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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

MAURO PEDROMÔNICO ARRYM

Avaliação da resposta antimicobacteriana

de linfócitos T Citotóxicos e Gama-Delta

em jovens brasileiros verticalmente infectados pelo HIV

em Terapia Antirretroviral Combinada efetiva

CAMPINAS

2017

MAURO PEDROMÔNICO ARRYM

Avaliação da resposta anti-micobacteriana de

linfócitos T Citotóxicos e Gama-Delta

em jovens brasileiros verticalmente infectados pelo HIV

em Terapia Antirretroviral Combinada efetiva

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas

como parte dos requisitos exigidos para a

obtenção do título de Mestre em Ciências na área de

concentração Saúde da Criança e do Adolescente.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcos Tadeu Nolasco da Silva

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Carlos Emilio Levy

CAMPINAS

2017

Dedico este trabalho a todas as pessoas presentes em minha vida:

Minha família, por sempre me inspirar e dar forças.

Meu pai, pelo exemplo de pessoa que é.

Minha mãe (sempre presente), pelo exemplo de mulher e mãe que foi.

Meu irmão, pelo incentivo e confiança.

Minha avó, Elizabeth, minha segunda mãe, por todo o carinho e cuidado.

Minha namorada, por estar ao meu lado em todos os momentos e sempre me apioar.

Meus amigos, por sempre tentarem me acalmar com risadas e conversas

AGRADECIMENTO

Gostaria de iniciar meus agradecimentos por Deus, por ter chego até aqui,

por toda a força concedida para a concretização de um sonho e por colocar

pessoa tão incríveis e especiais na minha vida. Sem todos, esse sonho não seria

concretizado.

Ao Prof. Dr. Marcos Tadeu Nolasco da Silva e Prof. Dr. Carlos Emilio Levy,

pela confiança, disponibilidade, oportunidade de trabalhar ao lado dos senhores

e todo o ensinamento. Por terem me recebido e aberto as portas da Universidade

para que eu pudesse realizar esse trabalho e um sonho. Obrigado pelas

conversas e conselhos.

Ao Dr. Fernando Guimarães, por ter aberto a porta de seu laboratório e

disponibilizado implementos essenciais para o desenvolvimento de nosso

trabalho. Muito obrigado pela disponibilidade, amizade e confiança.

Aos meus pais, Marcus Geraldes Arrym e Márcia Regina Marcondes

Pedromonico (sempre presente), meu infinito agradecimento. Por sempre

acreditarem em mim e na minha capacidade. Obrigado por toda a educação, por

todo o apoio e suporte dado nesses anos. Vocês são o motivo para que eu

sempre de o melhor de mim em tudo. Sem os senhores, nada disso seria

possível. Obrigado por tudo.

Ao meu irmão, Tiago Pedromonico Arrym, por sempre me apoiar e se

orgulhar de mim. Saiba que tenho uma admiração imensa por você e sempre

serei seu maior fã. Conte sempre comigo. Obrigado pela confiança.

À Talita Bianchi Aiello, minha namorada, que sempre esteve ao meu lado,

me apoiando, incentivando e me ajudando a superar meus limites. Sua presença

foi essencial em toda minha trajetória nesses anos. Obrigado pelo seu

companheirismo, amizade, paciência, compreensão, apoio e amor.

À minha família como um todo, avós, tios, tias, primas, por sempre me

apoiarem e sempre estarem ao meu lado. Vocês são meu maior bem, sem o

apoio de cada um, meu sonho não se tornaria realidade. Obrigado pelo amor

incondicional.

Aos integrantes do Grupo HIV/TB do Centro de Investigação em Pediatria

(CIPED), Mariana, Paulo, Tais, por toda a paciência, cooperação, amizade,

angustias e ensinamentos compartilhados. Meus companheiros do dia-a-dia que

sempre estarão comigo.

Aos funcionários do Setor de parasitologia do HC/Unicamp, Angela, Celia,

José Sergio e Sueli, por sempre me apoiarem nessa trajetória. A amizade de

vocês foi muito importante, assim como todos os conselhos.

Aos meus amigos, por sempre estarem comigo em todos os momentos,

me apoiando e fazendo eu me distrair com muitas risadas.

Agradeço a todos os pacientes do Hospital de Clinicas da Unicamp

(HC/Unicamp) e aos controles que participaram espontaneamente deste

trabalho. Por conta deles está dissertação pode ser concluída. Obrigado pela

confiança.

Aos funcionários do HC/Unicamp, médicos e enfermeiros, em especial à

Dra. Renata e ao Dr. Lucas, que sempre se mostraram dispostos a ajudar a

coletar o material e recrutar os integrantes deste trabalho.

Agradeço a CAPES e a FAPESP, pelo auxílio financeiro.

RESUMO

INTRODUÇÃO E OBJETIVO: Estimativas recentes avaliam que um terço da população mundial são portadores do bacilo e que cerca de 10,4 milhões de novos casos de tuberculose ocorrem anualmente em todo o mundo, dos quais 86 mil no Brasil. A infecção pelo HIV prejudica os mecanismos adaptativos da imunidade celular. O controle virológico de longa duração por terapia anti-retroviral combinada (TARC) reduz o risco de infecção por micobacterianos. Os linfócitos T Gama-Delta (γδ) podem adquirir a capacidade de processar e apresentar antígenos. Na tuberculose, podem desempenhar diversos papéis na resposta imunológicas, como produzir citocinas inflamatórias e ação citolítica. Com base nesse cenário, nosso estudo teve como objetivo avaliar a capacidade de produção de grânulos citotóxicos, expressão de fenótipo de apresentação de antígeno e ativação celular, em resposta a antígenos micobacterianos, por linfócitos T CD8+ e γδ, em jovens infectados pelo HIV por transmissão vertical, vacinados por BCG.

MÉTODO: Foi realizado um estudo analítico, prospectivo, observacional, do tipo corte transversal. Foram recrutados 20 indivíduos, entre 16 e 23 anos, no ambulatório de Imunodeficiência secundária do HC/Unicamp e 20 voluntários saudáveis com idade comparável. Foram realizadas culturas celulares não estimuladas, estimuladas por fitohemaglutinina e antígenos micobacterianos (BCG e Mycobacterium tuberculosis – Mtb). Essas culturas foram marcadas com anticorpo CD107a (marcador de degranulação), HLA-DR+CD80+CD86 (fenótipo de células apresentadoras de antígenos).

RESULTADOS: A expressão de CD107a de células T γδ em resposta a antígenos micobacterianos foi semelhante entre grupos e menor no grupo HIV em resposta a fitohemaglutinina. No grupo HIV, a expressão basal de HLA-DR foi maior e a expressão estimulada por antígeno Mtb foi maior nos linfócitos T CD8+. Especificamente no grupo de pacientes infectados pelo HIV, observou-se maior expressão de CD107a em resposta à fitohemaglutinina no grupo com imunossupressão grave.

CONCLUSÃO: A produção de grânulos citotóxicos semelhante em células T CD8+ e células T γδ, quando comparada a controles saudáveis, pode representar a preservação imunológica de longo prazo com reconstituição imune sob a TARC bem-sucedida. No entanto, as diferenças na expressão de HLA-DR podem representar inflamação em curso e respostas mais baixas específicas em jovens infectados pelo HIV. Essas características podem ser relevantes no contexto da precocidade e gravidade da infecção pelo HIV adquirida verticalmente.

Palavras-chaves: HIV; BCG; tuberculose; imunidade celular

ABSTRACT

BACKGROUND: Recent estimates evaluate that one-third of the world's population are carriers of the bacillus, and that around 10.4 million new cases of tuberculosis occur annually around the world, of which 86,000 in Brazil. HIV infection harms the adaptive mechanisms of cellular immunity. Long-term virological control by combination anti-retroviral therapy (TARc) reduces the risk of mycobacterial infection. Gamma-Delta T lymphocytes (γδ) may acquire the ability to process and present antigens. In tuberculosis, they may play several roles in the immune response, such as producing inflammatory cytokines and cytolytic action. Based on this scenario, our study aimed to evaluate the capacity of production cytotoxic granules, expression of antigen presenting phenotype and cellular activation in response to mycobacterial antigens by CD8+ and γδ T lymphocytes in young infected by HIV by vertical transmission, vaccinated by BCG.

METHODS: A prospective cross-sectional study was conducted. Twenty individuals, aged 16-23, were recruited at the Pedriatric Immunodeficiency Outpatient Unit at the State of University of Campinas (Unicamp) Hospital (Campinas, Brazil) and 20 healthy volunteers of comparable age. Cell cultures stimulated by phytohemagglutinin and mycobacterial antigens (BCG and Mycobacterium tuberculosis – Mtb) or negative control were performed. These cultures were marked with CD107a antibody (degranulation marker), HLA-DR+CD80+CD86 (antigen presenting cell phenotype).

RESULTS: CD107a expression of γδ T cells in response to mycobacterial antigens was similar between groups and lower in the HIV group in response to phytohemagglutinin. In the HIV group, the baseline expression of HLA-DR was higher and Mtb antigen-stimulated expression was higher, too. Specifically in the group of HIV-infected patients, greater expression of CD107a was observed in response to phytohemagglutinin in the group with severe immunosuppression.

CONCLUSION: Similar cytotoxic granule production in CD8+ T cells and γδ T cells, when compared to healthy controls, may represent long-term immune preservation with immune reconstitution under successful CART. However, differences in HLA-DR expression may represent ongoing inflammation and specific lower responses in HIV-infected youngsters. These characteristics may be relevant in the context of the precocity and severity of vertically acquired HIV infection.

Keywords: HIV; BCG; tuberculosis; celullar immunity

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Quadro 1: Classes de antirretrovirais disponíveis no Brasil para o tratamento de

crianças e adolescentes (adaptado de BRASIL, 2014). ................................... 22

Figura 1: Áreas delimitadas (representadas por números) da Câmara de

Neubauer.......................................................................................................... 29

Figura 2: Estratégia de análise de para o ensaio de Produção de grânulos

citotóxicos......................................................................................................... 32

Figura 3: Estratégia de análise de para o ensaio de Fenótipo de Celulas

Apresentadoras de antígeno. ........................................................................... 33

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Anticorpos utilizados para a marcação de superfície, quantidade

(µL/tubo) e fluorocromos. ................................................................................. 31

Tabela 2: Dados demográficos e laboratoriais dos pacientes infectados por HIV

e controles saudáveis ....................................................................................... 35

Tabela 3: Dados clínicos e imunológicos específicos do grupo de pacientes

infectados pelo HIV. ......................................................................................... 38

Tabela 4: Dados demográficos e laboratoriais no grupo de pacientes infectados

pelo HIV, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus

imunodeficiência grave ..................................................................................... 39

Tabela 5: Distribuição da expressão de CD80++CD86+ nas populações de

células HLA-DR+, nos linfócitos T γδ de controles e pacientes infectados por HIV

......................................................................................................................... 41

Tabela 6: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T CD8+ de

pacientes infectados por HIV e controles ......................................................... 42

Tabela 7: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T γδ de


Tabela 8: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T CD8+, nos


Tabela 9: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T γδ, nos


Tabela 10: Distribuição da expressão de CD80++CD86+ nas populações de

células HLA-DR+, nos linfócitos T γδ de pacientes infectados por HIV

comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência

grave ................................................................................................................ 45

Tabela 11: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T CD8+ de

pacientes infectados por HIV e controles, comparando-se imunodeficiência

ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ..................................... 46

Tabela 12: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T γδ de



Tabela 13: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T CD8+, nos



Tabela 14: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T γδ, nos



LISTA DE ABREVIAÇÕES

Mtb – Mycobacterium tuberculosis

Tb – Tuberculose

LTBI – Tuberculose latente

LAM – Lipoarabinomanana

TLR2 – Toll-Like Receptor 2

APC – Células apresentadoras de antígeno

ESAT-6 – Early Secreted Antigenic target of 6 kDA

CFP-10 – Culture filtrate protein of 10 kDA

Th-1 – T-helper 1

IFN-γ – Interferon Gama

IL-4 – Interleucina 4


MHC-I – Complexo de Histocompatibilidade I

MHC-II – Complexo de Histocompatibilidade II

TNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa



TCR-γδ – T cell Receptor Gamma Delta

HMBPP – (E)-4-hydroxi-3-metil-but-2-enil pirofosfato

BCG – Bacilo de Calmette e Guerín

HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana

AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

NK – Células Natural Killer

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 15

2. OBJETIVO .................................................................................................... 27

3. HIPÓTESE (enunciada na forma nula, ou H0) ............................................. 27

4 MÉTODOS .................................................................................................... 27

4.1 Modelo do estudo ................................................................................... 27

4.2. População, local e período do estudo .................................................... 28

4.4. Procedimentos ....................................................................................... 30

4.4.1 Hemograma, Imunofenotipagem de sangue periférico e Carga Viral do

HIV-1 ............................................................................................................ 30

4.4.2 Obtenção dos antígenos utilizados nos ensaios .................................. 30

4.4.3 Separação de Celulas Mononucleares do Sangue Periférico (CMSP) por

gradiente de densidade Ficoll-paque ............................................................ 31

4.4.4 Contagem de CMSP em câmara de Neubauer ................................... 32

4.4.7 Marcação de Anticorpos de superfície ................................................. 34

4.4.8 Estratégia de Análise para o ensaio de Produção de Grânulos Citotóxicos

...................................................................................................................... 36

4.4.9 Estratégia de Análise para o ensaio de Fenótipo de Células

Apresentadoras de Antígeno ........................................................................ 37

4.5. Variáveis ................................................................................................ 38

4.5.1 Variáveis dependentes. ....................................................................... 38

4.5.2 Variáveis independentes ...................................................................... 39

4.6. Análise Estatística ................................................................................. 39

5. RESULTADOS ............................................................................................. 39

5.1 Dados demográficos da população de estudo ........................................ 39

5.2. Dados específicos ligados ao histórico de infecção pelo HIV no grupo de

pacientes. ..................................................................................................... 42

5.3. Comparação de subpopulações linfocitárias entre as categorias

imunológicas consolidadas 1+2 (imunossupressão ausente ou moderada) e 3

(imunossupressão grave). ............................................................................ 44

5.4 Comparação entre marcadores celulares em linfócitos T γδ e T CD8+ -

pacientes e controles .................................................................................... 46

5.4.1 Comparação entre Fenótipo de Células Apresentadoras de Antígeno nos

linfócitos T γδ – pacientes e controles .......................................................... 46

5.4.2 Comparação entre marcadores de ativação celular nos linfócitos T CD8+

e γδ – pacientes e controles ......................................................................... 47

5.4.3 Comparação na expressão de CD107a nos linfócitos T CD8+ e γδ –

pacientes e controles .................................................................................... 48

5.5 Comparação entre marcadores celulares em linfócitos T γδ e T CD8+ no

grupo de pacientes – gravidade de comprometimento imunológico. ............ 49

5.5.1 Comparação entre Fenótipo de Células Apresentadoras de Antígeno nos

linfócitos T γδ – imunodeficiência ausente ou moderada versus

imunodeficiência grave ................................................................................. 50

5.5.2 Comparação entre marcadores de ativação celular nos linfócitos T CD8+

e γδ – imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave

...................................................................................................................... 50


imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ...... 52

6. DISCUSSÃO ................................................................................................ 54

7. CONCLUSÃO ............................................................................................... 58

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 59

ANEXO 1 ...................................................................................................... 67

ANEXO 2 ...................................................................................................... 72

ANEXO 3 ...................................................................................................... 75

ANEXO 4 ...................................................................................................... 77

ANEXO 5 ...................................................................................................... 78

ANEXO 6 ...................................................................................................... 80

ANEXO 7 ...................................................................................................... 81

ANEXO 8 ...................................................................................................... 84

15

1 INTRODUÇÃO

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o patógeno causador da tuberculose,

(TB) é um microorganismo dotado de múltiplas estratégias evolutivas de

disseminação, invasão, patogenicidade e sobrevivência no hospedeiro humano,

sendo considerado por alguns autores o patógeno mais bem sucedido para

afetar nossa espécie1. Estimativas recentes avaliam que um terço da população

mundial são portadores do bacilo e que cerca de 10,4 milhões de novos casos

de TB ocorrem anualmente em todo o mundo, dos quais 86 mil no Brasil. Apesar

da disponibilidade de um tratamento eficaz, a letalidade da tuberculose é alta,

com cerca de 1.400.000 mortes por ano, globalmente. No contexto das doenças

infecciosas, Mtb é atualmente o patógeno de maior letalidade global. O Brasil

atualmente ocupa o décimo nono lugar, entre os 22 países em desenvolvimento,

que abrigam 82% dos casos de TB no mundo2.

O Mtb aflige a humanidade há milênios. Lesões características da

tuberculose foram identificadas em múmias egípcias. O isolamento do bacilo,

passo decisivo para o progresso na compreensão dos mecanismos de doença,

diagnóstico e tratamento, ocorreu em 1882, graças à determinação de Robert

Koch3. O bacilo faz parte do chamado complexo do Mtb onde estão incluídas

outras cinco espécies de bactérias causadoras da doença, quatro delas capazes

de infectar humanos.

A via principal de infecção pelo Mtb é a transmissão da bactéria pelo

aerossol proveniente das secreções respiratórias de pessoas doentes. A história

natural da TB em pediatria demonstra que o risco de progressão para TB, após

a exposição, varia com a idade. No primeiro ano de vida, cerca de 50% das

crianças expostas progridem para doença. Este risco se reduz para 20% a 30%

no segundo ano, 5% entre 3 e 5 anos, e 2% entre 5 e 10 anos. Adolescentes e

adultos jovens apresentam risco semelhante, em torno de 5%4.

O risco de desenvolver TB após a infecção é determinado por diversos

fatores, que incluem a idade em exposição, estado nutricional e imunológico,

fatores genéticos, virulência do bacilo e a magnitude do inóculo inicial. Crianças,

16

idosos ou pessoas portadoras de imunodeficiências possuem maior risco de

desenvolver doença grave ou disseminada5.

A TB pode evoluir de diversas maneiras. Em quase todos os casos o

complexo primário da infecção se estabelece no pulmão, tendo como porta de

entrada os macrófagos alveolares. A forma mais comum de apresentação clínica

é a doença pulmonar. Durante seu desenvolvimento os bacilos podem se

disseminar pela corrente sanguínea e vasos linfáticos, em grande número,

levando à TB miliar ou meníngea, ou em número pequeno de bacilos que formam

focos tuberculosos em vários tecidos. Estes focos podem ou não se transformar

em TB extrapulmonar posteriormente6.

A resposta imune ao bacilo é complexa e pode resultar tanto na

eliminação completa do agente quanto na contenção da infecção pela formação

de granulomas, caracterizando uma infecção latente (Latent tuberculosis

infection – LTBI). A progressão para TB ativa ocorre de desequilíbrios na relação

agente-hospedeiro, com predomínio da replicação bacteriana sobre a resposta

imune6.

Uma das razões para o sucesso do Mtb como patógeno está em sua

capacidade de sobreviver dentro dos macrófagos alveolares, que compõem a

primeira linha de defesa contra o bacilo. A parede celular do Mtb é composta por

um arranjo complexo de proteínas, lipídios e glicolipídios. Dentre os

componentes desta parede, destaca-se a Lipoarabinomanana (LAM), importante

no reconhecimento do bacilo pelos receptores Toll-like 2 (TLR2) das células

apresentadoras de antígenos (APCs). Após este reconhecimento, a ativação do

TLR2 resulta em inibição da resposta inflamatória. Os mecanismos intracelulares

de virulência são caracterizados por sistemas de secreção proteica. Destes, o

mais importante é o sistema ESX-1, que secreta, entre outras, as proteínas Early

secreted antigenic target of 6 kDa (ESAT-6), e Culture Filtrate Protein of 10 kDa

(CFP-10). Tais componentes parecem contribuir com a inibição das funções dos

macrófagos, como ruptura da parede do fagossomo e liberação de bacilos no

ambiente menos agressivo do citosol, alterando o equilíbrio da resposta

inflamatória7.

17

A resposta imune ao Mtb abrange uma ampla interação entre

componentes da imunidade inata e da imunidade adaptativa. A interação entre

macromoléculas da parede (notadamente a LAM) e TLR2 inicialmente

desencadeia uma resposta de citocinas do tipo T-helper 1 (Th1), com destaque

para o Interferon Gama (IFN-γ), principal citocina envolvida na resposta

protetora. No entanto, a persistência intracelular do Mtb, resultando em estímulo

crônico aos TLR2, resulta em elaboração de citocinas imunossupressoras,

principalmente Interleucina 4 (IL-4) e Interleucina 10 (IL-10), e redução da

apresentação de antígenos pelo processamento MHC-II. Tal resposta resulta em

sobrevida aumentada do Mtb nos macrófagos8.

O IFN-γ tem papel central na imunidade celular ao Mtb, sendo

considerado o principal indutor da resposta tuberculostática e proteção do

hospedeiro. Produzido principalmente por macrófagos e linfócitos T CD4+, age

na ativação dos próprios macrófagos para fagocitose e produção de radicais

oxidativos, tornando-os capazes de controlar e/ou eliminar o bacilo. Neste

contexto, são importantes também as citocinas Fator de Necrose Tumoral alfa

(TNF-α) e Interleucina 2 (IL-2). Outras funções, como indução de apoptose,

condicionamento de APCs e produção de outras citocinas que direcionam a

resposta imune, também fazem parte do repertório dos linfócitos CD4+ no

controle da TB. A Interleucina 17 (IL-17), característica da resposta conhecida

como Th-17, também participa na defesa contra o Mtb, provavelmente por

mecanismos precoces transitórios1.

Devido à complexidade do agente e à resposta do hospedeiro humano, a

imunidade contra a tuberculose envolve múltiplos mecanismos. Uma

subpopulação de linfócitos T chamada Gama-Delta (TCR-γδ), compondo

aproximadamente 1% a 5% dos linfócitos circulantes, desempenha um papel

significante, ainda não completamente definido, nas infecções micobacterianas.

Essas células promovem funções efetoras importantes, como proliferação,

liberação de citocinas Th-1 e atividade citotóxica9. Mais recentemente, o papel

protetor dos TCR-γδ foi experimentalmente demonstrado, pela primeira vez, in

vivo, em um modelo de infecção tuberculosa em primatas não-humanos10.

18

Essa subpopulação se divide em dois principais subconjuntos, o primeiro

expressando a região variável (Vδ1), e o segundo expressando a região variavel

(Vδ2) no locus delta do receptor TCR. Em individuos saudáveis, as células T Vδ1

são encontradas predominantemente nas mucosas, e são conhecidas por

responder a moléculas MHC não classicas. Já as células T Vδ2 representam

70% dos linfócitos T γδ circulantes, são encontradas no sangue periférico, e são

capazes de responder a fosfoantigenos sem restrição de MHC11. O principal

fosfoantígeno a estimular a resposta de linfócitos T γδ em humanos é o (E)-4-

hydroxi-3-metil-but-2enil pirofosfate (HMBPP), expresso por diversas bactérias,

incluindo o Mtb12.

Os linfócitos T γδ podem adquirir a capacidade de processar e apresentar

antígenos. Experimentalmente, os linfócitos T γδ são capazes de expressão do

fenótipo apresentador de antígeno caracterizado pelos marcadores HLA-DR,

CD80 e CD86. A magnitude desta expressão é comparável à observada em

células dendríticas, consideradas padrões APC profissionais13. Embora existam

resultados que sugerem um papel específico para as células T γδ na ativação de

células T αβ, a relevância da capacidade das células T γδ para atuar como

células apresentadoras de antígeno (APCs) ainda não foi confirmada in vivo13-14.

Na tuberculose, as células T γδ humanas podem produzir diferentes

respostas funcionais. As células estimuladas pelo Bacilo de Calmette e Guérin

(BCG) ou lisados de micobactérias podem induzir a produção de grânulos

citotóxicos (granulisinas) e outros peptídeos antimicrobianos e mostrar atividade

citolítica após co-cultura com monócitos humanos infectados com

micobactérias15.

O processamento dos antígenos micobacterianos resultantes da liberação

de Mtb no citosol segue predominantemente a via MHC-I. Desta forma, são

apresentados peptídeos aos linfócitos T CD8+. Tais populações podem ser

estimuladas a produzir citocinas Th-1, como IFN-γ1. Além disso, a produção de

grânulos por linfócitos T citotóxicos (CD8+) e linfócitos T gamma-delta foi

caracterizada como um importante mecanismo adjuvante. Proteínas, tais como

as perforinas, granzima B e granulisina tem a capacidade de lisar células

19

infectadas por Mycobacterium tuberculosis, ou até mesmo lisar diretamente os

bacilos16.

Apesar dos grandes avanços no conhecimento sobre os mecanismos da

imunidade antituberculose, a prevenção da doença ainda é apenas parcialmente

bem-sucedida. A vacinação com a BCG apresenta moderada eficácia na

proteção contra a doença (aproximadamente 70%), sendo esta eficácia maior

em relação às formas disseminadas. A eficácia é maior em países com baixa

incidência de micobactérias ambientais17. Há controvérsias sobre a duração

deste efeito protetor. No Brasil, estudos epidemiológicos sugerem que tal efeito

se prolongue por cerca de 20 anos18. Há um consenso sobre a necessidade de

uma vacina mais eficaz, para um melhor controle da tuberculose. No entanto, os

resultados de estudos controlados até o momento não subsidiaram a adoção de

nenhum novo imunógeno19.

O entendimento dos mecanismos de resposta à imunização com BCG é

alvo de intensa atividade na pesquisa biomédica. Existe consenso que a indução

de linfócitos T produtores de IFN-γ, no contexto da resposta Th-1, está associada

à atividade protetora. A via intradérmica é a mais comumente utilizada para sua

administração. Os fenômenos iniciais da resposta envolvem a interação entre

componentes da parede celular (peptidoglicanos, arabinogalactana e ácido

micólico) com receptores Toll-like. A resposta inicial no tecido envolve

predominantemente linfócitos T, monócitos e neutrófilos. De forma similar à

infecção com patógenos virulentos, é identificado o papel de linfócitos T CD4+ e

T CD8+, bem como T γδ. A vacinação com BCG não é considerada uma indutora

potente de resposta Th-17. Apesar de uma ampla gama de conhecimentos

obtidos em ensaios in vitro, ainda não existem marcadores biológicos

representativos da proteção em lactentes vacinados20-21.

O impacto epidemiológico e clínico da tuberculose tem acometido a

humanidade há milênios. Nos últimos 35 anos, um novo agente infeccioso, o

Vírus da Imunodeficiência Humana, passou a interagir com o Mtb. Tal interação

resultou em uma intensificação da morbidade e mortalidade de ambas as

condições.

20

A infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), clinicamente

expressa, em sua fase avançada, pela Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

(Aids), se caracteriza, em sua história natural, como uma doença crônica,

incurável e invariavelmente fatal, na ausência de tratamento adequado.

Atualmente, 37 milhões de indivíduos estão infectados pelo HIV em todo o

mundo, dentre estes 3,3 milhões de crianças22. Segundo dados do Boletim

Epidemiológico Aids/DST entre a década de 1980 a junho de 2016, 835.000

casos de Aids foram registrados no Brasil23.

A Aids é caracterizada pela imunossupressão grave no contexto da

infecção crônica, insuficientemente tratada, pelo HIV. O HIV se diferencia dos

demais vírus pela sua capacidade de infectar células do sistema imunológico:

linfócitos T (CD4+), monócitos, macrófagos e células dendríticas. A replicação

viral e a resposta do hospedeiro promovem a disfunção e deleção progressiva

destas células, o que resulta na incapacidade do organismo em combater o vírus

e outras infecções oportunistas provocadas por bactérias e fungos24.

O HIV é membro do grupo dos retrovírus humanos T-linfotrópicos, da

família Retroviridae, caracterizado pela presença da enzima transcriptase

reversa. Existem duas variedades patogênicas para humanos. A mais comum,

correspondendo a mais de 90% dos casos no mundo e à quase totalidade no

Brasil, é conhecida como HIV-1, originária de mutações do Vírus da

Imunodeficiência Símia (SIV) do Chimpanzé (Pan troglodytes). Mais raramente,

seres humanos podem ser infectados pelo HIV-2, originário de mutações do SIV

do Mangabeu Fuliginoso (Cercocebus atys). A história natural da Aids causada

pelo HIV-1 apresenta curso mais rápido e compromento clínico e imunológico

mais grave25.

O HIV tem tropismo para os receptores CD4 e CCR5, em macrófagos, e

CXCR4, em linfócitos. Na superfície do envelope viral encontram-se a

glicoproteína externa (gp120) e a proteína transmembrana (gp41), responsáveis

pela entrada do vírus na célula alvo. Através da interação destes receptores com

seus ligantes na célula hospedeira ocorre a fusão do envelope viral com a

membrana celular, liberando seu conteúdo no citoplasma, onde a enzima

transcriptase reversa converterá RNA viral, em DNA. que será conduzido e

21

integrado ao DNA da célula hospedeira com o auxilio da enzima integrase,

ativando a produção de proteínas virais que irão compor as múltiplas cópias da

cepa infectante. Ao completar-se este ciclo, estelece-se uma infecção vitalícia,

com um período inicial variável de latência seguido de um período de progressão

para imunodeficiência, na ausência de tratamento24.

Na população, as principais vias de infecção pelo HIV são o contato sexual

e o contato com o sangue infectado, por meio de compartilhamento de material

contaminado no cenário do uso de drogas psicoativas. Mais raramente na

atualidade, pode ocorrer transmissão transfusional, comum no início da

epidemia24.

Em crianças, a infecção apresenta como principal via a transmissão

vertical, na qual o vírus é transmitido da mãe infectada para o recém-nascido ou

lactente (90% dos casos). Mais raramente em pediatria, a transmissão do vírus

pode ocorrer via transfusional, por meio de sangue e/ou derivados

contaminados, ou mesmo por contato sexual26. A transmissão na fase perinatal

pode ocorrer na vida intrauterina, durante o parto ou no pós-parto, incluindo a

fase de aleitamento materno. A taxa de transmissão vertical, na ausência de

intervenção, varia de 17% a 29%. No entanto, esta taxa cai para menos de 1%,

quando se efetua um protocolo de prevenção, que inclui o tratamento da

gestante infectada, precauções no parto, administração de medicamentos

antirretrovirais ao recém-nascido e a substituição do aleitamento materno27.

O caráter de persistência do patógeno, associado à infecção pelo HIV,

resulta em fenômenos patogênicos complexos. A apresentação antigênica para

a resposta citotóxica, fundamental no controle e erradicação de infecções virais,

é prejudicada pela modulação negativa do sistema MHC-I. O sistema MHC-II

também é afetado, resultando em prejuízo ao processamento de antígenos

microbianos externos. O efeito citopático do HIV, associado a mecanismos de

lise citotóxica, resulta em depleção de clones de linfócitos T CD4+. O parasitismo

persistente desencadeia ativação imunológica, com inflamação crônica, tendo

como resultado, entre outros, um aumento da apoptose de linfócitos T. Estes

mecanismos contribuem para a acentuada imunossupressão observada na

doença progressiva, notadamente em relação à imunidade celular, resultando

22

em risco aumentado de infecções oportunistas, autoimunidade e neoplasias.

Mecanismos adicionais incluem prejuízo na proliferação linfocitária,

desregulação na produção de citocinas, anormalidades do sistema imune inato,

disfunção da imunidade humoral e de linfócitos natural killer (NK)28.

Muitas evidências experimentais sugerem um papel direto dos linfócitos T

γδ circulantes na resposta imune ao HIV. Eles podem exercer um papel anti-HIV,

secretando quimiocinas que inibem os co-receptores de entrada do virus, e

outros fatores antivirais, eliminando as células infectadas por mecanismos

citotóxicos semelhantes às celulas natural-killer (NK)29.

A infecção por HIV afeta vários mecanismos da resposta imune, incluindo

células dendríticas e células T γδ, contribuindo para a perda de competência

imune. Estudos com pacientes infectados pelo HIV sugerem que esta infecção

pode afetar o repertório e a função efetora das células T γδ. Essas células têm

uma freqüência menor em indivíduos infectados pelo HIV30. Um estudo

demonstrou que durante a infecção pelo HIV, as células T γδ circulantes são

profundamente afetadas. Pode-se observar uma perda significativa de celulas T

Vδ2 no sangue periférico, comprometendo todas as suas funções, em pacientes

cronicamente infectados pelo virus31.

Um mecanismo adicional da imunodeficiência associada ao HIV é a

redução da capacidade de produção de grânulos citotóxicos, por várias

populações celulares, principalmente os linfócitos T CD8+. Tal capacidade de

produção pode ser recuperada com tratamento efetivo32.

Cerca de 25% das crianças infectadas pelo HIV exibem manifestações

clínicas graves nos primeiros dois anos de vida, sendo caracterizadas como

progressores rápidos. A progressão intermediária e a lenta ocorrem em 65% a

10% das crianças, aproximadamente. Os progressores lentos se caracterizam

por não possuírem depleção significativa da população de linfócitos T CD4+ e

nem manifestações clínicas da Aids, por um período de 8 ou mais anos após a

infecção33. Os estudos de história natural, nos anos iniciais da epidemia,

forneceram as bases para a classificação clínica e imunológica da infecção por

HIV em pediatria. A classificação clínica é baseada na gravidade dos sintomas,

variando entre categorias N, A, B e C. A classificação imunológica é baseada na

23

contagem de linfócitos T CD4+, variando entre categorias 1, 2 e 334. O

detalhamento do sistema de classificação adotado no Brasil está acessível no

Anexo 1.

Considerando a gravidade do comprometimento imunológico e das

repercussões clínicas, o diagnóstico precoce da infecção pelo HIV em pediatria

é, portanto, fundamental para permitir acesso a um tratamento adequado, capaz

de reduzir a morbidade, mortalidade e orientar nas decisões quanto à nutrição

infantil e melhoria da qualidade de vida destes pacientes, antes do

desenvolvimento de doenças oportunistas. O tratamento aos pacientes

infectados atua sobre as principais etapas de estabelecimento do vírus,

controlando sua replicação e complicações infecciosas com um regime de

drogas que bloqueiam as atividades das enzimas transcriptase reversa, protease

e integrase, bem como mecanismos de penetração celular pelo vírus. Este

regime terapêutico, instituído com grande sucesso a partir do final da década de

90, é hoje denominado Terapia Antirretroviral Combinada (TARC), e tem

permitido a transformação de uma doença letal em uma condição crônica, com

acentuada melhora nos indicadores de sobrevida e quallidade de vida35.

Atualmente, as diretrizes pediátricas de TARC no Brasil recomendam o início do

tratamento imediatamente após o diagnóstico34. Os resultados encorajadores em

relação à sobrevida e qualidade de vida em pacientes infectados por transmissão

vertical trouxeram a esperança, ainda não atingida, de cura da infecção36-37. No

quadro 1, são descritas as classes dos 21 antirretrovirais disponíveis para a

TARC pediátrica no Brasil.

24

Quadro 1: Classes de antirretrovirais disponíveis no Brasil para o tratamento de

crianças e adolescentes (adaptado34).

Inibidores de Entrada

Inibidores da Transcriptase Reversa Inibidores

da Protease

Inibidores da

Integrase

Nucleosídeos Nucleotídeos Não-Nucleosídeos

Enfuvirtida (T-20/ Inibidor de fusão)

Maraviroque (Inibidor do receptor CCR5)

Abacavir (ABC)

Didadosina (DDI)

Emtricitabina (FTC)

Lamivudina (3TC)

Estavudina (D4T)

Zidovudina (AZT)

Tenofovir (TDF)

Efavirenz (EFZ)

Etravirina (ETV)

Nevirapina (NVP)

Atazanavir (ATV)

Darunavir (DRV)

Fosampre-navir (FPV)

Lopinavir/ ritonavir (LPV/r)

Ritonavir (RTV)

Saquinavir (SQV)

Tipranavir (TPV)

Dolutegravir (DTG)

Raltegravir (RAL)

Os jovens infectados pela transmissão vertical apresentam aspecto

particular em relação à resposta ao tratamento. A atividade de infecção ocorre

desde o início da vida, podendo afetar profundamente o desenvolvimento do

sistema imune. A terapia anti-retroviral combinada tem eficácia significativa

nessa população, mas a preservação da função imune pode ser incompleta38.

A tuberculose (TB) é uma das doenças oportunistas mais frequentes nos

indivíduos infectados pelo HIV, sejam eles adultos ou crianças, sendo

atualmente a principal causa de morte entre indivíduos coinfectados, totalizando

cerca de 400.000 óbitos/ano39. A pandemia da infecção pelo HIV tem

contribuído, nos últimos anos, para uma intensificação do fardo social da

tuberculose, caracterizando uma sindemia. Em 2015, foram notificados 10,4

25

milhões de casos novos de tuberculose no mundo, sendo cerca de 11% em

indivíduos com a coinfecção pelo HIV. Indivíduos infectados pelo HIV com

tuberculose latente apresentam um risco 26 vezes superior de reativação,

quando comparados a indivíduos não-infectados. A coexistência de ambos os

patógenos no mesmo hospedeiro e a consequente mobilização da resposta

imune na intensificação da atividade de ambas as doenças, caracterizada por

maior morbidade e mortalidade nos pacientes coinfectados40.

A resposta imune à TB depende principalmente do sistema adaptativo,

com destaque para a imunidade celular. Na coinfecção pelo HIV, múltiplos

mecanismos estão envolvidos na redução da capacidade de estabelecimento de

uma resposta celular protetora. Existem evidências que linfócitos T CD4+

específicos para antígenos de Mtb sejam preferencialmente afetados e

deletados na infecção pelo HIV, principalmente aqueles com capacidades

polifuncionais (expressão simultânea de IFN-γ, TNF-α e IL-2). Outros relatos

sugerem que, na tuberculose, ocorra aumento da expressão dos receptores CD4

e CCR5, tornando os linfócitos T mais suscetíveis ao parasitismo pelo HIV41.

Os linfócitos T citotóxicos (CD8+) podem ter sua função prejudicada na

coinfecção. Um estudo em pacientes com TB latente mostrou, naqueles

infectados pelo HIV, menor expressão do marcador de degranulação CD107a e

menor proliferação em resposta a estímulo com ESAT-6 e CFP-1042. Embora

haja um número menor de relatos sobre a disfunção de linfócitos TCR-γδ na

coinfecção por HIV, um estudo demonstrou redução da capacidade de produção

de IFN-γ em indivíduos coinfectados43.

A função de macrófagos também é prejudicada na coinfecção HIV/Mtb.

Macrófagos infectados pelo HIV apresentam menor apoptose em resposta ao

Mtb, permitindo sobrevida aumentada do patógeno intracelular. Tal mecanismo

pode em parte ser devido à menor produção de TNF-α por macrófagos

infectados44.

O efeito da TARC em relação à recuperação da imunidade antituberculosa

em pacientes coinfectados foi demonstrado em diversos estudos. Porém, na

maior parte deles, tal restauração mostrou-se parcial ou incompleta44.

26

Considerando-se o grande impacto epidemiológico e clínico da coinfecção

HIV-TB, torna-se oportuno avaliar a capacidade de resposta em indivíduos

infectados pelo HIV com TARC efetiva. Tal avaliação assume especial interesse

no cenário de jovens infectados por transmissão vertical e vacinados por BCG

na infância. Tal população apresenta as consequências de uma infecção crônica,

adquirida em fases precoces do desenvolvimento do sistema imune. A

perspectiva de sobrevida e boa qualidade de vida proporcionada pela TARC,

universalmente disponível no Brasil, justifica a relevância da busca de

informações neste contexto, ainda escassamente pesquisado no cenário

internacional.

27

2. OBJETIVO

1. Avaliar a capacidade de produção de grânulos citotóxicos, expressão

de fenótipo de apresentação de antígeno e ativação celular, em resposta a

antígenos micobacterianos, por linfócitos T CD8+ e γδ, em jovens infectados pelo

HIV por transmissão vertical, vacinados por BCG, comparados a um grupo de

controle saudável.

2. Avaliar a capacidade de produção de grânulos citotóxicos, expressão

de fenótipo de apresentação de antígeno e ativação celular, em resposta a

antígenos micobacterianos, por linfócitos T CD8+ e γδ, em jovens infectados pelo

HIV por transmissão vertical, vacinados por BCG, de acordo com o grau de

imunossupressão.

3. HIPÓTESE (enunciada na forma nula, ou H0)

1. Jovens infectados pelo HIV por transmissão vertical, na vigência de

TARC efetiva, apresentam capacidade de produção de grânulos citotóxicos,

expressão de fenótipo de apresentação de antígeno e ativação celular, por

linfócitos T CD8+ e γδ, semelhantes àquela observada em jovens saudáveis.

2. Jovens infectados pelo HIV por transmissão vertical, na vigência de

TARC efetiva, apresentam capacidade de produção de grânulos citotóxicos,

expressão de fenótipo de apresentação de antígeno e ativação celular, por

linfócitos T CD8+ e γδ, independentemente do grau de imunossupressão.

4 MÉTODOS

4.1 Modelo do estudo

Estudo analítico, observacional, prospectivo, do tipo corte transversal.

28

4.2. População, local e período do estudo

Foram avaliados 20 pacientes, entre 16 e 23 anos, selecionados na

unidade ambulatorial do Serviço de Imunodeficiência Secundária, no Hospital de

Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (HC/Unicamp), Estado de São

Paulo, Brasil. Os pacientes faziam parte de uma coorte de 140 crianças e

adolescentes infectados verticalmente pelo HIV-1. Este serviço é o principal

centro de referência, na Região Metropolitana de Campinas, para

acompanhamento de crianças e adolescentes infectados pelo HIV. A

abrangência da área de cuidado atinge uma população de aproximadamente

quatro milhões de habitantes.

A infecção pelo HIV foi estabelecida e classificada, em relação a aspectos

clínicos e imunológicos, de acordo com os critérios do Ministério da Saúde do

Brasil45.

Os pacientes foram selecionados, de forma consecutiva, conforme

presença às consultas. Os membros do grupo controle fizeram parte de uma

amostra de conveniência de estudantes de ensino médio e estudantes de

graduação universitária. Os procedimentos do estudo foram realizados entre

Setembro de 2016 e Março de 2017.

4.2.1. Critérios de Inclusão:

a) Pacientes infectados pelo HIV

• Ter idades entre 16 e 24 anos;

• Ter comprovação da infecção pelo HIV por transmissão vertical,

conforme os critérios do Ministério da Saúde do Brasil34.

• Estar em vigência de TARC e possuir controle da replicação viral

(carga viral plasmática indetectável) por um período mínimo de doze meses;

• Apresentar evidência de imunização com a vacina composta pelo

Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) na infância, de acordo com as diretrizes do

Ministério da Saúde do Brasil45. Foi adotada como evidência de imunização a

29

presença de cicatriz vacinal característica, na área deltoide do membro superior

direito.

• Manifestar concordância com a participação no estudo, por meio

da assinatura no Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE - anexo 3),

após leitura do documento escrito, pelos pacientes ou responsáveis legais, no

caso de menores de idade;

b) Participantes do grupo de controle

• Ter idades entre 16 e 24 anos;

• Ser presumidamente saudável, com ausência de diagnósticos de

condições crônicas de saúde;

• Apresentar evidência de imunização com a vacina composta pelo

Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) na infância, de acordo com as diretrizes do

Ministério da Saúde do Brasil45. Foi adotada como evidência de imunização a

presença de cicatriz vacinal característica, na área deltoide do membro superior

direito.

• Manifestar concordância com a participação no estudo, por meio

da assinatura no Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE - anexo 3),

após leitura do documento escrito, pelos pacientes ou responsáveis legais, no

caso de menores de idade;

4.2.2. Critérios de Exclusão:

• Estar em uso de medicamentos com potencial de alteração da

resposta imune, como corticosteroides ou outros imunossupressores;

• Tabagismo;

• Apresentar, no momento da coleta de material para o estudo,

infecção aguda com padrão clínico viral ou bacteriano;

• Especificamente para o grupo de controle, apresentar

anormalidades hematológicas (anemia, leucopenia ou plaquetopenia);

30

4.3. Considerações éticas

O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Estadual de Campinas (declaração 286.070 / 2013 - anexo 2).

Foram seguidas as normas estabelecidas na Resolução 466, de 21 de dezembro

de 2012, do Conselho Nacional de Saúde46.

4.4. Procedimentos

4.4.1 Hemograma, Imunofenotipagem de sangue periférico e Carga Viral do

HIV-1

Um mL de sangue periférico foi coletado em tubos de ácido etileno

diaminatetraacético (EDTA) para realizar o hemograma, no Laboratório Clínico

Especializado do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti – Centro

de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM) da Unicamp (analisador de

hematologia automatizado KX-21, Sysmex, EUA).

Para a imunofenotipagem, foi utilizado o painel contendo os marcadores:

CD3-APCH7 (clone SK7), CD4-BB515 (clone RPA-T4), CD8-PercpCy5 .5 e

TCRγδ-PE (BD Biosciences, EUA). A leitura do experimento foi realizada com o

auxílio do citometro de fluxo FACSVerse® (BD Biosciences, EUA), no Laboratório

Clínico Especializado do CAISM/Unicamp.

A carga viral (RNA viral/mL de sangue) foi quantificada através do kit

Abbott RealTime HIV-1 e a leitura no instrumento Abbott m2000rt (Promega

Corporation, EUA), no Laboratório de Pesquisa em AIDS do HC/Unicamp. Foi

considerado carga viral indetectável, números menores ou iguais a 40 cópias de

RNA viral/mL.

4.4.2 Obtenção dos antígenos utilizados nos ensaios

O lisado de BCG (Mycobacterium bovis) foi desenvolvido a partir da

cultura, em meio de cultura sólido para micobactérias (Lowenstein Jensen), de

uma cepa atenuada do Bacilo Calmette-Guérin (Fundação Ataulpho de Paiva -

31

Cepa Moreau RJ), no Laboratório de Patologia Clínica do HC/Unicamp (setor de

microbiologia).

O lisado de Mtb (Mycobacterium tuberculosis) foi desenvolvido a partir da

cultura, em meio de cultura sólido para micobactérias (Lowenstein Jensen), da

cepa H37RA, no Laboratório de Patologia Clínica do HC/Unicamp (setor de

microbiologia).

Ambas as bactérias foram incubadas em estufa de cultura bacteriológica,

a 37°C. Após crescimento, foi realizada a raspagem e transferência do material

em tubos contendo tampão fosfato-salino (PBS).

A inativação das micobactérias foi realizada através do calor. Os lisados

foram adquiridos por meio de sonicação, no Laboratório de Farmacologia da

Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Unicamp. Neste mesmo laboratório,

foi realizada a quantificação de proteínas pelo método de Bradford, com o kit da

Bio-Rad® (EUA).

4.4.3 Separação de Celulas Mononucleares do Sangue Periférico (CMSP)

por gradiente de densidade Ficoll-paque

Primeiramente foi realizado a limpeza do Fluxo Laminar com álcool 70%

em toda a superfície metálica e em todas as micropipetas que foram utilizadas.

Após essa limpeza, a luz ultravioleta foi ligada por 30 minutos para a realização

da esterilização.

Aproximadamente 20 mL de sangue periférico foram coletados em tubos

com heparina e foi realizada uma diluição de 1:1 com solução salina a 0,9%

estéril. Com o auxílio de um pipetador, essa diluição foi transferida lentamente

para um tubo cônico de 50 mL contendo o reagente Ficoll Paque® (Sigma-

Aldrich, EUA), tomando cuidado para que não houvesse mistura da solução

sangue/salina com o Ficoll Paque®.

Essa solução foi centrifugada por 20 minutos a 600G (18°C, aceleração 2

e freio 1). Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, foi retirada apenas a “nuvem”

32

de CMSP transferindo-a para um tubo cônico de 15 mL. Esse tubo foi

centrifugado por 5 minutos a 700G (18°C, aceleração 4 e freio 4).

Após esse procedimento, o sobrenadante foi descartado e o “pellet”

ressuspendido em 10 mL de solução salina a 0,9% estéril. Os tubos novamente

foram centrifugados a 700G (18°C, aceleração 4 e freio 4).

O sobrenadante foi descartado e o “pellet” foi ressuspendido em 10 mL de

meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com

gentamicina. Essa solução foi homogeneizada em vórtex, e foi retirada uma

alíquota de 20 µL para contagem em Câmara de Neubauer.

4.4.4 Contagem de CMSP em câmara de Neubauer

Após a retirada da alíquota (20 µL) do tubo contendo os CMSP em meio

de cultura, foi adicionado a ela o mesmo volume do corante azul de trypan. Essa

solução foi homogeneizada e transferida para uma das áreas da câmara de

Neubauer (preenchendo toda a área com a amostra, evitando bolhas).

Em microscópio óptico comum, foi efetuada a contagem na área número

5, tendo sido contados 5 quadrantes dos 25, preferencialmente os quatro

extremos e o central (figura 1). Foi realizada a seguinte fórmula para a obtenção

do número total de células:

33

Média dos 5 quadrantes contados x 25 x 2 (diluição) x 104 (área da câmara)

= Número de células/mL

Número de células/mL x volume de meio da suspensão original = Número

total de células da amostra.

4.4.6 Ensaio de Produção de grânulos citotóxicos e Fenótipo de Células

Apresentadoras de Antígeno

Primeiramente foi realizado um protocolo preliminar para analisar os

melhores tempos de culturas (12 horas/ 16 horas/ 18 horas) e as concentrações

ideais para os anticorpos monoclonais em estudo. Para isso, foi coletado sangue

periférico de três indivíduos, sabidamente “bons respondedores” à antígenos

micobacterianos. As concentrações dos anticorpos testadas foram as indicadas

pela bula, variando até dois µL para menos.

Após a análise preliminares dos resultados, verificamos que o tempo de

cultura ideal seria 18 horas e as concentrações dos anticorpos poderia variar

Figura 1: Áreas delimitadas (representadas por números) da Câmara de Neubauer.

1 2 3

4 5 6

7 8 9

34

dois µL para menos, pois não houve diferença estatística entre o valor indicado

pela bula e sua nova concentração.

Para o desenvolvimento final do protocolo, as células obtidas foram

diluídas, em meio RPMI, para ficarem em uma concentração de 1x106

células/mL. Após esse procedimento, foram feitos quatro tubos: um controle

negativo, um controle positivo, um tubo estimulado pelo lisado de BCG e um

estimulado pelo lisado de Mtb.

Em cada um desses tubos foram adicionados: meio de cultura RPMI 1640

suplementado com gentamicina, Soro Humano AB 10% (10 µL), anticorpos

monoclonais anti-CD28 e anti-CD49d (1 µg/mL cada). O controle positivo foi

estimulado pela fitohemaglutinina (PHA), um mitógeno desenvolvido pela Sigma-

Aldrich® (EUA). O tubo negativo não tinha estímulo especifico, apenas meio de

cultura.

Para o controle positivo, foram utilizados 15 µg/mL de PHA. Para os

lisados, foram utilizados 10 µg/mL (BCG e Mtb).

Após a realização dos quatro tubos, esses foram cultivados em estufa

microbiológica a 37°C, 5% de CO2, por 18 horas. Durante as últimas quatro

horas, foi inoculado o anticorpo anti-CD107a (marcador de produção de grânulos

citotóxicos). As células em degranulação são identificadas pela expressão de

CD107a na superfície. A proteína CD107a é conhecida como Proteína de

Membrana Associda ao Lisossoma (LAMP-1). O marcador é mobilizado para a

superfície celular após a exocitose de grânulos induzida pela ativação.

4.4.7 Marcação de Anticorpos de superfície

Após as 18 horas de cultura, foram adicionados 100 µL de EDTA 20

milimolar (mM) em cada tubo, por 15 minutos, agitando cada tubo, em vórtex, a

cada 5 minutos para desfazer os grumos de células. No final dos 15 minutos,

foram adicionados 3 mL de PBS em cada tubo e foi realizada a centrifugação

(2200 rpm por 4 minutos).

35

O sobrenadante foi desprezado e o “pellet” ressuspendido em 20 µL de

Imunoglobulina humana. Os tubos foram incubados por 5 minutos a temperatura

ambiente (TA).

A marcação de superfície foi realizada utilizando os seguintes anticorpos

monoclonais e incubados por 20 minutos a TA, sob abrigo da luz:

Tabela 1: Anticorpos utilizados para a marcação de superfície, quantidade (µL/tubo) e fluorocromos.

Anticorpo Quantidade (µL/tubo) Fluorocromo

CD3 3 APCH7

CD8 3 PercpCy5.5

TCR-γδ 10 FITC

CD80 10 PE

CD86 10 APC

HLA-DR 3 BV421

Após os 20 minutos de incubação, foram adicionados 3 mL de PBS em

cada tubo e foi realizada a centrifugação (2200 rpm por 4 minutos). O

sobrenadante foi descartado e o “pellet” ressuspendido em 300 µL de PBS, e os

tubos foram analisados em citômetro de fluxo FACSVerse® (BD Biosciences,

EUA), no Laboratório Clínico Especializado do CAISM/Unicamp. As amostras

foram adquiridas pelo software FACS suite, e analisados pelo software FlowJo™,

versão 10.2 (FlowJo, EUA). Os níveis de corte de fluorescência para todos os

ensaios de citometria foram estabelecidos com a análise de populações não

marcadas.

36

4.4.8 Estratégia de Análise para o ensaio de Produção de Grânulos

Citotóxicos

Após cultura de 18 horas e marcação de anticorpos de superfícies, a

população de células T CD3+ foi selecionada (CD3-APCH7 x Side Scatter Area

(SSC-A)) a partir das CMSP de pacientes infectados por HIV e controles

saudáveis. Os “doublets” de células foram excluídos (Forward Scatter Area

(FSC-A) x Forward Scatter Height (FSC-H)). As subpopulações de linfócitos T

CD8+ (CD3-APCH7 x CD8-PercpCy5.5) e T γδ+ (CD3-APCH7 x TCR-γδ-FITC) e

a degranulação (CD107a-BV510 x SSC-A) foram quantificados a partir de 10 mil

eventos (Figura 2)

37

4.4.9 Estratégia de Análise para o ensaio de Fenótipo de Células

Apresentadoras de Antígeno

Após cultura de 18 horas e marcação de anticorpos de superfícies, a

população de células T CD3+ foi selecionada (CD3-APCH7 x Side Scatter Area

(SSC-A)) a partir dos CMSP de pacientes infectados por HIV e controles

saudáveis. Os “doublets” de células foram excluídos (Forward Scatter Area

(FSC-A) x Forward Scatter Height (FSC-H)). As subpopulações de linfócitos T

CD8+ (CD3-APCH7 x CD8-PercpCy5.5) e T γδ+ (TCR-γδ-FITC x SSC-A) e o

+

Controle negativo PHA BCGL MTBL

Controle negativo PHA BCGL MTBL

Figura 2: Estratégia de análise de para o ensaio de Produção de grânulos citotóxicos.

T CD8

T γδ

38

fenótipo de células apresentadoras de antígeno: HLA-DR+ (HLA-DR-BV421 em

histograma), e as células duplo-positivas, CD80+ e CD86+ (CD86-APC x CD80-

PE) foram quantificados a partir de 10 mil eventos (Figura 3).

4.5. Variáveis

4.5.1 Variáveis dependentes.

- Produção de grânulos citotóxicos: expressa pela porcentagem de linfócitos T

CD8+ ou linfócitos T γδ+, com expressão do marcador CD107a na membrana.

Figura 3: Estratégia de análise de para o ensaio de Fenótipo de Celulas Apresentadoras de antígeno.

T CD8

T γδ

39

- Capacidade de apresentação de antígenos: expressa pela porcentagem de

linfócitos T γδ+, com expressão dos marcadores HLA-DR + CD80 + CD86 na

membrana

- Ativação celular: expressa pela porcentagem de linfócitos T CD8+ ou linfócitos

T γδ+, com expressão do marcador HLA-DR na membrana

4.5.2 Variáveis independentes

- Estado de infecção pelo HIV: expresso pelas categorias “pacientes” ou

“controles”.

- Gravidade da imunossupressão (exclusivamente no grupo de pacientes):

expressa pelas categorias imunológicas 1 + 2 (imunossupressão ausente ou

moderada) e 3 (imunossupressão grave).

4.6. Análise Estatística

Os dados obtidos foram armazenados em base de dados do programa de

computador SPSS para Windows, versão 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL; EUA). A

análise dos resultados foi realizada através do mesmo programa. Análise

preliminar com o teste de Kolmogorov-Smirnov demonstrou que as principais

variáveis contínuas não apresentavam distribuição normal. As associações entre

variáveis contínuas e categorias foram analisadas por meio do teste de Mann-

Whitney. Foram consideradas significativas diferenças com valor de p ≤ 0,05.

5. RESULTADOS

5.1 Dados demográficos da população de estudo

A tabela 2 mostra os dados demográficos e laboratoriais dos 20 controles

saudáveis e dos 20 pacientes infectados pelo HIV incluídos no estudo. Não

houve diferença significativa na idade entre os grupos. O grupo controle

apresentou um número maior de células T CD4 (MW, p = 0,03) e na relação de

40

células T CD4/T CD8 (MW, p = 0,02) em comparação ao grupo de pacientes.

Todos os pacientes apresentaram cargas virais indetectáveis e recuperação

ótima de células T CD4 por uma terapia antirretroviral combinada a longo prazo,

no momento da coleta.

Tabela 2: Dados demográficos e laboratoriais dos pacientes infectados por HIV e controles saudáveis

Variáveis

HIV Controles p*

n = 20 n = 20

Idade (anos)

0,22 Média 19,25±2,48 18,37±1,95

Sexo

Masculino/Feminino 15/5 12/8

Leucócitos (x103/µl)

0,53 Mediana 5800 6650

(Min-Max) 4300 - 13800 4100 – 10500

Monócitos (x103/ul)

0,14 Mediana 559,0 689,5

(Min-Max) 310 – 1115 377 - 1134

Neutrófilos (x103/ul)

0,3 Mediana 3136.5 3685

(Min-Max) 1791 - 9191 1509 – 6741

41

Tabela 2. (continuação)

Variáveis HIV

n = 20

Controles

n = 20

p*

Linfócitos (%)

Mediana 30,6 29,2

(Min-Max) 14,2 - 56 17,7 – 42,9

T-CD3 (%)

0,8 Mediana 64,1 64,6

(Min-Max) 19,9 – 79,0 51,5 – 74,3

T-CD3 (cel/µl)

0,84 Mediana 1409 1377

(Min-Max) 270 - 2064 765 - 1795

T-CD4 (%)

0,02 Mediana 23,3 29,3

(Min-Max) 9,0 – 39,8 20,4 – 42,8

CD4 (cel/µl)

0,03 Mediana 516.5 632

(Min-Max) 122 - 775 344 – 1071

T-CD8 (%)

0,66 Mediana 22,6 22,5

(Min-Max) 7,4 – 43,6 14,2 – 32,6

T-CD8 (cel/µl)

0,49 Mediana 493 424

(Min-Max) 101 - 1452 230 – 811

TCR-γδ (%)

0,15 Mediana 2,0 3,1

(Min-Max) 0,7 – 9,2 1,2 – 12,6

TCR-γδ (cel/µl)

0,24 Mediana 44,0 54,5

(Min-Max) 10 - 233 22 - 162

42

Tabela 2 (continuação)

Variáveis HIV

n = 20

Controles

n = 20

p*

CD4/CD8

0,02 Mediana 1,1 1,4

(Min-Max) 0,4 – 1,7 0,8 – 2,9

*Mann-whitney.

5.2. Dados específicos ligados ao histórico de infecção pelo HIV no grupo

de pacientes.

Entre os pacientes infectados, a maior parte (11/20) estava situada na

categoria clínica B, e 9/20 estavam situados na categoria imunológica 3. Tal

estadiamento caracteriza pacientes com evolução crônica. Nenhum dos

pacientes apresentava história prévia de infecção por micobactérias. Os dados

estão sumarizados na tabela 3.

43

Tabela 3: Dados clínicos e imunológicos específicos do grupo de pacientes infectados pelo HIV.

Paciente Idade Sexo Classificação Clínica

Classificação Imunológica

Idade ao início da TARC

Tempo de TARC (anos)

Esquema atual de TARC

P1 21,55 M N 2 10,57 10,98 TDF+3TC+EFZ P2 23,16 M B 2 15,41 7,76 NVP+LPV/r+RAL+TDF+3TC P3 21,37 M B 1 16,56 4,81 AZT+3TC+EFZ P4 18,33 M B 1 4,34 13,99 LPV/r+TDF+3TC P5 18,13 F A 2 3,48 14,65 LPV/r+TDF=3TC P6 19,01 M B 2 3,86 15,16 ATV/r+TDF+3TC P7 17,28 F B 3 4,23 13,05 3TC+DDI+LPV/r P8 18,06 F B 1 1,54 16,53 FPV/r+RAL+TDF+3TC P9 19,24 M C 3 2,34 16,91 AZT+3TC+EFZ P10 20,99 M C 3 5,04 15,95 AZT+3TC+EFZ+LPV/r+RAL P11 17,59 F B 2 1,16 16,43 LPV/r+TDF+3TC P12 21,96 M C 3 5,59 16,37 LPV/r+TDF+3TC P13 16,13 M C 3 10,28 5,86 TDF+3TC+EFZ P14 22,40 M C 3 6,00 16,41 AZT+3TC+RAL+DRV/r P15 20,88 M C 3 4,33 16,56 TDF+3TC+FPV/r P16 20,25 M A 1 6,77 13,48 LPV/r+TDF+3TC P17 21,11 M B 1 8,59 12,52 3TC+ABC+LPV/r P18 13,37 F B 2 10,09 3,28 AZT+3TC+NVP P19 16,69 M B 3 1,61 15,08 RAL+TDF+3TC+EFZ+DRV/r P20 17,41 M B 3 1,76 15,65 T20+ETV+MARA+TDF+3TC+DRV/r

Abreviaturas – antirretrovirais: 3TC – Lamivudina; ABC – Abacavir; ATV/r – Atazanavir/ritonavir; AZT – Zidovudina; DDI – Didanosina; DRV/r – Darunavir/ritonavir; EFZ – Efavirenz; ETV – Etravirina; FPV/r: Fosamprenavir/ritonavir; LPV/r - Lopinavir/ritonavir; MARA – Maraviroque; NVP – Nevirapina; RAL – Raltegravir; T20 – Enfuvirtida; TDF – Tenofovir Abreviaturas – classificação clínica: N – Sintomas ausentes; A – sintomas leves; B – sintomas moderados; C – sintomas graves. Abreviaturas – classificação imunológicas: 1 – Imunossupressão ausente; 2 – Imunossupressão moderada; 3 – Imunossupresssão grave

44

5.3. Comparação de subpopulações linfocitárias entre as categorias

imunológicas consolidadas 1+2 (imunossupressão ausente ou moderada)

e 3 (imunossupressão grave).

Com o objetivo de melhor caracterização do grupo de pacientes para

posterior análise, foram estabelecidos dois grupos, de acordo com o grau de

comprometimento imunológico. Devido ao pequeno número, foram consolidadas

as categorias imunológicas 1 e 2 (imunossupressão ausente ou moderada) e

mantida a categoria 3 (imunossupressão grave). Observou-se na categoria 3

maior porcentagem de linfócitos totais (medianas de 39,2% versus 25,8%, p =

0,04). Os dados estão sumarizados na tabela 4.

Tabela 4: Dados demográficos e laboratoriais no grupo de pacientes infectados pelo HIV, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave

Variáveis

Categorias 1+2 Categoria 3 p*

n = 11 n = 9

Idade (anos)

0.71 Média 19.01±2.65 19.24±2.41

Gênero

Masculino/Feminino 7/4 8/1

Leucócitos (x103/µl)

0.88 Mediana 5600 5800

(Min-Max) 4600 - 13800 4300 – 9300

Monócitos (x103/ul)

0.82 Mediana 547 571

(Min-Max) 423 - 1115 310 – 1086

Neutrófilos (x103/ul)

0.94 Mediana 3177 3096

(Min-Max) 1927 - 9191 1791 – 6699

45


Variáveis Categorias 1+2 Categoria 3 p*

n = 11 n = 9

Linfócitos (%)

0.04 Mediana 25,8 32,9

(Min-Max) 14,2 – 40,0 18,10 – 56,0

T-CD3 (%)

0.37 Mediana 66,8 55,7

(Min-Max) 49,7 – 79,0 19,9 – 77,2

T-CD3 (cel/µl)

0,20 Mediana 1540 1397

(Min-Max) 684 - 2064 270 – 1625

T-CD4 (%)

0,76 Mediana 24,0 21,6

(Min-Max) 13,2 – 39,8 9,0 – 37,9

CD4 (cel/µl)

0,88 Mediana 508 530

(Min-Max) 337 – 761 122 – 775

T-CD8 (%)

0,26 Mediana 27,3 19,9

(Min-Max) 15,5 – 43,6 7,4 – 39,7

T-CD8 (cel/µl)

0,33 Mediana 594 481

(Min-Max) 246 - 1452 101 - 685

TCR-γδ (%)

0,71 Mediana 2,0 2,0

(Min-Max) 0,9 – 9,2 0,7 – 4,1

TCR-γδ (cel/µl)

0,26 Mediana 45 42

(Min-Max) 21 - 233 10 – 71

46


Variáveis Categorias 1+2 Categoria 3 p*

n = 11 n = 9

CD4/CD8

0,45 Mediana 1,1 1,1

(Min-Max) 0,4 – 1,7 0,6 – 1,7

*Mann-whitney.

5.4 Comparação entre marcadores celulares em linfócitos T γδ e T CD8+ -

pacientes e controles

5.4.1 Comparação entre Fenótipo de Células Apresentadoras de Antígeno

nos linfócitos T γδ – pacientes e controles

A tabela 5 apresenta a distribuição da expressão de CD80++CD86+ nas

populações de células HLA-DR+, nos linfócitos T γδ. Não houve diferenças

significativas na expressão de HLA-DR++CD80++CD86+ quando comparamos

pacientes infectados por HIV e o grupo controle.

Por outro lado, constatamos que os linfócitos T γδ, de ambos os grupos,

apresentam fenótipo para APC.

Tabela 5: Distribuição da expressão de CD80++CD86+ nas populações de células HLA-DR+, nos linfócitos T γδ de controles e pacientes infectados por HIV

HIV (n = 20) Controles (n = 20)

Amostras Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

p*

Negativo 3,01 0,39 6,88 1,31 0,30 6,20 0,08

Positivo 3,32 0,59 10,30 2,21 0,39 6,82 0,35

BCG 2,99 0,43 7,22 2,07 0,26 7,34 0,25

MTB 2,19 0,62 5,56 1,72 0,41 5,66 0,22

47

*Mann-whitney

5.4.2 Comparação entre marcadores de ativação celular nos linfócitos T

CD8+ e γδ – pacientes e controles

As tabela 6 e 7 apresentam a distribuição da expressão de HLA-DR (%)

nas células T CD8+ e T γδ, respectivamente, de paciente infectados por HIV e

grupo controle.

O grupo de pacientes infectados por HIV apresentou uma expressão de

HLA-DR significativamente maior em células T CD8+ não estimuladas e após

estimulação com Mtb (Tabela 6).

Já nas células T γδ, não foram observadas diferenças estatisticamente

significativas entre os grupos, para os diferentes estímulos (Tabela 7).

Tabela 6: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T CD8+ de pacientes infectados por HIV e controles.


Amostras Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

p*

Negativo 30,65 12,30 66,60 23,40 11,60 49,40 0,03

Positivo 77,45 14,70 88,90 72,45 56,70 89,50 0,70

BCG 26,45 10,80 66,90 24,20 9,89 46,20 0,21

MTB 28,40 10,00 65,80 21,15 11,60 45,70 0,05

*Mann-whitney

48

Tabela 7: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T γδ de pacientes infectados por HIV e controles.


Amostras Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

p*

Negativo 41,75 25,10 74,4 41,75 16,90 68,80 0,88

Positivo 76,40 39,00 91,40 75,55 54,40 93,20 0,31

BCG 44,20 32,10 78,00 48,10 23,90 74,40 0,39

MTB 45,90 31,50 76,80 49,75 19,50 69,10 0,52

*Mann-whitney


pacientes e controles

As tabelas 8 e 9 apresentam a distribuição da expressão de CD107a nas

células T CD8+ e T γδ, respectivamente, em pacientes infectados por HIV e grupo

controle.

Não houve diferença significativa entre os grupos em relação à produção

de grânulos citotóxicos nas células T CD8+ (Tabela 8). Por outro lado, as células

T γδ, do grupo HIV, mostraram uma produção de grânulos significativamente

menor do que o grupo controle, em resposta a PHA (p = 0,05)(tabela 9).

A produção de grânulos citotóxicos por linfócitos T γδ apresentou uma

tendência a níveis menores nos pacientes infectados por HIV, em reposta aos

antígenos micobacterianos [BCG (p = 0,17) e Mtb (p = 0,1)] (tabela 9).

49

Tabela 8: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T CD8+, nos pacientes infectados por HIV e controles.


Amostras Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

p*

Negativo 0,69 0,36 5,31 0,86 0,38 3,39 0,38

Positivo 35,25 11,50 65,20 38,90 23,80 63,90 0,22

BCG 0,94 0,52 6,20 1,22 0,62 4,72 0,13

MTB 0,83 0,42 8,09 1,12 0,39 2,88 0,21

*Mann-whitney

Tabela 9: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T γδ, nos pacientes infectados por HIV e controles.


Amostras Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

p*

Negativo 3,39 1,23 8,08 2,64 0,97 10,60 0,41

Positivo 22,85 7,92 50,90 29,95 11,70 66,50 0,05

BCG 10,85 3,01 23,80 13,30 4,49 39,00 0,26

MTB 8,40 2,86 23,90 13,05 3,33 28,30 0,26

*Mann-whitney

5.5 Comparação entre marcadores celulares em linfócitos T γδ e T CD8+ no

grupo de pacientes – gravidade de comprometimento imunológico.

50

5.5.1 Comparação entre Fenótipo de Células Apresentadoras de Antígeno

nos linfócitos T γδ – imunodeficiência ausente ou moderada versus

imunodeficiência grave

A tabela 10 apresenta a distribuição da expressão de CD80++CD86+ nas

populações de células HLA-DR+, nos linfócitos T γδ. Não houve diferenças

significativas na expressão de HLA-DR++CD80++CD86+ quando comparamos

pacientes infectados por HIV nos diferentes níveis de imunodeficiência.

Por outro lado, constatamos que os linfócitos T γδ, de ambos os grupos,

possuem fenótipo para APC.

Tabela 10: Distribuição da expressão de CD80++CD86+ nas populações de células HLA-DR+, nos linfócitos T γδ de pacientes infectados por HIV comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave

Leve ou Moderada (n = 11) Grave (n = 09)

Amostras Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

p*

Negativo 4,38 0,39 6,88 2,55 0,59 5,57 0,47

Positivo 3,21 0,86 4,64 3,55 0,59 10,30 0,73

BCG 3,78 0,43 7,22 2,26 1,36 4,81 0,90

MTB 2,11 0,62 5,56 2,22 0,77 4,96 0,56

*Mann-whitney

5.5.2 Comparação entre marcadores de ativação celular nos linfócitos T

CD8+ e γδ – imunodeficiência ausente ou moderada versus

imunodeficiência grave

A tabela 11 e 12 apresentam a distribuição da expressão de HLA-DR (%)

nas células T CD8+ e T γδ, respectivamente, em pacientes infectados por HIV,

nos diferentes níveis de imunodeficiência.

51

Não houve diferença significativa entre os grupos em relação a

marcadores de ativação, nos diferentes níveis de imunodeficiência.

Tabela 11: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T CD8+ de pacientes infectados por HIV, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave


Amostras Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

p*

Negativo 33,60 24,20 66,60 26,30 12,30 43,30 0,06

Positivo 76,50 32,20 88,90 78,40 14,70 88,50 0,16

BCG 27,70 17,30 66,90 23,20 10,80 41,90 0,10

MTB 30,40 21,00 65,80 24,10 10,00 41,90 0,85

*Mann-whitney

Tabela 12: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T γδ de pacientes infectados por HIV, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave


Amostras Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

p*

Negativo 39,00 26,20 74,40 42,20 25,10 64,80 0,90

Positivo 75,30 39,00 91,40 80,20 64,50 87,10 0,29

BCG 40,80 32,10 78,00 47,30 32,20 67,70 0,73

MTB 48,00 31,50 76,80 43,80 31,80 62,20 0,79

*Mann-whitney

52


imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave

As tabelas 13 e 14 apresentam a distribuição da expressão de CD107a

nas células T CD8+ e T γδ, respectivamente, em pacientes infectados por HIV,

nos diferentes níveis de imunodeficiência. Observou-se, em relação às células T

CD8, maior expressão de CD107a na categoria de imunodeficiência grave,

quando estimuladas com fitohemaglutinina (p = 0,05).

Tabela 13: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T CD8+, nos pacientes infectados por HIV, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave


Amostras Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

p*

Negativo 0,80 0,36 5,31 0,62 0,50 2,49 0,32

Positivo 34,40 11,50 38,60 47,50 15,70 65,20 0,05

BCG 0,89 0,52 6,20 0,99 0,59 2,28 0,97

MTB 0,86 0,42 8,09 0,81 0,46 1,85 0,93

*Mann-whitney

Tabela 14: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T γδ, nos pacientes infectados por HIV, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave


Amostras Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

Mediana

(%)

Mínimo

(%)

Máximo

(%)

p*

Negativo 3,96 1,23 8,08 2,91 1,34 5,75 0,51

Positivo 19,40 7,92 38,60 26,20 9,86 50,90 0,21

BCG 8,65 3,01 23,80 11,80 6,95 23,30 0,47

53

MTB 7,35 2,86 23,90 8,49 3,12 18,50 0,49

*Mann-whitney

54

6. DISCUSSÃO

Nosso estudo demonstrou que a capacidade de produzir grânulos

citotóxicos em resposta a antígenos micobacterianos por pacientes infectados

pelo HIV por transmissão vertical, sob terapia efetiva, é comparável à de

indivíduos saudáveis. Existem poucos relatos na literatura sobre a produção de

grânulos de linfócitos em imunidade a micobactérias em pacientes infectados

pelo HIV. Vários relatos mostraram que a produção de grânulos após a

estimulação com peptídeos ou proteínas do capsídio do HIV é reduzida com a

progressão da infecção em adultos e crianças47-48. Quanto à progressão da

infecção, em uma coorte pediátrica, demonstrou maior preservação da produção

de grânulos em progressores lentos49. A produção de grânulos para outros

antígenos, como os derivados do vírus Varicela-Zoster, mostrou-se menor em

crianças infectadas do que em controles saudáveis50. No entanto, a produção de

grânulos para proteínas do capsídio viral pode se recuperar nos casos de terapia

eficaz51-52. Em relação aos fosfoantígenos, capazes de estimular a produção de

grânulos por linfócitos T gama-delta, um estudo observou uma relação direta

com a preservação do número de linfócitos T CD4+ 53. Em um estudo, em adultos

coinfectados com HIV e tuberculose latente, demonstrou que a expressão de

CD107a por linfócitos T CD8+ era menor em pacientes infectados pelo HIV do

que em indivíduos soronegativos42.

Avaliados em conjunto com a literatura, nossos achados sugerem que a

produção de grânulos pode ser preservada em indivíduos infectados pelo HIV

em terapia efetiva. A preservação deste importante mecanismo de defesa contra

micobactérias pode ser relevante no contexto de uma infecção crônica.

A expressão significativamente menor de CD107a, pelos linfócitos T

gama-delta, em resposta ao mitógeno, observada em jovens infectados, pode

sugerir que a recuperação imune proporcionada pela terapia antirretroviral não

está completa, dada a cronicidade da infecção no grupo de pacientes. Em um

cenário análogo (estímulo com Forbol-Acetil Miristato e Ionomicina), observou-

se funcionalidade e quantidade reduzidas de linfócitos T gama-delta de mucosa

intestinal, em adultos com infecção crônica11.

55

No grupo de pacientes infectados pelo HIV, observamos maior expressão

de HLA-DR por células T CD8+ não estimuladas e após estímulo com o antígeno

Mtb. Estes resultados, em nossa opinião, podem refletir um estado de ativação

inflamatória secundária a doença crônica, mesmo tratada adequadamente, no

grupo HIV. A importância desta inflamação e ativação persistentes tem sido

destacada como uma das causas da morbidade sustentada em coortes de

indivíduos infectados com tratamento bem sucedido54.

Na subpopulação TCR-γδ estimulada com antígenos micobacterianos

(BCG e Mtb), não foram observadas diferenças na expressão de HLA-DR. Essas

descobertas provavelmente sugerem semelhanças na capacidade de resposta

específica ao antígeno em jovens infectados pelo HIV, provavelmente em

consequência do tratamento efetivo. Não encontramos relatos de investigações

semelhantes na literatura. Existem estudos em algumas situações relacionadas,

com resultados contrastantes. Foi relatado uma maior proporção de TCR-γδ +

HLA-DR+ em pacientes infectados pelo HIV com tuberculose ativa quando

comparados aos controles saudáveis. Esses achados sugerem que essa maior

expressão resulta da exposição anterior aos antígenos micobacterianos55. No

entanto, não é possível indicar se essa resposta está correlacionada com a

proteção.

Em nosso estudo, a expressão do fenótipo de células apresentadoras de

antígenos (HLA-DR+, CD80+ e CD86+), após a estimulação com antígenos

micobacterianos, foi identificada em ambos os grupos, na subpopulação TCR γδ.

Este fenótipo é encontrado em células apresentadoras de antígenos

profissionais13. Um estudo demonstrou experimentalmente que esta

subpopulação de linfócitos seria capaz de realizar esta função56. Não

encontramos na literatura nenhum estudo que identifique esta função em

pacientes infectados pelo HIV após a estimulação com antígenos

micobacterianos. A relevância desta função é potencialmente alta, considerando

a importância epidemiológica da coinfecção HIV-tuberculose.

Observamos que, no grupo de jovens infectados pelo HIV, os números

absolutos da subpopulação de linfócito T γδ não foram diferentes dos controles

saudáveis. Esta característica foi descrita como uma das principais disfunções

56

imunológicas observadas no contexto da infecção pelo HIV por outros

pesquisadores, em adultos30. Interpretamos que a heterogeneidade na

composição de populações infectadas pode explicar tais diferenças.

As alterações imunológicas observadas no grupo de pacientes infectados

pelo HIV em aspectos específicos da resposta antimicobacteriana e estimulada

por mitógenos podem refletir a cronicidade da infecção num cenário de

tratamento relativamente tardio. A mediana de início da TARC no grupo de

pacientes foi de 4,69 anos, refletindo as mudanças progressivas nas diretrizes

terapêuticas. Atualmente, o início do tratamento é preconizado imediatamente

após o diagnóstico. Estudos biomédicos e clínicos demonstraram que o

tratamento precoce, com seu efeito redutor sobre a replicação e a formação de

reservatórios virais, está associado a melhor prognóstico para reconstituição

imunológica, sobrevida e a qualidade de vida57.

Em nossa interpretação, a principal limitação de nosso estudo é o

tamanho de amostra relativamente baixo, que pode ter dificultado a revelação de

diferenças estatísticas. No entanto, esta mesma limitação é observada em

diversos relatos semelhantes na literatura biomédica. Como principais razões

para a amostra relativamente pequena, podemos destacar os custos de

reagentes e a irregularidade da frequência a consultas de alguns pacientes.

Muitos pacientes não eram moradores da cidade de Campinas, sendo

dependentes de transporte público fornecido por prefeituras, dificultando a vinda

em datas previamente marcadas.

Como limitação adicional, a análise de nossos resultados sofreu prejuízos

potenciais com a impossibilidade de definir a exposição prévia ao Mtb, tanto

entre os pacientes como entre os membros do grupo de controle. Tal deficiência

deveu-se à indisponibilidade do reagente Purified Protein Derivative (PPD). A

falta do reagente ocorreu devido a uma redução internacional de sua

disponibilidade entre 2014 e 2017, coincidindo com a fase de trabalho de campo.

Tal carência foi reconhecida por pesquisadores internacionais, que destacaram

seu impacto sobre a saúde pública e individual58.

Por último, deve ser destacada a originalidade de nossa abordagem. São

escassos os relatos na literatura abordando a resposta citotóxica, apresentação

57

de antígeno e ativação imunológica a antígenos micobacterianos em pacientes

infectados pelo HIV. Desta forma, a comparação de nossos resultados com

relatos semelhantes foi prejudicada.

58

7. CONCLUSÃO

Nossos resultados sugerem que os jovens infectados pelo HIV, que

possuem um tratamento eficaz, preservaram a capacidade de produção de

grânulos por linfócitos T CD8+ e γδ em resposta a antígenos micobacterianos.

Em jovens com imunossupressão grave, tal capacidade apresentou maior

expressão em resposta ao estímulo com fitohemaglutinina.

Os marcadores de ativação espontânea e após estímulo com o antígeno

Mtb apresentaram maior expressão em linfócitos T CD8+ em jovens infectados

pelo HIV.

Não houve diferenças em relação ao fenótipo de apresentação de

antígeno, entre os dois grupos, para todos os estímulos.

De forma geral, as diferenças de resposta a antígenos micobacterianos e

mitógenos no grupo de jovens infectados pelo HIV podem refletir a

heterogeneidade na idade de início e na eficácia do tratamento, bem como

aspectos particulares da interação entre agente infeccioso e sistema imune.

Estes resultados sugerem a importância do acompanhamento cuidadoso

desta população, a fim de avaliar sua capacidade de resposta a micobactérias

ao longo da vida.

59

REFERÊNCIAS

1. Kaufmann SH. EFIS lecture. Immune response to tuberculosis: How to control

the most successful pathogen on earth. Immunol Lett. 2016 Jul;175:50-7.

2. World Health Organization - Global Tuberculosis Report. 2016.

3. Barberis I, Bragazzi NL, Galluzzo L, Martini M. The history of tuberculosis:

from the first historical records to the isolation of Koch's bacillus. J Prev Med

Hyg. 2017 Mar;58(1):E9-E12.

4. Seddon JA, Shingadia D. Epidemiology and disease burden of tuberculosis in

children: a global perspective. Infect Drug Resist. 2014 Jun 18;7:153-65.

5. Marais BJ, Schaaf HS. Tuberculosis in children. Cold Spring Harb Perspect

Med. 2014 Jul 18;4(9):a017855.

6. Pai M, Behr MA, Dowdy D, Dheda K, Divangahi M, Boehme CC, Ginsberg A,

Swaminathan S, Spigelman M, Getahun H, Menzies D, Raviglione M.

Tuberculosis. Nat Rev Dis Primers. 2016 Oct 27;2:16076.

7. Delogu G, Sali M, Fadda G. The biology of mycobacterium tuberculosis

infection. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2013 Nov 16;5(1):e2013070.

8. Saraav I, Singh S, Sharma S. Outcome of Mycobacterium tuberculosis and

Toll-like receptor interaction: immune response or immune evasion? Immunol

Cell Biol. 2014 Oct;92(9):741-6.

9. Chen ZW. Multifunctional immune responses of HMBPP-specific Vγ2Vδ2 T

cells in M. tuberculosis and other infections. Cell Mol Immunol. 2013

Jan;10(1):58-64. doi: 10.1038/cmi.2012.46.

60

10. Qaqish A, Huang D, Chen CY, Zhang Z, Wang R, Li S, Yang E, Lu Y, Larsen

MH, Jacobs WR Jr, Qian L, Frencher J, Shen L, Chen ZW. Adoptive Transfer of

Phosphoantigen-Specific γδ T Cell Subset Attenuates Mycobacterium

tuberculosis Infection in Nonhuman Primates. J Immunol. 2017 Jun

15;198(12):4753-4763.

11. Cimini E, Agrati C, D'Offizi G, Vlassi C, Casetti R, Sacchi A, Lionetti R,

Bordoni V, Tumino N, Scognamiglio P, Martini F. Primary and Chronic HIV

Infection Differently Modulates Mucosal Vδ1 and Vδ2 T-Cells Differentiation

Profile and Effector Functions. PLoS One. 2015 Jun 18;10(6):e0129771.

12. Cruz-Adalia A, Veiga E. Close Encounters of Lymphoid Cells and Bacteria.

Front Immunol. 2016 Oct 7;7:405.

13. Moser B, Brandes M. Gammadelta T cells: an alternative type of professional

APC. Trends Immunol. 2006 Mar;27(3):112-8. Epub 2006 Jan 25.

14. Chien YH, Meyer C, Bonneville M. γδ T cells: first line of defense and beyond.

Annu Rev Immunol. 2014 ;32:121-55.

15. Chen ZW. Protective immune responses of major Vγ2Vδ2 T-cell subset in M.

tuberculosis infection. Curr Opin Immunol. 2016 Oct;42:105-112.

16. Stenger S. Cytolytic T cells in the immune response to mycobacterium

tuberculosis. Scand J Infect Dis. 2001;33(7):483-7.

17. Mangtani P, Abubakar I, Ariti C, Beynon R, Pimpin L, Fine PE, Rodrigues LC,

Smith PG, Lipman M, Whiting PF, Sterne JA. Protection by BCG vaccine against

tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis.

2014 Feb;58(4):470-80.

61

18. Pereira SM, Dantas OM, Ximenes R, Barreto ML. [BCG vaccine against

tuberculosis: its protective effect and vaccination policies]. Rev Saude Publica.

2007 Sep;41 Suppl 1:59-66.

19. Geadas C, Stoszek SK, Sherman D, Andrade BB, Srinivasan S, Hamilton CD,

Ellner J. Advances in basic and translational tuberculosis research: Proceedings

of the first meeting of RePORT international. Tuberculosis (Edinb). 2017

Jan;102:55-67.

20. Mazzola TN, Da Silva MT, Moreno YM, Lima SC, Carniel EF, Morcillo AM,

Antonio MA, Zanolli ML, Netto AA, Blotta MH, Raw I, Vilela MM. Robust

gammadelta+ T cell expansion in infants immunized at birth with BCG vaccine.

Vaccine. 2007 Aug 21;25(34):6313-20.

21. Dockrell HM, Smith SG. What Have We Learnt about BCG Vaccination in the

Last 20 Years? Front Immunol. 2017 Sep 13;8:1134. doi:

10.3389/fimmu.2017.01134. eCollection 2017. Review.

22. UNAIDS. Global Aids update. Geneva, 2016. Disponível em:

www.unaids.org. Acesso em 02 de junho de 2017.

23. Brasil. Ministério da Saúde – Secretaria de Vigilância em Saúde –

Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais. Boletim Epidemiológico – AIDS

e DST. Ano V - no 1 - 01a a 26a - semanas epidemiológicas - janeiro a junho de

2016. Brasília, 2016. Disponível em:

http://www.aids.gov.br/sites/default/files/anexos/publicacao/2016/59291/boletim

_2016_1_pdf_16375.pdf. Acesso em 21.04.2017.

24. Deeks SG, Overbaugh J, Phillips A, Buchbinder S. HIV infection. Nat Rev Dis

Primers. 2015 Oct 1;1:15035.

25. Goudsmit J. Viral Sex: the nature of AIDS. Oxford, Reino Unido. Oxford

University Press, 1998. 288 pp. Série: Nature of AIDS.

62

26. Becerra JC, Bildstein LS, Gach JS. Recent Insights into the HIV/AIDS

Pandemic. Microb Cell. 2016 Sep 5;3(9):451-475.

27. Luzuriaga K, Mofenson LM. Challenges in the Elimination of Pediatric HIV-1

Infection. N Engl J Med. 2016 Feb 25;374(8):761-70.

28. Luzuriaga K, Sullivan JL. Viral and immunopathogenesis of vertical HIV-1

infection. Pediatr Clin North Am. 2000 Feb;47(1):65-78.

29. Agrati, C.; D'Offizi, G.; Gougeon, ML.; Malkovsky, M.; Sacchi, A.; Casetti, R.

(2011) Innategamma/delta T-cells during HIV infection: Terra relatively Incognita

in novel vaccination strategies? AIDS Rev 13: 3–12.

30. Pauza CD, Poonia B, Li H, Cairo C, Chaudhry S. γδ T Cells in HIV Disease:

Past, Present, and Future. Front Immunol. 2015 Jan 30;5:687.

31. Martini, F.; Urso, R.; Gioia, C.; De Felici, A.; Narciso, P.; Amendola, A. (2000)

Gamma Delta T-cell anergy in human immunodeficiency virus-infected persons

with opportunistic infections and recovery after highly active antiretroviral therapy.

Immunology 100:481–486.

32. Jensen SS, Fomsgaard A, Larsen TK, Tingstedt JL, Gerstoft J, Kronborg G,

Pedersen C, Karlsson I. Initiation of Antiretroviral Therapy (ART) at Different

Stages of HIV-1 Disease Is Not Associated with the Proportion of Exhausted

CD8+ T Cells. PLoS One. 2015 Oct 1;10(10):e0139573.

33. Muenchoff M, Adland E, Karimanzira O, Crowther C, Pace M, Csala A,

Leitman E, Moonsamy A, McGregor C, Hurst J, Groll A, Mori M, Sinmyee S,

Thobakgale C, Tudor-Williams G, Prendergast AJ, Kloverpris H, Roider J, Leslie

A, Shingadia D, Brits T, Daniels S, Frater J, Willberg CB, Walker BD, Ndung'u T,

Jooste P, Moore PL, Morris L, Goulder P. Nonprogressing HIV-infected children

share fundamental immunological features of nonpathogenic SIV infection. Sci

Transl Med. 2016 Sep 28;8(358):358ra125.

63

34. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde.

Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais. Brasília (DF). 2014. Protocolo

Clinico e Diretrizes Terapêuticas para manejo da Infecção Pelo HIV em Crianças

e Adolescentes. Brasília: Ministério da Saúde, 2014. 240 p: il.

35. Cruz ML, Cardoso CA. Perinatally infected adolescents living with human

immunodeficiency virus (perinatally human immunodeficiency virus). World J

Virol. 2015 Aug 12;4(3):277-84.

36. Deeks SG, Lewin SR, Ross AL, Ananworanich J, Benkirane M, Cannon P,

Chomont N, Douek D, Lifson JD, Lo YR, Kuritzkes D, Margolis D, Mellors J,

Persaud D, Tucker JD, Barre-Sinoussi F; International AIDS Society Towards a

Cure Working Group, Alter G, Auerbach J, Autran B, Barouch DH, Behrens G,

Cavazzana M, Chen Z, Cohen ÉA, Corbelli GM, Eholié S, Eyal N, Fidler S, Garcia

L, Grossman C, Henderson G, Henrich TJ, Jefferys R, Kiem HP, McCune J,

Moodley K, Newman PA, Nijhuis M, Nsubuga MS, Ott M, Palmer S, Richman D,

Saez-Cirion A, Sharp M, Siliciano J, Silvestri G, Singh J, Spire B, Taylor J,

Tolstrup M, Valente S, van Lunzen J, Walensky R, Wilson I, Zack J. International

AIDS Society global scientific strategy: towards an HIV cure 2016. Nat Med. 2016

Aug;22(8):839-50.

37. Goulder PJ, Lewin SR, Leitman EM. Paediatric HIV infection: the potential for

cure. Nat Rev Immunol. 2016 Apr;16(4):259-71.

38. Montagnani C, Chiappini E, Bonsignori F, Galli L, de Martino M. Long-term

effect of highly active antiretroviral therapy on immunologic features in children.

Pediatr Infect Dis J. 2015 May;34(5 Suppl 1):S36.

39. Rockwood N, Wilkinson RJ. Understanding and intervening in HIV-associated

tuberculosis. Clin Med (Lond). 2015 Dec;15 Suppl 6:s43-9.

40. Tiberi S, Carvalho AC, Sulis G, Vaghela D, Rendon A, Mello FC, Rahman A,

Matin N, Zumla A, Pontali E. The cursed duet today: Tuberculosis and HIV-

coinfection. Presse Med. 2017 Mar;46(2 Pt 2):e23-e39.

64

41. Jasenosky LD, Scriba TJ, Hanekom WA, Goldfeld AE. T cells and adaptive

immunity to Mycobacterium tuberculosis in humans. Immunol Rev. 2015

Mar;264(1):74-87.

42. Kalokhe AS, Adekambi T, Ibegbu CC, Ray SM, Day CL, Rengarajan J.

Impaired degranulation and proliferative capacity of Mycobacterium tuberculosis-

specific CD8+ T cells in HIV-infected individuals with latent tuberculosis. J Infect

Dis. 2015 Feb 15;211(4):635-40.

43. Rojas RE, Chervenak KA, Thomas J, Morrow J, Nshuti L, Zalwango S,

Mugerwa RD, Thiel BA, Whalen CC, Boom WH. Vdelta2+ gammadelta T cell

function in Mycobacterium tuberculosis- and HIV-1-positive patients in the United

States and Uganda: application of a whole-blood assay. J Infect Dis. 2005 Nov

15;192(10):1806-14.

44. Du Bruyn E, Wilkinson RJ. The Immune Interaction between HIV-1 Infection

and Mycobacterium tuberculosis. Microbiol Spectr. 2016 Dec;4(6).

45. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde.

Departamento de Vigilância das Doenças Transmissíveis. Manual de Normas e

Procedimentos para Vacinação. Brasília: Ministério da Saúde, 2014. 176 p: il.

46. Brasil. Ministério da Saúde. Conselho Nacional de Saúde. Resolução no 466,

de 12 de dezembro de 2012. Publicada no DOU nº 12 – quinta-feira, 13 de junho

de 2013 – Seção 1 – Página 59.

47. Jones N, Eggena M, Baker C, Nghania F, Baliruno D, Mugyenyi P, Ssali F,

Barugahare B, Cao H. Presence of distinct subsets of cytolytic CD8+ T cells in

chronic HIV infection. AIDS Res Hum Retroviruses. 2006 Oct;22(10):1007-13.

48. Ssewanyana I, Elrefaei M, Dorsey G, Ruel T, Jones NG, Gasasira A, Kamya

M, Nakiwala J, Achan J, Charlebois E, Havlir D, Cao H. Profile of T cell immune

responses in HIV-infected children from Uganda. J Infect Dis. 2007 Dec

1;196(11):1667-70.

65

49. Thobakgale CF, Streeck H, Mkhwanazi N, Mncube Z, Maphumulo L, Chonco

F, Prendergast A, TudorWilliams G, Walker BD, Goulder PJ, Altfeld M, Ndung'u

T. Short communication: CD8(+) T cell polyfunctionality profiles in progressive

and nonprogressive pediatric HIV type 1 infection. AIDS Res Hum Retroviruses.

2011 Sep;27(9):1005-12.

50. Weinberg A, Huang S, Song LY, Fenton T, Williams P, Patterson J, Tovar-

Salazar A, Levin MJ. Immune correlates of herpes zoster in HIV-infected children

and youth. J Virol. 2012 Mar;86(5):2878-81.

51. Pallikkuth S, Fischl MA, Pahwa S. Combination antiretroviral therapy with

raltegravir leads to rapid immunologic reconstitution in treatment-naive patients

with chronic HIV infection. J Infect Dis. 2013 Nov 15;208(10):1613-23.

52. Jensen SS, Tingstedt JL, Larsen TK, Brandt L, Gerstoft J, Kronborg G,

Pedersen C, Fomsgaard A, Karlsson I. HIV-Specific CD8+ T Cell-Mediated Viral

Suppression Correlates With the Expression of CD57. J Acquir Immune Defic

Syndr. 2016 Jan 1;71(1):8-16.

53. Casetti R, De Simone G, Sacchi A, Rinaldi A, Viola D, Agrati C, Bordoni V,

Cimini E, Tumino N, Besi F, Martini F. Vγ9Vδ2 T-Cell Polyfunctionality Is

Differently Modulated in HAART-Treated HIV Patients according to CD4 T-Cell

Count. PLoS One. 2015 Jul 10;10(7):e0132291.

54. Hileman CO, Funderburg NT. Inflammation, Immune Activation, and

Antiretroviral Therapy in HIV. Curr HIV/AIDS Rep. 2017 Jun;14(3):93-100.

55. Pinheiro MB, Antonelli LR, Sathler-Avelar R, Vitelli-Avelar DM, Spindola-de-

Miranda S, Guimarães TM, Teixeira-Carvalho A, Martins-Filho OA, Toledo VP.

CD4-CD8-αβ and γδ T cells display inflammatory and regulatory potentials during

human tuberculosis. PLoS One. 2012;712):e50923. doi:

10.1371/journal.pone.0050923.

66

56. Brandes M, Willimann K, Bioley G, Lévy N, Eberl M, Luo M, Tampé R, Lévy

F, Romero P, Moser B. Cross-presenting human gammadelta T cells induce

robust CD8+ alphabeta T cell responses. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Feb

17;106(7):2307-12. doi: 10.1073/pnas.0810059106.

57. Smith C, McFarland EJ. Update on Pediatric Human Immunodeficiency Virus

Infection: Paradigms in Treatment and Prevention. Adv Pediatr. 2016

Aug;63(1):147-71.

58. Tebruegge M, Buonsenso D, Brinkmann F, Noguera-Julian A, Pavić I, Arbore

AS, Vančíková Z, Velizarova S, Welch SB, Ritz N; Paediatric Tuberculosis

Network European Trials Group (ptbnet). European shortage of purified protein

derivative and its impact on tuberculosis screening practices. Int J Tuberc Lung

Dis. 2016 Oct;20(10):1293-1299.

67

ANEXOS

ANEXO 1

CLASSIFICAÇÃO CLÍNICA E IMUNOLÓGICA DA INFECÇÃO PELO HIV

EM PEDIATRIA - MINISTÉRIO DA SAÚDE - BRASIL

CATEGORIAS CLÍNICAS

CATEGORIA N – ASSINTOMÁTICA:

Ausência de sinais e/ou sintomas ou com apenas uma das condições da

categoria A.

CATEGORIA A – SINAIS E/OU SINTOMAS LEVES:

Presença de 2 ou mais das condições abaixo, porém sem nenhuma das

condições das categorias B e C:

• linfadenopatia (maior que 0,5 cm em mais de 2 cadeias diferentes);

• hepatomegalia;

• esplenomegalia;

• parotidite; e

• infecções persistentes ou recorrentes de vias aéreas superiores

(otite média ou sinusite).

68

CATEGORIA B – SINAIS E/OU SINTOMAS MODERADOS:

• anemia (Hb < 8g/dl), neutropenia (<1.000/ mm3) ou trombocitopenia (<

100.000/ mm3), por mais de 30 dias;

• meningite bacteriana, pneumonia ou sepse;

• TB pulmonar (critérios CDC modificados pelo MS)

• candidíase oral persistindo por mais de 2

meses

• miocardiopatia;

• infecção por Citomegalovírus (CMV), antes de 1 mês de vida;

• diarréia recorrente ou crônica;

• hepatite;

• estomatite pelo vírus do Herpes Simples

(HSV) recorrente (mais do que 2 episó- dios/ano);

• pneumonite ou esofagite por HSV, com início antes de 1 mês de vida;

• herpes zoster, com 2 episódios ou mais de um dermátomo;

• pneumonia intersticial linfocítica (LIP);

• nefropatia;

69

• nocardiose;

• febre persistente (> 1 mês);

• toxoplasmose antes de 1 mês de vida; e

• varicela disseminada ou complicada.

CATEGORIA C – SINAIS E/OU SINTOMAS GRAVES.

Crianças com quaisquer das condições listadas abaixo:

2 episódios em intervalo de 1 ano): sepse, pneumonia, meningite, infecções

osteo- articulares, abscessos de órgãos internos;

• candidíase esofágica ou pulmonar;

• coccidioidomicose disseminada;

• criptococose extra-pulmonar;

• criptosporidíase ou isosporíase com diarréia (> 1 mês);

• CMV em locais além do fígado, baço ou linfonodos, a partir de 1 mês de

vida;

• encefalopatia pelo HIV (achados que per- sistem por mais de 2 meses),

em razão de: a) déficit do desenvolvimento neuropsi-

comotor;

b) evidência de déficit do crescimento cerebral ou microcefalia adquirida

identificada por medidas de perímetro cefálico ou atrofia cortical mantida em

tomogra- fias computadorizadas ou ressonâncias magnéticas sucessivas de

crânio; e

70

c) déficit motor simétrico com 2 ou mais dos seguintes achados: paresias, refle-

xos patológicos, ataxia e outros;

• infecção por HSV, úlceras mucocutâne- as com duração maior do que

1 mês ou pneumonite ou esofagite (crianças > 1 mês de vida);

• Infecções bacterianas graves, múltiplas ou recorrentes (confirmadas

por cultura,

histoplasmose disseminada;

• Mycobacterium tuberculosis disseminada ou extrapulmonar;

• Mycobacterium, outras espécies ou não identificadas, disseminadas;

• Mycobacterium avium ou M. kansasii dis- seminados;

• pneumonia por Pneumocystis jiroveci;

• salmonelose disseminada recorrente;

• toxoplasmose cerebral com início após o 1º mês de vida;

• síndrome da caquexia, manifestada por:

a) perda de peso > 10% do peso anterior;

ou

b) queda de dois ou mais percentis nas tabelas de peso para a idade; ou

c) peso abaixo do percentil 5, em duas medidas sucessivas; e

d) diarréia crônica (duração maior que 30 dias); ou

e) febre por 30 dias ou mais, documentada.

• leucoencefalopatia multifocal progressiva;

71

• sarcoma de Kaposi; e

• linfoma primário do cérebro ou outros linfomas

CATEGORIAS IMUNOLÓGICAS

ALTERAÇÃO

IMUNOLÓGICA

CONTAGEM DE LT CD4+

IDADE

< 12 meses 1 a 5 anos 6 a 12 anos

Ausente (1) > 1500 (> 25%) ≥ 1000 (≥ 25%) ≥ 500 (≥ 25%)

Moderada (2) 750-1499

(15-24%)

500 - 999

(15 - 24%)

200 - 499

(15 - 24%)

Grave (3) < 750 (< 15%) < 500 (< 15%) < 200 (< 15%)

72

ANEXO 2

COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - DECLARAÇÃO 286.070 / 2013

75

ANEXO 3

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)

Projeto: Resposta Imune ao Mycobacterium tuberculosis em Crianças e Adolescentes

Infectados pelo HIV

Pesquisador responsável: Paulo César Martins Alves

Objetivo da pesquisa:

Fui informado (a) que o objetivo deste trabalho é pesquisar como as células

brancas do sangue de crianças e adolescentes, infectados ou não pelo HIV, respondem

à presença de partículas de bactérias causadoras da tuberculose. Para que este estudo

seja realizado as células brancas do sangue serão submetidas a testes laboratoriais que

visem aumentar seu número e estimular a produção de substâncias contra as partículas

bacterianas.

Neste tipo de pesquisa, os resultados dos pacientes acometidos pela doença

crônica precisam sempre ser comparados com os resultados de controles saudáveis.

Com esta finalidade, o pesquisador gostaria de solicitar sua participação neste estudo,

onde a amostra de células brancas do seu sangue serão submetidas aos mesmos

procedimentos descritos neste termo.

Descrição dos procedimentos:

A quantidade de sangue doado será de aproximadamente 50ml.

Parte deste material será utilizada de imediato e outra parte será guardada para

outros exames posteriores, sendo que, ao final deste projeto toda amostra não utilizada

será DESCARTADA.

O sangue coletado será utilizado apenas no laboratório em que o estudo será

conduzido.

O sangue coletado não será usado em programas de doação de células, tecidos

ou órgãos.

O sangue coletado, bem como, células ou produtos derivados da amostra de

sangue não serão comercializados em nenhuma situação.

Benefícios:

Fui informado (a) de que a participação no estudo é voluntária, sem nenhum

ganho financeiro ou benefício imediato, e que estou livre para desistir em qualquer

momento da pesquisa sem sofrer qualquer tipo de retaliação e que meu atendimento ou

76

de meu (minha) filho (a) junto ao Centro de Saúde da Comunidade (CECOM) não será,

em nenhuma hipótese, prejudicado.

Os resultados obtidos com esta pesquisa poderão ajudar no entendimento de

como as células de defesa respondem a infecção pelo bacilo causador da tuberculose

e auxiliar no acompanhamento dos pacientes seguidos atualmente no ambulatório de

pediatria do HC – UNICAMP.

Transtornos ou riscos:

Fui informado (a) que não existem riscos à minha saúde ou a de meu (minha)

filho (a), ao doar sangue para realização deste estudo, a não ser os riscos comuns

inerentes da colheita de sangue.

Sigilo das informações:

Todas as informações sobre a minha participação ou de meu (minha) filho (a)

serão mantidas em segredo e nossa privacidade será preservada. Os resultados da

pesquisa serão mantidos em sigilo pelos pesquisadores e, mais tarde, publicados sem

que nossa identidade seja revelada.

Em qualquer momento, em caso de dúvida ou reclamações poderei procurar o

Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP

(telefone: 19 3521-8936 ou e-mail: [email protected]), localizado no endereço: Rua:

Tessália Vieira de Camargo, 126, Barão Geraldo – Campinas/SP ou o pesquisador

responsável: Paulo César Martins Alves (telefone: 19 3521-8988).

Declaro que li as informações contidas neste documento, tive minhas dúvidas

esclarecidas e recebi uma cópia do mesmo após concordar em participar desta

pesquisa.

Doador:.............................................................................................................................

Responsável Legal:.................................................................RG.........................Data:

Endereço:..........................................................................Telefone:...............................

__________________________________ ___________________________

Assinatura doador / Responsável Legal Assinatura do pesquisador

77

ANEXO 4

Participação no XXIV Congresso da Sociedade Brasileira de Parasitologia

XXIII Congresso Latino-americano de Parasitologia

27 a 31 de Outubro de 2015 – Salvador – BA – Brasil

Apresentação de Poster

78

ANEXO 5

Participação no XI Congreso da Sociedade Latinoamericana de Neumología

Pediátrica

XV Congreso Latinoamericano de Fibrosis Quística

XV Congresso Brasileiro de Pneumologia Pediátrica

Apresentação de 2 Pôsteres

80

ANEXO 6

Participação na IX Semana de Pesquisa da FCM – UNICAMP

Apresentação de Poster – Menção Honrosa

81

ANEXO 7

16th International Congress of Immunology - August 21st to 26st - Melbourne -

Australia

Oral presentation # 3835

"Immune Response to Mycobacterium tuberculosis in patients with

Human Immunodeficiency Virus vertical infection"

Resumo publicado em suplemento do European Journal of Immunology

Immune Response to Mycobacterium tuberculosis in patients with Human

Immunodeficiency Virus vertical infection. Alves, P.C.M., Castelhano, M.V.,

Macedo, V.S., Arrym, M.P., Mazzola, T.N., Guimarães, F., Silva, M.T.N.. ICI

2016. Melbourne, Australia. Aug 21-26, 2016. Eur. J. Immunol. 2016. 46, S1,

page 93. Meeting Abstract number 3835

84

ANEXO 8

Keystone Simposium - New developments in our basic understanding of

tuberculosis (A5)

January 14-18, 2017 - Vancouver - British Columbia - Canada

Apresentações de Pôsteres

# 1009 - "Lower cytotoxic granule release in mycobacterial-stimulated

cultures from vertically HIV-infected, BCG vaccinated adolescents"

# 3034 - "Deficient IFN-γ production in mycobacterial-stimulated cultures

from adolescents with HIV vertical infection"

universidade estadual de campinas faculdade de …...gostaria de iniciar meus agradecimentos por...

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