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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Química
DÊNIO EMANUEL PIRES SOUTO
ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE ANTÍGENOS DE LEISHMANIA INFANTUM
SOBRE PLATAFORMAS ORGANIZADAS EMPREGANDO SPR E QCM PARA
DETECÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS DA
LEISHMANIOSE VISCERAL
CAMPINAS
2016
DÊNIO EMANUEL PIRES SOUTO
ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE ANTÍGENOS DE LEISHMANIA INFANTUM
SOBRE PLATAFORMAS ORGANIZADAS EMPREGANDO SPR E QCM PARA
DETECÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS DA
LEISHMANIOSE VISCERAL
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos para a obtenção
do título de Doutor em Ciências
Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA
PELO ALUNO DÊNIO EMANUEL PIRES SOUTO, E ORIENTADA PELO PROF.
DR. LAURO TATSUO KUBOTA
CAMPINAS
2016
“Para não arrefecerdes, imaginai que podeis vir a saber
tudo; para não presumirdes, refleti que, por muito que
souberdes, mui pouco tereis chegado a saber”.
Rui Barbosa
Dedico este trabalho
À duas grandes mulheres da minha vida:
À minha Mãe (Stela Pires) por não ter medido esforços para, com muita luta,
vencer as dificuldades encontradas em nosso caminho. Com toda certeza,
você Mãe é a maior merecedora pela concretização deste sonho.
À minha tão amada Avó Judith (in memoriam), a qual nos ensinou como
conduzir o amor e generosidade às pessoas que nos cercam.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por iluminar meu caminho até este tão sonhado objetivo.
À minha Mãe Stela Pires, a qual sinonimizo como uma “verdadeira guerreira” por ter abdicado
muito de sua própria vida para buscar sempre o melhor para seus filhos. Sem dúvidas, ela é a
maior responsável pela realização desta tese de doutorado.
Ao meu Pai Hildebrando Souto pelas orações, energias positivas e incontáveis conselhos
espirituosos doados a mim em momentos tão difíceis. Um Ser iluminado que me orgulho muito!
Ao meu grande amor Carolinna Barbosa Guimarães, uma pessoa maravilhosa que Deus colocou
em minha vida! Obrigado por toda amizade, carinho, companheirismo e amor concedidos
durante essa fase tão essencial.
Em especial, agradeço ao Prof. Dr. Lauro Kubota, não somente pela excelente orientação em
termos científicos, mas também pela confiança, paciência e pelas palavras de incentivo em
momentos tão necessários. Com certeza, nossas conversas foram fundamentais para meu
crescimento profissional e pessoal, muito obrigado.
Ao José Tiago C. Barragan, um grande amigo e irmão que ganhei nessa jornada. Obrigado por
todos os conselhos e, principalmente, por influenciar-me com seu caráter tão humano!
Agradeço ao amigo Glauco Pilon, generosidade em pessoa, pela amizade sincera e pelo apoio
doado através de longas e produtivas conversas durante o período.
Aos amigos do LEEDS: Murilo Santhiago, Everson Tiago, Fernando Leite, Ronaldo e Cecília.
Em especial à Rúbia Pelli pelo auxílio à pesquisa e, principalmente, por todo incentivo pessoal,
uma pessoa muito importante em nosso grupo! E à Maiui Camargo pela excelente ajuda em
relação ao inglês.
Aos meus tão amados sobrinhos Samuel Souto e Matheus Souto pela energia positiva
transmitida através do amor de vocês, imensurável fonte de inspiração!
Agradeço aos meus irmãos (Diego Emanuel e Luana Souto) e cunhados (Dalva Ferreira e Carlos
Vagner) pelo amor e carinho de sempre.
Aos meus irmãos de coração Macel Rocha, Gleidson Rocha e Antônio Carlos (Bob) por
mostrarem sempre o sentido verdadeiro da amizade, grande estímulo nessa caminhada!
À Profa. Dra. Hélida Monteiro de Andrade e à Pesquisadora Dra. Angélica Rosa Faria pelas
amostras biológicas gentilmente fornecidas.
À Profa. Dra. Cátia Ornelas, pela colaboração, generosidade e ensinamentos fundamentais
sobre síntese orgânica. Aprendi muito durante minha passagem pelo laboratório de orgânica,
contribuindo significativamente para minha formação e para o enriquecimento desta tese.
Aos colegas Tiago Becher e Diego Bertuzzi pelo acompanhamento e apoio, os quais foram
imprescindíveis durante as etapas de síntese orgânica realizadas neste trabalho.
Agradeço imensamente aos meus sogros Luciana M. B. Guimarães e José G. Canuto, sempre
muito interessados e incentivadores da caminhada que percorri durante o doutoramento.
Obrigado pela confiança e por me acolherem de forma tão carinhosa na família!
À Eny da Penha, uma Vovó muito especial que ganhei durante esse período! É muito
gratificante receber o carinho e a energia ímpar transmitidos através da sua jovialidade!
Agradeço aos amigos Víctor Hugo e Juliana de Almeida pela consideração e apoio durante o
doutorado.
Ao Prof. Dr. Flávio Damos, por todo conhecimento repassado durante o mestrado, fator de
suma importância para a execução das atividades deste doutorado.
Aos órgãos de fomento FAPESP, principalmente pela bolsa de pesquisa concedida (Processo
2012/24493-3) e ao INCT Bioanalítica.
E a todos aqueles que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização desta tese.
RESUMO
A leishmaniose é referida pela organização mundial da saúde como uma das principais doenças
parasitárias, acometendo cerca de 2 milhões de pessoas anualmente em 98 países diferentes. A
leishmaniose visceral (LV) é a forma mais grave e devido às limitações dos ensaios
convencionais (ELISA, por exemplo) utilizados para seu diagnóstico, grandes motivações estão
voltadas ao desenvolvimento de novas metodologias para detecção dessa parasitose. No
presente trabalho, as técnicas de ressonância de plásmons de superfície (SPR) e microbalança
de cristal de quartzo (QCM) foram utilizadas no desenvolvimento de imunossensores para
detecção de anticorpos específicos da LV. Em relação à etapa de funcionalização de superfícies
metálicas durante a construção dos biossensores, maior eficiência foi observada através de
plataformas multivalentes formadas por dendrímeros ou dendrons combinados ou não a
monocamadas auto-organizadas (SAMs) de alcanotióis. Nesta etapa, destaca-se a síntese
orgânica de um dendron inédito do tipo HS-dendron-(PEG-COOH)9. Em relação à
caracterização dos biossensores, enfatiza-se uma abordagem particularmente adotada pelo
nosso grupo, através da qual foi possível mediante curvas de refletância de SPR obtidas em
diferentes comprimentos de onda (670 e 785 nm) determinar simultaneamente a espessura (4,64
nm) e o índice de refração (1,475) de uma proteína recombinante quimérica imobilizada sobre
o substrato sensor. Através de estudos cinéticos, foi possível mensurar o potencial antigênico
de novas proteínas de L. infantum, verificando elevada afinidade de ligação de duas proteínas
(KD = 8,27 x 10-10 mol L-1 para a proteína quimérica recombinante (CP10); e KD1 x KD2 =
1,64x10-7 mol L-1 para a proteína recombinante hipotética C1) frente a anticorpos específicos
da LV. Tais resultados, somados à capacidade de detecção de casos assintomáticos (> 80%)
observados nos ensaios de ELISA, evidenciaram a viabilidade de aplicação dessas proteínas no
imunodiagnóstico da LV. Análises com amostras reais (soros caninos) apontaram vantagens
dos biossensores de SPR e QCM em relação aos testes convencionais, tais como, maior
sensibilidade, especificidade, rapidez e a não necessidade de marcação. Portanto, os resultados
obtidos neste trabalho de tese são substanciais para contribuição significativa no diagnóstico e
programas de controle da LV.
ABSTRACT
Leishmaniasis is referred to by the world health organization as one of the main parasitical
diseases, affecting approximately 2 million people annually in 98 different countries. The
visceral leishmaniasis (VL) is the most serious form of the disease and due to the limitations of
the conventional assays (ELISA, for example) used for its diagnosis, high motivations are
turned to the development of new methodologies for the detection of this parasitosis. In this
current work, the techniques of surface plasmon resonance (SPR) and quartz crystal
microbalance (QCM) were used in the development of immunosensors for the detection of
specific antibodies of VL. Regarding the step of functionalization of metallic surfaces during
the construction of the biosensors, a higher efficiency was observed through multivalent
platforms formed by dendrimers or dendrons combined or not to self-assembled monolayers
(SAMs) of alkanethiols. In this step, emphasis is given to the organic synthesis of an
unprecedented dendron of the type HS-dendron-(PEG-COOH)9. With respect to the
characterization of the biosensors, an approach adopted particularly by our group is highlighted,
by which it was possible, using reflectance curves of SPR obtained at different wavelengths
(670 and 785 nm), to determine simultaneously the thickness (4,64 nm) and the refractive index
(1,475) of a recombinant chimeric protein immobilized on the sensor substrate. Through kinetic
studies, it was possible to measure the antigenic potential of new proteins of L. infantum,
verifying high bonding affinity of two proteins (KD = 8,27 x 10-10 mol L-1 for the recombinant
chimeric protein (CP10); and KD1 x KD2 = 1,64x10-7 mol L-1 for the recombinant chimeric
protein C1) towards specific antibodies of the VL. Such results, added to the capacity of
detection of asymptomatic cases (> 80%) observed in the ELISA assays, gave evidence to the
viability of the application of these proteins in the immunodiagnostics of the VL. Analyses with
real samples (canine serums) pointed out advantages of the SPR and QCM biosensors when
compared to conventional tests, such as higher sensitivity, specificity, speed and the fact that
marking is not necessary. Therefore, the results obtained in this thesis work are substantial for
significant contribution in the diagnosis and control programs of VL.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Curva de dispersão para os plásmons de superfície numa interface ar/ouro (curva em
azul). Relação de dispersão para a radiação eletromagnética propagando no ar (curva em verde)
e num prisma (curva em vermelho). ......................................................................................... 32
Figura 2. Fenômeno da reflexão interna total atenuada empregada nas configurações de Otto
(A) e de Kretschm (B). Na configuração de Otto, a camada dielétrica é colocada entre o prisma
e o metal. Na configuração de Kretschm, o filme metálico é inserido diretamente sobre o prisma
e os plásmons são excitados na interface externa. .................................................................... 33
Figura 3. Principais acopladores utilizados para construção de sensores de SPR: (A) prisma;
(B) grades de difração; (C) fibra óptica (guia de onda); (D) cristal fotônico (guia de onda planar
à esquerda e CF microestruturado à direita). Essas Figuras foram adaptadas de: Roh et al 56
(Figura A), DiPippo et al 57 (Figura B), e Tokel et al 45 (Figuras C e D). ................................ 35
Figura 4. Fotografia do equipamento de SPR, unidade óptica e substrato de SPR. ................. 38
Figura 5. Desenho esquemático ilustrando: (A) sensor de SPR com modulação angular baseado
na configuração de Kretschm; (B) curvas de refletância na ausência (θSPR1) e presença (θSPR2)
de espécies na superfície do filme metálico; (C) sensorgrama (ΔθSPR em função do tempo)
evidenciando interação de biomoléculas sobre superfície do metal. ........................................ 39
Figura 6. Representação esquemática de um sistema genérico empregado para produzir
oscilação mecânica e medir a frequência de oscilação do cristal piezoelétrico. Constituintes
básicos: cristal piezoelétrico inserido no interior da célula de fluxo, circuito oscilador,
frequencímetro e um computador pessoal. ............................................................................... 42
Figura 7. Representação esquemática da resposta característica observada em um sensor
baseado em QCM, evidenciando que a interação biomolecular é acompanhada pela diminuição
da frequência de oscilação do cristal de quartzo (f). ................................................................ 43
Figura 8. Fotografia do cristal de quartzo recoberto com uma camada nanométrica de ouro
sendo inserido no interior da célula (A); e acoplamento do sistema (célula e cristal) ao circuito
oscilador (B). ............................................................................................................................ 44
Figura 9. Desenho esquemático de um biossensor, ilustrando: (I) interação de analitos com
biomoléculas de reconhecimento imobilizadas sobre superfície de ouro funcionalizada; (II)
respostas acompanhadas em tempo real das interações pelos biossensores de SPR e QCM; (III)
parâmetros cinéticos e termodinâmicos medidos através dos resultados obtidos pelos
biossensores. ............................................................................................................................. 45
Figura 10. SAM do 11-MUA no seu estado final organizada (Au-RSH*). ............................. 47
Figura 11. Representação estrutural de dendrímero (A) e dendron (B). .................................. 48
Figura 12. Estrutura química de um dendrímero PAMAM de geração 3 (G3) com núcleo
diamino e 32 grupos amino-terminais. Cada parte da molécula representada por uma cor é
referente a cada geração: zero (G0), um (G1), dois (G2) e três (G3). ...................................... 50
Figura 13. Desenho esquemático ilustrando as etapas envolvidas na tecnologia do DNA
recombinante para síntese de proteínas: (I) extração do DNA e amplificação pela PCR; (II)
obtenção do gene de interesse após clivagem pelas enzimas de restrição; (III) clivagem do
plasmídeo bacteriano pelas mesmas endonucleases; (IV) uso da DNA ligase para síntese do
DNA recombinante; (V) introdução do DNA recombinante na bactéria; (VI) inserção da
bactéria em meio de cultura. ..................................................................................................... 53
Figura 14. (A) Fotografia do MP-SPR; (B) Substrato utilizado nas análises (filme de Au); (C)
Inserção do substrato no equipamento. .................................................................................... 59
Figura 15. Etapas envolvidas na construção e avaliação dos imunossensores: (I) formação da
SAM pela adsorção de 11-MUA sobre superfície do ouro; (II) imobilização da CP10 sobre a
SAM previamente ativada; (III) adição de etanolamina para bloqueio dos grupos reativos
remanescentes; (IV) interação das IgGs anti-CP10 com a CP10. ............................................ 63
Figura 16. A) Gel de poliacrilamida (12%) (SDS-PAGE) corado com Coomassie. Frações
solúveis (S) e insolúveis (IS) da cultura bacteriana que comprovam a banda relacionada para a
CP10 (21,4 kDa). B) Gel de poliacrilamida (12%) corado com Coomassie, I: pré-purificação
por coluna de afinidade, II-VI: fracções da purificação. C) Membrana de nitrocelulose após
Western blotting usando anti-histidina, VII: pré-purificação por coluna de afinidade, VIII:
fracção da purificação. MW: peso molecular em kDa. ............................................................ 65
Figura 17. (A) Sensorgramas relacionando as respostas obtidas para a adição de diferentes
concentrações da CP10 (2,32 a 934 nmol L-1). (B) Curvas de refletância obtidas sobre SAM
previamente ativada (curva em preto), após imobilização da CP10 (467 nmol L-1 ou 10 µg mL-
1, curva em vermelho) e após lavagem com HBS-EP, pH 7,4 (curva em verde). (C) Resposta
obtida pela QCM para a imobilização da CP10 (467 nmol L-1) sobre a SAM. ........................ 67
Figura 18. (A) Curvas de refletância medidas em 785 nm (curvas em preto) e 670 nm (curvas
em vermelho) para a superfície não modificada (Au) e após a formação ex situ de CP10/SAM
sobre superfície de ouro. (B) Gráfico n versus d obtido para CP10/SAM/Au em ambos os
comprimentos de onda apresentadas na Figura 18, curva em verde é a curva em 670 nm
deslocada. A interseção ocorre em d (6,80 ± 0,01) nm e n (1,475 ± 0,0001). .......................... 70
Figura 19. Diagrama de Nyquist (Z'' versus Z') obtido em solução aquosa de Fe(CN)6-3/-4 (1,0
mmol L-1) na presença de KCl (0,1 mol L-1). As curvas indicam a reação da sonda sobre
superfície de ouro não modificada (curva em azul), modificada com 11 MUA (curva em preto),
CP10/SAM (curva em vermelho) e com anti-CP10/CP10/SAM (curva em verde). Para essas
medidas, utilizou-se potencial de circuito aberto, uma amplitude de 10 mV e uma faixa de
frequência de 0,1 a 105 Hz. Inserção: circuito equivalente aplicado para modelar os dados dos
espectros de impedância na presença da sonda redox. ............................................................. 72
Figura 20. Curvas de SPR (A) e QCM (C) evidenciando as etapas de associação e dissociação
para a adição de diferentes concentrações dos anticorpos anti-CP10 (10,1; 20,2; 40,5; 81,0 e
162 nmo L-1) sobre CP10 imobilizada sobre SAM/Au. Figuras (B) e (D): curvas analíticas
obtidas pelo logaritmo da variação efetiva em função do logaritmo da concentração de
anticorpos para as respostas dos imunossensores de SPR (B) e QCM (D). ............................. 74
Figura 21. Etapas envolvidas na construção e avaliação do imunossensor de SPR. (I) Formação
de CYS-SAM sobre ouro; (II) Formação de PAMAM(G4)/CYS-SAM; (III) Imobilização da
proteína C1; (IV) Bloqueio dos grupos reativos inespecíficos; (V) interação entre IgGs anti-C1
e proteína C1. ............................................................................................................................ 84
Figura 22. Sensorgramas relacionando a ΔθSPR efetiva obtida para adição das diferentes
concentrações da proteína recombinante C1. Imobilização da proteína sobre CYS–SAM (A) e
sobre PAMAM(G4)-SAM (C). Figuras (B) e (D): relação linear entre a concentração da
proteína e a ΔθSPR efetiva para os resultados evidenciados pelas Figuras (A) e (B),
respectivamente. ....................................................................................................................... 85
Figura 23. Voltamogramas cíclicos (A) e diagrama de Nyquist (Z'' versus Z') (B), obtidos em
solução aquosa de Fe(CN)6 4-/3- (1,0 mmol L-1) na presença de KCI 0,1 mol L-1. As curvas
(Figuras A e B), evidenciam a reação da sonda sobre superfície de ouro não modificada (curvas
em preto), modificada com CYS-SAM (curvas em vermelho), PAMAM(G4)-SAM (curvas em
verde) e com antígeno-PAMAM(G4)-SAM (curvas em azul). Os voltamogramas (Figura 23A)
foram realizados a uma velocidade de varredura de 20 mV s-1. A Figura inserida (Figura 23B)
representa o circuito equivalente aplicado para modelar os dados de impedância na presença da
sonda redox. .............................................................................................................................. 87
Figura 24. (A) Sensorgrama ilustrando as fases de associação e dissociação após a adição de
diferentes concentrações dos anticorpos anti-C1 (9,70 a 155 nmol L-1) sobre a proteína C1 (1,96
µmol L-1 ou 80 µg mL-1) imobilizada sobre PAMAM(G4)/SAM/Au. (B) Curva analítica
evidenciando a faixa linear de resposta (9,70 a 51,8 nmol L-1). ............................................... 90
Figura 25. Gráfico construído a partir da derivada do ângulo de ressonância com o tempo
(dΔθSPR/dt) em função do ângulo de ressonância (ΔθSPR), obtido a partir das curvas de
associação e dissociação ilustradas na Figura 24A. ................................................................. 92
Figura 26. (A) Sensorgrama evidenciando as etapas de associação e dissociação para a adição
de soros caninos positivos em diferentes diluições (v/v) (1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1:
1600, 1: 3200, 1: 6400 e 1: 12800). (B) Curva analítica obtida do logaritmo da ΔθSPR efetiva
em função do fator de diluição do soro positivo. (C) Representação pelo gráfico de barras dos
valores da ΔθSPR efetiva após injeção de diferentes diluições dos soros caninos positivos e
negativos para a LVC. .............................................................................................................. 97
Figura 27. Esquema evidenciando as etapas envolvidas para síntese de HS-dendron-(PEG-
COOH)9 - composto (18). ....................................................................................................... 104
Figura 28. (A) Curvas de SPR ilustrando as etapas envolvidas na interação in situ de duas
diferentes concentrações do dendron (18) (1,0 e 0,75 mmol L-1) com a superfície de ouro. (B)
Curvas de refletância de SPR obtidas em cada etapa durante adsorção do dendron (1,0 mmol L-
1). ............................................................................................................................................ 116
Figura 29. Curvas de SPR ilustrando a imobilização de diferentes proteínas: IgG (A), Gal-3 (B),
CRP (C) e K39 (D) sobre o dendron (18) previamente ativado via EDC/NHS. .................... 117
Figura 30. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) do composto (2). ............................ 135
Figura 31. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 600MHz) do composto (3). ............................. 136
Figura 32. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250MHz) do composto (4). ............................. 137
Figura 33. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250MHz) do composto (5). Os picos 5,29 ppm,
2,96 ppm e 2,88 ppm são referentes a traços de CH2Cl2 e DMF............................................ 138
Figura 34. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 600MHz) do composto (6). O pico 5,29 ppm é
referente a traços de CH2Cl2. .................................................................................................. 139
Figura 35. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (7). ............................ 140
Figura 36. (A) Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (8). (B) Espectro de
RMN de 13C (CDCl3, 500 MHz) do composto (8), o pico em 77,16 ppm refere ao CDCl3. .. 141
Figura 37. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (10). .......................... 142
Figura 38. Espectro de RMN de 1H (CD3OH, 250 MHz) do composto (11). Os picos 3,31 ppm
e 4,88 ppm são referentes a traços de CH3OH e H2O, respectivamente................................. 143
Figura 39. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (12). .......................... 144
Figura 40. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (13). .......................... 145
Figura 41. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (14). .......................... 146
Figura 42. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (15). .......................... 147
Figura 43. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (16). .......................... 148
Figura 44. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (17). .......................... 149
Figura 45. Espectro de RMN de 1H (MeOD, 250 MHz) do composto (18). .......................... 150
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Desenho do gene sintético da CP10.......................................................................... 60
Tabela 2. Parâmetros cinéticos obtidos pelas técnicas de SPR e QCM ................................... 75
Tabela 3. Sequências de aminoácidos e nucleotídeos da proteína C1 - gi|146094146|ref|XP_
001467184.1| hypothetical protein [Leishmania infantum JPCM5]. ....................................... 80
Tabela 4. Parâmetros cinéticos obtidos a partir das curvas de SPR. ........................................ 96
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
11-MUA ácido 11-mercaptoundecanóico 13C RMN ressonância magnética nuclear de carbono 1H RMN ressonância magnética nuclear de hidrogênio
AFM microscopia de força atômica
anti-C1 anticorpo do antígeno C1
anti-CP10 anticorpo do antígeno CP10
BS3 bis (sulfosuccinimidyl) suberate
CF cristal fotônico
CP10 proteína quimérica recombinante
CPE elemento de fase constante
CRP proteína C reativa
CYS cisteamina
DIPEA N,N-diisopropiletilamina
DME dimetoxietano
DMF dimetilformamida
EA etanolamina
EDC hidrocloreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida
EIS espectroscopia de impedância eletroquímica
ELISA ensaio imunoadsorvente ligado à enzima
G0 geração zero
G1 geração um
G2 geração dois
G3 geração três
Gal-3 galectina-3
GLU glutaraldeído
HBS-EP solução tampão
Hepes 4 - (2 - hidroxietil) piperazina-1-etanossulfônico
His histidina
IFAT teste de anticorpo de imunofluorescência indireta
IgG imunoglobulina G
IPTG isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
LMC leishmaniose mucocutânea
LOD limite de detecção
LOQ limite de quantificação
LT leishmaniose tegumentar
LV leishmaniose visceral
LVC leishmaniose visceral canina
MP-SPR ressonância de plásmons de superfície multiparamétrica
NCBI Centro Nacional de Informações Biotecnológicas
NHS N-hidroxissuccinimida
OPS onda de plásmons de superfície
PAMAM poliamidoamina
PBS tampão fosfato salino
PCR reação em cadeia da polimerase
pET-28a vetor de expressão
pET9a24a vetor de expressão
Proteína C1 proteína recombinante hipotética ou antígeno C1
PS plásmons de superfície
QCM microbalança de cristal de quartzo
QIAamp quite para extração de DNA
r2 chi2
rA2 antígeno da classe das proteínas com função desconhecida
rHSP70 antígeno da classe das proteínas do choque térmico
rK26 antígeno da classe das cinesinas
rK39 antígeno da classe das cinesinas
rLACK antígeno da classe das enzimas
RTA reflexão total atenuada
SAMs monocamadas auto-organizadas
SPR ressonância de plásmons de superfície
SPRi ressonância de plásmons de superfície de imagem
THF tetraidrofurano
tween 20 surfactante P20
VC voltametria cíclica
LISTA DE SÍMBOLOS
[𝐵]0 concentração inicial do anticorpo
∆𝑚 variação de massa depositada sobre o cristal piezoelétrico
ⱪ𝑥 vetor de onda da luz incidente
𝐾𝐸𝑇o
constante aparente da velocidade heterogênea à transferência de elétrons
𝑘𝑎 constante cinética de associação
𝑘𝑑 constante cinética de dissociação
𝑘𝑡 constante de rearranjo molecular
𝜌𝑐 densidade do cristal piezoelétrico
𝜖1 parte real da constante dielétrica do prisma
[A] concentração de moléculas do antígeno C1
[AB] concentração do complexo antígeno C1 – anticorpo anti-C1
[B] concentração de moléculas do anticorpo anti-C1
∆𝑓 variação da frequência de ressonância do cristal piezoelétrico
µ módulo de cisalhamento do cristal
ABB complexo antígeno C1 – anticorpo anti-C1 formado por interação bivalente
C concentração molar
c velocidade da luz no vácuo
d espessura do filme
dn/dλ relação de correlação dos valores de n e λ
F constante de Faraday
Ia corrente de pico anódica
Ic corrente de pico catódica
ka1 constante cinética de associação para a primeira etapa de reação
ka2 constante cinética de associação para a segunda etapa de reação
KD constante de equilíbrio de dissociação
kd1 constante cinética de dissociação para a primeira etapa de reação
KD1 constante de equilíbrio de dissociação para a primeira etapa de reação
kd2 constante cinética de dissociação para a segunda etapa de reação
KD2 constante de equilíbrio de dissociação para a segunda etapa de reação
n índice de refração
n número de elétrons envolvidos na reação
R coeficiente de correlação
Rct resistência à transferência de carga
Rs resistência ôhmica da solução de eletrólito
RW impedância de Warburg
v velocidade de varredura
Z ' componente real originada da resistência e capacitância da célula
Z " componente imaginária originada da resistência e capacitância da célula
βPS vetor de onda dos plásmons de superfície
ΔE intervalo de potencial
ΔθSPR variações do ângulo de SPR
ΔθSPR1 variação do ângulo de SPR observada na primeira etapa de reação
ΔθSPR2 variação do ângulo de SPR observada na segunda etapa de reação
ΔθSPRmax sinal máximo obtido nas medidas de SPR
ϵa parte real da constante dielétrica do ambiente
ϵr parte real da constante dielétrica do metal
θ ângulo de incidência da luz
θSPR ângulo de SPR
λ comprimento de onda da luz no vácuo
ω frequência angular da luz
𝐴 área geométrica
𝐴𝑢 superfície do metal (sítio de adsorção)
𝐴𝑢 − 𝑅𝑆𝐻 monocamada desorganizada
𝐴𝑢 − 𝑅𝑆𝐻* monocamada organizada
𝑅 constante dos gases
𝑅𝑆𝐻 alcanotiol
𝑓o frequência de ressonância inicial
𝑡 tempo de interação
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 25
2. OBJETIVOS...................................................................................................................... 29
3 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................... 31
3.1. RESSONÂNCIA DE PLÁSMONS DE SUPERFÍCIE – SPR ...................................... 31
3.1.1. Plásmons de superfície ............................................................................................... 31
3.1.2. Sensores ópticos baseados em SPR ........................................................................... 34
3.1.3. Equipamento de SPR ................................................................................................. 37
3.2. MICROBALANÇA DE CRISTAL DE QUARTZO – QCM ....................................... 41
3.2.1. Piezoeletricidade ........................................................................................................ 41
3.2.2. Princípio básico de operação de um sensor baseado em QCM ................................. 41
3.2.3. Instrumentação - QCM .............................................................................................. 44
3.3. BIOSSENSORES BASEADOS EM SPR E QCM ....................................................... 45
3.3.1. Monocamadas auto-organizadas – SAMs .................................................................. 46
3.3.2. Dendrímeros e dendrons ............................................................................................ 48
3.4. LEISHMANIOSE VISCERAL ..................................................................................... 51
3.4.1. Proteínas recombinantes ............................................................................................ 53
4. USANDO QCM E SPR PARA AVALIAÇÃO CINÉTICA DA LIGAÇÃO ENTRE
UMA NOVA PROTEÍNA QUIMÉRICA RECOMBINANTE E ANTICORPOS DA LV136 57
4.1. MOTIVAÇÃO PARA REALIZAÇÃO DESTE ESTUDO .......................................... 57
4.2. EXPERIMENTAL ........................................................................................................ 58
4.2.1. Reagentes e soluções ................................................................................................. 58
4.2.2. Instrumentação ........................................................................................................... 58
4.2.3. Proteína quimérica recombinante - CP10 .................................................................. 60
4.2.4. Produção de anticorpos específicos para a CP10 ....................................................... 62
4.2.5. Construção dos imunossensores ................................................................................ 62
4.2.6. Caracterização e avaliação cinética da interação CP10 - anti-CP10.......................... 64
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 65
4.3.1. Proteína quimérica recombinante (CP10) .................................................................. 65
4.3.2. Avaliação in situ pela SPR e QCM da imobilização da CP10 sobre a SAM ............ 66
4.3.3. Determinando simultaneamente via SPR a espessura (d) e o índice de refração (n) da
CP10 imobilizada sobre SAM/Au ............................................................................................ 69
4.3.4. Caracterização da interação antígeno-anticorpo por espectroscopia de impedância
eletroquímica ............................................................................................................................ 71
4.3.5. Uso dos imunossensores de SPR e QCM para calcular a afinidade de ligação entre
CP10 e IgGs anti-CP10 ............................................................................................................ 73
4.4. CONCLUSÕES PARCIAIS .......................................................................................... 76
5. IMOBILIZAÇÃO SOBRE DENDRÍMERO DE UMA PROTEÍNA DE FUNÇÃO
DESCONHECIDA EM L. INFANTUM PARA ESTUDO CINÉTICO VIA SPR DA
INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO 146 ........................................................................ 78
5.1. MOTIVAÇÃO PARA REALIZAÇÃO DESTE ESTUDO .......................................... 78
5.2. EXPERIMENTAL ........................................................................................................ 79
5.2.1. Reagentes químicos, soluções e instrumentação ....................................................... 79
5.2.2. Proteína hipotética C1 (proteína recombinante C1 ou antígeno C1) ......................... 79
5.2.3. Produção de IgGs específicas para a proteína recombinante C1 ............................... 82
5.2.4. Soros caninos ............................................................................................................. 82
5.2.5. Construção e avaliação do imunossensor de SPR...................................................... 83
5.3. RESULTADOS E DISCUSAO ..................................................................................... 85
5.3.1. Imobilização da proteína C1 sobre CYS-SAM e PAMAM(G4)/SAM ..................... 85
5.3.2. Caracterização eletroquímica do imunossensor ......................................................... 86
5.3.3. Estudo cinético da reação entre a proteína C1 imobilizada sobre PAMAM(G4)/SAM
e suas IgGs anti-C1 ................................................................................................................... 89
5.3.4. Avaliação da imunogenicidade da proteína hipotética C1 frente a amostras reais .... 96
5.4. CONCLUSÕES PARCIAIS .......................................................................................... 99
6. SÍNTESE DE MOLÉCULA DO TIPO HS-DENDRON-(PEG-COOH)9 PARA
CONSTRUÇÃO DE UMA PLATAFORMA MULTIVALENTE INÉDITA EM
BIOSSENSORES ................................................................................................................... 101
6.1. MOTIVAÇÃO PARA REALIZAÇÃO DESTE ESTUDO ........................................ 101
6.2. EXPERIMENTAL ...................................................................................................... 102
6.2.1. Reagentes e instrumentação ..................................................................................... 102
6.2.2. Síntese do dendron de interesse - HS-DENDRON-(PEG-COOH)9 ........................ 102
6.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 115
6.4. CONCLUSÕES PARCIAIS ........................................................................................ 118
6.5. PERSPECTIVAS FUTURAS ..................................................................................... 118
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS SOBRE OS ESTUDOS
REALIZADOS NESTA TESE ............................................................................................... 121
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 124
ANEXO I ................................................................................................................................ 133
ANEXO II .............................................................................................................................. 134
ANEXO III ............................................................................................................................. 135
23
ESTRUTURA TEXTUAL
A sequência textual desta obra foi apresentada da seguinte forma:
Introdução geral abordando a problemática envolvida e as alternativas defendidas nesta
tese de doutorado. Sendo esta, uma discussão fundamentalmente importante para
ciência do leitor em relação à relevância científica dos objetivos deste trabalho.
Revisão da literatura, na qual foi discorrido sobre os temas relacionados, no intuito de
oferecer embasamentos teóricos/científicos para entendimento dos estudos realizados e
contextualização do assunto frente ao seu estado da arte.
Posteriormente, com o propósito de facilitar a compreensão dos avanços obtidos no
decorrer do trabalho, os estudos foram divididos em três partes (seções 4, 5 e 6), cada
qual consistindo de uma breve descrição sobre a motivação para realização do estudo,
do procedimento experimental, resultados e discussão e conclusões.
Por fim, foram mencionadas as perspectivas futuras e as considerações finais,
enfatizando as contribuições científicas dos estudos realizados nesta tese de doutorado.
24
Introdução
25
1. INTRODUÇÃO
Leishmaniose é uma doença tropical causada por parasita protozoário do gênero
Leishmania. 1 Apesar de apresentar-se como uma das principais parasitoses, em que são
notificados cerca de 2 (dois) milhões de novos casos por ano em quase 100 (cem) países
diferentes, a leishmaniose é referida por pesquisadores da área como uma doença ainda
negligenciada pelos órgãos governamentais. 2,3 De acordo com as espécies de Leishmania e a
resposta imune desenvolvida pelo indivíduo infectado, a leishmaniose é dividida em diferentes
classes. 4 Dentre estas, a leishmaniose visceral (LV) é a forma mais preocupante, apresentando
elevado índice de mortalidade, principalmente para indivíduos que não tem acesso a tratamento
adequado. 5,6 De acordo com a literatura, o número de casos de LV está intimamente
relacionado à situação econômica da região. 7
Nas Américas, o agente etiológico da LV mais comumente encontrado é a espécie
Leishmania infantum, sendo a principal via de transmissão desse protozoário através da picada
de flebotomíneos do gênero Lutzomyia. 8 A LV é considerada uma zoonose nas Américas, uma
vez que os cães ou outros canídeos são os principais hospedeiros do parasita. 8,9 Portanto, o
diagnóstico eficaz da leishmaniose visceral canina (LVC) é essencial, tanto para programas de
vigilância da LV quanto para evitar o abate desnecessário de cães. 10
O diagnóstico da LV é realizado em rotinas clínicas principalmente através de
métodos sorológicos, como o ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), devido ao fato de
a resposta humoral do indivíduo infectado apresentar elevados níveis de imunoglobulinas
específicas, além de evitarem a utilização de procedimentos invasivos. 11 No entanto, muitas
limitações ainda estão associadas a esses testes, tais como a baixa sensibilidade para detecção
de casos assintomáticos e a existência de reações cruzadas com outras doenças. 12 Sabe-se que
um dos fatores que contribui significativamente para estas limitações é a forma antigênica
utilizada nestes ensaios. 13 Neste contexto, grandes motivações para ultrapassar as limitações
dos ensaios convencionais da LV consistem no uso de técnicas alternativas para
desenvolvimento de novas metodologias de detecção da doença, assim como, na investigação
de novos antígenos (proteínas recombinantes, por exemplo) para serem empregados nos
imunoensaios. 14
Diante à problemática apresentada, pode-se destacar a passível contribuição de
biossensores baseados nas técnicas de ressonância de plásmons de superfície (SPR, do inglês
Surface Plasmon Resonance) e microbalança de cristal de quartzo (QCM, do inglês Quartz
26
Crystal Microbalance) em diversos aspectos relacionados ao imunodiagnóstico da LV. 15-17 As
principais vantagens na utilização de biossensores de SPR e QCM em relação aos testes
convencionais consistem em: (1) elevada sensibilidade para avaliação da interação antígeno-
anticorpo, fator de extrema importância para detecção de casos assintomáticos da doença,
situação em que a concentração parasitária é reduzida na corrente sanguínea do indivíduo
infectado; (2) redução do número de etapas, tornando-se um método de diagnóstico mais rápido;
(3) possibilidade de regeneração da superfície do sensor, permitindo o uso de um mesmo
imunossensor para avaliação de inúmeras amostras; (4) as análises não dispendem de marcação
química e/ou biológica, possibilitando o monitoramento de interações entre biomoléculas em
tempo real. Esta última característica, particularmente, permite explorar aspectos cinéticos e
termodinâmicos acerca de eventos de interação biomolecular, 18 sendo este, um fator
fundamentalmente importante para que, através dos biossensores de SPR e QCM, seja possível
mensurar a afinidade de ligação e elucidar a cinética de reação entre novas proteínas de L.
infantum e anticorpos específicos da LV.
Uma vez discutido o potencial de aplicação dos sensores de SPR e QCM, é
importante salientar que o bom desempenho de biossensores também está intimamente
relacionado à etapa de biofuncionalização. 19 Dessa forma, uma atenção deve ser voltada à
cobertura de superfícies metálicas anteriormente à imobilização de biomoléculas, permitindo
minimizar adsorções não específicas, bem como, introduzir grupos reativos para imobilização
específica. Com este intuito, pode-se destacar a elevada eficiência de monocamadas auto-
organizadas (SAMs, do inglês Self-Assembled Monolayers) de alcanotióis e de dendrímeros e
dendrons combinados ou não com as SAMs para a etapa de funcionalização de superfícies
metálicas. 20,21
A formação de SAMs pela adsorção de tióis sobre superfície de ouro consiste em
um dos métodos mais convenientes, flexíveis e simples. 22 Além disso, uma das vantagens mais
relevante desses organizados moleculares está em sua capacidade de controlar a acessibilidade
e a orientação de moléculas ligadas, possibilitando um excelente controle a nível molecular.
22,23 Portanto, apesar de sua extensiva utilização nos últimos anos, a funcionalização de
superfícies através de SAMs de alcanotióis apresenta-se como um método bem estabelecido,
consistindo em uma das principais vias para construção de biossensores baseados em SPR e
QCM. 21
No intuito de buscar a amplificação da interface transdutora para desenvolvimento
de biossensores com sensibilidades e seletividades cada vez mais elevadas, destaca-se o uso de
27
sistemas multivalentes, tais como os dendrímeros e dendrons para suporte de biomoléculas. 24
Dendrímeros e dendrons são macromoléculas monodispersas que possuem uma arquitetura
tridimensional altamente ramificada e são muito bem definidos em termos de tamanho e número
de grupos terminais. 25 Essas macromoléculas têm alcançado espaço no desenvolvimento de
uma promissora área de pesquisa científica fundamentada em suas propriedades, uma vez
possuem estruturas bem definidas com elevado controle sobre suas as dimensões e propriedades
físicas e químicas, possibilitando a construção de filmes finos com maior número e exposição
de sítios ativos para o suporte de biomoléculas. 20,24
De acordo com o exposto, é nítida a importância das técnicas de SPR e QCM e das
metodologias mencionadas para construção de biossensores, evidenciando a viabilidade de
aplicação destes sensores em aspectos diversos relacionados ao diagnóstico da LV. Neste
contexto, os estudos apresentados no presente trabalho de tese consistem, tipicamente, no
desenvolvimento de imunossensores de SPR e QCM para mensurar a afinidade de ligação e
estudar os mecanismos cinéticos da interação entre novas proteínas originárias de L. infantum
e anticorpos específicos da LV. Para a construção dos biossensores, diferentes plataformas para
imobilização das proteínas foram avaliadas, incluindo SAMs de alcanotióis combinadas ou não
com dendrímeros e dendrons. Nesta etapa, destaca-se a síntese orgânica de um dendron inédito
para construção dos biossensores. Finalmente, amostras reais de soros caninos positivos e
negativos para a LV foram utilizadas para avaliação da sensibilidade e seletividade dos
imunossensores desenvolvidos.
28
Objetivos
29
2. OBJETIVOS
Objetivo geral:
Desenvolvimento de imunossensores de SPR e QCM através da imobilização de
proteínas recombinantes de Leishmania infantum sobre plataformas organizadas para o estudo
de interações dessas proteínas com anticorpos específicos da Leishmaniose Visceral.
Objetivos específicos:
Estudo da funcionalização de superfícies de ouro empregando SAMs de tióis e
sistemas multivalentes formados pelo princípio layer-by-layer através da
combinação de dendrímeros comerciais do tipo poliamidoamina com as SAMs.
Síntese orgânica de um dendron inédito do tipo HS-dendron-(PEG-COOH)9 para
construção dos biossensores.
Investigação in situ via SPR e QCM da imobilização de diferentes proteínas de L.
infantum sobre os filmes formados.
Caracterização eletroquímica via espectroscopia de impedância eletroquímica e
voltametria cíclica dos imunossensores construídos.
Estudo através dos imunossensores de SPR e QCM de interações entre novas
proteínas recombinantes de L. infantum e anticorpos específicos da LV.
Avaliação do potencial antigênico das proteínas recombinantes estudadas através
de parâmetros cinéticos obtidos dos resultados das interações biomoleculares.
Emprego de amostras de soros caninos positivos e negativos para a LV para
avaliação da sensibilidade e seletividade dos imunossensores propostos.
30
Revisão da Literatura
31
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1. RESSONÂNCIA DE PLÁSMONS DE SUPERFÍCIE – SPR
3.1.1. Plásmons de superfície
O estudo da interação de ondas eletromagnéticas sobre interfaces, tem resultado em
inúmeras técnicas para monitoramento de processos interfaciais e superficiais. Neste contexto,
uma grande variedade de interfaces tem sido explorada, tais como, dielétrico-dielétrico,
dielétrico-semicondutor e dielétrico-metal. 26 Dentre estas, a interface dielétrico-metal
apresenta características particulares interessantes, uma vez que excitações eletrônicas coletivas
em superfícies metálicas são bem conhecidas por desempenharem um papel fundamental em
várias áreas, estendendo desde a física e ciência dos materiais até a biologia. 27,28
De acordo com Pitarke et al. (2007), 29 os estudos realizados por Tonks e Langmuir
(1929), 30 Ruthemann (1942), 31 Lang (1948), 32 Pines e Bohm (1952), 33 Pines (1956), 34 e
Ritchie (1957), 35 foram imprescindíveis para que Powell e Swan em 1959 finalmente
demonstrassem a existência de excitações coletivas sobre superfícies metálicas, 36,37 fenômeno
que passou a ser chamado por Stern e Ferrell (1960) de plásmons de superfície (PS). 38 Por
definição, PS são oscilações de cargas, em geral elétrons, na interface dielétrico-metal que
criam campos eletromagnéticos evanescentes decaindo exponencialmente em direção
perpendicular à superfície metálica.
Posteriormente, diferentes abordagens na literatura foram realizadas para descrever
a relação de dispersão para os PS. Em uma delas, Raether obteve essa relação para uma interface
metal-dielétrico através das equações que descrevem as condições de contorno de Maxwell 39-
41. Cardona por sua vez, utilizou uma abordagem mais simples para obtenção dessa relação. 42
Em geral, todas as abordagens culminam na equação abaixo, que consiste tipicamente na
relação entre frequência angular (ω) e a constante de propagação para os PS (βPS) numa
interface metal-dielétrico (equação 1).
𝛽𝑃𝑆 = 𝜔
𝑐√
𝜖𝑟𝜖𝑎
𝜖𝑟+ 𝜖𝑎=
2𝜋
𝜆 √
𝜖𝑟𝜖𝑎
𝜖𝑟+ 𝜖𝑎 (1)
Sendo, βPS a constante de propagação dos PS; ω é a frequência angular da luz; c é a velocidade
da luz no vácuo; λ o comprimento de onda no vácuo; ϵr e ϵa: parte real da constante dielétrica
do metal e do ambiente, respectivamente.
32
A Figura 1 evidencia a relação de dispersão dos PS numa interface metal-dielétrico
(curva em azul) e a relação de dispersão para uma radiação eletromagnética propagando no ar
(curva em verde) e em um prisma (curva em vermelho).
Figura 1. Curva de dispersão para os plásmons de superfície numa interface ar/ouro (curva
em azul). Relação de dispersão para a radiação eletromagnética propagando no ar (curva em
verde) e num prisma (curva em vermelho).
Conforme observado pela Figura 1, a curva de dispersão dos plásmons (curva em
azul) em toda região de ω observada está abaixo da curva de dispersão dos fótons propagando
no dielétrico ar (curva em verde). É possível evidenciar através dessas curvas que a constante
de propagação dos PS (βPS) em uma interface metal-dielétrico é maior que o vetor de onda da
luz no dielétrico. Neste caso, PS não podem ser excitados mediante o simples contato com a
onda incidente sobre uma superfície metálica lisa. Contrariamente, observando a curva de
dispersão da onda incidente em um prisma (curva em vermelho), observa-se que em
determinado momento o vetor de propagação da luz se iguala em magnitude ao βPS, podendo,
neste caso, ocorrer o acoplamento entre os fótons e os plásmons. Neste contexto, sistemas
ópticos foram desenvolvidos para elevarem o momento da radiação incidente de forma que os
plásmons possam receber energia da onda incidente através de uma transferência ressonante de
energia. 43-45
Teng and Stern em 1967 sugeriram que sobre uma superfície metálica rugosa ou
sobre uma rede metálica (grades de difração) pode haver o acoplamento entre PS e uma radiação
eletromagnética, sendo tal fato aplicado tanto para filmes finos quanto espessos. 46
Alternativamente, como demonstrado por Otto (1968) 44 e Kretchmann e Raether (1968) 43 o
acoplamento com prismas também pode ser utilizado para aumentar o momento da luz
33
incidente. No trabalho de Otto, a camada dielétrica foi inserida entre o metal e o prisma (Figura
2A) e os experimentos comprovaram que a queda na refletividade durante o fenômeno de
reflexão total atenuada (RTA) é devido à excitação dos PS. Sendo também observada por
Kretschm e Raether a excitação dos plásmons em outra configuração do método de reflexão
total atenuada, na qual a camada metálica foi colocada entre o prisma e o meio dielétrico (Figura
2B).
Figura 2. Fenômeno da reflexão interna total atenuada empregada nas configurações de Otto
(A) e de Kretschm (B). Na configuração de Otto, a camada dielétrica é colocada entre o prisma
e o metal. Na configuração de Kretschm, o filme metálico é inserido diretamente sobre o prisma
e os plásmons são excitados na interface externa.
Portanto, a partir dos estudos iniciais envolvendo os PS, tem havido um avanço
significativo em investigações teóricas e experimentais, que por sua vez, tornou-se essencial
para a interpretação de uma grande variedade de experimentos e no entendimento de várias
propriedades fundamentais de sólidos. 47 Adicionalmente, é de substancial importância
mencionar que nos trabalhos de Otto, Kretschm e Raether foi estabelecido um conveniente
método para excitação de plásmons na investigação do índice de refração nas proximidades do
metal. Estes estudos foram centrais para que, posteriormente, fosse explorado o fenômeno de
ressonância de plásmons de superfície (SPR) através de sensores ópticos para avaliação de
processos interfaciais e superficiais. 42
34
3.1.2. Sensores ópticos baseados em SPR
Por definição, um sensor óptico é um dispositivo de detecção que, por meios
ópticos, converte a informação requerida (como a concentração do analito de interesse presente
em uma amostra complexa) em um sinal normalmente baseado em características da onda de
luz. Isto permite que vários métodos sejam empregados em plataformas de sensores ópticos,
incluindo o monitoramento da variação do índice de refração, absorção e medidas baseadas em
espectroscopia. 48 No caso dos sensores ópticos baseados na excitação dos PS, os mesmos são
referidos como sensores de SPR. 49
Tipicamente, em um sensor de SPR variações no índice de refração próximas a uma
interface (metal-dielétrico, por exemplo) são acompanhadas por variações na constante de
propagação dos PS. Estas variações alteram as condições de acoplamento entre a onda incidente
e a onda dos plásmons, sendo caracterizadas através alterações observadas na onda incidente,
seja a variação do ângulo de incidência, comprimento de onda, intensidade da luz, mudança de
fase, entre outras. 42 Dessa forma, baseando-se nestas características da luz incidente, os
sensores de SPR são classificados como sensores com modulação angular, 50 do comprimento
de onda, 51 de intensidade 52 ou de fase. 53
Desde a primeira documentação de um sensor químico baseado em SPR reportado
por Nylander e colaboradores (1982), 52 esse campo tem avançado significativamente em
termos de tecnologia e suas aplicações. Tal fato se deve em grande parte aos progressos
alcançados no desenvolvimento dos dispositivos ópticos, tais como os acopladores. Apesar de
novas configurações terem surgido nos últimos anos, 45 o fenômeno físico da reflexão total
atenuada utilizando como acopladores prismas ou guias de ondas ópticas, juntamente com o
princípio da difração da luz empregando grades de difração, consistem nas principais
configurações utilizadas até o momento em sensores de SPR. 54,55
Acoplamento com prismas em sensores de SPR
A maioria dos sensores de SPR utiliza o prisma para acoplar a luz a um plásmon de
superfície. Este tipo de acoplamento é conveniente e pode ser realizado com elementos ópticos
simples e convencionais. Além disso, o prisma pode ser facilmente combinado com qualquer
tipo de modulação (intensidade, angular, comprimento de onda e fase) (Figura 3A). 17
35
Figura 3. Principais acopladores utilizados para construção de sensores de SPR: (A) prisma;
(B) grades de difração; (C) fibra óptica (guia de onda); (D) cristal fotônico (guia de onda
planar à esquerda e CF microestruturado à direita). Essas Figuras foram adaptadas de: Roh
et al 56 (Figura A), DiPippo et al 57 (Figura B), e Tokel et al 45 (Figuras C e D).
Os chamados sensores baseados em espectroscopia de PS são os mais empregados
em dispositivos comerciais de SPR. Nestas configurações, o espectro angular ou do
comprimento de onda da luz acoplada a um plásmon de superfície é medido e através do
fenômeno da RTA a informação sobre o índice de refração é correlacionada com uma alteração
na posição angular ou do comprimento de onda. 45 O princípio básico de transdução em um
sensor de SPR com modulação angular será descrito de forma pormenorizada posteriormente.
A investigação através dos sensores de SPR que operam pela modulação de
intensidade utilizando prismas também se destaca devido principalmente a dois aspectos
importantes: melhorias no desempenho analítico (sensibilidade e resolução) e aumento de
amostragem. Um exemplo típico desta configuração é a SPR de imagem (SPRi). Neste sistema,
basicamente, um feixe de luz monocromática passa através de um acoplador de prisma e incide
sobre um filme metálico fino com um ângulo de incidência próximo do ângulo de acoplamento.
A intensidade da luz refletida é diretamente correlacionada às variações do índice de refração
na superfície do filme metálico. 58
36
Uso de grades de difração como acopladores em sensores de SPR
Conceitualmente, se uma interface metal-dielétrico é periodicamente irregular
ocorre a difração da onda incidente, formando uma série de feixes que divergem em diferentes
angulações a partir da interface (Figura 3B). Este fenômeno pode ser aplicado para excitação
dos PS utilizando uma grade ou rede de difração metálica com dimensões de rede menores que
o comprimento de onda da luz. Nesta configuração, quando o momento de onda da luz ao longo
da interface de uma ordem difratada é igual à constante de propagação dos PS, pode haver o
acoplamento entre as ondas (Figura 3B). 59
Em termos estruturais, os sensores de SPR baseados em grades de difração são
muito diversos, operando tanto no modo de transmissão (Figura 3B) quanto no modo da
reflexão. Outro aspecto interessante refere-se à incidência da luz, podendo ser realizada
diretamente sobre a face do sensor ou sobre sua face oposta. Além disso, grades de difração são
passíveis de combinação em sensores de SPR com modulação de intensidade, comprimento de
onda ou angular. 59
Atualmente, acopladores de grades não têm sido utilizados em sensores de SPR tão
amplamente como os de prismas. No entanto, apresenta-se ainda como uma abordagem atrativa
para a fabricação de estruturas de sensores SPR de custo mais reduzido quando comparado ao
uso de prismas. 45
Acoplamento através de guias de onda em sensores de SPR
Estruturas de guias de ondas ópticas podem ser utilizadas para acoplamento de luz
para excitação dos PS. A intensidade da onda propagando na guia é concentrada na estrutura da
guia de onda planar, enquanto uma pequena porção da luz estende-se através da camada
metálica para a interface (metal – meio de detecção) e excita os PS. 60 Um exemplo
característico deste método consiste na abordagem de acoplamento baseada em fibra óptica,
conforme evidenciado através da representação esquemática da Figura 3C. Neste caso, os cabos
da fibra são guias de ondas ópticas cilíndricas que operam através do princípio da reflexão
interna. A elevada resistência à propagação da luz no revestimento da fibra (material de elevado
índice de refração) permite que a onda incidente se propague no núcleo da fibra onde o índice
de refração é menor. Então, uma parte do revestimento da fibra pode ser removida e revestida
com uma camada fina de metal que, por sua vez, estará em contato com a camada de detecção.
Dessa maneira, através do princípio da reflexão total a luz incide na camada de metal e chega
37
à interface (metal – meio de detecção) como uma onda evanescente de forma a excitar os PS.
61
Os primeiros sensores de SPR baseados em fibra óptica foram relatados no início
de 1990 62-64 e devido ao elevado potencial da fibra para a miniaturização de dispositivos,
observa-se pelo estado da arte de sensores de SPR um campo promissor na utilização de fibras
ópticas para construção de dispositivos do tipo point of care. 45,65
Recentes acopladores utilizados em sensores de SPR
Nos últimos anos, novos métodos de acoplamento também têm atraído a atenção,
como por exemplo, os sensores de SPR baseados em cristal fotônico (CF), com destaque para
as fibras de guias de ondas planares e fibras de CF microestruturadas. Estas tecnologias
apresentam-se boas perspectivas quanto ao seu emprego combinado ao campo da microfluídica
para construção de sensores integrados. 66
Basicamente, na estrutura de guias de ondas planares, o núcleo é coberto com uma
estrutura de CF periódica (Figura 3D), sendo um dos lados da guia de onda revestido com o
metal que está em contato com o analito a ser detectado. Por sua vez, em uma das possíveis
estratégias de uso das fibras de CF microestruturadas, os buracos geométricos preenchidos de
ar promovem a estrutura periódica para o CF e o formato semicircular são microcanais
preenchidos com o analito (Figura 3D). Esses canais são então cobertos de ouro para excitação
dos PS.
3.1.3. Equipamento de SPR
A Figura 4 é uma fotografia de um equipamento de SPR (Autolab Spirit, Eco
Chemie BV, Ultrech, Holanda), destacando a unidade óptica (fonte de luz, prisma e detector) e
o substrato (disco de vidro recoberto com uma camada nanométrica de ouro) utilizado nas
análises de SPR.
38
Figura 4. Fotografia do equipamento de SPR, unidade óptica e substrato de SPR.
Com o intuito de demonstrar o princípio de funcionamento de um equipamento que
opera mediante a excitação dos PS, será descrito de forma pormenorizada o princípio de
transdução de um sensor de SPR que utiliza prisma e é baseado no método de reflexão total
atenuada utilizando a configuração de Kretschm. Sendo esta, a configuração mais empregada
em dispositivos comerciais, uma vez que geralmente apresentam maior sensibilidade e
resolução em relação aos dispositivos desenvolvidos por grades de difração. 17
O exemplo a seguir envolve um sensor de SPR com modulação angular. A Figura
5A evidencia um esquema de um dispositivo óptico genérico constituído de um prisma e uma
interface metal-dielétrico. Neste sistema, quando um feixe luminoso (luz monocromática, em
geral, laser ou LED) atravessa o prisma e alcança uma superfície metálica que exibe um bom
comportamento de elétrons livres (Au, Ag, Pt ou Cu, por exemplo), pode ocorrer a excitação
dos PS. Em certos ângulos de incidência a luz monocromática penetra na interface na forma de
ondas evanescentes (campo eletromagnético) de forma a acoplar com as ondas de plásmons de
superfície (OPS) (Figura 5A).
Conforme aspectos fundamentais discutidos anteriormente, é necessário que a
constante de propagação da onda incidente tenha magnitude igual ou superior ao vetor de
propagação dos PS (𝛽𝑃𝑆) para haver o acoplamento mediante o contato direto das ondas.
Sabendo que a componente paralela da luz monocromática incidente tem o vetor de onda (ⱪ𝑥)
relacionado com o ângulo de incidência da luz, pode-se calcula-lo através da seguinte
expressão:
Equipamento de SPR
Fonte de Luz
Detector
Substrato de SPR
Prisma
39
Figura 5. Desenho esquemático ilustrando: (A) sensor de SPR com modulação angular
baseado na configuração de Kretschm; (B) curvas de refletância na ausência (θSPR1) e presença
(θSPR2) de espécies na superfície do filme metálico; (C) sensorgrama (ΔθSPR em função do
tempo) evidenciando interação de biomoléculas sobre superfície do metal.
ⱪ𝑥 = √𝜖1 2𝜋
𝜆 sin 𝜃𝑆𝑃𝑅 (2)
em que θ é o ângulo de incidência da luz com a superfície do metal, λ é o comprimento de onda
da luz incidente, e 𝜖1 é a constante dielétrica do prisma.
Sob condições de máximo acoplamento entre a radiação incidente e a OPS, a relação ⱪ𝑥 = 𝛽𝑃𝑆
é satisfeita (equação 3):
√𝜖1 2𝜋
𝜆sin 𝜃𝑆𝑃𝑅 =
2𝜋
𝜆√
𝜖𝑟𝜖𝑎
𝜖𝑟+ 𝜖𝑎 (3)
40
Rearranjando matematicamente esta última expressão pode-se verificar facilmente através da
expressão abaixo representada pela equação 4 que as propriedades ópticas do sistema, como as
constantes dielétricas do metal (𝜖𝑟), do prisma (𝜖1) e do ambiente (𝜖𝑎), provocam variações no
ângulo de incidência. Sendo o ângulo incidente, neste momento, chamado de ângulo de SPR
(θSPR):
θSPR = 𝑎𝑟𝑐𝑠𝑒𝑛 (√(𝜖𝑟𝜖𝑎
𝜖𝑟+ 𝜖𝑎) ×
1
𝜖1) (4)
Neste instante, ocorre uma transferência ressonante de energia entre a radiação incidente e a
OPS através do fenômeno de reflexão interna total atenuada, observando à queda da refletância
a quase zero, conforme evidenciado pela curva de refletância de SPR (Figura 5B). Estas
observações configuram o princípio de funcionamento de um sensor de SPR com modulação
angular, por meio da qual é possível aplicar o fenômeno da SPR para o monitoramento do índice
de refração nas proximidades da interface metal-dielétrico através do acompanhamento do θSPR
com o tempo (sensorgrama, Figura 5C). Dessa forma, as análises realizadas por um sensor de
SPR podem ser utilizadas para obtenção de informações em tempo real e sem a necessidade do
uso de marcadores químicos ou biológicos. 67,68
Atualmente, a exploração da excitação de PS para avaliação de processos
superficiais e interfaciais apresenta-se como um campo muito bem estabelecido, sendo a técnica
de SPR uma das principais ferramentas para avaliação de eventos de natureza biológica. 69
Neste contexto, fatores como detecção altamente sensível, rápido tempo de resposta,
capacidade de regeneração da superfície do sensor e possibilidade de miniaturização do sistema,
são características motivadoras encontradas em biossensores de SPR. 70,71 Adicionalmente,
torna-se de fundamental importância enfatizar que através de análises de SPR obtidas em tempo
real e sem marcação, torna-se possível explorar parâmetros cinéticos e termodinâmicos acerca
de interações biomoleculares, auxiliando significativamente o entendimento a nível molecular
desses sistemas. 18,72
41
3.2. MICROBALANÇA DE CRISTAL DE QUARTZO – QCM
3.2.1. Piezoeletricidade
Os sensores de ondas acústicas que operam através da QCM apresentam capacidade
de monitoramento de eventos de superfície semelhantes à SPR, embora os princípios de
transdução das técnicas sejam completamente distintos.
Sob aspectos fundamentais, certos materiais quando perturbados mecanicamente
(deformações ou aplicações de pressões externas) respondem com uma perturbação elétrica.
Por outro lado, perturbações elétricas são acompanhadas por respostas mecânicas desses
materiais, tal como o movimento cisalhante (movimentação do material na direção
perpendicular à direção normal de aplicação do campo elétrico). A esses fenômenos dá-se o
nome de piezoeletricidade (“eletricidade por pressão”, piezo do grego), nome proposto por
Hankel em 1881 um ano antes do fenômeno ser observado primeiramente pelos irmãos Pierre
e Jacques Currie. 73,74
Os cristais que apresentam essa propriedade são denominados de cristais
piezoelétricos, tendo o quartzo como um dos principais representantes. Assim, quando
pressionado, o cristal de quartzo deforma-se como resultado do rearranjo de sua rede cristalina,
de tal forma que cargas opostas são induzidas em suas faces. Como consequência, um campo
elétrico é gerado, que por sua vez, promove um movimento vibracional no cristal. Neste
instante, é estabelecida uma onda acústica transversa que se propaga através do cristal,
resultando no deslocamento dos átomos paralelo à sua superfície. Dessa forma, se um material
é depositado sobre a superfície do cristal ocorre uma redução no movimento de oscilação do
mesmo, ocasionando diminuição de sua frequência de ressonância. 73-75
3.2.2. Princípio básico de operação de um sensor baseado em QCM
A Figura 6 evidencia um esquema de um circuito genérico simples utilizado para
produzir a oscilação mecânica e medir a frequência de ressonância do cristal piezoelétrico.
Diretamente ligado ao circuito oscilador é conectado um contador de frequência
(frequencímetro) responsável pelo monitoramento das variações na frequência de oscilação do
cristal e um computador para obtenção e tratamento dos dados. É importante mencionar que o
circuito deve estar o mais próximo possível do quartzo para evitar interferências que produzam
variações na frequência de oscilação.
42
Figura 6. Representação esquemática de um sistema genérico empregado para produzir
oscilação mecânica e medir a frequência de oscilação do cristal piezoelétrico. Constituintes
básicos: cristal piezoelétrico inserido no interior da célula de fluxo, circuito oscilador,
frequencímetro e um computador pessoal.
De forma geral, o efeito comum básico para toda as classes de sensores que operam
mediante ondas acústicas é a diminuição na frequência de ressonância causada pela deposição
de uma massa pelicular sobre a superfície. Esse efeito gravimétrico motiva à denominação de
Microbalança de Cristal de Quartzo (QCM), que desde sua primeira aplicação em 1959 por G.
Sauerbrey, 76 cristais de quartzo recobertos com filmes finos de metais nobres (ouro ou prata,
por exemplo) passaram a ser utilizados diretamente como eletrodos ou como substratos
funcionalizados em uma variedade de aplicações. Atualmente, a QCM é referida como o
instrumento de escolha no campo de sensores acústicos. 15
De acordo com a equação desenvolvida por Sauerbrey (equação 5) uma relação
quantitativa entre a variação de massa de filmes rígidos depositados em fase gasosa sobre o
cristal (∆𝑚) com a variação de sua frequência de ressonância (∆𝑓) pode ser obtida:
∆𝑓 = −2𝑓02
1
𝐴√ρ𝑐 µ𝑐 ∆𝑚 (5)
Sendo, 𝑓o a frequência de ressonância fundamental, 𝜌𝑐 a densidade do cristal, µc o módulo de
cisalhamento do cristal e 𝐴 é a área do cristal que entra em contato com o meio de detecção.
Pode ser observado através da equação de Sauerbrey que apenas o efeito gravimétrico é levado
em consideração sobre a ∆𝑓.
43
No entanto, para casos em que se tem uma maior carga envolvida (estudos envolvendo
biomoléculas, por exemplo), há um afastamento do regime gravimétrico e a variação da
frequência torna-se uma função da massa, assim como, das propriedades viscoelásticas do
filme. 74,77
Neste contexto, a aplicação de amostras biológicas em QCM tornou-se possível
quando circuitos osciladores foram modificados para operarem em meio líquido. 78 Outro
aspecto a ser levado em consideração é a necessidade da não variação das propriedades do
líquido circundante durante os experimentos, uma vez que as mudanças nos parâmetros da
QCM devem ser devidas somente à deposição ou interação biomolecular que ocorre sobre a
interface metal-líquido. Além disso, nenhuma alteração na impedância acústica do sistema deve
ser monitorada durante o experimento, assegurando o comportamento de Sauerbrey como o da
camada de interface e efeitos insignificantes em relação às alterações das propriedades de
líquidos. 15,77
Em virtude da elevada sensibilidade e seletividade alcançada através da
combinação de receptores biológicos e o avanço tecnológico dos dispositivos piezoelétricos,
nos últimos anos, a grande maioria dos trabalhos publicados com QCM envolveu aplicações
em que o cristal de quartzo é utilizado como suporte para ligação de biomoléculas (Figura 7).
Para estes sistemas, a interação biomolecular pode ser acompanhada em tempo real através de
variações da frequência de oscilação do cristal piezoelétrico (Figura 7).
Figura 7. Representação esquemática da resposta característica observada em um sensor
baseado em QCM, evidenciando que a interação biomolecular é acompanhada pela
diminuição da frequência de oscilação do cristal de quartzo (f).
Δf
Tempo
Quartzo
Quartzo
Quartzo
44
Este tipo de abordagem permite a obtenção de parâmetros cinéticos e termodinâmicos acerca
dos eventos de natureza biológica e, portanto, tem se apresentado como uma excelente
ferramenta para o entendimento a nível molecular desses sistemas. 16,18,79
3.2.3. Instrumentação - QCM
O aperfeiçoamento da tecnologia de QCM para avaliação de eventos de
reconhecimento molecular, tais como, afinidade de ligação, cinética e mudança
conformacional, tem impulsionado um crescente número de sistemas disponíveis no mercado.
Esta tendência se deve em grande parte ao reconhecimento da versatilidade e capacidade
analítica de sensores acústicos. 15 A Figura 8 é a fotografia de uma QCM (Metrohm-Autolab,
Utrecht, Holanda) utilizada como sensor químico em laboratório. Observa-se o local da célula
onde o cristal de quartzo é inserido e o acoplamento desse sistema ao circuito oscilador (Figura
8A).
Figura 8. Fotografia do cristal de quartzo recoberto com uma camada nanométrica de ouro
sendo inserido no interior da célula (A); e acoplamento do sistema (célula e cristal) ao circuito
oscilador (B).
Atualmente, os sensores baseados em QCM disponíveis comercialmente estão
inseridos em dois principais mercados. O primeiro consiste na investigação científica, a qual
está voltada à ciência dos materiais e da vida, sendo os sensores de QCM empregados para
estudar as interações biológicas e características de superfície. 80-82 O segundo está relacionado
à sistemas de detecção do tipo point of care para aplicações médicas e detecção química de
drogas e explosivos, por exemplo. 77,79,83
(A)
(B)
45
Uma vez conhecido o potencial de aplicação das configurações baseadas em SPR e
QCM para a construção de sensores, uma ênfase será voltada ao uso dessas técnicas para o
desenvolvimento de biossensores, sendo este um campo interdisciplinar que tem despertado
grande atenção em inúmeras áreas da ciência.
3.3. BIOSSENSORES BASEADOS EM SPR E QCM
Os biossensores pertencem a uma subclasse de sensores químicos, sendo
constituídos de um componente de reconhecimento biológico (tais como enzimas, antígenos,
anticorpos, DNA, RNA, células inteiras e tecidos) em íntimo contato com uma superfície de
um transdutor, que por sua vez, converte a informação da interação biológica em um sinal
quantificável 84. Um desenho esquemático do princípio geral de operação dos biossensores pode
ser visualizado através da Figura 9.
Figura 9. Desenho esquemático de um biossensor, ilustrando: (I) interação de analitos com
biomoléculas de reconhecimento imobilizadas sobre superfície de ouro funcionalizada; (II)
respostas acompanhadas em tempo real das interações pelos biossensores de SPR e QCM; (III)
parâmetros cinéticos e termodinâmicos medidos através dos resultados obtidos pelos
biossensores.
Biossensores são dispositivos analíticos que combinam a elevada sensibilidade
alcançada pelo avanço da tecnologia dos sistemas de transdução, com a especificidade do
46
sistema de reconhecimento biológico. 85 Neste sentido, além da configuração utilizada para
transdução do sinal, o bom desempenho de um biossensor (tais como, sensibilidade,
especificidade, linearidade, reusabilidade, estabilidade química e reprodutibilidade) também
está intimamente relacionado à etapa de imobilização de biomoléculas sobre o substrato sensor
(biofuncionalização). Idealmente, uma matriz de um biossensor deve ser uma superfície
molecularmente organizada que exiba acessibilidade adequada com elevada densidade de
grupos reativos para imobilização específica, além de minimizar ligações inespecíficas.
Portanto, extensivos estudos devem ser realizados visando à cobertura de superfícies metálicas
previamente à imobilização de biomoléculas. 86,87
De acordo com o exposto, pode-se mencionar a elevada eficiência de monocamadas
auto-organizadas (SAMs, do inglês Self-Assembled Monolayers) de alcanotióis e de
dendrímeros e dendrons combinados ou não com as SAMs para etapa de funcionalização de
superfícies metálicas. Essas moléculas têm permitido a formação de filmes estáveis com
elevada eficiência e menor susceptibilidade às variações de pH, força iônica, temperatura e
solvente. 24
3.3.1. Monocamadas auto-organizadas – SAMS
O emprego de SAMs formadas pela adsorção de tióis consiste em um dos métodos
mais convenientes, flexíveis e simples, o qual se adequa às propriedades interfaciais de metais,
óxidos e semicondutores. Além disso, características como elevada estabilidade, estrutura de
superfície uniforme e relativa facilidade de variar os grupos funcionais terminais da SAM,
permite com que esses organizados moleculares controlem a acessibilidade, bem como, a
orientação de biomoléculas ligadas. Tais características possibilitam em um excelente controle
a nível molecular. 23
Esse tipo de modificação emprega camadas orgânicas monomoleculares que
exibem alta organização e elevada cobertura de superfície (Figura 10). Podem ser facilmente
obtidas à temperatura ambiente através da simples imersão do substrato em uma solução diluída
contendo os adsorbatos orgânicos por um período de tempo específico. Adicionalmente e não
menos importante, a investigação dos processos de formação de SAMs de alcanotióis sobre
superfície de ouro foi extensivamente estudada pelo nosso grupo, fator fundamental no que diz
respeito ao entendimento a nível de organização dessas nanoestruturas. 22 Neste sentido, através
de estudos obtidos para um alcanotiol de cadeia carbônica grande, o ácido 11-
mercaptoundecanóico (11-MUA, mercaptundecanoic acid), o mecanismo envolvido durante a
47
formação da SAM desse alcanotiol sobre superfície de ouro foi investigado e o seguinte modelo
de reação foi proposto 88,89:
sendo 𝐴𝑢 a superfície do metal (sítio de adsorção); 𝑅𝑆𝐻 o alcanotiol; 𝐴𝑢 − 𝑅𝑆𝐻 a
monocamada desorganizada; 𝐴𝑢 − 𝑅𝑆𝐻* a monocamada organizada; e 𝑘𝑎, 𝑘𝑑 e 𝑘𝑡 referem-se
às constantes de associação, dissociação e de rearranjo molecular, respectivamente.
Foi demonstrado através do modelo proposto que a reação do tiol 11-MUA sobre superfície de
ouro envolve duas etapas: (i) a primeira consistindo na etapa rápida, na qual uma cobertura de
superfície elevada é alcançada em segundos a poucos minutos, levando à formação de uma
monocamada ainda desorganizada (equação 6); (ii) seguida por uma segunda etapa lenta (ordem
de horas: 18 a 24h) envolvendo o rearranjo (organização) desse alcanotiol sobre superfície de
ouro, o que leva à formação de uma monocamada altamente organizada (equação 7, Figura 10).
Apesar de controvérsias ainda existirem na literatura especializada sobre a dinâmica
do processo de formação e as características estruturais da SAM de alcanotióis sobre superfície
de ouro, já é claro que o processo ocorre principalmente devido à elevada afinidade de ligação
entre enxofre e ouro, apresentando magnitude maior que 41,8 kJ mol-1. Tal fato, provavelmente
explica a elevada rapidez da primeira etapa de reação apresentada no modelo de reação
proposto. Adicionalmente, também é sabido que as energias envolvidas das interações entre as
moléculas de alcanotióis são consideradas menores que 41,8 kJ mol-1, e que o conjunto destas
interações confere à monocamada uma estabilidade bem mais elevada que unidades
individualmente adsorvidas. 22 Estas informações também vão de encontro ao modelo proposto,
sugerindo que um maior tempo se torna necessário para estabelecimento das interações entre
as moléculas do 11-MUA e formação de uma monocamada altamente organizada.
Atualmente, o uso de SAMs para funcionalização de superfícies metálicas consiste
em um campo de investigação bem estabelecido, no qual aspectos práticos e fundamentais
𝐴𝑢 + 𝑅𝑆𝐻 𝐴𝑢 − 𝑅𝑆𝐻
𝑘𝑎
𝑘𝑑
𝐴𝑢 − 𝑅𝑆𝐻 𝐴𝑢 − 𝑅𝑆𝐻 * 𝑘𝑡
(6)
(7)
Figura 10. SAM do 11-MUA no seu estado
final organizada (Au-RSH*).
48
acerca desses organizados moleculares podem ser encontrados em inúmeros artigos de revisão
e capítulos de livros. Importante mencionar que as SAMs formadas pela adsorção de grupos
tióis sobre superfície de ouro apresenta-se como um dos principais métodos empregados na
construção de biossensores de SPR e QCM. 90-92
3.3.2. Dendrímeros e dendrons
Com o propósito de buscar amplificação da interface transdutora para
desenvolvimento de biossensores com sensibilidades e seletividades cada vez mais elevadas,
observa-se na literatura que uma grande motivação está relacionada à construção de plataformas
3D através do uso de sistemas multivalentes, tais como os dendrímeros e dendrons combinados
ou não com as SAMs, para imobilização de biomoléculas. 21,93,94
Dendrímeros e dendrons são macromoléculas monodispersas que possuem uma
arquitetura tridimensional altamente ramificada e são muito bem definidos em termos de
tamanho e número de grupos terminais (Figura 11). 25 Atualmente, esses sistemas estão sendo
explorados com significativo sucesso em uma diversidade de aplicações. 95
Figura 11. Representação estrutural de dendrímero (A) e dendron (B).
Devido às características inerentes desses sistemas supramoleculares, tais como
geometria globular, homogeneidade estrutural, tamanho controlado, elevada funcionalidade de
superfície, hidrofilicidade, versatilidade e alta estabilidade mecânica e química, dendrímeros e
dendrons apresentam-se como plataformas ideais para a etapa de biofuncionalização no
desenvolvimento de biossensores. 94,96 Especificamente, suas arquiteturas tridimensionais
nanométricas têm proporcionado melhor controle sobre a espessura da matriz do sensor e o
espaçamento entre as moléculas de reconhecimento imobilizadas, preservando assim a
49
funcionalidade dos grupos ligantes imobilizados e reduzindo as ligações não específicas. Estas
características têm levado diversos grupos de pesquisa a reportarem melhorias no desempenho
analítico de biossensores construídos a base de dendrímeros e dendrons. 97
Estruturalmente, um dendrímero é tipicamente simétrico em torno de um núcleo,
apresentando uma morfologia tridimensional globular (Figura 11A). Por sua vez, o dendron
possui estrutura do tipo abx, em que a é igual ao ponto focal e x é igual ao número de grupos
funcionais terminais b (Figura 11B). 25 São moléculas sintetizadas através de sequências
iterativas de etapas de reação, em que cada iteração adicional conduz a uma geração mais
elevada, formando estruturas robustas que possuem alta densidade de grupos terminais (-NH2,
-COOH, -OH, -CHO, etc.), garantindo elevada exposição desses grupos. 98-101
A elevada versatilidade da química destas moléculas possibilitou na síntese de
estruturas ordenadas através de diferentes gerações, as quais não somente proveem diferentes
tamanhos de nanopartículas, mas também define os grupos terminais, morfologia, estabilidade,
solubilidade, rigidez/flexibilidade e a viscosidade destes sistemas. Dentre a diversidade de
moléculas sintetizadas, destaca-se a extensa e bem estabelecida família de dendrímeros
derivados de poliamidoamina (PAMAM) (Figura 12). 102 Esta classe foi desenvolvida
primeiramente por Tomalia e co-autores, 98 sendo sintetizada através de uma sequência de
adição de metil-acrilato (adição de Michael) sobre um núcleo diamino, seguido por amidação
com etilenodiamino (Figura 12). Atualmente, dendrímeros PAMAM são comercialmente
disponíveis, fator de suma importância para disseminação dessas moléculas em estudos
envolvendo biossensores, o que, consequentemente, culminou em um melhor entendimento em
relação a essas nanoestruturas. 103
Interessantemente, conforme discutido anteriormente, a sensibilidade de
biossensores baseados em SPR e QCM é fortemente influenciada pela distância entre o
substrato sólido e o elemento de reconhecimento, devendo as interações biomoleculares,
satisfatoriamente, ocorrerem nas proximidades da superfície do transdutor. Contudo, a ligação
de biomoléculas muito próximas ao substrato sólido leva ao impedimento estérico e perda de
funcionalidade devido ao menor caráter hidrofílico da superfície não modificada. 20 Dessa
forma, uma camada intermediária torna-se necessária para atuar como espaçador entre o
bioreceptor e o substrato sólido. De acordo com a literatura, 20 a espessura da camada de
dendrímero PAMAM (geração 3, por exemplo) sobre a matriz do sensor é cerca de 2-3 nm, o
50
que provavelmente apresenta grandes benefícios para o uso desses sistemas multivalentes em
biossensores de SPR e QCM.
Figura 12. Estrutura química de um dendrímero PAMAM de geração 3 (G3) com núcleo
diamino e 32 grupos amino-terminais. Cada parte da molécula representada por uma cor é
referente a cada geração: zero (G0), um (G1), dois (G2) e três (G3).
Adicionalmente, devido à estrutura de química sintética única e das propriedades
variadas discutidas anteriormente, o uso de dendrímeros e dendrons é extremamente passível
de combinação com as SAMs de tióis. Uma matriz biofuncionalizada típica pode ser constituída
por uma camada de uma SAM de alcanotiol sobre uma superfície de ouro, seguida por uma
camada intermediária de dendrímero (PAMAM, por exemplo) e, por fim, uma camada da
biomolécula de reconhecimento. Por exemplo, uma abordagem particularmente simples e de
custo reduzido para formação de filmes do tipo layer-by-layer sobre superfície de ouro envolve
o uso da cisteamina (alcanotiol de cadeia curta) para formação da SAM, seguida pela ligação
covalente de dendrímeros (PAMAM, por exemplo) às aminas livres via agentes de
acoplamento, tais como glutaraldeído (GLU) ou uma molécula do tipo diéster - BS3 (bis
(sulfosuccinimidyl) suberate). 104
G0
G1
G2
G3
51
Sumariamente, dendrímeros e dendrons têm aberto espaço para o desenvolvimento
de uma promissora área de pesquisa científica fundamentada nas propriedades desses
compostos. 105,106 Apresentam-se como propostas interessantes no desenvolvimento de
biossensores baseados em SPR e QCM, uma vez que estes sistemas supramoleculares excluem
a necessidade do uso de matrizes complexas como suporte para imobilização de biomoléculas.
A discussão realizada até o corrente momento teve como propósito demonstrar
frente a literatura especializada a viabilidade das técnicas de SPR e QCM e das metodologias
discutidas para construção de biossensores. A seguir, tendo como critério de escolha o seu
impacto no Brasil e em diversas partes no mundo, uma atenção será voltada à Leishmaniose
Visceral. Será enfatizada a importância em se investigar os eventos moleculares envolvidos
nessa parasitose, bem como, a necessidade do desenvolvimento de metodologias mais eficazes
para seu diagnóstico.
3.4. LEISHMANIOSE VISCERAL
As leishmanioses, conforme descrito originalmente por Ross em 1903, são doenças
infecciosas causadas por parasitas protozoários do gênero Leishmania. 1,107 A Organização
Mundial da Saúde refere-se à leishmaniose como uma das principais parasitoses, em que cerca
de 2 milhões de pessoas são infectadas anualmente em aproximadamente 98 países diferentes.
Portanto, trata-se de um grave problema de saúde pública.
De acordo com as espécies de Leishmania e a resposta humoral desenvolvida pelo
indivíduo infectado, existem algumas manifestações clínicas da doença que podem levar a
complicações cutâneas, mucosas ou viscerais. Levando-se em consideração estas
manifestações, as leishmanioses são basicamente divididas em leishmaniose tegumentar (LT),
leishmaniose mucocutânea (LMC) e leishmaniose visceral (LV). 4 Entre estas, a LV (conhecida
como "calazar") é a forma mais grave, em que parasitas de Leishmania deixam o local de
inoculação e proliferam no fígado, baço e medula óssea, resultando em imunossupressão do
hospedeiro. Esta capacidade de penetração do parasita em órgãos vitais do sistema fisiológico
humano resulta em elevado índice de mortalidade em indivíduos infectados que não tem acesso
a tratamento adequado. 5,6
Os sintomas típicos da LV são: febre, perda de peso, esplenomegalia,
hepatomegalia, linfadenopatia e anemia. 108,109 O agente etiológico mais encontrado nas
Américas e no norte da África é a espécie Leishmania infantum, também conhecida como
52
Leishmania chagasi. Já em áreas do subcontinente indiano e leste da África a espécie
Leishmania donovani é responsável pela infecção da LV. 8,110 Embora mais de 90% das
infecções da LV estejam concentradas na Índia, Brasil, Bangladesh, Nepal e Sudão, estudos
mostram um aumento de casos de LV em todo o mundo, sendo esperado em um futuro próximo
que mudanças climáticas venham a causar impacto significativo na Europa. 111
Nas Américas, a via de transmissão mais frequente de antígenos de L. infantum
ocorre através da picada de flebotomíneos do sexo feminino (gênero Lutzomyia), sendo a LV
considerada uma zoonose em que o cão e/ou outros canídeos tem o papel de hospedeiro do
parasita. 8,9 Importante mencionar que menos de 50% dos cães infectados apresentam evolução
crônica dos sinais clínicos víscero-cutâneos, mas tanto os animais sintomáticos como
assintomáticos são infecciosos para o mosquito vetor. 112 Neste sentido, testes de diagnósticos
confiáveis para a leishmaniose visceral canina (LVC) são essenciais para programas de
vigilância da LV e para evitar o abate desnecessário de cães. 2,10
O diagnóstico da LV é executado principalmente através de métodos sorológicos
em análises de rotinas clínicas, uma vez que a resposta humoral em LV é geralmente muito
intensa com elevados níveis de imunoglobulinas específicas, além de evitarem a utilização de
procedimentos invasivos. 11 Os testes sorológicos mais empregados são o ensaio
imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA) e o teste de anticorpo de imunofluorescência
indireta (IFAT, indirect immunofluorescence antibody test).113 Entretanto, estes testes ainda
apresentam limitações, tais como baixa sensibilidade para detecção de casos assintomáticos e a
existência de reações cruzadas com outras doenças. 12 Neste contexto, observa-se um grande
incentivo da pesquisa científica voltada à busca de novas metodologias para diagnóstico
sorológico da LV.
Um dos fatores que contribui significativamente para as limitações dos ensaios
convencionais é a forma antigênica utilizada, dado que antígenos brutos ou os seus extratos
solúveis ainda são utilizados nesses imunodiagnósticos. 13 Trabalhos recentes evidenciam que
a utilização de peptídeos sintéticos ou antígenos recombinantes ao invés do uso de antígenos
brutos, melhora a especificidade dos testes de diagnóstico da LV, diminuindo
significativamente o número de reações cruzadas com outras doenças. 114-117 No entanto, apesar
do progresso alcançado nestes últimos anos, o diagnóstico eficaz (100%) da LV ainda é um
desafio. 117. Portanto, a produção de novos antígenos de L. infantum, tais como proteínas
recombinantes com elevados potenciais antigênicos, apresenta-se como uma área bastante
53
promissora, com destaque à tecnologia do DNA recombinante para produção dessas
recombinantes. 115,118,119
3.4.1. Proteínas Recombinantes
Por definição, proteínas recombinantes são aquelas produzidas a partir da expressão
em bactérias ou em outros organismos utilizando a tecnologia do DNA recombinante.
Geralmente, o sistema de expressão em Escherichia coli é o mais empregado. 120 A Figura 13
é uma representação esquemática das etapas envolvidas na tecnologia do DNA recombinante
para produção de proteínas. Tipicamente, os seguintes passos são realizados: (I) extração do
DNA e amplificação pela PCR (Polymerase Chain Reaction) dos fragmentos que contém o
gene de interesse; (II) uso de enzimas de restrição (endonucleases) para obter o gene que
codifica a proteína de interesse; (III) utilização das mesmas endonucleases para clivar o
plasmídeo (vetor) bacteriano; (IV) ligação do gene de interesse ao plasmídeo pela enzima DNA
ligase, produzindo o DNA recombinante; (V) introdução do DNA recombinante em bactéria
(E. coli., por exemplo); e (VI) inserção da bactéria em meio de cultura apropriado.
Figura 13. Desenho esquemático ilustrando as etapas envolvidas na tecnologia do DNA
recombinante para síntese de proteínas: (I) extração do DNA e amplificação pela PCR; (II)
obtenção do gene de interesse após clivagem pelas enzimas de restrição; (III) clivagem do
plasmídeo bacteriano pelas mesmas endonucleases; (IV) uso da DNA ligase para síntese do
DNA recombinante; (V) introdução do DNA recombinante na bactéria; (VI) inserção da
bactéria em meio de cultura.
54
Após muitas gerações de bactérias, as proteínas recombinantes (produto da expressão dos
genes) são purificadas.
Nos últimos anos, observou-se um avanço significativo em relação ao domínio de
produção de proteínas através dessa tecnologia, sendo atualmente um método bem estabelecido
e amplamente difundido. Isto tornou possível o emprego de proteínas recombinantes de
diferentes sensibilidades e especificidades no imunodiagnóstico da LV. 117 Os antígenos de
natureza proteica originários do parasita Leishmania apresentam diferentes funções no
protozoário, fator que culminou na divisão das seguintes classes: (1) proteínas relacionadas à
cinesina, destacando a rK39 e a rK26; 121,122 (2) proteínas do choque térmico, por exemplo
rHSP70; 123 (3) enzimas, com ênfase à rLACK; 124 e (4) proteínas com função ainda
desconhecidas no protozoário, com destaque à rA2. 125
Entre estas classes, os genes de proteínas hipotéticas (proteínas de função
desconhecida) são alvos bastante interessantes para pesquisa, não somente pelo fato da
inexistência de dados a respeito dessas proteínas, mas também pela identificação de elevada
expressão e reprodutibilidade dessas proteínas, antes consideradas “hipotéticas”, nas formas
evolutivas (amastigotas e promastigotas) de L. infantum. 126,127
Outra abordagem particularmente interessante que vem sendo utilizada para
produção de antígenos e sua avaliação no diagnóstico da LV e de outras patologias está
relacionada à produção de proteínas recombinantes do tipo quimérica. Proteínas quiméricas
consistem na união de diferentes fragmentos peptídicos, originando uma proteína
artificialmente construída que pode apresentar vários epitopos em sua estrutura. Dessa forma,
as quimeras são capazes de expressar diferentes determinantes antigênicos, fator que tem sido
proposto por melhorar a sensibilidade de testes diagnósticos. 128
De acordo com a discussão apresentada, fica evidente que alternativas recentemente
utilizadas no intuito de buscar melhorias no imunodiagnóstico da LV estão voltadas para o
desenvolvimento de novas metodologias para detecção da doença, assim como, para a
investigação de novas proteínas recombinantes a serem empregadas nos imunoensaios.
Neste contexto, através de um levantamento realizado sobre os trabalhos publicados
que reportam a construção de biossensores que tem como incentivo a LV, observa-se que é uma
área ainda pouco explorada, mas que vem apresentando enorme perspectiva de crescimento.
129-135
55
Importante salientar que, de acordo com nosso conhecimento, o primeiro estudo
envolvendo um biossensor de SPR para detecção de anticorpos da LV foi reportado pelo nosso
grupo. 89 Desde então, essa linha de pesquisa tem se tornado uma peça chave em nossos estudos,
visando contribuir significativamente em diversos aspectos relacionados a LV.
56
Uso de SAM para imobilização
de uma proteína quimérica
recombinante
57
4. USANDO QCM E SPR PARA AVALIAÇÃO CINÉTICA DA LIGAÇÃO
ENTRE UMA NOVA PROTEÍNA QUIMÉRICA RECOMBINANTE E
ANTICORPOS DA LV136
4.1. MOTIVAÇÃO PARA REALIZAÇÃO DESTE ESTUDO
Uma das alternativas recentemente empregadas por diferentes grupos de pesquisa
como metodologia de produção de antígenos a serem testados em imunodiagnósticos consiste
na união de diferentes fragmentos peptídicos, dando origem a uma proteína artificialmente
construída (proteína quimérica). Este tipo de proteína é capaz de expressar diferentes
determinantes antigênicos, podendo resultar no aumento da sensibilidade em testes
diagnósticos.
Diante essa temática, em estudo realizado pelos nossos colaboradores, dez
peptídeos provenientes de nove diferentes proteínas de L. infantum se mostraram promissores
antígenos a serem empregados no diagnóstico sorológico da LVC. 137 Então, esses peptídeos
foram reunidos em um mesmo gene artificial para produção de uma nova proteína quimérica
recombinante (CP10, do inglês chimeric protein). Entre os resultados obtidos com esta proteína
em imunoensaios, foi verificada a capacidade da CP10 para identificar cães assintomáticos
(cerca de 80%), o que é muito expressivo devido à dificuldade em detecção desses casos por
antígenos já bem documentados na literatura. 128
A partir dos resultados obtidos pelos nossos colaboradores, tornou-se notória a
importância de uma avaliação quantitativa do caráter imunogênico (antigênico) da CP10, a fim
de demonstrar o quão forte é a interação entre essa nova proteína e anticorpos específicos da
LV. Além disso, conforme já discutido na introdução, é fundamentalmente importante a
realização de uma pesquisa científica voltada à busca de novas metodologias para diagnóstico
da LV.
Neste contexto, no estudo discutido a seguir, imunossensores de SPR e QCM foram
desenvolvidos para detecção de anticorpos anti-L. infantum. Através dos resultados alcançados,
foi possível avaliar cineticamente a afinidade da ligação entre a CP10 e suas IgGs
(imunoglobulinas G) específicas, contribuindo para uma melhor compreensão acerca da
interação entre essas biomoléculas. Tal abordagem permitiu inferir de forma quantitativa a
viabilidade de aplicação dessa nova proteína quimérica (CP10) em imunodiagnósticos da LV.
58
4.2. EXPERIMENTAL
4.2.1. Reagentes e soluções
Ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA, do inglês mercaptoundecanoic acid);
hidrocloreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC), N-hidroxissuccinimida
(NHS), 4 - (2 - hidroxietil) piperazina-1-etanossulfônico (Hepes), ferricianeto de potássio (III),
ferrocianeto de potássio (II), tween 20 (surfactante P20) e etanolamina (EA) foram adquiridos
da Sigma Aldrich Chemical (St. Louis, MO, EUA). Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA),
cloreto de potássio (KCl), hidróxido de potássio (KOH), etanol (EtOH, 99%) e fosfato de sódio
monobásico foram obtidos da LabSynth LTDA (SP, Brasil). Cloreto de sódio (NaCl) foi
comprado de JT Baker Chemicals® (Xalostoc, México).
A solução etanólica de 11-MUA e as soluções aquosas de EA e da mistura
EDC/NHS foram preparadas previamente às suas utilizações. A solução tampão HBS-EP em
pH 7,4, foi utilizada para dissolução das amostras biológicas e como tampão de corrida nas
análises de SPR, QCM e eletroquímicas. Esta solução foi produzida pela mistura de 10,0 mmol
L-1 de Hepes (pH 7,4), 150,0 mmol L-1 de NaCl, 3,0 mmol L-1 de EDTA (pH 8,0) e 0,005 % do
surfactante P20. Água deionizada foi utilizada para a preparação das soluções após sua
purificação em um sistema Milli- Q.
4.2.2. Instrumentação
As medidas eletroquímicas foram realizadas utilizando um Autolab PGSTAT 128N
potenciostato/galvanostato (Eco Chemie BV, Holanda) acoplado a um microcomputador PC
com o software NOVA 1.10. Para estas medidas, foram utilizados uma célula eletroquímica
com volume de 10 mL, um eletrodo de Ag/AgCl (KCl 3,0 mols L-1) como eletrodo de
referência, um fio de platina como eletrodo auxiliar e um filme de ouro (área de 0,0314 cm2)
como eletrodo de trabalho. Em relação às medidas de espectroscopia de impedância
eletroquímica (EIS, do inglês electrochemical impedance spectroscopy), uma modulação
potencial sinusoidal de 10 mV de amplitude foi sobreposta a um potencial de circuito aberto e
o ângulo de amplitude e fase da corrente resultante foram registrados em frequências que variam
de 100 kHz a 0,1 Hz. Todas as análises eletroquímicas foram realizadas à temperatura ambiente.
As técnicas de SPR e QCM foram utilizadas para avaliar em tempo real as etapas
de imobilização da CP10 e de sua interação com os anticorpos específicos da LV.
59
As medidas de SPR foram realizadas em um equipamento Autolab Spirit (Eco
Chemie BV, Ultrech, Holanda). Seu sistema óptico consiste de um prisma de vidro, um disco
de vidro recoberto com uma fina camada de ouro (50 nm de espessura) e um laser diodo com
um comprimento de onda fixo de 670 nm. Este equipamento está equipado com uma cubeta e
seu modo de operação é baseado na configuração de Kretschm. 43
Para as medidas de QCM, foi utilizado um cristal polido de corte-AT 6 MHz
contendo uma subcamada de adesão de 10 nm de TiO2 e um depósito de 100 nm de Au
(Metrohm-Autolab, Utrecht, Holanda). O cristal foi inserido em uma célula de polipropileno
apropriada com um volume máximo de 3 mL e fixado com o auxílio de dois anéis de vedação.
Ambas as faces do cristal (área de 0,361 cm2) foram utilizadas.
Tipicamente, os experimentos de SPR e QCM foram realizados à temperatura
constante (23 ± 1°C) em solução tampão HBS-EP (pH 7,4). E para avaliar cineticamente a
interação entre as biomoléculas através dos resultados obtidos por SPR e QCM, o software
Trace Drawer, versão 1.5 (Oy BioNavis Ltd., Tampere, Finlândia) foi utilizado.
Para a determinação simultânea da espessura (d) e índice de refração (n) da CP10
imobilizada sobre a SAM/Au, outro equipamento de SPR (MP-SPR, do inglês multiparametric
surface plasmon resonance) foi empregado (Oy BioNavis Ltd., Tampere, Finlândia). Uma
fotografia do equipamento MP-SPR pode ser visualizada abaixo (Figura 14).
Figura 14. (A) Fotografia do MP-SPR; (B) Substrato utilizado nas análises (filme de Au); (C)
Inserção do substrato no equipamento.
Este instrumento possui dois canais, cada um contendo um par de lasers com comprimentos de
onda fixos em 670 e 785 nm. Um software específico (Winspall, versão 3.02) foi utilizado para
60
modelar as curvas de refletância de SPR em ambos os comprimentos de onda para a
determinação dos parâmetros n e d da CP10 sobre a SAM/Au. O princípio de transdução da
MP-SPR também é baseado na configuração de Kretschm. 43
4.2.3. Proteína quimérica recombinante - CP10
A proteína CP10 (MM = 21,41 kDa) foi sintetizada por Faria et al (2015) 128 através
da tecnologia do DNA recombinante, conforme sumarizado a seguir. Um DNA sintético foi
construído pela reunião de 10 sequências de codificação de peptídeos antigênicos. Para a
construção, ligantes flexíveis (Gly-Ser-Gly-Ser-Gly) foram utilizados como espaçadores entre
os epítopos 138 e sítios de restrição para Ndel e Notl foram adicionados, respectivamente, às
extremidades 5' e 3' do gene artificial para auxiliar na clonagem. Além disso, uma sequência de
codificação 6x His tag foi adicionada anteriormente ao códon de parada para posterior
purificação por afinidade da proteína recombinante. O DNA sintético que codifica a CP10
consiste em 578 pares de bases e foi sintetizado comercialmente por Genscript, EUA. O
desenho do gene sintético da CP10 pode ser visualizado na Tabela 1.
Tabela 1. Desenho do gene sintético da CP10
Sequência de Nucleotídeos:
CATATGCAACGGGAGCTGAAAATGGTCGTGGCGCAGAGCGGTAGCGGCAGTGG
TTCGCAGCAGCTGCTGGGGCAGCGGCTGTACGGACTGTGGAAAGGCTCTGGTA
GTGGCTTCCGTGCGATCAGCACGCCACGCACTGGCACCATGCCCGGTAGCGGC
AGTGGTAACGGCGACCGCTACGACGGCGAGTGGAAAGATGATAAACGTGGCTC
AGGTAGCGGCTCGAAACGCTACGCCAAGGCCATGGCCAAAATGGGCCTGAAAG
GTTCAGGCTCTGGTAACAACATCAAATCCTCCATCTGCGATATCCCGCCGAAAG
GCGGTAGCGGCAGTGGTTGGAACAACAACATCTTCTACGATGGCCCGGTCGGT
GCCTTCGGTTCAGGCTCTGGTTTCACGAATCGTCGCTGCGACTCGAACGCGACG
AATGCGCGGGGCTCTGGTAGTGGCCGCAAAAACATCGTGAAAAAATGCCTGGA
AATGTTCGACGAGGGTAGCGGCAGTGGTAAAGACGTGACGAAAGAGGAGTACG
CGGCCTTCTACAAAGCCCATCATCATCATCATCATTAAGCGGCCGC
CATATG → sítio de restrição de NdeI e códon de início
CAACGG... → peptídeos
GGTAGC... → ligantes flexíveis
CATCAT... → cauda de histidina
TAA: → códon de parada
GCGGCCGC → sítio de restrição NotI
61
Sequência de Aminoácidos:
MWQRELKMVVAQSGSGSGSQQLLGQRLYGLWKGSGSGFRAISTPRTGTMPGSGS
GNGDRYDGEWKDDKRGSGSGSKRYAKAMAKMGLKGSGSGNNIKSSICDIPPKGGS
GSGWNNNIFYDGPVGAFGSGSGFTNRRCDSNATNARGSGSGRKNIVKKCLEMFDEG
SGSGKDVTKEEYAAFYKAHHHHHH
O gene quimérico obtido comercialmente foi produzido no plasmídeo PUC57 com
gene de resistência à ampicilina. Posteriormente, esse DNA artificial foi clonado nos sítios de
restrição Ndel e Notl de um vetor de expressão pET9a24a, resultando em pET-CP10. Então, um
plasmídeo recombinante foi utilizado para transformar uma cepa de E. coli C41 e a expressão
da proteína foi realizada através da inoculação (12 horas) de 500 mL de meio Luria Bertani
contendo 0,05 mg mL-1 de canamicina. Esta suspensão foi incubada em um agitador rotativo
(200 rpm) a 37° C. Quando a cultura atingiu uma absorbância de 0,6 a 600 nm, a mesma foi
induzida com 0,5 mmol L-1 de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo). A expressão foi
realizada durante 4 h a 37° C, e, então, as células foram lisadas por cinco passagens através de
um homogeneizador (EmulsiFlexTM C3, Avestin). Em seguida, as proteínas recombinantes
foram purificadas utilizando uma coluna HIS-Trap HP 5,0 mL (GE Healthcare Life Sciences)
ligados a um sistema de cromatografia ÄKTA Prime (GE Healthcare Life Sciences).
Alíquotas da proteína purificada (10 mg) foram aplicadas sobre um gel de
poliacrilamida (12%), o qual foi transferido para uma membrana de nitrocelulose (Amersham
Hybond ™, 0,2 um - GE Healthcare Life Sciences) a 30 V durante 50 min. Após, foi realizado
um western blotting empregando o quite Western Breeze™ Chromogenic Western Blot
Immunodetection kit (Life™). Então, as proteínas purificadas por cromatografia de afinidade
foram recolhidas em tampão de eluição (0,5 mol L-1 de NaCl, 0,5 mol L-1 de imidazol, 8 mol L-
1 de ureia e 1,0 mmol L-1 de β-mercaptoetanol). Em seguida, a amostra foi inserida em uma
membrana de diálise com poros de 12400 Da (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). No
primeiro dia, as membranas foram colocadas em água Milli-Q, realizando a troca de água após
4 h. Posteriormente, a água foi substituída por tampão PBS (phosphate buffer saline) 0,15 mol
L-1 em pH 7,4 (0,2 g de KH2PO4, 5,0 g de Na2HPO4, 4,2 g de NaCl, qsp 500 mL de H2O), que
foi deixado 16-18 h em contato com a membrana. No segundo dia, o tampão PBS foi substituído
e deixado em contato com a membrana durante 8 h. As amostras foram então liofilizadas em
unidade Liotop, modelo K105, durante 24 h. Por fim, alíquotas com diferentes quantidades de
CP10 foram dissolvidas em solução tampão HBS-EP em pH 7,4 e congeladas a -80ºC até à sua
utilização.
62
Todos os procedimentos descritos anteriormente foram realizados em conformidade com o
Comitê de Ética no Uso de Animais (Comitê de Ética no Uso de Animais / Universidade Federal
de Minas Gerais - UFMG), tendo obtido aprovação sob o protocolo número 161/2013 (ANEXO
I).
4.2.4. Produção de anticorpos específicos para a CP10
Soros de coelhos foram imunizados com a proteína CP10, conforme demonstrado
no trabalho de Faria et al. (2015). 128 Tais amostras foram gentilmente cedidas pelo Laboratório
de Leishmanioses coordenado pela Profa. Dra. Hélida Monteiro de Andrade do Instituto de
Ciências Básicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Um breve resumo do
procedimento adotado por nossos colaboradores é comentado a seguir. Os soros de coelhos
foram obtidos pela inoculação de 200 µg da CP10 em um coelho adulto do sexo masculino, da
raça Nova Zelândia. Anteriormente à primeira inoculação, uma amostra de sangue foi tomada
como controle pré-imune a partir da orelha do animal por punção venosa, estando esses
procedimentos em conformidade com o Comitê de Ética no Uso de Animais (ANEXO I).
Após a primeira imunização, as imunizações consecutivas foram realizadas em
intervalos de 15 dias (total de cinco imunizações). Uma semana após a última imunização, o
sangramento dos animais por punção cardíaca foi realizado, sendo recolhidos 60 mL de sangue
do animal. 139 Após imunização, as amostras foram centrifugadas e os soros obtidos foram
purificados por cromatografia de afinidade em relação às proteínas G e A. Seguidamente,
ensaios de ELISA foram realizados utilizando a CP10 para a determinação da concentração
molar de IgGs para CP10, obtendo-se uma concentração purificada de 1,3 mg mL-1 (8,90 μmol
L-1; IgG = 146 kDa). Por fim, as amostras contendo diferentes concentrações de
imunoglobulinas anti-CP10 foram obtidas por dissolução desses anticorpos em solução tampão
HBS-EP (pH 7,4).
4.2.5. Construção dos imunossensores
Anteriormente à etapa de funcionalização da superfície metálica durante a fase
inicial de construção dos sensores, a limpeza da superfície de ouro dos substratos utilizados nas
análises de SPR, QCM e eletroquímicas é fundamentalmente importante. Este processo foi
realizado em solução piranha (mistura 1:3 H2O2 (30%) e H2SO4 concentrado) durante cerca de
3-5 minutos, seguido pela imersão de cada substrato em acetona (5 minutos) e, então, em álcool
isopropílico (5 minutos). Posteriormente, os substratos foram lavados várias vezes com água
63
deionizada e secados sob fluxo de N2(g) puro. A eficiência do processo de limpeza foi avaliada
através de voltamogramas cíclicos (VCs) em solução de H2SO4 0,5 mol L-1, velocidade de
varredura, v, de 50 mV s-1 no intervalo de potencial, ΔE, de -0,1 a 1,5 V vs Ag/AgCl. Neste
processo, correntes de pico anódica (Ia) e catódica (Ic) são observadas em aproximadamente
1,27 e 0,90V, potenciais característicos da oxidação do ouro a óxidos de ouro e redução dos
óxidos a ouro elementar, respectivamente. Este procedimento visa à renovação da superfície
metálica.
Após processo de limpeza da superfície metálica, as etapas subsequentes
relacionadas à construção e avaliação dos imunossensores podem ser visualizadas no esquema
abaixo (Figura 15):
Figura 15. Etapas envolvidas na construção e avaliação dos imunossensores: (I) formação da
SAM pela adsorção de 11-MUA sobre superfície do ouro; (II) imobilização da CP10 sobre a
SAM previamente ativada; (III) adição de etanolamina para bloqueio dos grupos reativos
remanescentes; (IV) interação das IgGs anti-CP10 com a CP10.
Etapa I - Formação da SAM sobre superfície do ouro. Imediatamente após limpeza da
superfície de ouro, uma SAM foi formada através da imersão de cada substrato em solução
etanólica do 11-MUA (1,0 mmol L-1) durante 24 horas (Figura 15). Em seguida, a SAM/Au
formada foi lavada algumas vezes com etanol e secada por um fluxo de N2(g) puro. Então, os
grupos carboxílicos terminais da SAM foram ativados pela adição de uma solução aquosa
contendo EDC (150 mmol L-1) e NHS (100 mmol L-1) durante aproximadamente 10 minutos
para a formação de grupos NHS-ésteres reativos. Por fim, os substratos foram lavados com
água deionizada e secados sob fluxo de N2(g) puro. 89
64
Etapa II - Imobilização da CP10 sobre SAM. Para construção dos imunossensores de SPR,
QCM e eletroquímico, a proteína quimérica recombinante foi adicionada sobre a SAM/Au
previamente ativada (Figura 15). Visando otimizar o tempo de ligação e a concentração da
CP10 durante esta etapa de imobilização, a técnica de SPR foi utilizada. Neste estágio,
diferentes concentrações da CP10 (1,00, 2,32, 4,64, 23,2, 46,4, 116, 233, 350, 467, 934 e 1000
nmol L-1) dissolvidas em solução tampão HBS-EP (pH 7,4) foram avaliadas. Em seguida, as
condições otimizadas via SPR foram adotadas para construção dos imunossensores de EIS e
QCM.
Etapa III - Bloqueio dos grupos reativos inespecíficos. Após caracterização da ligação da CP10
sobre SAM/Au, os grupos ésteres reativos não ligados foram desativados por um breve fluxo
de 1,0 mol L-1 de uma solução aquosa de etanolamina (EA) em pH 8,5, durante
aproximadamente 5 min (Figura 15). A finalidade desta etapa é evitar ou minimizar ligações
não específicas. Em seguida, o excesso de moléculas de EA foi removido por sucessivas adições
de água, e, então, os imunossensores de SPR, QCM e EIS foram secados sob fluxo de N2(g).
4.2.6. Caracterização e avaliação cinética da interação CP10 - anti-CP10
Em um primeiro momento, a espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) foi
utilizada para caracterizar a interação entre a CP10 e os anticorpos anti-CP10. Para estas
medidas, concentrações equimolares de Fe(CN)64-/Fe(CN)6
3- (1,0 mmol L-1) em KCl 0,1 mol
L-1 foram utilizadas como sonda redox para examinar sua reatividade sobre eletrodo de ouro
não modificado e modificado com 11-MUA (SAM/Au), CP10/SAM/Au e após interação do
anticorpo sobre o imunossensor (anti-CP10/CP10/SAM/Au).
Posteriormente, a afinidade da ligação entre CP10 e os anticorpos anti-CP10 foi
mensurada via os imunossensores de SPR e QCM. Nesta etapa, diferentes concentrações dos
anticorpos (10,1; 20,2; 40,5; 81,0 e 162 nmol L-1) (Etapa IV, Figura 15) foram adicionadas
sobre os imunossensores de SPR e QCM. Em seguida, os resultados destas análises foram
extraídos para um software de modelagem cinética (TraceDrawer, versão 1.5) e os valores das
constantes cinéticas de associação (ka) e dissociação (kd) foram estimados. Dessa forma,
mediante os valores da constante de dissociação de equilíbrio, KD (kd/ka), encontrados tanto
via SPR quanto por QCM, foi possível avaliar o quão forte é a interação entre CP10 e as IgGs
anti-CP10 (anticorpos anti-L. infantum).
65
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1. Proteína quimérica recombinante (CP10)
Produção
A expressão da proteína codificada pelo gene sintético foi visualizada em gel de
poliacrilamida (12%), no qual foram adicionadas as fracções solúveis e insolúveis, e, então,
recolhidas após indução com IPTG. Observou-se após coloração com Coomassie que a fracção
insolúvel tinha uma banda de 21,4 kDa, a qual está relacionada com a CP10 (Figura 16A). Uma
vez observado que a proteína quimérica permanece na porção insolúvel da cultura bacteriana,
um novo ensaio de expressão empregando grandes quantidades de meio (500 ml) foi conduzido.
Isto foi necessário para obter um volume suficiente de fração insolúvel para prosseguir com a
purificação da proteína por cromatografia de afinidade.
A Figura 16B mostra que o processo de purificação foi realizado de forma eficaz,
sem evidências de outros componentes, como por exemplo, proteínas inespecíficas. Além disso,
por Western Blotting utilizando anticorpo anti-histidina, foi possível confirmar que a banda
observada sobre o gel de poliacrilamida refere-se a CP10 (Figura 16C).
Figura 16. A) Gel de poliacrilamida (12%) (SDS-PAGE) corado com Coomassie. Frações
solúveis (S) e insolúveis (IS) da cultura bacteriana que comprovam a banda relacionada para
a CP10 (21,4 kDa). B) Gel de poliacrilamida (12%) corado com Coomassie, I: pré-purificação
por coluna de afinidade, II-VI: fracções da purificação. C) Membrana de nitrocelulose após
Western blotting usando anti-histidina, VII: pré-purificação por coluna de afinidade, VIII:
fracção da purificação. MW: peso molecular em kDa.
66
Validação da CP10 em imunoensaios
Os estudos evidenciam que a utilização da proteína multiepitopo (CP10) tem um
grande potencial no diagnóstico da LVC. Resultados foram obtidos com a proteína CP10 em
três diferentes testes: 1) DPP® (Plataforma Dual-Path); 2) quite de EIE-LVC (ensaio
imunoenzimático) e 3) ELISA, observando diferenças significativas dos resultados encontrados
entre os testes. Os ensaios foram realizados com soros de cães não infectados (n = 9) e
infectados (n = 43). Enquanto as sensibilidades para os quites de EIE-LVC e DPP® foram
64,5% e 72,9%, respectivamente, no ELISA foi de 88,8%. No entanto, a especificidade obtida
pelo ELISA (80%) foi inferior quando comparada com os outros testes (DPP®: 90% e quite
EIE-LVC: 100%). Em relação à capacidade na detecção de cães infectados assintomáticos, o
quite de EIE-LVC não mostrou qualquer detecção, enquanto no DPP® foram detectados apenas
10% desses casos. Por sua vez, utilizando a CP10 em ensaios de ELISA foi possível detectar
80% dos cães assintomáticos, fator de extrema relevância, tendo em vista à dificuldade na
detecção desses casos.
A validação foi realizada com 231 amostras de soros de cães infectados com L.
infantum e 131 amostras de soros de cães não infectados utilizadas como os controles negativos.
Resultados promissores foram obtidos com ELISA, o que proporcionou uma sensibilidade
global de 80,2% e especificidade de 65,6%. De acordo com Swets, 140 esta proteína (CP10)
permitiu testes com precisão moderada (AUC = 0,82).
4.3.2. Avaliação in situ pela SPR e QCM da imobilização da CP10 sobre a SAM
Após a formação da SAM e a conversão dos seus grupos carboxílicos terminais em
NHS-ésteres reativos, a técnica de SPR foi utilizada para a análise em tempo real da
imobilização de diferentes concentrações da CP10 (1,00 a 1000 nmol L-1) sobre a SAM. Esta
etapa teve como finalidade caracterizar a imobilização da proteína sobre a monocamada, assim
como, otimizar a concentração e o tempo necessário para obter elevada cobertura de superfície
após interação da biomolécula com o filme.
A Figura 17A evidencia as curvas de SPR (sensorgramas) obtidas para a etapa de
imobilização de diferentes concentrações da CP10. Três regiões típicas das curvas para cada
uma das concentrações da proteína podem ser observadas. Primeiro, uma linha de base obtida
a partir da adição da solução tampão HBS-EP, pH 7,4, sobre a SAM previamente ativada.
67
Figura 17. (A) Sensorgramas relacionando as respostas obtidas para a adição de diferentes
concentrações da CP10 (2,32 a 934 nmol L-1). (B) Curvas de refletância obtidas sobre SAM
previamente ativada (curva em preto), após imobilização da CP10 (467 nmol L-1 ou 10 µg mL-
1, curva em vermelho) e após lavagem com HBS-EP, pH 7,4 (curva em verde). (C) Resposta
obtida pela QCM para a imobilização da CP10 (467 nmol L-1) sobre a SAM.
(C)
(B)
-2000 0 20000
10
20
30
40
50
60
70
80
Refl
etâ
ncia
(%
)
SPR
/ mº
HBS-EP - linha de base
adição de CP10 (467 nmol L-1)
HBS-EP - SPR
efetiva
0 3 7 10 13
-80
-60
-40
-20
0
adição de HBS-EP
CP10 (467 nmol L-1 = 10 g mL
-1)
HBS-EP - linha de base
f
(H
z)
Tempo / min
0 4 8 12 16 20
0
400
800
1200
1600
2000
SP
R / m
º
Tempo / min
934 nmol L-1
467 nmol L-1
350 nmol L-1
233 nmol L-1
116 nmol L-1
46,4 nmol L-1
23,2 nmol L-1
4,64 nmol L-1
2,32 nmol L-1
(A)
68
Em seguida, variações do ângulo de SPR (ΔθSPR) foram observadas para cada
concentração da proteína adicionada (Figura 17A). Tal fato ocorreu devido a ligação da CP10
sobre a SAM aumentar o índice de refração local nas proximidades da interface metal-
dielétrico, o que resultou em ΔθSPR como consequência de alterações provocadas na ressonância
de plásmons sobre a superfície metálica. Analisando a Figura 17A, observa-se que um
equilíbrio é atingido em aproximadamente 18 minutos, sendo este período de tempo suficiente
para obtenção de uma elevada cobertura de superfície da CP10 sobre o 11-MUA (SAM/Au). O
terceiro e último passo, consistiu em sucessivas adições da solução tampão HBS-EP (pH 7,4)
para a remoção de espécies fracamente adsorvidas sobre a SAM, observando diminuições
acentuadas na ΔθSPR devido à remoção das espécies fracamente ligadas (Figura 17A). Neste
estágio, variações efetivas do ângulo de SPR (ΔθSPR efetiva) foram obtidas, o que,
possivelmente, referem-se às moléculas de CP10 ligadas predominantemente de forma
covalente sobre a SAM. Através da análise dos valores obtidos para a ΔθSPR efetiva (Figura
17A), é possível visualizar que o aumento da concentração da CP10 de 2,32 para 467 nmol L-1
foi acompanhado por respostas mais elevadas. Por outro lado, para as concentrações de CP10
superiores a 467 nmol L-1, menores valores da ΔθSPR efetiva foram obtidos. Isto pode ser
atribuído à saturação da superfície alcançada após a adição de 467 nmol L-1 da CP10 e, portanto,
esta foi a concentração da proteína utilizada para a construção dos imunossensores.
A Figura 17B, evidencia as curvas de refletância obtidas após adição de HBS-EP,
pH 7,4, sobre SAM previamente ativada (curva em preto), após adição da CP10 (467 nmol L-1
ou 10 µg mL-1, curva em vermelho) e após lavagem com HBS-EP, pH 7,4 (curva em verde),
podendo visualizar a manutenção do mínimo das curvas de refletância obtidos em cada uma
das etapas durante o processo de imobilização da proteína sobre a SAM. Tal fato evidencia que
mesmo após a imobilização da CP10 houve o acoplamento entre a onda incidente e a onda de
plámons, e, portanto, a ocorrência do fenômeno de ressonância de plásmons sobre a superfície
de ouro.
As condições otimizadas nos estudos de SPR (concentração e tempo de
imobilização da proteína sobre a SAM) foram adotadas para a construção do imunossensor de
QCM. A Figura 17C evidencia a resposta obtida em tempo real pela QCM para a imobilização
da CP10 (467 nmol L-1 ou 10 µg mL-1) sobre a SAM. De forma semelhante às curvas de SPR,
a Figura 17C ilustra a linha de base obtida pela adição da solução tampão HBS-EP (pH 7,4)
sobre a SAM previamente ativada, seguido pela adição da CP10. Conforme observado, a adição
da proteína é caracterizada pela diminuição da frequência de oscilação do cristal de quartzo (f)
69
devido ao aumento de massa ocasionado pela deposição do biomaterial sobre a superfície,
caracterizando a ligação da CP10 sobre o 11-MUA. Por fim, após lavagens sucessivas com
solução tampão HBS-EP (pH 7,4), observou-se o aumento da f devido à remoção de
biomoléculas fracamente ligadas, obtendo a variação efetiva da frequência de oscilação do
cristal (Δf efetiva) (Figura 17C).
De acordo com os resultados obtidos pela SPR e QCM, foi possível afirmar que a
formação de uma monocamada simples sobre superfície de ouro foi eficiente para a
imobilização da proteína para a construção dos imunossensores de SPR e QCM. Portanto, uma
vez otimizado o tempo de imobilização e a concentração da CP10, o passo seguinte consistiu
em determinar a espessura (d) e o índice de refração (n) do filme CP10/11-MUA formado sobre
a superfície de ouro. Estes parâmetros são aspectos importantes a serem considerados em
biossensores de SPR e QCM, uma vez que a sensibilidade desses dispositivos está concentrada
nas proximidades da interface metal-dielétrico. 43
4.3.3. Determinando simultaneamente via SPR a espessura (d) e o índice de
refração (n) da CP10 imobilizada sobre SAM/Au
Em dispositivos de SPR que operam mediante a configuração de Kretschm, quando
o fenômeno de ressonância de plásmons ocorre sobre uma superfície metálica uma quantidade
mínima de luz chega ao detector (reflexão interna total atenuada). Este fenômeno é facilmente
observado através das curvas de refletância de SPR (intensidade de refletância versus o θSPR,
Figura 5B). Estas curvas podem ser quantitativamente descritas através de resoluções acerca
das equações de Fresnel para a refletividade de um sistema de multicamadas com luz p-
polarizada. 141 Isto torna possível a simulação numérica para a determinação de algumas
propriedades, tais como o índice de refração (n) e a espessura de camadas (d) para filmes
ultrafinos (d <50 nm) em dispositivos de SPR. 142 Esta abordagem pode ser aplicada para
diversos materiais, incluindo os poliméricos, os materiais biologicamente ativos, para estruturas
em multicamadas, na pesquisa bioquímica básica, entre outras aplicações. 143
Neste estudo, o equipamento MP-SPR foi utilizado para determinar
simultaneamente n e d da CP10 (467 nmol L-1) imobilizada sobre a SAM. O método empregado
baseou-se em análises realizadas em diferentes comprimentos de onda (670 e 785 nm). Para
isto, curvas de refletância em ambos os comprimentos de onda foram obtidas antes (superfície
de ouro não modificada) e após a formação ex situ de CP10/SAM sobre a superfície metálica
(Figura 18A), sendo as análises realizadas em um mesmo meio (solução tampão HBS-EP, pH
70
7,4). A imobilização de CP10 sobre 11-MUA em ambos os comprimentos de onda foi
acompanhada por uma significativa ΔθSPR, caracterizando a construção do imunossensor
(Figura 18A).
Figura 18. (A) Curvas de refletância medidas em 785 nm (curvas em preto) e 670 nm (curvas
em vermelho) para a superfície não modificada (Au) e após a formação ex situ de CP10/SAM
sobre superfície de ouro. (B) Gráfico n versus d obtido para CP10/SAM/Au em ambos os
comprimentos de onda apresentadas na Figura 18, curva em verde é a curva em 670 nm
deslocada. A interseção ocorre em d (6,80 ± 0,01) nm e n (1,475 ± 0,0001).
Em seguida, um software de ajuste óptico (Winspall, versão 3.02) foi utilizado para
modelar as curvas de refletância obtidas. Inserindo diferentes valores de n, contínuas respostas
1.40 1.42 1.44 1.46 1.48 1.50 1.52 1.54
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
Esp
essu
ra (
nm
)
Índice de Refração (a.u.)
670 nm
785 nm
deslocada
(B)
60 62 64 66 68 70 72 74 76 780.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8R
efl
etâ
ncia
SPR
(º)
785nm-Au
785nm-SAM/CP10
670nm-Au
670nm-SAM/CP10
(A)
71
(d - n) para ambos os comprimentos de onda foram obtidas (Figura 18B). A posição da curva
em 670 nm (curva em preto, Figura 18B) foi deslocada (curva em verde, Figura 18B) através
de ajustes dos valores de n de acordo com a equação:
𝑛(𝑑𝑒𝑠𝑙𝑜𝑐𝑎𝑑𝑎) = 𝑛(𝑜𝑟𝑖𝑔𝑖𝑛𝑎𝑙) +𝑑𝑛
𝑑𝜆∗ 115 (8)
sendo o valor dn/dλ utilizado para correlacionar os valores de n para o outro comprimento de
onda (o valor dn/dλ foi encontrado em: http://refractiveindex.info), e 115 é a diferença entre os
comprimentos de onda (neste caso 785 nm – 670 nm). Os valores para o ponto de interseção
das curvas deslocada e medida consiste numa única solução para n (1,475 ± 0,0001) e d (6,80
± 0,01) nm para CP10/SAM (Figura 18B).
De forma análoga, os valores de n e d foram previamente obtidos após adsorção ex
situ do 11-MUA sobre Au (SAM/Au). Considerando-se que a integridade da SAM não se
alterou após a imobilização da proteína, o valor aproximado de d para CP10 foi 4,64 nm (±
0,01). Estes resultados evidenciam a formação de um filme ultrafino formado após imobilização
da proteína sobre a SAM/Au. Baseando-se nestes resultados, foi possível avaliar seguramente
nas próximas etapas a interação entre a CP10 e suas IgGs específicas (anticorpos anti-CP10).
4.3.4. Caracterização da interação antígeno-anticorpo por espectroscopia de
impedância eletroquímica
A EIS fornece informações sobre variações de impedância a respeito da interface
entre a superfície metálica não modificada/solução ou a interface entre uma superfície do metal
modificado/solução. A impedância pode ser apresentada como a soma das componentes real Z
'(Ω) e imaginária Z "(Ω) que se originam, principalmente, da resistência e capacitância da
célula. Estes diagramas são conhecidos como Nyquist (-Z" versus Z') e seus espectros de
impedância incluem uma porção de semicírculo em frequências mais altas correspondente ao
processo limitante à transferência de elétrons, e uma porção linear em baixas frequências,
resultante da etapa limitante de difusão para o processo eletroquímico. O diâmetro do
semicírculo no diagrama de Nyquist representa a resistência à transferência de elétrons pela
camada, podendo, portanto, ser utilizado para descrever as propriedades da interface entre
eletrodo modificado e solução. 144
Para as medidas de EIS, quantidades equimolares de Fe(CN)6-3/-4 (1,0 mmol L-1)
em KCl 0,1 mol L-1 foram usadas como sonda eletroativa para examinar sua reatividade sobre
72
eletrodo de ouro não modificado e após modificação com 11-MUA (SAM), CP10/SAM e anti-
CP10/CP10/SAM (Figura 19).
Figura 19. Diagrama de Nyquist (Z'' versus Z') obtido em solução aquosa de Fe(CN)6-3/-4 (1,0
mmol L-1) na presença de KCl (0,1 mol L-1). As curvas indicam a reação da sonda sobre
superfície de ouro não modificada (curva em azul), modificada com 11 MUA (curva em preto),
CP10/SAM (curva em vermelho) e com anti-CP10/CP10/SAM (curva em verde). Para essas
medidas, utilizou-se potencial de circuito aberto, uma amplitude de 10 mV e uma faixa de
frequência de 0,1 a 105 Hz. Inserção: circuito equivalente aplicado para modelar os dados dos
espectros de impedância na presença da sonda redox.
Os dados de EIS foram simulados com um circuito equivalente do tipo Randles
modificado, como mostrado pelo inserte da Figura 19. Este circuito inclui a resistência ôhmica
da solução de eletrólito (Rs); a impedância de Warburg (RW); a resistência à transferência de
carga (Rct); e um elemento de fase constante (CPE), o qual foi utilizado ao invés de um capacitor
puro para compensar respostas capacitivas não ideais da interface. Os dois componentes do
esquema eletrônico, Rs e RW, representam as propriedades de bulk da solução de eletrólito e as
características de difusão da sonda redox, respectivamente. CPE e Rct estão relacionados com
as características dielétricas e isolantes, respectivamente, na interface eletrodo/eletrólito e são
alterados pela modificação da superfície do eletrodo.
0 2 4 6 8 10
0
2
4
6
8
10
100
100
-Z" (
10
5
)
Z' (105 )
anti-CP10/CP10/SAM/Au
CP10/SAM/Au
SAM/Au
Au
73
Cada espectro de impedância obtido (Figura 19) consiste de uma porção de semicírculo em
frequências mais altas, correspondendo ao processo limitante de transferência de elétrons, e
uma parte linear em baixas frequências resultante da etapa limitante de difusão do processo
eletroquímico. O diâmetro do semicírculo nos diagramas de Nyquist representa a Rct da camada,
e este diâmetro pode ser utilizado para descrever as propriedades da interface do eletrodo
modificado. 144
O eletrodo de ouro não modificado exibiu uma linha quase reta com um pequeno
semicírculo em altas frequências, indicando que o processo de transferência de elétrons é
limitado pela difusão (Rct = 4,30 x 10-4 MΩ) (curva ampliada em azul, Figura 19). Após a
adsorção do 11-MUA sobre a superfície de ouro (SAM/Au) e a imobilização da CP10 sobre
SAM/Au (CP10/SAM/Au), o valor de Rct aumentou para 0,732 MΩ (curva em preto, Figura
19) e 1,26 MΩ (curva em vermelho, Figura 19), respectivamente. É possível que a formação de
camadas com propriedades isolantes sobre a superfície de ouro bloquearam parcialmente as
espécies redox, e assim, dificultou a aproximação da sonda para a superfície do eletrodo. Estes
resultados demonstram a formação bem sucedida do imunossensor. Após a interação do
anticorpo anti-CP10 com CP10/SAM/Au (curva em verde, Figura 19), a Rct aumentou para 5,03
MΩ, caracterizando a interação antígeno-anticorpo.
4.3.5. Uso dos imunossensores de SPR e QCM para calcular a afinidade de ligação
entre CP10 e IgGs anti-CP10
A Figura 20 evidencia as fases de associação e dissociação obtidas após adição de
anticorpos anti-CP10 sobre os imunossensores (CP10/SAM/Au) de SPR e QCM. Tanto para a
SPR quanto para a QCM, as análises foram realizadas em três etapas consecutivas: (1) solução
tampão HBS-EP em pH 7,4 foi adicionada, e após estabilização da linha de base, a resposta
(ΔθSPR ou Δf) foi monitorada durante cerca de 50 segundos; (2) diferentes concentrações de
anticorpos anti-CP10 (10,1 a 162 nmol L-1) foram adicionadas durante aproximadamente 6-7
minutos, sendo esta etapa caracterizada como a fase de associação (ligação entre CP10 e anti-
CP10); (3) sucessivas lavagens com solução tampão HBS-EP (pH 7,4) foram realizadas para
remover o excesso de moléculas sobre a superfície do imunossensor (fase de dissociação). Após
estas etapas, foi possível obter por SPR e QCM a variação efetiva das respostas obtidas para a
ligação entre o anticorpo e CP10 imobilizada sobre a SAM/Au.
74
Figura 20. Curvas de SPR (A) e QCM (C) evidenciando as etapas de associação e dissociação
para a adição de diferentes concentrações dos anticorpos anti-CP10 (10,1; 20,2; 40,5; 81,0 e
162 nmo L-1) sobre CP10 imobilizada sobre SAM/Au. Figuras (B) e (D): curvas analíticas
obtidas pelo logaritmo da variação efetiva em função do logaritmo da concentração de
anticorpos para as respostas dos imunossensores de SPR (B) e QCM (D).
Analisando as curvas de SPR (Figura 20A), foi possível observar que a constante
dielétrica do ambiente aumentou proporcionalmente com a concentração do anticorpo, sendo
tal fato acompanhado, portanto, pelo aumento do ângulo de SPR (θSPR). Em seguida, uma curva
analítica foi construída usando o logaritmo da ΔθSPR efetiva em função do logaritmo da
concentração do anticorpo (Figura 20B). Um comportamento linear (R: 0,997) foi obtido no
intervalo de concentração de 10,1 a 162 nmol L-1 com um limite de detecção de 4,23 nmol L-1.
Por sua vez, foi observado pela QCM que a frequência de oscilação do cristal
piezoelétrico diminuiu em proporção com o aumento da concentração de anticorpo (Figura
0 2 3 5 7 8
0
40
80
120
160
200
SP
R /
mº
Tempo / min
162 nmol.L-1
81.0 nmol.L-1
40.5 nmol.L-1
20.2 nmol.L-1
10.1 nmol.L-1
(A)
1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Lo
g
SP
R (
mº)
Log conc. (nmol.L-1)
0 2 4 6 8 10
0
10
20
30
40
50
- [
f (H
z)]
Tempo / min
162 nmol.L-1
81.0 nmol.L-1
40.5 nmol.L-1
20.2 nmol.L-1
(B)
1.2 1.5 1.8 2.1 2.4
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Lo
g [
-f
(Hz)]
Log conc. (nmol.L-1)
(B)
(C)
(D)
75
20C), sugerindo um maior número de biomoléculas depositadas sobre a superfície do cristal.
Uma curva analítica foi construída usando o logaritmo do negativo da Δf efetiva em função do
logaritmo da concentração do anticorpo de 20,2 a 162 nmol L-1 (Figura 20D), obtendo um R:
0,997. O limite de detecção obtido foi de 4,61 nmol L-1. Importante salientar que para uma
mesma concentração do anticorpo (81,0 nmol L-1), o desvio padrão relativo obtido para as
medidas de SPR e QCM foi menor que 5% (n=10).
Após caracterização da reação entre a proteína multiepitopo (CP10) e suas IgGs
específicas, o próximo passo consistiu em mensurar a afinidade de interação entre essas
biomoléculas. De acordo com alguns estudos relatados na literatura, as constantes de ligação
obtidas a partir dos biossensores de SPR e QCM não foram afetadas pela imobilização do
ligante, podendo uma molécula imobilizada sobre a superfície interagir de forma análoga como
se estivesse em solução. 145 Neste contexto, os dois grupos de curvas da Figura 20 (A e C) foram
avaliados através de um ajuste teórico realizado em relação aos dados experimentais, utilizando
para esta finalidade um software específico para tratamento de dados (Trace Drawer, versão
1.5) através de um modelo de interação 1:1 de Langmuir. Os resultados obtidos estão
evidenciados na Tabela 2. O ajuste realizado tanto por SPR quanto pela QCM apresentou x2 <
8 (chi2 menor que 8), sugerindo que os resultados simulados e experimentais estão em
concordância com nível de confiança de 95%.
Tabela 2. Parâmetros cinéticos obtidos pelas técnicas de SPR e QCM
Técnica ka (L mol-1 s-1)* kd (s-1)* KD (mol L-1)* r2
SPR 1,51x105 1,25x10-4 8,27x10-10 7,34
QCM 4,09x105 9,88x10-5 2,42x10-10 2,99
* Os desvios encontrados para essas medidas não são significativos (< 5 %).
Estes resultados sugerem um sítio (epítopo) imunodominante presente no antígeno (CP10).
Além disso, os valores obtidos dos parâmetros cinéticos encontrados tanto pela SPR quanto
pela QCM (Tabela 2) evidenciam elevada afinidade de ligação da CP10 frente suas IgGs
específicas, conforme evidenciado pelo baixo valor da constante de dissociação de equilíbrio
(KD = 10-10 mol L-1). De acordo com a literatura, valores de KD na ordem de 10-7 a 10-8 sugere
elevada afinidade de ligação para interações envolvendo antígeno-anticorpo. 145 Portanto, o
valor de KD obtido em nossos estudos sugere uma afinidade de ligação anda mais elevada da
CP10 frentes aos anticorpos da LV quando tipicamente comparado com os sistemas antígeno-
76
anticorpo, demonstrando quantitativamente o forte caráter imunogênico dessa nova proteína
recombinante quimérica.
4.4. CONCLUSÕES PARCIAIS
No presente estudo, imunossensores de SPR e QCM foram empregados com
sucesso para avaliar cineticamente a afinidade de ligação de uma nova proteína quimérica
recombinante frente a anticorpos anti-Leishmania infantum, visando frente a uma abordagem
quantitativa, demonstrar a aplicabilidade dessa proteína no imunodiagnóstico da leishmaniose
visceral.
As medidas de SPR em diferentes comprimentos de onda (670 e 785 nm) foram
realizadas de modo a determinar simultaneamente o índice de refração (1,475) e a espessura
(6,80 nm) da CP10 covalentemente imobilizada sobre a SAM (CP10/SAM/Au). Sendo esta,
uma metodologia adotada pelo nosso grupo para análise de n e d de proteínas, sendo tal
abordagem possível de ser aplicada devido à formação de um filme ultrafino e transparente
formado sobre a interface metal-dielétrico após interação da CP10 com a SAM.
Pela técnica de EIS, verificou-se que a formação de camadas com propriedades
isolantes sobre a superfície do ouro bloquearam parcialmente as espécies redox, obtendo-se
valor mais elevado de Rct (5,03 MΩ) após a interação da CP10 com suas IgGs anti-CP10.
Através destes resultados, foi possível observar qualitativamente o caráter antigênico
(imunogênico) da CP10.
A partir da análise quantitativa do potencial antigênico da CP10 obtida pelos
imunossensores de SPR e QCM, observou-se elevada afinidade de ligação entre a CP10 e os
anticorpos anti-CP10 (KD = 8,27 x 10-10 mol L-1 calculado via SPR; e KD = 2,42 x 10-10 mol L-
1 calculado via QCM). Além disso, os baixos limites de detecção encontrados por SPR (LOD =
4,23 nmol L-1) e QCM (LOD = 4,61 nmol L-1) evidenciam a viabilidade de aplicação dos
imunossensores de SPR e QCM para detecção em tempo real, livre de marcação e com elevada
sensibilidade de anticorpos específicos da LV.
Os resultados encontrados nestes estudos, somados aos resultados obtidos pelo
método de ELISA empregando a CP10 para detecção dos cães infectados assintomaticamente,
consistem em fortes evidências para a potencial contribuição desta nova proteína em
imunodiagnósticos, e, portanto, em programas de controle da LV.
77
Plataforma multivalente empregada
para imobilização de uma proteína
de função desconhecida
78
5. IMOBILIZAÇÃO SOBRE DENDRÍMERO DE UMA PROTEÍNA DE
FUNÇÃO DESCONHECIDA EM L. INFANTUM PARA ESTUDO
CINÉTICO VIA SPR DA INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO 146
5.1. MOTIVAÇÃO PARA REALIZAÇÃO DESTE ESTUDO
Uma vez conhecida a viabilidade dos imunossensores desenvolvidos para avaliação
in situ da interação antígeno-anticorpo, o próximo passo do trabalho consistiu em buscar
amplificação da interface de reconhecimento durante a etapa de construção dos biossensores.
Para esta finalidade, foi explorado neste próximo estudo o método de “layer by layer” através
do uso combinado de SAM de tiol (cisteamina) e dendrímero de geração 4 consistindo de 64
grupos amino-terminais (poliamidoamina, PAMAM(G4)). Esta plataforma multivalente
(PAMAM-SAM) foi utilizada como suporte para a biomolécula de reconhecimento, sendo esta
uma proteína com função desconhecida no protozoário L. infantum (proteína hipotética C1 ou
proteína C1). 126
A importância de se empregar no presente momento a proteína hipotética
supracitada para a construção dos biossensores pode ser entendida a partir das considerações a
seguir. Verificou-se que a proteína hipotética C1 de L. infantum sintetizada por nossos
colaboradores (Fonseca et al. (2014)) apresentou em imunoensaios reatividade contra soros
caninos infectados por L. infantum e nenhuma reatividade frente a soros infectados com
Trypanosoma cruzi. Além disso, também foi notificado que todas as amostras de soros de cães
assintomáticos foram detectadas pela proteína C1. 126 Resultados estes bastante promissores,
tendo em vista à enorme dificuldade do diagnóstico eficaz para esses casos.
Outro ponto particularmente importante considerado para utilização da proteína C1
é que, conforme relatado por Peacock et al. (2007), L. infantum é uma célula diplóide que possui
36 pares de cromossomos e cerca de 8300 genes, dos quais 27 são genes específicos da espécie.
107 Entre estes genes, 10 apresentam funções preditas, enquanto 17 são hipotéticos, em outras
palavras, suas funções são desconhecidas. Dessa forma, em todo o genoma da espécie de L.
infantum não são conhecidas as funções para mais de 50% dos genes identificados, sendo estes
genes de proteínas hipotéticas, portanto, alvos bastante interessantes para a pesquisa. Tais
evidências corroboram às justificativas apresentadas para a escolha da proteína C1 neste estudo.
79
Neste contexto, uma vez encontrado grande incentivo para realização deste próximo
estudo, foi realizada a imobilização da proteína C1 sobre a plataforma multivalente para a
construção de um imunossensor de SPR para detecção de anticorpos anti-L. infantum.
Importante salientar que a técnica de SPR foi escolhida para este estudo devido, principalmente,
sua maior praticidade em relação à QCM.
A partir dos resultados encontrados da interação entre a proteína C1 e suas IgGs
específicas, um estudo cinético foi proposto para elucidar o mecanismo de reação entre essas
biomoléculas, tornando possível quantificar o número de sítios imunodominantes e o caráter
imunogênico (antigênico) dessa proteína hipotética C1. Por fim, visando avaliar a viabilidade
de aplicação imunossensor de SPR proposto, foram utilizadas amostras reais consistindo de
soros caninos positivos e negativos para a LV.
5.2. EXPERIMENTAL
5.2.1. Reagentes químicos, soluções e instrumentação
O dendrímero poliamidoamina (PAMAM, núcleo etilenodiamina, geração 4,0,
solução 10 % (g/g) em metanol), a cisteamina (CYS, 99%) e uma solução aquosa de
glutaraldeído (GLU, 25 % g/v) foram adquiridos da Sigma Aldrich Chemical (St. Louis, MO,
EUA). Os demais reagentes químicos, soluções e instrumentação utilizados neste estudo já
foram descritos no estudo anterior (seção 4)
5.2.2. Proteína hipotética C1 (proteína recombinante C1 ou antígeno C1)
A proteína recombinante C1 (MM = 40,7 kDa) foi sintetizada através da tecnologia
do DNA recombinante, sendo adquirida através de colaboração efetivada com o Laboratório de
Leishmanioses do Instituto de Ciências Básicas da Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG). 126 A Tabela 3, evidencia a sequência de aminoácidos dessa proteína e de nucleotídeos
do gene que a codifica.
80
Tabela 3. Sequências de aminoácidos e nucleotídeos da proteína C1 - gi|146094146|ref|XP_
001467184.1| hypothetical protein [Leishmania infantum JPCM5].
A seleção da proteína hipotética C1, as etapas realizadas para sua produção e a
avaliação de sua imunogenicidade, serão discutidas a seguir.
Seleção da proteína recombinante C1
Essa proteína hipotética de Leishmania foi selecionada com base em quatro critérios
diferentes. Primeiramente, a proteína não foi anteriormente descrita na literatura, exceto no
sequenciamento automático de genomas de tripanossomatídeos e em nossa pesquisa. Em
segundo lugar, essas proteínas são conservadas em espécies de Leishmania. O terceiro critério
consistiu na presença de epitopos de células B como previsto em dois softwares
MMYTGEIENGQMHGRGCLIYPNKEKYEGDWVYGKRHGHGVYTYAD
GSKYDGEWVEDKVHGKGTCYYASGNRYTGDWTFGRINGRGTLEYA
DGDRYDGEWKDGRMHGKGLYYYSNGDRYDGEWKDDKRHGKGTV
TYAGPDGSVSEKFDGDWVEGRMQGWGKYYYADGGVYEGEWQDGK
MHGKGTYIFPNGNKYEGEWCDDVKQGYGVLTYVNGERYEGYWLDD
KAHGTGTLTYLQGDRYTGEWYQGKKHGRGTLAYSNKDTYEGEWRN
DSATGRGVLEYANGCRYEGDWLDDRRHGEGQLLLPDGSSYEGGWV
NGKKEGRARIILKCGAVFVGTWKDNRIVGQGEFYLSENCDLNNPDY
Proteína em
formato FASTA
(358 aa)
Gene em
formato FASTA
(1077 pb)
ATGATGTATACAGGTGAAATCGAGAACGGCCAGATGCATGGCCGG
GGCTGCCTCATCTACCCGAACAAGGAGAAGTACGAGGGCGACTGG
GTGTACGGCAAGCGTCACGGCCACGGCGTGTACACATACGCGGAC
GGTAGCAAGTACGATGGGGAGTGGGTGGAGGATAAGGTGCACGG
CAAGGGCACATGCTACTACGCCAGCGGCAATCGCTACACCGGTGA
CTGGACGTTTGGCCGCATCAACGGCCGCGGTACCCTCGAGTACGCC
GACGGCGATCGCTACGACGGTGAGTGGAAGGACGGCCGCATGCAT
GGCAAAGGTCTCTACTACTACTCCAACGGCGACCGCTACGACGGC
GAGTGGAAGGATGATAAACGTCACGGAAAGGGTACGGTGACGTAC
GCCGGCCCCGACGGTAGCGTGTCGGAGAAGTTCGACGGCGACTGG
GTGGAGGGGCGCATGCAGGGCTGGGGTAAGTACTACTACGCCGAC
GGCGGCGTTTACGAGGGCGAGTGGCAGGATGGCAAGATGCACGGC
AAGGGTACGTACATATTCCCGAACGGCAACAAATACGAGGGTGAG
TGGTGCGACGATGTGAAGCAGGGCTACGGTGTGCTGACCTACGTC
AACGGCGAGCGCTACGAGGGCTACTGGCTGGACGACAAGGCGCAC
GGCACCGGCACCCTCACCTACCTCCAGGGTGACCGCTATACAGGC
GAGTGGTACCAGGGCAAGAAACACGGCCGCGGTACTCTGGCCTAT
AGCAACAAAGACACGTATGAGGGCGAGTGGCGGAACGACAGCGC
GACCGGCCGAGGTGTGCTCGAGTACGCGAATGGGTGCCGCTACGA
GGGAGACTGGTTGGATGATAGGCGCCACGGCGAAGGCCAGCTGTT
GCTACCGGACGGCTCCAGCTATGAGGGTGGGTGGGTGAATGGCAA
GAAGGAGGGCCGCGCCCGCATTATCCTCAAGTGCGGCGCCGTCTT
CGTGGGCACTTGGAAGGACAACCGTATCGTGGGACAGGGCGAGTT
CTACCTCTCCGAGAACTGCGACCTCAACAATCCCGACTACTAG
81
simultaneamente (BCPred e ABCPred). O quarto fator, é que os epitopos mapeados não
reagiram com soros caninos infectados com Trypanosoma cruzi, nem mesmo com soros caninos
saudáveis em imunoblottings. Adicionalmente, seus epitopos são altamente imunogênicos
quando testados com soros caninos infectados com L. infantum.
Produção do antígeno C1 de L. infantum
A sequência de nucleotídeos e aminoácidos utilizada neste estudo foi obtida a partir
do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Inicialmente, o DNA genômico foi extraído de L. infantum (MHOM/BR/1972/BH46) através
do quite QIAamp DNA Mini ® (QIAGEN) e utilizado como molde na PCR. Primes foram
projetados usando Oligo Explorer software 1.4 (www.genelink.com/tools/gl-oe.asp) e Primer
Premier 5.0 (www.premierbiosoft.com/primerdesign/). A reação de amplificação foi conduzida
nas seguintes condições: desnaturação preliminar a 94 ºC durante 5 minutos, seguido por 25
ciclos de desnaturação a 94 ºC durante 1 min, hibridização a 54 ºC durante 1 min, extensão a
72 ºC durante 1 min, e uma extensão final de 5 min.
O produto de PCR foi clonado em Nhel / HindIII (para proteínas C1) para sítios de
restrição do vector pET-28a - TEV, que permitiu uma marcação de 6 resíduos de histidina para
ser fundida com a proteína. Em seguida, células eletrocompetentes de Escherichia coli (BL21)
foram transformadas com os plasmídeos recombinantes. Para expressão da proteína, uma única
colônia foi crescida em meio 2xYT (1,6 % Bactotriptona, 1 % de extrato de levedura, 0,5 % de
NaCl) contendo 0,05 mg mL-1 de canamicina durante 16 h. Quando a cultura atingiu uma
absorbância de 0,6 a 600 nm, a mesma foi inoculada em 1L de 2xYT com canamicina, mantida
sob as mesmas condições acima e induzida com 0,5 mmol L-1 com IPTG. A expressão foi
realizada durante 4 h a 37°C, e as células foram então lisadas por cinco passagens através de
um homogeneizador (Emulsiflex ™ C3). Em seguida, a proteína recombinante foi purificada
utilizando uma coluna de 5 mL HIS-Trap (GE Healthcare Life Science) ligada a um sistema de
cromatografia Akta Prime (GE Healthcare Life Science).
Antigenicidade da proteína recombinante C1
Através dos ensaios de validação desta proteína, foi observado resultados
promissores para a utilização da proteína C1 frente a amostras de soros humanos e caninos.
Como exemplo, para amostras de soros caninos testados individualmente por ELISA, foi obtida
82
uma sensibilidade de 80% e a proteína foi capaz de diferenciar significativamente os grupos
controles e infectados. Além disso, todas as amostras de soros de cães assintomáticos foram
detectadas pela proteína C1. 126 O antígeno de C1 possibilitou testes com precisão moderada
(área sob a curva - AUC = 0,76) 140. Em seguida, alíquotas consistindo de diferentes quantidades
da proteína C1 foram dissolvidas em solução tampão HBS-EP, pH 7,4, e congeladas à -80ºC
até a sua utilização.
5.2.3. Produção de IgGs específicas para a proteína recombinante C1
Soros de coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados através da inoculação
da proteína C1, conforme demonstrado no trabalho de Fonseca et al (2014). 126 Anteriormente
à primeira inoculação, uma amostra de sangue (3 mL) foi tomada como controle pré-imune a
partir da orelha do animal por punção venosa. Os procedimentos foram realizados em
conformidade com o Comitê de Ética no Uso de Animais (Comitê de Ética no Uso de Animais
/ Universidade Federal de Minas Gerais), tendo obtido aprovação com o número do protocolo
161/2013 (ANEXO II). Após a primeira imunização, sucessivas imunizações foram realizadas
em intervalos de 10 a 15 dias (total de 4 imunizações). Posteriormente, 7 dias após a última
imunização, a sangria dos animais foi realizada por punção cardíaca, em que foram recolhidos
50 mL de sangue do animal. 139
Após imunização, as amostras foram centrifugadas e os soros obtidos purificados
por cromatografia de afinidade em relação às proteínas G e A. Em seguida, os ensaios de ELISA
foram realizados utilizando a proteína C1 para a determinação da concentração molar de IgGs
específicas para esta proteína, obtendo-se uma concentração purificada de 1,40 mg mL-1 (9,59
mmol L-1, IgG = 146 kDa). As amostras contendo diferentes concentrações de IgGs anti-C1
(1,00 a 200 nmol L-1) foram obtidas por dissolução destes anticorpos em solução tampão HBS-
EP, pH 7,4.
5.2.4. Soros caninos
Amostras de soros positivos para LVC foram coletadas de cães naturalmente
infectados com o antígeno L. infantum em regiões endêmicas da cidade de Belo Horizonte
(MG), Brasil. Para estas amostras, os diagnósticos foram realizados pelos métodos sorológicos
IFAT e ELISA no Laboratório de Leishmanioses da Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG), Belo Horizonte (MG), Brasil. Para os controles negativos, amostras de soros foram
83
obtidas a partir de cães saudáveis alojados em áreas não endêmicas da região metropolitana de
Belo Horizonte.
Para os ensaios, dois pools de soros caninos foram preparados. O primeiro
consistindo de 10 soros positivos para LV e o segundo de 10 soros negativos para LV. Ambos
os pools foram dissolvidos em tampão HBS-EP (pH 7.4) em diferentes diluições (v/v): 1:50,
1:100, 1:400 , 1:800 , 1:1600 , 1:3200 , 1:6400 , 1:12800 , 1:25600 , 1:51200 e 1:102400.
5.2.5. Construção e avaliação do imunossensor de SPR
Anteriormente ao início de construção dos biossensores, a limpeza da superfície de
ouro foi realizada, conforme já discutido no estudo anterior (seção 4).
Para facilitar a visualização das etapas envolvidas na construção do imunossensor
de SPR, um esquema foi inserido (Figura 21) e os procedimentos realizados em cada etapa
foram descritos abaixo:
Etapa I – Formação de CYS-SAM sobre ouro. Imediatamente após limpeza da superfície de
ouro, uma SAM foi formada por adsorção de cisteamina (CYS) sobre a superfície metálica
através da adição de uma solução etanólica consistindo de 2,0 mmol L-1 de CYS durante 24
horas de interação. Após formação, a superfície modificada com a CYS-SAM foi lavada
diversas vezes com etanol e secada sob fluxo de N2(g) puro. Então, os grupos amino-terminais
da SAM foram ativados pela adição de uma solução aquosa de glutaraldeído (GLU, 2,5 % g/v)
durante 10 minutos, seguido por sucessivas lavagens com água e secagem com fluxo de N2(g)
(Figura 21).
Etapa II – Formação de PAMAM(G4)/CYS-SAM. A solução metanólica de PAMAM(G4) 10%
(g/g) foi adicionada sobre CYS-SAM previamente ativada, deixando reagir overnight para a
formação de PAMAM(G4)/CYS-SAM (PAMAM(G4)/SAM). Então, a superfície contendo
PAMAM(G4)/SAM foi lavada três vezes com metanol e secada com N2(g). Posteriormente, os
grupos amino-terminais do dendrímero foram ativados pela adição da solução aquosa de
glutaraldeído (2,5% g/v) durante aproximadamente 30 minutos, seguido por sucessivas
lavagens com água e secagem sob fluxo de N2(g) (Figura 21).
84
Figura 21. Etapas envolvidas na construção e avaliação do imunossensor de SPR. (I)
Formação de CYS-SAM sobre ouro; (II) Formação de PAMAM(G4)/CYS-SAM; (III)
Imobilização da proteína C1; (IV) Bloqueio dos grupos reativos inespecíficos; (V) interação
entre IgGs anti-C1 e proteína C1.
Etapa III – Imobilização da proteína C1. Diferentes concentrações da proteína recombinante
C1 (0,1 – 80 µg mL-1 ou 0,00245 – 1,96 µmol L-1) foram adicionadas sobre CYS-SAM e
PAMAM(G4)/SAM (Figura 21) previamente ativadas e a imobilização monitorada em tempo
real via SPR. A eficiência de CYS-SAM e PAMAM(G4)/SAM para suporte da proteína foi
comparada.
Etapa IV – Bloqueio dos grupos reativos inespecíficos. Os grupos reativos glutaraldeídos (Glu)
remanescentes sobre a SAM e PAMAM(G4)/SAM, foram desativados por um fluxo de 1,0 mol
L-1 de solução aquosa de EA por aproximadamente 5 minutos, visando evitar ou minimizar
ligações não específicas (Figura 21).
Etapa V – Avaliação do Imunossensor. Após construção do imunossensor, a cinética de
interação entre a proteína C1 e suas IgGs anti-C1 foi avaliada através das curvas de associação
e dissociação obtidas via SPR. Nesta etapa, diferentes concentrações de anticorpos (9,70; 13,0;
19,4; 25,9; 51,8; 77,7; 104 e 155 nmol L-1) foram adicionadas sobre proteína
C1/PAMAM(G4)/SAM/Au (Figura 21).
85
5.3. RESULTADOS E DISCUSAO
5.3.1. Imobilização da proteína C1 sobre CYS-SAM e PAMAM(G4)/SAM
Primeiramente, a solução tampão HBS-EP (pH 7,4) foi adicionada sobre CYS-
SAM e PAMAM(G4)/SAM, ambas as superfícies previamente ativadas pela mistura
EDC/NHS, e o ângulo de ressonância foi monitorado até a estabilização da linha de base. Em
seguida, soluções da proteína C1 em diferentes concentrações foram adicionadas sobre os
filmes e o processo de imobilização foi acompanhado em tempo real via SPR (Figura 22).
Figura 22. Sensorgramas relacionando a ΔθSPR efetiva obtida para adição das diferentes
concentrações da proteína recombinante C1. Imobilização da proteína sobre CYS–SAM (A) e
sobre PAMAM(G4)-SAM (C). Figuras (B) e (D): relação linear entre a concentração da
proteína e a ΔθSPR efetiva para os resultados evidenciados pelas Figuras (A) e (B),
respectivamente.
0 3 6 9 12 15
0
300
600
900
1200
1500
1800
SP
R / m
º
Tempo / min
80 g mL-1
70 g mL-1
50 g mL-1
30 g mL-1
0 10 20 30 40 50
0
50
100
150
200
250
SP
R / m
º
conc. / g mL-1
30 40 50 60 70 80200
400
600
800
1000
1200
SP
R / m
º
conc. / g mL-1
0 3 6 9 12 15
0
300
600
900
1200
1500
1800
SP
R / m
º
Tempo / min
50 g mL-1
40 g mL-1
30 g mL-1
20 g mL-1
10 g mL-1
0.1g mL-1
(A)
(C)
(B)
(D)
86
A Figura 22A mostra que a ligação da proteína C1 sobre CYS-SAM/Au foi
acompanhada por ΔθSPR. Após esta etapa, realizou-se sucessivas lavagens com tampão HBS-
EP, pH 7,4, e a ΔθSPR efetiva foi obtida para cada concentração da proteína adicionada (Figura
22A). Como pode ser visto pela Figura 22B, a ΔθSPR efetiva aumentou linearmente com o
aumento do número de moléculas. No entanto, a adição da proteína C1 numa concentração mais
elevada (50 µg mL-1) não demonstrou diferença significativa da ΔθSPR efetiva em comparação
ao valor observado para a concentração de 40 µg mL-1. Além disso, concentrações maiores que
50 µg mL-1 (60, 70 e 80 µg mL-1) foram acompanhadas por respostas menores quando
comparadas com o valor da ΔθSPR efetiva obtido para 50 µg mL-1. Possivelmente, a saturação
da superfície ocorreu devido a um número limitado de sítios da CYS-SAM acessíveis para
ligação da biomolécula.
Por sua vez, a adição de concentrações elevadas da proteína recombinante C1 (30
– 80 µg mL-1 ou 0,737 - 1,96 µmol L-1) sobre PAMAM(G4)-SAM foi acompanhada por maiores
valores da ΔθSPR efetiva quando comparada aos valores obtidos com a CYS-SAM somente
(Figura 22C). Como visto pela Figura 22D, maiores ΔθSPR efetivas foram possivelmente
observadas para concentrações ainda mais elevadas da proteína (50, 70, e 80 µg mL-1), não
ocorrendo a saturação da superfície de PAMAM(G4)/SAM/Au. Provavelmente, esta resposta
melhorada ocorreu devido à estrutura tridimensional do dendrímero, a qual proporcionou um
aumento de área superficial para interação com a proteína C1. Assim, a geometria estérea
combinada com vários grupos aminos reativos existentes em PAMAM(G4) aumentou
significativamente a quantidade de biomoléculas ligadas (Figura 22 C e D). De acordo com
estes resultados, o uso combinado de PAMAM(G4) e CYS-SAM foi escolhido para a
construção do imunossensor de SPR.
5.3.2. Caracterização eletroquímica do imunossensor
As técnicas de voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância
eletroquímica foram utilizadas para caracterização do imunossensor. Para estas medidas, o
ferricianeto de potássio (III) foi utilizado como sonda eletroativa para examinar a sua
reatividade sobre superfície de ouro não modificada e modificada com CYS-SAM,
PAMAM(G4)/SAM e após imobilização do antígeno (proteína C1) sobre a camada
multivalente (antígeno-PAMAM (G4)-SAM). As curvas em preto e vermelho da Figura 23A
evidenciam, respectivamente, os voltamogramas cíclicos para a reação da sonda sobre
superfície de ouro não modificada e após formação da SAM (CYS 2,0 mmol L-1) sobre ouro.
87
Figura 23. Voltamogramas cíclicos (A) e diagrama de Nyquist (Z'' versus Z') (B), obtidos em
solução aquosa de Fe(CN)6 4-/3- (1,0 mmol L-1) na presença de KCI 0,1 mol L-1. As curvas
(Figuras A e B), evidenciam a reação da sonda sobre superfície de ouro não modificada (curvas
em preto), modificada com CYS-SAM (curvas em vermelho), PAMAM(G4)-SAM (curvas em
verde) e com antígeno-PAMAM(G4)-SAM (curvas em azul). Os voltamogramas (Figura 23A)
foram realizados a uma velocidade de varredura de 20 mV s-1. A Figura inserida (Figura 23B)
representa o circuito equivalente aplicado para modelar os dados de impedância na presença
da sonda redox.
Como pode ser visto, dois picos bem definidos característicos do Fe(CN)64-/ Fe (CN)6
3- foram
observados sobre o eletrodo de ouro não modificado (curva em preto, Figura 23A). Por sua vez,
após adsorção do alcanotiol de cadeia curta (formação de CYS-SAM) sobre superfície de ouro,
uma maior resistência à reação da sonda redox foi observada (curva em vermelho) em
-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
-12
-6
0
6
12
18
i (
A)
E(V) vs. Ag/AgCl
Au
CYS-SAM/Au
PAMAM/CYS-SAM/Au
C1/PAMAM/CYS-SAM/Au
0 500 1000 1500
0
500
1000
1500
Z'' (
)
Z' ()
Au
CYS-SAM/Au
PAMAM/CYS-SAM/Au
C1/PAMAM/CYS-SAM/Au
(A)
88
comparação à superfície não modificada. A curva em verde da Figura 23A evidencia que o
sistema multivalente formado por PAMAM(G4)/CYS-SAM dificultou ainda mais o acesso da
espécie redox Fe(CN)63-/Fe(CN)6
4- para a superfície do eletrodo. Por fim, as menores
intensidades de corrente anódica e catódica e o maior sobrepotencial foram observados após
ligação da proteína recombinante C1 (antígeno C1) sobre a plataforma multivalente (curva em
azul, Figura 23A). Portanto, uma maior resistência à reação da espécie eletroativa foi alcançada
após adição da proteína C1 sobre o filme, caracterizando o processo de imobilização da
biomolécula.
A fim de comprovar os indícios observados pelos voltamogramas cíclicos e para
obter informações detalhadas acerca da resistência de transferência de carga (Rct) medidas de
EIS foram realizadas. Figura 23B evidencia as curvas de Nyquist para eletrodo de ouro não
modificado (curva em preto), para CYS-SAM/Au (curva em vermelho), PAMAM(G4)/CYS-
SAM/Au (curva em verde) e para C1/PAMAM(G4)/CYS-SAM/Au (curva em azul) na presença
da sonda redox. Os dados de impedância foram simulados com um circuito equivalente de
Randles modificado, como mostrado na inserção da Figura 23B.
O eletrodo de ouro não modificado exibiu uma linha quase reta com um pequeno
semicírculo em altas frequências, indicando um processo de transferência de elétrons limitado
por difusão (Rct = 0,43 k) (curva em preto, Figura 23B). Após a adsorção de CYS-SAM sobre
a superfície de ouro, o valor de Rct aumentou para 1,19 k (curva em vermelho, Figura 23B),
ocorrendo um bloqueio parcial da transferência de elétrons da sonda redox sobre a superfície
do eletrodo, caracterizando a formação da CYS-SAM. Após formação do sistema multivalente
(PAMAM(G4)/CYS-SAM/Au) sobre superfície de ouro, o valor encontrado de Rct foi mais
elevado (2,10 k ). Seguidamente, para a imobilização do antígeno recombinante C1 sobre
PAMAM(G4)/CYS-SAM/Au (curva 4, Figura 23B), a Rct aumentou para 9,97 k ,
confirmando a tendência observada pelos experimentos de voltametria cíclica.
A interação entre o antígeno C1 de L. infantum e a plataforma previamente ativada
foi ainda caracterizada por meio da análise da constante aparente da velocidade heterogênea à
transferência de elétrons (𝐾𝐸𝑇o ) para a sonda redox estudada. A 𝐾𝐸𝑇
o correspondente dos
eletrodos modificados foi calculada usando a cinética de transferência de carga 147:
89
𝐾𝐸𝑇o = 𝑅𝑇 𝑛2⁄ 𝐹2𝐴 𝑅𝑐𝑡𝐶 (9)
sendo R a constante dos gases, T a temperatura, n o número de elétrons envolvidos, Rct a
constante de transferência de elétrons do par redox, F a constante de Faraday, A a área
geométrica do eléctrodo, e C a concentração molar da sonda em solução.
Quando o eletrodo de ouro não modificado foi funcionalizado com CYS-SAM a
kETo diminuiu de 1,97 x 10-2 cm s-1 para 7,12 x 10-3 cm s-1. Os valores de 𝐾𝐸𝑇
o para superfície
de ouro modificada com PAMAM(G4)/CYS-SAM e com a proteína C1 (antígeno C1/PAMAM
(G4)/CYS-SAM) foram 4,03 x 10-3 cm s-1 e 8,50 x 10-4 cm s-1, respectivamente.
Portanto, a formação de camadas sobre a superfície de ouro dificultou o acesso da
sonda eletroativa para a superfície do eletrodo, sendo o maior valor de resistência encontrado
após adição da proteína, caracterizando com sucesso sua imobilização sobre a plataforma
multivalente.
5.3.3. Estudo cinético da reação entre a proteína C1 imobilizada sobre
PAMAM(G4)/SAM e suas IgGs anti-C1
Após construção e caracterização do imunossensor de SPR, foi realizada uma
avaliação cinética da interação entre a proteína hipotética C1 e suas IgGs específicas anti-C1.
A Figura 24A evidencia as fases de associação e dissociação obtidas durante o ensaio.
Inicialmente, a solução tampão HBS-EP (pH 7,4) foi adicionada e, após a estabilização da linha
de base, a resposta (ΔθSPR) foi monitorada durante cerca de 50 segundos (Figura 24A). Em
seguida, diferentes concentrações de anticorpos anti-C1 (9,70 a 155 nmol L-1) dissolvidas em
solução tampão HBS-EP, pH 7,4, foram adicionadas sobre o imunossensor de SPR (proteína
C1/ PAMAM(G4)-SAM/Au), verificando a interação antígeno-anticorpo. Esta fase de
associação foi avaliada por aproximadamente 6 a 7 minutos. A última etapa consistiu em
sucessivas lavagens com solução tampão HBS-EP (pH 7,4) para remoção de moléculas em
excesso sobre a superfície do imunossensor (fase de dissociação). Após estas etapas, os valores
da ΔθSPR efetiva foram obtidos (Figura 24A e Figura 24B). É possível observar que a ΔθSPR
efetiva aumentou em proporção com a concentração de anticorpo adicionada. Dessa forma, uma
curva analítica foi construída usando a ΔθSPR efetiva em função da concentração do anticorpo
(Figura 24B). Este gráfico exibiu uma boa linearidade (R = 0,998) no intervalo de concentração
de 9,70 a 51,8 nmol L-1, com limites de detecção e quantificação de 7,37 e 7,83 nmol L-1,
respectivamente.
90
Figura 24. (A) Sensorgrama ilustrando as fases de associação e dissociação após a adição de
diferentes concentrações dos anticorpos anti-C1 (9,70 a 155 nmol L-1) sobre a proteína C1
(1,96 µmol L-1 ou 80 µg mL-1) imobilizada sobre PAMAM(G4)/SAM/Au. (B) Curva analítica
evidenciando a faixa linear de resposta (9,70 a 51,8 nmol L-1).
Com o intuito de um melhor entendimento acerca da cinética de reação entre a
proteína C1 e suas específicas IgGs anti-C1, um mecanismo de reação foi proposto neste estudo.
A seguir, serão descritos os processos que auxiliaram na elaboração de um modelo cinético que
explica o comportamento experimental observado através da Figura 24A. Para entendimento
dos mecanismos envolvidos na reação entre a proteína C1 (antígeno C1) e suas específicas IgGs
anti-C1, uma consulta à literatura foi realizada para estudo das abordagens disponíveis para
avaliação de interações entre biomoléculas. Verificou-se que há basicamente três metodologias
disponíveis, as quais envolvem estratégias de linearização, desenvolvimento de equações de
velocidades integradas e processos de integração numérica. 148 Além disso, foi observado que
0 2 3 5 7 8
0
40
80
120
160
200 155 nM
104 nM
77.7 nM
51.8 nM
25.9 nM
19.4 nM
13.0 nM
9.70 nM
SP
R /
mº
Tempo / min
(A)
0 30 60 90 120 150
0
30
60
90
120
150
SP
R / m
º
conc. (nmol L-1)
(B)
91
geralmente as interações do tipo antígeno-anticorpo são descritas com estequiometria de 1 para
1 que levam à formação de um complexo. Neste contexto, esta foi a estequiometria inicialmente
adotada para descrevermos a cinética da reação entre o antígeno C1 e os anticorpos anti-C1,
como demonstrado pela seguinte expressão:
𝐴 + 𝐵 ⇌ 𝐴𝐵 (10)
em que, [A]: concentração de moléculas do antígeno C1; [B]: concentração de moléculas do
anticorpo anti-C1; [AB]: concentração do complexo antígeno C1 – anticorpo anti-C1 com
ligação do anticorpo em um sítio (epitopo) do antígeno.
A expressão 10 pode ser representada pela constante de equilíbrio de dissociação (KD):
𝐾𝐷 =𝑘𝑑
𝑘𝑎=
[𝐴][𝐵]
[𝐴𝐵] (11)
sendo, Kd: constante cinética de dissociação; Ka: constante cinética de associação.
Considerando que as moléculas do antígeno C1 (A) estão fortemente imobilizadas
sobre PAMAM(G4)/SAM/Au, podemos considerar que sua variação é desprezível. Por sua vez,
ao adicionar uma determinada concentração de anticorpos anti-C1 sobre a superfície do sensor,
ocorre a formação do complexo antígeno-anticorpo (AB). A partir deste instante, a
concentração inicial do anticorpo (B) adicionada diminui de acordo com a seguinte equação:
𝑑[𝐵]
𝑑𝑡= −𝑘𝑎[𝐴][𝐵] + 𝑘𝑑[𝐴𝐵] (12)
De maneira semelhante, a formação do complexo antígeno-anticorpo (AB) também pode ser
representada:
𝑑[𝐴𝐵]
𝑑𝑡= 𝑘𝑎[𝐴][𝐵] − 𝑘𝑑[𝐴𝐵] (13)
Sabendo-se que a mesma solução tampão HBS-EP (pH 7,4) foi utilizada tanto para dissolução
das amostras biológicas quanto para as análises de SPR, podemos atribuir as variações no
ângulo de ressonância (ΔθSPR) devido somente às interações ocorridas sobre a superfície do
sensor. Diante disto e levando-se em consideração as espécies presentes, a formação do
complexo AB é responsável pela alteração no ângulo de SPR. Neste sentido, existe uma relação
de proporcionalidade entre a ΔθSPR e sua taxa de variação com a concentração do complexo:
92
𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅 [𝐴𝐵] (14)
𝑑𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅
𝑑𝑡
𝑑[𝐴𝐵]
𝑑𝑡 (15)
Realizando as substituições de (14) e (15) em (13) obtemos a seguinte equação resultante:
𝑑𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅
𝑑𝑡= 𝛼 𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅 + 𝛽 (16)
Em que, 𝛼 = −𝑘𝑎𝐶 − 𝑘𝑑; 𝛽 = 𝑘𝑎𝐶 𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅𝑚𝑎𝑥. Sendo, C: concentração do antígeno em tempo
t ([𝐴] = 𝐶); ΔθSPRmax: o sinal máximo a ser obtido durante as medidas de SPR, o qual é
dependente da concentração inicial do anticorpo, [𝐵]0, (𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅 𝑚𝑎𝑥 [𝐵]0).
Para os dados experimentais, a derivada do ângulo de ressonância com o tempo em
função do ângulo de ressonância (Figura 25) foi obtida a partir das curvas de associação e
dissociação representadas pela Figura 24A.
Figura 25. Gráfico construído a partir da derivada do ângulo de ressonância com o tempo
(dΔθSPR/dt) em função do ângulo de ressonância (ΔθSPR), obtido a partir das curvas de
associação e dissociação ilustradas na Figura 24A.
De acordo com a equação 16 originada do modelo inicialmente proposto, esperava-se obter um
comportamento linear para as diferentes concentrações de anticorpos anti-C1 adicionadas sobre
antígeno C1/PAMAM(G4)/SAM/Au. Entretanto, ao analisar as curvas ilustradas na Figura 25
dois comportamentos distintos foram observados. Em baixas concentrações de anticorpos e,
93
consequentemente, para menores ΔθSPR e baixas velocidades, um comportamento linear foi
verificado sobre toda a curva (Figura 25). Por outro lado, para maiores concentrações de
anticorpos e, portanto, para maiores ΔθSPR e elevadas velocidades, um comportamento não
linear do tipo quadrático foi observado (Figura 25).
Esse comportamento sugeriu que o mecanismo até então proposto (ligação do
anticorpo a um único epítopo do antígeno), não representou o comportamento experimental em
sua totalidade, sugerindo fortemente a presença de outra reação elementar que possa contribuir
para a cinética de interação. Desta forma, foi proposta uma adaptação no mecanismo cinético
para descrever a interação entre o antígeno e o anticorpo. Então, uma segunda etapa elementar
foi sugerida com a ligação do anticorpo anti-C1 em um segundo epítopo do antígeno C1. Esta
segunda ligação levou a formação do complexo representado por ABB, e uma nova etapa de
reação foi inserida (equação 17):
𝐴 + 𝐵 ⇌ 𝐴𝐵 (10)
𝐴𝐵 + 𝐵 ⇌ 𝐴𝐵𝐵 (17)
Sendo as equações 10 e 17 representantes da primeira e segunda etapa da reação,
respectivamente. As constantes de equilíbrio de dissociação foram descritas como:
𝐾𝐷1 =𝑘𝑑1
𝑘𝑎1=
[𝐴][𝐵]
[𝐴𝐵] (18)
𝐾𝐷2 =𝑘𝑑2
𝑘𝑎2=
[𝐴𝐵][𝐵]
[𝐴𝐵𝐵] (19)
em que, [AB]: concentração do complexo antígeno-anticorpo com ligação do anticorpo em um
primeiro sítio de ligação do antígeno; [ABB]: concentração do complexo antígeno-anticorpo
com ligação do anticorpo em um segundo epitopo do antígeno; KD1 e KD2: constantes de
equilíbrio de dissociação para primeira e segunda etapa; kd1 e kd2: constantes cinéticas de
dissociação para primeira e segunda etapa; ka1 e ka2: constantes cinéticas de associação para
primeira e segunda etapa.
De maneira semelhante como descrito anteriormente, as equações cinéticas que
descrevem as velocidades dessas reações podem ser representadas por:
94
𝑑[𝐵]
𝑑𝑡= −𝑘𝑎1[𝐴][𝐵] + 𝑘𝑑1[𝐴𝐵] − 𝑘𝑎2[𝐴𝐵][𝐵] + 𝑘𝑑2[𝐴𝐵𝐵] (20)
𝑑[𝐴𝐵]
𝑑𝑡= 𝑘𝑎1[𝐴][𝐵] − 𝑘𝑑1[𝐴𝐵] − 𝑘𝑎2[𝐴𝐵][𝐵] + 𝑘𝑑2[𝐴𝐵𝐵] (21)
𝑑[𝐴𝐵𝐵]
𝑑𝑡= 𝑘𝑎2[𝐴𝐵][𝐵] − 𝑘𝑑2[𝐴𝐵𝐵] (22)
Levando em consideração que somente os complexos AB e ABB alteram a ΔθSPR, os valores
observados experimentalmente (Figura 24A) podem ser atribuídos pela contribuição individual
de cada interação (ΔθSPR1) e (ΔθSPR2):
𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅 = 𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅1 + 𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅2 (23)
𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅1 [𝐴𝐵] (24)
𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅2 [𝐴𝐵𝐵] (25)
Sendo a taxa de ΔθSPR também descrita pelas contribuições individuais:
𝑑𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅
𝑑𝑡=
𝑑𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅1
𝑑𝑡+
𝑑𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅2
𝑑𝑡 (26)
𝑑𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅1
𝑑𝑡
𝑑[𝐴𝐵]
𝑑𝑡 (27)
𝑑𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅2
𝑑𝑡
𝑑[𝐴𝐵𝐵]
𝑑𝑡 (28)
Uma vez que, 𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅 𝑚𝑎𝑥 [𝐵]0, realizando-se as substituições em (21) e (22) e através de
rearranjos adequados, chegamos às equações diferenciais (29) e (30) que representam a
contribuição da interação AB e ABB, respectivamente:
𝑑𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅1
𝑑𝑡= 𝛼1𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅1
2 + 𝛽1𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅1 + 𝛾1 (29)
sendo, 𝛼1 = 𝑘𝑎2; 𝛽1 = −𝑘𝑎1𝐶 − 𝑘𝑑1 − 𝑘𝑎2 𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅𝑚𝑎𝑥 + 𝑘𝑎2𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅2; 𝛾1 =
𝑘𝑎1𝐶 𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅𝑚𝑎𝑥 − 𝑘𝑎1𝐶𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅2 + 𝑘𝑑2𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅2
95
𝑑𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅2
𝑑𝑡= 𝛼2𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅2 + 𝛽2 (30)
sendo, 𝛼2 = −𝑘𝑎2𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅1−𝑘𝑑2; 𝛽2 = 𝑘𝑎2𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅1 𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅𝑚𝑎𝑥 − 𝑘𝑎2𝛥𝜃𝑆𝑃𝑅12
Analisando as equações 29 e 30 verifica-se que a contribuição da interação AB
(equação 29) exibe um comportamento quadrático enquanto a contribuição da interação ABB
(equação 30) exibe um comportamento linear. Em concordância como os resultados
experimentais e a discussão realizada até aqui acerca da cinética de reação entre o antígeno
recombinante C1 e o anticorpo anti-C1 é possível inferir três condições limites a respeito desta
interação específica:
(1) Em elevadas concentrações de anticorpos a velocidade da interação é elevada e exibe um
perfil quadrático (Figura 25). Isso sugere que a cinética da interação AB representada por
dΔθSPR1/dt (equação 29) é a que mais contribuiu para a taxa de variação total do ângulo de
ressonância (ΔθSPR) para tempos iniciais;
(2) Em tempos prolongados, mesmo em concentrações elevadas de anticorpos, um perfil
próximo do linear foi observado (Figura 25). Isso sugere que a cinética da interação AB atingiu
uma condição de pseudoequilíbrio. Neste instante, a cinética da interação ABB representada
por dΔθSPR2/dt (equação 30) passa a contribuir mais para a taxa de ΔθSPR;
(3) Em baixas concentrações de anticorpos, a velocidade da interação é lenta e exibe um perfil
linear (Figura 25). Isso sugere que a cinética da interação ABB representada por dΔθSPR2/dt
(equação 30) é a que mais contribui para a taxa de ΔθSPR quando baixas concentrações de
anticorpos são adicionadas.
Conforme discutido até o corrente momento, as equações obtidas ajudaram a
explicar o comportamento qualitativo dos resultados experimentais. Neste contexto, visando
um estudo quantitativo através da obtenção dos valores das constantes cinéticas, a soma das
equações 29 e 30 deve ser levada em conta, o que dificulta a obtenção da resolução das equações
diferenciais e ou processos de linearização. 148 Devido a isto, as constantes foram obtidas por
métodos numéricos com auxílio de um software específico para tratamento de dados de SPR
(Trace Drawer, version 1), no qual inúmeros mecanismos de reações foram avaliados, tais
como, modelos envolvendo interações do tipo um para um, interação bivalente, um para dois,
entre outros. Dentre estes mecanismos, aquele que melhor se ajustou aos dados experimentais
(menor valor de chi2: 8,44) foi o modelo baseado na interação bivalente entre antígeno C1 e
anticorpo anti-C1. Os parâmetros cinéticos obtidos do ajuste estão inseridos na Tabela 4.
96
Tabela 4. Parâmetros cinéticos obtidos a partir das curvas de SPR.
ka1 (L mol-1 s-1) kd1 (s-1) KD1 (mol L-1) ka2 (L mol-1 s-1) kd2 (s-1) KD2 (mol L-1)
1,08x105 7,33x10-4 6,79x10-9 2,56x10-1 6,16x100 2,41x101
Analisando criteriosamente estes valores (Tabela 4) observamos que eles estão em
concordância com os mecanismos discutidos sobre a cinética de reação proposta. Conforme
demonstrado, a reação entre essas biomoléculas ocorre em duas etapas (visualizar representação
esquemática em Figura 21).
O elevado valor de ka1 (1,08 x 105 L mol-1 s-1), o baixo valor de 𝑘𝑑1 (7,33 x 10-4 s-1)
e consequentemente, o baixo valor de KD1 (6,79 x 10-9 mol L-1), evidenciaram que a etapa de
formação de AB (equação 10) é a etapa rápida da reação. Isto sugere que inicialmente uma
porção específica do anticorpo anti-C1 se liga fortemente em um dos sítios de ligação do
antígeno C1. Por outro lado, o maior valor de KD2 (2,41 x 101 mol L-1) evidencia que a etapa
rápida da reação é seguida por uma etapa lenta envolvendo a formação de ABB (equação 17).
Isto sugere que tempos maiores são necessários para que outra porção específica do anticorpo
anti-C1 se ligue menos fortemente a um segundo epitopo do antígeno C1. Portanto, o valor da
constante de dissociação de equilíbrio, KD da equação geral (KD1 x KD2: 1,64 x 10-7 mol L-1),
demonstra a elevada afinidade de ligação entre as biomoléculas, quantitativamente inferindo o
forte caráter imunogênico dessa hipotética proteína C1.
Uma vez que o potencial antigênico desta proteína de função desconhecida no
protozoário L. infantum foi cineticamente demonstrado, a próxima etapa consistiu na avaliação
pela SPR da reação entre essa proteínas e soros caninos positivos e negativos para a LV.
5.3.4. Avaliação da imunogenicidade da proteína hipotética C1 frente a amostras
reais
Para estes ensaios, pools de soros caninos positivos e negativos para a LV foram
utilizados, conforme descrito anteriormente na parte experimental. A Figura 26A evidencia as
fases de associação e dissociação características obtidas após adição de soros caninos positivos
para LVC.
97
Figura 26. (A) Sensorgrama evidenciando as etapas de associação e dissociação para a adição
de soros caninos positivos em diferentes diluições (v/v) (1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1:
1600, 1: 3200, 1: 6400 e 1: 12800). (B) Curva analítica obtida do logaritmo da ΔθSPR efetiva
em função do fator de diluição do soro positivo. (C) Representação pelo gráfico de barras dos
valores da ΔθSPR efetiva após injeção de diferentes diluições dos soros caninos positivos e
negativos para a LVC.
0 2 3 5 7 8
0
70
140
210
280
350
SP
R / m
º
Tempo / min
+ 1/50
+ 1/100
+ 1/200
+ 1/400
+ 1/800
+ 1/1600
+ 1/3200
+ 1/6400
+ 1/12800
(A)
1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800
0
20
40
60
80
100
120
SP
R / m
º
Diluição
soros caninos positivos
soros caninos negativos
(C)
-1.5 -2.0 -2.5 -3.0 -3.5 -4.0 -4.5
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
1/12800
Lo
g (
SP
R / m
º )
Log (fator de diluição)
(B)
1/50
98
Como pode ser visto, respostas (ΔθSPR efetiva) para uma ampla faixa de diluições dos soros
(1:50 a 1:12800) foram apresentadas. Para uma mesma diluição (1:1000) o desvio padrão
relativo obtido para essas medidas foi de 6% (n=10). A Figura 26B evidencia a relação linear
obtida a partir do logarítmo da ΔθSPR efetiva em função do fator de diluição do soro canino
positivo.
Para avaliação da especificidade do sensor, soros caninos negativos foram
injetados. Adições destes soros em diluições maiores não foram acompanhadas por ΔθSPR
efetiva em comparação com as respostas obtidas com os soros caninos positivos. Para fácil
comparação, os valores da ΔθSPR efetiva obtidos após a injeção de soros caninos positivos e
negativos para LV estão evidenciados pela Figura 26C. Como pode ser visto, para diluições de
soros mais elevadas, predominam a ligação específica antígeno-anticorpo e uma grande
discriminação entre as respostas positivas e negativas ocorre (Figura 26C).
Para diluições acima de 1:1000 nenhum sinal para o soro canino negativo foi
observado, mas para soros caninos positivos sinais elevados ainda são verificados, sugerindo,
portanto, que amostras mais diluídas devem ser empregadas para a detecção seletiva de
anticorpos da LV. Assumindo-se que a partir da diluição do soro de 1:1000 as respostas
observadas são devidas apenas à interação entre o antígeno C1 de L. infantum e os anticorpos
específicos anti-L. infantum, os valores da ΔθSPR efetiva ilustrados na Figura 26B foram
extrapolados para a curva analítica (Figura 24B) e as concentrações molares desses anticorpos
obtidas. Assim, para as diluições de soros caninos positivos de 1:1600, 1:3200, 1:6400 e
1:12800 as concentrações molares dos anticorpos específicos anti-L. infantum são de
aproximadamente 31,0, 25,8, 17,0, e 13,4 nmol L-1, respectivamente.
Adicionalmente, uma vez que essas mesmas amostras foram utilizadas em ensaios
de ELISA, no qual respostas características para amostras positivas não foram observadas para
um fator de diluição acima de 1:4000, o imunossensor de SPR proposto neste trabalho
apresentou maior sensibilidade em relação ao ensaio convencional. Estes resultados
demonstram a excelente sensibilidade do imunossensor de SPR proposto e confirmam a elevada
afinidade de ligação entre a proteína C1 e os anticorpos anti-L. infantum.
Portanto, em acordo à discussão acima, o forte caráter imunogênico desta proteína
hipotética C1 de L. infantum combinado com a eficiência do PAMAM(G4)/SAM/Au
apresentam-se como um sistema de reconhecimento promissor para ser explorado em
imunodiagnósticos da LV.
99
5.4. CONCLUSÕES PARCIAIS
Nesta fase do trabalho, foi construído com sucesso um imunossensor de SPR
baseado na imobilização de uma proteína de função desconhecida em Leishmania sobre
PAMAM(G4)/CYS-SAM/Au para a detecção de anticorpos específicos da LVC.
A imobilização da proteína recombinante C1 sobre a plataforma multivalente
formada pela combinação da SAM de tiol (cisteamina) e o dendrímero PAMAM(G4) foi
acompanhada pela amplificação do sinal de SPR. Esta observação sugeriu que a estrutura
tridimensional das moléculas do dendrímero forneceu maior área superficial para a interação
com a proteína C1, possibilitando maior número de biomoléculas imobilizadas. Estes
encontrados demonstram elevada eficiência do filme multivalente empregado para construção
do imunossensor de SPR.
O modelo cinético proposto mostrou que a reação entre o antígeno C1 e os
anticorpos anti-C1 ocorre através de uma interação bivalente devido à presença de dois sítios
imunodominantes existentes na proteína para a ligação com o anticorpo. Os valores das
constantes de dissociação de equilíbrio para a primeira e segunda etapa (KD1 = 6,79 x 10-9 mol
L-1 e KD2 = 2,41 x 101 mol L-1), assim como o valor de KD para a reação global (KD1 x KD2: 1,64
x 10-7 mol L-), evidenciaram elevada afinidade de ligação entre as biomoléculas. Em adição, os
baixos limites de detecção (LOD = 7,37 nmol L-1) e quantificação (LOQ = 7,83 nmol L-1)
alcançados pelo imunossensor de SPR demonstram a elevada sensibilidade da metodologia
proposta.
Em relação à avaliação do imunossensor de SPR frente às amostras reais, a adição
de soros caninos positivos em elevadas diluições foi acompanhada por ΔθSPR efetivas. Em
contraste, a adição de soros caninos negativos não apresentou ΔθSPR efetivas em diluições mais
elevadas, sugerindo que amostras mais diluídas devem ser empregadas para a detecção seletiva
de anticorpos. Por fim, o imunossensor de SPR possibilitou análise rápida e não necessitou do
uso de marcadores para a detecção sensível e seletiva de anticorpos anti-L. infantum.
Este estudo demonstrou via abordagem cinética realizada a partir dos resultados
obtidos com um imunossensor de SPR, um forte carácter antigênico (imunogênico) de uma
proteína de função desconhecida no protozoário L. infantum (proteína hipotética C1), e,
consequentemente, a potencial utilização desta proteína no imunodiagnóstico da LV.
100
Design de uma plataforma
multivalente baseada
em Dendron
101
6. SÍNTESE DE MOLÉCULA DO TIPO HS-DENDRON-(PEG-COOH)9 PARA
CONSTRUÇÃO DE UMA PLATAFORMA MULTIVALENTE INÉDITA EM
BIOSSENSORES
6.1. MOTIVAÇÃO PARA REALIZAÇÃO DESTE ESTUDO
Conforme observado nos estudos anteriores, a capacidade de sensoriamento é
fortemente dependente da metodologia adotada para imobilização de biomoléculas, verificando
a viabilidade de plataformas organizadas e multivalentes para construção de biossensores. A
partir destes achados, tornou-se bastante incentivador focarmos na síntese de moléculas inéditas
com características particulares desejáveis para aplicações em biossensores. Com este intuito,
através do desenho de uma molécula supostamente “ideal” para a finalidade de nossos estudos,
nesta parte do trabalho, uma atenção foi voltada à síntese orgânica de um dendron com as
seguintes características estruturais: (1) presença de um grupo tiol (-SH) em seu ponto focal,
conferindo-o elevada afinidade de ligação sobre o ouro, visando, dessa forma, facilitar a
formação de uma plataforma multivalente através da adsorção direta do dendron sobre a
superfície metálica; (2) presença de grupos hidrofílicos em toda sua estrutura, tendo como
propósito conferir elevada solubilidade do dendron em água. Tal fato é de suma importância,
uma vez que permite a manipulação do dendron nas mesmas soluções aquosas utilizadas para
a dissolução das biomoléculas (maior biocompatibilidade); (3) dimensões nanométricas (< 50
nm), uma vez que a sensibilidade dos sensores de SPR e QCM está concentrada nas
proximidades da interface metal-dielétrico; (4) elevada área superficial com grande número de
grupos carboxílicos funcionais terminais para ligação de biomoléculas. A escolha dos grupos
carboxílicos na extremidade do dendron se deve à facilidade de ativação desses grupos
(formação de ésteres reativos) via agentes de acoplamento EDC/NHS previamente à
imobilização de biomoléculas.
Levando-se em consideração todas as características supracitadas, no presente
estudo, foi sintetizado um dendron contendo um grupo tiol em seu ponto focal e nove grupos
ácidos carboxílicos espaçados entre si através de linkers hidrofílicos do tipo glicol (HS-
dendron-(PEG-COOH)9). A síntese orgânica desse dendron foi realizada sob colaboração da
Profa. Dra. Cátia C. C. Ornelas (Laboratório de Síntese Orgânica – Unicamp). Após síntese,
resultados prévios foram obtidos com a utilização do dendron na construção de biossensores.
102
6.2. EXPERIMENTAL
6.2.1. Reagentes e instrumentação
Os reagentes trietilenoglicol, cloreto de tosila (TsCl), azida de sódio (NaN3),
trifenilfosfina (PPh3), trietilamina (Et3N), dicarbonato de di-terc-butila, iodeto de sódio (NaI),
dimetoxietano (DME), nitrometano (MeNO2), t-butil-acrilato, anidrido succínico, HATU (1-
[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium-3-oxid hexa fluorophos-
phate), DIPEA (N,N-diisopropiletilamina) e o catalisador Raney-Ni foram obtidos da Sigma
Aldrich Chemical (St. Louis, MO, EUA). Os demais reagentes e solventes: ácido fórmico
(HCOOH), tioacetato de potássio, ácido trifluoracético (CF3CO2), piridina, carbonato de
potássio (K2CO3), metanol (MeOH), dimetilformamida (DMF), tetraidrofurano (THF),
diclorometano (CH2Cl2), clorofórmio (CHCl3), acetato de etila, hexano e etanol (EtOH) foram
obtidos da LabSynth LTDA (SP, Brasil).
Cada uma das etapas de síntese realizadas neste estudo foi caracterizada através da
espectrometria de ressonância magnética nuclear (1H RMN e 13C RMN, Bruker; modelos
avance III de 250, 400, 500 e 600 MHz) e espectrometria de massas acoplada a UPLC (Waters,
modelo TQD Quattro Micro API).
6.2.2. Síntese do dendron de interesse - HS-DENDRON-(PEG-COOH)9
Todas as etapas envolvidas para síntese do dendron de interesse estão evidenciadas
no esquema a seguir (Figura 27).
Síntese do linker 1 do ponto focal:
NaN3
DMF
Refluxo,
48h
TsCl,
Et3N
CH2Cl2
16h
50º C, 16h
PPh3, THF
CH2Cl2, 16h
(2)
(3) (4)
(1)
103
Síntese do HS-dendron-(PEG-COOH)9 - composto (18):
NaI, DMF,
50ºC, 24h
CF3CO2H
5h, CH2Cl2
linker 1
TsCl,
Et3N
CH2Cl2,
16h (5) (6)
(7) (8)
T
ri
to
n
DME, 75ºC
[H2], Raney-Ni Piridina,
48h 55ºC, 24h
DMF
HATU,
DIPEA
(9)
(10)
(11)
(12)
(13) (14)
HCOOH
16h
[H2], Raney-Ni
55ºC, 24h
104
Figura 27. Esquema evidenciando as etapas envolvidas para síntese de HS-dendron-(PEG-
COOH)9 - composto (18).
HATU, DIPEA, 48h
linker 1 (8)
(15)
(16)
(17)
HCOOH
48h
(18)
K2CO3,
2h
MeOH, CH2Cl2
105
A descrição da reação orgânica, assim como, o procedimento experimental realizado em cada
etapa para síntese do composto (18) serão abordados a seguir.149-154
SÍNTESE DO LINKER 1 DO PONTO FOCAL:
Etapa 1) Síntese do composto (2)
Fórmula química: C13H20O3S
Massa molecular: 304,36 g mol-1
Reação: nesta primeira etapa da síntese, foi realizada uma reação de
dessimetrização através da inserção do grupo tosila a uma das extremidades do composto (1)
(trietilenoglicol) para formação do composto (2) (ver Figura 27).
Procedimento: o composto (1) (trietilenoglicol) (7 mL; 7,8764 g; 0,0524 mol) e
trietilamina (Et3N) (14,60 mL; 10,6158 g; 0,1049 mol) foram dissolvidos em diclorometano
anidro sob atmosfera de N2 e agitação. Em seguida, o sistema foi resfriado a 0°C para adição
gota a gota de uma solução de cloreto de tosila (TsCl) (1 eq; 9,9990 g; 0,0524 mol) dissolvido
em diclorometano anidro (180 mL). A mistura reacional foi mantida a 0°C por 4 horas sob
agitação e, então, em temperatura ambiente por mais 12 horas. Após, foi realizada a
neutralização da solução com HCl (solução aquosa 10%), seguido por sucessivas lavagens com
água (3X), secagem com Na2SO4, filtração e evaporação do solvente sob pressão. A purificação
final foi realizada por coluna cromatográfica (sílica gel) utilizando CH2Cl2/MeOH (99:1) como
eluente. O produto (2) foi obtido como um óleo transparente em um rendimento de 42% (6,7300
g).
Caracterização: RMN de 1H (500 MHz, CDCl3): δ ppm= 7,81 (d, 2H), 7,35 (d,
2H), 4,17 (t, 2H), 3,70 (m, 4H), 3,61 (s, 4H), 3,57 (t, 2H), 2,44 (s, 3H). EM-ESI+ (M) m/z [M]+
para C13H20O6S: 304,36 (calculado), 305,12 (encontrado). ANEXO III (Figura 30).
(2)
106
Etapa 2) Síntese do composto (3)
Fórmula Química: C6H13N3O3
Massa molecular: 175,19 g mol-1
Reação: o grupo tosila presente no composto (2) foi substituído pelo grupo azida
para formação do composto (3) (Figura 27).
Procedimento: o composto (2) (6,7300g; 0,0220 mol)) foi dissolvido em DMF
anidro (30 mL), e azida de sódio (2 eq; 2,8600 g; 0,0440 mol) foi adicionado à solução. A
mistura reacional foi aquecida a 80°C durante 16 horas sob agitação. Posteriormente, o solvente
foi removido sob vácuo, seguido por dissolução da mistura em CH2Cl2 e lavagem com água
(3X). A fase orgânica foi secada com Na2SO4, filtrada e o solvente removido sob vácuo. O
composto (3) foi obtido como um óleo transparente com um rendimento de 87% (3,3787 g).
Caracterização: RMN de 1H (600 MHz, CDCl3): δ ppm = 3,71 (t, 2H), 3,66 (s,
6H,), 3,59 (t, 2H), 3,38 (t, 2H). EM-ESI+ (M) m/z [M]+ para C6H13O3N3: 175, 19 (calculado),
176,59 (encontrado). ANEXO III (Figura 31).
Etapa 3) Síntese do composto (4)
Fórmula Química: C6H15NO3
Massa molecular: 149,19 g mol-1
Reação: redução do grupo azida do composto (3) em grupo amino para a formação
do composto (4) (Figura 27).
Procedimento: no frasco de reação foram adicionados: o composto (3) (0,950 g;
5,42x10-3 mol), trifenilfosfina (PPh3, 1 eq; 1,42 g; 5,4x10-3 mol), água (1,3 eq; 0,1268 g; e
7,046x10-3 mol) e THF (150 mL). A mistura reacional foi aquecida a 50 °C durante 16 horas
sob agitação. Após, o solvente foi removido sob vácuo e a purificação realizada por coluna
cromatográfica (sílica gel) utilizando CH2Cl2/MeOH (99:1) como eluente. O composto (4) foi
obtido com um do óleo transparente com 60% de rendimento (0,2023 g).
(3)
(4)
107
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 3,72 (t, 2H), 3,63 (m,
6H,), 3,57 (t, 2H), 2,88 (t, 2H) EM-ESI+ (M) m/z [M]+ para C6H15NO3: 149,19 (calculado),
150,50 (encontrado). ANEXO III (Figura 32).
Etapa 4) Síntese do composto (5)
Fórmula Química: C11H23NO5
Massa molecular: 249,30 g mol-1
Reação: proteção do grupo amino do composto (4) através da inserção do grupo
terc-butilcarbamato (-BOC), formando o composto (5) (Figura 27).
Procedimento: o composto (4) (0,3960 g; 2,650x10-3 mol) foi dissolvido em DMF
anidro (100 mL), seguido pela adição sucessiva de trietilamina (3 eq; 0,804 g; 7,950x10-3 mol)
e dicarbonato de di-terc-butila (1,2 eq; 0,6360 g; 2,910x10-3 g). A mistura reacional foi mantida
sob agitação em temperatura ambiente durante 16 horas. Após, o solvente foi removido sob
vácuo e o produto purificado por coluna cromatográfica (sílica gel) utilizando como eluente
hexano/acetado de etila (90:10). O composto (5) foi obtido como um óleo transparente com
rendimento de 66% (0,4367 g).
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 3,75 (t, 2H), 3,63 (m,
6H), 3,56 (t, 2H), 3,31 (t, 2H), 1,44 (s, 9H). EM-ESI+ (M) m/z [M]+ para C11H24O5NNa: 272,29
(calculado), 272,14 (encontrado). ANEXO III (Figura 33).
Etapa 5) Síntese do composto (6)
Fórmula Química: C18H29NO7S
Massa molecular: 403,49 g mol-1
Reação: formação do composto (6) através da tosilação da hidroxila presente no
composto (5) (Figura 27).
(5)
(6)
108
Procedimento: o composto (5) (0,900 g; 3,610x10-3 mol) e Et3N (0,025 mL, 0,630
g; 0,0025 mol) foram dissolvidos em diclorometano anidro. A mistura reacional foi resfriada à
0°C para a adição gota a gota de TsCl (5 eq; 3,400 g; 1,80x10-2 mol) previamente dissolvido
em CH2Cl2 (80 mL). O sistema foi mantido a 0°C por 4 horas, e, então, em temperatura
ambiente por mais 12 horas. Em seguida, a mistura foi neutralizada com HCl (solução aquosa
10%), lavada com água (3X), secada com Na2SO4, filtrada e o solvente evaporado sob pressão.
A purificação final foi realizada por coluna cromatográfica, contendo SiO2 como fase
estacionária e CH2Cl2/MeOH (99:1) como eluente. O composto (6) foi obtido como um óleo
transparente com rendimento de 43% (0,6300 g).
Caracterização: RMN de 1H (600 MHz, CDCl3): δ ppm = 7,78 (d, 2H), 7,32 (d,
2H), 4,17 (t, 2H) 3,69 (t, 2H), 3,55 (s, 4H), 3,50 (t, 2H), 3,28 (t, 2H), 2,44 (s, 3H), 1,43 (s, 9H).
ANEXO III (Figura 34).
Etapa 6) Síntese do composto (7)
Fórmula Química: C13H25NO5S
Massa molecular: 307,41g mol-1
Reação: substituição do grupo tosila do composto (6) pelo grupo tioacetato para
formação do composto (7) (Figura 27).
Procedimento: foram adicionados no frasco de reação: o composto (6) (0.189 g,
4.68 x 10-4 mol), NaI (2 eq.; 0.1400 g; 9.37 x 10-4 mol), tioacetato de potássio (2 eq.; 0.1068 g;
9.37 x 10-4 mol) e DMF (15 mL). A mistura reacional foi mantida sob agitação a 50ºC durante
24 horas de reação. Em seguida, o solvente foi removido sob vácuo e o produto purificado por
coluna cromatográfica (sílica gel) utilizando como eluente CH2Cl2/MeOH (99,5:0,5). O
composto (7) foi obtido como um óleo transparente com rendimento de 48,3% (69,5 mg).
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 1,44 (s, 9H), 2,34 (s,
3H), 3,10 (t, 2H), 3,31 (t, 2H), 3,60 (m, 8H). ANEXO III (Figura 35).
(7)
109
Etapa 7) Síntese do composto (8) - (linker 1)
Fórmula Química: C8H17NO3S
Massa molecular: 207,32 g/mol
Reação: desproteção do grupo amino do composto (7) através da eliminação do
grupo terc-butilcarbamato para formação do composto (8) (Figura 27).
Procedimento: o composto (7) (0,0695g; 2,26 x 10-4 mol) foi dissolvido em CH2Cl2,
seguido pela adição de CF3CO2 (1,5eq.; 0,026 mL; 0,0987 g; 3,39x10-4 mol). A mistura
reacional permaneceu sob agitação em temperatura ambiente durante 5 horas. Após tempo de
reação, o produto foi lavado com CH2Cl2 e o solvente evaporado sob vácuo. Em seguida, foram
realizadas sucessivas lavagens com hexano (3X) e, então, a evaporação do solvente sob vácuo.
O composto (8) foi obtido como um óleo transparente com rendimento de 92 % (43,8 mg).
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 2,32 (s, 3H), 3,05 (t,
2H), 3,18 (s, 2H), 3,62 (m, 8H), 3,72 (t, 2H). RMN de 13C (500 MHz, CDCl3): δ ppm = 28,57;
30,62; 39,82; 66,69; 69,78; 70,07; 70,24; 196,04. ANEXO III (Figura 36).
SÍNTESE DO HS-DENDRON-(PEG-COOH)9 - COMPOSTO (18):
Etapa 8) Síntese do dendron (10)
Fórmula Química: C22H39NO8
Massa molecular: 455,62 g mol-1
Reação: Substituição dos hidrogênios do nitrometano (CH3NO2) pelo terc-
butilacrilato para a formação do dendron (10) (Figura 27).
Procedimento: para uma solução de dimetoxietano (DME) foram adicionados DME
(10 mL), nitrometano (MeNO2, 2,85 mL, 3,1561 g; 0,052 mol) e Triton (0,5 mL). A mistura foi
(8)
(10)
110
aquecida até 67ºC e 24 mL de t-butil-acrilato (20,5800 g; 0,1600 mol) foram adicionados gota
a gota. Então, ajustou-se a TºC para 75ºC e quando a temperatura começou a diminuir, o Triton
(0.25 mL) foi adicionado gota a gota e a solução foi aquecida para 75ºC durante 2h. Em seguida,
o solvente foi removido sob vácuo e o resíduo foi dissolvido em CHCl3. A solução resultante
foi lavada com 10% HCl e secada sobre Na2SO4, seguido pela filtração do sistema para remoção
de Na2SO4 e evaporação do solvente sob vácuo. A purificação final foi realizada por
recristalização do cristal em etanol. O dendron (10) foi obtido na forma de um sólido branco
com rendimento de 64,7% (8,97 g).
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 2,20 (s, 12H), 1,44 (s,
27H). ANEXO III (Figura 37).
Etapa 9) Síntese do dendron (11)
Fórmula Química: C22H15NO8
Massa molecular: 277,26 g mol-1
Reação: desproteção dos grupos carboxílicos do dendron (10) para formação do
dendron (11) (Figura 27).
Procedimento: o dendron (10) (2,0248g; 4,44 x 10-3 mol) foi dissolvido em uma
mistura consistindo de ácido fórmico (300 mL) e água (20 mL). O sistema foi deixado para
reagir sob agitação durante 24h à temperatura ambiente. Em seguida, o solvente foi removido
sob vácuo e o sólido lavado cuidadosamente com éter. O dendron (11), foi obtido na forma de
um sólido branco, com rendimento de 88% (1,08g.).
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 2,29 (s). ANEXO III
(Figura 38)
Etapa 10) Síntese do dendron (12)
Fórmula Química: C22H41NO6
(11)
(12)
111
Massa molecular: 415,64 g mol-1
Reação: Redução do grupo nitro do dendron (10) para formação do dendron (12)
(Figura 27).
Procedimento: o composto (10) (0,5041g; 1,11 x 10-3 mol) foi dissolvido em 60 mL
de EtOH, seguido pela adição do catalisador Raney-Ni. Em seguida, a solução foi saturada com
H2(g) e o sistema vedado. A mistura reacional foi colocada à temperatura de 55º C sob agitação,
durante tempo de ração de 24h. Após, a solução foi resfriada até a temperatura ambiente, filtrada
para remover o catalisador e o solvente foi removido sob vácuo. Então, o produto foi dissolvido
em CH2Cl2, filtrado novamente e o solvente evaporado sob vácuo. A purificação final foi
realizada por coluna cromatográfica (sílica gel) utilizando como eluente hexano/acetato de etila
(50:50). O dendron (12) foi obtido como um pó branco com um rendimento de 94 % (0,437g.).
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 2,55 (t, 6H), 1,81 (s,
2H), 1,63 (t, 6H) 1,43 (s, 27H). ANEXO III (Figura 39).
Etapa 11) Síntese do dendron (13)
Fórmula Química: C76H132N4O23
Massa molecular: 1470,12 g/mol
Reação: acoplamento entre os dendrons (11) e (12) para formação do dendron (13)
(Figura 27).
Procedimento: O dendron (11) (0,0404g; 1,46x10-4 mol) foi dissolvido em DMF
(15 mL), seguido pela adição do dendron (12) (4,5 eq.; 0,2724g; 6.55x10-4 mol), HATU (3,3
eq.; 0,1832g; 4,82 x 10-4 mol) e, por fim, adição de DIPEA (6 eq.; 0.15 mL; 0,1132g; 8,76 x
10-4 mol). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 48h. Após, o solvente foi
removido sob vácuo e o produto purificado por coluna cromatográfica (sílica gel) utilizando
hexano/acetato de etila (60:40) como eluente. O dendron (13) foi obtido como pó branco com
rendimento de 92 % (0,197 g).
(13)
112
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 6,13 (s, 3H), 2,20 (t,
24H), 1,95 (t, 18H), 1,72 (s, 6H) 1,43 (s, 81H). ANEXO III (Figura 40).
Etapa 12) Síntese do dendron (14)
Fórmula Química: C76H134N4O21
Massa molecular: 1440,14 g/mol
Reação: redução do grupo nitro do dendron (13) para formação do dendron (14)
(Figura 27).
Procedimento: O dendron (13) (0,138 g; 9,39 x 10-5 mol) foi dissolvido em 60 mL
de EtOH, seguido pela adição do catalisador Raney-Ni. A solução foi saturada com H2(g) e o
sistema vedado e colocado à temperatura de 55º C sob agitação durante tempo de ração de 24h.
Posteriormente, a solução foi resfriada até a temperatura ambiente, filtrada para remover o
catalisador e o solvente foi removido sob vácuo. Então, o produto foi dissolvido em CH2Cl2
para uma nova filtração. Após remoção do solvente sob vácuo, o dendron (14) foi obtido como
um sólido branco com rendimento de 89% (0,120 g).
Caracterização: RMN de 1H (600 MHz, CDCl3): δ ppm = 2,21 (s, 24H), 1,95 (s,
24H), 1,43 (s, 81H). EM-ESI+ (M) m/z [M]+ para C76H134N4:O21: 1440,14 (calculado), 1442,0
(encontrado). ANEXO III (Figura 41).
Etapa 13) Síntese do composto (15)
Fórmula Química: C80H138N4O24
Massa molecular: 1540,22 g mol-1
(14)
(15)
113
Reação: acoplamento entre o dendron (14) e o anidrido succínico para formação do
dendron (15) (Figura 27).
Procedimento: o dendron (14) (113,8 mg; 0,079 mmol) foi dissolvido em 5 mL de
piridina e anidrido succínico (2 eq.; 0.016 g; 0,158 mmol). A solução foi agitada à temperatura
ambiente durante 48h. Após tempo de reação, o produto bruto foi dissolvido em CH2Cl2 e
realizou-se sucessivas adições de água (3X). Em seguida, descartou-se a fase aquosa e o
solvente orgânico foi removido sob vácuo. O dendron (15) foi obtido na forma de um sólido
branco com rendimento de 87,7 % (106,7 mg).
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 1,41 (s, 81H), 1,92 (t,
24H), 2,18 (t, 24 H), 2,37 (m, 2H), 2,62 (m, 2H). ANEXO III (Figura 42).
Etapa 14) Síntese do composto (16)
Fórmula Química: C88H153N5O26S
Massa molecular: 1729,52 g mol-1
Reação: acoplamento entre o composto (8) (linker 1) e o dendron (15) para
formação do composto (16) (Figura 27).
Procedimento: o dendron (15) (78,8 mg; 5,12 x 10-5 mol) foi dissolvido em DMF
(10 mL), seguido pela adição do composto (8) (linker 1) (1,5eq.; 21,0 mg; 1,01x10-4 mol), de
HATU (31,5 eq.; 39,5 mg; 1,04x10-4 mol) e, por fim, adição de DIPEA (3 eq.; 0,1 mL; 2,08
x10-4 mol). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 48h. Em seguida, o solvente
foi evaporado sob vácuo e o produto purificado por coluna cromatográfica (sílica gel) utilizando
hexano/acetato de etila (10:90) como eluente. O dendron (16) foi obtido como um pó branco
com rendimento de 97,3 % (86,1 mg).
(16)
114
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 1,41 (s, 81H), 1,94 (t,
24H), 2,16 (t, 24 H), 2,33 (s, 3H), 2,47 (s, 4H), 3,08 (t, 2H), 3,41 (t, 8H), 3,61 (t, 2H). ANEXO
III (Figura 43)
Etapa 15) Síntese do composto (17)
Fórmula Química: C86H151N5O25S
Massa molecular: 1687,48 g mol-1
Reação: desproteção do grupo tiol do composto (16) para formação do composto
(17) (Figura 27).
Procedimento: o dendron (16) (86,1 mg; 4,98 x 10-5 mol) foi dissolvido em uma
mistura consistindo de MeOH (10 mL) e CH2Cl2 (10 mL). Adicionou-se no meio reacional
K2CO3 (2 eq.; 18,2 mg) e o sistema foi agitado à temperatura ambiente durante 2h. Em
seguida, lavagens foram realizadas com H2O e CH2Cl2 tendo como finalidade dissolver o
produto de interesse na fase orgânica e as impurezas em fase aquosa. Após recuperação da
fase orgânica, sucessivas adições de Na2SO4 foram realizadas até completa limpidez da
solução, seguido por filtração e remoção do solvente sob vácuo. O dendron (17) foi obtido na
forma de um pó branco com rendimento de 90,6 % (76,1 mg).
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 1,42 (s, 81H), 1,94 (t,
24H), 2,16 (t, 24 H), 2,49 (m, 4H), 3,65 (m, 8H). ANEXO III (Figura 44).
(17)
115
Etapa 16) Síntese do composto (18) - HS-dendron-(PEG-COOH)9
Fórmula Química: C50H79N5O25S
Massa molecular: 1182,40 g mol-1
Reação: desproteção dos grupos carboxílicos do composto (17) para formação do
composto (18) (HS-dendron-(PEG-COOH)9) (Figura 27).
Procedimento: dissolveu-se o dendron (17) (76,1 mg; 4,51 x 10-5 mol) em uma
mistura consistindo de MeOH (30 mL) e H2O (3 mL). A solução reacional foi agitada à
temperatura ambiente durante 48 h. Em seguida, o solvente foi removido sob vácuo. O dendron
(18) foi obtido na forma de um sólido branco com rendimento de 90 % (48,0 mg).
Caracterização: RMN de 1H (250 MHz, CDCl3): δ ppm = 1,93 (m, 24H), 2,26 (m,
24H) 2,45 (t, 4H), 3,31 (m, 4H), 3,56 (m, 8H). ANEXO III (Figura 45).
6.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Resultados iniciais foram obtidos com o dendron sintetizado. Em um primeiro
ensaio, foi avaliada in situ via SPR a interação do dendron (18) (HS-dendron-(PEG-COOH)9)
com superfície de ouro. Para estas medidas, soluções aquosas do dendron foram empregadas
(Figura 28). As curvas de SPR (Figura 28A) evidenciam três regiões características: (1)
estabelecimento da linha de base após adição de água; (2) adição de duas concentrações
diferente do dendron; e (3) adição de água para remoção das moléculas fracamente ligadas.
Conforme observado, após etapa de lavagem observou-se apenas uma pequena diminuição no
θSPR, sugerindo que o dendron se liga fortemente sobre a superfície do ouro. A Figura 28B
ilustra as curvas de refletância de SPR, evidenciando através do mínimo de refletividade
observado em cada etapa que o fenômeno de ressonância dos plásmons é mantido mesmo após
a interação do dendron. Estes resultados sugerem a viabilidade do uso do dendron (18) para
construção de biossensores de SPR.
(18)
116
Figura 28. (A) Curvas de SPR ilustrando as etapas envolvidas na interação in situ de duas
diferentes concentrações do dendron (18) (1,0 e 0,75 mmol L-1) com a superfície de ouro. (B)
Curvas de refletância de SPR obtidas em cada etapa durante adsorção do dendron (1,0 mmol
L-1).
Posteriormente, com o intuito de avaliar a versatilidade da plataforma multivalente
formada com o dendron (18), foi realizado o estudo via SPR da imobilização de proteínas de
diferentes naturezas sobre o filme. Para estas análises, deixou-se o dendron (1,0 mmol L-1)
interagir ex situ com a superfície de ouro durante 24 horas. Em seguida, os grupos carboxílicos
terminais do dendron foram ativados via EDC (150 mmol L-1)/NHS (300 mmol L-1) durante 30
minutos, e, então, o substrato modificado foi imediatamente colocado no equipamento de SPR.
(A)
0 20 40 60 80
0
100
200
300
SP
R / m
0
Tempo / min
Dendron:
0,75 mmol L-1
1,0 mmol L-1
-2000 -1000 0 1000 20000
10
20
30
40
50
Refl
etâ
ncia
(%
)
SPR
/ mº
antes da adsorção
durante a adsorção
após etapa de lavagem
1,0 mmol L-1 dendron(B)
117
A Figura 29 evidencia os resultados obtidos durante a imobilização das seguintes proteínas:
uma imunoglobulina padrão (IgG, Figura 29A), uma proteína com sítio de reconhecimento a
carboidratos (galectina-3 ou Gal-3, Figura 29B), um marcador cardíaco (proteína C reativa ou
CRP, Figura 29C) e um antígeno recombinante de L infantum (K39, Figura 29D).
Figura 29. Curvas de SPR ilustrando a imobilização de diferentes proteínas: IgG (A), Gal-3
(B), CRP (C) e K39 (D) sobre o dendron (18) previamente ativado via EDC/NHS.
Os resultados evidenciados demonstram que todas as proteínas avaliadas foram
eficientemente imobilizadas sobre o dendron (18), sugerindo elevada versatilidade dessa
plataforma multivalente inédita para construção dos biossensores de SPR.
0 120 240 360 480 600
0
50
100
150
200
250(A) IgG
SP
R / m
º
Tempo / s
IgG 100 g mL-1
IgG 50 g mL-1
0 150 300 450 600
0
8
16
24
32 Gal-3(B)
SP
R / m
0
Tempo / s
Gal-3 (500 g mL-1)
0 150 300 450 600
0
50
100
150
200
250(D) K39
SP
R / m
0
Tempo / s
K39 (50 g mL-1)
0 120 240 360 480 600
0
50
100
150
200
250CRP(C)
SP
R / m
º
Tempo / s
CRP (50 g mL-1)
(A)
(C)
(B)
(D)
118
6.4. CONCLUSÕES PARCIAIS
As etapas necessárias para obtenção da molécula HS-dendron-(PEG-COOH)9
(composto (18)), foram sintetizadas e caracterizadas com sucesso. Em seguida, os estudos
iniciais em relação à aplicação desse dendron na construção de biossensores de SPR mostraram-
se bastante promissores.
Através da avaliação in situ via SPR da interação do HS-dendron-(PEG-COOH)9
com a superfície de ouro, variações significativas no θSPR evidenciaram o sucesso da ligação do
dendron, sugerindo elevada afinidade de ligação da molécula com o ouro. Durante esta etapa,
também foi observado mediante as curvas de refletância de SPR que o mínimo da refletividade
foi mantido durante adsorção do dendron, demonstrando a viabilidade de aplicação dessa
macromolécula em biossensores de SPR.
Proteínas de diferentes naturezas foram imobilizadas com sucesso sobre o dendron
via agentes de acoplamento EDC/NHS, sugerindo elevada versatilidade da plataforma
multivalente formada pelo dendron.
Portanto, esses resultados iniciais abrem boas perspectivas em termos de aplicação
desse dendron inédito sintetizado, justificando nosso interesse em aprofundarmos os estudos
com essa molécula nas próximas etapas.
6.5. PERSPECTIVAS FUTURAS
As técnicas de SPR e QCM serão empregadas visando a obtenção de informações
precisas na caracterização in situ dos filmes formados com o dendron mediante o
monitoramento dos processos envolvidos em suas etapas de construção. Será mensurada a
afinidade pelo substrato metálico do dendron sintetizado, bem como, o estabelecimento da
cobertura superficial desse sistema multivalente (efeito do volume molecular).
A técnica de SPR multiparamétrica (MP-SPR, Oy BioNavis Ltd., Tampere,
Finlândia), será utilizada para obtenção de curvas de refletância de SPR em diferentes
comprimentos de onda (λ). Essas curvas serão quantitativamente descritas através de resoluções
das equações de Fresnel para a determinação simultânea do índice de refração (n) e espessura
(d) dos filmes ultrafinos formados (d < 50 nm). Sendo esta, particularmente, uma abordagem
ainda pouco difundida na literatura, uma vez que são poucos os instrumentos de SPR que
permitem análises em dois ou mais λ.
119
A topologia das superfícies será avaliada através da Microscopia de Força Atômica
(AFM, do inglês Atomic Force Microscopy) no intuito de obter informações sobre a densidade
e uniformidade das camadas orgânicas. Também se pretende pela AFM determinar a espessura
(d) dos filmes formados e comparar estes resultados com os obtidos pela técnica de MP-SPR.
Para auxiliar na construção de um modelo sobre a isoterma de adsorção do dendron
(18) sobre o substrato metálico, medidas de ângulo de contato serão realizadas. Além disso,
informações sobre a capacitância desses filmes e a sua resistência à transferência de carga serão
obtidas pela técnica de EIS.
Concluída a etapa de construção e caracterização dos filmes nanoestruturados
formados, subsequentemente serão avaliados os conceitos de multivalência e mensurado a
afinidade de ligação de biomoléculas (diferentes proteínas de L. infantum, por exemplo) sobre
o dendron (18). Outra abordagem a ser avaliada com o dendron será voltada à sua combinação
com nanopartículas metálicas, apresentando-se estas como um “elo” na busca do aumento de
sensibilidade da interface.
Espera-se que devido a estrutura construída de forma mais controlada desse
dendron, o mesmo apresente propriedades vantajosas, de forma a possibilitar a construção de
imunossensores com sensibilidades e seletividades cada vez mais elevadas. Tendo como
finalidade, portanto, o desenvolvimento de metodologias inéditas e mais eficientes em
comparação às metodologias empregadas nos estudos anteriores.
120
Considerações finais e perspectivas
sobre os estudos realizados
121
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS SOBRE OS ESTUDOS
REALIZADOS NESTA TESE
As principais contribuições científicas dos estudos realizados nesta tese de
doutorado estão sumarizadas a seguir.
Foi possível demonstrar a eficiência de plataformas organizadas formadas por
SAMs de alcanotióis combinadas com dendrímeros do tipo PAMAM para imobilização de
proteínas recombinantes de L. infantum na construção dos imunossensores de SPR e QCM. Em
relação aos filmes nanométricos avaliados, o destaque maior pode ser atribuído à síntese
orgânica de um dendron inédito do tipo HS-dendron-(PEG-COOH)9 e sua aplicação na
construção dos biossensores. Foi possível formar uma plataforma multivalente através da
interação direta do dendron sobre superfície de ouro, consistindo em uma nova metodologia
para funcionalização de superfícies metálicas.
Outro ponto a ser destacado, refere-se à metodologia adotada para mensurar
simultaneamente a espessura e o índice de refração de proteínas. Através da técnica de MP-
SPR foi possível trabalharmos com dois comprimentos de onda (670 e 785 nm) para esse
propósito, obtendo uma excelente precisão dos resultados. Neste sentido, estamos sugerindo e,
portanto, contribuindo, com uma nova abordagem para avaliar de forma simultânea a espessura
e o índice de refração de proteínas sobre superfícies metálicas.
Os biossensores desenvolvidos possibilitaram detecção livre de marcação e análises
mais rápidas, sensíveis e seletivas de anticorpos da LV em comparação às análises obtidas pelos
ensaios convencionais. Portanto, pode-se afirmar seguramente que novas e bem estabelecidas
metodologias foram desenvolvidas para o imunodiagnóstico da LV. Neste contexto, uma
perspectiva bastante promissora está centrada na aplicação dessas metodologias em dispositivos
miniaturizados e de baixo custo, os quais permitiriam a real aplicação em campo (áreas
endêmicas da LV, por exemplo) dos biossensores de SPR e QCM.
Uma outra vertente a ser destacada está voltada à viabilidade dos estudos cinéticos
realizados via os imunossensores de SPR e QCM, através dos quais foi possível demonstrar
quantitativamente a elevada afinidade de ligação (intenso caráter imunogênico) de proteínas
recombinantes inéditas frente a anticorpos da LV. Os resultados destes estudos, somados aos
resultados obtidos em ensaios de ELISA, evidenciaram vantagens a serem alcançadas pelo
emprego dessas proteínas no diagnóstico sorológico da LV.
122
Através de uma abordagem cinética sobre o mecanismo de reação entre uma
proteína hipotética (antígeno C1) e anticorpos da LV, foi possível sugerir como ocorre essa
interação. Tais resultados vêm a contribuir para uma melhor compreensão desses sistemas a
nível molecular.
Em termos gerais, os resultados obtidos neste trabalho de tese de doutorado são
substanciais para contribuição significativa no diagnóstico e programas de controle da
leishmaniose visceral.
123
Referências
bibliográficas
124
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
(1) Herwaldt, B. L. Lancet 1999, 354, 1191.
(2) Alvar, J.; Velez, I. D.; Bern, C.; Herrero, M.; Desjeux, P.; Cano, J.; Jannin, J.;
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(3) No, J. H. Acta Tropica 2016, 155, 113.
(4) Smith, D. F.; Peacock, C. S.; Cruz, A. K. International Journal for Parasitology
2007, 37, 1173.
(5) Loeuillet, C.; Banuls, A.-L.; Hide, M. Parasites & Vectors 2016, 9.
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H. M.; Damos, F. S.; Kubota, L. T. Biosensors & Bioelectronics 2015, 70, 275.
(147) Sabatani, E.; Rubinstein, I. Journal of Physical Chemistry 1987, 91, 6663.
(148) Morton, T. A.; Myszka, D. G.; Chaiken, I. M. Analytical Biochemistry 1995,
227, 176.
132
(149) Astruc, D.; Boisselier, E.; Ornelas, C. Chemical Reviews 2010, 110, 1857.
(150) Astruc, D.; Ornelas, C.; Liang, L.; Diallo, A. K.; Rapakousiou, A.; Djeda, R.;
Ruiz, J. Abstracts of Papers of the American Chemical Society 2011, 242.
(151) Ornelas, C.; Aranzaes, J. R.; Cloutet, E.; Alves, S.; Astruc, D. Angewandte
Chemie-International Edition 2007, 46, 872.
(152) Ornelas, C.; Pennell, R.; Liebes, L. F.; Weck, M. Organic Letters 2011, 13, 976.
(153) Ornelas, C.; Broichhagen, J.; Weck, M. Journal of the American Chemical
Society 2010, 132, 3923.
(154) Ornelas, C.; Weck, M. Chemical Communications 2009, 5710.
133
ANEXO I
134
ANEXO II
135
ANEXO III
Composto (2)
Figura 30. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) do composto (2).
d c e
a
b
c
d
e f
a
b c d
g f
g
136
Composto (3)
Figura 31. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 600MHz) do composto (3).
a b d
b
d c
c c
a
c
137
Composto (4)
Figura 32. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250MHz) do composto (4).
a
a b
b
c
c
c
c
d
d e
e
138
Composto (5)
Figura 33. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250MHz) do composto (5). Os picos 5,29 ppm,
2,96 ppm e 2,88 ppm são referentes a traços de CH2Cl2 e DMF.
a
a
b
b
c
c
d
d d
e
d e
139
Composto (6)
Figura 34. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 600MHz) do composto (6). O pico 5,29 ppm é
referente a traços de CH2Cl2.
a
a
b
b
c
c
d
d
e
e
e
f
f
g
g
h i
h i
140
Composto (7)
Figura 35. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (7).
a a
b
b
c
c
d
d
e
e e
e e
141
Composto (8)
Figura 36. (A) Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (8). (B) Espectro de
RMN de 13C (CDCl3, 500 MHz) do composto (8), o pico em 77,16 ppm refere ao CDCl3.
a
a
b
b
c
c
d d
d d
e
e
d
a a
b c
b d e d d
d d
e
f
f
142
Composto (10)
Figura 37. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (10).
a
a a
a
b
b b
H2O
143
Composto (11)
Figura 38. Espectro de RMN de 1H (CD3OH, 250 MHz) do composto (11). Os picos 3,31 ppm
e 4,88 ppm são referentes a traços de CH3OH e H2O, respectivamente.
a
a a
144
Composto (12)
Figura 39. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (12).
EtOH
a
a a
a
b c
d EtOH
c b d
145
Composto (13)
Figura 40. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (13).
a
a
b
b
c
c
d
d
e
d
e
146
Composto (14)
Figura 41. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (14).
a a
b c
b c
b c
147
Composto (15)
Figura 42. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (15).
c b
b c
a
e
d
a
b c d e
148
Composto (16)
Figura 43. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (16).
a
a
b
b c
c d e f g h
b c d e
e
f
g
h h
h h
149
Composto (17)
Figura 44. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 250 MHz) do composto (17).
a a
b
b
b
c
c
c e
d
d
d
e e
e
e
150
Composto (18)
Figura 45. Espectro de RMN de 1H (MeOD, 250 MHz) do composto (18).
b
b
a
a c
c
H2O
a b c
e e e e
e
d
d
d