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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
DIEGO MOTA LOPES
ESTUDO DO PERFIL DE CÉLULAS DENDRÍTICAS DE
PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA FRENTE AO
ANTÍGENO DO SCHISTOSOMA MANSONI SM29
Salvador, BA
2013
DIEGO MOTA LOPES
ESTUDO DO PERFIL DE CÉLULAS DENDRÍTICAS DE
PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA FRENTE AO
ANTÍGENO DO SCHISTOSOMA MANSONI SM29
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Imunologia, da Universidade Federal da Bahia como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre em Imunologia.
Orientador: Profª. Drª Maria Ilma A. Santos Araújo
Co-orientadora: Profª. Drª Luciana Santos Cardoso
Salvador, BA
2013
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Universitária de Saúde, SIBI -
UFBA.
L864 Lopes, Diego Mota
Estudo do perfil de células dendríticas de pacientes com
leishmaniose cutânea frente ao antígeno do Schistosoma
mansoni Sm29 / Diego Mota Lopes. – Salvador, 2013.
66 f.
Orientadora: Profª Drª Maria Ilma A. Santos Araújo.
Co-orientadora: Profª Drª Luciana Santos Cardoso.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal da Bahia.
Instituto de Ciências da Saúde, 2013.
1. Leishmaniose Cutânea. 2. Células Dendríticas. I. Araújo,
Maria Ilma A. Santos. II. Cardoso, Luciana Santos. III.
Universidade Federal da Bahia. IV. Título.
CDU 616.993.161
A minha família pelo incentivo e apoio na
realização deste trabalho. Em particular a
Professora Luciana Santos Cardoso, exemplo de
simplicidade, persistência e sabedoria. A
Professora Maria Ilma Araujo pelo incentivo e
oportunidade.
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Edgar Carvalho, chefe do Serviço de Imunologia, pelas valiosas críticas e sugestões
ao trabalho.
À Dra. Luciana Cardoso, pelo incentivo e pelos valiosos questionamentos e ensinamentos,
auxiliando-me neste trabalho, na minha formação científica e o mais importante pelo carinho
e grande amizade.
A professora Drª Maria Ilma Araujo pelo incentivo, oportunidade e pelos valiosos
questionamentos e ensinamentos, auxiliando-me neste trabalho e na minha formação
científica.
A Jamille Fernandes, pelos ensinamentos e incentivo e por dividir comigo toda a realização
desse trabalho e também pela valorosa amizade.
A Dra. Aline Báfica, pelos ensinamentos e incentivo para a realização desse trabalho e
também pela valorosa amizade.
Aos Dr. Sérgio Costa, Alex Loukas e Alfredo Góes pela contribuição tão importante neste
estudo doando o antígeno Sm29.
Ao Lago, Dr. Luis Henrique, Dr. Paulo Machado pelo suporte na área endêmica.
A Dilceia pelo suporte na secretaria.
A todos os professores, funcionários e colegas do Programa de Pós-Graduação em
Imunologia (PPGIm).
Aos meus colegas Giuseppe Tittoni, Rafael Jabar, Andreia Souza, Robson Souza, Joanemile
Pacheco, Ricardo Riccio e Luciane Lima todos do laboratório de Alergia e Helmintíases, por
compartilharem comigo as muitas alegrias nessa caminhada.
Agradeço ao Drº Lucas Carvalho pelo ensinamento sobre o cultivo de células dendríticas e
por sempre pacientemente auxiliar na resolução das dificuldades encontradas acerca da
citometria de fluxo.
Agradeço aos meus amigos do Serviço de Imunologia, pelo carinho e amizade.
Agradecimento especial aos indivíduos participantes da pesquisa.
À minha família pelo suporte em todos os momentos.
A Deus, sempre, pela força que me dá.
RESUMO
A resposta imune do tipo Th1 na leishmaniose cutânea (LC) ao tempo em que é responsável
pelo controle da infecção, está associada com a lesão tecidual e patogênese da doença. Por
outro lado, estudos tem mostrado que a resposta imune induzida por alguns antígenos do
Schistosoma mansoni é capaz de modular a resposta inflamatória em doenças imuno-
mediadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial do antígeno de S. mansoni Sm29 em
alterar o perfil das células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) em indivíduos com
LC estimuladas in vitro com o antígeno solúvel de L. braziliensis (SLA). Células
mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram obtidas utilizando gradiente de Ficoll-
Hypaque. Foram avaliados doze pacientes com leishmaniose cutânea. Os monócitos foram
cultivados na presença de GM-CSF e IL-4 para a diferenciação em células dendríticas (DC), e
em seguida estimulados com antígeno Sm29 na presença ou ausência do antígeno SLA. A
expressão de moléculas de superfície associadas a ativação celular e de citocinas pro e anti-
inflamatórias foram avaliadas nas MoDCs pela técnica de citometria de fluxo. A frequência
dos marcadores de ativação HLA-DR, CD80, CD83 e CD86 e das moléculas regulatórias IL-
10 e seu receptor (IL-10R) foram maiores em culturas de MoDCs estimuladas com Sm29 e
SLA em comparação com as culturas de células não estimuladas. Nossos resultados indicam
que o antígeno Sm29 é capaz de aumentar a expressão in vitro de mediadores anti-
inflamatórios (citocina e receptor de IL-10) sobre MoDCs de leishmaniose cutânea e
marcadores de ativação.
Palavras-chave: Leishmaniose cutânea. Células Dendríticas. Schistosoma mansoni. Sm29.
Imunomodulação.
ABSTRACT
The Th1-type immune response in cutaneous leishmaniasis (CL) at the time that is
responsible for controlling the infection, is associated with tissue injury and disease
pathogenesis. Moreover, studies have shown that the immune response induced by S. mansoni
antigens are able to modulate the inflammatory response in immune-mediated diseases. The
aim of this study was to evaluate the potential of S. mansoni Sm29 antigen change in the
profile of the monocyte derived dendritic cells (MoDCs) in subjects with LC stimulated in
vitro with soluble antigen of L. braziliensis (SLA). Peripheral blood mononuclear cells
(PBMC) were obtained using Ficoll-Hypaque. We evaluated twelve patients with cutaneous
leishmaniasis. Monocytes were cultured with GM-CSF and IL-4 for differentiation into
dendritic cells (DC), and then stimulated with Sm29 antigen in the presence or absence of
SLA antigen. The expression of surface molecules associated with cell activation and pro-
inflammatory and anti-inflammatory properties were evaluated in MoDCs by the technique of
flow cytometry. The frequency of activation markers HLA-DR, CD83, CD80 and CD86
molecules and regulatory IL-10 and its receptor (IL-10R) were higher in cultures stimulated
with MoDCs Sm29 plus SLA compared to the unstimulated cell cultures. Our results indicate
that the Sm29 antigen is able to enhance expression in vitro anti-inflammatory mediators
(cytokines and IL-10 receptor) on MoDCs of cutaneous leishmaniasis and activation markers.
Keywords: Cutaneous Leishmaniasis. Dendritic Cells. Schistosoma mansoni. Sm29.
Immunomodulation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Resposta imune na leishmaniose tegumentar americana (LTA) 18
Figura 2 Imagem densitométrica de fluorescência não específica por tamanho
(FSC) e granulosidade (SSC) celular, identificando as populações de
células dendríticas, a partir da expressão de CD11c
31
Figura 3 Frequência de células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs)
expressando marcador de superfície CD11c, CD1a e CD83
34
Figura 4 Frequência de células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs)
expressando marcador de ativação celular HLA-DR
35
Figura 5 Frequência da expressão de CD80, CD86 e CD40 pelas células
dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs)
36
Figura 6 Frequência da expressão de IL-12 e TNF pelas células dendríticas
derivadas de monócitos (MoDCs)
37
Figura 7 Frequência da expressão de IL-10 e IL-10R pelas células dendríticas
derivadas de monócitos (MoDCs)
38
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Infecção por parasitas ou seus produtos na prevenção de doenças com
base imunológica.
24
Tabela 2 Características demográficas e clínicas dos pacientes com leishmaniose
cutânea incluídos no estudos.
33
Tabela 3 Média de intensidade de fluorescência das moléculas de superfície e
citocinas nas células dendríticas derivadas de monócitos de pacientes
com leishmaniose cutânea na presença e ausência do Sm29 células
dendríticas, a partir da expressão de CD11c.
39
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APC Células apresentadoras de antígenos
BSA Albumina bovina sérica
CD do inglês “clusters of differentiation”
CMSP Células mononucleares do sangue periférico
CTLA-4 do inglês “Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4”
CY do ingles Cycrhome
DCs do inglês “dendrític cells”
DC-SIGN do inglês "DC- specific ICAM-3 grabbing non integrin"
DTH Reação de Hipersensibilidade Tardia
FACS Citometria de fluxo (flow citometer cell sorter)
FcR Receptor Fc
FITC Isotiocianato de fluoresceína
FSC do inglês “Forward Scatter”
GM-CSF Fator Estimulador de Colônia de Granulócitos e Monócitos
HLA Antígeno leucocitário humano
IFN-γ Interferon-gama
IL Interleucina
IL-10R receptor da interleucina 10
LCL Leishmaniose Cutânea Localizada
LPS Lipopolissacarideo
LTA Leishmaniose Tegumentar Americana
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade
MIF Média de intensidade de fluorescência
NLR do inglês “Nod Like Receptor”
NO Óxido nítrico
NK do inglês "Natural Killer"
OMS Organização Mundial da Saúde
pDCs Células Dendríticas Plasmocitóides
PE Ficoeritrina
PMB Polimixina B
Sbv Antimonial pentavalente
SLA Antígeno Solúvel de Leishmania braziliensis
SFB Soro Fetal Bovino
Sm29 Antígeno recombinante do tegumento do Schistossoma mansoni
Th do inglês: “T helper”
Th1 Linfócitos T auxiliar tipo 1
Th2 Linfócitos T auxiliar tipo 2
TLR do inglês “Toll-like receptor”
TNF Fator de Necrose Tumoral
SSC do inglês “Side Scatter”
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 13
1.1 EVENTOS INICIAIS NA INFECÇÃO PELA LEISHMANIA SP. ............................ 14
1.2 IMUNOPATOGÊNESE DA LEISHMANIOSE CUTÂNEA E MUCOSA .............. 16
1.3 PARTICIPAÇÃO DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS NA PATOGÊNESE DA LTA
.......................................................................................................................................... 17
1.4 IMUNOTERAPIA NA LTA ...................................................................................... 19
1.5 ANTÍGENOS DE SCHISTOSOMA MANSONI COMO MODULADORES DA
RESPOSTA IMUNE INFLAMATÓRIA NAS DOENÇAS DO TIPO TH1 E TH2 ....... 23
2 HIPÓTESE ............................................................................................................................ 25
3 JUSTIFICATIVA .................................................................................................................. 25
4 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 26
4.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................... 26
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 26
5 METODOLOGIA .................................................................................................................. 27
5.1 SELEÇÃO DE INDIVÍDUOS NA ÁREA ENDÊMICA EM LEISHMANIOSE E
DESENHO DO ESTUDO ................................................................................................ 27
5.3 CÁLCULO AMOSTRAL .......................................................................................... 27
5.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO .................................................................................... 28
5.5 CRITÉRIOS DE NÃO INCLUSÃO .......................................................................... 28
5.6 EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES ............................................................... 28
5.7 OBTENÇÃO DOS ANTÍGENOS UTILIZADOS NO ESTUDO ............................. 28
5. 8 OBTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGUE PERIFÉRICO 29
5.9 ISOLAMENTO DOS MONÓCITOS E DIFERENCIAÇÃO EM CÉLULAS
DENDRÍTICAS................................................................................................................ 29
5.10 AVALIAÇÃO DO FENÓTIPO, DO ESTADO DE ATIVAÇÃO E DA
EXPRESSÃO DE CITOCINAS PELAS CÉLULAS DENDRÍTICAS APÓS
ESTÍMULO EM CULTURA ........................................................................................... 30
5.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................... 31
5.12 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS .................................................................................. 32
6 RESULTADOS ..................................................................................................................... 33
IQR: variação, interquartis; SD: desvio padrão ................................................................ 33
6.1 FREQUÊNCIA E ESTADO DE MATURAÇÃO DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS
DERIVADAS DE MONÓCITOS (MoDCs) ESTIMULADAS COM O ANTÍGENO DO
S.MANSONI SM29 ........................................................................................................... 34
6.2 ESTADO DE ATIVAÇÃO DAS MoDCs APÓS ADIÇÃO DO ANTÍGENO SM29
.......................................................................................................................................... 35
6.3 EFEITOS DA ADIÇÃO DO ANTÍGENO DE S. MANSONI NAS CÉLULAS
DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MONÓCITOS NA EXPRESSÃO DAS
CITOCINAS INFLAMATÓRIAS ................................................................................... 37
6.4 EFEITOS DA ADIÇÃO DO ANTÍGENO DE S. MANSONI NA EXPRESSÃO DAS
MOLÉCULAS REGULATÓRIAS EM CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE
MONÓCITOS .................................................................................................................. 38
6.5 MÉDIA DE INTENSIDADE DE FLUORESCÊNCIA (MIF) DAS MOLÉCULAS
DE SUPERFÍCIE E CITOCINAS NAS CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE
MONÓCITOS DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA ......................... 39
7 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 40
8 RESUMO DOS RESULTADOS ........................................................................................... 48
9 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 49
10 PERSPECTIVAS................................................................................................................. 50
11 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 51
12 ANEXOS ............................................................................................................................. 61
12.1 ANEXO I – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCL .......................... 61
12.3 ANEXO III – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCL para menores 64
12.4 ANEXO III – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa ........................................... 66
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa (continuação) ................................................... 67
13
1 INTRODUÇÃO
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença endêmica na América do Sul e
Central, África e Ásia, causada por uma variedade de espécies de parasitos do gênero
Leishmania transmitidos pela picada de flebotomíneos infectados. Atualmente, 88 países de
clima tropical e sub-tropical são afetados pela leishmaniose, sendo a doença considerada de
notificação compulsória em somente 32 desses países, tendo assim um número substancial de
casos não reportados (GONTIJO et al., 2003; BHATTACHARYA et al., 2006). Segundo
dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), a LTA tem sido considerada como um grave
problema de saúde pública no Brasil, sendo associada a altas taxas de morbidade (OMS,
2011). A prevalência geral é de 12 milhões de pessoas com uma população de risco de 350
milhões de indivíduos expostos à infecção, sendo a incidência da doença cutânea de 1 a 1,5
milhão de casos/ano (DESJEUX, 2001; BHATTACHARYA et al., 2006). É bastante elevada
a incidência da doença no estado da Bahia, 33.41/100.000 habitantes, sendo distribuída em
áreas de atividade agrícola, com desmatamento (BRASIL, 2010). A doença afeta indivíduos
jovens e mesmo crianças que se expõem à infecção com frequência na atividade agrícola,
atingindo indivíduos em idade produtiva (COSTA et al., 1998).
A Leishmania é um parasito intracelular que causa um amplo espectro de doenças no homem,
variando desde lesões cutâneas localizadas, na leishmaniose tegumentar americana até as
formas viscerais. Além disso, cerca de 10% dos indivíduos residentes em áreas endêmicas
apresentam teste de hipersensibilidade tardia a antígenos de Leishmania positivo (Teste de
Montenegro) e não desenvolvem a doença, caracterizando uma forma subclínica (BADARO
et al., 1986; DAVIES et al., 1995). A LTA apresenta-se clinicamente sobre quatro formas
distintas da doença: leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose mucosa (LM), leishmaniose
disseminada (LD), causadas principalmente pela L. braziliensis e leishmaniose cutânea difusa
(LCD) causada principalmente pela L. amazonensis (MARSDEN, 1990c; a; b; YURDAKUL,
2005).
É bem documentado que as diferentes manifestações clínicas da doença estão relacionadas a
fatores intrínsecos do parasita, a exemplo da espécie de Leishmania e virulência da cepa, mas
também a fatores relacionados à resposta imune do hospedeiro. A leishmaniose cutânea
localizada, representa cerca de 90 a 95% dos casos de LTA (JONES et al., 1987). Caracteriza-
se, clinicamente, por uma úlcera cutânea bem delimitada com bordas elevadas, com um fundo
geralmente granuloso (JONES et al., 1987). A lesão cutânea localizada se instala no sítio de
14
entrada do parasita após período de incubação estimado de uma a duas semanas
(GONZALEZ et al., 2009). Aproximadamente 3% dos pacientes com LC desenvolvem a
doença mucosa que afeta principalmente a região naso-faríngea, concomitantemente ou meses
após o aparecimento da úlcera cutânea (JONES et al., 1987).
1.1 EVENTOS INICIAIS NA INFECÇÃO PELA LEISHMANIA SP.
A transmissão da Leishmania se dá pela picada da fêmea de flebotomíneo infectada, que
inocula na pele do hospedeiro formas promastigotas metacíclicas infectantes, suspensas na
saliva do flebotomíneo (TITUS E RIBEIRO, 1988).
A inoculação das formas promastigotas metacíclicas induz o recrutamento de células de
defesa do hospedeiro, tais como macrófagos/monócitos, células NK e leucócitos
polimorfonucleares neutrófilos (PMN), bem como a liberação de fatores solúveis como a
proteína C reativa (PCR) e fatores do sistema complemento (SOLBACH E LASKAY, 2000).
As promastigotas metacíclicas liberam um fator quimiotático para PMN (VAN
ZANDBERGEN et al., 2002), induzindo o recrutamento destas células para o sítio da
infecção (SUNDERKOTTER et al., 1993; LAUFS et al., 2002).
Os neutrófilos são estimulados pela Leishmania a produzirem quimiocinas que atuarão no
recrutamento de granulócitos, monócitos/macrófagos, células dendríticas imaturas e linfócitos
T (MULLER et al., 2001).
Após serem inoculados na pele e durante o processo de migração através da matriz
extracelular (MEC), as formas promastigotas metacíclicas podem ser endocitadas por
macrófagos residentes na pele, células dendríticas teciduais (Langerhans), monócitos
circulantes e por neutrófilos (SALAIZA-SUAZO et al., 1999). As células de Langerhans,
funcionam, inicialmente, com um “habitat seguro” para a Leishmania em função da
deficiência de óxido nítrico sintetase induzível (iNOS, NOS-2), que não permite que essas
células produzam óxido nítrico (NO) para eliminação do parasita (BOGDAN et al., 1996;
CUNNINGHAM, 2002; MOLL et al., 2002). Dentro de poucos dias de infecção, as células
dendríticas da pele transportam o parasita do sítio da infecção na pele aos linfonodos
regionais de drenagem. Durante esta migração, se diferenciam em células dendríticas maduras
com potentes funções apresentadoras de antígeno e capacidade de ativar células T (RITTER et
al., 2004; NG et al., 2008). Como a infecção pelo parasito, de um modo geral estimula as
15
células dendríticas a produzirem interleucina 12 (IL-12) na fase inicial da infecção, estas
células se tornam fundamentais para o desenvolvimento precoce de uma resposta Th1
protetora (MOLL et al., 2002). Além disso, outras células apresentadoras de antígenos
infectadas produzem também IL-12 que atuam sobre as células NK, induzindo-as a
produzirem IFN-γ, citocina responsável pela ativação de mecanismos microbicidas dos
macrófagos (MURRAY et al., 1985; TRINCHIERI, 1995).
Em modelos experimentais de leishmaniose utilizando-se camundongos susceptíveis, a
infecção por L. major promove um aumento da expressão de receptores para IL-4 nas células
de Langerhans infectadas e, em consequência um aumento de IL-4 nos linfonodos drenantes
nos primeiros dias da infecção e diminuição da produção de IL-12. Em camundongos
resistentes a infecção por Leishmania a IL-4 não alterou a produção de IL-12, provavelmente
por não apresentarem um aumento da expressão de receptores para IL-4 após a infecção pelo
parasita, como ocorre nos camundongos susceptíveis (MOLL et al., 2002).
As formas promastigotas infectam as células de Langerhans e os PMN, mas os macrófagos
são as principais células hospedeiras para a Leishmania. A Leishmania penetra nos fagócitos
mononucleares através de endocitose mediada por receptores, dentre os quais os mais
importantes são CR1 e CR3, que se ligam respectivamente ao C3b e C3bi mediando a
fagocitose sem ativação da cascata oxidativa, que é danosa ao parasita. Outro benefício para o
parasita com o uso do receptor CR3 é que essa interação inibe a imunidade celular induzida
por IL-12. As moléculas de lipofosfoglicano (LPG) e a gp63 também estão envolvidas na
invasão dos macrófagos através da ligação com receptores CR1, CR3 e o sítio lectina-símile e
CR3 e o da fibronectina, respectivamente, como revisado por Cunningham e cols. (2002) e
por Handman e Bullen (2002).
Outros receptores, como o da manose-fucose, o CR4 e o da proteína C reativa também
auxiliam a fagocitose das promastigotas pelos macrófagos do hospedeiro (HANDMAN E
BULLEN, 2002). Esses receptores também podem estar envolvidos na penetração das
promastigotas nas células de Langerhans da pele (CUNNINGHAM, 2002). Adicionalmente,
as promastigotas interagem com outras proteínas séricas para ativar o complemento,
facilitando, então, sua fagocitose pelos macrófagos do hospedeiro (CUNNINGHAM, 2002).
Após a ligação aos macrófagos, as promastigotas sofrem endocitose para o fagossomo, que
posteriormente, pela fusão com o lisossomo, se transforma em fagolisossomo - um
compartimento ácido rico em peptídeos microbicidas e enzimas hidrolíticas (CUNNINGHAM,
16
2002; HANDMAN E BULLEN, 2002). Antígenos da Leishmania, a exemplo do LPG estão
relacionados a inibição da ativação dos mecanismos oxidativos e de vias de transdução de
sinal, favorecendo a sobrevivência do parasita nos fagolisossomos (HANDMAN E BULLEN,
2002). O equilíbrio entre fatores do hospedeiro e do parasita, que controlam a
ativação/desativação dos macrófagos determinam o curso da infecção dos parasitas dentro dos
macrófagos infectados. Corroborando com isso, tem sido mostrado em modelo experimental
que certas moléculas liberadas pelo parasita são capazes de regular o resultado final da
infecção por L.major. Recentemente demonstrou-se que na ausência de fosfoglicanos (PG)
(exemplo do LPG2 de L. major), as Leishmania são incapazes de induzir a produção de IL-4
no inicio da infecção em camundongos BALB/c (LIU et al., 2009), sugerindo que moléculas
derivadas do parasita modulam a resposta imune adaptativa do hospedeiro para favorecer a
sua sobrevivência. Similarmente, as Leishmania também podem induzir a expressão de
moléculas imunomoduladoras para inibir a ativação de macrófagos, via inibição de iNOS
(CORTEZ et al., 2011).
Ao sobreviverem aos mecanismos de eliminação do hospedeiro, as formas amastigotas, se
multiplicam por divisão binária e causam, eventualmente, a lise dos macrófagos infectados.
Assim, as amastigotas são liberadas e podem infectar células dendríticas e macrófagos
vizinhos, recomeçando o ciclo (CUNNINGHAM, 2002).
1.2 IMUNOPATOGÊNESE DA LEISHMANIOSE CUTÂNEA E MUCOSA
Do ponto de vista histopatológico as lesões de LC e LM são caracterizadas por um processo
inflamatório com linfócitos e plasmócitos e com raros ou até mesma ausência de parasitos
(BITTENCOURT E BARRAL, 1991). A despeito de existir uma resposta imune do tipo Th1
protetora, os pacientes evoluem para a doença.
Evidências vêm sendo acumuladas de que a resposta imune exacerbada é a principal causa da
lesão tecidual da leishmaniose cutânea e mucosa: 1) Células mononucleares do sangue
periférico (CMSP) de pacientes com LC e LM produzem níveis altos de IFN- e TNF
existindo uma associação entre produção de IFN- e TNF e tamanho da lesão assim como o
aparecimento de formas mais graves da doença (RIBEIRO-DE-JESUS et al., 1998;
ANTONELLI et al., 2005). 2) Células de pacientes com LM e LC quando estimuladas com
antígeno de L. braziliensis in vitro produzem pouco ou não produzem IL-10 (BACELLAR et
17
al., 2002). 3) Os níveis de TNF e IFN- no soro e em sobrenadantes de culturas de células
estimuladas com o antígeno de Leishmania diminuem significativamente após o tratamento
(DA-CRUZ et al., 1996; RIBEIRO-DE-JESUS et al., 1998; BACELLAR et al., 2002;
ANTONELLI et al., 2005). 4) Indivíduos sub-clínicos, isto é, com teste sorológico e reação
de Montenegro positivos mas que não apresentam lesões, apresentam menores níveis de INF-
γ frente à exposição a antígenos de Leishmania quando comparados com os pacientes
sintomáticos (FOLLADOR et al., 2002).
Desse modo mecanismos imunológicos na leishmaniose levam à destruição celular e tecidual,
culminando com o aparecimento da úlcera leishmaniótica que é a manifestação clínica mais
importante na LTA. A resposta imune exacerbada do tipo Th1, ao mesmo tempo em que é
importante para ativação dos macrófagos e eliminação da Leishmania é a principal
responsável pela patogênese da doença, principalmente no que se refere à lesão tecidual
(RIBEIRO-DE-JESUS et al., 1998; BACELLAR et al., 2002).
1.3 PARTICIPAÇÃO DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS NA PATOGÊNESE DA LTA
As células dendríticas (DCs) humanas são originadas de uma linhagem de célula
hematopoiética comum que irá se diferenciar em populações heterogêneas de DCs com
funções e fenótipos diferentes. São descritas três linhagens celulares diferentes a partir das
células hematopoiéticas; as células precursoras linfóides, que originarão as DCs
plasmocitoides, que são CD11c-
e importantes produtoras de INFs do tipo I; as células
precursoras das células dendríticas que originarão principalmente as células de Langerhans
(CD1a+
), também chamadas de sentinelas; e as células precursoras da linhagem mieloide que
originarão tanto as DC mieloides (CD11c+
), também chamadas de DC clássicas, quanto os
monócitos que também são capazes de diferenciarem-se nas DC clássicas (CD11c+
)
(ARDAVIN et al., 2001; WU E DAKIC, 2004; GEISSMANN et al., 2010). As células
dendríticas (DCs) participam da interface entre a imunidade inata e adaptativa (DE SAINT-
VIS et al., 1998). São reconhecidas pela capacidade de sensibilizar linfócitos T não primados,
e por contribuírem para a diferenciação funcional de células T regulatórias (YAMAZAKI et
al., 2003).
As células dendríticas parecem desempenhar importantes funções na infecção pela
Leishmania sp. Os eventos iniciais da infecção, que ocorre após a inoculação das formas
promastigotas do parasita, tem sido bastante estudado, pela possibilidade de poder explicar o
18
curso da infecção. As células dendríticas e os macrófagos constituem a primeira linha de
defesa contra a Leishmania sp, participando da captação do parasita, transporte para os
linfonodos e apresentação de antígenos para as células T, além de produzirem citocinas que
vão influenciar na resposta do hospedeiro e no curso da infecção (Figura 1).
Figura 1 – Resposta imune na leishmaniose tegumentar americana (LTA). Adaptado: Parasitologia, Amato Netto
(1a. ed., Elsewier, 2008).
Um estudo em modelo experimental mostrou que monócitos presentes no sítio da lesão
diferenciam-se em células dendríticas após a inoculação das formas promastigotas e migram
para os linfonodos regionais drenantes onde apresentam antígenos do parasita a células T
(LEON et al., 2007).
Estudos demonstram que o contato das células dendríticas com as células NK induz atividade
citolítica e produção de INF-γ por esta última (FERNANDEZ et al., 1999). Por outro lado,
células NK ativadas por IL-12 induzem a maturação de células dendríticas, levando a
produção de mais IL-12 pelas mesmas e este efeito aumenta a capacidade das DCs de
estimular linfócitos T CD4+
a se diferenciarem em Th1, que irão produzir IFN- (KANE E
MOSSER, 2000; GEROSA et al., 2002).
19
A resposta imune induzida pelas células dendríticas in vitro ou em modelo experimental de
infecção destas células com Leishmania varia de acordo com a espécie do parasito. Em DCs
humanas derivadas de monócitos (MoDCs) infectadas com L. amazonensis observou-se uma
redução na expressão de CD1a e CD80, bem como uma menor produção de IL-6 produção de
IL-6 (FAVALI et al., 2007). Por outro lado, Sanabria e cols. (2008) mostraram que a infecção
de DCs por amastigotas de Leishmania braziliensis induziu uma maior expressão de CD11c e
CD40 quando comparadas com DCs infectadas com L. amazonensis (SANABRIA et al.,
2008).
A Leishmania também interfere na sinalização intracelular das DCs, o que afeta as funções de
apresentação do antígeno, e portanto, a sua capacidade de induzir uma resposta imune eficaz
mediada por célula contra o parasita (SOONG, 2008; XIN et al., 2008). Estudos mostram que
as amastigotas de L. amazonensis podem suprimir a ativação de citocinas, a ativação de
células dendríticas mediada por TLR-4 e produção de IL-12 via degradação rápida de
proteínas de sinalização intracelular, em particular as associadas com JAK/STAT e NFkB, via
fator regulador de interferon (IRF) (XIN et al., 2008).
A infecção de células dendríticas de camundongos por promastigotas de L. braziliensis induz
a produção de altos níveis de TNF, o que pode contribuir para uma resposta local de controle
parasitário (CARVALHO et al., 2008). Tsagozis e cols., (2004) observaram que
camundongos BALB/c infectados com L. major tiveram uma redução na formação das lesões
e da carga parasitária ao serem imunizados com células dendríticas pulsadas com peptídeos
sintéticos ou nativos de gp63 de Leishmania sp, mostrando a importância da manipulação das
células dendríticas no curso da infecção (TSAGOZIS et al., 2004).
1.4 IMUNOTERAPIA NA LTA
A forte associação entre a resposta imune do hospedeiro e a patogenia da infecção por
Leishmania faz com que a modulação da resposta imune seja uma das estratégias mais
estudadas para o controle e a prevenção da leishmaniose.
A falência terapêutica observada com tratamento convencional de leishmaniose com o
antimonial pentavalente (Sbv
) em todas as formas clínicas da doença e as reações adversas
relacionadas a dose e duração do tratamento apontam para a necessidade de novas estratégias
de tratamento (AREVALO et al., 2007). As observações de que a imunoterapia adjuvante,
20
além de diminuir o tempo de cicatrização das lesões, é efetiva para o tratamento de formas
resistentes tornam essa perspectiva terapêutica a mais promissora atualmente (BUATES E
MATLASHEWSKI, 1999; ALMEIDA et al., 2005).
Embora a maioria dos pacientes sejam curados com o uso de antimonial pentavalente (Sbv), a
necessidade de usar doses elevadas e por um longo período de tempo muitas vezes resulta no
aparecimento de toxicidade, que pode impedir a manutenção da droga (AREVALO et al.,
2007). Adicionalmente, muitos pacientes podem precisar de nova série de tratamento,
aumentando a incidência de efeitos colaterais e o custo do tratamento. Falha terapêutica tem
sido relatada em até 37% dos casos (SAENZ et al., 1991), enquanto um estudo realizado em
Corte de Pedra/BA documentou que 17% dos pacientes com LTA, causada por L. braziliensis,
tratados com Sbv , apresentam recidiva em períodos variáveis de tempo (NETTO et al., 1990).
Diversos efeitos colaterais têm sido associados ao uso de Sbv, incluindo atralgia, mialgia, dor
abdominal, náuseas, cefaléia, cardiotoxicidade, elevação de enzimas hepáticas e de enzimas
pancreáticas. A anfotericina B é a melhor opção para os pacientes com LM não responsivos
ao antimonial pentavalente, porém seu emprego requer hospitalização e sua utilização é
limitada pela toxicidade (MARSDEN, 1994).
Associação de alguns imunomoduladores com a terapia clássica tem sido estimulada, no
sentido de diminuir o tempo de cura da doença, aumentando o processo de cicatrização da
lesão. O imiquimod é um imunomodulador para uso tópico como creme. Esta droga exibe
atividade antiviral in vitro em modelos experimentais. Tem sido utilizada para o tratamento de
verrugas genitais por HPV (COX et al., 2004). O imiquimod foi efetivo para o tratamento da
leishmaniose induzida em camundongos e in vitro ativa macrófagos contra a Leishmania
(BUATES E MATLASHEWSKI, 1999). Estudos mostram que pacientes com leishmaniose
cutânea resistentes ao tratamento com antimonial isolado mostrou cura clínica em 90% dos
casos quando associado com o imiquimod (AREVALO et al., 2001).
Atualmente, a imunoterapia com vacinas e a modulação da resposta imune, através do uso de
citocinas e fatores de crescimento, constituem alternativas promissoras na profilaxia e no
tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana. Pesquisas de novas modalidades
terapêuticas para o tratamento da leishmaniose têm sido empreendidas para tentar diminuir os
efeitos colaterais que ocorrem com o uso de antimonial e anfotericina B, facilitar o tratamento
nas áreas endêmicas da doença, diminuir o tempo de tratamento e os índices crescentes de
falha terapêutica. Diante desse quadro e das dificuldades de tratamento é que a imunoterapia
associada passa a ser uma alternativa a ser explorada.
21
A pentoxifilina, uma droga capaz de de inibir a produção de TNF tem sido utilizada para o
controle da resposta exacerbada causada por esta citocina na leishmaniose (DOHERTY et al.,
1991). Bafica et al. (2003), num estudo aberto, testaram a pentoxifilina oral associada ao
antimoniato de N-metil-glucamina em 2 pacientes com leishmaniose cutânea que não
responderam à monoterapia com antimonial, obtendo-se resultados satisfatórios com rápida
cura das lesões (BAFICA et al., 2003).
Machado et al. (2007), realizaram um ensaio clínico randomizado, duplo-cego e controlado
com placebo, com 23 pacientes com leishmaniose mucosa, onde 11 foram tratados com a
associação antimonial e pentoxifilina, e 12 com o antimonial e placebo. Constatou-se que
todos os 11 pacientes (100%) tratados com antimonial e pentoxifilina foram curados,
enquanto que apenas 5 dos 12 (41,6%) do grupo tratado com antimonial e placebo
apresentaram cura das lesões, sendo necessário um segundo ciclo de administração de
antimonial pentavalente. Além disso, o tempo de cura do grupo da pentoxifilina foi menor em
comparação com o grupo placebo. Assim, a pentoxifilina contribui evitando a necessidade de
ciclos adicionais de antimonial pentavalente e reduzindo significativamente o tempo de
tratamento, de maneira segura e eficiente, reduzindo a exposição dos pacientes aos efeitos
tóxicos do antimônio pentavalente (MACHADO et al., 2007).
Estudos prévios têm mostrado que o fator estimulador de colônia de granulócitos e
mononuclear recombinante (rhGM-CSF), que é uma glicoproteína com papel importante no
crescimento de células hematopoiéticas induzindo o crescimento de colônias maduras de
granulócitos e/ou macrófagos (METCALF E BURGESS, 1982), pode alterar a resposta
imune à Leishmania em humanos, por aumento da ativação macrofágica, indução de
cicatrização e fibrose, e/ou por indução de uma resposta imune Th1 e uma apresentação mais
eficaz de antígenos (LIESCHKE E BURGESS, 1992; JONES, 1993; MANN et al., 2006).
Estudos vêm demonstrando que o rhGM-CSF desempenha papel importante não só na
velocidade de formação de cicatriz, quanto na sua qualidade (ALMEIDA et al., 1999; MANN
et al., 2006). Almeida e cols. (1999) utilizando GM-CSF injetável nas bordas das úlceras de
pacientes com LC, associado à administração endovenosa de antimonial, observaram uma
redução em mais de 50% do tempo total de cura das lesões dos pacientes (ALMEIDA et al.,
1999). Outro estudo realizado pelo mesmo grupo, mostrou que a administração de antimonial
com curativo oclusivo de GM-CSF obtiveram cura de 100% do cinco pacientes portadores de
LC refratária (ALMEIDA et al., 2005).
22
Esta modulação parece estar associada à produção de citocinas regulatórias como a IL-10,
desde que estudo realizado por Lehmann (1998) demonstrou que GM-CSF é capaz de
aumentar em cerca de dez vezes a expressão de RNAm de IL-10, citocina imunomodulatória
(LEHMANN, 1998). Adicionalmente, o tratamento com GM-CSF e antimônio aumentou
significativamente a produção de IL-10 por células mononucleares do sangue periférico em
comparação ao grupo tratado com antimonial isoladamente (LEHMANN, 1998).
A IL-10 é produzida por uma variedade de células, a exemplo dos linfócitos TCD4+, TCD4
+
CD25+, TCD8
+, monócito/macrófagos, células dendríticas e linfócitos B (BELKAID et al.,
2002). Ela é uma potente moduladora da proliferação de linfócitos TCD4+
e da produção de
citocinas antígeno-específico do tipo Th1 por estas células, inibe a produção de óxido nítrico
(NO) pelos monócitos e macrófagos, e a capacidade de apresentação de antígenos pelos
monócitos através da diminuição da expressão de moléculas de MHC classe II e moléculas
co-estimulatórias, a exemplo de CD80, CD86 e ICAM-1 (O'GARRA E VIEIRA, 2004).
Um estudo realizado por Faria e colaboradores mostrou que a diminuição da exposição in situ
do receptor de IL-10, foi correlacionada com a resposta inflamatória exacerbada em pacientes
com LM (FARIA et al., 2005). A presença de um equilíbrio entre a produção de citocinas Th1
e Th2 e entre a resposta imune protetora e a modulação dessa resposta, como observada em
indivíduos com a forma subclínica da infecção causada por L. braziliensis (FOLLADOR et al.,
2002), indica que a modulação da resposta imune pode ser fundamental para evitar o
aparecimento de lesões teciduais nos indivíduos que estão expostos à infecção. O dano
tecidual observado na leishmaniose cutânea e mucosa é também consequência da
incapacidade do hospedeiro de controlar esta resposta. Esse fenômeno torna ainda mais
relevante no contexto onde a refratariedade ao tratamento com antimonial pentavalente (Sbv)
e a presença da recidiva se associam aos diversos efeitos colaterais devidos ao uso parenteral
de Sbv
ou anfotericina B, limitando o controle adequado da doença. Todos esses fatores
ressaltam a importância de pesquisar novas modalidades terapêuticas que contribuam para
facilitar o tratamento nas áreas endêmicas tendo como base o conhecimento dos mecanismos
da imunopatogênese da LTA e como a imunoterapia pode contribuir para a prevenção da
lesão inflamatória associada a essa doença ou diminuir tempo de cura da lesão.
23
1.5 ANTÍGENOS DE SCHISTOSOMA MANSONI COMO MODULADORES DA
RESPOSTA IMUNE INFLAMATÓRIA NAS DOENÇAS DO TIPO TH1 E TH2
Evidências vêm sendo acumuladas de que a infecção crônica por helmintos, particularmente
pelo Schistosoma sp ou produtos do parasita, é capaz de modular a resposta inflamatória do
tipo Th1 e Th2 nas doenças de base imunológica. Em modelo experimental de doenças com
resposta imune exacerbada do tipo Th1 como na doença de Crohn, diabetes melitus tipo 1 e
esclerose múltipla a modulação se dá tanto pela indução de citocinas regulatórias a exemplo da
IL-10 e TGF-b quanto pelo desvio imune Th1/Th2. Nas doenças mediada pela resposta do tipo
Th2 como a asma a infecção por helmintos também é capaz de diminuir a produção das
citocinas, aumentar a produção de IL-10 e assim controlar a doença (Tabela 1) (ARAUJO et
al., 2000; ARAUJO et al., 2004; PACIFICO et al., 2009; CARDOSO et al. 2010). Estudos
realizados pelo nosso grupo do Serviço de Imunologia-UFBA mostraram que asmáticos
infectados pelo S. mansoni residentes em áreas endêmicas em esquistossomose não responde
aos testes cutâneos de alergia (ARAUJO et al., 2000), possuem uma forma branda da doença
(MEDEIROS et al., 2003), e que células desses pacientes produzem concentrações mais
baixas de citocinas do perfil Th2 e mais elevadas da citocina regulatória IL-10 em resposta a
alérgenos, quando comparado com asmáticos não infectados (ARAUJO et al., 2004). Foi
demonstrado também que proteínas recombinantes do S. mansoni, a exemplo da proteína do
tegumento do verme adulto, a Sm29 induz a produção de IL-10 por células de asmáticos não
infectados, sendo os macrófagos e as células TCD4+CD25
+ as principais fontes dessa citocina
(CARDOSO et al., 2010). Em modelo murino de asma induzida pela ovalbumina, a injeção de
Sm29 foi capaz de modular a resposta inflamatória alérgica pulmonar (CARDOSO et al.,
2010).
Adicionalmente tem sido demonstrado que a infecção pelo Schistosoma mansoni, ou produtos
do parasita, é também capaz de modular a resposta inflamatória do tipo Th1 envolvida em
algumas doenças auto-imunes, a exemplo do diabetes tipo I, artrite e psoríase (COOKE et al.,
1999; SEWELL et al., 2002; LA FLAMME et al., 2003; ATOCHINA E HARN, 2006). Sabe-
se que na leishmaniose cutânea a resposta Th1 é associada com o desenvolvimento da lesão
tecidual. Estudos realizados pelo nosso grupo, mostraram que a adição do antígeno Sm29 do
Schisotossoma mansoni às culturas de células mononucleares de sangue periférico de
indivíduos com leishmaniose cutânea foi capaz de aumentar in vitro a produção de IL-10 e
24
reduzir a produção das citonicas inflamatórias INF-γ e TNF por estas células (BAFICA et al.,
2012).
Tabela 1: Infecção por parasitas ou seus produtos na prevenção de doenças com base
imunológica.
Adaptado de Elliot et al, 2007.
O antígeno LNFPIII, um carboidrato encontrado no antígeno solúvel do ovo do Schistosoma
mansoni, promove a resposta Th2 in vivo, o recrutamento de macrófagos moduladores
(OKANO et al., 2001), e a diferenciação de células dendríticas não primadas para o tipo 2
(DC2), por uma via dependente de TLR-4 (THOMAS et al., 2003). Em apoio aos achados
deste trabalho, foi observado que um antígeno do S. mansoni, a fosfatidilserina, estimula o
TLR-2 em indivíduos não primados (VAN DER KLEIJ et al., 2004). Em outro estudo,
Vabulas e col., (2001) demonstraram que a proteína HSP60 é também reconhecido pelo TLR-
2 (VABULAS et al., 2001), mas o papel dos TLR no reconhecimento de proteínas ainda é
pouco estudado.
Diante destes dados da literatura de que infecções helmínticas ou produtos dos parasitas
podem interferir no desenvolvimento de doenças mediadas pela resposta do tipo Th1, neste
estudo foi testada a habilidade do antígeno do S. mansoni, Sm29, em modular a ativação de
células dendríticas de pacientes com leishmaniose cutânea.
25
2 HIPÓTESE
O antígeno Sm29 do S. mansoni é capaz de induzir um perfil regulatório nas células
dendríticas derivadas de monócitos de indivíduos com leishmaniose cutânea.
3 JUSTIFICATIVA
A leishmaniose acomete parcelas significativas da população mundial e sua importância
ganha destaque no Brasil, principalmente no Nordeste. A compreensão da relação parasito –
hospedeiro é essencial para a elucidação dos mecanismos de infecção e patogênese da doença,
principalmente dos fatores envolvidos no desenvolvimento das lesões teciduais na forma
cutânea e mucosa da leishmaniose. As células dendríticas são as principais células
apresentadoras de antígeno participantes da resposta imune inata e que, consequentemente,
determinam o direcionamento da resposta imune adaptativa. Desta forma, é de fundamental
importância à identificação de antígenos capazes de alterar o estado de ativação das células
dendríticas e desse modo controlar a resposta inflamatória exacerbada na leishmaniose
cutânea e mucosa. Estudos que visam à caracterização das células dendríticas em pacientes
com leishmaniose tegumentar, procurando elucidar as principais consequências e alterações
na resposta imune do hospedeiro, são importantes para o controle desta doença.
26
4 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a capacidade do antígeno do S. mansoni, Sm29 em modular a ativação das células
dendríticas derivadas de monócitos in vitro em indivíduos com leishmaniose cutânea.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Em células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) de indivíduos com leishmaniose
cutânea, avaliar in vitro:
1. A frequência e o estado de maturação das MoDCs estimuladas com o antígeno solúvel de
Leishmania (SLA) na presença do antígeno Sm29 do S. mansoni, através da expressão de
CD11c, CD1a e CD83;
2. A capacidade do antígeno Sm29 do S. mansoni em modular a ativação das células
dendríticas, através da expressão das moléculas de superfície HLA-DR, CD80, CD86 e CD40;
3. A capacidade do antígeno Sm29 em modular a expressão de citocinas inflamatórias IL-12 e
TNF pelas células dendríticas;
4. O efeito da adição do antígeno Sm29 às culturas de células dendríticas estimuladas com
antígeno solúvel de L. braziliensis, sobre a expressão das moléculas regulatórias IL-10 e
receptor de IL-10.
27
5 METODOLOGIA
5.1 SELEÇÃO DE INDIVÍDUOS NA ÁREA ENDÊMICA EM LEISHMANIOSE E
DESENHO DO ESTUDO
Participaram do estudo indivíduos com diagnóstico de leishmaniose cutânea, residentes na
área endêmica de Corte de Pedra. O diagnóstico foi realizado pelo achado de lesão típica,
que se caracteriza por uma lesão ulcerada associada ao teste positivo de hipersensibilidade
tardia ao antígeno de Leishmania braziliensis (Reação de Montenegro) ou pela
histopatologia compatível com leishmaniose cutânea. Os indivíduos foram negativos para a
infecção pelo S. mansoni, nos três exames parasitológicos de fezes solicitados. A partir da
seleção, ressalvados os critérios de exclusão referidos adiante, os primeiros 20 indivíduos
com leishmaniose cutânea não tratados que compareceram ao posto de saúde de Corte de
Pedra foram admitidos no estudo.
Devido a problemas técnicos, houve a perda de amostras de oito pacientes, ficando o
tamanho amostral final de 12 pacientes. Não houve diferença em relação a idade, o gênero e
o tamanho da lesão nos indivíduos que não foram incluídos nos resultados, comparados
àqueles incluídos no estudo (dado não mostrado).
5.3 CÁLCULO AMOSTRAL
O tamanho da amostra foi calculado em 20 pacientes, para um poder de 80% e erro α de
0,05, levando em consideração a produção de TNF nos sobrenadantes de macrófagos de
quatro pacientes com LTA e de 8 controles sadios, sendo os níveis de 147 ± 130 pg/ml e 36
± 41pg/ml, respectivamente (p=0,02; Mann Whitney test). Considerando que TNF é uma
importante citocina inflamatória e que diferenças significantes na produção desta citocina
entre os grupos têm sido demonstradas, foi usada a maior diferença relativa encontrada entre
os grupos e a menor média do desvio padrão como parâmetro para calcular o tamanho da
amostra para estes experimentos. Neste estudo só foi possível avaliar células de 12 pacientes,
sendo que 8 indivíduos foram excluídos devido a dificuldade em adquirir uma concentração
de monócitos suficientes para a realização do estudo.
28
5.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
a) indivíduos com diagnóstico de leishmaniose cutânea pré-tratamento.
b) ambos os gêneros;
c) idade entre 10 a 60 anos;
d) parasitológico de fezes negativo para S. mansoni em pelo menos uma de três amostras.
5.5 CRITÉRIOS DE NÃO INCLUSÃO
Não foram incluídos no estudo, pela possibilidade de alteração da resposta imune, os
indivíduos que estavam nas condições abaixo relacionadas:
a) Indivíduos tratados para leishmaniose;
b) Gestantes;
c) Portadores de doenças crônicas, ou em uso de drogas imunossupressora;
5.6 EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES
As análises coproparasitológicas foram realizadas através da técnica de sedimentação
espontânea – Hoffmann-Pons-Janer ou método de Lutz, para a determinação da infecção
parasitária.
5.7 OBTENÇÃO DOS ANTÍGENOS UTILIZADOS NO ESTUDO
Expressão e purificação da proteína recombinante do S. mansoni Sm29
O gene que codifica a proteína Sm29 do S. mansoni encontra-se clonado no vetor de
expressão pET21 em cepas de Escherichia coli BL21 (DE3). A proteína é purificada por
cromatografia de afinidade com resina de níquel (Amersham, Biosciences, São Paulo), que se
liga aos resíduos de histidina e é eluída por competição com o ácido imidoacético.
Este antígeno vem sendo gentilmente cedido pelo Dr. Sérgio Costa Oliveira do Laboratório
de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas/ICB - Universidade de
Minas Gerais (UFMG) ao Serviço de Imunologia para utilização nos Projetos que avaliam o
29
efeito dos antígenos de S. mansoni sobre as doenças inflamatórias que cursam com a
exacerbação da resposta imune do tipo Th1 e Th2.
Obtenção do antígeno solúvel de L. braziliensis (SLA)
O antígeno bruto da Leishmania, SLA vem sendo produzido no nosso laboratório como
previamente descrito (REED et al., 1986; GIUDICE et al., 2012).
5. 8 OBTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGUE PERIFÉRICO
Foram coletados 40 ml de sangue total heparinizado dos indivíduos com leishmaniose
cutânea. Células mononucleares de sangue periférico (CMSP) foram obtidas através do
gradiente de Ficoll-Hypaque e ajustadas para concentração de 5 x 106
células/ml em RPMI
1640 completo (100 l/ml de gentamicina, L-glutamina 2mM, 30mM HEPES), contendo
10% de Soro Fetal Bovino inativado (Life technologies GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).
Em seguida as CMSP foram incubadas a 37oC, 5% de CO2 por 2 horas em placas de 6 poços,
para aderência dos monócitos e posterior diferenciação destas em células dendríticas.
5.9 ISOLAMENTO DOS MONÓCITOS E DIFERENCIAÇÃO EM CÉLULAS
DENDRÍTICAS
O isolamento dos monócitos e diferenciação em células dendríticas foi realizado de acordo
com protocolo previamente descrito (SALLUSTO F., e cols., 1994). Resumidamente, após
incubação, o sobrenadante foi descartado e as células aderidas à placa foram lavadas duas
vezes com 2 ml de NaCl 0,9% a 37°C para retirar as células não aderidas. Os monócitos
aderidos à placa foram recolhidos pela adição de 2ml Glicose/EDTA contendo 3mM EDTA,
10mM Glicose em PBS 1X, pH 7.2, gelado. Em seguida foi adicionado 3ml/poço de RPMI
completo contendo 800UI/ml de IL-4 e 50ng/ml de GM-CSF (Peprotech) em placas de 6
poços e 2 x 106
monócitos/ml (50μL) na região central do poço. A placa foi então incubada a
37oC, 5% de CO2 por 7 dias. A cada três dias, retirou-se 1ml e adicionou-se 1ml, por poço, de
meio RPMI completo com IL-4 e GM-CSF. Após sete dias de cultura, as DCs foram
coletadas lavando-se os poços 3x com solução salina.
30
5.10 AVALIAÇÃO DO FENÓTIPO, DO ESTADO DE ATIVAÇÃO E DA EXPRESSÃO
DE CITOCINAS PELAS CÉLULAS DENDRÍTICAS APÓS ESTÍMULO EM CULTURA
Após obtenção das MoDCs, suspensões com 3 x 105 células foram incubadas em placas de
96 poços por 16 horas a 37ºC, 5% de CO2 na presença ou ausência do antígeno Sm29 (10
μg/μl) e do SLA (5 μg/μl). As células foram então marcadas com os anticorpos monoclonais
anti-CD11c- APC (clone 3.9), anti-CD1a-FITC (clone HI149), anti-IL-10Rα-PE (anticorpo
policlonal), anti-CD40-PerCP-e Fluor 710 (clone 5C3), anti-CD80-PerCP-e Fluor 710
(clone 2D10.4), anti-CD86-PE (clone IT2.2), anti-CD83-PE-Cy7 (clone HB15e), anti-HLA-
DR- PerCP-Cy5.5 (clone LN3) (todos da eBioscience) e mantidas a 4ºC, protegidas da luz
por 30 minutos. Após a marcação das moléculas de superfície, as placas foram lavadas com
PBS contendo azida sódica, fixadas com 200 l de formaldeído a 2% em PBS e mantidas a
4°C até o dia seguinte. Após a incubação, foram adicionados 20L/poço de brefeldina
diluída 10x e realizada nova incubação sob as mesmas condições por 4 horas. Após esta
etapa, as placas foram centrifugadas e incubadas com 150l/poço do tampão de
permeabilização, por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, foi feita
marcação intracelular, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-IL-10-APC (clone JES3-
19F1, BD Pharmingen), anti-IL-12-PE (clone C8.6, eBioscience) e anti-TNF-PeCy7 (clone
Mab11, eBioscience), seguido de incubação por 20 minutos à temperatura ambiente,
protegido da luz. Em seguida foram feitas sucessivas lavagens utilizando-se o tampão de
permeabilização, seguida de ressuspensão das células em 200 L de solução de lavagem e
transferência para tubos de leitura do FACS. A aquisição foi realizada utilizando-se o
aparelho FACSCanto (Becton Dickinson), num total de 100.000 eventos.
As células dendríticas foram analisadas de acordo com a frequência da expressão dos
marcadores de superfície celular usando o programa “FlowJo”. As populações celulares foram
definidas por fluorescência inespecífica a partir da dispersão frontal (FSC) e lateral (SSC)
como parâmetros de tamanho e granulosidade celular, respectivamente. De acordo com as
características celulares, foi feita a seleção das populações de DCs por janelas nesta
população (Figura 2). A frequência das populações duplo positivas foi realizada a partir da
seleção das células CD11c+, como mostrado na figura 2. Nesta população foi avaliada a
frequência de expressão de CD14+, uma vez que as células vão perdendo a expressão desta
molécula à medida que se diferenciam em células dendríticas (Figura 2).
31
Figura 2 - Imagem densitométrica de fluorescência não específica por tamanho (FSC) e granulosidade (SSC)
celular, identificando as populações de células dendríticas, a partir da expressão de CD11c. Plot representativo
de um experimento.
5.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados dos marcadores celulares por citometria de fluxo foram expressos em
percentagem de positividade do total de células, ou percentagem de positividade dentro de um
grupo celular específico. No caso da expressão de HLA-DR, CD80, CD86, CD83 e CD40
também foi utilizada a intensidade de expressão (MIF – Média da intensidade de
fluorescência), uma vez que praticamente todas as células dendríticas são positivos para estes
marcadores.
A proporção de células positivas para os diferentes marcadores foi expressa em porcentagem
e a comparação entre os grupos foi realizada utilizando-se o teste Friedman, sendo
considerado significativo um valor de P < 0,05.
32
5.12 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica Universidade Estadual da
Bahia/ UNEB (Aprovação número 0603110287514).
Os métodos utilizados para as avaliações não causaram prejuízos aos pacientes, além daqueles
inerentes aos procedimentos usuais para o diagnóstico da doença. O estudo proposto além de
não ter oferecido riscos, proporcionou aos pacientes um acompanhamento clínico. Antes de
entrar no estudo, todos os pacientes foram informados sobre a natureza da pesquisa. A
voluntariedade na participação desse projeto se fez mediante assinatura dos participantes ou
de seus representantes legais, do termo de consentimento, seguindo as normas do Ministério
da Saúde.
Foram respeitados aqueles que não quiseram participar ou que não consentiram na realização
dos exames necessários. Estes receberam tratamento e atenção médica do mesmo modo que
os participantes do estudo. Após ter sido convidado a participar do estudo o paciente pode
desistir em qualquer momento sem que houvesse qualquer prejuízo em relação ao tratamento
e acompanhamento. Todas as coletas e manuseio de material biológico foram realizados
utilizando medidas de segurança padronizadas.
33
6 RESULTADOS
Foram avaliados 12 pacientes com leishmaniose cutânea sendo 6 indivíduos do gênero
masculino e 6 feminino. A média de idade foi de 33 ± 6 anos. A maioria dos pacientes
apresentou apenas uma lesão (91,7%) e apenas um paciente apresentou mais de uma lesão
(8,3%; Tabela 2).
Tabela 2: Características demográficas e clínicas dos pacientes com leishmaniose cutânea
incluídos no estudo.
Características (n=12) Valores
Idade (anos) (média ± SD) 33,25 ± 6.44
Sexo (feminino / masculino) 6/6
Lesões [n(%)]
1
≥ 2
11 (91,7%)
1 (8,3%)
Tamanho da lesão [mediana mm² (IQR)] 120 (4-140)
IQR: variação, interquartis; SD: desvio padrão
34
6.1 FREQUÊNCIA E ESTADO DE MATURAÇÃO DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS
DERIVADAS DE MONÓCITOS (MoDCs) ESTIMULADAS COM O ANTÍGENO DO
S.MANSONI SM29
A frequência das MoDCs estimuladas com SLA na presença ou ausência de Sm29 foi
avaliada in vitro através da expressão das moléculas CD11c e CD1a. A adição do Sm29 não
alterou a frequência de MoDCs (CD1a+CD11c
+) (Figura 3A). A frequência das MoDCs foi
similar em todos os grupos avaliados sendo 97% (91%-99%) para as culturas sem estímulo,
97% (92%-99%) estimuladas com Sm29, 98% (93%-99%) para as culturas estimuladas com
SLA apenas e 98% (90%-99%) nas culturas estimuladas com SLA na adição do Sm29 (Figura
3A). Em relação ao estado de maturação destas células foi avaliada a expressão da molécula
CD83. Observou-se que a adição do Sm29 às culturas de MoDCs estimulados com SLA
[27,5% (16%-68%)] e nas culturas não estimuladas com SLA [42% (16%-75%)] resultou em
maior frequência de MoDCs expressando CD83 comparadas as culturas sem estimulo [19%
(11%-39%); p< 0,005; Figura 3B].
Figura 3. Frequência de MoDCs expressando CD1a e CD11c (A) e de MoDCs expressando CD83 (B) em
culturas de células de indivíduos com leishmaniose cutânea (n=12) estimuladas com SLA na presença ou
ausência do antígeno Sm29 do S. mansoni. Os resultados foram expressos como mediana, valores min. - max.. e
percentis. *p<0,05; Teste de Friedman.
35
6.2 ESTADO DE ATIVAÇÃO DAS MoDCs APÓS ADIÇÃO DO ANTÍGENO SM29
Os marcadores de ativação das MoDCs foram avaliados através da expressão de HLA-DR e
das moléculas co-estimulatórias CD80, CD86 e CD40. A adição do antígeno Sm29 as culturas
estimuladas com SLA aumentou a expressão de HLA-DR pelas MoDCs [84 (41-98) MIF]
quando comparadas as culturas não estimuladas [82 (55-97) MIF; p<0,05; Figura 4].
Figura 4. Média de Intensidade de Fluorescência (MIF) da expressão de HLA-DR pelas MoDCs de pacientes
com leishmaniose cutânea na presença do antígeno recombinante de Schistosoma mansoni Sm29 (n=12). Os
resultados foram expressos como mediana, valores min. - max.. e percentis. *p<0,05; Teste de Friedman.
A expressão das moléculas co-estimulatórias CD80, CD86 e CD40 também foram avaliadas
(Figura 5A, 5B e 5C, respectivamente). A adição do Sm29 as culturas de MoDCs estimuladas
com SLA resultou no aumento da frequência de células expressando CD80 [13,5% (3%-
39%)] comparado as culturas sem estímulo [3,9% (2%-12%); p< 0,0001] ou estimuladas com
SLA apenas [6,3% (2,4%-17%); p<0,05]. A estimulação com SLA também resultou no
aumento da frequência de células expressando CD80 [6,3% (2,4%-17%)] comparado com as
culturas sem estimulo [3,9% (2%-12%); p< 0,005; Figura 5A]. Em relação à frequência de
MoDCs expressando CD86, observou-se que a adição do Sm29 nas culturas estimuladas com
SLA resultou no aumento destas células [95,5% (81%-99,5%)] assim como nas culturas
estimuladas apenas com o SLA [93,5% (50%-99%)] quando comparadas com as culturas não
estimuladas [80,5% (40%-95%) p<0.005] (Figura 5B). Adicionalmente a expressão de CD86
em MoDCs em culturas estimuladas com SLA na presença de Sm29 [269 (97-456 MIF)] foi
maior que nas células não estimuladas [194 (89-245)]. A frequência de MoDCs expressando
CD40 foi similar entre os grupos avaliados, sendo 25,25% (11,10%-72,90%) para as culturas
sem estímulo, 31,35% (11,5%-63,5%) para as estimuladas com Sm29, 36,55% (12,2%-
36
65,3%) nas culturas estimuladas apenas com SLA e 56% (13%-88%) nas culturas estimuladas
com SLA na presença do Sm29 (Figura 5C).
Figura 5 – Frequência da MoDCs expressando CD80 (A), CD86 (B) e CD40 (C) em culturas de células de
pacientes com leishmaniose cutânea (n=12). Os resultados foram expressos como mediana, valores min. - max..
e percentis. *p<0,05; **p<0,005 e ***p<0,001; Teste de Friedman.
Fre
qu
ênci
a %
37
6.3 EFEITOS DA ADIÇÃO DO ANTÍGENO DE S. MANSONI NAS CÉLULAS
DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MONÓCITOS NA EXPRESSÃO DAS CITOCINAS
INFLAMATÓRIAS
Células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) de pacientes com leishmaniose cutânea
foram incubadas com SLA na presença ou ausência do antígeno de S. mansoni e a expressão
de citocinas inflamatórias (IL-12 e TNF) foi avaliada. A adição do antígeno Sm29 nas
culturas estimuladas ou não com SLA não levou a diferença significativas na frequência de
MoDCs expressando interleucina 12 e TNF (Figuras 6A e B) e nem na média de intensidade
de fluorescência destas citocinas (Tabela 3). A frequência da citocina IL-12 nas MoDCs nos
grupos avaliado foi 1,4% (0,4%-3,05%) nas culturas sem estímulo ou 1,75% (0,5%-4,3%)
estimuladas com Sm29, 1,45% (0,3%-3,3%) nas culturas estimuladas apenas com SLA e
1,6% (0,5%-3,0%) nas culturas estimuladas com SLA na adição do Sm29, respectivamente
(Figura 6A). A frequência da citocina TNF nas MoDCs também foi similar entre todos os
grupos avaliado sendo 1,45% (0,5%-2,7%) para as culturas sem estímulos ou 1,75% (0,6%-
3,1%) estimuladas com Sm29, 1,40% (0,3%-2,8%) culturas estimuladas com SLA apenas e
1,5% (0,7%-3,1%) nas culturas estimuladas com SLA na adição do Sm29, respectivamente
(Figura 6B).
Figura 6 – Frequência de MoDCs expressando IL-12 (A) e TNF (B) em culturas de células de pacientes com
leishmaniose cutânea (n=12). Os resultados foram expressos como mediana ( valores min. – max. e percentis).
38
6.4 EFEITOS DA ADIÇÃO DO ANTÍGENO DE S. MANSONI NA EXPRESSÃO DAS
MOLÉCULAS REGULATÓRIAS EM CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE
MONÓCITOS
Quando se avaliou a frequência de MoDCs expressando a citocina regulatória IL-10
observou-se que, tanto as culturas estimuladas com Sm29+SLA [2,3% (0,8-4,1%)] ou com
Sm29 apenas [1,8% (0,5-3,8%)] apresentaram maiores frequências dessas células expressando
IL-10, comparado as culturas sem estímulo [1,3% (0,3%-2,3%); p< 0,005; Figura 7A e 7B].
Em relação à expressão do receptor da interleucina 10 (IL-10R) nas culturas estimuladas com
Sm29+SLA houve maior frequência de MoDCs expressando esta molécula [4,3% (3,3%-
9,8%)] em comparação as culturas não estimuladas [1,4% (0,2%-3,7%); p<0,005],
estimuladas apenas com SLA [2,5% (1,2%-3,8%), e com Sm29 apenas [2,7% (2,2%-4,8%);
Figura 7C].
Figura 7 – Frequência de MoDCs expressando IL-10 (A, e B) e IL-10R (C) em indivíduos com leishmaniose
cutânea (n=12). Os resultados foram expressos como mediana (valores min. – max. e percentis). *p<0,05 e
**p<0,005; Teste de Friedman. Plot representativo de um paciente.
39
6.5 MÉDIA DE INTENSIDADE DE FLUORESCÊNCIA (MIF) DAS MOLÉCULAS DE
SUPERFÍCIE E CITOCINAS NAS CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE
MONÓCITOS DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA
A Tabela 3 mostra a média da intensidade de fluorescência (MIF) das moléculas co-
estimulatórias CD80, CD86 e CD40, das citocinas inflamatórias IL-12 e TNF e da molécula
regulatória IL-10 e seu receptor. Quando se avaliou a MIF destas moléculas em culturas
estimuladas com o SLA na presença ou ausência do antígeno recombinante Sm29 do S.
mansoni não se observou diferenças significantes, a exceção da maior expressão (MIF) de
CD86 nas culturas estimuladas com Sm29+SLA [269 (97-456 MIF)], comparadas as culturas
sem estímulo [194 (89-245 MIF); p<0,005].
Tabela 3: Média de intensidade de fluorescência (MIF) das moléculas de superfície e citocinas nas células
dendríticas derivadas de monócitos de pacientes com leishmaniose cutânea estimuladas com o antígeno solúvel
de Leishmania (SLA) na presença ou ausência do antígeno recombinante Sm29 do S. mansoni
Sem Estímulo
SLA
SLA+Sm29
Sm29
Moléculas co-estimulatórias
CD80 222 (90-362) 292 (98-490) 284 (87-703) 310 (108-622)
CD86 194 (89-245) 203 (102-310) 269 (97-456)* 252 (95-365)
CD40 186 (30-410) 186 (38-454) 213 (45-435) 212 (44-444)
Citocinas inflamatórias
IL-12 82 (41-398) 116 (12-400) 93 (24-350) 75 (13-380)
TNF 150 (78-278) 161 (63-303) 168 (121-398) 170 (112-294)
Moléculas regulatórias
IL-10 118 (72-743) 514 (89-835) 335 (104-765) 589 (87-872)
IL-10R 257 (46-644) 220 (83-397) 422 (163-1588) 224 (73-467)
Os valores foram expressos em média de intensidade de fluorescência. Mediana (min. – Max).
* p<0,005, Teste de Friedman. SLA+Sm29 vs Sem Estímulo.
40
7 DISCUSSÃO
Algumas doenças parasitárias decorrem da exacerbação da resposta imune do eixo
Th1/inflamatória, como no caso da leishmaniose cutânea e mucosa. A resposta imune celular
do tipo Th1, com produção de IFN-, ao tempo em que é importante para eliminação da
Leishmania, pela estimulação macrofágica, quando exacerbada está associada à destruição
tecidual observada nas formas cutânea e mucosa (BACELLAR et al., 2002). Os eventos
iniciais na infecção pela Leishmania sp, envolvendo os macrófagos e as células dendríticas na
produção de citocinas e na apresentação de antígenos do parasita para células T, devem
influenciar a resposta do hospedeiro e o curso da infecção (DE SAINT-VIS et al., 1998).
Desse modo, o ambiente celular associado ao perfil de citocinas pró-inflamatórias e anti-
inflamatórias é importante para controlar a multiplicação parasitária sem causar danos ao
hospedeiro (BELKAID, 2003; CARVALHO et al., 2005).
Existem evidências na literatura de que a infecção por Schistosoma spp. ou seus produtos,
protegem contra o desenvolvimento de doenças mediadas tanto pela resposta imune do tipo
Th1, quanto do tipo Th2, como revisado por Elliott e cols. (2007) (ELLIOTT et al., 2007).
Nosso grupo tem realizado alguns estudos na tentativa de caracterizar antígenos do S.
mansoni com propriedades regulatórias, que permitam modular o processo inflamatório
associado às doenças de base imunológica, a exemplo da asma (CARDOSO et al., 2006;
PACIFICO et al., 2009; CARDOSO et al., 2010), da infecção pelo HTLV-1 (LIMA, 2013, in
press) e da leishmaniose (BAFICA et al.; 2011; BAFICA et al., 2012). A identificação de
antígenos parasitários com propriedades modulatórias tem sido estimulada, desde que tem
sido demonstrado que tanto a infecção como produtos derivados dos patógenos são capazes
de modular doenças não relacionadas.
Os mecanismos responsáveis por esse fenômeno vêm sendo avaliados, contudo sabe-se que
este efeito modulador não depende do parasita vivo, haja visto que antígenos oriundos desses
patógenos possuem essa mesma propriedade moduladora (VELUPILLAI et al., 2000). Estes
mecanismos incluem a indução da produção de células e moléculas regulatórias a exemplo de
células T CD4+
e das moléculas CTLA-4 e IL-10 (ZACCONE et al., 2003; YANG et al., 2007;
ZHENG et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2009; PACIFICO et al., 2009; CARDOSO et al.,
2010; BAFICA et al., 2011).
O presente estudo avaliou a capacidade do antígeno de Schistosoma mansoni Sm29 em alterar
o perfil de resposta das MoDCs de pacientes com leishmaniose cutânea. A escolha do
41
antígeno Sm29 decorreu do fato deste antígeno induzir a expressão de células e moléculas
regulatórias, a exemplo da IL-10, tanto em estudos realizados in vitro em PBMC de
indivíduos asmáticos (CARDOSO et al., 2012) como em modelo experimental de asma
(CARDOSO et al., 2010).
Estudo realizado por Bafica e cols. (2011) demonstrou que a adição do antígeno Sm29 do S.
mansoni às culturas de PBMC de pacientes com LC foi capaz de aumentar a produção de IL-
10 em uma parcela significativa de pacientes, além de diminuir a produção das citocinas
inflamatórias TNF e INF-γ. Desde que, na leishmaniose as células dendríticas podem ser
determinantes da evolução da doença e que antígenos do S. mansoni são capazes de modular a
exacerbação dos processos inflamatórios nas doenças imuno-mediadas, o racional para este
estudo foi que o antígeno Sm29 possuiria a capacidade de induzir um perfil regulador nas
células dendríticas de pacientes com leishmaniose cutânea.
Foi observado que a presença do Sm29 não alterou a diferenciação das MoDCs, uma vez que
a frequência de células expressando CD1a+CD11c
+ foi semelhante nas diferente condições de
estímulos. A maioria dos estudos que apresentaram diminuição destas células são referentes a
modelos de infecção pela Leishmania. Um estudo realizado por Donovan e cols. (2007)
mostrou que infecção por L. major e L. donovani foi capaz de inibir a expressão de CD1a por
células dendríticas, diminuindo a sua habilidade em reconhecer patógenos e assim responder
aos seus estímulos (DONOVAN et al., 2007). Monócitos humanos cultivados na presença de
L. amazonensis apresentaram uma expressão diminuída de CD1a levando a uma a
diferenciação incompleta em células dendríticas (DONOVAN et al., 2007). Estas MoDCs
apresentaram ainda uma redução na capacidade de apresentação antigênica às células T
quando co-cultivadas com linfócitos (FAVALI et al., 2007). Desse modo, a não alteração na
expressão desta molécula observada neste estudo mostrou que o antígeno Sm29 não interfere
na habilidade de reconhecimento antigênico mediado por CD1a nas MoDCs.
Estudos tem mostrado que a infecção por helmintos ou a estimulação in vitro com antígenos
parasitários são capazes de diminuir a diferenciação, pela expressão de CD1a e o estado de
maturação, através da expressão de CD83 das células dendríticas derivadas de monócitos,
tanto de indivíduos infectados pelos helmintos, como de controle sadios (RIGANO et al.,
2007; FUJIWARA et al., 2009). Adicionalmente, MoDCs obtidas a partir de voluntários
sadios estimuladas com o antígeno de cestódeo Taenia crassiceps (TcES) foram capazes de
inibir a resposta inflamatória após estímulo pelo LPS, indicando que a estimulação com
42
antígeno parasitário foi capaz de modificar a resposta a um antígeno não relacionado
(TERRAZAS et al., 2011).
Quando se avaliou a influencia do antígeno Sm29 no estado de maturação das MoDCs,
através da presença da molécula CD83, observou-se que houve um aumento na frequência de
células expressando esta molécula na presença do Sm29 em culturas estimuladas ou não com
o SLA. Diferentes patógenos podem influenciar de maneira distinta a maturação e ativação
das células dendríticas e assim afetarem o desfecho da infecção (STEINMAN et al., 2003;
TERRAZAS et al., 2011). Corroborando com os achados deste estudo, um trabalho publicado
recentemente por Terrazas e cols. (2011) mostrou que a adição de antígeno TcES da T.
crassiceps às culturas estimuladas com LPS levaram a um aumento na expressão de CD83
pelas MoDCs, entretanto a presença do TcES sozinho não alterou o estado de maturação
destas células. No nosso estudo o Sm29 foi capaz de aumentar a frequência de MoDCs
expressando CD83. Favali e cols. (2007) mostraram que a infecção de MoDCs com L.
amazonensis ou o estímulo com SLA não alteraram a capacidade de maturação destas células
(FAVALI et al., 2007). O processo de maturação é uma etapa importante para as DCs por
tornarem-nas aptas a apresentarem antígenos às células T, bem como para aumentar sua
capacidade em produzir citocinas. Estudos mostram que a exposição de DCs a antígenos
parasitários, incluindo os derivados de helmintos, podem resultar em uma maturação limitada
destas células (SEGURA et al., 2007; CARVALHO et al., 2009), o que não foi também
observado no nosso estudo.
O estado de ativação das células dendríticas são importantes portanto para estimular os
linfócitos T a montarem uma resposta imune efetora. Nosso estudo avaliou a média de
intensidade de fluorêscencia (MIF) da molécula de ativação HLA-DR e a expressão das
moléculas co-estimulatórias CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) e CD40. Foi observado uma maior
expressão de HLA-DR e de CD83 nas MoDCs na presença do Sm29, enquanto que a
frequência das células expressando CD80 e CD86 foi também aumentada pela adição do
Sm29 às culturas.
Em estudo realizado com modelo experimental foi observado um aumento da frequência de
células dendríticas infectadas com Leishmania sp. expressando a molécula de ativação MHC
de classe II e as moléculas co-estimulatorias (CD40 e CD86) (MAROVICH et al., 2000;
CARVALHO et al., 2008). Estudo publicado por Carvalho e cols. (2008) mostrou que DCs
derivadas de medula óssea de camundongos não infectadas (bystanter), presentes no ambiente
de DCs infectadas com L. braziliensis apresentaram maior estado de ativação em relação às
43
infectadas por L. braziliensis. Este dado sugere que células dendríticas bystander são capazes
de responder a antígenos parasitários mesmo na ausência de infecção (CARVALHO et al.,
2008). Em MoDCs de indivíduos saudáveis foi demonstrado que tanto a presença da infecção
pela L. amazonensis ou a estimulação com SLA não alteram a expressão das moléculas MHC
de classe II, CD80 e CD86 em relação as DCs não cultivadas com o parasita ou estimuladas
com SLA (FAVALI et al., 2007).
Corroborando com nossos dados, Everts e cols. (2010) após estimular DCs com antígeno de S.
haematobium, mostraram uma maior expressão de HLA-DR nas DCs comparadas com as
células não estimuladas (EVERTS et al., 2010). Por outro lado, um estudo avaliando DCs
derivadas da medula óssea de camundogos estimuladas com uma molécula derivada do A.
lumbricoides (ABF), não observou um aumento na expressão das moléculas MHC classe II,
CD80 e CD86 após o estímulo (DOWLING et al., 2011). As controvérsias observadas na
literatura poderiam estar associadas ao modelo do estudo, a espécie da Leishmania e ao tipo
de célula dendrítica estudado.
Em relação à molécula co-estimulatória CD40, sabe-se que sua interação com o seu ligante
CD40L (CD154) controla muitos aspectos da imunidade celular, incluindo a ativação de
células T mediadas pelas DCs (CAUX et al., 1994). Tem sido demonstrado um papel
importante desta molécula na proteção contra Leishmania, pela indução da produção de IL-12
pelas DCs (QI et al., 2001). A sinalização via CD40 por células dendríticas presentes no local
da infecção pode contribuir para o desenvolvimento de uma resposta imune protetora
(MAROVICH et al., 2000). Neste estudo não se observou diferença na frequência de MoDCs
expressando a molécula CD40 pela presença do Sm29. Estudo experimental realizado por
Dowling e cols. (2011) mostrou que a estimulação de DCs com ABF de A. lumbricoides não
afetou a frequência de expressão da molécula de CD40 por estas células (DOWLING et al.,
2011).
É bem documentado que a resposta imune na leishmaniose é do tipo Th1/inflamatória, sendo
o IFN- a citocina responsável pela ativação do macrófago e consequentemente destruição da
Leishmania. Neste contexto, as citocinas IL-12 e TNF tem um papel importante no desvio da
resposta para o polo Th1 e no controle da infecção, respectivamente. Por outro lado, uma
resposta imune inflamatória exacerbada com alta produção de IL-12 e TNF, bem como uma
falta de resposta regulatória, está associada ao desenvolvimento de lesões na LC
(BACELLAR et al., 2002).
44
Diante disso, seria desejável que houvesse um equilíbrio na resposta imune, onde os
macrófagos continuassem ativados a matarem as leishmanias, mas que esta ativação não fosse
exacerbada. Neste contexto as DCs estimuladas com o antígeno Sm29 poderiam fornecer a
regulação necessária para controlar o processo inflamatório.
Alguns estudos com células dendríticas derivadas de monócitos humanos, estimuladas in vitro
com antígeno solúvel do ovo de S. mansoni (SEA) ou com antígenos derivados de ovos do S.
mansoni apresentaram um fenótipo do tipo 2 (conhecidas como DC2) capazes de auxiliar na
diferenciação dos linfócito Th0 para Th2 (DE JONG et al., 2002; AGRAWAL et al., 2003).
Este poderia ser um mecanismo adicional pelo qual as DCs estimuladas com antígenos de
helmintos são capazes de regular a resposta imune do tipo Th1. No entanto, semelhante ao
que é visto com as DCs murinas, DCs humanas produzem pouco IL-12p70, TNF ou IL-10 em
resposta ao SEA (DE JONG et al., 2002; VAN DER KLEIJ et al., 2002; AGRAWAL et al.,
2003). No estudo de Dowling e cols. (2011) a estimulação de DCs derivadas da medula óssea
de camundongos C57BL/6 com LPS seguido pelo extrato antigênico ABF de A. lumbricoides
modulou a produção de IL-12p70, a despeito da ausência de aumento na expressão de CD40,
sugerindo que a molécula CD40 não seria essencial para indução da produção de IL-12 por
estas células (DOWLING et al., 2011). No nosso estudo não foi observado aumento na
frequência de MoDCs expressando IL-12 ou TNF, assim como no MIF destas citocinas
quando estimuladas com o antígeno Sm29 do S. mansoni. Este resultado poderia ser
justificado tanto pela ausência de sinalização via CD40L, uma vez que na cultura de DCs os
linfócitos não estão presentes, como a baixa produção de IL-12 poderia ocorrer por um
mecanismo independente da sinalização via CD40-CD40L, como observado por Dowling e
cols. (2011).
Os principais mecanismos de modulação da resposta imune incluem a produção de células e
moléculas reguladoras, a exemplo das células Treg e das moléculas CTLA-4 e IL-10. A IL-10
é produzida por uma variedade de células da resposta imune a exemplo dos macrófagos,
linfócitos TCD4+CD25
+, linfócitos B, células NK e células dendríticas. Tem sido
demonstrado que a IL-10 inibe a diferenciação de células dendríticas e suprime a produção de
quimiocinas inflamatórias e citocinas do tipo Th1 e Th2 em alguns modelos (SHER et al.,
1991; DEL PRETE et al., 1993). Desde que tem sido demonstrado que existe uma baixa
produção de IL-10 na LC (BACELLAR et al., 2002) e que antígenos de S. mansoni induzem
a produção de IL-10 (BAFICA et al., 2011; CARDOSO et al., 2012), neste estudo foi então
avaliado a expressão desta citocina e do seu receptor nas MoDCs.
45
Observamos que o antígeno do S. mansoni Sm29 levou a um aumento na expressão de IL-10
pelas MoDCs de indivíduos com LC nas culturas estimuladas ou não com SLA. Tanto nosso
grupo como outros grupos tem mostrado um aumento na produção desta citocina estimulada
por antígenos de helmintos, tanto in vitro em PBMC de humanos, como em modelo
experimental de doença que cursa com resposta imune do tipo 1 (BAFICA et al.; 2011;
BAFICA et al., 2012) e do tipo Th2 (VAN DER KLEIJ et al., 2002; CARDOSO et al., 2006;
CARDOSO et al., 2010; CARDOSO et al., 2012). Um dos mecanismos para explicar o forte
potencial regulatório dos antígenos parasitários seria a proteção do hospedeiro contra
inflamação excessiva, garantindo a sobrevivência do parasita (BELKAID et al., 2001).
Na leishmaniose uma das células que contribuem com a produção de IL-10 são as células
dendríticas, como observado neste estudo, onde existe alguma produção de IL-10 pelas
MoDCs estimuladas com SLA. Embora pequenas quantidades de IL-10 são encontradas em
sobrenadantes de PBMC de indivíduos com LC e LM estimulados com antígenos de
Leishmania, estudos nas lesões destes pacientes têm documentado a presença de IL-10
secretada por macrófagos e por células T reguladoras (CD4+CD25
+Foxp3
+) (CAMPANELLI
et al., 2006; BOURREAU et al., 2009; FARIA et al., 2009). A IL-10 auxilia no controle de
células mediadoras do desenvolvimento da lesão na leishmaniose (POWRIE et al., 1994; JI et
al., 2005). Na LM observa-se uma falta de resposta a IL-10, em parte explicado pela
regulação negativa do receptor de IL-10 nas lesões de pacientes com LM que apresentam uma
diminuição no número de células que expressam receptor de IL-10 e uma diminuição na
intensidade da expressão deste receptor, quando comparada com pacientes com LC (FARIA
et al., 2005).
Algumas evidências sugerem um papel regulatório para as células dendríticas durante a
infecção por Leishmania. Apresentou-se, em um modelo murino, que um subconjunto de
células de Langerhans (células dendríticas) poderia favorecer o recrutamento de células Treg
para o local da infecção, agravando a doença. Este subconjunto de DC foi capaz de promover
a expansão Treg in vitro (KAUTZ-NEU et al.; 2011). Essas DC reguladoras, chamadas de
“DCs reg” são capazes de converter as células T naive em células Treg secretoras de IL-10.
Estudos em modelo murino de asma demonstram a existência de DC regulatórias que
apresentam um fenótipo totalmente maduras e que expressam níveis elevados de moléculas
co-estimulatórias e estimulam células T regulatórias via um mecanismo dependente de IL-10
(AKBARI et al., 2001). Em humanos, DC derivadas de monócitos e estimuladas com
prostaglandina E2 (PGE2) e TNF exibem um perfil de células maduras, caracterizado por
46
elevada expressão de moléculas co-estimulatórias e citocinas pró inflamatórias, mas que
suprimem a ativação das células T por meio de uma combinação de fatores, como IL-10 e
indoleamina 2,3 deoxygenase (IDO) (POPOV et al., 2006; POPOV E SCHULTZE, 2008).
Além disso, foi demonstrado que DCs com características intermediarias entre os estado
imaturos e maduros que expressam moléculas co-estimulatórias, mas baixos níveis de
citocinas inflamatórias, tais como IL-12, IL-6 e TNF, também são caracterizadas por função
reguladora (LUTZ E SCHULER, 2002). DCs expostas a IL-10 não conseguem induzir
citocinas imunoestimulantes, tais com IL-12 (DE SMEDT et al., 1997).
O papel das DC reguladoras na resposta imune geral contra este patógeno não está esclarecido.
Sabe-se que verminoses promovem a imunossupressão local no hospedeiro, permitindo que o
parasita alcance uma sobrevivência de longo prazo, que é geralmente associada com uma
infecção local crônica (TAYLOR et al., 2005). Recentemente, Li e colaboradores (2011)
descreveram um subconjunto de DC que ocorre naturalmente com atividade de regulação no
modelo murino de infecção pelo nematódeo Heligmosoides poligyrus. Essas DC reg após a
infecção por H. poligyrus promoveram a diferenciação in vitro de Treg (LI et al., 2011). No
entanto, mais estudos são necessários para realmente entender os mecanismos que levam à
função regulatória observado nas DCs.
Nosso estudo mostrou que, assim como a IL-10, a frequência de células expressando o
receptor desta citocina está aumentada nas culturas estimuladas com Sm29, mesmo na
presença do SLA. Existem poucos estudos avaliando in vitro células de indivíduos infectados
pela L. braziliensis. Um estudo publicado por Faria e cols. (2005) mostrou que a deficiência
de expressão do receptor de IL-10 na lesão estaria associada à resposta exacerbada observada
na leishmaniose mucosa, quando comparada a LC. Outros estudos com o receptor de IL-10 na
leishmaniose referem-se na sua maioria a modelos experimentais de infecção, outras espécies
de leishmanias e formas clínicas da doença (BELKAID et al., 2001; MURRAY et al., 2002;
MURRAY et al., 2003). Estes estudos relacionam a diminuição da expressão desse receptor à
persistência parasitária e ao aumento do tempo de cura da lesão.
Diante disto, uma resposta imune equilibrada deve ser a chave para o controle da resposta
exacerbada e, consequentemente do processo inflamatório associado a patogênese da LC.
Nosso estudo mostrou que o antígeno Sm29 do S. mansoni possui potencial para induzir esta
resposta desejada. Sabe-se que o uso das proteínas recombinantes em imunologia representa
uma importante ferramenta na pesquisa. Essas proteínas têm sido utilizadas para estudos dos
mecanismos de regulação da resposta imune do hospedeiro e dos mecanismos envolvidos na
47
resistência e susceptibilidade para doenças parasitárias. Esses resultados poderão fornecer
subsídios para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento de doenças que
cursam com a ativação excessiva ou inapropriada da resposta imune, a exemplo da LTA.
48
8 RESUMO DOS RESULTADOS
1. A adição do Sm29 as culturas de MoDCs estimuladas com SLA resultaram em:
Aumento da frequência de MoDCs expressando CD83, CD80 e CD86 e do MIF de
HLA-DR;
Aumento da frequência de MoDCs expressando IL-10 e IL-10R.
2. A presença de Sm29 as culturas de MoDCs não alterou a frequência destas células e
nem a frequência destas células expressando CD40, IL-12 e TNF.
49
9 CONCLUSÃO
As MoDCs na presença do antígeno Sm29 nas culturas apresentam-se como células maduras,
ativadas e com perfil regulatório. Este antígeno, entretanto não alterou a frequência de
MoDCs expressando as citocinas IL-12 e TNF.
50
10 PERSPECTIVAS
1. Avaliar a capacidade do Sm29 em modular a ativação e a produção das citotocinas
inflamatórias IL-12 e TNF por células dendríticas de pacientes com leishmaniose
cutânea e de controles saudáveis infectadas com L. braziliensis;
2. Avaliar o efeito da adição do antígeno Sm29 às culturas de células dendríticas
infectadas com L. braziliensis, sobre o perfil dos linfócitos TCD4+ e TCD8
+;
3. Avaliar a produção de citocinas (IL-12, TNF e IL-10) em sobrenadantes das co-
culturas de células dendríticas infectadas com L. braziliensis e linfócitos em resposta
ao SLA, na presença do antígeno Sm29.
51
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61
12 ANEXOS
12.1 ANEXO I – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCL
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PARTICIPAR
DO ESTUDO
Nome do Projeto: Estudo do perfil de células dendríticas de pacientes com leishmaniose
cutânea frente ao antígeno do Schistosoma mansoni Sm29.
Investigador Principal: Maria Ilma Andrade Santos Araújo, Médica, Serviço Imunologia,
Hospital Universitário Prof. Edgard Santos – UFBA, Rua João da Botas s/n, Canela, CEP
40.110-160, Salvador-BA
Nome do Paciente:_____________________________________________________
Convite e Objetivo:
Você está sendo convidado(a) a participar de um estudo que tem como objetivo avaliar se
produtos do verme Schistosma mansoni são capazes de prevenir a inflamação que causa lesão
cutânea nan leishmaniose. Esta participação implica na sua concordância em submeter-se,
periodicamente, durante um ano, aproximadamente, a exames para determinar a presença de
leishmaniose e esquistossomose, que consistem em: responder a um questionário com
perguntas sobre essa doenças, submeter-se a exames clínicos, além da coleta de amostras de
sangue e de amostras de fezes.
Além das informações aqui presentes você pode perguntar tudo sobre o estudo ao seu médico.
Participação Voluntária:
A sua participação no estudo é voluntária e você estará contribuindo para o melhor
entendimento da sua doença. Você é livre para recusar a participar do estudo, ou se retirar em
qualquer época após o seu início sem afetar ou prejudicar a qualidade e a disponibilidade da
assistência médica que lhe será prestada.
Finalidade do estudo:
Este estudo tem a finalidade de avaliar se a proteína do S. mansoni é capaz de prevenir o
desenvolvimento de resposta inflamatória de células dendríticas na leishmaniose cutânea.
62
Procedimentos:
Caso concorde em participar do estudo, você receberá os frascos coletores de fezes, que
deverão ser devolvidos, para que possamos realizar os exames parasitológicos. Em seguida,
você doará 40mL de sangue venoso, que será coletado por profissional capacitado para tal,
com o auxílio de seringas e agulhas descartáveis.
Duração do Estudo: Após a assinatura do termo de consentimento, sua participação no
estudo terá uma duração máxima prevista de 12 meses.
Confidencialidade:
Qualquer informação obtida durante este estudo será confidencial sendo apenas compartilhada
com outros membros da equipe. Os resultados serão divulgados na forma de comunicação
científica, não permitindo a identificação individual dos participantes.
Análise dos Riscos e Benefícios:
A retirada de sangue venoso é um procedimento médico de rotina e, em casos raros pode
provocar dor leve e sangramento após retirada da agulha. Caso isso aconteça, todos os
cuidados serão tomados por profissionais devidamente habilitados.
Retorno dos Benefícios para o Sujeito e para a Sociedade:
Estudos que contribuem para identificação dos mecanismos envolvidos na proteção da
leishmaniose por produtos do S. mansoni podem levar ao desenvolvimento de novos
tratamentos para estas doenças.
As pessoas que se submeterem aos exames receberão, se desejarem, os resultados dos
mesmos. No caso de detectarmos a presença de parasitas intestinais, você será tratado
gratuitamente.
Custos:
Você não terá custos com a participação no estudo e nem receberá pagamento por sua
participação.
Esclarecimentos:
Qualquer dúvida que você tenha sobre o que está escrito neste consentimento ou sobre os
procedimentos que constam desse projeto de pesquisa, poderá entrar em contato com Dra.
63
Maria Ilma Araujo, coordenadora do projeto, médica do Serviço de Imunologia do HUPES-
UFBA, João das Botas, s/n – Canela, telefone (071) 3237-7353, ou com o Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Estadual da Bahia- Rua Silveira Martins nº 2555- Cabula –
Salvador/Bahia/Brasil – CEP. 41150-000. Tel. (71) 31172445.
Consentimento:
Se você leu o consentimento livre e esclarecido ou este lhe foi explicado e você concorda em
participar voluntariamente deste estudo, favor assinar o nome abaixo. A você será entregue
uma cópia deste formulário.
__________________________________
Assinatura do Participante ou Responsável
__________________________________
Assinatura do Pesquisador
Local:___________________________ Data_____/_____/_____ e Hora:_________
64
12.3 ANEXO III – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCL para menores
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA MENORES DE
IDADE (MENORES DE 18), PARA O ESTUDO DA RESPOSTA IMUNE
Projeto: Estudo do perfil de células dendríticas de pacientes com leishmaniose cutânea frente
ao antígeno do Schistosoma mansoni Sm29.
Investigador Principal : Maria Ilma Andrade Santos Araújo, Hospital Universitário Prof.
Edgard Santos, Rua João das Botas s/n, Canela, 40110-160, Salvador-Bahia- Brazil.
Comitê de Ética: Universidade Estadual da Bahia- Rua Silveira Martins nº 2555- Cabula –
Salvador/Bahia/Brasil – CEP. 41150-000. Tel. (71) 31172445.
Nome do paciente: ___________________________________________________
Número de Identificação no Projeto:_____________________________________
Convite e objetivo: Você está sendo convidado a participar de um estudo científico. O
propósito deste estudo é avaliar se substâncias do verme Schistosma mansoni são capazes de
prevenir a inflamação que causa a leishmaniose. As principal doença que nós estudaremos
será a leishmaniose, mas nós daremos atenção a outras infecções.
Nós perguntaremos a você sobre a sua saúde. Um médico fará exame físico em você. Isto não
causará dor em você. Em seguida iremos solicitar amostra de fezes para avaliar a
possibilidade de estar com alguma verminose. Então, nós tiraremos um pouco de sangue
(cerca de quatro colheres de sopa) de seu braço usando uma seringa e agulhas descartáveis
para realizar alguns exames que ajudarão a explicar a doença. Nós esperamos através deste
estudo esclarecer mais sobre estaa doença, entendê-las e assim poderemos preveni-las no
futuro.
Você pode não participar deste estudo, caso não queira. Se você aceita participar, por
favor, assine ou coloque sua impressão digital abaixo.
_____________________________________________________________________
65
Assinatura ou impressão do paciente Data Hora
_____________________________________________________________________
Assinatura ou impressão do responsável Data Hora
_____________________________________________________________________
Testemunha Data Hora
COMPROMISSO DO PESQUISADOR
Discuti as questões acima apresentadas com os participantes do estudo ou com o seu
representante legalmente autorizado.É minha opinião que o indivíduo entende os riscos,
benefícios e direitos relacionados a este projeto.
___________________________________ ___________________
Assinatura do pesquisador Data Hora
66
12.4 ANEXO III – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
67
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa (continuação)