Universidade Estadual de Campinas Instituto de Física ‘Gleb Wataghin’

Processamento e Funcionalização de Pontas Para Aplicações Biológicas de Microscopia de

Força Atômica

Alberto Luís Dario Moreau

Orientadora: Profa Dra. Mônica Alonso Cotta

Banca Examinadora Prof. Dr. Maurício Urban Kleinke (IFGW/UNICAMP)

Prof. Dr. Carlos Frederico Oliveira Graeff (IF/USP-RP)

Dissertação apresentada ao Instituto de Física ‘Gleb Wataghin’ da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos à obtenção do título de Mestre em Física

Novembro de 2005

i

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO IFGW - UNICAMP

Moreau, Alberto Luís Dario M813p Processamento e funcionalização de pontas para

aplicações biológicas de microscopia de força atômica / Alberto Luís Dario Moreau. -- Campinas, SP : [s.n.], 2005.

Orientador: Mônica Alonso Cotta. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física “Gleb Wataghin”. 1. Microscopia de força atômica. 2. Funcionalização. 3. Sondas com nanotubos de carbono. I. Cotta, Mônica Alonso. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Física “Gleb Wataghin”. III. Título.

(vsv/ifgw)

ii

iii

"O que não me mata me torna mais forte" Friedrich Nietzsche - Filósofo Alemão (1844-1900)

iv

Agradecimentos

À Professora Mônica pela orientação, apoio, paciência e amizade.

Ao grupo de Microscopia Eletrônica do LNLS Daniel Ugarte, Denise, Paulo César, Jefferson,

Sidnei e Daniela pelo ensino, sugestões e pelo ambiente de trabalho agradável com que sempre

recebem a todos seus colaboradores.

Ao grupo da Professora Anete Pereira de Souza (CBMEG) pelo trabalho em conjunto

À minha mãe e irmãos e à minha namorada Andrea, pela paciência e apoio

Aos colegas do laboratório: Klaus, Roberto, João Hermes, Luiz Nieto, Gabriela e João

Guilherme pelas discussões e companheirismo

Ao técnico Antônio (Totó) do LPD pelas inúmeras colaborações

À Márcia e à Rosa pelos serviços burocráticos

Ao IFGW pela infraestrutura necessária ao desenvolvimento deste projeto

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro

deste trabalho

v

Resumo

Este trabalho teve como objetivo implementar a técnica de espectroscopia de força no

Microscópio de Força Atômica (AFM) existente no LPD/IFGW/UNICAMP e aplicá-la ao estudo

de pontas e amostras funcionalizadas com tiol (mercaptoundecanoic acid). Em particular, foi

necessária uma caracterização minuciosa da ponta de AFM, utilizando imagens de microscopia

eletrônica. Avaliamos a metalização da ponta com Au (necessária para a funcionalização), o raio

da extremidade da ponta e as formas de aproximação da mesma em relação à amostra. Um

estudo da constante de mola da alavanca onde se localiza a ponta foi realizado para obtermos

valores das forças absolutas medidas.

As medidas de força foram realizadas em atmosfera de N2 para evitarmos forças capilares

embora também tenhamos realizado algumas medidas em meio ambiente. Variamos a técnica

utilizada para a metalização da ponta (sputtering e deposição térmica), a concentração da solução

tiol/etanol e os tempos de funcionalização das pontas e amostras.

As medidas de força de adesão do tiol nos mostraram que a rugosidade da amostra

interfere significativamente na área de contato entre ponta e amostra e conseqüentemente na

dispersão nas forças. Apesar disso, nossos resultados forneceram valores de força de adesão e

energia livre com a mesma ordem de grandeza que a literatura na área.

Em paralelo, foram realizados testes de resistência e durabilidade com pontas de nanotubos de carbono, em colaboração com o Dr. Daniel Ugarte, além de imagens de AFM de amostras de DNA plasmídico, um possível candidato para futuros trabalhos com pontas funcionalizadas.

vi

Abstract

In this work we have implemented the force spectroscopy technique using the Atomic

Force Microscopy (AFM) equipment at the LPD/IFGW/UNICAMP; this technique was applied

to the study of functionalized tips and samples with thiol (mercaptoundecanoic acid). In

particular, a detailed characterization of AFM tips with Electron Microscopy was carried out. We

have studied the tip metalization with Au (necessary for functionalization), the tip radius and the

several modes of tip-sample approximation. We have also studied models for the cantilever

spring constant in order to evaluate the absolute force values.

The force measurements were carried out in N2 atmosphere to prevent capillary forces,

though we also carried out some measurements in laboratory atmosphere. Tip metalization

techniques (sputtering and thermal deposition), the thiol/ethanol solution concentration and the

functionalization times of tip and samples were varied in this work.

The sample roughness can interfere in the contact area between tip and sample, and, thus

on the thiol adhesion force measurements – particularly on force values dispersion. In spite of

that, our measurements provided values for the thiol adhesion forces and free energies in the

same order of magnitude of the literature in the area.

Parallel to this work, we have carried out resistance and durability tests with carbon

nanotubes tips, in collaboration with Prof. Daniel Ugarte, as well as AFM images of plasmid

DNA samples, a likely candidate for future work using funcionalized tips.

vii

Índice

Capítulo 1 Introdução .....................................................................................1

Capítulo 2 Forças de Interação ......................................................................4 2.1 – Potenciais interatômicos .................................................................................4

2.2 – Potencial de van der Waals entre corpos macroscópicos ...............................5

2.3 – Interações por pontes de hidrogênio ...............................................................9

2.4 – Forças capilares...............................................................................................9

2.5 – Forças de adesão ...........................................................................................12

2.6 – Modelo DMT e JKR .....................................................................................14

Capítulo 3 Técnicas de Microscopia Utilizadas..........................................16 A) Microscópio Eletrônico de Varredura – Field Emission Gun ..........................16

B) Técnicas de Microscopia por Varredura com Ponta de Prova (SPM) ..............17

3.1) Microscopia por Força Atômica (AFM).............................................18

3.2) Modo Contato (CM-AFM) .................................................................19

3.3) Modo Não-Contato (NC-AFM)..........................................................20

3.4) Espectroscopia de Força Atômica ......................................................21

3.5) Interações entre estruturas moleculares ..............................................23

3.6) Caracterização e calibração da sonda .................................................25

Capítulo 4 Metodologia para implementação de AFS................................27 4.1) Preparação de pontas e amostras ....................................................................27

4.1.1) Introdução........................................................................................27

4.1.2) Processos e Metalização ..................................................................28

4.1.3) Funcionalização dos chips e amostras.............................................30

4.2) Medidas de força ............................................................................................31

4.3) Histogramas....................................................................................................32

4.4) Gráficos de evolução das medidas de força ...................................................33

4.5) Análise de imagens de pontas no FEG-SEM .................................................34 viii

4.6) Determinação das constantes de mola das alavancas .....................................36

4.7) Pontas de AFM com nanotubos de carbono (CNTs)......................................39

Capítulo 5 Resultados e Análises................................................................42 5.1) Análise das Sondas .........................................................................................42

5.1.1) Imagens de microscopia eletrônica (FEG-SEM) e estudo da metalização dos

chips de AFM ........................................................................................................42

5.1.2) Pontas quebradas ou com a metalização descascada.......................46

5.1.3) Pontas padrão...................................................................................47

5.1.4) – Pontas com nanotubo de carbono .................................................48

5.2) Análise da superfície da amostra....................................................................52

5.3) Normalização dos valores da força de adesão................................................54

5.4) Distribuição nos histogramas .........................................................................54

5.5) Fator de correção ............................................................................................55

5.6) Propagação de erro .........................................................................................56

5.7) Análise dos gráficos de Força vs Distância dos lotes A e F...........................57

5.8) Medidas de força de adesão............................................................................59

5.8.1) Pontas e amostras não funcionalizadas............................................59

5.8.2) Pontas e amostras funcionalizadas...................................................67

5.9) Análise dos resultados....................................................................................73

Capítulo 6 Conclusões Gerais .....................................................................76

Apêndice A Perspectivas Futuras de Aplicações .....................................78 A.1) Medidas de DNA com AFM .........................................................................78

A.1.1) Aspectos Teóricos...........................................................................79

A.1.2) Procedimento Experimental............................................................82

A.1.3) Análise das imagens de AFM das amostras de plasmídeos............83

A.2) Conclusões.....................................................................................................89

Bibliografia ........................................................................................................90

ix

Capítulo 1

Introdução

O progresso nas técnicas de microscopia de varredura por sonda (SPM, do inglês

Scanning Probe Microscopy) tem sido substancial. Entre as técnicas SPM, a microscopia

de força atômica (AFM, do inglês Atomic Force Microscopy) mostrou-se uma técnica

poderosa, que permite a caracterização em escala nanométrica de diferentes propriedades –

mecânicas, elétricas e magnéticas – da amostra, além de sua topografia. O AFM também se

mostrou uma ferramenta poderosa para sondar interações moleculares, pois pode resolver

forças na escala de piconewton. Esta resolução pode, em princípio, ser várias ordens de

grandeza maior que as forças envolvidas nas ligações químicas mais fracas [1], sugerindo a

possibilidade de medida de interações moleculares individuais. Contudo, os grupos

químicos específicos na ponta (sonda) que interage com a superfície são indeterminados na

maioria dos casos. Além disso, a grande área de contato ponta-superfície, ou deformações

na curvatura da ponta resultantes das forças superficiais podem impedir a realização da

medida [2].

Para contornar essa limitação do AFM, surgiu o conceito de modificação química

das pontas [3-6], para torná-las sensíveis a interações moleculares específicas. Utilizando

pontas funcionalizadas quimicamente, medidas AFM podem ser usadas, por exemplo, para

sondar forças entre grupos moleculares distintos e mapear a distribuição espacial de grupos

funcionais específicos e seus estados de ionização. Esta nova aplicação do AFM tem sido

chamada de Microscopia de Força Química (CFM, do inglês Chemical Force Microscopy)

[3] ou então de Espectroscopia de Força Atômica (AFS, do inglês Atomic Force

Spectroscopy) [36].

Em AFS, a ponta do AFM é modificada com grupos químicos funcionais

específicos [3]. Isto permite que a ponta gere contraste dependente das propriedades

químicas da amostra [7], através por exemplo do sinal de fase no modo de tapping. Este

sinal será proporcional à adesão entre a ponta e a amostra e pode ser medido

simultaneamente com a topografia. Pontas funcionalizadas também tem sido empregadas

em espectroscopia de força. Neste modo de operação, a varredura não é realizada; a ponta é

colocada em contato com a superfície da amostra num ponto escolhido, e a amostra é então

1

retraída. As forças aplicadas à ponta durante a retração são devidas a uma variedade de

interações incluindo a adesão intermolecular entre grupos químicos fundamentais

[3,4,6,8,50,51], o desnovelamento de proteínas [9,51], e interações antígeno-anticorpo

[10,50], por exemplo. É possível medir a interação de apenas uma única molécula (uma

proteína, por exemplo) ligada à ponta através de uma molécula intermediária, que interage

com a superfície da amostra [52, 53].

Em geral, as pontas apresentam um grande raio de curvatura, o que dificulta

controlar o número de moléculas ativas na ponta e limita significativamente a resolução

lateral. Estas limitações podem ser contornadas com o uso de pontas de nanotubos de

carbono (CNT) [11]. Estas pontas apresentam raio de curvatura em geral menor que as de

silício, e podem ser especificamente modificadas apenas em suas extremidades. Deste

modo, a funcionalização das pontas de CNT cria pontas que tem poucos sítios moleculares

ativos, e com uma orientação relativamente controlada [54]. Em particular, pontas CNT

com parede única (single wall) poderiam levar à resolução subnanométrica em contraste

químico, permitindo o reconhecimento de sítios específicos de ligação. Por outro lado,

pontas CNT em geral são bem mais delicadas, e podem ser danificadas dentro de meios

líquidos, por exemplo.

O meio em que a superfície está interagindo com a ponta também é um fator

fundamental para a determinação das forças medidas. Para que a interação da ponta seja

determinada somente por energias livre de superfície do sólido, é necessário que as forças

de adesão sejam medidas em ultra alto vácuo. As forças medidas em ambiente de

laboratório são de difícil interpretação pois temos influências de forças capilares [14,15]

que são da mesma ordem de magnitude que uma interação química específica. As forças

capilares irão obscurecer as pequenas diferenças esperadas para as forças moleculares entre

diferentes grupos funcionais da ponta e da amostra. Medidas realizadas em atmosfera de

um gás inerte podem reduzir problemas relativos às forças capilares [16,17], porém ainda

assim é necessário cuidado na interpretação dos resultados pois é difícil excluir a

possibilidade da presença de líquido nas superfícies.

Os efeitos de capilaridade também podem ser eliminados se os experimentos forem

conduzidos em meio líquido ao invés de ar [18,19]. Estudos em soluções aquosas são

especialmente importantes pois o AFM está sendo cada vez mais utilizados em sistemas

biológicos que necessitam de soluções para garantir a sua integridade [20,21].

2

Um outro ponto importante na medida de forças com o AFM reside na constante de

mola da alavanca onde a ponta está montada. Na literatura, existem grupos que estudam

métodos para a determinação da constante de mola da alavanca na qual se encontra a sonda.

Estes estudos são importantes pois as medidas de força são diretamente proporcionais à

esta constante, logo é necessário conhecer seu valor para se obter os valores absolutos das

forças. Diversos métodos são relatados para a calibração experimental da constante de mola

da alavanca [22-25], e para a calibração pela geometria e material [26-28].

O objetivo desta dissertação é trabalhar na implementação de técnicas de

funcionalização de pontas de AFM, sistematizando os resultados de forma a poder aplicar

os resultados em medidas de força entre a ponta e a amostra. Para tanto, estudamos o

processamento de pontas visando a aplicação nesta técnica, bem como analisamos o efeito,

sobre a ponta, das medidas realizadas. Neste aspecto, trabalhamos tanto com pontas de Si

comerciais quanto com as pontas CNT fabricadas em colaboração com o Prof. Dr. Daniel

Ugarte, do Laboratório Nacional de Luz Sincrotron (LNLS). Estas pontas foram montadas

no LNLS utilizando o nanomanipulador construído pelo Dr. Ugarte. Nosso trabalho

consistiu em caracterizar as pontas obtidas, sua resolução espacial e durabilidade [12,13],

em função do procedimento adotado para a sua fabricação. Por outro lado, para verificar a

possibilidade de medidas de adesão no AFM, trabalhamos com pontas de Si e amostras

funcionalizadas com tiol terminados em radical COOH.

Esta dissertação está dividida da seguinte maneira. Conceitos básicos em forças de interação e adesão são apresentados no Capítulo 2, enquanto no Capítulo 3 apresentamos as técnicas utilizadas de microscopia por varredura por sonda e eletrônica. No Capítulo 4, descrevemos a metodologia de preparação de pontas, amostras, calibração de pontas e tratamento de dados.

Os resultados experimentais e análises sobre o estudo das pontas e sobre forças de

adesão entre pontas e amostras funcionalizadas com tiol estão no Capítulo 5. Neste capítulo

são apresentadas imagens de microscopia eletrônica das pontas além de imagens de AFM e

histogramas de força. A discussão dos resultados é feita no decorrer da apresentação dos

resultados experimentais, deixando para o Capítulo 6 as conclusões do trabalho e

perspectivas futuras. Finalmente, o Apêndice A relata o estudo realizado para a deposição

de ácido desoxirribonucléico (deoxyribonucleic acid, DNA) plasmídico em substratos,

possibilitando imagens com o AFM, e viabilizando um possível sistema de interesse para

trabalhos de funcionalização.

3

Capítulo 2

Forças de Interação

Neste capítulo, iremos fazer uma breve revisão das principais forças de interação,

microscópicas e macroscópicas, que servirão como referência para a interpretação dos

dados mostrados na seção experimental desta tese de mestrado. Em particular, trataremos

com mais detalhe da interação esfera-plano (ou esfera-esfera), uma vez que este é um

modelo que pode ser aplicado ao que ocorre na interação ponta-amostra do AFM.

Consideramos também que uma das esferas está ligada a uma mola, simulando a presença

da alavanca na qual está montada a ponta do AFM.

2.1 – Potenciais interatômicos

As principais forças envolvidas nas interações interatômicas surgem através de

três fatores [29]: 1) interações eletrostáticas entre cargas ou distribuições de cargas, tais

como monopolos, dipolos, quadripolos e combinações destas interações; 2) forças de

polarização, onde uma distribuição de forças numa molécula cria um momento de dipolo

numa molécula adjacente; e 3) forças provenientes de interações covalentes e repulsivas

de troca, devido ao princípio de exclusão de Pauli. Verifica-se experimentalmente que

estas forças repulsivas crescem abruptamente quando a distância interatômica diminui.

Separando os dois átomos, a força repulsiva cai a zero a distâncias da ordem de 3Å,

acima da qual a força passa a ser atrativa. A lei de potências é um possível modelo de

potencial interatômico, que é dado por: n

rrw ⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=σ)( (2.1)

Onde σ é o raio atômico. Um modelo possível para a interação entre átomos é o

potencial de Lennard Jones, que combina o potencial atrativo de van der Waals com o

repulsivo atômico, resultando em:

4

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡⎟⎠⎞

⎜⎝⎛−⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=

612

04)(rr

wrw σσ (2.2)

Na equação acima temos o mínimo da energia em w = -wo, numa distância de

r =1,12σ, e é zero na distância de r = σ. As forças são obtidas derivando a equação

acima, obtendo:

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡−= 13

12

7

6

0224)(rr

wrF σσ (2.3)

2.2 – Potencial de van der Waals entre corpos macroscópicos:

Forças entre corpos macroscópicos são de grande interesse nesta dissertação de

mestrado uma vez que estas descrevem as interações existentes entre a ponta de nosso

microscópio e a amostra. As geometrias mais comumente encontradas na prática são duas

superfícies planas ou duas superfícies esféricas interagindo entre si. Trataremos aqui do

caso de uma esfera interagindo com um plano (esfera com raio de curvatura infinito),

pois este é um modelo adequado para o sistema ideal ponta-amostra. Para isso

calcularemos inicialmente a interação entre uma molécula e uma superfície plana e em

seguida, entre uma esfera e uma superfície.

- Interação Molécula-Superfície

Assumimos um potencial puramente atrativo da forma w(r) = -C/rn, (onde C é

chamado de coeficiente de London [29]) para um par de átomos, e o princípio da

superposição de forças, ou seja, a interação entre uma molécula e a superfície plana de

um sólido será a soma das interações de todas as moléculas do sólido com a molécula

(figura 2.1a). Para as moléculas de um anel de seção transversal dx.dz e raio x, o volume

do anel será de 2πx.dx.dz, e o número de moléculas no anel será de 2πρx.dx.dz, onde ρ é

a densidade de moléculas no sólido. A rede de interações entre a molécula numa distância

D da superfície será de:

5

( ) ( )( )∫∫

∞=

= −

∞=

= −−−

=+

−=x

x nn

z

Dz DnnCdx

xzxdzCDw

0 3222 3222)( ρπρπ para n > 3 (2.4)

experimentalmente, sabe-se que para van der Waals n = 6, logo:

36)(

DCDw ρπ

−= (2.5)

Desta forma temos que o potencial de interação de van der Waals de uma

molécula interagindo com um plano decai com o cubo da distância entre eles, e não com

a sexta potência como no caso de duas moléculas.

A

B

Figura 2.1: (A)-Molécula interagindo com um plano, integração por anéis. (B)-Esfera interagindo com um plano, integração por discos [14].

- Interação Esfera-Superfície

Podemos generalizar o problema se calcularmos a energia de interação de uma

esfera de raio R e uma superfície plana (figura 2.1b). Pela simetria do problema faremos a

integração por discos da esfera onde, geometricamente, podemos dizer que o raio x do

disco é dado por x2 = (2R - z)z. O volume da seção circular do disco, de área πx2 e

espessura dz, é então escrita como πx2dz = (2R - z)zdz, logo o número de moléculas

contidas no disco é de ρ(2R - z)zdz, onde ρ é a densidade de moléculas na esfera. Desde

que todas as moléculas do sistema estejam a uma distância (D + z) da superfície do

plano, o potencial de interação, utilizando a equação 2.4, pode ser escrito como:

6

( )( )( )( )∫

=

= −+−

−−−=

Rz

z n dzzD

zzRnn

CDW2

0 3

22 232

2)( ρπ (2.6)

Para R>>D, e apenas para pequenos valores de z (z ≅ D) contribuindo para a

integral, nós obtemos que:

( )( ) ( )∫∞

−− −−−−−=

+−−−=

0 5

22

3

22

)5)(4)(3)(2(42

322)( nn Dnnnn

RCdzzD

Rznn

CDW ρπρπ (2.7)

Novamente, para interações de van der Waals, temos que n = 6. Desta forma o

potencial acima fica:

DARDW6

)( −= (2.8)

onde A é a constante de Hamaker, definida como A = π2Cρ2. Derivando a equação acima

em relação à distância D obtemos a equação da força pelo espaço:

23)(

DARDF = (2.9)

Para o caso de uma esfera de ouro interagindo com uma superfície de ouro, temos

que A ≅ 35.10-20J [30]. Desta forma a equação F(D) pode ser graficada como é mostrado

nas curvas vermelha e preta do gráfico 2.1. Escolhemos R = 50nm e R = 100nm pois os

raios das pontas que utilizamos em nossos experimentos encontram-se neste intervalo.

Caso consideremos que nossa esfera esteja presa na extremidade de uma mola

(correspondente à alavanca do AFM) com constante de mola k entre 3 e 5 N/m (gráfico

2.1), teremos que o ponto de intersecção das duas curvas, a de van der Waals e a elástica

(lei de Hooke), corresponde ao momento em que seus valores são os mesmos. Ou seja,

para uma pequena diminuição da distância, a força atrativa de van der Waals será maior

que a força exercida pela mola na esfera, quando plano e esfera se aproximam. Na

situação em que o plano está se afastando em relação à esfera e a distância cresce a partir

7

do ponto de intersecção entre as curvas, a força exercida pela constante de mola será

maior que a exercida pela força atrativa de van der Waals; logo a esfera irá se soltar do

plano. A tabela 2.1 ilustra os valores das forças correspondentes aos pontos de

intersecção para os valores de k = 3, 4 e 5 N/m.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.00

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

vdW (R = 100nm) vdW (R = 50nm) elástica (k = 3 N/m) elástica (k = 4 N/m) elástica (k = 5 N/m)

F [n

N]

D [nm]

Gráfico 2.1: Curvas de força por distância das forças de interação de van der Waals (vermelha e preta) e da força elástica para constantes de mola k = 3 N/m, 4 N/m e 5 N/m. O ponto de intersecção entre as duas curvas mostra a distância a partir da qual a esfera é atraída para o plano ou em que a esfera se solta do plano. A região hachurada indica o intervalo em que provavelmente o nosso sistema estará atuando.

k [N/m]

F intersecção R = 50nm

[nN]

F intersecção R = 100nm

[nN] 3 3,75 4,71 4 4,52 5,72 5 5,25 6,65

Tabela 2.1: Valores de força na intersecção das curvas do gráfico 2.1.

Como mencionamos na introdução deste capítulo, esta análise, em que temos a

esfera presa na extremidade de uma mola, será útil para o modelamento da técnica de

microscopia de força atômica. As constantes de mola que utilizamos no nosso sistema

estão no intervalo de 3 e 5 N/m enquanto o raio da extremidade de nossa ponta se

encontra entre 50 e 100 nm. Logo é possível afirmar que nosso sistema estará trabalhando

dentro da região hachurada da figura 2.1.

8

2.3) Interações por pontes de hidrogênio:

As pontes de hidrogênio são importantes interações entre moléculas que podem

estar presentes no decorrer de nossas medidas de força de adesão. Moléculas polares

(como a água, por exemplo) possuem regiões de carga negativa e positiva (átomo de O e

H da água, respectivamente) que atraem outras moléculas polares da vizinhança (figura

2.2). Uma molécula de água pode formar até quatro pontes com as moléculas da

vizinhança.

Figura 2.2: Moléculas de água interagindo entre si com pontes de hidrogênio (linha pontilhada).

As pontes de hidrogênio podem ter até cerca de 5% da força de uma ligação

covalente (~µN), e possuem comprimento de aproximadamente 0,2nm [31,55]. Quando

muitas pontes de hidrogênio são formadas com uma mesma molécula, a ligação pode ser

suficientemente forte para ser estável.

Neste trabalho, iremos medir a força de adesão entre moléculas que possuem

carboxilas (COOH) em sua extremidade, e estas interagem entre si através de pontes de

hidrogênio, conforme será descrito na seção 3.5.

2.4) Forças capilares:

O meio experimental exerce um papel fundamental na determinação da força

(figura 2.3). Para medirmos unicamente a energia livre da superfície, as forças de adesão

devem ser medidas em ultra alto vácuo. As medições de força feitas em meio ambiente

(ar) são de mais difícil interpretação devido às forças capilares [31] (vide figura 2.3) que

são usualmente de 1 a 2 ordens de magnitude maiores do que uma interação química

9

específica. Por isso as forças capilares tornam difícil a interpretação das pequenas forças

de interação entre os grupos moleculares da ponta e da amostra. Por outro lado, a

capilaridade irá enfatizar o grau relativo de “molhabilidade” e pode ser a base de

discriminação entre grupos hidrofóbicos e hidrofílicos quando medidos em meio

ambiente [14]. O desempenho das medidas em atmosfera de um gás inerte (N2, por

exemplo) pode ser aproximado à sensibilidade química das interações moleculares,

porém é necessário cuidado nas interpretações dos resultados obtidos, pois é difícil

excluir ou avaliar a presença de vapor adsorvido na superfícies das amostras.

A

B

C

Figura 2.3: Comparação entre forças medidas em ultra alto vácuo, em líquido e em meio ambiente (ar).(A) As condições de interação em ultra alto vácuo são determinadas pelas energias livres de superfície. (B) A magnitude da força de adesão em meio líquido é definida pela energia livre da superfície sólido-líquido. (C) Os experimentos feitos em meio ambiente refletem a molhabilidade da superfície; a interação predominante é resultado das forças capilares [31].

10

Figura 2.4: Desenho esquemático de esfera próxima de uma superfície plana unidos por menisco de um líquido.

Para um sistema esfera-plano, Israelachvili et al [14] calcularam, através da

equação de Kelvin (equação 2.10) e da pressão de Laplace (equação 2.11), a força de

capilaridade que irá manter a esfera no plano (figura 2.4). A pressão de Laplace [32]

descreve a pressão que um filme exerce ao aumentarmos a sua área superficial e,

conseqüentemente, modificarmos a sua energia livre de superfície, enquanto a equação de

Kelvin trata o mesmo problema quimicamente, utilizando grandezas como a constante

dos gases e o volume molar. Foi considerado o caso de um menisco simétrico (r1 = r2 = r)

e que R >> r.

( )s

L

ppRTV

rr log11

21

γ=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+ (2.10)

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+=

21

11rr

P Lγ (2.11)

onde r1 e r2 são os raios de curvatura dos meniscos, V é o volume molar, γL é a energia

livre de superfície do líquido, e p/pS é a pressão relativa de Laplace (a pressão sem a força

exercida sobre a pressão com a força exercida). A equação para a força atrativa entre a

esfera e a superfície devida à presença de capilaridade é:

( )dDRF L

+=

1cos4 θγπ (2.12)

onde θ é o ângulo de contato do menisco.

11

Considerando uma esfera de R = 50nm em contato com o plano (D = 0), ambos

de ouro, um ângulo de contato médio θ = 45°, e γágua = 72,8 mN/m2 obtemos pela

equação 2.12 que a força capilar normalizada pelo raio será de F/R ≅ 0,5 N/m. Esta força

está próxima das forças de adesão como mostraremos no Capítulo 3.

O efeito de capilaridade pode ser eliminado realizando o experimento em meio

líquido, em vácuo ou em atmosfera controlada de um gás inerte como o N2 [31]. Estudos

em soluções aquosas são especialmente importantes tendo em vista que o AFM está

sendo cada vez mais usado para medições em sistemas biológicos, que dependem

fortemente de forças de adesão.

2.5 – Forças de Adesão

Na interação da ponta funcionalizada do AFM com a superfície da amostra

também funcionalizada, esperamos que ocorra um trabalho de adesão entre as superfícies

dos meios envolvidos. Este trabalho está relacionado à mudança na energia livre do

sistema. Esta mudança, no caso de superfícies em vácuo, corresponde ao trabalho

(reversível) feito para separar (ou criar) duas unidades de área de dois meios em vácuo

(figura 2.5-a,b). No caso de dois meios diferentes, esta energia é chamada de trabalho de

Adesão W12, enquanto que para dois meios idênticos temos o trabalho de Coesão W11.

Desde que haja atração entre estes meios em vácuo, W11 e W12 são sempre positivos.

A Energia de Superfície, γ, está relacionada com a variação na energia livre

devido ao aumento de uma unidade na área do meio. O processo de criar uma unidade de

área é equivalente a separar duas meias unidades de área previamente em contato (figura

2.5-c,d), por isso nós podemos escrever:

111 21 W=γ (2.13)

Se este aumento da área ocorre em ambiente gasoso, como por exemplo uma

atmosfera controlada no laboratório, algumas moléculas de vapor desta atmosfera podem

vir a aderir na nova superfície criada, diminuindo assim o valor real da energia da

12

superfície em questão. Por exemplo, quando a mica é clivada em alto vácuo temos que

γ ≅ 4500mJ/m2. Quando este processo ocorre na atmosfera do laboratório, porém, γ é

menor que 300 mJ/m2 [14].

No caso de dois líquidos imiscíveis em contato, temos que considerar a energia

interfacial. A mudança da energia livre devida à expansão de uma unidade de área de

interface é conhecida como energia interfacial γ12. As energias associadas com o

processo de expansão podem ser entendidas seguindo dois passos hipotéticos (figura 2.5-

e). Inicialmente, unidades de área do meio 1 e 2 são criadas e são então trazidas em

contato. A mudança da energia total de contato γ12 é:

122112221112 21

21 WWWW −+=−+= γγγ (2.14)

esta equação é conhecida como Equação de Dupré.

Com esta equação, podemos desenvolver o trabalho de adesão num terceiro meio,

caso que melhor descreve nosso sistema experimental (ponta interagindo com a amostra).

Utilizando as equações 2.13 e 2.14 é possível encontrar uma relação para a mudança de

energia livre ao separarmos dois meios, meio 1 e 2 dentro de um meio 3 (figura 2.5-f),

que é dado por:

12231323133312132 γγγ −+=−−+= WWWWW (2.15)

Caso o meio 3 seja o vácuo, teremos que W132 W12, γ13 γ1, γ23 γ2, e,

cairemos novamente na equação 2.14 como esperado.

13

A) Trabalho de Adesão

1

2

1

2

W12

unidade de área

B) Trabalho de Coesão

11

W11

11

1/2 unidade de área

½ W11 = γ1 = γ2

C) Trabalho de Coesão

1 1 1 1

W11unidade de área

½ W11 = γ1

D) Energia Interfacial: Sólido-Líquido

1 1

1/2 +W11 1/2W22

11

1

1

2 2 2

-W12 γ12 = ½ W121 = ½ W11 + ½ W22 – W12

E) Energia Interfacial: Líquido-Líquido

1

2

1

2

1/2 +W11 1/2W22 -W12 γ12 = ½ W11 + ½ W22 – W12

F) Trabalho de Adesão num terceiro meio

1

2

1

3 3 3W132

2

W132 = W12 + W33 - W13 – W23

Figura 2.2: Desenhos esquemáticos representando os trabalhos de adesão/coesão e as energias interfaciais.

2.6) Modelo DMT e JKR:

O cálculo de γ através de medidas de força de adesão envolve a normalização das

medidas de força pela área de contato para obtermos o trabalho de adesão (WA). As

dificuldades para medir diretamente a área de contato pelas medidas de AFM são

contornadas aplicando modelos teóricos de mecânica de contato. Os modelos

desenvolvidos por Derjaguin-Muller-Toporov (modelo DMT) para pontas pequenas e

duras interagindo com amostras planas e duras [50] e por Johnson-Kendall-Roberts

(modelo JKR) para pontas moles e grandes interagindo com superfícies de alta energia

[51], são os mais utilizados para a análise de energia livre de superfície [36, 52]. De

acordo com estes dois modelos, a correlação entre a medida de força de adesão F e o

trabalho de adesão (WA) é:

14

ARWxF π= (2.16)

onde a constante x é igual a 2 para o modelo DMT e 1,5 para o modelo JKR, e R é o raio

de curvatura da extremidade da ponta. O trabalho de adesão (WA = W132) para três meios

diferentes é definido pela equação de Dupré, como foi mostrado na equação 2.15.

Na realidade, nenhuma superfície é perfeita, e a representação da verdadeira área

de contato entre a ponta e a superfície por um dos modelos é muito difícil. Irregularidades

das superfícies podem aumentar ou diminuir a área de interação entre as superfícies

causando dispersão nas medidas.

Na literatura, não existe um consenso sobre qual modelo descreve melhor o nosso

sistema ponta-amostra [53]. Maugis [54] propôs um parâmetro no qual determina qual é o

modelo mais apropriado. Os dois casos limites, modelo JKR e DMT, e a transição entre

eles, podem ser descritos por um parâmetro de transição adimensional chamado

parâmetro de Tabor, µ [55], e parâmetro de Maugis, λ [54]. Para o caso de dois materiais

iguais em contato, os parâmetros são escritos como: 3/1

30

2

2

964157,1 ⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛==

zKRγµλ (2.17)

Onde z0 é a distância de equilíbrio entre átomos, γ é a energia de superfície do

material e K é o módulo reduzido de Young, que é dado por:

( ) ( ) 1

2

22

1

21 11

34

−

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ −+

−=

EEK νν (2.18)

Onde ν1 e ν2 são razões de Poisson e E1 e E2 são os módulos de Young para as

duas esferas em contato. De acordo com Maugis, a teoria DMT é válida quando µ < 0,1 e

a JKR quando µ > 5.

Para o caso de uma esfera de Au interagindo com uma superfície de Au, temos

que γAu = 1,37 J/m2 [52], E = 117 Gpa, ν = 0,42 [52], e z0 = 0,28 nm. Supondo

R = 50nm e 100nm, temos, pela equação 2.17 que o valor do parâmetro de Tabor é 1,3 e

1,6 respectivamente, indicando que para os nossos experimentos podemos utilizar

qualquer um dos modelos. Deste modo, utilizaremos para os nossos cálculos no capítulo

5 a teoria JKR, pois é mais comum de ser encontrada na literatura.

15

Capítulo 3

Técnicas de microscopia utilizadas

A) Microscópio Eletrônico de Varredura – Field Emission Gun:

O funcionamento de um microscópio eletrônico de varredura (Scanning Electron

Microscopy - SEM) consiste na focalização de um feixe eletrônico sobre a superfície de

uma amostra e a gravação da corrente emitida em função da posição.

O SEM possui três partes principais: uma coluna eletro-óptica que gera e colima o

feixe eletrônico (em vácuo), um sistema de ultra alto vácuo incluindo a câmara onde fica a

amostra e a parte de detecção do sinal, e o sistema de geração de imagem.

No caso particular de um SEM, o princípio de operação baseia-se fundamentalmente

na quantificação dos elétrons secundários e retro-espalhados emitidos por uma amostra

como resposta a uma excitação eletrônica incidente. Esta medida de elétrons secundários

(ES) e retro-espalhados permitem uma definição qualitativa da morfologia e topografia da

amostra.

O feixe de elétrons se origina em um catodo, geralmente um filamento de LaB6 com

uma ponta muito pequena (raio < 1µm) [33], onde é aplicado um campo elétrico da ordem

de kV, suficiente para fazer os elétrons tunelarem a barreira de potencial do filamento para

o vácuo. Os elétrons emitidos são acelerados a partir do cátodo através de uma grade até

um anodo aterrado. Este sistema de eletrodos é chamado de Canhão de Elétrons por

Emissão de Campo (FEG).

Posteriormente, um sistema de lentes magnéticas reduz o diâmetro do feixe de

elétrons a aproximadamente 10nm. A redução é realizada usando duas ou mais lentes

magnéticas em série, cada uma capaz de reduzir o diâmetro do feixe de elétrons por um

fator de 20 a 100 vezes [34]. Uma corrente ajustável, é aplicada a uma bobina de deflexão

para mover o feixe de elétrons através da amostra.

Quando os elétrons primários alcançam a amostra, sua interação com os átomos do

material dá origem a elétrons secundários. O número de elétrons secundários emitidos varia

de acordo com a geometria e outras propriedades da amostra. Os elétrons secundários são

16

coletados por um detector, produzindo imagem. Os elétrons retro-espalhados e fótons

emitidos pela amostra pela ação do feixe de elétrons podem também ser usados para

produzir imagens.

O modo ES de operação é o mais importante porque os elétrons são coletados

facilmente através da grade coletora polarizada positivamente ao lado da amostra, mesmo

no caso de correntes muito pequenas.

B) Técnicas de Microscopia por Varredura com Ponta de Prova (SPM)

A microscopia por varredura consiste em realizar medidas seqüenciais sobre

diversos pontos de uma determinada área, com o objetivo final de formar uma imagem de

sua morfologia unindo todos os pontos adquiridos. Na microscopia por varredura com

ponta de prova, a análise da amostra é realizada com o auxílio da contração ou expansão

mecânica de cerâmicas piezo-elétricas que compensam as variações de topografia

detectadas pela ponta. Geralmente em forma de tubos, as cerâmicas piezo-elétricas podem

efetuar movimentos tridimensionais quando aplicamos potenciais elétricos através de

eletrodos conectados no tubo. Dependendo do tamanho deste, as áreas varridas podem

chegar até ~150µm de lado e a resolução pode ser sub-atômica. Este sistema de

movimentação chamado de scanner pode ser instalado tanto na ponta quanto na amostra.

Para a aquisição de propriedades físicas de superfícies ou sub-superfícies são utilizadas

pontas com características particulares para cada necessidade envolvida. A ponta ideal para

aquisição de topografias possui razão de aspecto (altura/largura) alta, enquanto que para

medidas de condutância é interessante que a ponta possua a maior condutividade possível.

Entretanto, essas condições não são encontradas na natureza e pontas com razão de aspecto

não ideal podem gerar imagens que não correspondem ao perfil real da amostra. Com a

convolução resultante, as estruturas medidas pela ponta não ideal podem ter seu tamanho

aumentado (no caso de ilhas) ou diminuído (no caso de depressões).

17

3.1) Microscopia por Força Atômica (AFM)

A microscopia por força atômica consiste em analisar a superfície de uma amostra

com uma ponta de prova. A ponta é montada sobre uma alavanca com constante de mola

conhecida. Quando a ponta está próxima da superfície da amostra, forças de interação

defletem a alavanca. Esta deflexão é medida por um sistema de detecção de posição; o sinal

de erro gerado é enviado para o circuito de realimentação do microscópio. A distância

ponta-amostra é então ajustada pela mudança na posição de um scanner piezoelétrico, de

modo a manter constante a força medida pela alavanca. Estas variações de posição são

calibradas com padrões de altura; deste modo, o mapa destas variações nos fornece a

topografia da superfície. A gama de amostras que podem ser analisadas com AFM é muito

ampla, na qual podemos destacar: amostras isolantes, células biológicas, medidas in situ no

modo eletroquímico, etc.

Força repulsiva

Força atrativa

Potencialda força

interatômica

Distância(ponta-amostra)

Modonão-contato

Modocontato

Modocontato

intermitente

0

Figura 3.1: Comportamento qualitativo da dependência do potencial da força interatômica com a distância entre a ponta de prova e a superfície da amostra. Dependendo do regime de forças escolhido existem três modos de operação: contato, não-contato e contato-intermitente.

A deflexão da alavanca pode ser causada por muitas forças de interação entre a

ponta e a superfície da amostra, sendo um problema bastante complicado do ponto de vista

teórico. Os modelos mais simples utilizados consideram a força devido ao potencial de

Lennard-Jones [29, 35], conforme foi citado na seção 2.1. Na Figura 3.1 temos a

18

dependência qualitativa do potencial da força interatômica com a distância entre a ponta e a

amostra. Dependendo do regime de forças escolhido, existem três modos de operação para

a microscopia por força atômica. No modo contato a força entre ponta-amostra é repulsiva,

no modo não-contato o regime é de forças atrativas e no modo contato-intermitente ocorre

uma inversão no tempo entre forças atrativas e repulsivas. A seguir apresentaremos

somente os detalhes dos dois primeiros modos, operando em ar.

3.2) Modo Contato (CM-AFM)

Neste modo de operação, a ponta do AFM exerce um contato físico com a superfície

da amostra. A intensidade da força envolvida é suficientemente baixa para que não ocorram

deformações permanentes numa amostra não-macia ou na ponta, impedindo a

reprodutibilidade e prejudicando a qualidade dos resultados. Em ambientes expostos ao ar

existe, freqüentemente, uma fina camada adsorvida (água, por exemplo) [35] sobre a

superfície da amostra, que adiciona a força de capilaridade ao problema. A intensidade da

força de capilaridade depende da distância entre a ponta e a amostra, mas em geral é da

ordem de 10nN. Em ar e com forças repulsivas da ordem de 10nN, a ponta do AFM não

penetra na fina camada de água sobre a superfície, mas no intervalo típico de operação do

modo contato de 0,1 até 1µN a ponta exerce o contato físico com a superfície da amostra,

depois de “perfurar” esta camada de água.

Feedback

Imagem

Diodo Laser

PSPD

Scanner PZT

Alavanca

Ponta

Amostra

Espelho

XYZ

Figura 3.2: Esquema geral da montagem e funcionamento da microscopia por força atômica em modo contato. O feixe de laser incide sobre a alavanca, sua reflexão é detectada por um fotodetector sensível à posição (PSPD), onde é obtida a deflexão da alavanca devido às forças de interação entre ponta-amostra.

19

A detecção da deflexão da alavanca pode ser feita por vários métodos [29], sendo

que os mais utilizados são os sistemas de deflexão ótica. No nosso microscópio de força

atômica (modelo Auto Probe CP da Park Scientific Instruments, atualmente Thermo

Microscopes – Veeco), a medida da deflexão da alavanca é realizada conforme mostra a

Figura 3.2. Um feixe laser incide sobre a alavanca, na parte oposta onde está montada a

ponta, e atinge um fotodetector sensível à posição (PSPD). Quando a alavanca sofre uma

deflexão ocorre a mudança da posição do feixe laser, refletido pela alavanca, no

fotodetector. Variações menores que 1Å podem ser obtidas dependendo do fator de

amplificação do sistema ótico, que é proporcional à razão do caminho ótico entre a

alavanca e o detector e o comprimento da alavanca. O sistema de movimentação

tridimensional, scanner na Figura 3.2, permite que a amostra realize varreduras nas

direções x e y. Durante estas varreduras, a topografia da amostra é medida adquirindo as

variações z (direção vertical) do scanner, produzidas pelo sistema de realimentação para

manter a força constante, conforme mostra a figura 3.2. Imagens topográficas de alta

resolução são adquiridas mantendo fixa a posição vertical (modo altura constante) do

scanner e medindo somente as deflexões da alavanca, para o caso de superfícies

atomicamente planas.

3.3) Modo Não-Contato (NC-AFM)

O regime de forças repulsivas do modo não-contato, que geralmente é em torno de

0,01nN [29], pode ser visto na Figura 3.1. Em modo não-contato, um oscilador bimorfo faz

a alavanca vibrar numa freqüência (fo+) um pouco maior que uma de suas freqüências de

ressonância, fo (tipicamente de 50 até 400kHz – em todos os casos, muito maior que a

freqüência de realimentação da topografia, < 5kHz), com uma amplitude de dezenas de

nanômetros. A amplitude do sinal medido pelo fotodetector, na freqüência selecionada, é

enviada ao sistema de realimentação do microscópio, conforme vemos na Figura 3.3. Na

presença do gradiente de força na região próxima à superfície da amostra, a nova

freqüência de ressonância f′o é menor que fo [29] e, portanto, ocorre diminuição na

amplitude de vibração da alavanca. O sistema de realimentação trabalha mantendo fixa uma

certa diminuição nessa amplitude e com isso a distância (média) entre ponta-amostra é

20

mantida constante. A camada adsorvida de água sobre as amostras analisadas em ar [35],

não é “perfurada” nesse modo de operação do AFM, pois a força envolvida é muito menor

que a necessária para tal. Caso a espessura desta camada não seja homogênea sobre toda a

área varrida, a imagem topográfica não irá corresponder à superfície real da amostra.

Contudo, por apresentar pequenas forças de interação (<< nN), que diminuem a pressão na

superfície analisada, este modo é bastante utilizado em amostras com superfície muito

macias, viabilizando sua utilização no ramo da biologia.

Feedback

Imagem

Diodo Laser

PSPD

Scanner PZT

Alavanca

Ponta

Amostra

Espelho

XYZ

Oscilador (Bimorph)f0+

Figura 3.3: Esquema geral da montagem e funcionamento da microscopia por força atômica em modo não contato. Variações na amplitude da oscilação da alavanca permitem que sejam adquiridas imagens topográficas com forças repulsivas da ordem de 0,01 nN [29].

3.4) Espectroscopia de Força Atômica

O microscópio de força atômica é uma poderosa ferramenta para medição de forças

intermoleculares pois tem resolução de força da ordem de piconewton e resolução espacial

da ordem de nanometros. A resolução de força do AFM é várias ordens de grandeza maior

que a mais fraca ligação química. Isto sugere que é possível medir interações moleculares

individuais. A funcionalização da ponta do AFM com, por exemplo, monocamadas

orgânicas (ligações covalentes) que tem terminações em grupos funcionais bem definidos,

permite a identificação de grupos moleculares. Esta aplicação do AFM é chamada na

21

literatura de Espectroscopia de Força Atômica (AFS – Atomic Force Spectroscopy) ou

também de Microscopia de Força Química (CFM – Chemical Force Microscopy) [31, 36].

Mesmo sendo possível medir interações químicas individuais, devido ao raio de

curvatura da ponta, um grupo químico específico da ponta interagindo com a superfície da

amostra não terá interações moleculares completamente definidas ocasionando a dispersão

dos resultados. Por isso é necessária uma grande quantidade de medidas para obter uma boa

estatística da força de interação.

Utilizando pontas quimicamente funcionalizadas, o microscópio de força atômica

pode ser utilizado para medir forças de diferentes grupos moleculares.

Diodo Laser

PSPD

Scanner PZT

Espelho

XYZ

CH3 CH3 CH3 CH3

CH3

CH3

Ponta

OC

OH OC

OH OC

OH OC

OH OC

OH

Amostra

Deslocamento da alavanca

Figura 3.4: Desenho esquemático do funcionamento de um AFS. A amostra é fixada em um scanner piezo -elétrico que se desloca em z. Um feixe laser reflete na alavanca e depois chega a um fotodetector no qual será detectado o movimento em z da alavanca. Quando a amostra se aproxima e encosta na ponta, haverá uma deflexão da alavanca que irá movimentar o laser e ser detectado pelo fotodetector. No destaque temos a interação entre uma ponta e uma amostra funcionalizados com tiol com terminação em CH3 e COOH respectivamente.

Em princípio o AFM pode medir tanto interações moleculares fracas, como a força

de van der Waals (~ > pN), quanto ligações covalentes fortes (~ 0,1µN) [31]. Na prática

temos que a resolução da força é limitada pelos ruídos eletrônicos do sistema ótico do

microscópio e pela excitação térmica da vibração da alavanca.

A magnitude das interações intermoleculares pode ser obtida diretamente por

medição de adesão (Figura 3.4). A interação adesiva entre diferentes grupos funcionais é

determinada pela curva de força versus distância da ponta da amostra. Durante a medição, a

deflexão da alavanca é monitorada durante o ciclo de aproximação e afastamento da

amostra em relação à ponta. Conhecendo a constante de mola da alavanca, é possível

calcular esta força. O salto no valor da força causado quando a alavanca é liberada da

22

amostra, corresponde à força de adesão entre os grupos funcionais da ponta e os da

superfície da amostra.

Repulsiva Atrativa

Figura 3.5: Curva da força pela distância da amostra. Em grandes distâncias, não são observadas forças entre a alavanca e a amostra. A uma pequena distância, a ponta é atraída abruptamente para a amostra devido à forças de van der Waals; subseqüentemente a alavanca acompanha o movimento linear da amostra. Existe uma pequena histerese na ida e na volta da alavanca quando ela está no regime linear. É necessária uma força finita para soltar a ponta da amostra; esta força corresponde à força de adesão dos grupos funcionais da ponta e da amostra. O gráfico mostra medidas realizadas neste trabalho de mestrado.

3.5) Interações entre estruturas moleculares:

• Modificação da ponta e amostra com grupos funcionais:

Para medirmos interações entre grupos funcionais, a ponta tem que ser funcionalizada

com grupos moleculares bem definidos. Um método bem caracterizado na literatura

envolve monocamadas auto-organizadas (SAMs - self-assembly of monolayers) de tióis

orgânicos em superfícies de Au. Esta superfície de Au pode ser obtida de diferentes

maneiras; um exemplo é o de pontas de AFM de Si metalizadas com Cr (ou Pt) e Au (vide

figura 3.6). Analogamente este processo de funcionalização pode ser feito com as amostras,

depositando uma camada de Cr (ou Pt) seguida de Au em um substrato semicondutor. A

função do Cr (ou Pt) é a de proporcionar boa adesão do filme de Au ao semicondutor.

23

Figura 3.6: Esquema de uma funcionalização química de ponta e amostra. A ponta e o substrato são inicialmente cobertos por uma camada de Cr ou Pt (~20nm) e, posteriormente, por uma camada de Au (~20nm). Feito isso, imergimos a ponta e o substrato em uma solução de tiol orgânico e uma monocamada densa de moléculas irá se formar em cima da superfície do Au. Em destaque temos a interação por ponte de hidrogênio dos radicais idênticos de COOH.

• Adesão entre diferentes grupos funcionais:

Forças adesivas entre pontas e substratos funcionalizados com SAMs terminados em

grupos CF3, CH3, OCH3, CH2Br, OH, COOH, COCH3, CONH2, e NH2 foram medidas em

atmosferas de gás inerte seco e analisadas pelo grupo de Lieber et al [31]. Alguns

resultados são mostrados na tabela 3.1. Nota-se que as forças adesivas entre ponta e

amostra funcionalizadas com grupos funcionais hidrofóbicos são muito pequenas ou

indetectáveis na resolução de nosso experimento. Em particular, as forças são pequenas

(~0,1 nN [31]) quando uma das terminações das superfícies funcionalizadas tem terminação

em grupos hidrofóbicos e outra em grupos polares. Em contraste, uma força adesiva mais

significativa é observada quando a ponta e a superfície funcionalizada terminam em grupos

de ligação de hidrogênio (tabela 3.1). As magnitudes relativas das forças adesivas

mostradas na Tabela 3.1 confirmam a relação para a força de ligação esperada que é

COOH/NH2 > COOH/COOH > NH2/NH2. Convém mencionar que uma atmosfera de gás

seco não evita completamente que as superfícies funcionalizadas apresentem um filme de

água adsorvida; estudos feitos em atmosfera de ultra alto vácuo podem esclarecer melhor

esta relação entre interações moleculares. Grupo Funcional (Ponta-Superfície)

Monolayer Comprimento da Cadeia

Meio Adesão (N/m)

Raio da Ponta (nm)

NH2-COOH Tiol SAM, C11 N2 Seco 4,3 ± 0,4 100-200 COOH-COOH Tiol SAM, C11 N2 Seco 1,4 ± 0,3 100-200

NH2-NH2 Tiol SAM, C11 N2 Seco 0,7 ± 0,2 100-200 CH3-CH3 Tiol SAM, C11 N2 Seco 0,4 ± 0,2 100-200

Tabela 3.1: Força de adesão entre grupos funcionais em meio gasoso [31].

24

3.6) Caracterização e calibração da sonda:

Para obtermos o valor absoluto da força é necessário o conhecimento da constante

de mola da alavanca e da geometria da ponta. Existem vários métodos experimentais de

calibração da constante de mola da alavanca, kz [22]. Em nosso caso em particular, o Cr e o

Au que cobrem a alavanca (necessários para a preparação das SAMs) mudam a sua

constante de mola sendo assim necessária a recalibração dos parâmetros de controle do

AFM para obter o valor correto da força.

• Determinação da constante de mola das alavancas

O chip que utilizamos neste trabalho apresenta alavanca em formato de V. Esta

alavanca pode ser aproximada por duas alavancas retangulares [22]; isto faz com que a

dinâmica que descreve o sistema massa-alavanca fique bastante simplificada.

A constante de mola de uma alavanca com seção transversal retangular é dada por:

3

3

4lwEtk = (3.1)

onde E é o módulo elástico do material, t é a espessura, w é a largura, e l o comprimento.

Será considerado w = 2w’, onde w’ é a base real da alavanca retangular, dentro da

aproximação considerada [4]. Podemos aproximar esta alavanca para um sistema massa-

mola com constante de mola k e massa efetiva m* = Me.mb ≅ 0,2427mb [25], onde mb =

(ρSitSi + ρAu tAu + ρPt tPt)wl é a massa da barra. Me é a massa de normalização efetiva, que

permitirá tratarmos o nosso sistema como um sistema massa-mola. Este fator depende

apenas das dimensões da base e do comprimento da alavanca, de forma que Me será o

mesmo para uma alavanca com e sem metalização pois está irá influenciar apenas na massa

adicionada, na espessura e no stress da alavanca, parâmetros dos quais Me não apresenta

dependência.

Podemos estimar a constante de mola utilizando a freqüência de ressonância de

nossas alavancas para um sistema massa-mola:

*2

12 m

kππ

ων == (3.2)

25

Cleveland et al. [22] desenvolveu um método que, através da adição de massas na

alavanca (utilizando microesferas de tungstênio), permite determinar não somente a

constante de mola como também a massa efetiva das alavancas. Isto é feito observando a

mudança da freqüência de ressonância das alavancas.

Com uma massa M adicionada na alavanca, a equação 3.2 é escrita como:

*2

12 mM

k+

==ππ

ων (3.3)

Caso tenhamos M = 0, ou seja, a freqüência de ressonância da alavanca sem carga, a

equação acima pode ser escrita em termos das propriedades fundamentais do material

através da equação 3.2:

( ) ( )PtPtAuAuSiSi

T

PtPtAuAuSiSi

T

tttEt

ltttEt

l ρρρπρρρπν

++≈

++≈

3

2

3

20 21

2427,041 (3.4)

onde tT = tSi + tAu + tPt..

A equação 3.3 pode ser reescrita como:

*)2( 2 mkM −=

πν (3.5)

A equação 3.5 mostra que, se várias massas conhecidas forem adicionadas no final

das alavancas e suas freqüências de ressonância forem medidas, podemos fazer uma curva

das massas adicionadas por (2πν)-2, obtendo uma reta [22]. O coeficiente angular deste

ajuste nos dará a constante de mola enquanto o coeficiente linear nos dará a massa efetiva.

Embora não tenhamos realizado medições deste tipo, utilizaremos as equações

desenvolvidas acima para a determinação das constantes de mola das alavancas, como

mostrado no capítulo 4.

26

Capítulo 4

Metodologia para implementação de AFS:

Neste capítulo, apresentamos a metodologia desenvolvida neste trabalho de

mestrado para a implementação da técnica de AFS. O sistema modelo escolhido como

teste foi o de pontas/amostras funcionalizadas com tióis. Para obter esta funcionalização,

etapas intermediárias de metalização de pontas e substratos semicondutores foram

realizadas. Apesar de processos de metalização em semicondutores serem atividade de

rotina no LPD/IFGW, notamos a necessidade de um estudo mais aprofundado no caso da

metalização das pontas. Por este motivo descrevemos aqui os vários tipos de

processamento de pontas e amostras empregados ao longo do trabalho.

4.1) Preparação de pontas e amostras:

4.1.1) Introdução

Para medidas de adesão, devemos usar alavancas com constantes de mola baixas,

de modo a não restringir o intervalo de forças a ser medido. Nossa primeira opção neste

sentido foi trabalhar com pontas de Si3N4, pois são as que apresentam menor constante de

mola, não só dentro das disponíveis no laboratório, como também em catálogos

comerciais. Como, porém, a metalização era uma etapa necessária do nosso trabalho, não

obtivemos êxito na utilização destas pontas. Isto se deve ao stress dos filmes de Cr e Pt

utilizados associados à baixa constante de mola da alavanca, < 0,1N/m - as alavancas se

envergaram muito inutilizando as pontas para a medição. Por isso escolhemos alavancas

de silício (chips UL06) para realizar as metalizações visto que estes possuem constantes

de mola maior e por isso sofrem menos a influência do stress.

Desenvolvemos inicialmente pontas metalizadas por evaporação térmica para

medidas em meio ambiente e atmosfera de N2. Utilizamos diversos tempos e

concentrações para a funcionalização. Embora algumas informações relevantes pudessem

27

ser extraídas destes lotes de pontas/amostras, as medidas de força de adesão não se

comportaram como o previsto devido à não uniformidade e reprodutibilidade dos filmes

de Au. Optamos então por usar a metalização por sputtering das pontas, que fornece

filmes mais uniformes e reprodutíveis. Além disso, o filme de Pt utilizado apresenta um

menor grau de stress que o de Cr no caso anterior. Com relação à funcionalização,

notamos que tempos menores que 15h e concentrações menores que 0,5mM não eram

eficientes para a formação de SAMs, ou para medidas de forças que evidenciassem

processos de adesão. Vimos também que uma aproximação mais cuidadosa da sonda era

necessária para garantir a sua integridade. Este estudo mais detalhado da metalização,

funcionalização e aproximação da sonda será apresentado no capítulo 5.

4.1.2) Processos de metalização

A seguir, iremos apresentar resultados de 4 lotes, A1 e A2, metalizados por

evaporação térmica e os lotes F1 e F2, metalizados por sputtering. Utilizamos chips de Si

UL06 da Thermomicroscopes.

• Lotes A1 e A2

Estes foram os dois primeiros lotes que foram medidos e serviram para os testes

nos processos de metalização, funcionalização e aproximação ponta-amostra. Foram

utilizadas as alavancas A e B dos chips UL06.

Utilizamos uma evaporadora térmica convencional, ligada à uma difusora e uma

bomba primária. Fizemos vácuo de 10-6 Torr e passamos uma corrente entre 2 e 3A para a

evaporação dos metais. Não foi feita uma prévia limpeza das pontas, apenas para as

amostras, as quais passaram por banhos de acetona, metanol e álcool respectivamente.

No primeiro lote (A1) depositamos por evaporação térmica uma camada de 20nm

de Cr e outra de 20nm de Au na face do chip onde se encontram as pontas (vide figura

4.1). Tivemos a preocupação de não fazer um filme muito espesso, pois isto iria aumentar

o diâmetro da ponta, o que diminuiria a sua resolução espacial. Esta técnica de

metalização já havia sido utilizada em nosso grupo, apresentando bons resultados para

28

medidas de condutância elétrica, apesar da grande granulação do filme de Au [37].

Devido ao stress do filme metálico as alavancas envergaram levemente para o lado em

que o filme foi depositado, o que dificultou as medidas com estas pontas. A presença do

filme de Cr não pode ser evitada, uma vez que o Au não apresenta boa adesão ao Si, e o

Cr melhora significativamente este aspecto.

Chip AlavancasAlavancas

Ponta C

Ponta D

Ponta A

Ponta B

Figura 4.1: Chip de Si do AFM, onde as alavancas tem diferentes dimensões, porém 0.6 µm de espessura (Ultralevers 06 Veeco). As constantes de mola nominais das alavancas – fornecidas pelo fabricante - são: A = 0,26N/m; B = 0,40N/m; C = 1,6N/m e D = 2,1N/m.

No segundo lote (A2) depositamos também uma camada de 20nm de Cr na face

do chip oposta à ponta. Esta segunda camada de Cr serviu para compensar o

envergamento causado pelo stress da camada depositada na face da ponta.

Nas amostras dos lotes A1 e A2, foram utilizados como amostra substratos de InP

metalizados com filmes de 20nm de Cr e 100nm de Au por evaporação térmica. Neste

caso utilizamos uma maior espessura de Au para garantir o recobrimento da superfície.

• Lotes F1 e F2

As pontas do lote F1 (onze chips) são chips UL06 (alavancas C e D) que foram

metalizadas com um filme de Pt de 20nm e um filme de Au de 40nm por sputtering, em

colaboração com Carlos Sales Lambert (IFGW-Unicamp). O vácuo inicial do sistema era

de 10-6Torr, e a pressão de Argônio de 2.10-2Torr. Num potencial de 2kV, depositamos Pt

durante 2min e Au durante 4 min. Novamente, para esta técnica realizamos limpeza com

solventes apenas para as amostras.

Analisando este lote no microscópio ótico, verificamos que a deposição de Au não

parecia ter ocorrido, por isso resolvemos metalizar novamente cinco pontas do lote F1

29

com um filme de Au de 20nm (2min). A estas cinco novas pontas chamamos de lote F2.

Pela técnica de sputtering, não observamos envergamento significativo da alavanca

devido ao stress do filme. Apenas para estes lotes de chips F1 e F2 foi feito um estudo

detalhado da integridade dos filmes e pontas após as medidas de AFS através do

microscópio eletrônica FEG, como será descrito no próximo capítulo.

Nas amostras dos lotes F1 e F2, foram utilizados substratos de Si que foram

metalizados com filmes de 20nm de Cr e 100nm de Au por evaporação térmica.

4.1.3) Funcionalização dos chips e amostras:

Utilizamos para a funcionalização, tanto do chip quanto da amostra o tiol

mercaptoundecanoic acid (SH(CH2)10COOH), que apresenta um radical com dez CH2 e

uma extremidade terminando em COOH. Este material nos foi fornecido pela Doutora

Daniela Zanchet (LNLS). Um modelo de recipiente que pudesse ser selado foi

desenvolvido especificamente para a funcionalização, de modo que se pudesse manter a

concentração da solução de tiol, uma vez que o etanol é muito volátil. Além disso, o

recipiente serviu para que ponta e amostra, após a funcionalização, fossem expostos

somente à atmosferas controladas, evitando assim contaminação com a atmosfera do

laboratório. A Fig. 4.2 mostra o esquema e a foto do recipiente, executado em teflon.

A

B

Figura 4.2: (A)-Desenho em corte do recipiente selado feito com programa AutoCad. (B)-Foto de um dos recipientes executados.

Para a funcionalização das pontas e amostras, variamos a concentração do tiol

diluído em etanol (pureza 99,9%), de 0,5 a 1,5 mM. Os tempos de funcionalização foram

variados de 5s até 5,5h para o lote A enquanto para o lote F o tempo mínimo foi de 15h.

30

O recipiente selado permitiu deixar as amostras e chips com as pontas metalizadas em

contato com a solução durante o tempo necessário sem que houvesse variação

significativa da concentração da solução de tiol devido à grande volatilidade do etanol.

4.2) Medidas de força:

Para as medidas de força de adesão, utilizamos o AutoProbe CP da

ThermoMicroscopes na configuração de hardware para topografias em modo não contato

(NCM), com um scanner piezo elétrico com amplitude de 5 µm em x e y, e 1,2 µm em z.

Uma caixa de acrílico que envolve a cabeça do AFM permitiu criar uma atmosfera

de N2 (AirLiquide, 99%) para o controle da umidade. Através de um higrômetro,

verificamos que a umidade relativa da atmosfera de N2 era menor do que 10%RH, o que

minimizou a presença de forças capilares. Convém mencionar aqui que, como observado

na literatura [4,51,52], as medidas de adesão são mais freqüentemente realizadas em meio

líquido. Com o AutoProbe porém, não conseguimos realizar imagens em meio líquido

(com a alavanca imersa no líquido), por causa da configuração da medida ótica da

deflexão da alavanca.

O controle dos parâmetros de movimento para a aproximação ponta-amostra no

AFM mostrou-se um aspecto importante para a realização das medidas de força com

maior confiabilidade, como é mostrado na seção 5.1.1. Nos testes realizados, foram

usados passos do motor de 0.4 e 0.1µm.

Na figura 4.3 temos uma curva típica de força (F) versus distância (H) entre ponta

e amostra onde a seta azul mede a força no momento em que a ponta se solta da

superfície da amostra e vai para o seu estado estacionário.

31

0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

F [n

N]

H [normalizado]

Força vs Distância - Chip A3 (COOH) com Amostra 7 (COOH)

∆F = 2.65 nN

Figura 4.3: Curva típica de força versus distância entre ponta e amostra. A distância está normalizada e varia de –1 a 1, representando neste caso um deslocamento total do scanner de – 0,6µm a 0,6µm. A seta azul indica o momento em que a ponta se solta da superfície da amostra e vai para o seu estado estacionário.

As medidas foram realizadas usando o software ProScan 1.5 do AutoProbe CP,

auxiliado pelo ClickAcquisition, escrito em Delphi pelo aluno de doutorado de nosso

grupo, Klaus O.Vicaro, para automatizar a tomada de dados.

Usando o programa Mathematica, escrevemos uma rotina que identifica

automaticamente a variação de força nos gráficos adquiridos, deixando os valores

disponíveis numa tabela que pode ser exportada para o programa Origin. Este, por sua

vez, foi usado para graficar os histogramas e as curvas de força pelo número da aquisição.

Medimos cerca de 12 regiões por amostra, dentro da área de 25µm2 em que o

scanner conseguia se deslocar, e cada região foi medida de 10 a 50 vezes.

Ao realizarmos uma imagem de AFM, existe o risco da ponta ser danificada

devido ao contato mecânico desta com a superfície da amostra. Por isso, não foram feitas

imagens da superfície com as pontas funcionalizadas, a fim de se preservar a ponta e o

seu filme metálico.

4.3) Histogramas:

Para o estudo da força de adesão, analisamos o histograma de força de todas as

medidas e ajustamos uma ou mais gaussianas para identificar os valores de força mais

prováveis, conforme mostrado no capítulo 5. Apesar das medidas de força de interação

serem consideradas no caso do afastamento entre ponta a amostra, analisamos os dois

32

casos, de aproximação e afastamento no sentido de comparar e validar os resultados

obtidos.

Em geral, na aproximação, as medidas exibem interações de van der Waals,

enquanto no afastamento também puderam ser observadas forças de adesão devidas aos

grupos de COOH e forças capilares devidas à umidade no ambiente. Para as forças

encontradas, foram aplicados os fatores de correção e normalização que serão descritos

com detalhe no capítulo 5.

4.4) Gráficos de evolução das medidas de força:

Para verificarmos a origem da dispersão dos resultados, mostramos a evolução das

medidas através de gráficos da força em função do número de aquisição. Assim

conseguimos analisar o histórico de medidas da ponta em diferentes regiões da amostra.

Nestes gráficos, tanto para a aproximação quanto no afastamento da ponta, foram

observados diversos “platôs” de valores de força representando as diferentes regiões

medidas, como mostrado nos círculos pretos da figura 4.4. Cada platô é formado por

pontos de uma região específica da amostra, que mudam na medida que mudamos esta

região. Estes platôs podem estar presentes tanto no afastamento quanto na aproximação

da ponta, e não necessariamente possuem a mesma força, como sugere a linha tracejada

da figura 4.4. Com isso podemos visualizar de melhor forma a não uniformidade das

medidas de força na superfície da amostra – como ilustrada na figura 4.4. Os trechos no

gráfico em que não há pontos, figura 4.4 círculos verdes, são devido à existência de um

nível de ruído que não permitiu a aquisição dos dados nestes pontos.

33

A

B

0 50 100 150 200 2500

2

4

6

8

10

12

Seqüência ordenada das medidas

F [n

N]

0 50 100 150 200 2500

2

4

6

8

10

12

Afastamento

F [n

N]

Aproximação

Figura 4.4: Gráficos que indicam as medidas de força em função do seu número de aquisição. As regiões circuladas em preto são os platôs de força que representam diferentes regiões medidas na amostra. A linha tracejada limita uma região de medida onde se observa um platô na aproximação e outro no afastamento da ponta. As regiões circuladas em verde são as aquisições em que não foi possível obter valores de força. (A) Ponta se aproximando da amostra. (B) Ponta se afastando da amostra.

4.5) Análise de imagens de pontas no FEG -SEM

Utilizamos imagens no FEG-SEM do LME/LNLS para avaliar a integridade das

pontas, além de estimar seu diâmetro para posteriormente fazer a normalização das

medidas. Este estudo foi feito apenas para as pontas do lote F.

A figura 4.5 mostra imagens feitas no FEG-SEM de pontas dos dois lotes, F1 e

F2. O raio de curvatura das pontas foi estimado a partir da barra de escala que se encontra

abaixo da imagem; uma circunferência foi traçada na extremidade da ponta para a

estimativa (círculo branco na figura 4.5).

Durante as imagens, houve contaminação pelo carbono existente na câmera de

vácuo do microscópio que aumentou ligeiramente o diâmetro das pontas (~2nm). Isto

colabora com a incerteza na estimativa do raio. Devido a esta contaminação, estas pontas

não foram utilizadas para as medidas.

34

(A) (lote F1)

(B) (lote F2)

Figura 4.5: Imagens por microscopia eletrônica FEG de pontas de AFM metalizadas. (A) - Ponta metalizada com 20nm de Pt e 40nm de Au (lote F1), a saliência indicada é devido à contaminação de carbono da atmosfera do microscópio. O círculo branco é usado para a estimativa do raio da ponta. Raio da ponta: RF1 ≅ 25nm. (B) - Ponta metalizada com 20nm de Pt e 60nm de Au (lote F2). Raio da ponta: RF2 ≅ 50nm. É possível enxergar a granulação do filme de Au nas duas imagens.

35

4.6) Determinação das constantes de mola das alavancas:

Podemos estimar a constante de mola da alavanca utilizando a equação 3.4. Para o

cálculo de k, é necessário conhecer o módulo elástico dos materiais e as dimensões l, w, t

das alavancas triangulares aproximadas para duas alavancas retangulares, figura 4.6.

Figura 4.6 - Aproximação de uma alavanca triangular para duas retangulares.

Tabela 4.1: Parâmetros necessários para o cálculo da constante de mola. A largura já considera a aproximação da alavanca triangular para duas retangulares. * [38]

Parâmetro Alavanca Valores Espessura do Si C e D tSi = 1 µm Espessura da Pt C e D tPt = 0,02 µm Espessura do Au (lote F1) C e D tAu = 0,04 µm Espessura do Au (lote F2) C e D tAu = 0,06 µm Largura C w = 36 µm Largura D w = 56 µm Comprimento C l = 85 µm Comprimento D l = 85 µm *Módulo Elástico do Si -- ESi = 100 GPa *Módulo Elástico da Pt -- EPt = 230 GPa *Módulo Elástico do Au -- EAu = 220 GPa

Os valores nominais de constante de mola das alavancas C e D (fornecidos pelo

fabricante) são respectivamente kC = 1,6 N/m e kD = 2,1 N/m. Para a aproximação da

alavanca triangular como duas retangulares [22], temos que a constante de mola fica

(equação 3.4):

36

( )36

6369

3

3

10.85.410.36.)10.(10.100

4 −

−−

==C

CSiSiC l

wtEk

mNkC /5,1=

( )36

6369

3

3

10.85.410.56.)10.(10.100

4 −

−−

==D

DSiSiD l

wtEk

mNkD /3,2=

Estas constantes de mola estão relativamente próximas às fornecidas pelo

fabricante. Desta forma, o cálculo das constantes de mola da alavanca com Au e Pt nos

dará uma noção de quanto será o acréscimo da constante de mola total. A tabela 4.2

mostra os valores calculados de kAu e kPt.

Constante de mola Ponta Lote

kPt = 1,3.10-5 N/m C F1

kPt = 4,2.10-5 N/m D F1

kAu = 2,1.10-4 N/m C F1

kAu = 3,5.10-4 N/m D F1

kAu = 7,0.10-4 N/m C F2

kAu = 1,1.10-3 N/m D F2

Tabela 4.2: Valores calculados das constantes de mola para os filmes metálicos da superfície da alavanca.

Pela tabela 4.2, a maior constante de mola dos filmes metálicos é kAu = 1,1.10-3

N/m, 0,05% da constante de mola dada pelo fabricante. Nosso sistema se comporta como

uma associação de molas em paralelo, e para este, devemos somar os valores de k para

obtermos a constante de mola total do sistema. Se apenas este fator influenciasse na

constante de mola total, poderíamos desprezar a variação introduzida pelos metais

depositados e adotar apenas a da alavanca de Si. Porém, devemos levar em conta o stress

que os filmes causam na alavanca, fator que influencia sua constante de mola. No lote de

chips A (UL06), em que metalizamos as pontas por evaporação térmica, o stress do filme

depositado chegava a causar uma curvatura significativa da alavanca, a ponto de termos

37

que metalizar a sua outra face para compensar este efeito. O mesmo aconteceu em menor

grau nas alavancas do lote F. Assim, a melhor forma de estimarmos a constante de mola

da alavanca é utilizando a equação 3.5, pois ela depende da freqüência de ressonância da

alavanca que pode ser medida pelo AFM. Isolando o k da equação 3.5 temos:

( )22.. πνbmMek = (4.1)

Agora vamos calcular os valores de Me para as nossas alavancas. Com a equação

4.1, podemos determinar Me caso conheçamos os valores de k, ν e mb. Como já foi dito

na seção 3.7, Me depende apenas da base e do comprimento da alavanca, fazendo com

que o Me da alavanca metalizada seja igual ao para a alavanca não metalizada. Para as

alavancas triangulares sem metalização (UL06), temos os seguintes valores nominais:

Constante de mola Freqüência de ressonância Massa de Si C D C D C D

1,6 N/m 2,1 N/m 140 kHz 160 kHz 5,6.10-12 kg 7,5.10-12 kg Tabela 4.3: Parâmetros necessários para o cálculo de Me fornecidos pelo fabricante.

Com a equação 4.1 e considerando a massa do Si, calculamos então:

28,037,0

==

alavancaD

alavancaC

MeMe

(4.2)

Estes valores de Me são mais convenientes do que o valor adotado para uma barra

retangular, Me = 0,2427.

Freqüência de ressonância Lote F1 Lote F2

C D C D 170 kHz 193 kHz 160 kHz 183 kHz

*Massa de Au *Massa de Pt Lote F1 Lote F2 Lote F1 Lote F2

C D C D C D C D 1,86.10-12 kg 2,48.10-12 kg 2,79.10-12 kg 3,72.10-12 kg 1,03.10-12 kg 1,38.10-12 kg 1,03.10-12 kg 1,38.10-12 kg

Tabelas 4.4: Parâmetros para o cálculo das constantes de mola. *Valores das densidades para o cálculo: [11]

38

Ainda com a equação 4.6, calculamos as constantes kC e kD para o caso de

alavancas metalizadas. Na tabela 4.4 temos os parâmetros para os cálculos – massa do

filme e freqüência de ressonância medida – e na tabela 4.5 temos os valores de k

calculados utilizando valores Me da equação 4.2:

Lote Alavanca Constante de mola [N/m] C 3,6 F1 D 4,7 C 3,5 F2 D 4,7

Tabela 4.5: Constante de mola das alavancas.

Notamos da tabela 4.5 que os valores da constante de mola são bem superiores

(fator 2 pelo menos) aos das alavancas não metalizadas. Contudo, podemos observar que

não existe uma diferença muito grande do valor das constantes de mola para os dois lotes

de metalização. A diferença de 10k Hz nas freqüências de ressonância (tabela 4.4) é

compensada em parte com o acréscimo de massa total do sistema de aproximadamente

10%.

4.7) Pontas de AFM com nanotubos de carbono (CNTs):

As pontas convencionais apresentam um grande raio de curvatura, o que torna

difícil controlar o número de moléculas ativas na ponta funcionalizada e limita

significativamente a resolução lateral. Isto acarreta incertezas na interpretação dos

resultados, e aumenta o número de interações não-específicas. Nos últimos anos, estas

limitações têm sido contornadas com o uso de pontas de nanotubos de carbono (CNT)

[39]. Estas pontas apresentam raio de curvatura em geral menor que as de silício, e

podem ser especificamente modificadas apenas em suas extremidades. Deste modo, a

funcionalização das pontas de CNT cria pontas que tem poucos sítios moleculares ativos,

e com uma orientação relativamente controlada.

Em nosso grupo, foram obtidas imagens topográficas com pontas de CNT’s,

inicialmente com as montadas no próprio laboratório e posteriormente com as montadas

39

no LME/LNLS, fornecidas pelo Dr. Daniel Ugarte. Nos trabalhos já realizados [49],

pudemos notar que as pontas produzidas no LME, apesar de apresentarem bom

aproveitamento na fabricação (comparadas às obtidas sem a visualização simultânea com

o FEG-SEM), eram bem mais frágeis e menos duráveis que as montadas em nosso

laboratório – com algumas poucas imagens o CNT se soltava da ponta, e a imagem

apresentava degradação significativa, pois em geral foram aproveitadas pontas

previamente usadas para a montagem de CNT. Assim, neste trabalho buscamos

proporcionar a fabricação de pontas de CNT com maior durabilidade, para um posterior

manuseio relativo à funcionalização.

Assim, em colaboração com o grupo do Prof. Daniel Ugarte, utilizamos o

nanomanipulador [40] instalado no microscópio eletrônico FEG-SEM (modelo JEOL

JSM 6330F) no LME/LNLS para manipular CNTs multiwalled e colá-los em pontas de

AFM. A pequenas distâncias, forças tipo van der Waals [14] atraem o nanotubo para a

ponta do AFM (figura 4.7A). Concentrando o feixe de elétrons na junção nanotubo-ponta,

o carbono residual presente na atmosfera da câmara do microscópio é acumulado, como

carbono amorfo, formando uma “solda” que une nanotubo à ponta (figura 4.7B). O

nanotubo é então quebrado através de manipulação mecânica para formar a nova ponta de

AFM. Algumas vezes, o comprimento do CNT fica muito grande (isto gera instabilidade

no momento das medidas), sendo necessário quebrá-lo uma segunda vez para diminuir o

seu comprimento, ou então criar uma cápsula de carbono, a fim de melhorar a sua

estabilidade (figura 5.7). Esta cápsula é feita pelo mesmo processo que as soldas da base,

porém concentramos o feixe ao longo do nanotubo, até que o seu comprimento fique

adequado para medidas (~200nm). Em geral, vários pontos de solda são necessários para

que o nanotubo não solte durante a medida no AFM.

Para a formação mais eficiente da solda ou cápsula de carbono, o vácuo da câmera

do microscópio foi “piorado” pois deixamos de alimentar a armadilha de nitrogênio

líquido da bomba difusora do sistema de vácuo. Desta forma a contaminação por carbono

na atmosfera é aumentada, tornando o processo de deposição de carbono amorfo mais

rápido.

40

A

B Figura 4.7: (A)- Nanotubo sendo atraído à ponta de Si por força de van der Waals. (B)- Primeira solda feita com a contaminação de carbono da atmosfera, fazendo a união nanotubo-ponta.

Trabalhamos com três chips, totalizando cinco pontas com nanotubos soldados. É

importante notar que não necessariamente as pontas precisam estar íntegras para a

colagem de nanotubos, já que ela será “remodelada” com o nanotubo. A fim de aumentar

a estabilidade mecânica do CNT, testamos a utilização de uma cápsula de carbono ao

longo do nanotubo (prolongando a deposição de carbono amorfo ao longo do nanotubo),

para evitar que este flexione durante as medidas na amostra.

O teste da resolução e durabilidade da ponta foi feito com uma amostra

semicondutora de pontos quânticos ordenados espacialmente, de

InAs/GaAs/InP/InGaP/GaAs, crescida em nosso grupo.

41

Capítulo 5 Resultados e Análises:

Em nosso primeiro lote de pontas, fizemos as medidas de forças em meio

ambiente com pontas e amostras funcionalizadas com tiol. Observamos que ora tínhamos

forças pequenas, da ordem das forças de van der Waals, ora tínhamos forças muito

grandes, que associamos ao fenômeno de capilaridade. Para evitarmos as supostas forças

capilares, no lote de pontas seguintes resolvemos realizar medidas somente em atmosfera

de N2 para diminuir a umidade relativa do meio. Porém continuamos detectando apenas

forças menores do que a escala prevista para forças de adesão, indicando que não estava

ocorrendo funcionalização das superfícies. Este problema nos incentivou à um estudo

mais detalhado de nossas pontas com imagens de FEG-SEM. Desta forma, pudemos

analisar melhor o processo de metalização da ponta, e sua aproximação em relação à

amostra. A dimensão do raio da ponta e os danos ocasionados após as medidas também

foram verificados. Estes estudos aumentaram o grau de confiabilidade de nossas medidas

e serão apresentados na seção 5.1 deste capítulo. Mostraremos também neste capítulo

processos de normalização e correção das medidas de força, além do estudo da superfície

da amostra e das forças detectadas durante as medidas.

5.1) Análise das Pontas

5.1.1) Imagens de microscopia eletrônica (FEG-SEM) e estudo da metalização dos

chips de AFM:

Ao analisarmos as imagens de microscopia eletrônica (FEG-SEM) do primeiro

lote de chips medidos, lote A, notamos vários problemas: algumas pontas ou estavam

com suas extremidades quebradas ou estavam com a metalização de Au-Cr (feita por

deposição térmica) danificadas; havia pontas também em que a metalização não era

visível (vide fig. 5.1). Este é um resultado importante, uma vez que o enxofre do grupo

tiol se liga (complexação) preferencialmente com o filme de Au (forças da ordem de µN)

42

e se este for danificado (ou não depositado), a força de interação medida será a força de

van der Waals entre a ponta de Si e a superfície de Au da amostra.

Figura 5.1: Ponta que foi submetida à metalização por evaporação térmica, porém não apresenta sinais de rugosidade em sua superfície, característicos do filme metálico. A parte clara na extremidade da ponta representa o efeito devido à concentração de cargas do feixe de elétrons.

• Danos nas pontas:

Para investigar a razão da aparente quebra da ponta, tentamos ajustar os

parâmetros para que a aproximação ponta-amostra no AFM fosse a mais suave possível.

Foram testados então dois tipos de controle da aproximação ponta-amostra: Normal em

Modo Contato (Normal CM); e o Fino em Modo Não Contato (Fine NCM). O modo de

aproximação normal é feito com um passo do motor de 0.4µm enquanto no modo de

aproximação fina, o passo do motor é de 0.1µm. Existe ainda um desvio permitido do

piezo em relação ao valor desejado de força, ou seja, o software de controle permite

variar a deflexão máxima da alavanca durante a aproximação, em relação ao valor de

referência que será mantido numa imagem, por exemplo. Este desvio foi padronizado em

1nm para os dois modos de aproximação. Para cada modo foram testadas duas pontas.

43

A

B

C D

Figura 5.2: (A),(C)-Imagens das pontas antes da medição. (B) – Ponta danificada após o uso do modo Normal M. (D)-Ponta não danificada com o modo Fine NCM. O pequeno aumento em sua área lateral se deve à contaminação de carbono causada pelo microscópio eletrônico.

ontas são danificadas no

primeir

imagens se deve à contaminação por carbono causada pelo

FEG-S

ntas não foram usadas para medidas de força, somente para o teste de

aproxim

C

O modo Normal CM é a técnica convencional (padrão do software do AFM) que

utilizávamos para aproximar a ponta. Constatamos que as p

o contato que ela tem com a amostra (figura 5.2, A-B).

No modo Fine NCM, as pontas não foram danificadas. O pequeno aumento da

espessura das pontas nas

EM (fig.5.2, C-D).

Estas po

ação.

44

• etalização dos chips:

a, indicando que o filme metálico – caso

existiss

as imagens da figura 5.3 podem ser

observ

s, foi estimado um

tempo

ring) na superfície das pontas. Isto é

um indicativo que existe Au na superfície da ponta.

M

Quando uma ponta metalizada com Au é analisada no FEG-SEM, nota-se uma

rugosidade com grãos de aproximadamente 100nm de diâmetro no caso da deposição

térmica. Porém, notamos que, num lote de pontas metalizadas por esta técnica, não se

observa esta rugosidade na superfície da pont

e – não era homogêneo e reprodutível.

Por estes motivos, utilizamos a técnica de sputtering para a deposição do filme

nos chips. Devido à impossibilidade de utilização do Cr no equipamento em questão,

utilizamos Pt como metal intermediário entre o Si e o Au. Como foi observado nas

freqüências de ressonância da tabela 4.4, o stress causado por ambos os filmes são

semelhantes, porém a Pt, sendo depositada por sputtering, causou menor envergamento

da alavanca pois a técnica permite com que o filme seja depositado em ambas as faces da

alavanca, compensando desta forma o stress do filme que diminui a deformação da

alavanca. Foram metalizadas por esta técnica três pontas que já haviam sido utilizadas

para imagens de topografia no AFM, por isso n

adas danos e estruturas relativas a este uso.

Depositamos 20nm de Pt e 40nm de Au numa câmara com pressão de Argônio de

2.10-2 Torr, a um potencial de 2kV. A partir de calibrações anteriore

de 2 min para o depósito da Pt e 4 min para o depósito de Au.

Nas imagens do FEG-SEM (figura 5.3), pudemos verificar que existe uma

rugosidade (grãos ≅ 20nm para deposição por sputte

45

A

B C Figura 5.3: Imagens feitas no FEG-SEM de pontas (usadas) metalizadas com Pt/Au. Aumento de 55k vezes. (A)- rugosidade na superfície da ponta. (B) e (C): Ponta antes e depois da metalização. Houve um aumento de volume e rugosidade. 5.1.2) Pontas quebradas ou com a metalização danificada:

Das 16 pontas que foram usadas para as medidas do lote F, apenas 7 serão

apresentadas nesta análise. Para podermos analisar as forças atuantes na ponta é

necessário que tenhamos o filme de Au íntegro na ponta para que haja a ligação tiol-Au.

Uma vez que este filme é danificado, mesmo durante as medidas, ficamos

impossibilitados de fazer uma análise mais conclusiva.

46

A B

C D

Figura 5.4: Imagens de pontas com o filme de Au danificado por quebra da ponta e/ou má aderência dos filmes.(Imagens A e B): Pontas descascadas devido à má adesão do filme na superfície. (Imagens C e D): Filmes descascados devido à quebra da ponta.

A figura 5.4 mostra imagens de pontas danificadas. Um fator de dano é que nem

todos os filmes apresentaram uma aderência eficiente na superfície, como mostram as

imagens 5.4 A e B. Nas imagens C e D temos exemplos de pontas que se quebraram e

conseqüentemente tiveram o seu filme danificado.

5.1.3) Pontas padrão:

A figura 5.5 mostra imagens feitas no FEG-SEM de pontas dos dois lotes, F1 e

F2, que não foram usadas para as medidas. O raio de curvatura das pontas foi estimado a

partir da barra de escala de 100nm que se encontra abaixo da imagem, conforme descrito

na seção 4.5. Estas imagens serão usadas como padrão para o restante das pontas nas

medidas de força de adesão.

47

(A) (lote F1)

(B) (lote F1)

(C) (lote F2)

(D) (lote F2)

Figura 5.5: Imagens por microscopia eletrônica FEG de pontas de AFM metalizadas. (A) e (B)- Pontas metalizadas com 20nm de Pt e 40nm de Au (lote F1), a saliência indicada em (A) é devido à contaminação de carbono da atmosfera do microscópio. Raios das pontas: RF1A ≅ 25nm e RF1B ≅ 25nm . (C) e (D)- Pontas metalizadas com 20nm de Pt e 60nm de Au (lote F2). Raios das pontas: RF2C ≅ 50nm e RF2D ≅ 50nm . É possível enxergar a granulação do filme de Au em todas as pontas 5.1.4) – Pontas com nanotubo de carbono:

Das 5 pontas fabricadas com CNT (seção 4.7), 4 apresentaram maior durabilidade

e resistência nas medidas em relação às pontas comerciais de Si, proporcionando um

mínimo de 50 imagens numa área de 1µm x 1µm com boa resolução, enquanto para as

pontas comerciais de Si (UL-06) utilizadas no mesmo experimento este número foi de ~

20. De modo geral as pontas com CNTs garantiram resoluções em x-y melhores do que

as pontas comerciais novas (raio de curvatura típico de 20nm), conforme pode ser

observado na figura 5.6, em que temos uma imagem feita com uma ponta comercial nova

e outra imagem feita com a ponta N1-B (figura 5.7-B). A ponta N1-B passou por um

48

processo de encapsulamento (seção 4.7) que melhorou a estabilidade do CNT,

possibilitando um número maior de imagens com melhor resolução, a grande maioria

com área de 1µm x 1µm.

Com o software de processamento de imagem IP2.0 do AutoProbe CP,

observamos o espectro de potências bi-dimensional mostrado nas imagens 5.6 A e B, que

permite uma análise quantitativa da resolução das imagens. O espectro de potências

depende do módulo da transformada de Fourier (FT), que por sua vez identifica as

freqüências espaciais presentes na imagem. Quanto maior a freqüência observada, menor

o comprimento de onda espacial associado, por isso melhor a resolução da ponta. A FT

da ponta com CNT (figura 5.6 B) abrange freqüências mais altas do que a ponta padrão

(figura 5.6 A), indicando que a ponta de CNT apresenta melhor resolução espacial em

relação à uma ponta comercial UL06 típica.

Podemos quantificar a resolução lateral da ponta através de um critério de

freqüência espacial máxima (MSF – maximum spatial frequency) [45], para a qual o

espectro de potências decai a 10% de sua intensidade máxima (100%). Com este critério,

nós selecionamos as freqüências correspondentes às estruturas da superfície, evitando o

ruído de fundo. O menor tamanho lateral (SLS – smallest lateral size) que pode ser

resolvido por uma ponta, é dada pela relação SLS = (2 MSF)-1 [49]. O gráfico da figura

5.6-C mostra o espectro de potência das imagens da figura 5.6-A e B. O valor de SLS

para a ponta de Si é 24% maior que o da ponta de CNT, indicando que a última é capaz

de resolver estruturas menores do que a primeira.

Na figura 5.7 C temos a imagem de microscopia eletrônica de outra ponta com

CNT (N3-B), que também passou pelo processo de encapsulamento. Adquirimos mais de

400 imagens de boa resolução com esta ponta (vide figura 5.8), que ainda continua em

boas condições de uso. O SLS das imagens é 16nm tanto para a figura 5.8-A, quanto para

a 5.8-B, indicando que a resolução da ponta se manteve. Atribuímos a grande

durabilidade da ponta às “soldas” de carbono reforçadas que fizemos em sua base,

procedimento que não foi realizado no caso da ponta N1-B.

49

A ponta padrão

B ponta CNT

C Espectro de

Potência

-20 0 20 40 60 80 100 120-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Freqüência Espacial [1/µm]

Esp

ectro

de

Pot

ênci

a CNTSi

Ponta MSF [µm] SLS [nm] 38 13 30 17

Figura 5.6: Topografias de área 1 x 1 µm de uma amostra padrão de InAs/GaAs feita com ponta nova de Si (A) e ponta com nanotubo N1-B (B). Ao lado das imagens encontra-se a Transformada de Fourier (FT) das mesmas. Nota-se que o perfil (B) está melhor resolvido que o perfil (A) e que o FT da ponta com CNT abrange freqüências mais altas que a ponta de Si. Além de melhorar a resolução lateral, outra vantagem da ponta com nanotubo é a durabilidade com que ela se mantém fazendo imagens de boa resolução em relação às pontas de Si, nos casos reportados aqui. (C) Espectro de Potência com o ajuste de uma curva de função de pico (LogNormal) das imagens A e B. A linha tracejada indica quando a intensidade do espectro atinge 10% do seu total.

50

(A)

(B) (C)

(E) (F)

Figura 5.7: (A) Nanotubo apenas soldado na base da ponta, ponta N1-B. (B) Cápsula de carbono feita em torno do nanotubo N1-B. (C) Ponta N3-B com CNT encapsulado; note a existência de um CNT sobressaindo do feixe, que foi soldado com reforço na base, em relação às demais pontas montadas. Com esta ponta foram feitas mais de 400 imagens de alta resolução sem perda da qualidade. (E) e (F) testes de estabilidade e resistência do CNT encapsulado. Nota-se que o CNT flexiona no final do encapsulamento de carbono.

Na figura 5.7-E e F temos imagens de FEG-SEM de um experimento realizado

pela doutoranda Denise Nakabayashi. Neste experimento, um CNT passou pelo mesmo

procedimento de ‘solda’ e encapsulamento, porém desta vez numa das pontas de

tungstênio do nanomanipulador do LME/LNLS. Com uma segunda ponta de tungstênio,

pode-se testar o CNT encapsulado em termos de sua flexibilidade, resistência e

estabilidade. Verificamos na Fig.5.7-F que o CNT sofre deflexão justamente no final da

cápsula de carbono, que por sua vez permanece rígida fornecendo estabilidade para a

ponta, e permitindo sua aplicação no AFM. Um aspecto importante, contudo, desta

técnica é o fato de que não é mais necessária a quebra do CNT da ponta do AFM quando

este se encontra muito longo (>200nm); basta apenas encapsular a sua base até o tamanho

51

desejado de seu comprimento. Neste caso, temos um casamento da flexibilidade do CNT

com rigidez da cápsula, tornando o sistema mais resistente.

A

a

B

FIn

igura 5.8: Imagens de AFM utilizando ponta com CNT (N3-B, figura 5.7-C); amostra padrão de as das primeiras imagens feitas com a ponta; (B) 400 solução lateral. O SLS para ambas imagens é de 16nm.

5.2) An

para amostras do lote F

(substr

e meia altura. O inverso da

As/GaAs crescida pelo nosso grupo. (A) Umimagens depois, a ponta ainda mantém uma boa re

álise da superfície da amostra:

Todas as amostras utilizadas para as medidas de força foram metalizadas pela

técnica de evaporação térmica. Esta, embora tenha uniformidade razoável no substrato

plano, proporcionou filmes de Au com granulação relativamente grande, o que torna mais

complicada a estimativa da área de contato efetiva que a ponta terá com a amostra. Para

realizar esta tarefa, portanto, necessitamos inicialmente de uma análise topográfica da

superfície do filme metálico. Este estudo foi realizado apenas

ato de silício), que foram as que proporcionaram resultados de forças de adesão

mais consistentes, como discutido mais adiante neste capítulo.

A densidade do espectro de potência 2D, obtido com a topografia da amostra, foi

ajustado por lorentziana com o software Origin (figura 5.9). Com isso pudemos obter o

valor máximo da freqüência espacial, além da sua largura d

52

primeir

ispersão do comprimento característico.

Podemos assim obter uma representação quantitativa do diâmetro médio das ilhas

de Au da amostra.

a grandeza representa o comprimento característico da imagem, enquanto a

segunda fornece a d

nmmAmostra 39564,129,17

1

±=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ±=

−

µD (5.1)

O enorme erro relativo, ~ 70%, se deve à grande variedade de diâmetros de ilhas

encontradas na amostra. Esta é uma caract tica da formação de filmes por deposição

térmica.

A

erís

B

0 50 100 150 200

C

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

xc = 17,9 µm-1

w = 24.8 µm-1

Inte

nsid

ade

Nor

mal

izad

a

Freqüência Espacial [1/µm]

Figura 5.9: (A)-Imagem topográfica da amostra de Si com um filme de 20nm de Au. (B)-Espectro de potência 2D da imagem (A). (C)- Ajuste de uma Lorentziana na densidade do espectro de freqüência espacial.

53

5.3) Normalização dos valores da força de adesão:

A normalização dos valores da força de adesão foi feita dividindo a força medida

pelo raio de curvatura da amostra, da forma mais conveniente encontrada na literatura da

área [16, 17]. Deste modo, os valores adquiridos neste experimento puderam ser

comparados aos reportados na literatura. Para superfícies planas de amostras, o fator de

normalização é o raio de curvatura da ponta. No caso das nossas amostras, porém,

tilizamos para a normalização da força de adesão um raio efetivo R* [36], que é definido

como:

u

( )erfícieponta Rsup+erfícieponta

RRR sup* =R (5.2)

da amostra é adquirido pela equação 5.2, enquanto os raios das pontas

ram

randeza F/R* permite assim a comparação dos nossos resultados com dados da

iferentes áreas envolvidas nas diferentes medidas.

Em grande parte de nossos histogramas encontramos distribuições que

pos litav

(i) com umidade

(ii) da

O raio

fo estimados por imagens de microscopia eletrônica, FEG-SEM, como foi mostrado

na seção 4.5.

Dividindo a força medida pelo raio R* teremos a normalização da força. A

g

literatura, minimizando o efeito das d

5.4) Distribuição nos histogramas:

sibi am o ajuste de mais de uma gaussiana. Dentre os motivos, destacamos:

Capilaridade: A amostra, apesar de estar em um ambiente

relativa menor que 10%RH, pode apresentar uma pequena película de água

que contribui para a adesão da ponta na superfície da amostra.

Múltiplos contatos: Devido ao raio de curvatura da ponta e a rugosidade

amostra, em muitas das medidas é provável que a ponta faça contato em um

ou mais pontos com a amostra, conforme ilustrado nas figuras 5.10 e 5.11.

54

(iii)

as medidas

de força. Nem sempre teremos camadas de moléculas alinhadas perfeitamente,

o que acarreta flutuações no número e tipo de interações medidas.

ola utilizada pelo programa. Esta

orreção foi feita apenas para as alavancas do lote F, e é multiplicada no valor final da

rça de adesão medida. Desta forma temos:

Conformação das monocamadas de tiol: A geometria da superfície e

conformação das camadas de tiol podem influenciar diretamente n

0 1 2 3 4 5 6 7

0

5

10

15

20

25

Núm

ero

de o

corrê

ncia

s

xc = 2.4 ± 0.1 nNw = 1.1 ± 0.1 nN

xc = 4.3 ± 0.1 nNw = 0.9 ± 0.1 nN

xc = 2.9 ± 0.2 nNw = 2.7 ± 0.4 nN

∆F [nN]

Figura 5.10: Esquema de múltiplos contatos durante

ma mediuco

da de força de adesão. (A)- Ponto de ntato único. (B)- Múltiplos pontos de contato. (C)-

onto de contato único se deslocando para múltiplo ntato.

uição de múltiplo contato (chip F2-3, amostra F3). xC é o máximo de ocorrências do histograma enquanto w é a largura de meia altura, ambos em nN.

Pco

Figura 5.11: Histograma em que temos uma típica distrib

5.5) Fator de correção:

O software que controla o AFM possui arquivos com calibrações para cada

alavanca que é utilizada. Porém, ao verificarmos estes arquivos após a aquisição dos

dados, notamos que o programa estava usando constantes de mola diferentes das

fornecidas pelo fabricante. Por isso, aplicamos um fator de correção assumindo que a

força é linear no intervalo de valores considerados. Deste modo, dividimos a constante de

mola dada calculada na seção 4.6 pela constante de m

c

fo

55

Lote F1: Lote F2:

27,3/1,1/6,3

===−

−

mNmN

kk

fabricanteC

calculadoCC FC 18,3

/1,1/5,3

===−

−

mNmN

kk

FCfabricanteC

calculadoCC

94,2/6,1/7,4

===−

−

mNmN

kk

FCfabricanteD

calculadoDD 94,2

/6,1/7,4

===−

−

mNmN

kk

FCfabricanteD

calculadoDD

(5.3)

o de erro:

aio da

amostra), de Rp (raio da ponta) e de FC (fator de correção) pode ser escrita como:

5.6) Propagaçã Após obtermos os valores da força média através do ajuste de gaussianas nos

histogramas, o valor da força é normalizado por R* (equação 5.2) e corrigido por FC

(equação 5.3). Desta forma a equação da força pelo raio, em termos de Ra (r

pa

ap

ap RFFC

RFFC

RRRR

FFCR

FFCRF ∆

+∆

=

+

∆=

∆=

....

*.

* (5.4)

Utilizando a teoria de propagação de erro [41], obtemos pela equação 5.4:

( ) ( ) ( ) ( ) ( )22

2

2

22

22

. aerroRerroF ⎟⎠

...,,,a

pp

ap RFerroR

RFFerro

FFerroFC

FCFRRFFC ⎟

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

∂∂

+∆⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

∆∂∂

+⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

∂∂

=∆

(5.5)

( ) ( ) ( ) ( )22

22

2

22

2

22

..arroRe

ap

ppaba

eR

FFCerroRR

FFCFerroRFC

RFCerroFC

RF

RFrroF ⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ∆−+⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ∆−+∆⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ∆+

∆=

(5.6)

Na tabela 5.1 temos os erros adotados para cada uma das variáveis da equação

5.6. erro∆F foi obtido pela dispersão dos histogramas de força, veja seção 5.8; erroFC

foi calculado pelo erro da constante de mola da alavanca com a metalização (vide

equação 5.3 e 4.1), onde na sua propagação de erro, utilizamos um erro de 5% na

freqüência de ressonância da alavanca ν, devido à dispersão do gráfico obtido pelo

programa AutoProbe CP da Themomicroscopes, e 20% na massa total dos metais ms,

devido à imprecisão da espessura dos filmes depositados. O erroRa foi calculado através

do ajuste da Lorentziana mostrado na figura 5.9; e erroRp foi estimado através da barra

56

de 100nm na figura de microscopia eletrônica, levando em consideração o tamanho dos

pixels da imagem (figura 5.7) e a contaminação por carbono na ponta durante a medição

de microscopia eletrônica, que pode influenciar aumentando as dimensões medidas.

Variável Erro D F Variação da força erro∆F = Dispersão dos histogramas FC Fator de correção erroFC = 0,2.FC Ra Raio da amostra a aerroR = 0,7.R R Raio da ponta p erroRp = 0,1.Rp

T .1: Erros adotados para cada variável. Utilizando a equação 5.6 e a tabela 5.1, calculamos os desvios propagados para os

valores de força medidos a partir do ajuste dos histogramas. No entanto, para fins de

análise dos dados obtidos em cada ponta isoladamente, utilizamos apenas o desvio

relativo à dispersão das medidas, uma vez que assumimos que a constante de mola (que

leva ao fator FC) e o raio da ponta não variarão significativamente para a análise dos

resultados de cada ponta individualmente. Na tabela que sumariza os resultados de cada

conjunto de pontas (seção 5.8), mostraremos os desvios devidos somente a esta dispersão

e também à propagação, separadamente. Apesar do enorme erro relativo introduzido no

último caso, veremos que os intervalos de forças medidos podem ser atribuídos a

abela 5

iferentes fenômenos físicos e que os valores médios estão em faixas numéricas distintas.

.7) Análise dos gráficos de Força vs Distância dos lotes A e F:

foram muito fora do esperado,

mo p

tas metalizadas do lote A1 e A2 totalizando mais de 200

medidas de força vs distância.

d 5

• Lote A1 e A2

Graças ao estudo de metalização e aproximação da ponta em relação ao substrato

(seção 5.1), vimos que a técnica de deposição térmica, utilizada nos lotes A1 e A2, não

conseguia depositar um filme de qualidade suficientemente boa para realizar medidas de

força de adesão. Por outro lado, a rápida aproximação da ponta em relação à amostra,

fazia com que as pontas quebrassem ou tivessem seus filmes danificados logo no início

das medidas. Por este motivo, as medidas destes lotes

co ode ser observado resumidamente na tabela 5.2.

Foram utilizadas 6 pon

57

Ponta Func.

AmostraFunc.

∆F [nN] (meio ambiente)

∆F [nN] (atmosfera de N2)

Não Não 4,8 ± 0,1 3,0 ± 0,1 Sim Sim 36,1 ± 0,4 2,9 ± 0,1

Tabela 5.2: Valores da força de adesão, medidas para ponta e amostra não funcionalizadas e ponta e amostra funcionalizadas. As medidas de força da tabela 5.2 não estão normalizadas, nem tiveram o valor da

constante de mola da alavanca corrigido. Logo só é possível uma comparação relativa

entre as forças.

Para a ponta-amostra não funcionalizadas, a medida em atmosfera de N2 é 1,8nN

menor em relação às medidas feitas em meio ambiente. Este fato pode ser explicado se

considerarmos a existência de forças capilares em meio ambiente. Já o caso de ponta e

amostra funcionalizadas, temos uma enorme diferença da força medida em meio

ambiente em relação à atmosfera de N2 (33,2nN). Como a força medida em atmosfera de

N2 foi próxima ao da ponta não funcionalizada, podemos concluir que não ouve

funcionalização da ponta. Este fato pode ser atribuído ao baixo tempo de funcionalização

(t < 5,5h) ou então à baixa qualidade do filme de Au. Porém o processo de

funcionalização teve alguma ação nas pontas, pois a força medida em meio ambiente foi

muito maior nas pontas funcionalizadas em relação às não funcionalizadas. Isto pode ser

influência de forças capilares, pois o mesmo não ocorreu em atmosfera de N2, ou de

algum resíduo da solução utilizada que permaneceu na amostra.

• Lote F1 e F2

Para estes lotes de pontas, aplicamos os resultados obtidos na análise por FEG-

SEM dos lotes anteriores e tivemos resultados mais satisfatórios, por isto foi feito um

estudo mais detalhado.

Inicialmente, para alguns pares chip-amostra, são apresentados um conjunto de

gráficos (histogramas e gráficos de evolução temporal das medidas) referentes a cada par

e imagens FEG-SEM da ponta metalizada após a medida. Também são apresentadas a

análise de cada item do conjunto e a correção e a normalização das medidas de força,

utilizando as equações 5.2 e 5.3.

58

5.8) Medidas de força de adesão:

Neste tópico, pretendemos identificar os tipos de forças que aparecem em nossos

histogramas e tentar associá-los à características de nosso sistema. Iremos sumarizar os

resultados para identificar o “background” de forças que estão presentes nas nossas

medidas, nos casos em que a adesão não seja dominante.

5.8.1) Pontas e amostras não funcionalizadas:

No conjunto 5.1 (chip F2-3-C), temos um caso típico de medidas de força para

pontas e amostras não funcionalizadas. O chip desta medida quebrou acidentalmente

durante as medidas no microscópio eletrônico, e por isso, não foi possível fazer a imagem

das pontas após as medidas de ∆F vs d. No entanto, os histogramas de força ficaram bem

definidos; por este motivo supomos que seu formato seja o mesmo que nas pontas

padrões do lote F2, figura 5.5 C e D, com raio de RF2 ≅ 50nm.

• Análise da aproximação da ponta em relação à amostra:

O histograma A mostra as forças de van der Waals quando a alavanca está se

aproximando da amostra. Nota-se claramente a presença de duas gaussianas, com centros

ligeiramente separados na escala de forças. Estas duas gaussianas foram identificadas em

todos os histogramas de aproximação de pontas não funcionalizadas. Sumarizando os

resultados obtidos para 4 pontas, observamos que em geral os valores médios de força

para os dois histogramas variam por um fator de 1,4 a 2,0, e a segunda gaussiana ajustada

(com maior valor para a força) apresenta menor dispersão (~50%) que a primeira

gaussiana, para as pontas de raio ~ 50nm.

Quando a ponta está realizando medidas na superfície da amostra, a rugosidade da

mesma causa a variação da área de contato da medida. Nas figuras 5.9 e 5.12-A, observa-

se a presença de regiões mais planas ao lado de grãos na superfície da amostra, com

depressões entre eles. Acreditamos que a primeira gaussiana, com maior dispersão seja

devido à medidas em que a ponta está interagindo com as regiões mais planas da amostra,

59

onde terá uma área de contato menor com a superfície (figura 5.10-A), porém com grande

dispersão, devido à rugosidade intrínseca existente nestas mesmas regiões. O histograma

da figura 5.12-B sugere uma maior área superficial para a região ‘plana’ do que para as

depressões ou grãos; deste modo, o número de ocorrências da primeira gaussiana também

será maior, como é geralmente observado nas medidas com pontas não funcionalizadas.

Dentro deste raciocínio, a segunda distribuição gaussiana se deve provavelmente às

medidas em que a ponta está em depressões ou em contato com os grãos maiores (figura

5.10-B e C), em que teremos um aumento mais significativo da área de contato e portanto

da força. Deste modo, associamos o menor número de ocorrências desta distribuição à

menor área superficial ocupada pelos grãos e depressões na superfície da amostra, como a

Fig.5.12-A sugere. Por outro lado, áreas de contato maiores apresentam uma menor

variação relativa durante as várias aquisições de força. Ou seja, é possível que as duas

distribuições distintas observadas no histograma A sejam devido a múltiplos contatos.

Conforme foi observado em imagens de microscopia eletrônica na seção 5.1, o

filme de Au da superfície da ponta sofre deformações ao longo das medidas, o que pode

modificar as dimensões da extremidade de Au da ponta e influenciar a interação de van

der Waals entre a ponta e a amostra causando dispersão nas medidas. Também pode

ocorrer do Si da ponta ficar exposto, fazendo assim que não tenhamos apenas a interação

Au-Au, mas também uma interação Au-Si. A força de van der Waals depende

diretamente do quadrado da densidade do material (vide equação 2.9); caso sejam

materiais diferentes, a força vai ser proporcional ao produto das duas densidades. A

densidade dos materiais são ρAu = 19,32g/cm3 e ρSi = 2,33g/cm3 [38], logo a força atrativa

de van der Waals entre o Au-Au é ~ 8 vezes maior que a do Si-Au. Desvios desta

magnitude não são observados em nenhum dos histogramas de aproximação. Desta forma

é plausível assumir que a interações Au-Au são dominantes nas pontas analisadas,

mesmo que esta tenha uma parte de Si exposta.

O gráfico A do conjunto 5.1 confirma este raciocínio, mostrando que a seqüência

de medidas de aproximação fornece valores de força que oscilam em torno de dois

valores médios (platôs) diferentes, para as diferentes regiões da amostra medida.

60

Histograma A de ∆F de van der Waals

(aproximação da ponta na superfície da amostra) Histograma B de ∆F de adesão

(afastamento da ponta da superfície da amostra)

0 1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

20

25

30

35

Núm

ero

de o

corr

ênci

as

∆F [nN]

xc = 2.4nNw = 1.1nN

xc = 4.3nNw = 0.9nN

xc = 2.9nNw = 2.7nN

0 5 10 15 20 250

5

10

15

20

25

30

35

xc = 24.7nNw = 0.6nN

xc = 15.9nNw = 3.7nN

Núm

ero

de o

corr

ênci

as

∆F [nN]

xc = 4.0nNw = 4.4nN

xc = 3.0nNw = 0.9nN

xc = 6.3nNw = 1.3nN

Gráficos A e B: ∆F vs seqüência de medidas

0 50 100 150 200 250 300 350

0

5

10

15

20

25

Sequência ordenada das medidas

B A

∆F [n

N]

Conjunto 5.1 (chip F2-3-C): Histograma A: Medidas de força da aproximação da ponta em relação à amostra. Histograma B: Medidas de força do afastamento da ponta em relação à amostra. Gráfico A: Seqüência ordenada de medidas da aproximação da ponta em relação à amostra. Gráfico B: Seqüência ordenada de medidas de afastamento da ponta em relação à amostra.

61

A

B Histograma de alturas

2 4 6 8 100

1000

2000

3000

4000

5000

Altura [nm]

Oco

rrênc

ias

Figura 5.12: (A)- Imagem topográfica de área 0,5x0,5µm feita por AFM da superfície da amostra com filme de Au. (B)- Histograma de alturas da amostra.

• Ponta se afastando em relação à superfície da amostra:

No histograma B do conjunto 5.1 podem ser observadas duas distribuições,

similarmente ao observado no histograma A. O ajuste de gaussianas ao histograma

mostra que os valores médios de força são deslocados para a direita em relação ao caso

anterior.

Em atmosfera de N2, as superfícies de Au estão em estado ligado quando ponta e

amostra estiverem em contato [42]. Esta interação justificaria o aumento no valor da

força medida, de ~ 1,1nN, das gaussianas observadas no histograma B em relação ao A.

Embora não possamos desprezar a contribuição de forças capilares, Tormoen et al. [36]

assumem que estas não são significativas para umidades relativas abaixo de 15%.

Ainda no histograma B, temos dois conjuntos de medidas de forças, uma centrada

em 15,9nN e outra em 24,7nN. Pelo gráfico B, observa-se que estas distribuições

ocorreram entre as aquisições 31 e 151, ao longo da medida. É possível que tenha havido

a união mecânica mais intensa apenas nesta região, e, em particular, entre as aquisições

61 e 90, em que temos a distribuição de 24,7nN. Novamente, não descartamos a

possibilidade de termos contribuição de forças capilares, já que estas medidas foram

feitas em regiões próximas entre si.

62

• Aumento do raio da ponta

Se as duas gaussianas ajustadas na região de forças de van der Waals nos

histogramas do conjunto 5.1 são devidas a múltiplos contatos, deveríamos observar uma

mudança na distribuição com a variação do raio da ponta. A diminuição do raio não é

possível com as pontas utilizadas nestas medidas, devido inclusive à metalização, porém

pontas com raios maiores foram obtidas. O histograma A do conjunto 5.2 mostra as

medidas feitas com uma ponta de raio de 100nm. Podemos observar uma distribuição

menos uniforme que no caso do conjunto 5.1, com um aumento da dispersão das

medidas, e a indicação de pelo menos três distribuições gaussianas. O mesmo

comportamento pode ser observado no histograma B desta ponta. A distribuição em

11,1nN, novamente, pode ser associada à união mecânica ou a presença de forças

capilares.

Nos gráficos A e B do conjunto 5.2 (obtidos para o chip F1-5-D), observa-se

platôs em várias forças, mostrando que em diferentes regiões da amostra, teremos

diferentes configurações de áreas de contato devido à grande dimensão da ponta. Neste

caso, o relevo da amostra deve estar determinando a área real de contato, sugerindo que a

idéia de “integração” do relevo da superfície pela maior área da ponta não funciona.

Logo, aumentar a dimensão da ponta apenas aumenta a dispersão de nossas medidas, não

sendo uma alternativa viável para medidas de força confiáveis.

63

Histograma A de ∆F de van der Waals (aproximação da ponta na superfície da amostra)

Histograma B de ∆F de adesão (afastamento da ponta da superfície da amostra)

1 2 3 4 50

5

10

15

20

25

30

Núm

ero

de o

corrê

ncia

s

∆F [nN]

xc = 2.0nNw = 3.3nN

xc = 3.6nNw = 0.8nN

xc = 1.3nNw = 0.5nN

2 4 6 8 10 120

2

4

6

8

10

12

14

16

Núm

ero

de o

corrê

ncia

s

∆F [nN]

xc = 11.2nNw = 0.2nN

xc = 2.6nNw = 3.7nN

Gráficos A e B: ∆F vs seqüência de medidas Imagem A

0 50 100 150 200 2500

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Sequência ordenada das medidas

∆F [n

N]

B A

Conjunto 5.2 (chip F1-5-D): (Histograma A): Medidas de força da aproximação da ponta em relação à amostra. (Histograma B): Medidas de força do afastamento da ponta em relação à amostra. (Gráfico A): Seqüência ordenada de medidas da aproximação da ponta em relação à amostra. (Gráfico B): Seqüência ordenada de medidas de afastamento da ponta em relação à amostra. (Imagem A): Imagem feita no FEG de ponta de Si de AFM metalizadas com 20nm de Pt e 40nm de Au, aumento de 55k. Raio estimado, R ≅ 100nm.

64

• Resultados para as medidas com diferentes pontas:

Dentre as medidas realizadas, quando a ponta está se aproximando da amostra

temos interações exclusivamente de van der Waals. Na tabela 5.3 temos os valores de

força obtidos para as quatro pontas utilizadas. Observa-se que os valores foram próximos

e que não é possível distinguir diferenças entre as pontas do lote F1 e F2 (que possuem

diferentes metalizações). Na tabela 5.3, mostramos o erro atribuído à dispersão dos

valores de força, e também o erro propagado conforme foi visto na seção 5.6. Este último

torna-se mais importante na comparação entre as diferentes pontas utilizadas.

Usando as equações 5.2 e 5.3, e com o valor do comprimento característico da

amostra, D = 56 nm (equação 5.1), a tabela abaixo mostra os valores das forças corrigidos

e normalizados.

Ponta Funcionalização FvdW ±

∆Fdispersão[N/m]

FvdW ± ∆Fpropagado [N/m]

F2-3-C Não func. 0,5 ± 0,2 0,5 ± 0,3 F2-3-D Não func. 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,2 F1-5-C Não func. 0,5 ± 0,2 0,5 ± 0,3 F1-5-D Não func. 0,3 ± 0,2 0,3 ± 0,3

Tabela 5.3: Forças de van der Waals na aproximação da ponta em relação à amostra.

A média das medidas da tabela 5.3 é ~ 0,43 N/m. Na tabela 5.4 temos os valores

teóricos calculados para o caso de uma esfera de Au interagindo com uma superfície de

Au, conforme foi calculado na seção 2.2 (tabela 2.1). Normalizando as forças encontradas

para um raio efetivo típico, R*= 20nm, também na tabela 5.4, é possível comparar os

valores teóricos com os valores médios da tabela 5.3. Embora maior, o valor

experimental é da mesma ordem de grandeza que os previstos teoricamente; o desvio da

medida experimental inclui os valores teóricos em seu limite inferior.

65

k [N/m]

F intersecção R = 50nm; [nN]

F intersecção R = 100nm; [nN]

Fintersecção normalizada R = 50nm; [N/m]

Fintersecção normalizada R = 100nm; [N/m]

3 3,75 4,71 0,19 0,24 4 4,52 5,72 0,23 0,29 5 5,25 6,65 0,26 0,33

Tabela 5.4: Valores de força da tabela 2.1 e valores normalizados para R* = 20nm.

Para a ponta se afastando da amostra, temos que levar em consideração a

existência de forças capilares e de forças de adesão entre as superfícies de Au. O valor e a

dispersão das forças são maiores que no caso da aproximação, e a média das medidas é

de ~ 0,6 N/m. Acreditamos que esta pequena contribuição adicional da força seja devida

principalmente à adesão Au-Au entre a ponta e a amostra.

Ponta Funcionalização FvdW ± ∆Fdispersão[N/m]

FvdW ± ∆Fpropagado [N/m]

F2-3-C Não func. 0,7 ± 0,4 0,7 ± 0,5 F2-3-D Não func. 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,2 F1-5-C Não func. 0,7 ± 0,2 0,7 ± 0,4 F1-5-D Não func. 0,3 ± 0,2 0,3 ± 0,3

Tabela 5.5: Forças de van der Waals no afastamento da ponta em relação à amostra.

Na tabela 5.6 apresentamos outras forças de adesão detectadas em pontas e

amostras não funcionalizadas, com valores significativamente maiores que as forças de

van der Waals. Novamente o número de ocorrências destas medidas é baixo e localizado

em determinadas regiões analisadas. Acreditamos que estas forças possam ser devido à

deformação do filme ou a fenômenos capilares.

Ponta Funcionalização FvdW ± ∆Fdispersão[N/m]

FvdW ± ∆Fpropagado [N/m]

F2-3-C Não func. 2,8 ± 0,3 3 ± 1 F1-5-D Não func. 1,5 ± 0,1 1,5 ± 0,8

Tabela 5.6: Forças mecânicas ou capilares que detectamos em amostras não funcionalizadas.

66

5.8.2) Pontas e amostras funcionalizadas:

As pontas funcionalizadas com tempo menor do que 15h ou as que tiveram o

filme de Au danificado durante as medidas de adesão, conforme verificado

posteriormente com o FEG-SEM, só apresentaram valores no intervalo de forças de van

der Waals, impossibilitando a análise de forças de adesão. Por este motivo, iremos

apresentar apenas os resultados das pontas que tiveram o comportamento similar ao

esperado para a adesão.

Para os dois primeiros casos, apresentados a seguir, temos que as condições de

funcionalização para a ponta e a amostra foram as mesmas. O chip F1-1-D e amostra do

lote F apresentadas no conjunto 5.3 foram funcionalizadas com solução tiol/etanol em

concentração 0,5mM durante 21h; esta ponta em particular apresenta R = 100nm.

O histograma A mostra uma distribuição de medidas diferenciada em relação ao

caso anterior de pontas e amostras não-funcionalizadas. Apesar de podermos ajustar duas

gaussianas às medidas obtidas, a distribuição dominante ocorre para valores maiores de

força. O gráfico de seqüência ordenada de medidas, gráfico A, mostra que existe

basicamente a oscilação entre dois valores médios que representam forças de van der

Waals.

Já o histograma B, mostra uma distribuição no mesmo intervalo de forças de van

der Waals, como é visto no histograma A, e ainda uma outra distribuição em torno de

17nN, um valor mais próximo ao esperado para forças de adesão, porém com poucas

contagens. No gráfico B observa-se um pico alto nas primeiras medidas e logo em

seguida os valores da força decrescem para o intervalo de força de van der Waals (~6nN).

Após isso, três platôs podem ser observados, estabilizando em torno de 8nN. De maneira

geral, podemos concluir que as medidas não são uniformes sobre a superfície, o que pode

ser atribuído a vários fatores, como a funcionalização inomogênea nas superfícies - até

mesmo a não-funcionalização de determinadas regiões da amostra - ou à deformação

mecânica do filme de Au, conforme pode ser observado nas imagens A e B do conjunto

5.3.

67

Histograma A de ∆F de van der Waals (aproximação da ponta na superfície da amostra)

Histograma B de ∆F de adesão (afastamento da ponta da superfície da amostra)

0 1 2 3 4 5 6 7 80

10

20

30

40

50

Núm

ero

de o

corrê

ncia

s

∆F [nN]

xc = 6.0nNw = 1.1nN

4 6 8 10 12 14 16 180

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Núm

ero

de o

corr

ênci

as

∆F [nN]

xc = 7.3nNw = 3.0nN

xc = 16.7nNw = 0.8nN

Gráficos A e B: ∆F vs seqüência de medidas Imagem A

0 20 40 60 80 100

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

B A

Sequência ordenada das medidas

∆F [n

N]

Conjunto 5.3 (Chip F1-1-D): (Histograma A): Medidas de força da aproximação da ponta em relação à amostra. (Histograma B): Medidas de força do afastamento da ponta em relação à amostra. (Gráfico A): Seqüência ordenada de medidas da aproximação da ponta em relação à amostra. (Gráfico B): Seqüência ordenada de medidas de afastamento da ponta em relação à amostra. (Imagem A): Imagem feita no FEG-SEM da ponta de Si para AFM metalizadas com 20nm de Pt e 40nm de Au, aumento de 55k. Raio estimado, R ≅ 100nm.

68

Para o Chip F2-1-D e amostra do lote F, apresentados no conjunto 5.4, temos que

a funcionalização foi feita com concentração de 1mM durante 16h, onde o raio da ponta

era de ~ 100nm. Comparativamente ao conjunto 5.3, esta ponta apresentou força

relativamente constante durante a sua aproximação (histograma e gráfico A, conjunto

5.4).

Na volta, tivemos uma distribuição com baixo número de ocorrências em torno de

16nN, região na qual observa-se uma distribuição no conjunto 5.3, e uma distribuição

bastante larga em 21nN. No gráfico B, observam-se regiões relativamente estáveis de

medidas até aproximadamente a aquisição 60. A partir deste momento temos uma região

de instabilidade que pode estar associada com problemas de conformação das moléculas

e recobrimento inomogênio da amostra pela SAM, ou ainda deformação da ponta. No

final das aquisições, porém observa-se novamente uma região de aparente estabilidade

em torno de 21nN.

Nas imagens A e B desta ponta, nota-se que ela está com formato semelhante à

ponta do conjunto 5.3 (chip F1-1-D), sendo possível uma comparação mais direta entre

elas. O aumento de 50% da concentração de tiol na solução do conjunto 5.4, mesmo com

o tempo de funcionalização cerca de 25% menor, fez com que ocorresse um

deslocamento do histograma B para maiores valores de forças, sugerindo a existência de

forças de adesão entre as terminações COOH. Acreditamos que houve uma

funcionalização mais uniforme nesta superfície em relação ao caso anterior.

69

Histograma A de ∆F de van der Waals (aproximação da ponta na superfície da amostra)

Histograma B de ∆F de adesão (afastamento da ponta da superfície da

amostra)

1 2 3 4 50

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Núm

ero

de o

corrê

ncia

s

∆F [nN]

xc = 3.7nNw = 0.7nN

14 16 18 20 22 240

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Núm

ero

de o

corrê

ncia

s

∆F [nN]

xc = 21.3nNw = 4.6nN

Gráficos A e B: ∆F vs seqüência de medidas Imagem A

0 20 40 60 80 100 1200

4

8

12

16

20

24

B A

Sequência ordenada das medidas

∆F

[nN

]

Conjunto 5.4 (Chip F2-1-D): (Histograma A): Medidas de força da aproximação da ponta em relação à amostra. (Histograma B): Medidas de força do afastamento da ponta em relação à amostra. (Gráfico A): Seqüência ordenada de medidas da aproximação da ponta em relação à amostra. (Gráfico B): Seqüência ordenada de medidas de afastamento da ponta em relação à amostra. (Imagem A): Imagem feita no FEG-SEM da ponta de Si de AFM metalizadas com 20nm de Pt e 60nm de Au, aumento de 55k. A seta indica o local onde há deformação do filme. Raio estimado, R ≅ 100nm

70

Para o Chip F2-4-C e amostra do lote F apresentados no conjunto 5.5, temos que a

funcionalização foi feita com concentração de 1mM para a ponta e 1,5mM para a

amostra, ambos durante 16h. O raio da ponta neste caso foi de ~ 65nm.

O histograma A mostra uma distribuição gaussiana dominante, com outra pequena

distribuição para valores mais altos de força. O gráfico A mostra que houve instabilidade

nas medidas iniciais, seguidas de outras mais estáveis, porém com muitos pontos com

ruído (regiões que não possuem pontos).

No histograma B temos uma distribuição relativamente larga (dispersão ~ 30%)

com uma maior concentração de contagens em ~ 28 e 32nN. O gráfico B mostra que não

houve a formação de platôs, mas de rampas que aumentavam numa determinada região.

Isto indica uma possível deformação da ponta. Porém, não se observa forças no intervalo

devido à interação de van der Waals (~3nN), sendo isto um indicativo que apesar da

deformação da ponta, ainda temos predominantemente interações entre os radicais do

tiol.

Acreditamos ainda que exista uma dispersão intrínseca por causa da conformação

das monocamadas de tiol na superfície, em particular na nossa amostra que é rugosa, e

que de fato, houve a funcionalização para este conjunto.

71

Histograma A de ∆F de van der Waals (aproximação da ponta na superfície da amostra)

Histograma B de ∆F de adesão (afastamento da ponta da superfície da amostra)

1 2 3 4 5 6 7 80

10

20

30

40

50

60

Núm

ero

de o

corrê

ncia

s

∆F [nN]

xc = 2.7nNw = 0.5nN

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 400

2

4

6

8

10

12

14

Núm

ero

de o

corrê

ncia

s

∆F [nN]

xc = 29.7nNw = 8.6nN

Gráficos A e B: ∆F vs seqüência de medidas Imagem A

0 100 200 300 4000

5

10

15

20

25

30

35

40

B A

Sequência ordenada das medidas

∆F [n

N]

Conjunto 5.5 (Chip F2-4-C): (Histograma A): Medidas de força da aproximação da ponta em relação à amostra. (Histograma B): Medidas de força do afastamento da ponta em relação à amostra. (Gráfico A): Seqüência ordenada de medidas da aproximação da ponta em relação à amostra. (Gráfico B): Seqüência ordenada de medidas de afastamento da ponta em relação à amostra. A região circulada mostra um platô em que as forças medidas tentem a aumentar. (Imagem A): Imagem feita no FEG-SEM da ponta de Si para AFM metalizadas com 20nm de Pt e 60nm de Au, aumento de 55k . Raio estimado, R ≅ 65nm.

72

5.9) Análise dos resultados

Analisamos nos conjuntos descritos na seção 5.8 a relação entre as condições de

funcionalização e a mudança nos valores de força nos histogramas. Vimos que é possível

medir com o nosso sistema forças no intervalo esperado para a adesão.

A tabela 5.7 mostra os valores de forças obtidos com três pontas, variando o

tempo de funcionalização e a concentração de tiol na solução. Usando as equações 5.2 e

5.3, e com o valor do comprimento característico da amostra, Damostra = 56nm (equação

5.1), a tabela 5.7 mostra os valores das forças corrigidos e normalizados. Na primeira

coluna com medidas de força, temos o erro relativo à dispersão dos histogramas,

enquanto na segunda coluna temos o erro propagado. A grande dispersão do erro

propagado se deve principalmente à imprecisão na determinação da constante de mola da

alavanca e à grande dispersão no diâmetro dos grãos da amostra, conforme pode ser visto

na seção 5.6.

Chip conjunto

∆t [hs]

Concentração de Tiol na Amostra

[mM]

Concentração de Tiol na Ponta

[mM]

Fadesão ± ∆Fdispersão

[N/m]

Fadesão ± ∆Fpropagado

[N/m] F1-1-D;5.3 21 0,5 0,5 2,2 ± 0,1 2,2 ± 1,2 F2-1-D;5.4 16 1 1 2,9 ± 0,6 2,9 ± 1,6 F2-4-C;5.5 16 1,5 1 4,8 ± 0,7 4,8 ± 2,5 Tabela 5.7: Forças de Adesão do mercaptoundecanoic acid, com terminação em COOH.

A literatura não fornece um grande número de trabalhos para medidas de adesão

em atmosfera controlada; a maior parte dos trabalhos são feitos em meio líquido,

especialmente etanol. Os valores de força de adesão encontrados na literatura, e que

podem servir de base de comparação para nossas medidas, estão indicados na tabela 5.8.

Observamos que nossos valores para forças de adesão são da mesma ordem e grandeza, e

estão próximos, em alguns casos, dos valores reportados na literatura. A comparação

exata entre as forças medidas em diferentes conjuntos (nossos e da literatura) é

complicada, mesmo normalizando as medidas com o raio efetivo R*; as imagens de

FEG-SEM permitiram detectar que sempre existe um grau de deformação no filme de

ouro ou na ponta, fato que gera maior dispersão além de eventualmente mudar os valores

médios da força (proporcionando o aparecimento de outras distribuições no histograma).

73

Cadeia de Carbono Tiol COOH

Força de Adesão [N/m]

Atmosfera Literatura

C16 1,4 ± 0,3 N/m N2 [16] C11 1,6 a 3,2 N/m Ar [17]

Tabela 5.8: Valores da literatura utilizando tióis semelhantes ao nosso porém com cadeias de carbono maiores. Em [16] a medida foi feita em atmosfera de N2 enquanto em [17] foi feita em atmosfera de Ar. Em [17] as medidas de força não estavam normalizadas; para o valor fornecido para o raio da ponta pelos autores, entre 20 e 40 nm, os valores de força fornecidos pelo autor estariam entre 1,6 e 3,2 N/m.

Outro comentário importante é que a metalização utilizada para a amostra não foi

das mais eficientes, pois a grande rugosidade aumenta a dispersão das medidas

complicando, assim, a nossa análise. Amostras do tipo flame anneal, onde um tratamento

térmico elimina parte do stress do filme depositado e uniformiza a superfície, seriam

mais adequadas para este teste. Mesmo neste caso, contudo, acreditamos que seja

imprescindível a visualização das pontas no FEG-SEM para termos maior confiabilidade

nos resultados.

• Energia Livre de superfície

Como foi descrito no capítulo 2, podemos calcular através da teoria DMT ou JKR

o trabalho de adesão (W) através das medidas experimentais de força de adesão. Usando

a superfície de Au como referência, utilizaremos o modelo JKR, como exposto no

capítulo 2.

Pela equação 2.16 e pelos valores da tabela 5.9, calculamos que o trabalho de

adesão para os tióis utilizados é:

Chip conjunto

FAdesão ± ∆Fpropagado

[N/m]

Teoria JKR WAdesão[mJ/m2]

F1-1-D;5.3 2,2 ± 1,2 470 ± 260 F2-1-D;5.4 2,9 ± 1,6 620 ± 340 F2-4-C;5.5 4,8 ± 2,5 1020 ± 530

Tabela 5.9: Valores do trabalho de adesão calculados pela teoria JKR.

Ainda com a equação 2.16, podemos calcular o trabalho de adesão para a média

das forças de van der Waals quando a ponta se afasta da amostra, tabela 5.5. Desta forma:

2/4064 mmJvdW ±=γ (5.7)

74

No caso de grupos moleculares que podem formar ligações de ponte de

hidrogênio através da interface adesiva, Fowkes [46] sugere que a energia de superfície

na interação das moléculas pode ser escrita em componentes de força de van der Waals,

γvdW, e componentes de interações tipo ponte de hidrogênio, γH-bond (equação 5.7).

( ) bondHvdwbondHvdW WW −− +=⇒+== γγγγγ 2222 (5.8)

Como os grupos de ácidos carboxílicos podem formar ligações intermoleculares

de ponte de hidrogênio, utilizamos a equação 5.8 para estimar γH-bond. A tabela 5.10

mostra os valores de γH-bond calculados a partir da tabela 5.9 e do valor de γvdW, equação

5.7. Os valores de γH-bond foram calculados em unidades de mJ/m2 e kcal/mol, levando em

consideração que uma molécula de SAM, idealmente alinhada, ocupa uma área de 2 nm2.

Chip conjunto

FAdesão ± ∆Fpropagado [N/m]

γH-bond [mJ/m2]

γH-bond [kcal/mol]

F1-1-D;5.3 2,2 ± 1,2 170 ± 90 4,8 ± 2,6 F2-1-D;5.4 2,9 ± 1,6 240 ± 140 7,0 ± 3,9 F2-4-C;5.5 4,8 ± 2,5 450 ± 230 12,8 ± 7,0

Tabela 5.10: Valores da energia de interação da ligação de hidrogênio. Michalske et al [17] faz uma interessante comparação entre γH-bond e a energia de

dimerização do ácido fórmico (CH2O2) em fase vapor (figura 5.11).

CO

OHH

HOC

OH

Figura 5.11: Formação de um dímero de ácido fórmico em fase vapor.

Esta dimerização envolve a ligação de duas pontes de hidrogênio, semelhante à

interação entre os tióis, e desprende uma energia equivalente à 14 kcal/mol [48, 49].

Michalske encontrou uma energia de 5 kcal/mol para a interação entre os pares de ácido

carboxílico. Ele atribuiu esta diminuição da energia em relação ao dímero de ácido

fórmico à conformação da monocamada de tiol, que forma ligações não completas entre

as pontes de hidrogênio. Para o nosso sistema, tabela 5.10, temos que as três energias

encontradas para ligação de hidrogênio evoluem para a energia do dímero de ácido

fórmico. A energia que mais se aproximou à do dímero foi a da ponta F2-4-C, 12,8

kcal/mol. Este resultado também dá suporte à conclusão que, para este conjunto de ponta-

amostra, a funcionalização foi bem sucedida.

75

Capítulo 6

Conclusões Gerais

Neste trabalho implementamos no microscópio de força atômica a técnica de

espectroscopia de força. Para ponta e amostra metalizadas e não funcionalizadas, foram

medidas principalmente interações de van der Waals além de forças de adesão, capilares e

relativas à deformações plásticas do filme metálico. Quando a alavanca/ponta e amostra foram

funcionalizadas com moléculas de tiol com terminação em COOH foram medidas forças de

adesão com características que indicam a interação entre estas moléculas.

Para que estes resultados pudessem ter um maior grau de confiabilidade, foi necessário

realizar imagens de FEG-SEM das pontas. Imagens feitas antes das medidas permitiram

verificar a cobertura metálica da ponta de Si, além da reprodutibilidade dos processos de

metalização utilizados. Com isso, observamos que a deposição por sputtering forneceu

melhores resultados que a deposição térmica, com melhor adesão na superfície de Si e menor

tamanho de grãos, o que permitiu diminuir a dispersão das medidas de força. As imagens do

FEG-SEM também permitiram verificar a integridade das pontas após as medidas; com isso

pudemos estabelecer os melhores parâmetros de controle para a aproximação da ponta em

relação à superfície da amostra.

Ainda com as imagens de FEG-SEM verificou-se que as pontas novas possuem uma

parte mais delicada (em seu ápice) que geralmente quebra logo nas primeiras medidas de ∆F x

d. Podemos contornar este problema preparando para funcionalização pontas já usadas para

fazer imagens. Estas já terão perdido a sua parte mais delicada e, após a metalização, a ponta

seria mais resistente. O preço que teremos que pagar é o aumento do raio da ponta que, como

mostramos, nos trará perda da resolução das medidas, especialmente em superfícies rugosas.

A fim de facilitar a aquisição e tratamento de dados, foram preparados programas

escritos em Delphi e no Mathematica. Com estes programas, foi possível trabalhar com uma

estatística adequada para o ajuste das distribuições. Convém lembrar que esta estatística

também é limitada pela integridade da ponta utilizada na medida.

Um estudo das constantes de mola das alavancas pós-metalização foi necessário para

que obtivéssemos os valores absolutos das forças. Utilizamos as espessuras nominais dos

filmes depositados na amostra. Nosso equipamento de metalização por sputtering não fornece a

76

espessura do filme com precisão, o que acarretou uma maior imprecisão nos cálculos

realizados.

Embora tenhamos uma boa estatística quanto ao número de medidas de força para

graficarmos os histogramas, a estatística de pontas e amostras funcionalizadas foi muito

pequena para que pudéssemos ter interpretações mais consolidadas. Porém foi possível analisar

que existe uma diferença nas forças de van der Waals entre a aproximação e o afastamento da

ponta, provavelmente devido à forças de adesão, e que a deformação plástica do filme de Au

causa dispersão nas medidas, como sugerido por N. Burnham [42]. Observamos também que a

grande maioria de nossas medidas apresentou uma distribuição vizinha à distribuição principal,

provavelmente relacionada à formação de múltiplos contatos, devido à grande rugosidade da

superfície da amostra. O aumento do raio da ponta não foi eficiente para minimizar estes

efeitos, uma vez que a dispersão das medidas aumentou para pontas com maior raio.

Verificamos também que a funcionalização não foi eficaz para tempos menores de 15h. Nossos

resultados apontam que uma SAM aproximadamente homogênea foi formada em

concentrações de tiol/etanol de 1,5mM. A comparação das medidas de forças das alavancas

funcionalizadas com valores reportados na literatura mostrou que as forças são da mesma

ordem de grandeza; além disso, a energia livre das pontes de hidrogênio estimada para o caso

das moléculas de tiol, ficou abaixo do valor para o caso de um dímero de ácido fórmico,

indicando que a SAM foi formada e que estamos medindo forças de adesão entre as moléculas

de COOH.

As pontas com CNTs apresentaram resolução semelhante às pontas de alta resolução já

utilizadas [45], porém com durabilidade muito maior, com mais de 400 imagens. O

encapsulamento do CNT mostrou-se útil para a estabilidade da sonda, contribuindo também

para a resolução final na imagem.

Este projeto trouxe para o nosso grupo a experiência em medidas de forças através da

microscopia de força atômica que abrirá portas para futuros trabalhos na área de biologia e

bioquímica. Como perspectivas futuras, pretendemos utilizar os conhecimentos adquiridos

neste trabalho com o novo AFM adquirido pelo laboratório (modelo PicoPlus, da Molecular

Imaging). Este equipamento, com perfil mais adequado para trabalhar em líquidos, permitirá

observar a funcionalização com moléculas específicas (por exemplo proteínas). Com a

espectroscopia de força, pretendemos testar a implementação de rotinas de funcionalização de

superfícies semicondutoras para a fabricação de nanosensores biológicos.

77

Apêndice A

Perspectivas Futuras de Aplicações:

A.1) Imagens de DNA com AFM

O DNA é um dos possíveis elementos com o qual podemos funcionalizar o sistema

ponta-amostra para medidas de espectroscopia de força. É possível analisar a força de

ruptura entre suas fitas complementares medindo a separação mecânica de um pedaço de

DNA dupla hélice [43]. Uma das extremidades da fita de DNA simples é modificada

quimicamente para que se tenha uma terminação em HS, possibilitando, desta forma, a

ligação química do DNA com uma outra molécula (PEG – polyethylene glycol) que irá

interagir com a superfície da ponta ou da amostra [43]. Desta forma, com o afastamento da

ponta em relação à amostra, é possível obter o espectro de forças do DNA relacionado com

o número de bases desligadas das duas fitas.

Nosso objetivo nesta primeira etapa de medidas é de realizar medidas topográficas

de um tipo de DNA (DNA plasmídico) na superfície de um substrato plano para verificar o

seu estado de relaxamento, conforme será explicado na próxima seção. Este estudo será útil

como introdução à manipulação de soluções com material biológico; estes procedimentos

poderão ser posteriormente utilizados na funcionalização de pontas-amostras além de

fornecer informações adicionais sobre o relaxamento do DNA plasmídico para o grupo de

pesquisa da Profa Anete Pereira de Souza, do Instituto de Biologia e Centro de Biologia

Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) da Universidade Estadual de Campinas.

A.1.1) Aspectos Teóricos:

DNAs plasmídicos - também chamados de plasmídeos - são moléculas dupla hélice

de DNA circular (figura A.1A) com aproximadamente 2000 bases (figura A.3A). Eles são

encontrados dentro de alguns tipos de bactérias.

78

Figura A.1: Imagens 3d de um DNA plasmídico. (A) Plasmídeo completamente relaxado. (B) e (C) Plamídeos parcialmente relaxados. Área 0,4 x 0,4 nm e escala de altura 0 a 3nm [44].

Dentro da bactéria, quanto não está em replicação, o plasmídeo se encontra no

estado super-enrolado (figura A.1 B e C). Para desenrolá-lo é necessária a utilização da

enzima topoisomeraze I, proteína que funciona como catalisador natural. Como toda

proteína, tem que ser mantida em condições ideais de tampão e temperatura para funcionar

como catalisador. No caso da topoisomeraze I, ela catalisa justamente o desenrolamento do

plasmídeo. O estado de relaxamento do plasmídeo dependerá do tempo em que o mesmo

ficou sob influência da enzima. Podemos saber quais são as populações de DNA que estão

em diferentes estados de relaxamento utilizando o gel de agarose, com a técnica conhecida

por eletroforese.

O plasmídeo apresenta carga negativa. Por isso, ao ser colocado na extremidade de

um pote de gel polarizado a –20V, ele irá se deslocar para a extremidade positiva. O gel

funciona como uma rede que dificulta a passagem de estruturas grandes. A técnica requer

uma calibração do gel que indica o quanto uma determinada quantidade de bases de DNA

linear consegue se deslocar durante um determinado período de tempo. No caso de um

plasmídeo, mesmo que relaxado, teremos sempre o mesmo número de bases. Porém temos

79

uma variação de seu tamanho quando ele é relaxado - isto fará que ele também tenha o seu

deslocamento influenciado pela presença do gel. Assim é possível estimar o estado de

relaxamento do plasmídeo (vide figura A.2) em relação ao número de bases de um DNA.

Figura A.2: Eletroforese mostrando o relaxamento de plasmídeos Bluescript com enzima Topoisomerase I. Os géis de agarose apresentam frações resultantes de incubação do DNA plasmídico por diferentes tempos a 37°C. O eixo vertical M são os marcadores, onde kb são kilo-bases de um DNA linear de vírus utilizado para caracterizar o gel. O eixo horizontal dá o tempo de ação da enzima, e a intensidade da faixa a porcentagem de plasmídeos relaxados. Neste caso, os mais plasmídeos mais relaxados são aqueles que equivalem ao maior número de bases

Para realizar uma medida no AFM, é fundamental que a amostra esteja bem fixa ao

substrato, caso contrário a ponta do AFM irá movimentar o objeto a ser medido e não

teremos a formação de uma boa imagem. Por outro lado, para que a imagem mostre a

topografia do objeto de interesse, é preciso que a superfície seja bem plana para evitar

interferência de sua rugosidade na medida.

Optamos por fixar o DNA em substratos de Si (100) (pela facilidade e experiência

em nosso grupo) e em mica, por se tratar do material mais utilizado para este fim. O Si foi

utilizado também porque a mica foi adquirida posteriormente ao início deste estudo.

A Mica é um produto mineral natural (um silicato contendo alumínio, magnésio e

potássio) com estrutura em forma de folha. A estrutura cristalina da mica confere uma

perfeita divisão basal que permite a separação em camadas ou planos uniformes e muito

finos. Estes planos são polares e ficam carregados negativamente (figura A.3 A).

80

As bases de um DNA, especificamente o fosfato, possuem cargas negativas (figura

A.3 B). Se utilizarmos uma solução MgCl2, o cátion Mg2+ irá interagir eletrostaticamente

com a superfície negativa da mica e com a carga negativa do DNA, fixando, assim, o DNA

no substrato de mica. Isto possibilita a lavagem do substrato eliminando resíduos da

solução tampão que atrapalham a imagem.

A

B

Figura A.3: (A) Figura esquemática de nucleotídeos (Base + açúcar + fosfato) de um DNA. O fosfato possui uma carga negativa em O-. (B) Figura esquemática da estrutura da mica, a linha tracejada vermelha indica onde ocorrerá a clivagem em planos. É nesta superfície que teremos cargas negativas.

Ligação de alum ioínComplexo Iônico

Plano de clivagem

Folha de Sílica

Após adquirir uma imagem, podemos ter várias estruturas que podem ser

confundidas com um DNA (respingos da solução, aglomerados das proteínas presentes na

solução, etc). Uma forma de avaliarmos se a estrutura é um DNA é comparando as suas

dimensões reais com as dimensões nominais. Dentre elas temos que a distância entre bases

nucleotídicas é de 0,34nm; uma vez que o plasmídeo Blue Script tem 2900 bases, temos

que seu perímetro é de aproximadamente 986nm. Com isso o seu diâmetro relaxado é de

313,9nm e a largura da cadeia dupla de DNA = 1,9nm (vide tabela A.1).

distância entre bases 0,34nm

perímetro 986,00nm

diâmetro 313,86nm

diâmetro da dupla hélice 1,90nm Tabela A.1: valores nominais das dimensões do DNA plasmídico Blue Script.

81

A.1.2) Procedimento Experimental:

Os plasmídeos, já relaxados com a enzima topoisomerase I, foram fornecidos pelo

grupo da Profa. Dr. Anete Pereira de Souza. Foi utilizado o plasmídeo comercial (DNA Blue

Script) e a enzima Topoisomerase I em solução para atingir o estado relaxado.

Deixamos o plasmídeo relaxando durante vários tempos diferentes entre 0 e 6h. A

viscosidade da solução sempre é a mesma, independendo do tempo de relaxamento.

Todas as medidas de AFM foram feitas com pontas cônicas de Si em modo não

contato, para danificarmos o mínimo possível as amostras.

a) Substrato de Si:

Inicialmente preparamos amostras em substratos de Si. Gotejamos 40µl da

solução com DNA em substratos de Si e utilizamos a rotação do spinner em 3, 4 ou 6.103

rpm durante 40s. Variamos também a concentração da solução em 1:1, 1:2, 1:3 e 1:4,

diluindo-a em água deionizada. Feito isto, deixamos as amostras numa estufa a 37°C

durante aproximadamente três dias para evaporar todos os resíduos da solução que

poderiam aderir à ponta do AFM e prejudicar a imagem. É importante ressaltar que acima

de 40°C ocorre a degradação da proteína.

Foram preparadas 18 amostras combinando variações de concentração e rotação

do spinner.

b) Substrato de Mica, sem MgCl2:

Durante o processo de relaxamento do plasmídeo utilizamos MgCl2, por isso

julgamos não ser necessário adicionar o MgCl2 na superfície da mica antes de depositar a

solução de DNA.

Numa superfície de mica recém clivada e limpa, gotejamos 40µl da solução de

DNA e aguardamos durante tempos diferentes (15s, 20s, 25s, 1min e 2min) para o DNA

82

precipitar e interagir com a superfície de mica. A concentração da gota da solução também

foi variada, em 1:1, 1:2, 1:3 e 1:20, diluíndo em água deionizada.

Foram preparadas 32 amostras combinando variações de tempo e diluição. Todas

foram mantidas em atmosfera de N2 por aproximadamente 1h para evaporar todos os

resíduos da solução.

c) Substrato de Mica com MgCl2:

Houve problemas na preparação da solução com DNA para esta bateria de

amostras. Pela eletroforese constatou-se que não houve relaxamento total dos plasmídeos,

apenas parcial. Mesmo assim, para testarmos a nova preparação de amostras, utilizamos

esta solução. Foi utilizada apenas a solução com tempo de relaxamento de 4h, na esperança

de encontrarmos plasmídeos relaxados.

A preparação deste substrato foi semelhante ao item anterior, exceto pelo fato de

termos clivado a mica e colocado uma gota de 20µl de MgCl2, lavado o substrato com água

deionizada, e só então ter colocado a gota de 40µl da solução de DNA. Feito isto, o

substrato foi delicadamente “lavado” N vezes com água pura e deixado secar durante 1h em

atmosfera de N2.

Foram preparadas 3 amostras variando o número de lavagens com água pura no

final para verificar como este processo influencia na retirada de resíduos nas amostras. As

amostras 1, 2 e 3 foram lavadas N = 2, 3 e 6 vezes, respectivamente.

A.1.3) Análise das imagens de AFM das amostras de DNA plasmídico.

a) Amostras preparadas no substrato de Si:

Foram obtidas imagens da superfície limpa do Si para a caracterização da

superfície (figura A.4). Destas imagens foram obtidas a rugosidade RMS e pico a pico do

Si utilizando o programa IP2.0.

83

Rugosidade Pico-a-Pico do Si (RPP) 2.8nm

Rugosidade RMS do Si (RRMS) 0.2nm

Figura A.4: Imagem feita em modo não contato pelo AFM da superfície de um substrato de Si. Analisando a imagem, obtivemos que RRMS = 0.2nm e RPP = 2.8nm.

Quando um filme da solução é formado em cima do substrato, a sua rugosidade

RMS fica em torno de 0.5nm. Conhecendo a rugosidade do Si, podemos analisar a

superfície da amostra para verificar se existe algo depositado em cima do substrato. Deste

modo, verificamos que, para rotações maiores do que 4000rpm, a gota da solução de DNA

em cima do substrato de Si era expelida da amostra independente da concentração. A

formação de filme fino foi observada para amostras com rotações menores que 4000rpm,

dependendo da concentração da solução.

Não foi possível realizar imagens AFM em todas as amostras onde se formaram

filmes finos. Apesar de seca, a solução ainda se mostrava extremamente viscosa; por este

motivo, a ponta do AFM muitas vezes aderia à superfície da amostra, impedindo a

aquisição de imagens (figura A.5A). Em outras amostras, porém, observou-se grandes

estruturas que poderiam ser grandes aglomerados de proteínas, ou cristais de um tampão

utilizado no relaxamento do DNA (tampão Tris) (vide figura A.5B). Além disso, foram

observadas estruturas com dimensões próximas às do DNA, porém com formatos que não

correspondiam às esperadas (vide figura A.6A e B).

84

A

B

Figura A.5: Imagens da amostra 8.3 (DNA 1h relaxado, concentração 1:4 e 4000rpm). (A) O arraste na imagem indica que a ponta estava aderindo à amostra, produzindo assim uma imagem de baixa qualidade. Escala de altura 0-14nm (B) Grandes aglomerados de proteína ou provenientes da solução tampão. Escala de altura 0-13nm

A

B

Figura A.6: Imagens da amostra 8.3 (DNA 1h relaxado, concentração 1:4 e 4000rpm). (A)-(0-15nm) e (B)-(0-13nm) Embora a estruturas não apresentem o formato esperado para um DNA, as dimensões correspondentes estão na mesma ordem de grandeza das dimensões de um plasmídeo. Existe a possibilidade da estrutura maior estar semi-mergulhada num filme ou conter resíduos da solução, uma vez que a rugosidade RMS na região em torno destas estruturas são RRMS~ 0,6nm. Não se pode sugerir que a estrutura seja realmente um plasmídeo.

b) Amostras preparadas em substrato de Mica sem MgCl2:

Foram obtidas imagens da superfície limpa de Mica para a caracterização inicial

da superfície (figura A.7). Destas imagens foram obtidas a rugosidade RMS e pico a pico

da Mica utilizando o programa IP2.0.

85

Rugosidade Pico-a-Pico da Mica (RPP) 2.1nm

Rugosidade RMS da Mica (RRMS) 0.1nm

Figura A.7: Imagem feita em modo não contato pelo AFM da superfície de um substrato de Mica. Imagem feita na superfície de um único plano. Analisando a imagem, obtivemos que RRMS = 0.1nm e que a RPP = 2.1nm.

Nas amostras com grande diluição em água, 1:20, não se observou nada na

superfície além da rugosidade da mica, ou seja, durante a lavagem da amostra nada foi

depositado a partir da solução.

Em amostras com diluições 1:1, 1:2, 1:3, encontramos várias estruturas bem

dispersas na superfície inclusive algumas com dimensões de DNA (vide figura A.9B). Pela

rugosidade, nota-se que as regiões mais baixas da amostra são relativas ao substrato de

mica.

86

A

B

Figura A.8: (A) Imagens da amostra 7 (DNA 50 min relaxado, concentração 1:3). Região com vários resíduos da solução. Escala de altura 0-86nm. (B) Imagens da amostra 16 (DNA 10min relaxado, concentração 1:3). Estrutura com formato semelhante a um plasmídeo superenrolado, porém com 8nm de altura. Escala de altura 0-18nm.

A

B

Figura A.9: (A) Imagem da amostra 9 (DNA 50min relaxado, concentração 1:3). Várias estruturas circulares alinhadas, como tivessem sido barradas por um degrau do plano da mica. Repare que as estruturas se sobrepõem, indicando que são estruturas individuais, e não anéis formados por uma gota seca da solução. Escala de altura 0-9nm. (B) Imagem da amostra 13 (DNA 5min relaxado, concentração 1:3). Estrutura com grande semelhança à um plasmídeo sendo relaxado. As regiões mais altas indicam nodos no “desenrolamento” do plasmídeo. Escala de altura 0-3nm.

Apesar de serem encontradas estruturas muito interessantes, de acordo com Dame

[44], com esta técnica teríamos que encontrar cerca de 1 plasmídeo por µm2, o que não

ocorreu em nenhuma das 36 amostras – mesmo quando existiam semelhanças das estruturas

com um plasmídeo.

c) Amostras preparadas em substrato de Mica com MgCl2:

Foram encontradas diversas estruturas com características semelhantes às esperadas

para as estruturas biológicas, espalhadas em várias regiões das amostras 1 e 3 (figura

A.10A e figura A.11A). Em ambos os casos, as estruturas eram lineares, indicando que não

87

houve o relaxamento. Isto está de acordo com os resultados de eletroforese para estas

amostras.

Na amostra 1 (figura A.10), nota-se que o relevo das estruturas tipo filamento não

são regulares, indicando a existência de resíduos da solução original que ligam as estruturas

lineares. Isto ocorre em menor escala para a amostra 3 (figura A.11). Este resultado indica

que as lavagens no final da preparação foram eficientes para eliminar os resíduos da

solução original, bem como diminuir a agregação das estruturas.

Na figura A.12 (A e B) é mostrado o início de relaxamento de um plasmídeo, porém

a ponta do AFM não conseguiu resolver muito bem a parte do desenrolamento. Não

descartamos a hipótese de ainda existir solução presa na parte desenrolada do plasmídeo, o

que diminuiria a resolução da imagem.

A B

Figura A.10:Amostra 1, 3 lavagens, 4h de relaxamento (A) Várias estruturas biológicas com dimensão de plasmídeo. Existem grandes partículas que provavelmente são proteínas. Escala de altura 0-11nm. (B) Ampliação de uma das estruturas biológicas, aparentemente existe algum resíduo interconectando estes filamentos. Escala de altura 0-12nm.

A B

Figura A.11: Amostra 3, 6 lavagens, 4h de relaxamento. (A) Várias estruturas biológicas em forma de fio. Provavelmente são plamídeos superenrolados. Escala de altura 0-3,5nm. (B) A ampliação de uma destas estruturas biológicas. Note que não temos tantos resíduos interligando estes filamentos. As regiões do filamento que possuem nodos são provavelmente o início de relaxamento do plasmídeo. Escala de altura 0-4,6nm.

88

Figura A.12: Amostra 3, 6 lavagens, 4h de relaxamento. (A) Imagem de um plasmídeo no início de relaxamento (parte superior direita). Escala de altura 0-2,3nm. (B) Imagem 3d do mesmo plasmídeo em que destaca mais o relaxamento. Nota-se que a ponta não resolveu bem a parte relaxada. Escala de altura 0-2,3nm.

A.2) Conclusões:

Apesar de termos conseguido formar filmes finos da solução de DNA no substrato

de Si, este não se mostrou eficiente na medição dos plasmídeos. Muitos resíduos da solução

permaneciam na amostra causando a adesão da ponta na superfície, além de esconder as

estruturas biológicas.

Nas amostras em substratos de Mica sem o MgCl2, encontramos estruturas

interessantes nas amostras porém com muita baixa freqüência. Estas estruturas não estavam

sendo bem aderidas ao substrato.

As amostras bem sucedidas foram as realizadas com substrato de Mica tratado com

MgCl2. Foram encontradas várias estruturas biológicas em diversas partes das amostras.

Podemos melhorá-las lavando-as mais vezes depois da preparação para eliminar alguns

poucos resíduos que sobraram, além de usarmos pontas de AFM com CNT para

melhorarmos a resolução espacial.

No substrato de mica, plasmídeos relaxados, individualmente ou em conjunto,

foram observados. Os resultados desta análise possibilitam caracterizar as condições das

diferentes formas de DNA plasmídico (linear, circular relaxado e superenrolado).

89

Bibliografia

[1] D.P.E.Smith, Rev.Sci.Instr. 66: 3191 (1995)

[2] R.J.Colton, Procedures in Scanning Probe Microscopy; Wiley & Sons, New York,

(1996)

[3] C.D.Frisbie, L.F.Rosznyai, A.Noy, M.S.Wrighton e C.M.Lieber, Science 265: 2071

(1994)

[4] A.Noy, D.V.Vezenov e C.M.Lieber, Annu.Rev.Mater.Sci. 27: 381 (1997)

[5] S.Biggs e P.Mulvaney, J.Chem.Phys. 100: 8501 (1994)

[6] A.Noy, C.D.Frisbie, L.F.Rosznyai, M.S.Wrighton e C.M.Lieber, J.Am.Chem.Soc.

117: 7943 (1995)

[7] A.Noy, C.H.Sanders, D.V.Vezenov, S.S.Wong e C.M.Lieber, Langmuir 14: 1508

(1998)

[8] J.B.D.Green, M.T.McDermott, M.D.Porter e L.M.Siperko, J.Phys.Chem. 99: 10960

(1995)

[9] M.Rief, M.Gautel, F.Oesterhelt, J.M.Fernandez e H.E.Gaub, Science 276: 1109

(1997)

[10] P.Hinterdorfer, W.Baumgertner, H.J.Gruber, K.Schilcher, H.Schindler, Proc. Nat.

Acad. Sci.USA 93: 3477 (1996)

[11] J.H.Hafner, C.-L.Cheung, A.T.Woolley e C.M.Lieber, Progr.Biophys.Mol.Biol. 77:

73 (2001)

[12] H.R.Gutiérrez, D.Nakabayashi, P.C.Silva, J.R.R.Bortoleto, V.Rodrigues, J.H.Clerici,

M.A.Cotta e D.Ugarte, comunicação oral no II Latin American Symposium on Scanning

Probe Microscopy, Búzios, Abril/2003

[13] H. R. Gutiérrez, M. A. Cotta, D. Ugarte, Phys. Stat. Sol. A 201(5):888–893 (2004)

[14] Israelachvili J.; Intermolecular and Surface Forces. New York: Academic (1992)

[15] Grigg DA, Russell PE, Griffith JE.; J. Vac. Sci. Technol. A 10:680 (1992)

[16] Green J-B, McDermott MT, Porter MD, Siperko LM.; J. Phys. Chem.99:10960

(1995)

[17] Thomas RC, Tangyunyong P, Houston JE, Michalske TA, Crooks PM.; J. Am.

Chem. Soc. 98:4493 (1995)

90

[18] Weisenhorn AL, Hansma PK, Albrecht TR, Quate CF.; Appl. Phys. Lett. 54:2651

(1989)

[19] Drake B, Prater CB, Weisenhorn AL, Gould SAC, Albrecht TR, et al.; Science

243:1586 (1989)

[20] Vesenka J, Mosher C, Schaus S, Ambrosio L, Henderson E.; BioTechniques 19:240

(1995)

[21] Shao Z, Yang J.; Q. Rev. Biophys. 28:195 (1995)

[22] Cleveland JP, Manne S, Bocek D, Hansma PK.; Rev. Sci. Instr. 64:403 (1993)

[23] Hutter JL, Bechhoefer J.; Rev. Sci.Instr. 64:1868 (1993)

[24] Senden TJ, Ducker WA.; Langmuir 10:1003 (1994)

[25] Sader JE, Larson I, Mulvaney P, White LR.; Rev. Sci. Instr. 66:3789 (1995)

[26] Warmack RJ, Zheng XY, Thundat T, Allison DP.; Rev. Sci. Instr. 65:394 (1994)

[27] Neumeister JK, Ducker WA.; Rev. Sci. Instr. 65:2527 (1994)

[28] Sader JE.; Rev. Sci. Instr. 66:4583 (1995)

[29] Dror Sarid, Scanning Force Microscopy; With Application to Electric, Magnetic,

and Atomic Forces (Oxford Series on Optical Sciences, Oxford University Press, Oxford,

1991)

[30] Xianguo Chen; Virginia Polytechnic Institute and State University; Master of

Science; September, (1998)

[31] Lieber, Charles M.; Chemical Force Microscopy; Annu Ver. Mater. Sci.; 27:381

(1997)

[32] Adamson, Arthur W.; Physical chemistry of surface; New York : J. Wiley, (1990)

[33] Williams D.B.; Carter C. B.; Transmission Electron Microscopy; Plenum Press, New

York and London-(1996)

[34] P.R.Thornton; Scanning Electron Microscopy, Applications to materials and device

science, Chapman and Hall Ltd, (1968)

[35] Andrew Zangwill, Physics at Surfaces (Cambridge Univ. Press, 1988)

[36] Tormoen, G. W; Drelich, J.; J. Adhesion Sci. Technol., 18 (1):1–17 (2004)

[37] Vicaro KO, Cotta MA, Gutierrez HR, Bortoleto JRR; Nanotechnology 14 (5): 509-

514 (2003)

91

[38] Página na internet: Environmental Chemistry

http://environmentalchemistry.com/yogi/periodic

[39] Hafner J.H., Cheung C.-L., Woolley A.T. e Lieber C.M., Progr.Biophys.Mol.Biol.

77:, 73 (2001)

[40] Nakabayashi, D. B.; e D.Ugarte; Caracterização e Manipulação de nanoobjetos

individuais por experimentos in situ de Microscopia Eletrônica; Tese de Doutorado ainda

não defendida; IFGW/UNICAMP;

[41] Vuolo J.H., Fundamentos da Teoria de Erros, Editora Edgard Blücher Ltda. (1991)

[42] Burnham N A, Colton R J and Pollock H M; Nanotechnology 4:64-80 (1993)

[43] Strunz T., Oroszlan K.; Proc. Natl. Acad. Sci; 96:11277-11282, September (1999)

[44] Dame, Remus Thei; H-NS mediated compaction of DNA visualised by atomic force

microscopy. Nucleic Acids Research; 28:18 (2000)

[45] Gutiérrez H. R., Cotta M. A., Ugarte D., Phys. Stat. Sol. A 201(5):888–893 (2004)

[46] Fowkes, F. M. J. Phys. Chem.; 66:682 (1962)

[47] Tabor D., R.H.S. Winterton, Proc. R. Soc. London Ser. A312:435, (1975)

[48] Pimentel, G. C.; McClellan, A. L. The Hydrogen Bond; W. H. Freeman and Co.: San

Francisco; Chapter 7 (1960)

[49] Klapetek P. and Ohlídal I., Ultramicroscopy; 94:19 (2003).

[50] Alexandre Berquand, Yves F. Dufreˆne*, Langmuir , 21:5517-5523 (2005)

[51] Kuhn M, Janovjak H, Hubain M, Muller DJ; Journal of Microscopy; 218: 125-132

Part 2, (2005)

[52] Idiris A, Kidoaki S, Usui K, Maki T, Suzuki H, Ito M, Aoki M, Hayashizaki Y,

Matsuda T; Biomacromolecules; 6 (5): 2776-2784 (2005)

[53] Higgins MJ, Riener CK, Uchihashi T, Sader JE, McKendry R, Jarvis SP;

Nanotechnology 16 (3): S85-S89 (2005)

[54] C. Stroh, P. Hinterdorfer; PNAS; 101 (34); 12503-12507; (2004)

[55] Crabtree R. H., Siegbahn E. M., Eisenstein O., Rheingold A. L., Koetzle T. F.; A

New Intermolecular Interaction: Unconventional Hydrogen Bonds with Element-Hydride

Bonds as Proton Acceptor; Acc. Chem. Res., 29(7), 348 – 354, (1999)

92