura da epiderme abaxial dos folíolos de P. emarginatus. A – Detalhe da epiderme abaxial, evidenciando tricomas tectores e papilas ; B – Aspecto geral da epiderme abaxial, evidenciando tricomas longos sobre nervuras e presença de papilas; C – Detalhe da epiderme abaxial, evidenciando papilas e estômato.................................................................................50
Figura 5 Secção transversal da folha de P. emarginatus Vog. A – Aspecto geral inter-nervura; B – Detalhe da inter-nerura; C – Detalhe da epiderme adaxial; D – Detalhe da epiderme abaxial ..........................................51
9
Figura 6 Secções transversais dos bordos do folíolo da folha de P. emarginatus Vog. A – Aspecto geral da borda mediana do folíolo B – Aspecto geral da borda da base do folíolo evidenciando bolsa secretora e tricoma tector; C – Aspecto geral da borda mediana evidenciando tricomas tectores...................................................................................52
Figura 7 Secção transversal da nervura principal do folíolo de Pterodon emarginatus Vog. A – Aspecto geral; B – Detalhe do sistema vascular central; C – Detalhe da epiderme abaxial da nervura principal; D – Detalhe da epiderme adaxial; E – Detalhe da bolsa secretora próxima à nervura central....53
Figura 8 Secção transversal da ráquis da folha de P. emarginatus A – Aspecto geral; B – Detalhe da epiderme e parênquima cortical; C – Detalhe do sistema vascular central; D – Nectário extrafloral E – Detalhe dos tricomas tectores unicelulares.....................54
Figura 9 Secção transversal do pecíolo de Pterodon emarginatus Vog. A – Aspecto geral;
B – Detalhe da epiderme até floema; C – Detalhe do parênquima cortical evidenciando cristais prismáticos próximos ao sistema vascular central ................55
Figura 10 Secção transversal do pecíolo de Pterodon emarginatus Vog. A e B – Histoquímica com Ácido Tânico/FeCl3 evidenciando células mucilaginosas. C – Histoquímica com Sudam IV ..........................................56
Figura 11 Secção transversal do pulvino primário de P. emarginatus A – Aspecto geral; B – Detalhe da epiderme e parênquima cortical; C – Detalhe do sistema vascular central ...............................57
CAPÍTULO 3
Figura 1 Esquema químico de um radical livre ...................................72
Figura 2 Esquema da formação das EROs ........................................73
10
Figura 3 Seqüência de fracionamento do extrato etanólico bruto da
casca de Pterodon emarginatus.............................................79
Gráfico 1 Curva padrão para doseamento de fenóis totais para os
extratos e frações de P. emarginatus. Concentração de ácido
tânico versus absorbância. Equação da reta: Absorbância = A
+ B . c. Erro de ajuste (R2) = 0,9983......................................85
Gráfico 2 Perfil da concentração efetiva 50% calculada através de regressão linear, logarítmica do gráfico obtido com os valores encontrados de %AA para cada concentração e amostra.....87
Quadro 1 Doenças relacionadas com a geração de radicais livres ......76
CAPÍTULO 5
Figura 1 Seqüência de fracionamento do extrato etanólico bruto das folhas de Pterodon emarginatus Vog. por meio de coluna filtrante..................................................................................122
Figura 2 Resumo esquemático do isolamento de S1.........................123 Figura 3 Cromatograma do óleo essencial de folhas de Pterodon
emarginatus, onde os picos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 são: α-copaeno (1,07%); β-elemeno (7,10%); E – cariofileno (6,73%); α – humuleno (2,48%); Allo-aromadendreno (0,93%); γ - muuroleno (48,79%); biciclogermacreno (22,66%); Acifileno (7,41) e δ – cadineno (0,70%) respectivamente IR = 100 . N [(tx – tn-1)/(tn –tn-1)] + 100. Cn-1. CBP – 5; 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), fluxo 1 mL/min de Hélio, com o gás de arraste, (60 0C /2min; 3 0C min-1/240 0C; 100C min-1/280 0C; 2080C/10min), 70 eV...........................................................126
Figura 4 Estrutura química dos compostos majoritários do óleo essencial das folhas de P. emarginatus, onde: I, II, III, IV, são γ-muuroleno (48,79%), biciclogermacreno (22,66%), acifileno (7,41%) e β-elemeno (7,10%), respectivamente (ADAMS, 2007)....................................................................................128
Figura 5 Estrutura Química do β-Sitosterol e Estigmasterol..............131
11
Figura 6 Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de S1...................132 Figura 7 Espectro de RMN 13C (75 MHz, CDCl3) de S1...................133 Figura 8 Espectro de RMN 1H (300 MHz) expandido, multipleto
centrado em 3,53 δ, (H-3).....................................................135 Figura 9 Espectro de RMN 1H (300 MHz) expandido, com diagrama de
linhas - duplo dubletos (J =15, e 8,4 Hz) em δH 4,9 e 5,2 ppm......................................................................................136
Figura 10 Espectro de RMN 13C (75 MHz) expandido, evidenciando os
sinais (138,5 e 129,4 δ/ C-22 e C-23) e (140,9 e 121,9 δ / C-5 e C-6)...................................................................................136
Quadro 1 Descrição dos microrganismos utilizados na determinação da
concentração inibitória mínima.............................................120
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LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela 1 Espécies reativas do oxigênio (ERO).....................................73
Tabela 3 ERO e antioxidantes .............................................................75
Tabela 3 Rendimento dos extratos e frações .......................................84
Tabela 4 Doseamento de fenóis totais expressos em porcentagem
(p/p)........................................................................................85
Tabela 5 Atividade antioxidante frente ao radical DPPH. .....................86
Tabela 6 Concentração efetiva 50% calculada através de regressão
linear, logarítmica...................................................................87
CAPÍTULO 5
Tabela 1 Componentes do óleo essencial das folhas de P. emarginatus.
.............................................................................................125
Tabela 2 Concentração inibitória mínima (mg/mL) do óleo essencial das folhas de P. emarginatus......................................................129
Tabela 3 Dados do espectro de RMN 13C (75MHz, CDCl3) para S1
(Mistura de esteróides), estigmasterol e β-sitosterol............134
Tabela 4 Dados do espectro de RMN 1H (75MHz, CDCl3) para S1 (Mistura de esteróides), estigmasterol e β-sitosterol............135
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LISTA DE ABREVIATURAS
NEF – Nectário extrafloral
ERO – Espécie reativa do oxigênio
SOD – Superóxido dismutase
DPPH – 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
FHc – Fração hexano da casca
FDMc – Fração diclorometano da casca
FAEc – Fração acetato de etila da casca
FMet/H2Oc – Fração metano/água da casca
%AA – Atividade antioxidante percentual
CE50 – Concentração eficiente 50%
OECD – Organization for Economic Co-operation and Development
DL50 – Dose letal 50
CG/EM – Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas.
IR – Índice de retenção
DMSO – Dimetilsulfóxido
HCl – ácido clorídrico
UFC – Unidade formadora de colônia
ATCC – The american type culture colletion
DP – Desvio Padrão
FeCl3 – Cloreto férrico
CIM – Concentração inibitória mínima
CCD – Cromatografia em camada delgada
TMS – Tetrametilsilano
CDCl3 – Clorofórmio
FDH – Fração diclorometano
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................17
CAPÍTULO 1 Pterodon emarginatus Vogel (LEGUMINOSAE = FABACEAE): UMA BREVE REVISÃO DA LITERATURA ...............................................................................................22
1.1 Considerações Gerais Sobre a Família Leguminosa e e o
Gênero Pterodon .................................................................23
1.2 Aspectos químicos e biológicos de algumas espé cies do
Gênero Pterodon ................................................................. 25
1.3 Espécie Pterodon emarginatus Vog. .................................27
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................30
CAPÍTULO 2 ESTUDO MORFO-ANATÔMICO DAS FOLHAS DE
Pterodon emarginatus Vogel (Leguminosae =
Fabaceae) ..............................................................................38
1 INTRODUÇÃO ......................................................................39
2 MATERIAL E MÉTODOS .....................................................41
2.1 Material botânico .................................................................41
2.2 Caracterização morfológica ...............................................41
2.3 Caracterização anatômica ..................................................41
2.3.1 Microscopia óptica ..............................................................41
2.3.2 Microscopia eletrônica de varredura ................................ 42
3 RESULTADOS ......................................................................44
3.1 Descrição macroscópica ....................................................44
3.2 Descrição microscópica .....................................................45
3.2.1 Lâmina foliar ........................................................................45
3.2.2 Ráquis ..................................................................................46
3.2.3 Pecíolo .................................................................................47
3.2.4 Pulvino primário ..................................................................47
4 DISCUSSÃO .........................................................................58
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................64
15
CAPÍTULO 3 FENÓIS TOTAIS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE D OS
EXTRATOS E FRAÇÕES DAS CASCAS DO CAULE E
FOLHAS DE Pterodon emarginatus Vog. (Leguminosae =
Fabaceae) .............................................................................70
1 INTRODUÇÃO ......................................................................71
1.1 Metabolismo do oxigênio e sua relação na formaç ão dos
radicais livres ......................................................................71
1.2 Antioxidantes ......................................................................74
2 MATERIAL E MÉTODOS .....................................................78
2.1 Reagentes e equipamentos ................................................78
2.2 Material botânico .................................................................78
2.3 Obtenção do extrato etanólico bruto ................................78
2.4 Fracionamento do extrato etanólico bruto das ca scas do
caule de P. emarginatus .....................................................79
2.5 Doseamento de fenóis totais ..............................................80
2.6 Avaliação da capacidade de reação com 2,2-difen il-1-
picril-hidrazil (DPPH .) ..........................................................82
2.6.1 Cálculo da concentraçã o eficiente 50%(CE50) ................83
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................84
3.1 Rendimento dos extratos etanólicos brutos e d as frações .
...............................................................................................84
3.2 Fenóis totais .........................................................................85
3.3 Atividade antioxidante percentual .....................................86
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................91
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................92
CAPÍTULO 4 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA ORAL DOS
EXTRATOS ETANÓLICOS BRUTOS DAS CASCAS DO
CAULE E FOLHAS DE Pterodon emarginatus Vogel
(Leguminosae = Fabaceae) .................................................98
1 INTRODUÇÃO ......................................................................99
2 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................102
16
2.1 Material botânico ...............................................................102
2.2 Obtenção do extrato etanólico bruto ...............................102
2.3 Toxicidade aguda dose única ..........................................102
2.3.1 Descrição detalhada do protocolo experimental ............103
2.3.2 Animais e condições ambientais de manutenção .........104
2.3.3 Via e modo de administração ...........................................105
2.3.4 Duração do período de observação ................................106
2.3.5 Observação dos sinais de toxicidade .............................106
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .........................................107
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...............................................110
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................111
CAPÍTULO 5 ANÁLISE DO ÓLEO ESSENCIAL EXTRAÍDO DAS F OLHAS
DE Pterodon emarginatus Vogel (Leguminosae =
Fabaceae), AVALIAÇÃO IN VITRO DA SUA ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA FRENTE FUNGOS E BACTÉRIAS
PATOGÊNICOS E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO
EXTRATO ETANÓLICO BRUTO ........................................114
1 INTRODUÇÃO ....................................................................115
2 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................110
2.1 Reagentes e Equipamentos ..............................................117
2.1.1 Material botânico e extração do óleo essenc ial .............117
2.2 Análise da composição química do óleo essencial ........118
2.3 Avaliação a atividade antifúngica do óleo essen cial das
folhas de P. emarginatus ...................................................119
2.4 Determinação da concentração inibitória mínima do óleo
essencial das folhas de P. emarginatus Vog. frente a
bactérias (atividade antibacteriana) .................................120
2.5 Investigação química do extrato etanólico brut os das
folhas de P. emarginatus Vog. ..........................................121
2.5.1 Isolamento e caracterização de constituintes químicos
das subfrações ...................................................................122
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................125
17
3.1 Rendimento do óleo essencial .........................................125
3.2 Análise da composição química do óleo essencial ........125
3.3 Avaliação da atividade antifúngica do óleo esse ncial das
folhas de P. emarginatus ..................................................128
3.4 Determinação da concentração inibitória mínima do óleo
essencial das folhas de P. emarginatus Vog. frente a
bactérias ..............................................................................129
3.5 Resultado da investigação química do extrato etanólico
brutos das folhas de P. emarginatus Vog. .......................131
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................131
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................140
18
1 INTRODUÇÃO
Recorrer às virtudes curativas de alguns vegetais é uma das mais antigas
manifestações do homem em compreender e utilizar a natureza como recurso
terapêutico. Sendo assim, desde os tempos mais remotos o homem vem
coletando plantas nativas ou cultivando outras nas proximidades de sua casa para
usar como alimento e medicamento (BRANDÃO, 2003).
Em civilizações antigas como as das regiões do Egito, Assíria e Oriente, os
eruditos reuniam seus conhecimentos e procediam à classificação de numerosas
plantas medicinais, indicando-lhes o uso. Os gregos, posteriormente os romanos,
liberaram essas práticas puramente empíricas do seu aspecto um tanto místico,
conferindo emprego racional às plantas. No século XVIII, surgiam as grandes
classificações das famílias vegetais e no século XIX, os progressos da química
levaram às experiências de extração dos princípios ativos das plantas
(CHATONET, 1983).
Ao tratar esse tema produtos naturais, deve-se ter bem claro que planta
medicinal é aquela, utilizada sob qualquer forma e por alguma via ao homem,
exercendo algum tipo de ação farmacológica. A aplicação das plantas é vasta,
pois além de seu uso na medicina popular, tem contribuído, por décadas, para a
obtenção de fármacos, amplamente utilizados na clínica (CALIXTO, 2000).
O conhecimento sobre plantas medicinais e sua utilização representam um
dos principais usos da biodiversidade, além de serem o único ou mais importante
recurso terapêutico de muitos grupos étnicos ou comunidades (MACIEL, et al.,
2002). As espécies vegetais são vistas como importantes mananciais de
substâncias úteis ao tratamento, prevenção ou cura de enfermidades que
acometem os seres humanos, o que vem sendo confirmado através de pesquisas
científicas, especialmente nas áreas da química e farmacologia (MONTANARI e
BOLZANI, 2001).
Segundo Fetrow e Ávila (1999) é pequena a porcentagem de plantas
medicinais adequadamente estudadas quanto a sua atividade farmacológica. É
difícil a seleção de espécies a investigar quanto ao potencial farmacológico,
considerando a grande quantidade de espécies a explorar. Neste contexto, os
relatos da medicina popular, investigados através da etnobotânica, funcionam
19
como base empírica para o desenvolvimento de estudos que possam respaldar a
obtenção de produtos naturais bioativos (AMOROZO, 2002).
Portanto, a abordagem etnobotânica é utilizada como instrumento que
coleta e analisa as informações populares que o homem tem sobre o uso das
espécies vegetais. Através dela é possível verificar o perfil de uma comunidade e
seus usos em relação às plantas, uma vez que cada comunidade é caracterizada
por seus costumes. As informações etnobotânicas obtidas são extremamente
relevantes, visto que revelam dados restritos a determinados grupos ou regiões
(MARTINS et al., 2005).
Tratando-se da utilização popular de plantas medicinais no Brasil, esta, foi
fruto da mistura do conhecimento de índios, africanos e europeus que data desde
a colonização (ALBUQUERQUE e ANDRADE, 2005), sendo difundida ao longo
dos tempos por raizeiros, curandeiros e bezendeiras. Até a década de 50 os
medicamentos utilizados eram quase que exclusivamente de origem vegetal. Com
o desenvolvimento da tecnologia farmacêutica, a produção de fármacos via
síntese química, e a ausência de comprovações científicas de eficácia e
segurança das substâncias de origem vegetal, aliada as dificuldades de controle
físico-químico, farmacológico e toxicológico dos extratos vegetais até então
utilizados, impulsionaram a substituição destes por fármacos sintéticos, e de alto
custo para o doente (RATES, 2001).
De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde, 80% da
população de países em desenvolvimento dependem dos recursos naturais como
fonte de atenção primária a saúde. Estimativas mostram que o mercado de
produtos farmacêuticos movimenta uma margem de US$ 320 bilhões/ano, dos
quais US$ 22 bilhões são oriundos de fontes naturais (BRESOLIN e FILHO,
2003).
Percebe-se que a medicina pelas plantas vem se libertando daquele seu
caráter empírico original e de sua aura misteriosa, tornando-se uma janela de
oportunidades na indústria de medicamentos, pois este mercado possibilita que
as novas moléculas descobertas assegurem a competitividade na produção de
novos medicamentos patenteados (VILLA-LOBOS e GADELHA, 2007), já que sua
eficácia pode ser constatada clínica e cientificamente. Apesar disso, ainda
20
existem muitas espécies que requerem ter sua eficácia e segurança comprovadas
cientificamente (RIBEIRO et al., 2002).
Observa-se que na última década, o interesse em trabalhar com plantas
medicinais tem então ressurgido. Fato constatado pela busca de novas
substâncias derivadas de espécies vegetais, que possam ser futuramente usadas
como protótipos para síntese de moléculas de interesse medicinal e pelo
crescente número de publicações nessa linha de pesquisa (CALIXTO, 2000).
Entretanto, a descoberta de novos fármacos consiste num processo longo,
complexo e de alto custo, que envolve algumas etapas como a descoberta, o
desenvolvimento e a comercialização. Não há dúvidas que na primeira fase desse
processo, ou seja, a descoberta, o Brasil possua qualificação e condições para
atuar com excelência, visto que é um dos maiores celeiros de plantas,
principalmente de angiospermas do planeta, e por ser detentor de uma ampla
biodiversidade, a qual se encontra inserida em cinco domínios morfoclimáticos e
fitogeográficos (MONTANARI e BOLZANI, 2001). Dentre estes domínios destaque
para o bioma Cerrado, descrito por Ribeiro e Walter (1998) como sendo o
segundo maior em área do país, abrangendo cerca de 23% do território nacional,
o equivalente a dois milhões de Km2.
O Cerrado encontra-se localizado basicamente no planalto central sendo
considerado um dos maiores complexos vegetacionais de heterogeneidade
fitofisionômica. Toda área ocupada pelo cerrado abrange os estados de Goiás,
Tocantins e o Distrito Federal, parte dos estados do Ceará, Maranhão, Bahia,
Mato Grosso entre outros (SANO e ALMEIDA, 1998). Segundo Pires e Santos
(2000), estimativas sugerem que o Cerrado possua cerca de seis mil espécies de
árvores, muitas utilizadas para fins medicinais. Calcula-se ainda, que a maior
parte das plantas lenhosas e das gramíneas que abarca sejam endêmicas. Em
trabalho de Mendonça et al., (1998), o bioma Cerrado é apontado como detentor
de 6.671 táxons nativos, distribuídos em 170 famílias e 1.140 gêneros. Nesta
mesma pesquisa são relatados 11 novos táxons (GUARIM-NETO e MORAIS,
2003). Em outros estudos realizados por Naves e Chaves (2001), em 98 áreas
representativas do Cerrado, foram encontradas 534 espécies lenhosas, sendo
que 158 delas (30%) ocorreram em um único local e apenas 28 espécies foram
encontradas em mais de 50% das áreas. Nenhuma espécie ocorreu em todos os
21
locais estudados. Este panorama de distribuição e espacialização das espécies
do Cerrado é um importante aspecto a ser levado em consideração na definição
de estratégias de conservação deste bioma.
O Cerrado fisionomicamente é caracterizado pela existência de um estrato
herbáceo constituído fundamentalmente por gramíneas e por um estrato arbóreo/
arbustivo de caráter lenhoso. Estas alternâncias no ecossistema do Cerrado
ocorrem principalmente pela relação entre nível do lençol freático, da fertilidade
do solo, da geomorfologia do relevo e da topografia ou altimetria do mesmo
(RIGONATO e ALMEIDA, 2003).
Tratando-se ainda das fitofisionomias do Cerrado, estas são classificadas
em: Cerradão, Cerrado Rupestre de Altitude, Cerrado "stricto sensu", Campo
Limpo, Mata Galeira, Mata Ciliar e Veredas. Em todas estas áreas são
encontradas as mais diversas espécies de plantas usadas para fins alimentícios
ou medicinais, e estudos têm revelado que a flora do Cerrado constitui uma
preciosa fonte de moléculas com atividade biológica (SANO e ALMEIDA, 1998). O
Cerradão, por exemplo, composto por uma vegetação florestal xeromorfa, com
árvores em maior desenvolvimento que as das outras fitofisionomias, devido aos
solos mais profundos e úmidos, e com algumas camadas de folhas em
decomposição, encontra-se nos chapadões ou nas encostas úmidas. O Cerradão
apresenta dossel praticamente contínuo e cobertura arbórea que pode variar de
59 a 90%. A altura mediana do estrato arbóreo oscila de 8 a 15 metros,
proporcionando condições de luminosidade que favorecem à formação de
estratos arbustivos e herbáceos diferenciados (SANO e ALMEIDA, 1998). É
comum neste estrato a presença de árvores altas como jatobá de mata
(Hymenaea stigonocarpa Mart. Ex Hayne) , o tingui (Magonia pubescens St. Hil.) ,
a pimenta de macaco (Xylopia aromatica Lam.), a sucupira branca (Pterodon
emarginatus Vog.) e a preta (Bowdichia virgilioides Kunth.) (RIGONATO e
ALMEIDA, 2003; SANO e ALMEIDA, 1998 ).
Dentre as várias famílias vegetais que compõem o domínio Cerrado,
destaca-se a família Fabaceae, também designada de Leguminosae, pertencente
à ordem Fabales, sendo uma das maiores famílias de angiospermas (POLHILL,
1981, JUDD et al., 1999, SOUZA e LORENZI 2005). Neste contexto, Cerrado e
plantas medicinas, este trabalho busca avaliar o extrato etanólico das cascas do
22
caule e das folhas de Pterodon emarginatus Vog. (sucupira branca), planta
largamente empregada pela população devido as suas propriedades
antiinflamatórias e antimicrobianas.
Não foram encontradas, no levantamento bibliográfico informações
toxicológicas relacionadas aos extratos das cascas do caule e das folhas de
Pterodon emarginatus Vog. Dados morfo-anatômicos das folhas da mesma
espécie são restritos. O que se observa são produções científicas voltadas à
atividade biológica e farmacológica de extratos dos frutos. Tendo em vista a
importância do estudo químico e biológico da nossa flora nativa, considerando a
função representativa do gênero Pterodon no contexto Cerrado e ainda a
escassez de estudos dos órgãos selecionados (casca e folha), este trabalho visa
avaliar o perfil de toxicidade aguda oral do extrato etanólico bruto das cascas e
folhas de P. emarginatus Vog., visando obter informações confiáveis e
extrapoláveis para humanos dos limites de exposição a essa planta utilizada pela
população como medicinal, realizar estudo morfo-anatômico das folhas de
P. emarginatus Vog., através de microscopia óptica e de varredura, visando
estabelecer parâmetros da matéria-prima vegetal para o controle de qualidade,
avaliar a atividade antioxidante in vitro dos extratos e frações pelo método DPPH,
e verificar possível atividade antifúngica do óleo essencial de suas folhas, bem
como a sua composição.
Acreditamos que, propor à sociedade a utilização de um determinado
fitoterápico requer, antes de tudo, a avaliação pragmática da efetividade e
toxicidade das plantas medicinais, isto para aumentar o seu valor agregado e
possibilitar a exploração do potencial terapêutico na saúde pública regional. Desta
forma, a realização das análises mencionadas é de grande valia, proporcionando
segurança aos demais pesquisadores na avaliação da utilização terapêutica de
tais extratos.
23
_________________________________________________________________
CAPÍTULO 1
Pterodon emarginatus Vogel (Leguminosae = Fabaceae):
UMA BREVE REVISÃO DA LITERATURA _________________________________________________________________
24
1 Considerações gerais sobre a família Leguminosae e o gênero Pterodon
A família Leguminosae, também designada de Fabaceae, pertence à
ordem Fabales, sendo uma das maiores famílias de angiospermas, com cerca de
650 gêneros e 18.000 espécies (POLHILL 1981, JUDD et al., 1999, SOUZA e
LORENZI 2005). No Brasil são encontrados cerca de 200 gêneros e 1.500
espécies. A família Leguminosae possui distribuição cosmopolita, sendo
representada por espécies arbustivas, herbáceas, arbóreas e liana, apresentando
grande importância econômica (SOUZA e LORENZI, 2005). No bioma Cerrado,
constitui a família mais representativa em número, com cerca de 777 espécies,
distribuídas em aproximadamente 101 gêneros (RATTER et al., 1977,
MENDONÇA et al., 1998).
Possui grande diversidade nos seus modos de reprodução e defesa, com
reservas centradas em áreas de variedade topográfica e de climas sazonais. A
sua versatilidade justifica seu amplo emprego sendo economicamente importante.
É também, uma das mais ricas na flora brasileira, encontrando-se representada
nas várias formações fitogeográficas do país (POLHILL e RAVEN, 1981;
HARBONE et al., 1971).
As leguminosas fornecem os mais diversos produtos para o homem, como
alimentos e forragem para a criação de gado, são excelentes fornecedoras de
substâncias medicinais, pesticidas, combustíveis e produtos industriais
(HARBONE et. al., 1971; SCHWANTES e WEBERLING, 1981). Convém lembrar
a importante capacidade de fixação simbiótica com o nitrogênio, através do
processo de nodulação, freqüente em raízes de leguminosas, fator este de grande
interesse na conservação de solos (POLHILL e RAVEN, 1981).
Segundo Solereder (1908), a família Leguminosae abrange
anatomicamente três subordens ou como descrito por alguns autores
subfamílias: Papilionaceae (Faboideae), Caesalpinoideae e Mimosoideae,
enquanto que Cronquist (1988), ressalta que o conjunto das subfamílias estão
englobadas nas famílias Mimosaceae, Caesalpiniaceae e Fabaceae
(Papilionaceae), ou seja são famílias distintas. Entretanto, este autor não é aceito,
por especialistas em leguminosas, com base no fato destas três sub-famílias não
constituírem grupos monofiléticos (SOUZA e LORENZI, 2005). As subfamílias
25
Caesalpinieae e Mimoseae ocorrem principalmente nas regiões tropicais e
subtropicais. O hábito é muito variado nas três subfamílias, apresentando
exemplares desde árvores de grande porte até pequenas ervas anuais (LEWIS,
1987).
De acordo com a classificação taxonômica de Polhill (1981), a subfamília
Papilionoideae (Faboideae) compreende 30 tribos englobando 440 gêneros e
1.200 espécies, apresentando ampla distribuição em florestas úmidas, até
desertos secos e frios. Vegetação arbórea e lianas ocorrem principalmente na
Amazônia, com notáveis disjunções para a Ásia Tropical e Austrália. Os principais
exemplares desta subfamília são encontrados no Planalto Brasileiro, no México,
Leste da África, Madagascar e região Sino-Himalayana (HARBONE et al., 1971;
POLHILL e RAVEN, 1981).
Quando comparada com as outras subfamílias, as características
essenciais das Papilionoideae são as flores papilionóides, com cálice na forma de
tubo, pétala adaxial em botão e pétalas menores alojadas na parte fértil. Outra
característica marcante é a presença de uma válvula hilar na semente, com
capacidade biossintética para alcalóides quinolizidínicos e isoflavonas
(HARBONE et al., 1971; POLHILL e RAVEN, 1981). Segundo Souza e Lorenzi
(2005), os espécimes da subfamília Papilionoideae apresentam folhas
imparipinadas, trifolioladas ou unifolioladas, as flores possuem corola com
prefloração imbricada descendente ou vexilar, estames frequentemente em
número duplo ao das pétalas, observando geralmente nove estames unidos entre
si e um livre (androceu diadelfo) ou todos unidos (androceu monadelfo), A maioria
das Papilionoideae podem sintetizar aminoácidos não protéicos, assim como a
canavanina, não encontrada em outro lugar. Raízes nodulares são regularmente
formadas como na maioria das Mimosoideae ao contrário da maioria das
Caesalpinoideae.
Dentre as diversas tribos que compõem a subfamília Papilionoideae, figura
a Dipteryxeae Polhill. Os gêneros abarcados pela tribo Dipteryxeae ocorrem
somente na América Central e do Sul, principalmente na região da Amazônia
(POLHILL, 1981; OLIVEIRA e PAIVA, 2005). A tribo Dipteryxeae caracteriza-se
pela presença de um único óvulo subapical no ovário. Suas sementes são
fusiforme-oblongas à ovóides (POLHILL, 1981).
26
O gênero Pterodon sistematicamente incluso na tribo Dipteryxeae é
composto de cinco espécies nativas brasileiras: Pterodon abruptus Benth., P.
appariciori, Pedersoli, P. emarginatus Vog., P. polygalaeflorus Benth. e P.
pubenscens Benth. (ALMEIDA et al., 1998). Estudos fitoquímicos do gênero
Pterodon têm revelado a presença de alcalóides na casca (TORRENEGRA et al.
1989), isoflavonas e alguns triterpenos no caule (MARQUES et al. 1998) e
diterpenos (FASCIO et al. 1976; ARRIAGA et al., 2000) e isoflavonas (BRAZ e
GOTTLIEB, 1971) em óleo das sementes. Quatorze furanosditerpenos foram
descritos e isolados de frutos do gênero Pterodon, entre outras substâncias
(BRAS e GOTTLIEB, 1971).
Os extratos alcoólicos obtidos a partir das sementes destas espécies são
usados pela medicina popular devido algumas propriedades, tais como: anti-
reumático, antiinflamatório (dores de garganta) e analgésico, quando ingeridos
por via oral em pequenas administrações e em tempos regulares (CORRÊA,
1975). Até 1980, ensaios biológicos com óleo dos frutos do gênero Pterodon,
descritos na literatura, apresentaram atividade anti-cercária para as espécies P.
apparicioi, P. emarginatus, P. polygalaeflorus e P. pubescens; ação
antimicrobiana in vitro e inibição do desenvolvimento de culturas de Crithidia
fasciculata e Trypanosoma cruzi, para o óleo da espécie P. pubescens (MORS, et
al. 1967; MAHAJAN e MONTEIRO, 1970; FASCIO et al. 1976; SANTOS e SARTI,
1980).
1.2 Aspectos químicos e biológicos de algumas espéc ies do gênero
Pterodon
Diversos estudos já foram realizados com as espécies do gênero e dentre
eles, destacam-se a espécie Pterodon pubescens. O óleo dos frutos desta
espécie mostrou-se como eficaz quimioprofilático contra as cercárias de
Schistosoma mansoni (MAHJAN e MONTEIRO, 1973), ação essa atribuída ao
diterpeno 14, 15- epoxigeranilgeraniol (SANTOS et al., 1987), e atividade
antiinflamatória (FALCÃO et al., 2005). O extrato hidroalcoólico das sementes de
P. pubescens apresentou importante atividade anti-artrite depois de prolongado
tratamento via oral em animais com artrite colágeno II - induzida
27
(SABINO et al., 1999). A partir do extrato etanólico das sementes e das frações
hexânica e diclorometânica, obtidas do fracionamento líquido-líquido, foi possível
verificar atividade antinociceptiva em animais (COELHO et al., 2005) e estudos
fitoquímicos realizados por Braz e Gottlieb, (1971), permitiram o isolamento de
isoflavonas. No que se refere à espécie P. apparicioi, existem apenas estudos
relatando o isolamento de isoflavonas (GALIRA e GOTTLIEB, 1974).
Outra espécie do gênero Pterodon amplamente estudada é a
P. polygalaeflorus, também conhecida como faveiro-azul, sucupira-branca,
sucupira-lisa, faveiro e sucupira (LORENZI, 2002), usada popularmente para o
tratamento de bronquite, amigdalites, reumatismo e como tônico (ARRIAGA et al.,
2000). Desta espécie foi isolado o diterpeno ácido 6α,7β-dihidroxivouacapan-17β
óico, a partir do óleo dos frutos, exibindo importante atividade antiinflamatória
(NUNAN et al., 1982) e efeitos analgésicos e antinociceptivos (DUARTE et al.,
1996). Mediante a realização de estudos fitoquímicos em folhas e alas dos frutos
de P. polygalaeflorus (FONSECA et al., 2004), foram identificados nos extratos
das folhas: leucoantocianidinas, flavonóides, catequinas, quinonas, saponinas e
taninos. No extrato do revestimento da semente foram observados: xantonas,
flavonóides, flavonas, quinonas, fenóis e flavonóis. MARQUES et al. (1998),
isolaram os isoflavonóides: 6,7-dimetoxiisoflavona, 3’,4’-metilenodioxiisoflavona,
4’-hidroxi-3’,6,7-trimetoxiisoflavona, 3,4,6,7-tetrametoxiisoflavona, 7-hidroxi-6-
metoxiisoflavona, 3,4-metilenodioxiisoflavona, 2’,6,7-trimetoxiisoflavona, 3’,4’ –
metilenodioxiisoflavona, 2’,3’,4’,7,7-pentametoxiisoflavona e 2’,4’,5,6,7-
pentametoxiisoflavona, os triterpenóides lupeol e betulina e o ácido 4-
metoxibenzóico dos extratos acetônicos do alburno e do cerne de
P. polygalaeflorus. Dois anos depois, Arriaga et al., (2000) isolaram o novo
diterpeno 6α-hidroxivouacapano e os conhecidos diterpenóides 6α,7β,14β,19-
tetrahidroxivouacapano, 6α,7β-diidroxivouacapan-17β-oato de metila e o
flavonóide taxifolina. Outros estudos fitoquímicos do extrato hexânico e
metanólico dos frutos permitiram também, o isolamento de 3 diterpenos furânicos:
6-α-acetoxivouacapano, 6-α-hidroxivouacapano e voucapano, sendo este último
relatado pela primeira vez como produto natural. Neste mesmo estudo ainda foi
possível verificar a ação larvicida do extrato hexânico dos frutos de
P. polygalaeflorus sobre Aedes aegypti (PIMENTA et al., 2006). Quanto à
28
composição do óleo essencial obtido a partir do extrato hexânico das sementes
da referida espécie, por arraste a vapor foram identificados os seguintes
constituintes: ilageno, α- capaeno, β-cariofileno, α-humuleno, γ- elemeno e δ-
cadineno (CAMPOS et al., 1990).
1.3 Espécie Pterodon emarginatus Vog.
A espécie Pterodon emarginatus Vog. (Fig. 1) conhecida popularmente
como sucupira-branca ou faveira é uma espécie arbórea, nativa dos cerrados
brasileiros, podendo ser encontrada nos Estados de Minas Gerais, São Paulo,
Goiás e Mato Grosso do Sul, seu uso, destaca-se pela importância medicinal e
florestal, apresentando sementes com baixo poder germinativo (LORENZI, 2002).
Quanto às características botânicas, a árvore pode atingir até 16 metros,
obscuramente pubérula nos ramos, pecíolo e, às vezes, face dorsal das folhas. A
espécie é hermafrodita, com flores de coloração rósea que podem às vezes se
tornar brancas, e são encontradas no período da seca entre os meses setembro e
outubro. As flores, frutos e face ventral das folhas são glabras. O fruto alado
possui endocarpo, podendo ser observado na sua lateral uma margem fibrosa e
ao centro uma rede de vasos ricos em óleo bem resinoso. Segundo Barroso et al.,
(1999), o fruto é uma criptossâmara com endocarpo lenhoso contendo bolsas
resiníferas aderidas às sementes. A maturação destes frutos se dá nos meses de
junho a julho com a planta já quase totalmente sem folhas, permanecendo,
entretanto, na árvore por mais algum tempo. A casca apresenta coloração cinza-
claro, levemente áspera, soltando placas. O tronco é liso e pode atingir cerca de
50 cm de diâmetro. Sua madeira é pesada (densidade 0,94 g/cm3), com tecido
compacto, sendo utilizada na construção civil e naval, pilares de pontes, carvão e
lenha. A árvore pode ser empregada com sucesso na arborização de ruas, praças
e reflorestamentos, por se tratar de uma planta tolerante a luz direta e pouco
exigente em solos (ALMEIDA et al., 1998; LORENZI, 2002).
29
Figura 1 – Vista geral da espécie Pterodon emarginatus Vog.. A. P. Santos, 04/04/2007.
Pela utilização popular brasileira, os extratos alcoólicos feitos, a partir, das
sementes de P. emarginatus Vog. são usados como anti-reumático,
antiinflamatório para garganta, problemas de coluna, depurativo e fortificante. Os
frutos são usados para o tratamento de dores musculares, torções, artrite e até
mesmo em casos de artrose, apresentando ação antiinflamatória e analgésica
(MORS et al., 1967). Na região Centro-Oeste, a população utiliza o chá das
cascas do caule para infecções ginecológicas (LEITE DE ALMEIDA e GOTTLIEB,
1975). O óleo dos frutos de P. emarginatus é aromático sendo usado também no
combate ao reumatismo e diabetes. Esse óleo é descrito como amargo e quando
30
misturado com água é empregado sob a forma de gargarejo (BRANDÃO et al.,
2002).
Novos diterpenóides foram obtidos das sementes de P. emarginatus por
MAHJAN e MONTEIRO (1970). CARVALHO (1998), a partir do extrato bruto dos
frutos de P. emarginatus, verificou a atividade antiinflamatória desta espécie,
atribuindo esta ação farmacológica à presença de compostos terpênicos.
Outros estudos mostram a ação protetora do extrato hexânico bruto dos
frutos de P. emarginatus contra o stress oxidativo e nitrosativo induzido por
exercícios agudos em ratos (PAULA et al., 2005).
A avaliação farmacognóstica e atividade antimicrobiana dos extratos da
casca já foram realizadas contra algumas bactérias patogênicas e constatada a
presença de flavonóides, heterosídeos saponínicos, resinas, traços de esteróides
e triterpenóides (BUSTAMANTE et al., 2005).
31
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38
_________________________________________________________________
CAPÍTULO 2
ESTUDO MORFO-ANATÔMICO DAS FOLHAS
DE Pterodon emarginatus Vogel (Leguminosae = Fabaceae)
_________________________________________________________________
39
1 INTRODUÇÃO
A família Leguminosae (Fabaceae) compreende 650 gêneros e 1.800
espécies sendo a família mais representativa de angiospermas depois de
Compositae e Orquidaceae (POLHILL e RAVEN, 1981). Comparada às demais
famílias, a Leguminosae é notavelmente generalista. Devido a suscetibilidade de
ecossistemas das florestas tropicais úmidas, as leguminosas são consideradas,
como na silvicultura, para a re-vegetação de áreas degradadas (MAGALHÃES et
al., 1982).
Compondo a tribo Dipteryxeae Polhill, um dos gêneros conhecidos é o
Pterodon, que como já descrito compreende cinco espécies nativas brasileiras:
P. abruptus Benth., P. appariciori Pedersoli, P. emarginatus Vog., P.
polygalaeflorus Benth. e P. pubescens Benth. Pelo exposto, observa-se que o
conhecimento das espécies que compõem esta grande família, é fundamental
para investigações científicas em diversos ramos da botânica pura, como
anatomia, morfologia e taxonomia, assim como em fisiologia, ecologia,
fitogeografia e agricultura.
Para Di Stasi (1996) a análise morfo-anatômica é importante para o
controle de qualidade da matéria-prima vegetal na indústria farmacêutica,
justificando que esta análise fornece subsídios para a padronização dos insumos
e diferenciação inclusive de espécies botanicamente próximas. Dentre os ensaios
anatômicos destacam-se os referentes à histoquímica, pois estes visam auxiliar
na caracterização de drogas e no monitoramento de análises fitoquímicas, bem
como no aproveitamento racional da droga vegetal. A indústria farmacêutica tem
dado ênfase na obtenção de parâmetros macro e microscópicos de drogas
vegetais, devido o baixo custo e tempo reduzido dos ensaios, que apresentam
alto grau de reprodutibilidade. Esta prática é contemplada nas resoluções que
normatizam, desde a década de 90 os procedimentos no controle de qualidade
das drogas utilizadas para a produção de fitoterápicos (MARQUES, 1999).
A agência Nacional de Vigilância Sanitária, por intermédio da resolução
RDC 48, de 16 de março de 2004, estabeleceu que a solicitação do registro de
produtos fitoterápicos só ocorrem mediante vários documentos, entre eles a
identificação botânica oficial da planta que compõe a matéria prima de origem,
40
além de laudos de identificação macro e microscópica do órgão vegetal utilizado,
emitido por profissional competente (ANVISA, 2004).
Com a finalidade de colaborar para a geração de fitoterápicos com
qualidade em sua matéria-prima, este capítulo teve por objetivo determinar
parâmetros morfo-anatômicos, visando o controle de qualidade de P. emarginatus
como insumo farmacêutico.
41
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material botânico
Para a realização dos estudos, o material botânico (cascas do caule e
folhas de Pterodon emarginatus Vog.) foi coletado no município de Bela Vista-GO
(847 m de Altitude, 17002’1,1” S / 48049’0,3” W). A espécie foi identificada pelo
Prof. Dr. José Realino de Paula e a exsicata encontra-se depositada no Herbário
da Universidade Federal de Goiás sob o número UFG – 27.155.
2.2 Caracterização morfológica
A caracterização morfológica das folhas foi realizada à vista desarmada, de
acordo com as descrições de Oliveira e Akissue (1993) e Vidal e Vidal (2000).
2.3 Caracterização anatômica
2.3.1 Microscopia óptica
Para a análise anatômica foram utilizadas folhas livres de injúrias, com o
limbo completamente expandido. Destas folhas, foram retirados folíolos
medianos. De cada folíolo foram utilizados fragmentos da região mediana e desta,
amostras da nervura central, entrenervuras e bordo. Os pulvinos, pecíolos e as
ráquis estudadas foram aquelas cujas folhas estão inseridas, ou seja, na região
mediana. Neste estudo foi adotado o conceito de pulvino primário empregado por
FLEURAT-LESSARD (1981), para o espessamento localizado na base do
pecíolo, ligando a folha ao caule. O material vegetal coletado foi fixado em FAA
(formaldeído, ácido acético glacial e álcool) 50% por 48 horas e posteriormente
preservado em álcool 70%, até o momento de se executar os cortes (JOHANSEN,
1940).
De acordo com as técnicas usuais na Microtécnica Vegetal, a confecção
das lâminas histológicas foi realizada a partir de secções transversais, obtidas à
mão livre. As secções foram clarificadas em hipoclorito de sódio a 10-12% e
42
posteriormente lavadas em água destilada e submetidas à dupla coloração com
azul de astra 0,3% e fucsina básica 0,1%. Os cortes paradérmicos foram obtidos
a partir da técnica de dissociação da epiderme de GHOUSE e YUNUS (1972). As
secções paradérmicas foram coradas com azul de metileno 1% e safranina 1%.
Após, as secções foram desidratadas em série alcoólica crescente (30%, 50%,
70%, 90% e 100%), pós-desidratadas em xilol e álcool (1:1) e xilol puro, de
acordo com JOHANSEN (1940). Montaram-se lâminas permanentes, utilizando-se
resina Verniz Vitral incolor (PAIVA et al., 2006).
As secções transversais foram submetidas a testes histoquímicos aos
seguintes reagentes:
- Reagente de Steinmetz (COSTA, 1970), para identificação de amido,
celulose, lignina, suberina, lipídeos diversos, compostos fenólicos, cutina e látex;
- Floroglucinol acidificado para identificação de lignina (FOSTER, 1949);
- Lugol, para identificação de amido (BERLYN e MIKSCHE, 1976);
- Cloreto férrico, para reações com compostos fenólicos (JOHANSEN,
1940);
- Sudan IV para evidenciar compostos lipídicos (GERLACH, 1984).
- Ácido tânico 5% / Cloreto de ferro III, para reação com mucilagens
(PIZZOLATO e LILLIE, 1973 apud ASCENSÃO, 2003) – a reação com Cloreto
férrico anteriormente realizada serviu como controle.
As fotomicrografias foram realizadas em fotomicroscópio ZEISS Axioskop,
utilizando-se filme Kodacolor ASA 100 e as escalas que acompanham foram
obtidas nas mesmas condições ópticas.
2.3.2 Microscopia eletrônica de varredura
Fragmentos da porção mediana dos folíolos de Pterodon emarginatus
Vogel foram fixados em solução de Karnovsky modificada, composta por
glutaraldeído 2%, paraformaldeído 2% em tampão cacodilato de sódio pH 7,2
0,05 M por 24 horas. Após esse tempo, os fragmentos foram submetidos a três
lavagens em tampão cacodilato 0,05 M, com duração de 10 minutos cada,
deixando-os em tampão, acondicionados em eppendorf devidamente identificado.
43
Foram armazenados em refrigerador, fazendo trocas temporárias quando o
tampão se apresentasse escuro (BOZZOLA e RUSSEL, 1992).
Após, os fragmentos foram submetidos a tampão cacodilato de sódio e
tetróxido de ósmio (1:1) por 1 hora, a seguir lavados em água destilada de 2 a 3
vezes e posteriormente, foram desidratados em série etanólica crescente (30%,
50%, 70% e 90%) com duração de 15 minutos cada e 3 vezes em etanol 100%,
10 minutos cada (BOZZOLA e RUSSEL, 1992). No Laboratório de Microscopia
Eletrônica, da Universidade de Brasília (UnB), os fragmentos foram levados à
secagem ao ponto crítico de CO2, utilizando-se o Aparelho de Secagem ao Ponto
Crítico da Balzers CPD30 e logo após, metalizados em ouro, com camada de
cobertura de aproximadamente 40 nm por 2 minutos, em Aparelho Metalizador
Zeiss DSM-962. A análise foi realizada em Microscópio de Varredura JEOL-JSM
840A.
As eletromicrografias foram obtidas em filme FUJI NEOPAN Asa 100. As
escalas e feixes de elétrons encontram-se registradas nas fotos.
44
3 RESULTADOS
3.1 Descrição macroscópica
Figura 1 - Aspecto do ramo foliar de P. emarginatus Vog.
Como já descrito por Almeida et al., (1998) as folhas são alternas,
compostas pinadas, imparipinadas e pecioladas. Inflorescência em panícula
terminal e nas axilas das folhas superiores, com cerca de 80 a 200 flores . A
lâmina foliar é oblonga, forma mais longa que larga, os bordos são paralelos e
inteiros. O ápice apresenta-se retuso e a base foliar atenuada.
As flores com aproximadamente 1 cm de comprimento, pediceladas, cálice
petalóide, róseo, com 3 dentes diminutos e 2 maiores, oblongos, ciliados,
semelhante a um vexilo, corola papilionácea, rósea ou lilás, ovário súpero,
unilocular, longo-estipitado, com um só óvulo parietal inserido no meio do lóculo.
Existe uma controvérsia sobre a possível existência de uma ou duas
espécies de sucupira-branca, quando unidas, o nome dado para a espécie é P.
emarginatus. Mas estudos recentes de taxonomia molecular usando RAPD dá
base para manter a divisão tradicional em duas espécies: P. polygalaeflorus
Benth que possui flores de coloração roxa e folhas glabras e P. pubescens Vogel
que possui flores de coloração rosa (ALMEIDA et al., 1998).
45
3.2 Descrição microscópica
3.2.1 Lâmina foliar
Em secção paradérmica a epiderme adaxial dos folíolos de Pterodon
emarginatus Vogel apresentaram células epidérmicas com tamanhos variados,
paredes anticlinais retas e espessadas (Fig. 2A e 2B), às vezes dispostas em
círculo nos locais de inserção dos tricomas tectores (Fig. 2B). Na epiderme
abaxial observa-se ainda a presença de estômatos, caracterizando uma folha
hipoestomática (Fig. 2D). A epiderme adaxial possui tricomas tectores curtos e
esparsos (Fig. 2A) e a epiderme abaxial apresenta tricomas tectores com maior
freqüência sobre as nervuras (Fig. 2C)
Em microscopia de varredura é possível verificar de forma detalha a
presença de tais tricomas tectores curtos, eretos, de ápice pontiagudo e superfície
variando de lisa a verrucosa (Figs. 3A, 4A e 4B) em ambas as epidermes. Na
epiderme abaxial as células epidérmicas estão especializadas em papilas (Figs
3B e 3C). Nos locais de inserção dos estômatos as papilas se dispõem ao redor
das células guardas (Fig. 3C e 4C), além disso percebe-se que o estômato
posiciona-se em nível inferior a estas células especializadas, encontrando-se
protegido.
Em secção transversal, a epiderme adaxial é unisseriada com cutícula
espessa apresentando franjas (Fig. 5C), e a epiderme abaxial também é
unisseriada, podendo ser observado a presença de papilas com estrias (Fig. 5D).
Em ambas as epidermes adaxial e abaxial, pode-se visualizar a presença de
tricomas tectores (Fig. 5A e Fig. 5B).
O mesofilo apresenta até 3 camadas de parênquima paliçádico,
abrangendo 2/3 do mesofilo e uma camada de parênquima lacunoso (Fig. 5A e
5B). Observa-se a presença de cavidades secretoras (esquizolisígenas) e feixes
vasculares de menor calibre, estando protegidos por dois grupos de fibras
esclerenquimáticas, que se estendem em direção às duas faces da lâmina do
folíolo, podendo apresentar extensão de bainha (Figs. 5A e 5B).
Em secção transversal do bordo do folíolo observou-se cutícula espessa e
epiderme unisseriada, feixe vascular colateral protegido por dois grupos de fibras
46
esclerenquimáticas (Figs. 6A e 6B). É possível ainda visualizar a presença de
tricomas tectores curtos e unicelulares, principalmente na epiderme adaxial (Figs.
6B e 6C). Pode-se encontrar também na extremidade da borda a presença de
cavidades secretoras (Fig.6B).
A nervura principal (ou central) do folíolo de P. emarginatus apresenta
epidermes adaxial e abaxial unisseriadas com cutícula espessa, sendo que na
epiderme abaxial foram observadas papilas (Figs. 7A, 7B e 7C). Tricomas
tectores curtos podem ser observados em ambas as epidermes. Observa-se
pequena quantidade de colênquima entre a epiderme abaxial e o sistema vascular
central (Fig. 7C). O sistema vascular central apresenta um grupo de fibras
esclerenquimáticas na porção superior e inferior e porções de floema abaixo do
xilema (Figs. 7A e 7B). Pode-se observar a presença de cavidades secretoras
próximo ao sistema vascular central (Figs. 7A, 7B e 7E). Próximo ao sistema
vascular central nota-se ainda a presença de cristais prismáticos tanto do lado
adaxial quanto abaxial (Figs. 7C e 7D).
3.2.2 Ráquis
Em sessão transversal a ráquis apresenta aspecto geral biconvexo, com a
face adaxial aguda (Fig. 8A). A epiderme é unisseriada em toda sua extensão,
com cutícula espessa apresentando franjas (Fig. 8B), e tricomas tectores curtos
unicelulares em toda sua extensão (Figs. 8D e 8E). O sistema vascular central
apresenta-se totalmente envolto por uma bainha esclerenquimática, ninhos de
floema externo ao xilema e um parênquima medular na região central (Figs. 8A e
8C). Observa-se a presença de cristais prismáticos no parênquima cortical
próximo a bainha esclerenquimática do sistema central (Fig. 8C).
Conforme relatado por Paiva et al., (2001) observa-se a presença de
nectários extraflorais, localizados na inserção de cada pecíolo. Os nectários
consistem numa pequena elevação, cuja porção apical é fortemente invaginada,
resultando em uma depressão, o pólo secretor. O tecido secretor consiste de
células parênquimáticas com citoplasma denso. Todo sistema secretor é coberto
pelos tricomas tectores unicelulares curtos (Fig. 8D)
47
3.2.3 Pecíolo
O pecíolo de P. emarginatus Vog. apresenta epiderme unisseriada com
cutícula espessa em toda sua extensão (Fig. 9A, 9B). Observa-se também a
presença de tricomas tectores (Fig. 9A, 9B) e raros tricomas glandulares (Fig.
10C). Células pétreas são observadas no parênquima cortical logo abaixo da
epiderme (Fig. 9B). Cristais prismáticos estão presentes no parênquima cortical
próximo ao sistema vascular central (Fig. 9C). O sistema vascular central
apresenta aspecto circular envolto por um grupo contínuo de fibras de
esclerênquima (Fig. 9A).
Na região cortical, observam-se dois feixes vasculares colaterais menores
também envoltos por esclerênquima. No sistema vascular central, o floema
encontra-se externo ao xilema e parênquima medular central apresentando
pontuações (Figs. 9A e 9B).
Reações histoquímicas com ácido tânico e cloreto férrico (FeCl3)
evidenciam a presença de células mucilaginosas próximas à epiderme (Figs. 10A
e 10B) e cavidades secretoras podem ser observadas no parênquima cortical
(Figs. 10A).
3.2.4 Pulvino primário
Em secção transversal o pulvino primário de P. emarginatus é dorsiventral
a cilíndrico com contorno irregular, devido às reentrâncias e protuberâncias (Fig.
11A). Sua epiderme é unisseriada com cutícula espessa apresentando tricomas
tectores (Figs. 11A e 11B). O parênquima cortical é bem desenvolvido com
células de forma e tamanho variados, podendo ser observada a presença de
cavidades secretoras (Fig. 11A). O sistema vascular central apresenta-se envolto
por uma bainha esclerenquimática, floema externo ao xilema e parênquima
medular reduzido na região central (Figs. 11A, 11C).
48
Figura 2 - Secção paradérmica da folha de P. emarginatus Vog. A – Aspecto geral da epiderme adaxial; B – Detalhe da epiderme adaxial; C – Aspecto geral da epiderme abaxial; D – Detalhe da epiderme abaxial; A, C e D – Coloração com Safranina. B. Azul de Metileno. Ttc – tricoma tector, Es – Estômato.
49
Figura 3 – Microscopia de Varredura das epidermes adaxial e abaxial dos folíolo de P. emarginatus. A – Detalhe da epiderme adaxial, evidenciando tricomas tectores; B – Aspecto geral da epiderme abaxial; C – Detalhe da epiderme abaxial, evidenciando papilas e estômato.
50
Figura 4 – Microscopia de Varredura da epiderme abaxial dos folíolos de P. emarginatus. A – Detalhe da epiderme abaxial, evidenciando tricomas tectores e papilas ; B – Aspecto geral da epiderme abaxial, evidenciando tricomas longos sobre nervuras e presença de papilas; C – Detalhe da epiderme abaxial, evidenciando papilas e estômato.
51
Figura 5 - Secção transversal da folha de P. emarginatus Vog. A – Aspecto geral inter-nervura; B – Detalhe da inter-nerura; C – Detalhe da epiderme adaxial; D – Detalhe da epiderme abaxial; A e B – Dupla coloração Alcian/Safranina, C e D – Steinmetz. Epa – Epiderme adaxial, Epb – Epiderme abaxial, Pp – Parênquima paliçádico, Cs – Cavidade secretora, Fv – Feixe vascular, Tt – Tricoma tector, Cut – Cutícula.
52
Figura 6 - Secções transversais dos bordos do folíolo da folha de P. emarginatus Vog. A – Aspecto geral da borda mediana do folíolo em dupla coloração: Azul de Astra/Fucsina Básica; B – Aspecto geral da borda da base do folíolo evidenciando bolsa secretora e tricoma tector; C – Aspecto geral da borda mediana evidenciando tricomas tectores. B e C – Histoquímica com reagente Steinmetz. Epa – Epiderme adaxial, Epb – Epiderme abaxial, Fv – Feixe vascular, Esc – Esclerênquima, Cs – Cavidade secretora, Ttc – Tricoma tector curto.
53
Figura 7 - Secção transversal da nervura principal do folíolo de Pterodon emarginatus Vog. em dupla coloração Azul de Astra/Fucsina Básica. A – Aspecto geral; B – Detalhe do sistema vascular central; C – Detalhe da epiderme abaxial da nervura principal; D – Detalhe da epiderme adaxial; E – Detalhe da bolsa secretora próxima à nervura central. Epa – Epiderme adaxial, Epb – Epiderme abaxial, Cs – Cavidade secretora, Esc – Esclerênquima, Xi – Xilema, Fl – Floema, Co – Colênquima, Cpr – Cristais prismáticos, Fv – Feixe vascular, Ttc – Tricoma tector curto.
54
Figura 8 – Secção transversal da ráquis da folha de P. emarginatus A, B, C em dupla coloração Azul de astra/fucsina básica; D e E Histoquímica com Sudam IV. A – Aspecto geral; B – Detalhe da epiderme e parênquima cortical; C – Detalhe do sistema vascular central; D – Nectário extrafloral e E – Detalhe dos tricomas tectores unicelulares. Ep – Epiderme, Cut - Cutícula, Pc – Parênquima cortical, Esc – Esclerênquima, Fl – Floema, Xi – Xilema, Pm – Parênquima medular, Ttc – Tricoma tector, Ps – Pólo secretor, Prs – Parênquima secretor, Cpr – Cristal prismático.
55
Figura 9 - Secção transversal do pecíolo de Pterodon emarginatus Vog. em dupla coloração Azul de Astra/Fucsina Básica. A – Aspecto geral; B – Detalhe da epiderme até floema; C – Detalhe do parênquima cortical evidenciando cristais prismáticos próximos ao sistema vascular central. Ep – Epiderme, Esc – Esclerênquima, Fl – Floema, Xi – Xilema, Cp – Célula pétrea, Cpr – Cristal prismático, Cs – Cavidade secretora, Pm – Parênquima medular.
56
Figura 10 - Secção tranversal do pecíolo de Pterodon emarginatus Vog. A e B – Histoquímica com Ácido Tânico/FeCl3 evidenciando células mucilaginosas. C – Histoquímica com Sudam IV. Cs – Cavidade secretora, Fv – Feixe vascular, Ep – Epiderme, Cm – Células mucilaginosas, Esc – Esclerênquima, Fl – Floema, Xi – Xilema, Pm – Parênquima medular, Tt – Tricoma tector, Tg – Tricoma glandular, Cut – Cutícula, Pc – Parênquima cortical.
57
Figura 11 – Secção transversal do pulvino primário de P. emarginatus A, B, C em dupla coloração Azul de Astra/Fucsina Básica A – Aspecto geral; B – Detalhe da epiderme e parênquima cortical; C – Detalhe do sistema vascular central; Cut - Cutícula, Pc – Parênquima cortical, Esc – Esclerênquima, Fl – Floema, Xi – Xilema, Pm – Parênquima medular, Ttc – Tricoma tector.
58
3 DISCUSSÃO
A análise da arquitetura foliar, os detalhes e as variações que ocorrem nos
tecidos vegetais contribuem para a identificação correta de várias espécies e
conseqüentemente no controle de qualidade de drogas vegetais. Em relação à
análise microscópica de P. emarginatus foi verificado que as características
morfológicas da folha não destoam do gênero como um todo.
A análise microscópica revelou a ocorrência de estômatos do tipo
paracítico (células-guarda acompanhada de cada lado por duas células
subsidiárias paralela à fenda estomática). Em Papilionoideae existe variedade
anatômica quanto à classificação dos estômatos, porém em algumas espécies é
comum verificar células subsidiárias paralelas ao ostíolo (SOLOREDER, 1908),
como observado para P. emarginatus. A grande variabilidade morfológica e
anatômica dos estômatos pode estar associada a adaptações dos vegetais em
locais com restrição de água (SENA et al., 2007).
Os estômatos encontram-se em depressões da epiderme abaxial
marcando o tipo xerofítico para P. emarginatus. Segundo Alquini e Bona (2006),
de acordo com o ambiente é comum a localização de estômatos em amplas
depressões, sendo estas denominadas de criptas estomáticas. Para Idu et al.,
(2000) estômatos anomocíticos e paracíticos podem ocorrer em representantes
de Fabaceae localizando-se exclusivamente na face abaxial. Ainda na epiderme
abaxial a presença de pequenas projeções da parede periclinal externa das
células epidérmicas caracterizam as papilas. A função das papilas é controversa,
visto que para alguns autores possui importância taxonômica, enquanto que para
outros funcionam apenas como refletores da luz solar (ALQUINI e BONA, 2006).
Em ambas as epidermes deve ser destacada a presença de tricomas tectores
unicelulares concordando com a descrição citada para a sub-família
Papilionoideae descrita por SOLEREDER (1908). Tricomas desempenham
importante papel na adaptação em ambientes xéricos, pois fornecem uma
atmosfera saturada em vapor de água em torno da folha (FAHN 1986). Além de
contribuir para a redução da transpiração, os tricomas podem interferir na
economia de água das plantas através da regulação da temperatura pela reflexão
dos raios solares que chegam às folhas (SALATINO et al., 1986; ELIAS, et al.,
59
2003). Recentemente alguns estudos consideram os tricomas como barreiras
físicas para redução da herbivoria (PRESS, 1999).
Outra característica marcante na epiderme de todas as regiões foliares
estudadas refere-se à espessa cutícula. Segundo, Vannuci e Rezende (2003),
cutículas espessas ocorrem em plantas que vivem em ambientes secos, e sua
estrutura atrai o interesse de pesquisadores no que tange aos problemas
relacionados à permeabilidade de certos produtos químicos, tais como nutrientes
minerais, fungicidas e herbicidas. A cutícula que é formada pelo processo de
impregnação de cutina, possui de modo geral a função de reduzir a perda
excessiva de água das plantas. Rodrigues e Machado (2004), relatam cutícula
espessa constituída por células papilosas em pulvino, pecíolo e ráquis de P.
pubescens.
Na anatomia foliar de espécies do gênero Pterodon, um aspecto que pode
ser útil em sua diagnose, é a formação de uma camada esclerenquimática junto
às nervuras de grande porte. Conforme Zanetti et al., (2004) a disposição destas
fibras junto aos feixes vasculares funciona como reforço mecânico evitando o
murchamento. Sugere-se que a presença de cavidades presentes em vários
gêneros da sub-família Papilionoideae, como por exemplo Amicia, Derris,
Dipteryx, Myroxylon, Pterodon entre outros (SOLEREDER, 1908), possa ser
utilizada no controle de qualidade destas espécies.
Segundo Castro e Machado (2005) os idioblastos secretores – células
individualizadas podem apresentar taninos, óleos, mucilagens, cristais em seu
conteúdo em vários grupos de plantas, conferindo valor taxonômico. Na lâmina
foliar, ráquis e pecíolo foi possível detectar a presença de idioblastos contendo
cristais prismáticos. Para algumas espécies da sub-família Papilionoideae já foi
relatada a presença de cristais de oxalato. Entretanto, neste caso o conteúdo do
idioblasto não apresenta valor taxonômico visto o grande número de espécies que
compõem esta sub-família possuírem idioblastos. Apesar disso a distribuição dos
idioblastos constitui caráter diagnóstico para P. emarginatus, outras espécies da
Família Leguminosae, sub-família Papilionoideae, como as do gênero Indigofera
L. apresentaram idioblastos contendo compostos fenólicos (reação positiva para
cloreto férrico), associados a compostos nitrogenados (reação positiva para
reagente de Wagner e ácido pícrico) apresentando variações entre as espécies
60
(MARQUIAFÁVEL et al., 2007). Em reações de histoquímica com ácido tânico e
cloreto férrico observam-se idioblastos ricos em mucilagem, localizados no
parênquima cortical do pecíolo próximo a epiderme. Solereder (1908), relata a
presença de células secretoras com mucilagem ou resinas em diversas espécies
da família Papilionaceae, sendo que a presença destas estruturas caracteriza
marcante distinção para esta família.
Em Papilionoideae, o esclerênquima pode se apresentar como um anel
ininterrupto ou não e também como grupos isolados de fibras. Em P. emarginatus
ele se apresenta disposto em calotas esclerenquimáticas contínuas na ráquis e
pecíolo. A presença de anéis contínuos e multisseriados de esclerênquima
geralmente caracteriza ordens e gêneros (SOLEREDER, 1908). Em Pterodon a
disposição destas calotas ou anéis tem valor unificador para as espécies já
estudadas.
Rodrigues e Machado (2004), descreveram a anatomia comparada do
pulvino, pecíolo e ráquis de Pterodon pubescens Benth., e Machado e Rodrigues
(2004), a anatomia e ultra-estrutura do pulvino primário de Pterodon pubescens
Benth., associando os eventos fisiológicos responsáveis pelos movimentos
foliares lentos com características estruturais da folha. Para estes autores a
posição e composição do cilindro vascular são responsáveis pela grande
flexibilidade do pulvino e maior rigidez do pecíolo. Um dos principais caracteres
que diferenciam Fabaceae das demais famílias da ordem Fabales é a ocorrência
de folhas compostas com pulvinos bem evidentes (JUDD et al., 1999). Segundo
Campbell e Thomson (1977), os pulvinos consistem em espessamento da base
foliar, sendo responsáveis pelos movimentos foliares rápidos ou lentos, mediante
a estímulos externos ou endógenos.
Em muitas espécies de leguminosas os movimentos foliares têm sido
atribuídos a mecanismos fisiológicos correlacionados às características
estruturais do pulvino. Dentre estas características, relatadas, destacam-se córtex
amplo constituído por células parênquimáticas, denominadas células motoras por
Toriyama (1953), ausência ou redução de tecidos lignificados, medula reduzida ou
ausente e sistema vascular em posição central. Paredes sinuosas ou dobradas
são evidências de modificações no compartimento apoplástico (FLEURAT-
61
LESSARD, 1988; MOYSSET e SIMÓN, 1991). Todas essas características
podem ser observadas para o pulvino primário de P. emarginatus.
No bioma Cerrado, como as plantas estão sujeitas às intempéries
climáticas como radiação excessiva, temperatura elevada, a morfologia foliar
torna-se importante na adaptação do meio ambiente (CALDAS et al., 1997). Em
estudo da anatomia comparada do pulvino primário de leguminosas realizado por
Rodrigues e Machado (2006), nove espécies de leguminosas nativas do cerrado
são descritas, mencionando a velocidade de movimento foliar destas. Para as
espécies analisadas da sub-família Faboideae foi observado movimento
heliotrópico e nictinástico lentos. A organização do pulvino de P. emarginatus é
similar a destas espécies analisadas, e demais leguminosas como descrito em
literatura (TORIYAMA, 1953; RODRIGUES e MACHADO, 2006). A ocorrência de
parênquima cortical amplo foi um dos parâmetros que diferenciou o pulvino
primário das demais regiões foliares, especialmente do pecíolo e ráquis.
Recentemente algumas pesquisas têm tentado estabelecer características
distintas das espécies do gênero Pterodon, entre elas P. polygalaeflorus Benth e
P. pubescens Benth que foram enquadradas taxonomicamente como sinônimos
para P. emarginatus (LEWIS, 1987). Entretanto estas espécies possuem
caracteres morfo-anatômicos que as diferem discretamente uma da outra, como
por exemplo, a estrutura dos nectários extraflorais (NEFs). Estas estruturas
secretoras estão localizadas nos órgãos vegetativos, podendo ocorrer nas folhas,
caule, cotilédone e outros. O tecido secretor nectarífero às vezes encontra-se
restrito a epiderme ou compreendido em toda a sua camada e também as células
parênquimáticas subjacentes. Os NEFs são definidos como glândulas que
elaboram soluções açucaradas denominadas néctar. A grande variabilidade
estrutural deles, bem como sua ampla ocorrência em vários táxons é destacada
em várias revisões bibliográficas (SCHNELL et al., 1963; VANNUCI e REZENDE,
2003). Estimativas mostram que o número de famílias de Angiospermas dotadas
de NEFs é superior a 90 (BLÜTHGEN e REIFENRATH, 2003), com
aproximadamente 2200 espécies (KELLER, 1989). Na flora arbórea dos cerrados
do Sudeste do Brasil, os NEFs estão presentes entre 15 a 22% e, no Centro-
Oeste, entre 21 a 26% das espécies (OLIVEIRA e LEITÃO-FILHO, 1987).
62
Diversos estudos relatam que os NEFs, estão envolvidos na proteção
contra a herbivoria. A proteção contra herbívoros é dependente em certos casos
da interação benéfica entre plantas e formigas, sendo estas atraídas pelos
produtos dos NEFs (KOPTUR et al., 1998; OLIVEIRA e FREITAS, 2004).
Na família Fabaceae os NEFs ocorrem com maior freqüência em
espécimes da sub-família Mimosoideae, sendo também observados em
Caesalpinoideae, e menor freqüência nas Faboideae (ELIAS, 1983; PAIVA e
MACHADO, 2006). A ocorrência, morfologia, densidade e disposição dos NEFs,
são características que possuem valor taxonômico (METCALFE e CHALK, 1979).
No presente estudo a espécie P. emarginatus apresentou NEFs assim como as
outras duas espécies do gênero já estudas. Em pesquisa realizada por PAIVA et
al., 2001), nectários extraflorais foram encontrados na ráquis abaixo da inserção
de cada pecíolo de P. polygalaeflorus e P. pubescens. O NEF observado em P.
emarginatus apresenta morfologia semelhante consistindo de uma elevação na
porção apical e profunda depressão, onde se localiza o pólo secretor. Tricomas
tectores ocorrem ao longo da ráquis. Numerosos tricomas são observados
também na ráquis de P. pubescens, sendo mais raros em P. Polygalaeflorus, por
essa característica o NEF de P. emarginatus aproxima-se ao de P. pubescens,
descrito por Paiva et al., (2000).
O tecido secretor em ambas as espécies é semelhante, apresentando
células parênquimáticas com citoplasma denso. Cristais prismáticos podem estar
presentes nas células parênquimáticas, associados ao floema. Em P.
polygalaeflorus a ocorrência dos cristais de oxalato é mais abundante, porém
essa diferença pode estar relacionada à disponibilidade de cálcio no solo, desde
que haja correlação entre a suplementação de cálcio e a formação de cristais de
oxalato de cálcio nos tecidos vegetais (ZINDLER-FRANK, 1995; PAIVA et al.,
2001). O sistema vascular e a estrutura anatômica dos NEFs é similar entre P.
emarginatus e as outras duas espécies estudadas por Paiva et al., (2001), não
conferindo identificação taxonômicas entre estas três espécies. A presença dos
NEFs permite a inclusão destas em estudos ecológicos do bioma Cerrado.
63
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Em conclusão, pode-se afirmar que a partir das características analisadas,
tais como folhas pinadas, imparipinadas e pecioladas, folha hipoestomática,
tricomas tectores unicelulares, epiderme com cutícula espessa, sistema vascular
envolto por fibras esclerenquimática, rica presença de cavidade secretoras,
pulvino com córtex bem desenvolvido, existe um padrão geral de organização
anatômica comum entre P. emarginatus e as outras espécies que compõem o
gênero, sub-família e família a qual pertence. Além disso, os vários parâmetros
listados são significativos para a diagnose de P. emarginatus podendo
futuramente serem utilizados no controle de qualidade desta espécie enquanto
insumo farmacêutico. Assim sendo, o presente estudo contribui para a
caracterização desta planta e complementam informações morfológicas para o
gênero Pterodon.
64
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70
____________________________________________________________
CAPÍTULO 3
FENÓIS TOTAIS E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS E FRAÇÕES DAS CASCAS DO CAULE E FOLHAS DE Pterodon emarginatus Vog. (Leguminosae =
Fabaceae)
_________________________________________________________________________
71
1 INTRODUÇÃO
As primeiras formas vivas a povoarem a superfície da terra eram
unicelulares e obtinham seu ATP na ausência de oxigênio, porém a partir de
sucessivas modificações físico-químicas na atmosfera terrestre, as absorções dos
efeitos danosos da radiação ultravioleta, conduziram à evolução das espécies
mais complexas, até chegar ao homem e muitos organismos passaram a utilizar o
oxigênio como fonte de energia para garantir sua existência (OLSZEWER, 1995).
O surgimento do oxigênio, por sua vez, foi acompanhado pelo aparecimento da
camada de ozônio (O3) na atmosfera (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1989).
1.1 Metabolismo do oxigênio e sua relação na formaç ão dos radicais livres
Normalmente organismos aeróbicos derivam a maior parte de seu ATP
(adenosina trifosfato) celular pela redução de 4 elétrons de oxigênio à água
através do transporte de elétrons por meio da via mitocondrial ou retículo
endoplasmática. Cerca de 95-98% do oxigênio consumido penetra no interior da
célula, sendo reduzido pela ação da citocromo-oxidase. Durante esse processo o
oxigênio pode aceitar menos que 4 elétrons para formar metabólitos oxigenados
que são citotóxicos (OLSZEWER, 1995).
O2
+� 4H+ � 4e - 2H
2O
As fontes que fornecem os cátions de hidrogênio e os elétrons para esta
reação são provenientes basicamente do NADH (nicotinamida adenina
dinucleotídeo), FADH (flavina adenina dinucleotídeo) e a ubiquinona ou coenzima
Q (LEHNINGER et al., 2000; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1989).
O oxigênio tem a sua atividade fundamental no metabolismo celular
aeróbico. Desta forma, a geração de radicais livres pelo organismo em condições
normais é inevitável. Havendo, portanto uma relação direta entre o oxigênio e a
gênese dos radicais livres. Toda molécula possui um número específico de
espaços a serem ocupados por elétrons, entretanto às vezes nem todos os
espaços disponíveis são ocupados, o que determina características importantes
nestas moléculas. Serão redutoras (ganham elétrons) aquelas que apresentaram
maior número de elétrons ocupando estes espaços e oxidantes (doam elétrons)
72
aquelas cujo número de elétrons, ocupando espaços nas órbitas for menor que a
metade dos espaços disponíveis. Para se encontrar num estado de equilíbrio toda
molécula precisa possuir um número pareado de elétrons na sua órbita externa,
caso isso não ocorra, haverá a formação um radical livre (HALLIWELL e
GUTTERIDGE, 1989), figura 1.
Molécula Normal Radical Livre (n0 não pareado
e- na órbita externa)
Figura 1 – Esquema químico de um radical livre (HAL LIWELL e GUTTERIDGE, 1989)
Portanto, um radical livre nada mais é do que qualquer átomo, íon ou
molécula, que possui um ou mais elétrons desemparelhados na sua órbita
externa. Esta partícula eletricamente instável, com vida média muito curta, é
extremamente reativa, sendo capaz de captar elétrons de um composto que
esteja próximo independente dele ser uma molécula, uma célula ou tecido do
organismo. Embora o ataque inicial vise promover a estabilização ou
neutralização do radical livre, outro radical livre é formado no processo resultando
numa reação em cadeia celular (KALIORA et al., 2006).
Estes intermediários altamente reativos são denominados de Espécies
Reativas do Oxigênio (ERO), Tabela 1. A formação dos ERO se dá inicialmente a
partir do radical superóxido (O2.-), que pode sofrer ação da enzima superóxido
dismutase (SOD), convertendo-se em peróxido de hidrogênio (H2O2). No
organismo atuam duas SODs, principais, uma citoplasmática (CuZnSOD)
contendo Cobre-Zinco e a outra mitocondrial (MnSOD) contendo Manganês
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1989). A Figura 2 demonstra a formação das
ERO.
73
2% a 5% Fe+2
Peróxido de Hidrogênio
GSH - Peroxidase
H2O + GS-SH
OH. (Radical Hidroxila)
H2O
95% a 98% 4e- + 4H
O2 O2. - (Superóxido)
H2O2
Figura 2 – Esquema da Formação das EROs. SOD – Superóxido dismutase, Cat – Catalase, O2
- - Superóxido, O2 – Oxigênio, GSSH – Glutadiona Oxidada, GSH – Glutadiona Peroxidase, H2O – Água, OH. – Radical Hidroxila, GSH – Glutadiona Reduzida, H2O2 – Peróxido de Hidrogênio, (OLSZEWER, 1995).
Tabela 1 - Espécies reativas do oxigênio (ERO).
O2. - Ânion superóxido ou radical superóxido
HO2. Radical perhidroxil
H2O2 Peróxido de hidrogênio
OH. Radical hidroxila
RO. Radical alcoxil
ROO. Radical peroxil 1O2 Oxigênio singlet
ROOH Hidroperóxido orgânico (ex.: lipoperóxido)
Fonte: (SIES, 1991)
SOD (Zn/Cu ou Mn)
Cat (Fe)
H2O + ½ O2 Fe+2
Vitamina C e E Beta Caroteno
Haber Weiss
74
1.2 Antioxidantes
Antioxidantes são compostos capazes de proteger o sistema biológico
contra o efeito nocivo de processos ou reações que possam causar oxidação
excessiva (KRINSKY, 1994). Como os radicais livres são gerados
endogenamente em conseqüência do metabolismo do oxigênio molecular e
também em condições não-fisiológicas, como a exposição da célula a
xenobióticos, o organismo lançou mão de dois sistemas enzimáticos de defesa.
Um deles atua como detoxificador do agente antes que ele induza a lesão e o
outro promove o reparo da lesão ocorrida.
O primeiro sistema é composto por Glutadiona Reduzida (GSH) que
protege a célula contra a lesão resultante da exposição a agentes como íons
ferro, oxigênio hiperbárico, radiação e luz ultravioleta; a Superóxido-Dismutase
(SOD) que catalisa a dismutação do radical superóxido em H2O2 e O2, além de
proteger o DNA de lesões provocadas pela sobrecarga de Fe3+; a Catalase, que
catalisa a redução do H2O2 a H2O e O2 e inibe lesões oxidativas do DNA;
glutadiona-peroxidase (GSH-Px) que catalisa a redução do peróxido de
hidrogênio e peróxidos orgânicos para seus correspondentes álcoois; e vitamina
E, que confere proteção à membrana celular por agir como quelante dos
oxidantes produzidos durante a peroxidação lipídica. O segundo sistema envolve
a participação do Ácido ascórbico que neutraliza diretamente os radicais livres;
glutadiona-redutase (GSH-Rd) que promove a recuperação da enzima GSH
mantendo íntegro o sistema de proteção celular; e GSH-Px, entre outros
(FERREIRA e MATSUBARA, 1997). A Tabela 2 resume as ERO e seus
respectivos antioxidantes. Além destes sistemas enzimáticos, os organismos
aeróbicos podem receber auxílio dos antioxidantes não enzimáticos, em sua
maioria exógenos, e compostos principalmente, pelas vitaminas, polifenóis,
flavonóides, carotenóides e licopeno (VELIOGLU et al., 1998; POLYAKOV et al.,
2001; SANTOS, 2006).
Dietas ricas em antioxidantes protegem a saúde humana contra várias
enfermidades (Quadro 1) e como já mencionado esse efeito protetor pode ser
atribuído a nutrientes antioxidantes presentes em plantas (KARIOLA et al., 2006).
A terapia antioxidante é uma importante ferramenta no tratamento de desordens
75
causadas por radicais livres e isso justifica a pesquisa de fontes antioxidantes
naturais (BRIANTE et al., 2002). Os vegetais constituem uma importante fonte de
moléculas bioativas e nos últimos anos, a prevenção de doenças como o câncer e
doenças neurodegenerativas está associada à ingestão de vegetais como fontes
de antioxidantes naturais (JOHNSON, 2001). Várias são as evidências de que alta
ingestão de tais compostos está associada a um baixo risco de mortalidade por
doenças como diabetes mellitus, aterosclerose, envelhecimento precoce e outras
que estejam relacionadas com o estresse oxidativo (GÜLCIN et al., 2003; SORG,
2004; CHANWITHEESUK et al., 2005)
Tabela 2 - ERO e antioxidantes
ERO Antioxidantes Endógenos Exógenos
Superóxido O2. - Superóxido dismutase (SOD)
a) citoplasmática: Zinco-Cobre b) mitocondrial: Manganês
Vitaminas, zinco, cobre, manganês, picnogenol, EDTA
Peróxido de hidrogênio (H2O2)
Catalase Fé+2
Peróxido lipídico (COOH_)
Glutadiona peroxidase, selênio, cisteína
Vitamina E, selênio
Radical hidroxila (OH.)
Vitamina C, picnogenol, dimetil sulfóxido, EDTA, ácido dimercapto succínico e manitol
Oxigênio singlet (1O2) β-caroteno Hidroxiperóxidos de ácidos graxos orgânicos (ROOH)
Glutadiona peroxidase
Fonte: BIANCH e ANTUNES (1999)
76
Quadro 1 -Doenças relacionadas com a geração de radicais livres
Artrite Parkinson Aterosclerose Alszheimer Diabetes Mellitus Câncer Catarata Envelhecimento Esclerose Múltipla Cardiopatias Inflamações Crônicas Enfisemas Doenças do sistema imune Disfunção cerebral
Fonte: BIANCH e ANTUNES (1999)
Diversas técnicas têm sido empregadas para determinação da atividade
antioxidante in vitro, de forma a permitir rápida seleção de substâncias e/ou
misturas potencialmente interessantes (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO,
2006). Estes métodos podem ser baseados na captura do radical peroxila, poder
de redução do metal, captura do radical orgânico, quantificação de produtos
formados durante a peroxidação de lipídios (oxidação do LDL, co-oxidação do β-
caroteno) (FRANKEL e MEYER, 2000; SÁNCHES-MORENO et al., 1998;
ARUOMA, 2003).
Em função de possíveis problemas causados pelo consumo de
antioxidantes de origem sintética, várias são as pesquisas voltadas atualmente
para a descoberta de produtos naturais, isolados ou mesmo de extratos de
plantas e suas frações com atividade antioxidante, os quais permitirão a
substituição dos sintéticos ou possíveis associações entre eles (PAREJO et al.,
2003; SILVA et al., 2005). A espécie eleita para a determinação da atividade
antioxidante foi a Pterodon emarginatus Vog. (Sucupira-Branca ou Faveira, nome
vulgar), família Leguminosae/Fabaceae, usada pela medicina popular para o
tratamento de dores na garganta, reumatismo, problemas de coluna, como
depurativo e tônico. Esta espécie é nativa dos Cerrados brasileiros, sendo
encontrada nas regiões de São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul e Goiás
(COELHO et al.,1999; COELHO et al., 2001). Quimicamente, as espécies deste
gênero acumulam diversos metabólitos tais como: alcalóides, triterpenos,
diterpenóides, isoflavonas entre outras substâncias (BRAZ e GOTTLIEB, 1971;
FASCIO et al., 1976; MARQUES et al. 1998; ARRIAGA et al., 2000). Embora
existam vários relatos na literatura relacionados às atividades farmacológicas e
biológicas dos extratos dos frutos e sementes, informações referentes à atividade
77
antioxidante do material botânico selecionado são inexistentes, justificando a
realização deste ensaio, uma vez que grande parte da população faz uso desta
espécie para o tratamento de diversos males.
Considerando o exposto acima, o objetivo deste capítulo foi avaliar o
potencial antioxidante do extrato etanólico bruto da casca do caule e das folhas,
além de frações do extrato etanólico bruto da casca do caule de P. emarginatus
(FABACEAE), através do ensaio espectrofotométrico com o radical 2,2-difenil-1-
picril-hidrazil (DPPH.), amplamente empregado para determinar a capacidade de
espécies vegetais na captura de radicais livres.
78
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Reagentes e equipamentos
Padrão: α-tocoferol foi obtido da Sigma, o 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
(DPPH.) da Sigma-Aldrich. Os reagentes, hexano, diclorometano, acetato de etila
e metanol e etanol foram obtidos da QUIMEX (P.A). A água utilizada foi obtida
pelo processo de destilação. Dos equipamentos, a balança analítica utilizada foi a
da marca Bioprecisa/Eletronic Balance, modelo: FA2104N, Espectrofotômetro
modelo FEMTO 432C da Tecnal, Moinho de facas tipo WILLYE, Evaporador
Rotativo (MARCONI) acoplado a bomba a vácuo (STRUBBER modelo TE-152
com vácuo entre 600 e 700 atm) e Refrigerador (TECNAL modelo TE -184).
2.2 Material botânico
Para a realização dos estudos, o material botânico (cascas do caule e
folhas de Pterodon emarginatus Vog.) foi coletado no município de Bela Vista-GO
(847 m de Altitude, 17002’1,1” S / 48049’0,3” W). A espécie foi identificada pelo
Prof. Dr. José Realino de Paula e a exsicata encontra-se depositada no Herbário
da Universidade Federal de Goiás sob o número UFG – 27.155.
As cascas e as folhas foram submetidas a secagem em estufa com
circulação forçada de ar 400C (FABBE-PRIMA), durante 48 horas e
posteriormente submetidas a moagem em moinho de facas do tipo WILLYE
(TENCNAL – Modelo: TE 650), até forma de pó. O pó foi empregado no preparo
dos extratos etanólicos e frações.
2.3 Obtenção dos extratos etanólicos brutos
O material pulverizado foi submetido a um processo de maceração a frio,
por três dias, com agitação ocasional utilizando como líquido extrator, etanol
96°GL P.A. A proporção utilizada foi de uma parte d o material pulverizado, para
cinco partes do etanol. Após a maceração, foi realizada uma filtração em papel de
filtro, o extrato obtido foi concentrado em evaporador rotativo a uma temperatura
79
Extrato Etanólico da Casca
de 40º C. O resíduo vegetal foi extraído por mais três vezes de maneira análoga à
primeira, obtendo assim o extrato etanólico bruto da casca do caule e das folhas
de P.emarginatus Vog. (FERRI, 1996).
2.4 Fracionamento do extrato etanólico bruto das ca scas do caule de P.
emarginatus
Para o fracionamento do extrato etanólico bruto das cascas, foi feita a
dissolução deste na mistura metanol/água na proporção de 7:3, a qual foi
submetida a sucessivas partições líquido-líquido com hexano, diclorometano e
acetato de etila. Desta forma, foram obtidas 4 frações: fração hexânica (FHc),
fração diclorometano (FDMc), fração acetato de etila (FAEc), e fração
metanol/água (FMet/H2Oc). As frações obtidas foram empregadas no teste de
atividade antioxidante através da reação com DPPH.. A Figura 2 esquematiza o
fracionamento realizado.
Suspensão em MetOH/H2O 7:3
Figura 3 - Seqüência de fracionamento do extrato etanólico bruto da casca de Pterodon emarginatus Vog.
Fração Metanol/Água Fração Hexânica
Fração Acetato de Etila Fração Diclorometano
Fração Metanol/Água
80
2.5 Doseamento de fenóis totais
Para o doseamento dos fenóis totais contidos nos extratos e frações de P.
emarginatus foi empregado o método de Hargerman e Butler (MOLE e
WATERMAN, 1987) descrito a seguir. Todo o ensaio foi realizado em triplicata.
Para o preparo das soluções a serem dosadas, pesou-se 100mg de cada
amostra (extrato bruto da casca do caule e folhas e frações hexano,
diclorometano, acetato de etila e metanol/água obtidas a partir do extrato bruto da
casca do caule), em seguida transferiu-se cada amostra para um balão
volumétrico de 100 mL, completando-se o volume com 40 mL de metanol 50% e o
restante com água destilada. Em caso de sedimentação durante a solubilização
das amostras filtração foi efetuada com auxílio de papel de filtro.
Adicionou-se em um tubo de ensaio 2 mL de solução de Lauril Sulfato de
Sódio/Trietanolamina1 e 1 mL de solução cromogênica de FeCl32. adicionou-se a
esse tubo 1 mL da solução da amostra obtida anteriormente. Deixou-se em
repouso por 15 minutos e fez-se a leitura da absorbância a 510 nm. Utilizou-se
como branco uma solução contendo 2 mL de solução de Lauril Sulfato de
Sódio/Trietanolamina e 1 mL de solução cromogênica de FeCl3 e 1 mL de água
destilada.
Curva padrão de ácido tânico: pesou-se 100mg de ácido tânico e
transferiu-se para um balão de 100 mL, completou-se o volume com 40 mL de
metanol 50% (V/V) e o restante com água destilada. Retirou-se alíquotas desta
solução que variam de 200 µL a 800 µL, dependendo da faixa de concentração
que se pretendia cobrir, e transferiu-se para tubos de ensaio contendo 2 mL de
solução de Lauril Sulfato de Sódio/Trietanolamina e 1 mL de solução cromogênica
de FeCl3 e completou-se o volume para 4 mL com água destilada. Deixou-se em
repouso por 15 minutos e fez-se a leitura da absorbância a 510 nm.
Confeccionou-se uma curva padrão de ácido tânico utilizando o programa
“GraphPad Prism 5”.
_____________________________ 1 Lauril sulfato de sódio 1% (p/V), Trietanolamina 5% (V/V) e isopropano 20% (V/V) em quantidade suficiente de água destilada para completar o volume de 10 mL.
2 1,62 g de FeCl3 em 1 L de solução de HCl 0,001M.
81
Através da curva padrão de ácido tânico e das diluições das amostras a
porcentagem de fenóis totais foi calculada, utilizando as seguintes fórmulas
Onde:
c = concentração de ácido tânico em mg
Os resultados apresentado para o doseamento dos fenóis totais
correspondem à média das três repetições (n=3) ± desvio padrão da média.
c = Absorbância – A B % fenóis totais = c x 100 x 10-3 x 100 0,1
82
2.6 Avaliação da capacidade de reação com 2,2-difen il-1-picril-hidrazil (DPPH.)
O método DPPH. (BRAND-WILLIAM et al., 1995) é baseado na captura do
radical cromóforo DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil), de coloração púrpura por
antioxidantes, produzindo um decréscimo da absorbância a 517nm. Por ação de
um antioxidante (AH) ou uma espécie radicalar (R.), o DPPH. é reduzido ao difenil-
picril-hidrazina, de coloração amarela, com conseqüente desaparecimento da
absorção. A partir dos resultados de absorbância obtidos em espectrofotômetros,
pode-se, determinar a atividade antioxidante ou seqüestradora de radicais livres
e/ou a porcentagem de DPPH. remanescente no meio reacional, (BRAND-
WILLIAM et al., 1995). Este método foi modificado por Sánches-Moreno et al.,
(1998) para mensurar parâmetros cinéticos.
A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade
de DDPH consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante
necessária para reduzir a concentração inicial de DPPH em 50% é denominada
concentração eficiente (CE50), também designada de concentração inibitória
(CI50). Quanto maior for o consumo do radical livre DPPH. por uma amostra,
menor será a sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante.
Para avaliar o potencial antioxidante, foram feitos e testados 2 extratos
etanólicos brutos (casca do caule e folhas) e as 4 frações do extrato etanólico
bruto da casca do caule acima mencionados. A avaliação da atividade
antioxidante frente ao radical DPPH. foi então realizada através de medidas
espectrofotométricas do consumo do radical livre, na presença de possíveis
substâncias antioxidantes (BRAND-WILLIAMS et al., 1995), com modificações. As
amostras foram diluídas em duplicata, com concentrações finais de 25 mg mL-1 à
0,0122 mg mL-1(12 concentrações no total) em metanol, partindo-se da Solução-
Mãe de 50 mg mL-1. Uma solução metanólica de DPPH. a 100 mM foi preparada,
e alíquotas de 1 mL, desta, foram adicionadas em cubetas contendo 50 µL de
cada amostra (A), à cada concentração. As reações transcorreram à temperatura
ambiente (em torno de 25 0C) por 30 minutos, ao abrigo da luz. Após transcorridos
os 30 minutos foram feitas as leituras das absorbâncias, a 517 nm. Metanol
(1,0 mL) mais 50 µL de cada amostra em cada concentração foram usados como
brancos (B) e a solução de DPPH. (1,0 mL; 100 mM) mais metanol (50 µL) foi
83
usada como controle (C). Os valores de absorbância foram convertidos em
atividade antioxidante percentual (AA%) usando a seguinte fórmula (MENSOR, et
al., 2001).
A vitamina E (α-tocoferol) foi usada como controle positivo com
concentrações de 25 mg mL-1 à 0,0122 mg mL-1. Uma alíquota contendo apenas
metanol foi utilizada como branco para zerar o espectrofotômetro.
2.6.1 Cálculo da concentração eficiente 50% (CE50)
O resultado de CE50 é utilizado para obtenção de parâmetros numéricos
que permitam verificar se a planta possui substâncias antioxidantes e observar
sua eficiência frente a radicais livres no modelo teste. Os valores de AA% e das
concentrações de cada amostra foram relacionados utilizando o programa
“GraphPad Prism 5”, obtendo-se, para cada amostra a concentração efetiva 50%.
A determinação da CE50 foi obtida, então por regressão linear dos pontos
plotados graficamente (MENSOR, et al., 2001). Para a plotagem dos pontos,
foram usados os valores de AA% obtidos de duplicatas realizadas para cada um
dos testes. A mensuração de CE50 configura o valor necessário para produzir
metade (50%) de um efeito máximo estimado em 100% para as amostras
testadas (BOSCOLO et al., 2007; VICENTINO e MENEZES, 2007).
AA% = 100 – { [ (ABSA – ABSB) X100] /ABSC}
84
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Rendimento dos extratos etanólicos brutos e das frações
Das 400 g do pó da casca e 260 g do pó das folhas de Sucupira-branca
processadas através da técnica de maceração empregada, seguida da rota-
evaporação, obteve-se 129,92 g de extrato etanólico bruto da casca da Sucupira
e 42,78g de extrato etanólico bruto das folhas de Sucupira. A partir desse valor o
rendimento obtido foi equivalente a 32,48% para casca e 16,45% para folhas.
Após o fracionamento do extrato etanólico bruto da casca obtido da
amostra coletada, obteve-se 10,65% de rendimento para a fração hexânica,
4,50% para a fração diclorometano, 32,36% para a fração acetato de etila e 34%
para a fração aquosa. A Tabela 3 resume o rendimento de todos os extratos e
frações obtidas.
Tabela 3 - Rendimento dos extratos e frações
.
Amostra Rendimento (%)
Extrato Etanólico da Casca 32,48
Extrato Etanólico da Folha 16,45
Fração Hexânica Casca 10,65
Fração Diclorometano da Casca 4,50
Fração Acetato de Etila da Casca 32,36
Fração Metanol/Água da Casca 34
85
3.2 Fenóis Totais
Os Resultados do doseamento dos fenóis totais encontram-se na Tabela 4, e
o Gráfico 1 representa a curva padrão do ácido tânico empregado no doseamento
pelo método Hargerman e Butler (MOLE e WATERMAN, 1987)
Tabela 4 – Doseamento de fenóis totais expressos em porcentagem (p/p).
.
DP – Desvio Padrão da média correspondente às três repetições
Gráfico 1 – Curva padrão para doseamento de fenóis totais para os extratos e frações de P. emarginatus. Concentração de ácido tânico versus absorbância. Equação da reta: Absorbância = A + B . c. Erro de ajuste (R2) = 0,9983.
Amostras % de fenóis totais ± DP
Extrato Etanólico Bruto da Casca do Caule 0,8416 ± 0,07
Fração Hexânica da Casca 0,0464 ± 0,04
Fração Diclorometano 7,9733 ± 0,15
Fração Acetato de Etila 4,0720 ± 0,15
Fração Metanol/Água 4,7926 ± 0,14
Extrato Etanólico Bruto das Folhas 22,882 ± 0,3
86
3.3 Atividade antioxidante percentual
A média das absorbâncias obtidas referentes a cada concentração foi
utilizada para calcular a AA% conforme já descrito em material e métodos. Os
valores de porcentagem de atividade antioxidante das amostras e do padrão (25 a
0,0122 mg/mL) frente ao radical livre DPPH. estão representada na Tabela 5.
Tabela 5 - Atividade antioxidante frente ao radical DPPH.
Concentração Atividade antioxidante %
mg/mL EEC FHc FDMc FAEc FMet/H2Oc EEF Padrão α-tocoferol
25mg/mL 95,98 63,68 95,78 95,84 94,69 96,04 92,94
12,5mg/mL 94,64 61,13 95,44 94,84 92,44 95,98 92,85
6,25mg/mL 84,72 33,46 94,89 94,03 90,20 95,64 92,64
3,125mg/mL 56,46 22,62 91,42 80,17 62,85 93,56 92,55
1,56mg/mL 31,07 14,48 77,82 49,56 35,37 90,95 92,43
0,78mg/mL 16,14 10,68 56,66 28,33 15,91 61,41 92,38
0,39mg/mL 5,291 9,690 38,70 11,31 13,87 34,29 92,21
0,1953mg/mL 4,755 7,592 22,10 8,640 1,632 16,61 83,75
0,0976mg/mL 2,478 6,943 17,75 4,688 1,088 10,24 75,68
0,0488mg/mL 1,473 6,243 3,129 2,880 0,884 6,229 51,82
0,0244mg/mL 1,071 4,945 0,544 1,540 0,204 5,023 39,11
0,0122mg/mL 0,267 4,695 0,204 0,267 0,190 3,348 32,78
ECC: Extrato etanólico da casca do caule; FHc: Fração hexânica da casca; FDMc: Fração diclorometano da casca; FAEc: Fração acetato de etila da casca; FMet/H2Oc: Fração metanol-água da casca; EEF: Extrato etanólico da folha. As atividades antioxidantes observadas foram dose-dependente,
permitindo calcular o valor de CE50 (concentração necessária para inibir 50% da
atividade do DPHH.). Os valores obtidos a partir desta mensuração podem ser
observados na Tabela 6 e a partir do Gráfico 1 é possível analisar o perfil traçado
pelos valores de CE50.
87
Tabela 6 – Concentração efetiva 50% calculada através de regressão linear, logarítmica.
Gráfico 2 – Perfil da concentração efetiva 50% calculada através de regressão linear, logarítmica do gráfico obtido com os valores encontrados de %AA para cada concentração e amostra. ECC: Extrato etanólico da casca do caule; FHc: Fração hexânica da casca; FDMc: Fração diclorometano da casca; FAEc: Fração acetato de etila da casca; FMet/H2Oc: Fração metanol-água da casca; EEF: Extrato etanólico da folha.
Amostras Estudadas CE50*
Extrato Etanólico Bruto da Casca do Caule 2,888
Fração Hexânica da Casca 6,336
Fração Diclorometano 0,1843
Fração Acetato de Etila 1,392
Fração Metanol/Água 1,760
Extrato Etanólico Bruto das Folhas 0,2733
Padrão – α-tocoferol -3,632
CE50*= Concentração efetiva 50% calculada através de regressão linear, logarítmica do gráfico obtido com os valores encontrados de %AA para cada concentração.
88
Várias substâncias naturais, obtidas de plantas, têm sido identificadas
como seqüestradoras de espécies reativas do oxigênio, conferindo proteção ao
organismo humano dos efeitos nocivos das mesmas (GÜLCIN et al., 2003).
Moléculas com núcleos fenólicos vêm se destacando como excelentes captadores
radicalares, como demonstrado por Gyamfi et al., (2001), Kujala et al., (2000),
Halliwell et al., (1995), Andrade et al., (2007) e outros autores.
O padrão α-tocoferol (vitamina E) demonstrou ser significativamente mais
ativo que as demais amostras. A fração diclorometano do extrato etanólico bruto
da casca do caule apresentou atividade antioxidante consideravelmente maior
que as demais frações, bem como do próprio extrato bruto da casca, sendo
interessante os valores obtidos, uma vez que esta fração acumula moléculas mais
apolares, não sendo comum a atividade verificada para esta fração, entretanto
compostos terpênicos possuem importante atividade antioxidante (CANDAN et al.,
2003; SACCHETTI et al., 2005), e estudos com essa fração realizados por
Moraes (2007), permitiram o isolamento de compostos terpênicos como lupeol e
betulina. Outra amostra com atividade antioxidante interessante foi a fração
acetato de etila. Tal resultado equipara-se a outros trabalhos que também têm
demonstrado maior potência para essa fração. Zanon (2006) num estudo de
Vernonia tweedieana Baker testou extratos de diversas polaridades, constatando
maior porcentagem no índice de inibição para a fração acetato de etila. Na fração
acetato de etila é comum a extração de compostos com núcleos fenólicos.
Metabólitos com estas estruturas estão presentes em praticamente todas as
plantas, além disso, compostos fenólicos possuem capacidade de doar átomos de
hidrogênio e, portanto inibir as reações em cadeia provocadas pelos radicais
livres (HARTMAN e SHANKEL, 1990).
O extrato etanólico bruto das folhas de P. emarginatus, também
demonstrou interessante atividade antioxidante quando comparada com o extrato
da casca e as frações deste extrato. Tal resultado pode ser justificado pela
presença de clorofila, pigmento com atividade antioxidante já constatada.
Comparativamente podemos então atribuir as melhores atividades
antioxidantes a fração diclorometano da casca e ao extrato etanólico bruto das
folhas, alcançando os valores de EC50 de 0,1843 e 0,2733 respectivamente.
Estas amostras quando tratadas com o DPPH. apresentaram rápido e forte
89
decaimento das absorbâncias, acompanhados de rápida descoloração da solução
de púrpura para amarelo. Este comportamento pode ser entendido pela presença
de substâncias com grupos hidroxilas, capazes de doarem hidrogênio. Existem
compostos que reagem rapidamente ao DPPH. e outros que apresentam
comportamento mais lento (TSIMOGIANNIS e OREPOULOU, 2004) , como
observado para a fração hexânica da casca. A partir dos resultados foi possível
ainda verificar uma correlação positiva entre os fenóis totais e a CE50 dos
extratos e frações. A análise realizada permite também sugerir que existe algum
constituinte que contribui particularmente e mais efetivamente para a ação
seqüestradora de radicais livres, na fração diclorometano.
Vários compostos de origem vegetal possuem potencial antioxidante. E
como já comprovado por CHOI (2002) componentes fitoquímicos como
aminoácidos, vitaminas, e pigmentos podem atuar sinergicamente fortalecendo a
atividade antioxidante. Muitas são as plantas que já tiveram seu uso popular
comprovado a partir de estudos etnobotânicos. Como exemplos podem ser
citados a aroeria, a embaúba e o jambo branco, que apresentam grande potencial
antioxidante (BOSCOLO et al., 2007).
A interação de uma espécie química antioxidante com o DPPH. depende,
de vários fatores, como a especificidade pela conformação estrutural do Radical
Livre. Por isso, determinados extratos de plantas e suas frações classificados em
alguns trabalhos como compostos não antioxidantes, devem ser testados por
outras metodologias, a fim de confirmar esse resultado (MENSOR, 2001). Este
ensaio in vitro pode ser visto como ponto de partida para estudos posteriores
como o isolamento, a purificação e a elucidação estrutural das substâncias que
podem atuar como antioxidantes (BOSCOLO et al., 2007). Recentemente
metodologias de muitos trabalhos têm proposto uma correlação quantitativa entre
a morfologia e a composição micromolecular característica de cada espécie
(GOTTLIEB e BORIN, 2002; GOTTLIEB et al., 1994). Muitas destas metodologias
mostraram que alguns grupos de plantas apresentam correlações entre a
evolução morfológica e a biossíntese de classes específicas de metabólicos
secundários, de função também antioxidante (GOTTLIEB, 1990).
90
Os resultados obtidos para P. emarginatus confirmam efeitos antioxidantes
importantes, podendo atribuir essa atividade biológica a possível presença de
substâncias fenólicas em algumas frações e nos extratos das folhas.
91
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados obtidos são bons indicativos de que a planta Pterodon
emarginatus Vog. (Sucupira-branca) possui constituintes químicos capazes de
capturarem radicais livres e formar compostos estáveis, configurando assim
importante atividade antioxidante. Assim sendo, pressupõe-se que as frações
acetato de etila e diclorometano do extrato etanólico da casca do caule bem como
o extrato etanólico bruto das folhas da espécie estudada possam ser exploradas
na busca por fármacos antioxidantes promissores e utilizadas para o tratamento
de doenças decorrentes do stress oxidativo, aumentando ainda mais as
possibilidades farmacológicas, visto que já foram isoladas várias moléculas com
atividade antinociceptiva e antiinflamatória dos extratos estudados da referida
espécie. Entretanto, testes in vitro não permitem a extrapolação para humanos,
visto que muitas moléculas ativas na reação com o DPPH. são inativas em testes
mais específicos, com inibição enzimática. Desta forma, testes in vivo devem ser
realizados, pois assim possibilitarão o uso industrial desta planta em formulações
farmacêuticas e cosméticas com fins antioxidantes.
92
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98
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CAPÍTULO 4
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA ORAL DOS EXTRATOS ETANÓLICOS BRUTOS DAS
CASCAS DO CAULE E FOLHAS DE Pterodon emarginatus Vogel (Leguminosae = Fabaceae)
_________________________________________________________________
99
1 INTRODUÇÃO
Ervas medicinais, como a maior parte dos remédios na medicina
tradicional, têm sido empregadas na prática médica por centenas de anos e
contribuído para saúde humana. A utilização das espécies vegetais é passada de
geração a geração, integrando parte da cultura de grupos étnicos. Segundo dados
da Organização Mundial da Saúde é inegável que a maioria da população de
baixa renda recorra às plantas medicinais como único lenitivo para seus males e
que cerca de 35% dos princípios ativos das formulações farmacêuticas,
desenvolvidos pela indústria mundial são provenientes de vegetais. No Brasil e
no mundo, o estudo de plantas cresce anualmente, e o interesse sobre plantas,
seus princípios ativos e seus efeitos terapêuticos têm despertado a atenção dos
pesquisadores (TOMAZZONI et al., 2006; CALIXTO, 2001). Vários são os
exemplos de medicamentos desenvolvidos de fontes naturais, especialmente de
plantas incluindo entre outros a morfina, os curares, os digitálicos e diversos
outros medicamentos usados no tratamento do câncer como a vimblastina,
vincristina e o taxol (BRAGGIO, 2003). Entre os adeptos do uso medicinal de
plantas, é comum a idéia de que a utilização popular destas fontes naturais já foi
testada e homologada, por isso, seriam remédios eficazes e seguros, sem os
efeitos colaterais comuns aos produtos sintéticos, não sendo necessário a
avaliação exigida para esse tipo de medicamento (SIMÕES et al., 2004).
Apesar de possuírem potencial curativo, as plantas possuem substâncias
que, dependendo da dose, podem tornar-se tóxicas ao organismo, causando
reações indesejáveis ou até mesmo levando ao óbito. Dentre os principais
princípios ativos responsáveis pelo potencial tóxico das plantas podemos destacar
os alcalóides, glicosídeos, taninos, saponinas, oxalatos, entre outros (SIMÕES et
al., 2004). Quando utilizada como medicamento a planta configura um
xenobiótico, isto é, um produto estranho ao organismo. Como qualquer outra
substância os produtos de sua biotransformação são potencialmente tóxicos e
assim devem ser encarados até prova em contrário. Portanto, o uso popular, e
mesmo tradicional, não são suficientes para atestar as plantas medicinais como
medicamentos eficazes e seguros (BRASIL, 1995).
100
Nesse sentido, a avaliação toxicológica das plantas é alvo de pesquisas e
investigações de muitos estudiosos desde as antigas civilizações, pois quando
utilizadas com critério, só tem a contribuir para a saúde (DI STASI, 1996). A
avaliação da segurança, ou seja, a relação risco/benefício, é a finalidade dos
estudos toxicológicos pré-clinicos e clínicos de medicamentos. De modo geral,
muitas normas estipulam os testes de toxicidade para avaliação do risco de um
novo medicamento. Nos testes gerais, as espécies mais utilizadas são
camundongos e ratos, machos e fêmeas, de linhagens exogâmicas e o número
de animais em cada teste deve seguir os Princípios Éticos da Experimentação
Animal (COBEA, 1991).
A principal fonte de guias para a regulamentação em âmbito mundial da
avaliação toxicológica de medicamentos fitoterápicos é a Organização Mundial de
Saúde. Dado o caráter multilateral dessa organização, suas diretrizes não têm
força de lei em nenhum país, mas influenciam fortemente na elaboração de
legislações nacionais. Desta forma a partir de 1981 a WHO elaborou diversas
normas técnicas, entre elas: Guidelines for the assessment of herbal medicine –
Normas para a avaliação dos medicamentos fitoterápicos; Research Guidelines
for Evaluating the Safety and Efficacy of Herbal Medicines – Normas de pesquisas
para a avaliação da eficácia e segurança dos medicamentos fitoterápicos (WHO,
2000). No que se refere à realização de ensaios toxicológicos pré-clínicos de
sustâncias químicas, os critérios para realização dos mesmos estão bem
especificados, por exemplo, nas normas da Organization for Economic Co-
Operation and Development (OECD) – Organização para Cooperação Econômica
e Desenvolvimento.
Existe uma tendência mundial para reavaliar a utilização de animais em
experimentos visando reduzir custos, tempo, e o mais preconizado sugere
critérios bioéticos, diminuindo o sofrimento desnecessário de animais de
laboratório. Várias alternativas foram sugeridas com base no princípio do
programa dos 3Rs: Reduction (redução do número de espécies e animais
utilizados nos procedimentos), Refinement (refinamento da técnica utilizada) e
Replacement (substituição de cobaias por modelos fabricados sem, no entanto,
prejudicar os resultados). Para isso, há a elaboração de protocolos de estudo
(guidelines) que são publicados quando a nova proposta de ensaio já foi avaliada,
101
validada e aprovada pelos órgãos competentes (ICCVAM e NICEATM – Estados
Unidos, ECVAM – Comunidade Européia). O ensaio de toxicidade aguda oral era
um dos ensaios toxicológicos mais duramente criticado e discutido frente ao
programa dos 3Rs: devido à utilização do grande número de animais e do grande
sofrimento submetido aos mesmos.
Em 1986, a Organization for Economic Co-operation and Development
(OECD) anunciou alterações nos guidelines de toxicidade aguda oral e dérmica.
No que se refere à toxicidade aguda oral foi sugerido o método de classe de dose
aguda tóxica (Acute Toxic Class Method – OECD 423) adotado em 1996 e
extensamente validado. O procedimento do teste preconiza o uso de três animais
do mesmo sexo por dose. Dependendo da mortalidade ou do estado moribundo
dos animais outras doses intermediárias são necessárias para que se admita um
critério da toxicidade aguda na sustância-teste. A classificação da substância
administrada é feita de acordo com o Globally Harmonised System (GHS).
A toxicidade aguda manifesta-se imediatamente ou com 14 dias após a
exposição de uma dose única de um xenobiótico por ingestão, inalação ou
através da pele em animais ou humanos. O propósito dos testes de toxicidade
aguda é identificar uma dose claramente tóxica, sub-letal ou letal, para identificar
os órgãos alvos da substância em estudo, e para gerar um banco de dados para
seleção de doses em testes subseqüentes de toxicidade (BRESOLIN e FILHO,
2003).
Em revisão bibliográfica da espécie P. emarginatus não foram encontrados
estudos referentes à avaliação toxicológica dos extratos etanólicos brutos da
casca do caule e folhas, justificando a realização e apresentação deste capítulo.
Várias diretrizes são utilizadas para determinar a toxicidade aguda oral e validar
plantas medicinais e outros produtos como seguros ou tóxicos. A diretriz
escolhida para a avaliação da toxidade aguda oral dos extratos acima
mencionados foi a OEDC 423 (Método de Classes). Como a sucupira branca
constitui fonte imediata e viável de medicamento para enfermidades como
infecções ginecológicas, reumatismo, dores de garganta, entre outras, faz-se
necessário, portanto a investigação do seu potencial toxicológico.
102
2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material botânico
Para a realização dos estudos, o material botânico (cascas do caule e
folhas de Pterodon emarginatus Vog.) foi coletado no município de Bela Vista-GO
(847 m de Altitude, 17002’1,1” S / 48049’0,3” W). A espécie foi identificada pelo
Prof. Dr. José Realino de Paula e a exsicata encontra-se depositada no Herbário
da Universidade Federal de Goiás sob o número UFG – 27.155.
As cascas e as folhas foram submetidas a secagem em estufa com
circulação forçada de ar 400C, durante 48 horas e posteriormente submetidas a
moagem em moinho de facas do tipo WILLYE, até forma de pó. O pó foi
empregado no preparo dos extratos etanólicos.
2.2 Obtenção do extrato etanólico bruto.
O material pulverizado foi submetido a um processo de maceração a frio,
por três dias, com agitação ocasional utilizando como líquido extrator, etanol
96°GL P.A. A proporção utilizada foi de uma parte d o material pulverizado, para
cinco partes do etanol. Após a maceração, foi realizada uma filtração em papel de
filtro, o extrato obtido foi concentrado em evaporador rotativo a uma temperatura
de 40º C. O resíduo vegetal foi extraído por mais três vezes de maneira análoga à
primeira, obtendo assim o extrato etanólico bruto da casca do caule e das folhas
de P.emarginatus Vog. (FERRI, 1996).
2. 3 Toxicidade aguda dose única .
A investigação da toxicidade aguda proposta seguiu, em linhas gerais, as
diretrizes da OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development)
e, no mínimo, as diretrizes da Portaria 116/96 do Ministério da Saúde, para
avaliação da toxicidade aguda oral de substâncias químicas e estudos de
toxicidade de dose única de novas drogas.
103
Os grupos experimentais de camundongos e ratos de ambos os sexos foram
compostos ao acaso, com animais de diferentes ninhadas, com o cuidado de que
a variação de peso entre eles não excedesse à 20% do peso médio. Os
camundongos foram agrupados em até três animais por gaiola e os ratos, até 3
animais por gaiola também.
Experimentos independentes foram realizados para avaliação da toxicidade
aguda oral dose única (métodos de classe) em camundongos e ratos machos e
fêmeas. Os resultados foram comparados na tentativa de evidenciar qualquer
diferença entre gêneros quanto à toxicidade aguda. O período total de observação
após administração da dose única foi de 14 dias.
Para a administração do fármaco/medicamento, no estudo de toxicidade
oral, os animais foram privados de alimento 12 horas antes da administração da
droga. O alimento foi restituído 3 a 4 horas após a administração da droga por via
oral. Excetuando-se este período de jejum, os animais tiveram livre acesso à
ração e à água.
2.3.1 Descrição detalhada do protocolo experimental
(Guideline OECD 423): Três animais são usados para cada dose. A dose
inicial foi selecionada entre as doses fixas de 5, 50, 300 e 2000mg/kg, sendo
aquela mais propensa a produzir mortalidade com base em relatos de dose com
toxidade evidente, quando possível, ou através de relatos evidenciados com base
na estrutura química. Na ausência de ambas, a informação pode iniciar o estudo
de triagem com a dose de 200mg/kg.
Quando informações avaliadas sugerem que a mortalidade significativa não
seja iniciada com o nível maior de dose (2000 mg/kg de peso corpóreo), o teste
para se conhecer o limite deve ser conduzido. Excepcionalmente, e somente
quando justificado por necessidades específicas, o uso de um nível de dose maior
de 5000 mg/kg pode ser considerada. O tempo de intervalo entre o tratamento
dos grupos é determinado pelo início, duração e gravidade dos sinais tóxicos. O
tratamento de animais com a próxima dose deve ser esperado até que se
confirme a sobrevivência de um animal previamente doseado.
104
A base da técnica consiste em se administrar a grupos de três animais
doses seqüenciais menores a partir da máxima de 2000 mg/kg caso se observe a
morte de mais de 1 animal. Isto possibilita a estimativa de uma DL50 conforme os
padrões da GHS.
Dependendo da mortalidade ou do estado moribundo dos animais outras
doses intermediárias são necessárias para que se admita um critério da
toxicidade aguda na substância–teste. A classificação da substância administrada
é feita de acordo com o Globally Harmonised System. Uma das três ações é
requerida: parar no teste que atribui a classificação do risco apropriado; testar em
uma dose fixa maior ou em uma menor.
Dose 2000 mg/kg: Inicia-se a administração da dose de 2000 mg/kg a três
animais. Caso haja a morte de um ou nenhum animal há duas opções: a amostra
não é classificada ou entra na classe 5 cuja DL50 varia até 5000 mg/kg sendo
maior que 2000 mg/kg. A morte de 2 ou 3 animais implica na administração de
uma dose de 300 mg/kg.
Dose 300 mg/kg: A sobrevivência de todos os animais ou mesmo a morte
de apenas um deles implica na classe 4 (DL50 maior que 300 mg/kg até o valor
de 2000 mg/kg). A morte de pelo menos 2 requer uma terceira dose no valor de
50 mg/kg.
Dose 50 mg/kg: A morte de no máximo um camundongo classifica a
substância na classe 3 (DL50 maior que 50 mg/kg e no máximo 300 mg/kg). Caso
dois ou mais camundongos morram administra-se a quarta dose de 5 mg/kg .
Dose 5 mg/kg: A morte de um ou nenhum camundongo determina uma
DL50 maior de 5 mg/kg e máximo de 50 mg/kg pertencendo à classe 2. a morte
do 2 ou 3 animais implica na classe 1, a DL50 equivale a no máximo 5 mg/kg o
que a caracterizaria como altamente tóxica.
2.3.2 Animais e condições ambientais de manutenção
Animais . Foram utilizados no presente estudo duas espécies de roedores:
camundongos albinos (Swiss), pesando de 20 a 25 g e ratos (Wistar), com peso
de 180 a 250 g, não-isogênicos, de ambos os sexos, com fêmeas nulíparas e não
prenhas, provenientes de colônias mantidas no Biotério da UNICEUB, ou oriundos
105
de outras fontes fidedignas e aclimatados (para observação do comportamento,
dos hábitos e das condições sanitárias dos mesmos).
Condições de Manutenção . O Biotério de manutenção foi provido de um
sistema de barreiras de modo a garantir condições sanitárias adequadas para
estudo toxicológico. O pessoal em contato direto com os animais utilizou
vestimenta especial (luvas, máscaras, aventais, toucas, sapatos, óculos). A
temperatura ambiente (23 ± 2 oC), a umidade relativa do ar (50 – 70%), a
renovação de ar (20 trocas de ar por hora) e o ciclo claro/escuro (12 horas claro/l2
horas escuro) foram monitorados.
A maravalha (de pinho-branco ou equivalente) foi autoclavada, portando
laudo de procedência para garantir a inocuidade da mesma. Foram utilizadas
gaiolas de polipropileno (42 x 34 x l7 cm) para a manutenção dos animais.
Dieta. Os animais foram alimentados com ração comercial de boa
qualidade e adequada às necessidades de nutrientes de ratos e camundongos
(Labina®- Purina). Uma estimativa destas necessidades pode ser encontrada no
Nutrient Requirements of Laboratory Animals da National Academy of Sciences,
dos Estados Unidos.
.
2.3.3 Via e modo de administração
Os extratos testados foram administrados em dose única, a via oral, que é
a preconizada para uso humano, sendo efetuada através de entubação gástrica
com cânulas apropriadas. O extrato da casca foi administrado na forma de
solução aquosa (diluente: 5% DMSO) e o extrato da folha em solução aquosa
(diluente: 5% Tween®). O volume administrado não excedeu a 1 mL/100g de peso
corporal, mantendo constante ajustamento das concentrações de acordo com o
nível de dose. O ponto de partida para a administração correspondeu a uma dose
de 2000 mg/kg. Na ausência de mortalidade e ou sinais de toxicidade a dose foi
aumentada para 5000 mg/Kg. Em todos os testes foi incluído um grupo controle,
tratado apenas com os veículos.
106
2.3.4 Duração do período de observação
O período total de observação na primeira etapa foi de 14 dias a partir da
administração dos extratos. No décimo quarto dia, os animais foram sacrificados e
necropsiados, avaliados à vista desarmada e não sendo necessária a remoção de
fragmentos de órgãos para o estudo histopatológico.
2.3.5 Observação dos sinais de toxicidade
Os animais foram observados em intervalos regulares e todos os sinais de
toxicidade, a época do seu aparecimento, a intensidade, a duração e a
progressão dos mesmos foram registradas. Dados como morte (latência) e o
modo pelo qual o animal morre também poderiam ser documentados. O peso dos
animais foi registrado ao final do experimento.
Observações comportamentais sistemáticas (screening hipocrático:
atividade geral, frênito vocal, irritabilidade, resposta ao toque, resposta aperto
cauda, contorção, posição trem posterior, reflexo endireitamento, tonus do corpo,
força para agarrar, ataxia, reflexo auricular, reflexo corneal, tremores, convulsões,
straub, hipnose, anestesia, lacrimação, ptosis, micção, defecação, piloereção,
hipotermia, respiração, cianose, hiperemia, morte) foram realizadas a intervalos
variados no dia de administração da droga (10 min., 30 min., 1h, 2h, 4h, 6h, 12h e
24h) e, a partir de então, diariamente, até o décimo quarto dia.
As intensidades dos eventos foram tabuladas de 0 a 4, correspondendo,
respectivamente a: ausente, raro, pouco, moderado, intenso. As alterações
encontradas na observação comportamental e exame clínico sistemático dos
animais foram registrados em protocolo impresso com a lista de sinais a serem
investigados. Esta lista e a pesquisa de sinais foram baseadas no modelo
proposto por MALONE e ROBICHAUD, 1962 e MALONE, 1977.
107
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os estudos de toxicidade aguda foram realizados empregando-se a via
intra-gástrica como já mencionado em material e métodos, baseado no fato de
que P. emarginatus é utilizada por humanos exclusivamente por via oral. As
doses administradas correspondentes a 2000 mg/kg e 5000 mg/kg não
demonstraram sinais de toxicidade nem dano fatal aos camundongos e ratos
machos e fêmeas. No estudo realizado observou-se que nem mesmo a maior
dose de 5000 mg/kg provocou dano considerável, o que descarta a determinação
de uma DL50.
É bom ressaltar que o método (OECD 423), não objetiva determinar DL50,
mas permitir, a determinação definida de ranques de exposição onde a letalidade
é esperada. Entretanto, ela permite mensurar o valor de DL50 quando as duas
últimas doses resultam em mortalidade maior que 0% e menor que 100%.
VALADARES (2006), em exposição do processo evolutivo dos testes de
toxicidade aguda aponta a tendência de desuso do cálculo da DL50 nesse tipo de
estudo.
As intensidades dos eventos relacionados às observações
comportamentais sistemáticas, receberam em todos os grupos testados o valor 0
correspondendo a ausência do evento observado no screening hipocrático.
Sensibilidade entre as espécies e sexo dos animais não foram constatadas. Na
análise macroscópica dos órgãos realizada a partir da necropsia sugerida pela
OECD 423, não foram constatadas alterações nos órgãos selecionados para
análise como o fígado, rim e baço, não sendo necessária a remoção de
fragmentos dos órgãos para o estudo histopatológico. Os dois primeiros possuem
papéis importantes no metabolismo e excreção de xenobióticos e o terceiro órgão
é capaz de fornecer sinais de toxicidade para o sistema imune dos animais
(HAYES e DIPASQUALE, 2001).
Em trabalho realizado por Sabino et al., (1999), com óleo das sementes de
P. pubescens, uma outra espécie do gênero, e para alguns autores sinonímia
botânica de P. emarginatus, foi verificado que o tratamento oral de camundongos
com esse óleo não induziu mortalidade ou o aparecimento de sinais clínicos de
toxicidade. Neste mesmo estudo análises histopatológicas dos tecidos também
108
não demonstraram nenhuma lesão. Resultados toxicológicos como este
envolvendo o óleo da semente e extrato etanólico bruto da casca e folha são de
grande importância, haja vista, que estes produtos são utilizados popularmente
como medicamentos naturais. Estudos toxicológicos in vivo têm reportado que os
resultados referentes à toxicidade variam muito de acordo com a rota de
administração. De acordo com Luz Dias et al., (1995), camundongos submetidos
em tratamento dérmico, também não apresentaram genotoxicidade, mas injeção
de doses de 0,5 e 1,0 mL de óleo das sementes de P. pubescens (dose esta
extremamente mais alta do que a usada popularmente) induziu efeitos tóxicos
causando morte de 25 a 50% dos animais respectivamente.
É importante observar que a os efeitos anti-reumáticos, antiinflamatórios,
tônicos da espécie estudada, dependem da administração oral, e felizmente, esta
foi exatamente a rota de administração que não mostrou nenhuma toxicidade para
os extratos testados.
A metodologia utilizada preconiza o uso de roedores, de preferência
fêmeas. Embora, as amostras tenham sido testadas em animais de ambos os
sexos e em duas espécies diferentes. Objetivando verificar a sensibilidade entre
sexo e espécies (OECD 423, 2001).
Como visto anteriormente, os estudos pré-clínicos são extremamente
importantes para o desenvolvimento de um produto fitoterápico, incluindo a
toxicologia, como a evidente necessidade de aliar a segurança à eficácia e se
potência. Podemos perceber isso no volume de trabalhos publicados e
relacionados com a toxicidade de plantas medicinais como Averrhoa carambola L.
(PROVASI et al., 2001), Synadenium umbellatum (OLIVEIRA, 2005) Jatropa
gossypiifolia L. (MARIZ, et al., 2006), entre outras.
No passado o uso tradicional das diversas plantas que compõem nossa
biodiversidade baseado no conhecimento popular, aliado à crença de que não
provocam males à saúde, excluiu de certa forma a avaliação de sua toxicidade
em estudos pré-clínicos. No que se refere à legislação para medicamentos
fitoterápicos no Brasil, várias modificações estão sendo feitas pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Essa preocupação das autoridades
regulatórias com a normatização de produtos naturais permite a avaliação de
aspectos importantes, como a eficácia e segurança do uso destes medicamentos.
109
Apesar dos avanços já conquistados, a regulamentação de produtos naturais
permanece em aberto, mesmo em países como a Alemanha e França onde são
mais comercializados (TUROLLA e NASCIMENTO, 2006).
110
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Percebe-se que o uso indiscriminado e conhecimento sobre a toxicidade de
plantas é uma vertente atual, e que para a maioria da população, toda erva é um
recurso natural e benéfico. Em conseqüência disso têm-se emergente importância
trabalhos que visem elucidar cada vez mais o potencial tóxico das plantas
utilizadas como medicinais. O resultado desta prática só tem a contribuir
fundamentalmente para a utilização racional das plantas, com base na utilização
tradicional cabendo aos profissionais de saúde, estarem atentos quanto à
orientação e utilização de plantas medicinais. Os resultados obtidos no presente
estudo contribuem de forma significativa para complementação de banco de
dados, sugerindo a ausência ou baixa toxicidade dos extratos etanólicos brutos
das cascas do caule e folhas de P. emarginatus. Entretanto estudos toxicológicos
subcrônicos e crônicos em animais são necessários nesta triagem.
111
REFÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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114
_________________________________________________________________
CAPÍTULO 5
ANÁLISE E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO
ÓLEO ESSENCIAL E OCORRÊNCIA DE ESTERÓIDES NAS FOLHAS DE Pterodon emarginatus
Vogel (Leguminosae = Fabaceae)
_________________________________________________________________
115
1 INTRODUÇÃO
O termo óleo essencial tem sido empregado para designar líquidos oleosos
voláteis fortemente aromáticos, extraídos de plantas. Seus principais constituintes
são os monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), alguns diterpenos (C20), além
de outros compostos alifáticos com baixo peso molecular. A geração destes se dá
por diversas vias metabólicas, cuja distribuição é restrita a algumas famílias,
gêneros ou mesmo espécies. Dependendo da família, eles podem ocorrer em
estruturas secretoras especializadas, como pêlos glandulares (Lamiaceae),
células parenquimáticas diferenciadas (Lauraceae, Piperaceae, Poaceae), e
bolsas lisígenas ou esquizolisígenas (Pinaceae, Rutaceae). O estoque destes
óleos ocorre em diversos órgãos, tais como flores, folhas, frutos, cascas do caule
entre outros (DORMAN e DEANS, 2000; ARAÚJO et al., 2001; SIMÕES e
SPITZER, 2004).
A utilização de óleos essencias pela indústria farmacêutica reside no fato
de que grande parte de seus constituintes já possuem descrição de diversas
atividades farmacológicas. Tais como ação carminativa, antiespamódica,
secretolítica, estimulante, antiinflamatória e antimicrobiana. Vale ressaltar que
estas atividades são atribuídas ao óleo isolado e não necessariamente à
farmacógenos ricos em óleos essencias, pois a presença de outros constituites
somam para a predominância de determinada atividade farmacológica (COSTA,
1994; SIMÕES, e SPITZER, 2004; DE PAULA, 2006).
Óleos essenciais de plantas apresentam uma atividade antimicrobiana
contra um grande número de bactérias incluindo espécies resistentes a
antibióticos e antifúngicos (CARSON et al., 1995; CARSON e RILEY, 1995). Estes
compostos podem atuar contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e ainda
contra leveduras e diversas cepas de fungos filamentosos. Embora as indústrias
farmacêuticas empreguem cada vez mais esforços para a obtenção de novos
antibióticos nas três últimas décadas, a resistência destes microorganismos para
estes fármacos tem aumentado (NASCIMENTO et al., 2000).
A atividade microbiana e antifúngica dos óleos essenciais depende do tipo,
composição e concentração, do tipo do microrganismo testado, a composição do
substrato, processamento e condições de estocagem (MARINO et al., 2001). O
116
problema da resistência microbiana tem aumento e a perspectiva para o
desenvolvimento de fármacos antimicrobianos no futuro é ainda imprecisa. Sendo
assim, ações devem ser tomadas com o intuito de reduzir este problema, como
uso racional dos antibióticos, desenvolvimento de pesquisas para medicamento
sintéticos ou naturais que possam atuar contra estes microorganismos
patogênicos (NASCIMENTO et al., 2000; BERTINI et al., 2005).
A busca de novos compostos antifúngicos a partir de plantas da flora
latinoamericana, baseada principalmente no seu uso etnofarmacológico, tem sido
tema do projeto de pesquisa X.7 do CYTED (Ciencia y Tecnologia para el
Desarrollo) “Proyecto Iberoamericano de Búsqueda y Desarrollo de Antifúngicos
Naturales y Análogos” (FENNER et al., 2006).
Em 1981 Gottlieb et al., descreveram triagem realizada da flora odorífera
da Amazônia com o objetivo de encontrar novas fontes de óleos essenciais
comercializáveis, apresentando monografias referentes a 25 espécies
pertencentes a 11 famílias. Dentre as famílias analisadas no estudo, consta duas
espécies da sub-família Papilionoidae pertencente a família Leguminosae. Para
os representantes da família Leguminosae os gêneros mais estudados quanto à
composição do seu óleo essencial são Bauhinia e Copaifera (sub-família
Caesalpinoideae).
O estudo referente a óleos essenciais no gênero Pterodon restringe-se
apenas ao óleo obtido das sementes de seus frutos, não havendo pesquisas
relacionadas à sua extração a partir de folhas. Como esta família não compõe as
classicamente estudas no que tange a óleos essenciais como, por exemplo, a
família Myrtaceae, e baseado no contexto anteriormente descrito, desenvolveu-se
esta pesquisa com o objetivo de analisar o teor e composição química, bem como
atividade antimicrobiana do óleo essencial da folhas de P. emarginatus.
117
2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Reagentes e Equipamentos
Os reagentes utilizados para os ensaios descritos no seguinte capítulo
foram: hexano, diclorometano, acetato de etila, ácido clorídrico (HCl), clorofórmio
metanol e etanol foram de procedência QUIMEX e/ou MERCK, especificação pró-
análise. A água utilizada foi obtida pelo processo de destilação. Meio RPMI
(Invitrogen). Para a detecção nas cromatografias, foi utilizado solução de reagente
cromogênico vanilina ácida. Os equipamentos utilizados para pesagem e
obtenção do extrato encontram-se sumarizados no item 2.1 do capítulo 3.
2.1.1 Material botânico e extração do óleo essencia l Para a análise do óleo essencial de P. emarginatus foram coletadas folhas
no município de Bela Vista-GO (847 m de Altitude, 17002’1,1” S / 48049’0,3” W). A
espécie foi identificada pelo Prof. Dr. José Realino de Paula e a exsicata
encontra-se depositada no Herbário da Universidade Federal de Goiás sob o
número UFG – 27.155. Para maior uniformidade as folhas foram coletadas do
mesmo indivíduo, por volta das 10 horas da manhã.
Após a coleta as folhas foram dessecadas em estufa com circulação
forçada de ar 400C (FABBE-PRIMA), durante 48 horas e posteriormente
submetidas à moagem em moinho de facas do tipo WILLYE (TENCNAL – Modelo:
TE 650), até forma de pó, que foi devidamente identificado e armazenado até a
extração do óleo essencial.
Para extração do óleo essencial 120 g do material botânico foi submetido à
hidrodestilação em aparelho do tipo Clevenger por 2 horas. O volume de óleo
essencial foi medido no tubo graduado do próprio aparelho e o rendimento e
porcentagem, foram calculados em relação à quantidade inicial de pó empregado
na extração. O óleo essencial obtido foi acondicionado em recipiente livre de
impureza e hermeticamente fechado e estocado a baixa temperatura até a
utilização.
118
2.2 Análise da composição química do óleo essencial O óleo essencial foi submetido à análise cromatográfica, em fase gasosa,
acoplada à espectrometria de massas (CG/EM) em aparelho SHIMADZU
QP5050A. Utilizou-se uma coluna capilar de sílica fundida (CBP – 5; 30 m x 0,25
mm x 0,25 µm), manteve-se um fluxo 1 mL/min de Hélio, com o gás de arraste,
aquecimento com temperatura programada (60 0C /2min; 3 0C min-1/240 0C; 100C
min-1/280 0C; 2080C/10min) e energia de ionização de 70 eV. O volume de injeção
de 1 µL da amostra diluída em CH2Cl2 na proporção de 1:5. Os componente
químicos do óleo essencial foram identificados por comparação dos espectros de
massa e índices de retenção com os descritos na literatura para os componentes
mais comuns de óleos essenciais (ADAMS, 2007). Os índices de retenção foram
calculados através da coinjeção de uma mistura de hidrocarbonetos C9 – C22, e
utilização da equação de Van Den Dool e Kratz (1963).
Equação de Van Den Dool e Kratz
Onde:
N = Cn – Cn-1
Cn = número de carbonos do n-alcano que elui após a substância analisada
Cn-1 = número de carbonos do n-alcano que antes da substância analisada
tx = Tempo de retenção da substância analisada
tn = tempo de retenção do n-alcano que elui após a substância analisada
tn-1 = tempo de retenção do n-alcano que elui antes da substancia analisada.
IR = 100 . N [(tx – tn-1)/(tn –tn-1)] + 100. Cn-1
119
2.3 Avaliação da atividade antifúngica do óleo esse ncial das folhas de P. emarginatus
Para a avaliação da atividade antifúngica in vitro do óleo essencial das
folhas de P. emargintaus Vog. foi utilizado o método de microdiluição em caldo
(NCCLS / M27-A2, 2002) nas concentrações de 1 a 512 µg/mL sobre 5 isolados
de Candida pertencentes ao Laboratório de Micologia Médica do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública – UFG. O óleo foi diluído em 1mL de
dimetilsulfóxido (DMSO) até se obter uma concentração de 1024 µg/mL.
O meio RPMI foi tamponado a pH 7,0 ± 0,1 em temperatura ambiente de
25 0C, levando em conta que a solução tampão não antagonize os agentes
antifúngicos. Para tal foi usado uma solução-tampão considerada satisfatória nos
testes de sensibilidade a antifúngicos, o HCl (0,1M). Em seguida foi procediada
filtragem da solução de RPMI através de membrana-filtro (Milli-Pore: Membrana
GS em éster de celulose 0,22 UM de poro, 47mm de diâmetro). Para o preparo do
inóculo, cultivou-se a colônia de Candida em Ágar Sabouraud a temperatura
ambiente por 48 horas. Em seguida, fez-se a suspensão em salina 0,85% estéril,
sendo esta ajustada à escala 0,5 Mc Farland, obtendo-se um UFC de 1.106. Em
seguida preparou-se uma diluição 1:50, com 10 µL do inóculo em salina em 0,5
mL de RPMI. A partir da diluição 1:50, realizou-se uma diluição 1:20 com 79 µL da
diluição 1:50 em 1,5mL de RPMI. Estas diluições sucessivas são realizadas para
obtenção de uma concentração de 5,0x102 a 2,5x103 células por mL2.
Para o preparo da microplaca, colocou-se 100 µL de RPMI em cada well
(poço) a partir da segunda fileira vertical. Na primeira fileira vertical, pipetou-se
200 µL do óleo e a partir daí, fez-se a diluição sucessiva. Finalmente, em cada
fileira horizontal, pipetou-se 100 µL do inóculo. A placa foi incubada a 350C
durante 48h-72h. A cepa padrão utilizada foi a (ATCC), Candida parapsilosis
22019. Transcorrido o tempo necessário para o crescimento do inóculo,
procedeu-se a leitura das placas.
120
2.4 Determinação da concentração inibitória mínima do óleo essencial das folhas de P. emarginatus Vog. frente a bactérias (atividade antibacteriana)
A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada pelo
método da diluição em ágar conforme recomendação do NCCLS (2003).
Primeiramente, realizaram-se diluições seriadas em duplicata com o óleo da
seguinte forma: pesou-se, em tubo de ensaio estéril, 1 g do óleo essencial e
completou-se o volume para 2 mL com etanol 95% (V/V), P. A. (tubo 1).
Adicionou-se 1 mL de água destilada estéril a uma seqüência de mais 8 tubos de
ensaio esterilizados (tubos 2 a 9). Retirou-se uma alíquota de 1 mL do tubo 1 e
adicionou-se ao tubo 2, retirou-se uma alíquota de 1 mL do tubo 2 e adicionou-se
ao tubo 3 e, assim, sucessivamente, até o tubo 9 desprezando-se ao final uma
alíquota de 1 mL.
Em seguida, cada um destes tubos adicionou-se 19 mL de ágar Müller
Hinton liquefeito (aproximadamente 50ºC), homogeneizou-se e verteu-se
rapidamente em placas de Petri estéreis. Desta forma obteve-se placas contendo
o óleo essencial em análise em concentrações que variaram de 50 mg/mL até
0,78 mg/mL. Prepararam-se também placas controle contendo o solvente utilizado
na extração e contendo apenas ágar Müller Hinton.
Foram utilizados, para este ensaio, os microganismos descritos na Quadro 1 mantidos na bacterioteca do Laboratório de Bacteriologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás. Quadro 1 – Descrição dos microrganismos utilizados na determinação da concentração inibitória mínima. Microrgan ismos Usados na Avaliação da Atividade Antimicrobia na Bactéria Gram -Positivas Staphylococcus aureus 2592 Staphylococcus epidermidis 12228 Micrococcus roseus 1740 Micrococcus luteus ATCC 9341 Bactérias Gram -Positivas Esporuladas Bacillus atropheus 6633 Bacillus cereus 14756 Bacillus stearothermophylus 1262 Bactérias Gram -Negativas Enterobacter cloaceae HMA/FT502 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Escherichia coli ATCC 8739 Escherichia coli ATCC 11225 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Serratia marcescens ATCC 14756
121
Estes microrganismos foram repicados para caldo tioglicolato e incubados
a 37°C por 24 – 48 horas para reativação. Em seguid a, foram repicados em
placas ASI e incubados novamente a 37° C por 24 hor as. Após o
desenvolvimento microbiano, inóculos de cada microrganismo foram suspensos
em 2 mL de solução salina esterilizada 0,85% (p/V) até obtenção de uma turvação
correspondente a metade do tubo n° 1 da escala Mac Farland. Transferiu-se 100
µL de cada uma dessas suspensões para o inoculador de Steers (STEERS;
FOLTZ; GRAAVES, 1959) e aplicou-se na superfície das placas de Petri contendo
as diluições dos extratos das plantas em ágar Müller Hinton e os controles. As
placas foram incubadas a 37° C por 24 horas. Foi co nsiderada CIM a menor
concentração capaz de inibir o desenvolvimento microbiano.
2.5 Investigação química do extrato etanólico bruto s das folhas de P. emarginatus Vog.
Para a realização do estudo químico do extrato etanólico bruto das folhas
de P. emarginatus foi realizado fracionamento do extrato a partir de coluna
filtrante. As frações foram obtidas por coluna filtrante, sendo cromatografado 10 g
do extrato etanólico bruto das folhas de P. emarginatus Vog. Como fase
estácionária foi utilizada sílica (40 g) (MN Kieselgel 60, 0,063-0,2mm/70-230 mesh
ASTM für die Säulen-Chromatographie (Macherey-Nagel). Para realização da
coluna filtrante foram então eluídos 100 mL de cada sistema: Hexano,
Hexano/diclorometano 1:1, Diclorometano, Diclorometano/Acetato de Etila 1:1,
Acetato de Etila, Acetato de Etila/Metanol 1:1 e Metanol, respectivamente. Para
cada sistema eluente foram coletadas 10 frações cada uma de 10 mL, conforme
Figura 1.
A partir de análise em cromatografia de camada delgada (25DC-Alufolien
20x20cm / Kieselgel 60 F254, Merck) e revelação no ultravioleta nos comprimentos
de onda 254 e 365 nm e reação com vanilina ácida1 seguida de aquecimento
1000C, em chapa aquecedora, as frações que apresentaram o mesmo perfil
cromatográfico foram reunidas em subfrações para posterior análise.
_____________________________ 1Solução cromogênica de vanilina ácida: 45 mL etanol, 1g vanilina, 45 mL água, 10mL H2SO4.
122
Figura 1 - Seqüência de fracionamento do extrato etanólico bruto das folhas de Pterodon emarginatus Vog. por meio de coluna filtrante.
2.5.1 Isolamento e caracterização de constituintes químicos das subfrações
A partir das cromatografias nos sistemas eluentes descritos as frações que
apresentaram o mesmo perfil cromatográfico foram reunidas, sendo que a fração
que se mostrou mais interessante e próxima ao isolamento foi a do sistema:
fração hexano/diclorometano (FHD).
As frações FHD6 a FHD8 (200 mg) apresentaram interessante perfil frente à
reação com vanilina ácida, com fatores de retenção (Rf) bem definidos. Tais
frações foram reunidas e nomeadas de C1. A nova fração foi cromatografada em
coluna com 20 g de Florisil® (0,150-0,250 mm, MERCK), no intuito de separar
Extrato Etanólico da Folha
Fração Hexânica
Fração Hexano/Diclorometano(1:1)
Fração Diclorometano
Fração Diclorometano/Acetato de Etila (1:1)
Fração Acetato de Etila
Fração Acetato de Etila/Metanol(1:1)
Fração Metanol
Coluna MN Kieselgel 60
H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10
HD1, HD2, HD3, HD4, HD5, HD6, HD7, HD8, HD9, HD10
D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10
DA1, DA2, DA3, DA4, DA5, DA6, DA7, DA8, DA9, DA10
A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10
AM1, AM2, AM3, AM4, AM5, AM6, AM7, AM8, MA9, MA10
M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10
123
Coluna Filtarante MN Kieselgel 60 (40 g)
Florisil® (20 g) / Hexano:Acetato de Etila (90:10)
Coluna MN Kieselgel 60 (15 g) / Hexano:Acetato de Etila (95:05)
pigmentos como a clorofila dos demais componentes. Nesta análise foi usado
como eluente hexano:acetato de etila (90:10) em sistema isocrático, coletando-se
10 mL para cada subfração. O novo fracionamento foi acompanhado por CCD e
revelação com vanilina ácida para reunião das amostras com perfil cromatográfico
semelhante, permitindo a reunião das seguintes frações: C1.10 a C1.13 (68,1 mg).
Esta nova amostra obtida da reunião das frações mencionadas foi codificada de
C2 e submetida a uma terceira coluna cromatógrafica com sílica MN Kieselgel 60
(15 g), usado como eluente hexano:acetato de etila (95:05) em sistema isocrático.
Desta coluna foram coletadas 50 subfrações. Da fração C2.10 a C2.30 foram
observados cristais de coloração branca. Após CCD no sistema eluente
Hexano:Acetato de Etila 15% com revelação em vanilina ácida foi possível
detectar a presença de um composto, designado de S1 (C2.27 a C2.30), com
massa de 8,8 mg. A amostra foi enviada à Universidade de Brasília (UNB) para
realização de Ressonância Magnética Nuclear de próton e carbono, para
elucidação da molécula isolada. A Figura 2 ilustra de forma esquemática o
isolamento.
Figura 2 – Resumo esquemático do isolamento de S1
Extrato Etanólico da Folha (10 g)
Fração Hexano/Diclorometano – (1:1) /(FHD)
FHD6 à FHD8 (200 mg) = C1
C1.10 à C1.13 = C2 (68,1 mg)
C2.27 à C2.30 = S1 (8,8 mg)
C1.1 – C1.50
C2.1 – C2..50
124
Uma vez purificada por cromatografia em coluna e cromatografia em
camada delgada a substância isolada S1, foi caracterizada por ressonância
magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e de carbono (RMN 13C). Para a
análise dos espectros de RMN de 1H e 13C de S1 foi utilizado o programa
“ACDLabes/Spec Manager 4.0”, e para desenho das estruturas o programa
“ChemWindow”. As análises de RMN foram realizadas à temperatura ambiente
em um espectrômetro Mercury plus da VARIAN (7,05 T), utilizando uma sonda de
5 mm e pulsos de 45º para o hidrogênio e carbono. Os deslocamentos químicos
no RMN de 1H (300 MHz) foram referenciados aos padrões internos TMS
(tetrametilsilano; 0,0 ppm) para o solvente clorofórmio (CDCl3). Nos espectros de
RMN de 13C (75,46 MHz), foram referenciados ao CDCl3 (77,0 ppm).
125
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Rendimento do óleo essencial O rendimento do óleo essencial em porcentagem (p/V), calculado a partir
da amostra analisada foi de 2%.
3.2 Análise da composição química do óleo essencial
Os resultados da análise por CG/EM do óleo essencial extraído das folhas
de P. emarginatus com os respectivos teores de cada componente expressos em
porcentagem encontram-se descritos na Tabela 1.
Tabela 1 – Componentes do óleo essencial das folhas de P. emarginatus
IR Componentes Teor (%)
1376 α - copaeno 1,07
1390 β - elemeno 7,10
1419 E - cariofileno 6,73
1454 α - humuleno 2,48
1460 Allo-aromadendreno 0,93
1479 γ - muuroleno 48,79
1500 biciclogermacreno 22,66
1497 Acifileno 7,41
1523 δ - cadineno 0,70
IR – Índice de retenção
O rendimento encontrando para o óleo essencial de P. emarginatus que foi
de 2% representa valor considerável quando comparado a amostras de plantas
cuja extração de óleo essencial é tradicional, como por exemplo, o óleo extraído
de espécies como Pseudocaryophyllus (Gomes) L. R. Landrum Myrtaceae (0,8%),
Bauhinia forficata (0,02%), Dipteryx lacunifera Ducke (0,62%) estas duas últimas
pertencentes à família Leguminosae (CORREA e SARTORELLI, 1995; DE
PAULA, 2006, JÚNIOR et al., 2007). O considerável rendimento do óleo obtido
das folhas de P. Emarginatus pode ser justificado pela alta incidência de
cavidades secretoras observadas no estudo morfo-anatômico de suas folhas.
126
A utilização da Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de
Massas (CG/EM), permitiu detectar 9 compostos, sendo todos identificados.
Destes 100% são hidrocarbonetos sesquiterpênicos. Compostos sesquiterpênicos
são amplamente encontrados em plantas, fungos e algas. Mais de 100
sesquiterpenos são conhecidos, e sua estrutura compreende 15 átomos de
carbono, relacionando-se com o constituinte trans-cis-farnesol ou o trans-trans-
farnesol (COSTA, 1994). A maioria dos sesquiterpenos apresenta propriedades
biológicas como inseticida e antibiótica (DEY, 1997). Os componentes majoritários
foram γ – muuroleno e o biciclogermacreno, Tabela 1 e Figura 3. Essas
substâncias apresentam esqueletos carbônicos com ampla atividade
antibacteriana, anti-fúngica, antioxidante, inseticida e inibidores enzimáticos
(ABRAHAM, 2001; YANG et al., 2003; KIM et al., 2003). Óleos essências ricos
nos compostos identificados têm demonstrado atividade larvicida frente ao Aedes
aegypti (SANTOS et al., 2006). O composto bibiclogermacreno, por exemplo, tem
apresentado atividade fungitóxica (SILVA et al., 2007), o β-elemeno apresenta
atividade antitumoral in vitro e in vivo em humanos (YANG, et al., 1996), atividade
antitumoral por mecanismo imunoprotetor (WU et al., 1999), exerce efeito
citotóxico em células leucêmicas (K562) por indução de apoptose (YANG, et al.,
1996; ZOU, et al., 2001), além de exibir importante efeito antiproliferativo em
células de glioma (ZHOU, et al., 2003). Plantas que apresentam altas
concentrações de γ – muuroleno têm apresentado atividade antimicrobiana
(PORTER e WIEKINS, 1998).
Figura 3 - Cromatograma do óleo essencial de folhas de Pterodon emarginatus, onde os picos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 são: α-copaeno (1,07%); β-elemeno (7,10%); E – cariofileno (6,73%); α – humuleno (2,48%); Allo-aromadendreno (0,93%); γ - muuroleno (48,79%); biciclogermacreno (22,66%); Acifileno (7,41) e δ – cadineno (0,70%) respectivamente. IR = 100 . N [(tx – tn-1)/(tn –tn-1)] + 100. Cn-1. CBP – 5; 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), fluxo 1 mL/min de Hélio, com o gás de arraste, (60 0C /2min; 3 0C min-1/240 0C; 100C min-1/280 0C; 2080C/10min), 70 eV.
127
Os compostos E – cariofileno e α – humuleno têm demonstrado atividade
antiinflamatória e citoprotetora (TAMBE, et al., 1996). Óleos essências que
possuem o cariofileno, como composto majoritário, exibiram moderada atividade
contra bactérias gram-positivas e uma grande atividade contra Helicobater pylori
(TZAKAU e SKALTSA, 2003); demonstraram, ainda, moderada atividade
antifúngica contra dermatófitos (FLANCH et al., 2002).
Conforme relatado por Simões e Spitzer (2004), a composição química dos
óleos essenciais pode sofrer variações por diversos fatores como influência
genética decorrente de aspectos ambientais. Óleos obtidos de diferentes órgãos
de uma mesma planta podem acumular diferente constituintes, por exemplo, o
óleo das cascas da canela é rico em aldeído cinânico, enquanto que os das folhas
e raízes desse mesmo vegetal são ricos em eugenol e cânfora, respectivamente.
Em estudo realizado por Polo et al., (2004), análise qualitativa e quantitativa do
óleo essencial bruto dos frutos de P. emarginatus revelaram a presença dos
seguintes constituintes: α-pineno, mirceno, metil eugenol, etil eugenol, eugenol
geraniol, cariofileno. Os compostos observados para a folha diferem
significativamente, sendo apenas o cariofileno comum aos dois órgãos
vegetativos. Fato interessante vale ser ressaltado quanto à composição química
entre o óleo essencial dos frutos de P. polygalaeflorus obtido por Campos et al.,
(1990), (ilangeno, α – capaeno, β-cariofileno, α-humuleno, γ-elemeno e δ-cadineno
e o óleo das folhas de P. emarginatus. A composição química se assemelha muito
aos compostos observados na presente pesquisa (Tabela 1).
A abundância destes compostos provém da rota metabólica dos
isoprenóides, que culmina na formação do sesquiterpeno cujo precursor é o
farnesildifostato. Esse precursor, com a ação de monoxigenases (enzimas
ativadas pelo oxigênio) formam trans-cariofileno, germacreno-δ, α-humuleno,
entre outros (BUCCHANAM et al., 2002), os quais segundo a literatura
apresentam atividades antibacterianas, fungicidas e inseticidas. A Figura 4
apresenta a estrutura química dos quatro compostos majoritários observados para
o óleo essencial das folhas de P. emarginatus.
128
E
E
H
H
H
Figura 4 – Estrutura química dos compostos majoritários do óleo essencial das folhas de P. emarginatus, onde: I, II, III, IV, são γ-muuroleno (48,79%), biciclogermacreno (22,66%), acifileno (7,41%) e β-elemeno (7,10%), respectivamente (ADAMS, 2007).
3.3 Avaliação da atividade antifúngica do óleo esse ncial das folhas de P. emarginatus
No teste de suscetibilidade em microdiluição em caldo para determinar a
atividade antifúngica (isolados de Candida) o resultado foi negativo, ou seja, não
satisfatório, visto que o óleo não inibiu nenhum inóculo em nenhuma
concentração. Entretanto, óleos com capacidade antifúngica sobre Candida são
ricos em mirceno γ-terpineno, cimeno, timol e β-cariofileno. A atividade biológica
dos óleos essenciais tem se mostrado dependente da composição de seus
constituintes químicos como citral, pineno, cineol, cariofileno, elemeno,
furanodieno, limoneno, eugenol, eucaliptol, carvacrol e outros. Estes constituintes
são responsáveis pelas propriedades antissépticas, antibacteiranas, antifúngicas
e antiparasíticas (CRAVEIRO et al., 1981; SOUZA et al., 2005), e estes
( I ) ( II )
( III ) ( IV )
129
compostos não foram detectados ou estão presentes em quantidades ínfimas na
amostra estudada, Tabela 1. Em pesquisa realizada por Silva et al., (2005) o
extrato dos frutos inibiu o desenvolvimento micelial de Alternaria brassicae,
Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Ceratoxystis fimbriata (fungos
fitopatogênicos), mostrando-se como alternativa econômica e ecológica.
3.4 Determinação da concentração inibitória mínima do óleo essencial das folhas de P. emarginatus Vog. frente a bactérias
Os valores da concentração inibitória mínima (CIM) encontram-se
expressos na Tabela 2.
Tabela 2 – Concentração inibitória mínima (mg/mL) do óleo essencial das folhas de P. emarginatus.
NI= não houve inibição do crescimento microbiano nas concentrações utilizadas neste ensaio.
Na concentração de 0,78 mg/mL o óleo essencial das folhas de P.
emarginatus inibiu apenas Micrococcus luteus ATCC 9341. Na concentração de
6,25 mg/mL foi capaz de inibir todas as bactérias Gram-Positivas testadas com
exceção de S. aureus 2592 (CIM = 50 mg/mL) e S. epidermidis 12228 (CIM =
12,5 mg/mL), o que perfaz 70% destes microrganismos Gram-positivos avaliados.
Em relação às bactérias Gram-negativas nenhuma das concentrações do óleo
testadas neste ensaio foram capazes de inibir tais microrganismos. A ausência de
atividade inibitória do óleo essencial das folhas de P. emarginatus, sobre
Microrganismos CIM Bactéria Gram -Positivas
Staphylococcus aureus 2592 Staphylococcus epidermidis 12228 Micrococcus roseus 1740 Micrococcus luteus ATCC 9341
50 12,5 6,25 0,78
Bacillus atropheus 6633 Bacillus cereus 14756 Bacillus stearothermophylus 1262
6,25 6,25 6,25
Bactérias Gram -Negativas Enterobacter cloaceae HMA/FT502 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Escherichia coli ATCC 8739 Escherichia coli ATCC 11225 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Serratia marcescens ATCC 14756
NI NI NI NI NI NI
130
bactérias Gram-negativas, pode estar relacionada com as diferenças estruturais
que estas bactérias apresentam em relação às Gram-positivas como presença de
uma membrana externa sobre o peptideoglicano, presença de cápsula, porinas
(KONEMAN et al., 2001). Estas diferenças podem dificultar a ação dos
componentes bioativos do óleo usado na análise. Outra suposição para esta
resistência pode estar relacionada a baixas concentrações das substâncias
potencialmente ativas contra as bactérias Gram-negativas, ou mesmo que estas
não exerçam nenhuma atividade sobre estes microrganismos.
O óleo essencial analisado como já descrito anteriormente é rico em
compostos hidrocarbonetos sesquiterpênicos. Provavelmente estes compostos
estejam envolvidos na inibição dos microrganismos Gram-positivos, com atividade
antibacteriana já comprovada (ABRAHAM, 2001). Deve-se levar em conta ainda
que a moderada atividade antimicrobiana da amostra analisada possa estar
relacionada pelo grau de dificuldade observado na difusibilidade do óleo no meio
de cultura, observado pela sua baixa solubilidade em água. Portanto, a
solubilidade do óleo pode ter sido fator limitante para uma boa atividade
antibacteriana. Os principais grupos de compostos com propriedades
antimicrobianas, extraídos de plantas incluem entre outros terpenóides e óleos
essenciais (TORSSEL, 1989). Rodrigues (1996), cita diversas árvores nativas
conhecidas pela etnobotânica por terem propriedades antimicrobianas e que ao
mesmo tempo, podem preencher critérios de preservação ambiental e manejo
auto-sustentável tais como Anacardium occidentale (cajueiro), Pterodon
emarginatus (sucupira), Copaifera langsdorffii (copaíba). Em estudo realizado por
Silva et al., (2005), o óleo bruto extraído das favas moídas de P. emarginatus
inibiu o desenvolvimento micelial de Alternaria brassicae, Fusarium oxysporum,
Rhizoctonia solani e Ceratocystis fimbriata, bem como de colônias bacterianas de
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Xanthomonas campestris e
Pseudomonas syringae. Pelos resultados observados o óleo essencial das folhas
e óleo bruto dos frutos de P. emarginatus constituem fonte interessante de
compostos que podem ser extraídos para serem empregados no tratamento de
doenças bacterianas e fúngicas.
131
OH
H
H H
1
3 5
28
26
27
24
2120
1911
9
7
15
17
18
13
OH
H
H H
1
3 5
28
26
27
24
2120
1911
9
7
15
17
18
13
22
23
22
23
3.5 Resultado da investigação química do extrato etanólico brutos da s folhas de P. emarginatus Vog.
Pela análise das camadas delgadas realizadas, notou-se que as frações
C2.27 à C2.30 estavam puras e tratavam-se do mesmo composto, sendo reunidas, e
codificadas de S1 com rendimento de 8,8 mg. A substância S1 foi analisada por
RMN de 1H e 13C, e sua elucidação estrutural é apresentada. A partir da análise
dos espectros de RMN de 1H e 13C foi possível constatar que S1 trata-se de uma
mistura de fitoesteróides β-sitosterol e estigmasterol de ampla ocorrência nos
vegetais, Figura 5. Nas Figuras 6 e 7 são apresentados os espectros de RMN de
1H e 13C, obtidos para S1.
I - β-Sitosterol II - Estigmasterol
Figura 5 – Estrutura Química do β-Sitosterol e Estigmasterol
132
9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5
0.950.030.02 0.020.02 0.01 0.000.000.000.000.00
TMS
CDCl3
0.00
0.68
0.70
0.80
0.86
1.01
1.03
1.13
1.25
1.43
1.48
1.83
1.962.00
2.02
2.29
2.31
3.493.51
3.52
3.54
3.56
4.97
5.005.
025.
055.11
5.14
5.195.
36
7.26
OH
H
H H
1
3 5
28
26
27
24
2120
1911
9
7
15
17
18
13
OH
H
H H
1
3 5
28
26
27
24
2120
1911
9
7
15
17
18
13
22
23
22
23
Figura 6 – Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de S1
Estigmasterol
β-Sitosterol
Hidrogênio Carbonílico (H-3) (H-23) (H-6)
133
230 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20
CDCl3
12.0
912.2
812
.49
19.2
019.6
421
.34
23.2
825
.64
28.4
829
.16
29.9
432
.12
36.7
437
.47
40.7
442
.52
50.3
651
.46
56.1
557
.0872
.04
76.8
277
.25
77.6
7
104.
99
121.
95
129.
47
138.
5514
0.96
OH
H
H H
1
3 5
28
26
27
24
2120
1911
9
7
15
17
18
13
OH
H
H H
1
3 5
28
26
27
24
2120
1911
9
7
15
17
18
13
22
23
22
23
Figura 7 – Espectro de RMN 13C (75 MHz, CDCl3) de S1
Estigmasterol
β-Sitosterol
Carbono carbinólico
(C-3)
134
Nas Tabelas 3 e 4 são apresentados os dados de RMN 13C (75 MHz) e
RMN 1H (300MHz) respectivamente.
Tabela 3 - Dados do espectro de RMN 13C (75MHz, CDCl3) para S1 (Mistura de esteróides), estigmasterol e β-sitosterol.
Carbono S1 (mistura) (δ) Estigamsterol (δ)* β-sit osterol (δ)*
1 37,1 37,2 37,2
2 31,8 31,8 31,8
3 72,0 71,5 71,5
4 42,4 42,2 42,2
5 140,9 140,7 140,7
6 121,9 121,6 121,6
7 32,1 33,6 33,6
8 34,1 33,6 33,6
9 50,3 50,1 50,1
10 36,7 36,4 36,4
11 21,2 21,1 21,1
12 39,8 39,7 39,7
13 42,5 42,2 42,2
14 56,2 56,7 56,7
15 24,5 24,2 24,2
16 28,4 28,3 28,3
17 56,1 56,0 56,0
18 12,0 12,1 12,1
19 19,1 19,2 19,2
20 39,9 40,3 40,3
21 20,6 20,5 18,7
22 138,5/33,7 137,9 33,9
23 129,4/26,2 129,8 26,0
24 51,1/46,3 51,2 45,8
25 32,2/29,3 31,9 29,1
26 19,6 21,2 19,8
27 19,6 19,8 19,0
28 25,6/23,2 25,4 23,0
29 12,09 11,9 11,8
* KOJIMA et al., 1990.
135
3.70 3.65 3.60 3.55 3.50 3.45 3.40 3.35 3.30 3.25 3.20
Tabela 4 - Dados do espectro de RMN 1H (300MHz, CDCl3) para S1 (Mistura de esteróides), estigmasterol e β-sitosterol.
Sinal (δ) Multiplicidade
0,70 s, CH3 – C -18
0,78 s, CH3 – C -18
0,82 – 0,85 CH3 – C -19
3,53 m, HO - 3
4,9 dd, J = 8,4 e 15Hz
5,2 dd, J = 8,4 e 15 Hz
5,36 d, J= 4,73Hz
s – singleto, m – multipleto, dd – duplo dubleto, J – constante de acoplamento
O espectro de RMN 1H apresentou acúmulo de sinais relativos a
hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos, na região de 0,70 -2,27 δ, o que
indicou a presença de esteróides. O dubleto largo em 5,36 δ, (H-6; J = 5,0 Hz) e o
multipleto (Figura 8) centrado em 3,53 δ, (H-3) caracteriza o β-sitosterol na
mistura. Já a presença do estigmasterol foi deduzida pelos duplo dubletos, em δH
4,9 e 5,2 ambos com constantes de acoplamento (JHH) de 15 e 8,4 Hz, relativos
aos hidrogênios vinílicos da cadeia lateral, conforme pode ser visto na análise do
diagrama de linhas Figura 9, estes dois sinais têm deslocamento de acoplamento
similar aos reportados para o estigmasterol (KOJIMA, et al., 1990).
Figura 8 - Espectro de RMN 1H (300 MHz) expandido, multipleto centrado em 3,53 δ, (H-3).
H-3
136
145 140 135 130 125 120
C5
Figura 9 – Espectro de RMN 1H (300 MHz) expandido, com diagrama de linhas - duplo dubletos (J =15, e 8,4 Hz) em δH 4,9 e 5,2 ppm.
O espectro de 13C-RMN apresentou sinais em 140,9 e 121,9 δ
característico da ligação dupla (sp2) entre C - 5 e C - 6 e o sinal em 72,0 δ
atribuído ao C – 3 (carbono carbinólico) do β-sitosterol. Os sinais 138,5 e 129,4 δ
característicos da ligação dupla entre C - 22 e C - 23 do estigmasterol foram
observados, Figura 10.
Figura 10 – Espectro de RMN 13C (75 MHz) expandido, evidenciando os sinais (138,5 e 129,4 δ/ C-22 e C-23) e (140,9 e 121,9 δ / C-5 e C-6).
5.25 5.20 5.15 5.10 5.05 5.00 4.95 4.90 4.85 4.80 4.75 4.70
JHH=15 Hz
JHH=8,4 Hz
C6 C23
C22
137
A elucidação dos componentes ativos presentes nas plantas, bem como
seus mecanismos de ação, vem sendo um dos maiores desafios para a química
farmacêutica, bioquímica e a farmacologia. As plantas contêm inúmeros
constituintes e seus extratos, quando testados podem apresentar efeitos
sinérgicos entre os diferentes princípios ativos devido à presença de compostos
de classes ou estruturas diferentes contribuindo para a mesma atividade (MACIEL
et al.,2002).
O estigmasterol e β-sitosterol pertencem ao grupo dos fitoesteróides que
constituem uma classe de lipídios derivados de um anel saturado de quatro
membros, com um grupo hidroxil na terceira posição. No organismo, atuam na
diminuição da absorção de colesterol no intestino delgado por um mecanismo de
competição, com conseqüente aumento na excreção fecal. Isso ocorre porque a
estrutura química dos fitoesteróides é semelhante à do colesterol, diferindo
apenas no tamanho da cadeia. Biogeneticamemente estão relacionados aos
triterpenos com um esqueleto cíclico base igual os triterpenóides tetracícliclos,
apresentam-se como sólidos incolores, cristalinos, opticamente ativos, e ponto de
fusão ligeiramente inferior a 200 oC. Já foram descritos vários esteróides obtidos
de plantas e suas formas mais comuns são o campesterol, sitosterol e
estigmasterol, sendo encontrados principalmente em óleos vegetais, nozes e
hortaliças (VOLPATO, 2005).
Em estudo realizado com plantas do gênero Phyllantus, conhecidas como
“quebra-pedra” foi observado potentes efeitos analgésicos, das frações semi-
purificadas, onde obteve-se os dois fitoesteróides estigmasterol e β-sitosterol. Os
resultados farmacológicos obtidos indicaram ação equipotente à aspirina.
(SANTOS, et al., 1993; NIERO, et al., 1994). Outros estudos relatam importantes
propriedades antiinflamatórias além de demonstrar que estes compostos, quando
associados a outros esteróides, são efetivos no tratamento da hiperplasia benigna
de próstata (GOMEZ et al., 1999; SENATORE, et al., 1989). Cordeiro (2006)
relata o uso de esteróides como o estigmasterol e β-sitosterol, entre outros como
marcadores moleculares da contaminação fecal em sistema estuarino para
investigação da contaminação de esgotos domésticos. Além das atividades já
descritas Missau et al., (2006), comenta importante atividade antifúngica do
estigmasterol isolado de Poygala paniculata (barba-de-São-João, barba de bode,
138
vassourinha branca), frente a Candida albicans, C. krusei, C. glabrata, C.
parapsilosis, C. tropicalis além de Sporothrix shenkii. Pelo exposto observa-se
que os dois esteróides isolados das folhas de P. emarginatus são importantes
moléculas bioativas para o tratamento de diversas doenças.
139
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O rendimento óleo essencial das folhas de P. emarginatus apresentou-se
bem superior quando comparado ao de outras espécies observadas em revisão
bibliográfica. A análise da composição do óleo essencial mostrou semelhança a
de frutos de outra espécie do gênero e diferente dentro da mesma espécie.
Possíveis atividades anti-bacterianas e antifúngicas podem ser atribuídas aos
compostos identificados. A atividade antifúngica não verificada frente às
Candidas testadas para o óleo essencial pode estar relacionada à sua
composição. Entretanto, a presença dos compostos hidrocarbonetos
sesquiterpênicos pode conferir atividade contra outros tipos de fungos
filamentosos. A atividade antibacteriana foi moderada frente a bactérias Gram-
positivas, e ausente para bactérias Gram-negativas, porém possui significado
clínico, uma vez que a espécie em estudo é usada para tratamento de
determinadas infecções. No estudo químico do extrato etanólico bruto das folhas
foi possível isolar e identificar mistura dos esteróides estigmasterol e β-sitosterol
de ampla atividade biológica. Mediante os resultados obtidos, pode-se inferir que
o óleo essencial e os compostos isolados das folhas de P. emarginatus possuem
potencial farmacológico e econômico, podendo este farmacógeno ser explorado
para a obtenção dos compostos bioativos identificados, pois o seu processo de
obtenção utiliza as folhas sem comprometer a sobrevivência das árvores.
140
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