universidade estadual de campinas instituto de...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE MICROBIOTA ORIGINADA DE
RESERVATÓRIOS DE PETRÓLEO PARA BIORREMEDIAÇÃO
EVALUATION OF THE BIOREMEDIATION POTENTIAL OF
MICROORGANISMS ORIGINATED FROM PETROLEUM RESERVOIRS
Bruna Martins Dellagnezze
Campinas- São Paulo
Janeiro/ 2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
BRUNA MARTINS DELLAGNEZZE
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE MICROBIOTA ORIGINADA DE
RESERVATÓRIOS DE PETRÓLEO PARA BIORREMEDIAÇÃO
EVALUATION OF THE BIOREMEDIATION POTENTIAL OF MICROORGANISMS
ORIGINATED FROM PETROLEUM RESERVOIRS
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da UNICAMP, obtenção do título de doutora em Genética e
Biologia Molecular, na área de Genética de Microorganismos.
Thesis presented of Biology Institute of University of Campinas in partial fulfillment of the requirements
for the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology, in the area of
Genetics of Microorganisms
Orientadora: Dra. Valéria Maia Merzel
Co-orientadora: Dra. Suzan Pantaroto de Vasconcellos
Este exemplar corresponde á versão final da tese defendida pela aluna Bruna Martins Dellagnezze e orientada pela Dra. Valéria Maia Merzel
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Campinas, 22 de janeiro de 2015
BANCA DE EXAMINADORA
Dra. Valéria Maia Merzel (orientadora)
Profa. Dra. Vânia Maria Maciel Melo __________________
Prof. Dr. Welington Luiz Araújo _______________
Dra. Lucélia Cabral __________________
Profa. Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte _________________
Profa. Dra. Fabiana Fantinatti-Garboginni ________________ Prof. Dr. Anderson de Souza Sant'Ana __________________
Prof. Dr. Fernando Dini Andreote _________________
Profa. Dra. Laura Mariscal Ottoboni _______________
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ABSTRACT
Pollution is a global environmental problem widely discussed, including oil spills that occur
accidentally or due to human activities, which cause huge environmental and economic
impacts. Bioremediation process uses biological agents, associated or not to other
compounds like biosurfactants or even their enzymes, to mineralize or complex organic
and inorganic pollutant compounds, transforming them into inert or non-toxic
compounds. Thus, bioremediation represents an ecofriendly and effective way to treat
impacted areas. In this work, the biodegradation potential of clones obtained from
metagenomic libraries and bacterial isolates, all originated from Brazilian petroleum
reservoirs, was evaluated in microcosm and mesocosm scale aiming at a future application
in bioremediation process. In the first assay, microorganisms were evaluated as free cells,
in 50 mL-volume of artificial seawater and using crude oil as sole carbon source. The
experiment was monitored each seven days during 21 days. Further, the best performing
microorganisms were selected, immobilized in chitosan beads and evaluated in microcosm
assays, at different scales, during 21 and 30 days. Finally, in the last experiment, one
consortium containing four metagenomic clones and a Bacillus subtilis strain was
evaluated in mesocosmos assay in 3000 L-volume of non-sterile seawater. Parameters
such as total counting of microorganisms by DAPI and biological oxygen demand (BOD)
were evaluated, and petroleum degradation was monitored by chromatographic analysis.
Results demonstrated the ability of the microorganisms to degrade aliphatic and aromatic
hydrocarbons. In microcosms, using free cells, the strains of Dietzia maris and Micrococcus
sp. showed the best performance, reaching 99% of aliphatic hydrocarbon degradation and
63-99% of aromatic compound degradation in 21 days. Among metagenomic clones, clone
2B presented the best performance to degrade aliphatic (47%) and aromatic hydrocarbons
(94%). In chitosan beads, the microorganisms were also able to degrade crude petroleum,
showing percentages between 90 and 100% for aliphatic hydrocarbons and 70 and 100%
to aromatic. The results gathered in this work demonstrate that a microbial consortium
containing metagenomic clones and one bacterial strain is able to achieve high extents of
hydrocarbon degradation, offering a promising tool to be further used in bioaugmentation
approaches for treating contaminated environments.
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RESUMO
A poluição é um problema mundial amplamente discutido, incluindo os derramamentos
de petróleo ocorridos através de acidentes ou por atividades humana, os quais acarretam
grande impacto ambiental e econômico. O processo de biorremediação utiliza micro-
organismos, associados ou não a outros compostos como biossurfactantes e até mesmo
enzimas, com o objetivo de transformar compostos orgânicos em inorgânicos, levando à
formação de compostos inertes ou não tóxicos. Deste modo, a biorremediação representa
um modo efetivo e sustentável para se tratar áreas contaminadas. Neste trabalho foi
possível avaliar o potencial de clones metagenômicos obtidos a partir da construção de
uma biblioteca fosmidial e de linhagens de bactérias, todos provenientes de amostras de
petróleo de reservatórios brasileiros em escala de microcosmos e mesocosmos, visando
futura aplicação em processos de biorremediação. Em um primeiro ensaio os micro-
organismos foram avaliados na forma livre, em 50 mL de água do mar artificial e petróleo
bruto como única fonte de carbono, a cada sete dias durante 21 dias. Posteriormente, os
micro-organismos com melhor potencial de biodegradação foram selecionados e
aprisionados em esferas de quitosana e testados novamente em microcosmos, em
diferentes escalas, durante 21 e 30 dias. Com base nos resultados observados nos ensaios
de degradação em microcosmos, um último ensaio foi realizado empregando-se um
consórcio contendo quatro clones metagenômicos e uma linhagem de Bacillus subtilis, o
qual foi avaliado em ensaio de mesocosmos em 3000 litros de água do mar não-estéril.
Nesta etapa, parâmetros como a contagem total dos micro-organismos (DAPI) e a
demanda biológica de oxigênio (DBO) foram avaliados, e a cromatografia gasosa (CG) foi
empregada para avaliar a degradação de hidrocarbonetos do petróleo. Os resultados
demonstraram a capacidade desses micro-organismos em degradar compostos do
petróleo bruto, tanto hidrocarbonetos alifáticos como aromáticos. Em microcosmos, na
forma livre, as linhagens de Dietzia maris e Micrococcus sp. apresentaram o melhor
desempenho, alcançando ao final de 21 dias 99% de degradação de hidrocarbonetos
alifáticos e de 63-99% de degradação de aromáticos (fenantreno e metilfenantreno).
Dentre os clones, o clone 2B apresentou o melhor desempenho para degradar tanto
hidrocarbonetos alifáticos (47%) como aromáticos (94%). Na forma aprisionada, os micro-
organismos também apresentaram capacidade para degradar petróleo bruto em
mesocosmos, exibindo valores de degradação de 90 a 100 % para hidrocarbonetos
saturados e 70 a 100% para aromáticos, ao final de 30 dias de avaliação. Os resultados
indicam um resultado promissor e inédito, onde um consórcio combinado contendo
clones metagenômicos e Bacillus subtillis pode ser futuramente utilizado em estratégias
de bioaumento, em sistemas de contenção, como ferramenta para biorremediação de
ambientes contaminados com hidrocarbonetos.
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SUMÁRIO
página
1. INTRODUÇÃO................................................................................................................................15
2. REVISÃO DA LITERATURA...............................................................................,.............................17
2.1. Microbiologia do petróleo..................................................................................................17
2.2. Derramamentos de petróleo..............................................................................................19
2.3. Biorremediação.................................................................................................................23
2.4. Bioaumentação utilizando organismos geneticamente modificados (OGM)..................... 29
2.5 Biorremediação e o uso de biossurfactantes.......................................................................32
2.6 Genes de degradação de hidrocarbonetos..........................................................................35
2.7 Metagenômica.....................................................................................................................41
2.8 Referências Bibliográficas....................................................................................................46
CAPÍTULO 1. Potencial de microbiota derivada de reservatórios de petróleo para biorremediação …………........................................................................................................53
CAPÍTULO 2. Avaliação e otimização da produção de biossurfactantes por micro-organismos de reservatórios de petróleo.............................................................................63
2.1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................................63
2. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................................................64
2.2.1. Delineamento experimental para otimização da produção de biossurfactantes............65
2.2.2. Ensaios de tensiometria.................................................................................................66
2.2.3. Ensaios de emulsificação (E24)........................................................................................66
2.2.4. Imobilização dos micro-organismos em quitosana.........................................................67
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................................69
2.3.1. Otimização da produção de biossurfactante por planejamento Placket-Burman.......... 69
2.3.2. Ensaios de emulsificação (E24)........................................................................................90
2.3.3. Imobilização dos micro-organismos em quitosana.........................................................95
2.4. CONCLUSÕES..............................................................................................................................98
2.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................................98
CAPÍTULO 3. Avaliação da estratégia de imobilização microbiana para a degradação do petróleo em microcosmos..........................................................................................................103
3.1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................103
3.2. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................................104
3.2.1. Ensaios de degradação em microcosmos.....................................................................104
3.2.2 Ensaios de degradação em tanques................................................................................106
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................................................109
3.3.1. Ensaios de degradação em microcosmos.......................................................................109
3.3.2. Ensaios de degradação em tanques..............................................................................115
xii
3.4.CONCLUSÕES.............................................................................................................................119
3.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................................120
CAPÍTULO 4. Avaliação da estratégia de bioaumento utilizando micro-organismos imobilizados para biorremediação de petróleo em mesocosmos....................................123
4.1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................................123
4.2. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................................124
4.2.1 Ensaios em mesocosmos .........................................................................................124 4.2.2. Contagem total de micro-organismos.....................................................................125
4.2.3. Demanda Biológica de Oxigênio (DBO)...................................................................125
4.2.4. Contagem dos micro-organismos heterotróficos....................................................126
4.2.5. Análises de cromatografia gasosa (CG- FID)............................................................126
4.2.6. Análise de Escalonamento Multidimensional não–métrico (nMDS)........................127
4.2.7. Sequenciamento das amostras de DNA dos mesocosmos......................................127
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................................................128
4.3.1. Contagem total de micro-organismos.....................................................................128
4.3.2. Contagem dos micro-organismos heterotróficos....................................................129
4.3.3. Demanda Biológica de Oxigênio (DBO).....................................................................130
4.3.4. Degradação dos hidrocarbonetos saturados............................................................131
4.3.5. Degradação dos hidrocarbonetos aromáticos..........................................................132
4.3.6. Análise de Escalonamento Multidimensional não–métrico (nMDS).........................136
4.3.7. Sequenciamento do gene RNAr 16S das amostras dos mesocosmos........................138
4.4 CONCLUSÕES.............................................................................................................................143
4.5. CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................................................................................146
4.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................................146
ANEXO: Aprovação do Comitê Interno de Biossegurança (CIBio).................................................151
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Agradecimentos
Primeiramente a Deus, que sempre me conduz nos momentos bons e nos mais
difíceis, pois sem Sua força, eu nada seria;
À minha família, meu porto seguro, meus amados pais Rene e Silvana, e minha
querida irmã Beatriz, por todo amor, paciência e apoio, que mesmo de longe pude sempre
contar;
Aos meus queridos tios e tias, primos e primas, que direta ou indiretamente me
ajudaram nessa jornada;
À minha co-orientadora, Dra. Suzan Vasconcellos, pela paciência, apoio,
atenção, dedicação e amizade e que tem me dado desde o mestrado e agora, mesmo mais
distante, obrigada por toda a sua ajuda!
À minha orientadora Dra. Valéria Maia Merzel, uma pessoa que admiro muito,
obrigada por todos esses anos de convivência, por toda a paciência, ensinamentos e por
todo o apoio. Por ter me possibilitado enxergar as coisas de um modo novo! Obrigada
pelas oportunidades que foram tão valiosas para a minha vida profissional, mas
principalmente para minha vida pessoal!
Aos meus queridos amigos de longa data, Vanessa e Paulo, que há muito tempo
estão na minha vida compartilhando tantos altos e baixos! Obrigada por estarem do meu
lado também nessa jornada, sempre dando apoio e incentivo! E tenho certeza que
estaremos compartilhando outras etapas de nossas vidas!
Flávia (Florzinha), e João Kléber amigos queridos que mesmo de longe, obrigada
pelo apoio, amizade e incentivo!
Aos meus queridos do laboratório, Maria Rafa, Natália, Dai, Vivi (por todos os
momentos!!), Alysson, Dani, Júlia, Éricka, Michel, Fernando, Mariana Neri, Mariana
Barato, Gileno, Sanderson, Elmer, Milena, Milene, Jaque, Tulio, Babu, Pati, Claudia,
xiv
Samantha. Com certeza meus dias no laboratório (e fora dele também) foram bem
melhores com vocês por perto!
Á profa. Georgiana Feitosa da Cruz da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) pela parceria ao longo desse trabalho;
Á profa. Vânia Melo, Alysson Angelim e todos os colegas do laboratório de
Ecologia Microbiana da Universidade Federal do Ceará (UFC) pelo apoio e parceria nesse
trabalho;
Ao Dr. Simone Cappello do Instituto per l’Ambiente Marino Costiero (IAMC),
em Messina (Itália), pelo empenho em auxiliar-me nos meus experimentos, por ter me
recebido tão bem em seu laboratório e proporcionado muitos bons momentos de
convivência no melhor estilo italiano!
Aos colegas do mesmo Instituto, Sanny, Gianluca, Anna, Giovanni, Saida,
Martina, Francesco, Gabriele, Francesca, Daniela por tantos bons momentos e apoio nessa
etapa do trabalho!
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte
financeiro, indispensável à realização deste trabalho;
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1. INTRODUÇÃO
O petróleo cru é uma mistura complexa e heterogênea contendo dezenas de
milhares de compostos orgânicos quimicamente distintos (Fernandez-Lima et al., 2009).
Geralmente são agrupados em quatro frações de acordo com sua solubilidade em
solventes orgânicos: hidrocarbonetos saturados, hidrocarbonetos aromáticos, resinas e
asfaltenos. Desde a primeira observação de micro-organismos viáveis em águas de campo
de petróleo (Bastin et al., 1926), tem havido um debate sobre a existência de uma
microbiota autóctone em reservatórios de petróleo (Magot et al., 2000).
Derramamentos acidentais de petróleo no mar vêm sendo reportados ao longo dos
anos (Vieites et al., 2004; Wieczorek et al, 2007; Outdot & Chaillan, 2010). A liberação de
grande quantidade de óleo em sistemas marinhos acarreta grande impacto ambiental,
afetando de maneira geral toda a cadeia trófica envolvida, direta ou indiretamente. Desde
o fitoplâncton até grandes mamíferos são afetados, sendo que o aproveitamento de
recursos é comprometido, influenciando diretamente na alimentação e reprodução
desses organismos (Perelo, 2010; Peterson et al., 2003). Esses danos podem ocorrer
imediatamente e persistir, em alguns casos, por décadas. Além de danos causados ao
meio ambiente, do mesmo modo, vazamentos acidentais de petróleo podem causar
impactos aos seres humanos, ocasionando danos psicológicos e econômicos àquelas
populações que dependem economicamente dos recursos marinhos, como por exemplo,
comunidades de pescadores.
Técnicas de remediação já são descritas e aplicadas a ambientes contaminados,
porém algumas tratam apenas fisicamente, promovendo a remoção da contaminação. A
biorremediação é uma estratégia que utiliza micro-organismos e seu potencial metabólico
para a despoluição e a restauração de ambientes, possibilitando a completa
decomposição de compostos químicos. Essa técnica se apresenta como menos custosa,
mais simples no manejo e ecologicamente mais adequada do que as outras (Lovely, 2003).
O processo de biorremediação envolve duas técnicas principais: bioaumentação e
bioestimulação. A bioestimulação consiste na adição de nutrientes, como fontes de
nitrogênio e fósforo, e outros substratos, como água, oxigênio e até mesmo surfactantes
16
(ou biossurfactantes), com o intuito de promover o aceleramento do metabolismo dos
micro-organismos em uma determinada área, aumentando assim a degradação de
compostos xenobióticos (Luqueño et al, 2011). Biossurfactantes são moléculas
estruturalmente diversas sintetizadas biologicamente e classificadas de acordo com sua
estrutura química e sua origem. São constituídas por uma porção hidrofílica,
compreendendo um grupo ácido, peptídeos, mono, di ou polissacarídeos, e uma porção
hidrofóbica, composta por cadeias de ácidos graxos ou de hidrocarbonetos saturados ou
insaturados. Essas estruturas conferem muitas propriedades, incluindo a capacidade de
diminuir a tensão superficial e interfacial entre líquidos e também a formação de
microemulsão entre duas fases diferentes (Banat et al., 2010). A biodegradação de
hidrocarbonetos torna-se mais eficiente com a adição de biossurfactantes, os quais
podem acelerar a biorremediação de solos e águas contaminadas por petróleo através da
diminuição da tensão superficial óleo – água, aumentando a solubilidade e assim a
mobilidade de compostos hidrofóbicos, tais como os hidrocarbonetos (Tango & Islam,
2002).
Bioaumentação consiste na adição de culturas microbiana especializadas, as quais
são cultivadas sob condições ideais para desempenhar determinada função
biorremediadora em um dado ambiente contaminado (in situ ou em biorreator) (Silva &
Alvarez, 2010). Embora as técnicas de cultivo tenham sido aprimoradas, sabe-se que
apenas uma pequena fração da diversidade microbiana presente na natureza pode ser
hoje cultivada em laboratório (Amann et al., 1995). Metodologias moleculares
desenvolvidas nas últimas décadas (extração de ácidos nucléicos, amplificação por PCR,
clonagem e seqüenciamento de DNA) têm sido otimizadas e adaptadas para superar as
limitações impostas pela abordagem clássica de estudo de populações microbianas,
evitando o isolamento e cultivo dos microrganismos. A utilização destas metodologias
vem permitindo uma avaliação mais precisa da diversidade microbiana no ambiente e a
descoberta de novos grupos de organismos, nunca antes cultivados (Hugenholtz et al.,
1998). O uso destas metodologias associado à estratégia de bibliotecas metagenômicas
nos permite ter acesso ao potencial metabólico destes novos organismos. Neste contexto,
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a utilização de OGM com potencial em biorremediação vem sendo relatada (Sayler & Ripp,
2000; Timmis et al., 1999; Pandey et al., 2005; Menn et al., 2008).
O presente trabalho apresenta a avaliação de oito micro-organismos, quatro
linhagens isoladas de reservatórios de petróleo e quatro clones metagenômicos
provenientes de bibliotecas metagenômicas construídas a partir de amostras de petróleo,
em ensaios de biorremediação de petróleo e seus componentes em diferentes em escalas.
Os resultados demonstraram o potencial de um consórcio microbiano contendo clones
metagenômicos e uma linhagem de Bacillus subtilis imobilizados em quitosana para
degradar petróleo bruto em água do mar contaminada, em ambas as escalas de
microcosmos e mesocosmos. O emprego de clones fosmidiais e isolados provenientes de
reservatórios de petróleo constitui uma estratégia inovadora, podendo ser aplicada em
processos de biorremediação em sistema de contenção.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Microbiologia do Petróleo
O petróleo é constituído por uma complexa mistura de hidrocarbonetos, como
compostos aromáticos entre outros compostos como ácidos orgânicos, ácidos naftênicos,
e vanádio e níquel (Van Hamme, 2003; Magot et al., 2000). Hidrocarbonetos são
compostos formados por carbono e hidrogênio e podem ser classificados quanto à sua
estrutura em cíclicos ou alifáticos e aromáticos (benzênicos e policíclicos) (Heider et al.,
1999). Os hidrocarbonetos aromáticos são constituídos por um anel benzênico como parte
de sua estrutura molecular. Os dois principais grupos de hidrocarbonetos aromáticos são
os compostos monocíclicos (benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno) e os hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (HPAs), tais como naftaleno, antraceno, fenantreno, dentre outros
(Holliger & Zehndert, 1996).
O uso do petróleo e seus derivados tem feito de seus hidrocarbonetos grande fonte
contaminadora, tanto em prevalência como em quantidade no meio ambiente. Vários
componentes dentre esses hidrocarbonetos são degradáveis, porém existem outros
compostos de característica recalcitrante, dependendo de sua estrutura química e estado
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físico. O petróleo bruto é composto principalmente de alcanos lineares e ramificados,
cicloalcanos e aromáticos. No entanto, estão presentes também outros compostos
associados a moléculas de oxigênio, nitrogênio, e enxofre, como fenol, indol e tiofeno,
respectivamente. A classe dos alcenos está presente em muitos produtos provenientes do
refino do petróleo, não ocorrendo no petróleo bruto, sendo obtidos principalmente
através do processo de craqueamento em altas temperaturas. Compostos mais pesados,
como asfaltenos, estão presentes no petróleo bruto, mas não em frações refinadas (Tyagi
et al, 2011).
A capacidade de sobrevivência dos micro-organismos em reservatórios de petróleo
depende das características físico-químicas deste ecossistema, como pH, salinidade e
temperatura, sendo esta última o principal fator limitante para o crescimento microbiano.
Diferentes tipos de dados sugerem que a presença de bactérias indígenas aos
reservatórios estaria limitada a um intervalo de temperatura entre 80 e 90oC (Magot et
al., 2000).
Pesquisas realizadas sobre a microbiologia de reservatórios de petróleo têm
evidenciado que a comunidade microbiana associada a este tipo de ambiente é
representada por bactérias e arquéias de distribuição geográfica bastante ampla, e que
diversos destes organismos têm potencial para transformar compostos orgânicos e
inorgânicos, atuando na interface óleo-água dos reservatórios (Coates et al., 1997; Korda
et al., 1997). Na literatura é descrita uma ampla variedade de micro-organismos que tem
sido isolada e/ou identificada a partir de reservatórios de petróleo, incluindo grupos
aeróbios (Bacillus sp., Halomonas sp., Acinetobacter sp.; Rhodococcus sp.) (Oliveira et al.,
2008; Sette et al., 2007; Orphan et al., 2000), anaeróbios facultativos (Deferribacter,
Flexistipes) (Greene et al., 1997; Silva et al. 2012), redutores de sulfato (Desulfovibrio,
Desulfobacter) (Kleikemper et al., 2002; Jing et al., 2013), metanogênicos
(Methanothermococcus, Methanocalculus sp., Methanococcus sp.) (Takai et al., 2002;
Yoshida et al., 2003; Hui et al., 2007 ) e fermentativos.
Entretanto, geralmente, uma só espécie de micro-organismo não é capaz de
promover a degradação completa da mistura de hidrocarbonetos, sendo necessária a
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atuação de consórcios microbianos munidos de uma ampla variedade enzimática capaz de
agir sobre os compostos aromáticos (por exemplo, benzeno, tolueno, naftaleno)
(Okerentungba & Ezeronye, 2003; Kanaly & Harayama, 2000). Nesta situação, os produtos
da biotransformação de um composto podem servir como fonte de carbono e energia
para outras espécies da comunidade (Röling et al., 2003).
2.2 Derramamentos de petróleo
Derramamentos acidentais de petróleo no mar vêm sendo reportados ao longo dos
anos (Vieites et al., 2004; Wieczorek et al, 2007; Outdot & Chaillan, 2010). A liberação de
grande quantidade de óleo em sistemas marinhos acarreta grande impacto ambiental,
afetando de maneira geral toda cadeia trófica envolvida, direta ou indiretamente. Desde o
fitoplâncton até grandes mamíferos são afetados, sendo que o aproveitamento de
recursos é comprometido, influenciando diretamente na alimentação e reprodução
desses organismos (Perelo, 2010; Peterson et al., 2003). Esses danos podem ocorrer
imediatamente e persistir, em alguns casos, por décadas. Além de danos causados ao
meio ambiente, do mesmo modo, vazamentos acidentais de petróleo podem causar
impactos aos seres humanos, ocasionado danos psicológicos e econômicos àquelas
populações que dependem economicamente dos recursos marinhos, como por exemplo,
comunidades de pescadores. Um estudo comparativo realizado no ano de 2012 avaliou a
saúde mental de habitantes de comunidades afetadas nos casos Exxon Valdez e
Deepwater Horizon. Foram observados quadros de elevado estresse e depressão,
principalmente ligados à preocupação com a saúde por exposição ao óleo, perda da
cultura com relação aos recursos naturais, assim como perda econômica e sobrevivência
futura daqueles que não tinham mais os mesmos recursos para explorarem (Gill et al.,
2012).
Alguns casos envolvendo derramamento de petróleo foram amplamente relatados
ao longo dos últimos anos, no entanto nesta seção serão descritos em maior detalhe
apenas os dois principais casos que ocorreram no continente americano, o caso do
petroleiro Exxon Valdez, em 1989, e do poço de exploração Deepwater Horizon, um duto
20
que se rompeu, explodindo uma plataforma, envolvendo a empresa British Petroleum
(BP).
O caso envolvendo o petroleiro Exxon Valdez na costa do Alasca, no ano de 1989,
provocou grande impacto ambiental, com a liberação de mais de 40 milhões de litros de
petróleo, que se espalhou por mais de 1300 km no golfo do Alasca. A aplicação de
fertilizantes comerciais, como tratamento de bioestimulação, foi empregada ao longo da
costa. Ao todo, 48.600 kg de nitrogênio (N) presente nos fertilizantes foram aplicados
entre 1989 a 1991, envolvendo 2.237 aplicações separadas de fertilizante. Isto representa
o maior uso de biorremediação já realizada. Uma pesquisa feita no período entre maio e
junho de 1992 constatou que a maior parte do óleo foi removida da orla costeira e em 12
de junho de 1992 a Guarda Costeira dos Estados Unidos oficialmente declarou a limpeza
concluída (Atlas, 2011). Porém, mesmo anos após o ocorrido, em estudo toxicológico,
foram relatadas anormalidades em populações de algas, invertebrados, pássaros e
mamíferos marinhos expostas à contaminação crônica do petróleo, mesmo em
quantidades significativamente menores (subletais) (Peterson et al., 2003).
Outro caso mais recente, envolvendo a petroleira British Petroleum, ocorreu em
abril de 2010 com o rompimento de uma tubulação, ocasionando a explosão de uma
plataforma no Golfo do México, com onze funcionários mortos e consequente, vazamento
de petróleo. O mesmo perdurou por 84 dias, com estimativa de liberação de
aproximadamente 780 milhões de litros no oceano, que se espalharam por mais de 1100
Km da costa dos Estados Unidos. Muitas medidas para conter o óleo foram tomadas,
como queima in situ, utilização de barreiras físicas de contenção, coleta do óleo e
utilização de surfactantes comerciais (Chen & Denilson, 2011; Atlas, 2011. A aplicação de
biorremediação não foi uma estratégia utilizada nesse caso devido à enorme quantidade
de óleo, o que poderia levar ao fenômeno de eutrofização. Trabalhos que mencionam
mudanças na microbiota marinha, aumentando significativamente o número de bactérias
degradadoras presentes no oceano durante ou depois do acidente, já são relatados
(Hazen et al., 2010; Kostska et al., 2011).
21
Após o vazamento de petróleo no oceano, muitos fatores podem influenciar o
“destino” do óleo no mar e sua contaminação neste ecossistema. Isso está diretamente
ligado com as condições físicas do ambiente, como a direção do vento e das marés (Figura
1). Como consequência do vazamento, o óleo se espalha pela superfície formando uma
camada fina, que por sua vez prejudica a troca de nutrientes e até mesmo a penetração
da luz, influenciando na fotossíntese do fitoplâncton (Carrera-Martínez et al., 2010;
González et al., 2009). Compostos voláteis (geralmente mais tóxicos) e hidrocarbonetos
mais leves acabam evaporando mais rapidamente, dependendo da natureza do próprio
óleo e principalmente das condições ambientais, como temperatura, velocidade do vento
e condições oceânicas. Outra pequena porção pode se aderir a materiais suspensos na
coluna d’agua e contaminar o sedimento mais profundo.
Reações de oxidação pela radiação ultravioleta (UV) solar, chamada de fotólise,
também podem ocorrer. Os produtos derivados dessas reações incluem compostos ácidos
e fenólicos, os quais podem ser mais tóxicos do que os hidrocarbonetos originais. No
entanto, geralmente esses acabam sendo diluídos em grandes quantidades de água, e as
concentrações desses compostos para produzir algum efeito tóxico são muito baixas, não
apresentando significância para o meio ambiente (Kingston, 2002).
Do mesmo modo, ocorre a dissolução dos hidrocarbonetos na coluna de água,
principalmente os de baixo peso molecular, relativamente tóxicos. Essa dissolução é
relativamente pequena, menos de 1%, sendo que aquilo que se torna facilmente
dissolvido, por sua vez, é facilmente degradado. A dispersão é provavelmente
responsável pela remoção natural da maioria do óleo sobre a superfície. O óleo é
“particulado” em pequenas gotas que ficam misturadas à coluna de água até a
degradação através de bactérias (Chen & Denilson, 2011).
Sob certas condições no mar, emulsões “água em óleo” podem ser formadas. Esse
processo pode ocorrer quando gotículas são incorporadas ao óleo na superfície. Essas
emulsões formam uma substancia viscosa denominada “mousse”, sendo que sua
formação e estabilidade dependerá também do tipo de petróleo derramado. A formação
22
dessa substância pode aumentar a persistência da camada de óleo no oceano (Kingston,
2002).
Figura 1. Petróleo liberado em ambiente marinho e diversas maneiras de contaminação e transformação. Fonte: Chen & Denison (2011).
A recuperação biológica de um ecossistema impactado por derramamento de
petróleo está relacionada com o nível da toxicidade ou outros elementos que causam
riscos às funções biológicas normais. Deste modo, a recuperação de um ambiente
impactado pode se iniciar a partir da diminuição dos compostos tóxicos em um nível
tolerável para a maioria dos organismos. No entanto, a recuperação dependerá de vários
fatores ambientais, como a época do ano, disponibilidade dos organismos
recolonizadores, interações biológicas e climáticas (Kingston, 2002; Chen & Denison,
2011).
23
2.3 Biorremediação
Existem muitas substâncias que são nocivas ao meio ambiente, tornando-se fontes
poluidoras. Na categoria dos resíduos químicos orgânicos estão incluídos os pesticidas,
solventes e óleos. Metais pesados como chumbo (Pb), cádmio (Cd), mercúrio (Hg), zinco
(Zn) e ferro (Fe) também são poluentes e geralmente estão associados a atividades
antrópicas, como a eliminação de resíduos em aterros sanitários, geração de resíduos
químicos e lodo (Mulligan, 2005). A liberação de grande quantidade desses compostos
pode causar sérios impactos no meio ambiente.
Técnicas de remediação já são descritas e aplicadas a ambientes contaminados.
Algumas técnicas convencionais, como a escavação dos solos contaminados, seguida de
tratamento ou disposição em aterros, têm sido utilizadas para efetuar a remediação de
locais contaminados, apesar de apresentarem, muitas vezes, custos elevados, bem como
possibilitarem impactos adicionais ao ambiente. Algumas dessas técnicas apenas
removem ou atenuam áreas contaminadas, como, por exemplo, técnicas de remoção e
redisposição de solos. Outras têm sido aprimoradas, testadas e avaliadas em relação a sua
eficiência/eficácia e custo, incluindo a contenção, dessorção térmica, oxidação química,
extração de vapores, bombeamento e tratamento de águas subterrâneas (Manual
CETESB, cap X, 2000).
A fitorremediação também é uma técnica alternativa de remediação que já vem
sendo descrita na literatura. Associada com micro-organismos (Ramos et al. 2005) ou
aplicada isoladamente (Gerhardt et al., 2009), o conceito da utilização de plantas para
despoluir ambientes contaminados não é novo. Cerca de 300 anos atrás a utilização de
plantas foi proposta para tratamento de águas residuais (Hartman Jr 1975). As espécies
aplicadas para remediação têm como característica o potencial de acumular, imobilizar e
transformar contaminantes recalcitrantes, como os metais pesados. Do mesmo modo,
também podem remover simultaneamente compostos orgânicos e inorgânicos (Pulford e
Watson 2003; Rascio e Navari-Izzo, 2011). No entanto, apresenta baixa aplicação
industrial devido à limitação de crescimento em ambientes contaminados com baixa
24
disponibilidade de nutrientes, baixa eficiência ocasional em acessar poluentes e tempo
mais longo para remediação efetiva comparada aos outros métodos.
Diferentemente das técnicas que apenas removem ou atenuam áreas contaminadas,
a biorremediação, que se utiliza de micro-organismos e seu potencial metabólico para a
despoluição e a restauração de ambientes, é uma alternativa viável. Essa técnica se
apresenta como menos custosa, mais simples no manejo e ecologicamente mais
adequada do que as outras (Lovely, 2003). A biorremediação pode resultar na completa
decomposição de compostos químicos ou ainda pode ser combinada com tratamentos
alternativos, como, por exemplo, eletro-biorremediação, uma tecnologia híbrida de
biorremediação e eletrocinética que vem sendo utilizada para remoção de compostos
orgânicos hidrofóbicos (Li et al., 2010).
Boopathy (2000) descreve as técnicas envolvendo biorremediação em uma
classificação mais ampla, entre ex situ (ou “on site”) e in situ. Tratamento ex situ consiste
na remoção física do contaminante e tratamento em outro local, como por exemplo, a
escavação (para solos) ou bombeamento (para águas subterrâneas) do substrato
contaminado e seu acondicionamento em uma área de contenção para ser tratado. Nas
técnicas in situ, o tratamento ocorre no próprio local de contaminação. Alguns exemplos
de tratamento in e ex situ estão descritos abaixo:
1. Land farming: Sistema de tratamento para solos contaminados. Consiste na degradação
biológica de resíduos em uma camada superior de solo, que é periodicamente revolvida
para haver aeração. Pode ser realizado na forma in situ, como ex situ.
2. Compostagem: tratamento aeróbico termofílico no qual o material contaminado é
misturado a um agente espessante. Pode ser feita com a utilização de pilhas estáticas ou
aeradas.
3. Biorreatores: Biodegradação ocorre em um container ou reator. Pode ser aplicado para
tratar líquidos ou lodo.
4. Bioventilação: Método de tratamento para solos contaminados aplicando oxigênio
através do solo com intuito de estimular a atividade microbiana.
25
5. Biofiltros: Utilização de colunas microbiológicas para tratar emissões de ar.
6. Bioaumentação: Adição de culturas de bactérias em uma área contaminada. Usada
tanto em sistemas in situ como ex situ.
7. Bioestimulação: Estimulação de população indígena (autóctone) em solos ou águas
subterrâneas através do fornecimento de nutrientes.
8. Atenuação natural: Biorremediação natural de contaminantes sem a utilização de
técnicas adicionais, baseadas apenas no monitoramento da microbiota autóctone.
Um exemplo de atenuação natural recente (biorremediação in situ) foi observada
após o acidente ocorrido através da explosão na plataforma Deepwater Horizon (British
Petroleum), fato citado anteriormente. Hazen e colaboradores (2010) relataram que a
microbiota dos ecossistemas marinhos profundos rapidamente se adaptou à
contaminação do óleo e se tornou dominada pelas bactérias da ordem Oceanospirillales,
pertencentes à classe ϒ-Proteobacteria, a qual inclui os descritos degradadores de
hidrocarbonetos psicrofílicos e micro-organismos provenientes de ambientes
contaminados com petróleo.
O processo de biorremediação envolve duas técnicas principais: bioaumentação e
bioestimulação. A bioestimulação consiste na adição de nutrientes, como fontes de
nitrogênio e fósforo, e outros substratos, como água, oxigênio e até mesmo surfactantes
com o intuito de promover o aceleramento do metabolismo dos micro-organismos em
uma determinada área, aumentando assim a degradação de compostos xenobióticos
(Luqueño et al, 2011). No entanto, para que isso ocorra, os micro-organismos devem ser
capazes de degradar determinado composto tóxico, e sua quantidade (em unidades
formadoras de colônias (UFC/mL ou grama de solo) deve ser abundante. Liu e
colaboradores (2010) relatam a estratégia de bioestimulação em solo contaminado com
hidrocarbonetos poliaromáticos (HPA), adicionado de adubo orgânico. Após 360 dias foi
observada uma redução de 58% dos hidrocarbonetos, comparado ao controle sem a
adição de nutrientes. No entanto, através do método de contagem total, foi possível
observar um número menor de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos no controle
26
sem a presença de adubo, do que nas amostras com o tratamento. Os autores concluíram
que na quantidade de bactérias abaixo de 105 UFC. g-1, o processo de biorremediação não
ocorreria de forma significativa. Portanto, quanto maior a população de micro-organismos
que degradam o contaminante dentro da área de remediação, mais rápido e mais
eficiente será o processo de biorremediação.
Bioestimulação já é amplamente descrita na literatura, tanto em solos como em
águas, mostrando ser eficiente na remoção de pesticidas (Kanissery et al, 2011), petróleo
e HPA (Nikolopoulou & Kalogerakis, 2008; Nikolopoulou & Kalogerakis, 2009; Dellile et a,
2009; Yu et al, 2011), organohalogenados (Major et al, 2002; Naihiro et al, 2010).
Bioaumentação implica na adição de micro-organismos isolados ou de consórcios de
micro-organismos, já sabidamente degradadores, carreando genes que possam ser
transferidos à microbiota autóctone ou não, em uma determinada área contaminada.
Segundo o documento “gerenciamento de áreas contaminadas” da CETESB, assim como
em alguns trabalhos da literatura, essa técnica deve ser aplicada quando a atenuação
natural ou a bioestimulação não se apresentaram efetivas, como no caso de ambientes
que: (1) não possuem a quantidade suficiente de micro-organismos, (2) micro-organismos
nativos não possuem rotas metabólicas necessárias para metabolizar os compostos
poluentes (Fantroussi e Agathos, 2005; Tyagi et al., 2011).
Processos envolvendo bioaumentação vêm sendo utilizados em alguns setores. Na
agricultura, a inoculação de legumes com bactérias fixadoras de nitrogênio Rhizobium spp.
ocorre desde o século 19. A utilização de bioaumentação com células livres ou micro-
organismos associados a plantas, como Azotobacter ou Azospirillum spp. para aumentar a
produtividade, também já é utilizada. Outra aplicação do bioaumento inclui a inoculação
de sementes de plantas com bactérias promotoras de crescimento ou ainda micro-
organismos antagonistas a patógenos. A inoculação é também utilizada para transformar
os produtos agrícolas em formas mais úteis como silagem de forragem. Em indústrias a
bioaumentação é aplicada na preparação de alimentos, como processos de fermentações
de leite e cerveja (Gentry et al, 2004; Lebeau 2011).
27
Bioaumentação pode ser aplicada de diversas formas. A primeira envolve a
reinoculação das bactérias autóctones, onde algumas bactérias utilizadas com este intuito
podem ser isoladas de um ambiente contaminado, posteriormente cultivadas sob
condições laboratoriais e depois reintroduzidas ao mesmo ambiente. A outra
possibilidade é a seleção de micro-organismos apropriados provenientes de ambientes
contaminados similares a uma determinada área alvo para biorremediação, onde os
mesmos serão empregados. Por último, existe ainda a utilização de organismos
geneticamente modificados com o intuito de potencializar os processos de degradação de
poluentes (Mrozik e Piotrowska-Seget, 2010, Hosokawa, 2009). Hosokawa (2009) relata a
o processo de bioaumentação com micro-organismos autóctones (reintrodução dos
micro-organismos) realizado na costa do Japão, na ilha de Hokaido.
Alguns micro-organismos, como bactérias e alguns fungos, já são descritos na
literatura sendo utilizados em processos de bioaumentação para a degradação de vários
compostos xenobióticos (Tabela 1).
Tabela 1: Micro-organismos utilizados em processos de bioaumentação na degradação de várias substâncias poluentes.
Micro-organismo Composto Literatura
Alcanivorax Hidrocarbonetos de petróleo McKew et al, 2007; Gertler, 2009
Bacillus Óleo diesel; quinolona Bento et al., 2005; Bao-hua et al., 2012
Rhodococcus Óleo diesel Kuyukina et al, 2010; Lee et al, 2011
Pseudomonas Petróleo; simazina; tabaco Stallwood et al. 2005; Morgante et al., 2009; Mei-zhen et al., 2012
Bulkhoderia sp
Carbofurano; Etileno diamino tetra acetato (EDTA)
Chen et al., 2005;
Plangklang et al., 2011
Aspergillus sp.
Metais pesados Braud et al., 2006
Penicilium sp.
Petróleo Alleri, 2012;
Ojeda- Morales et al., 2013
28
Apesar de suas vantagens, como baixo custo e maior eficiência comparada a outras,
essa técnica apresenta algumas limitações. A seleção das linhagens, a ecologia
microbiana, tipo e concentração do contaminante, restrições ambientais, assim como o
procedimento de inoculação dos micro-organismos podem influenciar na efetividade do
processo. Para uma maior efetividade, além de uma microbiota capaz de degradar os
contaminantes e competir e atuar com sinergia com a microbiota autóctone, outros
parâmetros devem ser levados em conta, como água, oxigênio e fontes utilizáveis de
fósforo e nitrogênio. A falta de qualquer um dos parâmetros mencionados pode acarretar
a ineficiência da biorremediação sob condições naturais (Boopathy, 2000; Tyagi et al,
2011). Gentry (2004) relata algumas abordagens que podem aumentar a persistência e
atividade dos micro-organismos e/ou genes introduzidos no ambiente: (1) métodos para
aumentar a sobrevivência dos micro-organismos inoculados em ambientes contaminados,
como a imobilização em matrizes; (2) o uso de genes “repórter” para monitorar a
atividade ou presença dos micro-organismos introduzidos; (3) o uso de genes suicidas
para controlar a dispersão dos micro-organismos transgênicos.
Trabalhos na literatura mencionam a avaliação tanto de bioestimulação como
bioaumento para a remoção de contaminantes, como hidrocarbonetos, metais pesados e
pesticidas. A combinação de bioaumentação e bioestimulação pode ser uma estratégia
promissora para acelerar a biorremediação. Ambos micro-organismos autóctones e
exógenos podem se beneficiar da bioestimulação devido à adição de nutrientes e
aceptores de elétrons (El Fantroussi e Agos, 2005).
Yu e colaboradores (2005) demonstraram a degradação de três hidrocarbonetos
poliaromáticos (HPA) em sedimentos de mangue contaminado, utilizando três estratégias:
atenuação natural, bioestimulação e bioaumentação, durante 4 semanas. Os resultados
variaram de acordo com o tipo de hidrocarboneto, sendo que para fenantreno e fluoreno,
na primeira semana de avaliação a taxa de degradação foi mais significativa no tratamento
utilizando a atenuação natural, porém ao final de quatro semanas, os três tratamentos
foram estatisticamente equivalentes. No entanto, quando se avaliou a degradação de
pireno, um hidrocarboneto mais pesado, contendo 4 anéis benzênicos, o tratamento com
29
maior eficiência foi de bioestimulação, no qual foi descrito 98% de degradação do
composto.
Mrozik e Piotrowska-Seget (2010) relatam alguns trabalhos que obtiveram bons
resultados utilizando a estratégia de bioaumentação e bioestimulação atuando em
conjunto.
Como já descrito, ambas abordagens, combinadas ou não, podem ser utilizadas para
a remediação de ambientes contaminados e sua eficiência dependerá também de fatores
externos.
2.4 Bioaumentação utilizando organismos geneticamente modificados (OGM)
Ao final dos anos 1970 e começo dos anos 1980, se iniciou o aprimoramento de
técnicas moleculares, como a clonagem e caracterização de genes bacterianos codificando
enzimas catabólicas para degradação de compostos recalcitrantes. Logo, muitos
microbiologistas e biólogos moleculares perceberam o potencial da engenharia genética
para biodegradação. O trabalho pioneiro de Gunsalus e Chakrabarty sobre a base genética
da degradação de um conjunto de compostos recalcitrantes por linhagens de
Pseudomonas culminou em 1981 com a concessão de uma patente para uma cepa
desenvolvida por conjugação que poderia degradar cânfora, octano, salicilato e naftaleno
[US Patent 425944], o primeiro organismo vivo a ser submetido a um processo de
propriedade intelectual (Cases e De Lorenzo, 2005).
A aplicação de organismos geneticamente modificados (OGMs) pode ser útil para o
tratamento de ambientes altamente contaminados para fins de biorremediação. A
modificação genética obtida através da clonagem de genes de vias envolvidas nos
processos de biodegradação pode possibilitar o aumento das taxas de biodegradação. No
entanto, é essencial verificar a estabilidade de qualquer OGM antes de sua aplicação no
campo. O destino dos OGMs depende em grande parte da estabilidade do plasmídeo
recombinante presente no organismo (Samanta et al, 2002).
Mesmo havendo micro-organismos naturalmente degradadores, ainda se pode
observar a persistência de muitos compostos químicos no meio ambiente. Deste modo,
vem sendo cada vez mais necessário o desenvolvimento de novos biocatalistas. Timmis e
30
Pieper (1999), na década de 90, já discutiam a necessidade do desenvolvimento dos
mesmos, descrevendo várias implicações desse processo, incluindo a descoberta de novas
rotas metabólicas (até então não descritas); ampliação de substratos para a expressão
dessas rotas metabólicas; avaliação da possível síntese de produtos intermediários tóxicos
ou altamente reativos; avaliação da utilização de substratos que não permitam a
acumulação de produtos intermediários, como catecóis; o aumento da estabilidade
genética das atividade catabólicas; e aumento da biodisponibilidade de poluentes
hidrofóbicos. Estudos envolvendo OGMs, objetivando biorremediar compostos nocivos e
recalcitrantes, já são descritos (Ford et al., 1999; Pandey et al., 2005; Menn et al., 2008).
No entanto, a utilização de OGM para biorremediação se depara com a legislação
restritiva que proíbe sua aplicação em ambientes na forma “in situ”. Como já descrito, a
descoberta realizada em 1975 por Gunsalus e Chakrabart, patenteada em 1980, se
encontra ainda sem comercialização.
Não obstante, a aplicação de OGM para biorremediação pode ser uma alternativa
viável e efetiva. É descrito que alguns OGMs têm capacidade para degradar alguns
componentes do petróleo de 10 a 100 vezes mais rápido do que outras linhagens não
transgênicas (Ezekika & Singer, 2010).
Sayler e Ripp (2000) mencionam um estudo de campo realizado com uma linhagem
transgênica de Pseudomonas designada HK44, aplicada para degradação de naftaleno em
solo (em contenção). Essa linhagem continha em seu genoma um plasmídeo responsável
pela degradação de naftaleno e adicionalmente um gene ligado a uma região promotora
(genes da família lux) que produziam bioluminescência. Portanto, quando ocorria contato
dessa linhagem com naftaleno (ou metabólitos intermediários da degradação do mesmo),
ocorria o aumento da expressão de genes catabólicos e também uma resposta
bioluminescente, podendo deste modo ser detectada a quantidade de naftaleno
biodisponível assim como sua degradação no ensaio. Ainda, Strong e colaboradores (2000)
realizaram um teste em escala de campo com uma linhagem de Escherichia coli
superprodutora da enzima atrazina clorohidrolase a fim de degradar o herbicida atrazina,
utilizado na agricultura.
31
Nos Estados Unidos, a Agência de Proteção Ambiental (US EPA) tem autoridade para
regulamentar a liberação de organismos geneticamente modificados, sob a seção 5
prevista na Ata de Controle de Substâncias Tóxicas (TSCA). Para aqueles que objetivam
produzir micro-organismos geneticamente modificados é requerido a submissão de um
documento denominado Aviso de Atividade Microbiológica Comercial (“Microbial
Commercial Activity Notice -MCAN”), no qual deve ser relatado o destino dos OGMs no
meio ambiente, riscos à saúde e propriedades físico-químicas dos propostos micro-
organismos. A modificação de micro-organismos é prevista como alto risco dentro das
regulamentações da agência de proteção ambiental. Embora tenha havido um avanço no
desenvolvimento de culturas agrícolas, novos fármacos e outras inovações biotecnológicas
ao longo das duas últimas décadas, os micro-organismos geneticamente modificados
desenvolvidos para biorremediação ainda não são comercializados. (Ezezika and Singer,
2010).
No Brasil, a legislação que rege a questão dos OGMs e transgênicos é a Lei de
Biossegurança (Lei 11.105/05), em vigência desde 24 de março de 2005. A partir daí,
alterações na regulamentação acerca dos transgênicos foram reordenadas bem como a
ratificação da criação da CTNBio (Conselho Técnico Nacional de Biossegurança) e suas
competências, além de criar o Conselho Nacional de Biossegurança (CNBS) e o Sistema de
Informação de Biossegurança (SIB).
A Lei de Biossegurança determina os mecanismos de fiscalização sobre as condutas
que envolvam os organismos geneticamente modificados, sendo elas a condução, cultivo,
produção, manipulação, transporte, transferência, importação, exportação,
armazenamento, pesquisa, comercialização, consumo, liberação no meio ambiente e
descarte, conforme preconiza o art. 1°, de forma a proteger a vida e a saúde humana, dos
animais e das plantas, bem como o meio ambiente (Giehl, 2008).
O processo de comercialização de OGM’s como culturas agrícolas de algodão, milho
e feijão já liberadas para cultivo, envolve órgãos como a CTNBio e CNBS, assim como
órgãos e entidades de registro e fiscalização do Ministério da Saúde, do Ministério da
32
Agricultura, Pecuária e Abastecimento e do Ministério do Meio Ambiente, e da Secretaria
Especial de Aqüicultura e Pesca.
Uma das competências da CTNBio, descritas no Artigo 14 da Lei de Biossegurança, é
emitir decisão técnica, caso a caso, sobre a biossegurança de OGM e seus derivados no
âmbito das atividades de pesquisa e de uso comercial de OGM e seus derivados, inclusive
a classificação quanto ao grau de risco e nível de biossegurança exigido, bem como
medidas de segurança exigidas e restrições ao uso.
Ao CNBS cabe analisar, a pedido da CTNBio, quanto aos aspectos da conveniência e
oportunidade socioeconômicas e do interesse nacional, os pedidos de liberação para uso
comercial de OGM e seus derivados.
Por último, cabe aos órgãos e entidades de registro e fiscalização dos Ministérios da
Saúde, da Agricultura, Pecuária e Abastecimento e do Ministério do Meio Ambiente, e da
Secretaria Especial de Aqüicultura e Pesca registrar e fiscalizar a liberação comercial de
OGM e seus derivados.
2.5 Biorremediação e o uso de biossurfactantes
Compostos tensoativos produzidos por micro-organismos (“microbial surface-active
compounds”) são moléculas estruturalmente diversas classificadas de acordo com sua
estrutura química e sua origem microbiana. São constituídas por uma porção hidrofílica,
compreendendo um grupo ácido, peptídeos, mono, di ou polissacarídeos, e uma porção
hidrofóbica, composta por cadeias de ácidos graxos ou de hidrocarbonetos saturados ou
insaturados. Essas estruturas conferem muitas propriedades, incluindo a capacidade de
diminuir a tensão superficial e interfacial entre líquidos e também a formação de micelas
e microemulsão entre duas fases diferentes. Estes compostos podem ser divididos entre
duas principais classes: compostos de baixo peso molecular, denominados
biossurfactantes, como lipopeptideos, glicolipídeos, proteínas, e compostos de alto peso
molecular, como polímeros complexos de polissacarídeos, lipopolissacarídeos ou
lipoproteínas, denominados bioemulsificantes. Essa última classe de moléculas é mais
efetiva em estabilizar emulsões óleo em água, mas não tão efetiva em diminuir a tensão
33
superficial (Banat et al. 2010).
Os surfactantes se concentram em interfaces (sólido-líquido, líquido-líquido ou
vapor-líquido). A interface é formada entre duas fases imiscíveis, sendo que a porção
hidrofóbica do surfactante se volta para a superfície, enquanto que a porção hidrofílica
está em contato com a solução (Mulligan, 2005).
Como já descrito, biossurfactantes são surfactantes produzidos biologicamente. A
atividade biossurfactante pode ser determinada através de mudanças nas tensões
interfaciais e superficiais de alguns “sistemas”, ou interfaces, como, por exemplo,
água/óleo e ar/água e essas mudanças podem ser medidas com auxílio de tensiômetro
(Desai & Banat, 1997). Devido à sua estrutura anfifílica, as moléculas dos biossurfactantes
tendem a se aglomerar e formar pequenas estruturas como vesículas, lamelas ou micelas
quando adicionados a esses sistemas e, deste modo, reduzem a tensão superficial até um
nível crítico (Figura 2). Esta medida é conhecida como “concentração micelar crítica”
(CMC) e é utilizada para definir a qualidade e eficiência do biossurfactante, de acordo com
suas propriedades como detergência, formação de espuma, emulsificação e dispersão.
Esse processo dinâmico é baseado na habilidade dos biossurfactantes de reduzir a tensão
superficial pelo rearranjo molecular, pelo qual ocorre o acúmulo de suas moléculas na
superfície de compostos insolúveis, influenciando as ligações de hidrogênio e outras
interações hidrofóbico-hidrofílicas.
34
Figura 2. Esquemas representando as estruturas formadas por biossurfactantes quando em contato com interfaces (Fonte: Champion et al., 1995).
Surfactantes considerados eficientes apresentam baixa concentração micelar crítica
(ou seja, menos surfactante é necessário para reduzir a tensão superficial). Um
surfactante ideal seria aquele que apresenta baixa concentração micelar crítica e tensão
superficial com valores menores que 30 mN/m (Ashby et al., 2008; Desai & Banat, 1997;
Mulligan, 2005). As interações de surfactantes nas interfaces são objeto de muitos
estudos. Essas reações não ocorrem somente em relação à porção hidrofóbica dessas
moléculas, mas também com a parte hidrofílica, que pode apresentar carga elétrica
aniônica, catiônica, anfotérica ou não-iônica (Neu, 1996).
Os hidrocarbonetos de petróleo e de outros óleos pesados, quando em contato com
o meio ambiente, se aderem fortemente a partículas de solo. Dentre os hidrocarbonetos,
a classe dos HAPs (Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos) são os maiores contaminantes
(Mulligan, 2005; Bordoloi & Konwar, 2009). A biodegradação de hidrocarbonetos torna-se
mais eficiente com a adição de biossurfactantes, os quais podem acelerar a
biorremediação de solos e águas contaminadas por petróleo através da diminuição da
tensão superficial óleo – água, aumentando a solubilidade e assim a mobilidade de
compostos hidrofóbicos, tais como os hidrocarbonetos (Tango & Islam, 2002).
Calvo e colaboradores (2009) mencionam que a degradação associada ao emprego
de surfactantes torna-se eficiente de acordo com alguns fatores, como por exemplo, a
35
taxa de nutrientes disponíveis no solo. Estes nutrientes (nas formas de nitrogênio e
fósforo) promovem o crescimento e, conseqüentemente, o aumento da população
indígena do solo contaminado, aumentando a taxa de degradação.
Vários trabalhos têm descrito o emprego de biossurfactantes na degradação de
hidrocarbonetos, principalmente utilizando ramnolipídeos (Rahman et al., 2003; Nguyen
et al., 2008; Souza et al., 2014) e surfactina (Mulligan et al., 1999; Cubitto et al., 2004;
Whang et al., 2008).
Além de atuar em processos de biodegradação de hidrocarbonetos, alguns
biossurfactantes são capazes de remover metais pesados, como cádmio, cobre, chumbo e
zinco em solos contaminados (Mulligan, 2005; Asci et al, 2009). Ao contrário dos
hidrocarbonetos, os metais pesados não são degradáveis e apresentam alta toxicidade,
mesmo em quantidades pequenas, representando uma ameaça para a saúde e meio
ambiente.
Mulligan e colaboradores (2001) analisaram a utilização de três diferentes
biossurfactantes (surfactina, ramnolipídeos e soforolipídeos) na remoção de metais em
sedimentos contaminados com cobre e zinco, onde os glicolipídeos (ramnolipídeos e
soforolipídeos) apresentaram-se como mais efetivos.
2.6 Genes de degradação de hidrocarbonetos
Hidrocarbonetos são compostos constituídos exclusivamente de carbono e
hidrogênio. Devido à ausência de grupos funcionais, os hidrocarbonetos são geralmente
apolares e exibem baixa reatividade química em temperatura ambiente. As diferenças em
reatividade são primariamente determinadas pelo tipo e arranjo das ligações insaturadas.
Sua classificação geralmente se dá pelas características das ligações entre os carbonos: 1)
hidrocarbonetos alifáticos, que incluem os de cadeia linear (n-alcanos); hidrocarbonetos
de cadeia ramificada e compostos cíclicos e 2) hidrocarbonetos aromáticos que incluem
hidrocarbonetos mono ou policíclicos, que também podem conter cadeias alifáticas, como
os alkibenzenos (Sierra- Garcia & Oliveira, 2013).
Os hidrocarbonetos podem ser degradados de duas formas, aeróbica e
anaerobicamente. Em organismos aeróbicos, como a maior parte fungos e algumas
36
bactérias, o ataque inicial de hidrocarbonetos sempre requer a molécula de oxigênio
como um co-substrato (Heider et al., 1999). No entanto, em alguns ambientes o oxigênio
não está presente, como em sedimentos profundos e reservatórios de petróleo, e deste
modo a degradação pode ocorrer em condições anóxicas. Estudos têm demonstrado que
o mecanismo de degradação por essas bactérias difere das aeróbicas. Nas bactérias
aeróbicas o O2 não é somente um aceptor de elétrons para os processos respiratórios,
mas também um indispensável “reagente” na ativação do mecanismo de degradação.
Através das monooxigenases (em hidrocarbonetos alifáticos) e dioxigenases (em
hidrocarbonetos aromáticos) um ou dois átomos são incorporados, levando à geração de
produtos hidroxilados (Widdel & Rabus, 2001).
Degradação aeróbica
Na maioria das rotas de degradação descritas na literatura, o substrato n-alcano é
oxidado ao álcool correspondente através das enzimas substrato-específicas
monooxigenases/ hidroxilases. O álcool é então oxidado ao correspondente aldeído e
finalmente convertido em ácido graxo. Ácidos graxos são conjugados à coenzima A (CoA)
e processados através de β – oxidação para gerar acetil- CoA. A hidroxilação terminal
pode ser realizada por diversas enzimas pertencentes a diferentes classes: (1) propano-
monoxigenase (C3), (2) classes diferentes de butano-monooxigenase (C2-C9), (3) CYP153
monooxigenases (C5-C12), (4) AlkB- relacionada com não-heme ferro monooxigenase (C3-
C10 ou C10-C20), (5) monooxigenase ligada à flavina -AlmA (C20-C36), (6) monooxigenase
LadA flavina-dependente (C10-C30), (7) dioxigenase cobre flavina-dependente (C10-C30).
Entre as enzimas ativas ligadas à degradação de alcanos, a não-heme ferro (AlkB),
presente em membranas, é a mais bem caracterizada.
Micro-organismos que degradam alcanos de cadeias médias (C5-C11) e longas
(>C12) vêm sendo frequentemente relatados portando o gene alkB e a presença do
mesmo tem sido utilizada como biomarcador para estudos de caracterização de
populações envolvendo bactérias aeróbias degradadoras de alcanos em várias amostras
ambientais, assim como em processos de biorremediação (Sierra- Garcia & Oliveira, 2013).
37
A degradação que envolve o sistema enzimático alk, sistema de degradação de alcanos, é
o mais amplamente distribuído em procariotos (van Beilen et al., 2003; Marchant et al.,
2006). Porém, outros dois sistemas implicados na oxidação inicial de alcanos existem em
bactérias, embora menos comuns, como a citocromo P450 mononoxigenase e uma
dioxigenase detectada em algumas cepas de Acinetobacter (Heiss-Blanquet et al., 2005).
Em particular, o sistema enzimático alk foi primeiramente descrito em
Pseudomonas oleovorans GPo1 (posteriormente classificada como cepa de Pseudomonas
putida). Este contém dois operons: alkBFGHJKL e alkST (van Beilen et al., 1994), sugerindo
que um operon pode regular o outro. Em contraste, os genes que codificam o complexo
alkB em Acinetobacter sp. APD1 parecem ter um arranjo totalmente irregular. A
degradação de alcanos em Acinetobacter é altamente dependente da expressão de no
mínimo cinco genes e alkR é conhecido por regular a expressão do cluster completo
(Marchant et al., 2006). Em cepas de Rhodococcus Q15 e NRRI, no mínimo quatro alcano-
monooxigenases têm sido identificadas (alkB1 a alkB4) (Marchant et al., 2006).
A Figura 3 mostra a principal reação enzimática da degradação aeróbica de
hidrocarbonetos. O ataque inicial intracelular a poluentes orgânicos consiste em um
processo oxidativo, no qual ocorre a ativação, assim como a incorporação de oxigênio,
uma reação enzimática chave catalisada pelas enzimas oxigenase e peroxidase. Vias de
degradação “periféricas” convertem poluentes orgânicos, passo a passo, em compostos
intermediários. A síntese de biomassa ocorre a partir dos metabólitos precursores
centrais, por exemplo, acetil-CoA, succinato, piruvato. Os açúcares necessários para
biossíntese e crescimento são produzidos por gliconeogênese (Das & Chandran, 2010).
38
Figura 3. Esquema indicando a principal via de degradação aeróbica. Fonte: Das & Chandran, 2010.
Outro sistema enzimático, o que envolve a enzima citocromo P450, também já é
descrito na literatura. Esse sistema foi encontrado envolvido com a biodegradação de
hidrocarbonetos do petróleo inicialmente em eucariotos. A capacidade de várias espécies
de leveduras em utilizar n- alcanos ou outros compostos alifáticos como fonte única de
carbono e energia é mediada pela existência de múltiplas formas de citocromo P450.
Essas enzimas têm sido isoladas a partir de algumas espécies de leveduras, como Candida
maltosa, Candida tropicalis e Candida apicola (Das & Chandran, 2011). Citocromo P450 é o
grupo mais comum de oxigenases utilizadas em processos de degradação em eucariotos,
embora tenha um papel secundário em bactérias (Fuchs et al., 2011).
A degradação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) pelas bactérias
também tem sido amplamente estudada. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
(HPA) estão classificados em uma outra classe de compostos orgânicos constituídos de um
ou mais anéis benzênicos ligados de forma linear ou angular. São encontrados no meio
ambiente após o despejo de resíduos relacionados ao processamento de carvão, petróleo
(lodo), asfalto, creosoto e madeira e podem persistir nos ecossistemas por anos, devido às
suas características de baixa solubilidade e capacidade de adsorção em partículas sólidas.
39
A descontaminação de ambientes contaminados com HPA é de vital importância, pois
além de sua intrínseca estabilidade química e resistência a muitas formas de degradação,
muitos destes compostos tóxicos são conhecidos como carcinogênicos e mutagênicos
(Collins et al., 1999; Habe & Omori, 2014). Como já descrito, algumas estratégias de
remoção consistem na aplicação de micro-organismos que podem degradar os HPAs.
Estes podem ser utilizados como fonte de carbono e energia por diversos micro-
organismos que adaptaram suas habilidades de utilização desses substratos.
A degradação de HPAs por bactérias sob condições aeróbicas começa com a adição
da molécula de oxigênio ao anel aromático pela enzima dioxigenase. As dioxigenases
pertencem a uma grande família conhecida como dioxigenases que hidroxilam anéis
aromáticos (ARHDs). Todos os membros dessa família possuem uma ou duas proteínas
transportadoras de elétron, dependendo do substrato e da origem da enzima (Gibson &
Parales, 2000).
ARHDs como benzoato, naftaleno, bifenilo, tolueno e benzeno dioxigenases são
complexos enzimáticos formados por três ou quatro subunidades protéicas. Estes
complexos catalisam uma reação redox na qual dois oxigênios moleculares são
incorporados no anel aromático do substrato à custa da oxidação de NADH (Gibson &
Parales, 2000). Posteriormente, intermediários podem ser catalisados por dois tipos de
enzimas, intradiol e estradiol dioxigenases, que representam duas classes de proteínas
relacionadas filogeneticamente. Essas enzimas têm papel chave na degradação de
compostos aromáticos e muitas dessas proteínas e suas sequencias vêm sendo descritas,
purificadas e caracterizadas nas últimas décadas (Sierra-Garcia & Oliveira, 2013).
Degradação anaeróbica
Muitos ambientes contaminados apresentam baixa ou nenhuma disponibilidade de
oxigênio, como aquíferos, sedimentos aquáticos e solos submersos, ocorrendo desta
forma a degradação de compostos poluentes através de micro-organismos estritamente
anaeróbicos ou anaeróbios facultativos.
40
O ataque inicial de hidrocarbonetos permanece como etapa crítica para
subsequente transformação desses compostos apolares. Como já descrito, em processos
aeróbicos a incorporação de um oxigênio às moléculas de hidrocarbonetos através da
ação das oxigenases é um processo bioquímico estritamente oxigênio-dependente e
energicamente favorável (Chakraborty & Coates 2004; Wentzel et al. 2007). No entanto,
na ausência de oxigênio, a biodegradação de hidrocarbonetos é dificultada pela inércia
química das ligações carbono-carbono. Por sua vez, os micro-organismos tiveram que
desenvolver alternativas, reações independentes de oxigênio e enzimas para o ataque
inicial sob condições anóxicas. Deste modo, a biodegradação é realizada através de micro-
organismos estritamente anaeróbicos ou anaeróbios facultativos, utilizando aceptores
alternativos de elétrons como nitrato (micro-organismos desnitrificantes), sulfato (sulfato-
redutores), Fe (ferro-redutores), CO2 (metanogênicos), ou outros aceptores (clorato, Mn,
Cr, U, etc.) (Diaz, 2004; Mbadinga et al., 2011).
Um dos mecanismos anaeróbicos mais bem descritos na literatura é a adição de
fumarato aos hidrocarbonetos, com a formação de succinato. Essa reação tem sido
caracterizada pela ativação em benzeno assim como n-alcanos. No entanto, o processo de
adição de fumarato ativando hidrocarbonetos é mais bem compreendida em estudos
utilizando tolueno (Sierra-Garcia & Oliveira, 2013). A enzima principal desse processo é a
benzil-succinato sintase. Todas as enzimas necessárias para β-oxidação de benzilsuccinato
são sintetizadas através do operon bbs. Os genes relacionados às vias de adição de
fumarato estão organizados em dois operons. Um deles inclui 3 genes estruturais
relacionados à proteína catalisadora da adição de fumarato e o outro inclui genes
necessários para converter succinato a benzoil-CoA. Sequências de genes e sua
organização são relativamente conservadas entre as bactérias nitrato-redutoras, diferindo
um pouco da ferro-redutora Geobacter metallireducens. A via relacionada à
desidrogenação hidrocarbonetos é, da mesma forma, organizada em dois operons. Um
contém genes estruturais para as primeiras duas reações (etilbenzeno desidrogenase e 1-
feniletanol desidrogenase) e o outro contém genes estruturais (Sierra-Garcia & Oliveira,
2013; Mbadinga et al.,2011)
41
Mbadinga e colaboradores (2011) relatam grupos de bactérias utilizando diferentes
aceptores de elétrons na degradação de hidrocarbonetos alifáticos. O atual panorama
inclui isolados degradadores de alcanos utilizando nitrato como substrato (nitrate
respiring bacteria- NRB), as quais são afiliadas à Classe Beta-proteobacteria. Com relação
aos que utilizam enxofre (sulfidogênicos), bactérias redutoras de sulfato (SRB)
recuperadas de ambientes anóxicos são predominantemente afiliadas com membros da
família Desulfobacteraceae, dentro da Classe Delta-proteobacteria. A maioria dos
representantes dessa família são anaeróbios estritos que realizam a completa oxidação de
compostos orgânicos.
A metanogênese se refere à formação biológica de metano, a qual é realizada por
micro-organismos anaeróbios estritos. As arquéias são micro-organismos capazes de
produzir metano, incluindo os membros do gênero Methanosaeta, responsável por
formar metano e CO2 a partir de acetato, assim como Metanospirillum e Methanoculleus,
que convertem CO2 e H2 em metano. Com relação aos hidrocarbonetos aromáticos, de
Desulfococcus oleovorans e Desulfotomaculum spp. já foram descritos como degradadores
de antraceno e fenantreno. Bactérias pertencentes à Classe Deltaproteobacteria já foram
descritas degradando naftaleno de forma anaeróbica (Meckenstock & Mouttaki, 2011).
2.7 Metagenômica
Metodologias baseadas em cultivo, apesar de serem extremamente importantes
para o entendimento do potencial fisiológico de micro-organismos isolados, não fornecem
informação abrangente sobre a diversidade e abundância de comunidades microbianas
(van Hamme et al., 2003). Embora as técnicas de cultivo tenham sido aprimoradas, sabe-
se que apenas uma pequena fração da diversidade microbiana na natureza, em torno de 1
a 10%, pode ser hoje cultivada em laboratório (Ward et al., 1990; Amann et al., 1995).
Metodologias moleculares desenvolvidas nas últimas décadas (extração de ácidos
nucléicos, amplificação por PCR, clonagem e seqüenciamento de DNA) têm sido
otimizadas e adaptadas para superar as limitações impostas pela abordagem clássica de
estudo de populações microbianas, evitando o isolamento e cultivo dos micro-organismos.
42
A utilização destas metodologias vem permitindo uma avaliação mais precisa da
diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novos grupos de organismos,
nunca antes cultivados (Amann et al. 1995; Hugenholtz et al., 1998). O uso destas
metodologias associado à estratégia de bibliotecas metagenômicas nos permite ter acesso
ao potencial metabólico destes novos organismos. Esta estratégia consiste na utilização de
vetores do tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosome), cosmídeos ou fosmídeos para a
clonagem de fragmentos grandes de DNA (40 a 100 kb) obtidos diretamente da
comunidade microbiana (metagenoma) de ambientes como solo, sedimento ou lodo, e
análise das bibliotecas resultantes em busca da expressão da atividade biológica de
interesse na linhagem hospedeira de Escherichia coli (Handelsman et al., 1998; Rondon et
al., 1999; Rondon et al., 2000) (Figura 4).
43
Figura 4. Comparação esquemática das estratégias de cultivo (esquerda) e metagenoma (direita) para obtenção de novos compostos com atividade biológica. Com a estratégia de cultivo, apenas uma fração da diversidade microbiana existente pode ser obtida em cultura pura. Os micro-organismos não cultivados só podem ser acessados através de seus genomas. Assim, com a estratégia de metagenoma, os genomas de todos os micro-organismos em um dado habitat são isolados e clonados em hospedeiros para subseqüente seleção e expressão do composto de interesse. Fonte: Lorenz et al. (2002).
Chen e Patcher (2005) definiram metagenômica como a aplicação de técnicas
modernas de genômica ao estudo de comunidades de micro-organismos diretamente em
seus ambientes naturais, ignorando a necessidade de isolamento e cultivo das espécies
individuais no laboratório. Apesar dos diferentes nomes utilizados para descrever os
mesmos métodos, o termo “metagenômica” foi aprovado pela revista científica
44
Enviromental Microbiology. A definição exclui o uso de primers para amplificar cassetes de
genes ou primers aleatórios para acessar genes de interesse (Handelsman, 2004;
Riesenfeld et al., 2004; Handelsman, 2007). O propósito da metagenômica inclui (1)
entendimento dos processos ecológicos (por exemplo, reações catabólicas) atuando em
um ecossistema de interesse e (2) busca de novos genes a partir de organismos não
cultivados que poderiam ser biotecnologicamente importantes (Watanabe e Kassai, 2008).
Embora existam outras espécies de hospedeiros empregados em estudos com
abordagem metagenômica, Escherichia coli é a que vem sendo mais utilizada. No entanto,
outras espécies como Streptomyces lividans e Pseudomonas putida vêm sendo
desenvolvidas como hospedeiros alternativos. As técnicas envolvendo metagenômica, por
um lado, possibilitam a elucidação de genomas de micro-organismos não cultivados para
uma melhor compreensão sobre ecologia microbiana. Por outro lado, essa mesma técnica
tem sido empregada visando atender ao aumento da demanda biotecnológica por novas
enzimas e biomoléculas (Schmeisser et al., 2007).
Os nichos microbianos investigados são diversos, englobando desde solos de
margens de rios (Henne et al., 1999), ambientes marinhos (Hårdeman e Sjöling, 2007) a
ambientes extremos, tais como águas profundas (Beja et al., 2000), sedimentos e lagos do
continente Antártico (Moreira et al., 2006), reservatórios de petróleo (Vasconcellos et al,
2009; Li & Hendry, 2008), dentre outros.
No caso de comunidades microbianas biodegradadoras, as bibliotecas
metagenômicas constituem-se em uma ferramenta que abre a perspectiva de descoberta
de novas vias catabólicas a partir de membros da microbiota, principalmente de micro-
organismos fastidiosos ou ainda não-cultivados, ou mesmo daqueles que vivem em
consórcios e não podem ser recuperados isoladamente. Ainda, a partir de uma biblioteca
de metagenoma, uma variedade maior de atividades catabólicas pode ser obtida
simultaneamente, em comparação ao método tradicional baseado em isolamento, cultivo
e triagem de linhagens puras de micro-organismos.
A triagem das bibliotecas metagenômicas, com conseqüente seleção de genes de
interesse, pode ser feita com base em similaridade de seqüência do inserto ou na
45
expressão da atividade biológica (Lorenz et al., 2002). Esta última estratégia, denominada
como triagem funcional, oferece a vantagem de poder acessar seqüências gênicas ainda
totalmente desconhecidas e de detectar apenas enzimas que estão ativas.
O método de triagem de bibliotecas metagenômicas baseado em seqüência é mais
conservador, uma vez que os oligonucleotídeos necessários para identificar os genes-alvo,
utilizando PCR ou métodos de hibridização, são desenhados com base em regiões
conservadas das seqüências de aminoácidos, de forma a garantir uma alta probabilidade
de pareamento com seqüências gênicas desconhecidas presentes no ambiente. Esta
estratégia é atraente, pois qualquer gene que apresente homologia com a seqüência de
DNA utilizada será detectado, independente da sua expressão na célula hospedeira
(Lorenz et al., 2002).
A triagem funcional é mais direta e tem tido sucesso na descoberta de genes
catabólicos (Galvão et al., 2005). Genes que codificam para funções metabólicas
importantes são freqüentemente pouco conservados, tornando difícil a comparação das
seqüências dos clones com seqüências homólogas. Ainda, o catabolismo de poluentes
específicos pode ser muitas vezes obtido por duas ou mais bactérias, cada espécie
contribuindo com parte da via catabólica, como no caso de bifenilas policloradas
(Abraham et al., 2002). Portanto, a estratégia funcional de triagem de bibliotecas
metagenômicas permite o estudo de consórcios de clones (combinação de múltiplos
clones) em meio líquido, na busca da atividade de degradação desejada.
Estes estudos podem revelar, ainda, importantes vias metabólicas
microbianas, contribuindo para a compreensão da fisiologia de micro-organismos não-
cultivados presentes no ambiente, e possibilitando a identificação de novos genes
biocatalíticos e biossintéticos.
46
2.8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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53
_____________________________________CAPÍTULO 1
Potencial de biorremediação de micro-organismos derivados de
reservatórios de petróleo
Bruna Martins Dellagnezze, Gabriel Vasconcelos de Sousa, Laercio Lopes Martins, Daniela Ferreira Domingos, Elmer E.G. Limache, Suzan Pantaroto de Vasconcellos; Georgiana Feitosa da Cruz, Valéria Maia de Oliveira. Bioremediation potential of microorganisms derived from petroleum reservoirs. Marine Pollution Bulletin, 2014.
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_____________________________________CAPÍTULO 2
Avaliação e otimização da produção de biossurfactantes por
micro-organismos de reservatórios de petróleo
2.1 INTRODUÇÃO
Como já mencionado, a aplicação de biossurfactantes em processos de
bioestimulação é descrita na literatura, pois estes compostos são capazes de aumentar a
solubilidade de poluentes de ambientes contaminados, como solo, e deste modo
melhorar sua biodisponibilidade. Além da estratégia de bioestimulação, a abordagem de
bioaumentação também é descrita. Uma das técnicas para aumentar a efetividade dos
micro-organismos no ambiente, seja com tratamento in situ ou ex situ, consiste na
imobilização dos mesmos em matrizes biológicas (Gentry et al., 2004). A imobilização ou
encapsulamento de bactérias pode oferecer um melhor suporte à sobrevivência
ambiental em condições de estresse, possibilitando, deste modo, processos de
biodegradação mais eficientes quando comparados à utilização de células livres. O
encapsulamento controla o fluxo de nutrientes, diminui a concentração de compostos
tóxicos no microambiente das células, minimiza os danos à membrana celular e a
exposição direta aos compostos poluentes e protege da predação e competição,
imitando um “reator em miniatura” no ambiente (Tyagi et al, 2011).
O trabalho descrito neste capítulo avaliou oito micro-organismos diferentes, 4
clones metagenômicos, provenientes de uma biblioteca fosmidial construída a partir de
amostras de petróleo da Bacia Potiguar (RN) e 4 linhagens de bactérias isoladas de
reservatórios de petróleo da Bacia de Campos (Achromobacter xylosoxidans, Bacillus
subtillis, Micrococcus sp. e Dietzia maris), quanto à produção de biossurfactantes. Ensaios
de tensiometria e emulsificação (E24) foram empregados para a avaliação da produção de
biossurfactantes.
64
É importante ressaltar que nessa etapa do trabalho os micro-organismos com
melhor performance nos ensaios de degradação apresentados no capítulo 1 foram
selecionados e imobilizados em esferas de quitosana. Posteriormente esse micro-
organismos imobilizados foram novamente testados para a biodegradação do petróleo em
ensaios de microcosmos, que serão apresentados no Capítulo 3.
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
Dentre os oito micro-organismos selecionados, as linhagens de bactérias já haviam
sido previamente descritas quanto à produção de EPS (Vasconcellos et al., 2011). Porém,
os clones metagenômicos foram avaliados para a produção de biossurfactantes ao longo
deste trabalho, utilizando diferentes fonte de carbono, nitrogênio e sais. Os micro-
organismos avaliados e sua proveniência estão descritos na Tabela 2.1.
Tabela 2.1: Micro-organismos avaliados para a produção de biossurfactantes.
Micro-organismos Fonte
Clone 1A Biblioteca metagenômica, Bacia Potiguar, RN (Vasconcellos et al., 2010)
Clone 2B Biblioteca metagenômica, Bacia Potiguar, RN (Vasconcellos et al., 2010)
Clone 9E Biblioteca metagenômica, Bacia Potiguar, RN (Vasconcellos et al., 2010)
Clone 10A Biblioteca metagenômica, Bacia Potiguar, RN (Vasconcellos et al., 2010)
Micrococcus sp. CBMAI 636 Água de formação, Bacia de Campos, RJ (Vasconcellos et al., 2009)
Dietzia maris CBMAI 705 Amostras de óleo, Bacia de Campos, RJ (Vasconcellos et al., 2009)
Bacillus subtilis CBMAI 707 Amostras de óleo, Bacia de Campos, RJ (Vasconcellos et al., 2009)
Achromobacter xylosoxidans CBMAI 709
Água de formação, Bacia de Campos, RJ (Vasconcellos et al., 2009)
65
Foram realizados ensaios preliminares com diferentes fontes de carbono antes de se
chegar à otimização dos substratos para a produção de biossurfactantes pelos micro-
organismos em estudo através da estratégia de delineamento experimental. Ensaios em
meio mineral foram realizados utilizando substratos diversos, como glicerol, hexadecano,
óleo de soja e glicose (dados não apresentados). Sabe-se que a fonte de carbono está
diretamente relacionada com a produção de compostos tensoativos Makkar & Cameotra,
2010; Mukherjee et al., 2008) e, desta maneira, foi realizada uma seleção de fontes de
carbono, nitrogênio e sais para se aplicar ao delineamento e, deste modo, obter um
melhor resultado quanto à produção de composto tensoativos.
2.2.1. Delineamento experimental para otimização da produção de biossurfactantes
Nesta etapa do trabalho foi aplicado o método de delineamento experimental
utilizando o modelo Plackett-Burman (P&B) para verificar as melhores condições da
produção de biossurfactantes. Um total de doze variáveis foi testado (Tabela 2.2),
incluindo fontes de carbono, nitrogênio e fósforo.
Todas as diferentes variáveis foram preparadas em dois níveis, designados como -1
para o inferior e +1 para o superior (Tabela 2.2). Três ensaios no ponto central foram
acrescentados à matriz para a determinação do erro padrão durante a análise dos
resultados. Os micro-organismos foram inoculados em 50 mL de meio de cultura em
frascos Erlenmeyer de 125 mL. A composição do meio de cultura, bem como as
concentrações neste primeiro P&B para a produção de biossurfactante, está descrita na
Tabela 1. Em todos os frascos foi adicionado 0,01% de solução de elementos traços (0,625
g EDTA; 2,74 g ZnSO4; 1,25 g FeSO4.7H2O; 0,385 g MnSO4.7H2O; 0,098 g CuSO4.5H2O;
0,044g Na2B4O7.10H2O). As condições de incubação foram 5 dias a 150 rpm, com
temperatura de 30°C para as linhagens de bactérias e 37°C para os clones.
66
Tabela 2.2. Componentes do meio de cultura utilizados nos experimentos de Plackett-Burman e
suas respectivas concentrações.
Variáveis Constituintes
do meio Unidade -1 0 +1
F1 Sacarose % 0 0,5 1
F2 Hexadecano % 0 0,5 1
F3 Glicerol % 0 0,5 1
F4 Óleo de soja % 0 0,5 1
F5 Glicose % 0 0,5 1
F6 Uréia g/L 0 2,5 5
F7 (NH4)2SO4 g/L 0 2,5 5
F8 Peptona g/L 0 2,5 5
F9 Ex. levedura g/L 0 2,5 5
F10 K2HPO4 g/L 0 1 2
F11 KH2PO4 g/L 0 1 2
F12 NaCl % 0 1,5 3
2.2.2. Ensaios de tensiometria
Os ensaios de tensiometria foram realizados através do método do anel (Du Nouy),
utilizando tensiomêtro Kruss (Easy Dyne), com o sobrenadante livre de células
proveniente dos ensaios de delineamento experimental P&B. Os resultados foram
analisados pelo software STATISTICA 8. O nível de significância de 10% (p <0,1) foi
considerado para as variáveis que tiveram influência significativa na redução da tensão
superficial.
2.2.3. Ensaios de emulsificação (E 24)
Do mesmo modo, os ensaios de emulsificação foram realizados utilizando o
sobrenadante livre de células proveniente dos ensaios de delineamento experimental.
Querosene e óleo diesel foram empregados como hidrocarbonetos. Em um tubo de
ensaio com rosca (10 x 130 mm) foi adicionado 1 mL do sobrenadante da cultura livre de
células e 1 mL de um dos diferentes óleos. A solução foi homogeneizada vigorosamente
em vórtex por 1 minuto e deixada em repouso por 24 horas à temperatura ambiente.
67
Após 24 horas, a altura da emulsão (fase do óleo) foi mensurada. Os valores foram
aplicados na seguinte fórmula:
E24 = ℎ (𝑒𝑚𝑢𝑙𝑠𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎çã𝑜)
ℎ (𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙) × 100
2.2.4. Imobilização dos micro-organismos em quitosana
Esta etapa do trabalho foi realizada no Laboratório de Ecologia Microbiana e
Biotecnologia, na Universidade Federal do Ceará, sob a supervisão da Profa. Vânia Maria
Melo. A metodologia utilizada foi baseada no trabalho de Angelim e colaboradores
(Angelim et al., 2013).
2.2.4.1. Ensaio de resistência à quitosana e tripolifosfato de sódio (TPP)
Inicialmente, foram selecionados os micro-organismos que tiveram melhor
desempenho na biodegradação de petróleo em microcosmos, realizados com os micro-
organismos na forma livre (descritos no Capítulo 1), a saber: os 4 clones na forma de pool,
o clone 2B, e as linhagens CBMAI 705, 636 e 707. Testes preliminares de resistência à
quitosana e TPP (tripolifosfato de sódio) foram realizados. Os ensaios foram realizados em
triplicata. Um gel de quitosana 3%, assim como a solução de TPP 1%, pH 9.0, e solução
salina 0,9%, foram preparados e autoclavados por 15 minutos, exceto o gel de quitosana.
As soluções, assim como o gel, foram distribuídas em tubinhos de vidro no volume de 1
mL e, posteriormente, foram adicionados de 100 microlitros da cultura de micro-
organismos, previamente cultivados em caldo nutriente (ATGE-Ágar, triptona, glicose e
Extrato de levedura) e LB acrescidos de cloranfenicol. Tempos de contato de 3 e 6 horas
foram verificados. A solução salina foi utilizada como controle negativo. Os micro-
organismos que resistiram à quitosana foram posteriormente imobilizados.
2.2.4.2. Imobilização dos micro-organismos
Para realizar a imobilização, foram feitos separadamente um pré-inóculo em 5 mL
de caldo TGE (triptona, glicose e extrato de levedura) para a linhagem CBMAI 707 e em
LB+ cloranfenicol para os clones metagenômicos. Para o preparo do inóculo (5%), as
68
células foram inoculadas em frasco Erlenmeyer contendo 200 mL de meio de cultivo na
densidade óptica (DO600) ajustada para 0,1. O inóculo foi incubado por 24 horas, 150 rpm,
a 37°C para os clones e 30°C para a linhagem CBMAI 707. Após esse período, novamente
foi mensurada a densidade óptica (DO600), sendo que neste caso o valor deveria estar
acima de 1,0. Posteriormente, as células foram centrifugadas por 15 minutos a 9000 rpm.
O pellet celular foi suspenso em solução salina e adicionado a um gel de quitosana 3%,
homogeneizado cuidadosamente, com auxílio de bastão de vidro, no qual permaneceu em
“repouso” por 30 minutos. Após esse período, o gel foi colocado em seringas estéreis de
10 mL acopladas em agulhas (0,70 x 25 mm) e gotejado em um frasco contendo uma
solução de TPP. Durante o processo de gotejamento, um bastão de vidro foi utilizado para
mexer a solução à medida que as beads eram formadas, com intuito de não haver a
formação de um aglomerado e, desta forma, evitar perdas (Figura 2.1).
Figura 2.1. Processo de imobilização de micro-organismos. (A) Gotejamento do gel de quitosana em solução de TPP. (B) Pequenas esferas já formadas no fundo do frasco.
Após o gotejamento do conteúdo total do gel de quitosana contendo micro-
organismos, as esferas foram deixadas por 3 horas imersas na solução de TPP. Procedeu-
se então à lavagem das mesmas, utilizando peneiras e solução de fosfato de potássio
bibásico (K2HPO4) 0,15 M. A lavagem foi feita por 3 vezes, com intervalos de repouso de
10 minutos. Ao final das três lavagens, foram acondicionadas em frascos estéreis
contendo solução de K2HPO4 0,15 M e mantidas a 4°C.
A B
69
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.3.1. Otimização da produção de biossurfactante por planejamento Placket-
Burman (P&B)
Visando otimizar a produção de biossurfactantes, a avaliação das condições físico-
químicas do processo pode ser considerada como um fator relevante. Neste sentido, o uso
de abordagens estatísticas tem sido amplamente empregado. Assim, o objetivo desta
etapa foi avaliar o efeito de componentes do meio de cultura, a fim de maximizar a
produção de biossurfactante pelos micro-organismos que apresentaram os melhores
resultados em ensaios prévios de tensiometria. A estratégia utilizada foi um planejamento
experimental do tipo Plackett-Burman, esta abordagem é recomendada quando se deseja
avaliar um grande número de fatores através de uma triagem experimental com foco na
redução do número de ensaios (Rodrigues e Iemma, 2005).
Foram avaliadas inicialmente 12 variáveis, dentre elas cinco fontes de carbono
(sacarose, glicose, glicerol, óleo de soja e hexadecano), quatro fontes de nitrogênio (uréia,
(NH4)2SO4, extrato de levedura e peptona) e três fontes de sais (NaCl, K2HPO4 e KH2PO4).
Os valores centrais dos níveis estudados (Ponto Central), bem como os constituintes do
meio são dados disponíveis na literatura (Sanket et al., 2007; Franzetti et al., 2009; Onwosi
& Odibo, 2012).
Nas Figuras 2.2 a 2.10 é demonstrado o efeito das variáveis utilizadas no
delineamento Placket-Burman com melhor resposta na redução de tensão superficial,
avaliadas nos ensaios de tensiometria para os diferentes clones e as linhagens de
bactérias.
Clone 1A
Como já observado em ensaios anteriores, os valores de tensão não diferiram muito
em comparação aos experimentos utilizando somente meio mineral +
hexadecano/glicerol. Os valores de tensiometria do clone 1A estão representados na
Tabela 2.3.
70
Tabela 2.3. Valores de tensiometria exibidos pelo clone 1A utilizando o planejamento P&B.
Para o clone 1A, não foi observado nenhum efeito negativo das variáveis. Dentre as
fontes de carbono, óleo de soja teve um maior efeito dentre as outras variáveis, o que
pode ser observado nos testes de emulsificação e tensiometria (Figura 2.2). O menor valor
de tensiometria alcançado foi de 44,3, no tratamento 13, que leva em sua composição
peptona e hexadecano, ao invés de óleo de soja. Entre as fontes de nitrogênio, peptona
demonstra ser a fonte que mais influenciou os resultados. Na Tabela 2.4 estão
representados os efeitos das variáveis, assim como o valor p. As variáveis mais
significativas apresentam o valor p abaixo de 0,1 (p<0,1), representadas em vermelho.
Tratamento Valores (mN/m)
1 50,5
2 52,8
3 56,9
4 47,9
5 50,9
6 49
7 54,1
8 52,3
9 46,7
10 47,9
11 48,9
12 49,7
13 44,3
14 54,2
15 48
16 71
17 45,9
18 45,6
19 45
71
Figura 2.2. Efeito das variáveis que apresentaram melhor resposta no P&B para o clone 1A.
Tabela 2.4: Efeito de cada variável e estimativa do valor p para o clone 1A.
Efeito Erro Padrão t(6) valor p
Mean/Interc. 19,17368 1,107329 17,31525 0,000002
Sacarose 1,56250 2,413369 0,64744 0,541315
Hexadecano 2,56250 2,413369 1,06179 0,329187
Glicerol 0,93750 2,413369 0,38846 0,711085
Óleo de soja 4,13750 2,413369 1,71441 0,137281
Glicose 3,33750 2,413369 1,38292 0,215953
Uréia 2,36250 2,413369 0,97892 0,365424
Sulfato 0,48750 2,413369 0,20200 0,846592
Peptona 6,38750 2,413369 2,64672 0,038196
Ext. levedura 2,61250 2,413369 1,08251 0,320600
K2HPO4 3,56250 2,413369 1,47615 0,190361
KH2PO4 1,38750 2,413369 0,57492 0,586239
NaCl 2,91250 2,413369 1,20682 0,272918
72
Clone 2B
Para o clone 2B, o mesmo ocorreu como observado para o clone 1A, os valores de
tensiometria não diferiram com relação aos ensaios anteriores. O menor valor observado
foi de 44,1 mN/m, no tratamento 12, composto por óleo de soja e KH2PO4 (Tabela 2.5).
Tabela 2.5. Valores de tensiometria utilizando o planejamento P&B para o clone 2B.
Dentre as variáveis nos ensaios, óleo de soja e KH2PO4 tiveram maior efeito positivo,
influenciando na redução da tensão superficial. No entanto, nenhuma variável atingiu o
valor p menor que 1, o que é estatisticamente colocado como efeito (Figura 2.3 e Tabela
2.6).
Tratamento Valores (mN/m)
1 54,7
2 49,4
3 47,4
4 45,2
5 48,9
6 45,2
7 52,6
8 51,4
9 45,4
10 45,1
11 48
12 44,1
13 45,3
14 51,9
15 45,9
16 71
17 43,8
18 43,2
19 45,8
73
Figura 2.3. Efeito das variáveis que apresentaram melhor resposta no delineamento P&B para o
clone 2B.
Tabela 2.6. Efeito de cada variável e estimativa do valor p para o clone 2B.
Efeito Erro Padrão t(5) valor p
Mean/Interc 23,04667 1,020914 22,57455 0,000003
Sacarose 1,58917 2,268519 0,70053 0,514845
Hexadecano 2,46417 2,268519 1,08624 0,326942
Glicerol 1,51417 2,268519 0,66747 0,534037
Óleo de soja 3,46417 2,268519 1,52706 0,187277
Glicose 0,46417 2,268519 0,20461 0,845944
Uréia -0,01083 2,268519 -0,00478 0,996374
(NH4)2SO4 1,33917 2,268519 0,59033 0,580641
Peptona 2,03917 2,268519 0,89890 0,409905
Ext. Levedura 0,41417 2,268519 0,18257 0,862306
K2HPO4 4,68917 2,268519 2,06706 0,093589
KH2PO4 -0,01083 2,268519 -0,00478 0,996374
NaCl 1,76417 2,268519 0,77767 0,471937
Clone 9E
Para o clone 9E, os valores de tensiometria ficaram entre 41,7 e 63 mN/m, sendo
que os menores valores de tensão foram observados para os tratamentos 11 e 13. Do
mesmo modo, neste ensaio foram observados baixos valores de tensão superficial para os
74
tratamentos relacionados ao ponto central em triplicata (17, 18 e 19; entre 41,7 e 43,8
mN/m). Diferentemente de todos os outros tratamentos, onde algumas variáveis estão
ausentes, nos tratamentos do ponto central todas as variáveis adicionadas estão
presentes (Tabela 2.7).
Tabela 2.7. Valores de tensiometria utilizando o planejamento P&B para o clone 9E.
Nos ensaios envolvendo esse clone, algumas variáveis apresentaram efeito negativo,
como sacarose, (NH4)2SO4 e KH2PO4. Essa variáveis seriam descartadas no caso de um
próximo ensaio envolvendo delineamento experimental (Figura 2.4). Dentre as fontes de
carbono, o óleo de soja teve maior efeito na redução da tensão superficial, assim como a
peptona (p<0,1) (Tabela 2.8). Nos tratamentos 11 e 13, a peptona está presente como
componente, porém o óleo de soja compõe apenas o ensaio 11. Nos ensaios 17, 18 e 19,
Tratamento Valores mN/m
1 51,2
2 56,9
3 64,1
4 45
5 48,1
6 48
7 57
8 51,8
9 47,2
10 45,1
11 44,9
12 49,4
13 44,9
14 55,5
15 46,9
16 71
17 43,8
18 41,7
19 43,4
75
está o ponto central (em triplicata), tratamento no qual estão presentes todas as variáveis
testadas. Para o clone 9E, o ponto central apresentou um valor semelhante aos
tratamentos 11 e 13.
Figura 2.4. Efeito das variáveis que apresentaram melhor resposta no delineamento P&B para o
clone 9E.
Tabela 2.8. Efeito de cada variável e estimativa do valor p para o clone 9E.
Efeito Erro Padrão t(5) valor p
Mean/Interc 21,31333 1,667183 12,78404 0,000052
Sacarose -1,48167 3,704561 -0,39996 0,705703
Hexadecano -0,00667 3,704561 -0,00180 0,998634
Glicerol 1,26833 3,704561 0,34237 0,745995
Óleo de soja 5,26833 3,704561 1,42212 0,214260
Glicose 2,86833 3,704561 0,77427 0,473773
Uréia 0,51833 3,704561 0,13992 0,894187
Sulfato -2,35667 3,704561 -0,63615 0,552653
Peptona 7,49333 3,704561 2,02273 0,099025
Ext. Levedura 2,34333 3,704561 0,63255 0,554819
K2HPO4 2,01833 3,704561 0,54482 0,609285
KH2PO4 -1,25667 3,704561 -0,33922 0,748226
NaCl 2,44333 3,704561 0,65955 0,538707
76
Clone 10 A
Para o clone 10 A, os valores de tensiometria variaram entre 41 a 61 mN/m, atigindo
a maior redução no tratamento 4 (Tabela 2.9).
Tabela 2.9. Valores de tensiometria utilizando planejamento P&B para o clone 10A.
Tratamento Valores (mN/m)
1 52,3
2 48,1
3 61
4 41
5 47,5
6 50
7 48
8 51,9
9 47,6
10 47,8
11 48,9
12 50
13 44,9
14 55,2
15 46,5
16 71
17 47
18 46,8
19 46,1
Algumas variáveis apresentaram efeito negativo nos ensaios, como sacarose,
glicerol, (NH4)2SO4 e fosfato de potássio bibásico (KH2PO4), que seriam eliminados se
houvesse um próximo experimento (Figura 2.5). As variáveis óleo de soja (p<0,1) e
peptona, que também compõem o tratamento 4, tiveram maior efeito para este clone
(Tabela 2.10).
77
Figura 2.5. Efeito das variáveis que apresentaram melhor resposta no delineamento P&B para o
clone 10 A.
Tabela 2.10. Efeito de cada variável e estimativa do valor p para o clone 10A.
Efeito Erro Padrão t(5) valor p
Mean/Interc 21,77000 1,038867 20,95552 0,000005
Sacarose -0,79125 2,308413 -0,34277 0,745713
Hexadecano 3,45875 2,308413 1,49832 0,194322
Glicerol -1,14125 2,308413 -0,49439 0,641986
Óleo de soja 5,05875 2,308413 2,19144 0,079951
Glicose 1,08375 2,308413 0,46948 0,658488
Uréia 0,53375 2,308413 0,23122 0,826308
Sulfato -2,81625 2,308413 -1,21999 0,276866
Peptona 4,45875 2,308413 1,93152 0,111273
Ext. Levedura 0,08375 2,308413 0,03628 0,972463
K2HPO4 0,13375 2,308413 0,05794 0,956041
KH2PO4 -0,39125 2,308413 -0,16949 0,872056
NaCl 3,40875 2,308413 1,47666 0,199800
78
E. coli EPI 300
A linhagem hospedeira dos clones fosmidiais E. coli EPI 300 também foi submetida
aos ensaios utilizando a estratégia P&B para fins de comparação. Os valores de
tensiometria não diferiram muito dos valores observados nos ensaios com os clones
metagenômicos, variando entre 42 e 59 mN/m. O tratamento 10 foi o que apresentou o
menor valor de tensão, 42,7 mN/m (Tabela 2.12).
Tabela 2.11. Valores de tensiometria utilizando planejamento P&B para E. coli EPI 300.
Tratamento Valores (mN/m)
1 51,9
2 46,3
3 48,1
4 49,3
5 46,1
6 50,3
7 46
8 53,3
9 47
10 42,7
11 48,1
12 49,8
13 49
14 59,4
15 48,3
16 71
17 46,2
18 48,4
19 46,6
Para a E. coli EPI 300, todas as variáveis tiveram efeito positivo. No entanto, o efeito
das fontes de carbono diferiu em relação ao observado para os clones. Neste ensaio, o
hexadecano teve o maior efeito positivo na redução da tensão superficial, em relação ao
óleo de soja (Figura 2.6). No entanto, o óleo de soja também apresentou efeito positivo,
79
assim como fosfato de potássio bibásico, apresentando o valor p abaixo de 0,1 (Tabela
2.12). O tratamento 10 contém em sua composição hexadecano e fosfato de potássio
bibásico. Para um próximo experimento, se necessário, essas três variáveis seriam fixadas.
Figura 2.6. Efeito das variáveis que apresentaram melhor resposta no delineamento P&B para
E.coli EPI 300.
Tabela 2.12. Efeito de cada variável e estimativa do valor p para a E.coli EPI 300.
Efeito Erro Padrão t(6) p-valor
Mean/Interc. 21,58947 1,009018 21,39652 0,000001
Sacarose 1,88750 2,199104 0,85830 0,423680
Hexadecano 7,26250 2,199104 3,30248 0,016357
Glicerol 1,56250 2,199104 0,71052 0,504052
Óleo de soja 4,66250 2,199104 2,12018 0,078264
Glicose 3,61250 2,199104 1,64271 0,151549
Uréia 1,03750 2,199104 0,47178 0,653750
Sulfato 2,23750 2,199104 1,01746 0,348194
Peptona 3,48750 2,199104 1,58587 0,163863
Ext. levedura 3,06250 2,199104 1,39261 0,213154
K2HPO4 5,23750 2,199104 2,38165 0,054645
KH2PO4 0,48750 2,199104 0,22168 0,831914
NaCl 0,51250 2,199104 0,23305 0,823470
0,000001,000002,000003,000004,000005,000006,000007,000008,00000
80
Pode-se concluir que, para a maioria dos clones, o óleo de soja e a peptona foram as
duas variáveis que tiveram o maior efeito na redução da tensão superficial. Houve
também diferenças entre a linhagem hospedeira e os clones, como já verificado em
ensaios prévios neste trabalho.
Em comparação com resultados anteriores de tensiometria observados em
experimentos anteriores (dados não mostrados), os valores de redução da tensão
superficial utilizando o sobrenadante dos clones não foram alterados, mesmo aplicando
diferentes condições de cultivo. Isso poderia ser explicado pela hipótese de que os clones
podem não carregar uma via metabólica inteira nos seus insertos, e elementos
regulatórios poderiam eventualmente estar ausentes. Já é descrito na literatura que vias
relacionadas com a produção de biossurfactante estão organizadas em grandes operons.
Surfactina, por exemplo, é sintetizada por um operon de 25 kb (Sen, 2010), assim como
Emulsan, um biossurfactante de alto peso molecular, é sintetizado por um cluster de
genes de 27 kb (Satpute et al., 2010). Por outro lado, algum composto tensoativo parece
estar sendo produzido, pois, mesmo que em valores não significantes é possível perceber
uma pequena redução na tensão superficial do meio e a formação de emulsão (item
2.3.2).
Dietzia sp. CBMAI 705
O gênero Dietzia já é descrito com relação à sua capacidade de degradação de
hidrocarbonetos (Nakano et. al, 2011). No entanto, na literatura existe ainda pouca
informação sobre produção de biossurfactantes por esse gênero. Os valores de
tensiometria observados para esta bactéria variaram entre 40 a 62 mN/m, sendo o menor
valor observado quando aplicado o tratamento 5. Este tratamento é composto de óleo de
soja e NaCl (Tabela 2.13).
81
Tabela 2.13. Valores de tensiometria utilizando planejamento P&B para Dietzia sp. CBMAI 705.
Tratamento Valores (mN/m)
55,6
2 50,1
3 62,2
4 45
5 40
6 42
7 55,1
8 54,8
9 44,1
10 47,3
11 46,2
12 42,7
13 46,7
14 59,8
15 42,3
16 71
17 48,2
18 40
19 46,6
Algumas variáveis apresentaram efeito negativo, como sacarose, uréia, (NH4)2SO4 e
KH2PO4. O óleo de soja teve efeito positivo ( valor p < 0,1), assim como NaCl (Figura 2.7 e
Tabela 2.14).
Dietzia é um gênero frequentemente encontrado em ambientes salinos
(Kleinsteuber et al., 2006). A linhagem em estudo (CBMAI 705) foi isolada de reservatórios
de petróleo (Vasconcellos et al., 2009), onde a salinidade geralmente é elevada, e isso
pode explicar o efeito maior dessa variável no experimento.
82
Figura 2.7. Efeito das variáveis que apresentaram melhor resposta no P&B para Dietzia sp. CBMAI
705.
Tabela 2.14. Efeito de cada variável e estimativa do valor p para Dietzia sp. CBMAI 705.
Achromobacter xylosoxidans CBMAI 709
Os valores de tensiometria para Achromobacter xylosoxidans variaram de 45 a 63
mN/m, sendo que o tratamento 4 apresentou o menor valor na redução de tensão
superficial, 45 mN/m (Tabela 2.15).
Efeito Erro Padrão t(5) valor p
Mean/Interc 22,54000 1,210116 18,62632 0,000008
Sacarose -0,88250 2,688936 -0,32820 0,756061
Hexadecano 2,11750 2,688936 0,78749 0,466669
Glicerol 0,41750 2,688936 0,15527 0,882685
Óleo de soja 10,39250 2,688936 3,86491 0,011821
Glicose 3,69250 2,688936 1,37322 0,228065
Uréia -1,45750 2,688936 -0,54204 0,611067
Sulfato -3,83250 2,688936 -1,42529 0,213394
Peptona 2,74250 2,688936 1,01992 0,354552
Ext. Levedura 3,29250 2,688936 1,22446 0,275317
K2HPO4 3,36750 2,688936 1,25235 0,265827
KH2PO4 -5,08250 2,688936 -1,89015 0,117337
NaCl 4,39250 2,688936 1,63355 0,163282
83
Tabela 2.15. Valores de tensiometria utilizando planejamento P&B para Achromobacter xylosoxidans CBMAI 709.
Algumas variáveis apresentaram efeito negativo, como o glicerol, uréia, sulfato de
amônio e fosfato de potássio, podendo ser eliminadas em um próximo ensaio, se
necessário (Figura 2.8).
As variáveis com maior efeito foram óleo de soja, peptona e fosfato de potássio
bibásico (K2HPO4). O tratamento 4, onde foi observado o menor valor de tensão
superficial, é composto de óleo de soja e peptona. Outras variáveis, como hexadecano e
glicose, tiveram o valor p abaixo de 0,1, no entanto com menor efeito em comparação ao
óleo de soja e peptona (Tabela 2.16).
Achromobacter xylosoxidans já é descrita na literatura com relação à sua capacidade
de degradação de hidrocarbonetos (Nielsen et al., 2006; Ghevariya et al., 2011). Assim
Tratamento Valores (mN/m)
1 50
2 49
3 57
4 45
5 49,4
6 49,7
7 52,9
8 52,2
9 49,1
10 47,8
11 48,6
12 48,4
13 48,7
14 63
15 48
16 71
17 51,6
18 49,4
19 53,9
84
como Dietzia, o gênero Achromobacter é pouco relatado produzindo biossurfactantes
(Tambekar et al., 2012).
Figura 2.8. Efeito das variáveis que apresentaram melhor resposta no P&B para a linhagem
Achromobacter xylosoxidans CBMAI 709.
Tabela 2.16. Efeito de cada variável e estimativa do valor p para Achromobacter xylosidans CBMAI
709.
Efeito Erro Padrão t(5) valor p
Mean/Interc 19,76000 0,560220 35,27185 0,000000
Sacarose 2,23250 1,244837 1,79341 0,132881
Hexadecano 2,60750 1,244837 2,09465 0,090364
Glicerol -0,84250 1,244837 -0,67680 0,528575
Óleo de soja 4,55750 1,244837 3,66112 0,014578
Glicose 2,55750 1,244837 2,05449 0,095098
Uréia -0,96750 1,244837 -0,77721 0,472186
Sulfato -2,26750 1,244837 -1,82152 0,128158
Peptona 4,98250 1,244837 4,00253 0,010297
Ext. Levedura 1,00750 1,244837 0,80934 0,455091
K2HPO4 3,03250 1,244837 2,43606 0,058939
KH2PO4 -1,06750 1,244837 -0,85754 0,430322
NaCl 1,40750 1,244837 1,13067 0,309494
85
Micrococcus sp. CBMAI 636
O gênero Micrococcus é relatado em trabalhos que mencionam a produção de
biossurfactantes (Das et al., 1998; Tuleva et al., 2009; Palme et al., 2010). Para a linhagem
de Micrococcus sp. em estudo, os valores de tensiometria não variaram muito com
relação aos ensaios anteriores (dados não mostrados), sendo que o menor valor
observado foi de 45 mN/m, no tratamento 4 (Tabela 2.17).
Tabela 2.17. Valores de tensiometria utilizando planejamento P&B para Micrococcus sp. CBMAI
636.
A maioria dos compostos utilizados teve efeito positivo, destacando-se como fonte
de carbono o óleo de soja e a peptona. Sulfato de amônio e fosfato de potássio
apresentaram efeito negativo (Figura 2.9 e Tabela 2.18). Assim como ocorreu com
Tratamento Valores mN/m
1 54,7
2 57,4
3 64,3
4 45
5 51,4
6 52,2
7 57
8 54,1
9 49,4
10 52,8
11 51
12 51,3
13 48,7
14 60
15 48,9
16 71
17 50,7
18 49,9
19 50,2
86
Achromobacter, o tratamento 4 para essa linhagem foi o que apresentou menor valor de
tensão, que continha, dentre vários compostos, de óleo de soja e peptona. Das e
colaboradores (1998) relataram a capacidade de redução de tensão em algumas espécies
de Micrococcus, cultivadas na presença de diferentes hidrocarbonetos e açúcares. Os
valores variaram entre as fontes hidrofóbicas e hidrofílicas, entre 45,2 (dodecano) e 58,3
mN m-1 (octadecano), no caso dos hidrocarbonetos, e 51,4 (sacarose) e 57,5 mN m-1
(glicose), no caso dos açúcares, valores semelhantes aos observados para este
experimento. Tuleva e colaboradores (2009) relataram um tipo de biossurfactante
produzido por uma linhagem de Micrococcus luteus que foi capaz de reduzir a tensão
superficial da água de 72 a 24,1 mN m-1. Esta eficiência não foi observada para os micro-
organismos em estudo.
Figura 2.9. Efeito das variáveis que apresentaram melhor resposta no P&B para a linhagem
Micrococcus sp. CBMAI 636.
87
Tabela 2.18. Efeito de cada variável e estimativa do valor p para Micrococcus sp. CBMAI 636.
Bacillus subtilis CBMAI 707
Para Bacilus subtilis CBMAI 707, já era esperada uma maior redução nos valores de
tensão superficial, pois como já mencionado, essa linhagem possui genes relacionados à
produção de surfactina. Parte do operon relacionado com a síntese de surfactina foi
detectada na linhagem CBMAI 707 através de reação de PCR com primers específicos
(Dellagnezze, 2010). O gênero Bacillus é um dos mais bem descritos em relação à
produção de biossurfactantes (Sullivan, 2008; Mukherjee et al., 2008; Ghribi et al., 2011).
Neste ensaio, os valores de tensiometria ficaram entre 37 e 56 mN/m. Os menores valores
foram observados nos tratamentos 5 (39,4), 9 (37,8) e 11 (37,4) (Tabela 2.19).
Efeito Erro Padrão t(5) valor p
Mean/Interc 17,73333 0,825133 21,49149 0,000004
Sacarose 0,55833 1,833486 0,30452 0,772999
Hexadecano 1,15833 1,833486 0,63177 0,555294
Glicerol -0,04167 1,833486 -0,02273 0,982748
Óleo de soja 6,10833 1,833486 3,33154 0,020744
Glicose 2,10833 1,833486 1,14990 0,302195
Uréia 0,20833 1,833486 0,11363 0,913955
Sulfato -1,79167 1,833486 -0,97719 0,373353
Peptona 6,50833 1,833486 3,54971 0,016393
Ext. Levedura 0,65833 1,833486 0,35906 0,734214
K2HPO4 1,00833 1,833486 0,54995 0,606014
KH2PO4 -0,34167 1,833486 -0,18635 0,859496
NaCl 3,45833 1,833486 1,88621 0,117933
88
Tabela 2.19. Valores de tensiometria utilizando o planejamento P&B para Bacillus subtilis CBMAI
707.
Algumas variáveis tiveram efeito negativo, como sacarose, sulfato de amônio,
fosfato de potássio e cloreto de sódio (Figura 2.10). Assim como em todos os ensaios, o
óleo de soja teve o maior efeito positivo, com valor p menor que 0,1. Dentre as fontes de
nitrogênio, extrato de levedura também apresentou o maior efeito para a redução de
tensão superficial (Tabela 2.20). Os tratamentos que apresentaram menores valores de
tensão possuem, em sua composição, óleo de soja, extrato de levedura e peptona.
Ainda que a linhagem de Bacillus subtilis tenha apresentado os menores valores de
tensão superficial entre as linhagens avaliadas, linhagens da mesma espécie foram
relatadas com melhor eficiência, reduzindo a tensão da água para 29, 5 mN/m, quando
cultivadas em glicose (Joshi et al., 2011) e 26,6 mN/m quando cultivadas em resíduos de
Tratamento Valores mN/m
1 49,4
2 55,5
3 53,7
4 47,9
5 39,4
6 46,8
7 55,9
8 53,2
9 37,8
10 43,6
11 37,4
12 46
13 46,4
14 53,2
15 48,5
16 71
17 41,2
18 48
19 43,4
89
mandioca (Nitschke & Pastore, 2006). Isso pode variar de acordo com a linhagem e seus
genes, e ainda o tipo de biossurfactante produzido. Linhagens do gênero Bacillus podem
produzir até 9 tipos de isômeros da surfactina (Tang et al., 2007).
Figura 2.10. Efeito das variáveis que apresentaram melhor resposta no P&B para a linhagem
Bacillus subtilis CBMAI 707.
Tabela 2.20. Efeito de cada variável e estimativa do valor p para Bacillus subtilis CBMAI 707.
Efeito Erro Padrão t(5) valor p
Mean/Interc 23,19333 1,455779 15,93191 0,000018
Sacarose -0,60917 3,234811 -0,18832 0,858033
Hexadecano 1,91583 3,234811 0,59226 0,579446
Glicerol 3,16583 3,234811 0,97868 0,372686
Óleo de soja 7,04083 3,234811 2,17658 0,081463
Glicose 1,79083 3,234811 0,55361 0,603687
Uréia 0,41583 3,234811 0,12855 0,902725
Sulfato -1,00917 3,234811 -0,31197 0,767653
Peptona 5,91583 3,234811 1,82880 0,126963
Ext. Levedura 6,39083 3,234811 1,97564 0,105162
K2HPO4 2,49083 3,234811 0,77001 0,476081
KH2PO4 -0,50917 3,234811 -0,15740 0,881087
NaCl -0,55917 3,234811 -0,17286 0,869542
90
2.3.2. Ensaios de emulsificação (E24)
Os ensaios de emulsificação foram realizados com o sobrenadante livre de células
proveniente do planejamento experimental P&B.
Duas fontes de carbono foram utilizadas, óleo diesel e querosene, já utilizadas em
ensaios prévios (dados não mostrados). Os valores estão representados na Tabela 2.21.
Para os clones, querosene foi a única fonte de hidrocarboneto que permitiu a
formação de emulsão estável após 24 horas. É possível observar que somente no
tratamento 9 foi formada emulsão por todos os clones (Figura 2.11), assim como para a
célula hospedeira EPI 300, alcançando valores em até 25% (Tabela 2.21). Com esse
tratamento foi possível também observar grande quantidade de massa de células, quando
as mesmas foram centrifugadas para a avaliação da tensiometria. O tratamento 9 é
composto de variáveis como sacarose, óleo de soja e hexadecano como fonte de carbono
e, do mesmo modo, várias fontes de nitrogênio, como uréia, sulfato de amônio
((NH4)2SO4), peptona e extrato de levedura. Já é conhecido que todos os compostos
utilizados para o cultivo do micro-organismo funcionam como fator limitante para a
produção de biossurfactantes.
Como pode ser observado na Tabela 2.21, apesar de ocorrer a formação de emulsão
em alguns dos tratamentos (2, 9 e 13), os valores de emulsificação da E. coli EPI 300 são
inferiores aos dos clones e, geralmente, pouco significativos. Porém, nos ensaios de
tensiometria, a linhagem também apresentou redução na tensão superficial, não diferindo
dos clones (item 2.3.2). Ainda não foi determinada a natureza da produção de possíveis
compostos tensoativos pela linhagem hospedeira. No caso do tratamento 9 do ensaio de
emulsificação, a E. coli EPI 300 apresentou índice de emulsificação igual ao do clone 9E, o
que poderia ser investigado em maior detalhe futuramente a fim de comparar os possíveis
compostos tensoativos sintetizados por cada um. Entretanto, como o objetivo principal
deste trabalho é verificar a capacidade de biorremediação, seja por meio de degradação
de hidrocarbonetos e/ou pela produção de biossurfactantes, os clones de uma maneira
geral demonstraram possuir atributos para essa finalidade, como o clone 2B, que
apresentou excelente capacidade de degradação do petróleo bruto e capacidade para
91
emulsificação em querosene, o que o torna um ótimo candidato para estudos mais
detalhados e extremamente interessante para aplicação biotecnológica futura.
Tabela 2.21. Ensaio de emulsificação (E24) com clones metagenômicos utilizando querosene. Valores correspondem à média dos resultados obtidos para triplicatas.
Ensaio EPI 300 Clone 1ª Clone 2B Clone 9E Clone 10 A
2 16% _________ _________ _________ _________
4 _________ _________ _________ _________ 28%
9 25% 30% 35% 25% 31%
13 8% _________ _________ _________ _________
Deve ser ressaltado que as emulsões variaram entre os tratamentos para o mesmo
micro-organismo. No caso do clone 10 A, para o tratamento 4 foi verificada uma
“inversão” da emulsão, que se concentrou na fase aquosa (Figura 2.11).
Figura 2.11. Teste de emulsificação E24 com os clones metagenômicos utilizando querosene como fonte de hidrocarboneto. A) Clone 2B, Tratamento 9 (a e b); B) Clone 9E, controle negativo e Tratamento 9 (a e b); C) Clone 10 A, tratamentos 4 e 9, respectivamente.
Para as linhagens de bactérias foi realizado o mesmo ensaio (Figura 2.12). Na Tabela
2.22 estão representados os índices de emulsificação frente ao querosene, demonstrando
que somente em alguns tratamentos foi observada a formação de emulsão estável após
24 horas.
A B C
a) b) a) b) 4 9
92
Tabela 2.22. Ensaio de emulsificação (E24) com linhagens de bactérias utilizando querosene. Valores correspondem à média dos resultados obtidos para triplicatas.
Ensaio Dietzia sp. CBMAI 705
Bacillus subtilis CBMAI 707
A. xylosoxidans
CBMAI 709
1 45% 37%
3 _________ 25% _________
5 _________ 10% 15%
10 14% _________ 22%
11 _________ 22% _________
12 _________ 20% _________
14 _________ 14% _________
17 22% 25% 25%
18 19% 20% 22%
19 _________ 20% 18%
Figura 2.12. Teste de emulsificação E24 com as linhagens de bactérias utilizando querosene como fonte de hidrocarboneto. (A) Dietzia sp. Tratamentos 10 (b e c) e 18; (B) Achromobacter xylosoxidans, (1) Tratamento 1 (a e b); (2) Tratamentos 17, 18 e 19; (C) Bacillus subtilis; (1) Tratamento 1 (a e b); (2) Tratamentos 11 e 14; (3) Tratamentos 3 e 10, respectivamente.
B
A B
1 2 10b) 10c) 18 a) b) 17 18 19
C
1 2 3 a) b) 11 14 3 10
93
Apesar de ser mencionada a capacidade de produção de biossurfactantes por
Micrococcus na literatura (Banat et al., 2002; Tuleva et al., 2009), a linhagem avaliada não
produziu emulsão em nenhuma das fontes utilizadas (querosene e óleo diesel).
Dietzia sp. CBMAI 705 formou emulsões em um número menor de tratamentos, e
possivelmente menos estáveis (Figura 2.12 A). Existem na literatura trabalhos que
mencionam a capacidade de produção de biossurfactante desse gênero. Nakano e
colaboradores (2011) descreveram uma linhagem capaz de reduzir a tensão superficial
para 31 mN.m-1 e de emulsificar hexadecano. Do mesmo modo, é descrita a capacidade
desemulsificante desse gênero (Liu et al., 2009).
Achromobacter xylosoxidans CBMAI 709 apresentou emulsões estáveis apenas no
tratamento 1 e nos tratamentos 17, 18 e 19 (Figura 2.12 B). Bacillus subtilis CBMAI 707
apresentou formação de emulsões em um maior número de tratamentos (Figura 2.12 C).
Como já relatado, o genêro Bacillus é amplamente descrito como produtor de
biossurfactantes e com capacidade para emulsificação (Jacques et al. 1999; Mehdi & Giti,
2008; Oliveira et al., 2013).
As emulsões formadas variaram também entre os tratamentos de um mesmo micro-
organismo, assim como entre os micro-organismos. É importante ressaltar que, não houve
relação entre os tratamentos que proporcionaram uma maior redução de tensão
superficial e os tratamentos em que foi observada a formação de emulsão. Mais uma vez
é necessário mencionar que as moléculas de biossurfactantes e bioemulsificantes diferem
entre si. Na verdade, elas são divididas em dois grupos principais, as de alto peso
molecular, e as de baixo peso molecular. Essa diferença na estrutura química influencia
em sua função; biossurfactantes de alto peso molecular são descritos como
bioemulsificantes, e tem como principal característica estabilizar emulsões, aumentando a
área de superfície e disponibilizando hidrocarbonetos para degradação. Já os de baixo
peso tendem a diminuir a tensão superficial do meio, através da formação de micelas.
Acima da concentração micelar crítica (CMC), uma fração dos hidrocarbonetos
(contaminantes) se liga às micelas, aumentando assim a biodisponibilidade dos
hidrocarbonetos para a degradação pelos micro-organismos (Banat et al., 2010).
94
Para o óleo diesel, a formação de emulsão foi observada para apenas duas linhagens
(Tabela 2.23), porém com resultados não significativos.
Bacillus subtilis CBMAI 707 apresentou um melhor desempenho, formando
pequenas emulsões em mais tratamentos, porém com menores índices de emulsificação.
Apesar do óleo de soja ter o maior efeito no ensaio, o melhor valor de emulsão observado
foi de 45% em querosene, utilizando uma combinação de dois açúcares (glicose e
sacarose) como fontes de carbono e duas fontes de nitrogênio (peptona e extrato de
levedura). Pereira e colaboradores (2013) investigaram a produção de biossurfactante em
três linhagens diferentes de Bacillus subtilis e observaram valores entre 37,3 a 52,7% de
emulsificação em hexadecano quando fontes diferentes de nitrogênio e carbono foram
utilizadas.
Tabela 2.23. Ensaio de emulsificação (E24) com linhagens de bactérias utilizando óleo diesel. Valores correspondem à média dos resultados obtidos para triplicatas.
TRATAMENTO CBMAI 707 CBMAI 709
1 10%
3 8%
10 -------------------- 19%
17 20%
18 13%
19 15%
O óleo diesel é utilizado em ensaios de emulsificação (Rahman et al., 2002), mas é
um óleo mais pesado do que o querosene, o que pode dificultar sua emulsificação.
Considerando que um biossurfactante efetivo deve reduzir a tensão superficial para
30 mN/m (Ashby et al., 2008; Desai & Banat, 1997), os resultados de tensiometria e de
emulsificação obtidos para os micro-organismos em estudo não foram satisfatórios.
Ainda, a busca por rotas metabólicas (dados não mostrados) associadas à produção de
tensoativos nos clones fosmidiais não resultou na identificação de genes conhecidos
efetivamente relacionados à síntese destes compostos. No entanto, vale ressaltar que,
mesmo não alcançando valores considerados ideais, as linhagens e clones metagenômicos
95
foram capazes de reduzir a tensão superficial do meio e apresentaram formação de
emulsão, o que deve ser investigado mais profundamente em trabalhos futuros. Porém,
em função dos baixos valores observados, é provável que a degradação de
hidrocarbonetos do petróleo pelos clones se deva exclusivamente à ação de enzimas
envolvidas nas etapas de degradação de compostos alifáticos e aromáticos.
2.3.3. Imobilização dos micro-organismos em quitosana
2.3.3.1 Ensaio de resistência à quitosana e TPP
Os resultados de cromatografia (Capítulo 1) permitiram selecionar os melhores
degradadores de hidrocarbonetos para a etapa de imobilização. No entanto, um teste
preliminar de resistência a reagentes envolvendo o processo de imobilização foi realizado.
Como descrito anteriormente, 3 linhagens de bactérias (CBMAI 636, 705 e 707), o clone
2B e o consórcio de clones foram submetidos ao contato com quitosana, tripolifosfato de
sódio (TPP) e solução salina, como controle. Neste trabalho são apresentados apenas os
resultados referentes aos ensaios com as linhagens de bactérias, pois a E.coli EPI 300 já
havia sido previamente testada pelo grupo da Profa. Vânia Melo (Universidade Federal do
Ceará), apresentando resultados positivos de resistência tanto para quitosana como para
TPP.
Na tabela 2.24, são mostrados os resultados após 3 e 6 horas de contato.
Tabela 2.24. Ensaio de resistência à quitosana e TPP com as diferentes linhagens de bactérias.
Quitosana TPP Salina
3 h 6 h 3 h 6 h 3 h 6 h
Bacillus subtilis CBMAI 707 + + + + + +
Micrococcus sp. CBMAI 636 - - + + + +
Dietzia sp. CBMAI 705 - - + + + +
96
Como pode ser observado, apenas a linhagem de Bacillus resistiu ao contato com
todas as soluções. As linhagens de Micrococcus e Dietzia não resistiram à quitosana, o que
impediu de seguir com o processo de imobilização neste composto. Estes resultados
foram similares àqueles obtidos por Angelim e colaboradores (2013), onde os micro-
organismos pertencentes ao Filo Actinobacteria não resistiram ao contato com a
quitosana. A quitosana tem, naturalmente, uma função antimicrobiana, o que em
determinados casos pode dificultar o emprego da técnica de imobilização de micro-
organismos nesta matriz.
Portanto, em função dos resultados obtidos, foram realizadas 3 imobilizações: uma
contendo apenas o clone 2B, outra contendo apenas Bacillus subtilis CBMAI 707 e um
consórcio contendo os quatro clones e Bacillus subtilis CBMAI 707.
2.3.3.2 Imobilização dos micro-organismos em quitosana
Após os processos de imobilização (descrito no item 3.5), foi realizada a contagem
das células. As beads foram maceradas e suspensas em solução salina e a partir daí foi
feita uma diluição seriada. As diluições foram plaqueadas pelo método de spread plate e
após 24 horas foi feita a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC).
Para o clone 2B, a contagem inicial foi de 8,2 x 108 UFC/mL e a final foi de 2,32 x 106
UFC/mL. Para Bacillus subtilis CBMAI 707, a contagem inicial foi de 2,9 x 108 UFC/mL e a
final foi de 1,27 x 107 UFC/mL. Para o consórcio, inicialmente foram feitas 2 contagens,
uma utilizando LB + cloranfenicol e a outra NB sem cloranfenicol para a contagem das
células de Bacillus. No entanto, os bacilos cresceram muito pouco, em vista da maior
quantidade de células de E. coli, pois o pool é composto de 4 clones e 1 bacilo. Por fim, foi
considerado o número total de células, sem distinguir as células de Bacillus ou E. coli, já
que se trata de um consórcio, sendo que o intuito é avaliar a atividade dos micro-
organismos em conjunto. A contagem inicial do consórcio foi de 7,9 x 108 UFC/mL e a final
de 1,08 x 107 UFC/mL. A redução na contagem é esperada, pois o processo envolve uma
mudança drástica de pH, no gel em torno de 3, passando para 9 quando na solução de
TPP. Mesmo havendo a redução na contagem, o processo pode ser considerado bem
97
sucedido, pois a quantidade de células aprisionadas (106-107 UFC/mL) nas beads é a
quantidade também utilizada em outros trabalhos na literatura (Chen et al., 2007; Hsieh
et al., 2008).
A quitosana é um polímero obtido através de reações de desacetilação da quitina,
um polissacarídeo presente em crustáceos, como camarões e lagostas. Apresenta algumas
características vantajosas em relação a outros materiais para ser utilizada no meio
ambiente, como biodegradabilidade e disponibilidade na natureza, além de não
apresentar toxicidade (Angelim et al., 2013). A estrutura principal da quitosana é
composta de grupos amina e hidroxila. Os grupos amina possibilitam a dissolução em
ácidos fracos, como ácido acético, utilizado neste protocolo. Quando a quitosana entra em
contato com a solução de tripolifosfato de sódio (TPP), ocorre uma modificação química
na qual os radicais amina se ligam com grupos fosfato da solução de TPP, o que torna a
estrutura da quitosana reticulada, uma forma mais estável.
A etapa de lavagem das esferas é necessária, pois remove o ácido e o TPP residual,
melhorando assim as condições dos micro-organismos imobilizados. Hsieh e
colaboradores (2008) investigaram diferentes soluções para a lavagem das beads, como
água, tampão PBS e fosfato de potássio bibásico (KH2PO4), e concluíram que a solução de
fosfato de potássio foi a mais efetiva e possibilitou a formação de microporos em sua
estrutura. Poros permitem a troca de nutrientes entre os meios externo e interno das
esferas, aumentando assim a “colonização” e possível formação de biofilmes no interior
das beads. A formação dessa estrutura de superfície porosa também é explicada pelas
cargas presentes na solução de fosfato de potássio, que permitem que através da alta
força iônica da solução ocorra um desmembramento das ligações dos compostos
quitosana e TPP presentes (Figura 2.13).
98
2.4. Conclusões
Os clones metagenômicos e as linhagens de bactérias investigadas foram capazes
de reduzir a tensão superficial e produzir emulsões frente querosene, porém os valores
obtidos não foram significativos nas condições utilizadas quando comparados à literatura;
Bacillus subtillis CBMAI 707 foi a linhagem que apresentou melhores resultados
para redução da tensão superficial (37,4 mN/m) e de formação de emulsão em querosene
(45%);
As variáveis que apresentaram maior efeito, influenciando positivamente as
repostas dos ensaios de tensiometria e emulsificação foram óleo de soja e peptona, as
quais podem ser utilizadas em ensaios futuros de delineamento experimental;
2.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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102
103
___________________________________Capítulo 3
Avaliação da estratégia de imobilização microbiana para a
degradação do petróleo em microcosmos
3.1. INTRODUÇÃO
Pesquisas realizadas sobre a microbiologia de reservatórios de petróleo têm
evidenciado que a comunidade microbiana associada a este tipo de ambiente é
representada por bactérias e arquéias de distribuição geográfica bastante ampla, e que
diversos destes organismos têm potencial para transformar compostos orgânicos e
inorgânicos, atuando na interface óleo-água dos reservatórios (Coates et al., 1997; Korda
et al., 1997). Na literatura é descrita uma ampla variedade de micro-organismos que tem
sido isolada e/ou identificada a partir de reservatórios de petróleo, incluindo grupos
aeróbios (Bacillus sp., Halomonas sp., Acinetobacter sp.; Rhodococcus sp.) (Oliveira et al.,
2008; Sette et al., 2007; Orphan et al., 2000), anaeróbios facultativos (Deferribacter,
Flexistipes) (Greene et al., 1997; Silva et al. 2013), redutores de sulfato (Desulfovibrio,
Desulfobacter) (Kleikemper et al., 2002; Jing et al., 2013), metanogênicos
(Methanothermococcus, Methanocalculus sp., Methanococcus sp.) (Takai et al., 2002;
Yoshida et al., 2003; Hui et al., 2007) e fermentativos.
Entretanto, geralmente, uma só espécie de micro-organismo não é capaz de
promover a degradação completa da mistura de hidrocarbonetos, sendo necessária a
atuação de consórcios microbianos munidos de uma ampla variedade enzimática capaz de
agir sobre os compostos aromáticos (por exemplo, benzeno, tolueno, naftaleno)
(Okerentungba & Ezeronye, 2003; Kanaly & Harayama, 2000). Nesta situação, os produtos
da biotransformação de um composto podem servir como fonte de carbono e energia
para outras espécies da comunidade (Röling et al., 2003).
A estratégia de imobilização ou encapsulamento de micro-organismos pode oferecer
um melhor suporte à sobrevivência ambiental em condições de estresse, possibilitando,
104
deste modo, processos de biodegradação mais eficientes quando comparados à utilização
de células livres (Tyagi et al., 2011).
O encapsulamento controla o fluxo de nutrientes, diminui a concentração de
compostos tóxicos no microambiente das células, minimiza os danos à membrana celular
e a exposição direta aos compostos poluentes e protege da predação e competição.
Alguns materiais utilizados para imobilização incluem matrizes naturais, como alginato de
cálcio e carragena, e polímeros sintéticos, como álcool polivinílico (PVA) e triacetato de
celulose (CTA). O aprisionamento celular vem sendo estudado e aplicado principalmente
em tratamento de resíduos para a remoção de poluentes, como fenol e corantes
(Siripattanakul & Khan 2010). Neste capítulo são apresentados ensaios de degradação de
petróleo em microcosmos, avaliando-se linhagens de bactérias e clones metagenômicos
provenientes de reservatórios de petróleo imobilizadas em quitosana.
3.2. Material e Métodos
Como já descrito no Capítulo anterior, clones metagenômicos e a linhagem de
Bacillus subtilis CBMAI 707 foram previamente selecionados e imobilizados em quitosana.
A partir dessa etapa, novos ensaios de degradação em microcosmos foram realizados
utilizando os micro-organismos imobilizados.
3.2.1 Ensaios de degradação em microcosmos
Como descrito anteriormente, ensaios utilizando microcosmos com água do mar
artificial, contaminada com petróleo bruto, foram realizados com a finalidade de avaliar o
potencial de degradação de oito diferentes micro-organismos, sendo 4 linhagens de
bactérias e 4 clones metagenômicos. Como base nos resultados de degradação do
petróleo observados para cada micro-organismo (Capítulo 1), apenas a linhagem de
Achromobacter xylosoxidans não foi selecionada para a etapa de imobilização em
quitosana. Testes para observar a resistência dos micro-organismos à quitosana foram
realizados, sendo que apenas a linhagem Bacillus subtilis CBMAI 707 e os quatro clones
metagenômicos resistiram. Deste modo, três imobilizações foram realizadas: i) contendo
105
apenas o clone 2B, ii) contendo apenas Bacillus subtilis CBMAI 707 e iii) contendo um
consórcio dos quatro clones + Bacillus subtilis CBMAI 707. Os ensaios foram realizados de
duas formas: o primeiro foi realizado em água do mar artificial estéril (ASW), e o segundo
foi conduzido em água do mar natural não–estéril.
3.2.1.1 Ensaios em água do mar artificial (ASW)
Os micro-organismos imobilizados em quitosana foram avaliados em ensaios de
microcosmos utilizando água do mar artificial estéril (artificial seawater- ASW). Os ensaios
foram conduzidos em frascos Erlenmeyer, contendo 40 mL de ASW, 0,1% de extrato de
levedura e 1% de petróleo bruto, os quais foram incubados a 30° C por 21 dias. A
avaliação da degradação do petróleo e da contagem total de micro-organismos foi
realizada a cada 7 dias por 21 dias. Como controle negativo, foi utilizado ASW nas mesmas
condições, porém sem a presença dos micro-organismos. Como descrito anteriormente, o
conteúdo total dos frascos Erlenmeyer contendo os microcosmos foi submetido à
extração da fase aquosa, seguindo o protocolo descrito por Cruz et al. (2008). As amostras
foram lavadas por três vezes com 40 mL de diclorometano (CH2Cl2) em funil de separação,
descartando-se a fase aquosa e transferindo-se a fase orgânica para um novo frasco
Erlenmeyer. Posteriormente, foi adicionado sulfato de sódio anidro (Na2SO4) como agente
secante. Por fim, foi realizada a filtração em algodão e rota-evaporação das amostras para
completa evaporação do solvente. A etapa da extração das amostras foi realizada em
nosso laboratório (DRM - CPQBA/UNICAMP), e posteriormente, análises de CG-EM foram
realizadas em colaboração com a Profa. Georgiana Feitosa da Cruz, do Laboratório de
Engenharia e Exploração de Petróleo-LENEP, da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro (UENF).
3.2.1.2 Ensaios em água do mar não-estéril (SW)
Esses ensaios foram conduzidos apenas com o objetivo de observar se os micro-
organismos seriam capazes de degradar petróleo em água do mar não-estéril, sendo assim
um ensaio preliminar, comparado aos ensaios em maior escala (mesocosmos).
106
A água do mar foi coletada na praia de Beira Mar, na cidade de Fortaleza e apenas
filtrada em papel de filtro. Os frascos Erlenmeyer foram autoclavados vazios e,
posteriormente, preenchidos com 40 mL de água do mar não-estéril. Petróleo bruto (1%)
e 2 g de beads de cada tratamento foram adicionados. As avaliações foram realizadas em
7, 21 e 40 dias. De maneira similar ao experimento em ASW, o conteúdo total dos frascos
Erlenmeyer contendo os microcosmos foi submetido à extração da fase aquosa, seguindo
protocolo descrito por Cruz et al. (2008).
3.2.1.3. Análises de cromatografia para os ensaios em frascos Erlenmeyer (ASW e SW)
A extração de petróleo para a análise de cromatografia seguiu o mesmo protocolo
descrito por Cruz et al. (2008), como já mencionado no Capítulo 1.
Para os dois ensaios (ASW e SW) as condições das análises de cromatografia gasosa
CG-DIC (ou GC-FID) foram as mesmas: cromatógrafo em fase gasosa Agilent 6890N, com o
detector do tipo ionização em chama (flame ionization detector, FID) com ar sintético, H2 e
N2 como gases de chama, e com coluna capilar de sílica fundida HP-5 (30 m x 0,32 mm x
0,25 μm). A programação de temperatura utilizada foi: temperatura inicial de 40oC
mantida por 1 minuto, seguida por aquecimento a uma taxa de 6 °C /min até 310oC, e
finalmente permanecendo nesta temperatura por 19 minutos. A temperatura do injetor
foi de 290oC e do detector de 320oC. O gás de arraste utilizado foi o hélio, com injeção
sem divisão de fluxo. Foi injetado 1 µL da amostra diluída em diclorometano na
concentração de 0,02 mg/µL.
3.2.2 Ensaios de degradação em tanques
É importante ressaltar que os ensaios de microcosmos realizados em tanques (90 L),
assim os como os ensaios em escala de mesocosmos (Capítulo 4), foram realizados no
Instituto per l`Ambiente Marino Costiero (CNR-IAMC), na cidade de Messina, Itália. Além
das análises de cromatografia, outros parâmetros foram avaliados, como a contagem total
de bactérias por DAPI, descrita no item 3.3.2.2 e demanda biológica de oxigênio (DBO),
descrita no item 3.3.3.3.
107
Este ensaio teve caráter preliminar para definir, entre os sete micro-organismos
imobilizados, os mais eficientes em degradar petróleo bruto, para posteriormente serem
avaliados em ensaio de biorremediação em uma escala maior, utilizando mesocosmos
(tanques com 3000 L). Por apresentarem grande potencial para a degradação de petróleo
bruto (Capítulo 1), também foram avaliadas as linhagens Dietzia maris CBMAI 705 e
Micrococcus sp. CBMAI 636 aprisionadas em ágar (Vassileva et al., 2003), uma vez que
essas duas linhagens não resistiram ao processo de imobilização em quitosana.
Os ensaios foram conduzidos em tanques com capacidade para 90 litros,
preenchidos com 70 litros de água do mar, captada diretamente do mar de Messina
(Itália). Antes de entrar nos tanques, a água do mar foi filtrada por uma membrana de
nylon (200 lmnylon mesh), para remover metazoários e detritos maiores, e então
contaminada com 0,1 % de petróleo (10 mL) como única fonte de carbono, simulando
poluição crônica. Os micro-organismos imobilizados em esferas de quitosana (beads)
foram acondicionados dentro de “colunas”, desenvolvidas a partir de tubos “Falcon”, as
quais foram fixadas nas paredes do tanque, impedindo desse modo que as esferas
afundassem (Figura 3.1). Uma pequena bomba foi utilizada para promover a oxigenação
do sistema. A avaliação da degradação do petróleo bruto foi feita nos tempos 5, 10, 20 e
30 dias. Três ensaios foram conduzidos: i) clone 2B aprisionado em quitosana, ii) consórcio
de 4 clones + Bacillus subtilis CBMAI 707, também aprisionado em quitosana; iii) consórcio
somente com as linhagens de bactérias Bacillus subtilis CBMAI 707 + Micrococcus sp.
CBMAI 636 + Dietzia maris CBMAI 705, aprisionadas em ágar.
O experimento nos tanques foi conduzido em sistema aberto, no qual o fluxo de
entrada e saída de água do mar foi contínuo.
108
3.2.2.1 Contagem Total de micro-organismos
A contagem total de células foi realizada através da coloração utilizando DAPI (4'-6
diamidino-2-fenilindol 2 HCl, Sigma-Aldrich). Amostras de água do tanque foram coletadas
e fixadas em formaldeído (com concentração final de 4%), de acordo com Porter e Feig
(1980). As lâminas foram analisadas em microscópio de fluorescência Axioplan 2 Imaging
(Carl Zeiss, Thornwood, NY,USA). Os resultados foram expressos em números de células.
mL-1. As amostras foram coletadas e medidas nos pontos 5, 10, 20 e 30 dias.
3.2.2.2 Demanda Biológica de Oxigênio (DBO)
A Demanda Biológica de Oxigênio (DBO) foi quantificada nos ensaios em tanques
utilizando um sensor específico, na escala de 90 ppm (VELP Scientifica), seguindo as
instruções do fabricante. As amostras foram coletadas e medidas nos pontos 5, 10, 20 e
30 dias.
3.2.2.3 Análises de Cromatografia (CG -FID)
A degradação de petróleo bruto foi analisada através de análise cromatográfica de
alta resolução utilizando o Master GC Fast Gas Chromatograph System (DANI Instrument
S.p.A., Milão). A identificação dos hidrocarbonetos alifáticos foi realizada pela comparação
das respectivas áreas com os correspondentes padrões (Chem Service Inc, West Chester,
B A
Figura 3.1. A) Tanques contendo as armadilhas com as beads; B) Armadilhas feitas a partir de tubos “Falcon”.
109
PA, USA). Os hidrocarbonetos alifáticos foram calculados de acordo com as concentrações
de n-alcanos. A programação de temperatura foi: temperatura inicial de 50 °C por 4
minutos, seguido de aquecimento a uma taxa de 5°C/min até 155°C, sendo mantida esta
temperatura por 6 minutos. Uma nova rampa de aquecimento foi estabelecida, partindo
de 155°C, com taxa de aquecimento de 4°C/min, chegando a 215°C. Nova rampa numa
taxa de aquecimento de 6°C/min até 240°C, depois 8°C/min até atingir 325°C, mantido por
10 minutos e finalmente uma taxa de aquecimento de 15°C/min até atingir 350°C.
No entanto, como esse ensaio teve caráter preliminar para avaliar a capacidade dos
micro-organismos em degradar petróleo na condição mais próxima da in situ, a análise da
degradação para esse experimento foi somente baseada na relação pristano/ fitano.
3.3.Resultados e Discussão
3.3.1. Ensaios de degradação em microcosmos
3.3.1.1 Ensaios de degradação em água do mar artificial (ASW)
A distribuição dos componentes do petróleo obtidos por CG-DIC (análise whole oil
ou fingerprint) é um dos parâmetros mais usados no monitoramento da biodegradação de
hidrocarbonetos saturados, visto que estes são os primeiros compostos a serem
consumidos pelos micro-organismos. Neste ensaio, as porcentagens de degradação de
hidrocarbonetos saturados foram monitoradas ao longo de 21 dias (Figuras 2 e 3).
Do mesmo modo, foi realizada a contagem de UFC através do método de spread
plate em todos os pontos de amostragem (7, 14 e 21 dias), o que demonstrou um
aumento de células no 14o dia do experimento, mantendo-se constante ao final de 21
dias.
Duas imobilizações em quitosana foram realizadas nessa primeira etapa de
avaliação: i) contendo apenas o clone 2B; ii) um consórcio contendo os quatro clones
metagenômicos + Bacillus subtilis CBMAI 707.
A Figura 3.2 mostra as taxas de degradação dos hidrocarbonetos saturados pelo
consórcio de clones + Bacillus subtilis CBMAI 707.
110
Como já descrito, o petróleo e seus derivados são misturas complexas constituídas
de milhares de compostos usualmente agrupados em 4 frações: i) alifáticos, ii) aromáticos,
iii) resinas, que são compostos polares com heteroátomos e estrutura mais simples que os
asfaltenos; e iv) asfaltenos, que são compostos ricos em heteroátomos com alta
aromaticidade, mais polares e com estrutura mais complexa que as resinas.
Hidrocarbonetos alifáticos consistem em n- alcanos, alcanos ramificados e alcanos cíclicos
(naftenos). A susceptibilidade dos hidrocarbonetos ao ataque microbiano ocorre na
seguinte ordem: n-alcanos- isoalcanos- aromáticos de baixo peso molecular- naftenos
(Gojgic-Cvijovic et al., 2012).
Os resultados da cromatografia mostraram que a maior degradação dos
hidrocarbonetos saturados se deu ao final de 21 dias, sendo que para a maioria dos
compostos a degradação foi em torno de 100%, com exceção dos isoprenóides pristano e
fitano, utilizados como biomarcadores para se avaliar a biodegradação.
Para o clone 2B, as taxas de degradação estão mostradas no gráfico abaixo (Figura
3.3).
Figura 3.2: Porcentagens de degradação de hidrocarbonetos saturados do petróleo avaliadas em água do mar artificial contendo consórcio de clones + Bacillus subtilis CBMAI 707 durante 21 dias
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pool 7D pool 14D pool 21D
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Comparado ao consórcio (Figura 3.2), as porcentagens de degradação apresentadas
pelo clone 2B foram menores. Os hidrocarbonetos (leves e pesados) tiveram degradação
similar (em torno de 55% em 14 dias; em torno de 60% em 7 dias e entre 65 e 80% em 21
dias). No entanto, as porcentagens de degradação foram maiores no tratamento em que
se utilizou o consórcio com clones e Bacillus, atingindo em torno de 100% ao final de 21
dias, para quase todos os compostos. Trabalhos que utilizam consórcios de micro-
organismos já são relatados na literatura como sendo mais eficientes que linhagens
isoladas (Sathishkumar et al., 2008; Rahman et al., 2002).
Como mencionado anteriormente, os clones metagenômicos avaliados nesse
trabalho possuem vetor do tipo fosmídeo com insertos em torno de 40 kb. O clone 2B foi
caracterizado geneticamente no trabalho de Sierra-Garcia e colaboradores (2014), que
demonstrou a presença de vias metabólicas relacionadas com degradação de aromáticos,
o que talvez possa explicar uma menor eficiência na degradação dos hidrocarbonetos
mais simples.
3.3.1.2. Ensaios de degradação em água do mar não -estéril (SW)
Como já descrito, este ensaio teve caráter preliminar, com o intuito de verificar se os
micro-organismos em estudo conseguiriam sobreviver e promover a degradação do
petróleo em uma situação de competição com outros micro-organismos presentes na
Figura 3.3: Porcentagens de degradação de hidrocarbonetos saturados do petróleo
avaliadas em água do mar artificial contendo clone metagenômico 2B durante 21 dias.
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2B 7D 2B 14D 2B 21D
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água do mar. Os mesmos tratamentos foram utilizados (as mesmas duas imobilizações
avaliadas previamente em água do mar artificial), porém com um tratamento a mais, a
linhagem de Bacillus subtilis CBMAI 707 imobilizada isoladamente em quitosana.
A Figura 3.4 mostra as porcentagens de biodegradação dos compostos presentes na
amostra de petróleo comparadas ao controle, água do mar não-estéril e petróleo, (0% de
degradação), utilizando Bacillus subtilis CBMAI 707, sendo possível observar que ao fim do
experimento (40 dias) quase todos os compostos saturados foram degradados, com
menor índice de degradação os isoprenóides pristano e fitano.
Essa alta porcentagem de degradação pode ser explicada pela presença da
microbiota presente na água do mar, uma vez que nesse experimento foi utilizada água
não-estéril. A presença de petróleo pode ter selecionado bactérias degradadoras
presentes na água, aumentando seu número. Bactérias marinhas degradadoras de
hidrocarbonetos são amplamente relatadas na literatura (Yakimov et al, 2007; Head et al.,
2006), sendo que podem se sobressair em número quando em contato com uma fonte de
hidrocarboneto. A ação degradadora das bactérias autóctones da água do mar em
conjunto com a da linhagem CBMAI 707 pode ter levado ao consumo maior dos
compostos presentes no petróleo. A espécie Bacillus subtilis já é descrita em trabalhos
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Controle SW 707 7D SW 707 21D SW 707 40D
Figura 3.4. Porcentagens de degradação de hidrocarbonetos saturados do petróleo avaliadas em
água do mar artificial contendo linhagem de Bacillus subtilis CBMAI 707 durante 40 dias.
113
que enfocam a produção de biossurfactantes (Mulligan, 2005; Banat et al., 2010;
Vasconcelos et al., 2011) e também a degradação de hidrocarbonetos (Das e Mukherjee,
2007; Das e Chandran, 2011). No trabalho de Dellagnezze e colaboradores (2014) foi
constatado que essa linhagem possui o gene alkB, relacionado à degradação de alcanos.
A Figura 3.5 mostra as porcentagens de degradação ao longo de 40 dias no
experimento em microcosmos contendo o clone 2B imobilizado em quitosana,
isoladamente.
Foi possível observar que as porcentagens de degradação para alguns compostos
atingiram 100% ao final de 40 dias, não sendo totalmente degradados os hidrocarbonetos
mais pesados, ficando entre 60 e 80% de degradação. Em um trabalho anterior do grupo,
esse clone foi descrito contendo vias para degradação de compostos saturados, como
hexadecano, e aromáticos, como fenantreno e naftaleno, apresentando alta eficiência na
degradação de hexadecano (70%) e fenantreno (44%) (Vasconcellos et al 2010; Sierra-
Garcia et al., 2013).
Similarmente aos resultados observados para Bacillus subtilis CBMAI 707, quase
todos os compostos saturados presentes no petróleo foram degradados ao final de 40
dias no microcosmo contendo o consórcio de 4 clones mais a linhagem de Bacillus subtilis
CBMAI 707 (Figura 3.6).
Figura 3.5: Porcentagens de degradação de hidrocarbonetos saturados do petróleo avaliadas em água do mar artificial contendo o clone metagenômico 2B aprisionado em quitosana durante 40 dias.
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Controle Sw 2B 7D SW 2B 21D SW 2B 40D
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Os hidrocarbonetos considerados leves são os primeiros a serem degradados pelos
micro-organismos (Van Hamme et al., 2003), o que explica a alta porcentagens de
degradação destes compostos ao final de 40 dias, observada para o consórcio (pool),
assim como para o clone 2B e para a linhagem CBMAI 707 de Bacillus subtilis.
Como já mencionado, na natureza a degradação de compostos é realizada mais
efetivamente através da ação de consórcios microbianos (Head et al., 2007) e, na
literatura, trabalhos sobre biorremediação mencionam a utilização de consórcios
microbianos (Cerqueira et al, 2011; Owsianiak et al., 2009). No entanto, em vista dos
resultados observados nesse experimento, quando comparados ao experimento
utilizando micro-organismos isolados (como a linhagem de Bacillus aprisionada
isoladamente), ao final de 40 dias, a quantidade de compostos remanescentes no
tratamento empregando o consórcio, foi maior.
Mesmo com pouca diferença, nesse experimento, foram observadas maiores
porcentagens de degradação do petróleo, com a maioria dos compostos alcançando
100%, no tratamento utilizando a linhagem Bacillus subtilis CBMAI 707. Uma hipótese
para explicar essa eficiência na degradação é que pode ter ocorrido a produção de
biossurfactantes pela mesma linhagem, uma vez que ela é sabidamente produtora de
surfactina. Já é conhecido que biossurfactantes aumentam a biodisponibilidade dos
Figura 3.6: Porcentagens de degradação de hidrocarbonetos saturados do petróleo avaliadas em água do
mar artificial contendo consórcio com 4 clones metagenômicos + Bacillus subtilis CBMAI 707 durante 40 dias
0
20
40
60
80
100
nC
13
nC
14
nC
15
nC
16
nC
17 Pr
nC
18
Ph
nC
19
nC
20
nC
21
nC
22
nC
23
nC
24
nC
25
nC
26
nC
27
nC
28
nC
29
nC
30
nC
31
nC
32
nC
33
nC
34
nC
35
nC
36
% B
iod
egra
daç
ão
Controle SW Pool 7D SW Pool 21D SW Pool 40D
115
hidrocarbonetos, consequentemente aumentam o acesso dessa fonte de carbono para a
degradação (Calvo et al., 2009). Este fato pode ter aumentado a degradação do petróleo
tanto pela linhagem de Bacillus como pelas bactérias hidrocarbonoclásticas presentes na
água do mar, ao final de 40 dias. Um outro fator que pode ter contribuído para as maiores
porcentagens de degradação observadas para o Bacillus subtilis CBMAI 707 isoladamente
é a quantidade de bactérias aprisionadas utilizadas. Todas as imobilizações (clone 2B,
Bacillus subtilis e consórcio clones + Bacillus subtilis) apresentaram em torno de 106 UFC/
g bead. Porém, no consórcio, essa quantidade era dividida entre os 5 micro-organismos
(quatro clones e Bacillus), ao contrário da cultura aprisionada isoladamente.
3.3.2. Ensaios de degradação em tanques
Como já descrito anteriormente, para esse ensaio, três condições foram testadas: i)
clone 2B imobilizado em quitosana; ii) consórcio de quatro clones metagenômicos +
Bacillus subtilis CBMAI 707 imobilizados em quitosana, denominado pool Q; iii) consórcio
apenas de linhagens de bactérias (Dietzia maris + Micrococcus sp. + Bacillus subtilis),
denominado pool A; e o controle, contendo apenas água do mar + petróleo.
3.3.2.1. Avaliação da degradação por Cromatografia (CG -FID)
Como já descrito anteriormente, esse experimento teve caráter preliminar no
sentido de avaliar a capacidade de degradação dos micro-organismos na situação mais
próxima da in situ. Para avaliar a degradação foi empregada a relação pristano/fitano. Foi
aplicada a seguinte fórmula de relação entre pristano e fitano, a saber: (C17/Pr+C18/Ph)/2
(Marty, 1994). Esse valor diminui conforme a biodegradação aumenta.
A Tabela 1 mostra os valores obtidos através de cromatografia ao final de 30 dias de
avaliação.
Tabela 3.1. Valores da relação pristano/fitano para avaliação da degradação do petróleo bruto em 30 dias.
Controle Consórcio linhagens (em ágar)
Consórcio clones + Bacillus (em quitosana)
Clone 2B
2,832886 1,025998 0,760344 1,151429
116
Os resultados demonstraram que o tratamento que apresentou o menor valor foi
aquele contendo o consórcio constituído de quatro clones metagenômicos + Bacillus
subtillis CBMAI 707. Isso pode ser explicado pela robustez das próprias linhagens (E. coli e
Bacillus) em suportar condições mais adversas. A água permaneceu em torno de 17°C, a
oxigenação não foi tão intensa como observada nos experimentos anteriores (realizados
em frascos Erlenmeyer). Essas bactérias comparadas, por exemplo, com Dietzia maris
CBMAI 705, apresentaram tempo de geração mais rápido (dados não mostrados), o que
pode ter contribuído para que se sobressaíssem e conseguissem um melhor desempenho
da degradação do petróleo bruto, mesmo que em competição com a microbiota indígena.
A quantidade adicionada de petróleo (0,01%), simulando a quantidade em situações de
poluição crônica, foi menor do que nos experimentos anteriores (1%), e mesmo assim,
esse consórcio foi capaz de degradar mais eficientemente o petróleo presente na água.
Desse modo, o mesmo foi selecionado para ser avaliado em ensaios em maior escala,
mesocosmos contendo 3000 L de água do mar.
3.3.2.2.Contagem total de bactérias
A contagem total de células foi realizada através da coloração utilizando DAPI (4'-6
diamidino-2-fenilindol 2 HCl, Sigma-Aldrich). O número de células foi expresso em células.
mL -1 e está mostrado na Figura 3.7.
Foram observadas flutuações no número de células em todos os ensaios. O Pool Q e
o clone 2B atingiram um número maior de células no dia 10 (na escala de 106), enquanto
que o pool A no dia 20. Já o controle se manteve constante, atingindo um número maior
de células no dia 30. A quantidade superior de células observadas ao longo de 30 dias para
os ensaios contendo os consórcios e o clone isolado já era esperada, e deve–se
justamente à adição destes micro-organismos na comunidade microbiana presente na
água do mar. A quantidade de células nos pools A e Q, assim como no ensaio com o clone
2B, foi na ordem de 105 células por grama de beads (no tempo 0). Já os picos na
quantidade de células, observados principalmente nos ensaios que continham os clones
metagenômicos (pool Q e 2B) após 10 dias, quando comparado ao controle, poderiam ser
explicados pelo rompimento das beads de quitosana.
117
Figura 3.7. Quantidade de células observadas nos três ensaios e no controle nos dias 5, 10, 20 e 30
utilizando coloração com DAPI.
Foram observadas flutuações no número de células em todos os ensaios. O Pool Q e
o clone 2B atingiram um número maior de células no dia 10 (na escala de 106), enquanto
que o pool A no dia 20. Já o controle se manteve constante, atingindo um número maior
de células no dia 30. A quantidade superior de células observadas ao longo de 30 dias para
os ensaios contendo os consórcios e o clone isolado já era esperada, e deve–se
justamente à adição destes micro-organismos na comunidade microbiana presente na
água do mar. A quantidade de células nos pools A e Q, assim como no ensaio com o clone
2B, foi na ordem de 105 células por grama de beads (no tempo 0). Já os picos na
quantidade de células, observados principalmente nos ensaios que continham os clones
metagenômicos (pool Q e 2B) após 10 dias, quando comparado ao controle, poderiam ser
explicados pelo rompimento das beads de quitosana.
Angelim e colaboradores (2013) observaram em solo contaminado, que a partir do
12° dia as beads se romperam, causando a liberação de uma quantidade bem maior no
meio externo. O mesmo fato pode ter ocorrido nos ensaios em água do mar, pois além da
grande quantidade de células observada no 10° dia de avaliação, ao final do experimento
as beads não se encontravam mais íntegras como no início. As beads de quitosana, assim
como as de ágar, possuem poros que permitem a troca de nutrientes entre os meios
interno e externo, assim como a saída dos micro-organismos (Hsieh et al., 2008). No
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
5 10 20 30
log
cell.
ml-
1
Tempo (dias)
controle
Pool Q
Pool A
clone 2B
118
entanto, dependendo da matriz na qual é realizada o processo de imobilização, podem
ocorrer algumas variações na dimensão dos poros. Isto poderia explicar uma liberação
mais lenta das células do pool A na água do mar, assim como características das próprias
linhagens em se aclimatarem às condições presentes.
É importante ressaltar que no experimento de microcosmos em tanques de 90 L, as
condições foram completamente distintas das previamente avaliadas. A média da
temperatura ficou em torno de 17°C, não sendo a temperatura ideal de crescimento para
nenhuma das linhagens e clones. Além disso, houve a presença da microbiota indígena, o
que criou um ambiente de competição por recursos.
Na literatura já é descrito que a comunidade marinha autóctone, frente a um
composto considerado tóxico, como o petróleo bruto, pode ser modificada de maneira
que os micro-organismos com maior capacidade de degradação dos hidrocarbonetos se
sobressaem em relação aos outros micro-organismos (Eun-Hee Lee et al., 2010; Capello et
al., 2006). Esse fato foi observado em alguns trabalhos a partir do 15o dia (Capello et al.,
2007), o que poderia explicar o aumento do número total de bactérias no tempo 20 dias
para o controle, o qual contém apenas a microbiota autóctone e petróleo.
O teste em água do mar não estéril é de grande importância, pois em princípio,
processos de biorremediação necessitam ser implementados em um ambiente não estéril
e natural, no qual a capacidade de degradação de compostos xenobióticos deverá se
expressar frente aos fatores abióticos e bióticos (Pandey et al., 2008).
3.3.3.3. Demanda Biológica de Oxigênio (DBO)
A demanda biológica de oxigênio também foi avaliada durante o experimento. Os
resultados foram expressos em ppm de oxigênio (Figura 3.8).
A demanda biológica de oxigênio é a quantidade de oxigênio consumida pelos
micro-organismos para a degradação de algum composto orgânico. É um parâmetro
utilizado principalmente em estudos aplicados envolvendo tratamento de efluentes, assim
como estudos em ecologia (Schindler et al., 2008) e de degradação de poluentes (Mazzeo
et al., 2010). Do mesmo modo, a DBO pode estar relacionada com a quantidade de
119
matéria orgânica, sendo que quando há uma maior concentração de matéria orgânica, a
demanda biológica também aumenta (Hassanshahian et al., 2014).
Figura 3.8. Valores da DBO (em ppm) observada nos três ensaios e no controle nos dias 5, 10, 20 e
30.
Com exceção do controle, foi observado um pico da DBO no tempo 10, o que pode
estar relacionado com a maior quantidade de bactérias presentes no mesmo tempo
avaliado, em todos os tratamentos. O controle apresentou um aumento constante da DBO
a partir do 10º dia, o que é compatível com o aumento da biomassa ao longo de 30 dias.
3.4 CONCLUSÕES
Os micro-organismos aprisionados em quitosana foram capazes de degradar os
hidrocarbonetos saturados presentes no petróleo bruto em todos os ensaios
apresentados.
No ensaio realizado em tanques de 90 L em água de mar não-estéril, as
porcentagens de degradação foram mensuradas se baseando apenas na relação entre
pristano/fitano, o que permitiu a seleção do consórcio com quatro clones metagenômicos
e a linhagem de Bacillus subtilis para estudo em mesocosmos;
A combinação entre os clones fosmidiais com capacidade de degradação de
hidrocarbonetos e a linhagem de Bacillus subtilis, produtora de biossurfactante e também
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
5 10 20 30
pp
m O
2.L
-1
Tempo (dias)
controle
pool Q
Pool A
clone 2B
120
degradadora de hidrocarbonetos, mostrou excelentes resultados de degradação de
hidrocarbonetos, tornando essa estratégia promissora para aplicação tecnológica.
Os resultados foram considerados inéditos e muito bons, uma vez que deve ser
levado em conta que, no caso dos clones metagenômicos, trata-se de um sistema de
expressão heteróloga.
3.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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123
__________________________ CAPÍTULO 4
Avaliação da estratégia de bioaumento utilizando micro-
organismos imobilizados para biorremediação de petróleo em
mesocosmos
4.1. INTRODUÇÃO
Bioaumentação consiste na adição (aumentação) de micro-organismos
especializados, capazes de crescer em condições específicas, com o intuito de
desempenhar uma função remediadora em ambientes poluídos, possibilitando dessa
forma melhorar e aumentar a biodegradação de compostos recalcitrantes (Silva & Alvarez,
2010). A utilização de micro-organismos encapsulados ou imobilizados em matrizes é uma
estratégia para aumentar o desempenho de micro-organismos alóctones em um
determinado ambiente, pois favorece a proteção dos mesmos em condições de estresse
(Siripattanakul & Khan, 2010).
A avaliação de micro-organismos em estudos de biorremediação empregando
ambientes não-estéreis e em condições mais próximas às naturais, é de absoluta
importância, pois permite verificar a capacidade de degradação de compostos
xenobióticos frente aos fatores abióticos e bióticos (Pandey et al, 2009). Os mesocosmos
representam a extensão de estudos que utilizam o método de microcosmos, oferecendo
maior amplitude de escala e permitindo a incorporação e a avaliação de parâmetros que
envolvem complexidade ecológica melhor do que pode ser observado em microcosmos. A
vantagem de se utilizar mesocosmos implica no controle de uma maior quantidade de
variáveis (química, física ou parâmetros biológicos), além de possibilitar o controle da
interação dessas variáveis em diferentes regiões de espaço e tempo com grande
capacidade de replicação e reprodutibilidade comparados àqueles realizados em
ecossistemas naturais (Capello & Yakimov, 2010).
A utilização de micro-organismos geneticamente modificados (OGM) já vem sendo
estudada desde o começo da década de 90 (Brokamp & Schmidt, 1991; Fulthorpe &
124
Wyndham, 1991). Exemplos do uso de OGM em estudos de biodegradação de compostos
poluentes incluem a degradação de 2,4-D (Dejonghe et al., 2000), fenol (Watanabe et al.,
2002), tolueno, clorobenzeno, indol, e transformação de mercúrio em forma menos tóxica
(Lange et al., 1998). Alguns tipos de micro-organismos são frequentemente
disponibilizados comercialmente e podem ser adquiridos através de empresas. No
entanto, se por um lado os OGM’s têm sido amplamente utilizados em estudos em escala
de laboratório (Moza, 2005), por outro sua robustez e impactos associados ao ciclo de
vida de longo prazo ainda precisam ser avaliados, o que pode incluir a transferência de
genes entre espécies exógenas, afetando potencialmente a biodiversidade e estrutura de
comunidades biológicas. Essa questão dá origem a muita especulação e polarização sobre
as consequências da manipulação genética in vitro, o que representa uma barreira política
significativa para a utilização de OGM na biorremediação (Silva & Alvarez, 2010).
Neste Capítulo está descrita a etapa do trabalho na qual foi avaliado o potencial de
um consórcio contendo 4 clones metagenômicos + Bacillus subtilis CBMAI 707
encapsulado em quitosana para degradação de petróleo bruto em água do mar em ensaio
de mesocosmos durante 30 dias.
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1 Ensaios em mesocosmos
Os ensaios em escala de mesocosmos foram realizados no Istituto per l'Ambiente
Marino Costiero/ Centro Nazionale delle Richerce (IAMC-CNR), na cidade de Messina,
Itália. Os ensaios foram realizados em tanques com capacidade para 3000 L. Água do mar
natural foi captada diretamente do mar, e filtrada por macrofiltração para eliminação de
detritos e metazoários. Foram adicionados 250 g de beads de quitosana contendo os
micro-organismos imobilizados, acondicionadas em colunas fixadas nas paredes do tanque
(Figura 4.1), e 50 mL de petróleo, simulando condição de poluição crônica. Como controle
foi utilizado apenas água do mar e petróleo nas mesmas condições descritas. Com base
nos resultados de cromatografia obtidos dos ensaios em tanques de 90 L, o consórcio
contendo 4 clones metagenômicos + Bacillus subtilis CBMAI 707, denominado pool Q, foi
125
selecionado para a avaliação em escala de mesocosmos. O experimento em mesocosmos
foi conduzido em sistema aberto, no qual o fluxo de entrada e saída de água do mar foi
contínuo. A avaliação foi realizada nos tempos 0, 5, 10, 20 e 30 dias.
Figura 4.1. Ensaios em mesocosmos. Tanque com capacidade para 3000 L de água. As setas vermelhas indicam as armadilhas contendo as beads, fixadas nas paredes do tanque.
4.2.2. Contagem total de micro-organismos
A contagem total de células foi realizada através da coloração utilizando DAPI (4'-6
diamidino-2-fenilindol 2HCl, Sigma-Aldrich). Amostras foram coletadas nos dias 0, 5, 10,
20 e 30 e fixadas em formaldeído (com concentração final de 4%), de acordo com Porter &
Feig (1980). As lâminas foram analisadas em microscópio de fluorescência Axioplan 2
Imaging (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA). Os resultados foram expressos em números de
células. mL-1.
4.2.3. Demanda Biológica de Oxigênio (DBO)
A Demanda Biológica de Oxigênio (DBO) foi quantificada nos ensaios de
mesocosmos utilizando um sensor específico, na escala de 90 ppm (VELP Scientifica),
seguindo as instruções do fabricante. As amostras foram coletadas e avaliadas nos dias 0,
5, 10, 20 e 30.
126
4.2.4. Contagem dos micro-organismos heterotróficos
Alíquotas de água do mar previamente contaminada om petróleo foram coletadas e
diluídas para 10 -1, 10 -3 e 10 -5 em meio ONR7a (Dyksterhouse et al., 1995) adicionado
com 100 µL de petróleo bruto, a fim de selecionar o crescimento de possíveis micro-
organismos degradadores e /ou resistentes à presença de petróleo. As diluições foram
plaqueadas pelo método de spread plate e incubadas por 5 dias em temperatura
ambiente (aproximadamente 23°C). Após esse período foi realizada a contagem das
unidades formadoras de colônia (UFC).
4.2.5. Análises de cromatografia gasosa (CG- FID)
O mesmo procedimento para as análises de cromatografia gasosa de alta resolução
(CG-FID) foi utilizado para os ensaios em tanques de 90 L (microcosmos) e de 3000 L
(mesocosmos). Foram coletadas alíquotas de 1 L de água do mar contaminada com
petróleo, diretamente dos tanques. As amostras foram lavadas três vezes com
diclorometano (CH2Cl2) (10% v/v) em funil de separação, descartando-se a fase aquosa e
transferindo-se a fase orgânica a um frasco Erlenmeyer. Posteriormente, foi adicionado
sulfato de sódio anidro (Na2SO4) como agente secante a fim de remover a água residual.
Por fim, foi realizada filtração em algodão, e seguiu-se à rota-evaporação das amostras
para completa evaporação do solvente. Posteriormente, seguiu-se a análise
cromatográfica de alta resolução Master GC Fast Gas Chromatograph System (DANI
Instrument S.p.A., Milan). A identificação dos hidrocarbonetos alifáticos foi realizada pela
comparação das respectivas áreas com os correspondentes padrões (Chem Service Inc,
West Chester, PA, USA). Os hidrocarbonetos alifáticos foram calculados de acordo com as
concentrações de n-alcanos. As concentrações individuais de cada alcano de n-C10 a n-
C28, pristano (Pr) e fitano, e n-alcanos totais foram calculadas para cada amostra.
Petróleo Árabe Leve (0,03%) foi utilizado como substrato nos mesocosmos.
A degradação dos hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos foi expressa como
porcentagem em relação às frações remanescentes no controle (tempo 0). A eficiência de
127
degradação baseada na diminuição da concentração de hidrocarbonetos foi calculada
usando a fórmula descrita por Hassanshahian et al. (2013):
100 – (As*100/Aac)
Onde As equivale à área do pico em cada amostra e Aac equivale à área do pico no
controle correspondente.
4.2.6. Análise de Escalonamento Multidimensional não–métrico (nMDS)
As análises estatísticas foram realizadas através do método de Escalonamento
Multidimensional não–métrico (nMDS), utilizando o software PAleontological STatistics
(PAST) versão 1.32, baseando-se nos valores de cromatografia gasosa.
4.2.7. Sequenciamento das amostras de DNA dos mesocosmos
Alíquotas de 400 mL foram coletadas diretamente dos sistemas de mesocosmos nos
diferentes tempos de amostragem e submetidas à extração de DNA metagenômico
segundo protocolo descrito por Chomsczynski & Saki, 1987. Amostras de DNA da
microbiota presente no controle e no ensaio de bioaumento foram submetidas ao
sequenciamento em larga escala de um fragmento do gene RNA ribossomal 16S para
avaliação da diversidade microbiana. O sequenciamento das amostras e o processamento
dos dados foram realizados pela empresa MR DNA (www.mrdnalab.com, Shallowater, TX,
USA) utilizando a plataforma MiSeq (Illumina), seguindo instruções do fabricante.
Os primers 515/806, com “barcode” no primer foward, foram utilizados em reação
de PCR para a amplificação da região variável V4 do gene RNAr 16S. As reações foram
realizadas através de kit comercial HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA) nas
seguintes condições: 94°C por 3 minutos, seguido por 28 ciclos de 94°C por 30 segundos,
53°C por 40 segundos e 72°C por 1 minuto, com uma etapa final de extensão a 72°C por 5
minutos. Após a amplificação, os amplicons foram observados em gel de agarose 2% para
determinação da intensidade das bandas. Para o sequenciamento as amostras de DNA
foram misturadas em proporções similares. As amostras em pool foram purificadas
128
utilizando esferas Ampure XP previamente calibradas. A partir do produto purificado, as
bibliotecas de DNA foram preparadas seguindo o protocolo Illumina TruSeq DNA.
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1. Contagem total de micro-organismos
Similarmente ao experimento em tanque de 90 L previamente descrito, também
foram observadas flutuações nas quantidades de células ao longo do ensaio em
mesocosmo, sendo observada quantidade maior de células do pool Q no dia 10, enquanto
que o controle apresentou uma quantidade maior no dia 20 (Figura 4.2).
Figura 4.2. Quantidade de células observadas para o consórcio (pool Q), linha representada com quadadros, e no controle(linha representada com losangos) nos dias 5, 10, 20 e 30 utilizando DAPI.
O tanque permaneceu aberto durante o período de avaliação, sendo que o fluxo de
entrada e saída de água foi contínuo. No entanto, nos primeiros 5 dias de incubação (do
tempo 0 ao 5) o sistema permaneceu fechado, a fim de promover uma aclimatação dos
micro-organismos imobilizados inseridos no tanque. Assim, do mesmo modo como
observado no experimento realizado em tanques de 90 L, esse fato pode ter contribuído
para uma maior quantidade de células no tempo de 10 dias. Além desse fator, pode ter
ocorrido também o rompimento das esferas, causando a liberação de uma quantidade
maior de micro-organismos no meio externo. Como já mencionado, esse fato foi
observado por Angelim e colaboradores (2013). As esferas podem se romper no caso de
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
0 5 10 20 30
log
cell
ml-
1
Tempo (dias)
CONTROLE POOL Q
129
degradação da quitosana através da ação de quitosanase (Hsieh et al., 2008). Foi
observado que ao fim deste experimento, as esferas de quitosana não se encontravam
íntegras, o que difere da observação realizada nos experimentos com as esferas de
quitosana em frascos Erlenmeyer.
4.3.2. Contagem dos micro-organismos heterotróficos
Do mesmo modo como observado para a contagem total de micro-organismos
através de DAPI, houve um pico na quantidade de células no tempo 10 dias (Figura 4.3).
Neste ensaio foram selecionadas bactérias que suportaram crescer na presença de
petróleo bruto, sugerindo se tratar de possíveis bactérias degradadoras.
Figura 4.3. Quantidade de bactérias heterotróficas observadas no consórcio (pool Q), linha
representada com quadadros, e no controle (linha representada com losangos) nos dias 5, 10, 20 e
30.
É interessante ressaltar que o mesmo perfil observado nos microcosmos se repetiu
nos experimentos em mesocosmos, com um aumento no número de células,
possivelmente em função do rompimento das esferas entre os dias 5 e 10 decaindo após
esse período. Também pode ter ocorrido um aumento na própria população autóctone da
água do mar.
Quanto ao controle, foi observado um aumento no número de células a partir do dia
20. Já é descrito que frente à contaminação com petróleo em um determinado ambiente,
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
0 5 10 20 30
log
cell
ml-
1
Tempo (dias)
CONTROLE POOL Q
130
ocorre uma alteração na microbiota indígena, situação em que bactérias
hidrocarbonoclásticas podem se sobressair em relação às outras (Rolling et al., 2004;
Kostka et al., 2011; Hazen et al, 2010). Geralmente, isto pode ser observado a partir de 15
dias (Capello et al, 2007). Entretanto, quando se trabalha com amostras ambientais, sabe-
se que apenas uma fração de 1% a 10% dos micro-organismos pode ser cultivada (Amann
et al., 1995), o que poderia explicar a diferença da quantidade de bactérias avaliada com
DAPI e a contagem de micro-organismos heterotróficos.
4.3.3. Demanda Biológica de Oxigênio (DBO)
Em paralelo, para avaliar a biodegradação, o consumo de O2 foi mensurado durante
os quatro pontos de amostragem. Baseado no consumo de oxigênio é possível inferir a
degradação da matéria orgânica pelos micro-organismos (Mazzeo et al, 2010).
Para o consórcio contendo os clones e linhagem de Bacillus, um aumento no
consumo de oxigênio (DBO) foi observado no dia 10, o que pode estar associado à
quantidade maior de biomassa observada tanto nas análises através da contagem total,
como através da contagem dos micro-organismos heterotróficos (Figura 4.4). Para o
controle, contendo apenas a microbiota autóctone e petróleo, apesar de não ser
observado um aumento na biomassa no tempo 10, foi observado um pico da DBO,
indicando que, mesmo em quantidade menor de biomassa, a atividade degradadora pode
ter atingido o seu máximo nesse ponto.
Figura 4.4. Valores de DBO (em ppm) observados para o pool Q e para o controle nos dias
5, 10, 20 e 30.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 20 30
pp
m.O
2. L
-1
Tempo (dias)
CONTROLE
POOL Q
131
4.3.4. Degradação dos hidrocarbonetos saturados
A degradação do petróleo bruto foi avaliada em 0, 5, 10, 20 e 30 dias. A
concentração dos componentes foi normalizada e os valores obtidos foram mensurados.
Pode-se observar que as taxas de degradação aumentaram a partir do décimo dia. A
concentração obtida para cada componente na amostra inicial (tempo 0) foi definida
como 100% e as porcentagens referentes aos n-alcanos totais, correspondentes aos
diferentes períodos de avaliação, estão representadas na figura 4.5.
Como já mencionado, o sistema permaneceu fechado para aclimatação das
bactérias utilizadas como bioaumento, permitindo deste modo um aumento na biomassa.
Porém, aos 5 dias não foi observada degradação da maioria dos compostos do petróleo.
Em estudos envolvendo degradação aeróbia de hidrocarbonetos em microcosmos, os
ensaios são avaliados por vários dias (Mazzeo et al., 2010) ou por meses (da Cruz et al.,
2010) para se observar a degradação. No entanto, a degradação em mesocosmos pode
ocorrer a partir do quinto dia. Hassanshahian e colaboradores (2014) descreveram um
trabalho em mesocosmos utilizando bioestimulação e bioaumento, com monitoramento
através de PCR em tempo real (PCRq), onde observaram que a partir do 5º dia ocorreu um
0
20
40
60
80
100
0 5 10 20 30
% b
iod
egr
adaç
ão
Tempo
controle
pool
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C1
0
C1
1
C1
2
C1
3
C1
4
C1
5
C1
6
C1
7
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stan
e
C1
8
Ph
ytan
e
C1
9
C2
0
C2
1
C2
2
C2
3
C2
4
C2
5
C2
6
C2
7
C2
8
C2
9
C3
0
C3
1
C3
2
C3
3
C3
4
C3
5
C3
6
C3
7
% B
iod
egrd
ação
10 dias
controle pool Q
Figura 4.5.Porcentagens de degradação de hidrocarbonetos saturados totais observadas para o consórcio contendo clones metagenômicos+ Bacillus subtilis CBMAI 707 imobilizados em quitosana e para o controle nos diferentes tempos amostrados.
132
aumento no número de cópias do gene alk B ligado à degradação de alcanos, assim como
a degradação de 30% dos alcanos totais.
Por outro lado, aos 10 dias a maioria dos hidrocarbonetos se mostrou com mais de
90% de degradação, tanto no ensaio controle como no ensaio utilizando o consórcio como
bioaumento (Figura 4.6). Porém, as taxas de degradação foram superiores no tratamento
utilizando o consórcio. Nesse tempo, possivelmente ocorreu uma maior atividade
degradadora dos micro-organismos, o que pode ser corroborado pelo aumento no
número de células e no consumo de oxigênio, mencionado anteriormente.
Similar ao tempo 10, aos 20 dias a maioria dos hidrocarbonetos presentes foi quase
que totalmente degradada. Mesmo para os hidrocarbonetos mais pesados, as taxas de
degradação foram altas, em torno de 100% para alguns compostos.
Após 30 dias de monitoramento, praticamente todos os hidrocarbonetos alifáticos
foram totalmente degradados, em ambos os experimentos, controle e pool Q.
Hassanshahian e colaboradores (2013) compararam a estratégia de bioaumento
empregando dois micro-organismos com o controle, utilizando apenas a microbiota
autóctone. Este último apresentou, ao final de 20 dias, 80% de degradação, sendo que o
tratamento de bioaumentação apresentou 70%. Portanto, a microbiota autóctone
também pode ser alterada e atingir altas taxas de degradação, assim como a estratégia de
bioaumento pode não ser efetiva, devido a inúmeros fatores abióticos, incluindo a
competição com a microbiota autóctone.
4.3.5. Degradação dos hidrocarbonetos aromáticos
Com relação à degradação dos hidrocarbonetos aromáticos, foi monitorada a
degradação de três componentes: benzopireno, benzoantraceno e benzofluoranteno.
Esses compostos são parte de um grupo específico de hidrocarbonetos, os
hidrocarbonetos poliaromáticos (HPAs), os quais são constituídos por dois ou mais anéis
benzênicos fundidos, arranjados em diversas formas estruturais. Esses compostos têm
como características alta persistência no ambiente e potencial carcinogênico, devido
principalmente à sua pouca solubilidade (Bamforth & Singleton, 2005).
133
Nas figuras 4.6 e 4.7 estão representadas as taxas de degradação do benzopireno,
benzoantraceno e benzofluoranteno nos controles e no pool Q, respectivamente.
Similarmente ao observado para os hidrocarbonetos saturados, no quinto dia não
foi observada degradação dos HPAs para o controle ou para o consórcio. Para os
hidrocarbonetos aromáticos isso já seria esperado, pois devido a sua complexidade
estrutural a degradação requer um tempo maior. No entanto, a partir do dia 10, foi
observada uma taxa em torno de 90% de degradação de benzopireno para o ensaio
controle. Estruturalmente esses compostos são diferentes, benzopireno (C20H12) possui
cinco anéis benzênicos, benzoantraceno (C18H12) quatro e benzo(k)fluoranteno (C20H12) é o
mais complexo de todos, possuindo cinco anéis, no entanto disposto de uma forma
diversa da do benzopireno. Ao final de 30 dias de experimento o benzopireno foi o
composto mais biodegradado no ensaio controle. Trabalhos prévios de literatura
mencionam a degradação de hidrocarbonetos aromáticos por bactérias marinhas,
geralmente relacionadas aos gêneros Alcanivorax e Cycloclasticus (Kasai et al., 2002;
Yakimov et al., 2007; Kotska et al., 2011).
Para o consórcio, as taxas de degradação de HPAs observadas foram superiores
quando comparadas ao controle, ao final de 30 dias de experimento. O
Figura 4.6. Taxas de degradação de hidrocarbonetos aromáticos observadas para o controle ao longo de 30 dias.
0102030405060708090
100
5 10 20 30
% b
iod
egra
daç
ão
dias
controle
benzoantraceno benzofluoranteno benzopireno
134
benzo(K)fluoranteno, que teve cerca de 35% de degradação no controle, atingiu 70% de
degradação no ensaio do consórcio, enquanto que o benzopireno foi totalmente
degradado (100%). O acesso a diferentes hidrocarbonetos depende da biodisponibilidade
e da estrutura de cada composto, assim como da composição genética de cada micro-
organismo, o que pode explicar uma maior degradabilidade do benzopireno em relação
aos outros dois compostos pelos micro-organismos presentes no consórcio avaliado. Os
resultados obtidos para os HPAs demonstraram a habilidade do consórcio em acelerar a
degradação de compostos recalcitrantes.
A quantidade inicial de cada composto separadamente não foi calculada, porém é
descrito que mesmo em concentrações muito baixas, os HPAs são os hidrocarbonetos
mais difíceis de serem degradados (Phale et al., 2007). Além da concentração do
contaminante, a concentração dos micro-organismos também influencia na
biodegradação. Este fator pode ter contribuído para uma maior degradação desses
compostos no consórcio. Enquanto a quantidade de micro-organismos crescendo na
presença de petróleo ficou em torno de 103 UFC/mL no controle ao longo dos 30 dias, o
consórcio teve um aumento no décimo dia de avaliação, apresentando uma quantidade
de 105 UFC/mL. Como já mencionado ao longo desse trabalho, quando se pretende a
Figura 4.7. Taxas de degradação de hidrocarbonetos aromáticos observadas para o consórcio contendo clones metagenômicos + Bacillus subtilis CBMAI 707 imobilizados em quitosana ao longo de 30 dias.
0102030405060708090
100
5 10 20 30
% b
iod
egra
daç
ão
dias
consórcio
benzoantraceno benzofluoranteno benzopireno
135
aplicação da estratégia de bioaumento, a quantidade de micro-organismos é um fator
limitante para a eficiência da técnica (Silva & Alvarez, 2010).
Como já descrito anteriormente, os clones metagenômicos presentes nesse
consórcio foram avaliados em estudo prévio quanto à degradação de hidrocarbonetos,
onde foi obtido até 98% de degradação de hexadecano (Vasconcellos et al., 2010) e, para
alguns deles, entre 44-49% de degradação de fenantreno entre 10 e 14 dias (Sierra-Garcia
et al., 2014). Dos cinco clones avaliados no trabalho de Sierra-Garcia et al. (2014), três
compõem o consórcio avaliado no presente trabalho, a saber: clones 2B, 1A e 10A. O
clone 9E foi selecionado com base em ensaios prévios de tensiometria não mostrados. As
sequências presentes nos insertos dos fosmídeos foram anotadas funcionalmente
utilizando a plataforma RAST, através da base de dados KEGG. A análise funcional permitiu
a caracterização das sequencias em várias categorias, sendo que a maioria foi relacionada
com degradação de xenobióticos, aminoácidos, geração de energia e metabolismo
envolvendo carboidratos (Sierra-Garcia et al., 2014).
Do mesmo modo, quando o petróleo bruto foi utilizado, os clones metagenômicos
2B e 10A foram capazes de degradar compostos aromáticos, como metilfenantreno e
fenantreno, em até 80% (Capítulo 1; Dellagnezze et al., 2014).
O gênero Bacillus vem sendo extensivamente descrito como relacionado a
ambientes contaminados com petróleo (Cerqueira et al., 2010), a processos associados à
produção e exploração de petróleo, como MEOR (McInerney et al., 2005), com a produção
de biossurfactantes (Banat et al., 2010; Domingos et al., 2014), degradação de
hidrocarbonetos (Kim et al., 2000; Lily et al., 2009) e aplicação em biorremediação
(Ruberto et al., 2003; Bento et al., 2005), o que corrobora os resultados encontrados e
torna essas bactérias ferramentas adequadas para aplicação em processos de
descontaminação de ambientes.
A linhagem Bacillus subtilis CBMAI 707 foi isolada de amostras de petróleo,
provenientes da Bacia de Campos, RJ (Vasconcellos et al., 2009), e foi selecionada para
este trabalho em função dos resultados de produção de EPS obtidos anteriormente
(Vasconcellos et al., 2011), assim como dos resultados de degradação de petróleo bruto e
136
de resistência ao processo de imobilização em quitosana obtidos ao longo deste trabalho.
Essa espécie é relacionada à produção de surfactina, um biossurfactante com ampla
aplicação (Mulligan, 2005; Banat et al., 2010), e à degradação de hidrocarbonetos
(Nwaogu et al., 2008; Das e Mukherjee, 2007).
4.3.6. Análise de Escalonamento Multidimensional não–métrico (nMDS)
Para a análise estatística foi utilizado o método de Escalonamento Multidimensional
não–métrico. Essa análise possibilita avaliar a dinâmica populacional ou um evento, como
por exemplo, degradação de compostos xenobióticos (Beazley et al., 2012; Stauffert et al.,
2014).
Na figura 4.8 estão plotados os pontos que representam a degradação de n-alcanos
pelo controle (K), indicados por setas vermelhas, e os pontos que representam o sistema
contendo os micro-organismos como bioaumento (M), indicados por setas azuis. A
distância entre os valores representa o nível de similaridade na degradação entre os dois
sistemas, pontos mais próximos são mais similares.
A condição presente no início do experimento (M5) e (K5) se modifica a partir do
tempo 10, sendo que os valores de degradação se aproximam, obtendo-se no final do
experimento (tempo 30) um cluster, significando que as taxas de degradação dos n-
alcanos se tornam similares. Estes resultados mostram que a eficiência de degradação
para n-alcanos foi similar entre a microbiota autóctone e o bioaumento no tempo 30 dias.
137
Figura 4.8. Plotagem da análise pelo método de Escalonamento Multidimensional não–métrico (nMDS) para degradação de n-alcanos. As setas vermelhas indicam o tratamento controle, enquanto que as azuis indicam o tratamento de bioaumento. No tempo 5 pode ser observada uma distância maior, e 30 dias, os valores mostram-se mais próximos formando um cluster (indicado pelo círculo).
Na figura 4.9 estão plotados os dados de degradação dos hidrocarbonetos
aromáticos, evidenciando as distâncias entre os tratamentos controle (K) e bioaumento
(M). Os pontos que indicam o tratamento com bioaumento estão bem mais distantes dos
pontos que representam a degradação pelo controle. Neste caso, é possível observar uma
degradação para os pontos do controle K5, K10 e K20, presumivelmente ligada à
microbiota autóctone no controle. No tratamento utilizando a estratégia de bioaumento,
o processo de degradação apresentou-se mais homogênea, resultado de um trabalho com
uma população microbiana específica. No controle (K), a população foi selecionada
naturalmente e a degradação se torna progressiva ao longo do tempo.
138
Figura 4.9: Plotagem da análise pelo método de Escalonamento Multidimensional não–métrico (nMDS) para degradação de aromáticos. As setas vermelhas indicam o tratamento controle, enquanto que as azuis indicam o tratamento de bioaumento.
4.3.7. Sequenciamento do gene RNAr 16S das amostras dos mesocosmos
A diversidade microbiana foi avaliada através do sequenciamento em larga escala de
parte do gene RNA ribossomal 16S, para ambos os ensaios contendo o consórcio
imobilizado em quitosana e o controle contendo a microbiota autóctone da água do mar
contaminada com petróleo.
As espécies encontradas em maior abundância no mesocosmos contendo o
consórcio, nos tempos 0, 5, 20 e 30, estão demonstradas na figura 4.10.
139
Figura 4.10. Diversidade de procariotos encontrada no sistema de mesocosmos contendo o
consórcio imobilizado em quitosana.
Sequências relativas ao gênero Escherichia ocorreram exclusivamente nesse ensaio,
porém em baixa abundância, em torno de 0,1% no tempo 0 e 1%, no tempo 20 Com
relação ao gênero Bacillus, esse gênero foi encontrado em baixa abundância também no
tempo 20, porém foram encontradas sequências relativas a esse gênero no controle. A
espécie Bacillus galactosidilyticus foi encontrada com menos de 1% de abundância no
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Arenimonas spp.
Acinetobacter schindleri
Caulobacter vibrioides
Oleispira spp.
Acinetobacter calcoaceticus
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia_Shigella spp.
Salinimicrobium spp.
Sarcina spp.
Comamonas aquatica
Sediminibacterium spp.
Alcanivorax venustensis
Holospora spp.
Acinetobacter johnsonii
Herbaspirillum spp.
Stenoxybacter spp.
Anaeromyxobacter dehalogenans
Mesorhizobium spp.
Methylobacterium radiotolerans
Massilia timonae
Alcanivorax borkumensis
Bacillus galactosidilyticus
Bacillus sp.
Abundância %
Esp
écie
s
30 20 5 0
140
controle e com 10% no tempo 20 no mesocosmos com o bioaumento. Essa espécie foi
relatada em alimentos de origem láctea (Heyndrickx et al., 2004).
Sarcina spp., Mesorhizobium spp., Caulobacter vibrioides mostraram-se abundantes
no tempo 0, porém Mesorhizobium spp. exibiu a maior abundância no tempo 20
(aproximadamente 36%) e Caulobacter vibrioides se sobressaiu, com aproximadamente
75%, ao final do experimento, no tempo 30. Herbaspirillum spp. foram verificadas no
tempo 20 (aproximadamente 5%) que mesmo em abundância foram apenas para o
tratamento contendo consórcio. Essas espécies são usualmente relatadas como fixadoras
de nitrogênio (Elbetagy et al., 2001), porém, já é relatado em trabalhos que mencionam
degradação de compostos xenobióticos, como o 4- clorofenol, um composto presente em
herbicidas e resíduos industriais, e em efluente de refinaria de petróleo (Im et al., 2004;
Das & Kazy, 2014). Espécies de Sarcina já foram relatadas como componentes da
microbiota presente em espécies de peixes, como o salmão (Cahill, 1990). Também já
foram descritas em ambientes contaminados com hidrocarbonetos, como solo
contaminado com querosene (Adetitun et al., 2014). Mesorhizobium spp. foram descritos
associados a ambientes contendo metais pesados (Mahieu et al, 2011), assim como solo
contaminado com petróleo (Liang et al, 2011). Geralmente é decrito em solos
contaminados, porém esse genêro já foi relatado em ambientes marinhos (Jimenez et al,
2011; Cappello et al, 2012). Caulobacter vibrioides já foi descrita em ambientes marinhos,
vivendo em associação com diatomáceas (Zakharova et al., 2010), e do mesmo modo, é
relatada em ambientes contaminados com hidrocarbonetos poliaromáticos (Benedek et
al., 2013).
No tempo 5, Alcanivorax venustensis e Oleispira spp. foram os grupos mais
abundantes, decaindo gradativamente até o fim do experimento (tempo 30 dias). Yakimov
e colaboradores (2007) descreveram esses gêneros, dentre outros, como integrantes de
um grupo específico de degradadoras de hidrocarbonetos, as bactérias
hidrocarbonaclásticas obrigatórias (obligate hydrocarbonoclastic bacteria -OHCB), no qual
estando em baixíssima abundância ou em níveis indetectáveis, aumentam
significativamente após um evento de poluição, como derramamento de petróleo.
141
Aos 30 dias, as espécies mais abundantes, além de Caulobacter vibrioides, foram
Mesorhizobium spp. (5%), Anaeromyxobacter dehalogenans (7%), relacionada à redução
de metais pesados e degradação de aromáticos (North et al., 2004; Jones et al, 2008; Vila
et al, 2010) e Holospora spp. (5%), associadas à microbiota de ciliados marinhos (Rautian
& Wackerow-Kouzova, (2013).
Na figura 4.10 estão demonstradas as espécies que foram detectadas nos diferentes
tempos no sistema de mesocosmos controle.
Figura 4.11: Diversidade de procariotos encontrada no sistema de mesocosmos controle (água do mar + petróleo).
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Arenimonas spp.
Acinetobacter schindleri
Caulobacter vibrioides
Oleispira spp.
Acinetobacter calcoaceticus
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia_Shigella spp.
Salinimicrobium spp.
Sarcina spp.
Comamonas aquatica
Sediminibacterium spp.
Alcanivorax venustensis
Holospora spp.
Acinetobacter johnsonii
Herbaspirillum spp.
Stenoxybacter spp.
Anaeromyxobacter dehalogenans
Mesorhizobium spp.
Methylobacterium radiotolerans
Massilia timonae
Alcanivorax borkumensis
Bacillus galactosidilyticus
Bacillus sp.
abundância %
esp
écie
s
30 20 5 0
142
Algumas espécies em comum foram encontradas nos dois sistemas. Como já
relatado, o gênero Sarcina teve maior abundância no controle, sendo que no tempo 0
representou 37% da microbiota, aumentando sua abundância no tempo cinco para mais
de 80%. Isso não foi observado no sistema com o bioaumento, onde ocorreu o oposto, ou
seja, sua abundância caiu drasticamente no tempo 5 e se manteve baixa até o fim do
experimento. As abundâncias das outras espécies relatadas no sistema com o bioaumento
também foram similares no controle, como no caso da espécie Caulobacter vibrioides, que
foi a mais abundante ao final de 30 dias, porém com menor valor (40%). Vale ressaltar um
aumento das espécies de Alcanivorax no tempo 30, onde Alcanivorax venustensis
representou 6% da microbiota e Alcanivorax borkumensis 6,5%, o que não foi observado
no bioaumento. Isso pode corroborar os resultados de degradação observados nas
análises estatísticas (item 4.3.6), que indicam que a degradação no controle foi gradual e
progressiva, podendo estar relacionada ao crescimento das degradadoras obrigatórias
frente às outras bactérias presentes na microbiota autóctone. Ao final de 30 dias do
experimento foi encontrada uma diversidade maior, porém com baixa abundância. Além
de Alcanivorax spp., Caulobacter vibrioides e Holospora spp. (estas últimas também
observadas no tratamento de bioaumentação), também foram encontradas as espécies
Acinetobacter calcoaceticus, com 5% e Acinetobacter johnsonii, com 4%. As espécies de
Acinetobacter são comumente relatadas em ambientes contaminados com petróleo (Luo
et al., 2010; Okoro et al., 2010). Sediminibacterium spp. também ocorreram,
representando 13% da microbiota, e estão relacionadas com ambientes de petróleo e
degradação (Al-Awadhi et al., 2013).
Vários estudos vêm demonstrando que a estratégia de bioaumentação pode
influenciar a microbiota autóctone (Morgante et al., 2009; McKew et al., 2007), o que
pode explicar as diferenças observadas entre as comunidades microbianas presentes nos
dois sistemas.
143
4.4. Conclusões
Os resultados demonstraram que o consórcio contendo quatro clones
metagenômicos + Bacillus subtillis CBMAI 707 apresentou porcentagens similares de
degradação dos compostos do petróleo bruto no sistema de mesocosmos em relação ao
controle contendo apenas a microbiota autóctone.
Condições consideradas não-ideais em sistema de mesocosmos, como a
temperatura (em torno de 16°C), baixa aeração, competição com microbiota marinha, e
escassez de nutrientes, uma vez que a única fonte de carbono acessível foi o petróleo
adicionado, pode ter resultado em uma eficiência na degradação de hidrocarbonetos
saturados similar à do controle.
Com relação à degradação dos compostos aromáticos, ao final de 30 dias, o
consórcio contendo os clones e Bacillus subtilis foi mais eficiente em relação ao controle
contendo apenas a microbiota autóctone.
A utilização do consórcio composto por clones metagenômicos com capacidade de
degradação de hidrocarbonetos (aromáticos e alifáticos), combinado com linhagem
produtora de biossurfactante, Bacillus subtilis, abre perspectiva de ser aplicado como
estratégia em sistemas de contenção para o tratamento de ambientes contaminados com
HPAs.
4.5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste trabalho foi possível avaliar o potencial de clones metagenômicos obtidos a
partir da construção de uma biblioteca fosmidial e de linhagens de bactérias, todos
provenientes de amostras de petróleo de reservatórios brasileiros, em escala de
microcosmos e mesocosmos, visando futura aplicação em processos de biorremediação.
Na primeira etapa, foram realizados ensaios em microcosmos para avaliação da
degradação de petróleo, com quatro clones metagenômicos e quatro linhagens isoladas,
avaliados na forma livre, em 50 mL de água do mar artificial e petróleo bruto como única
fonte de carbono, a cada sete dias durante 21 dias. Os resultados foram satisfatórios e
inovadores, uma vez que foi relatada a utilização de clones fosmidias portando vias de
144
degradação de hidrocarbonetos, para biorremediação, gerando a publicação do artigo
“Bioremediation potential of microorganisms derived from petroleum reservoirs”, na
revista Marine Pollution Bulletin. Neste artigo estão descritos os ensaios em microcosmos
com água do mar e as taxas de degradação de petróleo obtidas através da ação dos micro-
organismos, avaliada por Cromatografia gasosa-Espectrometria de Massas (CG-EM), nos
quais se destacaram as linhagens isoladas Dietzia maris CBMAI 705 e Micrococcus sp.
CBMAI 636, atingindo taxas de até 99% de degradação de hidrocarbonetos saturados
(Capítulo 1). Foi possível verificar a capacidade dos clones metagenômicos e das linhagens
isoladas para degradação de hidrocarbonetos presentes no petróleo, tanto para alifáticos,
como para aromáticos em ensaios de microcosmos. Esses resultados foram relevantes,
principalmente a performance dos clones 2B, 1A e 10A, uma vez que deve ser levado em
conta que os genes presentes nesses clones atuam em sistema de expressão heteróloga.
Concomitante aos primeiros ensaios de degradação em microcosmos, foram
realizados ensaios de tensiometria e emulsificação (E24) para a avaliação da produção de
biossurfactantes pelos micro-organismos em estudo. Inicialmente foram realizados
ensaios simples, utilizando apenas uma fonte de carbono, como hexadecano e glicerol
(não mostrados ao longo desse trabalho), porém os baixos valores de tensiometria e
emulsificação encontrados levaram à escolha de empregar o método de delineamento
experimental, modelo Plackett-Burman (P&B), testando ao mesmo tempo várias fontes de
carbono, nitrogênio e sais. Ainda assim, os resultados não foram muito satisfatórios, com
valores não significativos com relação à redução da tensão superficial e formação de
emulsão, através do teste E24, com a linhagem Bacillus subtilis CBMAI 707, já descrita
quanto à degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes, apresentando
melhores valores de redução de tensão e de emulsificação em querosene. O método de
delineamento experimental, modelo Plackett-Burman (P&B) foi eficiente para avaliar a
produção de compostos tensoativos, no entanto a melhor linhagem isolada testada foi
Bacillus subtilis, apresentando o menor valor de tensão superficial e melhor índice de
emulsificação entre os clones e linhagens avaliadas. Baseado nos resultados de
degradação descritos no artigo, as linhagens e os clones metagenômicos foram
145
selecionados para serem imobilizados em quitosana. Dietzia maris CBMAI 705 e
Micrococcus sp. CBMAI 636 não resistiram ao processo de encapsulamento. Seguiu-se
então com a imobilização dos quatro clones metagenômicos e da linhagem de Bacillus
subtilis CBMAI 707, a qual foi bem sucedida e permitiu dar continuidade aos experimentos
de degradação nas escalas de micro e mesocosmos. Os ensaios para a verificação da
produção de biossurfactantes, assim como a descrição do processo de imobilização em
quitosana estão descritos no Capítulo 2.
Na segunda etapa do trabalho foram realizados novos ensaios em microcosmos para
avaliar a degradação de petróleo, utilizando os micro-organismos imobilizados. Nos
ensaios envolvendo água do mar estéril, ao final de 21 dias, a taxa de degradação dos
hidrocarbonetos saturados ficou em torno de 65 a 80% para o clone 2B e 95 a 100% para o
consórcio. Nos ensaios em água do mar não-estéril, as taxas ao final de 40 dias, foram de
60 a 100% para o clone 2B, 80 a 100% para o consórcio e de 95 a 100% para o Bacillus
subtilis CBMAI 707. No último ensaio, realizado em tanques de 90L em água de mar não-
estéril, foi utilizado um consórcio em ágar contendo três linhagens isoladas, um consórcio
imobilizado em quitosana contendo 4 clones metagenômicos e Bacillus subtilis e um clone
2B imobilizado isoladamente, e as taxas de degradação foram mensuradas baseando-se
apenas na relação pristano/fitano, permitindo a seleção do consórcio com quatro clones
metagenômicos e a linhagem de Bacillus subtilis, posteriormente avaliado em ensaios de
mesocosmos. Foi possível observar que os micro-organismos, mesmo na forma
imobilizada foram capazes de degradar os hidrocarbonetos do petróleo bruto. Algumas
variações foram notadas quando avaliados juntamente com a microbiota autóctone em
água do mar não-estéril e nas condições mais próximas da situação in situ. Mesmo assim,
os micro-organismo avaliados foram capazes de degradar petróleo bruto.
Na última etapa do trabalho, foi avaliado um único consórcio imobilizado em
quitosana, contendo quatro clones metagenômicos e a linhagem de Bacilus subtilis CBMAI
707 em sistemas de mesocosmos, em tanques de 3.000 L preenchidos com água do mar
não-estéril. Esse consórcio foi selecionado baseando-se nos resultados de degradação de
petróleo bruto nos experimentos já descritos. Parâmetros como quantidade total de
146
bactérias (utilizando DAPI), contagem heterotrófica, e demanda biológica de oxigênio
(DBO) foram mensurados, assim como a degradação de petróleo através de cromatografia
gasosa (CG), além da caracterização da microbiota através de sequenciamento de DNA em
larga escala. As análises estatísticas revelaram similaridades nas taxas de degradação do
petróleo entre o tratamento com bioaumentação e o controle, no caso dos
hidrocarbonetos saturados. Porém, para os HPAs o tratamento com bioaumentação
revelou taxas superiores de degradação, abrindo perspectivas para aplicação futura na
remediação de contaminação com compostos recalcitrantes. Sequencias relacionadas aos
gêneros Escherichia e Bacillus foram encontradas apenas no tratamento utilizando o
consórcio, embora em baixas abundâncias. Porém ao final do experimento, foi observada
a prevalência de alguns grupos em comum, como Caulobacter vibrioides, Holospora spp. e
Mesorhizobium spp. Isso pode indicar que o consórcio com clones metagenômicos e
Bacillus subtilis pode não ter tido sucesso nas condições que simulam o ambiente natural,
contendo as bactérias autóctones da água do mar. Isso poderia ser explicado pelas
condições ambientais adversas nos sistemas de mesocosmos, diferentemente das
observadas em condições controladas de laboratório, assim como a competição com a
microbiota indígena. É possível que mesmo estando imobilizados em quitosana, os micro-
organismos não tenham tido muito sucesso na proliferação nos sistemas de mesocosmos.
Ainda assim, a utilização do consórcio pode ser interessante, uma vez que esses
clones possuem capacidade para degradar tanto hidrocarbonetos saturados como
aromáticos, além de capacidade para produzir biossurfactante, deste modo abrindo
perspectiva de ser utilizado em sistemas de contenção para o tratamento de ambientes
contaminados.
4.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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150
151
Anexo
Aprovação do Comitê Interno de Biossegurança (CIBio) para a manipulação
de organimos geneticamente modificados (OGM)
152
153
154
155