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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
GABRIELA DE MELLO GANDELINI
EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO CONFORMACIONAL E
FUNCIONAL DA HSPH1, UMA CO-CHAPERONA HSP110 HUMANA, COM
ÊNFASE EM SEU PAPEL EM SISTEMAS DE DESAGREGAÇÃO DE PROTEÍNAS
CAMPINAS
2018
GABRIELA DE MELLO GANDELINI
EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO CONFORMACIONAL E FUNCIONAL DA HSPH1, UMA CO-CHAPERONA HSP110 HUMANA, COM
ÊNFASE EM SEU PAPEL EM SISTEMAS DE DESAGREGAÇÃO DE PROTEÍNAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de
Mestra em Química na Área de Química Orgânica
Orientador: Prof. Dr. Carlos Henrique Inacio Ramos
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA GABRIELA DE MELLO GANDELINI, E ORIENTADA PELO PROF. DR.
CARLOS HENRIQUE INACIO RAMOS.
CAMPINAS 2018
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, começo agradecendo a Deus pelo dom da vida e por ter
me concedido saúde e sabedoria para realização deste trabalho de dissertação de
mestrado.
Sou grata a minha família, ao meu pai Antonio, a minha mãe Isaura e aos
meus irmãos Evandro e João Matheus, por todo apoio, incentivo e amor incondicional.
A minha prima Cristiane, por ter me incentivado a fazer o mestrado. Ao meu marido
Fabio, por sempre estar ao meu lado, pelo incentivo, compreensão, amor e,
principalmente, por respeitar e apoiar a minha decisão de realizar o mestrado em
Campinas. Amo muito vocês!
Agradeço ao Professor Doutor Carlos Henrique Inácio Ramos por ter me
aceitado como aluna e cedido espaço em seu laboratório, bem como por ter
disponibilizado os equipamentos e reagentes necessários para realização desta
dissertação. Obrigada Professor, por todo conhecimento transmitido e pela excelente
orientação, desempenhada com confiança, respeito e paciência.
Sou grata a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) pela bolsa concedida, todo apoio financeiro e, principalmente, pelo
interesse neste trabalho de dissertação de mestrado (processo nº 2016/04246-2).
Agradeço também ao CNPQ e a Capes pelo suporte financeiro.
Obrigada a todos que direta ou indiretamente contribuiram com este
trabalho. Em especial, aos colaboradores do grupo (Prof. Jason Young, McGill
University) que doaram o clone contendo o gene de interesse utilizado nesta
dissertação.
Sou grata ao Instituto de Química e a UNICAMP pela infra-estrutura e apoio
científico, bem como a todos os funcionários por trabalharem pela manutenção dessa
infra-estrutura.
Obrigada a todos os professores que contribuiram com a minha formação,
principalmente aos que ministraram as disciplinas da pós-graduação. Em especial,
agradeço aos professores que aceitaram participar da banca avaliadora desta
dissertação, dispondo do seu tempo e contribuindo com o mesmo.
Agradeço aos técnicos do Professor Doutor Carlos Ramos e a todos os
colegas de laboratório, por fazerem do ambiente de trabalho um lugar agradável e
estarem sempre dispostos ao auxílio e a troca de experiências, principalmente
Annelize, Conrado, Glaucia, Maria Luiza, Josielle e Juliana, por toda amizade e por
contribuirem para o desenvolvimento desta dissertação. E a todos os queridos amigos,
que mesmo distante, também me apoiaram e me ajudaram a concluir essa importante
etapa.
Por fim, termino agradecendo novamente a Deus, por ter tantas pessoas e
motivos especiais para agradecer!
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse
feito. Não sou o que deveria ser, mas graças a Deus, não sou o que era antes”.
(Marthin Luther King)
RESUMO
O enovelamento incorreto de proteínas pode ocasionar diversas doenças e até
mesmo o envelhecimento. Ele pode levar à perda de função das proteínas ou acarretar
na formação de agregados proteicos amiloidogênicos, os quais estão envolvidos com
diversas doenças. Para se proteger desses agregados, diversos organismos
expressam chaperonas moleculares da família Hsp100 (ClpB em bactéria, Hsp104 em
levedura e Hsp101 em plantas, por exemplo), que são capazes de desagregar outras
proteínas levando à reativação das mesmas. Surpreendentemente, metazoários não
possuem um gene para a família da Hsp100. Contudo, estudos recentes mostraram
que a co-chaperona Hsp110 tem função desagregase. Dessa forma, o objetivo desta
dissertação é caracterizar a HSPH1, uma co-chaperona Hsp110 humana, através da
expressão, purificação e caracterização da sua relação estrutura e função. O gene
hsph1 clonado no vetor pPROEX-Htb foi expresso na forma solúvel em Escherichia
coli (E. coli) BL21(DE3) e a proteína recombinante foi purificada em duas etapas
cromatográficas, afinidade e exclusão por tamanho. As análises de
espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD) determinaram que a HSPH1 foi
expressa e purificada enovelada e estável, com estrutura secundária predominante
do tipo hélice α, conservada até 48 ºC e na presença de ureia 3 mol/L. Além disso, a
análise da emissão de fluorescência indicou que pelo menos um dos resíduos de
triptofano se encontra parcialmente localizado no interior da proteína enovelada. As
propriedades hidrodinâmicas (massa molecular, coeficiente de difusão e raio de
Stokes), obtidas através das técnicas de cromatografia de gel filtração analítica (GFA),
cromatografia de exclusão por tamanho acoplada ao detector multiângulo (SEC-
MALS) e espalhamento de luz dinâmica (DLS), mostraram que a HSPH1 se comportou
como um monômero com conformação alongada. Finalmente, os experimentos
funcionais mostraram que a proteína possui atividade chaperona seletiva, sendo
capaz de proteger de maneira diferente proteínas-cliente contra a agregação. Os
resultados obtidos têm potencial para acrescentar significativamente ao conhecimento
sobre a homeostase proteica na célula, podendo gerar insumos que tenham aplicação
médica e biotecnológica.
ABSTRACT
The incorrect protein folding can cause many diseases and even aging. It can lead to
loss of function or to the formation of protein amyloid aggregates, which are involved
in several diseases. In order to protect from these aggregates, many organisms
express the Hsp100 chaperone (ClpB in bacteria, Hsp104 in yeast and Hsp101 in
plants), which is able to disaggregate other proteins leading to their reactivation.
Surprisingly, metazoa does not have a gene for the Hsp100. Nevertheless, recent
studies have suggested that Hsp110 co-chaperone have disaggregation function.
Thus, the aim of this dissertation is to characterize HSPH1, a human Hsp110 co-
chaperone, by expressing, purifying and performing structure and functional
characterization. The hsph1 gene in pPROEX-Htb vector expressed a soluble protein
into Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) and two chromatography steps were used to
purify de protein (affinity chromatography followed by size exclusion chromatography).
Circular dichroism (CD) and fluorescence emission spectroscopy assays showed that
HSPH1 was expressed and purified as a folded and stable protein, with α helical
content of about 34% and it kept its secondary structure content up to about 48 °C and
3 mol/L of urea. Analysis of the emission fluorescence spectroscopy indicated that at
least one of the tryptophan residues was partially buried in the native protein.
Hydrodynamics properties (molecular mass, diffusion coefficient and Stokes radius)
obtained from analytical gel filtration (AGF), size exclusion chromatography combined
with multi-angle light (SEC-MALS) and dynamic light scattering (DLS) techniques
results suggested that HSPH1 was an elongated monomer. Functional experiments
showed that the protein has selective chaperone activity with different protection
effects depend on the client-protein tested. The results have the potential to increase
significantly the knowledge about protein homeostasis in the cell, which can generate
inputs that have medical and biotechnological application.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ângulos de torção da ligação peptídica (ângulos diedrais).
Figura 2. Estrutura tridimensional das proteínas.
Figura 3. Homeostase proteica.
Figura 4. Representação dos domínios da Hsp70 humana e da Hsp110 humana.
Figura 5. Ciclo funcional Hsp70/Hsp40/Hsp110.
Figura 6. Mapa da região de policlonagem do vetor pPROEX-Htb.
Figura 7. Sequência de resíduos de aminoácidos da HSPH1.
Figura 8. Análise do teste de expressão da HSPH1 por gel de SDS-PAGE 10%.
Figura 9. Cromatograma de afinidade da HSPH1.
Figura 10. Análise da cromatografia de afinidade por gel de SDS-PAGE 10%.
Figura 11. Cromatograma de exclusão por tamanho da HSPH1.
Figura 12. Análise da cromatografia de exclusão por tamanho por gel de SDS-PAGE
10%.
Figura 13. Análise da pureza da HSPH1 por gel de SDS-PAGE 10%.
Figura 14. A) Caracterização da estrutura secundária da HSPH1. B) Voltagem da
fotomultiplicadora medida durante a caracterização da estrutura secundária da
HSPH1.
Figura 15. A) Desenovelamento térmico da HSPH1. B) Voltagem da fotomultiplicadora
medida durante o desenovelamento térmico da HSPH1.
Figura 16. Desenovelamento químico da HSPH1.
Figura 17. Espectro de emissão de fluorescência da HSPH1 com excitação em 295
nm.
Figura 18. Efeito do desenovelamento químico na intensidade da emissão de
fluorescência e no centro de massa da HSPH1.
Figura 19. Cromatograma de gel filtração analítica para determinação do raio de
Stokes da HSPH1.
Figura 20. Curva de calibração para obtenção do raio de Stokes da HSPH1.
Figura 21. Caracterização do estado oligomérico da HSPH1 por SEC-MALS.
Figura 22. Gráfico de distribuição de D em função da intensidade para HSPH1.
Figura 23. Verificação de atividade chaperona da HSPH1 utilizando o substrato
modelo MDH a 40 ºC por 50 min. A) HSPH1:MDH 0,5:1. B) HSPH1:MDH 1:1. C)
Gráfico de barras da agregação relativa.
Figura 24. Verificação de atividade chaperona da HSPH1 utilizando o substrato
modelo luciferase a 40 ºC por 50 min. A) HSPH1:luciferase 0,5:1. B) HSPH1:luciferase
1:1. C) HSPH1:luciferase 2:1. D) HSPH1:luciferase 10:1. E) BSA:luciferase 10:1. F)
Gráfico de barras da agregação relativa.
Figura 25. Verificação de atividade chaperona da HSPH1 utilizando o substrato
modelo insulina a 20 ºC por 50 min. A) HSPH1:insulina 1:5. B) Aldolase:insulina 1:5.
C) Gráfico de barras da agregação relativa.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Meio de cultura, tampão ou solução e sua respectiva composição.
Tabela 2. Coluna cromatográfica e sua respectiva resina.
Tabela 3. Equipamento e seu respectivo objetivo de uso.
Tabela 4. Proteína-cliente e seu respectivo lote.
Tabela 5. Oligonucleotídeos utilizados no sequenciamento da HSPH1.
Tabela 6. Propriedades físico-químicas das proteínas utilizadas como padrão no
experimento de gel filtração analítica.
Tabela 7. Quantidade de resíduos de tirosina e triptofano presentes na HSPH1, assim
como o valor do seu coeficiente de extinção molar, obtido pelo método de Edelhoch.
Tabela 8. Parâmetros físico-químicos preditos para a proteína HSPH1 fusionada á
cauda de histidina, a partir da sequência de aminoácidos.
Tabela 9. Alinhamento dos homólogos com a HSPH1 humana.
Tabela 10. Volumes de eluição (Ve) e propriedades físico-químicas das proteínas
padrão utilizadas.
Tabela 11. Parâmetros hidrodinâmicos para a HSPH1.
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
ATP: adenosina 5’ tri-fosfato.
b: comprimento do caminho óptico.
BME: beta mercapto etanol.
BSA: albumina de soro bovino (bovine serum albumin).
CD: dicroísmo circular.
cDNA: DNA complementar.
Cm: concentração de ureia no ponto médio da transição.
D: coeficiente de difusão.
Deg: grau (degree).
DLS: espalhamento de luz dinâmica (Dynamic Light Scattering).
DNA: ácido desoxidorribonucléico.
DTT: ditiotreitol.
E. coli: Escherichia coli.
EDTA: ácido etilenodiamino-tetra-acético.
f: coeficiente friccional.
fo: coeficiente friccional predito para uma esfera de mesma massa e não hidratada.
f/fo: razão friccional ou fator de Perrin.
fH: porcentagem de hélice α.
Fi: intensidade de fluorescência.
FT: flow through.
Gdm-Cl: cloreto de guanidina.
GFA (AGF): gel filtração analítica (analytical gel filtration).
His: Histidina (H).
Hsp: proteína de choque térmico (Heat Shock Protein).
Hsp70: proteína de choque térmico de 70 kDa.
Hsp40: proteína de choque térmico de 40 kDa.
Hsp110: proteína de choque térmico de 110 kDa.
I: input.
IPTG: isopropiltiol-β-D-galactosídeo.
IS: insolúvel (precipitado).
Kav: coeficiente de partição.
KB: constante de Boltzman.
LB: meio de cultura Luria-Bertani.
MM: massa molecular.
MDH: malato desidrogenase.
n: número de resíduos de aminoácido.
N: número de Avogadro.
NBD: domínio de ligação ao nucleotídeo (nucleotide-binding domain).
NEF: fator de troca de nucleotídeo (nucleotide exchange factor).
PMSF: fluoreto de fenilmetilsulfonila.
pI: ponto isoelétrico.
PT: proteína total.
rcf: força centrífuga relativa (relative centrifugal force).
RNA: ácido ribonucleico.
RNAm: RNA mensageiro.
rpm: rotações por minuto.
Rs: raio de Stokes.
Rso: raio de Stokes predito para uma esfera de mesma massa e não hidratada.
SBD: domínio de ligação ao substrato (substrate-binding domain).
SDS: dodecil-sulfato de sódio.
SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS.
SEC-MALS: cromatografia de exclusão por tamanho acoplada ao espalhamento de
luz multiângulo (Size Exclusion Chromatography - Multi-Angle Light Scattering).
SN: sobrenadante (solúvel).
SOC: meio de cultura SOB (super optimal broth) suplementado com glicose (with
carbon catabolite repression).
Tm: temperatura no ponto médio da transição.
Trp: triptofano (W).
Tyr: tirosina (Y).
u.a.: unidade arbitrária.
Vbar: volume parcial específico.
Ve: volume de eluição.
Vc: volume total da coluna cromatográfica.
Vo: volume morto da coluna cromatográfica.
λ: comprimento de onda.
λ máx.: comprimento de onda máximo de fluorescência.
<λ>: centro de massa espectral de fluoresecência.
θ: elipticidade.
[θ]: elipticidade molar residual.
Ɛ: coeficiente de absorbância molar.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 17
1.1. Proteínas ........................................................................................... 17
1.2. Chaperonas moleculares..................................................................... 20
1.3. Sistema desagregase ......................................................................... 23
2. OBJETIVOS ............................................................................................. 27
2.1. Objetivos gerais .................................................................................. 27
2.2. Objetivos específicos .......................................................................... 27
3. MATERIAIS .............................................................................................. 28
3.1. Meios de cultura, soluções e tampões.................................................. 28
3.2. Colunas cromatográficas ..................................................................... 29
3.3. Equipamentos .................................................................................... 29
3.4. Proteínas-cliente................................................................................. 30
4. MÉTODOS ............................................................................................... 31
4.1. Análise do cDNA ................................................................................ 31
4.2. Transformação de bactérias e expressão de proteínas.......................... 32
4.3. Lise bacteriana ................................................................................... 33
4.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) .............................. 33
4.5. Purificação da proteína ....................................................................... 34
4.5.1. Cromatografia de afinidade ................................................................. 34
4.5.2. Cromatografia de exclusão por tamanho .............................................. 34
4.6. Determinação da concentração de proteína ......................................... 35
4.7. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD) ................................... 36
4.8. Espectrometria de emissão de fluorescência ........................................ 37
4.9. Gel filtração analítica (GFA) e GFA acoplada ao espalhamento de luz
multiângulo (SEC-MALS).............................................................................. 37
4.10. Espalhamento de luz dinâmica (DLS)................................................... 39
4.11. Caracterização dos parâmetros hidrodinâmicos .................................... 39
4.12. Caracterização de proteção contra agregação ...................................... 39
5. RESULTADOS ......................................................................................... 41
5.1. Sequência proteica ............................................................................. 41
5.2. Expressão da proteína ........................................................................ 43
5.3. Purificação da proteína ....................................................................... 43
5.4. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD) ................................... 49
5.5. Espectrometria de emissão de fluorescência ........................................ 54
5.6. Gel filtração analítica (GFA) e GFA acoplada ao espalhamento de luz
multiângulo (SEC-MALS).............................................................................. 56
5.7. Espalhamento de luz dinâmica (DLS)................................................... 59
5.8. Caracterização dos parâmetros hidrodinâmicos .................................... 60
5.9. Caracterização de proteção contra agregação ...................................... 61
6. DISCUSSÃO ............................................................................................ 67
6.1. A porção codificante do gene hsph1 humano codifica uma Hsp110 ....... 67
6.2. A HSPH1 humana foi produzida solúvel, enovelada e estável................ 68
6.3. A HSPH1 humana é um monômero alongado....................................... 70
6.4. A HSPH1 humana possui atividade chaperona ..................................... 70
7. CONCLUSÕES ........................................................................................ 72
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 73
9. ANEXO .................................................................................................... 81
9.1. Autorizaçao da Comissao Interna de Biossegurança (CIBio) para condução
do projeto de pesquisa ................................................................................. 81
17
1. INTRODUÇÃO
1.1. Proteínas
As proteínas são as macromoléculas mais importantes e mais abundantes
nas células, ocorrendo em grande variedade e exibindo uma grande diversidade de
funções biológicas (Lehninger e col., 2002). Essas macromoléculas são formadas pelo
mesmo conjunto de 20 aminoácidos, ligados covalentemente em muitas combinações
e sequências diversas, através de ligações peptídicas. As ligações peptídicas (C-N)
ocorrem entre o grupo amino de um aminoácido e o grupo carboxila de outro, e devido
a ressonância, possuem caráter de dupla ligação, o que confere planaridade e impede
a rotação. Por outro lado, são ligações simples que ocorrem entre o grupo amino (N)
e Cα e entre o Cα e a carbonila (C), podendo rotacionar em diferentes ângulos de
torções (N-Cα ângulo θ, Cα-C ângulo ψ), e permitindo que as cadeias polipeptídicas
assumam várias orientações (figura 1) (Stryer, 2004).
Figura 1. Ângulos de torção da ligação peptídica (ângulos diedrais). A ligação
peptídica (C-N) possui caráter de dupla ligação, sendo planar e rígida, enquanto que
as ligações Cα-C e N-Cα são simples e rotacionam nos ângulos ψ e θ,
respectivamente (Modificado de Freeman e col., 2012).
A sequência de aminoácidos determina quais interações serão possíveis
entre as suas cadeias laterais, determinando a estrutura tridimensional da proteína,
que por sua vez, determina sua função (Lehninger e col., 2002). As estruturas das
proteínas são classificadas de acordo com o nível de organização tridimensional dos
18
aminoácidos na cadeia polipeptídica, sendo divididas em estrutura primária, estrutura
secundária, estrutura terciária e estrutura quaternária (figura 2). A estrutura primária
se refere somente a ordem da sequência de ligação dos aminoácidos em uma cadeia
polipeptídica. A estrutura secundária corresponde a organização espacial adquirida
pela cadeia principal, não considerando as cadeias laterais dos aminoácidos
envolvidos (predominam interações locais), sendo as estruturas mais comumente
encontradas as do tipo hélice α e folha β. Já a estrutura terciária compreende a
organização tridimensional da cadeia polipeptídica completa, ou seja, considera as
interações das cadeias laterais (predominam interações não-locais). Por fim, a
estrutura quaternária engloba a organização espacial das subunidades (mais de uma
cadeia polipeptídica) e a natureza das suas ligações (Stryer, 2004).
19
Figura 2. Estrutura tridimensional das proteínas. Estrutura primária se refere a
sequência de resíduos de aminoácidos; estrutura secundária corresponde a
organização espacial adquirida pela cadeia principal através de interações locais (sem
considerar as cadeias laterais dos aminoácidos); estrutura terciária compreende a
organização tridimensional da cadeia polipeptídica envolvendo interações não-locais
(considera as interações das cadeias laterais); estrutura quaternária engloba a
organização espacial das subunidades de estruturas terciárias (Modificado de Voet e
Voet, 2011).
As proteínas participam da grande maioria das funções celulares, as quais
viabilizam diversas atividades em nosso organismo. No entanto, para que elas
desenvolvam corretamente suas funções, é necessário que elas atinjam o seu estado
correto de enovelamento, adotando uma estrutura tridimensional característica,
também conhecida como estrutura nativa. O enovelamento proteico, ou estrutura
nativa, é definido como o estado termodinamicamente mais estável, mais favorável e
de menor energia livre que uma proteína pode alcançar (Anfinsen, 1973). Este
enovelamento, no qual as estruturas secundárias, terciárias e quaternárias se
20
encontram completamente definidas, é mantido principalmente por interações não
covalentes entre os resíduos de aminoácidos da cadeia lateral (Lehninger e col., 2004;
Ramos e Ferreira, 2005). As etapas do processo de enovelamento são complexas e
heterogêneas, envolvendo interações fracas e forças hidrofóbicas, pelas quais os
resíduos apolares ficam, predominantemente, no interior da proteína (Hartl e col.,
2011).
Durante o enovelamento na célula, devido à alta concentração de diversas
macromoléculas no meio celular, muitas proteínas não atingem ou não mantêm sua
estrutura correta, mesmo que a estrutura tridimensional de uma proteína esteja
codificada na sua seqüência de aminoácidos (Frydman e Hartl, 1996). Dessa forma,
para garantir o enovelamento correto de proteínas, muitas vezes é necessária a
presença de outras proteínas, as quais auxiliam no enovelamento, evitam a agregação
e/ou controlam o processo de desagregação. Essas proteínas são denominadas
chaperonas moleculares ou proteínas de choque térmico (Para revisões ver Ramos e
Ferreira, 2005; Tiroli e Ramos, 2011).
1.2. Chaperonas moleculares
As chaperonas moleculares são uma família de proteínas que auxiliam na
correta formação da estrutura tridimensional de proteínas-cliente, permitindo que elas
se enovelem mais eficientemente nas suas estruturas nativas. As chaperonas
moleculares, juntamente com o sistema proteassoma, são essenciais na manutenção
da homeostase proteica das células (Hendrick e Hartl, 1993; Hartl, 1996; Borges e
Ramos, 2005; Tiroli e Ramos, 2011). A homeostase proteica é mantida por um sistema
de controle de qualidade proteico, controlado pelas chaperonas moleculares e pelo
sistema proteassoma, garantindo o equilíbrio entre proteínas incorretamente
enoveladas e a degradação proteica. Este controle é essencial para a vida, pois o
acúmulo de proteínas mal enoveladas no ambiente celular é base de muitas doenças
degenerativas, como o mal de Alzheimer e Parkinson, causadas pelo acúmulo das
proteínas β-amiloíde e α-sinucleína, respectivamente (Para revisão ver Ramos e
Ferreira, 2005; Ramos, 2011; Tiroli e Ramos, 2011).
As chaperonas moleculares interagem com diferentes proteínas-cliente em
estado não-nativo ou parcialmente enovelado, reconhecendo sequências ou regiões
hidrofóbicas expostas ao solvente, e, portanto, não necessitam de uma região
específica de interação (Martin e Hartl, 1993). Sendo assim, as chaperonas se ligam
21
e estabilizam polipeptídeos, facilitando seu enovelamento correto sem contribuir com
informações conformacionais (Hendrick e Hartl, 1993; Hartl e Hayer-Hartl, 2009).
As chaperonas são chamadas de proteínas de choque térmico porque, de
maneira geral, sua síntese é aumentada em condições de estresse térmico. Contudo,
outros tipos de estresse também estimulam a sua síntese, e, ainda, muitas são
expressas constitutivamente (Lindquist e Craig, 1988). O fato das chaperonas serem
expressas e estáveis sob condições de estresse, as torna fundamentais para a
manutenção e sobrevivência celular, visto que, justamente nessas condições,
diversos processos do metabolismo celular podem ser inibidos, incluindo a replicação
do DNA, transcrição, processamento de RNAm e síntese de proteínas, além de
proteínas celulares poderem se enovelar de maneira incorreta (Martin e Hartl, 1993;
Saibil, 2013).
Dependendo do tipo de atuação que as chaperonas exercem sobre as suas
proteínas-cliente, elas podem ser divididas em três grupos: enovelases, holders e
desagregases (Tiroli e Ramos, 2011). As enovelases são capazes de auxiliar no
enovelamento de proteínas-cliente, utilizando energia da hidrólise de ATP feita por
seus domínios. Para que as enovelases façam seu trabalho eficientemente, as holders
reconhecem, se ligam e estabilizam polipeptídeos ainda não nativos, e os entregam
para as enovelases, evitando assim a formação de agregados (Slepenkov e Witt,
2002). Há ainda as chaperonas consideradas desagregases, as quais utilizam energia
provinda do ATP para liberar polipeptídeos a partir de agregados e entregá-los as
enovelases para que elas realizem um novo enovelamento. Se a reestruturação não
for possível, o polipeptídeo é entregue ao sistema proteossomo para ser degradado
(figura 3) (Bösl e col., 2006).
22
Figura 3. Homeostase proteica. As proteínas devem atingir seu estado correto de
enovelamento para serem funcionais. Proteínas mal enoveladas levam a perda de
função e, em muitos casos, ao desenvolvimento de doenças. O processo de
enovelamento pode ser espontâneo, mas geralmente, no ambiente celular
concentrado, é necessário o auxílio das chaperonas moleculares. As chaperonas
moleculares podem ser divididas em três tipos: as holders (H) se ligam nos
polipeptídeos não nativos e os entregam para as enovelases; as enovelases (E)
auxiliam no enovelamento correto e as desagregases (D) liberam polipeptideos não
nativos a partir de agregados proteicos. Se o enovelamento não for possível, os
polipeptídeos são entregues ao sistema proteassomo (P) para serem degradados
(Modificado de Tiroli e Ramos, 2011).
A maioria das chaperonas funciona em cooperação com as chamadas co-
chaperonas: proteínas-cliente ligam-se as chaperonas e as co-chaperonas atuam
direcionando a atividade e especificidade delas às proteínas-cliente (Tiroli e Ramos,
2011). As chaperonas e co-chaperonas moleculares são nomeadas de acordo com a
massa molecular do monômero, apesar da maioria delas atuar na forma de
oligômeros. Dessa maneira, a chaperona Hsp70 e suas co-chaperonas Hsp40 e
Hsp110, por exemplo, possuem monômeros com cerca de 70, 40 e 110 kDa,
respectivamente (Doyle e Wickner, 2009). Em conjunto, a chaperona Hsp70 e suas
co-chaperonas Hsp40 e Hsp110 formam, em metazoários, um sistema envolvido na
23
desagregação de proteínas, o sistema desagregase (Shorter, 2011; Rampelt e col.,
2012).
1.3. Sistema desagregase
O sistema desagregase clássico é composto pela chaperona Hsp100
(Sousa, 2014; Aguado e col., 2015; Mokry e col., 2015; Nillegoda e Bukau, 2015;
Sweeny e Shorter, 2016). A família de chaperonas Hsp100 apresentam função
desagregase e são membros da família AAA + (ATPases associadas a várias
atividades celulares). A Hsp100 é caracterizada por um domínio N-terminal (NTD) que
apresenta afinidade a agregados, além de estar envolvido na ligação e hidrólise de
ATP (Beinker e col., 2002; Schlieker e col., 2004). Após o domínio NTD, um domínio
médio (M) é essencial na reativação dos agregados proteicos (Lee e col., 2013;
Jackrel e col., 2014). Por fim, a região C-terminal está envolvida na oligomerização e
na interação co-chaperona (Mackay e col., 2008). O mecanismo de desagregação da
Hsp100 envolve a extração contínua de proteínas desenoveladas do agregado, que é
solubilizado no canal central de uma estrutura hexamérica de Hsp100 organizada em
forma de anel (Schlieker e col., 2004; Mogk e col., 2015). Essa estrutura hexamérica
sofre alterações conformacionais desencadeadas pela ligação e hidrólise de ATP
(Zolkiewski, 2006). As chaperonas Hsp100 estão presentes em eucariotos não-
metazoários, eubactérias e algumas arqueobactérias, sendo ClpB de bactéria e
Hsp104 de levedura os membros mais bem estudados (Olivares e col., 2016; Sweeny
e Shorter, 2016; Yedidi e col., 2017).
Contudo, metazoários não possuem um gene para a família da Hsp100 e
apresentam um sistema desagregase alternativo composto pela chaperona Hsp70 e
suas co-chaperonas Hsp40 e Hsp110 (Glover e Lindquist, 1998; Doyle e Wickner,
2009; Shorter, 2011; Rampelt e col., 2012; Shiber e Ravid, 2014; Gao e col., 2015).
As proteínas da família Hsp70 funcionam como enovelases e são
caracterizadas pela presença de dois domínios funcionais: a porção N-terminal com
um domínio NBD, e a porção C-terminal com um domínio SBD (Tiroli e Ramos, 2011).
O domínio NBD é o domínio de ligação ao nucleotídeo, se ligando a ATP e ADP e
possuindo atividade ATPase. O domínio SBD é o domínio de ligação ao substrato,
sendo composto por um subdomínio α (flexível) e um subdomínio β (rígido) (Finka e
col., 2015; Sarbeng e col., 2015).
24
A família de proteínas Hsp40 contém as principais co-chaperonas da Hsp70
(Cyr e col., 1994). Elas atuam como holders, reconhecendo e se ligando em
polipeptídeos desenovelados, ou parcialmente enovelados, para entregá-los às
chaperonas Hsp70 (Sarbeng e col., 2015). As co-chaperonas Hsp40 são formadas
por um domínio J conservado, o qual é responsável pela interação com o domínio
NBD das Hsp70, estimulando atividade ATPase. A hidrólise de ATP em ADP no
domínio NBD da Hsp70 induz uma mudança conformacional no seu domínio SBD,
aumentando a afinidade da Hsp70 ao substrato (proteína) (Gao e col., 2015).
A Hsp110 é uma co-chaperona pertencente a uma subfamília da Hsp70.
Em relação a estrutura, as proteínas Hsp110 possuem domínio ATPase (N-terminal)
com 34% de identidade com as chaperonas Hsp70 (Oh e col., 1999), enquanto que
seu domínio C-terminal é notavelmente maior que o das chaperonas Hsp70, devido,
principalmente, à presença de resíduos carregados negativamente (figura 4)
(Dragovic e col., 2006; Raviol e col., 2006). A Hsp110 colabora com a Hsp70 e a
Hsp40 para solubilizar agregados proteicos estáveis e gerar monômeros não tóxicos,
através do sistema desagregase (Gao e col., 2015).
Figura 4. Representação dos domínios da Hsp70 humana e da Hsp110 humana.
Os domínios N-terminal (NBD) da Hsp70 e da Hsp110 possuem identidade elevada.
O domínio C-terminal (SBD) da Hsp110 é notavelmente maior que o da Hsp70, devido
à presença de resíduos carregados negativamente (Modificado de Nillegoda e Bukau,
2015).
O sistema desagregase envolve ciclos consecutivos de ligação,
enovelamento e liberação de proteínas-cliente, sendo dependente de ATP. Quando a
Hsp70 está ligada ao ATP, ela possui uma conformação aberta com baixa afinidade
pelo substrato. Nesse caso, as proteínas Hsp40 entregam a proteína-cliente para a
25
Hsp70, e através da interação entre o domínio NBD da Hsp70 e o domínio J da Hsp40,
tem-se o estímulo da atividade ATPase da Hsp70 (hidrólise do ATP), resultando na
predominância da Hsp70 no seu estado ligado ao ADP, apresentando uma
conformação fechada com maior afinidade pelo substrato. Nesse momento, a Hsp110
atua como NEF, estimulando a liberação de ADP da Hsp70, e consequentemente,
permitindo a religação de ATP e liberação do substrato (figura 5) (Cyr e Ramos, 2015;
Gonçalves e Ramos, 2016).
Figura 5. Ciclo funcional Hsp70/Hsp40/Hsp110. A interação entre a Hsp70 ligada
ao ATP e a Hsp40 ligada ao substrato estimula a hidrólise do ATP em ADP, resultando
em uma mudança conformacional na Hsp70, aprisionando o substrato e liberando a
Hsp40. A Hsp110 catalisa a dissociação do ADP da Hsp70 e permite a religação do
ATP, o que provoca a liberação do substrato (Modificado de Shiber e Ravid, 2014).
No entanto, evidências sugerem que além de atuar como NEF, as Hsp110
humanas também colaboram com as Hsp40 para hidrolisar ATP e converter
polipeptídeos mal enovelados em proteínas reenoveladas na forma nativa (Mattoo e
col., 2013). Adicionalmente, elas também cooperam com as Hsp70 no correto
enovelamento de proteínas (Dragovic e col., 2006), ao atuarem como holders,
evitando a agregação desses substratos (Oh e col., 1997).
26
Desse modo, sabendo que o enovelamento correto da proteína é essencial
para que ela atue corretamente e que o acúmulo de proteínas agregadas pelo
enovelamento incorreto é base de muitas doenças degenerativas, entender como o
sistema desagregase pode prevenir a formação de agregados de proteínas
citotóxicas, desagregá-las e solubilizá-las em espécies inofensivas, e como a Hsp110
atua nesse sistema, é essencial para o desenvolvimento de terapêuticos contra
doenças conformacionais (Finka e col., 2015). Logo, o estudo proposto se justifica
pela importância médica e/ou biotecnológica que o mesmo tem, podendo fornecer
resultados com potencial para acrescentar significativamente o conhecimento sobre a
homeostase proteica na célula.
27
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
Caracterização da relação estrutura e função da HSPH1, um membro da
família de co-chaperonas Hsp110 humana.
2.2. Objetivos específicos
• Expressar e purificar a proteína.
• Caracterizar o estado conformacional fazendo uso das técnicas de CD e
emissão de fluorescência intrínseca.
• Investigar o efeito da temperatura e agente desnaturante na conformação,
através da técnica de CD.
• Determinar as características hidrodinâmicas e o estado oligomérico
utilizando GFA, SEC-MALS e DLS.
• Caracterizar a função chaperona in vitro, através de experimentos de
prevenção de agregação de proteínas-cliente.
28
3. MATERIAIS
3.1. Meios de cultura, soluções e tampões
A composição dos meios de cultura, soluções e tampões utilizados estão
apresentadas na tabela 1.
Tabela 1. Meio de cultura, tampão ou solução e sua respectiva composição.
Meio de cultura, tampão ou
solução Composição
Meio SOC
Peptona 20 g L-1; extrato de levedura 5 g L-1;
NaCl 0,5 g L-1; KCl 2,5 mmol L-1; MgCl2 0,01
mmol L-1 e glicose 0,02 mmol L-1, pH 7,0.
Meio LB líquido
Triptona 10 g L-1; extrato de levedura 5 g L-1 e
NaCl 10 g L-1, pH 7,0 (autoclavado por 20 min a
121 ºC).
Meio LB sólido LB líquido suplementado com ágar 1,5%
(autoclavado por 20 min a 121 ºC).
Tampão de Lise
Tris-HCl 50 mmol L-1; pH 8,0; KCl 100 mmol L-1;
EDTA 1 mmol L-1; BME 1 mmol L-1; PMSF 75
μmol L-1; DNAse 5u e lisozima 12,5 μg mL-1.
Tampão A Tris-HCl 20 mmol L-1; pH 7,5; NaCl 100 mmol L-
1; BME 1 mmol L-1.
Tampão B Tris-HCl 20 mmol L-1; pH 7,5; NaCl 100 mmol L-
1; BME 1 mmol L-1 e imidazol 300 mmol L-1.
Tampão de amostra
(eletroforese)
Tris-HCl 50 mmol L-1; pH 6,8; DTT 100 mmol L-
1; SDS 2%; azul de bromofenol 0,1% e glicerol
10%.
Solução corante 1 ácido acético : 5 etanol : 15 água (v:v:v) e
Coomassie Brilliant Blue R (Bio-Rad) 0,25%.
Solução descorante 3 ácido acético : 2 etanol : 35 água (v:v:v).
Solução desnaturante Na3PO4 20 mmol L-1; pH 6,6; Gdm-Cl 6 mol L-1.
29
3.2. Colunas cromatográficas
As resinas das colunas cromatográficas utilizadas estão apresentadas na
tabela 2.
Tabela 2. Coluna cromatográfica e sua respectiva resina.
Coluna cromatográfica Resina (GE Life sciences)
Afinidade HisTrap de 5 mL Ni-Sepharose
SEC XK 26/60 de 320 mL Superdex 200
GFA Tricorn 10/300 GL de 24 mL Superdex 200
3.3. Equipamentos
Os equipamentos utilizados e respectivos objetivos de uso estão
apresentados na tabela 3.
Tabela 3. Equipamento e seu respectivo objetivo de uso.
Equipamento Objetivo de uso
Sistemas Äkta FPLC e Äkta PURE GE Life
Sciences
Absorbância a 280 nm durante
a cromatografia de afinidade,
cromatografia de exclusão por
tamanho, GFA e SEC-MALS.
Sonicador Misonix Ultrasonic Liquid Process
Model S-4000 Lise das células bacterianas.
Espectropolarímetro Jasco (J-720) Medidas de CD.
Fluorímetro Cary Eclipse Agilent
Medidas de emissão de
fluorescência e de
monitoramento de agregação.
Detector multi-ângulo de espalhamento de luz
Mini Dawn TREOS Wyatt acoplado a um
detector de índice de refração Optlab T-rEX
Wyatt
Medidas hidrodinâmicas de
SEC-MALS.
Zetasizer nano Malvern (Zen 3600) Medidas de DLS.
30
3.4. Proteínas-cliente
As proteínas-cliente utilizadas no experimento de caracterização de
proteção contra agregação e seus respectivos lotes estão apresentados na tabela 4.
Tabela 4. Proteína-cliente e seu respectivo lote.
Proteína-cliente Lote (Sigma)
Luciferase de vaga-lume (L9506) SLBB9805
MDH suína (M1567) 019K7024
Insulina humana (I9278) SLBF4191
31
4. MÉTODOS
4.1. Análise do cDNA
Colaboradores do grupo (Prof. Jason Young, McGill University) doaram o
clone contendo o gene de interesse. A porção codificante do gene hsph1 foi clonada
no vetor pPROEX-Htb (figura 6), entre os sítios de restrição das enzimas Ehe1 e Kpn1.
Figura 6. Mapa da região de policlonagem do vetor pPROEX-Htb. Os sítios de
restrição das enzimas utilizadas Ehe1 e Kpn1 estão destacados em vermelho
(Modificado de Invitrogen).
No caso do sistema de expressão do tipo pPROEX em células de E. coli da
linhagem BL21(DE3), o gene que codifica a Trc RNA polimerase normalmente se
encontra inibido pelo repressor lac. Após a adição do indutor IPTG, análogo à lactose,
o repressor se desliga do operador, tornando possível a transcrição da Trc RNA
polimerase e, consequentemente, se inicia a transcrição do gene de interesse (Garges
e Adhya, 2003; Studier e col., 1990). O pPROEX-Htb apresenta uma sequência de
nucleotídeos que codifica uma cauda de polihistidina na região N-terminal, cuja
32
sequência de aminoácidos deve ser randômica, não interfere na função proteica e
facilita a purificação de proteínas. Além disso, esse vetor também contém um sítio de
clivagem para a protease TEV, o que possibilita a remoção dessa cauda, se
necessário.
Uma vez tendo o clone de interesse, o sequenciamento de DNA foi
realizado pela empresa Helixxa com oligonucleotídeos no sentido forward e reverse,
apresentados na tabela 5.
Tabela 5. Oligonucleotídeos utilizados no sequenciamento da HSPH1.
Primer forward Primer reverse
5’CACGATTACGATATCCCAACGACCGA
AAACCTGTATTTTCAGGGCGCC3’ 5’GATTTAATCTGTATCAGG3’
A análise bioinformática também foi feita para predizer os parâmetros
físico-químicos da proteína em estudo (programa Protparam encontrado no Expasy),
assim como para verificar sua identidade com outras proteínas (programa Clustawl).
4.2. Transformação de bactérias e expressão de proteínas
Cepas de E. coli BL21 (DE3) (Stratagene) foram utilizadas para expressão
da proteína recombinante (HSPH1), já que possuem baixos níveis de produção de
proteases, evitando a degradação das proteínas-alvo (Studier e Moffatt, 1986). As
bactérias E. coli BL21 (DE3) foram transformadas através de choque térmico
(Sambrook e Russell, 2001), recebendo os vetores plasmidiais contendo o DNA
codificante para a proteína HSPH1 após serem submetidas a uma mudança de
temperatura: incubação da célula competente e do DNA plasmidial em banho de gelo
(30 min), seguida pela incubação a 42 ºC (1 min 30 s), retorno ao banho de gelo com
adição imediata do meio SOC e posterior incubação a 37 ºC (45 min). Após a
transformação, adicionou-se 100 μL da cultura de bactérias em uma placa contendo
meio LB sólido e o antibiótico ampicilina 50 μg mL-1. Em seguida, essa placa foi
incubada por aproximadamente 18 h a 37 °C para crescimento das células. Para o
crescimento bacteriano em suspensão, utilizou-se o meio de cultura LB líquido
contendo o antibiótico ampicilina 50 μg mL-1. A adição do antibiótico específico
(ampicilina) ao meio estéril garantiu a seleção e manutenção das células
33
transformadas com o vetor de interesse (pPROEX-Htb), já que a cepa de E. coli
utilizada BL21(DE3) não possui naturalmente resistência a este antibiótico e o vetor
confere essa resistência.
Para o procedimento de expressão, colônias isoladas foram solubilizadas
em 250 mL de meio LB contendo 50 μg mL-1 de ampicilina, e incubadas por 18 h a 37
°C, sob agitação constante de 200 rpm (pré-inóculo). Então, 25 mL desse pré-inóculo
foi solubilizado em 500 mL de meio LB contendo 50 μg mL-1 de ampicilina e incubado
a 25 °C, sob agitação constante de 200 rpm, até atingir a absorbância a 600 nm entre
0,6 e 0,8. Atingido esse valor, adicionou-se 0,4 mmol L-1 do indutor IPTG, induzindo a
expressão da proteína de interesse por um período de aproximadamente 18 h a 18
°C, sob agitação constante de 200 rpm. Por fim, centrifugou-se por 15 min (2497 rcf,
4 °C), e o precipitado obtido foi armazenado a -20 °C.
4.3. Lise bacteriana
O precipitado contendo as bactérias que expressaram a proteína
recombinante foi lisado em um sonicador. Primeiramente, em um banho de gelo,
adicionou-se ao precipitado descongelado o tampão de lise (20 mL de tampão a cada
0,5 L de indução). Após homogeinizada, essa suspensão foi sonicada por 2 min e 30
s, sendo: um pulso de 5 s, com intervalos de 1 min entre cada sonicação de amplitude
de 30 W.
Após esse procedimento de lise, realizou-se o teste de expressão, onde
alíquotas de precipitado antes e após a indução com o IPTG foram lisadas e
analisadas por gel de poliacrilamida. Após o teste de expressão, a suspensão foi
centrifugada (15871 rcf, 30 min, 4 °C) e a fração correspondente ao material solúvel
foi filtrada utilizando membrana de 45 μm e armazenada a 10 °C até a etapa de
purificação.
4.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Utilizou-se a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida para analisar
as amostras obtidas no teste de expressão e em cada etapa de purificação realizada.
Essa técnica fundamenta-se no fato de que uma molécula com carga elétrica se move
em um campo elétrico. A força desse campo, além da carga e da forma da molécula,
influencia na velocidade e na distância de deslocamento. As proteínas são
desnaturadas na presença de SDS e esse detergente se liga numa razão constante,
34
fazendo com que todos os polipeptídeos fiquem com a mesma proporção
carga/massa, sendo então separados apenas por suas massas (Stryer, 2004;
Laemmli, 1970).
As amostras foram diluídas em tampão de amostra para eletroforese, e
juntamente com um padrão de massa molecular, foram submetidas à eletroforese em
SDS-PAGE, utilizando gel de empacotamento 5%, gel de separação 10%, e voltagem
constante de 200 V por aproximadamente 1 h 40 min. Os géis foram corados por 15
min em solução corante e em seguida descorados em solução descorante.
4.5. Purificação da proteína
4.5.1. Cromatografia de afinidade
A cromatografia de afinidade é baseada na afinidade diferencial de
moléculas ou grupamentos químicos específicos, que podem ser imobilizados em uma
matriz sólida (resina da coluna). As proteínas possuem certos resíduos de
aminoácidos que podem doar elétrons para o íon metálico adsorvido na matriz da
coluna, ficando assim, retidas na coluna. Em seguida, aplica-se um eluente capaz de
competir com os resíduos de aminoácidos pela ligação ao metal para eluir as proteínas
de interesse que interagem com a matriz da coluna (Porath, 1992).
Para purificar a HSPH1, utilizou-se uma coluna cromatográfica contendo o
íon níquel imobilizado na resina. Como a proteína em estudo foi expressa contendo
uma cauda de polihistidina (6 H seguidas), o anel dessas histidinas, por ligações de
coordenação com o íon metálico Ni2+, reteve a proteína na coluna. Para eluir a
proteína da coluna, utilizou-se concentrações crescentes de imidazol, com o intuito de
aumentar a força cromatográfica da fase móvel. Os tampões utilizados foram: tampão
A de ligação e lavagem e tampão B de eluição. Após o gel de poliacrilamida, as frações
eluídas da cromatografia de afinidade que continham a proteína de interesse foram
reunidas e dialisadas para remoção do imidazol. Em seguida, a amostra obtida foi
concentrada até aproximadamente 15 mL, filtrada utilizando membrana de 22 μm e
então submetida à cromatografia de exclusão por tamanho.
4.5.2. Cromatografia de exclusão por tamanho
A cromatografia de exclusão por tamanho é uma técnica cromatográfica na
qual as proteínas são separadas de acordo com o seu tamanho. A coluna
cromatográfica utilizada nesta técnica é constituída por uma resina (matriz) a base de
35
polímeros (apresenta pequenas esferas porosas) como fase estacionária. Assim, ao
se aplicar uma solução proteica pela coluna, as proteínas pequenas migram entrando
nos poros dessas esferas, resultando em um maior caminho percorrido por estas
proteínas e aumentado o tempo e volume de eluição das mesmas. Por outro lado, as
proteínas maiores passam diretamente pela coluna, sem entrar nos pequenos poros
da resina, e, portanto, são eluídas em um tempo menor (Barth e col., 1994).
O tampão utilizado foi o tampão A, com fluxo de eluição de 1,5 mL min-1.
Após o gel de poliacrilamida, reuniu-se as frações eluídas da cromatografia de
exclusão por tamanho que continham a proteína de interesse e mediu-se a
concentração da HSPH1 obtida.
4.6. Determinação da concentração de proteína
Utilizou-se o método espectroscópico de absorbância, Método de Edelhoch
(Edelhoch, 1967), modificado por Pace (Pace e col., 1995), para determinar a
concentração da proteína pura em solução (proteína obtida após a cromatografia de
exclusão por tamanho). A utilização deste método foi possível devido a presença de
resíduos de triptofano e tirosina na HSPH1, que estão relacionados com a
absorbância a 280 nm. Desse modo, o coeficiente de absorbância molar da proteína
(Ɛ280) foi calculado utilizando a seguinte equação, em solução desnaturante e
considerando ambiente redutor, de modo a expor os resíduos de aminoácido e reduzir
as ligações cistina da proteína (ligações entre resíduos de cisteína):
Ɛ280 (proteína) = (ƐTrp.nTrp) + (ƐTyr.nTyr)
Onde Ɛ280 é o coeficiente de absorbância molar da proteína a 280 nm (mol
L-1 cm-1); nTrp e nTyr referem-se aos números de triptofanos e tirosinas,
respectivamente; ƐTrp e ƐTyr são os coeficientes de absorbância molar a 280 nm: 5690
e 1280 mol L-1 cm-1, respectivamente. Uma vez tendo o valor de Ɛ280, a medida de
absorbância em 280 nm e o caminho ótico da cubeta utilizada, calculou-se a
concentração da proteína, pois segundo a lei de Lambeert-Beer, a absorbância é uma
função linear da concentração molar:
A = Ɛ.b.C
Onde A é a absorbância, Ɛ o coeficiente de absorbância molar (mol L-1 cm-
1), b o caminho ótico (cm) e C a concentração molar (mol L-1) (Pace e col., 1995).
36
4.7. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD)
No método de CD, luz circularmente polarizada à esquerda e à direita incide
sobre a amostra e a diferença de absorção entre elas é medida. Essa diferença resulta
em uma luz elipticamente polarizada e seu ângulo, representado por ϴ (mdeg) (para
revisão ver Correa e Ramos, 2009). Elipticidade e absorção são relacionadas, e o
resultado é usualmente expresso como elipticidade molar [ϴ]:
[ϴ] = (ϴ.100.MM) / (C.b.n)
Onde, [ϴ] é a elipticidade molar (deg cm2 dmol-1), ϴ é a elipticidade (mdeg),
MM é a massa molecular (kDa), C é a concentração (mg mL-1), b é o caminho ótico
(cm) e n o número de resíduos da proteína. De maneira geral, a porcentagem de hélice
α (fH) é calculada considerando a elipticidade molar em 222 nm ([ϴ]222):
fH = ([ϴ]222 – 3000) / (–36000 – 3000) (Morriset e col., 1973).
Dessa forma, a técnica de CD foi utilizada principalmente para a avaliação
do enovelamento e estabilidade da proteína enovelada. Monitorou-se a composição
da estrutura secundária da proteína e a manutenção desta estrutura, ao submeter a
proteína a temperaturas elevadas e na presença de ureia (que atua como um agente
desnaturante). As amostras foram solubilizadas em tampão A e todas as medidas
foram feitas sob fluxo de 10 L min-1 de nitrogênio, tendo como branco o tampão da
proteína analisada.
Para os experimentos de análise de estrutura secundária, utilizou-se cubeta
de quartzo de 1 mm de caminho óptico e concentração proteica de 4,1 μmol L-1. Os
resultados são a média de uma triplicata de lotes diferentes de proteína com pelo
menos 8 espectros acumulados medidos de 205 a 260 nm, com velocidade de 20 nm
min-1. Já os experimentos de análise do desenovelamento térmico, fizeram uso de
cubeta de quartzo de 2 mm de caminho óptico e concentração proteica de 2,3 μmol L-
1. Os resultados são a média de uma triplicata de lotes diferentes de proteína com
sinal monitorado a 222 nm na faixa de temperatura de 20 a 90 °C, com velocidade de
1 °C min-1. Por fim, os experimentos de análise do desenovelamento químico foram
realizados em cubeta de quartzo de 2 mm de caminho óptico e concentração proteica
de 2,5 μmol L-1. Os resultados são a média de uma triplicata de lotes diferentes de
proteína com pelo menos 6 medidas com sinal monitorado a 222 nm. A concentração
da proteína foi mantida constante na presença de ureia de 0 a 8 mol L-1, com
incubação de 1 h 40 min a 25 °C.
37
4.8. Espectrometria de emissão de fluorescência
A emissão de fluorescência foi utilizada para monitorar sonda intrínseca,
como os resíduos de aminoácido de triptofano (W), que apresentam espectros
diferentes dependendo da polaridade do meio em que estão localizadas na proteína
(Lakowicz, 1999; Ramos, 2004). Se o resíduo de W estiver localizado no interior da
proteína enovelada, não exposto ao solvente, ele vai fluorescer em comprimentos de
onda (λ) menores. Por outro lado, se o resíduo se encontra na superfície proteica, em
um ambiente polar (solvente), a fluorescência ocorrerá em λ maiores (Lakowicz,
1999). Logo, a indução do desenovelamento da proteína (com a adição de um agente
desnaturante, por exemplo ureia), resulta na exposição ao solvente (ambiente polar)
dos resíduos de aminoácidos que se encontravam no interior da sua estrutura
enovelada e, portanto, ela fluoresce em λ maiores.
Os experimentos de fluorescência foram realizados em um fluorímetro
(Cary Eclipse Agilent) com cubeta de quartzo de 10 mm x 2 mm de caminho ótico. Os
espectros de emissão de fluorescência foram monitorados utilizando-se o λ de
excitação de 295 nm e de emissão de 300 a 400 nm. Foram utilizadas soluções da
proteína na concentração de 2,5 μmol L-1, solubilizadas em tampão A na presença de
ureia de 0 a 8 mol L-1, com incubação de 1 h 40 min a 25 °C. Os dados de emissão
de fluorescência obtidos foram analisados pelo comprimento de onda máximo (λ máx)
e pelo centro de massa espectral (<λ>), dado pela equação:
<λ > = (ƩλiFi) / (ƩFi)
Onde λi corresponde a cada λ e Fi a intensidade de fluorescência em λi.
4.9. Gel filtração analítica (GFA) e GFA acoplada ao espalhamento de luz
multiângulo (SEC-MALS)
A GFA, ou SEC, pode ser utilizada sozinha ou combinada com detector
MALS para caracterização de proteínas (Gava e col., 2011; Silva e col., 2013;
Zanphorlin e col., 2014).
A técnica de GFA foi utilizada para caracterização do Raio de Stokes (Rs),
ou raio hidrodinâmico, da proteína. Essa técnica separa as proteínas de acordo com
seu tamanho molecular, que juntamente com a forma, influencia no volume em que
as proteínas são eluídas da coluna. Para tal, utilizou-se cinco proteínas padrão
monoméricas de formato esférico, massa molecular e Rs conhecidos (tabela 6). Essas
38
proteínas foram utilizadas de modo a abranger toda resolução cromatográfica da
coluna utilizada.
Tabela 6. Propriedades físico-químicas das proteínas utilizadas como padrão no
experimento de gel filtração analítica.
Proteínas MM (kDa) Rs (Å)
Ovoalbumina 43 30,5
Conalbumina 75 47,0
Aldolase 158 48,1
Ferritina 440 61,0
Tireoglobulina 669 85,0
Primeiramente, calculou-se o coeficiente de partição (Kav) para todas as
proteínas padrão, assim como para a proteína de interesse, de acordo com a equação:
Kav = (Ve-Vo) / (Vc-Vo)
Onde, Ve é o volume de eluição da proteína, Vo é o volume morto da coluna
e Vc é o volume total da coluna. Uma vez tendo os valores de Kav, construiu-se uma
curva de calibração de Rs versus (-log Kav)1/2. A partir da equação da reta, obtida,
estimou-se o valor de Rs da proteína em estudo (Tiroli e Ramos, 2007). As proteínas
padrão foram utilizadas na concentração de aproximadamente 1 mg mL-1,
solubilizadas em tampão A.
Com o intuito de caracterizar o estado oligomérico e a massa molecular da
proteína em estudo, acoplou-se o experimento de GFA a um detector MALS (SEC-
MALS) e a um detector de índice de refração. O SEC-MALS é capaz de determinar a
massa molecular absoluta e o tamanho de proteínas (Gava e col., 2011; Silva e col.,
2013; Zanphorlin e col., 2014). Desse modo, as proteínas foram separadas de acordo
com o seu tamanho e, através das informações da intensidade da luz espalhada e do
índice de refração medido, determinou-se a massa molecular (MM) da proteína de
concentração conhecida (Wyatt, 1993).
O tratamento dos dados foi realizado com auxílio do programa ASTRA
(Wyatt Technologies). Foram utilizadas soluções proteicas nas concentrações de 3,7
e 7,3 mg mL-1, previamente centrifugadas (17949 rcf, 15 min, 4 ºC), solubilizadas no
tampão A.
39
4.10. Espalhamento de luz dinâmica (DLS)
O DLS é uma técnica que mede a intensidade de flutuação do movimento
Browniano das partículas, adequada para determinação do coeficiente de difusão (D)
das mesmas. O valor de D é dependente do tamanho da partícula, da estrutura da
superfície, da concentração e do tipo de íons presentes no meio, o que afeta a
velocidade de difusão das partículas (Jachimska e col., 2008). Os experimentos foram
realizados a 25 ºC utilizando diversas concentrações proteicas entre 10,5 e 64,0 μmol
L-1. As amostras foram previamente centrifugadas (17949 rcf, 15 min, 4 ºC) e
solubilizadas no tampão A.
4.11. Caracterização dos parâmetros hidrodinâmicos
A combinação de GFA e SEC-MALS tem sido utilizada para obter
informações importantes sobre a conformação e interação de chaperonas moleculares
(Gonçalves e col., 2010; Gava e col., 2011). Essas técnicas, juntamente com o DLS,
são utilizadas para se obter informação sobre a MM, o Rs e o D da proteína. Esses
parâmetros estão relacionados pela equação de Stokes-Einstein:
D = [(KB.T) / (6.π.η. Rs)], sendo Rs = [(3.MM.Vbar) / (4.π.N)]1/3
Onde, D é o coeficiente de difusão (m2 s-1), KB a constante de Boltzman, T
a temperatura absoluta, η a viscosidade do tampão, obtida pelo software Sednterp
como sendo igual a 1,29 x 10-2 Poise, Rs o Raio de Stokes (m), MM a massa molecular
(kDa), Vbar volume parcial específico (Vbar = 0,7269 mL g-1) e N o número de Avogadro.
Essas equações permitem validar as medidas e obter informações sobre a
conformação da proteína, por exemplo sua semelhança a estruturas globulares
(Borges e Ramos, 2011), através do fator de Perrin:
(f/fo) = (Rs/ Rso), sendo:
f = 6.π.η. Rs e fo = 6.π.η. Rso;
Onde, f é o coeficiente friccional, η é a viscosidade do tampão e Rs é o Raio
de Stokes obtido por GFA e Rso e fo são definidos para uma esfera de mesma massa
molecular não hidratada.
4.12. Caracterização de proteção contra agregação
Os experimentos de proteção contra agregação foram realizados na
presença da HSPH1 para avaliar se esta consegue proteger proteínas-cliente contra
a agregação, ou seja, possui atividade chaperona. Foram feitos experimentos com as
40
proteínas-cliente isoladas, assim como com a HSPH1 isolada, para controle. No caso
de proteção da proteína-cliente contra agregação, os experimentos foram repetidos
substituindo a HSPH1 por proteínas modelo (BSA e Aldolase), para eliminar o efeito
de exclusão de volume. Os experimentos foram realizados com cubeta de quartzo de
10 mm x 2 mm de caminho ótico, monitorando o espalhamento de luz em um
comprimento de onda fixo (320 nm), já que o fenômeno de agregação pode ser
monitorado pelo aumento no espalhamento de luz (Tiroli e Ramos, 2007).
Para as proteínas-cliente modelo luciferase e MDH, a agregação térmica
foi monitorada através de um espectrofotômetro em função do tempo durante 50 min
a 40 °C. A temperatura experimental foi estabelecida de acordo com a estabilidade
térmica da HSPH1 e das proteínas-cliente. Para a proteína-cliente modelo insulina, a
agregação em um ambiente redutor foi monitorada durante 50 min a 20, após uma
incubação de 30 min no gelo na presença de DTT.
A atividade chaperona relativa foi calculada pela porcentagem de proteção
contra a agregação das proteínas-cliente, de acordo com a equação:
Proteção (%) = 100[(Δe – Δech) / Δe]
Onde Δe representa o máximo de espalhamento de luz da proteína-cliente
(intensidade no tempo final subtraída da intensidade no tempo inicial da proteína-
cliente isolada), enquanto que Δech se refere ao máximo de espalhamento de luz na
presença da chaperona HSPH1, descontando o sinal da chaperona isolada
(considerando em ambos, o tempo final da reação). Todas as proteínas foram
solubilizadas em tampão A.
41
5. RESULTADOS
5.1. Sequência proteica
O cDNA correspondente à porção codificante do gene hsph1 humano foi
clonado no plasmídeo pPROEX-Htb entre os sítios de restrição das enzimas EheI e
KpnI, fundindo ao N-terminal uma cauda de 25 resíduos de aminoácidos
(MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGA), contendo uma sequência de 6 resíduos de
histidinas seguidas, comumente chamada de cauda de polihistidina. Desse modo, a
HSPH1 expressa com a cauda possui uma sequência de 883 resíduos de
aminoácidos, apresentada na figura 7.
Figura 7. Sequência de resíduos de aminoácidos da HSPH1. A cauda de
polihistidina está representada em vermelho. Os resíduos de tirosina (Y) estão
destacados em amarelo, enquanto que os resíduos de triptofano (W) estão
destacados em verde.
A partir dessa sequência de aminoácidos para a proteína fusionada à cauda
de histidina, determinou-se o número de resíduos de Y e W presentes na proteína, e
42
calculou-se o seu coeficiente de extinção molar (Ɛ), considerando ambiente redutor,
através do método de Edelhoch (tabela 7).
Tabela 7. Quantidade de resíduos de tirosina e triptofano presentes na HSPH1, assim
como o valor do seu coeficiente de extinção molar, obtido pelo método de Edelhoch.
Proteína Y W Ɛ (mol L-1 cm-1)
HSPH1 23 4 52200
Além disso, com o auxílio do programa Protparam encontrado no portal
Expasy, fez-se a predição dos parâmetros físico-químicos para a proteína fusionada
á cauda de histidina, presentes na tabela 8.
Tabela 8. Parâmetros físico-químicos preditos para a proteína HSPH1 fusionada á
cauda de histidina, a partir da sequência de aminoácidos.
Proteína Massa Molecular (kDa) Ponto isoelétrico (pI)
HSPH1 99,96 5,34
Para verificar a porcentagem de identidade da HSPH1 humana com
diferentes homólogos, realizou-se o alinhamento da sequência de resíduos de
aminoácidos da proteína de interesse com outras proteínas. A tabela 9 apresenta a
porcentagem de identidade referente a cada homólogo.
Tabela 9. Alinhamento dos homólogos com a HSPH1 humana.
Homólogo Identidade (%)
HSPH2 de Homo sapiens 95
Hsp110 de Mus musculus 93
Hsp70 de Arabidopsis thaliana 40
Sse1 de Saccharomyces cerevisiae 37
DnaK de E. coli 31
43
5.2. Expressão da proteína
A figura 8 apresenta o resultado do teste de expressão. Observa-se que a
proteína HSPH1 foi expressa em E. coli BL21(DE3) predominantemente na fração
solúvel (SN), sendo a melhor condição de expressão encontrada a 18 ºC por um
período de aproximadamente 18 hs. A migração no SDS-PAGE da banda da proteína
HSPH1, massa molecular predita de 99,96 kDa (destacada em vermelho), ocorreu
entre os padrões de massa molecular de 116 e 97 kDa.
Figura 8. Análise do teste de expressão da HSPH1 por gel de SDS-PAGE 10%.
MM: padrões de massa molecular (em kDa). NI: fração não induzida, antes da adição
de IPTG. PT: proteína total após a indução com IPTG. SN: proteína presente na fração
solúvel, sobrenadante da fração PT após a lise. IS: proteína presente na fração
insolúvel, precipitado da fração PT após a lise. Delimitado pelo retângulo vermelho,
observa-se a região de migração da HSPH1.
5.3. Purificação da proteína
A proteína HSPH1 foi purificada em duas etapas cromatográficas. A
primeira etapa utilizada foi a cromatografia de afinidade ao níquel, para separar a
HSPH1, fusionada a cauda de histidina, da grande maioria dos contaminantes
provenientes da E. coli. Primeiramente, fez-se a injeção do sobrenadante filtrado
44
resultante do material lisado das células bacterianas obtidas após a expressão (I),
seguida por uma lavagem com o tampão de eluição. Isso resultou na eluição do
primeiro pico no cromatograma (figura 9), que apresentou a maior absorbância (em
torno de 3000 mAu), comparada aos demais picos, pois se refere ao material que não
teve afinidade pela coluna (FT). Após a lavagem ter sido eficiente, utilizou-se um
gradiente com variação crescente da concentração de imidazol, visando aumentar a
força cromatográfica da fase móvel e eluir as proteínas que estavam retidas na coluna.
O segundo, terceiro e quarto picos foram eluídos com 7% (21 mmol L-1 de imidazol),
14% (42 mmol L-1 de imidazol) e 100% (300 mmol L-1 de imidazol) do tampão B,
respectivamente. Essa primeira etapa cromatográfica foi analisada por gel de SDS-
PAGE 10% (figura 10). Logo, através dos resultados do cromatograma (figura 9) e do
gel (figura 10), observou-se que a proteína foi eluída na presença de 42 mmol L-1 de
imidazol, no pico de absorbância entre 100 e 140 mL.
45
Figura 9. Cromatograma de afinidade da HSPH1. Cromatograma referente a 0,75
L de indução. Em preto: perfil do cromatograma medido na forma de absorbância a
280 nm. Em vermelho: porcentagem do tampão B (nula até aproximadamente 60 mL
seguida por uma pequena variação linear e valores constantes em 7%, 14% e 100%).
O primeiro pico se refere a fração que não teve afinidade pela coluna (FT), saindo logo
após a injeção do lisado das células bacterianas (I). O segundo, terceiro e quarto picos
foram eluídos com 7% (21 mM de imidazol), 14% (42 mM de imidazol) e 100% (300
mM de imidazol) do tampão B, respectivamente.
46
Figura 10. Análise da cromatografia de afinidade por gel de SDS-PAGE 10%. Gel
referente a uma indução de 0,75 L. MM: padrões de massa molecular (em kDa). I:
fração lisada das células bacterianas injetada na coluna. FT: fração que não teve
afinidade pela coluna. L: fração eluída após a lavagem com tampão A. 21 mM, 42 mM
e 300 mM: picos que foram eluídos com 21, 42 e 300 mmol L-1 de imidazol. Delimitado
pelo retângulo vermelho: região de migração da HSPH1.
Após a diálise, as frações que foram eluídas com 42 mmol L-1 de imidazol
(contendo as bandas referentes a HSPH1, delimitadas no retângulo vermelho) foram
concentradas (cerca de 40 mL em 15 mL), filtradas a 0,22 μm e submetidas a
cromatografia de exclusão por tamanho, utilizada para separação das proteínas por
massa molecular, isolando a proteína de interesse em um único estado oligomérico.
As frações eluídas com 300 mmol L-1 de imidazol foram desprezadas devido a
presença de contaminantes. Essa segunda etapa cromatográfica também foi
analisada por gel de SDS-PAGE 10%.
O cromatograma por exclusão por tamanho (figura 11) apresentou quatro
picos de absorbância (P1, P2, P3 e P4) entre os volumes de eluição de
aproximadamente 100 e 225 mL. De acordo com os resultados do cromatograma
(figura 11) e pelo gel (figura 12), nota-se que a proteína de estudo se encontra em um
único estado oligomérico, mas na presença de uma espécie entre 31 e 45 kDa. É
importante destacar que foi verificado que essa espécie não se trata de degradação.
47
Figura 11. Cromatograma de exclusão por tamanho da HSPH1. Cromatograma
referente a uma indução de 1,5 L. Observa-se a presença de 4 picos de absorbância
entre os volumes de eluição de aproximadamente 100 e 225 mL, sendo P1, P2 e P4
de intensidade menor que 50 mAu e P3 de intensidade entre 200 e 250 mAu.
48
Figura 12. Análise da cromatografia de exclusão por tamanho por gel de SDS-
PAGE 10%. Gel referente a uma indução de 1,5 L. MM: padrões de massa molecular
(em kDa). I: fração concentrada e filtrada resultante da cromatografia de afinidade. P1,
P2, P3 e P4: picos 1, 2, 3 e 4, respectivamente. Delimitado pelo retângulo vermelho:
região de migração da HSPH1.
Com o intuito de investigar se a espécie entre 31 e 45 kDa se encontrava
em quantidade significativa, misturou-se as frações presentes no pico 3 (contendo as
bandas da HSPH1 delimitadas no retângulo vermelho), e realizou-se uma diluição
seriada, analisando o resultado por densitometria através do programa ImageJ (figura
13).
49
Figura 13. Análise da pureza da HSPH1 por gel de SDS-PAGE 10%. MM: padrões
de massa molecular (em kDa). 1x, 2x, 5x e 10x: amostra diluída em 1x, 2x, 5x e 10x,
respectivamente. Através da análise por densitometria usando o programa ImajeJ,
obteve-se a porcentagem referente a banda da HSPH1, comparada com a outra
espécie, que varia de 95 a 100%, conforme se aumenta a diluição.
Nota-se que a porcentagem da HSPH1 aumenta com a diluição, sendo,
portanto, a espécie predominante. Sabendo que esse contaminante não está presente
de maneira considerável, utilizou-se essa proteína para caracterização, após medir
sua concentração pelo método de Edelhoch. Assim, a proteína HSPH1 foi purificada
com pureza maior que 95% em duas etapas cromatográficas, com um rendimento de
cerca de 16 mg L-1.
5.4. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD)
Para caracterizar a estrutura secundária da HSPH1, foram realizados
experimentos de CD, monitorando a elipticidade e a voltagem da fotomultiplicadora
(figuras 14 A e B, respectivamente). Na figura 12 A, observa-se que a HSPH1
apresenta espectro de CD condizente com o de proteínas enoveladas, sendo o
conteúdo de hélice α igual 39 ± 2%. Vale destacar que o o conteúdo de hélice α predito
50
para a sequência de aminoácidos da HSPH1 pelo programa Gor4 foi igual a 40 %.
Desse modo, sabendo que a HSPH1 apresenta estrutura secundária do tipo hélice α
(com mínimos em 208 e 222 nm), monitorou-se o sinal de dicroísmo a 222 nm para
avaliar a estabilidade do seu enovelamento, através de um experimento de
desenovelamento térmico: aquecendo a proteína de 20 a 90 ºC e em seguida
resfriando de 90 a 20 ºC (figura 15 A). Observa-se que o desenovelamento medido
durante o aquecimento segue um padrão sigmoidal, apresentando um valor médio
(Tm) igual a aproximadamente 48 ºC (transição). O reenovelamento monitorado de 90
a 20 ºC se sobrepõem ao desenovelamento apenas na região de pós-transição. Além
de valores de elipticidade, a voltagem da fotomultiplicadora também foi medida
durante o experimento (figura 15 B), apresentando valores crescentes durante o
aquecimento e decrescentes durante o resfriamento.
51
Figura 14. A) Caracterização da estrutura secundária da HSPH1. Quadrados
pretos: média de um experimento realizado em triplicata com lotes de proteínas
diferentes. É possível observar em 208 e 222 nm as bandas negativas características
de hélice α. B) Voltagem da fotomultiplicadora medida durante a caracterização
da estrutura secundária da HSPH1. Nota-se que a voltagem varia de cerca de 300
a 650 V, na faixa analisada (de 260 a 205 nm).
52
Figura 15. A) Desenovelamento térmico da HSPH1. Os símbolos correspondem à
média de um experimento realizado em triplicata com lotes de proteínas diferentes. O
desenovelamento medido variando a temperatura de 20 a 90 ºC (quadrado preto)
segue um padrão sigmoidal (ajuste sigmoidal para acompanhar o olhar: y = A2 + [(A1
- A2) / (1+ E(x-x0/dx)]); R² = 0,99). De 20 a 40 ºC observa-se que a elipticidade molar
se manteve estável (pré-transição). De 40 a 60 ºC nota-se uma alteração abrupta de
sinal (transição), com valor médio (Tm) igual a aproximadamente 48 ºC. A partir de 60
até 90 ºC, novamente a elipticidade se mantém estável (pós-transição). O
reenovelamento foi monitorado de 90 a 20 ºC (esfera vermelha). De 90 a 20 ºC
53
observa-se uma pequena variação no sinal que se sobrepõem ao desenovelamento
apenas na região de pós-transição. B) Voltagem da fotomultiplicadora medida
durante o desenovelamento térmico da HSPH1. Em preto: medida de voltagem
durante o aquecimento de 20 a 90 ºC. A voltagem aumenta durante o aquecimento,
mas apresenta um salto significativo apenas em 90 ºC. Em vermelho: voltagem
medida durante o resfriamento de 90 a 20 ºC. Nota-se uma queda abrupta entre 90 e
80 ºC, seguida por uma região estável.
O sinal de dicroísmo a 222 nm também foi monitorado em experimento de
desenovelamento químico: submetendo a proteína a concentrações crescentes de um
agente desnaturante (ureia de 0 a 8 mol L-1) e em seguida a concentrações
decrescentes (de 8 a 0,5 mol L-1) (figura 16). Nota-se que a HSPH1 apresenta
desenovelamento químico com pelo menos uma transição bem definida entre 1,8 e
2,9 mol L-1 de ureia, apresentando valor médio (Cm) de aproximadamente 2,8 mol L-1
de ureia.
54
Figura 16. Desenovelamento químico da HSPH1. Os símbolos correspondem a
média de um experimento realizado em triplicata com lotes de proteínas diferentes. O
desenovelamento foi medido adicionando-se quantidades crescentes de ureia, com
variação de 0 a 8,0 mol L-1 (quadrado preto) e segue um padrão sigmoidal. De 0 a 1,5
mol L-1 observa-se que a elipticidade molar se manteve praticamente constante (pré-
transição). De 1,8 a 2,9 mol L-1 nota-se uma alteração significativa de sinal, com valor
médio correspondente a aproximadamente 2,8 mol L-1 (transição). A partir de 2,9 até
8,0 mol L-1, novamente a elipticidade se mantém estável (pós-transição). O
reenovelamento foi monitorado de 8,0 a 0,5 mol L-1 (esfera vermelha), apresentando
sinal que praticamente se sobrepõem ao desenovelamento.
5.5. Espectrometria de emissão de fluorescência
Essa técnica permite uma análise do ambiente do resíduo de triptofano (W),
devido à sensibilidade desse resíduo à polaridade do ambiente. Dessa forma, os
espectros de emissão de fluorescência da HSPH1 foram obtidos em condições nativas
(ausência de ureia) e em condições de desnaturação (ureia variando de 0,5 a 8,0 mol
L-1), de modo a expor os resíduos de W da HSPH1, que se encontravam no interior
da sua estrutura enovelada, ao solvente (ambiente polar) e comparar os espectros
nas diferentes condições. Os experimentos foram realizados com HSPH1 a 2,5 μmol
L-1, excitando em 295 nm (W), observando a emissão de fluorescência entre 300 e
55
400 nm. Os resultados na ausência e na presença de ureia 6,0 e 8,0 mol L-1 (para
melhor visualização) estão apresentados na figura 17.
Figura 17. Espectro de emissão de fluorescência da HSPH1 com excitação em
295 nm. Resultado dos experimentos realizados na ausência (preto) e na presença
de ureia 6,0 mol L-1 (vermelho) e 8,0 mol L-1 (azul).
De maneira geral, conforme se aumenta a concentração de ureia, observa-
se um deslocamento no comprimento de onda de emissão para λ maiores. Além disso,
em condições de desnaturação também ocorre uma diminuição na intensidade de
emissão de fluorescência. Esse efeito pode ser observado na figura 18 (em vermelho),
que apresenta todos os dados de desnaturação (ureia variando de 0,5 a 8 mol L-1). A
figura 18 também contem a variação do centro de massa (em azul), que aumenta
conforme se aumenta a concentração de ureia. A variação do centro de massa mostra
um desenovelamento químico onde a transição tem Cm igual a aproximadamente 3,3
mol L-1, enquanto que a emissão de fluorescência em 340 nm apresenta Cm igual a
aproximadamente 2,2 mol L-1.
56
Figura 18. Efeito do desenovelamento químico na intensidade da emissão de
fluorescência e no centro de massa da HSPH1. Os símbolos correspondem à média
de um experimento realizado em triplicata com lotes de proteínas diferentes. Em
vermelho: intensidade de fluorescência (com excitação em 295 nm e emissão em 340
nm). Em azul: centro de massa (com excitação em 295 nm e emissão entre 300 e 400
nm).
5.6. Gel filtração analítica (GFA) e GFA acoplada ao espalhamento de luz
multiângulo (SEC-MALS)
A GFA foi utilizada para medir o Rs da proteína em estudo. A figura 19
apresenta um dos experimentos realizados. A partir da GFA das proteínas padrão
(figura 19, em preto), e dos volumes de eluição (Ve) dessas proteínas de MM e Rs
conhecidos (tabela 10), construiu-se uma curva de calibração (figura 20, em preto).
Com a equação da reta obtida (y = -34 + 107 x; R² = 0,98) (figura 20, em vermelho),
foi possível relacionar o tamanho com o volume de eluição da HSPH1. Desse modo,
o Rs da HSPH1 pode ser calculado e foi igual a 48 ± 1 Å (figura 20, em verde).
57
Tabela 10. Volumes de eluição (Ve) e propriedades físico-químicas das proteínas
padrão utilizadas.
Proteínas Ve (mL) MM (kDa) Rs (Å)
Ovoalbumina 15,2 43 30,5
Conalbumina 14,4 75 47,0
Aldolase 13,1 158 48,1
Ferritina 10,6 440 61,0
Tireoglobulina 9,2 669 85,0
Figura 19. Cromatograma de gel filtração analítica para determinação do raio de
Stokes da HSPH1. Em azul: cromatograma do corante Blue-dextran (BD), com
volume de eluição equivalente ao volume morto da coluna (Vo = 8,1 mL). Dessa forma,
os picos que estão contidos no pico do BD não são considerados. Em preto:
cromatograma das proteínas padrão: tireoglobulina (Ve = 9,2 mL), ferritina (Ve = 10,6
mL), aldolase (Ve = 13,1 mL), conalbumina (Ve = 14,4 mL) e ovoalbumina (Ve = 15,2
mL), respectivamente. Em vermelho: cromatograma da HSPH1 (Ve = 12,5 mL).
58
Figura 20. Curva de calibração para obtenção do raio de Stokes da HSPH1.
Gráfico de Raio de Stokes (Rs; Å) das proteínas padrão eluídas na GFA versus (-log
Kav1/2), onde Kav é o coeficiente de partição obtido pelo volume de eluição de cada
proteína. Em preto: proteínas padrão. Em verde: HSPH1. Em vermelho: ajuste linear
(y = -34 + 107 x; R² = 0,98).
Durante a eluição da SEC, foi utilizado um detector MALS, acoplado a um
detector de índice de refração. A figura 21 apresenta um dos cromatogramas obtidos,
com HSPH1 3,7 mg mL-1. A massa molecular resultante foi igual a 94 ± 2 kDa, sendo
que o valor teórico, de acordo com a composição de resíduos para a HSPH1, é 99,96
kDa.
59
Figura 21. Caracterização do estado oligomérico da HSPH1 por SEC-MALS. Em
preto: cromatograma da HSPH1. Em vermelho: massa molecular de 94 ± 2 kDa.
5.7. Espalhamento de luz dinâmica (DLS)
Utilizou-se o DLS para medir o coeficiente de difusão (D) da HSPH1. Os
experimentos foram realizados com diferentes concentrações de HSPH1, sendo que
a figura 22 mostra a distribuição de D em função da intensidade para HSPH1 64,0
μmol L-1. O D obtido pelo resultado médio de pelo menos 20 medidas independentes
foi igual a 3,6 ± 0,2 x 10-7 cm² s-1.
60
Figura 22. Gráfico de distribuição de D em função da intensidade para HSPH1.
Em preto: Distribuição de D em função da intensidade. Em vermelho: valor de D
referente a intensidade máxima (36,3 μm² s-1).
5.8. Caracterização dos parâmetros hidrodinâmicos
A partir dos valores de Rs, MM e D obtidos por GFA, SEC-MALS e DLS,
respectivamente, utilizou-se a equação de Stokes-Einstein para predizer esses
mesmos parâmetros considerando a proteína HSPH1 como uma esfera de mesma
MM e não hidratada (tabela 11). É importante realçar que a MM medida por SEC-
MALS se refere a um monômero, e a partir do Rs medido por GFA obtem-se um valor
predito para D que é similar ao medido por DLS e vice-versa (tabela 11).
Tabela 11. Parâmetros hidrodinâmicos para a HSPH1. Medida direta e os valores
calculados através da equação de Stokes-Einstein.
Parâmetro Medido Calculado*
Rs (nm) 4,8 ± 0,1 3,1
D (x10-7 cm² s-1) 3,6 ± 0,2 5,5
* Para uma esfera de mesma MM do monômero e não hidratada.
61
O (f/fo) fornece informações sobre o formato da proteína, sendo 1 referente
a forma globular não hidratada. Ele é dado pela razão do coeficiente friccional medido,
f (sendo f = 6.π.η. Rs, utilizando-se o valor de Rs medido por GFA: 4,8 nm), pelo
coeficiente friccional para uma esfera de mesma MM e não hidratada, fo (sendo fo =
6.π.η. Rso, utilizando-se o valor de Rso predito para uma esfera de mesma MM e não
hidratada: 3,1 nm). Logo, obteve-se um fator de Perrin igual a 1,6 (maior que 1).
5.9. Caracterização de proteção contra agregação
Foram realizados experimentos para investigar se a HSPH1 era capaz de
proteger substratos proteicos contra a agregação, ou seja, se apresentava atividade
chaperona. Para as proteínas-cliente modelo MDH (figura 23) e luciferase (figura 24),
o sinal de espalhamento de luz a 320 nm foi monitorado a 40 ºC. Para a proteína-
cliente insulina (figura 25), o sinal de espalhamento de luz a 320 nm foi monitorado a
20 ºC, na presença de DTT.
62
Figura 23. Verificação de atividade chaperona da HSPH1 utilizando o substrato
modelo MDH a 40 ºC por 50 min. Mediu-se o espalhamento de luz relativo da HSPH1
isolada (em preto), da MDH isolada (em vermelho), e em seguida da mistura da
HSPH1 com a MDH (em azul). A) HSPH1:MDH (0,5:1). HSPH1 1,25 μmol L-1 e MDH
2,5 μmol L-1. B) HSPH1:MDH (1:1). HSPH1 e MDH 2,5 μmol L-1. C) Gráfico de barras
da agregação relativa. Os dados apresentados se referem a média, com erro padrão,
de dois experimentos independentes, realizados em triplicata.
63
64
Figura 24. Verificação de atividade chaperona da HSPH1 utilizando o substrato
modelo luciferase a 40 ºC por 50 min. Mediu-se o espalhamento de luz relativo da
HSPH1 isolada (em preto), da luciferase isolada (em vermelho), e em seguida da
mistura da HSPH1 com a luciferase (em azul). A) HSPH1:luciferase (0,5:1). HSPH1
0,62 μmol L-1 e luciferase 1,25 μmol L-1. B) HSPH1:luciferase (1:1). HSPH1 e
luciferase 1,25 μmol L-1. C) HSPH1:luciferase (2:1). HSPH1 2,5 μmol L-1 e luciferase
1,25 μmol L-1. D) HSPH1:luciferase (10:1). HSPH1 2,5 μmol L-1 e luciferase 0,25 μmol
L-1. E) BSA:luciferase (10:1). BSA 2,5 μmol L-1 e luciferase 0,25 μmol L-1. O BSA foi
utilizado como um controle, substituindo a HSPH1 na proporção 10:1. F) Gráfico de
barras da agregação relativa. Os dados apresentados se referem a média, com erro
padrão, de dois experimentos independentes, realizados em triplicata.
65
Figura 25. Verificação de atividade chaperona da HSPH1 utilizando o substrato
modelo insulina a 20 ºC por 50 min. Mediu-se o espalhamento de luz relativo da
HSPH1 isolada (em preto), da insulina isolada (em vermelho), e em seguida da mistura
da HSPH1 com a insulina (em azul). A) HSPH1:insulina (1:5). HSPH1 9 μmol L-1 e
insulina 45 μmol L-1. B) Aldolase:insulina (1:5). Aldolase 9 μmol L-1 e insulina 45
μmol L-1. A aldolase foi utilizada como um controle, substituindo a HSPH1. C) Gráfico
de barras da agregação relativa. Os dados apresentados se referem a média, com
erro padrão, de dois experimentos independentes, realizados em triplicata.
66
Considerando 0% a agregação da HSPH1 isolada e 100% a agregação das
proteínas-cliente isoladas, observou-se que nas condições testadas, a HSPH1 não foi
capaz de proteger a MDH contra a agregação térmica. Por outro lado, a HSPH1
protegeu a luciferase contra a agregação térmica (resultando em 77 ± 9% de proteção)
e a insulina contra agregação em um ambiente redutor (resultando em 77 ± 6% de
proteção), nas proporções de 10:1 e 1:5 (chaperona:substrato), respectivamente.
Além disso, a HSPH1 só foi capaz de proteger a luciferase contra a agregação térmica
na proporção de (10:1), sendo que em concentrações menores de HSPH1, observou-
se uma agregação maior do que a da luciferase isolada.
67
6. DISCUSSÃO
6.1. A porção codificante do gene hsph1 humano codifica uma Hsp110
Diversos organismos expressam chaperonas moleculares da família
Hsp100 (ClpB em bactéria, Hsp104 em levedura e Hsp101 em plantas), que são
capazes de desagregar outras proteínas levando à reativação das mesmas (Glover e
Lindquist, 1998; Doyle e Wickner, 2009; Shorter, 2011). Surpreendentemente,
metazoários não possuem um gene para a família da Hsp100 e essa ausência é
intrigante. Principalmente, quando se considera que humanos, por exemplo, sofrem
com várias doenças degenerativas, como o mal de Alzheimer e Parkinson, causadas
pela formação e deposição de agregados proteicos (Shorter, 2011; Gao e col., 2015).
Contudo, estudos recentes mostraram que a co-chaperona Hsp110,
juntamente com a chaperona Hsp70 e sua co-chaperona Hsp40, cooperam em um
sistema com função desagregase (Shorter, 2011; Rampelt e col., 2012). Uma vez que
um sistema alternativo foi encontrado, ele precisa ser devidamente caracterizado em
toda sua extensão. Desse modo, nesta dissertação de mestrado foi proposto o estudo
da HSPH1, um membro da Hsp110 humana.
A proteína HSPH1 apresenta identidade de 95% com a HSPH2 (outra
isoforma Hsp110 humana) e de 93% com a Hsp110 de camundongo (Mus musculus).
A elevada identidade da HSPH2 com a proteína de estudo torna possível a
comparação dos resultados obtidos nesta dissertação com resultados da literatura.
Em relação ao clone utilizado neste estudo, esse apresentava o cDNA
codante hsph1 humano clonado no plasmídeo pPROEX-Htb, entre os sítios de
restrição das enzimas EheI e KpnI. No sistema de expressão do tipo pPROEX-Htb em
células de E. coli BL21(DE3), a transcrição do gene de interesse se inicia após a
adição do indutor IPTG (Studier e col., 1990; Garges e Adhya, 2003), resultando na
expressão da proteína com uma cauda de polihistidina na região N-terminal, que
possibilita a sua purificação através da cromatografia de afinidade. Apesar do vetor
utilizado conter um sítio de clivagem que possibilita a remoção da cauda de
polihistidina, esta não foi removida, já que apresenta sequência de aminoácidos
randômica e, portanto, não deve interferir na função proteica.
68
6.2. A HSPH1 humana foi produzida solúvel, enovelada e estável
A HSPH1, nas condições testadas nesta dissertação, foi expressa na
fração solúvel, após indução com 0,4 mmol L-1 de IPTG. Esse resultado é coerente
com resultados encontrados na literatura (Mattoo e col., 2013).
Duas etapas cromatográficas foram utilizadas nesta dissertação para a
purificação da HSPH1: cromatografia de afinidade seguida de exclusão por tamanho.
A cromatografia de afinidade ao níquel foi utilizada para separar a HSPH1 fusionada
a cauda de histidina da grande maioria dos contaminantes provenientes da E. coli.
Utilizou-se a fração eluída com 42 mmol L-1 de imidazol, pois foi a que resultou em
uma maior pureza (em comparação com a fração eluída com 300 mmol L-1 de
imidazol). Em seguida, a etapa cromatográfica de exclusão por tamanho foi
necessária para garantir que a proteína fosse obtida pura e em um único estado
oligomérico. Verificou-se que a espécie presente entre 31 e 45 kDa se refere a um
contaminante de valor de MM próximo ao da HSPH1, já que é eluído com a proteína
de interesse e não é proveniente de degradação. Essa mesma isoforma humana já
havia sido purificada utilizando apenas a etapa de cromatografia de afinidade (Mattoo
e col., 2013), bem como a Hsp110 humana também já foi purificada através do uso
de três etapas cromatográficas (afinidade, troca iônica e exclusão por tamanho)
(Tzankov e col., 2008). No entanto, como se obteve a proteína de estudo com pureza
satisfatória, considerou-se duas etapas cromatográficas suficientes.
Além de pura, a HSPH1 foi obtida enovelada, apresentando estrutura
secundária predominantemente de hélice α. O conteúdo de hélice α foi estabelecido
pela presença dos dois mínimos no espectro de estrutura secundária (em 208 e 222
nm), sendo o valor de hélice α encontrado similar ao predito para a sua sequência de
aminoácidos (Garnier e col., 1996). Em comparação com a literatura, a Apg-2 humana
(HSPH2) também apresentou um espectro de CD predominantemente de hélice α
(Raviol e col., 2006).
A técnica de CD funciona como sonda de estrutura secundária de
proteínas. Desse modo, ao aquecer a proteína ou adicionar agente desnaturante, é
possível monitorar a estabilidade da sua estrutura secundária. Nos experimentos de
desenovelamento térmico e químico realizados, onde a estrutura secundária da
HSPH1 foi monitorada, observou-se que a proteína de estudo aparentemente não se
desenovelou completamente em temperaturas elevadas (90 °C) e nem mesmo com
altas concentrações de agente desnaturante (ureia 8 mol L-1). O desenovelamento
69
térmico foi irreversível para a HSPH1, nas condições testadas. É importante destacar
que a reversibilidade também foi testada com aquecimento parcial de 20 a 45 ºC
(sendo parcialmente reversível nesta faixa de temperatura) e de 20 a 60 ºC (sendo
irreversível nesta faixa de temperatura). O perfil sigmoidal e o valor de Tm
(temperatura no ponto médio de transição) encontrado para a HSPH1 (48 ºC) foi
similar ao reportado para a Apg-2 humana (HSPH2) (Tm = 50,7 ºC) (Raviol e col.,
2006). Resultado interessante, pois mostra que a proteína é estável acima da
temperatura corpórea humana, ideal em torno de 37 ºC (Tortora e Derrickson, 2017).
A espectrometria de emissão de fluorescência permite uma análise do
ambiente do resíduo de triptofano (W) devido à sensibilidade desse resíduo à
polaridade do ambiente. A HSPH1 estudada é composta por 4 resíduos de W, logo, a
fluorescência emitida é uma média da fluorescência de cada resíduo (só é possível
realizar uma avaliação média do ambiente). Os resultados mostraram que pelo menos
1 dos resíduos de W se encontra parcialmente localizado no interior da proteína
enovelada, sendo outra indicação, juntamente com o CD, de que a proteína foi
produzida enovelada.
O desenovelamento químico obtido nesta dissertação para a HSPH1
através do CD foi reversível, apresentando pelo menos uma transição bem definida
entre 1,8 e 2,9 mol L-1 de ureia (Cm de aproximadamente 2,8 mol L-1). Os estudos de
fluorescência mostraram que os resíduos de W são expostos ao solvente com o
aumento da concentração de ureia, já que foi observado um deslocamento no
comprimento de onda de emissão de fluorescência para λ maiores. Contudo, o valor
de Cm obtido por CD foi diferente do obtido por espectrometria de emissão de
fluorescência. A variação do centro de massa mostrou um desenovelamento químico
onde a transição tem Cm igual a aproximadamente 3,3 mol L-1, enquanto que a
emissão de fluorescência em 340 nm apresenta Cm igual a aproximadamente 2,2 mol
L-1. A diferença dos valores de Cm encontrados se deve ao fato de que o CD funciona
como uma sonda global que monitora a estrutura secundária da proteína, enquanto
que a emissão de fluorescência funciona como uma sonda local para estrutura
terciária, monitorando resíduos específicos de triptofano. Assim, analisando os
experimentos de desenovelamento de CD e fluorescência, nota-se que HSPH1 possui
um desenovelamento químico complexo, com pelo menos três estados, mas no qual
o desenovelamento da estrutura terciária antecede ao da estrutura secundária. Esse
desenovelamento químico complexo sugere que a HSPH1 possui dois domínios que
70
desenovelam de maneira diferente, resultando em dois valores de Cm para a emissão
de fluorescência e, provavelmente, duas transições no desenovelamento analisado
por CD, onde uma não é reversível.
6.3. A HSPH1 humana é um monômero alongado
A técnica de SEC-MALS é capaz de realizar uma determinação precisa da
massa molecular da proteína, independente do seu formato (globular ou alongado).
Essa técnica combina a separação de acordo com o tamanho (cromatografia de
exclusão por tamanho), e, através das informações da intensidade da luz espalhada
e do índice de refração medido, determina a massa molecular da proteína. Através do
resultado de SEC-MALS desta dissertação, concluiu-se que a HSPH1 foi obtida como
um monômero, resultado coerente com a massa molecular teórica predita e com o
esperado para Hsp110 de mamíferos (Chang e col., 2007). Com a técnica de GFA,
encontrou-se o valor do raio hidrodinâmico da HSPH1, de acordo com seu tamanho
molecular, que juntamente com a forma, influencia no volume em que a proteína é
eluída da coluna. Ainda na caracterização hidrodinâmica, o DLS forneceu o coeficiente
de difusão da HSPH1, ao relacionar o movimento Browniano com o tamanho das
partículas, medindo flutuações da luz espalhada após incidência de laser. Os
resultados de SEC-MALS, GFA e DLS foram validados pelo fator de Perrin, sendo
possível obter informações sobre a conformação da HSPH1 ao comparar sua
semelhança a estruturas globulares, o que sugeriu que a HSPH1 foi purificada com
conformação mais alongada, já que diferiu da forma globular.
6.4. A HSPH1 humana possui atividade chaperona
Em relação aos experimentos funcionais, o fenômeno de agregação foi
monitorado pelo aumento no espalhamento de luz (Tiroli e Ramos, 2007). A HSPH1
humana foi capaz de proteger a luciferase contra a agregação térmica, nas condições
utilizadas nesta dissertação, resultado que também foi observado para a Apg-2
humana (HSPH2) na literatura (Gotoh e col., 2004). Além disso, observou-se uma
coagregação da luciferase com a HSPH1, quando a chaperona se encontrava em
baixas concentrações. Isso pode ser explicado pelo fato da HSPH1 se ligar em
polipeptídeos já agregados. A HSPH1 não foi capaz de proteger a MDH contra
agregação causada por estresse térmico, nas condições testadas, mas foi capaz de
proteger a insulina contra agregação causada por estresse oxidativo. Esses
71
resultados sugerem que essa chaperona possui seletividade pelos seus substratos, o
que é compatível com o que se conhece sobre a atuação das famílias de chaperonas
para manter a proteostase.
72
7. CONCLUSÕES
• A HSPH1 humana foi produzida solúvel, pura, enovelada e estável.
• A HSPH1 humana apresentou conformação monomérica alongada.
• A HSPH1 humana possui importante função chaperona, atuando na
prevenção da agregação proteica durante condições de estresse.
Esta dissertação de mestrado possibilitou a caracterização de um membro
da Hsp110 humana que faz parte de um sistema alternativo com função desagregase.
Desse modo, os dados encontrados para a a HSPH1 humana podem ser utilizados
para estabelecer estratégias de intervenção com fins terapêuticos, o que é de extrema
importância, visto que humanos sofrem com várias doenças causadas pela formação
e deposição de agregados proteicos, como o mal de Alzheimer e Parkinson.
73
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aguado, A.; Fernandez-Higuero, J.A.; Moro, F. e Muga, A. (2015) “Chaperone-
assisted protein aggregate reactivation: Different solutions for the same problem”,
Archives of biochemistry and biophysics, 580, 121-34.
Anfinsen, C.B. (1973) “Principles That Govern Folding of Protein Chains”, Science,
181, 223-230.
Barth, H.G.; Jackson, C. e Boyes, B.E. (1994) “Size Exclusion Chromatography” ,
Analytical Chemistry, 66, 595-620.
Beinker, P.; Schlee, S.; Groemping, Y.; Seidel, R. e Reinstein, J. (2002) “The N
terminus of ClpB from Thermus thermophilus is not essential for the chaperone
activity”, The Journal of biological chemistry, 277, 47160-66.
Borges, J.C. e Ramos, C.H.I. (2005) “Protein folding assisted by chaperones”, Protein
and Peptide Letters, 12, 257-261.
Borges, J.C. e Ramos, C.H.I. (2011) “Analysis of molecular targets of Mycobacterium
tuberculosis by analytical ultracentrifugation”, Current Medicinal Chemistry, 18, 9,
1276-1285.
Bösl, B.; Grimminger, V. e Walter, S. (2006) “The molecular chaperone Hsp104-a
molecular machine for protein disaggregation”, J. Struct. Biol., 156 (1): 139-48.
Correa, D.H.A. e Ramos, C.H.I. (2009) “The use of circular dichroism spectroscopy to
study protein folding, form and function”, African J. Biochem., Res. 3, 164-173.
Chang, H.-C.; Tang, Y.-C.; Hayer-Hartl, M. e Hartl, F.U. (2007) “SnapShot: Molecular
Chaperones, Part I”, Cell, 128.
Cyr, D.M. e Ramos, C.H.I. (2015) “Specification of Hsp70 Function by Type I and Type
II Hsp40” em: “Subcellular Biochemistry”, Vol. 78, Blatch, G.L. e Edkins, A.L., eds.,
Springer.
74
Cyr, D.M.; Langer, T. e Douglas M.G. (1994) “DnaJ-like proteins: molecular
chaperones and specific regulators of Hsp70”, Trends Biochem Sci., 19 (4): 176-81.
Doyle, S.M. e Wickner, S. (2009) “Hsp104 and ClpB: protein disaggregating
machines”, Trends Biochem Sci. 34 (1): 40-8.
Dragovic, Z., Broadley; S.A., Shomura, Y.; Bracher, A. e Hartl, F.U. (2006) “Molecular
chaperones of the Hsp110 family act as nucleotide exchange factors of Hsp70s”, The
EMBO journal, 25, 2519-28.
Edelhoch, H. (1967) “Spectroscopic Determination of Tryptophan and Tyrosine in
Proteins”, Biochemistry, 6, 1948-54.
Finka, A.; Sharma, S.K. e Goloubinoff, P. (2015) “Multi-layered molecular mechanisms
of polypeptide holding, unfolding and disaggregation by HSP70/HSP110 chaperones” ,
Front. Mol. Biosci., 2:29.
Freeman, W.H.; Berg, J.M.; Tymoczko, J.L. e Stryer, L. (2012) “Biochemistry”, 7ª
edição.
Frydman, J. e Hartl, F.U. (1996) “Principles of chaperone-assisted protein folding:
differences between in vitro and in vivo mechanisms”, Science, 272, 14971502.
Gao, X.; Carroni, M.; Nussbaum-Krammer, C.; Mogk, A.; Nillegoda, N.B.; Szlachcic,
A.; Guilbride, D.L.; Saibil, H.R.; Mayer, M.P. e Bukau, B. (2015) “Human Hsp70
Disaggregase Reverses Parkinson’s-Linked α-Synuclein Amyloid Fibrils”, Molecular
Cell. 59, 1-13.
Garges, S. e Adhya, S.L. (2003) “RNA polymerases and associated factors”, Methods
in Enzymology, Vol. 371, parte D.
75
Garnier, J.; Gibrat, J-F. e Robson B. (1996) “GOR method for predicting protein
secondary structure from amino acid sequence”, Methods in Enzymology, 266: 540-
53.
Gava, L.M.; Gonçalves, D.C.; Borges, J.C. e Ramos, C.H.I. (2011) “Stoichiometry and
thermodynamics of the interaction between the C-terminus of human 90 kDa heat
shock protein Hsp90 and the mitochondrial translocase of outer membrane Tom70”,
Arch. Biochem. Biophys., 513, 119-125.
Glover, J.R. e Lindquist, S. (1998) “Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone
system that rescues previously aggregated proteins”, Cell., 94: 73–82.
Gonçalves, D.C.; Gava, L.M. e Ramos, C.H.I. (2010) “Human Hsp70/Hsp90 organizing
protein (Hop) D456G is a mixture of monomeric and dimeric species”, Protein Pept.
Lett., 17:492-498.
Gonçalves, D.C. e Ramos, C.H.I. (2016) “Molecular Chaperones and HSPs in
Sugarcane and Eucalyptus” em: “Heat Shock Proteins”, Vol. 10, Asea, A.A.A. e
Calderwood, S.K., eds., Springer.
Gotoh, K.; Nonoguchi, K.; Higashitsuji, H.; Kaneko, Y.; Sakurai, T.; Sumitomo, Y.; Itoh,
K.; Subjeck, J.R. e Fujita, J. (2004) “Apg-2 has a chaperone-like activity similar to
Hsp110 and is overexpressed in hepatocellular carcinomas”, FEBS Letters, 560, 19-
24.
Hartl, F.U. (1996) “Molecular chaperones in cellular protein folding”, Nature, 381, 571-
579.
Hartl, F.U. e Hayer-Hartl, M. (2009) “Converging concepts of protein folding in vitro and
in vivo”, Nature, 16, 574 – 581.
Hartl, F.U.; Bracher, A. e Hayer-Hartl, M. (2011) “Molecular chaperones in protein
folding and proteostasis”, Nature, 475, 324-32.
76
Hendrick, J.P. e Hartl, F.U. (1993) “Molecular chaperone functions of heatshock
proteins”, Annual review of biochemistry, 62, 349-384.
Jachimska, B.; Wasilewska, M. e Adamczyk, Z. (2008) “Characterization of
Globular Protein Solutions by Dynamic Light Scattering, Electrophoretic Mobility, and
Viscosity Measurements”, Langmuir, 24, 6866-6872.
Jackrel, M.E.; DeSantis, M.E.; Martinez, B.A.; Castellano, L.M.; Stewart, R.M.;
Caldwell, K.A.; Caldwell, G.A. e Shorter, J. (2014) “Potentiated Hsp104 variants
antagonize diverse proteotoxic misfolding events”, Cell., 156, 170-82.
Laemmli, U.K. (1970) “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4”, Nature, 277: 680-685.
Lakowicz, J.R. (1999) “Principles of fluorescence spectroscopy”, 2ª edição.
Lee, J.; Kim, J.H.; Biter, A.B.; Sielaff, B.; Lee, S. e Tsai, F.T. (2013) “Heat shock protein
(Hsp) 70 is an activator of the Hsp104 motor”, Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America, 110, 8513-18.
Lehninger, A.L.; Nelson, D.L. e Cox, M.M. (2002) “Principles of Biochemistry”, 3ª
edição.
Lehninger, A.L.; Nelson, D.L. e Cox, M.M. (2004) “Principles of Biochemistry”, 4ª
edição.
Lindquist, S. e Craig, E.A. (1988) “The heat-shock proteins”, Annual Review of
Genetics, 22, 631-677.
Mackay, R.G.; Helsen, C.W.; Tkach, J.M. e Glover, J.R. (2008) “The C-terminal
extension of Saccharomyces cerevisiae Hsp104 plays a role in oligomer assembly”,
Biochemistry, 47, 1918-27.
77
Martin, J. e Hartl, F.U. (1993) “Protein folding in the cell: molecular chaperones pave
the way”, Structure, 1, 161-164.
Mattoo, R.U.H.; Sharma, S.K.; Priya, S.; Finka, A. e Goloubinoff, P. (2013) “Hsp110 Is
a Bona Fide Chaperone Using ATP to Unfold Stable Misfolded Polypeptides and
Reciprocally Collaborate with Hsp70 to Solubilize Protein Aggregates”, J. Biol. Chem.,
vol. 288. nº 29. pp. 21399–21411.
Mogk, A.; Kummer, E. e Bukau, B. (2015) “Cooperation of Hsp70 and Hsp100
chaperone machines in protein disaggregation”, Frontiers in molecular biosciences, 2,
22.
Mokry, D.Z.; Abrahao, J. e Ramos, C.H.I. (2015) “Disaggregases, molecular
chaperones that resolubilize protein aggregates”, Anais da Academia Brasileira de
Ciências, 87, 1273-92.
Morrisett, J.D.; David, J.S.; Pownall, H.J. e Gotto, A.M.Jr. (1973) “Interaction of an
apolipoprotein (apoLP-alanine) with phosphatidylcholine”, Biochemistry, 12:1290-
1299.
Nillegoda, N.B. e Bukau, B. (2015) “Metazoan Hsp70-based protein disaggregases:
emergence and mechanisms”, Frontiers in molecular biosciences, 2, 57.
Oh, H.J.; Chen, X. e Subjeck, J.R. (1997) “Hsp110 protects heat-denatured proteins
and confers cellular thermoresistance”, The Journal of biological chemistry, 272,
31636-40.
Oh, H.J.; Easton, D.; Murawski, M.; Kaneko, Y. e Subjeck, J.R. (1999) “The
chaperoning activity of hsp110. Identification of functional domains by use of targeted
deletions”, The Journal of biological chemistry, 274, 15712-18.
Olivares, A.O.; Baker, T.A. e Sauer, R.T. (2016) “Mechanistic insights into bacterial
AAA+ proteases and protein-remodelling machines”, Nature reviews Microbiology, 14,
33-44.
78
Pace, C.N.; Vajdos, F.; Fee, L.; Grimsley, G. e Gray, T. (1995) “How to measure and
predict the molar absorption coefficient of a protein”, Protein Science, 4, 2411-2423.
Porath, J. (1992) “Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, Protein Expression
and purification”, 3, 263-281.
Ramos, C.H.I. (2004) “A Spectroscopic-based Laboratory Course for Protein
Conformational Studies”, Biochem. Mol. Biol. Edu., 32, 31-34.
Ramos, C.H.I. (2011) “Molecular Chaperones and Protein Quality Control”, Protein and
Peptide Letters, 18, 100-100.
Ramos, C.H.I. e Ferreira, S.T. (2005) “Protein folding, misfolding and aggregation:
evolving concepts and conformational diseases” (Revisão), Protein Pept. Lett., 12,
213-222.
Rampelt, H.; Kirstein‐Miles, J.; Nillegoda, N.B.; Chi, K., Scholz, S.R.; Morimoto, R.I. e
Bukau, B. (2012) “Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein
disaggregation”, The EMBO Journal, 31, 4221-4235.
Raviol, H.; Bukau, B e Mayer, M.P. (2006) “Human and yeast Hsp110 chaperones
exhibit functional differences”, FEBS Letters, 580, 168–174.
Saibil H. (2013) “Chaperone machines for protein folding, unfolding and
disaggregation”, Nature, 14, 630-642.
Sambrook, J. e Russell, D.W. (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 3ª edição.
Sarbeng, E.B.; Liu, Q.; Tian, X.; Yang, J.; Li, H.; Wong, J.L. e Zhou, L. (2015) “A
Functional DnaK Dimer is Essencialfor the Efficient Interaction with Hsp40 Heat Shock
Protein”, Journal of Biological Chemistry, Vol. 290, nº 14.
79
Schlieker, C.; Tews, I.; Bukau, B. e Mogk, A. (2004) “Solubilization of aggregated
proteins by ClpB/DnaK relies on the continuous extraction of unfolded polypeptides”,
FEBS letters, 578, 351-56.
Shiber, A. e Ravid, T. (2014) “Chaperoning Proteins for Destruction: Diverse Roles of
Hsp70 Chaperones and their Co-Chaperones in Targeting Misfolded Proteins to the
Proteasome”, Biomolecules, 4(3), 704-724.
Shorter, J. (2011) “The Mammalian Disaggregase Machinery: Hsp110 Synergizes with
Hsp70 and Hsp40 to Catalyze Protein Disaggregation and Reactivation in a Cell-Free
System”, PLoS ONE, 6(10): e26319.
Silva, V.C.H.; Cagliari, T.C.; Lima, T.B.; Gozzo, F.C. e Ramos, C.H.I. (2013)
“Conformational and functional studies of a cytosolic 90 kDa heat shock protein Hsp90
from sugarcane”, Plant Physiol. Biochem., 68, 16-22.
Slepenkov, S.V. e Witt, S.N. (2002) “The unfolding story of the Escherichia coli Hsp70
DnaK: is DnaK a holdase or an unfoldase?” Mol. Microbiol., 45 (5): 1197-206.
Sousa, R. (2014), “Structural mechanisms of chaperone mediated protein
disaggregation”, Frontiers in molecular biosciences, 1, 12.
Stryer, L. (2004), “Bioquímica”, 5ª edição.
Studier, F.W. e Moffatt, B.A. (1986) “Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to
direct selective high-level expression of cloned genes”, Journal of Molecular Biology,
189, 113-30.
Studier, F.W.; Rosenberg, A.H.; Dunn, J.J. e Dubendorff, J.W. (1990) “Use of T7 RNA
polymerase to direct expression of cloned genes”, Meth. Enzymol., 185: 60-89.
Sweeny, E.A. e Shorter, J. (2016) “Mechanistic and Structural Insights into the Prion-
Disaggregase Activity of Hsp104”, Journal of molecular biology, 428, 1870-85.
80
Tiroli, A.O. e Ramos, C.H.I. (2007) “Biochemical and biophysical characterization of
small heat shock proteins from sugarcane. Involvement of a specific region located at
the N-terminus with substrate specificity”, Int. J. Biochem. Cell. Biol., 39, 818-831.
Tiroli, A.O. e Ramos, C.H.I. (2011) “An overview of the role of molecular chaperones
in protein homeostasis”, Protein Pept. Lett., 18, 101-109.
Tortora, G.J. e Derrickson, B. (2017) “Corpo Humano - Fundamentos de Anatomia e
Fisiologia”, Editora Artmed, 10ª edição.
Tzankov, S.; Wong, M.J.H.; Shi, K.; Nassif, C. e Young, J.C. (2008) “Functional
Divergence between Co-chaperones of Hsc70”, The Journal of Biological Chemistry,
Vol. 283, nº 40, pp. 27100–27109.
Voet, D. e Voet, J.G. (2011) “Biochemistry”, 4ª edição.
Wyatt, P. (1993) “Light scattering and the absolute characterization of
macromolecules”, Analytica Chimica Acta, 272, 1- 40.
Yedidi, R.S.; Wendler, P. e Enenkel, C. (2017) “AAA-ATPases in Protein Degradation”,
Frontiers in molecular biosciences, 4, 42.
Zanphorlin, L.M.; Alves, F.R. e Ramos, C.H.I. (2014) “The effect of celastrol, a
triterpene with antitumorogenic activity, on conformational and functional aspects of
human 90 kDa heat shock protein Hsp90, a chaperone implicated in the stabilization
of the tumor phenotype”, Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, 1840,
3145-3152.
Zolkiewski, M. (2006) “A camel passes through the eye of a needle: protein unfolding
activity of Clp ATPases”, Molecular microbiology, 61, 1094-100.
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9. ANEXO
9.1. Autorizaçao da Comissao Interna de Biossegurança (CIBio) para
condução do projeto de pesquisa