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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

SUZAN VITÓRIA GIRÃO LIMA

PESQUISA MICROBIOLÓGICA EM CALOPSITAS (Nymphicus hollandicus)

ORIUNDAS DE PET SHOPS E RESIDÊNCIAS DE FORTALEZA, CEARÁ

FORTALEZA - CEARÁ

2016

SUZAN VITÓRIA GIRÃO LIMA

PESQUISA MICROBIOLÓGICA EM CALOPSITAS (NYMPHICUS HOLLANDICUS)

ORIUNDAS DE PET SHOPS E RESIDÊNCIAS DE FORTALEZA, CEARÁ

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da

Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará, como requisito parcial para

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Veterinárias.

Orientador: Prof. Dr. William Cardoso Maciel

Co-orientador: Dr. Régis Siqueira de Castro

Teixeira

FORTALEZA - CEARÁ

2016

Ao meu pai, pelo cuidado especial nesses anos

de mestrado e de vida

À minha mãe, pela esperança que sempre

ilumina meus dias e horas

Aos meus melhores amigos, Débora Nishi e

Anderson Vieira, por me lembrarem que ainda

existem pessoas sãs em meio à loucura

Aos animais, pela jornada que enfrentamos

juntos

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo e cada parte.

À Universidade Estadual do Ceará e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

(PPGCV), pela oportunidade de cumprir essa jornada.

Ao Laboratório de Estudos Ornitológicos - LABEO, pela oportunidade de conhecer o mundo

das aves e da pesquisa científica.

Ao meu orientador Prof. Dr. William Cardoso Maciel, pelo incentivo ao trabalho científico no

início da minha vida acadêmica, e contínuo apoio durante minha carreira científica.

Ao Dr. Régis Siqueira de Castro Teixeira, Super Régis, meu co-orientador, pelo apoio

científico, pelas conversas filosóficas, pelos conselhos espirituais, e tantas outras pequenas

coisas que fizeram grande diferença ao longo de toda essa jornada.

À doutoranda Elisângela de Sousa Lopes, que encerra comigo essa caminhada árdua, por todo

o companheirismo e ajuda em todo o meu experimento.

À mestranda Fernanda Gaio, uma surpresa bem-vinda nesses últimos momentos tensos que a

vida traz, pela amizade que eu tanto aprendi a apreciar.

À IC Ana Paula, pelo apoio inestimável ao meu trabalho, e essa alma genuína que possui.

À toda equipe do LABEO: Jackson Beleza, Ruben Horn, Anne Bezerra, Felipe Rebouças,

Bruno Pessoa, Neilton Monteiro, Cecília Casimiro e Marcel Lucena, por todo e cada

momento vivido em equipe, marcados por alegrias e atribulações.

À mestranda Mariana Duarte, do Laboratório de Toxinologia Molecular da UFC, por todo o

cuidado durante a análise de PCR, e paciência com as nossas várias mensagens e e-mails.

E, finalmente, agradeço a todos aqueles que me ajudaram de alguma forma durante esses

anos, quer tenham sido inspiração, ou apenas exemplos a não ser seguidos.

RESUMO

As calopsitas (Nymphicus hollandicus) pertencem à ordem Psittaciformes, sendo uma das

aves de companhia mais populares no Brasil e em todo o mundo. Sendo nativas da Austrália,

essas aves são encontradas no Brasil obtidas em lojas pet shop ou feiras livres. O contato

direto entre psitaciformes e seres humanos é bastante abrangente e a análise da flora

bacteriana dessas aves é pouco conhecida, e infecções bacterianas representam uma das

principais causas de doenças entéricas em aves. A presença de bactérias Gram-negativas tais

como Escherichia coli e Pseudomonas sp. em psitacídeos já foi relatada na literatura, embora

a realidade dos plantéis de criadores de calopsitas seja desconhecida. Assim sendo, o objetivo

desse estudo foi identificar e avaliar os perfis de resistência de cepas de bactérias Gram-

negativas isoladas de calopsitas oriundas de residências e pet shops em Fortaleza – CE, a

analisar a presença de cepas de E. coli diarreiogênicas (DEC) nesses animais. Para a

realização desse estudo foram coletadas 182 amostras de swabs de arrasto e suabes cloacais de

calopsitas provenientes de 8 domicílios, 7 Pet shops e 3 aviários. Este estudo foi aprovado

pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará (Protocolo

647396-2015). O procedimento microbiológico para isolamento e identificação das cepas foi

composto pelas seguintes etapas: pré-enriquecimento com Água Peptonada, seguido pelo

enriquecimento seletivo em caldos Rappaport-Vassialidis, Seletino-Cistina e Brain Heart

Infusion (BHI), plaqueamento em Ágar Verde Brilhante, MacConkey e Salmonella-Shigella,

e identificação bioquímica presuntiva. Adicionalmente, os perfis de resistência antimicrobiana

das cepas foram determinados pelo método de discodifusão, e a detecção de oito genes de

virulência nas cepas de E. coli isoladas foi realizada por PCR. Foi possível o isolamento de

bactérias pertencentes aos gêneros Pantoea, Citrobacter, Serratia, Escherichia coli,

Providencia spp., Enterobacter sp, Shigella, Proteus e Pseudomonas, sendo Pantoea

agglomerans a mais prevalente. O teste sensibilidade evidenciou maior resistência à ácido

nalidíxico, azitromicina, sulfonamida e cotrimoxazol. Apenas uma cepa de E. coli foi positiva

para os genes eaeA e bfpA, sendo classificada como EPEC típica. Os resultados indicam que

calopsitas podem albergar bactérias Gram-negativas, e que as cepas apresentam alto índice de

resistência a antimicrobianos.

Palavras-chave: Enterobactérias. Antibiograma. EPEC. Pseudomonas sp. Calopsitas.

ABSTRACT

Cockatiels (Nymphicus hollandicus) belong to the order Psittaciformes, being one of the most

popular company birds in Brazil and around the world. Being native to Australia, these birds

are found in Brazil obtained at a pet shop or free trade shows. Direct contact between

psittaciformes and humans is quite comprehensive and the analysis of bacterial flora of these

birds is little known, although bacterial infections represent a major cause of enteric diseases

in birds. The presence of Gram negative bacteria such as Escherichia coli and Pseudomonas

sp. in psittacines has been reported in the literature, but the reality of the breeding grounds of

calopsitas breeders is unknown. Thus, the objective of this study was to identify and evaluate

the resistance profiles of strains of Gram-negative bacteria isolated from calopsitas from

residences and pet shops in Fortaleza, CE, to analyze the presence of diarrheogenic E. coli

strains Animals. For this study, 182 samples were collected from drag swabs and cloacal

swabs of cockatiels from 8 households, 7 pet shops, and 3 aviaries. This work was approved

by the Ethics Committee for the use of animals of the State University of Ceará (UECE):

647396-2015. The microbiological procedure for the isolation and identification of

Salmonella was composed of the following steps: pre-enrichment with Peptone Water,

followed by selective enrichment in Rappaport-Vassiliadis, Selenito-Cystine and Brain Heart

Infusion (BHI), plating in Bright Green, MacConkey and Salmonella-Shigella Agar, and

presumptive biochemical identification. Additionally, the antimicrobial resistance of the

strains was determined by the disc-diffusion method, and the detection of eight virulence

genes in strains of E. coli isolated was performed by PCR. It was possible to isolate bacteria

belonging to the genus Pantoea, Citrobacter, Serratia, Escherichia coli, Providencia spp.,

Enterobacter sp, Shigella, Proteus, and Pseudomonas, being Pantoea agglomerans the most

prevalent. The sensitivity test showed greater resistance to nalidixic acid, azithromycin,

sulfonamide and cotrimoxazole. Only one strain of E. coli was positive for the eaeA and bfpA

genes and was classified as typical EPEC. The results indicate that cockatiels can harbor

Gram-negative bacteria and that the strains present a high rate of antimicrobial resistance.

Key words: Enterobacteria. Antibiogram. EPEC. Pseudomonas sp. Cockatiels.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Lutino Macho .............................................................................................. 19

Figura 2 - Canela Macho e Fêmea .............................................................................. 20

Figura 3 - Pérola Macho e Fêmea ............................................................................... 20

Figura 4 - Cara amarela Macho .................................................................................. 21

Figura 5 - Cara branca Arlequim cinza reverso ........................................................ 22

Figura 6 - Cara branca Macho e Fêmea ..................................................................... 22

Figura 7 - Macho fulvo arlequim (esq) e Fêmea fulvo pérola (dir) .......................... 23

Figura 8 - Pastel Macho e Fêmea ................................................................................ 23

Figura 9 - Oliva Macho e Fêmea ................................................................................. 23

Figura 10 - Macho Cara Branca pérola prata recessivo ........................................... 24

Figura 11 - Silvestre Macho e Fêmea .......................................................................... 24

Figura 12 - Macho cara branca arlequim prata dominante ..................................... 25

Figura 13 - Platinum Macho e Fêmea ......................................................................... 26

Figura 14. Albino Macho ............................................................................................ 26

CAPÍTULO 1

Figura 1 - Eletroforese em gel de agarose de produtos de PCR .............................. 52

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Nomenclatura oficial segundo a Ordem Brasileira de Juízes de Ornitologia:

CALOPSITA LINHA CARA AMARELA (FUNDO AMARELO) ........... 19


CALOPSITA LINHA CARA-BRANCA (FUNDO BRANCO) .................. 20


CALOPSITA LINHA PÉROLA (FUNDO AMARELO E BRANCO) ..... 25

CAPÍTULO 1

Tabela 1 Frequências absolutas e relativas de enterobactérias isoladas de suabes

cloacais e de arrasto de calopsitas (Nymphicus hollandicus) de Fortaleza,

Brasil ................................................................................................................ 50

Tabela 2 Porcentagem de cepas de Enterobacteriaceae isoladas de calopsitas

(Nymphicus hollandicus) resistentes a antimicrobianos .............................. 51

Tabela 3 Enterobactérias Multirresistentes (MDR) isoladas de calopsitas

(Nymphicus hollandicus) ................................................................................. 52

CAPÍTULO 2

Table 1 Percentage of Pseudomonas sp. strains isolated from cockatiels (Nymphicus

hollandicus) resistant to antimicrobials …………………………………… 62

Table 2 Multidrug-resistant (MDR) Pseudomonas sp. strains isolated from

cockatiels (Nymphicus hollandicus) ……………………………………… 63

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

APEC: Escherichia coli patogênica para aves

DAEC: Escherichia coli difusamente aderente

DEC: Escherichia coli diarreiogênica

EAEC: Escherichia coli enteroagregativa

EHEC: Escherichia coli enterohemorrágica

EIEC: Escherichia coli enteroinvasiva

EPEC: Escherichia coli enteropatogênica

ETEC: Escherichia coli enterotoxigênica

ExPEC: Escherichia coli extraintestinal

NMEC: Escherichia coli causadora de meningite neonatal

PCR: Polimerase chain reaction

STEC: Escherichia coli produtora de toxina de shiga

UPEC: Escherichia coli uropatogênica

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 13

2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 14

2.1 ORDEM PSITTACIFORMES .................................................................................. 14

2.2 CALOPSITAS (Nymphicus hollandicus) .................................................................. 14

2.2.2 Tipos de mutações .................................................................................................... 18

2.2.3 Características gerais .............................................................................................. 26

2.3 FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEA ...................................................................... 28

2.3.1 Escherichia coli ........................................................................................................ 28

2.3.2 Salmonella spp. ........................................................................................................ 34

2.3.3 Proteus spp. .............................................................................................................. 34

2.3.4 Citrobacter spp. ........................................................................................................ 35

2.3.5 Pantoea sp. ................................................................................................................ 35

2.3.6 Providencia spp. ....................................................................................................... 36

2.4 Pseudomonas aeruginosa .......................................................................................... 37

2.5 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA ..................................................................... 38

3 JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 40

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA ...................................................................................... 41

5 OBJETIVOS ............................................................................................................ 42

5.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 42

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 42

6 CAPÍTULO 1 ........................................................................................................... 43

7 CAPÍTULO 2 ........................................................................................................... 58

8 CONCLUSÃO .......................................................................................................... 70

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 71

13

1 INTRODUÇÃO

A calopsita (Nymphicus hollandicus) pertence à ordem Psittaciformes, sendo

considerada a menor cacatua existente. Essas aves se destacam no comércio pet em

decorrência do baixo custo de aquisição e manutenção, bem como por sua beleza, canto e

docilidade (CÔRREA, 2012). A criação dessas aves não exige nenhuma autorização especial,

visto que a legislação vigente as considera como animais domésticos, possibilitando sua

criação em cativeiro (IBAMA, 1998). Por conta disso, o número de criadores de calopsitas no

Brasil vem se intensificando, sendo seus exemplares encontrados, em sua grande maioria, em

criadouros comerciais e em residências.

As aves da ordem Psittaciformes são passíveis de albergarem inúmeros agentes

etiológicos, e várias doenças são transmitidas de aves em cativeiro para os seres humanos

através do contato direto ou indireto com aves doentes ou portadoras assintomáticas. Dentre

estas doenças, destacam-se as de origem bacteriana, considerados os agentes zoonóticos mais

comuns (AKHTER et al., 2010). Inúmeros são os micro-organismos que afetam as aves

ornamentais, sendo as bactérias Gram-negativas consideradas as mais patogênicas nesta

espécie, merecendo destaque Escherichia coli, Salmonella sp, Klebsiella sp, Pseudomonas sp,

Proteus sp, Bordetella sp, Citrobacter freundii, e Yersinia sp.

Desse modo, além da possibilidade de carrearem agentes de potencial

patogenicidade, aptos a serem transmitidos para outros animais, inclusive ao homem, os

psitacídeos de vida livre ou de cativeiro podem albergar bactérias com inúmeros mecanismos

de resistência a antimicrobianos (HIDASI et al., 2013). Com o crescente interesse pela

comercialização dessas aves, torna-se de fundamental importância um estudo da microbiota

desses animais com o intuito de auxiliar no diagnóstico das possíveis doenças que acometem

as calopsitas, possibilitando a instituição de uma terapêutica adequada para o tratamento dos

animais debilitados, assim como uma maior compreensão da colonização da microbiota

entérica dessas aves, fornecendo dados relevantes para os ajustes necessários de manejo e de

acondicionamento dessas aves nos criadouros (CÔRREA, 2012).

Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi identificar e avaliar os perfis de

resistência de cepas de enterobactérias isoladas de calopsitas de residências e pet shops em

Fortaleza – CE, e analisar a presença de cepas de E. coli diarreiogênicas (DEC) nesses

animais.

14

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 ORDEM PSITTACIFORMES

A ordem Psittaciformes é bastante diversificada, constituída por cerca de 78

gêneros e 332 espécies, sendo classificada atualmente em três famílias: Psittacidae,

representada pelas araras (Ara spp., Anodorhynchus spp.), papagaios (Amazona spp.),

maracanãs (Propyrrhura spp) e periquitos (Brotogeris spp).; Loridae, formada pelos Lóris

(Trichoglossus spp., Eos spp.); e Cacatuidae, composta pelas cacatuas (Cacatua spp) e

calopsitas (Nymphicus spp.) (COLLAR, 1997; CHRISTIDIS & BOLES, 2008; GODOY &

CUBAS, 2009; HARCOURT-BROWN, 2010).

Os Psittaciformes caracterizam-se pelo bico forte, grosso e recurvo, língua

carnuda e grossa, e pela mandíbula superior recurvada sobre a inferior, adaptada à

alimentação a base de sementes e frutos. As patas são zigodáctilas, sendo o primeiro e o

quarto dedos em posição posterior enquanto o segundo e o terceiro dedos se dispõem na

dianteira, facilitando em uma maior agilidade para captura de alimentos e de posicionamento

(SICK, 1997; GODOY, 2007). Modificações antrópicas de habitat, a caça furtiva e o

comércio ilegal são ameaças significativas: 85 espécies estão listadas como crítico, em perigo

ou vulnerável e 19 espécies como extinto pela União Internacional para a Conservação da

Natureza (IUCN, 2015).

Quanto ao dimorfismo sexual, verifica-se que a maioria das espécies são

monomórficas, necessitando de testes moleculares ou endoscópicos para a determinação do

sexo das mesmas (GODOY, 2007). Mediante algumas espécies serem capazes de

mimetizarem a voz humana, como devido à variedade de coloração e exuberância em suas

plumagens, os psitacídeos são amplamente visados para atuar como animais de companhia ou

de exibição (SIGRIST, 2014).

2.2 CALOPSITAS (Nymphicus hollandicus)

A calopsita pertence à ordem Psittaciformes, família Psittacidae, subfamília

Cacatuinae (BIRDLIFE INTERNATIONAL, 2012). Inicialmente descrita pelo escritor e

naturalista escocês Robert Kerr em 1793, como Hollandicus psittacuse, foi transferida para

seu próprio gênero, Nymphicus, por Wagler em 1832 (SANTOS, 2013). Em 1864, se tornou

15

bastante conhecida dos ingleses e, por volta de 1884, já se encontrava bem estabelecida nos

aviários europeus. Entretanto, a disseminação maciça dessa ave somente ocorreu a partir do

surgimento da primeira mutação de cor, o arlequim, pouco antes de 1949, no estado da

Califórnia (Estados Unidos). A partir daí outros padrões de cores foram sendo fixados,

ganhando então grande popularidade, igualando-se, praticamente, àquela do periquito

australiano, e a introdução destas aves no Brasil se deu a partir da década de 1970 (BENEZ,

2001; AUSTRALIAN MUSEUM, 2006).

Segundo pesquisa realizada pelo painel online CONECTAí em todo o país, em

setembro e outubro de 2013 mostra que 80% dos internautas brasileiros possuem animal de

estimação, dos quais as aves ocupam o terceiro lugar (12%). Entre as aves, a mais comum é o

periquito, citado por 28%, seguido do canário (26%), calopsita (21%) e papagaio (14%). O

gasto médio mensal com animais é de R$ 99,25. 32% dos respondentes gastam entre R$ 30 e

75 com os animais e 30% gastam entre R$ 75 e R$ 150. Nos extremos, 15% gastam menos do

que R$ 30 por mês e 15% gastam mais do que R$ 300 mensais. A maioria compra os

produtos para os animais em petshops (61%), 42% compram em supermercados e 20% em

mercadinhos. Na hora da compra, 76% levam em consideração a qualidade do produto, 45%

consideram o preço e 26% a indicação do veterinário. Cerca de três em cada 10 internautas

(34%) levam seu animal ao veterinário somente quando ele apresenta algum problema de

saúde. 15% levam seus animais ao veterinário pelo menos uma vez por mês, 17% entre dois a

três meses e 18% levam uma vez entre três e seis meses. Um em cada 10 (9%) leva o animal

ao veterinário uma vez por ano (IBOPE, 2013).

2.2.1 Cores e Mutações

Os diversos padrões de cores existentes, originadas de padrões silvestres e

mutações, podem se mesclar originando uma grande gama de cores, tornando cada calopsita

única.

De forma geral, as aves possuem duas cores básicas:

1) Melânica (melanina): pigmentos melânicos e podem variar do negro ao cinza

azulado, do marrom (castanho) escuro ao bege claro ou mesmo estar ausente, se distribuem

principalmente no eixo das penas e na periferia;

16

2) Lipocrômica (lipocromo): pode se apresentar em várias gradações de

vermelho, amarelo ou simplesmente branca.

A cor que vemos nas aves é resultante da combinação dos efeitos dessas duas

cores básicas. São transmitidas em genes diferentes de forma independente. As diversas

possíveis mutações podem atuar tanto nas melaninas como nos lipocromos, reduzindo sua

expressão em graus variáveis, inibindo seu aparecimento ou aumentando seu efeito.

Mutação é toda alteração espontânea dos caracteres hereditários (genes)

transmissíveis à descendência. Chamamos de pássaros mutantes aqueles que diferem dos seus

ancestrais.

As mutações não afetam a posição do gene no cromossoma, mas o gene mutante

produz um efeito diferente do gene original. Muitas mutações passam despercebidas pois seus

efeitos são de pouca expressão, há outras onde o efeito é percebido sensivelmente. Toda

mutação é progressiva e só se manifesta completamente com o passar do tempo. Quando

ocorre uma mutação o gene passa a existir de duas formas, a original que produz um efeito

conhecido, e a mutante que produz um novo efeito. As formas diferentes de um gene são

denominadas de alelos. Existem genes que apresentam mais de uma mutação, neste caso,

teremos uma série alomórfica ou alelos múltiplos. Embora possam haver três ou mais versões

de cada gene, cada indivíduo possui apenas dois alelos.

As mutações podem se manifestar de diferentes maneiras e recebem as seguintes

denominações:

1) Dominante: Para que se manifeste, basta que o gene esteja presente uma vez

no par de cromossomos correspondentes (heterozigótico) e pode ser herdado do pai ou da

mãe;

2) Recessiva autossômica: Só se manifesta em quem herda um gene recessivo de

cada progenitor (homozigoto), ou seja, sempre se manifesta aos pares. Caso esteja presente

em um único cromossomo, dizemos que o pássaro é portador;

3) Ligada ao sexo: Transmitida por genes contidos no cromossomo que transmite

as características do sexo. Como todas as mutações sexo-ligadas são recessivas em relação ao

gene original, nos machos o efeito delas só se fará sentir no fenótipo quando em homozigose.

17

Assim somente os machos poderão portar genes recessivos sexo-ligados. As fêmeas jamais

serão portadoras, serão puras ou normais.

São infinitas as possibilidades de tonalidades de cores nos pássaros. Quando

combinadas com fatores mutantes a variedade cresce mais ainda. Estas variações podem tanto

atuar nos lipocromos como nas melaninas.

Variedades das cores lipocrômicas

As cores lipocrômicas podem se apresentar em várias tonalidades de amarelo,

passando pelo laranja, podendo chegar ao vermelho vivo, ou mesmo ser inibida por alguma

mutação, chegando ao branco total ou parcial. O pássaro que tem a melanina inibida é

chamado de lipocrômico puro. São as seguintes possibilidades de cores lipocrômicas:

1 - Branco Recessivo - A inibição do lipocromo é total, o pássaro apresenta uma

brancura imaculada e a cor da pele fica com tom violeta. A transmissão hereditária é recessiva

não ligada ao cromossomo do sexo (autossômica). Só se exterioriza no fenótipo em estado de

homozigoto.

2 - Branco dominante - O lipocromo se apresenta de maneira latente e sua inibição

é parcial, vestígios de lipocromos serão perceptíveis, principalmente nos encontros. Se

manifesta estando apenas em um dos cromossomos do par hereditário (heterozigótico),

quando em estado de homozigoto pode ser letal.

3 – Amarelo - Nessas cores o lipocromo pode se apresentar de maneira intensa ou

com nevoas brancas espalhadas uniformemente pela plumagem na forma de escamas. O fator

intenso é dominante em relação ao nevado, ou seja, os intensos podem portar nevado, sendo

heterozigoto para o esse fator, ou ainda serem homozigotos com duplo fator intenso. Os

nevados só se exteriorizam quando os pássaros são homozigotos para o nevadismo. Tanto o

lipocromo intenso, quando o nevado, podem ser inibidos pelo branco recessivo ou dominante.

4 – Inos - Albinos (brancos com olhos vermelhos) e Lutinos (amarelos com olhos

vermelhos). São os chamados Inos lipocrômicos (sem melanina). Na verdade, existem duas

diferentes mutações que causam o mesmo efeito no fenótipo. Uma de transmissão recessiva

autossômica e outra sexo-ligada, podem atuar em todas as cores lipocrômicas.

18

Variedades das cores melânicas

As melaninas se apresentam em várias tonalidades de cor, partindo do negro

imaculado podendo chegar ao bege claro, em algumas vezes é quase imperceptível. Pode até

em algumas circunstâncias ser totalmente inibidas. Quando o pássaro tem os lipocromos

inibidos e apresentam alguma melanina, são chamados de melânicos puros.

1 – Negro - O negro é a oxidação máxima das possíveis melaninas e é dominante

em relação a todas outras manifestações melânicas.

2 – Canela - A melanina canela tem a mesma característica da negra oxidada, a

única diferença é a tonalidade da cor que passa a ser marrom escuro oxidado. Sua transmissão

é de natureza sexo-ligada, é recessiva em relação a melanina negra e dominante a todos

fatores de diluição melânica.

3 – Pastel - A mutação pastel causa mudança na tonalidade das melaninas negras

que passam a se apresentar com uma coloração cinza escuro (quase negra). Já nas melaninas

marrons o efeito é de diluição e dispersão. Sua transmissão é sexo-ligada recessiva e pode

atuar em todas as cores melânicas clássicas.

2.2.2 Tipos de mutações

As mutações básicas ou primárias são Lutino, Arlequim, Canela, Pérola, Cara

Branca, e Prata. As mutações combinadas ou cruzadas são Pérola-Arlequim, Canela-

Arlequim, Canela-Pérola-Arlequim, Lutino-Canela, Lutino-Pérola, Lutino-Pérola Arlequim,

Cara Branca-Lutino (albino), Cara Branca-Arlequim, Cara Branca-Pérola, Cara Branca-

Pérola-Arlequim, Cara Branca-Canela, Cara Branca-Canela-Arlequim, e Cara Branca-Canela-

Pérola-Arlequim.

Diversas das mutações existentes são raras, das quais muitas ainda não são

encontradas no Brasil. Essas mutações são classificadas da seguinte forma:

19

1) Sexo-ligado: Lutino, Canela, Pérola, Cara Amarela

Lutino (Lutino): Sem dúvida alguma, é o padrão mais popular e apreciado, tendo surgido

nos EUA em 1958. Essa mutação causa perda do

pigmento melanina (que confere o tom cinza à ave).

Desse modo, são aves de cor dominante branca, com

olhos vermelhos, pés rosados, crista amarela, bico

marfim, cabeça amarelada com bochechas vermelhas.

Nas asas e cauda, também está presente o amarelo. Na

realidade, os lutinos não podem ser considerados como

brancos ou albinos, pois não são inteiramente brancos,

em razão da presença das cores amarela e vermelha

(dadas pelo pigmento psitacina). Os indivíduos podem

apresentar desde um amarelo forte até um branco quase

total no corpo. Neste padrão ocorre um defeito de

origem genética, caracterizado pela existência de uma

área sem penas localizada atrás da cabeça. As fêmeas têm estrias amarelas na face inferior

da cauda e pontos amarelos embaixo da asa (RUPLEY, 1999).

Tabela 1. Nomenclatura oficial segundo a Ordem Brasileira de Juízes de Ornitologia

CALOPSITA LINHA CARA AMARELA (FUNDO AMARELO)

CÓD. COR

PS070101 Calopsita cinza fêmea

PS070102 Calopsita cinza macho

PS070103 Calopsita canela fêmea

PS070104 Calopsita canela macho

PS070105 Calopsita arlequim cinza (padrão 50% e reversos)

PS070106 Calopsita arlequim canela (padrão 50% e reversos)

PS070107 Calopsita lutino

PS070108 Calopsita fulvo

PS070120 Calopsita outras mutações fundo amarelo

PS070150 Calopsita combinações fundo amarelo

Figura 1. Lutino Macho

Fonte: calopsitasmansas.net

20


CALOPSITA LINHA CARA-BRANCA (FUNDO BRANCO)

CÓD. COR

PS070201 Calopsita cara-branca cinza fêmea

PS070202 Calopsita cara-branca cinza macho

PS070203 Calopsita cara-branca canela fêmea

PS070204 Calopsita cara-branca canela macho

PS070205 Calopsita cara-branca arlequim cinza (padrão 50% e reversos)

PS070206 Calopsita cara-branca arlequim canela (padrão 50% e reversos)

PS070207 Calopsita cara-branca ino (albino)

PS070208 Calopsita cara-branca fulvo

PS070209 Calopsita cara-branca outras mutações fundo branco

PS070250 Calopsita cara-branca combinações fundo branco

Canela (Cinnamon): Também conhecida como Isabelino, surgiu pela primeira vez na

Bélgica, em 1960. As aves são semelhantes ao padrão normal, com exceção da alteração

na coloração da melanina, produzindo uma coloração marrom-claro (ou canela). Também

as patas e os olhos são de coloração mais clara. Os machos adultos são um pouco mais

escuros que as fêmeas (em razão da maior presença de melanina). Algumas fêmeas podem

ter mais amarelo na face do que os machos, além de apresentarem o barramento típico sob

as penas da cauda (RUPLEY, 1999).

Pérola (Pearl): Surgiu pela primeira vez na Alemanha

Ocidental em 1967. É uma

mutação que afeta as penas

individualmente (há uma

falta de melanina no centro

de cada pena,

individualmente), fazendo

com que haja uma falta de

coloração uniforme,

resultando em penas com

Figura 2 Canela Macho e Fêmea Fonte: calopsitasmansas.net

Figura 3. Pérola Macho e Fêmea


21

coloração em forma de "concha". São aves extremamente vistosas, sendo que o padrão

básico pode variar bastante. De modo geral, mostram as duas manchas laterais à cabeça,

as faces são amarelas salpicadas de cinza, e a crista amarela riscada de cinza. As penas das

costas exibem um padrão “escamado”, resultante da ausência de melanina no seu centro,

podendo a cor desta parte das penas variar do branco ao amarelo. As penas das asas são

cinza, com faixas amarelas. A cauda é amarela, e o peito e a barriga, listrados de amarelo

e cinza. As fêmeas carregam o perolado nas costas, asas, nuca e cabeça, com uma

concentração maior nas costas. Os machos adultos podem perder totalmente o perolado,

principalmente na cabeça e na nuca (RUPLEY, 1999).

Cara amarela (Yellow Face ou Yellow Cheek): É uma das mais recentes mutações,

surgida na Europa na década de 80, e ainda não há

notícia de sua existência no Brasil. Os primeiros

exemplares deste padrão chegaram aos EUA por

volta de 1992. São em tudo, semelhantes aos demais

padrões, diferindo apenas na cor das bochechas, que,

ao invés de serem vermelhas, mostram-se amarelas.

A principal diferença entre os sexos é o amarelo da

bochecha, que é mais forte no macho. Há três

formas dessa mutação (como ocorre com o padrão

prata): a dominante simples-fator, a dominante

duplo-fator e a recessiva (RUPLEY, 1999).

2) Recessivo: Arlequim, Cara Branca, Fulvo, Pastel, Esmeralda, Prata Recessivo

Arlequim (Pied): É a mutação mais antiga, surgida nos EUA em 1949; causa alteração da

coloração normal em extremidades. Esse padrão é extremamente variável, podendo

apresentar aves bastante semelhantes ao normal até aquelas com poucas áreas de cor

cinza, predominando o amarelo claro e apenas algumas penas de coloração cinza. A

Figura 4. Cara amarela Macho


22

cabeça exibe um amarelo forte, faces vermelhas e crista amarela. Idealmente, um arlequim

deve mostrar 75% de penas com ausência de melanina e 25% com presença. Um arlequim

puro possui, idealmente, uma máscara “limpa”, livre de manchas cinzas, uma cauda limpa

e asas de voos com um balanço igual de marcas, com simetria perfeita. Nesse padrão, é

virtualmente impossível a distinção de sexo (uma vez que a marcação arlequim obscurece

as diferenças de plumagem), só sendo possível no caso em que a fêmea apresente barras

na parte inferior do rabo. São reconhecidas quatro classificações de arlequim: escuro (ou

heavy, com 75% ou mais de melanina), claro (ou light, com apenas 25% de melanina),

reverso (ou reverse, com marcações apenas nas asas de voos, tendo o restante do corpo

sem melanina) e limpo (ou clear, um pássaro totalmente amarelo ou branco; é também

chamado de lutino com olhos pretos) (RUPLEY, 1999).

Cara branca (White Face): O padrão Cara

Branca surgiu na

Holanda por volta de

1969. No final da

década de 1970,

passou a ser produzido

na Alemanha e

Inglaterra. Essa mutação

causa perda do pigmento psitacina (que confere tons

amarelo e laranja), causando a falta da pigmentação laranja

e amarela nas bochechas e no corpo. A fêmea tem o corpo

cinza, bordas das asas brancas e face inferior da cauda com

estrias pretas e brancas, tornando a face inteiramente cinza. O macho segue um padrão

parecido com o normal, porém com a face totalmente branca e as cores cinzas com um

tom mais escuro, crista cinza e bordas das asas brancas (RUPLEY, 1999).

Figura 5. Cara branca Arlequim cinza reverso Fonte: Arquivo pessoal

Figura 6. Cara branca Macho e Fêmea


23

Figura 7. Macho fulvo arlequim (esq) e Fêmea fulvo pérola (dir)


Fulvo (Fallow): Surgidos em 1971, nos EUA. Semelhante ao Canela (também há

mudança da coloração da melanina de preto para marrom), mas aqui também ocorre uma

diminuição da densidade da melanina, fazendo com que pareçam um Canela pálido. O

amarelo é mais pronunciado (principalmente embaixo do corpo e crista), olhos são

vermelhos e peito é de coloração mostarda ou creme. As fêmeas costumam ser mais

bonitas que os machos, por apresentarem cores mais brilhantes. Os sexos são praticamente

iguais, tornando-se mais difícil a identificação (RUPLEY, 1999).

Pastel (Pastelface): A ave

possui a coloração

das bochechas no tom

pastel. Apesar de

conferir a mesma

coloração, o padrão

Pastel não deve ser

confundido com o cara amarela. Essa é uma mutação

sutil, que promove um tom mais brando de todas as

cores. Externamente é em tudo semelhante ao cara

amarela, mas tem herança genética autossômica

recessiva, o que facilita e acelera as combinações entre os padrões, principalmente com

aqueles de herança ligada ao sexo. É dominante apenas para o padrão cara branca.

Também aqui ocorre duas formas: fator-simples e fator-duplo.

Oliva ou Esmeralda (Olive ou Spangle ou Esmerald

Green): Mutação extremamente nova, surgida nos EUA,

de padrão ainda não muito definido. Caracteriza-se,

basicamente, por uma coloração canela-esverdeada,

podendo variar de claro a escuro, e um padrão de

marcação das penas muito característico (que as pessoas

denominam padrão de "lantejoulas", ou spangled no

inglês) (RUPLEY, 1999).

Figura 8. Pastel Macho e Fêmea Fonte: calopsitasmansas.net

Figura 9. Oliva Macho e Fêmea


24

Prata Recessivo:

Mutação estabilizada na década de 60, na Europa (apesar

de ter surgido na Nova Zelândia, em 1950). Difere do

padrão normal pelo fato de os olhos serem de cor

vermelha e o cinza global do corpo ter passado à cor

prateada, ocorrendo uma grande flutuação de tonalidades

entre os indivíduos. As demais características de cor são as

mesmas do padrão normal, inclusive quanto à

identificação do macho e da fêmea (RUPLEY, 1999).

3) Dominante: Cinza Silvestre, Prata Dominante, Bochecha Amarela Dominante

Cinza ou Normal (Normal Grey): A variedade original, encontrada na natureza, tem o

corpo cinza com as bordas das asas brancas. A crista do macho é amarela sobre uma

cabeça amarela e, na fêmea, cinza-amarelada com a

cabeça cinza. Ambos têm as faces formadas por uma

mancha vermelha, circular, em cada lateral da face, de

tom mais suave na fêmea. A cauda é totalmente negra no

macho e na fêmea intercalada de negro com amarelo na

parte de baixo. No macho adulto, a cabeça é amarela,

com duas manchas circulares laterais (bochechas) de cor

vermelha, crista amarela, corpo revestido com penas de

cor cinza, com o dorso mais escuro, bordas das asas

brancas e cauda negra. A fêmea adulta apresenta a

mesma coloração dos filhotes. O corpo é de cor cinza,

cabeça também cinza com as bochechas de cor vermelha mais suave, crista cinza-

amarelada, bordas das asas brancas e face interior da cauda estriada de amarelo e preto,

Figura 10. Macho Cara Branca pérola prata recessivo


Figura 11. Silvestre Macho e Fêmea


25

com penas laterais externas amarelas. Em ambos os sexos, os olhos são marrons, o bico

cinza escuro e as patas, cinza escurecido (RUPLEY, 1999).


CALOPSITA LINHA PÉROLA (FUNDO AMARELO E BRANCO)

CÓD. COR

PS070301 Calopsita pérola cinza

PS070302 Calopsita pérola canela

PS070303 Calopsita pérola arlequim cinza (padrão 50% e reversos)

PS070304 Calopsita pérola arlequim canela (padrão 50% e reversos)

PS070305 Calopsita pérola cara-branca cinza

PS070306 Calopsita pérola cara-branca canela

PS070307 Calopsita pérola cara-branca arlequim cinza (padrão 50% e reversos)

PS070308 Calopsita pérola cara-branca arlequim canela (padrão 50% e reversos)

PS070309 Calopsita pérola lutina

PS070310 Calopsita pérola fulvo (fundo amarelo e branco)

PS070311 Calopsita pérola outras mutações

Prata Dominante: É um padrão de cor obtido

recentemente, tendo sido fixado por volta de 1979.

São aves que apresentam a cor cinza do padrão

normal diluída, mostrando um tom pastel prateado. Os

olhos e patas são pretos, as penas cinzas, mantendo o

amarelo forte das faces e da crista e o vermelho das

bochechas, com um prateado mais escuro na região do

pescoço. A graduação do prateado varia de ave para

ave, sendo a cor dos machos mais brilhante e intensa.

A diferenciação entre os sexos pode ser feita do

mesmo modo que o padrão normal. Nesta mutação,

os genes produzem dois efeitos visuais diferentes,

caso ocorram como fator simples ou duplo. Aves fator-duplo são mais claras que as aves

fator-simples, parecendo lutinos, mas com um tom acinzentado; eles retêm a marcação

mais escura na cabeça, olhos e pés escuros (RUPLEY, 1999).

Bochecha Amarela Dominante: É muito similar ao Bochecha Amarela Sexo Ligado, com

diferenças sutis quanto à intensidade na coloração da cor amarela e laranja.

Figura 12. Macho cara branca arlequim prata dominante


26

Outras mutações existentes são:

Albino (White Face Lutino): Ave inteiramente branca,

com os olhos vermelhos e pés rosados, com ausência

total de qualquer pigmentação (na realidade, resultam

da combinação de duas mutações: lutino e cara branca).

As fêmeas são mais fáceis de serem encontradas, por

ser um padrão com herança ligada ao sexo (RUPLEY,

1999).

Platinum: Mutação

só existente na Austrália.

Há uma confusão com relação a esse nome, uma vez que na

América do Norte chamam de Platinum aves prata

dominante. Essa mutação se caracteriza por uma coloração

"cinza-fumaça" clara (smokey-grey), com asas e cauda cinza

mais escuro. Bico, pés e patas são bege claro. Os olhos são

vermelhos ao nascer, mas escurecem logo em seguida

(RUPLEY, 1999).

2.2.3 Características gerais

Consideradas a menor espécie de cacatua existente, apresentam, em média, 30 a

33 cm de comprimento, 45 cm de envergadura e o peso varia de 80 a 150 gramas. São aves

dóceis, que podem ser utilizadas como animal de estimação. Resistentes quando adultas, com

uma alimentação balanceada e cuidado adequado podem viver até 25 anos (BENEZ, 2001;

FORSHAW, 2010; GORMAN, 2010).

Figura 13. Albino Macho


Figura 14. Platinum Macho e Fêmea Fonte: calopsitasmansas.net

27

Na natureza, essas aves habitam quase todas as partes do continente australiano,

vivendo tanto em áreas úmidas quanto em regiões secas. São comumente encontrados em

áreas agrícolas, savanas, jardins, área de vegetação arbustiva, e até em parque de cidades,

embora dificilmente sejam vistos nas zonas costeiras. Em áreas secas onde água torna-se um

fator limitante, calopsitas tendem a disputar por comida, o que gera a necessidade de

migração, quando essas aves viajam em grupos se movendo para áreas com fontes de água e

alimentos (TORLONI, 1991).

Em cativeiro, vivem com uma dieta básica de ração e mistura de sementes

apropriadas, com um complemento de milho, pequenas quantidades de frutas e legumes

(VERHOEF-VERHALLEN, 2004). O tamanho e comportamento dos grupos formados em

cativeiro variam de acordo com o habitat e sazonalidade. Animais jovens e adultos de ambos

os sexos podem formar grandes grupos ou ainda subgrupos tanto em vida livre quanto em

cativeiro (RUPLEY, 1999).

Existem diferentes e variadas colorações de plumagem devido a mutações, sendo

a plumagem de adulto desenvolvida entre três e seis meses de idade. Segundo alguns autores,

a calopsita atinge a maturidade sexual em torno dos seis meses de idade (HARPER & LOWE,

1998; WATSON & HURLEY, 2003; FORSHAW, 2010), enquanto que para HICKMAN

(2001) a maturidade ocorre a partir de um ano de idade. Os indivíduos adultos, durante o

período reprodutivo, são divididos em pares, em gaiolas destinadas à reprodução. O macho

adulto tem ainda um comportamento de defesa de seu território, enquanto a fêmea se limita

exclusivamente à postura e sobrevivência da ninhada (BENEZ, 2001). O período médio de

incubação é de 18 dias, onde os pais se revezam chocando os ovos de uma ninhada,

normalmente, formada por seis ovos (WATSON & HURLEY, 2003; VERHOEF-

VERHALLEN, 2004).

A criação dessas aves não exige nenhuma autorização especial, visto que a

portaria Nº 93, de 07 de junho de 1998 do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos

Recursos Naturais Renováveis - IBAMA (1998) as considera como animais domésticos,

possibilitando sua criação em cativeiro. Recentemente, a criação de calopsitas no Brasil vem

se intensificando, sendo seus exemplares encontrados, em sua grande maioria, em criadouros

comerciais particulares e em estabelecimentos comerciais (BENEZ, 2001).

28

2.3 FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEA

Entre as bactérias apontadas como importantes patógenos aviários relacionados às

falhas de manejo em aves de cativeiro, destacam-se as pertencentes à família

Enterobacteriaceae, que apresenta cerca de 42 gêneros e mais de 142 espécies bacterianas

(JANDA e ABBOT, 2008). Os membros da família Enterobacteriaceae são bacilos Gram

negativos de até 3 µm de comprimento, classificados em aproximadamente 28 gêneros e 80

espécies, que se distinguem bioquimicamente (QUINN et al., 2005); são capazes de fazerem a

redução de nitrato a nitrito e a não formação de esporos, apresentando um ótimo crescimento

a uma temperatura de 37 °C (BERGEY & HOLT, 1994; QUINN et al., 2005), e de fermentar

a glicose e uma ampla variedade de carboidratos, sendo oxidase-negativos e catalase-

positivos, com exceção da Shigella dysenteriae.

Por afetarem o trato intestinal de seus hospedeiros, sejam como habitantes

naturais ou parasitários, as enterobactérias de um modo geral são responsáveis por quadros de

diarreia, sonolência e perda de apetite (SEGABINAZI, 2004). As enterobactérias mais

problemáticas aos psitaciformes são: Escherichia coli, Yersinia sp, e Salmonella sp, advindo

daí a importância dos psitacídeos em relação à saúde pública por conta de seu potencial de

albergar patógenos zoonóticos (SIMPSON, 1996; IKUNO et al, 2008). O grau de infecção e

de invasão bacteriana varia quanto ao tipo de enterobactéria, porém, de um modo geral, a sua

proliferação e disseminação no organismo do homem ou do animal que atinge, depende da

idade do hospedeiro, das espécies e de suas condições fisiológicas.

2.3.1 Escherichia coli

Escherichia coli é um bacilo Gram negativo, fermentativo, geralmente móvel,

com flagelos peritríquios e fímbrias (QUINN et al., 2005). Apresentam hastes restas, cujo

comprimento se estendem de 1,1 – 1,5 μm a 2,0-6,0 μm. Suas cepas podem ser circundadas

por cápsulas ou microcápsulas, sendo anaeróbias facultativas (BERGEY & HOLT, 1994). São

capazes de fermentarem, bioquimicamente, os açúcares glicose, ramnose, maltose, manose,

manitol, xilose, sorbitol e arabinose. Em contrapartida, a fermentação de adonitol, sacarose,

salicina, rafinose, ornitina, dulcitol e arginina é variável (KONEMAN et al., 2010). Cresce

rapidamente em meios bacterianos como ágar MacConkey, onde forma colônias lactose

positiva grandes. E. coli é a principal bactéria anaeróbica facultativa, presente no trato

intestinal da maioria das espécies animais e é geralmente recuperada da cultura de fezes, mas

29

em aves de estimação saudáveis é recuperada em apenas uma pequena porcentagem de

indivíduos (GYLES; FAIRBROTHER, 2010).

Logo após o nascimento, sem necessariamente causar infecção, a Escherichia coli

coloniza o intestino dos indivíduos, porém o papel dela como membro da microbiota de aves

não é completamente elucidado, podendo atuar como fonte de vitaminas e ocupando os sítios

na mucosa intestinal, impedindo assim a colonização do epitélio por microrganismos

patogênicos (FERREIRA & KNÖBL, 2000). Diversos estudos já realizados em aves

demonstraram que E. coli é um dos patógenos mais prevalentes entre as outras enterobactérias

isoladas (AKHTER et al., 2010; HIDASI et al., 2013; HORN et al., 2015; LOPES et al.,

2015). GORDON & COWLING (2003), argumentaram que a associação com os humanos, as

alterações de dieta e a massa corporal são fatores predisponentes significativos na prevalência

dessa bactéria nos animais, ao realizarem um estudo de isolamento de E. coli em mamíferos e

aves silvestres na Austrália.

A patogenia das infecções por E. coli em aves ainda é pouco conhecida. As cepas

de E. coli patogênicas para aves são menos toxigênicas do que as cepas que infectam

mamíferos (BARNES; VAILLANCOURT; GROSS, 2003). As E. coli de aves podem

produzir enterotoxinas que induzem a hipersecreção de fluidos no lume intestinal causando

diarreia (GERLACH, 1994).

Nos psitacídeos, tanto em infecções primárias ou secundárias de colibacilose, os

sinais clínicos geralmente se apresentam de forma inespecífica, sendo as aves passíveis de

desenvolverem reações de letargia, incoordenação motora, penas arrepiadas, rinite, dispneia,

presença de sons estertores, anorexia, diarreia, políúria, dor abdominal, inchaço articular,

edema subcutâneo, conjuntivite, perda de peso, vômito e morte súbita. Foi observada também

a presença de sinais como morte embrionária, onfalite, coligranuloma, sinovite, doença

respiratória crônica complicada, colisepticemia, salpingite, síndrome da cabeça inchada e

celulite aviária (FERREIRA, KNÖBL, 2000; GODOY, 2007; MARIETTO-GONÇALVES et

al, 2010).

Quanto ao aspecto necroscópico são inclusos atrofia da musculatura peitoral,

penas descoloridas, hepatomegalia com a disposição de pontos amarelados ao longo do órgão,

pneumonia, aerossaculite, opacificação dos sacos aéreos, pericardite, congestão hepática e

renal, hiperemia da mucosa intestinal, peritonite, esplenomegalia e polisserosite fibrinosa. Nas

30

septicemias bacterianas nas aves são descritas lesões esplênicas caracterizadas por presença

de exsudato fibrinoso ao redor dos capilares embainhados, depleção linfoide, hiperemia e

infiltrado de heterofilos e trombócitos (RIDELL, 1987).

A existência de cepas patogênicas de E. coli causadoras de colibacilose está

relacionada aos fatores de virulência que podem ser avaliados para diferenciar amostras

patogênicas de não patogênicas (JOHNSON, 1991; SAIDENBERG et al., 2012). Mediante a

esses diversos fatores de virulência, associados com uma série de mecanismos de

patogenicidade, essa espécie bacteriana foi classificada em patotipos, divididos em duas

categorias: os patotipos associados a infecções intestinais, denominados de E. coli

diarreagênica (DEC), e aqueles integrantes causadores de infecções extraintestinais,

pertencente a Escherichia coli patogênica extraintestinal (ExPEC) (MARTINEZ e

TRABULSI, 2008).

As DEC são geralmente agrupadas em pelo menos seis categorias: E. coli

enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E.

coli entero-hemorrágica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli difusamente

aderente (DAEC) (KAPER; NATARO; MOBLEY, 2004; KONEMAN et al., 2010). Já as

ExPEC, comumente, são divididas em E. coli uropatogênica (UPEC), E. coli associada à

meningite neonatal (MNEC) e E. coli patogênica aviária (APEC) (SANTOS et al., 2009).

Em humanos e animais, cepas de EPEC causam diarreia aquosa contendo muco

acompanhada de vômitos e febre, sendo uma das principais causas de diarreia infantil em

países em desenvolvimento (LEVINE, 1987; DONNENBERG, KAPER, 1992). Produzem

uma lesão característica de ligação ou desaparecimento nas bordas da microvilosidade,

causando diarreia crônica, que leva a sequelas como má absorção, má nutrição, perda de peso

e retardo no crescimento (MINAGAWA, 2007). O gene eaeA, localizado no loci de

desaparecimento dos enterócitos (LEE) em uma ilha de patogenicidade (PAI), tem sido

utilizado para identificação de EPEC. A presença desse gene determina um padrão de

aderência de bactérias ao epitélio intestinal em enterócitos com lesão em forma de pedestal

conhecida por attaching and effacing (A/E), que é o mecanismo principal da patogênese da

EPEC (A/E) (VALLANCE, FINLAY, 2000; SYDOW, 2005). O contato com as células

epiteliais resulta na secreção de diversas proteínas disparando resposta na célula hospedeira,

incluindo a ativação de um sinal de rotas de transdução, a despolarização das células e a

31

ligação da proteína intimina da membrana externa. A intimina é codificada pelo gene eaeA.

Não produzem nenhuma enterotoxina ou citotoxina (CROXEN & FINLAY, 2010). Tal como

acontece com outros patotipos de E. coli, a transmissão de EPEC é através da via fecal-oral, e

diversos estudos mostraram que este patotipo causa grande parte das infecções de origem

alimentar (DILIELO, 1982; PRASAD, 1998; DE BUYSER et al., 2001; EVANCHO et al.,

2001; SOOMRO et al., 2002).

E. coli entero-hemorrágica (EHEC) possui a capacidade de destruir células

epiteliais e produzir uma citotoxina potente, a toxina Shiga, que provoca diarreia com ou sem

a presença de sangue, síndrome urêmico-hemolítica, e é fatal para crianças. Existem dois

grupos de toxina Shiga, denominados Stx1 e Stx2. Pela presença do gene eaeA ligam-se

fortemente às células dos mamíferos e produzem o mesmo fenômeno que as linhagens de

EPEC. (ROCHA, 2008; CROXEN & FINLAY, 2010; SILVA et al., 2011).

Em humanos e animais, as E. coli enterotoxigênicas (ETEC) colonizam as

proximidades do intestino delgado causando diarreia aquosa e hipotermia. Este patotipo se

parece com o Vibrio cholerae no fato de aderirem-se à mucosa do intestino delgado e

causarem diarreia sem invadir a mucosa, porém produzindo toxinas que agem nas células da

mucosa. Possui fatores de colonização específicos (CFA/ I a IV) (ROCHA, 2008; CROXEN

& FINLAY, 2010). Produzem dois tipos de enterotoxinas, uma semelhante à toxina da cólera,

denominada toxina termolábil (LT), e outra do tipo diarreica, chamada de toxina termoestável

(ST). Existem dois tipos de toxinas LT: LT-I e LT-II. A ST é uma família de pequenas

toxinas, às quais podem ser divididas em dois grupos: as solúveis (STa) e as insolúveis em

metanol (STb), ambas são codificadas por plasmídeos (CAMPOS & TRABULSI, 2002;

BERCHIERI JUNIOR et al., 2009)

Em humanos e animais cepas de E. coli enteroinvasiva (EIEC) causam distúrbios

no intestino grosso, provocam febre e diarreias profusas contendo muco e sangue. O

microrganismo coloniza o cólon e contém plasmídeos de 120 a 140 MDa necessário para a

invasibilidade, o qual carrega todos os genes necessários para a virulência (BERCHIERI

JUNIOR et al., 2009). Causam um distúrbio que é indistinguível dos sintomas da disenteria

causada pelas espécies de Shigella. Invadem e proliferam em células epiteliais in vivo e in

vitro (CAMPOS & TRABULSI, 2002; SYDOW, 2005). As linhagens EIEC invadem

ativamente as células do cólon e propagam-se lateralmente para as células adjacentes,

32

virtualmente idênticas às espécies de Shigella. No entanto, as EIEC não produzem

shigatoxinas. Quando a infecção é severa, pode levar a uma forte reação inflamatória com

grande ulceração.

Cepas de E. coli enteroagregativa (EAEC) podem colonizar e causar doença no

intestino de humanos e animais, causando diarreia aquosa persistente por mais de 14 dias. O

padrão de aderência é em forma de agregados de cultura em célula de cólon humano. Esta

bactéria estimula a secreção mucoide e se liga a ela, formando um biofilme, causando assim

uma colonização persistente e diarreia (MINAGAWA, 2007). Produzem uma toxina

termolábil relacionada antigenicamente à hemolisina, mas que não é hemolítica, e uma toxina

(citotoxina) termoestável enteroagregativa codificada por um plasmídeo (EAST1). Produzem

uma toxina do tipo ST e uma do tipo hemolisina. Algumas cepas são conhecidas por

produzirem uma toxina do tipo shigatoxina (verotoxina) (CAMPOS & TRABULSI, 2002;

SYDOW, 2005).

E. coli uropatogênica (UPEC) é responsável por infecções urinárias em humanos e

animais (cistite e pielonefrite). A bactéria penetra o trato urinário e invade o epitélio da

bexiga, causando cistite, e quando não é tratada corretamente, pode ascender aos rins causar

pielonefrite, lesão renal irreversível, insuficiência renal e septicemia. Acredita-se que o

reservatório para esta linhagem de E. coli seja o próprio trato gastrointestinal (SIDOW, 2005;

BERCHIERI JUNIOR, et al., 2009).

E. coli causadora de meningite neonatal (NMEC) afeta crianças recém-nascidas.

Este tipo se caracteriza por atravessar a barreira hematoencefálica e colonizar o sistema

nervoso central causando meningite. A proteína IbeA presente na NMEC possui a habilidade

de invadir células endoteliais da microvasculatura cerebral, causando meningite neonatal em

humanos (SAVIOLLI, 2010).

Escherichia coli que adere difusamente (DAEC) está associado em alguns estudos

com diarreia, embora sua patogenia não seja definida com consistência. O termo DAEC foi

inicialmente utilizado para se referir a qualquer cepa que se adere às células HEp-2 e He-La

que não forme microcolônias típicas de EPEC. Com a descoberta da EAEC, alguns autores

reconhecem a DAEC como uma categoria independente, potencialmente causadora de

diarreia. Como se trata de uma categoria ainda não muito estudada, pouco se sabe sobre sua

patogênese (MINAGAWA, 2007).

33

E. coli patogênica aviária (APEC) apresentam fatores de virulência como a

expressão de adesinas, a produção de sideróforos e a capacidade de resistir aos efeitos

microbicidas do soro como agentes fundamentais da manutenção e sobrevivência do

microrganismo no hospedeiro, os quais são responsáveis pelo desenvolvimento da

colibacilose aviária, termo que se refere a qualquer infecção, localizada ou sistêmica, causada

por APEC (DELICATO et al., 2003; PRIOSTE et al., 2013). A maior parte das APEC

isoladas de aves de produção é patogênica apenas para aves e apresentam um baixo risco de

doença para humanos ou outros animais (BARNES et al., 2003; BARCELOS, 2005), embora

alguns trabalhos frequentemente comparem cepas APEC a cepas isoladas de casos humanos

de infecções extra intestinais (RODRIGUEZ-SIEK et al., 2005; EWERS et al., 2007; MORA

et al., 2012; MORA et al., 2013).

O diagnóstico da colibacilose é feito pela associação do histórico, dos sinais

clínicos, duração da doença, juntamente com práticas laboratoriais baseadas no isolamento e

identificação do agente microbiano. O exame citológico por coloração de Gram, quando

associado ao processamento microbiológico padrão, tem sido evidenciado como uma boa

técnica para detecção bacteriana (MACHADO, 2000; QUINN et al., 2005; CATÃO-DIAS &

CARVALHO, 2007; EVANS et al., 2014). Os clínicos de aves, geralmente, não têm acesso a

testes de sorotipagem, ensaio de toxicidade, sondas de DNA e técnica de PCR, e sem estes

exames complementares não é possível obter informações sobre a patogenicidade da cepa

isolada, dificultando o estabelecimento de protocolo terapêutico e prognóstico da ave avaliada

(FUDGE, 2001).

O tratamento é feito com antibióticos de amplo espectro de ação, suplementos

vitamínicos, dieta balanceada e melhoras nas condições sanitárias e de manejo, sendo

importante ressaltar o emprego prévio de testes de sensibilidade dos isolados para a promoção

terapêutica adequada, sendo necessário acrescentar suplementos vitamínicos, dieta balanceada

e um manejo adequado ao tratamento terapêutico (QUINN et al., 2005; GODOY, 2007;

HIRSH, 2009).

Práticas de desinfecção das habitações das aves, o manejo alimentar adequado aos

animais, o controle de roedores e insetos, assim como a realização rotineira do monitoramento

sanitário e microbiológico do ambiente e dos animais é recomendada por MARIETTO-

GONÇALVES et al. (2010) para garantir a sanidade animal.

34

2.3.2 Salmonella spp.

As salmonelas são bactérias da família Enterobactereaceae que incluem mais de

2500 sorotipos (CAMPOS, 2002). O gênero Salmonella é dividido em duas espécies S.

enterica, no qual são incluídas seis subespécies (enterica, salamae, arizonae, diarizonae,

houtenae e indica) e S. bongori (SÁNCHEZ-VARGAS et al.,2011). São bastonetes curtos,

Gram negativos, aeróbios e anaeróbios facultativos de fácil crescimento em meios comuns

(TORTORA, 2012).

Salmonella spp tem como habitat primário o trato intestinal do homem e de

diversos animais, incluindo insetos, aves, répteis e mamíferos, de forma que sua excreção

resulta na contaminação da água, alimentos e o próprio ambiente (BAÚ et al., 2001). A

ocorrência de Salmonella tem sido muito comum em aves (SILVA & DUARTE, 2002).

Em passeriformes e psitacídeos, a salmonelose é uma causa frequente de doença e

mortalidade causada por uma grande variedade de sorotipos, sendo S. Typhimurium o sorotipo

mais isolado destas aves (PASMANS et al, 2013). Outras espécies isoladas incluem, S.

arizonae, S. houtenae, S. Enteritidis, S. Rissen e S. Pullorum (MARIETTO-GONÇALVES et

al, 2010). O resultado da infecção pode variar desde o desenvolvimento de portadores

assintomáticos a surtos de doenças com mortalidade elevada. Nos casos subclínicos, as aves

podem tornar-se portadores persistentes ou temporários, eliminando contínua ou

intermitentemente o agente através das fezes (FLAMER, 1999; PASMANS et al., 2013).

2.3.3 Proteus spp.

As bactérias do gênero Proteus sp. são bacilos Gram negativos anaeróbicos

facultativos, móveis, catalase positivos e oxidase negativos. Hidrolisam ureia, produzem H2S,

e são lisina descarboxilase e lactose negativos. Para a diferenciação entre as espécies (Proteus

vulgaris e Proteus mirabilis) devem ser analisadas as variações que ocorrem nos testes de

indol, Voges-Proskauer e citrato de Simmons (HOLT et al., 1994; OLIVEIRA, 1995).

Habitualmente encontradas no solo, na água e em materiais contaminados com

fezes, as bactérias desse gênero são constituídas por cinco espécies: P. vulgaris, P. mirabilis,

P. myxofaciens, P. penneri e P. hauseri (KONEMAN et al., 2010). P. mirabilis e P. vulgaris

correspondem às duas espécies mais estudadas desse gênero, nos quais ambas já foram

isoladas do trato intestinal de mamíferos, aves e répteis (MANOS & BELAS, 2006).

35

Proteus spp. fazem parte da microbiota do intestino grosso. Potencialmente

patogênicos para aves, apontados como causa de lesões nos pés e doenças respiratórias como

aerosaculite e pneumonia caseosa, quando o animal tem imunodepressão, esta bactéria pode

infectar os ovos através da penetração do microrganismo pela casca, que é facilitada pela

contaminação fecal. Apesar de Proteus spp. estar frequentemente relacionado a infecções no

trato urinário, estas bactérias podem ser isoladas de muitas partes infectadas do corpo

(GODOY; CUBAS, 2009; BROOKS et al., 2014), e quadros de septicemia foram observados

em codornas e faisões infectados com vírus apatogênico da influenza aviária. Em aves

aquáticas é capaz de causar salpingite, artrite, aerossaculite e septicemia (BARNES, 2003).

2.3.4 Citrobacter spp.

As espécies do gênero Citrobacter apresentam potencial zoonótico, atuando como

agente de infecções secundárias ao atingir as aves (GODOY, 2007; RITCHIE et al., 1994).

Segundo GERLACH (1994) as três espécies mais comuns do gênero Citrobacter são C.

freundii, C. amalonaticus e C. diversus, que são menos frequentemente isoladas de aves do

que outros membros da família Enterobacteriaceae. Destas, a espécie C. freundii parece ser a

mais patogênica das três, proprocionando o desenvolvimento de sinais como depressão,

diarreia e óbito (GODOY, 2007), enquanto que C. diversus é raramente isolada de aves.

Adicionalmente, é de conhecimento científico que as aves que sobrevivem a uma infecção por

esse patógeno podem se tornar carreadoras. Este gênero causa infecções secundárias graves,

ocorrendo rápida bacteremia seguida por morte aguda quando o microrganismo penetra a

mucosa intestinal. Contudo, não há casos de infecções humanas derivadas de exposição a aves

infectadas (GERLACH, 1994).

2.3.5 Pantoea sp.

Pertencente à familia Enterobacteriaceae, Pantoea agglomerans (previamente

classificada como Bacillus agglomerans e Enterobacter agglomerans) é um bacilo Gram

negativo, comumente encontrado em nichos ecológicos como água, solo, esgoto, sementes,

vegetais, material feculento e alimentos, bem como relatado como patógenos oportunistas de

animais e humanos (SHARMA et al.2012). KIRZINGER et al. (2015) relata que várias cepas

de Pantoea, incluindo uma de ambiente clínico, realizam intercâmbio genético de

mecanismos metabólicos importantes na colonização de hospedeiros vegetais e animais com

outros membros da família Enterobacteriaceae, incluindo espécies patógenas para humanos.

36

GIBBS et al. (2007) relata que a bactéria P. agglomerans foi a mais isolada de

amostras de fezes de Graúnas de Cabeça Amarela (Xanthocephalus xanthocephalus). Estes

autores afirmaram que esta espécie pode ser estudada como possível organismo de exclusão

competitiva para a microbiota de aves de produção, devido à habilidade que este

microrganismo possui em inibir a colonização por patógenos em plantas e a aparente

adaptabilidade ao sistema gastrointestinal destas aves.

2.3.6 Providencia spp.

O gênero Providencia pertence à família Enterobacteriaceae e apresenta

semelhanças fenotípicas com os gêneros Proteus e Morganella, também incluídos nessa

família. A taxonomia do gênero Providencia tem sido caracterizada por uma grande

instabilidade. Atualmente, este gênero consiste de cinco espécies: Providencia alcalifaciens,

Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia rustigianii e Providencia heimbachae

(PIGNATO et al, 1999).

São bastonetes Gram-negativos e anaeróbios facultativos, com motilidade devido

à presença de flagelo peritríqueo, apresentando as seguintes características bioquímicas:

citrato de Simmons positivo, não produz H2S, negativo no teste de lisina e ornitina

descarboxilase, fermenta manose e a hidrólise da ureia é variável (O'HARA et al., 2000).

Apesar de considerada uma bactéria da flora fisiológica de algumas espécies de

aves, Providencia spp. já foi associada a nefrite devido a ascensão da bactéria a partir da

cloaca (LUMEIJ, 1994).

2.3.7 Outras enterobactérias

Klebsiella possui células capsuladas e alta capacidade de fermentação de diversos

carboidratos, sendo um dos poucos membros da família Enterobacteriaceae que é imóvel. A

principal espécie do gênero é K. pneumoniae que, assim como K. oxytoca e algumas outras

espécies do gênero menos frequentes, atuam como patógenos oportunistas em humanos,

sendo encontrados no ambiente e muitas vezes causando infecções nosocomiais (BERGEY et

al., 1994). As infecções por Klebsiella spp. em psitacídeos, mais especificamente por K.

pneumoniae e K. oxytoca, envolvem o trato respiratório e intestinal, acarretando em

problemáticas como sinusite, aerossaculite, pneumonia caseosa e, eventualmente, hepatite,

nefrite, afecções do sistema nervoso e desenvolvimento de uma resposta septicêmica

37

(GODOY, 2007). Não são conhecidas informações especificas sobre as vias de transmissão,

período de incubação e patogenia de Klebsiella spp nas aves (BROWN, 2000), mas de acordo

com GERLACH (1994), as bactérias desse gênero podem desencadear um quadro de

bacteremia, sendo passíveis de afetarem os rins, promovendo problemáticas relacionadas a

falhas renais, bem como nas infecções crônicas, os pulmões podem ser apresentar como

órgãos alvo. Desse modo, embora, a infecção sistêmica possa ser mais comum que a local, em

psitaciformes afecções no pele, cavidade oral e papo podem ser desenvolvidas.

As bactérias do gênero Enterobacter fazem parte da microbiota entérica comensal,

sendo associadas a uma variedade de infecções oportunistas que afetam as vias urinarias e o

trato respiratório (KONEMAN et al., 2010). O gênero possui 16 espécies, todavia as espécies

E. aerogenes e E. cloacae são as mais comumente isoladas de amostras biológicas.

Encontram-se distribuídas amplamente na água, esgoto, solo e vegetais. O grau de infecção e

de invasão bacteriana varia quanto ao tipo de enterobactéria, porém, de um modo geral, a sua

proliferação e disseminação no organismo do homem ou do animal que atinge depende da

idade do hospedeiro, das espécies e de suas condições fisiológicas, estando associadas uma

variedade de infecções oportunistas humanas que afetam as vias urinárias, o trato respiratório,

as feridas cutâneas e, em ocasiões, causam septicemia e meningite (KONEMAN et al, 2010).

As outras enterobactérias, tais como as espécies dos gêneros Edwarsiella,

Morganella, e Serratia atuam como patógenos oportunistas para os animais, suscitando

infecções em diferentes regiões anatômicas, além de depender de circunstâncias como a

imunidade do hospedeiro, a presença de infecções primárias, tecidos danificados e a própria

virulência bacteriana para o desenvolvimento de uma atividade patogênica (QUINN et al.,

2005; TIZARD, 2009). Essas enterobactérias já foram previamente isoladas em estudos

realizados com psitacídeos de cativeiro e canários (HIDASI et al., 2013; HORN et al., 2015;

LOPES et al., 2015).

2.4 Pseudomonas aeruginosa

Este microrganismo da família Pseudomonadaceae (PALLERONI et al., 1973),

caracteriza-se como bastonete Gram-negativo reto ou ligeiramente curvo, aeróbio estrito,

podendo ser observado como células isoladas, aos pares, ou em cadeias curtas, revelando

mobilidade através de flagelo polar monotríquio (POLLACK, 2000). P. aeruginosa é não

fermentadora de carboidratos, produtora de citocromo-oxidase, utiliza o nitrato em

38

substituição ao oxigênio como aceptor final de elétrons, produzindo também Arginina

dehidrolase e Ornitina-descarboxilase. A pioverdina e a piocianina são pigmentos

fluorescentes difusíveis no meio de cultura produzidos por este microrganismo. Algumas

cepas produzem um pigmento avermelhado (piorrubina) ou preto (piomelanina) (POLLACK,

1983).

É um patógeno oportunista que normalmente habita o solo e superfícies em

ambientes aquosos. Sua adaptabilidade e alta resistência intrínseca aos antibióticos permitem

sobreviver em uma ampla gama de outros ambientes naturais e artificiais, incluindo

superfícies em instalações médicas. As infecções graves de P. aeruginosa são frequentemente

nosocomiais e quase todas estão associadas a defesas do hospedeiro comprometidas, como em

neutropenia, queimaduras graves ou fibrose cística (LYCZAK et al., 2000). O espectro de

doenças causadas por este agente compreende desde infecções superficiais da pele a sepse

fulminante (MURRAY, 1995). P. aeruginosa pode causar infecção aguda pela produção de

toxinas e infecção crônica pela ação da camada espessa que consiste no seu biofilme, e ainda,

pode resultar no somatório dos tipos de infecção pela ação concomitante desses componentes

(PALLERONI, 1998).

Devido ao surgimento e disseminação contínua de cepas resistentes aos

antimicrobianos, as opções terapêuticas são cada vez mais limitadas; como resultado, as

infecções por P. aeruginosa demonstram alta morbidade e mortalidade. Nos Estados Unidos,

está entre os patógenos hospitalares mais comuns, e é o segundo patógeno mais isolado de

pacientes com pneumonia associada ao ventilador (HIDRON et al., 2008).

2.5 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA

A resistência bacteriana pode ser classificada em dois tipos: resistência adquirida,

na qual microrganismos que são originalmente susceptíveis aos antimicrobianos se tornam

resistentes a eles pela presença de mutação cromossômica ou pela aquisição de plasmídeos ou

transposons que carreiam marcadores de resistência após prolongada exposição; e a

resistência natural, onde os microrganismos apresentam resistência intrínseca a uma variedade

de agentes antimicrobianos (NIKAIDO, 1994).

Segundo Gutiérrez et al. (1990) a resistência bacteriana a antibióticos é um sério

problema do ponto de vista clínico e de saúde pública. Há evidências que o tratamento

39

indiscriminado de animais com antibióticos torne seus produtos e derivados fonte para

resistência aos antibióticos em patógenos da espécie humana. Portanto, é de extrema

importância o isolamento e identificação desses agentes em laboratório, como prova definitiva

no diagnóstico das enfermidades a análise in vitro da sensibilidade antimicrobiana se faz

necessário nas amostras isoladas. Desta forma, contribui-se para um melhor controle, com a

utilização de terapêutica adequada, além de promover um decréscimo na resistência aos

antibióticos.

Caracterizado como uma problemática de alarde mundial, tem se evidenciado

cada vez mais o surgimento de cepas resistentes a antimicrobianos ou resistentes a múltiplas

drogas (MDR) carreados por aves (SHOBRAK e ABO-AMER, 2014). Essa resistência

adquirida é uma das principais causas de insucesso da terapia antimicrobiana, uma vez que

prejudica os tratamentos ao limitar as opções viáveis de antimicrobianos (SPINOSA, 2006).

A transferência de genes por membros da família Enterobacteriaceae já foi

demonstrada in vitro por Okamoto et al. (2011), os quais demonstraram que E. coli pode

transferir genes plasmidiais de resistência de forma horizontal para Salmonella Enteritidis,

todavia os mesmos afirmam que in vivo outras condições podem ser desfavoráveis para que

este fenômeno ocorra.

Resistência a múltiplos antimicrobianos em cepas de enterobactérias já foram

evidenciados em diversos estudos com aves de vida livre (SANTOS et al., 2013; SMITH et

al., 2014; STEDT et al., 2014), como também em aves silvestres de cativeiro (HIDASI et al.,

2013; LOPES et al., 2015).

Existem dois métodos de avaliação da sensibilidade bacteriana: o método

quantitativo e o qualitativo. O método quantitativo determina a concentração inibitória

mínima (CIM), definida como a menor concentração do antibiótico capaz de inibir o

crescimento bacteriano, enquanto o método qualitativo mais usual consiste no método de

discodifusão, no qual emprega discos de papel de filtro impregnados com concentrações fixas

de antibióticos (FREITAS et al., 2013).

Os testes in vitro não são capazes de mimetizar a concentração de antimicrobianos

e a sua real biodisponibilidade a nível intestinal, tendo a sua confiabilidade reduzida, o que

representa desvantagens no emprego dessas técnicas de avaliação do perfil de sensibilidade.

40

Além disso, a ausência das condições naturais no método in vivo tais como a relação

hospedeiro e droga empregada, assim como a própria reação bacteriana ante o ambiente

apresentada pelo hospedeiro (PRESCOTT, 2009) são outras desvantagens. Apesar disso, os

métodos in vitro ainda consistem no melhor exame para orientação ante uma terapia anti-

infecciosa (FREITAS et al., 2013).

3 JUSTIFICATIVA

Com a popularização da criação de calopsitas como animais de companhia tem se

verificado seu crescente contato com o homem, gerando o risco da transmissão de micro-

organismos potencialmente patogênicos para outros animais, incluindo o homem. Nesse

contexto, essas aves são passíveis de albergarem diversas bactérias, dentre elas destacando-se as

pertencentes ao gênero Escherichia coli, agente de inúmeras patologias.

Desse modo, o conhecimento da presença, comportamento patogênico e

resistência antimicrobiana desses patógenos são de grande importância para o controle de

possíveis problemas sanitários relacionados a esses micro-organismos, permitindo o

fornecimento de dados essenciais para o estabelecimento de diagnóstico de enfermidades, como

também de medidas preventivas de controle a serem adotadas pelos criadores.

41

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA

É possível isolar cepas de diversas bactérias Gram-negativas em Psittaciformes, portanto

estas podem ser disseminadas ao meio ambiente pelas calopsitas. Os microrganismos presentes

nas calopsitas podem apresentar resistência a antibióticos e assim promover um risco de

transmissão de resistência a patógenos humanos.

42

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Investigar a presença de bactérias Gram-negativas em calopsitas (Nymphicus

hollandicus) obtidas de pet shops e residências e avaliar seus perfis de resistência a

antimicrobianos.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

5.2.1 Isolar e tipificar as bactérias Gram-negativas de amostras de suabes cloacais

e fezes de calopsitas presentes em cativeiro domiciliar e Pet shops, assim como de aves

clinicamente doentes e destinadas à avaliação clínica;

5.2.2 Avaliar a resistência a antimicrobianos das cepas de bactérias Gram-

negativas isoladas de calopsitas;

43

5.2.3 Identificar genes diarreiogênicos presentes nas cepas de Escherichia coli

isoladas das aves;

5.2.5 Verificar os riscos de calopsitas serem albergadoras de microrganismos de

interesse na saúde humana.

6 CAPÍTULO 1

Detection of enterobacteria and antimicrobial sensibility in cockatiels (Nymphicus

hollandicus) from house-captive and pet shops

Detecção de enterobactérias e sensibilidade antimicrobiana em calopsitas (Nymphicus

hollandicus) de cativeiro domiciliar e Pet shops

44

Periódico submetido: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

(Submetido em Novembro – QUALIS A2)

DETECÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS, SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANA E

ANÁLISE DE PCR DE Escherichia coli DIARREIOGÊNICAS EM CALOPSITAS

(Nymphicus Hollandicus) DE PET SHOPS E RESIDÊNCIAS DE FORTALEZA - CE

[Enterobacterial Detection, Antimicrobial Sensitivity and PCR Analysis of Escherichia coli

Diarreiogenic in Pet shops and Household Cockatiels]

S.V.G. Lima*1, A.P.A da Silva

1, E.S. Lopes

1, M.D. Bona

2, R.V. Horn

1, P.H.Q.S. de

Medeiros2, R.S.C. Teixeira

1, A.H. Bindá

2, W.M. Cardoso

1

1Laboratório de Estudos Ornitológicos (LABEO). Programa de Pós-Graduação em Ciências

Veterinárias (PPGCV), Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE),

1700, Campus do Itaperi, Fortaleza, CE, Brasil.

2Laboratório de Toxinologia Molecular. Escola de Medicina da Universidade Federal do

Ceará (UFC), Campus do Porangabussu, Fortaleza, CE, Brazil

*Autor para correspondência: email: [email protected]

45

RESUMO

O objetivo do presente trabalho foi identificar e avaliar os perfis de resistência de cepas de

enterobactérias isoladas de calopsitas e analisar a presença de cepas de E. coli diarreiogênicas

(DEC) nesses animais. 182 amostras foram coletadas e submetidas a pré-enriquecimento

utilizando água peptonada; enriquecimento seletivo com os meios Rappaport-Vassiliadis,

Selenito-Cistina e Brain Heart Infusion (BHI); e triagem em placas contendo os ágares Verde

Brilhante, MacConkey e Salmonella-Shigella. As colônias foram selecionadas e submetidas à

identificação bioquímica e susceptibilidade antimicrobiana. Foram avaliadas 21 cepas de E.

coli quanto à presença de oito genes de virulência de DEC por reação em cadeia da

polimerase (PCR). As enterobactérias encontrada com maior frequência foi Pantoea

agglomerans (28%), Citrobacter freundii (11%) e Serratia liquefaciens (10%). Dois

antibióticos apresentaram baixa eficácia contra as bactérias testadas: Sulfonamida (22%) e

Cotrimoxazol (sulfametoxazol + trimetoprim) (21%). O total de bactérias multirresistentes

(MDR) foi de 158 (50%). Apenas uma cepa de E. coli foi positiva para os genes eaeA e bfpA,

que foi classificada como EPEC típica. Calopsitas apresentam enterobactérias

multirresistentes e cepas de E. coli contendo genes de virulência relacionados a EPEC, que são

potencialmente patogênicas para animais e humanos.

Palavras-chave: Enterobactérias, antibiograma, Escherichia coli diarreiogênicas, EPEC,

calopsitas

SUMMARY

The objective of the present work was to identify and evaluate the resistance profiles of

strains of enterobacteria isolated from calopsites and to analyze the presence of strains of

diarrheogenic E. coli (DEC) in these animals. 182 samples were collected and submitted to

pre-enrichment using peptone water; selective enrichment with Rappaport-Vassiliadis,

Selenito-Cystine and Brain Heart Infusion (BHI) media; and screening on plaques containing

the Green Bright, MacConkey and Salmonella-Shigella agar. The colonies were selected and

submitted to biochemical identification and antimicrobial susceptibility. Twenty-one E. coli

strains were evaluated for the presence of eight DEC virulence genes by polymerase chain

reaction (PCR). The enterobacteria found most frequently were Pantoea agglomerans (28%),

46

Citrobacter freundii (11%) and Serratia liquefaciens (10%). Two antibiotics showed low

efficacy against the tested bacteria: Sulfonamide (22%) and Cotrimoxazole (sulfamethoxazole

+ trimethoprim) (21%). Total multiresistant bacteria (MDR) was 158 (50%). Only one E. coli

strain was positive for the eaeA and bfpA genes, which was classified as typical EPEC.

Cockatiels present multiresistant enterobacteria and E. coli strains containing EPEC-related

virulence genes, that are potentially pathogenic to animals and humans

Key words: Enterobacteria, antibiogram, diarrheogenic Escherichia coli, EPEC, cockatiels

INTRODUÇÃO

Calopsitas (Nymphicus hollandicus) são atualmente um dos psitacídeos mais

populares mantidos como animais de companhia, devido à sua inteligência e habilidades, e à

adaptabilidade da espécie a pequenos ambientes. Contudo, erros de manejo associados ao

stress do confinamento predispõem esses animais à diversas doenças, e devido à proximidade

dessas aves com seus proprietários, o risco da ocorrência de doenças relacionadas a patógenos

capazes de infectar diferentes hospedeiros se torna relevante (DLUGOSZ et al, 2015.)

Entre as bactérias apontadas como importantes patógenos aviários, os principais

agentes envolvidos nas doenças gastrintestinais são as enterobactérias, particularmente

Salmonella sp., Escherichia coli e Enterobacter sp., que podem causar tanto infecções

intestinais como extraintestinais, afetando também outras espécies de aves e mamíferos

(MEYER JÚNIOR, et.al, 2006; QUEIROZ, 2008).

E. coli é uma das principais causas de mortalidade em aves e é responsável por

perdas econômicas significativas em todo o mundo (SCHOULER et al., 2012). Além disso, E.

coli diarreiogênicas (DEC) estão relacionadas com doenças intestinais/diarreicas, infecções do

trato urinário, sepse e meningite em humanos. Em relação as E. coli diarreiogênicas, existem

47

seis tipos bem definidos: EPEC – E. coli enteropatogênica, EHEC - E. coli enterohemorrágica,

EAEC – E. coli enteroagregativa, EIEC - E. coli enteroinvasiva, ETEC - E. coli

enterotoxigênica e DAEC - E. coli difusamente aderente (KAPER; NATARO; MOBLEY,

2004). Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi identificar e avaliar os perfis de

resistência de cepas de enterobactérias isoladas de calopsitas provenientes de residências e pet

shops em Fortaleza – CE, e analisar a presença de cepas de E. coli diarreiogênicas nesses

animais.

MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da

Universidade Estadual do Ceará (Protocolo 647396-2015). De setembro de 2015 a maio de

2016, foram coletadas 182 amostras, das quais 110 foram suabes cloacais individuais e 72

suabes de arrasto, de 18 criatórios. As aves analisadas foram obtidas de 8 domicílios, 7 pet

shops e 3 aviários localizados na cidade de Fortaleza, no Ceará, Brasil. As amostras foram

coletadas em tubos contendo água peptonada tamponada (Himedia, Mumbai, India) e

transportadas para o Laboratório de Estudos Ornitológicos (LABEO) da Universidade

Estadual do Ceará (UECE) para processamento microbiológico. Posteriormente, alíquotas das

amostras foram transferidas para tubos contendo Brain Heart Infusion (Himedia, Mumbai,

India) e tubos com caldo Selenito Cistina (Himedia, Mumbai, India) e Rappaport Vassiliadis

(Merck). Sequencialmente, as amostras foram estriadas em placas com ágar MacConkey

(Himedia, Mumbai, India) e em ágar Hektoen (Himedia, Mumbai, India). Colônias com

características morfológicas de enterobactérias foram selecionadas e identificadas por meio de

bateria de provas bioquímicas. A temperatura e o período de incubação para cada etapa foram

padronizados respectivamente em 37° C e 24 horas.

O teste de sensibilidade antimicrobiana foi realizado utilizando o método de

difusão em disco em ágar Mueller-Hinton (Himedia®) seguindo os padrões fornecidos pelo

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2013). Foram utilizados os seguintes

discos nas respectivas concentrações: Azitromicina (15 μg), ácido nalidíxico (30 μg),

Ciprofloxacina (5 μg), Enrofloxacina (5 μg), Cloranfenicol (30 μg), Estreptomicina (10 μg),

Gentamicina (10 μg), Tetraciclina (30 μg), Ceftiofur (30 μg), Polimixina B (300 μg),

Cotrimoxazol (sulfametoxazol + trimetoprim) (25 μg) e Sulfonamida (300 μg) (Laborclin,

Pinhais, PR, Brasil). Os resultados foram interpretados medindo as zonas de inibição ao redor

48

dos discos (CLSI, 2015), e as zonas intermediárias foram interpretadas como resistência ao

respectivo antibacteriano; as cepas que mostraram resistência fenotípica a três ou mais

antibióticos foram consideradas multirresistentes. A amostra de controle utilizada para este

teste foi a estirpe de E. coli ATCC 25922.

Adicionalmente, realizou-se pesquisa de genes de virulência nas cepas de E. coli

isoladas. As cepas mantidas em ágar nutriente foram reativadas em BHI e plaqueadas em

MacConkey e incubadas durante 24h a 37°C. A partir de cada placa, foram recolhidas duas a

três colônias e colocadas em tubos contendo 1 mL de Triton X-100 a 0,5%, que foram

agitados em vórtice durante 15s e fervidos durante 20min a 94ºC. Os tubos foram então

centrifugados a 10.000 rpm durante 10 min. O sobrenadante contendo DNA foi quantificado e

qualificado por espectrofotometria usando NanoDrop Spectrophotometer 2000 (Thermo

Scientific, Wilmington, EUA). Para diagnóstico molecular de DEC as amostras de DNA

foram submetidas a reações em cadeia da polimerase (PCR). A presença de oito genes de

genes de virulência de cinco patotipos foi avaliada como se segue: genes stx1 (348pb) e stx2

(584pb) para a identificação de E. coli produtoras de Shiga-Toxina (STEC); eltB (508 pb) e

estA (147 pb) para E. coli enterotoxigênica (ETEC); eaeA (881 pb) e bfpA (300 pb) para E.

coli enteropatogênica (EPEC); ipaH (483 pb) para E. coli enteroinvasiva (EIEC); aatA (630

pb) e aaiC (215 pb) para a E. coli enteroagregativa (EAEC) (TANIUCHI ET AL., 2012). As

cepas positivas para os genes eaeA e bfpA foram consideradas EPEC típicas, enquanto que as

positivas exclusivamente para o gene eaeA foram classificadas como EPEC atípicas.

(DONNENBERG & FINLAY, 2013). As estirpes EAEC 042, EHEC O157: H7, EIEC O124,

EPEC 2348/69 e ETEC H10407 foram utilizadas como controles positivos para as reações. A

PCR foi realizada utilizando GoTaqGreen kit (Promega) e iniciadores a 0,4 uM em MyCycler

Thermal Cycler (Biorad, CA, EUA), com o seguinte protocolo: 95°C durante 15 min; 40

ciclos de 95°C durante 30 s, 57°C durante 30 s e 72°C durante 110 min; seguido de 72°C

durante 10 min. Os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese em gel de agarose

corado com brometo de etídio a 2% e fotografados pelo sistema transiluminador ChemicDoc

XRS 112 (Biorad, CA, EUA).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O total de enterobactérias encontrada em suabes cloacais das calopsitas analisadas

foi de 67,9% e de 32,3% em suabes de arrasto (Tab. 1). Dos 315 isolados obtidos, verificou-se

49

que a enterobactéria encontrada com maior frequência foi Pantoea agglomerans (28%),

seguido por Citrobacter freundii (11%), Serratia liquefaciens (10%) e Proteus mirabilis

(9%). Também foram isolados E. coli (8%), Proteus vulgaris (8%), Serratia rubidae (7%),

Providencia spp (7%), Enterobacter cloacae (6%), Citrobacter diversus (3%), Enterobacter

aerogenes (1%), Shigella sp. (1%), e Enterobacter sakazakii (1%). Nenhuma Salmonella foi

isolada (Tab. 2).

Esses dados são consistentes com os achados de HORN et al. (2015), que

identificou Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Pantoea agglomerans,

Serratia spp., e Proteus mirabilis em amostras obtidas em um levantamento de

enterobactérias em canários, bem como LOPES et al. (2015), que também descreve um

número significativo dessas espécies bacterianas em psitacídeos alojados no Centro de

Triagem de Animais Selvagens (CETAS), em Fortaleza, CE, Brasil. Pantoea agglomerans é

relatada na literatura como uma bactéria comumente isolada de plantas, causando raramente

infecção no homem e animais (QUINN et al., 1994; De CHAMPS et al., 2000). Entretanto,

KIRZINGER et al. (2015) relata que várias cepas de Pantoea, incluindo uma de ambiente

clínico, realizam intercâmbio genético de mecanismos metabólicos importantes na

colonização de hospedeiros vegetais e animais com outros membros da família

Enterobacteriaceae, incluindo espécies patógenas para humanos.

TABELA 1. Frequências absolutas e relativas de enterobactérias isoladas de suabes cloacais e

de arrasto de calopsitas (Nymphicus hollandicus) de Fortaleza, Brasil

Espécie Suabe cloacal Suabe de arrasto

n % n %

Pantoea agglomerans 42 13,3 48 15,2

Citrobacter freundii 20 6,3 15 4,76

Serratia liquefaciens 19 6,0 11 3,49

Proteus mirabilis 23 7,3 5 1,59

Serratia rubidae 18 5,7 5 1,59

Proteus vulgaris 21 6,7 4 1,27

Providencia sp 17 5,4 4 1,27

Enterobacter cloacae 15 4,8 4 1,27

Citrobacter diversus 8 2,5 2 0,63

E. coli 26 8,3 0 0,00

Enterobacter aerogenes 1 0,3 3 0,95

Shigella sp. 4 100,0 0 0,00

Enterobacter sakazakii 1 0,3 0 0,00

50

Total

214,0 67,9 101 32,38

Espécies dos gêneros Proteus, Hafnia e Serratia podem atuar como patógenos

oportunistas em certas circunstâncias e resultar em um perigo para a saúde aviária. Na maioria

dos estudos, no entanto, os gêneros Enterobacter spp, Proteus spp., Providencia spp. e

Citrobacter são suspeitas de causarem doenças em homens, e muitas vezes estão associadas a

infecções nosocomiais (STEELE et al., 2005). Citrobacter freundii é considerada uma

bactéria oportunista e ubíqua (FERNANDEZ et al., 2011), foi detectada como agente primário

em casos de morte súbita em papagaios cativos (CHURRIA et al., 2014). Proteus já foi

relatado em aves jovens, sendo identificado como uma população microbiana que tende a

diminuir à medida que as aves envelhecem (NALDO et al., 1988). É considerado um

microrganismo oportunista e têm sido associados a distúrbios do sistema respiratório superior

e pododermatite em aves selvagens (OLINDA et al., 2012). Enterobacter sakazakii tem sido

correlacionada com a ocorrência de surtos de alta mortalidade em rebanhos de canários, e

estes microorganismos têm sido considerados tão importantes como Salmonella e Escherichia

coli (CATTAROSSI et al. 2013).

A ausência de Salmonella tem sido relatada em vários estudos brasileiros recentes,

com baixa ou nenhuma detecção desta bactéria em aves aparentemente saudáveis (BEZERRA

et al. 2013; HORN et al, 2015; LOPES et al, 2015). DLUGOSZ et al. (2105) relatou que não

houve isolamento desse patógeno em um estudo em que se avaliou a presença de Salmonella

sp. em amostras fecais de 86 calopsitas mantidas em cativeiro na região metropolitana de

Curiti

51

TABELA 2. Porcentagem de cepas de Enterobacteriaceae isoladas de calopsitas (Nymphicus hollandicus) resistentes a antimicrobianos.

Espécie Total de cepas

isoladas SUT SUL ENO TET CLO EST GEN CIP CTF NAL AZI POL

Total de cepas

resistentes

n (%) n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n (%)

Pantoea agglomerans 90 (28) 6 7 22 27 2 2 - - - - - - 5 6 3 4 13 16 11 14 19 24 - - 80 (89)

Citrobacter freundii 35 (11) 11 45 5 18 1 2 3 10 1 5 1 5 - - 3 15 - - - - - - - - 25 (71)

Serratia liquefaciens 30 (10) - - 13 50 - - - - - - - - - - - - - - 13 50 - - - - 25 (83)

Proteus mirabilis 28 (9) 16 65 1 3 2 10 NR - 3 12 1 6 - - - - 2 8 - - - - NR - 24 (86)

Serratia rubidae 23 (7) - - 18 100 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 18 (78)

Proteus vulgaris 25 (8) 11 50 2 10 3 14 NR - - - 2 9 - - - - 4 17 - - - - NR - 22 (88)

Providencia spp 21 (7) 5 29 4 20 7 40 2 10 - - - - - - - - - - - - - - - - 18 (86)

Enterobacter cloacae 18 (6) 5 30 - - 2 15 - - 2 10 - - 7 45 - - - - - - - - - - 15 (83)

Citrobacter diversus 10 (3) - - - - - - - - - - - - - - - - - - 4 60 - - 2 40 6 (60)

E coli 26 (8) 8 31 5 20 4 16 2 8 3 10 - - - - 2 8 - - 2 8 - - - - 25 (96)

Enterobacter aerogenes 4 (1) 2 50 - - 1 30 - - 1 20 - - - - - - - - - - - - - - 3 (75)

Shigella 4 (1) 3 75 - - - - - - 1 25 - - - - - - - - - - - - - - 4 (100)

Enterobacter sakazakii 1 (1) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0 (0)

TOTAL 315 (100) 65 21 68 22 22 7 6 2 9 3 5 2 12 4 6 2 19 6 29 9 19 6 3 1 265 (95)

SUT = cotrimoxazol, SUL = sulfonamida, ENO = enrofloxacino, TET = tetraciclina, CLO = cloranfenicol, EST = estreptomicina,GEN = gentamicina, CIP = ciprofloxacino, CTF = cetiofur, NAL = ácido nalidíxico,

AZI = azitromicina, POL = polimixina B; NR = Naturalmente resistente.

52

Curitiba-PR. GOPEE et al. (2000) citam que aves de vida livre são apontadas como potenciais

carreadoras de patógenos para o interior de plantéis de animais, mas que a frequência de

Salmonella sp. em aves de cativeiro é relativamente baixa, quando comparada a mamíferos e

répteis.

Os resultados dos testes de sensibilidade aos antimicrobianos estão demonstrados

na tab. 2. Dois antibióticos apresentaram baixa eficácia contra as bactérias testadas:

Sulfonamida (22%) e Cotrimoxazol (sulfametoxazol + trimetoprim) (21%). Todas as

diferentes espécies de enterobactérias isoladas de calopsitas apresentaram taxas de resistência

variada para os antibióticos testados. Apenas a única Enterobacter sakazakii isolada foi

sensível a todos.

As cepas de Serratia liquefaciens apresentaram resistência para Sulfonamida

(50%) e Ácido Nalidíxico (50%). Citrobacter diversus apresentou alta resistência para Ácido

Nalidíxico (60%) e Polimixina B (40%). As cepas de Shigella (75%), Proteus mirabilis

(65%), Proteus vulgaris (50%), Enterobacter aerogenes (50%), e E. coli (30%) apresentaram

as maiores taxas de resistência à Cotrimoxazol (sulfametoxazol + trimetoprim). O gênero

Providencia apresentou resistência de 40% à Enrofloxacina, enquanto 45% das cepas de

Enterobacter cloacae foram resistentes à Gentamicina. Todas as cepas de Serratia rubidae

apresentaram alta resistência apenas a Sulfonamida (100%).

Entre as 315 enterobactérias isoladas neste estudo, 265 (95,1%) apresentaram

resistência a pelo menos um dos antibióticos testados, e o total de bactérias multirresistentes

(MDR) foi de 158 (50%). O máximo de antimicrobianos para o qual 17 isolados foram

resistentes foi de sete, seguidos por 50 isolados resistentes a seis antimicrobianos (Tab. 3).

TABELA 3. Enterobactérias Multirresistentes (MDR) isoladas de calopsitas (Nymphicus

hollandicus)

Nº de antibióticos Nº de cepas resistentes %

Pelo menos 1

265

84,2

>1

207

65,8

>2

158

50

>3

158

50

>4

149

47,4

>5

149

47,4

>6

50

15,8

>7

17

5,3

53

>8

0

0

Resultados semelhantes já foram obtidos anteriormente por HORN et al. (2015),

que relatou resistência de 55,7% para sulfonamidas. Várias das espécies estudadas por esses

autores também apresentaram resistência para sulfazotrim (sulfametoxazol + trimetoprim) e

ácido nalidíxico. Além disso, 55,7% das bactérias apresentaram multirresistência, e o máximo

de antimicrobianos para o qual um único isolado foi resistente foi de oito, seguidos por três

isolados resistentes a sete antimicrobianos, o que corrobora com os achados deste estudo.

LOPES et al. (2015) relata que 95,1% das cepas analisadas por esses autores mostraram

resistência a pelo menos um dos antibióticos testados, e apenas uma única cepa de Proteus

mirabilis (0,6%) apresentou resistência a 11 dos 12 antibióticos utilizados.

21 cepas de E. coli foram submetidas a PCR apenas 1 (4,7%) foi positiva para os

genes eaeA e bfpA (fig. 1). Considerando a presença desses genes, essa cepa foi classificada

como EPEC típica (tEPEC). KNÖBL e MENÃO (2010) investigou a presença de EPEC típica

e atípica em psitacídeos em um estudo com 80 suabes de fezes frescas coletadas de

psitacídeos no Estado de São Paulo. Vinte e quatro cepas (30%) foram isoladas, mas apenas

duas foram positivas para o gene eae.

Fig. 1 Eletroforese em gel de agarose de produtos de PCR. Coluna 1: Marcador Molecular. Coluna 2: Controle positivo para

o gene eaeA. Coluna 3: amostra negativa. Coluna 4: amostra isolada de calopsita positiva para o gene eaeA. Colunas 5, 6 e

7: amostras negativas. Coluna 8: Controle negativo. Coluna 9: Controle positivo para o gene bfpA. Coluna 10: amostra

negativa. Coluna 11: amostra isolada de calopsita positiva para o gene bfpA. Colunas 12, 13 e 14: amostras negativas.

Coluna 15: Controle negativo.

EPEC foi o primeiro patotipo a ser descrito e continua sendo um importante

agente etiológico de diarreia infantil em todo mundo, com elevada prevalência em ambientes

hospitalares e comunidades carentes (WHO, 2002), bem como também é relatado ser uma das

principais causas de diarreia persistente (ABBA et al., 2009).

54

As cepas de EPEC são classificadas em típicas quando abrigam o plasmídeo para

o fator de aderência de EPEC (EAF), que codifica bfp (bundle forming pili), enquanto as

cepas atípicas são negativas para o gene bfp (TRABULSI et al, 2002). Em aEPEC, a presença

de certos marcadores genômicos adicionais está fortemente associada com diarreia crônica

(AFSET, J.E. et al.,2006).

REPLE et al. (2015) investigou a presença de grupos filogenéticos de EPEC e

STEC em cepas isoladas de fezes de 448 psitacídeos, obtendo elevada frequência de

ocorrência de E. coli positiva para os genes eae e bfp em calopsitas (39,3%). Destas, 14,58%

foram classifcadas como EPEC típicas e como EPEC atípicas (5/48). TRABULSI et al.

(2002) relata que EPEC típicas são raramente isoladas de animais, sendo este patotipo

encontrado majoritariamente em humanos. A presença de EPEC típicas nesses psitacídeos

sugere a transmissão de caráter antropozoonótico como a mais provável.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Verificou-se a presença de enterobactérias nas calopsitas estudadas, além da

detecção de uma amostra de E. coli positiva para genes de virulência relacionados a EPEC.

Além disso, os resultados mostraram que essas bactérias possuíam elevado percentual de

resistência aos antimicrobianos estudados. Estes resultados indicam a necessidade de medidas

preventivas que visem melhorar as condições sanitárias, como por exemplo, reduzir a

contaminação ambiental e dos alimentos ofertados aos animais.

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58

7 CAPÍTULO 2

Prevalence and antibiogram analysis of Pseudomonas spp. in cockatiels (Nymphicus

hollandicus) from Fortaleza, CE

Prevalência e análise de antibiograma de Pseudomonas spp. em calopsitas (Nymphicus

hollandicus) de Fortaleza, CE

59

Periódico submetido: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

(Submetido em Novembro – QUALIS A2)

PREVALENCE AND ANTIBIOGRAM ANALYSIS OF Pseudomonas spp. IN

COCKATIELS (Nymphicus hollandicus) FROM FORTALEZA, CE

[Pseudomonas spp. in cockatiels from Fortaleza]

Suzan Vitória Girão Lima1,2

, William Cardoso Maciel1, Windleyanne Gonçalves Amorim

Bezerra1, Jackson Forte Beleza

1, Fernanda Gaio Conceição

1, Régis Siqueira de Castro

Teixeira1

1Laboratory of Ornithological Studies (LABEO). Graduate Program in Veterinary Science

(PPGCV), Faculty of Veterinary Medicine, State University of Ceará (UECE), Itaperi

Campus, Fortaleza, CE, Brazil. Fax +55 (85) 3101-9860]. Faculty of Veterinary Medicine,

PPGCV, UECE. Av. Dr. Silas Munguba, n. 1700, Itaperi Neighborhood. CEP 60.714.903

Fortaleza-CE. Brazil.

2Correspondence: S.V.G. Lima [[email protected]]

Abstract

Cockatiels (Nymphicus hollandicus) are among the most common pet bird, but little is known

about the zoonotic risks of these animals. Thus, the objective of the present work was to

identify and evaluate the resistance profiles of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from

cockatiels (Nymphicus hollandicus) from residences and pet shops in Fortaleza - CE. A total

of 182 samples (110 individual cloacal suabes and 72 drag suabes) were collected from

eighteen domiciliary breeding location. Twenty-nine (Pseudomonas aeruginosa) strains were

identified, and the antimicrobial resistance profiles of the strains were determined using the

disk diffusion method. All the 29 strains tested presented resistance to at least one antibiotic.

Furthermore, 21 isolates showed a multidrug resistance profile, corresponding to 72.4 % of

the total, and the maximum number of antibiotics to which a strain presented resistance was 7.

The results indicate that common pet birds such as cockatiels can harbor strains of

Pseudomonas sp., a pathogen harmful to both animal and human health. In addition, a high

rate of antimicrobial resistance was verified.

60

Keywords: Antimicrobial resistance, Pseudomonas aeruginosa, Cockatiel

INTRODUCTION

Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous and metabolically versatile Gram-negative

bacterium notable for its ability to thrive in highly diverse ecological niches, and due to

numerous virulence factors that contribute to its pathogenesis, can cause significant morbidity

and mortality among compromised humans1,2

. Moreover, P. aeruginosa possesses an intrinsic

resistance to many antimicrobials because of the bacterium’s outer membrane barrier, the

presence of multidrug efflux transporters, and endogenous antimicrobial inactivation3.

Due to the frequency with which it is involved in infections in man, it represents a serious

problem, particularly in hospitalized patients, since most infections with Pseudomonas

species occur in compromised hosts4,5,6

. The pathogenicity of these organisms is based on its

ability to produce a variety of toxins and proteases and on its ability to resist phagocytosis4.

The clinical picture is extremely severe, especially in patients with immune system

deficiencies or chronic infections and in patients with acquired immunodeficiency syndrome,

with severe burns, cancer, and mortality rates may reach 50%5,6

.

Pseudomonas aeruginosa causes diseases in plants and animals, being a common avian

pathogen7,8,9

, principally affecting the upper respiratory tract, causing respiratory tract

infections8,10,11

, being also frequently isolated from hemorrhagic enteritis, corneal ulcers, and

septicemia in birds12

.

P. aeruginosa resistance to different antimicrobials may be intrinsic due to the low

permeability of its membrane and the ability to form a biofilm, or readily acquired by the

association with microorganisms commonly resistant to antibiotics via chromosomal

mutations and lateral gene transfer, becoming a dangerous and dreaded pathogen3,13,14

. The

only antibiotic agents to which strains are regularly sensitive are cephalosporins,

5carbenicillin, colistin, gentamicin, polymyxin, quinolones, and streptomycin; however,

degrees of cross-resistance between these agents have been reported13

.

61

Therefore, the aim of this study was to identify and evaluate the resistance profiles of

Pseudomonas aeruginosa strains isolated from cockatiels (Nymphicus hollandicus) from

residences and pet shops in Fortaleza - CE.

MATERIAL AND METHODS

Sampling

This study was approved by the Local Ethics Committee for the Use of Animals from the

State University of Ceará (Protocol 647396-2015). From September 2015 to May 2016 a total

of 182 samples were collected, from which 110 were individual cloacal suabes and 72 were

drag suabes samples from eighteen domiciliary breeding location. The birds analyzed were

from households, pet shops and aviaries located in the city of Fortaleza in Ceará State, Brazil.

The cloacal suabe samples were placed in tubes containing buffered peptone water broth

(Himedia, Mumbai, India), which were maintained in a box containing ice in order to preserve

their intrinsic properties. The collected material was transported to the Laboratory of

Ornithological Studies (LABEO), located at the State University of Ceará, for the

microbiological procedure. When present, clinical signs from each sampled bird were taken

note.

Laboratory method

The samples stored in tubes containing buffered peptone water were removed from the ice

box and incubated in a bacteriological incubator for 24 h at 37ºC, which was the

standard duration and the temperature used in all procedures performed in this study. In the

following step, aliquots of 1 mL of the initial samples were transferred to tubes containing

Brain Heart Infusion broth (Himedia, Mumbai, India), and then placed again in the incubator.

In the third step, the colonies were removed aseptically with a nickel-chrome handle and

plated on MacConkey agar (Himedia, Mumbai, India), and posteriorly incubated.

For each sample, one to three bacterial colonies were selected based on morphology and

pigmentation of the colonies and submitted to the following biochemical tests for bacterial

identification: investigation of classic fermentation characteristics in TSI agar (Triple– Sugar-

Iron), decarboxylation reactions in the LIA (Lysine Iron agar), production of sulfide, indole

62

and motility in SIM medium, as well as biochemical activities in methyl red and

vogesProskauer tests, ornithine decarboxylase, mannitol, arabinose, raffinose, dulcitol,

adonitol, inositol, urease, rhamnose, citrate, malonate, glucose and lactose (Acumedia,

lansing, Michigan, USA; Difco, Le pont de craix, France)15

.

Antimicrobial resistance

The antimicrobial susceptibility test was performed using the disk diffusion method in

Mueller-Hinton agar (Himedia®) following the standards provided by Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI, 2013). The following discs in the respective

concentrations were used: Azithromycin (15 µg), Nalidixic acid (30 µg), Ciprofloxacin

(5 µg), Enrofloxacin (5 µg), Chloramphenicol (30 µg), Streptomycin (10 µg), Gentamycin (10

µg), Tetracycline (30µg), Ceftiofur (30 µg), Polymyxin B (300 µg), Sulfamethoxazole and

trimethoprim (25 µg) and Sulfonamide (300 µg) (Laborclin, Pinhais, PR, Brazil). Results

were interpreted measuring the inhibition zones around the discs; the strains that showed

phenotypic resistance to three or more antibiotics were considered multidrug resistant. The

control sample used for this test was the Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 strain.

RESULTS

A total of 29 strains of Pseudomonas aeruginosa were isolated, from which 24 (13,1%) were

found in cloacal suabes of the analyzed birds, and 5 (6,9%) from drag suabes samples.

Table 1. Percentage of Pseudomonas sp. strains isolated from cockatiels (Nymphicus

hollandicus) resistant to antimicrobials

ATB N = 29 %

R I S R I S

SUT 23 4 2 79,3 13,8 6,9

SUL 23 - 6 79,3 - 20,7

ENO - - 29 - - 100,0

TET 13 4 12 44,8 13,8 41,4

CLO 13 6 10 44,8 20,7 34,5

EST 8 12 9 27,6 41,4 31,0

GEN 3 24 2 10,3 82,8 6,9

CIP - - 29 - - 100,0

CTF 14 1 14 48,3 3,4 48,3

NAL 27 2 - 93,1 6,0 -

AZI 24 - 5 82,8 - 17,2

63

POL 2 - 27 6,9 - 93,1 ATB = antimicrobial; SUT = Sulfazotrim (Sulfamethoxazole+trimethoprim; SUL = sulfonamides;

ENO = enrofloxacin; TET = tetracycline; CLO = chloramphenicol; EST = streptomycin; GEN =

gentamycin; CIP = ciprofloxacin; CTF = cetiofur; NAL = nalidixic acid; AZI = azithromycin; POL

= polimyxin B.

Table 1 shows the variable resistance levels exhibited by the strains to 10 of the 12

tested antibiotics, where only enrofloxacin and ciprofloxacin were fully effective against all of

the tested strains. The antibiotic to which strains presented the most frequent resistance was

Nalidixic acid (93,1%), followed by azithromycin (82,8%). All the 29 (100,0%) strains tested

presented resistance to at least one antibiotic. Furthermore, 21 isolates showed a multidrug

resistance profile, corresponding 72.4 % of the total. The maximum number of antibiotics to

which a strain presented resistance was 7 (7 strains), followed by 6 (8 strains) (Table 2).

Table 2. Multidrug-resistant (MDR) Pseudomonas sp. strains isolated from cockatiels

(Nymphicus hollandicus)

Nº of antimicrobials Nº of resistant strains (%)

At least 1 29 (100)

>1 29 (100)

>2 28 (96,6)

>3 21 (72,4)

>4 13 (44,8)

>5 8 (27,6)

>6 7 (24,1)

>7 0 (0)

DISCUSSION

The analysis of the samples allowed the identification of 29 strains of P. aeruginosa.

24 (21,8%) were found in cloacal suabes of the analyzed birds. A study from 2015 in nestling

red-tailed amazon indicated a prevalence of Pseudomonas spp. in 31.57% of the samples16

.

The authors regarded the finding as common since these bacteria are widely distributed in the

world and are frequently found in cultures with samples of coana and cloaca17

. However,

several studies in broiler chicks and egg layers demonstrated the presence of systemic

symptoms such as congested liver, heart, lungs and kidneys, enlargement of the yolk sac,

embryonic mortality in hatcheries, septicemic infections in newly hatched chickens.

Moreover, the pathogenicity of P. aeruginosa was associated with localized and systemic

hemorragyc lesions both in young and growing birds18,19

.

64

5 (6,9%) strains were obtained from drag swabs samples. this P. aeruginosa causes

diseases in plants and animals. Thus, P. aeruginosa is known to be highly adaptable and to

have diverse phenotypic characteristics, which enable it to subsist on a variety of different

carbon sources for energy, is able to utilize nitrogen as a terminal electron acceptor to respire

under anaerobic conditions, has minimal nutrient requirements, and grows at temperatures of

up to 42°C20,21

. Also, this pathogen naturally forms polysaccharide-encased, surface attached

communities known as biofilms, and resists protozoan predation by directly injecting

cytotoxic effector proteins into the cytosol of eukaryotic cells through a type III secretion

system20,21,22

. These mechanisms act on opportunistic infections in humans as well. Due to its

metabolic diversity, P. aeruginosa can even multiply in certain disinfectants and metabolize

many antibiotics19,24

. While antimicrobials were originally developed and used to kill bacteria,

recent work reveals that the biological functions of antibiotics are not limited to bactericidal

(killing) or bacteriostatic (growth inhibition) effects. Pseudomonas aeruginosa possesses

multifactorial mechanisms of responses and resistance to antimicrobials, such as altered target

sites, bacterial efflux pumps, enzyme production or inhibition and loss of membrane

protein24,25,26.

The higher antibiotic resistance was to Nalidixic acid (93,1%). This result is

corroborated by a study performed in different species of psittacines in 2015, where the

authors observed that the Pseudomonas strains analyzed were generally resistant to nalidixic

acid with a 94,12% prevalence. All 29 strains were susceptible to enrofloxacyn, although the

literature relates that enrofloxacyn resistance is most frequently reported for Pseudomonas

aeruginosa27.

Similarly, all strains were susceptible to Ciprofloxacin. A prevalence study

done in clinical specimens collected from different hospitals of Karachi, Pakistan28

, revealed

75% sensitivity against Ciprofloxacin and Nalidixic acid. Other studies performed in human

samples, however, demonstrated a varied percentage of resistance to Ciprofloxacin, and

Nalidixic acid ranging from 87.8% to 100%29,30,31.

Azithromycin had a resistance prevalence of 82,8%. This might be explained by the

P. aeruginosa cells being intrinsically resistant to macrolides when tested in standard broth

culture32

. However, macrolides such as azithromycin are still widely used antibiotics, since it

causes a reduced P. aeruginosa virulence, delayed bactericidal effects, reduced bacterial

adherence to the respiratory epithelium, decreased bacterial motility, and impaired biofilm

production32,33,34

.

65

21 isolates showed a multidrug resistance profile, corresponding to 72.4 % of the

total. The maximum number of antibiotics to which a strain presented resistance was 7 (7

strains), followed by 6 (8 strains). Multidrug-resistant (MDR) P. aeruginosa phenotype is

defined as resistant to one anti-microbial agent in three or more anti-pseudomonal anti-

microbial classes (carbapenems, fluoroquinolones, penicillins /cephalosporins and

aminoglycosides)35.

A report describing the clinical and laboratory findings of kori bustards

(Ardeotis kori) infected with Pseudomonas aeruginosa showed an antibacterial resistance

pattern to 6 antibiotics. Similarly, in a study performed in different species of psittacines in

2015, the authors observed that the Pseudomonas strains analyzed had an MDR pattern to 5

antibiotics24

.

In the light of the considerable increase in the prevalence of multidrug resistance in

P. aeruginosa, which complicates decisions on treatment with antibiotics and its effects on

high morbidity and mortality in humans36

, some authors state that the volume of antibiotics

used and further released directly or through the microbiota into municipal effluents and

sewage creates a selective pressure that results, for the environment, in a "reservoir Natural

"strains of multidrug-resistant strains37

. There has also been observed that resistance of

Pseudomonas aeruginosa species towards the antibiotic action has a genetic correspondent,

although there is no full correspondence between the “in vitro” sensitivity of Pseudomonas

aeruginosa and the one “in vivo”25.

CONCLUSION

The results indicate that common pet birds such as cockatiels can harbor strains of

Pseudomonas sp., and a high resistance rate to antimicrobials was detected. Due to the health

importance of these bacteria, the emergence of multidrug resistant strains is concerning, and

greater prevention and control efforts must be imposed to avoid the presence of this pathogen

in the environment where these birds are held.

CONFLICT OF INTEREST

The authors declare no conflicts of interest in this study.

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70

8 CONCLUSÃO

Os resultados indicam que as calopsitas criadas em ambiente doméstico e comercial

podem abrigar cepas de bactérias Gram-negativas prejudiciais para a saúde animal e humana e

animais, tais como Pseudomonas sp. e Escherichia coli.

Adicionalmente, foi possível evidenciar que as cepas isoladas apresentam alto índice

de resistência, apresentando cepas resistentes a múltiplas drogas, o que denota um possível

risco

para a saúde de proprietários e demais pessoas envolvidas na criação destas aves.

Além disso, o estudo dos fatores de virulência de E. coli revelou a presença de cepas

patogênicas de cepas contendo genes relacionados a EPEC. A investigação destas questões é

importante para avaliar a patogenicidade, o potencial zoonótico e os riscos envolvidos tanto

para a saúde animal quanto para a saúde pública.

71

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