protocolo de pesquisa - app.uff.br final_ana paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta...

84
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS ANA PAULA BLACK DREUX EFEITOS DA DIETA HIPOPROTEICA NOS NÍVEIS DE TOXINAS URÊMICAS DE PACIENTES RENAIS CRÔNICOS EM TRATAMENTO CONSERVADOR: O PAPEL DA MICROBIOTA INTESTINAL NITERÓI-RJ 2017

Upload: tranthuy

Post on 28-Jan-2019

232 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

ANA PAULA BLACK DREUX

EFEITOS DA DIETA HIPOPROTEICA NOS NÍVEIS DE TOXINAS URÊMICAS DE

PACIENTES RENAIS CRÔNICOS EM TRATAMENTO CONSERVADOR: O PAPEL

DA MICROBIOTA INTESTINAL

NITERÓI-RJ

2017

Page 2: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

II

ANA PAULA BLACK DREUX

EFEITOS DA DIETA HIPOPROTEICA NOS NÍVEIS DE TOXINAS

URÊMICAS DE PACIENTES RENAIS CRÔNICOS EM TRATAMENTO

CONSERVADOR: O PAPEL DA MICROBIOTA INTESTINAL

Tese submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense como parte

dos requisitos necessários à obtenção do Grau

de Doutor. Área de Concentração: Ciências

Médicas.

ORIENTADORA: PROFa. DR

a. DENISE MAFRA

CO-ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ CARLOS CARRARO-EDUARDO

NITERÓI-RJ

2017

Page 3: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

III

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Dreux, Ana Paula Black.

Efeitos da dieta hipoproteica nos níveis de toxinas urêmicas de pacientes renais

crônicos em tratamento conservador: o papel da microbiota intestinal. Ana Paula

Black Dreux – Niterói: UFF, 2017.

Número de páginas: 84

Orientadora: Denise Mafra

Co-orientador: José Carlos Carraro Eduardo

Tese (Pós-Graduação Stricto-Sensu) – UFF/ FN- Programa de Pós-Graduação em

Ciências Médicas, 2017.

Referências Bibliográficas: f. 64-80

1. Doença renal crônica 2. Dieta com restrição de proteínas 3. Microbiota

intestinal 4.Toxinas urêmicas

I. Mafra, Denise. II. Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Nutrição

Emília de Jesus Ferreiro, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas. III.

Título.

Page 4: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

IV

ANA PAULA BLACK DREUX

EFEITOS DA DIETA HIPOPROTEICA NOS NÍVEIS DE TOXINAS URÊMICAS DE

PACIENTES RENAIS CRÔNICOS EM TRATAMENTO CONSERVADOR: O PAPEL

DA MICROBIOTA INTESTINAL

Tese submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense

como parte dos requisitos necessários

à obtenção do Grau de Doutor. Área

de Concentração: Ciências Médicas.

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________________

Prof. Dr. Clóvis Orlando Pereira da Fonseca

Universidade Federal Fluminense

______________________________________________________________________

Profa. Dr

a. Ludmila Ferreira Medeiros de França Cardozo

Universidade Federal Fluminense

______________________________________________________________________

Profª. Drª Milena B. Stockler-Pinto

Universidade Federal Fluminense

______________________________________________________________________

Profa. Dr

a. Flávia Lima do Carmo

Universidade Federal do Rio de Janeiro

______________________________________________________________________

Prof. Dr. Alvimar Gonçalves Delgado

Universidade Federal do Rio de Janeiro

NITERÓI-RJ

2017

Page 5: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

V

Ao Meu amado Deus, sou muito grata por este presente maravilhoso. Agradeço também pelas

pessoas que o Senhor colocou em meu caminho. Algumas delas me inspiraram, me ajudaram, me

desafiaram e me encorajaram a ser cada dia melhor.

Page 6: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

VI

Agradecimento

Ao meu amado amigo e marido Fernando, pelo grande incentivo e pela compreensão em

adiarmos nossos planos familiares em detrimento do meu sonho profissional.

À minha família, pelo amor e torcida por mais uma conquista.

Às minhas amigas, Cassia, Juliana e Rosane por entenderem minha ausência durante suas

gestações, mas por terem certeza do meu amor sincero por elas. Às minhas amigas Deise e Fátima

e à minha querida tia Eridane, pelo companheirismo e incentivo em cada etapa da minha vida.

À minha querida orientadora Denise Mafra por me dar essa oportunidade de aprender um

pouquinho mais, por compartilhar comigo toda sua experiência no cuidado com os pacientes e no

mundo da pesquisa.

Ao meu amigo e coorientador Carraro por me ensinar a dar valor às pessoas, além de

dividir comigo todo seu conhecimento científico.

Às excelentes estagiárias Bruna, Daiane, Drielly e Greice, pela ajuda em todas as etapas

da pesquisa.

A todos os pacientes que concordaram em participar desse estudo, permitindo o

aprimoramento do conhecimento científico em Nefrologia.

À professora Nara Xavier Moreira e suas estagiárias pela colaboração nas oficinas

culinárias no laboratório de Técnica Dietética da Faculdade de Nutrição – UFF.

À professora Vivian Wahrliche e à técnica Ana Paula Santos por cuidarem tão bem dos

pacientes no Laboratório de Avaliação Nutricional e Funcional da UFF-LANUFF.

Ao professor Beni Olej coordenador da Unidade de Pesquisa Clínica (HUAP/UFF) onde

foram realizadas algumas etapas da pesquisa e ao LABNE-UFF por realizar as análises

bioquímicas.

Aos professores Dennis Carvalho e Flávia L. Carmo do Instituto de microbiologia da

UFRJ, por me ajudarem na análise da microbiota intestinal, etapa fundamental da minha

pesquisa.

À chefia do Serviço de Nutrição e à Direção do HUAP/UFF por todo incentivo dado a

mim.

A todos os professores e às secretárias da Pós-Graduação em Ciências Médicas, em

especial a Orlandina, sou muito grata por toda a ajuda.

Page 7: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

VII

“Que seu remédio seja seu alimento, e que seu alimento seja seu remédio”.

Hipócrates

Page 8: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

VIII

RESUMO

Introdução: A dieta hipoproteica é uma das intervenções mais importantes para o paciente com

doença renal crônica (DRC) em tratamento conservador, pela sua atuação na modulação da

disbiose intestinal, reduzindo o influxo para o plasma de toxinas urêmicas, tais como indoxyl

sulfato (IS), ácido indol-3-acético (AIA), p-cresyl sulfato (p-CS) produzido pela microbiota

intestinal. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da dieta hipoproteica sobre o

perfil microbiano intestinal, bem como sobre a geração de toxinas urêmicas em pacientes com

DRC em tratamento conservador. Métodos: Trata-se de um estudo longitudinal, com 30

pacientes com DRC em tratamento conservador, acompanhados por 6 meses após intervenção

nutricional com dieta hipoproteica. A adesão à dieta foi monitorada através do Equivalente

Proteíco do Aparecimento de Nitrogênio (nPNA). Foi considerada adesão à dieta quando a

ingestão de proteína estava entre 90 e 110% da quantidade prescrita (0,6g/kg/dia). A ingestão

alimentar foi analisada pelo método de recordatório de 24 horas. Os parâmetros antropométricos,

bioquímicos e perfil lipídico foram medidos de acordo com métodos padrão. As concentrações

séricas de toxinas urêmicas (IS, p-CS, AIA) foram obtidas por cromatografia líquida de fase

reversa (HPLC). As amostras fecais foram coletadas para avaliar o perfil da microbiota intestinal

por meio da Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) e da Eletroforese em Gel com Gradiente

Desnaturante (DGGE). Os pacientes foram divididos em 2 grupos: pacientes com boa adesão à

dieta (N=14) e pacientes que não apresentaram boa adesão à dieta (N=16). A análise estatística

foi realizada pelo software do programa SPSS 23.0.

Resultados: Pacientes com boa adesão à dieta (nPNA = 0,7 ± 0,2g/kg/dia) tiveram aparente

melhora da função renal e apresentaram redução significativa das concentrações séricas de

colesterol total e LDL-c (183,9±48,5 a 155,7±37,2 mg/dL, p=0,01; 99,4±41,3 a 76,4±33,2 mg/dL,

p=0,01, respectivamente). Após 6 meses de intervenção nutricional, os níveis séricos de p-CS

foram significativamente reduzidos no grupo com boa adesão à dieta prescrita [ de 19,3 (9,6-24,7)

para 15,5 (9,8-24,1) mg/L, p=0,03] e, em contraste, suas concentrações foram aumentadas em

pacientes que não tiveram boa adesão [ de 13,9 (8,0-24,8) para 24,3 (8,1-39,2) mg/L, p=0,004].

Não houve diferença no número médio de bandas de acordo com a técnica de DGGE, após

intervenção nutricional (grupo adesão: de 29,2 ± 9,6 para 27,1 ± 4,2 bandas, p = 0,56; grupo não

adesão: de 26,1 ± 6,8 para 28,3 ± 5,8 bandas, p = 0,36). No entanto, o número médio de bandas

foi positivamente associado à ingestão de proteína (r = 0,44, p = 0,04). Além disso, utilizando a

técnica de DGGE, observou-se mudança no perfil da microbiota intestinal após intervenção em

ambos os grupos, mas não foi possível perceber similaridade entre eles.

Conclusão: Além da melhora da função renal, a dieta hipoproteica pode ser boa estratégia para

reduzir a produção de toxinas urêmicas produzidas pela microbiota intestinal. Estudos utilizando

técnicas moleculares mais robustas são necessários para confirmar a eficácia da dieta hipoproteica

na modulação da microbiota intestinal de pacientes com DRC em tratamento conservador.

Palavras chave: Doença renal crônica, dieta com restrição de proteínas, microbiota intestinal,

toxinas urêmicas.

Page 9: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

IX

ABSTRACT

Introduction: Low protein diet (LPD - 0.6g/kg/d) is one of the most important interventions for

chronic kidney disease (CKD) patients in conservative treatment, for its role in modulating

intestinal dysbiosis by reducing the influx of uremic toxins such as indoxyl sulfate (IS), indole-3-

acetic acid (IAA) and p-cresyl sulphate (p-CS) which are produced by fermentation of amino

acids by the gut microbiota. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of the LPD in

the gut microbial profile, as well as the generation of uremic toxins in non-dialysis CKD patients.

Methods: Longitudinal study with 30 non-dialysis CKD patients followed for 6 months after

nutritional intervention with LPD. Adherence to the diet was evaluated based on the calculation

of protein equivalent of nitrogen appearance (nPNA). Good adherence to LPD was considered

when protein intake was from 90 to 110% of the prescribed amount (0.6g/kg/day). Food intake

was analyzed by the 24-hour recall method. The anthropometric, biochemical and lipid profile

parameters were measured according to standard methods. Uremic toxins serum levels (IS, p-CS,

IAA) were obtained by high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). Fecal samples

were collected to evaluate the gut microbiota profile through polymerase chain reaction (PCR)

and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Patients were divided into 2 groups:

patients who adhered to LPD (N=14) and patients who did not adhere to the diet (N=16).

Statistical analysis was performed by the SPSS 23.0 program software.

Results: Patients who adhered to the diet (nPNA = 0.7 ± 0.2 g / kg / day) had an apparent

improvement in renal function and significant reduction in total and LDL cholesterol (183.9

±48.5 to 155.7 ± 37.2 mg/dL, p=0.01; 99.4 ± 41.3 to 76.4 ± 33.2 mg/dL, p=0.01, respectively).

After 6 months of nutricional intervention, p-CS serum levels were reduced significantly in

patients who adhered to the LPD [19.3 (9.6-24.7) to 15.5 (9.8-24.1) mg/L, p=0.03] and in

contrast, the levels were increased in patients who did not adhere [13.9 (8.0-24.8) to 24.3 (8.1-

39.2) mg/L, p=0.004]. There was no change in the average number of bands according DGGE

after LPD intervention (adhesion group: from 29.2 ± 9.6 to 27.1 ± 4.2 bands, p=0.56; non-

adhesion group: from 26.1 ± 6.8 to 28.3 ± 5.8 bands, p=0.36; data not shown). However, the

average number of bands was positively associated with protein intake (r=0.44, p= 0.04). In

addition, using the DGGE technique, it was observed change in the intestinal microbiota profile

after LPD intervention in both groups, but it was not possible to perceive a clustering microbial

profile within each group. Conclusion: Besides the improvement of renal function, LPD may be

a good strategy to reduce the uremic toxins production by the gut microbiota. More studies using

molecular techniques are needed to confirm the effectiveness of LPD in the the gut microbiota

modulation in non-dialysis CKD patients.

Key words: chronic kidney disease, dietary protein restriction, gut microbiota, uremic toxins.

Page 10: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

X

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Quadro 1 Categorias da doença renal crônica de acordo com a taxa de filtração glomerular e

albuminúria.....................................................................................................................................20

Quadro 2 Cálculo da estimativa de ingestão proteica (nPNA) para pacientes com DRC em fase

pré-diálise.......................................................................................................................................41

Quadro 3 Classificação do estado nutricional de adultos de acordo com o IMC, baseado nos

critérios da WHO............................................................................................................................43

Quadro 4 Valores de referência para percentuais de gordura corporal........................................44

Figura 1 Representação esquemática da origem e síntese das principais toxinas urêmicas do

microbioma do intestino em disbiose, modificação subsequente no fígado e secreção na

circulação........................................................................................................................................33

Figura 2 Disbiose e doença renal crônica (DRC)........................................................................36

Figura 3 Fluxograma de avaliação de pacientes com DRC em tratamento conservador antes e

após intervenção nutricional……………………………………………………………………...40

Figura 4 Fluxograma do estudo………………………………………………………………...50

Figura 5 Correlação entre a ingestão proteica e perfil da comunidade microbiana de amostras

fecais...............................................................................................................................................56

Figura 6 Análise de componente principal (PCA) e clustering de perfis de DGGE para genes de

16S rRNA..…………..…………………………………………..................................................57

Page 11: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

XI

LISTA DE TABELA

Tabela 1 Efeito da LPD nos parâmetros antropométricos e de ingestão alimentar em pacientes

com DRC em tratamento conservador............................................................................................52

Tabela 2 Efeito da LPD nos parâmetros bioquímicos em pacientes com DRC em tratamento

conservador……………………………………………………………………………………….53

Tabela 3 Efeito da LPD nas concentrações séricas de toxinas urêmicas em pacientes com DRC

em tratamento conservador.............................................................................................................55

Page 12: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

XII

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AGCC Ácidos Graxos de Cadeia Curta

AIA Ácido indol-3-acético

AhR Receptor de Aril Hidrocarboneto

CC Circunferência da Cintura

DCV Doença Cardiovascular

DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Eletroforese em Gel com Gradiente

Desnaturante)

DRC Doença Renal Crônica

DXA Absorciometria com Raio-x de Dupla Energia

EDTA Etilenodiaminotetracético

IL Interleucina

IS Indoxyl Sulfato

IMC Índice de Massa Corporal

LPD Low Diet Protein (Dieta Hipoproteica)

LPS Lipopolissacarídeo

MDRD Modification of Diet in Renal Disease

NKF National Kidney Foundation

NUU Nitrogênio Uréico Urinário

PAMPS Padrões Moleculares Associados à Patógenos

PCR Polymerase Chain Reaction (Reação de Polimerização em Cadeia)

PCR-us Proteína C Reativa Ultrasensível

p-CS P-Cresyl Sulfato

nPNA Equivalente Protéico do Aparecimento do Nitrogênio Total

PTH Paratormônio

R-24 Recordatório de 24 horas

TFG Taxa de Filtração Glomerular

TGF Transforming Growth Factor

TIMP Metaloproteinase

TRS Terapia Renal Substitutiva

Page 13: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

XIII

TLR Toll Like Receptor (Receptor Toll-Like)

TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa

VLPD Very low-protein diet (Dieta muito hipoproteica)

WHO World Health Organization

Page 14: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

XIV

SUMÁRIO

1.0 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA...................................................................................16

2.0 REVISÃO DE LITERATURA..............................................................................................19

2.1 DOENÇA RENAL CRÔNICA...............................................................................................19

2.2 TERAPIA FARMACOLÓGICA E NUTRICIONAL NA DOENÇA RENAL CRÔNICA....23

2.3 DIETA HIPOPROTEICA NA DOENÇA RENAL CRÔNICA..............................................24

2.4 MICROBIOTA INTESTINAL................................................................................................27

2.5 TOXINAS URÊMICAS PROVENIENTES DA MICROBIOTA INTESTINAL...................31

2.6 MICROBIOTA INTESTINAL E DOENÇA RENAL CRÔNICA..........................................34

3.0 OBJETIVOS...........................................................................................................................38

3.1 GERAL....................................................................................................................................38

3.2 ESPECÍFICOS.........................................................................................................................38

4.0 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................................39

4.1 CASUÍSTICA..........................................................................................................................39

4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO........................................................................39

4.3 DESENHO EXPERIMENTAL...............................................................................................39

4.4 INGESTÃO ALIMENTAR E OFICINA CULINÁRIA..........................................................41

4.5 ESTADO NUTRICIONAL.....................................................................................................42

4.6 COLETA E ANÁLISE DE MATERIAL BIOLÓGICO..........................................................44

4.7 PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DE ROTINA.....................................................................45

4.8 DETERMINAÇÃO DAS TOXINAS URÊMICAS................................................................45

4.8.1 Determinação dos níveis séricos das toxinas urêmicas p-CS, IS e AIA.......................45

4.9 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL.......................46

4.9.1 Coleta e análise de espécimes (fezes)...............................................................................46

4.9.2 Extração de DNA..............................................................................................................46

4.9.3 Reação de polimerização em cadeia (PCR) do gene 16S rRNA....................................47

4.9.4 Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE - Deanturing Gradient Gel

Electrophoresis).............................................................................................................................47

5.0 ANÁLISE ESTATÍSTICA.....................................................................................................49

Page 15: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

XV

6.0 RESULTADOS.......................................................................................................................50

7.0 DISCUSSÃO...........................................................................................................................58

8.0 CONCLUSÃO.........................................................................................................................63

9.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................64

10.0 APÊNDICES.........................................................................................................................81

10.1. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO...........................................81

10.2. RECORDATÓRIO DE 24 HORAS.....................................................................................83

11.0 ANEXOS................................................................................................................................84

11.1. APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA DA FACULDADE DE MEDICINA/UFF........84

Page 16: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

16

1.0. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

A doença renal crônica (DRC) é uma síndrome clínica decorrente da perda progressiva e

irreversível das funções renais, ocasionando diversas complicações e significante

morbimortalidade, uma vez que os rins desempenham importante papel na manutenção da

homeostasia corporal (KDIGO, 2009). Sua incidência e prevalência têm aumentado em todo o

mundo, apresentando alto custo para as instituições de saúde, principalmente em pacientes com

insuficiência renal terminal devido à necessidade de se iniciar a terapia renal substitutiva (TRS)

somado ao alto risco de complicações do tratamento e à piora da qualidade de vida (Scalone et

al., 2010).

A falência renal e as doenças cardiovasculares (DCV) são os principais desfechos adversos da

DRC, os quais podem ser prevenidos pela identificação imediata e tratamento das complicações e

comorbidades associadas à doença (Bastos et al., 2009). Dentre os fatores de risco para o

desenvolvimento de DCV, existem os fatores de risco cardiovasculares tradicionais, já bem

estabelecidos na literatura, como hipertensão, dislipidemia, diabetes, tabagismo, entre outros, e os

fatores não tradicionais, tais como estresse oxidativo, disfunção endotelial, calcificação aórtica e

inflamação (Storino et al., 2015). Além disso, recentemente, tem-se estudado o acúmulo de

toxinas urêmicas como fator preditor de DCV e mortalidade em pacientes com DRC (Sallée et al.,

2014; Dou et al., 2015).

Muitas toxinas urêmicas são provenientes da fermentação de aminoácidos da dieta pela

microbiota intestinal (Briskey et al., 2016). Bactérias anaeróbias facultativas, incluindo os

gêneros Bacteroides, Lactobacillus, Enterobacter, Bifidobacterium, e especialmente Clostridium,

promovem a fermentação dos aminoácidos tirosina e fenilalanina com produção de p-cresyl. A

Escherichia coli metaboliza o triptofano, resultando na produção de indol que é

subsequentemente metabolizado a indoxyl sulfato (IS) ou a ácido indol-3-acético (AIA) (Salleè et

al., 2014; Briskey et al., 2016). Alguns destes compostos são encontrados na urina de seres

humanos saudáveis. Porém, em indivíduos com DRC, há o acúmulo dessas toxinas na corrente

sanguínea levando a um quadro de inflamação sistêmica e de estresse oxidativo com consequente

desenvolvimento de DCV (Meyer & Hostetter, 2012).

Page 17: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

17

Intervenções farmacológica e nutricional são utilizadas para reduzir as concentrações de

solutos urêmicos. Dentre as intervenções, tem-se a modulação da capacidade de absorção

intestinal, através da redução da quantidade ingerida de seus precursores ou das toxinas e

remoção extracorpórea. O uso de medicamentos, tais como o adsorvente oral AST-120 e

quelantes de fosfatos removem parte dos solutos acumulados no trato gastrointestinal. Já os

prebióticos e probióticos atuam na recolonização da microbiota intestinal. Como última instância,

tem-se a implementação de TRS (hemodiálise e diálise peritoneal) que removem parte dos solutos

acumulados no sangue (Barreto et al., 2014).

Outra alternativa para diminuir a produção de toxinas urêmicas seria limitar a produção de

solutos pela modificação do alimento fornecido à microbiota do cólon, uma vez que estes solutos

são derivados de aminoácidos dietéticos (Meyer & Hostetter, 2012). Sabendo-se que a ingestão de

proteína dietética apresenta forte relação com a produção destas toxinas, são necessários maiores

esclarecimentos sobre qual seria a quantidade de ingestão proteica recomendada para promover

tais benefícios (Mafra et al., 2013).

Dessa forma, o hábito alimentar é fundamental na determinação da modulação da composição

da microbiota intestinal e, alterações na dieta estão associadas com alterações na sua composição

(Sonnenburg & Bäckhed, 2016). Outros fatores também podem ocasionar a disbiose intestinal,

como por exemplo, fatores iatrogênicos ou a uremia per se. A perda da função renal leva a

secreção de ureia no trato gastrintestinal, sendo hidrolisado pela urease expressa por alguns

microrganismos do intestino, resultando na formação de grandes quantidades de amônia, o que

poderia afetar o crescimento de bactérias comensais (Ramezani & Raj, 2014).

A intervenção nutricional especificamente com a prescrição de dieta hipoproteica (LPD,

em inglês: low protein diet) tem sido proposta há décadas como um dos maiores componentes da

terapia na DRC, por lentificar a progressão da falência renal (Wang et al., 2014). A LPD mostra-

se eficaz e segura na melhora da retenção de resíduos de nitrogênio, na melhora da acidose

metabólica, na regulação do metabolismo de cálcio-fósforo e no retardo do início da TRS, sem

qualquer efeito deletério sobre o estado nutricional (Garneata & Mircescu, 2010). A prescrição

de LPD para pacientes com DRC em tratamento conservador pode também atuar na modulação

da microbiota intestinal de forma simples e fisiológica, promovendo modificações no perfil de

risco cardiometabólico nesses pacientes (Moraes et al., 2014).

Page 18: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

18

Assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos da dieta hipoproteica no

perfil microbiano intestinal e nos níveis de toxinas urêmicas em pacientes com DRC em

tratamento conservador.

Page 19: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

19

2.0. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. DOENÇA RENAL CRÔNICA

Atualmente, a DRC é considerada um problema de saúde pública mundial afetando de 10

a 16% da população geral da Ásia, Europa e Estados Unidos (Wang et al., 2016). Estima-se que

em 2030, aproximadamente 70% dos portadores de DRC sejam residentes de países em

desenvolvimento devido à rápida tendência no número de casos de obesidade e diabetes (Tohidi

et al., 2012). De acordo com o Censo da Sociedade Brasileira de Nefrologia (SBN) de 2013,

estima-se que no Brasil existam mais de dois milhões de brasileiros portadores de algum grau de

disfunção renal, sendo que aproximadamente mais de 100 mil encontram-se em terapia dialítica

(Bochnie et al., 2016).

As causas mais comuns para o desenvolvimento de DRC são a obesidade, a hipertensão

arterial e o diabetes mellitus, todos componentes da síndrome metabólica, sendo considerados

também fatores de risco para DCV (Panahi et al., 2016). Dentre outros fatores de risco estão a

história familiar de DRC, o uso de medicamentos nefrotóxicos e a idade avançada (Bastos et al.,

2010).

Segundo a National Kidney Foundation (KDIGO, 2013), a DRC é definida como

anormalidades de estrutura ou função renal apresentada por no mínimo três meses consecutivos,

apresentando implicações para a saúde, com estimativa da TFG usualmente menor que

60ml/min/1,73m² de superfície corporal associada a pelo menos um marcador de dano renal

parenquimatoso ou alteração no exame de imagem. Assim, albuminúria ≥ 30mg/dia, história de

transplante renal e anormalidades de sedimentos urinários e eletrólitos são considerados

marcadores de danos renais. Sua progressão é dividida em estágios de acordo com a TFG e

albuminúria persistente (Quadro 1).

Page 20: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

20

Quadro 1. Categorias da doença renal crônica de acordo com a taxa de filtração

glomerular e albuminúria

Prognóstico da DRC por Categorias de TFG e

Albuminúria

Categoria de Albuminúria Persistente

Descrição e Classe

A1 A2 A3

Normal ou

levemente

aumentada

Moderadamente

aumentada

Severamente

aumentada

TF

G

Ca

teg

ori

as

(ml/

min

/1,7

3m

2)

Des

criç

ão

e C

lass

e

<30mg/dia 30-300mg/dia >300mg/dia

G1 Normal ou alta >90 G1A1 G1A2 G1A3

G2 Levemente reduzida 60-89 G2A1 G2A2 G2A3

G3a Leve a moderadamente reduzida 45-59 G3aA1 G3aA2 G3aA3

G3b Moderada a severamente reduzida 30-44 G3bA1 G3bA2 G3bA3

G4 Severamente reduzida 15-29 G4A1 G4A2 G4A3

G5 Falência renal <15 G5A1 G5A2 G5A3

DRC: doença renal crônica; TFG: taxa de filtração glomerular

Verde: baixo risco (se não há outros marcadores de doença renal, sem DRC); Amarelo: risco moderadamente

aumentado; Laranja: risco alto; Vermelho: risco muito alto.

Fonte: Adaptado de NKF/KDIGO, 2013.

As categorias da DRC que englobam de G1A1 até G4A3 compreendem a fase pré-

dialítica que corresponde ao tratamento conservador da doença (KDIGO, 2013) e caracterizam-se

pela contínua diminuição da função renal cujo resultado final é a combinação de múltiplos sinais

e sintomas decorrentes da incapacidade dos rins de manterem a homeostasia interna (Snively &

Gutierrez, 2004; Barbosa & Salomon, 2013; KDIGO, 2013). Geralmente, somente na categoria

G5 a TRS deve ser instituída, configurando-se como opções de tratamento a hemodiálise, diálise

peritoneal ou transplante renal (Sesso et al., 2014).

Os rins são considerados órgãos reguladores, responsáveis pela manutenção da

homeostase do organismo humano. Com a progressão da DRC, ocorre diminuição progressiva da

TFG juntamente com a perda das funções endócrinas, excretoras e regulatórias promovendo a

chamada síndrome urêmica, a qual ocasiona os seguintes comprometimentos em seus portadores

(Magnani et al., 2014):

- Expansão do volume extracelular: O volume do fluido extracelular altera-se nos

estágios mais avançados da DRC, nos quais a perda na capacidade de excretar sódio e água é

progressiva, ocasionando retenção dos mesmos, com consequente desenvolvimento de edema e

Page 21: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

21

hipervolemia, associada com o aumento da pressão arterial (Phakdeekitcharoen & Boonyawat,

2012; Schork et al., 2016). A relação negativa entre o estado de hiper-hidratação e a

hipoalbuminemia pode ser explicada pela hemodiluição que estimula o balanço positivo entre

água e sal e expande o volume extracelular. Essa associação inversa entre a hiper-hidratação e a

razão urinária sódio/potássio poderia explicar o papel do hiperaldosteronismo no

desenvolvimento da sobrecarga de volume extracelular nesses pacientes (Caravaca et al., 2011).

Como tratamento deve-se prescrever o uso de diuréticos (Phakdeekitcharoen & Boonyawat,

2012).

- Acidose metabólica: ocorre pela queda da filtração glomerular e consequente diminuição da

excreção de hidrogênio. Como implicações clínicas da acidose metabólica pode-se observar

aumento do catabolismo protéico, diminuição da síntese de proteínas e balanço nitrogenado

negativo. A manutenção de concentrações séricas de bicarbonato maiores que 22mEq/L pode ser

alcançada com a prescrição de bicarbonato de sódio oral (Leal et al., 2008).

- Anemia: manifesta-se geralmente quando a TFG apresenta-se <70 ml/min/1,73m2 em homens e

50ml/min/1,73m2 em mulheres (Hsu et al., 2001). Em geral, a anemia é normocítica e

normocrômica sendo atribuída a deficiência de produção da eritropoietina pelos fibroblastos

peritubulares renais. Outros fatores podem determinar a ocorrência de anemia, tais como

deficiência de ferro (causada por perdas gastrointestinais imperceptíveis, desnutrição, múltiplas

intervenções cirúrgicas, exames laboratoriais frequentes), presença de fenômeno inflamatório e

outras causas não relacionadas à DRC (Ribeiro-Alves & Gordan, 2014). Anemia não tratada ou

seu tratamento tardio aumenta a probabilidade de hospitalização causada por insuficiência

cardíaca, transfusão sanguínea e risco de mortalidade (Besarab et al., 2015; Charytan et al., 2015).

Portanto, recomenda-se manter os níveis de hemoglobina entre 11-12g/dL. Para iniciar o

tratamento com eritropoietina é fundamental que o paciente tenha estoque normal de ferro,

mantendo o índice de saturação da transferrina >20% e a ferritina >100 ng/dL (Bastos et al.,

2010).

- Osteodistrofia renal ou distúrbio mineral e ósseo da DRC: pacientes com DRC podem

desenvolver osteomalácia, osso adinâmico, hiperparatireoidismo, calcificação vascular ou uma

combinação destes, que pode estar associado a fraturas. Isto ocorre por anormalidades da função

Page 22: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

22

do hormônio da paratireóide (PTH), por distúrbios no metabolismo da vitamina D e dos minerais

cálcio e fósforo (Black et al., 2015). O sucesso do tratamento consiste no controle dos níveis

circulantes de cálcio, fósforo e PTH (Kasama et al. 2013), aliada à uma dieta equilibrada e ao uso

de medicamentos, tais como quelantes de fósforo, suplemento de vitamina D e uso de adsorvente

oral AST-120 (Lehmkuhl et al., 2009).

- Distúrbios metabólicos e endócrinos: Os dois principais fatores de risco para DRC são a

hipertensão arterial e diabetes mellitus tipo 2, ambos ligados ao desenvolvimento de síndrome

metabólica e obesidade (Lerman & Lerman, 2011). A uremia está associada à resistência

periférica à insulina, caracterizada por hiperglicemia de jejum, intolerância à glicose e

hiperinsulinemia, sugerindo-se que ela ocorra a partir de defeitos pós-receptor na via de

sinalização da insulina (Soulage et al., 2013). Também são observadas anormalidades no perfil

lipídico que variam dependendo do nível da proteína urinária e do estágio da DRC, tais como

altos níveis de quilomícrons, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL-c) e triglicerídeos,

níveis normais de lipoproteína de baixa densidade (LDL-c) e colesterol total, e baixos níveis de

lipoproteína de alta densidade (HDL-c) (Kanda et al., 2016; Wang et al, 2016). A dislipidemia

leva à aterosclerose e é considerada importante fator de risco para DCV, sendo as principais

causas de morte em pacientes com DRC (Wang et al, 2016).

- Estado nutricional: Anorexia urêmica ou perda de apetite é um importante componente da

protein-energy wasting (PEW) observada em pacientes com DRC. Anormalidades do paladar

(palatabilidade, acuidade, sabor metálico), boca seca, revestimento da língua, inflamação das

mucosas ou ulceração oral, maior prevalência de periodontite e sintomas gastrointestinais

(distensão gástrica, constipação, distúrbios de motilidade e esvaziamento gástrico lento) podem

contribuir para a inapetência (Carrero, 2011). Outros fatores que poderiam ocasionar prejuízo no

estado nutricional desses pacientes seriam distúrbios no metabolismo proteico e energético,

desregulações hormonais e redução espontânea da ingestão alimentar (Barbosa & Salomon,

2013).

- Complicacões cardiovasculares: Pacientes com DRC têm como principal causa de morte a

DCV, o que frequentemente se manifesta com eventos cardiovasculares mesmo antes que se

desenvolva a doença renal em estágio final. A patogênese da DCV nessa população é complexa e

Page 23: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

23

parece ser determinada por elevada prevalência de fatores de risco tradicionais como hipertensão

arterial, diabetes mellitus e dislipidemia e pela presença de outros fatores inerentes à DRC, tais

como anemia, distúrbios do metabolismo mineral, presença de inflamação sistêmica e

exacerbação de estresse oxidativo (Bucharles et al., 2010).

Dessa forma, os principais objetivos relacionados ao cuidado do paciente com DRC

envolvem a desaceleração da diminuição da taxa de filtração glomerular com consequente

desaceleração da progressão da doença renal, redução da toxicidade urêmica, dos transtornos

metabólicos da insuficiência renal, da proteinúria e manutenção do bom estado nutricional com

consequente redução do risco de complicações secundárias, tais como DCV, doenças ósseas e

controle de pressão arterial (Gluba-Brzózka et al. 2017).

2.2. TERAPIA FARMACOLÓGICA E NUTRICIONAL NA DOENÇA RENAL CRÔNICA

A terapia farmacológica e nutricional constitui a base para prevenção e tratamento dos

sinais e sintomas da DRC, tendo como objetivo retardar o início da diálise (Caria et al., 2014). O

tratamento farmacológico baseia-se na redução da pressão arterial, com prescrição de inibidores

da enzima conversora da angiotensina e de bloqueadores de receptores da angiotensina II. Para

reduzir o risco de desenvolvimento de DCV são também indicados o uso de estatinas e

empagliflozina (Briskey et al., 2016).

No tratamento nutricional pré-dialítico, também conhecido como tratamento conservador,

tem sido recomendado a prescrição de LPD (Mafra et al., 2013; Garneata & Mircescu, 2013;

Giordano et al., 2013; Kanda et al., 2014). Porém, ainda não se tem definido qual seria a TFG

indicada para iniciá-la. Uma opinião comum para nefrologistas e nutricionistas é iniciar a LPD

quando a TFG for menor que 60ml/min/1,73m2 de superfície corporal (estágio 3 da DRC) (Lai et

al., 2015).

A LPD para pacientes adultos com DRC em tratamento conservador deve conter de 0,6-

0,7g/kg de peso ideal/dia de proteínas (> 50% com alto valor biológico, como carne, peixe e ovo).

A recomendação de energia deve ser normo a hipercalórica, isto é, 30-35kcal/kg/dia, a fim de

evitar balanço nitrogenado negativo. Além disso, deve conter aproximadamente 35% de lipídeos,

preferencialmente de origem vegetal, com colesterol menor que 300mg/dia e gordura saturada

Page 24: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

24

inferior a 5% e, cerca de 55% de carboidratos. A dieta deve conter concentrações controladas de

fósforo (600-800 mg/dia), sódio (2-3g/dia), ácidos orgânicos, potássio e cálcio, podendo ser feita

suplementação de cálcio, quando necessário (400-800 mg de cálcio elementar por dia) (Bellizzi et

al., 2016). No entanto, é de suma importância compreender que a populaão brasileira tende a

apresentar ingestão protéica acima do recomendado para a população aparentemente saudável

(0,8g/kg/dia), podendo este ser um fator negativo na adesão à LPD (Mafra & Leal, 2016).

2.3. DIETA HIPOPROTEICA NA DOENÇA RENAL CRÔNICA

A restrição de proteínas na dieta de pacientes com DRC foi descrito pela primeira vez há

140 anos, e tem sido utilizada durante 60 anos para o tratamento da DRC, azotemia e sintomas

urêmicos. Vários estudiosos concluíram que o balanço de nitrogênio poderia ser mantido com

LPD e dieta muito baixa em proteína (VLPD) suplementada com aminoácidos essenciais e/ou

cetoácidos (Dumler, 2011).

O primeiro médico-cientista a usar a dieta hipoproteica foi Mariano Semmola em 1850,

seguido por Dr. L. S. Beale, que, em 1869, aconselhou a ingestão de dieta hipoproteica para

pacientes com DRC em tratamento conservador. A próxima contribuição significativa para a

terapia nutricional renal foi feita por Franz Volhard em 1918, sendo adotada também por Bull,

Joekes e Lowe. Em seguida, Kempner em 1934 utilizou dieta hipoproteica, hipolipídica e

hipossódica para pacientes com DRC e observou diminuição da pressão arterial. A partir dos anos

60, os pesquisadores Giordano e Giovannetti mostraram que a LPD foi capaz de melhorar os

sintomas urêmicos, retardando o início de diálise, influenciando positivamente a qualidade de

vida dos pacientes e, reduzindo a mortalidade (Di Iorio et al., 2013).

Deste modo, enquanto as LPDs eram a única forma de adiar a diálise, elas foram

amplamente seguidas, até que em 1980 o transplante renal desviou a atenção das LPDs. Assim, o

interesse renovado entre os pesquisadores para a dieta LPD está baseado em três conceitos

principais: o custo elevado da diálise na crise financeira mundial, as vantagens de evitar a diálise

nos idosos e a ineficiência da introdução precoce da diálise em aumentar a sobrevida desses

pacientes (Piccoli et al., 2014).

Page 25: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

25

Em 1994, o estudo Modification of Diet in Renal Disease (MDRD) publicou resultados

primários a respeito da eficácia dessa intervenção, porém não obteve resultados satisfatórios.

Após uma reavaliação comparando-o com vários estudos randomizados controlados concluiu-se

que a LPD deve ser recomendada para pacientes com DRC em tratamento conservador (Levey et

al., 1999) uma vez que permite prolongar a expectativa de vida por cerca de 1 ano, sendo

considerada segura desde que corrigido o déficit em particular de ferro, vitamina B12 e vitamina

D (Piccoli et al., 2015). De fato, uma metanálise com 2000 participantes com insuficiência renal

moderada a grave, acompanhados por pelo menos um ano mostrou uma redução de 32% na

ocorrência de morte renal naqueles participantes que tiveram menor ingestão proteica quando

comparado ao grupo com alta ingestão (Fouque & Laville, 2009).

Porém, um ponto que pode contribuir para que alguns estudos sejam inconclusivos sobre a

eficácia da prescrição da LPD no retardo do aparecimento da doença renal de estágio final, é que

modificar o hábito alimentar do paciente é altamente invasivo, e com o passar do tempo eles

tendem a retornar as suas dietas habituais. Como contrapartida, um aconselhamento adequado por

médicos e nutricionistas permitiria fazer melhor avaliação da sua eficácia (Piccoli et al., 2015).

Em um artigo de revisão abordando 10 estudos sobre LPD em pacientes com DRC em

tratamento conservador, foi concluído que a redução moderada na ingestão de proteínas (0,8

g/kg/d) pode ser recomendada para indivíduos com DRC estágio 3 e, redução mais acentuada

para aqueles em estágio 4 (Giordano et al., 2013).

No estudo conduzido por Lai et al. (2015) com 16 pacientes com DRC em estágio 3 e 4

submetidos a LPD (0,7±0,1g/kg de peso ideal) por 12 meses foi observado significante aumento

da concentração dos níveis séricos de bicarbonato e vitamina D, e significante redução da

concentração sérica de fósforo e marcadores inflamatórios, tais como proteína C reativa (PCR) e

razão de sedimentação de eritrócitos. Apesar de não significativa, a análise da composição

corporal mostrou redução do tecido adiposo com manutenção da massa magra. Não houve

redução dos níveis séricos de albumina e proteínas totais, e a função renal permaneceu estável

com significante redução da excreção proteica urinária. Marcadores de aterosclerose e de

disfunção endotelial também permaneceram estáveis.

Para avaliar a possível correlação entre LPD e desnutrição, 41 pacientes com DRC

estágios 3b/4, foram submetidos à LPD (0,7g/kg de peso ideal) por 6 semanas, observando-se

Page 26: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

26

retardo da progressão da doença renal, com redução significativa da creatinina e da azotemia e

piora do estado nutricional. Houve diminuição significativa dos valores de albumina sérica e

aumento de PCR, seguido por comprometimento da porcentagem de massa livre de gordura e

aumento da relação entre massa extracelular e massa celular corporal, indicando prejuízo do

estado nutricional após intervenção. Também foi observado redução do ângulo de fase, que é

fator prognóstico negativo para a sobrevida (Noce et al., 2016).

Assim, a intervenção nutricional com dieta hipoproteica para pacientes com DRC ainda é

tema de pesquisas nos dias atuais, uma vez que ainda existem resultados de ensaios clínicos não

concordantes (Garneata & Mircescu, 2010). As vantagens para sua prescrição estão relacionadas à

eficiência do manejo de certos distúrbios metabólicos, tais como na melhoria da retenção de

resíduos de produtos nitrogenados, da acidose metabólica, do metabolismo de cálcio-fósforo,

além de retardar o início da TRS (Garneata & Mircescu, 2013).

Por outro lado, sua segurança nutricional tem sido frequentemente questionada

principalmente quanto às consequências negativas sobre a morbimortalidade quando os pacientes

precisam se submeter à TRS (Chauveau et al., 2009). Para alcançar o objetivo proposto com essa

intervenção nutricional, o profissional de saúde deverá controlar periodicamente o estado

nutricional do paciente e prover um aconselhamento dietético detalhado (Garneata & Mircescu,

2010).

De uma forma geral, a prescrição de dieta hipoproteica (0,6g/Kg/d) para pacientes com

DRC em tratamento conservador mostra-se eficiente em proteger a função renal residual, reduzir

a perda de nefróns remanescentes, melhorar a resistência à insulina, reduzir o stress oxidativo e a

proteinúria, reduzir os níveis do paratormônio (PTH), minimizar os efeitos da osteodistrofia,

reduzir a albuminúria e prevenir os sintomas urêmicos, além de melhorar o perfil lipídico e a

hipertensão arterial sistêmica (Fouque & Aparicio, 2007; Ikizler et al., 2009; Kovesdy et al.,

2013; Mafra et al., 2013).

Alguns pesquisadores sugerem ainda que dieta hipoproteica possa modular as

concentrações séricas de toxinas urêmicas como o indoxyl sulfato (IS), ácido indol-3-acético

(AIA) e p-cresyl sulfato (p-CS) visto que essas são produzidas pela fermentação de proteínas pela

microbiota intestinal (Mafra et al., 2013; Mafra et al., 2014; Barreto et al., 2014; Poesen et al.,

2015). Nesse contexto, cabe ressaltar que recentes estudos apontam para a presença de disbiose

Page 27: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

27

intestinal nesses pacientes causada por diversos fatores relacionados à DRC (Meijers et al., 2008;

Musso et al., 2011; Mafra et al., 2013; Briskey et al, 2016). Porém, as consequências da disbiose

intestinal na progressão da DRC ainda não são totalmente compreendidas no campo da

nefrologia, sendo necessários estudos clínicos para elucidá-los (Koppe et al., 2015).

2.4. MICROBIOTA INTESTINAL

O corpo humano é habitado por um grande número de bactérias, arqueias, vírus e células

eucarióticas (Nallu et al., 2017). A coleção de microrganismos que vivem em coexistência

pacífica com seus hospedeiros é conhecida como microbiota. A composição e os papéis das

bactérias que fazem parte desta comunidade têm sido intensamente estudados nos últimos anos

enquanto que os demais são menos conhecidos (Sekirov et al., 2010). Distintas comunidades

microbianas são encontradas na boca, na vagina, na pele e no trato gastrointestinal assemelhando-

se nos seres humanos de acordo com o sítio corporal (Clemente et al., 2012).

A composição da microbiota intestinal humana é influenciada por múltiplos fatores,

incluindo o tipo de parto, o tempo de aleitamento materno, as condições sanitárias e o uso de

antibióticos (Bergström et al., 2014). Os lactentes, amamentados exclusivamente ao seio,

possuem uma microbiota dominada por bifidobactérias e sua composição no primeiro ano de vida

passa a se caracterizar por uma diversidade de espécies e alta instabilidade, tornando-se mais

complexa, estável e adulta somente a partir de 2,5 anos de idade (Claesson et al, 2011; Bergström

et al., 2014). Já na senilidade, devido alterações fisiológicas e mudança de hábito alimentar,

ocorre novamente alterações na composição da microbiota do cólon, com predomínio de

Bacteroidetes e redução de Firmicutes, além de menor diversidade bacteriana (Scott et al., 2013).

A microbiota é taxonomicamente classificada através da nomenclatura biológica

tradicional (filo-classe-ordem-família-gênero-espécie) e, atualmente, mais de 50 filos de bactérias

têm sido descritos, dos quais 10 habitam o cólon intestinal (Dethlefsen et al., 2007). Em

indivíduos saudáveis, os filos Bacteroidetes e Firmicutes contribuem com mais de 90% de todas

as espécies, incluindo gêneros como Bacteroides spp., Alistipes spp., Prevotella spp.,

Porphyromonas spp., Clostridium spp., Dorea spp., Faecalibacterium spp., Eubacterium spp.,

Ruminococcus spp., E Lactobacillus spp. Em menor proporção existem Actinobacteria

Page 28: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

28

(Bifidobacterium spp. e Collinsella spp.), Proteobacteria (Enterobacteriaceae, Sutterella spp. e

Helicobacter spp.), Verrucomicrobia (Akkermansia spp.) e Arquea metanogênica. A densidade e

a composição das espécies oscilam entre as diferentes regiões do trato gastrointestinal, no qual

aumenta do estômago (102-10

4/ml) em direção ao íleo (10

6-10

8/ml), atingindo o máximo no cólon

(>1012

células/ml) (Anders et al., 2013).

O intestino humano possui cerca de 10–100 trilhões de microrganismos, principalmente

anaeróbios (95% dos microrganismos totais) e abriga o maior e mais diversificado ecossistema de

micróbios do corpo humano, cerca de 500 a 1000 espécies de bactérias vivem no intestino

humano, superando em dez vezes o número de células do corpo humano (Sekirov et al., 2010;

Mitreva et al., 2012). O genoma coletivo da microbiota intestinal, conhecido como microbioma,

contém ao menos 150 vezes mais genes que o genoma humano, com a maioria desempenhando

funções fisiológicas humanas (Qin et al., 2010).

A homeostase da microbiota intestinal (simbiose) mantém funções bioquímicas e

fisiológicas que são fundamentais para a saúde humana (Prakash et al., 2011). Microrganismos

comensais competem por nutrientes e locais de fixação com patógenos potenciais impedindo

assim sua colonização (Reid et al., 2003; Saad, 2006; Nallu et al. 2017). A microbiota intestinal

tem um importante papel na metabolização de substratos, tais como polissacarídeos não

digeríveis e amido resistente, originando os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), que serão

utilizados como fonte de energia pelas células epiteliais colônicas, promovendo sua proliferação e

diferenciação com manutenção da integridade da barreira intestinal através da regulação da

expressão de proteínas do complexo juncional e da produção de muco (Krishnan et al., 2015).

Atua também na biotransformação de ácidos biliares com efeito no metabolismo de glicose e

colesterol e na degradação de oxalato. Promove absorção de íons cálcio, ferro e magnésio, e

produzem vitaminas K, B12, biotina, ácido fólico e ácido pantotênico (Hill, 1997; Vaziri, 2012).

Além disso, a microbiota intestinal regula muitos aspectos da imunidade inata e adquirida,

protegendo o hospedeiro da invasão de patógenos e da inflamação crônica (Sanz et al., 2007;

Medina et al., 2007; Anders et al, 2013).

A microbiota intestinal no cólon é composta principalmente por quatro filos bacterianos:

Firmicutes (64%), Bacteroidetes (23%), Proteobactéria (8%) e Actinobacteria (3%) (Frank et al.,

2007; Tremaroli & Bäckhed, 2012). Deste modo, os dois filos dominantes são: as Firmicutes

Page 29: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

29

(bactérias gram-positivas, estritamente anaeróbicas) e as Bacteroidetes (bactérias gram-negativas,

estritamente anaeróbicas) e a razão entre eles (Firmicutes/Bacteroidetes) possui relevância

bastante significativa na composição da microbiota intestinal, no entanto, essa razão pode se

modificar dramaticamente, com o uso de antibióticos, alguns nutrientes dietéticos e em condições

patológicas (Ley et al., 2006; Marteau, 2009; Musso et al., 2011).

O desequilíbrio na composição da microbiota intestinal tem sido associado à maior

susceptibilidade a infecções, desordens imunológicas, inflamação, estresse oxidativo e resistência

à ação da insulina, por meio de mecanismo denominado endotoxemia, que envolve o aumento da

exposição a produtos provenientes do intestino, particularmente os lipopolissacarídeos (LPSs)

(Cani et al., 2008; Manco et al., 2009).

LPSs são endotoxinas encontradas na membrana externa de bactérias gram-negativas, tais

como γ-proteobacterias, que em situações patológicas podem ser absorvidas pela circulação

sanguínea provocando reações inflamatórias (Pussinen et al., 2011, Anders et al., 2013). Os LPSs

iniciam respostas pró-inflamatórias ao se ligarem aos receptores Toll-like-receptor-4 (TLR-4) em

células epiteliais, macrófagos e monócitos. Estes receptores são responsáveis por reconhecerem

padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) tais como o LPS, peptideoglicanos,

flagelina e ácidos nucleícos bacterianos, iniciando uma cascata de sinalização que conduz à

ativação de fatores nucleares como fator nuclear κB (NF-κB), Proteina ativadora-1 (AP-1) e

interferon. Essas vias aumentam a transcrição de diversas moléculas inflamatórias, incluindo

citocinas tais como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina (IL) 6 e IL-1, quimiocinas,

e outros fatores, sendo os mesmos ativados em doenças como aterosclerose (Seki & Brenner,

2008).

Existem diversos fatores envolvidos no aumento das concentrações plasmáticas de LPS,

como por exemplo, ingestão excessiva de álcool, estresse e exposição à radiação. Além desses

fatores, uma dieta rica em gordura pode também elevar os níveis de LPSs, uma vez que aumenta

a permeabilidade intestinal por meio da secreção de mediadores, tais como TNF-α, IL-1β, IL-4 e

IL-13, bem como via receptor ativado por protease-2, que favorecem a translocação de LPSs para

circulação (Moraes et al., 2014) e promove desequilíbrio na composição da microbiota intestinal

(Ramezani & Raj, 2014).

Page 30: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

30

De fato, ratos alimentados com dieta rica em gordura apresentaram aumento da razão de

bactérias gram-negativas em relação a gram-positivas e, essa modulação da microbiota intestinal

foi associada com aumento significativo nas concentrações plasmáticas de LPSs (Cani et al., 2007

e 2008).

No estudo de Caesar et al. (2015), ratos alimentados com banha de porco (gordura

saturada) por 11 semanas apresentaram aumento da ativação de TLR-2 e TLR-4, com aumento

das concentrações de LPSs, inflamação de tecido adiposo branco e redução da sensibilidade à

insulina comparado a ratos alimentados com óleo de peixe (gordura polinsaturada). Esta alteração

pode ser parcialmente atribuída a diferenças na composição da microbiota intestinal, observando-

se aumento dos gêneros Bacteroides, Turicibacter e Bilophila nos ratos alimentados com banha

de porco e Actinobacteria (Bifidobacterium e Adlercreutzia), bactérias ácido láctica

(Lactobacillus e Streptococcus), Verrucomicrobia (Akkermansia muciniphila),

Alphaproteobacteria e Deltaproteobacteria nos ratos alimentados com óleo de peixe.

Curiosamente, mudança na dieta a longo prazo promove alterações nos enterótipos. Indivíduos

com dieta rica em gordura animal têm um enterótipo dominado por Bacteroides, enquanto que

uma dieta rica em carboidratos está associada com predomínio de Prevotella (Wu et al., 2011).

Além disso, o ser humano não codifica enzimas necessárias para degradar os polissacarídeos

dietéticos estruturais e necessita da microbiota colônica para sua degradação (Scott et al., 2013).

As principais formas de carboidratos incluem amido resistente, polissacarídeos não amiláceos e

oligossacarídeos, que podem ser metabolizados no intestino grosso pelas bactérias produzindo

AGCC: acetato, propionato e butirato, numa proporção de 3: 1: 1. Quantidades elevadas de

AGCC evitam o crescimento de bactérias potencialmente patogênicas, tais como E. coli e outros

membros da família Enterobacteriaceae (Zimmer et al., 2012), atuam na melhora da função de

barreira da mucosa intestinal, na redução dos níveis plasmáticos de lipopolissacarídeos (LPS) e de

marcadores inflamatórios (Frota et al., 2015). Ruminococcus champanellensis é a bactéria

celulolítica mais ativa isolada a partir do cólon humano, enquanto Ruminococcus bromii tem

papel na fermentação do amido resistente. Butirato em particular é a principal fonte de energia

para os colonócitos, propionato é transportado para o fígado, onde tem papel na gliconeogênese,

enquanto o acetato entra na circulação sistêmica e é utilizado na lipogênese (Scott et al., 2013).

Page 31: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

31

Aproximadamente 12-18g de proteína atingem o cólon humano diariamente. O cólon é um

local ativo de turnover proteico o qual provém nitrogênio para o crescimento de bactérias

sacarolíticas e aminoácidos para fermentação por espécies não sacarolíticas. As bactérias

proteolíticas predominantes identificadas nas fezes humanas são espécies de Bacteroides

(especialmente o grupo B. fragilis) e também Clostridium perfringens, propionibacteria,

streptococci, bacilli e estafilococos. A fermentação de aminoácidos no cólon humano por meio da

desaminação produz AGCC, amônia e ácidos graxos de cadeia ramificada. As concentrações de

amônia fecal variam de 12 a 30 mM e podem aumentar com maior ingestão proteica. A amônia

produzida é rapidamente absorvida e metabolizada em ureia pelo fígado e excretada na urina. Já a

desaminação bacteriana de aminoácidos aromáticos leva à produção de compostos fenólicos p-

cresol, fenilpropionato (a partir de tirosina), fenilacetato (a partir de fenilalanina) e propionato de

indol e acetato de indol (a partir de triptofano). As bactérias envolvidas nesta conversão incluem

espécies dentro de Clostridium, Bacteroides, Enterobacterium, Bifidobacterium e Lactobacillus

(Scott et al., 2013).

Logo, além dos nutrientes influenciarem na composição da microbiota intestinal, as

bactérias intestinais também promovem a conversão de componentes dietéticos levando à

formação de grande variedade de metabólitos, que podem ter efeitos benéficos ou adversos à

saúde humana (Blaut & Clavel, 2007).

2.5. TOXINAS URÊMICAS PROVENIENTES DA MICROBIOTA INTESTINAL

Dietas hiperproteicas promovem maior entrada de proteínas no cólon intestinal, resultando

em aumento da fermentação de produtos que incluem metabólitos nitrogenados nocivos para a

integridade da microbiota intestinal (Gill & Rowland, 2002; Mafra et al., 2013). De fato, diversos

estudos têm demonstrado haver correlação entre a microbiota intestinal, os metabólitos gerados

por ela a partir da alimentação e o desenvolvimento de doenças como diabetes, obesidade, DCV e

progressão da DRC (Mafra et al., 2014, Poesen et al., 2015; Briskey et al., 2016).

A microbiota colônica é também importante contribuidor do metaboloma em pacientes

com DRC. A retenção de solutos urêmicos tais como p-CS e IS são na realidade co-metabólitos

do microbioma humano (Poesen et al., 2015).

Page 32: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

32

O aminoácido triptofano pode ser metabolizado a indol pela triptofanase no intestino

grosso por bactérias intestinais, tais como Escherichia coli. Indol é absorvido no sangue, sofrendo

oxidação e sulfatação no fígado sendo então metabolizado a IS e aproximadamente 90% dele está

ligado à albumina sérica (Taki & Niwa, 2007; Meyer & Hostetter, 2012). É excretado na urina

por secreção tubular, principalmente pelas células tubulares proximais, e, secundariamente, por

filtração glomerular (Barreto et al., 2014). O acúmulo de IS está associado a altas concentrações

de IL-6, estimula a fibrose tubulointesticial progressiva, esclerose glomerular e progressão da

DRC pelo aumento da expressão de transforming growth factor (TGF)-β1 que atua inibindo a

produção de metaloproteinase (TIMP)-1 e pro-α 1 (I) colágeno, levando a perda de néfrons e

completando um ciclo vicioso de injúria renal (Niwa, 2011; Barreto et al., 2014). IS induz a

produção celular de radicais livres, tais como superóxido pela ativação de NADPH oxidase,

especialmente NOx4, prejudicando o sistema antioxidante tubular renal (Niwa, 2010).

Em um estudo in vitro sobre o efeito de IS na ativação de macrófagos em resposta ao LPS

de E. coli foi confirmada sua participação no processo inflamatório através do aumento

significativo na produção de óxido nítrico (NO), do fator de necrose tumoral-a (TNF-a), de IL-6,

de NF-kB, de espécies reativas de oxigênio (EROs) e alteração nas concentrações de cálcio,

principalmente pela sobrecarga de cálcio mitocondrial (Adesso et al., 2013). Um estudo feito pelo

nosso grupo, também observou correlação positiva entre concentração plasmática de IS e IL-6 (r

= 0,6: p = 0,01) em estudo transversal onde participaram 46 pacientes com DRC em hemodiálise

(Brito et al., 2016).

A toxina urêmica ácido indol-3-acético (AIA) também é produzida a partir do triptofano

sendo metabolizada a indol diretamente no intestino ou no tecido via triptamina. O AIA é

comumente excretado na urina e acumula-se no sangue de pacientes com DRC (Sallée et al.,

2014). É um agonista de transcrição do receptor de aril hidrocarboneto (AhR), que regula a

resposta das células por meio xenobióticos, como tetraclorodibenzo-p-dioxina. A ativação do

AhR por ligantes exógenos promove inflamação vascular, estresse oxidativo e aterosclerose, e

desempenha um papel importante no desenvolvimento de DCV (Dou et al., 2015; ).

Já os aminoácidos tirosina e fenilalanina provenientes da proteína dietética sofrem ação

das bactérias putrefativas da microbiota intestinal e se convertem a ácido 4-hidroxifenilacético

que é então descarboxilado a p-cresol por uma enzima que se mostrou mais presente no

Page 33: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

33

Clostridium difficile (Meyer & Hostetter, 2012; Stockler-Pinto et al., 2014). O p-cresol é então

convertido a p-CS pela ativação da sulfotransferase no tecido submucosal do intestino curto,

sendo transportado para a corrente sanguínea, ligando-se, em sua maioria, à albumina plasmática

(Watanabe et al., 2013). Pesquisas têm mostrado sua relação com o aumentado risco

cardiovascular e mortalidade em pacientes com DRC (Meijers et al., 2010a; Wu et al., 2012;

Koppe et al., 2013; Liabeuf et al., 2013; Barreto et al., 2014).

Recentemente, foi demonstrado que o p-CS causa aumento do estresse oxidativo por

induzir a atividação da NADPH oxidase, levando desta forma ao dano tubular renal. Contudo, o

mecanismo pelo qual o p-CS induz a toxicidade tubular renal ainda não foi identificado

(Watanabe et al., 2013). A Figura 1 mostra como as toxinas urêmicas provenientes de

aminoácidos da dieta são produzidas pela microbiota intestinal até atingirem a corrente

sanguínea:

Figura 1. Representação esquemática da origem e síntese das principais toxinas urêmicas

do microbioma do intestino em disbiose, modificação subsequente no fígado e secreção na

circulação. TMA, trimetilamina; TMAO, trimetilamina-N-óxido.

Fonte: Adaptado de Nallu et al., 2017.

A produção dessas toxinas urêmicas tem sido associada com progressão da doença renal e

mortalidade (Wu et al., 2011; Adesso et al., 2013). De fato, observou-se maiores concentrações

séricas de AIA, IS e p-CS em pacientes em estágios mais avançados da DRC. A média das

concentrações séricas de AIA, IS e PCS foram 2,12, 1,03 e 13,03 mM, respectivamente, em

Fenil

alanina

Tirosin

a

Aumento da permeabilidade intestinal

• Fenol

- p-Cresyl Sulfato

• Indol

- Indoxyl Sulfato

- Ácido Indol-3-Acético

• Amina -TMAO

Circulação Fígado

Bactéria intestinal Ingestão de

alimento (dieta)

Colina

Triptofano

Page 34: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

34

indivíduos saudáveis, 3,21, 17,45 e 73,47 mM em pacientes com DRC em tratamento

conservador e, 5,9, 81,04 e 120,54 mM em pacientes hemodialisados (Calaf et al., 2011).

Wu et al. (2011) observaram que enquanto o IS é independentemente associado com a

progressão da DRC, sua associação é diminuída após correção para p-CS. Por outro lado, a

associação independente entre p-CS e progressão da DRC persiste após a correção para IS e

permanece diretamente associado com todas as causas de mortalidade. Desta forma,

concentrações séricas de IS e p-CS poderiam ser utilizadas como marcadores da função tubular e

da progressão da DRC (Meijers & Evenepoel, 2011).

Em outro estudo, pacientes submetidos à hemodiálise apresentaram altos níveis séricos de

toxinas urêmicas, tais como, β2-microglobulina, homocisteína, p-CS, IS e AIA e 42% deles

apresentaram história de DCV, quando comparado ao grupo controle. Além disso, os altos níveis

séricos das toxinas urêmicas AIA e β2-microglobulina e a presença de injúrias vasculares,

afetaram negativamente o número de células progenitoras endoteliais e mielóides,

respectivamente, as quais estão envolvidas na regeneração endotelial (Jourde-Chiche et al., 2009).

O paciente com DRC parece apresentar perfil microbiano diferente de indivíduos

saudáveis. De fato, nosso grupo de pesquisa observou nos pacientes em tratamento conservador

diferenças (analisada pelo sequenciamento do DNA - polymerase chain reaction) no tipo de

bactérias quando comparados com indivíduos saudáveis e esta alteração na microbiota intestinal

pode estar relacionada com o aumento da produção de toxinas urêmicas (Barros et al., 2015).

2.6. MICROBIOTA INTESTINAL E DOENÇA RENAL CRÔNICA

Em condições normais, o epitélio intestinal mantém a integridade com seus tight junctions

(parte do complexo juncional da barreira intestinal) formando uma barreira eficaz contra a

entrada de microrganismos, toxinas microbianas, antígenos, enzimas digestivas, produtos

alimentares degradados e de outras substâncias nocivas. No entanto, o comprometimento da

barreira intestinal, permite a passagem de antígenos luminais e produtos pró-inflamatórios no

tecido intestinal, levando à ativação de macrófagos, células dendríticas e linfócitos T, liberação de

citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e infiltração inflamatória, ocasionando inflamação local

e sistêmica (Vaziri, 2012).

Page 35: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

35

DRC afeta profundamente o ambiente gastrintestinal, influenciando assim o metabolismo

microbiano do cólon. Em pacientes com DRC a assimilação de proteína intestinal é prejudicada,

fazendo com que cheguem aminoácidos intactos no cólon, os quais sofrerão fermentação por

bactérias proteolíticas, sendo então convertidos em toxinas urêmicas (Koppe et al., 2015). A

perda de função renal leva à secreção de ureia no trato gastrointestinal que é hidrolisada pela

urease expressa por alguns microrganismos no intestino, resultando na formação de grande

quantidade de amônia, o que aumenta o pH intestinal, afetando o crescimento de bactérias

comensais (Vaziri, 2012). O tempo de trânsito intestinal é prolongado devido às restrições

dietéticas, principalmente de frutas e legumes, para impedir a sobrecarga de potássio,

ocasionando diminuição significativa da ingestão de fibras e menor produção de AGCC,

importante fonte de nutriente para os enterócitos (Poesen et al., 2015). Uso de medicamentos,

como antibióticos, quelantes de fósforo e suplementação de ferro também podem influenciar a

composição da microbiota intestinal (Vaziri et al., 2013).

Além disso, pacientes com DRC estão constantemente expostos a diversos fatores como:

desnutrição, que aumenta a permeabilidade da barreira intestinal; falência cardíaca e edemas;

estresse oxidativo ou mesmo, psicológico ou farmocológico que podem reduzir o fluxo sanguíneo

intestinal; além de constipação e uremia per se que podem desencadear atrofia da barreira

intestinal, aumento da permeablilidade, levando à translocação de endotoxinas e aumento do

processo inflamatório (Charalambous et al., 2007; Lambert, 2009; Hauser et al., 2011), conforme

descrito na Figura 2. De fato, estudos mostram forte associação entre a disfunção da barreira

intestinal, toxicidade urêmica e inflamação (Gonçalves et al., 2006; Szeto et al., 2008; Raj et al.,

2009; Feroze et al., 2012).

Page 36: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

36

Figura 2. Disbiose e doença renal crônica (DRC). DRC prejudica o equilíbrio entre simbiontes e

patobiontes de forma a favorecer o crescimento excessivo de patobiontes. As conseqüências são

as seguintes: (A) comprometimento da barreira intestinal pela ruptura colônica epitelial de tight

junctions (ETJ) e diminuição da sobrevida epitelial. O aumento da permeabilidade intestinal

permite a translocação de bactérias e lipopolisacarídeo (LPS). (B) Desregulação de resposta

imune e inflamação. LPS poderá ativar células imunes inatas através de um receptor Toll-like 4

(TLR4) - dependente e pelo fator nuclear kappa B (NF-κ B). Os patobiontes estimulam células

dendríticas (DCs) que ativam resposta de células T Th17 / Th1 e aumentam a produção de

citocinas inflamatórias. (C) Modificação da fermentação de carboidratos, proteínas e ácido biliar

(AB). As proteínas são fermentadas por patobiontes intestinais, que são então convertidos

preferencialmente em indoxyl-sulfato (IS), p-cresyl sulfato (p-CS) e trimetilamina n-oxidase

(TMAO). A redução de simbiontes, especificamente Bifidobacterium, induz a uma diminuição

nos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC). Disbiose modifica os níveis de AB e sua composição.

INF-γ, interferon γ; IL-1, interleucina-1; TNF-α, fator de necrose tumoral-α. Fonte: Adaptado de Koppe et al., 2015.

No estudo de Poesen et al. (2015), foi explorado a influência da DRC no metabolismo

microbiano intestinal, observando-se que a DRC está associada a um distinto metabolismo

microbiano que pode ser atribuída a grande restrição dietética e em menor extensão, à perda da

função renal. Foram demonstradas diferenças substanciais nos perfis de metabólitos fecais de

pacientes em hemodiálise e controles saudáveis, identificando-se 81 metabólitos fecais

Baixa ingestão de fibras: Motilidade

intestinal reduzida

Acidose metabólica Antibióticos, bloqueadores de

fosfato, antimetabólitos

Excreção intestinal aumentada de

ureia, ácido úrico e oxalato

DRC

Disfunção da barreira intestinal

ꜜ Muco

ꜜ Defensin

ꜜ Sobrevida epitelial

ꜜ Tight junction

Fermentação de proteínas e carboidratos

Metabolismo de ácidos biliares

ꜛ Toxinas urêmicas (fenol, indol e TMAO)

ꜜ AGCC

ꜜ Ácido deoxicólico, ácido litocólico

Hipoperfusão

Luz intestinal

Muco

Enterócitos

Lâmina própria

Vasos

Simbiontes

Patobiontes

Lipopolisacarídeos

Citocinas pró-inflamatórias

Toxinas urêmicas

Macrófagos

Toxinas urêmicas

TNF-α, IL1-β

Citocinas pró-inflamatórias

Desrregulação da

resposta imune

Inflamação

Dismetabolimo

Infecções

Complicações cardiovasculares

Amônia

Ureia

Page 37: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

37

significativamente diferentes entre os grupos. Pacientes em hemodiálise apresentaram altos níveis

de p-cresol, indol, aldeídos, benzenos, ácidos graxos de cadeia ramificada, furanos, ácidos graxos

de cadeia média e curta, e menor produção de cetonas, podendo contribuir para disfunção da

barreira intestinal associada à DRC, possivelmente levando à translocação bacteriana e

endotoxemia. Quando comparado pacientes em hemodiálise e habitantes da mesma residência, os

perfis dos metabólitos fecais foram semelhantes, apontando-se influências externas como hábito

alimentar, ambiente físico e interações sociais. Neste mesmo estudo foi observado o perfil

metabólico fecal em ratos nefrectomizados comparado com ratos que sofreram operação

simulada, submetidos a uma dieta regular, sendo observadas diferenças substanciais nos perfis de

metabólitos fecais entre os grupos, o que aponta importante e independente influência da perda de

função renal per se.

Adicionalmente, além da ativação do processo inflamatório pela presença de LPSs das

bactérias intestinais, a microbiota intestinal nesses pacientes também está envolvida na geração

de toxinas urêmicas a partir da metabolização de aminoácidos (Schepers et al., 2007; Meijers et

al., 2010b). Como falado anteriormente, fatores que elevam a geração e absorção dessas toxinas

urêmicas incluem aumento da proporção de proteínas e carboidratos na dieta, insuficiente

ingestão de fibra e/ou redução da absorção intestinal de proteínas, bem como tempo de trânsito

colônico prolongado. Até o momento, existem apenas duas estratégias para reduzir a absorção

intestinal dessas toxinas: intervenções que modulam o crescimento e o metabolismo bacteriano

intestinal (por exemplo, probióticos, prebióticos e modificação dietética) e terapia com

adsorventes que se ligam aos precursores de solutos urêmicos, reduzindo sua absorção (Meijers &

Evenepoel, 2011).

Como o desequilíbrio da microbiota intestinal parece estar envolvido com todas essas

complicações supracitadas, estudos têm sido feitos no sentido de equilibrar a microbiota em

pacientes renais para minimizar os efeitos negativos causados pela endotoxemia e pelo acúmulo

dessas toxinas urêmicas. Desta forma, emerge a hipótese de que além de todos os benefícios já

conhecidos, a dieta hipoproteica para os pacientes com DRC em tratamento conservador, possa

também contribuir para modulação da microbiota intestinal e consequente redução de produção

de toxinas urêmicas.

Page 38: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

38

3.0. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

- Avaliar os efeitos da dieta hipoproteica no perfil microbiano intestinal e nas concentrações

séricas de toxinas urêmicas em pacientes com DRC em tratamento conservador.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Avaliar a adesão à dieta hipoproteica;

- Avaliar o estado nutricional e a ingestão alimentar dos pacientes antes e após intervenção

nutricional;

- Avaliar o perfil lipídico e bioquímico antes e após intervenção nutricional;

- Avaliar as concentrações séricas das toxinas urêmicas IS, AIA e p-CS antes e após intervenção

nutricional;

- Avaliar o perfil microbiano intestinal antes e após intervenção nutricional.

Page 39: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

39

4.0. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. CASUÍSTICA

Estudo longitudinal com pacientes com DRC em fase pré-dialítica encaminhados ao

Ambulatório de Nutrição Renal na Universidade Federal Fluminense, Niterói, Rio de Janeiro.

Todos os pacientes foram informados previamente sobre a coleta de dados e uso de material

biológico e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Os dados demográficos,

clínicos e bioquímicos foram obtidos através da análise de prontuários e entrevistas com os

pacientes, como parte da consulta nutricional ou no momento da coleta do material biológico

(sangue, fezes e urina). Ressalta-se que após a pesquisa, os pacientes continuam sendo atendidos

no Ambulatório.

O projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de

Medicina -UFF, sob o número 26698914.7.0000.5243 (Anexo 1).

4.2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO

Foram incluídos pacientes em estágios de 3A a 4 da DRC (TFG entre 15-59 mL/min),

maiores de 18 anos de idade. Foram excluídos fumantes, grávidas, pacientes em uso de

suplementos (probióticos, prebióticos, simbióticos, antioxidantes, L-carnitina, lecitina), com

doenças autoimunes, hepáticas, AIDS, câncer e pacientes com prescrição de dieta hipoproteica.

4.3. DESENHO EXPERIMENTAL

Conduziu-se um ensaio clínico onde foram selecionados por amostragem de conveniência

pacientes com DRC (segundo cálculo amostral prévio, considerando p< 0,05 e poder de teste de

0,8 precisaríamos de 45 pacientes).

Os pacientes receberam a prescrição de dieta hipoproteica, com 0,6g de proteína/kg de

peso ideal/dia, contendo de 55 a 60% de carboidratos e 30 a 35% de lipídeos. A ingestão calórica

foi calculada de acordo com avaliação nutricional individual, sendo prescrita dieta contendo 35

kcal/kg/dia para pacientes com menos de 60 anos de idade ou abaixo do peso, 30 kcal/kg/dia para

Page 40: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

40

pacientes acima de 60 anos, com sobrepeso ou obesidade. Além disso, foi solicitado aos pacientes

que reduzissem a ingestão de sal (5g/dia) e fósforo (800-1000mg/dia). A recomendação de

ingestão de potássio e cálcio foi individualizada, levando-se em conta os resultados dos exames

laboratoriais. Foram realizadas consultas de acompanhamento nutricional bimestralmente após o

início da intervenção e, se necessário, os ajustes eram feitos para a dieta prescrita com base em

oscilações de peso e preferências individuais. Todas as análises referentes ao estudo (avaliação

nutricional, exames laboratoriais e clínicos) foram realizadas no momento basal e após 6 meses

de intervenção nutricional, conforme apresentado na Figura 3.

Fluxograma do estudo

Dieta Hipoproteica (0,6g/kg/d)

Início 6 meses

1a Análise 2

a Análise

1.1.

Figura 3. Fluxograma de avaliação de pacientes com DRC em tratamento conservador antes e

após intervenção nutricional.

Já a adesão à dieta foi avaliada com base em dois parâmetros: recordatório de 24 horas (R-

24) e cálculo da estimativa de ingestão proteica (―Protein Equivalent of Nitrogen Appearance” -

nPNA) a partir da análise de urina de 24h. As fórmulas usadas para o cálculo da nPNA são

mostradas no Quadro 2.

Composição Corporal

Ingestão Alimentar

Parâmetros Bioquímicos

Determinação das Toxinas

Urêmicas (p-CS, IS , AIA)

Perfil da Microbiota Intestinal

Composição Corporal

Ingestão Alimentar

Parâmetros Bioquímicos

Determinação das Toxinas

Urêmicas (p-CS, IS , AIA)

Perfil da Microbiota Intestinal

Page 41: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

41

Quadro 2. Cálculo da estimativa de ingestão proteica (nPNA) para pacientes com DRC

em fase pré-diálise.

Fonte: www.sbn.org.br

Considerou-se boa adesão à LPD quando a ingestão de proteínas foi de 90 a 110% da

quantidade prescrita (0,6g/kg/dia). Sendo assim, os pacientes foram divididos em dois grupos:

grupo adesão e grupo não adesão.

4.4. INGESTÃO ALIMENTAR E OFICINA CULINÁRIA

A análise da ingestão alimentar foi realizada por equipe de nutricionistas previamente

treinadas, antes e após a intervenção nutricional pela aplicação do recordatório de 24 horas (R-24;

apêndice 2- Recordatório de 24 horas) referentes a um dia da semana e um dia de final de semana.

Para auxiliar na coleta de dados do R-24 foram utilizados utensílios, tais como copos e talheres

de diversos tamanhos, juntamente com réplicas de alimentos para melhorar a memória e a

precisão do registro do paciente. Também foram mostrados, como forma ilustrativa, tubos

contendo diferentes quantidades de sal em associação com fotos de alimentos ricos neste

ingrediente para facilitar o entendimento pelos pacientes e familiares.

Após a obtenção do R-24, foi estimada a ingestão de energia, macronutrientes e

micronutrientes usando o Software Office Excel® (2010), sendo a composição de nutrientes

obtida através da Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO) (2011). As quantidades

dos alimentos ingeridos foram estimadas em medidas caseiras e os resultados obtidos do R-24

foram comparados com tabelas de referência para pacientes com DRC.

No final da consulta, os pacientes recebiam uma cartilha de orientações nutricionais,

desenvolvido especificamente para pacientes com DRC não dialisado. Neste material educativo

continha, dentre outras informações, diretrizes dietéticas para controlar a ingestão de sal, manejo

em caso de hiperglicemia, dislipidemia, hiperfosfatemia, hipercalemia e problemas intestinais

(diarréia e constipação).

NUU – Nitrogênio Uréico Urinário

NUU = Ureia/2,14 X Volume Urinário

nPNA= (NUU + (0,031 x Peso) x 6,25

Page 42: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

42

Para maior adesão à dieta, foram promovidas duas oficinas culinárias como estratégia

pedagógica de articulação teórica-vivencial pautada na participação, na integração, na apropriação

ativa do saber, na troca de experiências e na criatividade. O objetivo principal foi sensibilizar e

instrumentalizar os pacientes e seus familiares a desenvolverem ações de cuidado à saúde e

nutrição. Além disso, foi possível desenvolver habilidades culinárias, debater e aprofundar

conceitos sobre fontes de proteínas, sal, potássio e fósforo e as quantidades adequadas para

pacientes com DRC. Nas vivências culinárias, os participantes puderam compartilhar o ato de

criar e preparar novas receitas, e degustá-las. Assim, os mesmos foram estimulados a ocuparem

uma posição de protagonistas, sujeitos em ação. Suas histórias, saberes, crenças, dificuldades e

potencialidades, afetos e gostos puderam emergir e foram compartilhados (Rotenberg et al.,

2011).

Em cada encontro, além das discussões fomentadas no grupo, foram realizadas avaliações

individuais escritas nas quais os participantes puderam registrar livremente suas impressões sobre

as atividades desenvolvidas, incluindo os conteúdos apresentados, a metodologia empregada, a

reflexão de como tal experiência poderia contribuir para o cuidado à saúde na sua prática

cotidiana, além de sugestões. As opiniões registradas nas avaliações das oficinas reorientaram o

planejamento e execução da próxima. Assim, foi possível obter subsídios para discutir a oficina

como ferramenta que reflete na prática à adesão dos pacientes à dieta. Como produto final da

oficina culinária, foi elaborado um livro de receitas, contendo sugestões de lanches e grandes

refeições, incluindo receitas festivas. Em todas as receitas constavam fotos das porções das

preparações, baseado em uma dieta de 2000 calorias diárias.

4.5. ESTADO NUTRICIONAL

O estado nutricional foi avaliado em cada consulta por uma nutricionista da equipe

devidamente treinada. O paciente foi avaliado em relação aos seguintes parâmetros: peso corporal

seco, estatura e circunferência da cintura (CC). A aferição do peso (kg) foi realizada em balança

da marca Filizola com capacidade de 150kg e precisão de 0,1kg com o indivíduo posicionado de

pé, no centro da base da balança. A estatura (cm) foi medida com estadiômetro vertical acoplado

à balança com o indivíduo descalço, com os calcanhares juntos, costas retas e braços estendidos

Page 43: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

43

no prolongamento do corpo. A CC foi aferida com o indivíduo em pé utilizando uma fita métrica

inextensível, no nível natural da cintura, na região mais estreita entre o tórax e o quadril, no ponto

médio entre a crista ilíaca anterior superior e a última costela, com precisão de 0,1cm. A leitura

foi feita em apnéia após uma expiração (Lohman et al., 1991).

O acúmulo de gordura na cintura, ou obesidade abdominal foi classificado em elevado

quando os valores de CC encontravam-se entre 80,0 e 87,9 cm para as mulheres, e 94,0 a 101,9

cm para os homens; muito elevado quando a CC foi maior ou igual a 88,0 cm e 102,0 cm para

mulheres e homens, respectivamente. Valores abaixo de 80,0 cm para as mulheres e 94,0 cm para

os homens foram classificados como adequados (WHO, 2000).

O estado nutricional foi avaliado segundo o IMC, obtido pela razão entre o peso seco e o

quadrado da estatura, e sua classificação seguiu o proposto por World Health Organization

(Quadro 3) (WHO, 2000).

Quadro 3. Classificação do estado nutricional de adultos de acordo com o IMC, baseado nos

critérios da WHO.

Classificação IMC

Baixo Peso ≤ 18,4 kg/m2

Eutrofia 18,5-24,9kg/m2

Sobrepeso 25-29,9Kg/m2

Obesidade ≥ 30Kg/m2

Fonte: WHO, 2000.

Adicionalmente, os pacientes realizaram o exame de absorciometria com raio-x de dupla

energia (DXA, Lunar Prodigy Advance Plus, General Electric Madison, Wisconsin, USA) no

início e após 6 meses de intervenção no LANUFF-UFF. A obtenção dos compartimentos

corporais foi feita pela medida de atenuação de picos fotoelétricos que permitiu realizar a

mensuração corporal total e por segmentos (cabeça, tronco e membros). O DXA é o único

método capaz de informar a composição corporal de gordura, de massa magra e de tecido

mineralizado por segmentos. Cada paciente foi submetido à pesagem e à aferição da estatura

antes do procedimento e em seguida foi colocado em posição supinada para a realização do

Page 44: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

44

exame. Os valores de referência para o percentual de gordura corporal (%GC) foram adotados

conforme estabelecido por Lohman et al. (1991) (Quadro 4).

Quadro 4. Valores de referência para percentuais de gordura corporal

Homens Mulheres

Risco de distúrbios associados à desnutrição ≤ 5 ≤ 8

Abaixo da média 6 a 14 9 a 22

Média 15 23

Acima da Média 16 a 24 24 a 31

Risco de doenças associadas à obesidade ≥ 25 ≥ 32

Fonte: Lohman et al., 1991.

4.6. COLETA E ANÁLISE DE MATERIAL BIOLÓGICO

As coletas de sangue, fezes e urina de 24 horas foram realizadas no início e 6 meses após

a intervenção, na UPC–UFF. A coleta de sangue foi realizada com 12 horas de jejum. Foram

coletados 10mL de sangue em tubos Vacutainer® contendo etilenodiaminotetracético (EDTA)

como anticoagulante (1mg/mL) e 10mL sem anticoagulante e centrifugados (3500rpm por 15

minutos a 4oC) para obtenção de plasma e soro, respectivamente, os quais foram acondicionados

em tubos eppendorfs de polipropileno de 1,5mL e conservados a –80°C na UPC-UFF, para

posteriores análises.

Foi solicitado ao paciente que levasse o exame de fezes em pote adequado seguindo-se

protocolo pré-determinado, tomando-se o devido cuidado para não haver contaminação com a

urina ou com a água do vaso sanitário. O paciente deveria coletar um pouco de fezes com a

pazinha do pote, colocá-la dentro do frasco, escrever o nome completo e guardar na geladeira por

24 horas até ser levado para a UPC-UFF.

Também foi solicitado ao paciente que levasse a urina coletada em 24 horas armazenada

em recipiente adequado, o qual foi entregue por nossa equipe juntamente com o protocolo de

coleta. No dia anterior à consulta, pela manhã, após acordar, o paciente foi orientado que a

primeira urina da manhã deveria ser feita no vaso sanitário, com anotação da hora exata. A partir

Page 45: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

45

daí, o mesmo deveria coletar todo o volume urinário do dia e da noite no recipiente, sendo que

a última urina a ser coletada no recipiente deveria ser à mesma hora da urina do dia anterior que

fez no vaso sanitário, com uma tolerância de 10 minutos. Entre as coletas de urina, o recipiente

deveria estar na geladeira. A análise da urina de 24 horas foi realizada pelo laboratório Rocha &

Fonseca.

4.7. PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DE ROTINA

Os níveis plasmáticos de glicose (<100mg/dL), ureia (15-40mg/dL), creatinina (0,4-

1,4mg/dL), ácido úrico (1,5-6mg/dL para mulher/ 2,5-7,0mg/dL para homem), albumina

(≥3,8mg/dL), sódio (136-146mmol/L), potássio (3,5-5,1mmol/L), fósforo (2,5-4,8mg/dL) e perfil

lipídico (colesterol total ≤200mg/dL; HDL-colesterol 40-60mg/dL; LDL-colesterol <160mg/dL;

triglicerídeos<150mg/dL) foram analisados através de aparelho de automação BioClin® com kits

comerciais da BioClin® apropriados no LABNE-UFF. As análises foram realizadas no início do

estudo e após 6 meses de intervenção. A TFG foi estimada pela equação CKD-Epi (Levey et al.,

2009).

4.8. DETERMINAÇÃO DAS TOXINAS URÊMICAS

4.8.1. Determinação dos Níveis Séricos das Toxinas Urêmicas p-CS, IS e AIA

As toxinas urêmicas séricas (p-CS, IS e AIA) foram analisadas por Cromatografia Liquida

de Fase Reversa (High-performance liquid chromatography HPLC), utilizando um dispositivo

Waters Alliance 2695 (Waters, Zellik, Bélgica) conectado a um detector de fluorescência Waters

2475. A separação foi realizada à temperatura ambiente em uma coluna de fase reversa

Ultrasphere ODS (150 3 4, 6 mm, tamanho de partícula 5-lm; Beckman Instruments, Fullerton,

CA) e com uma coluna de guarda Ultrasphere ODS (45 3 4,6 mm, 5-lm de partícula; mentos

Beckman Instruments). A separação cromatográfica consistiu de um gradiente linear de metanol e

tampão de formiato de amônio (50 mM, pH 3,0) de 35 a 70% de metanol em 15 minutos a uma

Page 46: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

46

taxa de fluxo de 1 mL/min. O detector de fluorescência foi fixado em kex 265 nm/290 nm kem.

Para análise dos dados foi utilizando o software Empoder 2 (Waters).

Para determinar as concentrações totais das toxinas urêmicas, as amostras foram diluídas

com água e aquecidas a 95°C durante 30 minutos. Depois foram resfriadas (10 minutos em gelo)

e filtradas (Centrifree filter - Millipore, Billerica, MA). O ultrafiltrado (60uL) foi injetado na

coluna. Espectros de emissão de fluorescência e excitação foram registrados a partir de soluções-

padrão e de amostras urêmicas e não urêmicas, permitindo selecionar os comprimentos de onda

ideais e excluir interferências. A curva de calibração foi construída com soluções-padrão das

toxinas. As áreas de pico foram representadas graficamente em função das concentrações e todas

as concentrações foram expressas como miligramas por litro. Estas análises foram realizadas na

Universidade Federal do Paraná com colaboração da Profa. Dr

a. Lia S. Nakao.

Foi utilizado o banco de dados EUTox para quantificação das toxinas urêmicas avaliadas

(Vanholder et al., 2003).

4.9. DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL

4.9.1. Coleta e análise de espécimes (fezes)

Amostras de fezes frescas foram coletadas no mesmo dia da coleta do sangue na UPC-

UFF. Ao chegar ao laboratório, cada amostra foi imediatamente homogeneizada e armazenada a -

80°C para posteriores análises.

A determinação do perfil da microbiota intestinal foi realizada no Laboratório de Ecologia

Molecular do Instituto de Microbiologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), sob

supervisão da Profa. Dr

a. Flávia Lima do Carmo.

4.9.2. Extração de DNA

O DNA das amostras fecais foi extraído através do Kit Xpedition ™ Soil/Fecal

DNA MiniPrep (Zymo, Irvine, California, USA), de acordo com as instruções do fabricante. A

Page 47: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

47

integridade e a qualidade do DNA extraído foram avaliadas por eletroforese em gel de agarose a

0,8% com tampão TBE 0,5 (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA, pH 8,0).

4.9.3. Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) do Gene 16S rRNA

Os iniciadores selecionados para esta análise foram o U968f-GC1 (―grampo‖ + 5’ AAC

GCG AAG AAC CTT AC 3') e o L1401r (5'GCG TGT GTA CAA GAC CC 3') (Nübel et al.,

1996). O iniciador U968f é homólogo à região 968-1401 do gene 16S rRNA de Escherichia coli,

enquanto que o iniciador L1401r é homólogo à região 1385-1401 deste mesmo gene. As reações

de 50µL contêm uma mistura de tampão da enzima Taq-polimerase 1x, 2,5mM de MgCl2,

200µmol de cada dNTP, 20µmol de cada iniciador, 2,5U Taq-polimerase (Invitrogen) e água

Milli-Q estéril. Em cada reação, foram aplicados cerca de 4ng de DNA. O programa de reação de

PCR utilizado compreende um ciclo de desnaturação das fitas de DNA por 3 minutos a 94°C,

seguidos de 35 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 55ºC e 1 minuto a 72°C, e da extensão a

72°C por 10 minutos.

4.9.4. Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE - Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis)

O experimento com DGGE foi realizado com uma unidade DGGE da Bio-Rad

(Richmond, USA). Os produtos de PCR foram aplicados diretamente no gel contendo 6% (P/V)

de poliacrilamida e 0.5 x TAE (20 mM Tris-acetato [pH 7.4], 10mM de acetato de sódio, 0.5mM

EDTA). O gradiente de 45% e 65% foi formado a partir de soluções de estoque de poliacrilamida

(6%) contendo 0 a 100% de desnaturantes (100% correspondem a 7M de ureia e 40% de

formamida deionizada com resina AG501-X8 Bio-Rad, Inc). O tempo de eletroforese foi de 16

horas a 60°C e 75V.

Após a eletroforese, o gel foi corado por 40 minutos com SYBR Gold I (Molecular

Probes) e digitalizado em sistema de captura de imagem STORM (Pharmacia, Amersham). Para a

análise do gel de DGGE foi montado um dendrograma baseado nos perfis de bandas observados

utilizando-se o coeficiente de similaridade de Pearson e o método de agrupamento UPGMA,

Page 48: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

48

através da utilização do software Bionumerics v 6.0 (Applied Maths, BE) (Strathdee & Free,

2013).

As bandas presentes em cada perfil representaram a população dominante na comunidade

microbiana e seu aparecimento ou desaparecimento representaram mudanças na composição de

comunidade microbiana. Já a análise de clustering separou as amostras em grupos que

compartilharam características semelhantes (perfis de conjunto de bandas) gerada a partir de uma

matriz de similaridade. O coeficiente de similaridade entre duas amostras levou em conta o

número total de bandas e o número total de bandas em comum.

Page 49: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

49

5.0. ANÁLISE ESTATÍSTICA

O teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para testar a distribuição das variáveis,

sendo os resultados expressos como média ± DP (desvio-padrão), mediana (distância

interquartílica) ou percentual, conforme adequado. Foi utilizado Teste-t pareado ou teste de

Wilcoxon para avaliar a diferença nas variáveis de interesse em decorrência da intervenção, e o

Teste t-Student ou Mann-Whitney para a comparação entre os grupos. O coeficiente de correlação

de Pearson ou Spearman foi considerado para avaliar a correlação entre as variáveis. Os testes

foram fixados com valores de confiança em 95% (p < 0,05), sendo considerados significativos.

Também foi usado o delta percentual (Δ) para verificar as diferenças nas variáveis antes e após

intervenção. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa SPSS (23.0).

A Análise de Componentes Principais (PCA) foi realizada em software de Estatística

Paleontológica (PAST) (versão 3.04) utilizando os dados de abundância relativa bacteriana (%)

após a normalização (x-média/desvio padrão). Testes significativos para o clustering das

amostras na análise PCA foram realizados em PAST usando análise unidirecional de

similaridades (ANOSIM). Os dados da análise DGGE provenientes do software Bionumerics

foram exportados como tabela de correspondência de banda e análise ANOSIM unidirecional

realizada em PAST.

Page 50: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

50

6.0. RESULTADOS

Foram selecionados para participar do estudo 48 pacientes com DRC em tratamento

conservador. Desses, 7 pacientes não preenchiam os critérios de inclusão da pesquisa por

apresentar TFG≥60mL/min/1,73m2 (n=06) ou Lupus (n=01). Sendo assim, 41 pacientes

participaram do estudo, porém somente 30 deles concluíram todas as etapas da coleta de dados no

momento basal e 6 meses após intervenção (avaliação nutricional, exames laboratoriais e

clínicos), conforme mostrado na Figura 4.

Figura 4. Fluxograma do estudo.

Os pacientes selecionados a participar da pesquisa apresentaram no momento basal TFG

média de 35,6±12,2 mL/min/1,73m2, idade média de 55,5 ± 14,5 anos, sendo 16 deles do sexo

masculino, e IMC médio de 29,1 ± 5,9 kg/m2.

O perfil etiológico da DRC revelou nefrosclerose hipertensiva (n=27; 90%), nefropatia

diabética (n=1; 3,3%), glomerulonefrite crônica (n=1; 3,3%) e doença renal policística (n=1;

3,3%). As medicações utilizadas durante o período de investigação foram: inibidores da enzima

conversora da angiotensina ou antagonistas dos receptores da angiotensina II (n=24; 80%),

Pacientes Selecionados: 48

Iniciaram a Pesquisa: 41

Não Preencheram os Critérios

de Inclusão: 07

06 TFG ≥ 60mL/min

01 Lupus

Completaram Todas as

Etapas da Pesquisa: 30 Não Completaram todas as

Análises após Intervenção: 11

Grupo Adesão: 14 Grupo Não Adesão: 16

Page 51: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

51

diuréticos (n=14; 46,7%), estatinas (n=12; 40%), alfa e beta bloqueadores (n =11; 36,7%),

bloqueadores adrenérgicos (n=10; 33,3%), bloqueadores dos canais de cálcio (n=8; 26,7%),

vasodilatadores (n=2; 6,7%), bicarbonato de sódio (n=11; 36,7%), sulfato ferroso (n=6; 20,0%) e

eritropoietina humana recombinante (n=2; 6,7%). Esses medicamentos não foram alterados

durante o período de estudo.

Os parâmetros antropométricos, clínicos e de ingestão dietética são apresentados nas

Tabelas 1 e 2. Conforme mostra a Tabela 1, 14 pacientes apresentaram boa adesão à LPD,

segundo o nPNA, com manutenção dos parâmetros antropométricos após intervenção nutricional.

Neste mesmo grupo, 35,7% dos pacientes apresentaram sobrepeso e 28,6% apresentaram

obesidade. Já no grupo não adesão, 1 (6%) paciente apresentou baixo peso (IMC <18,5 kg/m2),

25,0% foram classificados com sobrepeso e 44,0% com obesidade. Após 6 meses, este grupo

apresentou redução significativa no % de gordura corporal, IMC e CC. Quanto aos parâmetros

bioquímicos foi observado no grupo adesão aparente melhora da função renal (não significativa),

e redução significativa nas concentrações séricas de colesterol total e LDL-c (tabela 2).

Page 52: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

52

Tabela 1. Efeito da LPD nos parâmetros antropométricos e de ingestão alimentar em pacientes com DRC em tratamento conservador.

Adesão (n=14) Não-Adesão (n=16)

Parâmetros Basal Após p valor Basal Após p valor

Idade (anos) 59,6 ±16,1 - - 52,0 ±12,2 - -

Sexo (F/M) (8/6) - - (6/10) - 0,8

% Gordura Corporal 36,8 ± 6,1 36,2 ± 8,2

0,47 35,8 ± 9,2 34,5 ± 9,6

0,03

% Massa Magra 57,3± 8,7 60,4± 11,3 0,20 60,4± 8,9 61,7± 9,5 0,16

IMC (kg/m2) 28,0 ± 5,0 27,6 ± 5,1

0,35 30,1 ± 6,6 29,3 ± 6,6

0,02

CC (cm) 91,0 ± 10,8 91,8 ± 12,7 0,27 99,9 ± 17,2 96,3 ± 16,2 0,01

nPNA (g/kg/dia) 0,9 ± 0,3 0,7 ± 0,2 0,01 0,7 ± 0,2 0,9 ± 0,2 0,001

Ingestão Calórica

(kcal/dia) 1593,2 ± 406,9 1325,0 ± 300,1 0,13 1627,1 ± 417,2 1316,2 ± 379,7 0,04

Os dados são apresentados como média ± DP ou números absolutos. N: número; F / M: feminino / masculino; IMC: índice de massa

corporal; nPNA: equivalente proteico do aparecimento de nitrogênio; CC: circunferência da cintura.

Page 53: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

53

Tabela 2. Efeito da LPD nos parâmetros bioquímicos em pacientes com DRC em tratamento conservador.

Adesão (n=14) Não-Adesão (n=16)

Parâmetros Basal Após p valor Basal Após p valor

Albumina (mg/dL) 3,7 ± 0,3 3,7 ± 0,3 0,93 3,6 ± 0,3 3,6 ± 0,3 0,65

Potássio (mg/dL) 4,4 ± 0,5 4,5 ± 0,6 0,43 4,3 ± 0,6 4,4 ± 0,5 0,89

Sódio (mg/dL) 138,9 ± 4,4 134,9 ± 8,9 0,26 136,1 ± 6,8 136,3 ± 12,2 0,96

Fósforo (mg/dL) 3,3 ± 1,0 3,3 ± 0,9 0,94 2,9 ± 0,3 3,0 ± 0,4 0,74

Ureia (mg/dL) 78,2 ± 30,4 62,9 ± 32,5 0,20 63,2 ± 22,9 63,6 ± 28,7 0,90

Creatinina (mg/dL) 1,9 ± 0,5 2,0 ± 1,7 0,62 2,3 ± 1,1 2,3 ± 1,3 0,80

Ácido Úrico (mg/dL) 6,1 ± 0,8 5,7 ± 0,9 0,22 6,6 ± 1,6 5,7 ± 1,0 0,02

Glicose (mg/dL) 113,3 ± 70,5 87,6 ± 18,7 0,20 96,4 ± 27,5 95,6 ± 20,2 0,92

TFG (mL/min/1,73m2) 36,5 ± 11,7 42,2 ± 20,0 0,10 34,8 ± 12,8 36,9 ± 15,6 0,29

Colesterol Total (mg/dL) 183,9 ± 48,5 155,7 ± 37,2 0,01 180,3 ± 46,2 167,0 ± 48,1 0,16

HDL-c (mg/dL) 54,8 ± 13,7 50,4 ± 14,3 0,20 47,9 ± 14,3 47,6 ± 12,8 0,87

LDL-c (mg/dL) 99,4 ± 41,3 76,4 ± 33,2 0,01 104,8 ± 36,9 95,7 ± 38,7 0,17

Triglicerídeos (mg/dL) 145,8 ± 72,0 140,5 ± 109,9 0,83 137,8 ± 48,0 118,4 ± 56,0 0,31

Os dados são apresentados como média ± DP. TFG: Taxa de Filtração Glomerular; HDL-c: Lipoproteína de Alta Densidade; LDL-c:

Lipoproteína de Baixa Densidade.

Page 54: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

54

Nos pacientes que apresentaram boa adesão à dieta prescrita, foi observada redução

significativa nos níveis séricos de p-CS e redução, embora não significativa, de AIA. Em

contraste, os pacientes que não tiveram boa adesão à LPD apresentaram maiores concentrações

séricas dessas toxinas urêmicas após 6 meses de intervenção (Tabela 3). Quanto ao número médio

de bandas, não foi observada diferença estatística significativa entre os grupos, apesar de ser

notado pequena redução no grupo adesão e pequeno aumento no grupo não adesão (grupo adesão:

de 29,2±9,6 para 27,1±4,2, p=0,56; grupo não adesão: de 26,1±6,8 para 28,3±5,8, p=0,36) (dados

não apresentados). No entanto, o número médio de bandas foi positivamente associado à ingestão

proteíca (r=0,4, p=0,04) (Figura 5).

Além disso, utilizando-se a técnica de PCR-DGGE, observou-se mudança no perfil da

microbiota intestinal após o período de intervenção em ambos os grupos, mas não foi possível

separar as amostras por agrupamentos devido à baixa similaridade entre os perfis gerados (Figura

6).

Page 55: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

55

Tabela 3. Efeito da LPD nas concentrações séricas de toxinas urêmicas em pacientes com DRC em tratamento conservador.

Adesão (n=14) Não-Adesão (n=16)

Parâmetros Basal Após p valor Basal Após p valor p

IS (mg/L) 2,5 (1,8-3,8)

2,9 (1,6-7,2)

1,0 (-0,3; 2,3) 0,30 2,9 (1,7-4,0) 3,01 (1,2-5,7) 0,02 (-0,3; 1,3) 0,44 0,8

p-CS (mg/L) 19,3 (9,6-24,7) 15,5 (9,8-24,1) -3,8 (-6,6; 0,5) 0,03 13,9(8,0-24,8)

24,3 (8,1-39,2) 8,4 (0,18;13,1) 0,02 0,004

AIA (µg/L) 646,4 (476-1054) 571,6 (366-1125) - 68,7 (- 237;111) 0,36 718,6 (398 994) 783,9 (537-1105) 77,4 (-108;322) 0,13 0,09

Dados são apresentados como mediana (percentil 25, percentil 75). IS: indoxyl sulfato, p-CS: p-cresyl sulfato, AIA: ácido indol-3-

acético.

Page 56: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

56

Figura 5. Correlação entre a ingestão proteica e perfil da comunidade microbiana de amostras

fecais.

Ingestão Proteica (g/dia)

mer

o d

e B

an

das

(DG

GE

)

r = 0,4; p= 0,04

Page 57: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

57

Figure A Figure B

Figura 6. Análise de componentes principais (PCA) e classificação através de clustering de perfis DGGE para genes 16R rRNA.

Figura 6.A) PCA de genes 16S rRNA. Círculos pretos: momento basal do grupo adesão; Círculos azuis: grupo adesão após intervenção

nutricional; Quadrados pretos: momento basal do grupo não adesão; Quadrados azuis: grupo não adesão após intervenção nutricional.

Figura 6.B) Análise de clustering de genes 16S rRNA. Os números no eixo x correspondem ao coeficiente de similaridade (%) e cada

código no eixo y representa um paciente (número: identificação do paciente; T0: momento antes da intervenção e T1: momento após a

intervenção).

-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5Component 1

-2,0

-1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Co

mp

on

en

t 2

Com

pon

ente

Pri

nci

pal

Sco

re 2

Componente Principal Score 1

P1T1

P2T2

P3T0

P4T0

P4T1

P5T1

P6T1

P7T0

P8T0

P3T1

P8T1

P9T0

P10T0

P10T1

P11T0

P7T1

P11T1

P12T0

P9T1

P12T1

P13T1

P14T0

P15T0

P16T0

P16T1

P17T0

P5T0

P18T0

P18T1

P19T0

P19T1

P20T0

P20T1

P14T1

P17T1

P21T0

P21T1

P15T1

P13T0

P6T0

P2T0

P1T0

P1T1

P2T2

P3T0

P4T0

P4T1

P5T1

P6T1

P7T0

P8T0

P3T1

P8T1

P9T0

P10T0

P10T1

P11T0

P7T1

P11T1

P12T0

P9T1

P12T1

P13T1

P14T0

P15T0

P16T0

P16T1

P17T0

P5T0

P18T0

P18T1

P19T0

P19T1

P20T0

P20T1

P14T1

P17T1

P21T0

P21T1

P15T1

P13T0

P6T0

P2T0

P1T0

Page 58: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

58

7.0. DISCUSSÃO

Sabe-se que a prescrição de LPD para pacientes com DRC em tratamento conservador foi

descrita há mais de 140 anos para o tratamento dos sintomas urêmicos e, atualmente tem-se

estudado o seu papel, na modulação da microbiota intestinal e seus efeitos na redução da

produção de toxinas urêmicas. Desta forma, surge a necessidade de novas pesquisas que

comprovem tais benefícios. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da

dieta hipoproteica no perfil microbiano intestinal e nas concentrações séricas de toxinas urêmicas

em pacientes com DRC em tratamento conservador.

Os resultados deste estudo mostraram diminuição significativa nos níveis séricos de p-CS

após 6 meses de intervenção nutricional em pacientes com boa adesão à LPD quando comparados

aos pacientes do grupo não adesão. Além disso, tais pacientes apresentaram redução das

concentrações séricas de colesterol total e LDL-c, e não houve alteração nos parâmetros

nutricionais. Em contraste, os pacientes que não tiveram boa adesão à LPD apresentaram ingestão

proteica e níveis séricos de p-CS aumentados. Somado a isso, os parâmetros nutricionais como

IMC, CC e % de gordura corporal foram reduzidos.

Após 6 meses de intervenção nutricional, foi possível observar mudança no perfil da

microbiota intestinal, porém não foi observado agrupamento do perfil microbiano através de

clusters nos dois grupos avaliados. No entanto, o número médio de bandas foi positivamente

associado à ingestão de proteínas, sugerindo que a quantidade de proteína presente na dieta pode

interferir na composição da microbiota intestinal.

Sabe-se que a dieta tem impacto significativo no perfil da microbiota intestinal decorrente

das diferentes funções metabólicas exigidas para digerir a alimentação ingerida pelo hospedeiro

(Nallu et al., 2017). Além do hábito alimentar, outros fatores também podem levar à disbiose

intestinal, como os fatores iatrogênicos ou a uremia per se. A perda de função renal leva à

secreção de ureia no trato gastrointestinal que é hidrolisada pela urease expressa por alguns

microrganismos no intestino, resultando na formação de grande quantidade de amônia, o que

pode afetar o crescimento de bactérias comensais. O uso de antibióticos, a acidose metabólica, o

edema da parede intestinal e a prescrição de ingestão oral de ferro para corrigir casos de anemia

também podem influenciar a composição da microbiota intestinal (Ribeiro-Alves & Gordan,

Page 59: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

59

2014; Ramezani & Raj, 2014; Ramezani et al, 2016). Vaziri et al. (2013) identificaram maior

quantidade de unidades taxonômicas operacionais bacterianas (OTUs) das famílias

Brachybacterium, Catenibacterium, Enterobacteriaceae, Halomonadaceae, Moraxellaceae,

Nesterenkonia, Polyangiaceae, Pseudomonadaceae e Thiothrix em pacientes em hemodiálise

quando comparados ao grupo controle. Para corrigir variações interindividuais, um estudo

experimental foi realizado com ratos e diferença significativa na abundância de OTUs bacterianas

foi observada entre os ratos urêmicos e controle, com diminuição das famílias Lactobacillaceae e

Prevotellaceae, confirmando que a uremia per se altera a composição do microbioma intestinal.

Achados indicam que o perfil do microbioma pode estar alterado em pacientes com DRC

(Poesen et al., 2015; Ranganathan et al., 2010) apresentando maior quantidade de bactérias

potencialmente patogênicas e pró-inflamatórias, que são capazes de produzir toxinas urêmicas

que, por sua vez, contribuem para a progressão da doença renal e resultam em complicações

cardiovasculares (Poesen et al., 2015; Briskey et al, 2016). Barros et al. (2015) não encontraram

mudança no perfil da microbiota intestinal gerados pela técnica de DGGE em pacientes com DRC

em tratamento conservador quando comparados com indivíduos saudáveis, mas o

sequenciamento das bandas mostrou diferença na microbiota e foi observado correlação negativa

entre o número da bandas e os níveis de VCAM-1, importante marcador de risco cardiovascular.

Como citado anteriormente, a ingestão alimentar pode alterar o perfil da microbiota

intestinal e nos últimos anos, alguns estudos parecem confirmar que a ingestão de proteínas está

relacionada à produção de toxinas urêmicas pela microbiota intestinal (Patel et al., 2012; Mafra et

al., 2013; Poesen et al., 2015). Patel et al. (2012) observaram que a alta ingestão de proteína por

omnívoros provocou maior excreção urinária de IS quando comparado aos vegetarianos,

sugerindo que a ingestão de proteínas, principalmente de origem animal, poderia ser responsável

por aumentar a produção de toxinas urêmicas produzidas pela microbiota intestinal.

Wu et al. (2011), em uma pesquisa envolvendo 98 indivíduos saudáveis, confirmaram que

a dieta LPD interfere na saúde humana modulando a composição da microbiota intestinal. Depois

de coletar amostras de fezes, analisar amostras de DNA e realizar o pirosequenciamento 454

parcial do gene 16S rRNA, observou-se predominância de Bacteroides relacionada a maior

ingestão de proteína animal e de gordura, típico da dieta ocidental, e predominância de Prevotella

quando a dieta era rica em carboidratos.

Page 60: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

60

A hipótese proposta pelo nosso grupo foi que a LPD prescrita aos pacientes com DRC em

tratamento conservador poderia ser boa estratégia para diminuir as concentrações séricas de

toxinas urêmicas (Mafra et al., 2013). Em um estudo publicado por Poesen et al. (2015)

mostraram que o triptofano e os metabólitos fenólicos da dieta aumentaram a produção de toxinas

urêmicas, como IS, indoxyl glucuronido, ácido quinurênico, ácido quinolínico e p-CS, concluindo

que a ingestão de proteínas pode exercer influência sobre o metabolismo da microbiota intestinal.

Marzocco et al. (2013) observaram que dieta muito pobre em proteínas (0,3g/kg/dia)

suplementada com cetoácidos para pacientes com DRC na fase não-dialítica foi capaz de reduzir

as concentrações de IS. Um estudo transversal que incluiu 40 participantes com DRC em

tratamento conservador demonstrou que a razão proteína/fibra dietética estava associada a

elevados níveis séricos de IS e p-CS e esses autores especularam que a modificação da dieta com

o intuito de reduzir a razão proteína/fibra dietética poderia contribuir para diminuir essas toxinas

(Rossi et al., 2015). No entanto, no melhor do nosso conhecimento, não há estudo sobre os efeitos

da LPD (0,6g/kg/dia) nos níveis séricos de toxinas urêmicas em pacientes com DRC na fase não-

dialítica.

A prescrição de LPD para pacientes com DRC em tratamento conservador não é um

conceito novo (Dumler, 2011). Beale (1869) propôs que a LPD pudesse melhorar os sintomas

urêmicos (Di Iorio et al., 2013) e, hoje em dia, existem muitos estudos que confirmam tais efeitos

benéficos com a prescrição desta dieta (Marzocco et al., 2013; Rossi et al., 2015, Lai et al., 2015).

De fato, no presente estudo foi possível observar aparente melhora clínica da função renal e

melhora significativa do perfil lipídico do grupo adesão, provavelmente pela redução da ingestão

proteica de origem animal, como a carne vermelha, que favoreceu a redução do declínio da

função renal e do risco de desenvolvimento de DCV (Mafra et al, 2018).

No entanto, é muito difícil realizar estudos utilizando esta intervenção, porque mudar o

hábito alimentar é altamente invasivo e ao longo do tempo os participantes tendem a retornar às

suas dietas habituais, contribuindo para uma baixa adesão à LPD (Piccoli et al., 2015). Além do

hábito alimentar de ingerir grande quantidade de proteínas pela população da América do Norte,

os nefrologistas americanos raramente prescrevem a LPD (0,6g/kg/dia). Entre outras justificativas

para a não prescrição desta dieta, estão a falta de conhecimento sobre sua eficácia e segurança,

pouco treinamento e experiência relacionada a sua prescrição e o risco de desenvolvimento de

Page 61: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

61

protein energy wasting pelos pacientes renais crônicos (Kalantar-Zadeh et al., 2016). No Brasil,

dados da Pesquisa de Orçamento Familiar, mostraram que os alimentos mais consumidos pelos

brasileiros, dentre outros, foram feijão e arroz (fontes de proteína vegetal), e carne (fonte de

proteína animal) (IBGE, 2010). Desta forma, o hábito alimentar do brasileiro inclui dieta rica em

proteínas com ingestão média de carne de aproximadamente 180g/dia, o que também dificultaria

o seguimento dessa proposta nutricional (Mafra & Leal, 2016). De fato, apenas 50% dos

pacientes deste estudo apresentaram boa adesão à dieta.

Além disso, é importante enfatizar que os pacientes que não tiveram boa adesão à

prescrição de LPD apresentaram diminuição significativa no IMC, no % de gordura corporal e

nos valores de CC e, curiosamente, redução significativa na ingestão de energia, o que nos levou

a acreditar que o foco desses pacientes era a perda de peso e não a função renoprotetora da dieta.

Diversos estudos tem mostrado baixa adesão ao tratamento, tanto em relação ao planejamento

dietético quanto farmacológico, o qual varia de 20% a 70% dependendo do método de avaliação

utilizado, confirmando que nenhuma estratégia educacional ou clínica foi consistentemente eficaz

nesta população até o presente momento (Kirsztajn et al., 2014, Beto et al., 2016; Briskey et al.,

2016).

Koya et al. (2009) também encontraram dificuldade de 112 pacientes com nefropatia

diabética de seguirem a prescrição de dieta com 0,8g de proteínas /kg/dia a longo prazo. Este fato

pode ter contribuído para que os pesquisadores não encontrassem correlação entre LPD e

renoproteção. Já Lai et al. (2015) apresentaram resultados semelhantes aos encontrados no

presente estudo. Após um ano com prescrição de LPD para 16 pacientes com DRC na fase não-

dialítica, os mesmos apresentaram redução do IMC e manutenção da massa magra, manutenção

dos níveis séricos de albumina e proteína, enquanto que a função renal permaneceu estável.

Dessa forma, o papel da dieta restrita em proteína com a finalidade de retardar a

progressão da DRC ainda é controverso. A principal razão para isso seria a dificuldade de adesão

à LPD, não sendo possível concluir de forma convincente que a restrição proteica a longo prazo

pudesse retardar a evolução da doença renal em estágio final (Kirsztajn et al., 2014). Somado a

isso, a segurança nutricional da prescrição de LPD tem sido muitas vezes questionada,

principalmente quanto às consequências negativas sobre morbidade e mortalidade quando os

pacientes precisam ser submetidos à terapia renal substitutiva (Chauveau et al., 2009). Assim, a

Page 62: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

62

seleção de pacientes motivados, juntamente com o acompanhamento periódico dos profissionais

de saúde para controlar o estado nutricional, o aconselhamento dietético e o uso adequado de

medicamentos, podem ser de suma importância para a eficácia do tratamento (Garneata &

Mircescu, 2010; Piccoli et al., 2015).

Por fim, este estudo apresentou algumas limitações, uma vez que envolveu somente 30

participantes, e apenas 14 deles conseguiram seguir a dieta durante os 6 meses de intervenção,

mesmo após a utilização de diversas estratégias de educação nutricional, tais como oficinas

culinárias e aconselhamento nutricional individualizado bimestralmente. Não foi estimada a

ingestão dos aminoácidos precursores das toxinas urêmicas estudadas, tais como triptofano,

tirosina e fenilalanina, os quais poderiam nortear os reais motivos da redução sérica de p-CS e

AIA. O número amostral também pode ter sido insuficiente para determinar a eficácia na

detecção do agrupamento do perfil da microbiota intestinal nos 2 grupos de pacientes com DRC

na fase pré-dialítica, já que não só o hábito alimentar, mas outros fatores podem interferir na

composição da microbiota intestinal do indivíduo. Somado a isso, a técnica de PCR-DGGE não

apresenta a sensibilidade necessária para determinar qual a diversidade da microbiota. Para

obtenção de resultados mais detalhados sobre o surgimento ou a extinção de grupos de bactérias

após a intervenção nutricional seria necessário a utilização de técnicas moleculares mais

modernas, como o sequenciamento de nova geração. A metagenômica tem sido muito utilizada

para mapear o microbioma intestinal humano, sendo aplicada em 2 importantes projetos: Human

Microbiome Project e o MetaHIT. No entanto, no presente estudo não foi realizado este tipo de

análise.

Além disso, o período de estudo pode ter sido muito curto para realmente mudar o estilo

de vida de todos os participantes. Alterar o hábito alimentar requer tempo, e as mudanças na dieta

podem ter efeitos variados em diferentes pessoas devido às características individuais. Estudos de

intervenção a longo prazo são necessários para entender o efeito da LPD na função renal. No

entanto, não acreditamos que essas limitações tenham alterado nossas principais descobertas.

Page 63: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

63

8.0. CONCLUSÃO

Desta forma, os resultados deste estudo nos possibilitaram concluir que:

LPD prescrita para pacientes com DRC não-dialisados parece ser uma importante

estratégia para reduzir a progressão da falência renal e a produção de toxinas urêmicas

sem efeito deletério no estado nutricional, quando propriamente monitorada por médicos e

nutricionistas.

Utilizando a técnica PCR-DGGE, observou-se que a intervenção nutricional foi capaz de

promover alteração no perfil da microbiota intestinal em ambos os grupos, mas não foi

possível perceber um agrupamento da comunidade microbiana devido à baixa

similaridade entre os perfis gerados.

Após análise do perfil da microbiota intestinal, não foi observada mudança da média do

número de bandas em ambos os grupos. Porém, o número de bandas foi positivamente

associado com maior ingestão proteica.

Pacientes com boa adesão à dieta prescrita tiveram redução significativa das

concentrações séricas de colesterol total, LDL-c e p-CS, aparente melhora da TFG e não

apresentaram alterações nos parâmetros antropométricos e de ingestão alimentar.

Nos pacientes do grupo não adesão houve redução da ingestão calórica, do IMC, da CC e

do percentual de gordura corporal e aumento significativo da concentração sérica de p-CS.

Porém, não foi observado mudança nos parâmetros bioquímicos e no perfil lipídico após

intervenção nutricional.

Page 64: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

64

9.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Adesso S, Popolo A, Bianco G, Sorrentino R, Pinto A, Autore G, Marzocco S.The uremic toxin

indoxyl sulphate enhances macrophage response to LPS. PLoS ONE 2013; 8(9): e76778.

Anders H-J, Andersen K, Stecher B. The intestinal microbiota, a leaky gut, and abnormal

immunity in kidney disease Kidney International 2013; 83: 1010–1016.

Barbosa ACSCS, Salomon ALR. Resposta inflamatória de pacientes com doença renal crônica

em fase pré-dialítica e sua relação com a ingestão proteica. Com. Ciências Saúde. 2013; 22(4):

111-125.

Barreto FC, Stinghen AEM, Oliveira RB, Franco ATB, Moreno NA, Barreto DV, Pecoits-Filho

R, Drüeke TB, Massy ZA. Em busca de uma melhor compreensão da doença renal crônica: uma

atualização em toxinas urêmicas. J Bras Nefrol 2014; 36 (2): 221-235.

Barros AF, Borges NA, Ferreira DC, Carmo FL, Rosado AS, Fouque D, Mafra D. Is there

interaction between gut microbial profile and cardiovascular risk in chronic kidney disease

patients? Future Microbiol. 2015; 10(4), 517–526.

Bastos MG, Bregman R, Kirsztajn GM. Doença renal crônica: frequente e grave, mas também

prevenível e tratável. Rev Assoc Med Bras 2010; 56(2): 248-53.

Bastos RMR, Teixeira MTB, Chaoubah A, Bastos RV, Bastos MG. Hiperuricemia: Um marcador

para doença renal crônica pré-clínica? J Bras Nefrol 2009; 31(1): 32-8.

Bellizzi V, Cupisti A, Locatelli F, Bolasco P, Brunori G, Cancarini G, Caria S, et al. Low-protein

diets for chronic kidney disease patients: the Italian experience. BMC Nephrology 2016; 17:77.

Page 65: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

65

Bergström A, Skov TH, Bahl MI, Roager HM, Christensen LB, Ejlerskov KT, Mølgaard,

Michaelsen KF, Lichta TR. Establishment of intestinal microbiota during early life: a

longitudinal, explorative study of a large cohort of danish infants. Applied and Environmental

Microbiology 2014; 80 (9): 2889–2900.

Beto, JA, Schury, KA, Bansal, VK. Strategies to promote adherence to nutritional advice in

patients with chronic kidney disease: a narrative review and commentary. International Journal of

Nephrology and Renovascular Disease 2016; 9: 21–33.

Besarab A, Provenzano R, Hertel J, Zabaneh R, Klaus SJ, Lee T, et al. Randomized placebo-

controlled dose-ranging and pharmacodynamics study of roxadustat (FG-4592) to treat anemia in

nondialysis-dependent chronic kidney disease (NDD-CKD) patients. Nephrol Dial Transplant

2015; 30: 1665–1673.

Black AP, Cardozo LFMF, Mafra D. Effects of Uremic Toxins from the Gut Microbiota on Bone:

A Brief Look at Chronic Kidney Disease. Therapeutic Apheresis and Dialysis 2015; 19(5):436–

440.

Blaut M, Clavel T. Metabolic diversity of the intestinal microbiota: implications for health and

disease. J Nutr 2007; 137: 751S–5S.

Bochnie KA, Gregório PC, Maciel RAP. Análise da viabilidade celular por mtt em células

tratadas com toxinas urêmicas – revisão. Cad. da Esc. de Saúde 2016; 1 (15): 42-51.

Briskey D, Tucker P, Johnson DW, Coombes JS. Microbiota and the nitrogen cycle: implications

in the development and progression of CVD and CKD. Nitric Oxide 2016; 1-7.

Briskey D, Tucker P, Johnson DW, Coombes JS. The role of the gastrointestinal tract and

microbiota on uremic toxins and chronic kidney disease development. Clin Exp Nephrol 2016.

Page 66: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

66

Brito JS, Borges NA, Dolenga, CJR, Carraro-Eduardo JC, Nakao LS, Mafra D. Há relação entre

ingestão alimentar de triptofano e níveis plasmáticos de indoxil sulfato em pacientes renais

crônicos em hemodiálise? J Bras Nefrol 2016; 38(4): 396-402.

Bucharles SGE, Varela AM, Barberato SH, Pecoits-Filho R. Avaliação e manejo da doença

cardiovascular em pacientes com doença renal crônica. J Bras Nefrol 2010; 32 (1):120-127.

Caesar R, Tremaroli V, Kovatcheva-Datchary P, Cani PD, Backhed F. Crosstalk between gut

microbiota and dietary lipids aggravates WAT inflammation through TLR signaling. Cell

Metabolism 2015; 22: 1–11.

Calaf R, Cerini C, Génovésio C, Verhaeghe P, Jourde-Chiche N, Bergé-Lefranc D et al.

Determination of uremic solutes in biological fluids of chronic kidney disease patients by HPLC

assay. Journal of Chromatography B 2011; 879 (23): 2281–2286.

Cani PD, Amar J, Iglesias MA, Poggi M, Knauf C, Bastelica D, et al. Metabolic endotoxemia

initiates obesity and insulin resistance. Diabetes 2007; 56(7): 1761-72.

Cani PD, Bibiloni R, Knauf C, Waget A, Neyrinck AM, Delzenne NM, Burcelin R. Changes in

gut microbiota control metabolic endotoxemia-induced inflammation in high-fat diet-induced

obesity and diabetes in mice. Diabetes 2008; 57(6): 1470-81.

Caravaca F, Martínez del Viejo C, Villa J, Martínez Gallardo R, Ferreira F. Hydration status

assessment by multi-frequency bioimpedance in patients with advanced chronic kidney disease.

Nefrologia 2011; 31(5): 537-44.

Caria S, Cupisti A, Sau G, Bolasco P. The incremental treatment of ESRD: a low-protein diet

combined with weekly hemodialysis may be beneficial for selected patients. BMC Nephrology

2014; 15:172.

Page 67: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

67

Carrero JJ. Mechanisms of altered regulation of food intake in chronic kidney disease. Journal of

Renal Nutrition 2011; 21(1): 7–11.

Charalambous BM, Stephens RC, Feavers IM, Montgomery HE. Role of bacterial endotoxin in

chronic heart failure: the gut of the matter. Shock 2007; 28 (1): 15-23.

Charytan DM, Fishbane S, Malyszko J, McCullough PA, Goldsmith D. Cardiorenal Syndrome

and the Role of the Bone-Mineral Axis and Anemia. Am J Kidney Dis. 2015; 66(2): 196–205.

Chauveau P, Couzi L, Vendrely B, Précigout V, Combe C, Fouque D, Aparicio M. Long-term

outcome on renal replacement therapy in patients who previously received a keto acid–

supplemented very-low-protein diet. Am J Clin Nutr 2009; 90: 969–74.

Claesson MJ, Cusacka S, O’Sullivanc O, Greene-Diniza R, Weerdd H, Flannerye E, et al.

Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly. PNAS

2011; 108 (1): 4586–4591.

Clemente JC, Ursell1 LK, Parfrey LW, Knight R. The Impact of the Gut Microbiota on Human

Health: An Integrative View. Cell. 2012; 148(6): 1258–1270.

Dethlefsen L, McFall-Ngai M, Relman DA. An ecological and evolutionary perspective on

human-microbe mutualism and disease. Nature 2007; 449: 811–18.

Di Iorio B, De Santo NG, Anastasio P, Perna A, Pollastro MR, Di Micco L, Cirillo M. The

Giordano-Giovannetti diet*. J Nephol 2013; 26 (22): S143-S152.

Dou L, Sallée M, Cerini C, Poitevin S, Gondouin B, Jourde-Chiche N, et al. The cardiovascular

effect of the uremic solute indole-3 acetic acid. J Am Soc Nephrol 2015; 26: 876–887.

Page 68: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

68

Dumler, F. Body composition modifications in patients under low protein diets. Journal of Renal

Nutrition 2011; 21 (1): 76–81.

Feroze U, Kalantar-Zadeh K, Sterling KA, Molnar MZ, Noori N, Benner D et al. Examining

associations of circulating endotoxin with nutritional status, inflammation, and mortality in

hemodialysis patients. J Ren Nutr 2012; 22 (3): 317–326.

Frota KMG, Soares NRM, Muniz VRC, Fontenelle LC, Carvalho CMRG. Efeito de prebióticos e

probióticos na microbiota intestinal e nas alterações metabólicas de indivíduos obesos. Nutrire.

2015; 40 (2): 173-187.

Fouque D, Aparício M. Eleven reasons to control the protein intake of patients with chronic

kidney disease. Nut Clin Pract Nephrol 2007; 3: 383-392.

Fouque D, Laville M: Low protein diets for chronic kidney disease in non diabetic adults.

Cochrane Database Syst Rev 2009; 8:CD001892.

Frank DN, St Amand AL, Feldman RA, Boedeker EC, Harpaz N, Pace NR. Molecular-

phylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel

diseases. Proc. Natl Acad. Sci. 2007; 104 (34): 13780–13785.

Garneata L, Mircescu G. Effect of Low-Protein Diet Supplemented with keto acids on

progression of chronic kidney disease. Journal of Renal Nutrition 2013; 23 (3): 210-213.

Garneata L, Mircescu G. Nutritional intervention in uremia—myth or reality? Journal of Renal

Nutrition 2010; 20 (5S): S31–S34.

Gill CI, Rowland IR. Diet and cancer: assessing the risk. Br J Nutr. 2002; 88 (1): S73–87.

Page 69: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

69

Giordano M, Ciarambino T, Castellino P, Paolisso G. Light and shadows of dietary protein

restriction in elderly with Chronic Kidney Disease. Nutrition 2013; 29: 1090–1093.

Gluba-Brzózka A, Franczyk B, Rysz J. Vegetarian diet in chronic kidney disease- a friend or foe.

Nutrients 2017; 9 (374): 1-15.

Gonçalves S, Pecoits-Filho R, Perreto S, Barberato SH, Stinghen AEM, Lima EGA, Fuerbringer

R, Sauthier SM, Riella MC. Associations between renal function, volume status and

endotoxaemia in chronic kidney disease patients. Nephrol Dial Transplant 2006; 21 (10): 2788–

2794.

Hauser AB, Stinghen AEM, Gonçalves SM, Bucharles S, Pecoits-Filho R. A Gut feeling on

endotoxemia: causes and consequences in chronic kidney disease. Nephron Clin Pract 2011; 118:

165–172.

Hill MJ. Intestinal flora and endogenous vitamin synthesis. Eur J Cancer Prev 1997; 6: S43–5.

Hsu CY, Bates DW, Kuperman, GJ, Curhan GC. Relationship between hematocrit and renal

function in men and women. Kidney International 2001; 59: 725–731.

IBGE. Ministério do Planejamento, Orçamento e Gestão, Instituto Brasileiro de Geografia e

Estatística, Pesquisa de orçamentos familiares 2008-2009. Análise do consumo alimentar e

pessoal no Brasil. Rio de Janeiro. [S.l: s.n.]., 2010.

Ikizler AP. Dietary protein restrition in CKD: the debate continues. Am J Kidney Dis 2009; 53:

189-191.

Jourde-Chiche N, Dou L, Sabatier F, Calaf R, Cerini C, Robert S, et al. Levels of circulating

endothelial progenitor cells are related to uremic toxins and vascular injury in hemodialysis

patients. J Thromb Haemost 2009; 7: 1576–84.

Page 70: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

70

Kalantar-Zadeh K, Moore LW, Tortorici AR, Chou JA, St-Jules DE, Aoun A,et al. North

American experience with Low protein diet for Non-dialysis-dependent chronic kidney disease.

BMC Nephrology 2016; 17 (90): 1-11.

Kanda E, Ai M, Kuriyama R, Yoshida M, Shiigai T. Dietary acid intake and kidney disease

progression in the elderly. Am J Nephrol. 2014; 39: 145–152.

Kanda E, Ai M, Okazaki M, Yoshida M, Maeda Y. Association of high-density lipoprotein

subclasses with chronic kidney disease progression, atherosclerosis, and klotho. PLoS ONE 2016;

11(11): 1-18.

Kazama JJ, Iwasaki Y, Fukagawa M. Uremic osteoporosis. Kidney International Supplements

2013; 3: 446–450.

KDIGO. KDIGO Clinical practice guideline for the diagnosis, evaluation, prevention, and

treatment of chronic kidney disease-mineral and bone disorder (CKD-MBD). Kidney Int. 2009;

76 (113): S22-S49.

KDIGO 2012. Clinical practice guideline for the evaluation and management of chronic kidney

disease. Kidney Int. 2013; 3:5-6.

Kim HJ; Vaziri ND. Contribution of impaired Nrf2-Keap1 pathway to oxidative stress and

inflammation in chronic renal failure. Am J Physiol Renal Physiol 2010; 298: F662–F671.

Kirsztajn GM, Filho NS, Draibe SA, Netto MVP, Thomé FS, Souza E, Bastos MG. Leitura rápida

do KDIGO 2012: Diretrizes para avaliação e manuseio da doença renal crônica na prática clínica.

J Bras Nefrol 2014; 36(1):63-73.

Krishnan S, Alden N, Lee K. Pathways and Functions of Gut Microbiota Metabolism Impacting

Host Physiology. Curr Opin Biotechnol. 2015 ; 36: 137–145.

Page 71: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

71

Koppe L, Mafra D, Fouque D. Probiotics and chronic kidney disease. Kidney International 2015;

88 (5): 958-66.

Koppe L, Pillon NJ, Vella RE, Croze ML, Pelletier CC, Chambert S, et al. p-Cresyl sulfate

promotes insulin resistance associated with CKD. JASN 2013; 24 (1): 88-89.

Koya D, Haneda M, Inomata S, Suzuki Y, Suzuki D, Makino H, et al. Long-term effect of

modification of dietary protein intake on the progression of diabetic nephropathy: a randomized

controlled trial. Diabetologia 2009; 52: 2037–2045.

Kovesdy CP, Kopple JD, Kalantar-Zadeh K. Management of protein-energy wasting in non-

dialysis-dependent chronic kidney disease: reconciling low protein intake with nutritional

therapy. Am J Clin Nutr 2013; 97: 1163–77.

Lai S, Molfino A, Coppola B, De Leo S, Tommasi V, Galani A, Migliaccio S, Greco EA, Musto

TG, Muscaritoli M. Effect of personalized dietary intervention on nutritional, metabolic and

vascular indices in patients with chronic kidney disease. European Review for Medical and

Pharmacological Sciences 2015; 19: 3351-3359.

Lambert GP. Stress-induced gastrointestinal barrier dysfunction and its inflammatory

effects. Journal of animal science 2009; 87 (14): E101-E108.

Leal VO, Leite Júnior M, Mafra D. Acidose metabólica na doença renal crônica: abordagem

nutricional. Rev. Nutr. 2008; 21(1):93-103.

Lehmkuhl A, Maia AJM, Machado MO. Estudo da prevalência de óbitos de pacientes com

doença renal crônica associada à doença mineral óssea. J Bras Nefrol 2009; 31(1):10-7.

Lerman LO; Lerman A. The metabolic syndrome and early kidney disease: another link in the

chain? Rev Esp Cardiol. 2011; 64 (5): 358–360.

Page 72: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

72

Levey AS, Greene T, Beck GJ, Caggiula AW, Kusek JW, Hunsicker LG, Klahr S. Dietary protein

restriction and the progression of chronic renal disease: what have all of the results of the MDRD

study shown? J Am Soc Nephrol 1999; 10: 2426–2439.

Levey AS, Stevens LA, Schmid CH, Zhang Y, Castro A, Feldman AF, et al. For the CKD-EPI

(Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration). A new equation to estimate glomerular

filtration rate. Ann Intern Med 2009; 150: 604-612.

Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI. Microbial ecology: human gut microbes associated

with obesity. Nature 2006; 444: 1022–1023.

Liabeuf S, Glorieux G, Lenglet A, Diouf M, Schepers E, Desjardins L, et al. Does P-Cresyl

glucuronide have the same impact on mortality as other protein-bound uremic toxins? PLoS ONE

2013; 8(6): 1-10.

Lohman, TG, Roche AF, Martorell R. Anthropometric standardization reference manual.

Abridged edition. Champaign, IL: Human Kinetics Books; 1991. P90.

Mafra D, Barros AF, Fouque D. Dietary protein metabolism by gut microbiota and its

consequences for chronic kidney disease patients. Future Microbiology 2013; 8(10): 1317–1323.

Mafra D, Borges NA, Cardozo LFMF, Anjos JS, Black AP, Moraes C et al. Red meat intake in

chronic kidney disease patients: Two sides of the coin. Nutrition 2018; 46: 26–32.

Mafra D, Leal VO. A practical approach to a low protein diet in Brazil. BMC Nephrology 2016;

17: 105-112.

Mafra D, Lobo JC, Barros AF, Vaziri ND, Fouque D. Role of altered intestinal microbiota in

systemic inflammation and cardiovascular disease in CKD. Future Microbiology, 2014; 9(3):

399-410.

Page 73: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

73

Magnani BM , Costa TS , Silva NS , Matos VM , Silva VYNE, Kashiwabara TGB. Doença renal

crônica em hipertensos e diabéticos. Brazilian Journal of Surgery and Clinical Research 2014; 6

(3):60-62.

Manco M. Endotoxin as a missed link among all the metabolic abnormalities in the metabolic

syndrome. Atherosclerosis 2009; 206, 36.

Marteau P. Bacterial flora in infl ammatory bowel disease. Dig Dis 2009; 27: 99 – 103.

Marzocco S, Dal Piaz F, Di Micco L, Torraca S, Sirico ML, Tartaglia D, et al. Very low protein

diet reduces indoxyl sulfate levels in chronic kidney disease. Blood Purif. 2013; 35(1-3):196-201.

MDRD study. Effects of dietary protein restriction on the progression of moderate renal disease

in the Modification of Diet in Renal Disease Study. J Am Soc Nephrol 1996; 7: 2616–26.

Medina M, Izquierdo E, Ennahar S, Sanz Y. Differential immunomodulatory properties of

Bifidobacterium logum strains: relevance to probiotic selection and clinical applications. Clinical

& Experimental Immunology 2007; 150(3): 531–538.

Meijers BK, Bammens B, De Moor B, Verbeke K, Vanrenterghem Y, Evenepoel P. Free p-cresol

is associated with cardiovascular disease in hemodialysis patients. Kidney Int 2008, 73: 1174–

1180.

Meijers BK, Claes K, Bammens B, de Loor H, Viaene L, Verbeke K, et al. p-Cresol and

cardiovascular risk in mild-to-moderate kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol 2010a; 5: 1182–

1189.

Meijers BK, Evenepoel P. The gut-kidney axis: indoxyl sulfate, p-cresyl sulfate and CKD

progression. Nephrol Dial Transplant 2011; 26: 759-761.

Page 74: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

74

Meijers BK, De Preter V, Verbeke K, Vanrenterghem Y, Evenepoel P. p-Cresyl sulfate serum

concentrations in haemodialysis patients are reduced by the prebiotic oligofructose-enriched

inulin Bj Nephrol Dial Transplant 2010b; 25: 219–224.

Meyer TW, Hostetter TH. Uremic solutes from colon microbes. Kidney Int. 2012; 81: 949–954.

Mitreva, M. Human Microbiome Project Consortium. Structure, function and diversity of the

healthy human microbiome. Nature 2012; 486: 207–214.

Moraes ACF, Silva IT, Almeida-Pititto B, Ferreira SRG. Microbiota intestinal e risco

cardiometabólico: mecanismos e modulação dietética. Endocrinol Metab. 2014; 58(4): 317-27.

Musso G, Gambino R, Cassader M. Interactions between gut microbiota and host metabolism

predisposing to obesity and diabetes. Annu Rev Med 2011; 62: 361–80.

Nallu A, Sharma S, Ramezani A, Muralidharan J, Raj D. Gut microbiome in chronic kidney

disease: challenges and opportunities. Translational Research 2017; 179: 24–37.

Niwa, T. Uremic toxicity of indoxyl sulfate. Nagoya J. Med. Sci. 2010; 72:1-11.

Niwa, T. Role of indoxyl sulfate in the progression of chronic kidney disease and cardiovascular

disease: experimental and clinical effects of oral sorbent AST-120. Therapeutic Apheresis and

Dialysis 2011; 15(2):120–124.

Noce A, Vidiri MF, Marrone G, Moriconi E, Bocedi A, Capria A, et al. Is low-protein diet a

possible risk factor of malnutrition in chronic kidney disease patients? Cell Death Discovery

2016; 2:16026.

Page 75: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

75

Nübel U, Engelen B, Felske A, Snaidr J, Wieshuber A, Amann RI, Ludwig W, Backhaus H.

Sequence heterogeneities of genes encoding 16S rRNAs in Paenibacillus polymyxa detected by

temperature gradient gel electrophoresis. J Bacteriol. 1996; 178 (19): 5636-43.

Panahi MH, Hadaegh F, Yavari P, Kazempour-Ardebili S, Mehrabi Y, Azizi F, Khalili D. A

challenging interaction of chronic kidney disease with other metabolic disorders. Paradoxes in

cardiometabolic risk factors. Iranian Journal of Kidney Diseases 2016; 10 (5): 274-281.

Patel KP, Luo FJ, Plummer NS, Hostetter TH, Meyer TW. The production of p-cresol sulfate and

indoxyl sulfate in vegetarians versus omnivores. Clin J Am Soc Nephrol. 2012; 7(6): 982–8.

Phakdeekitcharoen B, Boonyawat K. The added-up albumin enhances the diuretic effect of

furosemide in patients with hypoalbuminemic chronic kidney disease: a randomized controlled

study Bunyong. BMC Nephrology 2012; 13 (92):1-9.

Piccoli GB, Deagostini MC, Vigotti FN, Ferraresi M, Moro I, Consiglio V, et al. Which low-

protein diet for which CKD patient? An observational, personalized approach. Nutrition 2014;

30: 992–999.

Piccoli GB, Vigotti FN, Leone F, Capizzi I, Daidola G, Cabiddu G, Avagnina P. Low-protein

diets in CKD: how can we achieve them? A narrative, pragmatic review. Clin Kidney J. 2015; 8:

61–70.

Poesen R, Mutsaers HAM, Windey K, van den Broek PH, Verweij V, Augustijns P, et al. The

influence of dietary protein in take on mammalian tryptophan and phenolic metabolites.

PLoSONE 2015; 10 (10): 1-12.

Poesen R, Windey K, Neven E, Kuypers D, De Preter V, Augustijns P, et al. The influence of

CKD on colonic microbial metabolism. J Am Soc Nephrol 2015; 27: 1-11.

Page 76: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

76

Prakash S, Rodes L, Coussa-Charley M, Tomaro-Duchesneau C. Gut microbiota: next frontier in

understanding human health and development of biotherapeutics. Biologics: Targets and Therapy

2011; 5: 71–86.

Pussinen PJ, Havulinna AS, Lehto M, Sundvall J, Salomaa V. Endotoxemia is associated with an

increased risk of incident diabetes. Diabetes Care 2011; 34(2): 392-397.

Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Arumugam M, Burgdorf KS, Manichanh C, et al. A human

gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing Nature 2010; 464: 59–65.

Raj DS, Carrero JJ, Shah VO, Qureshi AR, Bárány P, Heimbürger O, et al. Soluble CD14 levels,

interleukin 6, and mortality among prevalent hemodialysis patients. Am J Kidney Dis 2009; 54

(6): 1072–1080.

Ramezani A, Massy ZA, Meijers B, Evenepoel P, Vanholder R, Raj DS. Role of the Gut

Microbiome in Uremia: A Potential Therapeutic Target. Am J Kidney Dis. 2016; 67(3): 483-498.

Ramezani A, Raj DS. The gut microbiome, kidney disease, and targeted interventions. J Am Soc

Nephrol 2014; 25: 657–670.

Ranganathan N, Ranganathan P, Friedman EA, Joseph A, Delano B, Goldfarb DS, et al. Pilot

Study of Probiotic Dietary Supplementation for Promoting Healthy Kidney Function in Patients

with Chronic Kidney Disease. Adv Ther. 2010; 27(9): 634-647.

Reid G, Sanders ME, Gaskins HR, Gibson GR, Mercenier A, Rastall R, et al. New scientific

paradigms for probiotics and prebiotics. J Clin Gastr 2003; 37(2): 105–118.

Ribeiro-Alves MA; Gordan PA. Diagnóstico de anemia em pacientes portadores de doença renal

crônica. J Bras Nefrol 2014; 36(1 Supl. 1):9-12.

Page 77: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

77

Rossi M, Johnson DW, Xu H, Carrero JJ, Pascoe E, French C, Campbell KL. Dietary protein-

fiber ratio associates with circulating levels of indoxyl sulfate and p-cresyl sulfate in chronic

kidney disease patients. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases 2015; 25, 860-865.

Rotenberg, KJ, Costa P, Trueman M, Lattimore P. The relation between the lack of control

attributional style for indulgent food consumption and bulimic symptoms. Eating Behaviors,

2011; 12 (4): 325–327.

Saad SMI. Probióticos e prebióticos: o estado da arte. Revista Brasileira de Ciências

Farmacêuticas 2006; 42 (1): 1-16.

Sallée M, Dou L, Cerini C, Poitevin S, Brunet P, Burtey S. The aryl hydrocarbon receptor-

activating effect of uremic toxins from tryptophan metabolism: a new concept to understand

cardiovascular complications of chronic kidney disease. Toxins 2014; 6: 934-949.

Sanz Y, Nadal I, Sanchez E. Probiotics as drugs against human gastrointestinal infections. Recen

P A Dr Disc 2007; 2(2): 148–156.

Scalone L, Borghetti F, Brunori G, Viola BF, Brancati B, Sottini L, et al. Cost-benefit analysis of

supplemented very low-protein diet versus dialysis in elderly CKD5 patients. Nephrol Dial

Transplant 2010; 25: 907–913.

Schepers E, Meert N, Glorieu XG, Goeman J, Van der Eycken J, Vanholder R. p- Cresyl

sulphate, the main in vivo metabolite of p- cresol, activates leucocyte free radical production.

Nephrol Dial Transplant 2007; 22: 592–596.

Schork A, Woern M, Kalbacher H, Voelter W, Nacken R, Bertog M, et al. Association of

Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clinical Journal of the American Society

of Nephrology  2016; 11(5): 761–769.

Page 78: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

78

Scott KP, Gratz SW, Sheridan PO, Flint HJ, Duncan SH. The influence of diet on the gut

microbiota. Pharmacological Research 2013; 69: 52– 60.

Seki E, Brenner DA. TLR and adaptor molecules in liver disease: update. Hepatology 2008; 48:

322–35.

Sekirov I, Russell SL, Antunes LC, Finlay B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev

2010; 90: 859–904.

Sesso RC, Lopes AA, Thomé FS, Lugon JR, Santos DR. Inquérito Brasileiro de Diálise Crônica

2013 - Análise das tendências entre 2011 e 2013. J Bras Nefrol 2014; 36(4):476-481.

Snively CS, Gutierrez C. Chronic kidney disease: prevention and treatment of common

complications. Am Farm Physician 2004; 70: 1921-1928.

Sonnenburg JL, Bäckhed F. Diet–microbiota interactions as moderators of human metabolism.

Nature 2016; 535: 56-64.

Soulage CO, Koppe L, Fouque D. Protein-bound uremic toxins...New targets to prevent insulin

resistance and dysmetabolism in patients with chronic kidney disease. Journal of Renal Nutrition,

2013; 23(6): 464-466.

Stockler-Pinto MB; Fouque D; Soulage CO; Croze M; Mafra D. Indoxyl sulfate and p-cresyl

sulfate in chronic kidney disease. Could these toxins modulate antioxidant Nrf2-Keap1 pathway?

J Ren Nutr. 2014; 13: S1051-2276.

Storino GF, Moraes C, Saldanha J, Mafra D. Mortalidade cardiovascular em pacientes renais

crônicos: o papel das toxinas urêmicas. Internacional Journal of Cardiovascular Sciences 2015;

28(4): 327-334.

Page 79: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

79

Strathdee F, Free A. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Methods Mol Biol. 2013;

1054: 145-57.

Szeto CC, Kwan BCH, Chow KM, Lai KB, Chung KY, Leung CB, Li PK. Endotoxemia is

related to systemic inflammation and atherosclerosis in peritoneal dialysis patients. Clin J Am

Soc Nephrol. 2008; 3: 431–6.

TACO. Tabela Brasileira de Composição de Alimentos. Núcleo de Estudos e Pesquisas em

Alimentação; Unicamp. 4ª edição. 2011.

Taki, K.; Niwa, T. Indoxyl sulfate–lowering capacity of oral sorbents affects the prognosis of

kidney function and oxidative stress in chronic kidney disease. Journal of Renal Nutrition, 2007;

17 (1): 48-52.

Tremaroli V, Bäckhed F. Functional interactions between the gut microbiota and host

metabolism. Nature 2012; 489(7415): 242-249.

Tohidi M, Hasheminia M, Mohebi R, Khalili D, Hosseinpanah F, Yazdani B, et al. Incidence of

Chronic Kidney Disease and Its Risk Factors, Results of Over 10 Year Follow Up in an Iranian

Cohort. PLoS ONE 2012; 7(9): 1-9.

Vanholder R, De Smet R, Glorieux G, Argilés A, Baurmeister U, Brunet P, et al.; European

Uremic Toxin Work Group (EUTox). Review on uremic toxins: classification, concentration, and

interindividual variability. Kidney Int 2003; 63:1934-43.

Vaziri ND. CKD impairs barrier function and alters microbial flora of the intestine: a major link

to inflammation and uremic toxicity. Curr Opin Nephrol Hypertens 2012; 21(6): 587–592.

Vaziri ND, Wong J, Pahl M, Piceno YM, Yuan J, DeSantis TZ, et al. Chronic kidney disease

alters intestinal microbial flora. Kidney Int. 2013; 83(2): 308-315.

Page 80: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

80

Wang D, Lu L, Shi Y, Geng Z, Yin Y, Wang M, Wei L. Supplementation of ketoacids contributes

to the up-regulation of the Wnt7a/Akt/p70S6K pathway and the down-regulation of apoptotic and

ubiquitin–proteasome systems in the muscle of 5/6 nephrectomised rats. British Journal of

Nutrition 2014; 111: 1536–154.

Wang Y, Qiu X, Lv L, Wang C, Ye Z, Li S, et al. Correlation between Serum Lipid Levels and

Measured Glomerular Filtration Rate in Chinese Patients with Chronic Kidney Disease. PLoS

ONE 2016; 11(10): 1-8.

Watanabe H, Miyamoto Y, Honda D, Tanaka H, Wu Q, Endo M, et al. p-Cresyl sulfate causes

renal tubular cell damage by inducing oxidative stress by activation of NADPH oxidase. Kidney

Int Kidney Int. 2013; 83(4):582-92.

World Health Organization. Obesity: preventing and managing the global epidemic. Report of a

World Health Organization Consultation. Geneva: World Health Organization, 2000.

Wu GD, Chen J, Hoffmann C, Bittinger K, Chen Y, Keilbaugh SA, et al. Linking long-term

dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science 2011; 7, 334(6052): 105–108.

Wu IW, Hsu KH, Lee CC, Sun CY, Hsu HJ, Tsai CJ, et al. p-Cresyl sulphate and indoxyl

sulphate predict progression of chronic kidney disease. Nephrol Dial Transplant 2011; 26: 938–

947.

Wu IW, Hsu KH, Hsu HJ, Lee CC, Sun CY, Tsai CJ, Wu MS. Serum free p-cresyl sulfate levels

predict cardiovascular and all-cause mortality in elderly hemodialysis patients-a prospective

cohort study. Nephrol Dial Transplant. 2012; 27(3):1169-75.

Zimmer J, Lange B, Frick JS, Sauer H, Zimmermann K, Schwiertz A, et al. A vegan or vegetarian

diet substantially alters the human colonic faecal microbiota. Eur J Clin Nutr 2012; 66: 53–60.

Page 81: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

81

10.0. APÊNDICES

10.1. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Título do Projeto: Efeitos da dieta hipoproteica na expressão dos fatores transcricionais Nrf2

e Nf-B, no sistema cardiovascular e nos níveis de toxinas urêmicas em pacientes com

doença renal crônica em tratamento conservador

Pesquisador Responsável: Denise Mafra.

Instituição a que pertence o Pesquisador Responsável: Universidade Federal Fluminense.

Nome do voluntário:________________________Idade:___R.G.: ______________________

O(A) Sr.(ª) está sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa “Efeitos da dieta

hipoproteica na expressão dos fatores transcricionais Nrf2 e Nf-B, no sistema

cardiovascular e nos níveis de toxinas urêmicas em pacientes com doença renal crônica em

tratamento conservador”, de responsabilidade da pesquisadora Denise Mafra.

Estas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste estudo,

que tem como objetivo verificar se uma dieta com baixa concentração de proteína pode alterar os

níveis de alguns compostos do sangue (Nrf2, Nf-B e toxinas urêmicas), da urina (proteínas

totais, sódio e ureia) e fezes (microbiota intestinal) presente nos pacientes renais crônicos que são

atendidos no Ambulatório de Nutrição Renal da UFF.

Esta pesquisa tem como principal benefício verificar se a dieta hipoproteica pode reduzir a

inflamação e os níveis de toxinas urêmicas no plasma e urina dos pacientes. Além de entender o

papel dos microrganismos presentes no intestino na produção dessas toxinas.

Será feito o preenchimento do formulário em que constará uma sequência de perguntas

sobre a sua ingestão de alimentos nas últimas 24 horas. Estas perguntas serão feitas em 2 datas

distintas, o que é muito importante para conhecermos seus hábitos alimentares. Para a avaliação

do estado nutricional serão coletadas medidas do seu corpo, como peso corporal e estatura,

necessárias para sabermos se você está dentro da faixa de peso adequada.

Uma amostra de seu sangue, urina e fezes serão coletados para realizarmos análise desses

compostos presentes no seu sangue em 2 momentos durante 6 meses do tratamento com uma

dieta pobre em proteína, que é nosso tratamento convencional no Ambulatório para pacientes

renais. Esta coleta de sangue será um procedimento comum já realizado mensalmente por

profissionais treinados tendo como desconforto a picada de agulha. Além da coleta de sangue,

você deverá coletar sua urina (por um período de 24 horas anteriores à consulta) e suas fezes.

Outro exame a ser realizado é o exame de imagem absorciometria com raio-x de dupla energia

(DXA), para verificar a sua composição corporal e o exame score de cálcio para verificar

entupimento da artéria carótida. Todos os medicamentos utilizados regularmente pelos pacientes

serão mantidos.

Durante este período de participação no estudo, você será convidado a participar de uma

oficina culinária para aprender a preparar pratos saudáveis com baixo teor proteico.

A qualquer momento você terá acesso aos resultados parciais da pesquisa, bem como a

qualquer dado referente ao resultado dos exames. Você tem a liberdade de querer não participar

Page 82: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

82

desta pesquisa ou, no caso de aceitação, retirar seu consentimento a qualquer momento, sem

nenhum prejuízo à continuidade de seu tratamento.

A avaliação do seu prontuário médico e dos resultados dos exames somente será realizada

pelos pesquisadores envolvidos na pesquisa e médicos responsáveis pelo seu tratamento, sendo

usado exclusivamente para o seu tratamento e para pesquisa.

Não há despesas pessoais para o participante em qualquer etapa do estudo. Todos os dados

coletados assim como os resultados desta pesquisa serão publicados e divulgados no meio

científico sem qualquer identificação pessoal.

Esse documento será assinado em 2 (duas) vias por ambas as partes, uma pelo

pesquisador responsável e outra por você.

Eu, ________________________________________________, acredito ter sido suficientemente

informado a respeito das informações sobre o estudo citado, que li ou que foram lidas para mim.

Eu discuti com a pesquisadora Denise Mafra sobre a minha decisão em participar deste estudo.

Ficaram claros os propósitos do estudo, os procedimentos realizados, seus desconfortos e riscos,

as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que

minha participação é isenta de despesas, e que tenho garantia de acesso a tratamento hospitalar

quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar meu

consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízos ou

perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido ou no meu atendimento nesta instituição.

A qualquer momento posso contatar o responsável pelo estudo para maiores esclarecimentos

sobre minha participação no estudo e informações decorrentes dela, no telefone: 21 985683003.

Em caso de dúvida quanto à condução ética do estudo, entre em contato com o Comitê de

Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da UFF. O Comitê de Ética é a instância que tem

por objetivo defender os interesses dos participantes da pesquisa em sua integridade e dignidade e

para contribuir no desenvolvimento da pesquisa dentro de padrões éticos. Dessa forma o comitê

tem o papel de avaliar e monitorar o andamento do projeto de modo que a pesquisa respeite os

princípios éticos de proteção aos direitos humanos, da dignidade, da autonomia, da não

maleficência, da confidencialidade e da privacidade‖.

___________________________________________ Data:___/___/___.

Assinatura do Paciente

___________________________________________ Data:___/___/___.

Assinatura da Testemunha

___________________________________________ Data:___/___/___.

Assinatura do Pesquisador

Page 83: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

83

10.2. Recordatório de 24 Horas

CAFÉ DA MANHÃ

Horário

COLAÇÃO

Horário

ALMOÇO

Horário

LANCHE

Horário

JANTAR

Horário

CEIA

Horário

Page 84: PROTOCOLO DE PESQUISA - app.uff.br final_Ana Paula... · ii ana paula black dreux efeitos da dieta hipoproteica nos nÍveis de toxinas urÊmicas de pacientes renais crÔnicos em tratamento

84

11.0. ANEXOS

11.1. Aprovação do Comitê de Ética da Faculdade de Medicina/UFF