universidade do vale do paraíba instituto de pesquisa e ...§ão do efeito anti... · elisa...

Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Elisa Celeste Dreux

“Avaliação do efeito antiinflamatório do extrato hidroalcoólico de Vernonia scorpioides (Lam) Persoons em inflamação aguda”.

“Antiinflamatory effects of hidroalcoholics extract of Vernonia scorpioides (Lam)

Persoons in acute inflammation”.

São José dos Campos, SP 2005

Elisa Celeste Dreux

“Avaliação do efeito antiinflamatório do extrato hidroalcoólico de Vernonia scorpioides (Lam) Persoons em inflamação aguda”.

“Antiinflamatory effects of hidroalcoholics extract of Vernonia scorpioides (Lam)

Persoons in acute inflammation”.

Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.

Orientador: Prof. Dr. José Carlos Cogo. Co-orientador: Prof Dr Rodrigo A. Martins

São José dos Campos, SP 2005

... Aos meus pais Denis e Arlete que através de exemplos de integridade, sabedoria, amor e

compreensão me apoiaram e incentivaram em todos os momentos de minha vida.

... Ao Beto e minha filha Priscille por tudo que representam em

minha vida e pela compreensão nos momentos difíceis e de

ausência.

... ofereço este trabalho.

... ao Professor José Carlos Cogo

pela orientação, pelo seu profissionalismo e seriedade na pesquisa,

pelo respeito e credibilidade na minha pessoa, me incentivando e

ajudando-me nos momentos necessários.

... A amiga Ana Maria Barbosa por me ensinar algumas

técnicas na realização desta pesquisa e pelo companhei-

rismo indispensável em todos os momentos necessários.

... meu reconhecimento e consideração.

Agradecimentos - Ao Prof Dr Wellington Ribeiro pelos conselhos, trocas de idéias e incentivos na

realização desta pesquisa, permitindo o livre acesso ao laboratório de fisiologia e

farmacodinâmica;

- Ao Prof Dr Rodrigo A. Martins pela co-orientação durante a realização desta

pesquisa;

- Ao Prof Mestre Luiz Eduardo Cardozo que orientou sobre a produção do extrato.

- Ao Prof Dr Milton Beltrame por auxiliar na elaboração do extrato utilizado na

pesquisa, permitindo a utilização do Laboratório de química e os equipamentos

necessários;

- As técnicas Carolina e Érica do laboratório de química orgânica que me apoiaram e

auxiliaram para que o extrato ficasse pronto em tempo hábil, me ensinando a

manipular os aparelhos e me auxiliando nos momentos difíceis;

- Á Rebeca da Biblioteca do IP&D que viabilizou grande parte dos pedidos de

inúmeros “papers” e teses para a realização desta pesquisa;

- Ao Prof Dr Stephen Hyslop pela liofilização do extrato no laboratório do

Departamento FCM - Unicamp;

- Á Carol do Laboratório de Histologia da Odontologia (Univap) pela oportunidade

de confeccionar as lâminas histológicas e o ensinamento das técnicas pertinentes

para a realização das mesmas;

- Á Fernanda por me auxiliar na confecção das lâminas histológicas;

- A amiga e Mestre Tatiana V. Mendes pelo incentivo nos momentos difíceis e o

contato com o laboratório da odontologia para a confecção das lâminas histológicas;

- À Tatiana, Carli, Andréia Delu; Roberta, Catarina pelo companherismo constante

no laboratório de Fisiologia e Farmacodinâmica durante a realização dos

experimentos;

- Ao amigo e Mestre Luiz Prudêncio e Silvana pelo apoio, amizade e lucidez que me

ofereceram nas várias etapas desta pesquisa;

- Ao Amigo e Mestre Antonio Carlos Prianti, pela presença, orientação, incentivo e

amizade dispensada durante toda a pesquisa;

- Ao Giordano, pela importante ajuda na leitura das lâminas me auxiliando na

diferenciação das células mononucleares;

- Ao André Luiz de Toledo, pela ajuda e o empenho na finalização da dissertação me

auxiliando nos recursos gráficos e técnicas apropriadas de computação;

- A Rosangela Regis Cavalcanti Taranger, pela revisão final da dissertação e a

delicadeza em me orientar nos erros e na finalização da dissertação;

- Aos meus amigos e vizinhos Naiara e Davis pelo apoio e empenho na parte gráfica

e recursos do computador;

- Á todos professores, amigos e funcionários do IP&D que me ajudaram nos

momentos em que necessitei de apoio e orientação.

“Que se permita atodas as coisasfazerem o que elasnaturalmente fazem, demodo que a sua naturezafique satisfeita”

Chuang- Tse

RESUMO

A espécie vegetal Vernonia scorpioides (Lam) Persoons (Asteraceae) (Piracá), é utilizada popularmente no Vale do Paraíba (SP) como agente antiiflamatório na forma de extratos fluidos preparados empiricamente com álcool e folhas do vegetal no tratamento de processo edematogênicos. Com o objetivo de investigar a atividade antiinflamatória de Vernonia scorpioides em inflamação aguda, foi preparado o extrato hidroalcoólico de folhas e flores da espécie vegetal, realizando-se os seguintes testes: - Edema de pata em ratos induzido por carragenina e histamina; - Peritonite em camundongos induzido por carragenina; - Análise histológica do músculo plantar dos ratos após 4 horas da indução do edema de pata por carragenina. No teste de edema de pata em ratos por carragenina (1mg/pata), determinou-se as curvas doses respostas do extrato de Vernonia scorpioides para as doses de 0,45, 0,67 e 1g/Kg, comparados ao diclofenaco sódico (10 mg/Kg) (i.p), adotando-se os tratamentos de 30 minutos antes, tratamento imediato e tratamento 30 minutos após a indução do edema. No teste de edema de pata em ratos induzido por histamina (50µg/pata), foi utilizada a dose única de 0,45g/Kg (i.p) comparado ao Fernegan (cloridrato de prometazina) (4mg/Kg) adotando-se os tratamentos de 15 minutos antes; tratamento imediato e tratamento 15 minutos após a indução do edema. No modelo de peritonite em camundongos induzida por carragenina (600µg/cavidade), utilizou-se as doses de 0,45, 0,67 e 1g/Kg do extrato comparados ao diclofenaco sódico (10 mg/Kg) (v.o); 30 minutos após a indução de peritonite. O extrato inibiu o edema por carragenina e histamina em todos os tratamentos realizados com resposta diferenciada das doses adotadas. No edema de pata induzido por carragenina o tratamento realizado 30 minutos antes, a melhor dose foi de 1 g/Kg que reduziu o edema em 32%, 51%,45% e 42% após 1, 2, 3 e 4 horas respectivamente; para o tratamento imediato, todas as doses inibiram o edema sem apresentar diferença significativa entre elas, mas de forma superior ao diclofenaco; no tratamento 30 minutos após a melhor dose foi a de 0,45g/kg que reduziu o edema em 30%, 60% 55% e 60 % respectivamente após 1, 2, 3 e 4 horas respectivamente. Em edema de pata induzido por histamina o melhor resultado foi o realizado 15 minutos após onde o extrato apresentou ação semelhante ao fernegam, reduzindo o edema em 30%, 60%, 55% e 40 % após 0,5, 1, 1,5 e 2 horas respectivamente; nos demais tratamentos, o extrato inibiu o edema mas não foi mais eficiente que o fernegan. Em peritonite induzida por carragenina a melhor dose foi a de 1g/kg em relação a contagem total e diferencial com resultados semelhantes ao diclofenaco. A análise histológica do músculo plantar dos ratos realizada 4 horas após a indução do edema por carragenina confirmou a diminuição do edema e do infiltrado leucocitário em todas a doses utilizadas.Baseados nos resultados obtidos podemos concluir que o extrato de Vernonia scorpioides possui ação antiiflamatória nos modelos de inflamação aguda testados. Palavras chave: Extrato, Vernonia scorpioides , Edema de pata, peritonite, inflamação.

Abstract

Ethanolic extracts and the leaves of Vernonia scorpioides (Lam) Persons (Compositae), a plant commonly known in Brazil as piracá, are widely used to treat inflammation and edema. In this work, we examined the antiinflammatory activity of a lyophilized ethanolic extract of the leaves and flowers of V. scorpioides on rat paw edema induced by carrageenan (1 mg/paw) and histamine (50 µg/paw), and on peritonitis induced by carrageenan. The histological alterations in paws injected with carrageenan were also assessed. Administration of three doses of this extract (0.45, 0.67 and 1 g/kg) 30 min before the agonists markedly reduced the subsequent edema, although this inhibition was not as effective as that seen with sodium diclofenac (10 mg/kg); an extract dose of 1 g/kg had an effect similar to that of diclofenac, and reduced the edema by 31%, 51%, 45% and 48% after 1, 2, 3 and 4 h, respectively. Inhibition of edema was also seen when the extract was give 30 min after the agonists, with the most effective dose being 0.45 g/kg, which reduced the edema by 48%, 44%, 50% and 60% after 1, 2, 3, and 4 h, respectively; the other doses produced effects similar to that of diclofenac. When given immediately after the agonists, all doses of the extract also inhibited the edema to an extent similar to that seen with diclofenac. A single dose of extract (0,45 mg/kg) also inhibited the edema induced by histamine when given 15 min before, 15 min after or immediately after the agonist. The greatest inhibition was seen when the extract was given 15 min after the agonist, with reductions of 30%, 60%, 55% and 40% after 0.5, 1.0, 1.5 and 2 h, respectively; these decreases were similar to that seen with promethazine (4 mg/kg). In carrageenan (600 µg/cavity)-induced peritonitis, the same doses of extract as used for paw edema reduced the leucocyte migration when given 30 min after the agonist. The most effective dose of extract was 1 g/kg, with reductions of 39%, 29%, 18% and 43% after 1 ,2, 3 and 4 h, respectively, which was similar to that seen with diclofenac (1 g/kg). The most effective doses against neutrophil migration were 0.45 g/kg and 1 g/kg (27% inhibition at all time intervals), whereas the most effective doses against mononuclear migration were 0.67 and 1 g/kg, both of which were similar to diclofenac. Histological analysis of the effects of the extract 4 h after the induction of edema with carrageenan showed a reduction in the amount of edema and a decrease in leucocyte infiltration compared to mice receiving carrageenan alone. Together, these results indicate that the ethanolic extract of V. scorpioides has an antiinflammatory action in experimental models of acute inflammation. Key words: Ethanolic extract, inflammation, peritonitis, rat paw edema, Vernonia scorpioides.

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Vernonia scorpioides (Lam) Persons. (A) aspecto geral do hábito

vegetativo; (B) receptáculo floral; (C) Detalhes do botão floral; (D) semente.

04

Figura 2: Fotografia da espécie Vernonia scorpioides (Lam) Persons, detalhe das

folhas adultas e do botão floral.

06

Figura 3: Seqüência dos eventos leucocitários na inflamação. 11

Figura 4: Geração de metabólitos do ácido aracdônico e seus papéis na inflamação 14

Figura 5: Fotografia do pletismógrafo. 21

Figura 6: Fotografia ilustrando a realização da medição do volume da pata de ratos

através do uso do pletismógrafo

22

Figura 7: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos

inoculados com carragenina (1000 µg/pata). Os animais foram tratados 30

minutos antes (i.p) após a aplicação do estímulo.

29


inoculados com carragenina (1000 µg/pata). Os animais foram tratados (i.p)

30 minutos após a aplicação do estímulo.

31


inoculados com carragenina (1000 µg/pata). Os animais foram tratados

imediatamente (i.p) após a aplicação do estímulo.

32

Figura 10: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos

inoculados com Histamina. Os animais foram tratados 15 minutos antes da

aplicação do estímulo.

34

Figura 11: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos ) em ratos

inoculados com histamina. Os animais foram tratados imediatamente após a


35

Figura 12: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos ) em ratos

inoculados com histamina. Os animais foram tratados 15 minutos após da


36

Figura 13: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45

g/Kg; 0,67g/Kg e 1 g/Kg sobre o processo inflamatório em modelo

experimental de Peritonite em camundongos induzido por carragenina

comparados aos grupos controle (salina e carragenina e tratamento com

diclofenaco sódico ), observando o nº de Leucócitos Totais migrantes para a

cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1,2,3 e 4 horas após a

indução da inflamação.

39




comparados ao grupos controle (salina e carragenina e tratamento com

diclofenaco sódico , observando o nº de Neutrófilos migrantes para a

cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1,2,3 e 4 horas após a

indução da inflamação.

40




comparados ao grupos controle (salina e carragenina e tratamento com

diclofenaco sódico), observando o nº de células mononucleares migrantes

para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1,2,3 e 4 horas

após a indução da inflamação.

41

Figura 16: Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle salina A:

Aumento de 100x. B: aumento de 400x.

44

Figura 17: Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo carragenina. A:

Aumento de 100x. B: Aumento de 400x.

45

Figura 18: Fotomicrografia do grupo diclofenaco sódico.A: Aumento de 100x. B:

Aumento de 400x.

46

Figura 19: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose de

0,45g/kg do extrato de V. scorpioides. A: Aumento de 100x. B: Aumento

de 400x.

47


0,67g/kg do extrato de V. scorpioides A: Aumento de 100x. .B:Aumento

de 400x.

48


1,0g/kg do extrato de V. scorpioides. A: Aumento de 100x.B:

Aumento de 400x.

49

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Porcentagem de inibição nº de Leucócitos Totais migrantes para a

cavidade peritonial comparados com o grupo carragenina e os tratamentos

por diclofenaco sódico e o extrato.

42

Tabela 2: Porcentagem de inibição nº de neutrófilos migrantes para a cavidade

peritonial comparados com o grupo carragenina e os tratamentos por

diclofenaco sódico e o extrato.

42

Tabela 3: Porcentagem de inibição nº de neutrófilos migrantes para a cavidade

peritonial comparados com o grupo carragenina e os tratamentos por

diclofenaco sódico e o extrato.

42

SUMÁRIO 1-Introdução 01

1.1 – Fitoterapia 01

1.2 - A Família Asteraceae 02

1.3 - Considerações Gerais sobre Vernonia scorpioides 03

1.4 - Aspectos vasculares e celulares da reação inflamatória aguda 09

1.4.1 - O processo inflamatório. 09

1.4.2 - Os mediadores da inflamação 12

1.4.3 – Inflamação experimental 16

2 – Objetivos 17

3 - Material e métodos 18

3.1 – Aprovação pelo comitê de ética 18

3.2 – Animais 18

3.3 – Protocolo de eutanásia 18

3.4 – Obtenção do extrato 19

3.4.1 – Coleta do material vegetal 19

3.4.2 – O processo extrativo 19

3.5 – Avaliação farmacológica – via intraperitonial 20

3.5.1 – Edema de pata induzido pela carragenina 20

3.5.2 – Edema de pata induzido pela histamina 24

3.6 – Análise histológica 25

3.7 – Avaliação farmacológica – via oral 25

3.7.1 - Peritonite 25

4 - Resultados 28

4.1 – Avaliação farmacológica – via intraperitonial 28

4.1.1 – Edema de pata induzido pela carragenina 28

4.1.2 – Edema de pata induzido pela histamina 33

4.2 – Peritonite induzida pela carragenina 37

4.2.1 – Resultados da migração celular 37

4.3 – Estudo histológico 43

5 - Discussão 50

6 – Conclusão 56

Referências Bibliográficas 57

Anexos 66

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Fitoterapia A fitoterapia constitui uma forma de terapia medicinal que cresceu notadamente

nestes últimos anos, ao ponto que atualmente o mercado mundial de fitoterápicos gira em

torno de aproximadamente 22 milhões de dólares. O Brasil não se destaca no mercado

mundial de fitoterápicos apesar de possuir uma extensa e diversificada flora (detendo

aproximadamente um terço da flora mundial) ficando inclusive atrás de países menos

desenvolvidos tecnologicamente. No entanto, no Brasil desenvolve-se um grande número

de pesquisas que têm contribuído significativamente para o desenvolvimento da química de

produtos naturais de plantas (YUNES et al., 2001).

Existem muitos setores da sociedade que desenvolvem programas de assistência

fitoterápica baseados nas práticas e saberes populares, tradicionalmente transmitidos, sobre

o uso de plantas. Muitos desses programas, assentados em bases não científicas, contribuem

para agravar o problema social do uso indiscriminado de medicamento. Apesar de se

reconhecer a legitimidade do conhecimento tradicional, uma planta para ser usada em

qualquer atividade ou programa de fitoterapia deve ser cientificamente validada

(ABULQUERQUE et al., 2004).

Carline (1983) propõe que o estudo farmacológico de extratos de plantas brasileiras

conste de três etapas. Primeiramente, os testes farmacológicos devem ser realizados ao

acaso, preferencialmente com vegetais utilizados na medicina popular; comprovando sua

atividade, parte-se para o fracionamento do extrato bruto e para testes farmacológicos das

respectivas frações; a seguir, realiza-se estudo farmacológico detalhado de substâncias

ativas, eventualmente obtidas em estado puro.

Segundo Bachi (1988), Davino (1989), o extrato bruto com ação farmacológica

comprovada e baixa toxicidade podem ser utilizados na terapêutica com vantagens sobre

substâncias puras dele isoladas. A atividade terapêutica do extrato bruto deve-se muitas

vezes, a um conjunto de substâncias com ação sinérgica que contribui para a obtenção de

melhores resultados do que com os compostos isolados.

2

Do ponto de vista de saúde pública é de extrema importância que haja uma avaliação

farmacológica de plantas e preparações utilizadas pela população com propriedades

medicinais.

Há no Brasil, inúmeras famílias botânicas bem representadas em número de táxon e

estudadas entre as quais destacam-se a família dos Compositae (Asteracae) devido ao seu

grande uso popular e grande variedades de espécies freqüentemente citadas em

levantamentos etnobotânicos, podendo citar como exemplos a “Camomila” (Matricaria

chamomila L.), a “Carqueja” (Baccharis trimera Less.), “ erva doce” (Stevia rebaudiana

Ber), “Guaco” (Mikania glomerata) entre outras (MENDES, 2001).

No Vale do Paraíba destaca-se a espécie vegetal “Piracá”, Vernonia sp; que

apresenta ampla distribuição entre a vegetação nativa nos quintais das residências, sendo

utilizada popularmente na forma de infusões para tratamento de edemas e traumatismos.

1.2 A Família Asteraceae

A espécie Vernonia scorpioides (Lam) Persons pertence a família das Compositae

(Asteraceae), que reúne cerca de 1.100 gêneros (180 no Brasil) com aproximadamente

2.500 espécies, de ampla distribuição, sendo a família com maior número de espécies entre

as dicotiledôneas, com inúmeras propriedades farmacológicas devido a grande variedades

de metabólicos secundários por elas produzido (CUNHA, 1989).

Os constituintes químicos mais encontrados entre as espécies desta família são os

terpenos, flavonóides e poliacetilenos, enquanto que as lactônas sesquiterpênicas constitui o

componente químico que desencadeia grande parte da atividade farmacológica dessas

plantas ( DAVINO, 1989; FREIRE, 1996; LOPES, 1991).

Entre as atividades biológicas atribuídas as espécies desta família cita-se a ação

citotóxica tumoral, antibiótica, inibidora de penetração de cercarias de Schitossoma

mansoni, atividade desistimulante de apetite de insetos, alergênica, ação tóxica nos

vertebrados, alelopática ,fungicida, antielmíntica, atividade antiinflamatória

(DAVINO,1989), moluscida (LOPES, 1991).

Entre as 13 tribos que compõem a família Asteraceae, destaca-se a tribo Vernoniae,

uma das mais numerosas, com cerca de 70 gêneros e aproximadamente 1500 espécies. A

3

tribo Vernoniae tem uma distribuição pan tropical, ocorrendo na América, África, Ásia e

Austrália. Reconhece-se dois centros de dispersão do gênero, um no sudeste do Brasil e

outro na África. A tribo presente no Brasil contém 40 gêneros e entre eles o gênero

Vernonia (CUNHA, 1989).

O gênero Vernonia contém cerca de 1000 espécies encontradas nos trópicos do

velho e novo mundo. No Brasil é bastante disseminado, ocorrendo pelo menos 200

espécies, cujo porte pode ser herbáceo, arbustivo e aéreo (HARBONE, 1977).

A variação do aspecto morfológico e vegetativo de suas espécies é extensa; os

caracteres florais são relativamente uniformes (KELEY, 1979).

1.3 Considerações gerais sobre Vernonia scorpioides

Vernonia scorpioides conhecida em algumas regiões do Brasil por Erva-de Preá,

Erva de São Simão, Capichingui-de-bicho, Enxuga, Piracá encontra-se distribuída

geograficamente pelos continentes: Europeu, Asiático, Africano e Americano, e foi

espalhada pela ação do homem. É cultivada em vários países tropicais e alguns

subtropicais.

É uma espécie perene, subarbustiva, bastante ramificada, caule lanuginoso-

pubescente, medindo entre 1 e 2 metros de altura, com reprodução por sementes e por

estaquia. As folhas são alternadas, membranáceas, glabas na face superior e cerício-pilosa

na inferior, pecioladas medindo 6-12 centímetros de comprimento e 3-6 cm de largura. As

inflorecências são terminais, em cimeiras escorpiódes de capítulos sésseis. As flores são

violáceas em números de 20 a 30 por capítulo (LORENZI, 1982) (Figura 1).

A espécie Vernonia scorpioides apresenta a seguinte classificação botânica:

Divisão: Angiospermae

Classe: Dicotyledonea

Sub classe: Asteridae

Ordem: Asterales

Família: Composite Giseke (Asteraceae)

Sub família: Asteróide

Gênero: Vernonia

Espécie: Vernonia scorpioides

4

Figura 1: Esquema Vernonia scorpioides (Lam) Persons. (A) Aspecto geral do hábito vegetativo;

(B) receptáculo floral; (C) Detalhes do botão floral; (D) Semente (Fonte: CABRERA, 1980).

5

No que se refere à anatomia, Carvalho et al., 1884 descreveram a presença de

células de transferência do tipo a em V. scorpioides, ou seja, células companheiras,

altamente especializadas, apresentando projeções parietais, citoplasma denso e numerosas

mitocôndrias caracterizadas por suas cristas abundantes e conspícuas, agrupadas

densamente.

Vernonia scorpioides (Lam) Persons, foi descrita pela primeira vez como Conyza

scorpioides Cass. Essa espécie possui diversas sinonímias, entre elas:

* Chrycossoma reponda Well

* Lepidoploa scorpioides Cass

* Cacalia scorpioides O Huntze

* Vernonia centrioflora Link

* Vernonia flavescens Less

É uma erva comum da vegetação secundária da encosta Atlântica e da Floresta

Latifoliada do alto do Uruguai, no extremo oeste Catarinense, apresentando, portanto área

de dispersão a América Central, desde a Nicarágua até o nordeste da Argentina

(CABRERA, 1980).

No Brasil, apresenta extensa distribuição geográfica, sendo encontrada desde o

Ceará até o Rio Grande do sul, como também no Centro-oeste (MS e MT) (CORREA,

1984).

É uma planta que exige plena luz suportando bem o sol intenso do verão, preferindo

solos argilo-arenosos, não necessariamente férteis, mas drenados (espécie seletiva

higrófita), nestas condições costuma florescer de junho a outubro (CABRERA, 1980). No

entanto, quando encontrada em áreas sombrias e úmidas (planície litorânea) floresce nos

meses de setembro a fevereiro (CORREA, 1984).

A espécie é de fácil cultivo sendo que as partes do vegetal empregadas em medicina

popular são preferencialmente as folhas (Figura 2).

6

Figura 2: Fotografia da espécie Vernonia scorpioides (Lam) Persons, detalhes das folhas adultas e

do botão floral (Dreux, 2004, Bairro dos Freitas - SJC – SP)

Na terapêutica popular e em levantamentos etnobotânicos encontram-se algumas

indicações do uso de V. scorpioides como por exemplo, infecções do estômago (úlceras)

(chás), edemas provocados por traumatismos e agentes infecciosos (Infusão), efeito

sedativo (chás), cura de hemorróidas e leucorrérias (banho das partes afetadas), cura de

desinterias (chás).

Na literatura podemos encontrar estudos farmacológicos realizados com

V. scorpioides onde:

Lopes (1991) verificou a ação desestimulante de apetite em insetos (antifeedant)

contra Locrusta migratória (defesa da planta contra atividade predadora de insetos

herbívoros).

Freire et al., (1996) verificou a existência de propriedades antifúngicas dos extratos

obtidos de folhas e caules de V. scorpioides para Penicilium citrinus. O desenvolvimento

de hifas no meio da cultura, testado na presença dos extratos hexânico e clorofórmicos

7

mostraram-se insipientes, além de formar halos de inibição significativos. Os extratos de

folhas frescas também apresentaram efeitos semelhantes, embora de menor intensidade,

obtendo halos de inibição para Aspergillus alutaceos. Os autores relacionaram a atividade

observada a provável produção de lactonas sesquiterpênicas indicadas pela observação de

sinais característicos do estiramento de carbanilas lactânicas ativas com obsorção entre

1750 nm e 1770 nm no espectro de infravermelho.

Leite et al., (2002) investigaram a atividade de cicatrização a partir do extrato

etanólico de folhas de V. scorpioides comprovando que o tratamento não acelera o tempo

de fechamento do ferimento mais contribui para o processo de regeneração e organização

do novo tecido.

Alguns autores também realizaram estudos referentes a composição fitoquímica de

V. scorpioides como:

Drew et al., (1980) isolaram e identificaram das partes aéreas desta planta um novo

germacranolídeo que foi denominado escorpioidina.

Warning et al., (1987) isolaram e identificaram em partes aéreas de V. scorpioides

um novo tipo de lactona sesquiterpênica denominada escorpiolídeo.

Gomes et al., (1987) descreveram a estrutura em raio-X de 6 - deoximikanokryptin,

um novo guaianolide de V. scorpioides (Lam) Pers.

Andreucci (2002) verificou e descreveu a presença dos princípios ativos presentes

no extrato hidroalcólico de V. scorpioides tais como: alcalóides, flavonóides, taninos,

saponinas e óleo essencial através da análise química qualitativa do extrato de

V. scorpioides.

Freire (2000) isolou e quantificou pela primeira vez um triterpeno, o acetato de

lupeol através de métodos fitoquímicos clássicos. O método de detecção foi estabelecido a

partir de anticorpos antiacetato de lupeol (anti-L Ac). Foram realizados ensaios de Elisa de

captura, segundo a metodologia clássica para a quantificação de haptenos. A maior

concentração de acetato de lupeol foi encontrada nas raízes na casa de vegetação, e na parte

aérea (principalmente no caule) das plantas silvestres, sugerindo existir uma relação entre a

idade das plantas analisadas e o sítio de produção desta susbstância.

Mendes (2001) isolou compostos terpenoidais a partir da fração clorofórmica, de V.

scorpioides por cromatografia em camada delgada preparativa e identificada por

8

espectroscopia de RMN de 1H e de 13C. O lupeol e seus derivados lupenona e acetil lupeol

revelaram ter atividade sobre a produção de anticorpos em especial os das classes IgM e

IgG2a. O acetil lupeol apresentou atividade antitumoral, enquanto que o lupeol foi

ineficiente. Já o acetil lupeol inibiu a rejeição aguda a transplantes alogênicos de pele em

camundongos. Os ensaios microbiológicos realizados com o extrato bruto metanólico de V.

scorpioides não inibiu o crescimento dos microrganismos testados; o extrato metanólico

bruto como a fração clorofórmica de V. scorpioides induziu inibição do número de células

secretoras de anticorpos IgM em animais imunizados com antígenos T dependente.

Embora V. scorpioides seja potencialmente importante por suas propriedades

medicinais, permanece pouco estudada quanto a sua padronização no sentido de

proporcionar o controle de qualidade na produção de fitoterápicos. Suas atividades

biológicas e farmacológicas também necessitam ser estudadas com maior profundidade

pois praticamente não existem.

9

1.4 Aspectos Vasculares e Celulares da reação inflamatória aguda:

1.4.1 O Processo inflamatório

A inflamação é uma resposta do organismo a um trauma, cuja característica

fundamental é a de se manifestar de maneira esteriotipada, independente da natureza do

agente lesivo; caracterizando-se por alterações morfofuncionais da microcirculação na área

lesada envolvendo células, tecidos, vasos sanguíneo, e linfáticos. As alterações

estereotipadas podem ser determinadas pela intensidade ou persistência da injúria,

característica do órgão ou tecido atingido e pela capacidade de reação do organismo

(PEGORARO, 1994).

Desde Celsus (contemporâneo de Cristo) que se caracteriza a inflamação por quatro

sinais cardinais “rubor, calor, tumor e dor”. Virchow, no século XIX, acrescentou um

quinto sinal a perda da função (MONTENEGRO et al., 1999).

Desta forma, a inflamação é um processo multimediado e seus sinais e sintomas

podem ser definidos como a expressão dos efeitos da mobilização endógena de mediadores

que atuam localmente (DI ROSA et al., 1971).

A resposta inflamatória ocorre no tecido conjuntivo vascularizado, inclusive no

plasma, nas células circulantes, nos vasos sanguíneos e nos componentes extravasculares

do tecido conjuntivo (COTRAN et al., 1996).

Uma resposta inflamatória, entretanto pode ser transitória ou aguda, com predomínio

de alterações vasculares exudativas, e se o estímulo lesivo original ou modificado

permanecer por períodos relativamente longos, pode modificar-se e adquirir caráter

persistente ou crônico, com grande proliferação celular, que não raramente levará a lesão

funcional do órgão afetado (GARCIA & LEME, 1979).

Na primeira fase da reação inflamatória, a fase aguda, ocorrem fenômenos

vasculares e celulares; as principais mudanças observadas envolvem praticamente três

processos sumariamente caracterizados pelas seguintes fases (ALBERTINE, 2001):

10

1) Mudança de calibre e fluxo na microcirculação levando a vasodilatação das

arteríolas;

2) Aumento da permeabilidade vascular das vênulas em conseqüência da abertura das

junções entre as células levando a formação de exudato rico em proteínas e edema

local;

3) Migração de leucócitos do sangue circulante para o local da lesão.

As alterações que ocorrem nas arteríolas a contração das células endoteliais das

vênulas e as respostas celulares são causadas por substâncias liberadas no local da

inflamação, conhecidos como mediadores inflamatórios. Estes mediadores podem atuar

isoladamente, associadamente ou em seqüência podendo amplificar a resposta inflamatória

influenciando na sua resolução (YOSHIKAI, 2001).

Os mediadores podem ter origem no plasma, células e tecidos agredidos. Entre os

principais mediadores destacam-se: histamina, cininas plasmáticas, serotonina,

prostaglandinas, elementos formados durante a ativação do sistema complemento, proteases

neutras, proteínas catiônicas de origem lisossomal, produtos decorrentes da degradação de

fibrina (PDF), fatores reativos de linfócitos, citocinas, entre outros (LANSEN et al., 1983).

A reação inflamatória é caracterizada pelo acúmulo local de leucócitos

polimorfonucleares no tecido lesado que migram de vasos adjacentes. Os mecanismos de

acúmulo no local da lesão são complexos e dependem de uma seqüência de eventos que

compreendem a marginação, adesão, migração em direção ao estímulo quimiotático,

fagocitose e degradação intracelular, ocorrendo também a liberação extracelular de

produtos de leucócitos (COTRAN et al., 1989) (Figura 3).

11

Figura 3: Seqüência de eventos leucocitários na inflamação (COTRAN, et al., 2000).

Na inflamação existe um aumento da permeabilidade capilar devido a ação dos

mediadores que se formam no local induzindo a contração dos endotélios e pericitos,

separando as junções intracelulares e permitindo a passagem sucessiva de líquido,

macromoléculas e eventualmente de células do sangue para o interstício. (MONTENEGRO

et al., 1999).

O líquido rico em macromoléculas e células que se acumula nos intertíscio da área

constitui o exsudato, que é um fluido extravascular de origem inflamatória contendo altas

concentrações de proteínas e muitos detritos celulares (SIQUEIRA & DANTAS, 2000).

O exudato inflamatório é importante na contenção e limitação da agressão, trazendo

para o interstício anticorpos, complemento e outras macromoléculas envolvidas na inibição

e destruição de agressores, assim como na modulação da própria resposta inflamatória

( MONTENEGRO et al., 1999).

O exudato deforma e comprime os vasos, sobrecarregando a circulação linfática, que

perde a eficiência de drenagem agravando a retenção de água no interstício. Todo este

processo, portanto, contribui para a formação do edema inflamatório (BRASILEIRO,

1998).

12

As células, principalmente neutrófilos são as primeiras a atingirem o sítio da lesão e

migram pelo processo de quimiotactismo se acumulando no sítio da lesão seguido por

leucócitos mononucleares, em períodos mais tardios. Muitos são dotados de propriedades

fagocíticas, englobando material particulado ou microorganismos do seu citoplasma

(GARCIA & LEME, 1979).

Estudos histológicos demonstraram casos de inflamação exudativa aguda com

predomínio de infiltração neutrolítica, seguida de fase crônica caracterizada por

proliferação fibroblastica, formação de vasos sanguíneos e infiltração de mononucleares

(SILVA, 1986; GARCIA & LEME, 1979).

1.4.2 Mediadores da inflamação:

Em termos simples, um mediador pode ser considerado como um mensageiro

químico que tem ação nos vasos sanguíneos e/ou células e contribuem para a resposta

inflamatória. (LANSEN et al., 1983).

Tais substâncias modulam uma série de eventos locais, sendo os principais

vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, opsonização, quimiotaxia para células

inflamatórias, destruição tecidual e dor, como também febre e mal estar. Os mediadores

químicos da inflamação podem ser de origem plasmática ou tecidual (SIQUEIRA &

DANTAS , 2000).

Plasmática:

- Sistema das cininas (Substrato plamático).

- Sistema complemento ( C3a; C5a; C5b – C9) (Proteínas plasmáticas via

fígado, macrófagos).

- Sistema de coagulação (leucócitos).

- Sistema fibrinolítico.

Tecidual:

- Aminas vasoativas: histamina e serotonina (mastócitos e plaquetas).

- Derivados do ácido aracdônico (A.A.) (fosfolipídeos da membrana).

- Enzimas lisossomais (neutrófilos e mastócitos).

- Metaloproteinases de matriz.

13

- Radicais livres derivados do oxigênio (leucócitos).

- Fator ativador de plaquetas (PAF) (leucócitos e mastócitos).

- Citocinas (macrófagos e linfócitos ativados).

- Óxido nítrico (macrófagos e endotélio).

- Fatores do crescimento.

As aminas vasoativas, histamina e serotonina, liberadas dos mastócitos e das

plaquetas podem ser identificadas no início da inflamação aguda. A histamina é o primeiro

mediador a atuar; gerando o aumento da permeabilidade vascular e uma contração do

endotélio venular com alargamento de junções celulares interendoteliais. A serotonina

apresenta ações semelhantes ás da histamina, correspondendo a um segundo mediador pré

formado (COTRAN et al. 1996).

As prostaglandinas originadas da conversão do ácido aracdônico também agem

como importantes substâncias vasodilatadoras. No homem, o ácido aracdônico é o mais

abundante precursor de prostaglandinas, como também prostaciclina, tromboxanos ou

leucotrienos. A liberação do ácido aracdônico ocorre como conseqüência da estimulação

específica de receptores da superfície celular e da subseqüente ativação de fosfolipases do

tipo A2. Vários tipos de células liberam ácido aracdônico em resposta a diferentes estímulos

tais como a bradicinina, angiotensina II, vasopressina, trombina, colágeno, adrenalina,

ADP, peptídios quimiotáticos, IgE – Ag, concanavalina A e histamina (CARVALHO,

1990).

Duas grandes rotas do metabolismo do Ácido aracdônico em células de mamíferos

correspondem a via da ciclooxigenase e a via da lipoxigenase. Prostanóides incluindo

prostaglandinas e tromboxano A2 são produzidos por fosfalipases A2 e ciclooxigenase e

leucotrienos são produzidos por 5- lipoxigenase (YOSHIKAI, 2001) (Figura 4).

14

Figura 4: Geração de metabólitos do ácido aracdônico e seus papéis na inflamação. (COTRAN, et al. 2000).

15

As prostaglandinas podem participar de reações alérgicas, como o mais abundante

produto produzido por reação imunológica de mastócitos em pulmão, como a PGD2. Efeito

biológico de prostaglandinas produzido durante a reação de mastócitos em tecidos incluem

modulação da musculatura lisa e contração, permeabilidade vascular, sensação de prurido e

dor e agregação plaquetária (WHITE, 1999).

A via da ciclooxigenase conduz a geração de prostaglandinas que incluem PGE2,

PGD2, PGF2α, PGI2 (Prostaciclina e tromboxano (Tx A2), todos derivados da ação de

enzimas específicas (COTRAN et al., 1996).

Na via da lipooxigenase a 5-lipooxigenase é a enzima predominante dos neutrófilos.

O principal produto, a HETE, que é quimiotática para neutrófilos é convertida em uma série

de compostos conhecidos como leucotrienos (COTRAN et al., 2000). Dentre os

leucotrienos mais importantes está o LTB, que causa aderência de neutrófilos ao endotélio

das vênulas pós-capilares, sendo também um potente quimiotático para neutrófilos

(CORREA, 2001). O LTC4 LTD4, LTDC4, causam vasoconstrição, broncoespasmo e

aumento da permeabilidade vascular (SIQUEIRA & DANTAS, 2000).

Recentemente descobriu-se que o óxido nítrico (NO) pode ser sintetizado por células

do organismo com células endoteliais, macrófagos e por neurônios específicos podendo

desempenhar funções distintas em muitos tecidos. O NO é uma molécula instável capaz de

permear rapidamente membranas biológicas e interagir com a enzima guanilato ciclase

solúvel presente em células vizinhas. Assim, o NO sintetizado nas células endoteliais

difunde-se rapidamente para fora das células de origem para as células musculares lisas

subjacentes, provocando relaxamento e, conseqüentemente vasodilatação e para as

plaquetas do lúmen do vaso, inibindo a adesão e agregação destas (PALMER et al., 1987;

IGNARO, 1989). Além de promover o relaxamento da musculatura lisa, o NO desempenha

outros papéis importantes na inflamação. Reduz a agregação e adesão plaquetária, é

citotóxico para determinados micróbios e células tumorais, e sua produção descontrolada

por macrófagos ativados no choque séptico pode levar a uma vasodilatação periférica

maciça e a choque (COTRAN et al. 2000). Células endoteliais produzem e liberam NO,

após a estimulação por citocinas como MCP-1;IL-6; M-CSF, ICAM – 1 e VCAM – 1

(TEDGUI & MALLAT, 2001).

16

As citocinas podem ser definidas como uma família de peptídeos sintetizados por

monócitos e linfócitos, destacando-se a interleucina 1(IL-1) e o fator de necrose tumoral

(TNF) que participam da resposta inflamatória (MONTENEGRO, 1999). Citocinas são

liberadas também por fagócitos ativados em inflamação aguda. TNF-α é um indutor de

inflamação aguda local causada por bactérias infecciosas ou lipopolisacarídeos. Interleucina

1 e 6 e TNF- α possuem papel importante não somente na indução da inflamação local

mas também na indução da febre que favorece um efeito defensivo contra o agressor por

vários dias (YOSHIKAI, 2001).

1.4.3 – Inflamação experimental:

O estudo da reação inflamatória e o desenvolvimento de novas terapias e drogas

sempre dependeram de modelos animais apropriados (ALBERTINE, 2001).

Do ponto de vista laboratorial existem diversos métodos experimentais empregados

na investigação do processo inflamatório. Estes métodos são bastante variáveis e analisam

alguns aspectos do processo inflamatório (GARCIA & LEME, 1979). Exemplos:

- os fenômenos vasculares precoces: dilatação, alterações do fluxo, dinâmica circulatória;

- as alterações da permeabilidade vascular;

- o desenvolvimento de edemas;

- a pesquisa de fatores quimiotáticos e seu mecanismo;

- os processo fagocitários;

- a análise química e farmacológica de exsudatos inflamatórios e perfusatos de áreas

inflamadas, para detecção de substâncias ativas (mediadores e enzimas).

- as alterações no sistema linfático: composição e fluxo da linfa;

- os fenômenos dolorosos, sua produção e mecanismos;

- as alterações morfológicas globais, a natureza das células presentes, a extensão do

infiltrado celular, a lesão final;

- os processos cicatriciais.

17

2 OBJETIVO

Objetivo geral:

- Investigar o efeito antiiflamatório do extrato hidroalcóolico liofilizado de flores e folhas

de Vernonia scorpioides (Piracá) no processo inflamatório agudo, utilizando-se para isto, os

modelos de edema de pata em ratos e peritonite em camundongos.

Objetivos específicos:

- Verificar o efeito inibitório do extrato hidroalcoólico de V. scorpioides em edema de pata

induzido por carragenina e histamina.

- Verificar a migração leucocitária após a administração do extrato de V. scorpioides.

- Realizar a análise histológica do músculo plantar dos ratos em relação ao tratamento

realizado por diclofenaco sódico e doses do extrato de 0,45g/Kg; 0,67g/Kg e 1,0 g/Kg 4

horas após a indução do edema por carragenina.

- Verificar o melhor tratamento adotado em relação ao extrato hidroalcoólico de V.

scorpioides para edema de pata induzido por carragenina e histamina.

18

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Aprovação pelo Comitê de Ética

Neste trabalho foram aplicados os princípios éticos da experimentação animal de

acordo com a COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação animal) tendo sido aprovado

pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Univap seguindo as normas para Prática Didático

Científica da Vivissecação de animais. Protocolo L017/2004/CEP (Anexo A).

3.2 Animais

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, machos adultos, pesando entre 150 e

200g, e camundongos machos, pesando entre 15 e 25g, acondicionados em gaiolas de

polietileno convencionais (n = 6) em condições de temperatura controlada (22ºC á 28ºC),

ciclo de luz controlado (período de luz 6:00 ás 18:00 h) e recebendo água e ração ad

libitum.

3.3 Protocolo de Eutanásia

Os animais foram anestesiados com 0,05 mL de cloridrato de Xilazina mais 0,05 mL

cloridrato de Ketamina (10mg/Kg) injetados intraperitonialmente.

Os animais ainda sob o efeito do anestésico foram sacrificados em câmara fechada

com Halotano .

19

3.4 Obtenção do extrato

3.4.1 Coleta do Material Vegetal

A espécie vegetal Vernonia scorpioides foi cultivada durante um período de 2 anos

em um sítio particular localizado no Bairro dos Freitas no município de São José dos

Campos onde foi realizada a coleta do material vegetal (folhas e flores) no período de

intensa floração, em junho de 2003. A identificação botânica já havia sido realizada em

1996, no Instituto de Botânica pela Prof Drª Silvia Chiléia especialista na família

Asteraceae (Anexo B).

3.4.2 O Processo extrativo

As folhas e flores de V. scorpioides foram secas á temperatura ambiente durante 10

dias, posteriormente foram colocadas numa estufa de lâmpadas de 100 watts por mais um

período de 10 dias, terminando-se a desidratação total do material numa estufa com

temperatura controlada á 40º C por mais 3 dias. Após a dissecação total, o material foi

moído em moinho elétrico de facas. O pó obtido foi pesado e acondicionado em frasco

âmbar e mantido á temperatura ambiente por aproximadamente uma semana.

O extrato fluido foi preparado em percolador de aço inoxidável com capacidade para

5000 mL segundo o processo da Farmacopéia Brasileira 1959, utilizando-se 650g da droga

pulverizada, 3000 mL de álcool etílico 70%. A mistura permaneceu no percolador durante

o período de seis dias onde foi feita a primeira extração. Adicionou-se ao resíduo a mesma

quantidade de álcool etílico 70% (3000 mL) e a mistura foi agitada por mais três dias. Este

processo foi repetido por mais uma vez totalizando três extrações (ANDREUCCI, 2002;

MENDES, 2001).

O extrato líquido obtido foi concentrado com o auxílio de um rotoevaporador,

obtendo-se 138g de extrato concentrado (rendimento de 21%). O extrato foi liofilizado no

Laboratório do DR Stephem Hyslop – FCM – Unicamp.

20

3.5 Avaliação Farmacológica – via intraperitonial

3.5.1 Edema de pata induzido pela carragenina

Avaliação do processo inflamatório

O processo inflamatório agudo foi induzido pela administração de carragenina

(1000µg/0,1 mL/ pata) no tecido subcutâneo do coxim plantar direito dos animais, sendo o

edema medido através de plestimógrafo (UGO BASILLE 7140) Plethysmometer, ornano

IMBIBENTE BBC 97 com precisão de duas casas decimais.

O Método utilizado para avaliação do edema inflamatório foi o método da

pletismografia de VAN ARMAN et al., (1965). (Figura 5 e 6). A primeira medida do

volume da pata foi feita imediatamente antes da injeção do agente irritante e as demais

foram feitas de uma em uma hora no período de 4 horas. Nesse método a diferença de

volume da pata medido por imersão de líquido reflete o edema acumulado.

O aumento do volume das patas foi calculado pela diferença entre o volume inicial

da pata (antes da injeção do agente inflamatório) e o volume a cada hora, durante um

período de 4 horas como pode ser observado na figura 6. Os resultados foram expressos

como aumento do volume de pata (mL).

Tratamento dos animais

Nos experimentos para se obter a curva dose resposta do extrato de V. scorpioides

foram utilizadas três concentrações das doses do extrato (0,45g/Kg; 0,67g/Kg e 1,0 g/Kg)

que foram diluídas em 0,3 mL de água deionizada .A determinação das doses foram

baseadas no estudo da toxicidade aguda segundo MONTEIRO, (1996); GAD &

CHENGELIS, 1998).

O diclofenaco sódico foi utilizado em todos os tratamentos com o objetivo de

comparar o efeito antiinflamatório produzido com o extrato vegetal.

21

Figura 5: Fotografia Pletismógrafo (Univap 2005).

22

Figura 6: Fotografia ilustrando a realização da medição do volume da pata em ratos através do

plestismógrafo (Univap, 2005).

23

Foram realizados os seguintes protocolos:

Protocolo 1:

Tratamento com o diclofenaco e o extrato 30 minutos antes da indução do edema por

carragenina.

Protocolo 2:

Tratamento com o diclofenaco e o extrato imediatamente com a indução do edema por

carragenina.

Protocolo 3:

Tratamento com o diclofenaco e o extrato 30 minutos após a indução do edema por

carragenina.

Todos os protocolos foram compostos por 30 animais, divididos em 5 grupos (n = 6).

Grupo 1: Carragenina (1000µg/pata) - controle

Grupo 2: Carragenina (1000µg/pata) + Tratamento com diclofenaco sódico

(10 mg/Kg)(i.p).

Grupo 3: Carragenina (1000µg/pata) + Tratamento com o extrato de

V. scorpioides na dose de 0,45g/Kg (i.p).


V. scorpioides na dose de 0,67g/Kg (i.p).


V. scorpioides na dose de 1g/Kg (i.p).

24

3.5.2 – Edema de pata induzido por histamina

Avaliação do processo inflamatório

O processo inflamatório agudo foi induzido por administração de histamina na dose

de 50µg/0,1 mL/ pata (CARVALHO et al, 1999) no tecido subcutâneo do coxim plantar

direito dos ratos, sendo o edema medido através de plestimógrafo.

Tratamento dos animais

Após a indução do edema por histamina os ratos foram tratados por via

intraperitonial (i.p) com a dose única de extrato de 0,45g/Kg diluído em 0,3 mL de água

deionizada. Os animais em todos os experimentos foram tratados com Fernegam

(Cloridrato de prometazina) na dose de 4 mg/Kg (COELHO et al., 2004).

Foram realizados os seguintes Protocolos:

Protocolo 4:

Tratamento com Fernegan e Extrato 15 minutos antes da indução do edema por histamina.

Protocolo 5:

Tratamento com Fernegam e o extrato imediatamente após a indução do edema por

histamina.

Protocolo 6:

Tratamento com Fernegan e o Extrato 15 minutos depois da indução do edema por

histamina.

25

Todos os protocolos foram compostos por 18 animais divididos em 3 grupos (n = 6).

Grupo 1: Histamina (50µg/pata) – controle

Grupo 2: Histamina (50µg/pata) + Cloridrato de prometazina (4mg/Kg) (i.p)

Grupo 3: Histamina (50µg/pata) + tratamento com extrato de V. scorpioides na

dose de 0,45 g/Kg (i.p).

3.6 Análise histológica

A análise histológica foi realizada para se confirmar o efeito antiiflamatório do

extrato de V. scorpioides.

Ao término da 4ª hora do experimento de edema de pata induzido por carragenina o

músculo plantar foi retirado para análise histológica e fixado em formol 10 % por um

período de 7 dias.

Após este período a peça foi desidratada em etanol com porcentagens crescentes

(50%, 70%, 80%, 90%) por períodos de 1 hora e finalmente em álcool 100% durante 8

horas. A peça desidratada foi diafanizada em xilol por 4 horas, permanecendo em parafina

ou paraplast por 4 horas na estufa á 58ºC para então ser emblocada para a realização dos

cortes histológicos. As peças foram coradas com eosina e hematoxilina e analisadas em

microscópico óptico Karl Zeiss e fotografadas com câmara Olimpus BB12 acoplada ao

microscópio CX41.

3.7 – Avaliação Farmacológica – via oral

3.7.1- Peritonite

Indução da peritonite

Os camundongos receberam 600 µg/cavidade carragenina suspensa em 0,1 mL

solução fisiológica estéril através de injeção intraperitonial para a indução da peritonite e

foram tratados por via oral com o extrato de V. scorpioides através de gavagem com as três

26

doses utilizadas no experimento com edema de pata por carragenina (0,45g/Kg; 0,67g/Kg

1,0g/Kg) 30 minutos após a aplicação do agente flocógeno (CARVALHO et al., 1999) e

comparados com tratamento com diclofenaco sódico (10 mg /Kg) e o grupo salina.

Foi realizado o seguinte protocolo:

Protocolo 7

Grupo 1: Salina estéril (0,1mL/cavidade) (i.p) Grupo 2: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) - controle

Grupo 3: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com diclofenaco

sódico (10 mg/Kg) (v.o).

Grupo 4: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com o extrato de V. scorpioides na dose de 0,45g/Kg (v.o).

Grupo 5: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com o extrato de V. scorpioides na dose de 0,67g/Kg (v.o).

Grupo 6: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com o extrato de V. scorpioides na dose de 1g/Kg (v.o).

Os animais foram sacrificados 1, 2, 3 e 4 h após a indução da peritonite em câmara

fechada utilizando-se Halotano. Em seguida suas cavidades peritoniais foram lavadas com

1mL de solução contendo PBS (dissolvido em 9 partes de água destilada) e 10 µl de

heparina. O volume do interior da cavidade foi coletado com pipeta automática e em

seguida foram feitas as contagens de leucócitos totais e contagem diferencial.

Contagem total de leucócitos

Para a contagem do número total de células presentes no lavado peritonial utilizou-

se 20µl do lavado que foram diluídos em líquido de Tukey (380 µl). Para a contagem foi

utilizada a câmara de Neubauer com auxílio de microscópio óptico Karl Zeiss sob aumento

de 40x. Os resultados foram expressos como número total de leucócitos por cavidade.

27

Contagem diferencial de leucócitos

Para a contagem diferencial de leucócitos, alíquotas de 100µl da suspensão celular

foram utilizadas para o preparo do citoesfregaço em citocentrífuga (FANAEM – Citospim).

A coloração foi realizada pelo método de Instant – Prov e a contagem diferencial das

células foi realizada com auxílio de um microscópio óptico (Karl Zeis) com objetiva de

imersão em óleo sob aumento de 100x. As populações celulares avaliadas foram de células

mononucleares e neutrófilos.

Análise estatística

Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste de variância a 5% de

probabilidade (ANOVA) e quando da necessidade de outro teste para determinação da

diferença encontrada foi utilizado o teste de Tukey, também com 5% de probabilidade. Os

resultados estão expressos na forma de gráficos, que foram escolhidos de acordo com a

melhor representação para cada tipo de experimento.

28

4. RESULTADO 4.1 Avaliação farmacológica – via intraperitonial

4.1.1 Edema de pata induzido pela carragenina

A administração de carragenina (0,1mL a 1%) no interior das patas dos ratos causou

aumento progressivo do volume das patas que foi mensurado uma hora após a aplicação do

agente irritante, apresentando pico máximo na 3ª hora e a redução do volume a partir deste

momento em todos os tratamentos realizados.

No experimento de edema de pata induzido por carragenina determinou-se as curvas

dose resposta do extrato hidroalcoólico de V. scorpioides quando administrado

intraperitonialmente avaliando-se uma possível relação entre a dose administrada e o

aparecimento de um efeito antiiflamatório.

No tratamento realizado 30 minutos antes da indução do edema por carragenina

todas as doses do extrato diminuíram o edema em relação ao grupo controle. O diclofenaco

sódico diminuiu o edema na proporção de 31%, 51%,54%, 40% respectivamente na 1ª, 2ª,

3ª e 4ª hora e a melhor dose do extrato para este tratamento foi a de 1 g/Kg, com ação

semelhante ao diclofenaco sódico, na proporção de 31%, 51%, 45% e 48% respectivamente

na 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora. (Figura 7)

29

0 1 2 3 4 50

1

2

3Carragenina 1000µg/Kg (n=6)

Diclofenaco 10 mg/Kg (n=6)

Extrato 0,45g/Kg (n=6)



*

*

* **

* * ***

Tempo (Horas)

Volu

me

poda

l (m

L)

Figura 7: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos inoculados com carragenina

(1000 µg/pata). Os animais foram tratados 30 minutos antes (i.p.) com o extrato e diclofenaco, após a

aplicação do estímulo (n = 6). Os valores estão representados como média + DP para *P< 0,05, ** P< 0,01,

em relação ao controle.

30

A figura 8 representa o tratamento realizado imediatamente a indução do edema por

carragenina. Observamos a evolução do edema de pata induzido pela carragenina e

diminuição do edema quando tratados com diclofenaco e três doses do extrato. Nota-se que

na primeira hora para a dose 0,45g/Kg do extrato, um efeito similar ao diclofenaco e nas

demais horas com a mesma dose do extrato houve uma redução significativa do edema em

44% (2ª hora); 50 % (3ª hora) e 60 % na 4ª hora, comparado ao grupo controle.

As outras duas doses utilizadas (0,67g/Kg e 1g/Kg) também provocaram redução do

edema em relação ao grupo controle, com efeito similar ao diclofenaco.

No tratamento realizado 30 minutos após a indução do edema por carragenina todas

as doses diminuíram o edema de pata em relação ao grupo controle e ao tratamento

realizado com o diclofenaco sódico. Nota-se que na 1ª hora o extrato, na dose de 1g/Kg tem

um efeito similar ao diclofenaco sódico, apresentando posteriormente nas demais horas

uma significativa redução do edema em relação ao grupo controle na proporção de 64%,

72% e 40% respectivamente para a 2ª, 3ª e 4ª hora.

A dose 0,45 g/Kg reduziu o edema em 64%, 59%, 63%, 55% na 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora,

respectivamente. As doses utilizadas neste tratamento reduziram o edema numa proporção

semelhante, não havendo uma diferença estatística significativa entre elas (Figura 9).

Para analisar a porcentagem de inibição do extrato em todos os experimentos de

edema de pata utilizou-se como método a área da curva (expresso em porcentagem).

31

0 1 2 3 4 50

1

2Carragenina 1000µg/Pata (n=6)


Extrato 0,45g/kg (n=6)


Extrato 1,0g/Kg (n=6)**

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

**

Tempo (Horas)

Volu

me

poda

l (m

L)


(1000 µg/pata). Os animais foram tratados (ip) imediatamente a aplicação do estímulo com o extrato e o

diclofenaco n=6). Os valores estão representados como média + DP *P< 0,05, em relação ao controle.

.

32

0 1 2 3 4 50

1

2Carragenina 1000µg/Kg (n=6)




Extrato 1,0 g/Kg (n=6)

*

*

*

*

**

**

*

*

*

*

Tempo (horas)

Volu

me

poda

l (m

L)


(1000 µg/pata). Os animais foram tratados 30 minutos após (ip) a aplicação do estímulo pelo extrato e

diclofenaco (n=6). Os valores estão representados como média + DP *P< 0,05, ** P< 0,01, ***P< 0,001 em

relação ao controle.

33

4.1.2 Edema de pata induzido pela histamina

O edema de pata provocado por histamina obteve seu pico máximo aos 60 minutos,

onde o edema foi mensurado de 30 em 30 minutos após a aplicação do agente irritante. O

volume da pata voltou ao nível normal após 120 minutos.

Neste experimento o edema foi mensurado até o 180 minutos onde foram realizados

os seguintes tratamentos: 15 minutos antes, imediatamente e 15 minutos depois da indução

do edema pelo extrato e fernegam, devido ao fato do pico máximo do edema provocado

pela histamina ocorrer aos 60 minutos.

No tratamento realizado 15 minutos antes da indução do edema por histamina

observamos que a dose de 0,45g/Kg do extrato diminuiu o edema aos 30 minutos em 9,6%;

60 minutos em 32%; 90 minutos em 32% e 120 minutos em 15% . O grupo tratado pelo

fernegam diminuiu o edema aos 30 minutos em 41%, aos 60 minutos em 55%, 90 minutos

em 62% e 120 minutos em 60 % apresentando melhor resultado comparado á dose do

extrato utilizado. (Figura 10)

No tratamento realizado imediatamente após a indução do edema por histamina

observamos que o extrato na dose de 0,45g/Kg teve ação similar ao fernegam (Cloridato de

Prometazina), reduzindo em ambos tratamentos aos 30 minutos em 30%, aos 60 minutos

60% aos 90 minutos 35% e 120 minutos 40 %. Não houve diferença significante após os 90

minutos entre grupo controle, extrato e Fernegam. (Figura 11)

A figura 12 representa o tratamento com Fernegam e extrato realizado 15 minutos

após da indução do edema por histamina.

Para este tratamento o fernegam e o extrato diminuíram o edema aos 30 minutos,

numa proporção menor que aos 60 minutos onde o extrato e o fernegam diminuíram o

edema na proporção de 21%, apresentando portanto uma curva semelhante nos demais

intervalos como pode ser observado na figura 12.

34

0 30 60 90 120 150 1800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Histamina 50µg/pata (n=6)

Fernegan 4mg/pata (n=6)

Extrato 0,45 g/Kg (n=6)

*

*

*

**

*

Tempo (Minutos)

Volu

me

poda

l (m

L)

Figura 10: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos inoculados com histamina.

Os animais foram tratados com Fernegam e extrato 15 minutos antes da aplicação do estímulo. Os valores

estão representados como média + para animais * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle.

35

0 30 60 90 120 150 1800.00

0.25

0.50

0.75Histamina 50µg/pata (n=6)

Fernegam 4mg/Kg (n=6)


* *

*

Tempo (Minutos)

Volu

me

poda

l (m

L)

Figura 11: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos inoculados com Histamina.

Os animais foram tratados com Fernegam e extrato imediatamente com a aplicação do estímulo. Os valores

estão representados como média + DP para 6 animais *P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle

.

36

0 30 60 90 120 150 1800.00

0.25

0.50

0.75Histamina 50µg/pata (n=6)

Fernegan 4mg/Kg (n=6)


*

* * * *

Tempo (Minutos)

Volu

me

poda

l (m

L)

Figura 12: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos inoculados com histamina.

Os animais foram tratados com Fernegam e extrato 15 minutos após a aplicação do estímulo. Os valores estão

representados como média + DP para animais * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle.

37

4.2 Peritonite induzida pela carragenina

Através do uso do estímulo carragenina é possível produzir uma resposta

inflamatória aguda na cavidade peritonial com predominância de um grande número de

células polimorfonucleares presentes no exsudato.

Os resultados mostram a migração de leucócitos Totais e Diferenciais durante a 1ª,

2ª,3ª e 4ª horas, revelando a quantidade de células que migraram para o local inflamado nas

respectivas horas (Figura 13, 14 e 15).

Para calcular os valores adequados e realizar a confecção dos gráficos, na contagem

total e diferencial, utilizamos as seguintes fórmulas (CORREA, 2001) (obtidas pela

fundação Oswaldo Cruz):

Contagem Total

Valor da contagem x 2,5 x 40 x 1000 (Resultado desta multiplicação corresponde ao valor

real). Onde:

2,5 é o valor de correção da câmara de Newbawer

40 e o valor da diluição (Líquido de Turkey)

1000 é o fator da lavagem da cavidade.

Contagem diferencial

Valor da contagem total ________ 100%

X (Valor real) ________ nº diferencial %

4.2.1 Resultados da migração celular Contagem Total

Na Figura 13 estão expressos o resultados do experimento, podendo observar a ação

antiinflamatória do diclofenaco sódico e do extrato de V. scorpioides sobre o processo de

migração leucocitária em camundongos (contagem total).

A contagem do número total de leucócitos que migraram para a cavidade peritonial

foi feita durante o intervalo de tempo de uma hora em todos os grupos onde foi aberta a

38

cavidade peritonial dos animais durante a 1ª, 2ª, 3ª e 4ª horas após a indução de peritonite

por carragenina e os resultados podem ser observados na figura 13.

Contagem diferencial

Na contagem diferencial de células determinou-se o número de neutrófilos e células

mononucleares que migraram durante a 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora após a indução de peritonite por

carragenina. Foram contadas 100 células por lâmina diferenciadas entre neutrófilos e

células mononucleares até atingir o número total. O resultado foi expresso em porcentagem.

Os valores da migração de neutrófilos analisados durante o intervalo de tempo de 1

á 4 horas após a indução de peritonite por carragenina estão expressos em porcentagem

com o mostra a figura 12 . O melhor resultado obtido em relação as doses utilizadas foi

com a dose de 1g/Kg que diminuiu o edema em todos intervalos de tempo observados

(Tabela 2).

A Figura 13 expressa os valores em porcentagem da migração de células

mononucleares analisados durante o intervalo de tempo de 1 á 4 horas após a indução da

peritonite por carragenina. Observamos que a dose de 0,67g/Kg e 1,0 g/Kg inibiram a

migração de células mononucleares. A dose 2 apresentou um efeito significativo em relação

ao grupo carragenina e e a dose 1 (Tabela 3). A dose de 1g/Kg apresentou o melhor

resultado observado na quarta hora com valores semelhantes ao diclofenaco sódico e á dose

2.

Para melhor compreensão dos resultados da migração leucocitária induzida por

carragenina os resultados estão expressos em porcentagem de inibição do número de

leucócitos totais, neutrófilos e células mononucleares migrantes para a cavidade peritonial,

comparados com grupo controle carragenina em relação aos tratamentos realizados pelo

diclofenaco sódico, e as doses do extrato de V. scorpioides durante o intervalo de tempo de

4 horas nas tabelas 1, 2 e 3.

39

��

��

��

A

salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 30

100

200

1 hora

106Le

ucóc

itos

tota

is p

orca

vida

de (m

m3 )

** ��

��

��

B


50

100

150

*

2 horas10

6Le

ucóc

itos

tota

is p

orca

vidad

e (m

m3 )

��

��

��

D

Salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 30

50

100

150

**

4 horas

106Le

ucóc

itos

tota

is p

orca

vida

de (m

m3)

Figura 13: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45 g/Kg; 0,67g/Kg e 1 g/Kg sobre o processo inflamatório de peritonite em camundongos induzido por carragenina comparados aos grupos controle (salina e carragenina e tratamento com diclofenaco sódico ), observando o nº de leucócitos totais migrantes para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1, 2 ,3 e 4 horas após a indução da inflamação. Os valores estão representados como média + DP * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle.; P < 0,01 diclofenaco x extrato.(A=1; B=2; C=3 e D=4 horas)

��

��

��

C


50

100

150

*

3 horas

106 L

eucó

cito

s to

tais

por

cavi

dade

(mm

3 )Carragenina 600µg/pata(n=6) Diclofenaco 10 mg/Kg (n=6) Dose1; 045g/Kg (n=6) Dose2; 0,67g/Kg (n=6) Dose3; 1,0g/Kg (n=6)

40

��

��

��

A


50

100

150

* *

1 hora

106 N

eutró

filos

por

cav

idad

e(m

m3 )

��

��

��

B


50

100

150

*

*

2 horas

106 N

eutró

filos

por

cav

idad

e(m

m3 )

��

��

��

C


25

50

75

100 **

3 horas

106 N

eutró

filos

por

cav

idad

e(m

m3 ) * ��

��

��

��

D

Salina Carrag Diclof Dose 1Dose 2Dose 30

25

50

75

100

* *

4 horas

106 N

eutró

filos

por c

avid

ade

(mm

3 )

Figura 14: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45 g/Kg(n=6); 0,67g/Kg(n=6) e 1 g/Kg(n=6) sobre o processo inflamatório de Peritonite em camundongos induzido por carragenina comparados ao grupos controle (salina e carragenina e tratamento com diclofenaco sódico , observando o nº de neutrófilos migrantes para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1, 2, 3 e 4 horas após a indução da inflamação. Os valores estão representados como média + DP * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle P < 0,01 diclofenaco x extrato.(A=1; B=2; C=3 e D= 4 horas)

Carragenina 600µg/pata(n=6) Diclofenaco 10mg/Kg (n=6) Dose 1 = 0,45 g/Kg; (n=6) Dose 2 = 0,67g/Kg; (n=6) Dose 3 = 1,0 g/Kg; (n=6)

41

��

��

��

A


10

20

30

40

1 hora

106 M

onon

uclea

res

por c

avida

de(m

m3 ) *

*

*

*

��

��

��

B


10

20

30

**

*

2 horas

106m

onon

ucle

ares

por

cav

idad

e(m

m3 )

*

��

��

��

C


10

20

30

40 *

* *

3 horas

106 M

onon

ucle

ares

por

cavi

dade

(mm

3 )

*

��

��

��

D


10

20

30

40 *

* * *

4 horas

106 m

onon

ucle

ares

por

cav

idad

e(m

m3 )

Figura 15: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45 g/Kg; 0,67g/Kg e 1 g/Kg sobre o processo inflamatório em modelo experimental de Peritonite em camundongos induzido por carragenina comparados ao grupos controle (salina e carragenina e tratamento com diclofenaco sódico), observando o nº de células mononucleares migrantes para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1,2,3 e 4 horas após a indução da inflamação. Os valores estão representados como média + DP * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle; P < 0,01 diclofenaco x extrato. (A=1; B=2; C=3 e D= 4 horas)

Carragenina 600µg/pata(n=6) Diclofenaco 10mg/Kg (n=6) Dose 1 = 0,45 g/Kg; (n=6) Dose 2 = 0,67g/Kg; (n=6) Dose 3 = 1,0 g/Kg; (n=6)

42

Tabela 1: Porcentagem de inibição nº de Leucócitos Totais migrantes para cavidade peritonial comparados

com o grupo carragenina e os tratamentos por diclofenaco sódico e extrato

Tempo Diclofenaco Extrato 0,45 g/Kg Extrato 0,67 g/Kg Extrato 1,0 g/Kg

1H Inibiu 21% Não houve inibição Inibiu 4,3% Inibiu 37%

2H Inibiu 34% Não houve inibição Inibiu 13% Inibiu 21%

3H Inibiu 20% Não houve inibição Inibiu 2,5% Inibiu 19%

4H Inibiu 32% Não houve inibição Inibiu 17,5% Inibiu 49% .

Tabela 2: Porcentagem de inibição nº Neutrófilos migrantes para cavidade peritonial comparados com o

grupo carragenina e os tratamentos por diclofenaco sódico e extrato

Tempo Diclofenaco Extrato 0,45 g/Kg Extrato 0,67 g/Kg Extrato1,0 g/Kg

1H Inibiu 5,2% Não houve inibição Não houve inibição Inibiu 26,5%

2H Inibiu 34% Não houve inibição Não houve inibição Inibiu 20%

3H Inibiu 11% Não houve inibição Não houve inibição Inibiu 33,%

4H Inibui 48% Inibiu 7,5% Inibiu 5,5% Inibiu 46,5% .

Tabela 3: Porcentagem de inibição nº células mononucleares migrantes para cavidade peritonial comparados

com o grupo carragenina e os tratamentos por diclofenaco sódico e extrato

Tempo Diclofenaco Extrato 0,45 g/Kg Extrato0,67 g/Kg Extrato 1,0 g/Kg

1H Inibiu 57,% Inibiu 46% Inibiu 74,% Inibiu 56%

2H Inibiu 22,5% Não houve inibição Inibiu 66,5% Não houve inibição

3H Inibiu 68,5% Não houve inibição Inibiu 71% Inibiu 22%

4H Inibiu 66% Não houve inibição Inibiu 67% Inibiu 62%

43

4.3 Estudo Histológico

A figura 16 demonstra as lâminas histológicas da região plantar da pata de ratos, 4

horas após a injeção de salina estéril. Observa-se a ausência de células inflamatórias e

edema tecidual, um capilar sanguíneo com acúmulo de células intravasculares envolvidas

na resposta inflamatória. A figura 17 demonstra as lâminas histológicas do tecido plantar da

pata de ratos após 4 horas da indução do edema de pata por carragenina. Podemos observar

edema tecidual com espaçamento entre as fibras musculares em resposta transitória aguda e

infiltrados celulares precoces com grande número de neutrófilos e outras células

inflamatórias acumulados em área de inflamação aguda.

A figura 18 demonstra as lâminas histológicas do grupo tratado com diclofenaco

sódico. Observa-se a redução do edema tecidual e do infiltrado inflamatório (influxo

leucocitário).

No tratamento realizado com todas as doses do extrato de V. scorpioides, podemos

observar uma diminuição significativa da infiltração leucocitária no tecido plantar da pata

dos ratos (figuras 19, 20 e 21) e redução do edema induzido pela carragenina.

44

Prancha 1 Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle salina 4 horas após a realização

do experimento. Observa-se a ausência de células inflamatórias e edema tecidual.

Figura 16: Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle salina. A: Aumento de 100x. B: Aumento de 400x. Univap 2005.

A

B

45

Prancha 2 Fotomicrografia das lâmina histológicas do grupo controle carragenina após 4 horas da indução do edema. Observa-se o edema tecidual e um grande número de neutrófilos e outras células inflamatórias.

Figura 17: Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo carragenina . A: Aumento de 100x. B: aumento de 400x. Univap 2005.

A

B

46

Prancha 3 Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo diclofenaco sódico. Observa-se a redução do edema tecidual e diminuição do infiltrado leucocitário.

Figura 18: Fotomicrografia do grupo diclofenaco sódico.A: Aumento de 100x. B: aumento de 400x. Univap 2005.

A

B

47

Prancha 4 Fomicrografia das lâminas histológicas do grupo tratado pela dose de 0,45g/kg do extrato após a 4ª hora da indução do edema por carragenina. Observa-se a presença de um capilar sanguíneo com acúmulo de células intravasculares envolvidas na resposta inflamatória.

Figura 19: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose de 0,45g/kg do extrato de V. scorpioides. A: Aumento de 100x . B: Aumento de 400x . Univap 2005.

A

B

48

Prancha 5 Fomicrografia das lâminas histológicas do grupo tratado pela dose de 0,67g/kg do extrato após a 4ª hora da indução do edema por carragenina observa-se redução do edema e do número de células envolvidas no processo inflamatório

Figura 20: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose de 0,67g/kg do extrato de V. scorpioides. A: Aumento de 100x . B: Aumento de 400x Univap 2005.

A

B

49

Prancha 6 Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo tratado pela dose de 1,0g/kg do extrato após a 4ª hora da indução do edema por carragenina. Observa-se redução do edema e do número de células envolvidas no processo inflamatório.

Figura 21: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose de 1,0g/kg do extrato de V. scorpioides. Aumento de 100x. B: Aumento de 400x Univap 2005.

A

B

50

5. DISCUSSÃO

Os resultados do presente estudo demonstraram que o extrato hidroalcoólico de

V. scorpioides inibiu o processo de inflamação aguda nos modelos utilizados de edema de

pata em ratos induzido tanto pela carragenina como por histamina e migração leucocitária

por peritonite em camundongos.

De acordo com dados da literatura, o edema de pata induzido pela carragenina está

associado com três fases distintas de alterações de permeabilidade vascular induzida por

mediadores (SPECTOR, 1962; VAN ARMAN et al., 1965; WILLIS, 1969; DI ROSA et

al., 1971). Durante os 60 minutos (fase inicial) possivelmente ocorre a liberação de

histamina e serotonina. A segunda fase, que se estende até aproximadamente 150 minutos

caracteriza-se pela liberação de bradicinina. Na terceira fase, até os 360 minutos (fase de

edema persistente), ocorre a produção local de prostaglandinas, principalmente PGE2 (DI

ROSA & WILLOUGHBY, 1971; DI ROSA, 1972; GOETZL E GOLDSTEIN, 1980).

O extrato inibiu o edema de pata induzido pela carragenina em todos os tratamentos

realizados, no entanto, as doses administradas produziram uma resposta diferenciada frente

aos tratamentos adotados. No tratamento realizado 30 minutos antes da indução do edema

por carragenina a melhor dose foi a de 1 g/Kg; no tratamento realizado 30 minutos depois a

melhor dose foi a de 0,45g/Kg e no tratamento imediato todas as doses inibiram o edema,

porém sem diferença significativa entre as três doses; neste tratamento as doses

apresentaram resultado superior ao diclofenaco.

Os resultados obtidos em relação aos tratamentos e as doses adotadas podem estar

relacionados a metabolização dos princípios ativos presentes no extrato hidroalcólico de

V. scorpioides, envolvendo aspectos relacionados a absorção e biodisponibilidade do

fármaco analisado. A administração intraperitonial de fármacos oferece uma grande

superfície de absorção, onde os fármacos entram rapidamente na circulação, em especial

através da veia porta, podendo ocorrer perdas na primeira passagem pelo fígado; o que

poderá influenciar na biodisponibilidade dos princípios ativos atuantes no organismo,

podendo-se deduzir que as doses menores utilizadas no tratamento realizado 30 minutos

antes podem não ter apresentado efeito tão eficaz devido ao fato dos princípios ativos não

51

serem absorvidos tão rapidamente, ou mesmo ter ocorrido perdas de metabolização na

primeira passagem pelo fígado (GOODMAN E GILMAN, 1996).

No tratamento imediato e tratamento realizado 30 minutos após a indução do edema

por carragenina, todas as doses apresentaram efeito antiinflamatório superior ou igual ao

diclofenaco sódico (figura 8 e 9). Este resultado pode estar relacionado á presença de

princípios ativos que possuam uma atividade antiedematosa de forma similar a Arnica

montana (Asteraceae) que apresenta propriedades antiinflamatória testadas em modelos de

inflamação por carragenina (CARVALHO et al., 2001).

A via da ciclooxigenase é inibida por antiinflamatórios não esteróides (AINES)

impedindo a formação de prostaglandinas (BROOKS & DAY, 1991). A droga padrão de

referência para este modelo experimental foi o diclofenaco sódico, um AINE consagrado na

terapêutica cuja ação antiinflamatória e efeito analgésico está relacionada a inibição da

enzima ciclooxigenase e redução da liberação dos derivados do ácido aracdônico com

afinidade para ambas isoformas de ciclooxigenase, COX-1 e COX-2 (BURITOVA et al.,

1995).

O extrato de V. scorpioides também demonstrou efeito inibidor em inflamação em

edema de pata induzido pela histamina em todos os tratamentos realizados com efeito

bastante similar ao Fernegam ( Cloridrato de prometazina).

No tratamento realizado 15 minutos antes da indução do edema por histamina, o

extrato na dose de 0,45g/Kg não foi tão eficaz em reduzir o edema comparado aos

tratamentos realizados 15 minutos depois e tratamento imediato, o que pode novamente

sugerir que a biotransformação dos princípios ativos esteja relacionado a presença de uma

maior quantidade de substâncias disponíveis e suficientes para inibir o edema, produzindo

um efeito protetor antinflamatório, mas dependente da dose utilizada. Nos tratamentos

realizados 15 minutos após e imediatamente a indução do edema por histamina, os

resultados foram semelhantes aos apresentados pelo fernegam.

A histamina sintetizada pelos mastócitos e basófilos é armazenada em grânulos e pode

ser liberada para o meio extracelular como resposta a diversos estímulos como: agravos

físicos como traumatismos, frio e calor; reações imunes que envolvam a ligação de

anticorpos aos mastócitos; fragmentos de complementos denominados anafilatoxinas (C3a

e C5a); proteínas liberadoras de histamina derivadas de leucócitos; neuropeptídeos e

52

citocinas (COTRAN et al., 2000). Segundo Bonamin & Abel, (1999) a histamina também

pode ser liberada para o meio extra celular pelo rompimento acidental da membrana

plasmática provocado por exemplo por estímulos mecânicos ou por alguns medicamentos.

As aminas vasoativas, histamina e serotonina, influenciam a resposta inflamatória

através de vários mecanismos. A histamina através de receptores H1 e H2, interage com o

endotélio, com a musculatura lisa dos vasos integrantes da microcirculação local e também

com as terminações nervosas próximas. O aumento da permeabilidade vascular ocorre á

nível venular e está ligado aos receptores H1, desta forma o efeito da histamina sobre os

vasos consiste em aumentar o calibre e a permeabilidade vascular, permitindo a passagem

de plasma para o interstício, o qual está associado ao desenvolvimento do edema

inflamatório (BONAMIN & ABEL, 1999).

A droga padrão de referência para este modelo experimental foi o Cloridrato de

prometazina onde o extrato apresentou uma ação similar ao seu efeito; os efeitos

farmacológicos das drogas antagonistas H1 podem ser caracterizados da seguinte forma:

inibição da musculatura lisa não vascular por antagonismo competitivo da histamina;

bloqueio total do aumento da permeabilidade vascular prevenindo a formação do edema e

ação anestésica local por bloqueio de receptores H1 das terminações nervosas presentes no

local inflamado (SPINOSA et al., 1999).

Segundo Maleki, 2001 na segunda fase da inflamação aguda induzida por carragenina

há a acumulação de PMN. Assim para avaliar o possível efeito sobre a inibição e infiltração

dos neutrófilos, foi realizada a migração leucocitária em modelo de peritonite induzidos por

carragenina em camundongos.

O extrato inibiu a migração leucócitária com efeito significativo na dose mais alta

utilizada (1g/Kg) apresentando uma redução do número de neutrófilos e mononucleares em

todos os intervalos de tempo analisados para esta dose, no entanto as demais doses não

foram tão mais eficientes que o diclofenaco sódico que foi utilizado como droga padrão

neste modelo de inflamação.

O efeito do extrato de V.scorpioides na inibição da migração leucócitária pode ser

confirmado através do exame histológico observado em edema de pata induzido pela

carragenina, revelando após a análise histológica acentuada inibição do edema e diminuição

53

da infiltração de neutrófilos no músculo plantar dos ratos em todos tratamentos utilizados

após a quarta hora da indução do edema, comparados ao grupo carragenina.

Segundo Robbins, 1994 os leucócitos aderem ao endotélio nas fases iniciais da

inflamação e atingem o espaço extravascular após a 2ª e 3ª hora da lesão inicial migrando

para o local da lesão.

Os resultados do experimento sobre a migração leucocitária em camundongos

demostram um aumento da migração leucocitária durante a 1ª hora após o estímulo

carragenina no peritônio dos camundongos, com uma diminuição da migração de se inicia

moderadamente na 2ª hora em todos os grupos analisados, observando-se uma tendência a

adaptação fisiológica com diminuição do número de leucócitos a partir a primeira hora do

experimento.

Segundo Martins, 1989 o fluido peritonial dos camundongos é excelente para o estudo

de leucócitos extravasculares devido a fatores como:

- O número de células livres do fluido peritonial é completamente constante em

camundongos não estimulados, ocorrendo uma tendência do sistema se reequilibrar

as medidas normais em manipulação experimental;

- Os camundongos parecem depender mais de fatores celulares que humorais;

- O fluido peritonial do camundongo não estimulado contém poucos neutrófilos, fato

que facilita detectar e medir o influxo de qualquer número de células.

De acordo com Vinegar et al., (1968), a mobilização de neutrófilos

(polimorfonucleares) resultantes da injeção intraperitonial de carragenina aumenta entre a

1ª e 3ª horas, sendo que a mobilização de monócitos (mononucleares) ocorre duas horas

após a presença dos neutrófilos. Este fato pode ser comparado e observado no grupo

controle carragenina; grupo tratado pelo diclofenaco sódico e nas duas doses utilizadas

com o extrato; onde na 4ª hora nota–se um pequeno aumento do número de células

mononucleares como revela a figura 15.

A administração oral do extrato na dose de 1 g/Kg após os 30 minutos da injeção

intraperitonial de carragenina inibiu de forma efetiva a mobilização celular de leucócitos

polimormonucleares (neutrófilos e mononucleares).

A curva da migração de leucócitos em todos os intervalos de tempo até a 4ª hora

analisados revela uma ostensiva diminuição de neutrófilos e mononucleares em todas as

54

doses, inclusive na dose de 0,45 g/Kg que na 1ª hora apresentou um número elevado de

células inflamatórias, sugerindo que a diminuição da resposta inflamatória é dependente da

dose do extrato pois as doses utilizadas apresentaram resultados diferentes para a migração

leucócitária tanto para a contagem total de células como na contagem diferencial das

células.

A redução dos polimorfonucleares, a leucopenia pode refletir algum efeito citotóxico de

antiinflamatórios não esteroidais. Segundo ALE et al, 1988, as drogas antiiflamatórias

atuam sobre a superfície da membrana plasmática dos leucócitos, particularmente dos

monócitos, prejudicando sua capacidade de movimentação e sua capacidade de fagocitose;

fato que pode ser atribuído á uma possível ação do extrato de V. scorpioides.

A ação farmacológica do extrato pode estar relacionada a presença de constituintes

químicos característicos a algumas espécies da família compositae a qual pertence a espécie

estudada como a presença de lactonas sesquiterpênicas, presença de flavonóides e

triterpenóides (MALEKI et al., 2001).

As lactonas sesquiterpênicas compreendem um dos constituintes químicos mais

abundantes e caracteristicos da família Compositae e que possivelmente sejam responsáveis

por desencadear grande parte da atividade farmacológica destas plantas (GIESBRECHT et

al. 1985; DAVINO,1989; LOPES, 1991; FREIRE, 1996).

Cerca de 90% das lactonas mencionadas na literatura científica foram isoladas de

espécies presentes na família Compositae, não existindo família na qual as lactonas

ocorram tão freqüentemente e com tal grau de diversidade (CUNHA, 1989).

Segundo Lopes, (1991) a atividade biológica de alguma lactonas sesquiterpênicas foram

investigadas com resultados positivos para atividade antimicrobiana como inibidora para

fungos e bactérias; no entanto nenhum efeito foi observado com glaucolide B (uma lactona

sesquiterpênica) testada em modelo de edema de pata induzido pela carragenina.

A atividade antiiflamatória de flavonóides foi investigada para a espécie Tanacetum

microphylun D.C (Compositae) apresentando atividade antiinflamatória com ação sobre o

ciclo da Lipoxygenase e síntese de prostaglandina (ABAD et al. 1995) quando testados em

modelo de edema de pata induzidos pela carragenina.

Foi investigado a ação de um outro flavonóide “o ternatin”, isolado de Egletes

viscosa Less (Compositae) em atividade anti-anafilática e antinflamatória concluindo que o

55

ternatin apresentou efeito antiiflamatório e propriedade anti-anafilática nos testes realizados

de alergias e pleurisia induzida por carragenina o que sugere que esta substância pode ser

utilizada como droga antialérgica como o disodium cromoglycate (DSGG) um tipo de

droga utilizada em tratamento de asma brônquica (SOUZA et al. 1992).

Alguns trabalhos sugerem a influência dos flavonóides com mecanismos envolvidos no

processo inflamatório (MALEKI et al., 2001; MANZUNDER et al., 2003). De acordo com

Vane (1971), os flavonóides podem inibir a atividade da enzima ciclooxigenase, o maior

mecanismo de ação comparada a atividade antiiflamatória dos clássicos AINES.

No entanto a ação dos triterpenos, um outro constituinte químico característico da

família Compositae pode também ser responsável pela a ação antinflamatória do extrato de

V. scorpioides onde Freire (2000), isolou e quantificou pela primeira vez um triterpeno, o

acetado de lupeol através de métodos fitoquímicos clássicos nas raízes, caules e folhas de

V. scorpioides podendo esta substância também estar influenciando na resposta

antiiflamatória da espécie estudada pois segundo Singh et al., (1997) existe um grande

número de triterpenos com atividade antiiflamatória fazendo parte da constituição de

drogas não esteroidais.

A atividade de um triterpeno foi avaliada em uma espécie vegetal conhecida como

Crataeva religiosa (Capparidaceae) uma planta que apresentava propriedades

antiiflamatórias onde foi comprovado o efeito antiinflamatório de um triterpeno isolado

desta planta (SINGH et al. 1997).

O presente trabalho abre perpectivas promissoras para o uso do extrato de

V. scorpioides como agente antiiflamatório. A comprovação deste fato e os possíveis

mecanismos de ação dos constituintes químicos requerem novas investigações.

56

6. CONCLUSÃO

Em vista dos resultados obtidos e dentro das condições em que foi realizada a presente

pesquisa, pode-se concluir que:

1- A administração intraperitonial do extrato hidroalcoóliico V. scorpioides em ratos

apresenta efeito inibitório nos modelos experimentais de inflamação aguda de edema

de pata tanto induzido por Carragenina como por histamina.

2- A administração oral do extrato hidroalcoóliico de V. scorpioides em camundongos

apresenta diminuição da migração leucocitária em modelo de peritonite induzido pela

carragenina, diminuindo o número de neutrófilos e células mononucleares migrantes.

3- A análise histológica confirma a inibição da infiltração leucocitária em edema de pata

induzido pela carragenina no tratamento realizado 30 minutos após a indução do edema e

com todas as doses utilizadas.

4- O melhor tratamento realizado foi o tratamento imediato após a indução do edema por

carragenina e por histamina.

57

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABAD, M. J.; BERMEJO, P. A. The activity of Flavonóides Extracted fron Tanacetun

microphylum D.C. (Compositae) on Soybean Lipoxigenase and Prostaglandin Synthetase.

Gen. Pharmac. v.26, n.24, p. 815 – 819, 1995.

ANDREUCCI, V. Caracterização farmacobotânica e farmacognóstica da espécie

V. scorpioides. In: CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA. 10., 2002, Bragança

Paulista. Anais... Bragança Paulista: USF, 2002. 62p.

ALBERTINE, R. Análise do efeito do laser de Baixa Potência (As-Ga-Al) em

Inflamação Aguda. 2001. 80f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) Instituto

de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba.2001.

ALBUQUERQUE V, P.; ANDRADE, L. H .C. Fitoterapia uma alternativa para quem?

Fitoterapia. v. 43, p. 1 – 15, 2004.

ALLE, N.; ALLE , N. F.; MARCHESANO, L. H. Determinação dos efeitos das drogas

antiiflamatórias não esteróides (Indometacina, Butazona, Clinoril, Naprozil, Benflogin e

Inflaril) nos Leucogramas de ratos portadores de processo inflamatório crônico. Rev

Odont. USP. v. 2, n.2, p. 120 – 126, abr./jun., 1988.

BACHI, E. M.; Estudo farmacológico da ação antiúlcera dos extratos de Styrax

camporum POHL e Caesalpinia ferera Martius. 1988. 252 f. Tese (Doutorado) – Instituto

de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo.1988.

BONAMIN, L. V.; ABEL, M. N. C. Histamina, Serotonina e seus Antagonistas. In

SPINOSA ,H. S.; GÓRNIAK, S. L. ; BERNADI, M. M.(Ed.). Farmacologia aplicada á

medicina veterinária. 2. ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1999. p. 183 – 191.

BRITO, A.S. Manual de ensaios toxicológicos in vivo. Campinas: Editora da Unicamp,

1994.

58

BRASILEIRO FILHO, G. Bogliolo patologia geral . 2ª ed. Rio de Janeiro. Guanabara

Koogan, 1998, 312 p.

BROOKS, P. M. ; DAY, R. O. Nonsteroidal antiinflamatory drugs – differences and

similarities. N. Engl. J. Med.,v. 324, p. 1716 – 1725, 1991.

BURITOVA, J.; HONORE, P; CHAPMAN,V.; BESSON, M. J. Concurrent reduction of

inflamation and spinal Fos – LI neurons by sytemic diclofenac in the rat. Neurocience

Letter. v.188, p.177 – 178, 1995.

CABRERA, A. L.; KLEIN, R. M. Flora Ilustrada Catarinense. Itajaí , S.C: IOESC –

CNPQ, 1980. 480p.

CARLINE , E. A. Pesquisas com plantas brasileiras usadas em medicina popular. Rev. Ass.

Méd. Brasil. v. 29, n.8, p. 109 – 110, maio/ junho, 1983.

CARVALHO, S. M.; COSTA, C.G.; KITAJIMA, E.W. Células de transferência em

Vernonia scorpioides (Lam) Pers (Compositae). Rodriguésia, Rio de Janeiro. v.36, n.60,

p. 69 – 72, jul/set. 1884.

CARVALHO, W. A . Mecanismo de ação das drogas antiiflamatórias não esteróides. I –

Ações farmacológicas das prostaglandinas e leucotrienos. Farmacologia médica (Br). v.

100, n.1-2, p.37 – 44, 1990.

CARVALHO, J. C. T.; SETIE, J. A. A. ; BARBOSA. M. V. J.; PATRÍCIO, K. C. M.;

CAPUTO, L. R. G.; SARTI, S. J.; FERREIRA, L. P.; BASTOS, J. K. Anti – inflamatory

activy of the crude extract fron the fruits of Pterodon ermaginatus Vog. Journal of

Etnopharmacology. v. 64, p.127 – 133. 1999.

59

CARVALHO, A.; BONAMIM, L. V. Efeitos da administração da Arnica Montana (tintura

mãe e preparações dinamizadas 6 CH) na atividade de diferentes agentes flogísticos em

ratos. Pesquisa homeopática. v.16, p. 31 – 43. 2001.

COELHO, C. F. Efeito da terapia com Óxido nítrico inalatório sobre edema de pata

induzido por carragenina em camundongos. 2004. 77f. Dissertação (Mestrado em

Ciências Biológicas). Instituto de pesquisa e Desenvolvimento. Universidade do Vale do

Paraíba.2004.

CORREA, M. P.; PENNA, L. A. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas

cultivadas. Rio de Janeiro, Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal, 1984. v. 6,

255p.

CORREA, F. I. Comparação do efeito antinflamatório dos laseres de baixo potência

AsGa (904 nm) e AsGaAl (630 – 670 nm) em modelo experimental de edema de pata

em ratos e peritonite em camundongos induzidos por carragenina,LPS e 48/80. 2001.

82f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica). Instituto de Pesquisa e

Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba. 2001.

COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; ROBBINS, S. L. Pathologic basis of disease. 4.ed.

Philadelphia: Saunders, 1989. p. 39 – 71.

COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; ROBBINS, S. T.; Robbins Patologia estrutural e

funcional. 5. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996.

COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; ROBBINS, S. T. Robbins Patologia estrutural e

funcional. 6.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2000.

CUNHA, R. W. Estudo Fitoquímico e Ensaios Biológicos de Lichnophora rupestris,

Samir Leitão (Vernoniae, compositae). 1989. 160f. Tese (Doutorado em Ciências):

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP. Ribeirão Preto.1989.

60

DAVINO, S. C. Estudo in vitro da atividade antifúngica e antibacteriana de extrato de

plantas brasileiras da família Compositae (Asteraceae) e alguns de seus constituintes.

1989. 115f. Dissertação (Mestrado em Ciências). USP. São Paulo.

DI ROSA, M.; WILLOUGHBY, D. A. Screens for anti-inflamatory drugs. J. Pharm.

Pharmac. v.23, p 297 – 298, 1971.

DI ROSA, M. Review. Biological proprieties of Carragenan. J. Pharm. Pharmac. v. 24, p.

89 – 102, 1972.

DREW, M. G. B.; HITCHAMAN, S.P.; MANN, J. X Ray Cristal struture of the

sesquiterpene lactone scorpioidine. J. C. S. Chem. Comm, Cambrige, v.27, p.802-803,

1980.

FATURETO, M. C.; SIMÕES, M. J.; TEIXEIRA, V. P. A.; GOLDENBERG, S. Aspectos

morfológicos e morfométricos do processo inflamatório provocado por fio de catecute

simples no subcutâneo de ratos tratados com diclofenaco sódico. Acta Cir. Bras. v.4, p. 5

– 9. 1999.

FARMACOPÉIA DOS ESTADOS UNIDOS DO BRASIL. 2.ed São Paulo: Indústria

gráfica Siqueira, 1959. p. 448, 666, 901.

FREIRE, M. F. I.; ABREU, H. S; CRUZ ,L. C. H; FREIRE, R. B. Inibition of fungal

grouth by extract of Vernonia scorpioides (Lam) Pers. Rev. Microbial, São Paulo,.v. 27, p.

1 - 6, 1996.

FREIRE, M. F. I. Obtenção, Qualificação e Atividade Biológica de Acetato de Lupeol

oriundo de Vernonia scorpioides (Lam) Pers silvestre ou cultivada em diferentes doses

de Nitrogênio e fósforo. 2000. 131f. Tese ( Doutorado em Ciências do Solo). Universidade

Federal Rural do Rio de Janeiro.2000.

61

GAD, S. C.; CHENGELIS, C. P. Acute Toxicology Testing. 2.ed. New York:Academic

press. 1998. 255 p.

GARCIA LEME, J. Métodos experimentais no estudo da resposta inflamatória. Rev. Bras.

Reumat. v. 19 ,n. 5 , p.146 – 150, out. 1979.

GIESBRECHT, A. M.; LOPES, J. N. C. ; WIRCHNERWSKI. Antibiotic activity of

extracts and of constituintes of Compositae species. Brasilian J. Med. Biol. Res. v. 18, p. 5

– 6. 1985.

GOETZL, E .J. Mediator of immediate hypersensivity derived fron aracdônic acid. N.

Engl. J. Med. v. 303, p. 822 - 825, 1980.

GOMES, D. C.; RIVIERA, V.; GIL, E. R; VALERI, B.V.; TRIANA, J. X Ray struture of

6-deoximikanokryptin, a New Guaianolide from Vernonia scorpioides Pers. Acta Cryst.

v.43, n.11, p.2216 - 2218, 1987.

GOODMAN ; GILMAN. As bases farmacológicas em terapêutica. 9ed. Rio de Janeiro:

Legos, 1996. 1436p.

HARBONE, J.B.; WILLIANS, C. A.Vernonia; Chemical review. In: HEYWOOD,V. H.;

TUNER, L. 9Ed.) The biology and chemistry of the Compositae. London: Academic

Press, 1977. p. 523 – 537.

KELLEY, S. G. ; JONES, S. B. Distribuition of pollen types in Vernonia (Vernoniae:

Compositae) Syst. Bot., v. 4, p. 195 – 202, 1979.

LANSEN, G.L. ; HENSON, P.M. Mediators of inflammation. Rev. Immunol. v. 1, p. 335

–359, 1993.

62

LEITE, S. N; PALHANO, S.; ALMEIDA, M. W. B. Wound healing activity and systemic

efects of Vernonia scorpiodes extract in guinea pig. Fitoterapia. v.73, p. 496 - 500, 2002.

LOPES, J. L. C.; Sesquiterpene lactones from Vernonia. Mem. Inst. Oswald Cruz, Rio de

Janeiro. v. 86. Supl. II p.227 - 230, 1991.

LORENZI, H. Ervas daninhas do Brasil. São Paulo: Ed. Do autor, 1982. 108p.

MALEKI, N.; GARJANI, A.; NAZAMIYLH, H.; NILFOUROUSHAN, N.; EFTEKHAR,

S.; ALLAMEH, Z.; HASANNIA, N. Potent anti-inflamatory activies hidroalcoolic extract

fron aerial parts of stachys inflata on rats. Journal Ethnopharmacology. v. 75. p. 213 –

218, 2001.

MARTINS, D. AP.A. S. Efeitos do paracetamol na permeabilidade capilar e migração

leucocitária. Estudo experimental em camundongos (M. Muscularis) . 1989. 77f.

Dissertação (Mestrado em Farmacologia) Faculdade de odontologia de Piracicaba da

Universidade Estadual de Campinas.1989.

MANZUMDER, V. K.; GUPTA, M.; MANIKANDAN, G. M.; BRATTACHARYA, S. K.;

HALDAR AND ROY, S. Evoluation of antiinflamatory activy of vernonia cinerea less.

extract in rats. Phitomedicine. v.10, p.185 – 188, 2003.

MENDES, A. M. C. Triterpenos e a atividade imunossupressora de Vernonia

scorpioides Pers. (Asteracea). 2001. 77f. Dissertação. (Mestrado em Ciências Biológicas e

Ambiente).Universidade do Maranhão, São Luis.2001.

MONTEIRO, M. H. D. Avaliação da toxidade do “Assa peixe” Vernonia condensata

Becker (Asteracea). 1996. 110 f. Dissertação ( Mestrado em Saúde Pública) Escola

Nacional de Saúde pública ( ENSP/ Fiocruz).1996.

63

MONTENEGRO, M. R..; FRANCO, M. Patologia, Processo gerais. São Paulo: Atheneu,

1999.

PEGORARO, D. H. Avaliação do efeito antiinflamatório do extrato Bruto Seco das

raízes da Petiveria alliacea L. (Phytolaccaceae) 1994. 117f. Dissertação ( Mestrado em

Ciências Biomédicas) Universidade de são Paulo. 1994.

ROBBINS, COTRAN, Kumar ; ROBBINS. Patologia estrutural e funcional. 3ª ed. Rio

de Janeiro: Guanabara Koogan, 1994.

SILVA, J. C. Prostaglandinas: alguns aspectos de sua participação no processo

inflamatório. C. C. S. v.8, n. 4, p. 37 – 38, out, nov, dez , 1986.

SINGH, S.; BANI,C.B.; SINGH. Antiiflamatory activity of lupeol. Fitoterapia. v. 62,n.1,

p.9 – 16, 1997.

SIQUEIRA, J .F. JR.; DANTAS, C. J. S. Mecanismos celulares e Moleculares da

INFLAMAÇÃO. Rio de Janeiro:MEDSi , 2000. 238 p.

SOUZA, M. F.; RAO, V. S.; NAND, S.E .R.; Anti – anaphylacti and Anti inflamatory

effect of Ternatim, a Flavonóide isolated fron Egletes viscosa Less. Brasilian j. Med. Res

v.25, p. 1029 – 1032. 1992.

SPINOSA, H. S.; GORNIAK, S.L.; BERNADI, M. M. Farmacologia apliacada á

medicina veterinária. 2. ed. Rio de janeiro: Guanabara Koogam, 1999. 480p.

SPECTOR, V. G.; WILLOUGHBY. The activation by irritants of Slow – contracting

substances, and their relation to the vascular changes of inflamation in the rat. J. Path.

Bact. v.84 , p. 391 – 402. 1962.

64

TEDGUI, M.; MALLAT, Z. Anti- inflammatory Mechanisms in the Vascular Wall.

Circulation Research. v.88, p. 877 –887, 2001.

VAN ARMAN, C. G.; BEGANY, A. J.; MILLER, L. M.; PLESS, A. H. Some details of

the inflamations caused by yeast and carrageenin. J. Pharmacol. Exp. Ther. v.150, p. 328

– 334, 1965.

VANE, J. R. Inibition of prostaglandin synthesis as a mechnism of action for aspirin – like

drugs. Nature (New Biol). v. 231, p. 232 – 235, 1971.

VINEGAR, R.; SCHREIDER, W. AND HUGO R. Biophasic development of carrageenin

edema de pata in rats. Journal of Pharmacoloc and Experimentl Therapeutics v. 166, n.

1, p. 96 - 103, 1968.

WARNING, V. et al. Scorpiolide, a new type of sesquiterpene lactone fron Vernonia

scorpioides. Liebigs Ann. Chemm. v.5, p.467 - 468, 1987.

WILLIS, A. L. Parallel assay of prostaglandin – like activy in rat inflammatory exudates by

means of cascade supervision. Journal of Pharmacology and Experimental Terapeutics.

v. 21, p. 126 – 128, 1969.

WHITE, M. Mediator of inflamation and the inflamatory process. J. Allergy Clin

immunol. v. 103, n. 3. p. 378 – 381, 1999.

WINTER, A. R. Carrageenin: Induced Edema in hind Paw of the rat as an assay for

Antiinflamatory Drugs. Merch Institute for therapeutic. v. 3, p. 544 – 547, 1962.

YOSHIKAI, Y. Roles of prostaglandins and leukotrienes in acute inflammation caused by

bacterial infection. Current opinion infectious Diseases. v. 14, p. 257 – 263. 2001.

65

YUNES, A. R.; PEDROSA, R.C.; FILHO, V. C. Fármacos e Fitoterápicos: a necessidade

de desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Química Nova.

v. 24, n. 1, p. 146 – 152, 2001.

66

ANEXOS A – Aprovação pelo Comitê de Ética B - Classificação da espécie Vernonia scorpióides

universidade do vale do paraíba instituto de pesquisa e ...§ão do efeito anti... · elisa...

Documents