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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
CARACTERIZAÇÃO DE HIDROFOBINAS DO FUNGO Crinipellis perniciosa (STAHEL) SINGER, CAUSADOR DA
DOENÇA VASSOURA-DE-BRUXA NO CACAUEIRO
STÊNIO CARVALHO SANTOS
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Agosto de 2005
STÊNIO CARVALHO SANTOS
CARACTERIZAÇÃO DE HIDROFOBINAS DO FUNGO Crinipellis perniciosa (STAHEL) SINGER, CAUSADOR DA DOENÇA VASSOURA-DE-BRUXA NO
CACAUEIRO
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.
STÊNIO CARVALHO SANTOS
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Agosto de 2005
STÊNIO CARVALHO SANTOS
CARACTERIZAÇÃO DE HIDROFOBINAS DO FUNGO Crinipellis perniciosa (STAHEL) SINGER, CAUSADOR DA DOENÇA VASSOURA-DE-BRUXA NO
CACAUEIRO
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz,
como parte das exigências para obtenção
do título de Mestre em Genética e Biologia
Molecular.
APROVADA: 09 de agosto de 2005
Profª. Drª. Andréa Cristina Mariano
UNEB
Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto
UEFS
Prof. Dr. Júlio Cézar de Mattos Cascardo
UESC - Orientador
S237 Santos, Stênio Carvalho. Caracterização de hidrofobinas do fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, causador da doença vas- soura-de-bruxa no cacaueiro / Stênio Carvalho Santos. – Ilhéus, Ba: UESC, 2005. 56f. : il. Orientador: Júlio Cézar de Mattos Cascardo. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular Inclui bibliografia.
1. Cacau – Doenças e pragas – Controle biológico. 2. Vassoura-de-Bruxa (Fitopatologia). 3. Fungos fitopa- togênicos. 4. Cacau – Fungos e doenças. I. Título. CDD 633.7496
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Plácido Alves dos Santos e
Adélia Agapito Carvalho Santos, pelo amor,
carinho e doação, dedico.
À minha esposa Heliana Argôlo Carvalho e ao
meu filho, Stênio Carvalho Filho, pelo afeto e
dedicação, ofereço.
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha vida e saúde, e por todos que contribuíram de forma
direta ou indireta, para o cumprimento desta jornada.
À Coordenação e Secretaria do Mestrado em Genética e Biologia Molecular
da Universidade Estadual de Santa Cruz, pelo apoio e incentivo.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia – FAPESB, pela
concessão da bolsa de estudo de mestrado.
Ao Prof. Dr. Júlio Cezar de Mattos Cascardo, pela oportunidade, orientação,
amizade, presteza e confiança.
Aos pesquisadores Abelmon Gesteira (co-orientador), Fabienne Micheli e
Carlos Priminho (colaboradores), Andréa Mariano, Acássia Pires, Fátima Alvim,
Márcio Costa, Karina Gramacho, pelo apoio e cooperação durante o
desenvolvimento da pesquisa.
Aos professores Diego Frias, Edna Dora Martins, Irene Carzola, José Luiz
Bezerra, Júlio Cascardo, Leandro Loguércio, Mônica Bertão e demais professores do
programa, pela competência no exercício da docência e dedicação ao programa de
mestrado.
A todos os funcionários da Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC, que
de forma direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho.
Ao pessoal da iniciação científica em especial à Thaís Bomfim Santos, pela
cooperação nos afazeres de bancada.
A Jaci, Pelé e Robson, pelo apoio técnico e inestimável atividade laboratorial.
Aos colegas do Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Genômica e
Expressão Gênica, em especial Geruza Ceita, Jeiza Leal e Joci Neuby, pelo apoio,
amizade e companheirismo.
iii
Aos colegas do Mestrado em Genética e Biologia Molecular da UESC,
especialmente a Cristiano e Fabrício, e aos companheiros de turma Milde, Alayne,
André, Dine, Dahy, Dori, Silsan, Maizete, Marcinha, Ritinha, Sônia, Valéria e Van,
pelo convívio e amizade.
A minha família (pais, esposa, filho, irmãos, sobrinhos, sogro e sogra,
cunhados, tios e primos) e amigos, pelo amor, carinho e apoio constante.
iv
ÍNDICE
EXTRATO .................................................................................................................vii ABSTRACT................................................................................................................ix
LISTA DE FIGURAS..................................................................................................xi LISTA DE TABELAS ...............................................................................................xiii 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................3
2.1. O cacaueiro (Theobroma cacao L.)...................................................................3
2.2. Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer ................................................................4
2.3. Interação planta-patógeno ................................................................................9
2.4. Hidrofobinas....................................................................................................10
2.4.1. Propriedades bioquímicas e biofísicas das hidrofobinas ..........................11
2.4.2. Funções biológicas das hidrofobinas........................................................12
2.4.2.1. Família gênica ....................................................................................12
2.4.2.2. Surgimento de hifas aéreas................................................................13
2.4.2.3. Proteção das estruturas fúngicas .......................................................15
2.4.2.4. Fixação de patógenos a superfície de hospedeiros ...........................15
2.4.3. Potencial biotecnológico ...........................................................................15
3. MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................................17
3.1. Análises de seqüências gênicas e desenho de oligonucleotídeos
específicos .............................................................................................................17
3.2. Cultivo de Crinipellis perniciosa ......................................................................19
3.3. Cultivo de C. perniciosa em sistema artificial ..................................................19
3.4. Material vegetal infectado por C. perniciosa ...................................................21
3.5. Extração do DNA genômico de C. perniciosa .................................................22
v
3.6. Extração do RNA total de C. perniciosa ..........................................................23
3.7. Extração do RNA total de meristemas de T. cacao.........................................24
3.8. Extração de proteínas secretadas em meio de cultura de C. perniciosa ........25
3.9. Southern Blot ..................................................................................................25
3.10. Síntese de cDNA por meio de RT-PCR (reverse transcriptase -
polymerase chain reaction) ....................................................................................27
4. RESULTADOS......................................................................................................31
4.1. Análise de seqüências de hidrofobinas de Crinipellis perniciosa ....................31
4.2. Detecção do número de cópias gênicas de hidrofobinas de C. perniciosa .....36
4.3. Análise da expressão gênica de hidrofobinas de C. perniciosa em fases do
desenvolvimento fúngico in vitro e em plântulas de cacau infectado.....................37
4.4. Indício de hidrofobinas secretadas em meio de cultura de C. perniciosa .......41
5. DISCUSSÃO.........................................................................................................42
5.1. C. perniciosa codifica quatro hidrofobinas distintas e pertencentes
a classe I................................................................................................................42
5.2. Hidrofobinas de C. perniciosa constituem uma família multigênica ................43
5.3. Hidrofobinas possuem expressão diferencial durante as fases do
desenvolvimento fúngico e em plântulas de cacau infectado por C. perniciosa ....46
5.4. Oligomerização de hidrofobinas em cultivo de C. perniciosa ..........................47
6. CONCLUSÕES .....................................................................................................48
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................49
vi
EXTRATO
SANTOS, Stênio Carvalho, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus - Ba,
agosto de 2005. Caracterização de Hidrofobinas do Fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, Causador da Doença Vassoura-de-Bruxa no Cacaueiro. Orientador: Júlio Cézar de Mattos Cascardo. Co-orientador: Abelmon da Silva
Gesteira Colaboradores: Fabienne F. Lucienne Micheli e Carlos P. Pirovani.
Dentre a enorme diversidade fúngica está presente o fungo filamentoso
Crinipellis perniciosa, um basidiomiceto hemibiotrófico responsável pela doença
vassoura-de-bruxa no cacaueiro, doença que nos últimos 15 anos vem provocando
perdas significativas nas lavouras cacaueiras do Sul da Bahia. Este fungo propaga-
se por basidiósporos produzidos em basidiomas e este evento é favorecido nas
condições de monocultura e clima da região. O entendimento do ciclo de vida deste
patógeno, bem como dos fatores que podem impedir a sua propagação, são de
fundamental importância para a retomada da produção de cacau e da economia Sul
Bahiana. Dentre as estratégias de controle, o melhoramento genético, é uma das
estratégias mais promissoras. O sequenciamento de bibliotecas genômica do C.
perniciosa, de ESTs da interação cacau-Crinipellis e do desenvolvimento do fungo
em sistema artificial permitiu a identificação de genes importantes desse patógeno e
de seu patosistema. A partir dos dados de sequenciamento dessas bibliotecas foram
identificados os genes de hidrofobinas, que são proteínas de peso molecular em
torno de 12 kDa, e que são secretadas por fungos filamentosos. Essas proteínas têm
caráter anfipático, possuem entre 75 e 125 aminoácidos e são sintetizadas na forma
monomérica, que quando encontram uma interface hidrofílica/hidrofóbica, formam
vii
um filme anfipático. As hidrofobinas possuem papel essencial durante a colonização,
crescimento e desenvolvimento fúngico. Com isso, a hidrofobina torna-se um
excelente alvo de estudo para o entendimento do ciclo biológico, visando o controle
de infecção fúngica. A virulência do C. perniciosa está relacionada à indução
dimórfica, apresentando fase parasítica (micélio monocariótico) e fase saprofítica
(micélio dicariótico), onde as hidrofobinas devem ter participação desde a
penetração do tubo germinativo dos basidiósporos nos tecidos meristemáticos de
cacaueiros até a formação do basidioma. As sequências de hidrofobinas foram
analisadas por ferramentas de bioinformática como BLAST, ClustalW 1.82, ORF
finder e a partir dessas análises foram identificadas regiões consenso, feita a
categorização de classe, os alinhamentos e agrupamento em árvore. O número de
cópias do gene no genoma do fungo foi analisado. A expressão gênica foi estudada
em nível transcricional por meio de RT-PCR semi-quantitativo, utilizando-se primers
específicos. O fungo foi cultivado em sistema artificial (bolachas) e o RNA total
extraído de diversas fases do desenvolvimento fúngico e de tecidos meristemáticos
infectados. O sequenciamento das bibliotecas de ESTs de C. perniciosa permitiu a
identificação de quatro cDNAs distintos que codificam para hidrofobinas. O
alinhamento das seqüências deduzidas de aminoácidos, deduzidas, das
hidrofobinas de C. perniciosa com outras, previamente descritas para outros fungos,
mostrou que estas apresentam alta homologia com proteínas da classe I. O
dendrograma mostrou que as hidrofobinas possuem um ancestral comum e, que a
exemplo de outros basidiomicetos, não foram encontradas hidrofobinas da classe II.
O Southern blot confirmou a presença de pelo menos quatro hidrofobinas distintas
em C. perniciosa, pertencendo então a uma pequena família gênica. A análise de
expressão dos genes por meio de RT-PCR mostrou que eles são expressos durante
fases distintas do ciclo de vida do fungo, e em diferentes intensidades. A análise
funcional desses genes poderá ajudar no entendimento da funcionalidade dos genes
envolvidos durante a vassoura-de-bruxa.
Palavras Chave: estudo funcional, hidrofobinas, vassoura-de-bruxa, interação
planta-patógeno.
viii
ABSTRACT
SANTOS, Stênio Carvalho, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus – Ba,
August, 2005. Characterization of hydrophobins from the fungus Crinipellis
perniciosa (Stahel) Singer, the causal agent Witches´ broom disease in cacao. Advisor: Júlio Cézar de Mattos Cascardo. Co-advisor: Abelmon da Silva Gesteira,
Collaborators: Fabienne F. Lucienne Micheli and Carlos P. Pirovani.
Among the enormous fungi genetic diversity, it is found the filamentous fungus
Crinipellis perniciosa, a hemibiotrophic basidiomycete, responsible for the Witches´
broom disease in cacao, which is causing, for the last 15 years, significative losses in
the cacao crop in Southeast Bahia. This fungus spreads through basidiospores,
produced in basidiocarps, event that, found in Bahia ideal climate and host
conditions. The understanding of this pathogen life cycle, allied with factors that might
block its propagation, are crucial for the recovering of the cacao production, and
consequently, the economy in the region. Between the control strategies, the genetic
advance is one of the most promising one. The sequencing of the C. perniciosa
partial genome, and ESTs from both, a cacao x C. perniciosa interaction library and a
C. perniciosa simulated life cycle in artificial systems, allowed the identification of
important genes from this pathogen and its pathosytem. The sequencing data
revealed several hydrophobins genes. They comprehend a group of proteins with
molecular weight mass around 12 kDa that are secreted from filamentous fungus.
These proteins possess an amphipathic behavior, have between 75 to 125 amino
acids and are synthesized as monomers, which polymerize, in the presence of a
hydrophilic/hydrophobic interface, generating an amphipathic film. The hydrophobins
ix
play an essential role during colonization, growing and fungus development. Thus,
hydrophobins are an excellent target, aiming to understand the biological life cycle, to
control fungal infection. The virulence of C. perniciosa is associated to the dimorphic
induction, with two distinct phases: one biotrophic (monokaryotic mycelium) and
another saprophytic (dikaryotic mycelium), where the hydrophobins play an important
role, from the penetration of the germinative basidiospores in the meristematic
tissues, to the development of the fruit body. The hydrophobins sequences were
analyzed using bioinformatic tools, such as: BLAST, ClustalW 1.82, ORF finder.
From these analyses, consensus regions were identified; classes and a Phylogenetic
clustering established categorized the genes. The gene copy number was identified.
The mRNA expression levels were analyzed by semi-quantitative RT-PCR using
specific primers. For this purpose, the fungus grew in artificial systems (cookies) and
total RNA was extracted from several development times, also total RNA was
extracted from infected cacao tissues. The sequencing of the ESTs revealed the
presence of four distinct cDNAs hydrophobins genes. The alignment and the
dendrogram of the deduced amino acid sequences, together with other previously
described hydrophobins, showed that the C. perniciosa genes belong to proteins
class I, and that they have a common ancestor, and, such as another
basidiomycetes. No class II hydrophobins were detected. The genomic Southern blot
confirmed the presence of at least four distinct genes, thus they can be considered
as a small gene family. The expression analyses by RT-PCR showed that the
different genes are expressed during distinct phases of the fungus life cycle, and at
different levels. The functional analysis of these genes will help to elucidate the role
of the genes involved in the disease development.
Key words: functional studies, hydrophobins, witches’ broom disease, plant-
pathogen interactions.
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida do fungo Crinipellis perniciosa. ...............................................6
Figura 2. Sintomas da vassoura-de-bruxa em cacau ..................................................8
Figura 3. Oligomerização de hidrofobinas formando interface
hidrofílica/hidrofóbica ................................................................................................11
Figura 4. Comparação dos arranjos de pontes disulfeto de hidrofobinas de classe I
(SC3) e classe II (CU) ...............................................................................................13
Figura 5. Modelo da formação da interface hidrofóbica/hidrofílica das hidrofobinas .14
Figura 6. Desenho de oligonucleotídeos específicos que visa a síntese de cDNA por
meio de RT-PCR semi-quantitativo ...........................................................................18
Figura 7. Desenho esquemático do cultivo de C. perniciosa in vitro e em
vassoureiro................................................................................................................20
Figura 8. Fases do desenvolvimento de C. perniciosa cultivado em
sistema artificial.........................................................................................................21
Figura 9. Eletroforese dos produtos de extração de RNA total em gel de agarose...28
Figura 10. Síntese de cDNA e padronização da amplificação de primers específicos
para análise de expressão semi-quantitativa ............................................................30
Figura 11. Alinhamento das seqüências de hidrofobinas classe I .............................33
Figura 12. Dendrograma ...........................................................................................34
Figura 13. Perfil hidropático e alinhamento das seqüências primárias
de hidrofobinas..........................................................................................................35
Figura 14. Análise genômica do número de cópias de hidrofobinas de
Crinipellis perniciosa .................................................................................................36
Figura 15. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de RT-PCR de cDNAs de C.
perniciosa e cacaueiros infectados ...........................................................................39
xi
Figura 16: Expressão relativa das hidrofobina de Crinipellis perniciosa normalizadas
pela expressão da actina ..........................................................................................40
Figura 17. SDS-PAGE 12,5 % de proteínas hidrofóbicas secretadas pelo
micélio de C. perniciosa ............................................................................................41
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Similaridade de seqüências de aminoácidos de hidrofobinas de C.
perniciosa com hidrofobinas de classe I de diferentes basidiomicetos......................30
Tabela 2. Análise densitométrica da expressão semi-quantitativa de hidrofobinas de
C. perniciosa via RT-PCR..........................................................................................36
Tabela 3. Análise de possível conservação evolutiva das funções das hidrofobinas
de C. perniciosa.........................................................................................................45
xiii
1. INTRODUÇÃO
O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma planta arbórea, neotropical, originada
da América Central e da Amazônia, cujo principal produto comercial são as
amêndoas, matéria-prima da indústria de chocolate. No sul da Bahia a cacauicultura
sofreu prejuízos econômicos de grande escala devido à propagação da vassoura-
de-bruxa, doença causada pelo fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer.
O fungo Crinipellis perniciosa é um basidiomiceto, hemibiotrófico, que
apresenta fase parasítica e fase saprofítica, provocando alterações histológicas,
morfológicas e fisiológicas tecido-específicas e temporais no cacaueiro (FRIAS et al.,
1991; ORCHARD et al., 1994; SILVA, 1997). O fungo infecta os lançamentos foliares
novos, os frutos em desenvolvimento e as almofadas florais, podendo até provocar a
morte da planta quando afetada por sucessivos ciclos do patógeno associados a
fatores abióticos (QUEIROZ et al., 2003).
O controle dessa doença tem-se baseado em poda fitosanitária, controle
químico e biológico, e o uso de cultivares resistentes. Entretanto, uma das
alternativas mais promissoras para o manejo da vassoura-de-bruxa é a elaboração
de novas estratégias de controle através do estudo molecular. Estudos moleculares
do C. perniciosa e da interação T. cacao : C. perniciosa têm sido alvos de muitos
projetos de pesquisas que visam elucidar a biologia do fungo e os diferentes
mecanismos de defesa acionados pela planta contra o ataque do patógeno. A partir
do sequenciamento genômico do C. perniciosa, de cDNAs das fases de
desenvolvimento fúngico em sistema artificial e da interação cacau-Crinipellis estão
sendo suscitados importantes conhecimentos sobre a interação planta-patógeno, o
que contribuirá para uma melhor estratégia de controle.
1
Com o sequenciamento, já foram identificados genes envolvidos em rotas
metabólicas, processo de colonização e de resposta de defesa nos tecidos do
hospedeiro. Dentre estes genes estão os genes de hidrofobinas, proteínas
secretadas por fungos filamentosos. As hidrofobinas são pequenas proteínas
anfipáticas de 75 a 125 aminoácidos, que são sintetizadas na forma monomérica.
Porém, quando encontram uma interface hidrofílica/hidrofóbica, polimerizam-se
formando um filme anfipático. As hidrofobinas possuem papel crucial durante a
infecção fúngica, no processo de penetração dos tecidos, cruzamento sexual,
mudanças de fases, dentre outros (KERSHAW; TALBOT, 1998). Com isso, as
hidrofobinas são excelentes alvos biológicos para terem sua função bloqueada,
visando o controle de fungos fitopatogênicos. Estudos de caracterização molecular
como identificação e alinhamento de seqüências, categorização de classe protéica,
agrupamento através de similaridade de seqüências em árvore, determinação do
número de copias gênicas, e análise de expressão semi-quantitativa e diferencial
foram realizados. Portanto, nesta dissertação, visamos o estudo dessas
hidrofobinas, que representa uma das mais importantes proteínas envolvidas
durante a interação patógeno-hospedeiro, que certamente ajudará no entendimento
e futuros estudos de seus modos de ação. A análise da regulação desses genes
será de fundamental importância na caracterização de mecanismos envolvidos nas
reações de resistência e de susceptibilidade à doença.
2
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. O cacaueiro (Theobroma cacao L.)
O cacaueiro é uma espécie de clima tropical inicialmente descrita como
Cacao fructus por Charles de L’ Écluse. Posteriormente, em 1737, foi descrita por
Linneu como Theobroma fructus, permanecendo essa classificação até 1753,
quando foi definitivamente denominado como Theobroma cacao L. (GRAMACHO et
al., 1992). O cacaueiro foi originalmente classificado como uma dicotiledônea
pertencente à família Sterculiaceae e gênero Theobroma. Este gênero inclui outras
21 espécies (CUATRECASAS, 1964), das quais apenas o cacau e o cupuaçu
(Theobroma grandiflorum) são espécies comercializadas. Mais recentemente foi
sugerida a reclassificação do cacaueiro como pertencente à família Malvaceae
(ALVERSON et. al, 1999), muito embora não venha sendo adotado essa nova
classificação botânica na maioria dos trabalhos científicos mais recentemente
publicados.
O cacaueiro é uma planta perene, arbórea, alógama, e nativa das florestas
tropicais úmidas das Américas do Sul e Central, sendo que o seu centro de origem
possivelmente situa-se nas nascentes dos rios Amazonas e Orinoco (GRAMACHO
et al., 1992).
É cultivada nas Américas do Sul e Central, Caribe, África e Ásia, e as suas
amêndoas constituem a principal matéria prima para a indústria de chocolate, sendo
o cacau consumido também na utilização da manteiga de cacau, polpa, licor,
achocolatados, entre outros produtos. O Brasil sempre se destacou na produção de
cacau, chegando a ser considerado o principal país produtor das Américas no ano
3
de 1994 (PURDY; SCHIMIDT, 1996). Diversas doenças como a vassoura-de-bruxa,
podridão-parda, monilíase e morte-descendente são responsáveis pela diminuição
da qualidade e quantidade da produção das lavouras cacaueiras nas Américas,
sendo o Crinipellis perniciosa o patógeno que se destaca como principal causador
da redução da produtividade das plantações de cacau brasileira (DIAS, 2001).
2.2. Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer
O fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, agente etiológico da vassoura-
de-bruxa, foi descrito primeiramente em 1785 por Ferreira, como “lagartão”, devido
as malformações por ele observada (SILVA, 1987). Com a primeira investigação
científica da vassoura-de-bruxa do cacau no Suriname em 1895, o patógeno foi
nomeado Marasmius perniciosus (STAHEL, 1915); e renomeado para Crinipellis
perniciosa por Singer (1942), ao revisar o gênero Marasmius. O C. perniciosa é da
ordem Agaricales, família Tricholomataceae, e é endêmica da Bacia Amazônia na
região da América do Sul (HOLIDAY, 1952); sendo o único patógeno do cacau que
se desenvolve simultaneamente com o hospedeiro (PURDY; SHIMIDT, 1986). A
vassoura-de-bruxa é a doença mais destrutiva do cacaueiro, provocando enormes
prejuízos na América do Sul e Caribe (THAROLD, 1975). A vassoura-de-bruxa do
cacaueiro foi inicialmente detectada em alguns países como: Peru (1930),
Venezuela (1928), Suriname (1895), Guiana (1906), Colômbia (1917), Equador
(1921), Trinidad & Tobago (Trinidad 1928; Tobago 1939), Panamá (1989) e Brasil,
na Bahia em 1989 (PURDY; SCHIMIDT, 1996). O primeiro relato da doença no
Brasil deu-se na região Sul do estado da Bahia no município de Uruçuca, em maio
de 1989 (PEREIRA et al., 1989), seguido de uma segunda observação seis meses
depois no município de Camacã, 120 Km ao sul. A área com plantas infectadas em
Camacã era maior do que aquela encontrada em Uruçuca, sugerindo que a
introdução se deu anteriormente à de Uruçuca. O aparecimento da doença em dois
sítios distantes e distintos, bem no meio da região cacaueira, sugere que ocorreu
mais do que uma introdução, provavelmente a partir da Região Amazônica, e
possivelmente, por meio de intervenção humana (ARDEBRHAM et al., 1999;
PEREIRA et al., 1996; ROCHA et al., 1993). A região sul bahiana compreende uma
4
das maiores regiões produtoras de cacau em área contínua no mundo. A região Sul
Bahiana compreende uma área de 600.000 ha com predominância de cacaueiros da
variedade “Comum“, considerado altamente suscetível, e apresentando baixa
variabilidade genética, o que favoreceu a dispersão da doença causando
progressivas perdas na produção de cacau (CASCARDO; FIGUEIRA, 1995).
O C. perniciosa apresenta ciclo de vida hemibiotrófico (GRIFFITH; HEDGER,
1994), apresentando fase biotrófica e fase saprofítica (Figura 1), provocando
alterações histológicas, morfológicas e fisiológicas tecido-específicas e temporais no
cacaueiro. A infecção típica (vassoura vegetativa) se inicia quando o tubo
germinativo dos basidiósporos penetra no tecido meristemático de gemas apicais em
atividade. A resposta do hospedeiro, localizada no ponto de infecção, resulta em
considerável aumento dos tecidos e no desenvolvimento de ramos laterais, sintomas
que levam a perdas indiretas da produção por causar debilitação da árvore infectada
(FRIAS et al., 1991; ORCHARD et al., 1994; SILVA, 1997). Quando há infecção em
frutos, as sementes tornam-se impróprias para o consumo e há também a formação
de frutos em forma de morangos e cenouras, O fungo permanece na fase primária
(micélio biotrófico, monocariótico) por um tempo de 6 a 9 semanas dentro de tecidos
em desenvolvimento, até que a vassoura verde inicie um processo de necrose,
alteração associada à mudança do fungo para uma fase secundária (micélio
saprofítico, dicariótico). Subseqüentemente à morte das vassouras, o micélio
saprofítico frutifica formando basidioma (WHEELER, 1985). Os basidiósporos são
dispersos pelo vento e chuva, tipicamente à noite e são os únicos propágulos em
condições adequadas comprovadamente capazes de infectar o cacaueiro,
geminando na superfície da planta e produzindo tubos monocarióticos, que são
atraídos para os estômatos ou espaços intercelulares do hospedeiro (FRIAS et al.,
1991; KILARU; HASENSTEIN, 2005; SILVA, 1997). Esses basidiósporos são
produzidos em lamelas na parte inferior do píleo do basidioma e são liberados em
condições ambientais em que a umidade está próxima a saturação com temperatura
variando entre 20 e 30 ºC (ROCHA; WHELLER, 1985). Devido a sua sensibilidade a
radiação UV-B e sua facilidade de dessecação, os basidiósporos perdem a
capacidade de germinação rapidamente, e é muito improvável que estes possam se
dispersar a um raio superior a 60 Km (ANDEBRHAN et al., 1993; FRIAS et al.,
1991).
5
Figura 1. Ciclo de vida do fungo Crinipellis perniciosa. Figura extraída de Wheeler (1985).
6
A doença vassoura-de-bruxa inicia-se quando ocorre a infecção de tecidos
em crescimento da planta, tais como, ramos apicais, almofadas florais, flores e frutos
resultando em anormalidades, que variam de acordo com o tipo de tecido infectado,
do estágio de desenvolvimento e o cultivar (SILVA et al., 2002). A partir da infecção
do fungo ocorre um intumescimento e ramificação de ramos apicais e gema axilares
desenvolvendo-se um grande número de ramos dando a aparência de uma
vassoura (Figura 2a, b), resultado da perda de dominância apical dos ramos,
apresentando também intumescimento dos pecíolos e pulvinos das folhas (Figura
2c). As vassouras apresentam coloração verde vívido quando jovem, e com o
desenvolvimento da doença passam a apresentar uma coloração marrom. Cancros
são formados a partir da infecção em folhas, pulvinos e pecíolos (Figura 2d). As
infecções de flores resultam em vassouras de almofadas e desenvolvimento de fruto
morango e cenoura (Figura 2e, f, g). As infecções em frutos jovens apresentam
externamente nas áreas infectadas uma lesão negra, dura e irregular. A infecção
tardia dos frutos causa lesões necróticas e irregulares. Quando internamente, a
casca apresenta pontos necróticos de diferentes tamanhos com liquefação da
mucilagem (Figura 2h). Em frutos próximo a maturação, a infecção é notada apenas
quando esses são colhidos, sendo que em alguns frutos, parte das amêndoas
podem ser aproveitadas para o beneficiamento, entretanto não podem ser utilizadas
para o plantio (GRAMACHO et al., 1992; GRIFFITH et al., 2003; SILVA et al., 2002;
WHEELER, 1985). Após necrose tecidual ocorre uma degradação pelo micélio
saprofítico, provavelmente com o envolvimento de enzimas hidrolíticas que criam um
ambiente adequado à sua sobrevivência (GRIFFITH et al., 1994; PURDY;
SCHIMIDT, 1996), e posterior formação dos basidiomas (Figura 2i), estruturas
reprodutivas do fungo onde se forma os basidiósporos que é a forma infectiva, que
dará continuidade do ciclo de infecção (FRIAS et al., 1991; SILVA, 1997). Os
mecanismos de mudanças das fases do desenvolvimento da doença e seus
sintomas permanecem desconhecidos embora sejam indicativos de um desequilíbrio
na regulação do crescimento da planta ou da utilização de recursos biológicos pelo
patógeno (ORCHARD et al., 1994).
7
Figura 2. Sintomas da vassoura-de-bruxa em cacau. a – proliferação de vassouras axilares e infecção nos ramos em formação (seta); b – infecção de gema axilar; c – vassoura terminais, com intumescimento de pecíolos e pulvinos (setas); d – cancro do pecíolo foliar, dando origem a vassoura axilar (seta); e – vassoura de almofada floral composta; f – frutos morangos; g – frutos cenoura verde e seco preso a almofada floral; h – infecção interna em fruto, com liquefação da mucilagem; i – produção de basidiomas em vassouras penduradas. Figura extraída de Silva et. al. (2002).
8
2.3. Interação planta-patógeno
As interações entre plantas e patógenos são bastante estudadas pela
contínua exposição de plantas ao ataque de microorganismos capazes de causar
doenças que ocasionam sérios danos à agricultura, sendo necessário a presença de
mecanismos de defesa na planta para contribuir com a sua sobrevivência
(CONRATH et al, 2002; JACKSON; TAYLOR, 1996).
Fungos fitopatógenos possuem estratégias biotróficas, necrotróficas e
hemibiotróficas para o alojamento em seus hospedeiros. Podendo essa colonização
ser iniciada pela invasão de tecidos que se encontram previamente feridos,
penetração nos tecidos superficiais por ataque enzimático, ou por orifícios naturais
como lenticelas e estômatos. Os fungos biotróficos possuem caráter de vida oposto
aos necrotróficos, pois eles necessitam de tecidos vivos para seu estabelecimento
enquanto que os necrotróficos têm a necessidade da morte do tecido para o seu
desenvolvimento (HAMMOND-KOSACK; JONES, 1997). Fungos hemibiotróficos,
como o Crinipellis perniciosa, utilizam estratégia intermediária, primeiramente
mantendo as células do hospedeiro vivas, voltando o metabolismo a seu favor,
porém com o avanço da doença promovem a morte das células e completam seu
ciclo de vida (HAMMOND-KOSACK; JONES, 2000; PURDY; SCHMIDT, 1996).
A planta precisa de um sistema de vigilância para que possa reconhecer
sinais de ataque de patógenos e acionar os mecanismos de defesa. Inicialmente a
resposta de defesa da planta resulta na formação de condições não favoráveis ao
desenvolvimento e propagação do patógeno, que apresenta como característica a
morte celular localizada ao redor do ponto de invasão do patógeno. Esta resposta
imediata da planta ao ataque de patógenos é chamada de resposta hipersensitiva,
além desta, outros mecanismos de defesa também são acionados entre eles a
ativação de genes relacionados a patogênese, como a presença de proteínas PR
(pathogenesis related proteins) na vassoura verde, o que é sugestivo de uma
tentativa de aumento da resposta de defesa do hospedeiro (DANGL et al., 2000;
GRIFFITH et al. 2003), a secreção de toxinas do fungo ou da senescência acelerada
do hospedeiro (EVANS, 1980).
A identificação e a análise de expressão de genes envolvidos na interação
planta-patógeno pode vir a elucidar fatores e ou mecanismos associados ao
9
patosistema, possivelmente abrindo um novo caminho para a produção de
variedades de plantas resistentes a partir da transformação genética. Visto esta
possibilidade é que pesquisadores da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC)
vem desenvolvendo pesquisas com genes codificadores de glucanases, quitinases e
hidrofobinas, que são importantes proteínas envolvidas na interação cacau-
Crinipellis, um dos maiores problemas da cacauicultura da região Sul da Bahia.
2.4. Hidrofobinas
As hidrofobinas constituem uma família de pequenas proteínas extracelulares,
com aproximadamente 100 aminoácidos, que são moderadamente hidrofóbicas e
secretadas em abundância por fungos filamentosos. Os genes codificadores de
hidrofobinas já foram identificados em ascomicetos, deuteromicetos e basidiomicetos
que representam o maior filo do reino fungi. O primeiro relato da existência das
hidrofobinas foi em Schizophyllum commune, e essas podem compor 10% da
proteína total deste organismo (WESSELS et al., 1991a,b). As hidrofobinas em sua
maioria só são conhecidas por suas sequências gênicas, e sua importância com
relação ao crescimento e desenvolvimento de fungos foi principalmente elucidada
baseado no estudo de mutagênese, de modo que somente algumas de suas
proteínas foram isoladas e estudadas.
As hidrofobinas formam uma interface hidrofílica/hidrofóbica quando em
contato entre água e ar, água e óleo, ou água e um sólido hidrofóbico como, por
exemplo, o teflon (Figura 3), formando um filme anfipático (WÖSTEN; DE VOCHT
2000).
Dentre as diversas funções realizadas pelas hidrofobinas durante o
desenvolvimento fúngico está o direcionamento da saída do fungo do meio aquoso
para o ambiente hidrofóbico, criando estruturas fúngicas aéreas como as hifas
aéreas, os basidiomas e os esporos (WESSELS, 1997; WÖSTEN; WESSELS, 1997;
WÖSTEN, 2001). Além disso, fornecem canais com coberturas hidrofóbicas em
basidiomas, o que possibilita uma troca gasosa eficiente quando em ambiente
aquoso (LUGONES et al., 1999; SCHERRER et al., 2000; VAN WETTER et al.,
2000; WESSELS et al., 1996), elas também intermedeiam a fixação da hifa em
10
superfície hidrofóbica que é um passo importante da interação patogênica antes da
penetração fúngica e da ocorrência da infecção (TALBOT et al., 1996; VAN
WETTER et al., 2000; WÖSTEN et al., 1994b).
Figura 3. Oligomerização de hidrofobinas formando interface hidrofílica/hidrofóbica. A – Filme hidrofóbico, como por exemplo teflon, fortemente formado por hidrofobinas de classe I imerso em uma solução aquosa formando ângulo de contato que varia ente 22 e 63°; B – Monômeros de hidrofobinas desidratados, localizados sob uma interfase hidrofílica (tal como, vidro ou papel filtro), quando em contato com uma solução aquosa tornam-se hidrofóbicos, formando ângulo de contato de 110°. Figura extraída de Wösten e De Vocht (2000).
2.4.1. Propriedades bioquímicas e biofísicas das hidrofobinas
As hidrofobinas são pequenas proteínas de caráter hidrofóbico,
caracterizadas por oito resíduos de cisteína conservados e padrões hidropáticos
típicos (WESSELS, 1997). Estas oito cisteínas são confirmadas principalmente por
meio do estudo de hidrofobina de Ophiostoma ulmin (CU) e Schizophyllum commune
(SC3) que formam quatro ligações disulfeto intramolecular, com o acoplamento
11
provável de cys1-cys2, cys3-cys4, e assim por diante (Figura 4). As posições polares
e apolares são bem preservados nos aminoácidos que conferem o padrão de
hidrofobicidade para todas as hidrofobinas. As diferenças nos padrões de
hidrofobicidade e das propriedades biofísicas permitem realizar a classificação das
hidrofobinas em classes I e II (DE VRIES et al., 1993; WESSELS, 1994). As
membranas formadas pelo agrupamento das hidrofobinas de classe I são altamente
insolúveis, capazes de suportar uma concentração de 2% de SDS e uma
temperatura de 100 °C, sendo dissociado apenas pela ação do ácido fórmico ou
ácido trifluoroacético. Entretanto, as membranas formadas pelo agrupamento das
hidrofobinas de classe II são menos estáveis, podendo ser dissociadas facilmente
com etanol a 60% ou com SDS a 2% (RUSSO et al., 1982). Comparando as
seqüências de aminoácidos das hidrofobinas de classe I e II pode-se observar que o
comprimento do segmento entre as pontes cys3 e cys4 em hidrofobinas de classe II
é muito mais curto que as de classe I (Figura 4). Também é verificado que as
hidrofobinas de classe II contêm aminoácidos mais carregados que as de classe I
(WÖSTEN; DE VOCHT, 2000).
2.4.2. Funções biológicas das hidrofobinas
2.4.2.1. Família gênica
As hidrofobinas parecem estar sempre presente no reino fungi. Seus genes
são encontrados em ascomicetos, deuteromicetos e basidiomicetos, sendo que as
hidrofobinas de classe II até hoje não foram identificadas em basidiomicetos. Alguns
fungos contêm mais de um gene de hidrofobina formando uma pequena família
gênica. Em S. commune foram identificados quatro genes de hidrofobina de classe I,
com o gene SC3 ativo em micélio monocariótico e dicariótico, e os genes SC1, SC4
e SC6 ativos somente em micélio dicariótico, na formação do basidioma. Deste
modo, é visto que diferentes hidrofobinas são expressas em fases diferentes do
desenvolvimento fúngico e são responsáveis por funções biológicas diferentes
(KERSHAW et al., 1998; VAN WETTER et al., 2000; WÖSTEN et al., 1994a).
12
Pesquisas com ensaios de complementação mostraram que hidrofobinas de mesma
classe podem substituir funcionalmente até certo ponto uma outra, porém não se
sabe se entre as classes a substituição pode ser funcional (KERSHAW et al., 1998).
Figura 4. Comparação dos arranjos de pontes disulfeto de hidrofobinas de classe I (SC3) e classe II (CU). O cumprimento da parte N-terminal que precede o primeiro resíduo de cisteína e o comprimento do segundo segmento ente a cys 3 e cys 4 são diferentes entre as hidrofobinas de classe I e II. Nota-se que o comprimento da parte N-terminal das hidrofobinas de classe I e II que precede o primeiro resíduo de cisteína, inclui uma sequência sinal (± 20 aa) que está ausente nas proteínas maduras. Figura extraída de Wösten e De Vocht (2000).
2.4.2.2. Surgimento de hifas aéreas
O passo inicial para os fungos formarem hifas aéreas é a saída das hifas do
substrato úmido para o ar (WÖSTEN et al., 1999), essas hifas surgem recobertas
por uma camada hidrofóbica, e essa camada é decorrente do agrupamento dos
monômeros de hidrofobina que formam um filme anfipático (Figura 5). O lado
hidrófilo do filme é voltado para a parede da hifa que tem caráter hidrofílico,
enquanto o seu lado hidrofóbico está exposto. É provável que o monômero de
hidrofobina secretado na extremidade de uma hifa aérea não pode ser difundido
13
para fora do oligômero da parte em desenvolvimento desta hifa, considerando que o
ápice desta, pode ainda conter monômeros (WESSELS, 2000). Tanto na classe I
como na classe II das hidrofobinas, a cobertura das estruturas aéreas fúngicas com
uma camada hidrofóbica, é útil para o seu crescimento e desenvolvimento
(CLASSEN et al., 2003; ELLIOT et al., 2003).
Figura 5. Modelo da formação da interface hidrofóbica/hidrofílica das hidrofobinas. a
- Hifa crescendo em ambiente úmido, cercado por uma película da água. Durante o crescimento, monômeros de hidrofobinas são secretadas em abundância. Os monômeros são descritos como tendo dois domínios hidrofóbicos e dois domínios hidrofílicos; b – A oligomerização reduz a tensão da superfície, permitindo que a hifa cresça e escape para o ar, sendo contínua a secreção de hidrofobinas; c – A hifa aérea cresce com contínua secreção de monômeros de hidrofobinas. O filme anfipático formado contorna a camada externa da parede da hifa. Figura extraída de Talbot (1999).
14
2.4.2.3. Proteção das estruturas fúngicas
As camadas de hidrofobina nas estruturas aéreas são muito resistentes a
substâncias químicas e tratamento enzimático, proporcionando assim, a proteção
dessas estruturas contra condições ambientais adversas, como dessecação
(WÖSTEN et al., 1993).
2.4.2.4. Fixação de patógenos a superfície de hospedeiros
As hifas dos fungos patogênicos são fixadas firmemente a superfícies
hidrofóbicas de seus hospedeiros devido à formação da membrana anfipática de
hidrofobinas, como visto em S. commune (WÖSTEN et al., 1994b). A membrana
anfipática pode juntar duas superfícies incompatíveis. A afinidade da superfície
hidrófila da membrana pela parede celular pode ser mediada pela atividade de
lectinas, e o lado hidrofóbico da membrana interage fortemente com sólidos
hidrofóbicos por interações de mesmo caráter (BECKERMAN; EBBOLE, 1996).
2.4.3. Potencial biotecnológico
As hidrofobinas possuem várias aplicações industriais. Suas aplicações
potenciais estão baseadas nas atividades de superfície e das propriedades de
polimerização. A natureza anfipática dos oligopeptídeos das hidrofobinas sugere que
elas possam ser úteis alterando as propriedades de superfície para as quais elas
são aplicadas. As hidrofobinas se agrupam com a aeração, alterando sua forma e
estabilidade formando um filme para cobrir as vesículas de gás. Estas formam
espumas muito estáveis em condições laboratoriais (WÖSTEN et al., 1993). O uso
de hidrofobinas pode fornecer uma melhoria natural em processos industriais, como
a produção de produtos de nata, confeitaria, refrigerantes, e cerveja. Além disso,
hidrofobinas de classe Il que também produzem espumas estáveis em aeração
mostram uma diferença de solubilidade quando pressurizados (TAKAI; RICHARDS,
1978). Esta característica sugere utilidade efetiva em alimentos pressurizados onde
15
a formação de uma espuma estável é requerida na abertura de um recipiente
pressurizado. As hidrofobinas também alteram a afinidade hídrica de superfícies
(TALBOT et al., 1996; WÖSTEN et al., 1993) permitindo seu uso em fabricação de
produtos para tratamento de cabelo. Seu filme pode formar adesivo plástico capaz
de mudar propriedades de superfícies. O uso de hidrofobinas na indústria médica
pode estar relacionado na cobertura de superfícies como em cobertura de cateteres,
cirurgia como transplantes e implantes. Seu uso também é potencialmente útil em
muitos processos por ser uma proteína natural, utilizada na alimentação humana,
presente nas superfícies de cogumelos comestíveis, sugerindo a sua não toxidade,
estando seguro a sua introdução em uma variedade de produtos (KERSHAW;
TALBOT, 1998).
16
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Análises de seqüências gênicas e desenho de oligonucleotídeos específicos
As seqüências identificadas nos bancos de dados do Projeto Genoma do
Crinipellis perniciosa, na biblioteca de ESTs da Interação Cacau:Crinipellis e na
biblioteca de ESTs do Desenvolvimento do C. perniciosa em Sistema Artificial foram
analisadas com programas disponíveis nos seguintes endereços eletrônicos: análise
de similaridade de seqüências, BLAST - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/;
tradução das seqüências de nucleotídeos, ORF finder -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html; predição do sítio de clivagem do peptídeo
sinal, SignalP - http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/; análise de padrões de
hidrofobicidade, ProtScale - http://au.expasy.org/tools/protscale.html; alinhamento de
seqüências, MultAlin - http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html e ClustalW
1.82 - http://www.ebi.ac.uk/clustalw/, também utilizado para construir um
dendrograma.
A análise das seqüências possibilitou o desenho de cinco oligonucleotídeos
específicos sendo quatro primers senso e um anti-senso (Figura 6) que flanqueiam
os quatros distintos cDNAs de hidrofobinas de C. perniciosa com a finalidade de
avaliar a expressão desses genes via RT-PCR (Reverse transcriptase - polymerase
chain reaction) semi-quantitativo.
17
Figura 6. Desenho de oligonucleotídeos específicos que visa a síntese de cDNA por
meio de RT-PCR semi-quantitativo.
18
3.2. Cultivo de Crinipellis perniciosa
Micélios de C. perniciosa foram inoculados e cultivados em meio de cultura
composto por Glicose 1 % (p/v), NH4H2PO4 0,1 % (p/v), KCl 0,02 % (p/v),
MgSO4.7H2O 0,02 % (p/v), CuSO4 0,005 % (p/v), ZnSO4.7 H2O 0,001 % (p/v),
extrato de levedura 0,5 % (p/v); Para confecção do meio sólido foi adicionado ágar
1,5 % (m/v), antes da autoclavagem. O meio de cultura foi esterilizado através de
autoclavagem a 121 ºC e pressão de 1 atm por 20 minutos. Após a inoculação o
fungo foi cultivado a temperatura de 28 ºC em B.O.D., sem agitação quando em
meio sólido e com agitação de 200 rpm quando em meio líquido, por 10 - 14 dias.
Após o período de incubação, o micélio cultivado foi utilizado para extração de DNA
e o meio líquido para purificação de proteínas secretadas.
3.3. Cultivo de C. perniciosa em sistema artificial
O fungo C .perniciosa foi cultivado em sistema de bolachas (NIELLA et al.,
1999), que propicia o desenvolvimento de todas as fases de crescimento de forma
artificial (Figura 7). Discos de micélio dos isolados fúngicos 998, 1189 e 1441
(CEPEC/CEPLAC), cultivados em meio BDA a 25 °C por 15 dias, foram utilizados
para inocular bolachas (vermiculita 38,6 %, gesso 11,6 %, farelo de trigo 48,4 %,
calcário 1,4 %, água destilada suficiente para atingir o ponto de saturação) contidas
em placas de Petri. As bolachas foram mantidas entre 21 e 25 °C, com 100 % de
umidade e fotoperíodo de 12 horas até que o micélio tomasse toda a placa,
aproximadamente 15 dias. Após este período as bolachas foram cobertas por um
terriço de cacau autoclavado e mantidas nas mesmas condições anteriormente
descritas até que o micélio novamente tomasse toda a placa, mais ou menos 15
dias, e então penduradas no vassoureiro com temperatura variando entre 21 e 25
°C, com 100 % de umidade e fotoperíodo de 12 horas. As coletas foram realizadas
em seis diferentes estágios do cultivo, sendo a primeira coleta realizada logo após
as bolachas terem sido penduradas no vassoureiro, com 35 dias de cultivo (fase
19
branca); a segunda coleta quando ocorreu a primeira mudança de coloração,
quando apresentavam a cor amarela com 37 dias (fase amarela); a terceira coleta foi
feita a aproximadamente 40 dias após o inicio do cultivo (fase rosa), quando ocorreu
a segunda mudança de coloração, apresentando a cor rosa. Decorrido
aproximadamente 15 dias após a colocação das bolachas no vassoureiro,
apresentando a coloração rosa, ocorreu a sujeição de um estresse hídrico de quatro
dias. Logo após o estresse hídrico, quando as bolachas apresentavam uma
coloração rosa escuro foi realizada a quarta coleta (fase rosa escuro). A quinta
coleta foi realizada quando as bolachas apresentavam a formação de primórdios dos
basidiomas (fase de primórdios), e a sexta coleta foi a do último estágio do
desenvolvimento fúngico, os basidiomas presentes nas bolachas (Figura 8).
Figura 7. Desenho esquemático do cultivo de C. perniciosa in vitro e em vassoureiro
(bolachas).
20
Figura 8. Fases do desenvolvimento de C. perniciosa cultivado em sistema artificial
(bolachas). A – Bolachas antes da inoculação fúngica; B – Fase micelial branca; C – Fase micelial amarela; D – Fase micelial rosa; E – Fase micelial rosa escuro, de primórdios e basidioma; F – Formação de primórdios e basidioma. Fotos: Acássia B. Leal Pires.
3.4. Material vegetal infectado por C. perniciosa
Sementes de Theobroma cacao da variedade catongo (susceptível ao C.
perniciosa) foram plantadas em tubetes plásticos contendo solo esterilizado. As
plântulas foram cultivadas em condições controladas em casa de vegetação no
CEPEC/CEPLAC (Centro de Pesquisas da Comissão Executiva do Plano da
Lavoura Cacaueira – Ilhéus Bahia) onde permaneceram até inoculação.
As plântulas de T. cacao com trinta dias de crescidas foram inoculadas
artificialmente por aspersão, com uma suspensão de 1 x 105 basidiósporos viáveis
de Crinipellis perniciosa.ml-1 (isolado 1441 CEPEC/CEPLAC) na gema apical. Após
21
as inoculações, as plântulas permaneceram por 24 horas em câmara climatizada a
25 ºC ± 2 ºC e umidade relativa próxima a 100 % para favorecer a germinação dos
basidiósporos e, a penetração no hospedeiro e conseqüentemente o
estabelecimento da infecção, retornando em seguida à casa de vegetação (FRIAS et
al., 1995; SILVA et al., 2000).
A coleta dos meristemas apicais infectados e não infectados (controle) foram
coletados 45, 60 e 90 dias após a inoculação. Após cada coleta, o material
necessário às extrações de RNA total foi congelado em nitrogênio líquido e
armazenado em freezer -80 ºC.
3.5. Extração do DNA genômico de C. perniciosa
O DNA genômico do Crinipellis perniciosa foi extraído conforme o método
descrito por Zolan e Pukkila (1986). O micélio fúngico foi macerado em nitrogênio
líquido e nas alíquotas de 20 a 40 mg do macerado adicionou-se 500 µL de tampão
de extração (CTAB 1 %, NaCl 0,7 mol.L-1, Tris-HCl 20 mmol.L-1, pH 8,0, EDTA 10
mmol.L-1, pH 8,0 e β-mercaptoetanol 1 %) homogeneizando bem. Em seguida, foi
adicionado 500 µL de clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 (v/v), centrifugado a 20.000
x g por 5 minutos e a fase aquosa contendo o DNA foi recolhida. O DNA foi
precipitado por adição de igual volume de isopropanol, seguido de incubação por 10
minutos a temperatura ambiente e centrifugado a 20.000 x g por 1 minuto. O
precipitado de DNA foi ressuspenso em 300 µL de água milli-Q, seguido da adição
de 100 µg/mL de RNAse (DNAse free) e incubado por 30 minutos a 37 ºC para a
degradação dos RNAs presentes. A suspensão de DNA foi purificada com a adição
de 300 µL de clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 (v/v), seguida de agitação e
centrifugação a 20.000 x g por 5 minutos. A fase aquosa foi recolhida adicionando-
se 75 µL de CH3COONH4 7,5 mol.L-1 e 750 µL de etanol 95 %, incubando-se por 20
minutos a -20 ºC com a finalidade de precipitar o DNA. Após a centrifugação a
20.000 x g por 1 minuto, o DNA foi lavado com etanol 70 %, seco a temperatura
ambiente e solubilizado em 50 µL de água milli-Q.
Para verificação da qualidade e quantidade do material extraído, procedeu–se
eletroforese em gel de agarose a 1 % corado com brometo de etídio a 0,25 µg.mL-1,
22
visualizado em transiluminador UV (Vilber Loumart) e fotodocumentado em sistema
Kodak EDAS 290.
3.6. Extração do RNA total de C. perniciosa
A extração do RNA total dos distintos estágios de desenvolvimento do C.
perniciosa cultivado em sistema artificial foi realizada utilizando-se o kit RNeasy®
Midi (QIAGEN) conforme as recomendações do fabricante. O tecido micelial
presente nas bolachas foi macerado em nitrogênio líquido e às alíquotas de 250 mg
do macerado adicionado-se 5 mL de tampão RLT (fornecido pelo kit) com a adição
de 50 µL de β-Mercaptoetanol. Em seguida a mistura foi homogeneizada
vigorosamente e incubado em banho-maria a 56 ºC por 3 minutos, e então
centrifugado a 5000 x g por 10 minutos. A solução sobrenadante foi transferida para
um novo frasco, adicionando metade do volume transferido de etanol 96-100%
sendo imediatamente homogeneizado por vigorosa agitação. A amostra foi então
aplicada à coluna RNeasy® midi, que colocada em um tubo de centrifuga de 15 mL
foi centrifugada a 5000 x g por 5 minutos. O filtrado foi descartado e à coluna foi
adicionado 4 mL do tampão RW1 (fornecido pelo kit), a fim de lavar a coluna. Após a
adição do tampão RW1 o tubo de centrifuga contendo a coluna foi centrifugado a
5000 x g por 5 minutos. Novamente o filtrado foi descartado e 2,5 mL do tampão
RPE (fornecido pelo kit) foi adicionado à coluna presente num tubo de centrifuga que
foi novamente centrifugada a 5000 x g por 2 minutos para uma nova lavagem, sendo
este passo repetido por mais uma vez, sendo que ao final da última centrifugação
fosse drenado todo o tampão. A coluna foi transferida para um novo tubo de
centrifuga de 15 mL, e para a eluição do RNA total foi adicionada 200 µL de H2O
milliq RNAse free diretamente sobre a membrana de sílica e homogeneizada
delicadamente. Após a incubação a temperatura ambiente por 1 minuto, centrifugou-
se a coluna a 5000 x g por 3 minutos, sendo então coletado a solução de RNA total.
Para verificação da qualidade e quantidade do material extraído, procedeu–se
eletroforese em gel de agarose a 1 % corado com brometo de etídio a 0,25 µg.mL-1,
23
visualizado em transiluminador UV (Vilber Loumart) e fotodocumentado em sistema
Kodak EDAS 290.
3.7. Extração do RNA total de meristemas de T. cacao
A extração do RNA total de tecido meristemático de T. cacao infectados e não
infectados por C. perniciosa foi realizado como descrito por Gesteira et al. (2003). As
amostras foram maceradas em nitrogênio líquido e às alíquotas de 80 mg adicionou-
se 1,5 mL de tampão de extração (ácido bórico 0,2M, EDTA 10 mmol.L-1 pH 7,6 ,
ajustado com Tris base), 200 µL de SDS 25 % e 200 µL de β-mercaptoetanol 13,4
mol.L-1, misturando-se bem, deixado sob agitação em vortex por 10 minutos e
centrifugado a 15.000 x g por 10 minutos a temperatura ambiente. A fase aquosa foi
recuperada (cerca de 1 mL), transferida para um novo tubo e então adicionado igual
volume de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico 25:24:1 (v/v), seguida de agitação por
10 minutos e centrifugação de 15.000 x g por 10 minutos a temperatura ambiente.
Novamente foi recuperado a fase aquosa (cerca de 0,9 – 1 mL) e adicionado igual
volume de clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 (v/v). Em seguida foi homogeneizado
por 10 minutos e centrifugado a 15.000 x g por 10 minutos a 4 ºC. Após a
centrifugação, foi colhido 700 µL da fase aquosa, transferido para um novo tubo e
adicionado 70 µL de NaAc 3 mol.L-1 pH 4,5 e 308 µL de butanol terciário (0.4
volume) para a eliminação da goma. Foi incubado em gelo por 30 minutos, sob
agitação constante. Após a incubação foi centrifugado a 15.000 x g por 10 minutos a
4 ºC, recuperando a fase aquosa por inversão. Ao tubo contendo a fase aquosa foi
adicionado 594 µL de butanol terciário (0,6 volume) homogeneizando bastante com
o auxilio de vortex e deixado no gelo por 30 minutos. Após 20 minutos de
centrifugação a 15.000 x g a 4 ºC o pellet foi lavado com EtOH 70 % gelado, seco a
temperatura ambiente por 10 minutos, solubilizado em 50 µL de água milli-Q RNAse
free e estocado a -80 °C.
Para verificação da qualidade e quantidade do material extraído, procedeu–se
eletroforese em gel de agarose a 1 % corado com brometo de etídio a 0,25 µg.mL-1,
visualizado em transiluminador UV (Vilber Loumart) e fotodocumentado em sistema
Kodak EDAS 290.
24
3.8. Extração de proteínas secretadas em meio de cultura de C. perniciosa
O meio de cultura de C. perniciosa foi recolhido após 15 dias de cultivo do
fungo, filtrado em papel filtro umedecido em água milliq e em seguida procedeu-se a
extração de proteína hidrofóbicas baseado no método descrito por Santos e
Cascardo (2002).
Em um funil de decantação colocou-se 300 mL de meio de cultura filtrado
agitando-o vigorosamente. Ao meio foi adicionado 300 mL de 2-butanol:clorofórmio
1:1 (v/v), submetendo a mistura a uma vigorosa agitação por 10 minutos. Após
completa homogeneização o funil contendo a mistura foi mantido em repouso para
promover a formação de três fases distintas (solventes orgânicos, proteínas
hidrofóbicas totais e fase aquosa). Em seguida foi coletada a interfase, que contém
as proteínas hidrofóbicas totais, e submetidas a tratamento com ácido
trifluoroacético (TFA) como descrito por WANG et al. (2004). As proteínas foram
tratadas e solubilizadas com 250 µL de ácido trifluoroacético (TFA) e secas com jato
de nitrogênio gasoso. Após completa secagem, as proteínas foram suspensas em
250 µL de tampão de corrida (Tris-HCl 25 mmol.L-1, glicina 200 mmol.L-1, EDTA 1
mmol.L-1e SDS 3,5 mmol.L-1), sendo analisadas por SDS-PAGE 12,5 % para
posterior purificação em HPLC Akta System (GE Health Care).
3.9. Southern Blot
A análise de fragmentos via Southern Blot permite visualizar o número de
cópias desse fragmento presente no genoma de uma espécie. Para tal foi feita a
extração do DNA genômico do C. perniciosa, sendo a técnica de transferência
realizada segundo Sambrook et al. (1989) e para marcação e detecção do sinal da
sonda utilizou-se o kit AlkPhos DirectTM Labelling and Detection system (Amersham
Biosciences) conforme as recomendações do fabricante.
Quatro alíquotas de 6 µg de DNA genômico de C. perniciosa foram clivadas
com 12 unidades das enzimas de restrição Sma I, Eco RI, Bam HI e Xho I, enzimas
que não promovem clivagem nas seqüências codificantes das hidrofobinas de
25
Crinipellis perniciosa. O DNA genômico digerido foi separado por eletroforese em gel
de agarose 0,8 % corado com brometo de etídeo 0,25 µg.mL-1. Após a eletroforese e
a fotodocumentação, o gel incubado sob leve agitação em uma solução de
depurinação (HCl 0,2 mol.L-1) por 15 minutos, seguido de duas incubações de 30
minutos em solução de desnaturação (NaOH 0,5 N e NaCl 1,5 mol.L-1) e duas
incubações de 30 minutos em solução de neutralização (Tris-HCl 0,5 mol.L-1, pH 7,2
e NaCl 1,5 mol.L-1). O DNA foi transferido para membrana de náilon Hybound N+
(Amersham Biosciences) por capilaridade durante 16 horas. Para a transferência foi
utilizada uma cuba de eletroforese horizontal contendo SSC 20X (NaCl 3 mol.L-1,
citrato de sódio 0,3 mol.L-1, pH 7,0) em seu reservatório. Sobre a plataforma da cuba
foram colocadas três folhas de papel filtro (3M) com as extremidades embebidas em
SSC 20 X, formando assim uma ponte. Sobre essa ponte foram colocados o gel, a
membrana de náilon e três pedaços de papel filtro umedecidos em SSC 20 X, e
camadas sucessivas de papel toalha, atingindo aproximadamente 10 cm de altura,
sobre esta foi colocada uma placa de vidro e um peso de aproximadamente 1 kg. O
aparato de transferência foi desmontado e a membrana lavada em SSC 2 X (NaCl
0,3 mol.L-1 e citrato de sódio 0,03 mol.L-1, pH 7,0). O DNA foi fixado na membrana
por incidência de luz UV usando Spectro LinkerTM XL-1000 UV Crosslynker (Fisher
Scientific).
A marcação da sonda foi realizada com o kit AlkPhos DirectTM Labelling and
Detection system (Amersham Biosciences), seguindo as recomendações do
fabricante. Na reação foram usados 200 ηg de um fragmento de 314 pb
correspondente à região codificante da seqüência de HCp-3, amplificado por PCR
(Polimerase Chain Reaction) a partir do cDNA utilizando oligonucleotídeos
específicos. Os fragmentos de hidrofobinas amplificados e purificados utilizando-se o
kit Prep-A-Gene® DNA Purification Systems (BIO-RAD), conforme recomendações
do fabricante, foi desnaturado por aquecimento e a sua marcação deu-se via ligação
covalente da enzima fosfatase alcalina ao DNA fita simples.
A membrana foi pré-hibridizada com 0,2 mL..cm-2 de tampão de hibridização
do fabricante, com NaCl 0,5 mol.L-1 e reagente de bloqueio do kit 4 % (p/v), por 1
hora a 55 °C. Em seguida, a sonda foi adicionada ao tampão procedendo a
hibridização por 16 horas a 55 °C em forno de hibridização (Fisher Scientific). As
lavagens da membrana foram realizadas a 55 °C por duas vezes de 10 minutos em
tampão contendo uréia 2 mol.L-1, SDS 0,1 % (p/v), NaH2PO4 50 mmol.L-1, pH 7,0,
26
NaCl 150 mmol.L-1, MgCl2 1 mmol.L-1 e reagente de bloqueio 0,2 % (p/v) e por duas
vezes de 5 minutos a temperatura ambiente em Tris base 50 mmol.L-1, NaCl 0,1
mol.L-1 e MgCl2 2 mmol.L-1, pH 10,0.
A detecção do sinal foi realizada por degradação do substrato dioxetano, CDP
Star (Amersham Biosciences), pela ação enzimática da fosfatase alcalina. A energia
luminosa emitida foi observada por sensibilização do Hyperfilm ECL após 20 horas
de exposição, seguida de revelação por autoradiografia.
3.10. Síntese de cDNA por meio de RT-PCR (reverse transcriptase - polymerase
chain reaction)
Alíquotas de RNAs totais, das seis diferentes fases de desenvolvimento do C.
perniciosa (cultivadas em sistema de bolachas inoculadas com o isolado 1189
CEPEC/CEPLAC) e de meristemas de T. cacao, foram tratadas com DNAse I –
RNAse Free (Fermentas), seguindo recomendações do fabricante, quantificados
(Figura 9) e amplificados por PCR (polymerase chain reaction) para verificar a
eficácia do tratamento.
Após o tratamento, os RNAs totais foram submetidos a transcrição reversa
utilizando a enzima RevertAidTMH Minus M-MuLV (Fermentas) conforme
recomendações do fabricante. A síntese de cDNAs foi realizada utilizando 10µL de
RNA total como molde, 20 unidades de inibidor de RNAse (Fermentas), 10 mmol.L-1
de dNTPs Mix, 0,5 µg de primer oligo(dT) e 200 unidades de RevertAidTMH Minus M-
MuLV. A reação foi incubada a 42°C por 60 minutos, sendo a enzima transcriptase
reversa inativada por incubação a 70 °C por 10 minutos.
Com a finalidade de padronizar a técnica de RT-PCR foram realizadas
amplificações dos cDNAs utilizando oligonucleotídeos específicos para o gene de
actina de C. perniciosa ( ActinCP-F 5’CCACAATGGAGGACGAAGTCG3’ e ActinCP-R 5’CCCGAGATAGGAGTCCTTCTG3’). Os volumes de cDNAs necessários para a
correta análise semi-quantitativa da expressão dos genes de hidrofobinas, durante
as diferentes fases de desenvolvimento de C. perniciosa e nos diferentes estágios
da vassoura-de-bruxa no cacaueiro, foram determinadas pela análise densitométrica
27
dos genes de actina e do RNA total de cacau, utilizando o software Kodak Digital
ScienceTM ID Image Analysis.
BA
Figura 9. Eletroforese dos produtos de extração de RNA total em gel de agarose. A – Eletroforese dos RNAs totais extraídos nas distintas fases do desenvolvimento artificial de C. perniciosa. As fases mencionadas refere-se a coloração desenvolvida nos micélios durante o cultivo; B - Eletroforese dos RNAs totais extraídos dos diferentes estágios da vassoura-de-bruxa em plântulas de cacaueiro. A linha C corresponde ao RNA total de uma plântula controle (não infectado), as linhas 45, 60 e 90 DAI correspondem aos RNAs de plântulas infectadas após 45, 60 e 90 dias após inoculação.
A padronização das reações de PCR (polymerase chain reaction) foram
realizadas a partir da amplificação dos distintos ESTs de hidrofobinas com os
primers específicos, ocorrendo amplificação exclusiva dos fragmentos quando
utilizado os respectivos primers na presença dos cDNAs que fazem
correspondência, confirmando assim a especificidade dos mesmos (Figura 10). Os
fragmentos de hidrofobinas foram amplificados utilizando as seguintes condições de
amplificação: 94 °C 2 min.; 2 ciclos: 94 °C por 30 seg., 71 °C por 45 seg., 72 °C por
80 seg.; 2 ciclos: 94 °C por 30 seg., 69 °C por 45 seg., 72 °C por 80 seg.; 2 ciclos: 94
°C por 30 seg., 67 °C por 45 seg., 72 °C por 80 seg.; 25 ciclos: 94 °C por 30 seg., 65
°C por 45 seg., 72 °C por 80 seg.; 72 °C por 7 min.; 15 °C continuamente.
Os produtos da transcrição reversa (cDNA) foram amplificado por meio de
PCR e separados em gel de agarose 2 % corado com brometo de etídio a 0,25
µg.mL-1. As bandas foram visualizadas sobre luz ultravioleta, fotodocumentadas pelo
28
sistema Kodak EDAS 290 e analisados por densitometria utilizando o software
Kodak Digital ScienceTM ID Image Analysis.
A normalização da expressão dos genes de hidrofobinas de C. perniciosa foi
realizada a partir dos dados da análise densitométrica do gene da actina, gerados
em pixels, baseado na área das bandas fotodocumentadas. O valor referente a
banda que corresponde a menor expressão de actina foi dividido pelos demais
valores, referentes as expressões de actina nas distintas fases. Os resultados
obtidos foram utilizados como coeficiente de erro. O coeficiente de erro encontrado
na expressão de actina de uma determinada fase foi então multiplicado pelos
valores gerados com a expressão dos demais genes nesta mesma fase, estimando
assim a legítima expressão gênica.
29
A
B
Figura 10. Síntese de cDNA e padronização da amplificação de primers específicos para análise de expressão semi-quantitativa. A – Alinhamento dos cDNAs de hidrofobinas de C. perniciosa com referências a ancoragem dos correspondentes primers. B – Eletroforese de fragmentos amplificados a partir de cDNAs de hidrofobinas com primers específicos. A linha M corresponde ao padrão de pares de bases; As linhas 1, 2, 3 e 4 correspondem aos cDNAs utilizados nas reações de PCR, sendo 1 correspondente ao gene HCp-1, 2, 3 e 4 aos genes HCp-2, HCp-3 e HCp-4, respectivamente. Hidro 1, 2, 3 e 4 refere-se ao primer utilizado.
30
4. RESULTADOS
4.1. Análise de seqüências de hidrofobinas de Crinipellis perniciosa
Durante o processo de sequenciamento e anotação do Projeto Genoma do C.
perniciosa, http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura/, foram observadas seqüências
(reads) genômicas correspondentes aos fragmentos de genes de hidrofobinas. O
alinhamento destes reads resultou na montagem de 27 contigs (seqüência contínua
gerada pelo agrupamento de reads sobrepostos). No banco de dados da Biblioteca
de ESTs do Desenvolvimento do C. perniciosa em Sistema Artificial foram
encontradas quatro cDNAs distintos, sendo dois destes, também encontrados no
banco de dados da Biblioteca de ESTs da Interação cacau:Crinipellis. As seqüências
de nucleotídeos foram comparadas com o banco de dados público GenBank,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, utilizando o programa BlastX (ALTSCHUL et al.,
1997), confirmando a similaridade com seqüências de hidrofobinas já caracterizadas.
As seqüências de nucleotídeos foram traduzidas em quatro ORFs (open reading
frame) sendo denominadas como HCp-1 com 333 nucleotídeos, HCp-2 com 321
nucleotídeos, HCp-3 com 336 nucleotídeos e HCp-4 com 330 nucleotídeos que
codificam proteínas de 110, 106, 111 e 109 aminoácidos respectivamente. As ORFs
HCp-1 e HCp-3 foram também identificadas no banco de dados da biblioteca de
ESTs correspondente a interação T. cacao-C. perniciosa.
As seqüências de hidrofobinas de C. perniciosa quando comparadas com
seqüências do GenBank apresentaram similaridade com hidrofobinas de classe I de
diferentes basidiomicetos (Tabela 1). A menor similaridade encontrada foi de 70 %
31
com a proteína de Agaricus bisporus e a maior foi de 87 % com a proteína de
Pleurotus ostreatus.
O alinhamento das seqüências de hidrofobinas de C. perniciosa com as
seqüências de hidrofobinas de classe I de basidiomicetos como Agaricus bisporus,
Coprinopsis cinerea, Dictyonema glabratum, Lentinula edodes, Pholiota nameko,
Pleurotus ostreatus e Schizophyllum commune, permitiu a identificação de alguns
aminoácidos comuns a todas as hidrofobinas. Inclusive os oito resíduos de cisteína
característicos, com conservação dos espaçamentos entre os resíduos,
característico das seqüências de hidrofobinas de classe I (Figura 11).
Tabela 1. Similaridade de seqüências de aminoácidos de hidrofobinas de C. perniciosa com hidrofobinas de classe I de diferentes basidiomicetos.
Organismos Número de acesso Similaridade %
Agaricus bisporus CAC03466.1 70
Coprinopsis cinerea_CoH1 CAA71652.1 80
Dictyonema glabratum_hyd3 CAC86006.1 77
Lentinula edodes_hyd1 AAG00900.1 80
Pholiota nameko_hyd315 BAB84547.1 75
Pleurotus ostreatus CAA74987.1 87
Schizophyllum commune_Sc3 JH0184 79
Schizophyllum commune_Sc1 JU0321 72
Um dendrograma baseado nas seqüências de hidrofobinas de classe I dos
basidiomicetos presentes na tabela 1 e hidrofobinas de classe II de ascomicetos, foi
construído usando o programa ClustalW 1.82 (Figura 12). As hidrofobinas de classe
II foram agrupadas distintamente, as hidrofobinas de C. perniciosa foram agrupadas
com seqüências de hidrofobinas de classe I de basidiomicetos, demonstrando
particular similaridade entre HCp-1 com as proteínas de P. nameko_hyd315 e L.
edodes_hyd1; HCp-2 com proteínas de D. glabratum_hyd3 e S. commune_Sc3;
HCp-3 com C. cinerea-CoH1; e HCp-4 com maior similaridade a C. cinerea-CoH1 e
HCp-3.
32
Figura 11. Alinhamento das seqüências de hidrofobinas classe I. Seqüências de aminoácidos de hidrofobinas de C. perniciosa foram alinhadas com auxílio do ClustalW 1.82, com seqüências de proteínas relacionadas, depositadas no GenBank. Em vermelho encontram-se os resíduos conservados em todas as proteínas. Os asteriscos destacam os oito resíduos de cisteínas conservados entre as seqüências. A caixa verde refere-se aos sítios de clivagem do peptídeo sinal.
O perfil hidropático das seqüências de hidrofobinas maduras de C. perniciosa
demonstra um padrão semelhante de hidrofobicidade (Figura 13A, B). A
hidrofobicidade foi calculada de acordo com Kyte e Doolittle (1982) utilizando o
programa ProtScale, http://au.expasy.org/tools/protscale.html.
O alinhamento das seqüências de hidrofobinas de C. perniciosa permitiu a
identificação de segmentos conservados em todas seqüências. Além dos
segmentos, alguns aminoácidos isolados são comuns a todas as hidrofobinas,
destacando-se a presença de oito resíduos de cisteínas com espaçamento
conservados em todas as seqüências. Na extremidade carboxila das proteínas foi
identificada o sítio de clivagem do peptídeo sinal, representado pelos resíduos de
aminoácidos das posições 19, 16 e 17 em HCp-1, HCp-2 e HCp-4, e HCp-3 (Figura
33
13C) resultando em proteínas maduras com 91, 90, 93 e 94 aminoácidos e com
massas estimadas de 8.692, 8.873, 9.483 e 9.255 Da, respectivamente.
Figura 12. Dendrograma. Agrupamento com estimativa filogenética baseada na análise de distância das seqüências de hidrofobinas classe I e II.
34
Figura 13. Perfil hidropático e alinhamento das seqüências primárias de hidrofobinas.
A – Comparação do perfil de hidrofobicidade das hidrofobinas maduras
de classe I (Sc-3) e classe II (CU); B – Comparação do perfil de
hidrofobicidade das hidrofobinas madura de C. perniciosa; C –
Alinhamento de seqüências primárias. Em vermelho estão os
aminoácidos comuns às quatro ORFs. Os asteriscos destacam os oito
resíduos de cisteína característicos e na caixa azul encontram-se os
sítios de clivagem do peptídeo sinal nas diferentes hidrofobinas.
35
4.2. Detecção do número de cópias gênicas de hidrofobinas de C. perniciosa
O DNA genômico de Crinipellis perniciosa foi sondado com um fragmento de
314 pares de bases, correspondente à região central do gene HCp-3, possuindo
regiões homologas com as demais hidrofobinas do organismo. A hibridação foi
realizada em condições de baixa estrigência, permitindo a identificação de pelo
menos quatro bandas de diferentes tamanhos nos produtos de digestão do DNA
(Figura 14).
Figura 14. Análise genômica do número de cópias de hidrofobinas de Crinipellis perniciosa. A – Fracionamento das reações de digestão do DNA genômico de C. perniciosa com Sma I (S), Eco RI (E), BamH I (B) e Xho I (X); B - Southern Blot não radioativo revelado por autoradiografia, hibridizado com os fragmentos gênicos de hidrofobinas.
36
4.3. Análise da expressão gênica de hidrofobinas de C. perniciosa em fases do desenvolvimento fúngico in vitro e em plântulas de cacau infectado
Após normalização (Tabela 2) e execução de uma curva de amplificação do
gene da actina para evitar erros e saturação dos fragmentos amplificados, foram
realizadas as amplificações dos cDNAs correspondentes as diferentes fases do
desenvolvimento de C. perniciosa em sistema artificial com os primers específicos
para os distintos genes de hidrofobinas de C. perniciosa. Os produtos das
amplificações foram separados por eletroforese em gel de agarose revelando a
expressão semi-quantitativa desses genes. Os genes HCp-1, HCp-2 e HCp-4
apresentaram expressão diferencial nos cDNAs das diferentes fases do
desenvolvimento fúngico (isolado 1189). O gene HCp-3 apresentou expressão
quando amplificados em cDNAs das fases de crescimento fúngico que foram
cultivados a partir dos isolados 998 e 1441.
O gene HCp-1 foi expresso em todas as fases do crescimento fúngico,
possuindo distintos níveis de expressão, sendo mais intenso na fase micelial rosa
escuro e em primórdios com discreta expressão em basidioma. O gene HCp-2 não
apresentou expressão na fase micelial branca, mostrando expressão nas demais
fases, sendo esta intensificada na fase micelial amarela e em basidioma. O gene
HCp-4 apresentou discreta expressão em todas as fases sendo estas aumentada
nas fases miceliais branca e rosa sendo sua expressão diminuída com o
desenvolvimento do fungo (Figura 15a e 16). O gene HCp-3 não revelou expressão
quando amplificado com cDNAs originados do cultivo do isolado fúngico 1189, mas
apresentou expressão em cDNAs de dois outros isolados. Nas fases miceliais
branca, amarela e rosa do isolado 998 foram detectadas expressões em todas fases,
excetuando quando amplificado a partir do cDNA confeccionado com RNA total
extraído da camada externa da bolacha. Na fase micelial rosa escuro, primórdios e
basidioma do isolado 1441 ocorreram expressões apenas nos dois primeiros pontos,
sendo a expressão em primórdios bastante intensificada (Figura 15b).
Devido a não otimização na amplificação das reações de PCR com os primers
específicos para o gene S18 (SHIMIZU et al., 2001), foi realizado a avaliação
densitométrca do RNA total de cacau a fim de minimizar os erros nas análises semi-
quantitativas de expressão gênica com os cDNAs confeccionados a partir desse
37
material. A amplificação dos cDNAs evidenciou apenas a expressão dos genes HCp-
1 e HCp-2. O HCp-1 foi evidenciado na fase terminal da vassoura com 90 dias após
a inoculação. O HCp-2 foi expresso unicamente na fase inicial da vassoura, 45 dias
após a inoculação (Figura 15c).
Tabela 2. Análise densitométrica da expressão semi-quantitativa de hidrofobinas de C. perniciosa via RT-PCR.
Genes Análise densitométrica1
Fase Branca
Fase Amarela
Fase Rosa
Fase Rosa
Escuro Primórdios Basidioma
HCp-1 129,0 118,6 143,9 191,4 182,6 109,9
HCp-2 - 109,7 89,9 93,7 89,3 113,3
HCp-4 98,4 79,4 100,3 83,4 62,3 46,6
Actina 130,1 139,2 136,5 133,5 126,7 116,7 1 Os dados da análise densitométrica são gerados em pixels baseado na área das bandas fotodocumentadas com a eletroforese em gel de agarose 2 %, observadas sobre luz UV (365 nm).
38
Figura 15. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de RT-PCR de cDNAs de C.
perniciosa e cacaueiros infectados. Os fragmentos de hidrofobina foram amplificados a partir do cDNA com auxilio de primers específicos. A – Expressão gênica semi-quantitativa de hidrofobinas em diferentes fases do desenvolvimento de C. perniciosa (isolado 1189); B - Expressão gênica semi-quantitativa de HCp-3 em diferentes fases do desenvolvimento de C. perniciosa. As três primeiras fases correspondem ao isolado 998 e as demais fases ao isolado 1441). A letra I corresponde a camada interna da bolacha e E a camada externa; C - Expressão gênica semi-quantitativa de hidrofobinas em diferentes estágios de vassoura-de-bruxa em cacaueiros.
A
C
B
39
020406080
100120140160180
Expr
essã
o re
lativ
a
Branc
aAmar
ela
Rosa
R. Esc
uro
Primór
dioBas
idiom
a
Fase de desenvolvimento do fungo
Expressão das Hidrofobinas de C. perniciosa nornalizadas pela Actina
HCp-1HCp-2HCp-4
Figura 16: Expressão relativa das hidrofobina de Crinipellis perniciosa normalizadas pela expressão da actina.
40
4.4. Indício de hidrofobinas secretadas em meio de cultura de C. perniciosa
Discos de micélios de C. perniciosa foram cultivados em meio líquido e após
15 dias de cultivo, proteínas hidrofóbicas secretadas pelo fungo foram purificadas do
sobrenadante. As proteínas foram fracionadas por SDS-PAGE 12,5 % sendo então
identificada uma banda de aproximadamente 10 kDa, correspondente à migração
esperada para as hidrofobinas de C. perniciosa (Figura 17). Essas proteínas serão
purificadas em colunas de interação hidrofóbica C-18 com auxílio de um HPLC Akta
System (GE Health Care) para produção de anticorpos monoclonais.
MW 1 2 3 4 5
45.0 kDa -
35.0 kDa - 25.0 kDa -
18.4 kDa -
14.4 kDa -
Figura 17. SDS-PAGE 12,5 % de proteínas hidrofóbicas secretadas pelo micélio de
C. perniciosa. A linha MW refere-se ao padrão de massa molecular em kDa; A linha 1, 2, 3 e 4 corresponde diferentes frações do extrato de proteínas hidrofóbicas secretadas e 5 meio de cultura após a extração protéica. A seta indica a presença da banda de 10 kDa correspondente as hidrofobinas secretadas por C. perniciosa.
41
5. DISCUSSÃO
5.1. C. perniciosa codifica quatro hidrofobinas distintas e pertencentes a classe I
A análise de três bibliotecas construídas com isolados distintos de Crinipellis
perniciosa, sendo uma genômica e as outras de cDNA, da Interação
Cacau:Crinipellis e do Desenvolvimento do C. perniciosa em Sistema Artificial,
permitiu a identificação de quatro seqüências gênicas que codificam para a proteína
hidrofobina. Contigs referentes as quatro seqüências foram identificadas no banco
de dados do Projeto Genoma de C. perniciosa,
http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura/. Hcp-1, Hcp-2, Hcp-3 e Hcp-4 foram
identificadas na biblioteca de cDNA do Desenvolvimento do C. perniciosa em
Sistema Artificial, sendo também identificado Hcp-1 e Hcp-3 na biblioteca de
Interação Cacau:Crinipellis. Todas as seqüências apresentaram similaridade com
hidrofobinas de classe I, não sendo até agora identificadas hidrofobinas da classe II
em basidiomicetos. Sua estrutura primária mostra diversas sequências de
aminoácidos, no entanto é caracterizada pela presença de oito resíduos de cisteína
com espaçamento conservado, seqüência de endereçamento secretório entre os
primeiros 20 aminoácidos, e semelhantes padrões de hidrofobicidade (WESSELS,
1994, 1997). As hidrofobinas formam quatro pontes disulfeto intramolecular. O
acoplamento das ligações disulfeto da origem as alças que possuem segmentos
com distintos números de aminoácidos, sendo essa uma das propriedades biofísicas
bastante peculiar na classificação das hidrofobinas (WÖSTEN; DE VOCHT, 2000). A
presença de ligações disulfeto pode levar a inferência de que mutações que
42
desestabilizem estas interações podem acarretar em mudanças conformacionais na
estrutura terciária dessas proteínas, e conseqüentemente, afetar sua função
biológica.
O alinhamento das sequências de hidrofobina evidência a região de clivagem
do peptídeo sinal, segmento característico de proteínas que são secretadas. A
funcionalidade do sinal de endereçamento foi confirmada por estudos de
imunolocalização (LUGONES et al., 1996) e pela presença dos oligômeros e
monômeros nos extratos de proteínas hidrofóbicas secretadas em meio de cultura
por C. perniciosa.
Hidrofobinas são proteínas secretadas em abundância por fungos
filamentosos envolvidos nos processos de crescimento e desenvolvimento fúngico,
cruzamento sexual, mudanças de fases (KERSHAW; TALBOT, 1998), no processo
de desenvolvimento hifal de um ambiente hidrófilo (substrato) para um ambiente
hidrofóbico (ar), envolvidas na formação de estruturas aéreas hidrofóbicas como
hifas aéreas, esporos e basidiomas (LUGONES et al., 1996; TALBOT et al., 1996;
WÖSTEN et al., 1993, 1999). O estudo das hidrofobinas durante o desenvolvimento
da vassoura-de-bruxa e transição entre os sintomas de vassoura é de fundamental
importância para o entendimento de mecanismos acionados pelo fungo durante o
desenvolvimento da doença no cacaueiro.
5.2. Hidrofobinas de C. perniciosa constituem uma família multigênica
A análise de Southern Blot para a confirmação do número de copias dos
genes de hidrofobinas em C. perniciosa revelou a presença de pelo menos quatro
bandas. Resultado este, que corrobora com o sequenciamento da biblioteca de
cDNA de C. perniciosa, onde também foi identificado quatro diferentes genes de
hidrofobina sendo expressos durante o desenvolvimento do fungo em sistemas
artificiais de produção de basidioma. O número de genes de hidrofobinas no genoma
do fungo demonstra que a exemplo de outros fungos, como por exemplo, S.
commune que também possui quatro distintos genes de hidrofobina (KERSHAW et
al., 1998), o genoma de C. perniciosa também possui uma família multigênica.
43
Os resultados encontrados não isentam da possibilidade de encontrar
isoformas ou seqüências em tandem no genoma de C. perniciosa, visto que
bibliotecas de cDNA de diferentes estágios da doença e de fases de
desenvolvimento fúngico estão sendo confeccionadas com isolados diferentes, e
também que estudos têm demonstrado uma relativa variabilidade genética entre
isolados distintos C. perniciosa (ANDEBRHAN et al., 1999).
O agrupamento das hidrofobinas no dendrograma formou quatro grupos, três
dos quais, as hidrofobinas de C. perniciosa aparecem. Baseado nas classes das
proteínas compôs dois grupos. As hidrofobinas de classe II (ascomicetos) e as de
classe I (basidiomicetos). As hidrofobinas de C. perniciosa agruparam distintamente
entre os demais basidiomicetos e em concordância com a sua função biológica. O
gene HCp-1 apresentou similaridade com um gene de Lentinula edodes_hyd1,
envolvido na formação do basidioma (NG et. al., 2000), fazendo correspondência
com a função identificada para HCp-1. O HCp-2 apresentou similaridade com um
gene de Dictyonema glabratum_hyd3, hidrofobina de uma espécie de líquen,
envolvida na formação de canais de gás em basidiomas (TREMBLEY et. al., 2002),
ambas possuem expressão em basidioma. HCp-3 e HCp-4 apresentaram
similaridade de seqüência com Coprinopsis cinerea_CoH1 (Coprinus cinereus), cuja
expressão parece ser restrita ao micélio monocariótico, possuindo baixa expressão
em micélio vegetativo dicariótico e completamente ausentes em basidiomas
(ÁSGEIRSDÓTTIR et. al., 1997). O HCp-3 apresenta expressão em micélio
dicariótico ocorrendo também sua expressão na formação de basidiomas, pois foi
detectada uma alta expressão na fase de formação de primórdios nos sistemas de
bolachas. HCp-4 apresenta expressão em micélios dicarióticos possuindo atividade
em todas as fases do desenvolvimento fúngico em sistema artificial. O padrão de
expressão dos genes de hidrofobinas são coincidentes entre o C. perniciosa e
alguns organismos, esses resultados sugerem uma conservação evolutiva das
funções desses distintos genes entre os fungos filamentosos (Tabela 3).
44
45
5.3. Hidrofobinas possuem expressão diferencial durante as fases do desenvolvimento fúngico e em plântulas de cacau infectado por C. perniciosa
Os oligonucleotídeos específicos construídos para amplificar os distintos
cDNAs de hidrofobinas foram capazes de discriminar a expressão diferencial dos
quatro genes de hidrofobina por meio de RT-PCR semi-quantitativo.
A expressão dos genes de hidrofobinas observada nas fases de cultivo de C.
perniciosa e nos diferentes estágios da doença mostrou que os diferentes genes são
expressos nas distintas fases do desenvolvimento fúngico e da doença. O gene
HCp-1 teve maior expressão na fase micelial rosa escuro, na fase de aparecimento
dos primórdios e no último estágio da doença (90 DAI), correspondendo a uma
possível produção do basidioma, tanto nas bolachas, como na vassoura seca. A
expressão do gene HCp-2 foi intensificada na fase micelial amarela e em
basidiomas, foi verificada também sua expressão na fase inicial da vassoura,
sugerindo que a mesma ocorre tanto em micélio monocariótico como em dicariótico,
visto que aos 30 DAI o fungo ainda se encontra na fase parasítica, intercelular, nos
tecidos infectados. O gene HCp-4 tem sua expressão em todas as fases do
desenvolvimento fúngico na bolacha, indicando sua presença em micélios
dicarióticos. Embora não tenha sido identificada a expressão de HCp-4 nos estágios
de desenvolvimento da vassoura e no basidioma, é comprovada sua expressão no
desenvolvimento fúngico. HCp-3 foi o único gene que não evidenciou expressão
nem nas fases do desenvolvimento artificial do fungo nem nas fases de vassoura,
porém em estudo com diferentes isolados foi verificada sua expressão. Também é
constatada a expressão de HCp-3 em vassouras verdes, pois este gene foi
encontrado no sequenciamento da biblioteca de ESTs da interação cacau-Crinipellis.
Transcritos da HCp-3 foram encontrados em abundância na fase de primórdios nos
sistemas de bolachas, sugerindo sua participação na produção do basidioma. Tal
qual o observado em S. commune foram identificadas expressões dos genes de
hidrofobina em micélio monocariótico e dicariótico, e que diferentes hidrofobinas são
responsáveis por distintas funções biológicas (KERSHAW et al., 1998; WÖSTEN et
al., 1994a).
Ao separar as bolachas em camadas, interna e externa, e efetuar a análise de
expressão via RT-PCR, observou-se que HCp-3 sempre mostrou uma maior
46
expressão na camada externa (com exceção da fase branca), isto era esperado,
visto que é a parte de maior contato com o ar. Apenas a expressão de HCp-1, HCp-2
e HCp-4 foram observadas nos basidiomas.
A análise da expressão via imunoblotting poderá auxiliar no estudo de
expressão gênica de hidrofobinas durante o desenvolvimento da vassoura-de-bruxa
no cacaueiro.
5.4. Oligomerização de hidrofobinas em cultivo de C. perniciosa
A secreção de proteínas é complexa e envolve vários compartimentos
celulares. É certo que a secreção de proteínas envolve processos de tradução e
translocação através do retículo endoplasmático, desse modo é que fungos
filamentosos como o basidiomiceto C. perniciosa secreta suas hidrofobinas. O filme
anfipático com interfase hidrofílica/hidrofóbica formado por monômeros de
hidrofobinas de classe I é altamente insolúvel, sendo seus oligômeros dissociados
apenas com a ação de ácido fórmico ou ácido trifluoroacético (TFA). Em contraste,
os oligômeros formados por hidrofobinas de classe II são menos estáveis (DE
VRIES et al., 1993; WESSELS et al., 1991a). Baseado nestas informações é que
cultivamos C. perniciosa para a purificação de hidrofobinas. Após purificação das
mesmas, anticorpos monoclonais serão produzidos, titulados e utilizados para
verificar a expressão dos genes de hidrofobina, via imunoblotting, em diferentes
estágios da vassoura-de-bruxa no cacaueiro.
47
6. CONCLUSÕES
A família multigênica de hidrofobinas de Crinipellis perniciosa possui pelo
menos quatro diferentes genes codificadores de hidrofobinas de classe I.
Os genes codificadores para hidrofobinas são expressos diferencialmente nas
fases biotróficas e necrotróficas do ciclo de vida do fungo C. perniciosa causador da
vassoura-de-bruxa no cacaueiro.
As hidrofobinas de C. perniciosa apresentam similaridade de seqüências com
as de outros basidiomicetos, apresentando semelhança de funções biológicas e
envolvimento em fase de vida.
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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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