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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS – UNICAMP INSTITUTO DE BIOLOGIA
CARLA ALOIA CODIMA
“MAPEAMENTO METABÓLICO DE Trichoderma harzianum P49P11 EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA VISANDO AUMENTO DE PRODUÇÃO DE
GLICOSIL HIDROLASES”
“METABOLIC MAPPING OF Trichoderma harzianum P49P11 IN SUBMERGED
FERMENTATION AIMING INCREASE PRODUCTION OF GLYCOSYL HYDROLASES”
Campinas – SP
2019
Carla Aloia Codima
“MAPEAMENTO METABÓLICO DE Trichoderma harzianum P49P11 EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA VISANDO AUMENTO DE PRODUÇÃO DE
GLICOSIL HIDROLASES”
“METABOLIC MAPPING OF Trichoderma harzianum P49P11 IN SUBMERGED FERMENTATION AIMING INCREASE PRODUCTION OF GLYCOSYL
HYDROLASES”
DISSERTAÇÃO apresentada ao Instituto
de Biologia da UNICAMP como parte dos
requisitos exigidos para obtenção do título
de Mestra em Genética e Biologia
Molecular na área de Genética de
Microrganismos.
DISSERTATION presented to Institute of
Biology of UNICAMP for partial fulfillment
of the requirements for the degree of
Master in Genetic and Molecular Biology in
the area of Genetics of Microorganisms.
Orientador(a): Dra. Priscila da Silva Delabona
ESTE TRABALHO CORRESPONDE A
VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELA ALUNA CARLA ALOIA
CODIMA E ORIENTADA PELA PROFA.
DRA. PRISICILA DA SILVA DELABONA
CAMPINAS, SP 2019
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPESORCID: https://orcid.org/0000-0002-5200-5722
Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de BiologiaMara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Codima, Carla Aloia, 1986- C648m CodMapeamento metabólico de Trichoderma harzianum P49P11 em
fermentação submersa visando o aumento de produção de glicosil hidrolases /Carla Aloia Codima. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
CodOrientador: Priscila da Silva Delabona. CodCoorientador: Geizecler Tomazetto. CodDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Biologia.
Cod1. Glicosídeo hidrolases. 2. Hidrólise enzimática. 3. Trichoderma. 4.
Bioreatores. I. Delabona, Priscila da Silva. II. Tomazetto, Geizecler, 1979-. III.Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Metabolic mapping of Trichoderma harzianum P49P11 insubmerged fermentation aiming increase production of glycosyl hydrolasesPalavras-chave em inglês:Glycosyl hydrolasesEnzymatic hydrolysisTrichodermaBioreactorsÁrea de concentração: Genética de MicroorganismosTitulação: Mestra em Genética e Biologia MolecularBanca examinadora:Priscila da Silva Delabona [Orientador]Aline Carvalho da CostaCristiane Sanchez FarinasData de defesa: 04-02-2019Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
1698892
Comissão Examinadora:
Dra. Aline Carvalho da Costa
Dra. Cristiane Sanchez Farinas
Dra. Priscila da Silva Delabona
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se
encontra no processo de vida acadêmica da aluna.
Agradecimento
A Deus e a São José por permitirem a oportunidade de cursar a pós-
graduação.
À Universidade Estadual de Campinas, seu corpo docente, direção e
administração que oportunizaram esta conquista.
Ao Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol – CTBE e
ao Laboratório Nacional de Biociências – LNBio pelo uso das instalações.
Às orientadoras Priscila Delabona e Geizecler Tomazetto, pelo empenho,
dedicação e paciência por me guiarem ao longo deste projeto.
Aos colegas de laboratório, especialmente a Deise, pelas experiências e
aprendizados que compartilharam comigo.
A minha família, pelo amor, incentivo e apoio incondicional.
A todos que participaram da minha formação, muito obrigada!
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de
Financiamento 001. Número do processo: 1698892.
This study was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. Process number:
1698892.
RESUMO
Diversos micro-organismos como fungos e bactérias são capazes de
produzir enzimas lignocelulósicas para a degradação de biomassas. Fungos
filamentosos, em específico, têm sido tradicionalmente utilizados para produção de
complexos enzimáticos aplicados na hidrólise destes materiais, devido a capacidade
de produção de coquetéis enzimáticos com alta atividade e especificidade.
Visando o aprimoramento da etapa da hidrólise na produção de bioetanol,
o objetivo desse trabalho foi investigar o potencial do micro-organismo Trichoderma
harzianum P49P11 quanto à produção de enzimas degradadoras de biomassa. A
linhagem do fungo isolada na Amazônia foi sequenciada e revelou a presença de 689
CAZymes - carbohydrate-active enzymes - preditas em seu genoma. Também foram
feitas anotações funcionais para genes relacionados a produção de metabólitos
secundários, devido aos fungos serem conhecidos pela vasta produção de compostos
bioativos e por esses apresentarem possível influência na regulação de CAZymes.
O cultivo do micro-organismo em biorreatores, utilizando celulose cristalina
como fonte de carbono, foi analisado em tempo real quanto aos parâmetros de pH,
temperatura, agitação, aeração e demanda de oxigênio. Através da comparação com
resultados de biomassa do fungo e do espectrômetro de gases, pode-se distinguir
comportamentos específicos na fase de crescimento do micro-organismo como a
variação de pH, DO e aeração e na fase estacionária, a produção enzimática. A
composição do sobrenadante durante o cultivo foi analisada pelo espectrômetro de
massas, revelando a presença de 42 metabólitos (47,62% aminoácidos, 21,43%
açúcares e 14,28% compostos orgânicos). Também foi analisado o secretoma do
micro-organismo e constatada a presença de 108 proteínas totais, sendo que 50 são
CAZymes (40 glicosil hidrolases, 5 carboidrato esterases, 5 proteínas com atividades
auxiliares, 12 domínios com ligação a carboidratos associados a outro domínio
catalítico), que participam do processo de hidrólise da biomassa. O fungo é candidato
à aplicação em larga escala, pois sua produtividade enzimática alcançou 10,14
FPU/L.h, em 72 horas de cultivo, com atividade enzimática específica de 220 U/ml em
xilanase - representando a degradação de hemicelulose pelas enzimas GH10, GH11
e GH30 encontradas no secretoma - e 2,21 U/ml de β-glucosidase – representando a
degradação de celulose por GH3, GH30-3, GH30-7, presentes no secretoma.
ABSTRACT
Several microorganisms such as fungi and bacteria are able to produce
lignocellulosic enzymes for the degradation of biomasses. Filamentous fungi, in
particular, have been traditionally used to produce enzymatic complexes applied to the
hydrolysis of these materials due to the capacity of producing enzymatic cocktails with
high activity and specificity.
Aiming to improve the hydrolysis step in the production of bioethanol, the
objective of this study was investigating the potential of the microorganism
Trichoderma harzianum P49P11 for the production of biomass-degrading enzymes.
The isolated fungus strain from the Amazon was sequenced and revealed the
presence of 689 CAZymes - carbohydrate-active enzymes - predicted in its genome.
Functional annotations have also been made for genes related to the production of
secondary metabolites due to the fungi being well-known for the vast production of
bioactive compounds and also because they have a potential influence on the
regulation of CAZymes.
The culture of the microorganism in bioreactors, using crystalline cellulose
as carbon source, was analyzed in real time for parameters as pH, temperature,
agitation, aeration and oxygen demand. Through the comparison with biomass results
of the fungus and the gas spectrometer, specific behaviors can be distinguished in the
growth phase of the microorganism such as pH variation, DO, aeration and in the
stationary phase, the enzymatic production. The composition of the supernatant during
the culture was analyzed by the mass spectrometer, revealing the presence of 42
metabolites (47.62% amino acids, 21.43% sugars and 14.28% organic compounds).
We also analyzed the secretome of the microorganism and found the presence of 108
total proteins, of which 50 are CAZymes (40 glycosyl hydrolases, 5 carbohydrate
esterases, 5 proteins with auxiliary activities, 12 carbohydrate-binding modules
associated with another catalytic domain), which participate in the biomass hydrolysis
process. The fungus is a candidate for large scale application, due to the enzymatic
productivity reached 10.14 FPU / Lh, in 72 hours of culture, with specific enzymatic
activity of 220 U / ml in xylanase - representing the degradation of hemicellulose by
the enzymes GH10, GH11 and GH30 found in the secretome - and 2.21 U / ml β-
glucosidase - representing the degradation of cellulose by GH3, GH30-3, GH30-7,
present in the secretome.
Lista de Abreviaturas e Siglas AA – proteínas com atividades auxiliares
CAZy - plataforma de dados com enzimas degradadoras de carboidrato
CAZymes - enzimas degradadoras de carboidrato
CBH - celobiohidrolases
CBM - módulo de ligação a carboidrato
CE - carboidrato esterases
CMCase - carboximetilcelulase
CTBE - Centro Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol
DNS - ácido 3-5 dinitrosalicílico
DO – demanda de oxigênio
E2G - etanol de segunda geração
FPase - atividade em papel filtro
Gasfloo- aeração
GH - glicosil hidrolases
GT - glicosil transferases
IUMBM - União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular
LNBio - Laboratório Nacional de Biociências
LPMO - mono-oxigenases líticas de polissacarídeo
MS – metabolismo secundário
NRPS - peptídeos não-ribossomais
PCA – Análise de componentes principais
PKS – policetídeo sintase
PL - liases polissacarídicas
T1- PKS – policetídeo sintase do tipo 1
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 11
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................... 13
2.1 ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO (E2G) ................................................................. 13 2.2 COMPOSIÇÃO DA BIOMASSA ................................................................................. 13 2.3 CELULOSE CRISTALINA ......................................................................................... 17 2.4 CONVERSÃO DA BIOMASSA AO BIOETANOL ............................................................. 18 2.5 HIDRÓLISE .......................................................................................................... 19 2.6 PRODUÇÃO ENZIMÁTICA ....................................................................................... 19 2.7 ENZIMAS ENVOLVIDAS NA HIDRÓLISE DA BIOMASSA ................................................ 20 2.8 PRODUÇÃO ENZIMÁTICA POR MICRO-ORGANISMOS ................................................. 24 2.8.1 O FUNGO TRICHODERMA HARZIANUM COMO PRODUTOR DE ENZIMAS ....................... 25 2.9 GENOMA ............................................................................................................. 26 2.10 METABOLISMO CELULAR ...................................................................................... 28 2.11 SECRETOMA ....................................................................................................... 30
3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 32
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 32
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 33
4.1 FLUXOGRAMA DE TRABALHO ................................................................................. 33 4.2 MICRO-ORGANISMO ............................................................................................. 33 4.3 GENOMA ............................................................................................................. 34 4.3.1 CULTIVO DA LINHAGEM E EXTRAÇÃO DO DNA ........................................................ 34 4.3.2 SEQUENCIAMENTO E ANOTAÇÃO ........................................................................... 34 4.4 PRÉ-INÓCULO PARA FERMENTAÇÃO ...................................................................... 35 4.5 FERMENTAÇÃO SUBMERSA ................................................................................... 35 4.6 AMOSTRAGEM ..................................................................................................... 35 4.7 CONCENTRAÇÃO DE CELULOSE E CÉLULA .............................................................. 36 4.8 PRODUÇÃO DE CO₂ ............................................................................................. 36 4.9 ATIVIDADES ENZIMÁTICAS E PROTEÍNAS TOTAIS ..................................................... 38 4.10 ANÁLISE DE PERFIS METABÓLICOS ........................................................................ 39 4.11 SECRETOMA ....................................................................................................... 39 4.12 MICROSCOPIA ÓPTICA .......................................................................................... 40
5 RESULTADOS .................................................................................................... 41
5.1 GENOMA ............................................................................................................. 41 5.1.1 SEQUENCIAMENTO .............................................................................................. 41 5.1.2 PREDIÇÃO DE FUNÇÃO PARA CAZYMES ................................................................ 41 5.1.3 PREDIÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS ........................................................... 43 5.2 ANÁLISE DOS PARÂMETROS DURANTE O PROCESSO FERMENTATIVO ........................ 44
5.3 ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS E CELULOSE .......................................... 47 5.4 ANÁLISE DA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA ..................................................................... 48 5.5 SECRETOMA ....................................................................................................... 50 5.6 METABOLOMA ..................................................................................................... 53 5.7 MICROSCOPIA ..................................................................................................... 56
6 DISCUSSÕES ..................................................................................................... 57
6.1 O ESTUDO GENÔMICO .......................................................................................... 57 6.2 CRESCIMENTO DO MICRO-ORGANISMO .................................................................. 59 6.3 PRODUÇÃO ENZIMÁTICA ....................................................................................... 60 6.4 METABOLOMA ..................................................................................................... 63
7 CONCLUSÕES ................................................................................................... 64
7.1 PERSPECTIVAS .................................................................................................... 65
8 REFERÊNCIA ..................................................................................................... 66
9 APÊNDICE .......................................................................................................... 81
9.1 TABELA COMPLETA DE CAZYMES PREDITAS NO GENOMA DE T. HARZIANUM P49P11 81 9.2 TABELA DE PROTEÍNAS RELACIONADAS COM METABOLISMO SECUNDÁRIO PREDITAS
NO GENOMA DE T. HARZIANUM P49P11 ................................................................ 88 9.3 GRÁFICOS GERADOS EM TEMPO REAL AO LONGO DOS 5 PROCESSOS
FERMENTATIVOS PELO SOFTWARE BIOCOMMAND BATCH CONTROL ........................ 89 9.4 TABELA COMPLETA DE CAZYMES ENCONTRADAS NO SECRETOMA DE T. HARZIANUM
P49P11 ............................................................................................................. 91
10 ANEXO ................................................................................................................ 93
10.1 DECLARAÇÃO DE BIOSSEGURANÇA ....................................................................... 93 10.2 DECLARAÇÃO DE DIREITOS AUTORAIS ................................................................... 94
11
1 INTRODUÇÃO
Dentro do contexto de mudanças climáticas e da tentativa de encontrar um
combustível a partir de fontes renováveis para substituição dos combustíveis fósseis,
surge como alternativa, a produção de etanol de segunda geração (E2G) (ROBAK et
al., 2018). O biocombustível apresenta alta octanagem e alta temperatura de
vaporização, além de mostrar a capacidade de diminuir em até 86% a taxa de emissão
de gases do efeito estufa, quando comparado a gasolina (SPYRIDON et al., 2016;
WANG, 2007).
O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, tendo grande
importância para o agronegócio brasileiro (CONAB, 2018). A partir do cultivo de cana
de açúcar, uma grande quantidade de subprodutos agroindustriais, abundantes e
baratos, é gerada, como por exemplo o bagaço, que pode constituir de matéria-prima
para a produção de etanol de segunda geração (CONAB, 2018; ZABED et al., 2016;
YUSUF et al., 2011). A safra de cana-de-açúcar destinada a etanol 2017/2018
produziu aproximadamente 343 mil toneladas, sendo que, 20-30% do peso é
composto de bagaço (NETO e MELO, 2005; CONAB, 2018), ou seja, em torno de 96
mil toneladas de bagaço foram produzidas. Atualmente esta matéria prima tem sido
usada para combustão no processo de aquecimento de caldeiras dentro das
refinarias. No entanto, podem ser destinadas a produção de bioetanol (CONAB, 2018;
REYNOL, 2009).
São necessárias 4 etapas para a produção do biocombustível, sendo elas:
pré-tratamento (a qual permite a maior exposição dos polissacarídeos ao ataque
enzimático), hidrólise (etapa na qual ocorre a despolimerização dos açúcares
constituintes da biomassa para a disponibilização de açúcares fermentescíveis como
produto), fermentação (o consumo de açúcares por micro-organismos através do
metabolismo energético gerando etanol) e por fim a destilação (etapa de separação
e concentração do etanol produzido) (SPYRIDON et al., 2016; ROBAK et al., 2018).
Um dos principais gargalos econômicos deste processo relaciona-se ao
processo de hidrólise através de enzimas específicas, necessárias à degradação dos
polímeros da biomassa. O alto custo da produção enzimática representa um dos
parâmetros com maior influência na precificação final do bioetanol (JOHNSON, 2016;
DRUZHININA & KUBICEK, 2017).
12
Diversos micro-organismos como fungos e bactérias são capazes de
produzir enzimas lignocelulósicas para a degradação da biomassa (DRUZHININA &
KUBICEK, 2016). Fungos filamentosos, em específico, têm sido tradicionalmente
utilizados para produção de complexos enzimáticos aplicados na hidrólise destes
materiais, devido a capacidade de produção de coquetéis enzimáticos com alta
atividade e especificidade (DE FRANÇA PASSOS et al., 2018).
O fungo filamentoso Trichoderma harzianum, conhecido por ser bioagente
de fungos patógenos de plantas, recebe atenção pela habilidade de degradar paredes
celulares. Devido a presença de diversas sequências de enzimas degradadoras de
carboidratos em seu genoma, bem como altos níveis de atividade enzimática, com
destaque para β-glucosidase e endoglucanases, muitos trabalhos sugerem a
utilização deste micro-organismo na produção de coquetéis (DE SOUZA et al., 2018;
HORTA et al., 2014; DELABONA et al., 2013; GÓMEZ-MENDOZA, 2014). Porém, a
composição do meio altera qualitativamente e quantitativamente a secreção de
proteínas, portanto, faz-se necessário o estudo genômico para compreender o
potencial biotecnológico de produção enzimática da espécie.
A localização dos genes responsáveis pelas enzimas degradadoras de
carboidratos (CAZymes) e de genes relacionados ao metabolismo secundário na
mesma região cromossômica demonstra a possibilidade de corregulação (FANELLI et
al, 2018). Além disso, o mapeamento destes genes pode promover a descoberta de
um número muito maior de substâncias do que aquelas já conhecidas e que
apresentem importância econômica (YAEGASHI et al., 2014; BARAL et al., 2018).
Compreender a dinâmica do metabolismo do micro-organismo pode ajudar a
elucidar fatores de influência na produção enzimática. Nesse contexto, insere-se o
presente trabalho, que teve como alvo o estudo genético do potencial biotecnológico
do micro-organismo Trichoderma harzianum P49P11 em produzir enzimas e o
entendimento bioquímico envolvido durante o processo fermentativo em biorreator, a
fim de compreender os fatores que possam influenciar a produção enzimática.
13
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Etanol de segunda geração (E2G)
O impacto ambiental, devido ao grande uso de combustíveis fósseis não
renováveis, provoca a busca por energias sustentáveis. O etanol de segunda-geração,
produzido a partir de matéria-prima lignocelulósica, surge como alternativa promissora
para substituir os combustíveis fósseis no mercado de energia nos próximos anos,
uma vez que apresenta alto índice de octanagem e alta temperatura de vaporização,
além de reduzir a produção de gases do efeito estufa, já que utiliza biomassa vegetal
como matéria prima (ROBAK, 2018; ZABED et al., 2016; SPYRIDON et al., 2016).
A produção de E2G utiliza como fonte de carbono principal a biomassa
proveniente especialmente de resíduos agroindustriais. O Brasil, por ter sua posição
consolidada no mercado agroindustrial, possui como subprodutos altas quantidades
de bagaço e palha de cana-de-açúcar, casca de arroz, sabugo e palha de milho,
produtos considerados de baixo custo e alta disponibilidade (LYND et al., 2008). Estes
compostos agrícolas são materiais lignocelulósicos formados principalmente por
celulose, hemicelulose e lignina que podem servir como fonte de biomassa na
produção de açúcares fermentescíveis (SPYRIDON, 2016).
Para que estes subprodutos sejam fermentados a etanol, a biomassa passa
por processos como pré-tratamento, hidrólise, fermentação e destilação (ZABED et
al., 2016; SPYRIDON, 2016).
2.2 Composição da biomassa
A biomassa é formada por material lignocelulósico, constituído
principalmente por três componentes: celulose, hemicelulose e lignina, além de, em
menores proporções, compostos nitrogenados, sais minerais, resinas, taninos, fenóis
e ácidos graxos (SUN & CHENG, 2002; MENON & RAO, 2012). O teor dos diferentes
componentes presentes varia entre espécies, variedade, condições de crescimento e
maturação (KIM et al., 2010; LIMA, 2002). A Tabela 1 apresenta a composição média
de celulose e hemicelulose em diferentes materiais lignocelulósicos.
14
Tabela 1. Composição média de celulose e hemicelulose em diferentes materiais lignocelulósicos.
Referência Material Celulose% Hemicelulose% Figueiredo et al., 2010 bagaço 40 30
Phan et al., 2006 fibra de coco 64 -
LV e WU et al., 2012 planta de milho 42.4 29.6
Ahmad et al., 2011 biomassa de palma 18.85 -
Perepelkins et al., 2004 fibra de algodão 97-98 -
Tyriaki et al., 2014 casca de amêndoa 21.7 27.7 Adaptado de GUPTA et al., 2016
A Figura 1 representa esquematicamente a organização das fibras
lignocelulósicas contendo celulose, hemicelulose, lignina e pectina na parede da
célula vegetal.
Figura 1. Esquema simplificado da estrutura organizacional das fibras lignocelulósicas na parede celular vegetal mostrando seus principais constituintes: celulose (amarelo), hemicelulose (azul), lignina (laranja) e pectina (vermelho). (BIDLAK et al., 1992).
A celulose (Figura 2) é um polímero linear constituído por unidades
monoméricas de celobiose, as quais são formadas por duas unidades de D-glicose,
unidas por ligações glicosídicas β-1,4 e ligações de hidrogênio, formando uma cadeia
polimérica (SUN & CHENG, 2002). As moléculas de celulose têm forte tendência para
formar ligações de hidrogênio intermoleculares (responsáveis por determinar a
rigidez) e intramoleculares (responsáveis por formar a fibra celular) (BRAGATTO,
2007). Desta forma, múltiplas ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxilas das
15
distintas cadeias justapostas de glicose originam fibras compactas, insolúveis em
diversos solventes, as quais constituem a parede celular dos vegetais (OGEDA e
PETRI, 2010, GUPTA et al., 2016).
Figura 2. Estrutura molecular do polímero de celulose (GUPTA et al., 2016).
As unidades de celulose se alinham compondo a estrutura em forma de
microfibrilas (Figura 1). Cada microfibrila consiste em aproximadamente 36 cadeias
lineares de glicose. Estas fibras constituem regiões cristalinas, moléculas altamente
ordenadas, estabilizadas por ligações de hidrogênio, além de regiões amorfas, onde
as moléculas se encontram desordenadas (Figura 3). A estrutura cristalina da celulose
se adere a outras cadeias por ligação de hidrogênio e força de Van der Waals,
formando uma estrutura altamente insolúvel (BRAGATTO, 2007; GUPTA et al., 2016).
Figura 3. Estrutura da celulose destacando a região cristalina e amorfa (SUN & CHEN, 2002).
A hemicelulose (Figura 4) é um heteropolímero composto
predominantemente por hexoses e pentoses tais como L-arabinose, D-xilose, D-
glicose, D-manose, D-galactose e ácidos urônicos (ácido D-glucorônico, β-
galacturônico e metilglucorônico) ligadas por ligação glicosídica β-1,4, formando uma
estrutura principal composta por um tipo específico de resíduo com curtas
16
ramificações. São classificadas conforme o açúcar predominante na cadeia principal
e a ramificação lateral, por exemplo arabino-xilanas, xilanas, galactomananas. Devido
a sua estrutura complexa, uma variedade de enzimas é necessária para a sua
degradação (POLIZELI et al., 2005; COLLINS et al., 2005).
A hemicelulose está intrinsicamente associada à celulose. A especificidade
da interação hemicelulose-celulose existe em função da semelhança estrutural entre
a cadeia principal deste polissacarídeo, de modo que as hemiceluloses contribuem
com o alinhamento e organização das microfibrilas de celulose, dando estabilidade e
flexibilidade ao agregado (SANTOS et al, 2012; SUN & CHENG, 2002).
Figura 4. Estrutura de hemicelulose mostrando sua cadeia principal e laterais (MUSSATTO, 2002).
A lignina (Figura 5) é uma macromolécula aromática considerada uma fonte
potencial de valiosos insumos para a indústria química, por exemplo na produção de
espumas e fibras de carbono (ROBAK, 2018; RAGAUSKAS et al., 2014). Possui
natureza química bem distinta dos carboidratos, sendo caracterizada por uma
estrutura aromática de natureza fenólica, como por exemplo, acetovanilina, ácido p-
cumárico, ácido ferúlico, ácido p-hidroxibenzóico, ácido p-hidroxibenzaldeído, ácido
siríngico, ácido vaníllico, siringaldeído, hidroquinona e vanilina. Os tipos de moléculas
presentes na composição da molécula de lignina, bem como suas proporções,
dependem da sua origem (SUN et al., 2010).
17
Figura 5. Modelo de estrutura da lignina (FENGEL e WEGNER, 1989).
Existem outros componentes presentes na biomassa que não constituem a
parede celular vegetal, sendo estes: a) os extrativos, por serem extraíveis em água,
solventes neutros ou volatilizados a vapor, por exemplo as resinas e fenóis; b) as
cinzas, materiais inorgânicos como por exemplo carbonatos alcalinos, alcalinos
terrosos e oxalatos (KLINKE et al., 2004).
2.3 Celulose cristalina
Estudos prévios realizados pelo nosso grupo compararam a indução da
secreção enzimática de T. harzianum P49P11 em diferentes substratos, utilizando
bagaço explodido deslignificado, lactose e celulose cristalina. As análises indicaram
que em bagaço, a atividade de β-glicosidase (~2,55 U/ml) e FPAse (~0,78 FPU)
apresentam valores próximos de celulose (~2,45 U/ml e ~0,88 FPU), sendo mais baixa
em lactose (~0,62 U/ml e ~0,22 FPU). Ao quantificar proteínas totais secretadas pelo
fungo, o meio utilizado com celulose cristalina se mostra com valores próximos, mas
acima dos apresentados com o uso do bagaço (~0,46 mg/mL em celulose e 0,32
18
mg/ml em bagaço) e maiores quando comparado ao meio de lactose (~0,16 mg/ml).
Resultados similares foram encontrados por Delabona (2013), quando investigou a
melhor fonte de carbono indutora de celulases, atingindo a produção de 7,15mg/L.h
de proteínas totais com biofermentação em bagaço explodido e deslignificado e
6,01mg/L.h de proteínas totais em celulose.
Estudos utilizando a celulose cristalina como indutora na produção de
glicosil hidrolases, assim como o bagaço de cana-de-açúcar, são bem documentados
(DELABONA et al., 2013; COSTA et al., 2016; LIU et al., 2017; HORTA et al., 2018).
A celulose cristalina possui sua composição caracterizada composta de 86% (±0,49)
de celulose, 14,9% (±0,22) de hemicelulose, 0,97% de lignina (±0,08) e 0,15% de
cinzas (±0,04) (BRAGA et al., 2018).
Apesar de o foco da pesquisa ser a produção de enzimas aplicadas na
degradação do bagaço de cana-de-açúcar, este não foi utilizado no momento como
substrato da fermentação devido a variação da composição, causando variação nas
análises químicas do sobrenadante. Além disso, diferentes pré-tratamentos utilizados
na fibra do bagaço causam diversidades na secreção de proteínas pelo micro-
organismo devido a diferentes necessidades de expressão de enzimas conforme a
organização e composição das fibras lignocelulósicas (ROBAK et al., 2018; GÓMEZ-
MENDOZA et al., 2014; PAULOVA et al., 2015).
2.4 Conversão da biomassa ao bioetanol
São usados dois tipos de abordagens para a conversão da biomassa em
bioetanol, sendo estes o processo termoquímico e o processo bioquímico (ROBAK,
2018). O primeiro envolve temperaturas altas para gaseificação (800 - 1000 °C) ou
pirólise (400 – 650 °C) da biomassa, reações catalíticas não biológicas e destilação
(FOUST, et al., 2009). Já o uso da conversão bioquímica não necessita de condições
extremas. Outra vantagem é que a rota bioquímica apresenta alta eficiência na
degradação da biomassa por utilizar enzimas específicas, portanto, se torna a técnica
mais utilizada. Este último processo é dividido em 4 etapas: pré-tratamento para
exposição das fibras da biomassa, hidrólise, fermentação e destilação (SPYRIDON et
al., 2016).
19
2.5 Hidrólise
Uma etapa prévia de pré-tratamento da biomassa é necessária, a fim de
remover a lignina, diminuir a cristalinidade da celulose e melhorar a área de exposição
das fibras lignocelulósicas para a hidrólise ser eficiente (BHATTACHARYA, 2008).
A proposta da etapa de hidrólise é converter os polímeros presentes na
biomassa em açúcares fermentescíveis para posterior fermentação (ROBAK, 2018).
Existem dois tipos de abordagens para a degradação dos polímeros de
celulose e hemicelulose – a hidrólise química e enzimática. O uso de ácidos em
grande quantidade faz com que a hidrólise ácida seja menos atrativa (HAMELINK et
al., 2005). A alternativa mais promissora consiste na utilização de um coquetel
enzimático capaz de hidrolisar os polissacarídeos em açúcares fermentescíveis,
porém, o alto custo desses biocatalisadores pode ser um fator limitante no processo
de obtenção do etanol de segunda geração (MARCUSCHAMER et al., 2012; ROBAK,
2018).
Uma análise técnica-econômica feita por Johnson (2016) mostra que o
custo da produção de enzimas celulolíticas representa um dos parâmetros com maior
influência na precificação final de etanol 2G. É neste ponto que muitos micro-
organismos desempenham um importante papel na produção de enzimas para
hidrólise da biomassa, pois estes produzem coquetéis enzimáticos capazes de
degradar os componentes da biomassa lignocelulósica e assim, reduzir o custo das
enzimas.
2.6 Produção enzimática
As enzimas lignocelulósicas são produzidas principalmente através de
cultivos microbianos. Distinguem-se dois tipos: fermentação no estado sólido e
fermentação submersa, sendo o teor de água no meio o fator que distingue estes
processos. Tratando-se de fungos filamentosos, a limitação de água pode ocasionar
a desnaturação de enzimas-chave no metabolismo celular e influenciar os processos
de germinação, esporulação e formação de metabólitos, além de diminuir a taxa de
crescimento microbiano e tornar mais longo o período de aclimatação das células
(GERVAIS & MOLIN, 2003).
20
A fermentação submersa é caracterizada essencialmente pelo alto teor de
água que facilita a distribuição de nutrientes e homogeneidade do sistema. Apesar de
ter maior risco de contaminação, suas vantagens, como por exemplo controle de pH,
temperatura e aeração fazem com que a maioria das enzimas comerciais sejam
produzidas através desta técnica de cultivo (SINGHANIA et al., 2010; DE FRANÇA
PASSOS et al., 2018; PEREIRA Jr. et al., 2008).
Nos processos de fermentação em estado submerso, os fungos
filamentosos sofrem diversas mudanças morfológicas. Geralmente as células dos
fungos apresentam três principais fases. A primeira fase corresponde à dilatação e
germinação dos esporos, extensão das hifas e ramificações. Na segunda fase ocorre
a formação das redes de hifas ou “biopellet”. E na terceira fase ocorre a autólise das
células (EL-ENSHASY, 2007). À medida que as hifas se estendem, o crescimento
celular dos fungos filamentosos ocorre devido ao aumento da formação das pontas.
Novas pontas formadas pela ramificação geram novos ramos que possibilitam o
aumento do crescimento superficial, melhorando a captação de nutrientes e secreção
de produtos (EL-ENSHASY, 2007).
A secreção de enzimas por fungos filamentosos se restringe principalmente
às pontas das hifas em crescimento (EL-ENSHASY, 2007). Bader (1993) propões um
modelo matemático o qual segrega as células em dois tipos – jovens e adultas –
apenas as células adultas produziriam enzimas celulolíticas. Velkovska (1997) explica
a produção enzimática baseado na ideia de que haja micélios primários e secundários,
sendo esses responsáveis pela síntese enzimática. Um modelo matemático para
descrever a produção de celulases pelo mesmo micro-organismo utilizado neste
trabalho (T. harzianum P49P11) foi desenvolvido baseado, entre outros fatores, no
crescimento celular, atingindo resultados aproximados com a cinética de produção
enzimática em biorreatores (GELAIN, 2015).
2.7 Enzimas envolvidas na hidrólise da biomassa
A secreção enzimática em células de eucariotos se inicia após a tradução
no ribossomo. As proteínas sintetizadas como precursoras, carregam um peptídeo
sinal para reconhecimento da maquinaria celular. Estes peptídeos consistem em uma
sequência de aminoácidos que direciona as proteínas ao compartimento celular
correto como por exemplo, a secreção celular (SALLESE, G., et al, 2009). Após a
21
síntese, as proteínas precursoras são encaminhadas ao retículo endoplasmático onde
são enoveladas e adquirem glicolisações. Posteriormente, as proteínas são
transportadas através de vesículas para o complexo golgiense, onde as modificações
pós traducionais são completadas. Finalmente ocorre o último estágio, quando as
vesículas que transportam as proteínas deixam o complexo golgiense e se fundem à
membrana plasmática, completando a exocitose (VALKONEN et al., 2003).
As enzimas de interesse a serem produzidas para hidrólise enzimática são
aquelas que são secretadas e capazes de degradar a biomassa, como por exemplo
celulases, hemicelulases e ligninases (VAN DICY e PLETSCHKE, 2012; BOURNE E
HENRISSAT, 2001; MINIC, 2008).
Podem ser classificadas de acordo com a especificidade ao substrato,
conforme a IUMBM – International Union of Biochemistry and Molecular Biology
propõe. Seguindo este modelo de classificação, as celulases podem ser agrupadas
com outras hemicelulases e polissacarídeos, sendo nomeadas de glicosil-hidrolases -
GHs - (EC 3.2.1.x) por agirem sobre o mesmo substrato (LYND, 2002). Com a
identificação e caracterização de muitas GHs, essa classificação se tornou
insuficiente. Um novo agrupamento das enzimas em famílias, baseado na similaridade
da sequência de aminoácidos, foi proposto e organizado no banco de dados CAZy -
Carbohydrate-Active Enzymes (HENRISSAT, 1991; CAZy, 2018). Devido as
informações obtidas sobre a estrutura terciária das proteínas, uma unidade maior
chamada - clã - foi definida de acordo com o tipo de enovelamento. Assim, duas ou
mais famílias se organizam nos 17 clãs existenste de GHs, nomeados como GH-A a
GH-Q (CAZy, 2018).
As glicosil hidrolases são uma classe de enzimas que catalisam a hidrólise
da ligação glicosídica entre dois ou mais carboidratos ou entre um carboidrato e uma
unidade não-carboidrato (LOMBARD et al, 2013). Portanto, celulases são glicosil
hidrolases que catalisam a hidrólise das ligações β-1,4 liberando açúcares
fermentesíveis (ZHANG & LYND, 2004). São classificadas em três grandes grupos,
de acordo com o sítio de clivagem: endoglucanases (clivam ligações internas da fibra
celulósica); exoglucanases (atuam na região externa da celulose) e β-glucosidases
(hidrolisam oligossacarídeos solúveis em glicose) (BAYER et al., 1998).
Endoclucanases, também conhecidas como carboximetilcelulase
(CMCase), (E.C. 3.2.1.4), são responsáveis por iniciar a degradação da fibra,
quebrando ligações internas da estrutura amorfa. Liberam glicose, celobiose e
22
celodextrina como produto, criando extremidades não redutoras para atuação
subsequente das exoglucanases (LYND et al, 2002).
Exoglucanases, incluindo celobiohidrolases - CBH - (E.C.3.2.1.91) e
glucanohidrolases - GHs – (E.C.3.2.1.74), têm maior afinidade por celulose insolúvel
ou microcristalina, liberando glicose e principalmente celobiose como produto. A CBH
hidrolisa os terminais redutores (CBH I) e não redutores (CBH II) da molécula,
pertencentes às famílias GH 7 e 6, respectivamente. Essas enzimas geralmente
sofrem inibição pelo seu produto de hidrólise - ácido glucorônico e ácido celobiônico
(ZHANG e LYND, 2004). A CBH I, em particular, aparece como sendo a enzima mais
importante para indústria na conversão da celulose, sendo considerada enzima chave
no processo de hidrólise, pois é capaz de hidrolisar a celulose cristalina
extensivamente, sendo predominante excretada pela maioria dos micro-organismos
produtores de celulases (BECKHAM et al., 2011). As glucanohidrolases atuam
liberando glicose nos terminais do polímero celulósico (LYND et al, 2002).
β-glucosidases (E.C.3.2.1.21) hidrolisam celobiose e oligossacarídeos
solúveis em glicose. Assim como a celobiohidrolase, sofrem inibição por seu produto
de hidrólise (LYND et al., 2002).
Os 3 grupos de enzimas celulásicas agem em conjunto, portanto, atuam
sinergicamente de modo que um grupo de enzimas gera produto para atuação do
outro grupo (HORN et al, 2012). São descritos 4 tipos de sinergismo: a) Endo-exo: as
endoglucanases agem na região amorfa da fibra, formando terminais redutores e não
redutores para posterior reação dos grupos CBHI e CBHII; b) Exo-exo: CBHI e CBHII
atuam simultaneamente na hidrólise dos terminais redutores e não redutores
disponibilizados pela ação das endoglucanases; c) Exoglucanase β-glucosidases: que
removem celobioses e celodextrinas como produto final das duas enzimas; d)
sinergismo intramolecular: ocorre entre o domínio catalítico e o módulo de ligação ao
carboidrato - CBM - carbohydrate-binding modules (LYND et al., 2002; CASTRO et
al., 2010). Estes módulos CBM são descritos como proteínas únicas, conhecidas por
facilitar a aproximação do domínio catalítico ao substrato, funcionando como âncora
na adsorção destes dois componentes. (LYND et al., 2002; BORASTON et. al., 2004).
Remover o CBM diminui a atividade das celulases no substrato insolúvel (IRWIN et
al., 1993; COLUSSI et al, 2011), ou adicioná-lo, aumenta a atividade enzimática
(MELLO e POLIKARPOV, 2014).
23
Figura 6. Estrutura de CBH1 demonstrando domínio catalítico, linker e CBM de Trichoderma sp. Adaptado de BECKHAN et al., 2011
As hemicelulases são divididas entre enzimas que degradam a cadeia
principal e aquelas que degradam a cadeia lateral (SHALLOM e SHOHAM, 2003).
Devido a hemicelulose ter uma composição mais variada quando comparada à
celulose, requer um número maior de enzimas para ocorrer a hidrólise (VAN DYK e
PLETSCHKE, 2012). Um sistema enzimático incluindo endo e exo-xilanase,
mananases, β-xilosidase, α-glicuronidase, α-arabinofuronosidase torna-se necessário
para a hidrólise completa. Sendo as β-1,4-endoxilanase (E.C. 3.2.1.8) e as β-D-
xilosidases (E.C. 3.2.1.37) – coletivamente chamadas de xilanases – as principais
enzimas envolvidas na degradação da xilana, maior componente da hemicelulose
(JUTURU e WU, 2013).
A degradação de pectina envolve diversos grupos de enzimas devido a sua
composição heterogênea, entre elas a pectina liase, a pectina metil esterase e
poligalacturonase. Por conta das ramificações laterais, arabinofuranosidase e
galactosidase também participam nas reações de despolimerização (SWEENEY, XU,
2012).
Existem outros tipos de enzimas classificados pelo CAZy tais como as
transferases glicosídicas (GTs), as quais geram novas ligações glicosídicas, as liases
polissacarídicas (PLs), responsáveis pela clivagem de um polissacarídeos através de
uma reação do tipo β-eliminação (não hidrolítica) e as esterases de carboidratos
(CEs), as quais hidrolisam as ligações éster de grupamentos acetil que determinados
polímeros de carboidratos possuem (BORASTON et al., 2004).
A biomassa apresenta alta recalcitrância e cristalinidade, dificultando o
acesso de celulases à celulose. Em 2013, uma nova classe de enzimas foi adicionada,
denominada de atividades auxiliares (AAs). Este grupo é relatada como ajudante na
24
desconstrução das fibras lignocelulósicas, seja quebrando as ligações de hidrogênio
ou atacando as fibras por mecanismos de oxidação. As proteínas com essas
características foram agrupadas em diferentes famílias e sub-famílias, de acordo com
os mesmos requisitos das demais classes organizadas no CAZy (EZEILO et al., 2017;
LEVASSEUR et al., 2013). Dentre as AAs, destacam-se AA9, AA10 e AA13, que
incluem as enzimas capazes de oxidar a biomassa lignocelulósica, principalmente a
celulose e hemicelulose, chamadas de mono-oxigenases líticas de polissacarídeo
(LPMOs) (HORN et al., 2012). A família de enzimas AA9 (antigas GHF-61),
encontradas apenas em fungos, são capazes de oxidar celulose, xiloglucano e xilano.
As famílias AA11 e AA13 possuem LPMOs descritas para bactérias e fungo, sendo
responsáveis por degradarem quitina e amido, respectivamente (LEVASSEUR et al.,
2013).
Enzimas oxiredutoras agem através do mecanismo de oxidação ao invés
de hidrólise, gerando como produto espécies reativas de oxigênio - ROS - que acabam
por agir sobre a despolimerização da celulose e hemicelulose (MARTINEZ, 2009).
A produção de peróxido de hidrogênio por vários fungos propõe uma via de
degradação baseada na reação de Fenton: H2O2 + Fe2+ + H+ à H2O + Fe3+ + •OH.
Esta reação é uma rota bem reconhecida da produção de •OH em sistemas biológicos.
Segundo Baldrian (2008), o H2O2 é produzido, por exemplo, por fungos da podridão
branca, Phanerochaete chrysosporium, pela ação de enzimas como a glioxal oxidase,
glucose oxidase e álcool arílico oxidase, no processo de decomposição da madeira.
2.8 Produção enzimática por micro-organismos
Celulases podem ser produzidas por um grande número de organismos,
por exemplo bactérias, actinobactérias, fungos, plantas e animais. Dentre esses, a
maior parte das enzimas comerciais hemicelulolíticas são produzidas por fungos
filamentosos (MUSSATTO e TEIXEIRA, 2010).
A fim de buscar a produção de um coquetel enzimático eficiente, realizam-
se diversos estudos comparativos dos secretomas de distintas linhagens de micro-
organismos, bem como a variação do meio de cultura e alimentações, devido as
diferentes estratégias utilizadas pelos organismos na hidrólise da biomassa (GUO et
al., 2018).
25
Os gêneros Penicillium, Aspergillus e Trichoderma correspondem a mais
de 50% dos estudos publicados na literatura sobre a produção de celulases em 2017,
sendo Trichoderma o maior dentre eles, apresentando-se candidato na aplicação da
rota biotecnológica da hidrólise enzimática da biomassa (DE FRANÇA PASSOS et al.,
2018; DRUZHININA et al., 2011).
2.8.1 O fungo Trichoderma harzianum como produtor de enzimas
A espécie Trichoderma harzianum, pertencente ao filo Ascomycota, ordem
Hypocreales e família Hypocreaceae, é um fungo filamentoso, assexual, encontrado
comumente em solos tropicais, material orgânico em decomposição e ecossistemas
rizosféricos, numa proporção de 101 a 103 esporos por grama de solo (DRUZININA et
al., 2011; SAMUELS, 2006). Este micro-organismo é utilizado há anos como
biocontrole de fitopatógenos e como auxiliar no crescimento de plantas (MASTOURI,
2010). Nos últimos anos, tem também despertado o interesse pela capacidade de
produção de enzimas degradadoras da biomassa (AL ROCHA et al., 2016). O
Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE) utilizou por muitos
anos esta espécie como sendo produtora de enzimas celulolíticas, a fim de explorá-la
para formulação de coquetel enzimático eficiente.
Entre as espécies capazes de produzir celulases e hemicelulases, a
espécie Trichoderma reesei é mais amplamente estudada e utilizada na indústria
(BISCHOF et al., 2016). No entanto, a espécie Trichoderma harzianum também
demonstra capacidade de produzir complexos celulolíticos, sendo que essa apresenta
atividade de β-glucosidase ainda maior que aquela (DE SOUZA et al., 2018;
BENOLIEL et al., 2013; AL ROCHA et al., 2016).
Delabona e colaboradores (2013) avaliaram a influência de diferentes
componentes de meio reacional para indução de celulases em T. harzianum P49P11
utilizando experimento de misturas em biorreator. Em um segundo estudo foi proposto
um cultivo em alta densidade de células utilizando 2 fases (crescimento em glicerol e
indução de enzimas celulolíticas utilizando bagaço de cana pré-tratado), com esta
nova estratégia dobrou-se a produção de glicosil hidrolases (DELABONA et al., 2016).
O secretoma deste fungo cultivado em bagaço de cana explodida e deslignificado,
identificou a expressão de 12 diferentes famílias de enzimas degradadoras de
biomassa, dentre elas uma GH61 (DELABONA et al., 2013), família esta que foi
26
reclassificada como LPMO, (LEVASSEUR et al., 2013). Estudos sobre o perfil
transcriptômico da linhagem T. harzianum IOC-3844 foi delineado quando crescido
em diferentes substratos (lactose, avicel e bagaço de cana deslignificado), permitindo
a identificação de sequências gênicas com potencial aplicação à hidrólise enzimática
(HORTA et al., 2014). A enzima celobiohidrolase I (CBH1) obtida da mesma linhagem
foi caracterizada bioquímica e biofisicamente e revelou um potencial para aplicações
biotecnológicas, mostrando alta atividade contra Avicel (COLUSSI et al., 2011). Melo
e Polikarpov (2014) clonaram CBM de CBH1 de T. harzianum e verificaram aumento
da hidrólise da celulose quando suplementada em coquetel comercial. A predição
genômica da cepa T. harzianum B97 mostrou a presença de 266 GHs, 40 CBMs, 69
CEs, 89 GTs, 76 AAs e 7 PLs (FANELLI et al., 2018).
As linhagens estudadas de Trichoderma harzianum têm mostrado
resultados promissores quanto à habilidade de produzir enzimas envolvidas na
degradação da biomassa lignocelulósica, no entanto, o uso de mutantes, espécies
geneticamente modificadas, são utilizadas para o melhoramento da produção em
larga escala (LOPEZ-RAMIREZ et al., 2018), assim, o estudo genético do micro-
organismo se faz necessário.
2.9 Genoma
Apesar da espécie Trichoderma harzianum P49P11 ser promissora na
produção enzimática, poucos estudos mostram os dados sobre a genômica, quanto a
capacidade de produção de coquetéis enzimáticos envolvidos na biodegradação
(FERREIRA et al., 2017).
Devido ao interesse industrial na capacidade de produzir enzimas
celulolíticas, estudos genômicos, baseados na busca de sequências de CAZymes,
foram realizados em algumas linhagens da espécie T. harzianum (Tabela 2) e
mostraram que a linhagem de T. harzianum B97 e T. harzianum T6776 apresentaram
números maiores de sequências para glicosil hidrolases que encontrados no genoma
de outras espécies do gênero, como por exemplo T. reesei QM6a que apresentou 199
GHs (FANELLI et al., 2018). O estudo desenvolvido por Ferreira (2017) comparou a
presença de CAZymes no genoma da linhagem de T harzianum T6776 e T. reesei
RUT-C30 e concluiu que, apesar do coquetel enzimático produzido por T. reesei RUT-
27
C30 ser mais eficiente na hidrólise, T. harzianum T6776 contém mais CAZymes em
seu genoma, o que mostra seu potencial na aplicação industrial.
Tabela 2. Comparação de sequências genômicas de CAZymes preditas em diferentes espécies de Trichoderma.
Espécie GH GT PL CE CBM AA Referência
T. harzianum B97 266 89 7 69 42 76 FANELLI et al., 2018
T. harzianum T6776 259 101 6 22 46 42 FERREIRA et al., 2017
T. reesei RUT-C30 198 92 5 20 35 40 FERREIRA et al., 2017
T. reesei QM6a 199 92 5 16 55 32 FANELLI et al., 2018
A localização de genes de CAZymes e de genes relacionados ao
metabolismo secundário na mesma região (telomérica) demonstra a possibilidade de
corregulação destes (FANELLI et al., 2018; MARTINEZ et al., 2008; KELLER et al.,
2005). Um exemplo é o gene LAE1, conhecido por regular a expressão de celulases
(SEIBOTH et al., 2012), que está associado também ao desenvolvimento assexual e
atividade micoparasitária, modulando a produção de ambos, CAZyme e metabolismo
secundário (FANELLI et al., 2018). No genoma de T. reesei, Martinez (2008)
encontrou 25 clusters que continham tanto CAZymes como genes associados ao
metabolismo secundário. A predição de genes para RNPSs (peptídeos não-
ribossomais), um tipo de metabólito secundário que forma canais iônicos nas
membranas celulares resultando em atividade antimicrobiana e anticancerígena
(WANG et al., 2007), mostrou que T. reesei possui 8 genes, T. atroviride possui 9
genes, T. virens possui 22 genes, T. pleuroti TPhu1 e T. aggressivum f. europaeum
CBS 4333.95 possuem ambos 18 genes para este grupo (ZEILINGER et al., 2016;
MARIK et al., 2017). Schirbock e colaboradores (1994) identificaram 2 NRPSs que
eram produzidos e atuavam em sinergia com quitinases e β-glucanases. A predição
de genes de metabólitos secundários da espécie Aspergillus nidulans mostrou o
potencial de 56 vias putativas, mas nem sempre expressas (YAEGASHI et al., 2014).
A biossíntese de metabólitos secundários em fungos está relacionada com
genes encontrados em clusters, muitos adquiridos por meio de transferência
horizontal e a maioria deles silenciados quando submetidos a condições laboratoriais
(MUKHERJEE, et al., 2013). Embora, por muitos anos, métodos analíticos e químicos
tenham sido utilizados a fim de descobrir produtos naturais, nos últimos anos,
28
metodologias para decifrar o código genético e identificar essas substâncias em micro-
organismos vêm sendo e adotadas (BLIN et al., 2017; WEBER et al., 2016). O
mapeamento destas sequências gênicas pode promover a descoberta de um número
muito maior de substâncias do que aquelas já conhecidas por serem expressas e que
apresentem importância econômica (YAEGASHI et al., 2014; BARAL et al., 2018)
2.10 Metabolismo celular
O metabolismo central ou primário de fungos filamentosos é similar a outros
eucariontes (THRANE et al., 2007). São produzidos durante a fase de crescimento
exponencial do micro-organismo e formados como parte do metabolismo energético.
Enquanto o metabolismo primário é comum aos demais eucariontes, o metabolismo
secundário, ou exo-metabolismo, se mostra espécie-específico.
Os metabólitos secundários são produzidos durante a fase estacionária de
crescimento, ou seja, a produção “não associada” ao crescimento celular. Esses
metabólitos não são componentes essenciais para a reprodução do organismo
(THRANE et al., 2007; BARAL et al., 2018). Incluem uma ampla variedade de
compostos envolvidos na sinalização, desenvolvimento e interação com outras
espécies (VINALE et al., 2009). São frequentemente bioativos e de baixa massa
molecular, conhecidos por desempenhar atividades anti-bacterianas, anti-fungicas ou
anti-tumorais (BANSAL e MUKHERJEE, 2016; MEDEMA et al., 2011). Em geral, os
metabólitos secundários parecem ser formados quando grande quantidade de
precursores de metabólitos primários é acumulada utilizando vias bioquímicas únicas
e incomuns, como por exemplo acetil-CoA e mevalonato (ZEILINGER et al., 2016
KELLER et al., 2005).
O gênero Trichoderma é conhecido por produzir uma gama de metabólitos
secundários (MARIK et al., 2017). Com base na literatura, mais de 100 compostos
foram obtidos do metabolismo secundário deste grupo (ZEILINGER et al., 2016).
Podem ser classificados, de maneira geral, de acordo com a principal via biossintética
em peptídeos não-ribossomais (NRPSs), terpenóides e policetideos (NEUMANN et
al., 2015).
Os peptídeos não-ribossomais constituem o grupo mais importante
economicamente e são, em sua maioria, produzidos por espécies de Trichoderma
29
(NEUMANN et al., 2015; ZEILINGER et al., 2016). São formados pela união de dois
ou mais aminoácidos fora do ribossomo e que, muitas vezes, sofrem modificações
posteriores. Um exemplo deste grupo é a ciclosporina, conhecida por ser
imunossupressora (EVANS et al., 2011). O maior grupo dentro de NRPSs são os
chamados peptailbols, que recebem este nome por se tratar de um peptídeo com a
presença de aminoácidos não proteinogênicos, como α-aminoisobutirato (Aib), na
região N-terminal, e por possuírem grupamentos álcoois na região C-terminal. Estes
peptaibols apresentam natureza anfipática, permitindo a formação de canais iônicos
nas membranas lipídicas, podendo estar relacionados com atividade antimicrobiana
(MARIK et al., 2017). Epipolitiodioxopipirazinas (ETPs) são metabólitos secundários
pertencentes a NRPSs. São altamente reativos e tóxicos devido a presença de pontes
dissulfeto, as quais reagem com proteínas gerando espécie reativa de oxigênio. Um
exemplo de ETP é a gliotoxina, um composto imunossupressor e também conhecido
como sendo biocontrolador de patógenos em plantas (GARDINER et al., 2005).
Sideróforos também fazem parte de NRPSs. São metabólitos ferro-quelados, por
exemplo coprógeno, que são excretados por espécies de Trichoderma quando o ferro
se encontra deficiente no meio de cultura (ZEILINGER et al., 2016; SEGARRA et al.,
2010). Vinale (2009) descreveu um composto sideróforo descoberto em T. harzianum
e nomeado como ácido harziânico que apresenta afinidade com o íon Fe3+ e atividade
antifúngica.
Outro grupo de metabólitos secundários são os terpenóides, como a
tetraciclina (ZEILINGER et al., 2016). As espécies de Trichoderma são conhecidas
pelo sucesso na competição de espaço e nutrientes com outros micro-organismo,
parte é devido a secreção de terpenóides, os quais roubam ferro do meio e tornam a
competição inviável à outra espécie (SEGARRA et al., 2010).
Os policetídeos podem ser dividos em 3 classes: moléculas complexas ou
reduzidas, sintetizadas por PKSs do tipo I (t1-PKS); policetídeos aromáticos
sintetizados por PKSs do tipo II (t2-pks), que possuem um sistema enzimático
multifuncional; moléculas sintetizadas por PKSs do tipo III (t3-pks), formadas por
enzimas biossintéticas (HOPWOOD et al., 1990). Este grupo de metabólitos estão
envolvidos na interação fungo-planta em relação a respostas defensivas da célula
vegetal e na produção de fitotoxinas, além de serem responsáveis pela pigmentação
de conídios e resistência a estresse (ATANASOVA et al., 2013a; MUKHEERJE et al.,
2012).
30
Muitos outros metabólitos secundários são descritos na literatura como
pironas, aminoglicosídeos, compostos β-lactâmicos, entre outros (MEDEMA et al.,
2011).
Tabela 3. Genes preditos para metabolismo secundário em espécies de Trichoderma.
Espécie NRPs PKS PKS/NRPS Terpenos
T. reesei 8 11 2 6
T. atroviride 9 15 1 7
T. virens 22 18 4 11
T. atrobrunneum 8 18 5 5 Fonte: FANELLI et al., 2018; ZEILINGER et al., 2016
O metabolismo secundário é geralmente o resultado de muitas enzimas e
seus respectivos genes e nem sempre há relação um-para-um entre um gene e um
metabólito (SCHMOLL et al., 2009).
Entender a dinâmica do metabolismo do micro-organismo pode ajudar a
compreender o comportamento do fungo durante o processo fermentativo a fim de
desenvolver estratégias de cultivo em meio indutor que aumente a produtividade
enzimática, e assim, a viabilização do uso de coquetéis lignocelulolíticos na
sacarificação da biomassa.
2.11 Secretoma
Devido a capacidade de produzir enzimas lignocelulolíticas, o mapeamento
das proteínas secretadas pelo micro-organismo e, portanto, presentes no
sobrenadante, se torna importante para a compreensão da estratégia utilizada pelo
fungo no processo de hidrólise da biomassa (HORTA et al., 2018). A composição do
secretoma das espécies de fungos filamentosos depende das características
biológicas do micro-organismo, bem como resposta às condições ambientais
(PAPAGIANI et al., 2004).
O estudo feito por Gómez-Mendoza (2014) compara o secretoma do fungo
T. hazianum T4 em diversos meios de cultura e conclui que apesar do sobrenadante
apresentar maior atividade enzimática quando crescido em bagaço de cana, a maior
31
variabilidade de proteínas secretadas se encontra quando a fermentação foi realizada
utilizando celulose como fonte de carbono (total de 352 proteínas crescido em celulose
e 207 proteínas crescido em bagaço de cana). A análise do extrato enzimático, quando
a linhagem T. harzianum IOC3844 foi cultivada em celulose parcialmente
deslignificada, detectou a presença de total de 117 proteínas, sendo 83 proteínas
classificadas como GHs e, dentre este grupo, a família GH3 se mostrou mais
abundante (17%), seguido de GH5 (11%) e GH7 (10%) (AL ROCHA et al., 2016).
Resultados similares foram encontrados com a mesma linhagem utilizada neste
trabalho (T. harzianum P49P11) quando cultivado em bagaço de cana, na qual
apresentou 24 proteínas da família GH sendo, em sua maioria, as famílias GH3 (21%),
GH10 e GH11 (16,66%) (DELABONA et al., 2013).
A secreção de enzimas pelo micro-organismo depende da espécie
utilizada, bem como do meio de cultura e das condições de cultivo (HORTA et al.,
2018; NAUOM et al., 2018; AL ROCHA et al., 2016).
32
3 OBJETIVOS
Este projeto teve como objetivo investigar o potencial de produção
enzimática da espécie Trichoderma harzianum P49P11 através do estudo genômico
da busca de enzimas degradadoras de carboidratos e do estudo do micro-organismo
durante o processo fermentativo em biorreatores.
3.1 Objetivos específicos
Entre os objetivos específicos estão:
a) Realizar o estudo genômico da cepa T. harzianum P49P11 quanto a
presença de CAZymes e de genes relacionados com o metabolismo
secundário;
b) Avaliar a produção de CO2.
c) Avaliar o crescimento fúngico e o consumo do substrato ao longo do
processo fermentativo;
d) Avaliar a atividade enzimática presente no sobrenadante de T.
harzianum P49P11 ao longo do cultivo;
e) Avaliar o secretoma de T. harzianum P49P11 durante a fermentação
em batelada;
f) Avaliar a presença compostos encontrados no sobrenadante durante o
processo fermentativo;
33
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Fluxograma de trabalho
Abaixo segue fluxograma (Figura 7) mostrando esquematicamente como
as amostras, a partir da fermentação em batelada, foram fracionadas em porções para
destinação das diversas análises a fim de mapear os compostos químicos envolvidos
durante todo o processo.
Figura 7. Fluxograma de trabalho para as diversas análises a serem realizadas a partir do crescimento do fungo Trichoderma harzianum P49P11
4.2 Micro-organismo
Foi utilizado o micro-organismo Trichoderma harzianum P49P11, isolado
na Floresta Amazônica (DELABONA et al., 2012), depositado na EMBRAPA
ALIMENTOS (Rio de Janeiro-RJ) sob número BRMCTAA 115 e concedido para este
estudo pela EMBRAPA INSTRUMENTAÇÃO (São Carlos-SP).
34
4.3 Genoma
4.3.1 Cultivo da linhagem e extração do DNA
O fungo Trichoderma harzianum P49P11 foi repicado em placas contendo
meio PDA e crescido em estufa a 29 ºC por 7 dias. Após este período, uma solução
de esporos foi ressuspendida (em 20ml Tween 80 (0,1%v/v)) e transferida para o meio
de inóculo (10 g/l sacarose, 1 g/l peptona vegetal, 1 ml/l tween 80, 50 ml/l meio
Mandels (MANDELS, 1969)), onde se manteve em shaker (New Brunswick Scientific)
por 72h nas condições de 200 rpm de agitação, a 29 ºC. A solução foi filtrada e os
micélios macerados. Para a extração de DNA foi utilizado o kit de extração Qiagen
Dneasy Plant Mini Kit conforme especificações do fabricante.
4.3.2 Sequenciamento e anotação
O genoma foi sequenciado através da plataforma de sequenciamento
Illumina HiSeq 2500, facilitadora encontrada no CTBE, utilizando biblioteca pared-end.
Os dados do sequenciamento foram submetidos a análise qualitativa utilizando o
programa FastQC, seguido do refinamento de dados utilizando o programa
Trimmomatic versão 032 (BOLGER et al., 2014).
A anotação funcional de genes quanto a presença de metabólitos
secundários foi feita através da plataforma antiSMASH fungal version – Antibiotic and
Second Metabolism Analysis Shell 4.0 a partir do carregamento do arquivo FASTA
(WEBER et al., 2016; BLIN et al., 2017).
A anotação funcional de CAZymes foi realizada através da base de dados
dbCAN versão 4, utilizando o pacote HMMER 3.1b. (YIN, et al., 2012). Os resultados
foram manualmente acessados e confrontados com a base de dados BLAST, Priam
e Pfam para identificar a melhor correspondência. Foram consideradas apenas as
funções preditas, com e-value menor ou igual a 10-8.
A plataforma SignalP foi utilizada a fim de identificar proteínas que
continham o peptídeo sinal para exportação celular, ou seja, aquelas proteínas com
potencial presença no secretoma.
35
4.4 Pré-inóculo para fermentação
O fungo foi repicado em placas contendo meio PDA e crescido em estufa a
29 ºC por 7 dias. Uma suspensão de solução salina 0.9% contendo 10⁷ esporos/ml foi
preparada para inoculação do biorreator.
4.5 Fermentação submersa
Os ensaios foram realizados com cinco réplicas biológicas em batelada,
utilizado fermentador de 3L (BioFlo 115 fermenter - New Brunswick Scientific Co) com
impelidor Rushton, volume final de 1,5L. O meio de cultura do fermentador era
composto por: 20 g/l de celulose cristalina - Celufloc®, 1 g/l peptona vegetal, 1 ml/l
tween 80, 50 ml/l meio Mandels (MANDELS, 1969), 0,5% v/v anti-espumante P2000
Dow Chemical, Brazil. Seguindo as condições operacionais do biorreator: agitação
200 – 400 rpm; pH 5.0 - 6.0 controlado pela adição de ácido (HCl) ou base (NaOH);
O2 dissolvido 30%; temperatura 29 °C; fluxo de ar 0,35 - 0,7 vvm, DO mínima
estabelecida em 30% e para isto, acionada a cascata de agitação e aeração quando
necessária. O processo foi monitorado através do software BioCommand Batch
Control. Foram coletadas amostras nos tempos 48h, 72, 96h e 120h de cultivo.
4.6 Amostragem
Alíquotas de 10 ml foram retiradas da fermentação nos tempos de 48 horas,
72 horas, 96 horas e 120 horas. As amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por
10 minutos. O sobrenadante foi destinado à quantificação de proteínas totais,
atividade enzimática e análise de secretoma, enquanto que o sedimento foi destinado
à quantificação de celulose e célula.
Para a segunda filtração, com destinação à espectrometria de massas para
análise de compostos do sobrenadante, foi utilizado o filtro PTFE 0,45 µm hidrofílico
(Analítica). O sobrenadante foi separado, congelado em nitrogênio líquido e
armazenado a - 80 °C para posterior análise dos metabólitos em espectrômetro de
massas.
36
4.7 Concentração de celulose e célula
A concentração de celulose residual foi estimada segundo Ahamed e
Vermette (2009). O sedimento resultante da amostra centrifugada foi seco em estufa
a 80 ºC até atingir massa constante. O resultado dessa etapa corresponde à massa
seca total, a qual foi suspensa em 3 ml de uma solução de ácidos (ácido acético 80 %
(v/v) e ácido nítrico puro na proporção de 10:1) e fervida por 30 minutos em banho de
água termostatizado a 99 °C. Após, a amostra foi resfriada, centrifugada (3000 G por
20 min) e lavada com água destilada. Esse processo foi realizado 3 vezes, por fim a
massa foi seca em estufa a 80 ºC até atingir massa constante novamente, sendo o
sólido resultante composto principalmente por celulose. A concentração de células foi
estimada pela diferença entre a massa seca total e a celulose.
4.8 Produção de CO₂
A produção de CO₂ pelo cultivo em batelada foi mensurada através dos
gases de saída do fermentador por espectrometria de gases de exaustão (HPR 20
QIC Gas Analysis System, Hiden Analytical, Inglaterra). O equipamento utilizou
amostragens do ar comprimido injetado utilizado para aeração e gases de exaustão
dos fermentadores.
A fim de calcular a produção de CO2 durante a fermentação foram
necessárias, segundo Kolling (2017), (a) - a massa molar média do ar atmosférico de
entrada (considerada constante durante o cultivo, devido à alteração da composição
ter sido relativamente pequena); (b) - a vazão volumétrica de ar de entrada, obtida
através do software BioCommand, a qual foi considerada igual à vazão de saída para
efeitos de cálculo; (c) - as porcentagens mássicas dos gases de interesse presentes
no ar de entrada do fermentador (CO2), obtidas através de análise do ar de entrada
pelo espectrômetro de massas; (d) – as porcentagens mássicas do CO2 nos gases de
exaustão dos fermentadores, obtidas através de análise dos gases de exaustão pelo
espectrômetro de massas.
Para obtenção da massa molar média do ar atmosférico (m), utilizou-se a
composição volumétrica média do ar como sendo: 78,10% de nitrogênio (N2); 20,96%
37
de oxigênio (O2); 0,94% de argônio (Ar). A partir dessa composição volumétrica, é
possível encontrar a massa molar média do ar atmosférica através da equação:
mar = fN2 . mN2 + fO2 . mO2 = far . mar ( 1 )
Onde: m é a massa molar de cada componente f é a fração volumétrica de
cada componente no ar atmosférico.
Aplicando as frações volumétricas e massas molares de cada componente
na equação, temos:
m ar = 0,7810 x 28,01 + 0,2096 x 32,00 + 0,0094 x 35,95 = 28,96 g/ mol
Utilizando-se a massa molar média, é possível obter a vazão mássica de
ar em cada instante do cultivo a partir da equação abaixo:
mar,t=mar . Qar,t / VCATP ( 2 )
Onde: mar,t é a vazão mássica de ar no instante t;
mar é a massa molar do ar;
Qar,t é a vazão volumétrica de ar no instante t;
VCATP é o volume em litros de 1 mol de gás em condições ambientais
de temperatura e pressão, correspondente a 24,76 L/mol para 29 °C
e 1 atm (condições de cultivo), calculada pela Equação de
Clapeyron.
Como passo seguinte, foram obtidas as porcentagens mássicas de CO2
produzido no tempo t através das equações 3.
%CO2 produzido, t = %CO2 exaustão,t – %CO2 entrada,t ( 3 )
A partir destes valores foi possível obter as vazões mássicas de CO2
produzido através da equação 4.
mCO2 produzido,t = %CO2 produzido,t . mar,t ( 4 )
38
A linha de expurgo do equipamento serviu para acompanhamento da
composição de gases injetados, a fim de garantir que a modificação ocorrida fosse
proveniente do resultado da fermentação e não da composição de ar.
O espectrômetro de gases também foi programado para medir a produção
de etanol da mesma forma caso ocorresse.
4.9 Atividades enzimáticas e proteínas totais
Os ensaios enzimáticos de FPase foram determinados de acordo com a
metodologia descrita por Ghose (1987), sendo 3 mg de papel de filtro Whatman n° 1,
100 µL de tampão citrato 50 mM pH 4,8 e 50 µL de sobrenadante da amostragem da
fermentação. A reação foi mantida por 1 hora à 50 °C, quando então foi interrompida
pela adição de 300 µL do reagente ácido 3-5 dinitrosalicílico (DNS). Em seguida a
reação foi aquecida a 99 °C durante 5 minutos e 2 mL de água destilada foi adicionada
para posterior leitura da absorbância a 540 nm. Uma unidade de FPU/mL é calculada
como sendo a razão de 0,37 e a concentração da enzima necessária para liberar 0,2
mg de glicose.
A atividade de xilanase foi determinada segundo metodologia descrita por
Miller (1959), sendo 10 µL da solução enzimática, 40 µL de tampão citrato 50 mM -
pH 4,8 e 50 µL de solução de xilana (beechwood) 0,50%. A reação foi mantida a 50
°C por 10 minutos e interrompida pela adição de 100 µL do reagente DNS seguida
pelo aquecimento a 98 °C para a quantificação dos açúcares redutores liberados a
partir da curva padrão de xilose.
Para a determinação da atividade de β-glicosidase, o procedimento de
reação foi o mesmo utilizado pela quantificação da atividade de xilanase exceto o
substrato utilizado, sendo este 4-p-nitrofenol-β-D-glicopiranosídeo 1 mM (p-β-NPG
Sigma). A reação foi mantida a 50 °C por 10 minutos, quando então foi interrompida
com 100 µL de solução de Na2CO3 1 M. O nitrofenol liberado foi quantificado por
espectrofotometria a 400 nm.
A concentração de proteínas totais foi determinada segundo Bradford
(1976), sendo 80 µL de enzima e 20 µL de Bradford com leitura da reação feita a 495
nm em espectrofotômetro.
39
4.10 Análise de perfis metabólicos
A extração dos metabólitos foi realizada a partir de cinco réplicas biológicas
segundo metodologia descrita por Caldana (2011). Os metabólitos foram extraídos a
partir de 100 µl de sobrenadante e adicionado 1 mL de uma mistura gelada a -20 °C
do tampão methyl-tert-butyl-ether (1:3:1, v/v/v). As amostras foram homogeneizadas
em termostato por 30 minutos a 4 °C, seguida por fase de ultra-sonificação com gelo
por 10 minutos. Após este período, 650 µL de uma mistura do tampão composto por
água e metanol (3:1, v/v) foi adicionada. As amostras foram homogeneizadas em
vortex e centrifugadas a 14.000 rpm por 5 min/ 4 °C. Em seguida, ~500 µL da fase
apolar orgânica contendo lipídeos foram removidos da porção superior de cada
amostra restando, assim, somente a fase polar. Alíquotas de 150 e 300 µL da fase
polar foram transferidas para novos tubos e secas em um concentrador à vácuo. A fim
de volatilizar os metabólitos, as amostras foram derivatizadas. O volume de 1 µL das
amostras derivatizadas foi injetado em uma coluna Combi-PAL autosampler (Agilent
Technologies GmbH, Alemanha) acoplada ao equipamento CG/MS Pegasus HT,
LEGO. Os cromatogramas foram importados do programa Leco Chroma TOF software
(versão 4.51.6.0) para R software, sendo a detecção dos picos, alinhamento dos
tempos de retenção e busca em bibliotecas, realizadas através do uso do pacote
TargetSearch do Bioconductor.
As substâncias foram quantificadas pela intensidade do pico e massa. A
intensidade foi normalizada pelo peso-seco, seguido da soma da contagem total de
íons e substituição global, conforme descrito por Giavalisco (2011).
A fim de correlacionar os compostos orgânicos presentes no sobrenadante,
obtidos como resultado da análise do espectrômetro de gases, foi realizada a análise
multivariada denominado PCA – Principal Component Analysis, através do programa
R.
4.11 Secretoma
A concentração de proteínas totais foi determinada segundo a metodologia
descrita Bradford (1976). Alíquotas equivalentes dos diferentes cultivos em batelada
foram misturadas para a constituição de uma única amostra (pool das réplicas) a fim
40
de se obter um screening da variedade de proteínas presentes no secretoma. Vinte
microgramas do extrato proteico foram submetidos a eletroforese em gel desnaturante
de poliacrilamida (SDS-PAGE). O gel foi corado com Coomassie Brilliant Blue, e as
bandas visíveis foram cortadas, reduzidas e alquiladas. Em seguida, essas bandas
foram submetidas a digestão com tripsina e tratadas conforme protocolo interno da
facilitadora do Laboratório Nacional de Biociências (LNBio). Os peptídeos obtidos
foram separados por gradiente de hidrofobicidade em coluna C18 (75 mm x 100 mm)
em sistema de cromatografia EASY-nLC system acoplado a uma interface de ESI
nanospray em um espectrômetro de massa do tipo LTQ Velos Orbitrap (Therm o
Fisher Scientific). Os dados brutos gerados da espetrometria de massas
(arquivos.raw) foram processados no programa MASCOT Search Engine tendo como
parâmetros uma clivagem perdida pela tripsina, modificação fixa de
carbamidometilação, modificação variável de oxidação da metionina, 10 ppm de
tolerância de massas para MS, 1 Da de tolerância de massas para MS/MS. Para
validar a identificação de proteínas, os arquivos gerados pelo Mascot (arquivos .dat)
foram analisados pelo programa Scaffold Q+ (Proteome Software Ink., Portland, OR)
com parâmetros para identificação de proteínas com mínimo de confiança de 95%
(protein threshold), ao menos 2 peptídeos identificados para cada proteína (peptide
threshold) e falso positivo (FDR) igual ou menor que 3% e, 50% de chance de
identificação do aminoácido, FDR 0,39%. Em seguida, o perfil MS/MS foi pesquisado
e comparado contra o genoma do fungo Trichoderma harzianum P49P11.
4.12 Microscopia óptica
A observação do processo fermentativo foi realizada a partir de 20 µl da
amostra utilizando o equipamento microscópio Eclipse E100 (Nikon, Tokyo, Japan)
acoplado com a câmera digital DS-Fi2 e o software NIS-Elements. As imagens foram
capturadas após o ajuste de foco com as lentes objetivas de 40X/0.65NA e
20X/0.65NA.
41
5 RESULTADOS
5.1 Genoma
A fim de investigar as informações genéticas da linhagem T. harzianum
P49P11 na produção de enzimas degradadoras da biomassa, o genoma de novo do
fungo foi sequenciado e anotações funcionais para CAZymes e metabólitos
secundários foram feitas.
5.1.1 Sequenciamento
O sequenciamento a partir do Illumina HiSeq 2500 resultou em 27 milhões
de reads de 2x100 pares de bases (pb), contendo 49,05% de CG. A cobertura do
genoma foi de aproximadamente 130X. A predição de genes resultou na identificação
de 11755 genes (Tabela 4).
Tabela 4. Caracteristicas gerais do genoma de T. harzianum P49P11
Tamanho do genoma (pb) 41485224
n° contigs 780
maior contig 597410
CG % 49,05
N50 181635
L50 74
genes preditos 11755
5.1.2 Predição de função para CAZymes
Devido a importância de enzimas degradadoras da biomassa, foi realizada
uma investigação na busca de sequências correspondentes as famílias de CAZymes
no genoma do fungo.
A partir da anotação automática do programa dbCAN, inicialmente foram
preditas o total de 689 CAZymes, sendo 303 GHs, 104 CEs, 96 AAs, 100 GTs, 77
CBMs e 9 PLs.
42
Cada sequência foi manualmente confrontada utilizando a ferramenta
Blastp para checar alinhamento, e-value e função. Aquelas com atividade
desconhecida não foram consideradas. Assim, foi gerado um total de 340 CAZymes.
Dentre essas, 213 são GHs, 60 CBMs, 41 AAs, 20 CEs e 8 PLs. A família de glicosil-
transferases (GT) não foi tratada neste trabalho.
Dentre a família de CBMs, a maior representação foi o domínio CBM1 (21
genes), que apesar de historicamente estar relacionado ao módulo de ligação a
celulose, também apresentam relação ao domínio de quitina (LIMON et al., 2004),
seguida da família CBM50 (17 genes), também relacionada a ligação com quitina.
Dentre as GHs, a família GH18 apresentou maior número de sequências,
contendo 24 sequências genicas, o que corresponde a atividades de quitinase. Muitas
delas apresentaram peptídeo sinal, mostrando que a expressão é seguida de
secreção enzimática. Algumas, além do domínio catalítico GH18, apresentam domínio
para CBM1, CBM50 e CBM18 (módulos estes que estão associados à aproximação
da enzima com o substrato de quitina).
A classe de proteínas com atividades auxiliares AA3 foi a maior
representante deste grupo (21 genes), com atividades de glicose oxidase e celobiose
desidrogenase (LEVASSEUR et al., 2013). Uma das proteínas AA9 (anteriormente
classificadas como GH61) encontradas chama atenção por conter o domínio CBM na
mesma sequência gênica. As proteínas AA9 desempenham função de clivagem da
cadeia celulósica através da oxidação dos carbonos, enquanto que CBM1 está
relacionada a celulose (CAZY, 2018).
Um total de 18 CEs foram encontradas e classificadas em 7 grupos
diferentes, sendo o maior deles CE5 (6 genes), com atividades de cutinase e acetil
xilana esterase.
Tabela 5. Número de sequências genéticas por família de CAZymes encontradas no genoma do fungo T. harzianum P49P11
CAZyme Número de
sequências CAZyme
Número de
sequências CAZyme
Número de
sequências
AA1 3 PL7 5 GH31 5
AA2 5 PL8 1 GH35 1
AA3 21 PL20 2 GH36 1
43
AA5 1 GH1 4 GH37 2
AA6 1 GH2 13 GH38 3
AA9 3 GH3 14 GH43 3
AA11 5 GH4 1 GH45 1
CBM1 21 GH5 9 GH47 6
CBM6 1 GH6 1 GH49 1
CBM13 1 GH7 3 GH54 2
CBM18 9 GH10 3 GH55 9
CBM20 1 GH11 4 GH66 1
CBM21 1 GH12 3 GH64 5
CBM24 2 GH13 8 GH65 1
CBM50 17 GH15 2 GH67 1
CBM43 2 GH16 17 GH71 6
CBM48 1 GH17 2 GH72 5
CBM66 1 GH18 24 GH75 3
CBM67 1 GH20 3 GH76 7
CE1 6 GH23 1 GH78 2
CE4 2 GH24 1 GH79 3
CE5 6 GH25 1 GH89 2
CE8 1 GH26 1 GH92 6
CE9 1 GH27 5 GH115 1
CE10 2 GH28 4 GH127 1
CE14 1 GH30 6 GH128 4
CE15 1
A tabela completa detalhada das sequências preditas depois da checagem
e filtragem de dados se encontra no apêndice do trabalho.
5.1.3 Predição de metabólitos secundários
O genoma do fungo foi submetido a plataforma antiSMASH fungal version
que foi criada para identificar sequências genéticas para enzimas associadas a
metabólitos secundários (MS). O total de 54 sequências foram encontradas sendo 8
terpenos, 21 t1-pks, 10 NRPS, 4 clusters que contêm tanto o domínio para pks quanto
44
para NRPS, 3 enzimas putativas para ácidos graxos e 8 genes classificadas como
outras (proteínas que pertencem ao metabolismo secundário, mas não apresentam
características das demais classes descritas).
Dentre essas sequências, 8 enzimas para metabólitos secundários foram
encontradas próximos de CAZymes (Tabela 6) indicando possível corregulação
(Martinez et al.,2008).
Tabela 6. Sequências genéticas para metabólitos secundários encontradas próximas de CAZymes.
Cluster para MS CAZyme Atividade enzimática
terpeno CBM13/GH142 arabinofuranosidase
terpeno CE4 N-acetilglucosamina deacetilase
terpeno GH31 α -xilosidase
T1-pks CE12 lipase
T1-pks GH74 GH74
T1-pks GT21 glicosilceramida sintase
NRPS AA3 oxiredutase
NRPS GH10 endo-xilanase
A tabela completa com proteínas relacionadas ao metabolismo secundário
se encontra no apêndice deste trabalho.
5.2 Análise dos parâmetros durante o processo fermentativo
Os ensaios em quintuplicata em biorreator de 3L foram realizados e
retiradas amostras em 48h, 72h, 96h e 120h, as quais foram fracionadas para as
diversas análises como mostrado anteriormente pelo fluxograma de atividades (Figura
7).
As fotos abaixo (Figura 8) ilustram o processo fermentativo realizado em
quintuplicata neste trabalho, utilizando celulose cristalina como fonte de carbono para
o micro-organismo.
45
Figura 8. Foto dos biorreatores com 72 horas de cultivo utilizando T. harzianum em meio celulose cristalina.
Figura 9. Perfil traçado ao longo do processo fermentativo através do software BioCommand Batch Control com o fungo T. harzianum e celulose cristalina como fonte de carbono. As linhas da figura representam: agitação (vermelho), demanda de oxigênio (azul), aeração (rosa), pH (verde) e temperatura (marrom). As amostragens do processo ocorreram em 48h, 72, 96 e 120h, conforme demonstram as barras verticais em preto.
O processo fermentativo foi monitorado através do software BioCommand
Batch Control, mostrando o perfil de agitação, demanda de oxigênio (DO), aeração e
pH na figura acima (Figura 9). As 5 réplicas apresentaram gráficos de comportamento
muito parecidos (apêndice).
46
Também foi acompanhado o perfil de saída de CO2 com o espectrômetro
de gases de exaustão (Figura 10), como modelo indireto para medir o crescimento
microbiano em processos fermentativos, visto que se torna uma solução para
acompanhamento quando aplicado em larga escala (SAUCEDO-CASTAÑEDA et al.,
1994).
Figura 10. Produção de CO2 em g/L.h ao longo do processo fermentativo com o fungo T. harzianum em meio indutor de celulose cristalina como fonte de carbono.
Conforme os dados obtidos pelo espectrômetro de gases, o ponto de 42
horas representa o maior volume de liberacão de CO2 (Figura 10). O valor máximo
encontrado foi de 0,84 g/L.h de CO2 produzidos e mensurados na composição do ar
exalado.
O comportamento gráfico da produção de gás carbônico se mostra
coerente com o trabalho apresentado por LOPEZ-RAMIRES (2018) em que monitorou
o comportamento de gás produzido durante a fermentação por T. harzianum PBLA
como forma de inferir o crescimento celular no processo.
O espectrômetro de gases foi programado para medir a produção de etanol,
caso isso ocorresse, porém, os valores se mantiveram estáveis em zero ao longo do
cultivo, mostrando não ocorrer fermentação alcoólica por este micro-organismo.
47
5.3 Análise da concentração de células e celulose
Os dados coletados sobre o crescimento de biomassa presente (Figura 11),
mostram que houve maior concentração de células próximo de 48h, sendo em média
3,64 g/l, os quais se tornam coerentes quando comparados com o resultado do
espectrômetro de gases (Figura 10) onde neste mesmo ponto demonstrou a maior
liberação de CO2 nas amostragens (0,54 g/L.h).
A partir de 72h a quantidade de células presentes e o consumo de celulose
tem pouca variação - o que sugere que o cultivo esteja em fase estacionária de
crescimento do micro-organismo.
A técnica utilizada para mensurar celulose (AHAMED E VERMETTE, 2009)
apresenta desvio da quantificação da celulose presente no meio, pois o ponto zero
horas, ou seja, com 20 g/l, foi submetido a análise e demonstrou valor próximo a 7g/l
de celulose. No entanto, o desvio se mantém ao longo da análise, pois em diversos
trabalhos utilizando a mesma técnica e o mesmo micro-organismo, o comportamento
gráfico é semelhante (GELAIN, 2015). Assim, pode-se considerar o comportamento
dos gráficos de célula e celulose, mas não o valor nominal para quantificação.
Figura 11. Concentração de células (azul) e consumo de celulose (vermelha) em g/L ao longo do tempo (h) pelo cultivo de T. harzianum em fermentação submersa utilizando celulose cristalina como fonte de carbono.
A razão da produção de CO2 e a biomassa apresenta diferentes valores ao
longo da fermentação (Tabela 7), resultado obtido devido a oxidação de diferentes
compostos metabólicos do fungo ao longo do processo. Conforme mostra a tabela
48
abai
xo, a
rela
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3,45
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0,
16
72h
2,83
18
0,19
0,
06
96h
2,29
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0,07
0,
03
120h
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1866
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0,01
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5.4
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49
Figura 12. Atividade enzimática de xilanase e β -glicosidase em U/ml das amostras retiradas ao longo do tempo (h) no cultivo de T. harzianum em fermentação submersa utilizando celulose cristalina como fonte de carbono.
Figura 13. Atividade de FPase (FPU/ml) e quantificação de proteínas totais (mg/ml) das amostras retiradas ao longo do tempo (h) pelo cultivo de T. harzianum em fermentação submersa utilizando celulose cristalina como fonte de carbono.
A Figura 13 representa o gráfico com atividade de FPase (azul) e a
quantificação de proteínas totais (vermelho). O ponto de máxima concentração de
proteínas totais e FPase se encontra nas amostragens de 72 e 96 horas de cultivo,
com a concentração de 1,0 ± 0,05 mg/ml de proteínas totais e 0,73 ± 0,05 FPU/ml de
atividade de FPase em 72h, o que representa uma produtividade de 10,14 FPU/L.h.
Quando comparado os dados de FPU/ml e a quantificação de proteínas totais (Figura
50
13), observa-se que há correlação dos valores de aproximadamente 1:1 e, portanto,
que as proteínas totais presentes no sobrenadante correspondem diretamente às
enzimas específicas degradadoras do substrato.
5.5 Secretoma
Alíquotas do sobrenadante referentes as diferentes replicas dos cultivos em
batelada foram misturadas para a constituição de uma única amostra (pool das
replicas) para o tempo referente as amostragens em 72 horas e outro pool para
amostras no tempo de 96 horas a fim de se fazer análise qualitativa do secretoma.
Estes foram escolhidos devido a presença de maior concentração de proteínas totais
quantificado por Bradford (Figura 13). As amostras foram aplicadas em gel SDS-
PAGE (Figura 14) porém, apenas a amostragem de 72h foi cortada, tratada e
submetida ao espectrômetro de massas devido a sua maior produtividade em
FPU/L.h.
Figura 14. Gel SDS-PAGE com pool de amostra de 72h e 96h de fermentação.
A análise do secretoma, quando crescido em meio celulose cristalina,
identificou um total de 108 proteínas (2304 espectros), sendo 50 proteínas
classificadas como CAZymes. Dessas, foram relatadas 40 GHs, 5 CEs, 5 AAs e 12
CBMs juntamente com outro domínio catalítico. As GHs, maior grupo presente no
51
secretoma, foram distribuídas em 27 famílias. A Tabela 8 contém a identificação das
proteínas encontradas (ID), bem como sua classificação segundo o banco de dados
CAZy, número EC, a presença de peptídeo sinal para secreção celular (SignalP) e a
quantidade de espectros gerados.
Tabela 8. CAZy encontradas no secretoma de T. harzianum P49P11 em 72 horas de cultivo em biorreator, utilizando celulose cristalina como fonte de carbono.
Identificação da Proteína (ID) CAZy Classificação Número EC SignalP Espectro
THAR_003918 AA2 L-ascorbato peroxidase 1.11.1.11 não 6 THAR_001001 AA2 catalase peroxidase 1.11.1.21 não 7 THAR_001205 AA5 glioxal oxidase 1.2.3.15 sim 11 THAR_011135 CE1 feruloil-esterase 3.1.1.73 não 6 THAR_011592 CE5 acetil-xilana-esterase 3.1.1.72 sim 6 THAR_004037 CE5 acetil-xilana-esterase 3.1.1.72 sim 2 THAR_007672 CE8 pectinase-esterase 3.2.1.11 sim 2
THAR_000687 CBM1/CE15 metil-transferases 3.2.1.- sim 12
THAR_005835 CBM1/AA9 celulase 3.2.1.4 não 2
THAR_005820 CBM1/GH11 endo-xilanase 3.2.1.8 não 3
THAR_010035 CBM1/GH5 endoglucanase 3.2.1.4 sim 4
THAR_009333 CBM1/GH5-5 endoglucanase 3.2.1.4 sim 3
THAR_010517 CBM1/GH6 celobiohidrolase 3.2.1.91 sim 10
THAR_004903 CBM1/GH7 celobiohidrolase 3.2.1.91 sim 20
THAR_000270 CBM1/GH7 endoglucanase 3.2.1.7 sim 5
THAR_001807 CBM24/GH71 α-endo-glucanase 3.2.1.59 sim 8
THAR_004055 CBM42/GH54 arabinofuranosidase 3.2.1.55 sim 7
THAR_007975 CBM43/GH72 β-glucanosiltransferase 2.4.1- sim 6
THAR_011525 CBM6/GH43 β-xilosidase 3.2.1.37 sim 9
THAR_004929 GH10 endo-xilanase 3.2.1.8 sim 16 THAR_005508 GH10 endo-xilanase 3.2.1.8 sim 7 THAR_000744 GH11 endo-xilanase 3.2.1.8 não 7
52
THAR_002305 GH115 α -glucoronidase GH115 não 8 THAR_005887 GH12 endoglucanase 3.2.1.4 não 5 THAR_009992 GH16 GH16 GH16 sim 7 THAR_000837 GH16 β-galactosidase 3.2.1.103 sim 5 THAR_007593 GH18 chitinase 3.2.1.14 sim 11 THAR_007271 GH2 galactosidase 3.2.1.23 sim 4 THAR_002920 GH20 acetil-hexosaminidase 3.2.1.52 sim 6 THAR_000369 GH25 lisozima 3.2.1.17 sim 3 THAR_011476 GH27 α-galactosidase 3.2.1.22 sim 2 THAR_003667 GH28 rhaminosidase 3.2.1.40 não 3 THAR_010018 GH3 β-glucanase 3.2.1.21 não 21 THAR_004907 GH30 endo-xilanase 3.2.1.136 sim 11 THAR_004578 GH30-3 β-glucanase 3.2.1.75 sim 7 THAR_004421 GH30-5 galactanase 3.2.1.164 sim 6 THAR_000685 GH30-7 β-glucanase 3.2.1.75 não 5 THAR_000440 GH31 α-glucosidase 3.2.1.20 sim 7 THAR_004256 GH35 galactosidase 3.2.1.23 sim 3 THAR_007910 GH38 manosidase 3.2.1.24 sim 3 THAR_011570 GH49 dextranase 3.2.1.11 não 7 THAR_008676 GH55 exo-glucanase 3.2.1.58 não 13 THAR_007389 GH55 endoglucanase 3.2.1.39 sim 8 THAR_006343 GH55 endoglucanase 3.2.1.39 sim 4 THAR_001809 GH62 α-arabinofuranosidase 3.2.1.55 sim 6 THAR_011501 GH64 endoglucanase 3.2.1.39 não 2 THAR_000346 GH71 α-endo-glucanase 3.2.1.59 sim 6 THAR_009358 GH92 manosidase GH92 sim 14 THAR_002783 GH92 manosidase GH92 sim 3
Para a degradação de celulose, o fungo utilizou a secreção de
endoglucanases (CBM1-GH5-5, GH12, GH55, GH71) agindo na cadeia interna,
formando terminais redutores e não redutores. A secreção de exoglucanases (GH55,
CBM1-GH6 e CBM1-GH7) permitiu a liberação de celobiose no meio que,
posteriormente, foi convertida em glicose pela ação de β-glucosidases (GH3, GH30-
7, GH30-3,) e α-glucosidase (GH31).
Os resultados demonstram que o fungo Trichoderma harzianum P49P11
possui os 4 modelos de atividade sinérgica para degradação de celulose, pois há
presença de endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases e β-glucosidases
(CASTRO et al, 2010; LYND et al., 2002).
Já para a degradação de hemicelulose o micro-organismo utilizou de
enzimas tais como endo-xilanases (GH10,GH11,GH30), β-xilosidases (CBM6-GH43),
53
arabinofuranosidase (GH62, CBM62-GH54), galactosidase (GH2, GH27, GH35),
galactanase (GH30-5), manosidase (GH38, GH92), feruloil-esterase (CE1) e acetil-
xilan-esterase (CE5), entre outras.
Embora o genoma revele grande quantidade de sequências para GHs18,
apenas 1 foi expressa frente ao meio de cultura utilizado, visto que não há presença
de quitina e esta pode estar presente devido ao crescimento de hifas.
O secretoma contém a enzima metiltransferase (CE15), a qual está
associada em regulação de CAZymes (SEIBOTH et al., 2012) e desenvolvimento
morfológico como esporulação (AGHCHEH et al., 2013).
Apesar de encontrados 4 grupos de proteínas com atividades auxiliares,
apenas 1 deles (AA5) foi predita para ser encontrada no secretoma, devido a presença
do peptídeo sinal na sua sequência. A enzima em questão (EC 1.2.3.15) é ferro
dependente e participa da degradação de lignina (LEVAUSSER et al., 2013), que
compõe aproximadamente 1 % da composição de celulose cristalina, caracterizada
nos laboratórios do CTBE. As demais enzimas foram classificadas como enzimas que
participam do processo interno da célula.
Das 50 proteínas encontradas no secretoma, 35 delas apresentaram
peptídeo sinal para secreção celular, as demais corresponderam a proteínas
intracelulares provavelmente como resultado de eventos de lise de células, apoptose
ou mecanismos não convencionais de secreção de proteínas.
5.6 Metaboloma
A fim de compreender o perfil das substâncias encontradas no sobrenadante,
resultantes de metabólitos e de produtos da hidrólise da biomassa, foi realizado o
metaboloma de T. harzianum P49P11 cultivado em celulose cristalina como fonte de
carbono durante 120 horas.
Após o pré-processamento dos dados obtidos por espectrometria de massas
foram detectados 42 compostos durante a cinética do crescimento do fungo conforme
observado na Figura 15.
Das substâncias encontradas 47,62% são aminoácidos, responsáveis pela
síntese de proteínas, seguido de açúcares (mono e dissacarídeos) com um total de
21,43% e compostos orgânicos num total de 14,28%.
54
O perfil de metabólitos apresentados na Figura 15 revela uma separação
Os compostos foram divididos em dois grandes grupos – um grupo de
substâncias com maior concentração (grupo superior) e um grupo com substâncias
de menor concentração (grupo posterior). Do grupo de substâncias mais concentradas
- ácido glucurônico, leucina e glutamina – apresentaram menores valores em 48 horas.
Já substâncias como valina, myo inositol, tirosina e ácido aspártico tiveram maior
concentração após 96 horas. Alguns compostos foram encontrados com a mesma
intensidade durante todo o tempo de cultivo (glicerol 3 fosfato, ácido 4 amino butírico,
glicina, ácido cítrico, ácido lático, glicose, uréia e fosfato).
A fim de identificar compostos possivelmente correlacionados foi realizado
um procedimento matemático denominado Principal Component Analysis (PCA) -
Análise de Componentes Principais (ACP), que é definido como uma transformação
linear ortogonal (ortogonalização de vetores) para converter um conjunto de dados
para um sistema de coordenadas de forma que a maior variância fica ao longo da
Figura 15. Heat map dos metabólitos encontrados no sobrenadante da biofermentação com T. harzianum P49P11.
55
primeira coordenada denominada primeiro componente, a segunda maior variância
fica ao longo da segunda coordenada e assim por diante.
A Figura 16 mostra o PCA realizado para as 3 réplicas fermentativas dos
dados de metabólitos identificados como 1, 2 e 3 nos tempos de 48, 72, 96 e 120
horas.
Figura 16. PCA para dados de metabólitos encontrados nas amostragens de 48 horas (triângulo azul), 72 horas (quadrado verde), 96 horas (cruz rosa) e 120 horas (circulo vermelho).
Pela ferramenta matemática PCA podemos correlacionar metabólitos com
o tempo de amostragem. O tempo de 48 horas tem forte correlação para os açúcares
celobiose, xilose e arabinose.
Em 72 horas a correlação está entre o aminoácido glicina e a base
nitrogenada uracila que constitui o RNA, o qual será traduzido em proteína. Além
disso, a uracila é um componente de várias coenzimas que atuam em conjunto com
enzimas em processos de metabolismo de carboidratos, o que pode estar relacionado
com a produção enzimática mais elevada nesta amostra. Em 72 horas, também é o
56
tempo de alta correlação para o ácido glucorônico, conhecido por ser produto
repressor da enzima CBH.
Os tempos de 96 e 120 horas apresentaram alta correlação para a maioria
dos aminoácidos, assim como para a putrescina, molécula orgânica que se forma pela
decomposição de aminoácidos, o que pode explicar a diminuição da síntese proteica
e atividade enzimática
5.7 Microscopia
Abaixo (Figura 17 e Figura 18) são representadas imagens realizadas em
microscópio óptico com 20 μl de meio de cultura das amostragens nos tempos de 48
e 72 h.
Figura 17. A) Microscopia óptica da amostra do cultivo em 48h com aumento de 20x. B) Microscopia óptica da amostra do cultivo em 72h com aumento de 20X.
Figura 18. C) Microscopia óptica da amostra do cultivo em 96h com aumento de 40x. D) Microscopia óptica da amostra do cultivo em 120h com aumento de 20X.
A B
C D
57
As imagens demostram a presença de esporos e hifas em todos os tempos
da fermentação, entretanto foi observado o predomínio de hifas em 48 e 72 horas de
cultivo (Figura 17 A e B). A presença de ambos – hifas e esporos – em todas as
amostras era esperada devido ao meio de cultura utilizado - celulose cristalina, 20 g/l
- conforme demostrou o artigo de Delabona, 2016, no qual foi acompanhado o
crescimento e morfologia de hifas e esporos do fungo T. harzianum em diversos meios
de cultura e constatou que, quando usado celulose, sempre há presença de ambas
fases morfológicas da espécie em questão.
A diminuição da biomassa ao longo do processo fermentativo, demonstrada
pelo gráfico da Figura 11, parece estar relacionada com o processo de esporulação
visto pelas imagens microscópicas obtidas a partir das amostras retiradas ao longo do
cultivo em reator.
6 Discussões
6.1 O estudo genômico
O estudo realizado por Horta (2018) demonstra que T. harzianum e T.
reesei compartilham um fundo genético amplamente comum sendo que pequenas
diferenças podem ser detectadas ao comparar seus desempenhos enzimáticos.
Sabendo que T. reesei é utilizado em escala industrial na produção de coquetéis
enzimáticos, surge a necessidade de aprofundar os estudos genômicos de T.
harzianum, que embora seja uma linhagem selvagem, tem demonstrado ser
promissora para produção de enzimas degradantes da biomassa.
O estudo de sequências genômicas de CAZymes em T. harzianum P49P11
revelou a presença de um total de 689 sequências preditas pelo programa dbCAN.
Dentre o grupo de GHs, a família GH18 (EC 3.2.1.14), com atividade para quitinase,
mostra maior representatividade, com 24 genes. Outro grande grupo são enzimas
endoglucanases, exoglucanases β-glucosidases (GH3, GH5, GH6, GH7, GH12,
GH30-3, GH30-7, GH55 e GH64). Os dados são esperados devido a atividade
micoparasitária realizada pelo gênero Trichoderma, que utilizam a estratégia
combinada de ataque da parede celular de outros fungos (composta principalmente
por quitina e β-glucano) por processo de hidrólise, além de secreção de metabólitos
secundários que exercem funções antimicrobianas diversas (DRUZHININA et al.,
58
2011; BENÍTEZ et al., 2004; NAUOM et al., 2018). Horta (2018) também identificou
maior porcentagem de GH18 que incluem principalmente quitinases (EC 3.2.1.14) e
endo-β-N-acetilglucosaminidases para a linhagem de T. harzianum CBMAI0020.
Fanelli (2018) também encontrou a maior porcentagem de GHs18 no genoma de
Trichoderma atrobrunneum. O estudo feito por Kubicek (2011) das espécies
Trichoderma virens e Trichoderma atroviride, mostraram que a família GH18 foi a
maior representante de glicosil hidrolases no genoma destas espécies. O estudo
também encontrou os domínios de ligação CBM 1, CBM18 e CBM50, relatados como
domínios de ligação a quitina, junto das proteínas GH18. Os mesmos dados também
foram vistos no presente estudo para a linhagem T. harzianum P49P11.
O fungo apresenta destaque na literatura pela produção de β-glicosidases
justamente por possuir a estratégia de hidrólise da parede de fungos na competição
com outros micro-organismos, bem como pela atividade decompositora de matéria
orgânica. O genoma de Trichoderma harzianum P49P11 revelou numerosas
sequências gênicas para enzimas degradadoras de carboidratos, como
endoglucanasase, celobiohidrolases, xilanases, entre outras, importantes na
produção de coquetel enzimático para hidrólise da biomassa.
Quando analisadas sequências para proteínas envolvidas no metabolismo
secundário, foram encontradas 8 sequências que continham tanto proteínas
envolvidas no metabolismo secundário quanto CAZymes, indicando possível
corregulação. Martinez (2008) sugere tratar-se da estratégia do micro-organismo na
competição por nutrientes, visto que a secreção de antibióticos ou agentes
microbianos estaria associada as enzimas degradadoras de carboidratos. Não foram
encontrados clusters com sequências relacionadas ao MS e enzimas degradadoras
da parede celular de fungo (quitinases ou glucanases) indicando não haver relação
direta com atividade micoparasitária. Contudo, outros metabólitos secundários, que
funcionam como agentes anti-microbianos, podem estar relacionados, como por
exemplo NRPS.
Os terpenos foram representados por enzimas, chamadas de terpeno
ciclases ou esqualeno sintases, que agem sobre farnesil-difosfato, substância
intermediária na biossíntese de tricotecenos a partir de Acetil-CoA (MALMIERCA et
al., 2013). Alguns estudos apresentam as moléculas de farnesol e ácido farnesóico,
produzidas a partir de farnesil-difosfato, envolvidas na repressão de desenvolvimento
de hifas no fungo filamentoso Candida albicans, no entanto, metabólitos secundários
59
são espécie-específicos, podendo não haver relação com a espécie Trichoderma
harzianum (HORNBY et al., 2001; HOGAN D., 2004). Malmierca (2013) estudou os
genes envolvidos na via de biossíntese de tricotecenos em T. arundinaceum e
concluiu que os compostos produzidos por esta via são, em geral, tóxicos para animais
e plantas e fazem parte do sucesso de adaptação do micro-organismo ao ambiente.
NRPS e PKS representam a maior porcentagem de proteínas relacionadas
ao metabolismo secundário em Trichoderma, estando de acordo com o estudo de
Atanavosa (2013). Estão envolvidos na interação Trichoderma-planta ou Trichoderma-
microrganismo (MUKHERJEE et al., 2012). Alguns PKSs estão envolvidos no
desenvolvimento sexual de fungos (NOWROUSIAN et al., 2009). Neste trabalho não
foi possível correlacionar metabólitos secundários e CAZymes. Faltam estudos que
descrevam metabólitos secundários e suas funções para a espécie em questão, tendo
em vista que o fungo T. harzianum P49P11 possui sequências genicas para tais
produtos.
6.2 Crescimento do micro-organismo
O comportamento do crescimento pelo micro-organismo pode ser notado
nas análises de produção de CO2 (Figura 10), quantificação de células (Figura 11) e
DO (Figura 9).
Na primeira etapa o fungo passa por uma fase de adaptação ao meio de
cultura, conhecida como fase Lag. Entre 24h de cultivo, aproximadamente, e 48h, o
micro-organismo demonstra características da fase log, onde o crescimento é
exponencial, pois apresenta a DO baixa (Figura 9) e maior produção de CO2 (Figura
10), resultado de seu metabolismo ativo. Pode-se perceber o pico da produção de
CO2, que ocorreu em aproximadamente 42 h (Figura 10), marcando o final da fase de
crescimento exponencial (SAUCEDO-CASTAÑEDA et al., 1994). Neste período
observa-se também a necessidade de aeração do processo, pela variação de aeração
mostrada em rosa pelo software BioCommand. Há também uma leve alteração de pH,
característica desta etapa de desenvolvimento. Nesta fase, o fungo produz
principalmente metabólitos primários, aqueles responsáveis por mantê-lo vivo e
estável. Apesar de apresentar atividade enzimática para a degradação do substrato,
esta ainda não é intensa, pois será resultado de metabolismo secundário que se
intensificará na fase seguinte - estacionária.
60
Quando o cultivo se encontra com 96 horas, parece ser próximo ao final da
fase estacionária, pois sua produção enzimática não é tão maior que a apresentada
na amostragem anterior (72 horas), tampouco a produção de CO2 (Figura 10). A DO
(Figura 9) se mostra ainda estável, bem como a quantidade de células envolvidas no
processo (Figura 11). É na fase estacionária que os metabólitos secundários são
produzidos em maior quantidade, sendo ilustrada neste trabalho pelo período entre
48 e 96 horas. A mensuração da produção enzimática celulolítica se encontra em
maior concentração, visto pelas atividades e produtividades apresentadas. Este se
mostra um momento essencial para as análises do secretoma a fim de se fazer o
screening das proteínas produzidas e secretadas, visto que o valor de proteínas totais
também é maior neste período (1 mg/ml).
A partir do ponto de amostragem de 96 horas em diante a DO sobe e os
níveis de CO₂ chegam próximos a zero (0,03 g/L.h) antes de completar 120 horas, se
igualando as condições iniciais do reator, quando inoculado apenas esporos. O fungo
demostra estar na fase de declínio, visto também através da microscopia (Figura 18-
C), a qual demostrou a existência de poucas hifas e o predomínio de esporos.
6.3 Produção enzimática
A presença de hifas está relacionada com a secreção de proteínas no meio,
segundo EL-ENSHASY (2007). Esta relação também pode ser observada no presente
trabalho, pois a maior quantificação de proteínas do processo fermentativo se
encontra próximo do ponto de 72 horas de cultivo (Figura 13), quando atingiu 1mg/ml,
o que coincide com as imagens microscópicas, as quais demostram haver maior
concentração de hifas no mesmo tempo (Figura 17). Com a amostragem de 72 horas
foi feito o estudo das proteínas presentes no sobrenadante.
O secretoma revelou o total de 108 proteínas sendo 50 CAZymes (Tabela
5). Dessas, houve concentração em enzimas da família GH (40 GHs), pertinente ao
meio de cultura indutor utilizado - celulose cristalina. O estudo do secretoma feito por
Delabona (2013) com o mesmo micro-organismo, porém utilizando bagaço de cana
como fonte de carbono, revelou a presença de 24 GHs. Devido a diferenças na forma
de cultivo, o mesmo estudo revelou a ausência de enzimas pectinases e α-
arabinofuranosidase no sobrenadante e sugeriu a suplementação de coquetel com
essas. Contudo, este trabalho encontrou ambas enzimas presentes no genoma do fungo
61
(CE8, GH54 e GH62), com a presença de peptídeo sinal nas sequências, revelando que
o fungo é capaz de secretar as enzimas em questão, dependendo das condições de
cultivo. A enzima α-arabinofuranosidase foi também encontrada no estudo do secretoma,
(GH54 e GH62), sendo que GH54 apresenta CBM42 (domínio cuja função consiste em
aproximação da enzima ao substrato arabinofuranose) junto do domínio catalítico,
revelando alta especificidade da enzima ao substrato. Nauom (2018) relatou a presença
de α-arabinofuranosidase no secretoma da linhagem T. harzianum ALL42. Castro, (2016)
também observou a presença de α-arabinofuranosidase em cultivo de T. reesei Rut-C30
utilizando como fonte de carbono celulose, mas não em soforose. Portanto, o fungo tem
o potencial de produzir tais enzimas, dependendo das condições de cultivo, sem a
necessidade de suplementação do coquetel enzimático.
A família AAs foram representadas no secretoma apenas por AA2 e AA5,
no entanto, somente a última teria atividade enzimática sobre lignina (EC 1.2.3.15),
visto que as demais não apresentam peptídeo sinal e foram caracterizadas como
enzimas que participam de atividades celulares internas. O genoma de T. harzianum
P49P11 revela as sequências genômicas para diversas famílias de AAs, inclusive para
AA9 com a presença de peptídeo sinal. O trabalho de Al Rocha (2016) encontrou 1%
do secretoma de T. harzianum IOC 3844 constituído de AA9, portanto, o fungo não
secretou as enzimas quando cultivado em celulose cristalina.
O estudo do secretoma de T. harzianum ALL42 (Nauom et al., 2018) relatou
a presença de galactose-oxidase (AA5-2), contudo, não foi encontrado no secretoma
e nem no genoma no presente estudo, utilizando a linhagem T. harzianum P49P11.
Devido ao meio de cultura indutor utilizado, houve maior expressão de
celulases e hemicelulases, mostrando o potencial do micro-organismo na degradação
da biomassa lignocelulósica. A elevada concentração de enzimas degradadoras de
carboidratos é importante fator para a etapa de hidrólise da biomassa na produção de
E2G.
O fungo utilizado neste estudo revelou atividade enzimática para a
degradação de celulose representada pela atividade de β-glicosidase e FPase (endo-
glucanases e exo-glucanases). Para a degradação da hemicelulose, presente no meio
de cultura utilizado, foi considerada a atividade de xilanase.
Quando observado os dados do secretoma, a análise mostra a presença
das proteínas GH10, GH11 e GH30 no sobrenadante, confirmando a atividade
enzimática de xilanase observada. As enzimas GH3, GH30-3 e GH30-7 também
62
aparecem nos dados obtidos do espectrômetro de massas, indicando estarem
envolvidas na atividade de β-glicosidase e GH5, GH6, GH7, GH12, GH55 e GH64
estão relacionadas a endo e exoglucanases confirmadas pela atividade de FPase.
As atividades enzimáticas mensuradas neste trabalho se mostraram
maiores em 72 horas de cultivo (Figura 12 e Figura 13), amostra na qual a
quantificação de proteínas totais também atingiu seu ponto máximo, em torno de 1
mg/ml. Quando calculada a produtividade, o fungo obteve valores de 10,14 FPU/L.h
em celulose cristalina. A mesma cepa, em meios otimizados, atingiu a produção de
16,8 FPU/L.h (DELABONA, 2013). Benoliel (2013) utilizou T. harzianum L04, e
reportou a produção enzimática alcançada como sendo 15,4 FPU/L.h. Estes valores
são compatíveis aos reportados pela literatura em diversos cultivos por outras
espécies de fungos produtores de celulases, como o T. reesei RUT-C30 relatado por
Bigelow et al. (2002), em cultivo com bagaço pré-tratado, o qual chegou a produção
máxima de 3.1 FPU/L.h. Kovacs et al. (2009), descreveu a produtividade de T.
atroviridae como sendo 9,2 FPU/L.h.
O trabalho de Florencio (2016), comparou a produção celulolítica de T.
harzianum P49P11, mesma cepa utilizada neste trabalho, com T. reesei Rut-C30
utilizando bagaço explodido como substrato e constatou a maior produção de enzimas
pelo primeiro em detrimento do segundo. Os valores constatados pelo estudo quanto
a atividade produzida por T. harzianum foram de (26.1 ± 5 IU/L) para β - glicosidase,
(53.0 ± 16 IU/L) para avicelase e (21.2 ± 4 FPU/L) para FPase, enquanto que o extrato
enzimático produzido por T. reesei foi de (6.3 ± 0 IU/L) para β - glicosidase, (9.1 ± 1
IU/L) para Avicelase e (5.2 ± 0 FPU/L) para FPAse. De Souza (2018) também
comparou atividades enzimática entre T. harzianum 422 e T. reesei Rut-C30 quando
ambos fermentados em meio lactose e concluiu resultados melhores com a linhagem
de T. harzianum. O fungo A. niger DR02, conhecido por ser um grande produtor de β-
glicosidase, obteve a máxima atividade em 120 horas de fermentação, atingindo o
valor de 1.16 IU/ml (ROBL, 2013). Quando comparada a produção por T. harzianum
P49P11 no mesmo substrato utilizado por Robl, Delabona (2013) obteve 8.33 IU/ml.
A presença de açúcares como celobiose, xilose e glicose no sobrenadante,
apresentado pelos dados do espetrômetro de massas, na análise do sobrenandante
do cultivo (Figura 15), indicam a ação das enzimas hemicelulolíticas presentes agindo
no processo de hidrólise da celulose e hemicelulose constituintes da celulose
cristalina.
63
Desta forma, pode-se considerar que a estipe em questão neste trabalho
apresenta potencial para aplicações em larga escala na indústria.
6.4 Metaboloma
O valor de glicose apresentou-se constante ao longo das amostragens. A
glicose promove o recrutamento nuclear de CRE1, principal fator de transcrição que
medeia a repressão catabólita de carbono, um mecanismo que favorece a assimilação
de fontes de carbono com altos rendimentos de energia, ao invés daquelas que
rendem menos energia (PORTNOY et al., 2011). Braga (2018) avaliou a expressão
gênica de T. harzianum P49P11 em diferentes fontes de carbono e encontrou a
transcrição de CRE1 expressa de maneira constante até 96 horas de cultivo, momento
em que teve maior expressão. Portanto a diminuição da produção enzimática após 72
horas indica não estar correlacionada com o desencadeamento da repressão
catabólica por glicose. O estudo feito por Makela (2018) também concluiu que o gene
CreA em A. niger não está relacionado com a absorção de açúcares e sugere que
outros genes, também repressores de expressão de enzimas glicosídicas estejam
envolvidos.
Pela ferramenta matemática PCA podemos correlacionar metabólitos com
o tempo de amostragem. O tempo de 48 horas tem forte correlação para os açúcares
celobiose, xilose e arabinose. Esses açúcares, de alguma forma, podem estar
ocasionando a expressão de algum fator repressor de celulases, como por exemplo,
o ACE1. O papel repressor de ACE1 foi sugerido em estudos demonstrando que a
deleção do gene ace1 resulta em aumento da expressão de todos os principais genes
de celulase e hemicelulase em culturas induzidas por soforose e celulose (PORTNOY
et al., 2011). Braga (2018) também avaliou a expressão de ACE1 em cultivo de T.
harzianum em celulose cristalina e encontrou um valor elevado logo nos primeiros
tempos de cultivo, desta forma, não podemos descartar que a presença de açúcares
na célula como celobiose, xilose e arabinose pode ser capaz de ativá-lo
64
7 Conclusões
Com base nos resultados discutidos neste trabalho, conclui-se que:
1. A análise genômica revelou a presença de inúmeras sequências de
CAZymes, importantes para a constituição de coquetel enzimático na
aplicação da fase de hidrólise da biomassa;
2. O fungo apresenta diversas sequências gênicas para GHs com
atividades enzimática hemicelulolíticas;
3. Quando cultivado em biorreator, o micro-organismo passa por uma fase
de adaptação ao meio, seguido da fase de crescimento exponencial
(fase lag), as quais ocorrem antes de 48h;
4. A fase de crescimento é caracterizada por alteração no pH, fluxo de gás,
alteração de DO, resultados do aumento metabólico como visto na
correlação de massa e produção de CO2;
5. A análise de CO2 se mostra útil na inferência do crescimento celular, já
que o pico da produção demarca o final do crescimento exponencial
pelo fungo e inicio da fase estacionária.
6. As enzimas de interesse (glicosil-hidrolases) são produzidas na fase
estacionária e sua maior produtividade é atingida em 72h;
7. A análise do secretoma encontrou 50 enzimas relativas a degradação
de carboidratos, concluindo que o fungo apresenta secreção para
glicosil hidrolases.
8. O secretoma revelou que o micro-organismo libera as 4 tipos de
enzimas que atuam sinergicamente na degradação da celulose, sendo
elas endoglucanases, exoglucanases e celobiohidrolases e β-
glicosidases , revelando sua estratégia eficiente na hidrólise enzimática.
9. Foram detectados 42 metabólitos durante a cinética do crescimento do
fungo e dentre esses, os destaques foram para os aminoácidos -
47,62%; açúcares (mono e dissacarídeos) - 21,43% e compostos
orgânicos - 14,28%.
10. O tempo de 48 horas tem forte correlação para os açúcares celobiose,
xilose e arabinose. Esses açúcares de alguma forma podem estar
ocasionando a expressão de algum repressor de hemicelulases.
65
O gênero Trichoderma é conhecido por ser grande produtor de enzimas
celulolíticas. A linhagem T. harzianum P49P11 vem ganhando destaque em diversos
trabalhos na área de hidrólise como mostrado nesta dissertação.
7.1 Perspectivas
A fim de compreender o comportamento do micro-organismo durante o
processo fermentativo, a análise transcriptômica dos metabólitos secundários se faz
importante, uma vez que se tem o genoma da linhagem e a confirmação da presença
das sequências genômicas, para melhor compreensão das cinéticas químicas
envolvidas no processo de fermentação, bem como a correlação com CAZymes, visto
que podem estar no mesmo cluster.
O cultivo do micro-organismo com variação de íons Fe2+ no meio de cultura
pode ser uma estratégia de melhoramento na etapa de produção enzimática, visto que
a celulose e alguns metabólitos, como os terpenos, podem sequestrar o metal e
prejudicar a função de enzimas ferro-dependentes, como por exemplo AA5, presente
no secretoma.
O estudo do metabolismo primário se torna essencial na compreensão do
metabolismo celular do fungo envolvido para a discussão de futuras estratégias de
cultivo e alimentação, uma vez que o micro-organismo se mostra geneticamente
potencial na rota biotecnológica do etanol de segunda geração.
66
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81
9 APÊNDICE
9.1 Tabela completa de CAZymes preditas no genoma de T. harzianum P49P11
Familias Identificação da sequência genética (ID)
E-value Coverage SignalP
AA1_2 THAR_000073_T0 1.2e-160 0.988235294117647 sim AA1_2 THAR_008942_T0 4.5e-152 0.988235294117647 sim AA1_3 THAR_005941_T0 7.5e-122 0.987179487179487 não AA11 THAR_000535_T0 3.1e-74 0.979057591623037 sim AA11 THAR_001386_T0 5.5e-67 0.947643979057592 não AA11 THAR_003014_T0 1.8e-65 0.926701570680628 sim AA11 THAR_011086_T0 2.1e-60 0.973821989528796 não AA11 THAR_011401_T0 1.4e-61 0.979057591623037 sim AA2 THAR_003918_T0 2.3e-25 0.701960784313725 não AA2 THAR_000471_T0 3E-20 0.67843137254902 sim AA2 THAR_000772_T0 1.5e-13 0.890196078431372 não AA2 THAR_001001_T0 3.1e-12 0.894117647058824 não AA2 THAR_006684_T0 9.9e-24 0.674509803921569 não AA2 THAR_007037_T0 4.5e-25 0.694117647058824 sim AA2 THAR_008437_T0 1.8e-60 0.984313725490196 não AA3_2 THAR_000251_T0 1.8e-102 0.994736842105263 não AA3_2 THAR_000497_T0 1.4e-109 0.987719298245614 não AA3_2 THAR_003240_T0 3.8e-110 0.987719298245614 não AA3_2. THAR_004924_T0 4.7e-103 0.989473684210526 não AA3_2. THAR_006673_T0 2.8e-109 0.992982456140351 não AA3_2. THAR_006969_T0 1.1e-116 0.991228070175439 não AA3_2. THAR_008068_T0 2.1e-125 0.994736842105263 não AA3_2. THAR_010267_T0 6.1e-95 0.824561403508772 não AA3_2. THAR_010541_T0 8.9e-103 0.987719298245614 sim AA3_2. THAR_011428_T0 3.9e-97 0.992982456140351 não AA3_3. THAR_005787_T0 2E-258 0.996615905245347 não AA3_3. THAR_011465_T0 1E-260 0.996615905245347 Não AA3. THAR_000806_T0 9.4e-71 0.508090614886731 Não AA3. THAR_000941_T0 1.2e-93 0.516181229773463 não AA3. THAR_001138_T0 3.4e-85 0.496763754045307 não AA3. THAR_003274_T0 2.6e-71 0.508090614886731 não AA3. THAR_004138_T0 2.5e-74 0.508090614886731 não AA3. THAR_004739_T0 6.7e-42 0.514563106796116 não AA3. THAR_006001_T0 7.8e-50 0.503236245954693 não AA3. THAR_006006_T0 3.1e-72 0.509708737864078 não AA3. THAR_010797_T0 1.5e-69 0.5 não AA5_1. THAR_001205_T0 3.5e-110 0.660746003552398 sim AA6. THAR_002158_T0 1.8e-85 0.979487179487179 não AA9. THAR_005835_T0 1.2e-64 0.990909090909091 não
82
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83
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84
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86
GH30_7. THAR_000685_T0 1.2e-182 0.988610478359909 não GH30_7. THAR_004907_T0 1.4e-171 0.993166287015945 sim GH30_7. THAR_005519_T0 2.7e-170 0.988610478359909 sim GH31. THAR_000440_T0 8.8e-148 0.997658079625293 sim GH31. THAR_002474_T0 1.3e-104 0.995316159250585 não GH31. THAR_006200_T0 9.8e-149 0.995316159250585 sim GH31. THAR_007959_T0 7E-119 0.997658079625293 não GH31. THAR_008902_T0 2.5e-144 0.985948477751756 não GH35. THAR_004256_T0 1.3e-91 0.98371335504886 sim GH36. THAR_006039_T0 1.1e-234 0.995639534883721 sim GH37. THAR_002948_T0 4.7e-153 0.993890020366599 não GH37. THAR_005893_T0 2.4e-138 0.90020366598778 sim GH38. THAR_007910_T0 1.2e-85 0.947955390334573 não GH38. THAR_009645_T0 3.3e-14 0.386617100371747 não GH38. THAR_009645_T0 3.9e-34 0.368029739776952 não GH4. THAR_002532_T0 1.1e-53 0.972067039106145 não GH43_11. THAR_003461_T0 3.7e-146 0.996575342465753 não GH43. THAR_004971_T0 9.4e-59 0.983870967741935 sim GH43_29. THAR_011525_T0 1.4e-85 0.996296296296296 sim GH45. THAR_007893_T0 2.2e-78 0.98989898989899 não GH47. THAR_001942_T0 2.4e-168 0.995515695067265 sim GH47. THAR_003552_T0 2.1e-164 0.997757847533632 não GH47. THAR_006028_T0 1E-160 0.995515695067265 não GH47. THAR_007175_T0 2.6e-108 0.773542600896861 não GH47. THAR_007235_T0 1.5e-131 0.997757847533632 sim GH47. THAR_009919_T0 2.7e-142 0.995515695067265 sim GH49. THAR_011570_T0 7E-114 0.644808743169399 não GH5_15. THAR_006012_T0 2.5e-128 0.996677740863787 não GH5_22. THAR_006670_T0 7.2e-131 0.996478873239437 não GH5_24. THAR_003886_T0 3.3e-160 0.996825396825397 não GH5_31. THAR_004420_T0 3.6e-47 0.982332155477032 não GH5_5. THAR_009333_T0 8.8e-122 0.992957746478873 sim GH5_5. THAR_010035_T0 6.4e-117 0.98943661971831 sim GH5_5. THAR_010789_T0 2.8e-99 0.992957746478873 sim GH5_5. THAR_010970_T0 3.7e-117 0.992957746478873 sim GH5_9. THAR_004801_T0 3.8e-106 0.993464052287582 não GH54. THAR_004055_T0 4E-151 0.990506329113924 sim GH54. THAR_005812_T0 1.2e-158 0.993670886075949 sim GH6. THAR_010517_T0 9.9e-93 0.938775510204082 sim GH62. THAR_001809_T0 2.7e-130 0.996402877697842 sim GH64. THAR_007057_T0 3.1e-82 0.994550408719346 sim GH64. THAR_009134_T0 1.8e-93 0.994550408719346 sim GH64. THAR_011420_T0 1.4e-110 0.997275204359673 não GH64. THAR_011501_T0 1.2e-42 0.517711171662125 não GH64. THAR_011749_T0 7.4e-21 0.302452316076294 sim GH65. THAR_005613_T0 2E-80 0.983870967741935 sim GH67. THAR_006102_T0 3.5e-270 0.995515695067265 sim GH7. THAR_000270_T0 1E-135 0.995180722891566 sim GH71. THAR_000346_T0 4.6e-137 0.994666666666667 sim GH71. THAR_001807_T0 2.7e-143 0.994666666666667 sim
87
GH71. THAR_004376_T0 1.2e-76 992 sim GH71. THAR_006809_T0 5.6e-142 0.946666666666667 sim GH71. THAR_008133_T0 1.2e-118 976 sim GH71. THAR_009267_T0 7.6e-137 968 sim GH72. THAR_002610_T0 1.7e-113 0.987179487179487 sim GH72. THAR_004634_T0 6.4e-129 0.987179487179487 sim GH72. THAR_004945_T0 2.7e-124 0.983974358974359 sim GH72. THAR_007975_T0 2.7e-128 0.987179487179487 sim GH72. THAR_008421_T0 5.3e-105 0.919871794871795 sim GH75. THAR_007480_T0 2.5e-73 0.986363636363636 sim GH75. THAR_008498_T0 6.6e-75 0.954545454545455 sim GH75. THAR_009026_T0 9.2e-86 0.954545454545455 sim GH76. THAR_002139_T0 1.4e-54 0.829608938547486 sim GH76. THAR_003009_T0 3E-90 0.941340782122905 não GH76. THAR_004516_T0 5.1e-108 0.963687150837989 sim GH76. THAR_007196_T0 2.3e-106 0.958100558659218 sim GH76. THAR_007934_T0 1.5e-73 0.865921787709497 não GH76. THAR_011000_T0 9.8e-106 0.960893854748603 sim GH76. THAR_011331_T0 9.7e-100 0.955307262569832 sim GH78. THAR_001856_T0 5.8e-82 0.98015873015873 sim GH78. THAR_005838_T0 7.2e-146 0.998015873015873 não GH79. THAR_000540_T0 9.3e-86 0.953846153846154 sim GH79. THAR_009362_T0 3.5e-60 0.927472527472528 não GH79. THAR_010148_T0 2.5e-40 0.868131868131868 sim GH89. THAR_002630_T0 4.1e-198 0.972850678733032 não GH89. THAR_004624_T0 1.2e-157 0.83710407239819 sim GH92. THAR_002783_T0 1.4e-154 0.993890020366599 sim GH92. THAR_003467_T0 8.6e-162 0.989816700610998 não GH92. THAR_004063_T0 2.5e-145 0.993890020366599 sim GH92. THAR_004878_T0 6.4e-150 0.995926680244399 sim GH92. THAR_005346_T0 3.4e-168 0.989816700610998 não GH92. THAR_009358_T0 7E-164 0.991853360488798 sim GH55. THAR_000659_T0 2.1e-293 0.993243243243243 sim GH55. THAR_001144_T0 1.3e-255 0.983783783783784 sim GH55. THAR_006020_T0 8.5e-220 0.990540540540541 não GH55. THAR_006343_T0 5.2e-230 0.987837837837838 sim GH55. THAR_007389_T0 3E-160 0.947297297297297 sim GH55. THAR_008676_T0 1.9e-292 0.991891891891892 não GH55. THAR_009148_T0 4.5e-219 0.983783783783784 sim GH55. THAR_010479_T0 2.6e-201 0.97972972972973 sim GH55. THAR_011063_T0 5.3e-296 0.987837837837838 sim GH115. THAR_002305_T0 1.4e-228 0.822094691535151 não GH7. THAR_004903_T0 3.2e-185 0.992771084337349 sim GH142. THAR_008704_T0 2.1e-181 0.968684759916493 não PL20. THAR_000172_T0 2.8e-112 0.986899563318777 sim PL20. THAR_000682_T0 1.1e-101 0.995633187772926 sim PL7_4. THAR_003273_T0 3.8e-56 0.995327102803738 não PL7_4. THAR_007394_T0 6.1e-87 0.995327102803738 sim PL7_4. THAR_007479_T0 6E-63 0.995327102803738 sim PL7_4. THAR_010941_T0 3E-82 0.995327102803738 sim
88
PL7_4. THAR_011665_T0 1.9e-59 0.742990654205608 não PL8. THAR_000891_T0 3.2e-45 0.976833976833977 sim
9.2 Tabela de proteínas relacionadas com metabolismo secundário preditas no genoma de T. harzianum P49P11
Identificação da sequência genética (ID) Metabólito Secundário THAR_011498_T0 Proteína relacionada com ácido graxo THAR_009578_T0 Proteína relacionada com ácido graxo THAR_002638_T0 Proteína relacionada com ácido graxo THAR_003487_T0 nrps THAR_001675_T0 nrps THAR_005375_T0 nrps THAR_010153_T0 nrps THAR_010151_T0 nrps THAR_000316_T0 nrps THAR_000942_T0 nrps THAR_009676_T0 nrps THAR_005506_T0 nrps THAR_005119_T0 nrps THAR_001423_T0 Outros THAR_009322_T0 Outros THAR_005627_T0 Outros THAR_000377_T0 Outros THAR_007616_T0 Outros THAR_000979_T0 Outros THAR_005501_T0 Outros THAR_008756_T0 Outros THAR_003076_T0 t1pks THAR_003695_T0 t1pks THAR_002206_T0 t1pks THAR_002200_T0 t1pks THAR_001676_T0 t1pks THAR_003802_T0 t1pks THAR_005366_T0 t1pks THAR_004263_T0 t1pks THAR_006856_T0 t1pks THAR_010405_T0 t1pks THAR_009666_T0 t1pks THAR_009591_T0 t1pks THAR_006771_T0 t1pks THAR_010535_T0 t1pks THAR_005865_T0 t1pks THAR_000576_T0 t1pks THAR_009016_T0 t1pks THAR_004861_T0 t1pks THAR_005504_T0 t1pks
89
THAR_008100_T0 t1pks THAR_005092_T0 t1pks THAR_009415_T0 t1pks-nrps THAR_005256_T0 t1pks-nrps THAR_008063_T0 t1pks-nrps THAR_010120_T0 t1pks-nrps THAR_008706_T0 terpene THAR_001371_T0 terpene THAR_005581_T0 terpene THAR_009627_T0 terpene THAR_009628_T0 terpene THAR_001155_T0 terpene THAR_004299_T0 terpene THAR_007958_T0 terpene
9.3 Gráficos gerados em tempo real ao longo dos 5 processos fermentativos pelo software BioCommand Batch Control
90
91
9.4 Tabela completa de CAZymes encontradas no secretoma de T. harzianum P49P11
Identificação da Proteína (ID) CAZy NEC Classificação Espectro
THAR_001001_T0 AA2 EC 1.11.1.21 catalase peroxidase 4 THAR_001001_T0 AA2 EC 1.11.1.21 catalase-peroxidase 4
THAR_003918_T0 AA2 EC 1.11.1.11 L-ascorbato peroxidase 7
THAR_001205_T0 AA5 EC 1.2.3.15 glioxal oxidase 11 THAR_005835_T0 CBM1/AA9 EC 3.2.1.4 celulase 2 THAR_000687_T0 CBM1/CE15 EC 3.2.1.- metil-transferases 15 THAR_005820_T0 CBM1/GH11 EC 3.2.1.8 endo-xilanase 5 THAR_010035_T0 CBM1/GH5 EC 3.2.1.4 β -glucanase 6 THAR_009333_T0 CBM1/GH5-5 EC 3.2.1.4 endoglucanase 4 THAR_010517_T0 CBM1/GH6 EC 3.2.1.91 celobiohidrolase 16 THAR_004903_T0 CBM1/GH7 EC 3.2.1.91 celobiohidrolase 26 THAR_000270_T0 CBM1/GH7 EC 3.2.1.7 endoglucanase 6 THAR_001807_T0 CBM24/GH71 EC 3.2.1.59 glucanase 12 THAR_004055_T0 CBM42/GH54 EC 3.2.1.55 arabinofuranosidase 7 THAR_007975_T0 CBM43/GH72 EC 2.4.1- β -glucanosiltrans 7 THAR_011525_T0 CBM6/GH43 EC 3.2.1.37 β -xilosidase 12 THAR_011135_T0 CE1 EC 3.1.1.73 feruloil-esterase 7 THAR_011592_T0 CE5 EC 3.1.1.72 acetil-xilan-esterase 5 THAR_004037_T0 CE5 EC 3.1.1.72 acetil-xilan-esterase 3 THAR_007672_T0 CE8 EC 3.2.1.11 pectina-esterase 2 THAR_004929_T0 GH10 EC 3.2.1.8 endo-xilanase 32 THAR_005508_T0 GH10 EC 3.2.1.8 endo-xilanase 6
92
THAR_000744_T0 GH11 EC 3.2.1.8 endo-xilanase 9 THAR_002305_T0 GH115 Gh115 α -glucoronidase 6 THAR_005887_T0 GH12 EC 3.2.1.4 endoglucanase 6 THAR_000837_T0 GH16 EC 3.2.1.103 β -galactosidase 5 THAR_009992_T0 GH16 GH16 GH16 6 THAR_007593_T0 GH18 EC 3.2.1.14 chitinase 15 THAR_007271_T0 GH2 EC 3.2.1.23 galactosidase 3
THAR_002920_T0 GH20 EC 3.2.1.52 acetil-hexosaminidase 5
THAR_000369_T0 GH25 EC 3.2.1.17 lisozima 3 THAR_011476_T0 GH27 EC 3.2.1.22 α -galactosidase 2 THAR_003667_T0 GH28 EC 3.2.1.40 rhaminosidase 3 THAR_010018_T0 GH3 EC 3.2.1.21 β -glucosidase 22 THAR_004907_T0 GH30 EC 3.2.1.136 endo-xilanase 8 THAR_004578_T0 GH30-3 EC 3.2.1.75 β -glucanase 5 THAR_004421_T0 GH30-5 EC 3.2.1.164 galactanase 6 THAR_000685_T0 GH30-7 EC 3.2.1.75 β -glucosidase 4 THAR_000440_T0 GH31 EC 3.2.1.20 α -glucosidase 4 THAR_004256_T0 GH35 EC 3.2.1.23 galactosidase 4 THAR_007910_T0 GH38 EC 3.2.1.24 manosidase 3 THAR_011570_T0 GH49 EC 3.2.1.11 dextranase 6 THAR_007389_T0 GH55 EC 3.2.1.39 β -glucanase 9 THAR_006343_T0 GH55 EC 3.2.1.39 endoglucanase 2 THAR_008676_T0 GH55 EC 3.2.1.58 exo-glucanase 15 THAR_001809_T0 GH62 EC 3.2.1.55 arabinofuranosidase 13 THAR_011501_T0 GH64 EC 3.2.1.39 β -glucanase 2 THAR_000346_T0 GH71 EC 3.2.1.59 glucanase 5 THAR_009358_T0 GH92 GH92 manosidase 15 THAR_002783_T0 GH92 GH92 manosidase 3
93
10 Anexo
10.1 Declaração de biossegurança
94
10.2 Declaração de direitos autorais