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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
DANIELLE CAROLINE CIPRIANI MELO
PREPARAÇÃO DE BIOCATALISADORES CONTENDO
DERIVADOS DA QUITOSANA, LIPASE E PARTÍCULAS
MAGNÉTICAS PARA SÍNTESE DE ÉSTERES DE CADEIA
LONGA
Itajaí- 2012
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
DANIELLE CAROLINE CIPRIANI MELO
PREPARAÇÃO DE BIOCATALISADORES CONTENDO
DERIVADOS DA QUITOSANA, LIPASE E PARTÍCULAS
MAGNÉTICAS PARA SÍNTESE DE ÉSTERES DE CADEIA
LONGA
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues
Itajaí, Setembro de 2012.
PREPARAÇÃO DE BIOCATALISADORES CONTENDO
DERIVADOS DA QUITOSANA, LIPASE E PARTÍCULAS
MAGNÉTICAS PARA SÍNTESE DE ÉSTERES DE CADEIA
LONGA
Danielle Caroline Cipriani Melo
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
(corpo 12)
____________________________________ Clóvis Antonio Rodrigues, Doutor
Orientador
__________________________________________________________ Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora
Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________ Doutor Clóvis Antonio Rodrigues (Univali)
Presidente
______________________________________ Doutora Fátima de Campos Buzzi (Univali)
Membro
______________________________________ Doutor Rogério Correa (Univali)
Membro
____________________________________ Doutor Edésio Luiz Simionatto (Furb)
Membro
Itajaí (SC), 27 setembro de 2012.
Dedico esta dissertação àqueles que sempre apoiaram minhas Dedico esta dissertação àqueles que sempre apoiaram minhas Dedico esta dissertação àqueles que sempre apoiaram minhas Dedico esta dissertação àqueles que sempre apoiaram minhas
decisões decisões decisões decisões e e e e escolhasescolhasescolhasescolhas....
AGRADECIMENTOS
Devo essa dissertação ao meu orientador, professor Doutor Clóvis
Antonio Rodrigues, pois sem seus conhecimentos, sua experiência e
orientação, não teria desenvolvido essa pesquisa. Agradeço também pela
atenção, compreensão, amizade e, principalmente, pelo aprendizado.
Agradeço, com muito carinho também, aos professores do Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas que foram fundamentais durante o
desenvolvimento das leituras e pesquisas, sempre presentes e disponíveis
para solucionar minhas dúvidas e inquietações.
Aos amigos e colegas, pelo companheirismo, solidariedade e afeto.
Aos meus pais e familiares que souberam ser pacientes e
compreensivos nos momentos difíceis, apoiaram minhas escolhas e me deram
muita força nos momentos que precisei. Agradeço pelo amor, pelo carinho e
pela dedicação que sempre trataram tudo que me faz feliz.
Os meus agradecimentos vão a todos àqueles que, de alguma forma,
foram fundamentais para a realização deste sonho e que, junto comigo, o
tornaram possível.
PREPARAÇÃO DE BIOCATALISADORES CONTENDO DERIVADOS DA QUITOSANA, LIPASE E PARTÍCULAS
MAGNÉTICAS PARA SÍNTESE DE ÉSTERES DE CADEIA LONGA
Danielle Caroline Cipriani Melo
Setembro/2012
Orientador: Clóvis Antonio Rodrigues, Doutor. Área de Concentração: Pesquisa e desenvolvimento de métodos analíticos, insumos e medicamentos. Número de Páginas: 100. A transesterificação de óleos vegetais e gorduras animais para a produção de ésteres de cadeia longa, que podem ser utilizados como biodiesel além de uma variedade de outras aplicações, como matéria-prima para a indústria farmacêutica, vem recebendo considerável atenção nos últimos anos. As novas rotas químicas utilizadas para a obtenção dos ésteres de cadeia longa envolvem a utilização de biocatalisadores como a lipase. Entretanto, a busca por matéria-prima de baixo custo, a reutilização do biocatalisador e a diminuição de etapas no processo de síntese são fatores fundamentais no processo de obtenção industrial destes ésteres. Dentro deste contexto, a proposta do projeto é preparar biocatalisadores imobilizando a lipase em derivados da quitosana e partículas magnéticas e sintetizar ésteres de cadeia longa utilizando óleo de sementes da Aleurites moluccana. A lipase foi imobilizada através do método de encapsulamento, empregando os derivados da quitosana e o alginato, em meio contendo íons cálcio, conhecido como complexo de polieletrólito. O processo de otimização do sistema catalítico foi monitorado através da esterificação do ácido láurico, sendo determinado através de alterações das condições reacionais. A produção dos ésteres de cadeia longa foi determinada via transesterificação do óleo de Aleurites moluccana com metanol. A presença do material magnético, além de favorecer o processo de separação das esferas, aumentou a eficiência. As esferas magnéticas mais eficientes foram as sintetizadas com OC-Bz 500 e QTS-Bz 250 que apresentaram taxa de conversão do ácido láurico em torno de 70,4 %-92,6 % dependendo das condições empregadas na síntese. As esferas foram reutilizadas por 13 ciclos apresentando manutenção na taxa de conversão em aproximadamente 60 %. As esferas preparadas com OC-Bz 500 e QTS-Bz 250 apresentaram taxas de conversão do óleo de Aleurites moluccana entre 54,0 e 38,0 % e mantiveram a taxa de conversão relativa em 100 % após 3 reutilizações. Os resultados mostram que os biocatalisadores contendo a lipase e o material magnético podem ser utilizados na preparação dos ésteres de cadeia longa. Palavras-chave: Ésteres de cadeia longa. O-carboximetilquitosana. Aleurites moluccana. Nanopartículas magnéticas. Imobilização enzimática. Esferas. Biocatálise.
PREPARATION OF BIOCATALYSTS CONTAINING DERIVATES OF CHITOSAN, LIPASE AND MAGNETIC PARTICLES FOR SYNTHESIS OF
LONG CHAIN ESTERS
Danielle Caroline Cipriani Melo September/2012
Supervisor: Clóvis Antonio Rodrigues, Dr. Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of Pages: 100. The transesterification of vegetable oils and animal fats for the production of long chain esters, which can be used as biodiesel fuel and for variety of other applications, such as raw materials for the pharmaceutical industry, has received considerable attention in recent years. New chemical routes used to obtain long chain esters involve the use of lipase as a biocatalyst. However, the search for low cost raw materials, reusability of the biocatalyst, and the reduction of steps in the synthesis process are key factors in the process of obtaining these industrial esters. Within this context, the proposal of this project is to prepare biocatalysts, immobilize lipase on chitosan derivatives and magnetic particles, and synthesize long chain esters using oil from seeds of Aleurites moluccana. The lipase was immobilized by the encapsulation method, using chitosan derivatives and alginate in a medium containing calcium ions, known as polyelectrolyte complex. The optimization process of the catalytic system was monitored through the esterification of lauric acid, being determined through changes in reaction conditions. The production of long chain esters by transesterification was determined by transesterification of Aleurites moluccana oil with methanol. The presence of magnetic material, in addition to promoting the separation process of the beads, increased their efficiency. The most efficient magnetic beads were synthesized with OC-Bz 500 and QTS-Bz 250, which showed a lauric acid conversion rate of about 70.4% - 92.6%, depending on the synthesis conditions. The beads were reused for 13 cycles, presenting maintenance of the conversion rate of approximately 60%. The beads prepared with OC-Bz 500 and QTS-Bz 250 showed Aleurites moluccana oil conversion rates of between 54.0 and 38.0%, maintaining a conversion rate of 100% after 3 reuses. The results show that lipase-containing biocatalysts and magnetic material may be used in the preparation of long chain esters. Keywords: Long chain esters. O-carboxymethylchitosan. Aleurites moluccana. Magnetic nanoparticles. Enzyme immobilization. Spheres. Biocatalysis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01
Figura 02
Figura 03
Figura 04
Figura 05
Figura 06
Figura 07
Figura 08
Figura 09
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Figura 21
Figura 22
Figura 23
Figura 24
Processo ideal de transesterificação..................................................
Processo real de transesterificação....................................................
Mecanismo de transesterificação utilizando catalisador ácido...........
Mecanismo de transesterificação utilizando catalisador básico.........
Estrutura tridimensional da lipase de Candida rugosa. (a)
Conformação fechada. (b) Conformação aberta................................
Mecanismo de imobilização enzimática por cross-linking em um
suporte de quitosana..........................................................................
Estrutura da quitosana (QTS).............................................................
Estrutura do principal monômero da O-CMQTS.................................
Estrutura do principal monômero da OC-Bz.......................................
Esquema da síntese da O-CMQTS a partir da quitosana..................
Curva da titulação condutimétrica da O-CMQTS. Massa de
amostra: 50 mg, temperatura: 25 ºC, titulante: NaOH 0,1 M..............
Espectro no infravermelho da O-CMQTS na forma ácida..................
Esquema da síntese do derivado OC-Bz a partir da O-CMQTS........
Espectro no infravermelho do derivado OC-Bz..................................
Espectro de RMN 1H do derivado OC-Bz em D2O/CD3COOD à
temperatura ambiente.........................................................................
Esquema da síntese do derivado benzilado da QTS..........................
Curva de titulação potenciométrica da QTS-Bz. Massa do sólido:
200 mg, concentração do NaOH 0,118 M..........................................
Espectro no infravermelho do derivado QTS-Bz................................
Espectro de RMN 1H do derivado QTS-Bz em D2O/CD3COOD à
temperatura ambiente.........................................................................
Óleo extraído das sementes da Aleurites moluccana.........................
Esferas magnéticas de QTS-Bz 500...................................................
Efeito magnético das esferas com derivados da quitosana................
Gráfico dos ciclos de reutilização do biocatalisador com OC-Bz 500.
Placa de CCD da reação de transesterificação com óleo da
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Figura 25
Figura 26
Aleurites moluccana............................................................................
Espectro de RMN 1H do éster em D2O/CD3COOD à temperatura
ambiente.............................................................................................
Gráfico dos ciclos de reutilização do biocatalisador com OC-Bz 500
na reação de transesterificação do óleo da Aleurites
moluccana...........................................................................................
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79
83
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Quantidade de água e percentagem de intumescimento das esferas
com diferentes polímeros......................................................................
61
Tabela 2
Tabela 3
Tabela 4
Tabela 5
Tabela 6
Tabela 7
Tabela 8
Tabela 9
Efeito do biocatalisador sobre a taxa de conversão (%) de
esterificação do ácido láurico................................................................
Efeito do processo de armazenamento das esferas (congelamento)
sobre a taxa de conversão (%) de esterificação do ácido láurico.........
Efeito da quantidade de biocatalisador sobre a taxa de conversão
(%) do ácido láurico..............................................................................
Efeito da temperatura do meio reaciona sobre a taxa de conversão
(%) do ácido láurico..............................................................................
Efeito do álcool sobre a taxa de conversão (%) do ácido láurico, a
quantidade de álcool equivale 1,0 mmol...............................................
Efeito do álcool sobre a taxa de conversão (%) do ácido láurico, a
quantidade de álcool equivale 1,0 mmol...............................................
Efeito do tipo solvente utilizado na reação de esterificação sobre a
taxa de conversão (%) do ácido láurico................................................
Efeito da adição do álcool em uma única etapa e em três etapas na
reação de transesterificação sobre a taca de conversão (%) do óleo..
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LISTA DE ABREVIATURAS
O-CMQTS: o-carboximetilquitosana
OC 250: esferas de o-carboximetilquitosana com 250 mg de material magnético
OC 500: esferas de o-carboximetilquitosana com 500 mg de material magnético
OC-Bz: o-carboximetilquitosana-N-benzilada
OC-Bz 250: esferas de o-carboximetilquitosana-N-benzilada contendo 250 mg
de material magnético
OC-Bz 500: esferas de o-carboximetilquitosana-N-benzilada contendo 500 mg
de material magnético
QTS: quitosana
QTS-Bz: quitosana benzilada
QTS-Bz 250: esferas de quitosana benzilada contendo 250 mg de material
magnético
QTS-Bz 500: esferas de quitosana benzilada contendo 500 mg de material
magnético
RMN H1: ressonância magnética nuclear de H1
SEs: ésteres de sacarose
SN2: reação de substituição nucleofílica bimolecular
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................14
2 OBJETIVOS....................................................................................................17
2.1 Objetivo Geral..............................................................................................17
2.2 Objetivos específicos...................................................................................17
3 REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................18
3.1 Biodiesel......................................................................................................18
3.2 Aplicação de ésteres de cadeia longa na indústria farmacêutica................22
3.3 Métodos de obtenção de ésteres de cadeia longa......................................23
3.4 Catálise enzimática para a obtenção do biodiesel.......................................29
3.5 Imobilização enzimática...............................................................................33
3.6 Quitosana e seu derivado N-benzil..............................................................35
3.7 Nanopartículas magnéticas.........................................................................37
4 MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................39
4.1 Síntese dos materiais................................................................................ 39
4.1.1 Síntese da O-CMQTS............................................................................. 39
4.1.2 Síntese da OC-Bz.................................................................................... 39
4.1.3 Síntese da QTS-Bz.................................................................................. 40
4.1.4 Preparação do material magnético inorgânico (Fe3O4/ γ-Fe2O3).............40
4.2 Preparação das esferas magnéticas de alginato/cálcio com derivados da
quitosana...........................................................................................................41
4.3 Reação de esterificação com ácido láurico.................................................41
4.3.1 Reutilização do biocatalisador..................................................................42
4.3.2 Determinação da taxa de conversão do ácido láurico.............................42
4.4 Extração do óleo da Aleurites moluccana...................................................43
4.5 Caracterização do catalisador.....................................................................43
4.5.1 Titulação condutimétrica...........................................................................43
4.5.2 Titulação pontenciométrica.......................................................................44
4.5.3 Espectroscopia de infravermelho (IV).......................................................45
4.5.4 Ressonância magnética nuclear (RMN H1)..............................................45
4.5.5 Determinação do teor de proteína............................................................45
4.6 Produção e caracterização de ésteres de cadeia longa..............................46
4.6.1 Efeito da reutilização do catalisador.........................................................46
4.6.2 Determinação da taxa de conversão do éster..........................................46
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................48
5.1 Preparação dos materiais............................................................................48
5.1.1 Síntese e caracterização da O-CMQTS..................................................48
5.1.2 Síntese e caracterização da OC-Bz..........................................................51
5.1.3 Síntese e caracterização da QTS-Bz........................................................54
5.1.4 Preparação do material magnético inorgânico (Fe3O4/ γ-Fe2O3).............58
5.2 Extração do óleo da Aleurites moluccana....................................................59
5.3 Preparação das esferas magnéticas de alginato/cálcio com derivados da
quitosana...........................................................................................................60
5.4 Reação de esterificação com ácido láurico.................................................62
5.4.1 Efeito do tipo de biocatalisador................................................................62
5.4.2 Efeito do processo de armazenamento das esferas na reação de
esterificação do ácido láurico............................................................................66
5.4.3 Efeito da quantidade de esferas...............................................................68
5.4.4 Efeito da temperatura de reação..............................................................70
5.4.5 Efeito do tipo de álcool.............................................................................71
5.4.6 Efeito do solvente....................................................................................74
5.4.7 Reutilização do biocatalisador..................................................................76
5.5 Produção de ésteres de cadeia longa.........................................................77
5.5.1 Reutilização das esferas...........................................................................82
6 CONCLUSÃO.................................................................................................84
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................86
14
1 INTRODUÇÃO
A biocatálise enzimática fornece uma alternativa que permite a
transesterificação de grande variedade de matérias-primas utilizando
catalisadores ambientalmente sustentáveis, com alta seletividade e em
condições suaves de reações, minimizando danos químicos a natureza. Além
disso, o uso de biocatalisadores permite o manejo de suportes que imobilizem
a enzima fornecendo ganhos econômicos e ambientais significativos por
facilitar a retirada do material enzimático da solução e sua posterior reutilização
(BADENES; LEMOS; CABRAL, 2010).
A lipase, como catalisador biológico, pode ter sua atividade, seletividade
e estabilidade modificadas quando imobilizada em um suporte sólido como a
quitosana (QTS), um oligossacarídeo obtido através da desacetilação da
quitina, quimicamente denominado como poli-N-acetilglicosamina. A QTS
apresenta-se altamente biocompatível, biodegradável e atóxica sendo utilizada
em diversas aplicações farmacêuticas e, como matriz, para a imobilização de
enzimas. Dentro deste contexto, muito esforço tem sido feito com o intuito de
desenvolver o melhor método de imobilização enzimática para sistemas
catalíticos utilizando biopolímeros como a QTS (CHIOU; WU, 2004; DENG et
al., 2009; WU et al., 2009).
Uma das características mais notáveis da lipase é o seu poder de
catálise na interface óleo/água. Quando imobilizada em suportes, sua área de
superfície específica aumenta e apresenta baixa resistência à difusão, sendo
muito eficaz para a catálise. Algumas metodologias de imobilização em
suportes podem dificultar a remoção do catalisador da solução, fazendo com
que a utilização de materiais com propriedades magnéticas se tornem uma boa
solução para este problema. A aplicação de campos magnéticos permitem a
retirada do catalisador magnético com praticidade e eficiência (WU et al.,
2009).
A transesterificação é uma reação química que consiste na produção de
um éster a partir de ácidos graxos com álcool ou outros aceptores de grupo acil
15
na presença de catalisadores químicos ou biológicos, que facilitam e amenizam
as condições da reação (JEGANNATHAN et al., 2010; ZHANG et al., 2010).
Alguns exemplos de ésteres provenientes de fontes naturais são
abordados na literatura e muito utilizados na indústria farmacêutica. Agentes
tensoativos naturais como os ésteres de sacarose (SEs) são formados a partir
de ácidos graxos de origem vegetal, possuindo vasta propriedade (SZÜTS;
SZABÓ-RÉVÉSZ, 2012; KAEWPRAPAN et al., 2012).
A preocupação com o meio ambiente aumentou o interesse pelo
desenvolvimento de metodologias e compostos com propriedades
ambientalmente favoráveis abrangendo todas as áreas, inclusive a área
farmacêutica. A obtenção de ésteres de cadeia longa através de fontes
renováveis tem sido largamente empregada pela indústria de biocombustíveis,
alimentícia e farmacêutica, pois permite que esses compostos sejam atóxicos e
biodegradáveis (SINGH, SINGH, 2010).
O esgotamento das reservas de combustíveis fósseis, a crescente
demanda por diesel e demais matérias-primas industriais produzidas a partir
deste, além da incerteza de sua disponibilidade, são fatos cruciais que
impulsionam a busca por fontes alternativas de combustíveis (SINGH, SINGH,
2010).
O biodiesel é um biocombustível composto, quimicamente, de alquil
ésteres de ácidos graxos de cadeia longa, preparado a partir de lipídios de
fontes renováveis e tem sido o foco de uma quantidade significativa de
pesquisas recentes. É considerado uma alternativa promissora de combustível
renovável e sustentável, uma vez que é obtido a partir de fontes biológicas, tais
como óleos vegetais, gordura animal e óleos residuais (SUN et al., 2010; WEN
et al., 2010a, WEN et al., 2010b).
Dentre as fontes renováveis de óleos não comestíveis, a Aleurites
moluccana, conhecida popularmente como Nogueira-da-Índia, produz
sementes com grande teor de óleo e desperta grande interesse para a
produção de biodiesel, uma vez que não há competição com o mercado
alimentício, reduzindo o custo de produção. Esta planta está sendo utilizada
como fonte alternativa para a produção de biodiesel nas regiões da Índia e
Tailândia (AZAM; WARIS; NAHAR, 2005).
16
Dessa forma, o trabalho tem como objetivo a obtenção e caracterização
de um sistema de biocatálise, formado através da imobilização enzimática em
esferas magnéticas de quitosana modificada:alginato, para a obtenção de
ésteres de cadeia longa por transesterificação. A escolha do processo de
biocatálise, utilizando a enzima lipase incorporada a uma esfera magnética de
alginato e quitosana modificada, irá permitir o aumento da quantidade de
enzima imobilizada e a eficiência da catálise, proporcionando um processo
ambientalmente mais correto na produção de ésteres de cadeia longa. As
nanopartículas magnéticas incorporadas às esferas irão permitir a separação
do material enzimático da solução obtida, permitindo a reutilização do sistema.
17
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver um sistema catalítico, utilizando lipase imobilizada em
esferas magnéticas de quitosana modificada:alginato e cálcio, para a obtenção
de ésteres de cadeia longa a partir de fontes de ácidos graxos renováveis, a
fim de obter processos menos danosos ao ambiente e com menor custo.
2.2 Objetivos Específicos
- Sintetizar a O-carboximetilquitosana (O-CMQTS), seu derivado N-
benzilado (OC-Bz) e a Quitosana-benzilada (QTS-Bz) e caracterizar os
polímeros através da espectroscopia no infravermelho, ressonância magnética
nuclear de 1H e quanto ao grau de carboximetilação.
- Sintetizar as nanopartículas magnéticas (Fe3O4/y-Fe2O3) através da
metodologia de coprecipitação dos íons férricos (Fe3+) e ferrosos (Fe2+) em
meio aquoso básico.
- Incorporar o material magnético às esferas com derivados da quitosana
modificada (QTS-Bz e OC-Bz) através da metodologia de imobilização
enzimática e encapsulamento através da reticulação quitosana:cálcio utilizando
o alginato de sódio/cálcio, e determinar a eficiência da incorporação da lipase
ao sistema;
- Determinar as condições ótimas da atividade catalítica do
biocatalisador utilizando a reação de esterificação do ácido láurico através da
quantificação do éster determinando a taxa de conversão do ácido utilizado;
- Extrair o óleo das sementes da Aleurites moluccana;
- Obter os ésteres de cadeia longa através da reação de
transesterificação utilizando o óleo da Aleurites moluccana e o biocatalizador
contendo a lipase;
- Determinar a taxa de conversão do óleo por RMN-H1;
18
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Biodiesel
A disponibilidade de energia é um pré-requisito básico para o avanço
econômico de um país e sua demanda é exponencialmente crescente frente ao
desenvolvimento populacional e industrial. As fontes comuns de energia são
petróleo, gás natural e carvão, obtidos de combustíveis fósseis provenientes de
fontes não renováveis de energia. Seu consumo excessivo, crescente e
necessário; e o provável esgotamento das fontes não renováveis, remete ao
aumento do preço dos combustíveis e a uma grande preocupação sobre a
segurança energética de cada país (JUAN et al., 2011).
Além disso, existem muitas desvantagens da utilização de combustíveis
fósseis como principal fonte de energia mundial, principalmente no que diz
respeito às questões ambientais. Emissões de gases resultantes da combustão
de tais combustíveis fósseis são a principal fonte de gases com efeito estufa
que contribuem para o aquecimento global, além de serem fontes importantes
de poluição do ar, que consistem de monóxido de carbono (CO), óxidos de
nitrogênio (NOx), óxidos de enxofre (SOx), hidrocarbonetos (HC), partículas e
compostos cancerígenos (HARDING et al., 2007; JUAN et al., 2011).
Encontrar uma alternativa de combustível tem atraído considerável
atenção nos últimos anos devido à limitação dos tradicionais recursos fósseis,
aumento do preço do petróleo bruto e as crescentes preocupações ambientais,
principalmente com as emissões de gases de efeito estufa (LEUNG; WU;
LEUNG, 2010; ZABETI; DAUD; AROUA, 2009).
Dessa forma, o biodiesel foi recentemente considerado o melhor
candidato para a substituição do gasóleo porque ajuda a reduzir o dióxido de
carbono (CO2) e outras emissões poluentes provenientes dos motores; pode
ser utilizado em qualquer motor de ignição sem necessidade de modificação
por apresentar propriedades semelhantes ao diesel; é fabricado a partir de
fontes renováveis; o motor diesel tem melhor desempenho com a utilização do
19
biodiesel por apresentar um elevado número de cetano; apresenta elevado
grau de pureza o que eliminaria o uso de lubrificantes; sua produção é
considerada mais eficiente quando comparada aos combustíveis fósseis por
não haver perfuração de poços terrestres e submarinos assim como o processo
de refinaria. O biodiesel permite ainda que uma região se torne independente
em sua necessidade de energia, pois o mesmo pode ser produzido localmente
(LEUNG; WU; LEUNG, 2010; JUAN et al., 2011; MOSER; VAUGHN, 2010).
Além de ser biodegradável e atóxico tornando-o útil também para
aplicações de transportes em ambientes altamente sensíveis, como os
ecossistemas marinhos, por exemplo, o biodiesel é também essencialmente
livre de enxofre e compostos aromáticos (DEMIRBAS, 2009). As reduções de
CO2 líquido chegam a 78% em uma base do ciclo de vida quando comparado
com o diesel convencional. Quanto às reduções sobre emissões de poluentes,
a combustão de monóxido de carbono (CO) do biodiesel puro diminui para
46,7%, as emissões de partículas para 66,7%, de hidrocarbonetos (HC) não
queimados para 45,2%, provando suas vantagens ambientais (HELWANI et al.,
2009).
Segundo um estudo técnico realizado pela United States Environmental
Protection Agency em 2002, as emissões de escape de motores movidos a
biodiesel puro possuem quantidades muito menores de material particulado,
CO e HC em comparação com as emissões de diesel puro, apesar de
apresentar emissões de NOx 10% superiores. Um estudo ainda mais recente,
realizado em 2006 pelo mesmo departamento mostrou que o biodiesel emitiu
54% menos CO, 46% menos HC e 14,7% menos NOx, porém apresentou 0,5%
a mais na emissão de CO2 quando comparado ao diesel. As reduções de
emissões de poluentes são significativas frente à questão ambiental e de saúde
pública segundo a pesquisa, evidenciando a sua aplicação e sendo uma
promissora fonte de energia renovável (SUKKASI et al., 2010).
Quimicamente, o biodiesel é constituído de ésteres metílicos de cadeia
longa (C14-C20) de ácidos graxos provenientes de recursos biológicos como
óleos vegetais, gordura animal, óleos de cozinha e gordura reciclada da
indústria de alimentos, que faz com que 90% da sua composição seja
biodegradada em um período de 21 dias, sendo este um prazo médio de
20
decomposição do material no ambiente (LEUNG; WU; LEUNG, 2010; YANG et
al., 2010; ZIEBA et al., 2010).
Óleos vegetais são promissoras matérias-primas para a produção de
biodiesel uma vez que são renováveis e podem ser obtidos em larga escala.
São subdivididos em óleos comestíveis e não comestíveis, sendo mais de 95%
da produção de biodiesel obtida através de óleos comestíveis devido às suas
propriedades. No entanto, a utilização de óleos comestíveis pode provocar
problemas como a competição com o mercado de óleo comestível,
encarecendo a obtenção do óleo e a produção de biodiesel, inutilizando esse
recurso; e pode reforçar o desmatamento de florestas para fins de plantio das
fontes vegetais (JUAN et al., 2011).
Assim, a utilização dos óleos não comestíveis pode ser uma solução,
uma vez que não são adequados para o consumo humano por apresentarem
componentes tóxicos. Além disso, as oleaginosas não comestíveis podem ser
cultivadas em terrenos baldios, sendo desnecessário o desmatamento de
florestas e possuem baixo custo por não haver competição com o mercado de
óleos comestíveis e por apresentarem alto rendimento sem cuidados intensivos
(JUAN et al., 2011; LEUNG; WU; LEUNG, 2010).
Alguns exemplos de plantas oleaginosas não comestíveis são Jatropha
curcas (Pinhão manso), Pongamina pinnata (Karanja), Madhua indica,
Collophyllum iniphyllum (Polanga), Hevea brasiliensis (Seringueira) entre outras
(JUAN et al., 2011).
A Aleurites moluccana, uma oleaginosa conhecida popularmente como
Nogueira-da-Índia, é uma planta pertencente à família Euphorbiaceae e foi
escolhida como fonte para a produção de biodiesel por produzir sementes com
alto teor de óleo não comestível, aproximadamente 30% (m/m) em relação à
amêndoa (AKO; KONG; BROWN, 2005; SANTOS et al 2009; SILVA et al,
2012; SULISTYO et al 2009;).
A origem do biodiesel depende, geralmente, da porcentagem de óleo e
rendimento por hectare plantado e dos cultivos propícios para o clima regional
de cada país. Dessa forma, mesmo que o interesse econômico da produção do
biodiesel esteja voltado para os óleos não comestíveis, nos Estados Unidos, o
óleo de soja é a principal matéria-prima para esse biocombustível, assim como
no Brasil, onde o óleo de soja corresponde a 90 % da matéria-prima utilizada
21
para a produção do biodiesel, enquanto que o óleo de canola e o óleo de palma
são as fontes mais comuns na Europa e em países tropicais, respectivamente
(SINGH, SINGH, 2010).
Do ponto de vista químico, os óleos e gorduras de diferentes fontes têm
distintas composições de ácidos graxos, pois variam em seu comprimento de
cadeia e no número de ligações insaturadas que eles contêm (SINGH, SINGH,
2010).
Óleos e gorduras são basicamente insolúveis em água por
apresentarem substâncias hidrofóbicas, sendo comumente referidas como
triglicerídeos ou triacilgliceróis. Assim, óleos e gorduras consistem de 90-98%
de triglicerídeos e pequena quantidade de mono e diglicerídeos (GANESAN et
al., 2009; SINGH, SINGH, 2010).
Os triglicerídeos possuem quantidade significativa de oxigênio em suas
estruturas e, aqueles com um átomo de hidrogênio em falta, formam uma dupla
ligação entre átomos de carbono e são chamados de monoinsaturados, e
aqueles com mais de um hidrogênio em falta são chamados de poliinsaturados.
Triglicerídeos totalmente saturados podem levar a depósitos de carbono em
excesso em motores (SINGH, SINGH, 2010).
Os ácidos graxos são diferentes em relação ao comprimento da cadeia,
grau de insaturação ou presença de outras funções químicas. Além disso, óleo,
éster, e o diesel têm números diferentes de compostos de hidrogênio, porém o
óleo diesel não apresenta grande quantidade de oxigênio em sua
estrutura, formando uma boa qualidade de combustível (GANESAN et al.,
2009).
Por outro lado, a resistência à oxidação no caso dos óleos vegetais
é marcadamente influenciada pela composição de ácidos graxos. A grande
dimensão das moléculas de óleo vegetal (geralmente três ou mais vezes
maiores que as moléculas de combustível de hidrocarbonetos) e a presença de
oxigênio nessas moléculas sugere que algumas propriedades do combustível
proveniente de óleos vegetais diferem das de hidrocarbonetos (GANESAN et
al., 2009; SINGH, SINGH, 2010).
Combustível para motores diesel à base de petróleo apresentam
estruturas químicas diferentes de óleos vegetais e ésteres. O primeiro contém
apenas átomos de carbono e hidrogênio, que são organizados em cadeia linear
22
normal ou ramificados. As estruturas lineares são preferidas para uma melhor
qualidade de ignição. O diesel derivado de petróleo é composto por cerca de
75% de hidrocarbonetos saturados (n-alcanos e cicloalcano), e 25% de
hidrocarbonetos aromáticos (incluindo naftalenos e alquilbenzenos), sendo esta
uma quantidade insuficiente para causar problemas de oxidação do
combustível. A fórmula química média do diesel comum é C12H23, variando de
cerca de C10H20 a C15H28 (SINGH, SINGH, 2010).
Os óleos vegetais contêm ácidos graxos, fosfolipídios, fosfatídeos,
carotenoides, tocoferóis, compostos de enxofre e água. Os ácidos graxos que
são comumente encontrados em óleos vegetais são o esteárico, palmítico,
oleico, linoleico e linolênico. Os triglicerídeos apresentam peso molecular entre
800 e 900 e são, portanto, quase quatro vezes maiores que o normal para
moléculas de combustível diesel (GANESAN; RAJENDRAN; THANGAVELU,
2009).
Os diversos óleos vegetais e ésteres são distinguidos por suas
composições de ácidos graxos. Essa composição é utilizada para prever a
qualidade de ésteres metílicos ou etílicos do óleo para o uso como biodiesel.
Tendo como exemplo 26 espécies, incluindo Azadirachta indica, Calophyllum
inophyllum, Jatropha curcas e Pongamia pinnata foram selecionadas como
sendo adequadas para uso como biodiesel, pois elas atendem as
especificações das principais normas de produção de biodiesel de
organizações dos EUA, Alemanha e Europa (GANESAN; RAJENDRAN;
THANGAVELU, 2009; SINGH; SINGH, 2010).
3.2 Aplicação de ésteres de cadeia longa na indústria farmacêutica
Os ésteres de cadeia longa são muito utilizados na área farmacêutica.
Um dos principais exemplos se refere aos ésteres de ácido graxos de
sacarose, por serem muitos abundantes. Esses ésteres foram aprovados em
1959, no Japão, para uso como aditivos alimentares e, posteriormente, foi
aprovado para aplicação como surfactantes não-iônicos e emulsionantes. A
grande vantagem destes compostos reside no seu metabolismo total e
23
biodegradabilidade (POLAT, LINHARDT, 2001; SZÜTS; SZABÓ-RÉVÉSZ,
2012).
Monoésteres de sacarose são compatíveis com a pele, eles provocam
pouca ou nenhuma irritação, sugerindo aplicações na área de cosmetologia e
estética, incluindo preparações para a pele, tratamentos de cabelo e
formulações desodorizantes. Eles também têm utilidade na formulação e
liberação de fármacos na indústria farmacêutica (POLAT, LINHARDT, 2001;
SZÜTS; SZABÓ-RÉVÉSZ, 2012).
Exemplos de monoésteres de sacarose incluem o estearato, oleato,
palmitato, miristato e geralmente contêm 70% de monoésteres e 30% de di-, tri-
, e ésteres superiores. Esses compostos têm se mostrado promissores como
surfactantes, detergentes e emulsificantes quando comparados com o
desempenho de outros compostos tensoativos (POLAT, LINHARDT, 2001;
SZÜTS; SZABÓ-RÉVÉSZ, 2012).
A sacarose é uma molécula altamente quiral disponível em quantidades
a granel e com um custo relativamente baixo. A acilação regioespecífica da
sacarose proporciona tensioativos de forma semelhante e altamente quirais.
Estes surfactantes são capazes de interações específicas com outras
moléculas quirais, tais como proteínas, ácidos nucleicos, e polissacarídeos e a
exploração da especificidade quiral pode ter importância também na área
farmacêuticas (POLAT, LINHARDT, 2001; SZÜTS; SZABÓ-RÉVÉSZ, 2012).
Outro exemplo comum de éster de cadeia longa, muito utilizado na área
farmacêutica, são os ésteres de celulose. Esses compostos são aplicados em
formas sólidas de dosagem de fármacos, usados tipicamente para o controle
da liberação desses fármacos.
3.3 Métodos de obtenção de ésteres de cadeia longa
(biocombustível)
Existem diferentes métodos de produção de biodiesel, tais como uso
direto e mistura, microemulsão, craqueamento térmico (pirólise) e
transesterificação (BISEN et al., 2010; HELWANI et al., 2009; JUAN et al.,
2011).
24
Algumas metodologias propostas no passado, tais como a pirólise e a
quebra de óleos e gorduras podem produzir compostos que são menores do
que a sua fonte de triglicerídeos e, portanto, adequados para serem utilizados
como combustível. No entanto, a pirólise não é muito seletiva e uma ampla
gama de compostos é geralmente obtida. Dependendo da fonte de
triglicerídeos e do método pirolítico empregado, alcanos, alcenos, aromáticos,
ésteres, CO2, CO, H2 e água são produzidos em proporções variadas. A
remoção de oxigênio a partir de moléculas de substrato é outra desvantagem
dos métodos de produção pirolítico. Biocombustíveis obtidos por pirólise de
triglicerídeos podem ser ambientalmente menos interessantes do que os
combustíveis derivados do petróleo em termos de teor de oxigênio. Além disso,
os resíduos sólidos que são criados durante a pirólise de triglicerídeos
requerem etapas de separação adicional (BISEN et al., 2010; HELWANI et al.,
2009; JUAN et al., 2011).
O craqueamento catalítico tem sido utilizado em um esforço
para controlar os tipos de produtos gerados pela quebra de triglicerídeos,
utilizando uma grande variedade de catalisadores. De todos esses métodos, o
mais comum para a produção de biodiesel é a transesterificação (BISEN et al.,
2010; HELWANI et al., 2009; JUAN et al., 2011).
A transesterificação consiste na produção de três moléculas de ésteres
alquílicos a partir de uma molécula de triglicerídeo, formando o glicerol como
subproduto em uma razão molar de 1:1 glicerol:triglicerídeo. O processo geral é
normalmente uma sequência de três etapas consecutivas e reversíveis. Na
primeira etapa, o triacilglicerol reage com uma molécula de álcool formando
diacilglicerol, na segunda etapa, a partir do diacilglicerol é formado
monoacilglicerol, e na última etapa, o glicerol é obtido a partir do
monoacilglicerol (BISEN et al., 2010; MARTINS; PRADO, 2008; SAMIOS et al.,
2009; YAN et al., 2010).
Em todas estas reações, ésteres são produzidos, como é possível
observar na figura 1, ilustrando a reação ideal de transesterificação com um
álcool primário e na figura 2, ilustrando a reação real de transesterificação
também utilizando um álcool primário, observada durante a produção do
biodiesel; uma vez que a reação nunca ocorre de forma ideal, ou seja, com
100% de conversão (BISEN et al., 2010; MARTINS; PRADO, 2008; SAMIOS et
25
al., 2009; YAN et al., 2010). Samios et al. (2009) relatam conversões
superiores a 97% na transesterificação de girassol e óleo de linhaça,
correspondente a 85% de rendimento.
Entre os álcoois que podem ser utilizados no processo de
transesterificação, pode-se mencionar o metanol, etanol, propanol, butanol e o
álcool amílico. O metanol e o etanol são utilizados com mais frequência, sendo
o metanol o preferido para todo o desenvolvimento comercial devido ao baixo
custo e suas vantagens físicas e químicas (álcool de cadeia curta e polar)
(BISEN et al., 2010; MARTINS; PRADO, 2008; SAMIOS et al., 2009; YAN et
al., 2010).
O
O
O
R3
O
R2
O
R1
O
+ 3 OH R4
R1
O
O R4
R2
O
O
R4
R3
O
O
R4
+ OH
OH
OH
cat
Figura 01. Processo ideal de transesterificação (MARTINS; PRADO, 2008).
O
O
O
R3
O
R2
O
R1
O
+ 3 OH R4R
1
O
OR4 +
cat
OH
O
O
R3
O
R2
O
OH
O
O
R3
O
R2
O
3 OH R4cat
R2
O
OR4 OH
OH
O
R3
O
+
OH
OH
O
R3
O
+
+ 3 OH R4
cat
R3
O
OR4
+ OH
OH
OH
1a etapa
2a etapa
3a etapa
Figura 02. Processo real de transesterificação (MARTINS; PRADO, 2008).
26
Os parâmetros que afetam significativamente a taxa de reação na
transesterificação incluem a temperatura de reação, a relação molar
álcool/óleo, a concentração e o tipo do catalisador utilizado para acelerar a
reação. A transesterificação pode ser realizada em temperaturas diferentes, e
o aumento da produção de éster metílico está relacionado ao aumento da
temperatura da reação. No entanto, se a temperatura chegar ao ponto de
ebulição do metanol, bolhas serão formadas, inibindo a transferência de massa
na interface da reação. Na reação de transesterificação, a relação
estequiométrica do álcool e do óleo é de três mols de álcool para um
mol de óleo, podendo utilizar o álcool em excesso para favorecer a
formação de ésteres metílicos (ZABETI et al., 2009).
A reação de transesterificação pode ser realizada através de processos
não-catalíticos ou utilizando catalisadores que beneficiam o processo industrial
devido à aceleração da reação. Catalisadores ácidos, básicos e enzimáticos
são três categorias muito estudadas para a produção de biodiesel (JUAN et al.,
2011; ZABETI et al., 2009).
A transesterificação utilizando catálise ácida inclui a combinação de três
reações reversíveis, como mostrado na Figura 3. Os ácidos comumente
empregados são HCl, H2SO4, BF3 e ácidos sulfônicos. No entanto, a catálise
ácida é muitas vezes mais lenta do que a básica. A velocidade da reação de
produção de biodiesel com catalisador ácido está relacionada com as
condições da reação de transesterificação, como a razão molar
álcool/triglicerídeos, a temperatura, a concentração do catalisador, a pureza
dos reagentes que afetam a velocidade e o equilíbrio químico (SAMIOS et al.,
2009).
27
Figura 03. Mecanismo de transesterificação utilizando catalisador ácido
(MARTINS; PRADO, 2008).
A catálise básica é o processo de transesterificação mais utilizado
industrialmente. Apresenta muitas vantagens, já que é uma reação rápida e
utiliza baixa razão molar álcool/triglicerídeos, apresentando bons
rendimentos. No entanto, a catálise básica exige condições mais rígidas do que
quando comparada com a catálise ácida e a presença de água pode levar à
hidrólise irreversível dos lipídios (MARTINS; PRADO, 2008).
Pode formar emulsão se a concentração do catalisador for maior do
que o necessário. Essencialmente, as espécies utilizadas nesse processo são
hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, e bases de Lewis em geral; exceto os
óxidos que formam sistemas heterogêneos (SAMIOS et al., 2009).
O
O
O
R3
O
R2
O
R1
O
H+
O
O
O
R3
O
R2
O
R1
O+
H
O
O
O
R3
O
R2
O
R1
OH
+
HOR
O
O
O
O
R3
R2
O
R1
OHH
+R
- H+
O
O
O
R3
R2
O
R1
OHOR
- H+O
+
O
O
R3
R2
O
R1
OHO
H
R
- H+
R1
O
O
R+ OH
O
O
R3
O
R2
O
28
A figura 4 mostra o mecanismo de reação da transesterificação
utilizando a catálise básica, onde ocorre a formação das espécies
ativas com forma semelhante à alcóxidos e, estas atacam a carbonila dos
triglicerídeos, originando um intermediário tetraédrico a partir do qual o alquil
éster e o ânion correspondente do diglicerídeo são formados. A
regeneração das espécies ativas ocorre após a liberação do mono alquil éster
e a formação do glicerol ocorre no final do processo. (SAMIOS et al., 2009).
O
O
O
R3
O
R2
O
R1
O
RO-
+O
O
O
R3
O
R2
O
R1
O-
OR
HOR
R1
O
O
R+ OH
O
O
R3
O
R2
O
OH-
HOR + RO-
+ H2O
+RO-
Figura 04. Mecanismo de transesterificação utilizando catalisador básico
(MARTINS; PRADO, 2008).
Existem dois tipos de catalisadores em função da mobilidade, o
homogêneo e o heterogêneo. A aplicação de catalisadores homogêneos,
ácidos ou básicos, gera mais problemas em relação aos catalisadores
heterogêneos, pois se torna difícil remover o catalisador homogêneo do
produto devido à sua forma líquida e durante a reação pode ocorrer a formação
de efluentes perigosos sendo necessário tratamento para um posterior
descarte. Já os catalisadores heterogêneos são sólidos, o que permite que este
seja separado do biodiesel por uma simples filtração. Além disso, a reutilização
29
do catalisador sólido também se torna possível após a separação do mesmo
(JUAN et al., 2011).
Reações enzimáticas para a produção de biodiesel tem atraído muita
atenção nos últimos anos, uma vez que as enzimas apresentam tolerância a
ácidos graxos livres e água em óleo, evitando a formação de sabão e tornando
a purificação do biodiesel e do glicerol mais fácil (JEGANNATHAN et al., 2010;
SAMIOS et al., 2009).
3.4 Catálise enzimática para a obtenção de biodiesel
Lipases (EC 3.1.1.3) são enzimas hidrolíticas versáteis que podem ser
obtidas a partir de animais e plantas, bem como de microrganismos naturais e
recombinantes com bons rendimentos. As enzimas desempenham papéis
essenciais na digestão, transporte e processamento de lipídios como os
triglicerídeos, gorduras e óleos; na maioria ou senão em todos os organismos
vivos (TAN et al., 2010; TOMIN et al., 2010; WANG et al., 2006).
Lipases microbianas, por exemplo, são fundamentais na obtenção de
queijos, iogurtes, vinhos, provando seu importante papel na vida cotidiana do
ser humano há muitos anos. No entanto, as lipases também estão sendo
exploradas como biocatalisadores multíplices em aplicações mais modernas,
como a produção de biodiesel, por exemplo, pois possuem a capacidade
intrínseca de catalisar a clivagem de ligações éster carbóxi em tri-, di-,
monoacilglicerol e ácidos graxos (TAN et al., 2010; TOMIN et al., 2010; WANG
et al., 2006).
Além disso, são considerados biocatalisadores flexíveis, pois podem
catalisar uma grande variedade de reações enantio e regiosseletivas tais como
hidrólise, esterificação, transesterificação, aminólise a amoniólise. A reação de
esterificação ou hidrólise geralmente ocorre com alta regio- e/ou
enantiosseletividade, fazendo das lipases um importante grupo de
biocatalisadores na química orgânica. Possuem ainda, excelente atividade e
estabilidade em meios não aquosos, facilitando a reação de transesterificação
no processo de produção do biodiesel (TAN et al., 2010; YIGITOGLU;
TEMOÇIN, 2010).
30
As principais lipases microbianas utilizadas na produção de biodiesel
são Candida antarctia, Candida rugosa, Rhizopus pryzae, Pseudomonas
cepacia e Mucor miehei (GHIACI et al., 2009; YANG; SOHN; KIM, 2009; YI;
NOH; LEE., 2009)
Quando a transesterificação química (com catalisadores sólidos) é
utilizada na produção do biodiesel, a reação apresenta baixo tempo e altos
rendimentos, porém, apresenta grandes desvantagens durante o processo
como exigência de elevada energia, dificuldades na recuperação do catalisador
e do glicerol como subproduto e potenciais de poluição do meio ambiente (TAN
et al., 2010).
A lipase como catalisador biológico, quando comparada com
catalisadores químicos, se sobressai, pois acelera a reação em condições
brandas de temperatura, não produz poluentes, apresenta facilidade na
remoção da solução (imobilização) e pode ser reutilizada várias vezes (TAN et
al., 2010). Tahir, Adnan e Mischnick (2009) realizaram quatro ciclos de
reutilização da matriz com a enzima imobilizada, tendo como resultado um
decréscimo na conversão de 80% para 70%. Já Yang, Sohn e Kim (2009)
obtiveram maior estabilidade operacional, mantendo a atividade inicial da
enzima em 85% durante dez ciclos.
Uma particularidade interessante das lipases refere-se ao seu
mecanismo de atuação, chamado de ativação interfacial. A maioria
das lipases tem uma cadeia de oligopeptídeos que funcionam como uma
"tampa" que cobre o seu sítio ativo fazendo com que se torne inacessível ao
substrato. Na ausência de uma interface hidrofóbica, o sítio ativo
é isolado do meio reacional formando a chamada “conformação fechada ou lid”.
Já na presença de uma interface hidrofóbica, importantes rearranjos
conformacionais ocorrem, resultando na “conformação aberta”, onde o lid é
deslocado expondo a o sítio ativo e permitindo o acesso do substrato. Além
disso, as lipases mostram alta afinidade por interfaces hidrofóbicas, incluindo
suportes quimicamente modificados com agentes hidrofóbicos. A estrutura
tridimensional da lipase proveniente da Candida rugosa é ilustrada na figura 05
(GAO et al., 2009; MENDES et al., 2010; WU et al., 2010).
O mecanismo de atuação das lipases é explicado através de sua
estrutura tridimensional e dos sítios ativos que possuem, o qual consiste de
31
uma tríade de aminoácidos; o resíduo nucleofílico da serina, o resíduo de sítios
ácidos (aspartato ou glutamato) e ainda, o resíduo de histidina. Essa sequência
de resíduos classificam as lipases como serino hidrolases (RODRIGUES,
2009).
Figura 05. Estrutura tridimensional da lipase de Candida rugosa. (a)
Conformação fechada. (b) Conformação aberta. (RODRIGUES, 2009).
O mecanismo de ação dessas enzimas apresenta quatro etapas, onde
ocorre a hidrólise da ligação éster presente em acilgliceróis, liberando o
ácido graxo e glicerol (RODRIGUES, 2009).
Na primeira etapa, ocorre um ataque do par de elétrons do átomo de
oxigênio, presente no grupamento OH do resíduo nucleofílico da serina, no
carbono da carbonila que forma a ligação éster do substrato. A propriedade
nucleofílica apresentada por esse átomo de oxigênio é aumentada pela
presença do aminoácido histidina, pois o próton do grupo OH da serina é
transferido para a histidina, que possui um anel imidazol, estabilizando a carga
formada. Na segunda etapa ocorre a formação de uma estrutura intermediária
tetraédrica, caracterizada pela carga negativa do átomo de oxigênio da
carbonila que é estabilizada pela interação de ligações de hidrogênios de dois
peptídeos através do grupos NH (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI,
2004; RODRIGUES, 2009; SKORONSKI, 2006).
A terceira etapa, também intermediária, é caracterizada pela formação
de uma ligação entre o próton do grupo imidazol da histidina com o oxigênio do
éster presente no intermediário tetraédrico formado anteriormente, sofrendo
clivagem e liberando um álcool. A água presente no meio é essencial para a
32
atividade enzimática porque é ativada pelo aminoácido histidina que libera o
grupo OH, o qual ataca o carbono da carbonila do grupo acil ligado ao
aminoácido da serina (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004;
RODRIGUES, 2009; SKORONSKI, 2006).
Por fim, a quarta etapa é caracterizada pela ação da histidina que doa
um próton do grupo imidazol para o átomo de oxigênio da serina, liberando o
grupo acil do ácido carboxílico formado. Após a difusão do ácido carboxílico,
inicia-se outro ciclo catalítico (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004;
RODRIGUES, 2009; SKORONSKI, 2006).
O metanol é geralmente utilizado como aceptor acila para a
produção biológica de biodiesel. No entanto, a sua presença pode inibir a
atividade da lipase e diminuir a produtividade do biodiesel, aumentando
o custo da suplementação enzimática, pois o metanol é insolúvel no óleo e as
lipases imobilizadas são facilmente inativadas pelo contato com gotículas de
metanol. Contudo, é um álcool simples, de cadeia curta e polar, sendo o
substrato mais utilizado devido ao baixo custo, o que o torna muito acessível
(JUNG et al. 2010; LI; ZHENG; YAN, 2010).
O glicerol, subproduto da reação é hidrofílico e insolúvel em óleos e
é facilmente adsorvido na superfície da lipase imobilizada, reduzindo a
estabilidade operacional do sistema. Para superar este efeito inibitório
do metanol, várias estratégias têm sido desenvolvidas. A adição de co-
solventes como o n-hexano e o tetrahidrofurano podem aliviar
esses obstáculos até certo ponto, mas um complexo processo deve ser
implementado para removê-los do meio reacional. Com o intuito de superar a
desativação da lipase e melhorar a eficiência do processo, o acetato de metila
e o acetato de etila já foram propostos como aceptores de grupamento acila. A
adição de etanol também já foi proposta para evitar a desativação inicial da
lipase e apresentou conversão de 90 a 95%, porém em um tempo reacional
muito longo, de 50 a 70 horas (JUNG et al. 2010; LI; ZHENG; YAN, 2010).
Assim, os processos detalhados, incluindo as condições ambientais e
os métodos de adição de metanol devem ser otimizados para maximizar o
rendimento de conversão e produtividade de biodiesel. O t-butanol pode ser um
promissor solvente na transesterificação com catálise enzimática (JUNG et al.
2010; LI; ZHENG; YAN, 2010).
33
Não é possível utilizar a lipase solúvel na síntese orgânica porque os
solventes e ácidos graxos livres são meio natural e substrato para a lipase.
Estes produtos químicos podem desnaturar a enzima, extraindo os últimos
vestígios de água da proteína, uma quantidade mínima que é essencial para a
manutenção das estruturas quaternárias da molécula enzimática, tal qual as
forças de estabilização, componente de sal, interações hidrofóbicas e ligações
de hidrogênio, que são alteradas em ambiente biológico. Além disso, os ácidos
graxos também podem desnaturar a enzima pela protonação se o pH estiver
baixo (TAHIR et al. 2009; TAN et al. 2010).
Um dos gargalos para aplicação industrial da lipase é o alto custo do
biocatalisador. A imobilização de enzimas é uma estratégia frequentemente
utilizada para superar problemas como a estabilidade de armazenamento,
capacidades operacionais térmicas e conformacionais e o elevado custo da
aquisição e utilização da enzima. Além de que, os efeitos estabilizadores e a
qualidade dos produtos também podem ser melhorados, evitando subprodutos
ou intermediários indesejáveis. Outro aspecto importante relacionado com a
imobilização refere-se à separação facilitada da enzima, podendo ser
reutilizada e tornando o processo economicamente mais viável. A técnica de
imobilização também influencia nas propriedades do biocatalisador e na
cinética da reação orgânica (TAHIR et al., 2009; TAN et al., 2010).
3.5 Imobilização enzimática
Muitas técnicas de imobilização de lipases têm sido desenvolvidas nos
últimos anos. Elas podem ser classificadas em quatro tipos: adsorção de
materiais à base de polímeros orgânicos ou inorgânicos; encapsulamento;
ligação covalente e reticulação com a utilização de uma molécula ‘ponte’ como
o glutaraldeído (DA RÓS et al., 2010; YANG et al., 2009).
Entre esses métodos, a adsorção tem sido habitualmente utilizada por
ser um processo de produção mais simples e de alta atividade. A adsorção em
suportes hidrofóbicos tem sido amplamente utilizada para lipases devido suas
características de ser hiperativada em interfaces hidrofóbicas; esse mecanismo
é chamado de ativação interfacial. No entanto, as enzimas adsorvidas
34
geralmente exibem pouco reaproveitamento devido à fraca interação entre as
enzimas e o suporte (DA RÓS et al., 2010; YANG et al., 2009).
Nos últimos anos, um método de imobilização foi desenvolvido baseado
no conceito de “reticulação”, envolvendo as seguintes etapas: moléculas de
enzima são ligadas covalentemente ao suporte, em seguida, outras moléculas
de enzima e seus agregados são reticuladas com glutaraldeído. Desta forma, a
carga mais elevada da enzima pode ser alcançada, resultando no aumento da
atividade global da enzima e em uma maior estabilidade do biocatalisador
imobilizado (DA RÓS et al., 2010; YANG et al., 2009).
O mecanismo de imobilização enzimática utilizando o método de
reticulação em uma matriz de quitosana pode ser observado na figura 06.
Nessa metodologia a enzima é imobilizada ao suporte através de um cross-
linking formado pela adição do glutaraldeído, permitindo que os sítios ativos da
enzima fiquem expostos e livres para que ocorra a catálise.
O
NH2OH
O
OHO
H
O
H
Lipase NH2
O
NOH
O
OH
N NH2Lipasen n
Figura 06. Mecanismo de imobilização enzimática por cross-linking em um
suporte de quitosana (YI; NOH; LEE, 2009).
Outro método tem-se tornado expansivo no que se refere à imobilização
de proteínas, o encapsulamento ou microencapsulamento, que consiste na
utilização de biopolímeros para a formação de microesferas ou microcápsulas
como carreadores. Biopolímeros são predominantemente escolhidos para
produzir as microcápsulas devido as suas vantagens, como biocompatibilidade,
biodegradabilidade e atoxicidade (MLADENOVSKA et al., 2007).
O alginato, um polissacarídeo natural, tem sido considerado um dos
biopolímeros mais adequados para a produção de microcápsulas devido sua
composição e estrutura, pois contêm dois ácidos urônicos, o ácido β-D(1-4)
manurônico (M) e o ácido α-L(1-4) gulurônico (G), e é composto por blocos
homopoliméricos M-M e G-G assim como blocos com alternâncias de
sequências (M-G). Além disso, o alginato de sódio possui uma propriedade
35
única de cross-linking ou reticulação quando em contato com cátions
multivalentes, como íons de cálcio em meio aquoso; formando complexos com
as sequências G-G da cadeia polimérica que por sua vez, originam as ‘junções
de caixas de ovos”. Assim, o alginato forma uma estrutura reticulada em
contato com os íons de cálcio e esta rede pode armazenar e transportar
proteínas (FINOTELLI et al., 2010).
Outro biopolímero, a quitosana, tem sido comumente associada ao
alginato na formação reticulada das microesferas devido à forte interação
eletrostática dos grupos amino com os grupos carboxílicos do alginato, o que
leva a formação do complexo quitosana/alginato que torna a microcápsula mais
resistente (FINOTELLI et al., 2010; ZHANG et al., 2011). O complexo
polieletrolítico entre a quitosana e o alginato tem sido utilizado na formação de
microcápsulas para liberação modificada e controlada de fármacos como a
insulina e outras substâncias sendo relatado por Finotelli et al. (2010).
As cápsulas formadas através do complexo quitosana-alginato podem
ser obtidas através de dois procedimentos diferentes; um método de passo
único, onde um complexo de coacervado é formado na interface entre as
soluções de alginato e quitosana quando a solução de alginato é descartada
diretamente em uma solução de cloreto de cálcio misturado com a quitosana. O
outro método é composto por dois passos, onde as cápsulas de alginato-cálcio
são recuperadas e posteriormente revestidas com quitosana (GASEROD et al.,
1998,; MLADENOVSKA et al., 2007).
Nesse contexto, torna-se importante a escolha de um suporte adequado
para a imobilização, levando em conta, principalmente, a sua interação com a
enzima, pois esta possui grande influência sobre a estabilidade e cinética o
processo.
3.6 Quitosana e seu derivado N-benzil
A quitosana (figura 07) é um polissacarídeo facilmente obtido por
hidrólise alcalina da quitina e tem sido utilizada em áreas farmacêuticas, na
formulação de medicamentos, como carreadores de liberação modificada de
fármacos e na engenharia de tecidos. É considerado um suporte adequado
para a imobilização enzimática porque é biocompatível, está disponível de
36
várias formas (gel, membrana de fibra e filme), é atóxico e passível de
modificações químicas. Anteriormente, grânulos de quitosana eram utilizados
para a imobilização de w-Transaminase, enzima útil na área farmacêutica
(CHIOU; WU, 2004; DENG et al., 2009; YI et al., 2009). Além disso, seu uso
está relacionado a vantagens ambientais, econômicas e sociais (MARTINS;
PRADO, 2008; KRAJEWSKA, 2004).
O OO
OH NH2
OH
n
Figura 07. Estrutura da quitosana (QTS) (KRAJEWSKA, 2004).
A quitosana tem grupos reativos amino (-NH2) e hidroxila (-OH) que,
após modificações químicas, podem fazer ligações covalentes com grupos
reativos da enzima. Devido a seus grupos amina a quitosana é um polieletrólito
catiônico (pKa= 6,5), sendo insolúvel em soluções aquosas neutras, mas
solúvel em soluções ácidas com pH abaixo de 6,5. As propriedades mecânicas
do polímero podem ser melhoradas através da reticulação adicional usando
reagentes bifuncionais como glutaraldeído. No método de reticulação as
moléculas de glutaraldeído reagem com grupamentos amino da quitosana e da
enzima (RODRIGUES et al., 2008).
Muitos estudos já demonstraram que a quitosana é um bom suporte
para a imobilização de lipase, porém, a lipase imobilizada em
quitosana geralmente apresenta menor atividade que a lipase livre, mas possui
a vantagem de ser reaproveitada (JIANG et al., 2005; WU et al., 2010).
A O-carboximetilquitosa (O-CMQTS), observada na figura 08 é o
derivado mais explorado da quitosana, sendo um polímero anfótero, pois é
solúvel em água no qual o grupamento o-hidroxila é substituído por um
grupamento carboximetil através da formação de uma ligação éter, conferindo
ao polímero solubilidade tanto em pH ácido quanto básico (RINAUDO, 2006;
ZHU et al., 2005).
37
O
O
NH2
O
OH
CH2COOH
Figura 08. Estrutura do principal monômero da O-CMQTS (DEBRASSI, 2008).
Um derivado da O-CMQTS estudado para aplicações farmacêuticas é a
O-carboximetilquitosana-N-benzil (OC-Bz) (Figura 09) no qual ocorre a
inserção de um grupamento benzil proveniente da adição do benzaldeído no
nitrogênio do monômero de O-CMQTS, conferindo a esse polímero uma região
hidrofílica (solúvel em água), condicionada pelo comportamento do ácido
carboxílico presente na estrutura e uma região hidrofóbica (solúvel apenas em
lipídios e solventes orgânicos), condicionada pela inserção do anel aromático,
caracterizando uma estrutura anfifílica (DEBRASSI, 2008).
O
O
NH
O
OH
CH2COOH
Figura 09. Estrutura do principal monômero da OC-Bz (DEBRASSI, 2008).
O derivado mencionado acima tem sido utilizado como auxiliar na
dissolução de compostos bioativos pouco solúveis, no preparo de matrizes
para a imobilização enzimática e em formulações para liberação de fármacos
em aplicações farmacêuticas (DEBRASSI, 2008; DEBRASSI, 2011; ROSA,
2008; BRESSAN, 2009; SANTOS, 2010).
3.7 Nanopartículas magnéticas
Recentemente, as nanopartículas magnéticas têm surgido como uma
alternativa para facilitar a remoção do material enzimático ligado ao suporte de
38
imobilização para que possa vir a ser reutilizado, beneficiando
economicamente o processo de transesterificação dos óleos vegetais para a
produção de biodiesel. As razões da escolha de partículas magnéticas para
este fim se dão, quanto ao tamanho do material de suporte, sendo este
normalmente em escala nanométrica. Sendo assim, por possuir propriedades
superparamagnéticas, as nanopartículas magnéticas podem facilmente
controlar a reciclagem do catalisador biológico empregado com a aplicação de
um campo magnético. Sendo assim não há necessidade de caros sistemas de
cromatografia líquida, centrífugas, filtros ou outros equipamentos para a
remoção do suporte (HU et al., 2009; JIANG et al., 2009; LEE et al., 2009).
Alguns artigos têm proposto o uso de nanopartículas magnéticas
como suporte para a imobilização da enzima como mostrado por Dussan e
colaboradores (2010), Lei e colaboradores (2009) e Wu e colaboradores
(2009).
39
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Síntese dos materiais 4.1.1 Síntese da O-CMQTS
A O-CMQTS foi sintetizada de acordo com método previamente descrito
na literatura (CHEN; PARK, 2003). Inicialmente, 27 g de hidróxido de sódio
foram dissolvidos em 20 mL de água e 180 mL de isopropanol, sendo
adicionado posteriormente 20 g de quitosana (lote H0512-A2, adquirida da
Purifarma Distribuidora Química e Farmacêutica Ltda, peso molecular de 265
g/mol, com grau de desacetilação de 80%). A solução permaneceu agitando
durante uma hora a 0 oC, sendo armazenada no freezer a 0oC por um período
mínimo de 24 horas. Após o tempo determinado, a mistura foi retirada do
freezer, e uma solução com 30 g de ácido monocloroacético dissolvidos em 40
mL de isopropanol foi gotejada na mistura que reagiu por, no mínimo, 24 horas,
conduzida em banho de gelo, à temperatura de 0 oC. Posteriormente, a mistura
foi armazenada novamente no freezer por, no mínimo, 15 dias, mantendo-se a
temperatura de 0 oC. O derivado formado foi filtrado, lavado em etanol 70 % e
seco em dessecador em temperatura ambiente.
4.1.2 Síntese da OC-Bz
Para a síntese da OC-Bz, 20 g da O-CMQTS foram dispersas em 800
mL de água e um equivalente de benzaldeído (10 mL), com base no monômero
da O-CMQTS, sendo previamente dissolvido em metanol foi adicionado à
mistura. Posteriormente, metanol foi adicionado à mistura até que esta
obtivesse um aspecto homogêneo. O pH foi ajustado para aproximadamente
4,0 e a mistura reagiu por 24 horas. Após o tempo determinado, uma solução
aquosa contendo 2 g de boroidreto de sódio foi dissolvida em
aproximadamente 200 mL de água, sendo gotejada à mistura sob agitação por
90 minutos. Os derivados formados foram precipitados, lavados com acetona e
filtrados. O benzaldeído remanescente foi removido e os derivados foram secos
em dessecador.
40
4.1.3 Síntese da QTS-Bz
Para a síntese do derivado benzaldeído da quitosana, 30 g de quitosana
(lote H0512-A2, adquirida da Purifarma Distribuidora Química e Farmacêutica
Ltda, peso molecular de 265 g/mol, com grau de desacetilação de 80%) foram
dissolvidos em uma solução de ácido acético a 3% sob agitação. Em seguida,
uma diluição de 20 mL de benzaldeído e metanol foram adicionados à mistura.
Posteriormente, metanol foi adicionado à mistura até que esta obtivesse um
aspecto homogêneo. O pH foi ajustado para aproximadamente 4,0 e a mistura
reagiu por 24 horas. Após o tempo determinado, uma solução aquosa contendo
10 g de boroidreto de sódio foi dissolvida em aproximadamente 200 mL de
água, sendo gotejada vagarosamente à mistura, sob agitação, para não haver
formação de espuma, por 90 minutos. Os derivados formados foram
precipitados, lavados com acetona e filtrados. O benzaldeído remanescente foi
removido e os derivados, por fim, foram submetidos ao dessecador para
secagem e armazenagem.
4.1.4 Preparação do material magnético inorgânico (Fe3O4/ γγγγ-Fe2O3)
As nanopartículas magnéticas foram preparadas através do método
descrito na literatura (WU et al., 2009). Assim, 4,53 g de FeCl3.6H2O e 3,33 g
de FeSO4.(NH2)SO4.6H2O foram dissolvidos em 50 mL de água,
separadamente, de forma a obter a proporção 2:1 de Fe3+:Fe2+. Em seguida, a
solução de FeCl3.6H2O foi adicionada aos poucos à solução de
FeSO4.(NH2)SO4.6H2O e o pH foi mantido em 9,0 utilizando hidróxido de sódio.
As nanopartículas formadas foram filtradas, lavadas com água e acetona e
secas em dessecador.
41
4.2 Preparação das esferas magnéticas de alginato/cálcio com
derivados da quitosana
Para a preparação das esferas como catalisadores, 0,5 g de um
derivado da quitosana (O-CMQTS, OC-Bz ou QTS-Bz) foram dissolvidos em
100 mL de água sob agitação. Após a dissolução, 2 g de cloreto de cálcio
foram pesados e adicionados à solução, sob agitação e aquecimento. Em outro
béquer, uma solução de alginato de sódio a 1% foi preparada com ajustamento
do pH para aproximadamente 4,0. Após, um equivalente de nanopartículas
magnéticas (0,25 g ou 0,5 g) foram adicionadas a 25 mL da solução de alginato
de sódio; que foi agitada para a incorporação do material magnético e,
posteriormente, 0,5 mL de enzima (Lipozyme 100L TL) foram adicionadas à
mistura (REBELO, 1998).
A solução com o derivado da quitosana e cloreto de cálcio foi colocada
em uma placa de petri e com uma seringa, a mistura de alginato com as
partículas magnéticas e a enzima foi gotejada, formando as esferas através da
reticulação do alginato com o cálcio.
As esferas permaneceram, em repouso, por 6 horas para o
enrijecimento da esfera, foram lavadas com água e posteriormente, uma
solução de glutaraldeído a 5% foi adicionada, permanecendo em contato com
as esferas por um período mínimo de 2 horas. Por fim, as esferas foram
lavadas com água, sendo que o excesso foi removido com papel toalha,
separadas em frações de aproximadamente 2,0 g e armazenadas no
refrigerador até o seu uso (FINOTELLI et al., 2010; MLADENOVSKA et al.,
2007; ZHANG et al., 2011).
4.3 Reação de esterificação com ácido láurico
A reação de esterificação padrão utilizada foi preparada a partir de 0,2 g
de ácido láurico, sendo dissolvidos em 30 mL de hexano ou n-hexanol
(solvente). Uma alíquota de 0,074 mL de álcool butílico ou n-butanol foi
adicionada, assim como 2 g de esferas dos derivados da quitosana.
42
Alguns fatores foram alterados para avaliar as condições ótimas de
conversão do ácido láurico, como o tipo de polímero empregado para formar as
esferas (O-CMQTS, OC-Bz e QTS-Bz), as condições de armazenamento das
esferas, a quantidade de esferas empregadas durante a reação de
esterificação (0,10, 0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 g) e a temperatura de reação entre 25 e
55 oC. Além desses fatores, vários tipos de álcoois foram empregados como
solventes.
Estas reações foram repetidas para os diferentes tipos de esferas
preparadas com os três polímeros e com diferentes quantidades de material
magnético.
4.3.1 Reutilização do biocatalisador
A reação de esterificação padrão utilizada foi preparada a partir de 0,2 g
de ácido láurico, sendo dissolvidos em 30 mL de hexano ou n-hexanol
(solvente). Uma alíquota de 0,074 mL de álcool butílico ou n-butanol foi
adicionada, assim como 2,5 g de esferas preparadas com a QTS-Bz possuindo
0,25 g de nanopartículas magnéticas de Fe e 0,5 mL de enzima. A mistura
permaneceu sob agitação mecânica, em banho-maria, a temperatura ambiente
durante 24 horas. Em seguida, as esferas foram separadas com a utilização de
um imã e a reação repetida.
4.3.2 Determinação da taxa de conversão do ácido láurico
A quantidade de ácido láurico remanescente após cada etapa de reação
foi determinada através da titulação com o KOH 0,05 M (preparado em etanol
95 % v/v) utilizando a fenolftaleína como indicador. Cinco mL do meio reacional
foram misturados com 10 mL de etanol e titulados até a mudança da coloração
da solução. A taxa de conversão foi calculada a partir da Equação 1
%C = 100 – {[V(t) / V(s.p.)] x 100} Equação 1
43
Onde, V(t) é o volume de KOH gasto para consumir o ácido láurico após a
reação e V(solução padrão) é o volume de KOH gasto para consumir a
quantidade de ácido láurico antes de iniciar a reação.
4.4 Extração do óleo da Aleurites moluccana
O óleo foi extraído das sementes da Aleurites moluccana, previamente
secas em estufa a 80 oC por 2 horas, foram quebradas manualmente e
trituradas, sendo, posteriormente, aquecidas sob refluxo, utilizando como
solvente CH2Cl2, CHCl3 e hexano. O material foi filtrado e submetido ao
rotaevaporador para eliminar os solventes utilizados (SANTOS et al 2009).
O óleo obtido na etapa de extração foi avaliado quanto a sua densidade
através do método de picnometria de acordo com metodologia Adolfo Lutz,
2004, calculada pela razão entre a massa da amostra e o volume do
picnômetro.
O rendimento do óleo extraído foi estimado pela regra aritmética a
seguir:
Q1 ..................................................100%
Q2.....................................................X Equação 02
Onde: Q1 se refere a quantidade (g) de sementes secas utilizadas para
extração; Q2 é a quantidade (g) de óleo obtido após extração e X é rendimento
em % do óleo extraído.
4.5 Caracterização do catalisador
4.5.1 Titulação condutimétrica
Para a determinação do grau de carboximetilação da O-CMQTS, a forma
ácida da O-CMQTS foi preparada através da adição de 5 mL de ácido clorídrico
0,25 M em 50 mg da O-CMQTS anteriormente preparada. Em seguida, sob
44
agitação magnética constante, foram adicionadas alíquotas de 0,25 mL de
hidróxido de sódio 0,1 M e os valores de condutividade da dispersão foram
obtidos com o auxílio de um condutivímetro Digimed DM-31. Através do gráfico
de condutividade em função do volume de hidróxido de sódio adicionado, com
o prolongamento das curvas ascendente e descendente, foram determinados
os pontos de inflexão V1 e V2. Estes valores foram então aplicados na Equação
03, onde 5,8 é o equivalente em massa correspondente a 0,1 mEq de
CH2COO- e m é a massa em miligramas do polímero (CASU; GENNARO,
1975).
%CH2COO =V2 −V1( )× 5,8 ×100
m Equação 03
4.5.2 Titulação potenciométrica
Para a determinação da porcentagem de grupamentos NH2 livres do
derivado benzilado da quitosana, foram dispersos 0,2 g do polímero em 50 mL
de água, adicionando-se posteriormente 5 mL de ácido clorídrico 0,25 M. Em
seguida, realizou-se a titulação utilizando uma solução de hidróxido de sódio
0,1 M, conforme a variação de pH apresentada. Através dos valores de pH
obtidos com pHmetro, foi construída uma curva de titulação de pH em relação
ao volume de hidróxido de sódio gasto durante a titulação, obtendo a primeira
derivada dessa curva. A porcentagem de grupamentos NH2 livres foi calculada
a partir dos pontos de inflexões obtidos, aplicando-se a fórmula abaixo
(BROUSSIGNAC, 1970):
Equação 04
Onde, V2 corresponde ao volume de neutralização do ácido forte (HCl) em
excesso; V1 refere-se ao volume de neutralização do ácido fraco (NH3+); M é
igual a molaridade do titulante (NaOH) utilizado; m é a massa do polímeros em
gramas, e o valor referente a 16,1 é relativo ao peso molecular do monômero
da D-glicosamina.
45
4.5.3 Espectroscopia de infravermelho (IV)
Os espectros no infravermelho dos polímeros foram obtidos via DRS,
utilizando o Espectrômetro de Infravermelho Prestige-21 Shimadzu.
4.5.4 Ressonância magnética nuclear de H1
Os espectros de RMN 1H foram obtidos pela dispersão do polímero em
água deuterada e ácido acético deuterado em temperatura ambiente, utilizando
o Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear Bruker AC-300 a 300 MHz
no Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear do Curso de Farmácia da
UNIVALI.
Para a determinação do grau de substituição da OC-Bz e da QTS-Bz
foram considerados os valores das integrais dos espectros (LIU et al., 2006).
Este método de determinação do grau de substituição baseia-se na relação
entre o valor da integral dos hidrogênios aromáticos (próximo a 7,0 ppm) e do
hidrogênio ligado ao C-2 do anel glicosídico (próximo a 3,0 ppm), conforme a
Equação 05.
GS =AI
1HAr ~ 7,0ppm
AI1HC2 ~ 3,0ppm
×1
N1HAr
Equação 05
Onde:
AI 1HAr: integral dos prótons aromáticos;
AI 1H C2: integral dos prótons do C-2 do anel glicosídico e
N 1HAr: número de prótons do anel aromático.
4.5.5 Determinação do teor de proteína
A quantidade de proteína na enzima Lipozyme 100L TL foi determinada
utilizando o reagente de azul de Comossie e a leitura em comprimento de onda
46
de 540 nm. Previamente foi preparada uma curva analítica de albumina sérica
bovina também para determinação da quantidade de proteína (ORREGO et al.,
2010).
4.6 Produção e caracterização de ésteres de cadeia longa
O óleo de Aleurites moluccana (5 g) foi agitado em um erlenmeyer
juntamente com as esferas (2,0 g) a 25ºC e a quantidade equivalente de álcool
para manter a relação molar óleo:álcool (1:10). Portanto 0,150 mL de metanol
foram adicionados em três etapas nos tempos 0, 12 e 24 horas (LI; ZONG; WU,
2009).
O mesmo procedimento foi realizado também sem o catalisador,
somente com a enzima livre. A formação do éster foi acompanhada através de
cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando hexano:acetona:ácido
acético (95:5:0,05) como fase móvel e posterior revelação com ácido
sulfúrico/metanol e aquecimento.
4.6.1 Efeito da reutilização do catalisador
Para avaliar a influência da reutilização do catalisador na produção dos
ésteres de cadeia longa, um sistema foi montado utilizando-se as esferas OC-
Bz 500, reutilizando-as a cada 48 horas.
4.6.2 Determinação da taxa de conversão do éster
A taxa de transesterificação dos componentes do óleo foi analisada por
Ressonância Magnética Nuclear de 1H (RMN 1H) em Espectrômetro Bruker 300
MHz, utilizando CDCl3 como solvente e TMS como referência. A conversão foi
determinada através da equação que relaciona a integral do sinal
correspondente aos prótons dos metilenos adjacentes ao grupamento éster nos
triglicérides e ésteres metílicos (δ 2,3) com a do sinal correspondente aos
prótons metóxi dos ésteres metílicos (δ 3,7) (SILVA et al., 2008) Equação 06.
47
C=100 x (2 AME) Equação 06
(3 ACH2)
48
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Preparação dos materiais 5.1.1 Síntese e caracterização da O-CMQTS
A síntese da O-CMQTS ocorre através de uma reação de substituição
nucleofílica bimolecular (SN2), na qual o ataque nucleofílico ao átomo de
carbono ligado ao cloro acontece simultaneamente à expulsão do grupo de
saída formando um éter (Figura 10).
Figura 10. Esquema da síntese da O-CMQTS a partir da quitosana (DEBRASSI,
2011).
As baixas temperaturas empregadas durante o processo de síntese da
O-CMQTS têm como objetivo direcionar a substituição do grupamento ácido
carboxílico para o álcool primário do monômero da quitosana, pois este
encontra-se menos impedido estericamente quando comparado com o álcool
secundário também encontrado na estrutura do polímero. A substituição do
álcool primário ainda permite que o grupamento amina fique livre
estericamente, para que esta possa, posteriormente, reagir com o benzaldeído
formando o derivado anfifílico OC-Bz (CHEN; DU; ZENG, 2003; DEBRASSI,
2011; ROSA, 2008). .
A condição alcalina e a utilização do isopropanol como meio reacional
são fundamentais para diminuir a cristalinidade do polímero deixando a
estrutura amorfa e permitindo o acesso do ácido monocloroacético a estrutura
polimérica, possibilitando assim a carboximetilação, uma vez que o isopropanol
possui baixa constante dielétrica sendo um solvente ruim para o NaOH,
49
favorecendo uma alta concentração da base na superfície da quitosana e,
consequentemente, um maior rompimento da sua estrutura cristalina (CHEN;
DU; ZENG, 2003; DEBRASSI, 2011; ROSA, 2008).
A O-CMQTS foi obtida na forma salina utilizando 20 g de quitosana
como material de partida e apresentando 40 g de rendimento ao final da
reação, sendo uma pequena parte desta transformada na forma ácida para a
determinação do grau de carboximetilação através da titulação condutimétrica
que baseia-se na substituição dos íons com determinada condutividade por
outros com condutividade diferente (MUZZARELLI et al., 1982).
Através dos volumes correspondentes aos pontos de inflexão, obtidos
através da curva de titulação condutimétrica da O-CMQTS na forma ácida
utilizando NaOH 0,1 M como agente titulante (Figura 11) foi determinado o grau
de carboximetilação do derivado testado.
0 1 2 3 4 5200
400
600
800
1000
1200
2,250,84
Con
dutâ
ncia
(µS
/cm
)
Volume de NaOH (mL)
Figura 11. Curva da titulação condutimétrica da O-CMQTS. Massa de amostra: 50 mg, temperatura: 25 ºC, titulante: NaOH 0,1 M.
A curva de titulação condutimétrica da forma ácida da O-CMQTS é
dividida em três regiões: a primeira, em que há um decréscimo nos valores de
condutividade, corresponde à neutralização dos grupamentos NH3+ presentes
no polímero na forma ácida; a segunda refere-se à neutralização dos
50
grupamentos COOH e a terceira corresponde à adição dos íons Na+ e OH-. A
diferença entre os pontos de inflexão no fim e no início da neutralização do
COOH é empregada para o cálculo do grau de carboximetilação (DEBRASSI,
2011). Sendo assim, o grau de carboximetilação obtido através da diferença
dos pontos de inflexões foi de 19,20%. Este valor encontra-se abaixo dos
valores obtidos a derivados carboximetilados da quitosana anteriormente
através do mesmo método de síntese, cujos valores de carboximetilação se
situam entre 20 e 30% (CHEN; PARK, 2003; ROSA, 2008; SANTOS, 2010) e
mais recentemente, 44,31%, relatado por Debrassi, 2011. Esta diferença
implica a necessidade de caracterização para cada lote de derivado
sintetizado.
Outro método analítico complementar empregado para este derivado (O-
CMQTS) foi a técnica de espectroscopia no infravermelho, muito utilizada na
síntese orgânica, química farmacêutica, fitoquímica e áreas afins para a
determinação de estruturas químicas durante a identificação de compostos,
pois os espectros de absorção no infravermelho tem origem quando ocorre a
absorção da radiação eletromagnética em frequências correlacionadas à
vibração de ligações químicas de determinados grupos funcionais de uma
molécula. Assim, a condição fundamental para que haja absorção na região do
infravermelho é a existência de uma variação do momento de dipolo elétrico de
uma molécula como consequência da vibração ou rotação dos seus átomos.
(COATES, 2000; DEBRASSI, 2011).
O espectro no infravermelho do derivado carboximetilado da quitosana
(O-CMQTS) pode ser observado na figura 12, abaixo.
51
Figura 12. Espectro no infravermelho da O-CMQTS na forma ácida.
No espectro da O-CMQTS é possível verificar a presença de uma banda
na região de 1680 cm-1 (estiramento) correspondente à carbonila (C=O) e uma
banda larga na região de 3020 cm-1 (estiramento) relacionada à ligação O–H,
ambas indicando a presença do grupamento ácido carboxílico, confirmando a
carboximetilação da quitosana. Há também uma banda em 1560 cm-1 atribuída
à deformação angular de N–H dos grupamentos amino livres (NH2); em 1460
cm-1 (deformação) relativa ao grupamento amino protonado (NH3+) e na região
entre 1150 e 900 cm-1 (estiramento) relativas às ligações glicosídicas C–O e C–
O–C (ABREU; CAMPANA-FILHO, 2009; LIU et al., 2009).
5.1.2 Síntese e caracterização da OC-Bz
O derivado anfifílico da quitosana (OC-Bz) foi obtido tendo a quitosana
como polímero de partida, sendo obtido através de uma reação de aminação
redutiva, demostrada na figura 13.
52
+HO
NaBH4
O
NOH
O
O CH2COOH
O
NH2OH
O
O CH2COOH
+ H OH
1a etapa
2a etapa
O
NOH
O
O CH2COOH
+O
OH
O
O CH2COOH
N
H
Figura 13. Esquema da síntese do derivado OC-Bz a partir da O-CMQTS
(DEBRASSI, 2011).
No decorrer da síntese da OC-Bz, há a condensação entre o
grupamento amino livre da quitosana e o benzaldeído através do ataque
nucleofílico da amina à carbonila do aldeído e a posterior remoção de água,
formando a imina, também chamada de base de Schiff. A imina, em seguida, é
reduzida utilizando o borohidreto de sódio (NaBH4) como agente redutor. Para
a síntese desse derivado utilizou-se como material de partida 20 g da O-
CMQTS, obtendo-se ao final, 39,5 g do polímero desejado utilizando-se o
método homogêneo, onde a O-CMQTS é dissolvida para a obtenção do seu
derivado, mantendo-se as características de solubilidade.
A figura 14 representa o espectro obtido no infravermelho da OC-Bz, no
qual podem ser observadas as bandas correspondentes ao grupamento ácido
carboxílico, apresentando a banda relativa à carbonila (C=O) em
aproximadamente 1650 cm-1 e um conjunto de bandas em aproximadamente
1450, 1400, 1315 e 1050 cm-1 indicam a inserção do anel aromático na
estrutura do polímero e às ligações glicosídicas C–O e C–O–C (SAJOMSANG
et al., 2008).
53
Figura 14. Espectro no infravermelho do derivado OC-Bz.
O espectro da OC-Bz ilustrado na figura 15 apresenta um sinal em 1,82
ppm correspondente aos hidrogênios do grupamento acetamida dos
monômeros residuais de quitina e um sinal em 3,01 ppm relativo ao hidrogênio
que está ligado ao carbono C2 do anel glucosamina. Também apresenta um
grupo de sinais na região entre 3,42 e 3,81 ppm correspondente aos
hidrogênios ligados aos carbonos C3, C4, C5 e C6 do anel glucosamina; outro
grupo de sinais em aproximadamente 4,70 ppm correspondente ao hidrogênio
ligado ao carbono C1 e aos hidrogênios do carbono ligado ao oxigênio do
grupamento carboximetil e ainda, um sinal em 7,28 ppm que corresponde aos
hidrogênios do anel aromático, o que confirma a inserção do grupo benzil na
estrutura do polímero OC-Bz.
54
Figura 15. Espectro de RMN 1H do derivado OC-Bz em D2O/CD3COOD à temperatura
ambiente.
O grau de substituição encontrado foi de 78,0%, sendo calculado a partir
da área da integral dos sinais em 3,01 ppm referente ao hidrogênio do C2 e
7,28 ppm, sinal referente aos hidrogênios do anel aromático obtidos através do
espectro do derivado OC-Bz.
5.1.3 Síntese e caracterização da QTS-Bz
O derivado benzaldeído da quitosana foi obtido através de uma reação
de aminação redutiva, semelhante ao processo empregado para a obtenção do
seu derivado anfifílico (OC-Bz), citado e descrito anteriormente e apresentado
na figura 16 abaixo. A reação de aminação permite o aumento da
hidrofobicidade do derivado obtido.
55
+HO
NaBH4
O
NOH
O
OH
O
NH2OH
O
OH
+ H OH
O
NOH
O
OH
+O
OH
O
OH
N
H
1a etapa
2a etapa
Figura 16. Esquema da síntese do derivado benzilado da QTS.
Para a síntese da QTS-Bz, 30 g de quitosana foram utilizadas como
material de partida, resultando em um rendimento final de 38,5 g.
A caracterização do material sintetizado foi determinada através dos
métodos de titulação pontenciométrica, para quantificar os grupamentos NH2
livres; espectroscopia no infravermelho (IV) e ressonância magnética nuclear
de H1 (RMN H1).
A figura 17 apresenta os dados obtidos pela titulação potenciométrica do
derivado benzilado da quitosana (QTS-Bz) ilustrando simultaneamente a curva
de titulação de pH versus volume de NaOH gasto e a curva da primeira
derivada da mesma titulação.
56
10 20 30 40 50 60
2
4
6
8
10
12
50,5
Volume de NaOH (mL)
pH
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
43,0
∆pH
/∆V
Figura 17. Curva de titulação potenciométrica da QTS-Bz. Massa do sólido: 200 mg, concentração do NaOH 0,118 M.
A porcentagem de grupamentos NH2 livres da quitosana encontrada
através da aplicação da equação 4 e dos pontos de inflexão obtidos foi de
71,24%. A quitosana livre apresenta %NH2 livres de 84%, indicando que o grau
de substituição foi 13% desse grupamento pelo anel aromático do benzaldeído
empregado durante a reação de aminação.
O espectro da QTS-Bz (figura 18) apresentou bandas características
desse polímero. A região entre 3080 cm-1 refere-se ao estiramento O-H; a
região próxima 3080 cm-1 é atribuída ao estiramento C-O do carbono
tetraédrico; os picos entre 1415 e 1360 cm-1 estão relacionados ao estiramento
e a vibração do anel glicosídico e em aproximadamente 1680 cm-1 e um
conjunto de bandas em aproximadamente 1130, 1072, 990 e 940 cm-1
indicando a inserção do anel aromático na estrutura do polímero
(SAJOMSANG et al., 2008; MARTINS, 2008).
57
Figura 18. Espectro no infravermelho do derivado QTS-Bz.
O espectro de RMN de H1 do derivado benzilado da quitosana
apresentou picos característicos visualizados na figura 19, como um sinal em
1,93 ppm correspondente aos hidrogênios do grupamento acetamida dos
monômeros residuais de quitina; 3,05 ppm referente ao hidrogênio ligado ao
carbono C2 do anel glicosídico; sinais na região entre 3,64 e 3,79 ppm
correspondente aos hidrogênios ligados aos carbonos C3, C4, C5 e C6 do
anel; um grupo de sinais em aproximadamente 4,70 ppm correspondente ao
hidrogênio ligado ao carbono C1 e um sinal em 7,38 ppm relativo aos
hidrogênios do anel aromático, confirmando novamente a inserção do grupo
benzil na estrutura do polímero.
58
Figura 19. Espectro de RMN 1H do derivado QTS-Bz em D2O/CD3COOD à
temperatura ambiente.
O grau de substituição encontrado para a QTS-Bz foi de 28,60 %, sendo
calculado a partir da área da integral dos sinais em 3,05 ppm referente ao
hidrogênio do C2 e 7,38 ppm, sinal referente aos hidrogênios do anel
aromático.
5.1.4 Preparação do material magnético inorgânico (Fe3O4/ γγγγ-Fe2O3)
As partículas magnéticas inorgânicas são compostas por uma mistura de
γ-Fe2O3 e Fe3O4 e foram obtidas através do método de coprecipitação dos íons
férricos (Fe3+) e ferrosos (Fe2+) em meio aquoso básico na razão de 2:1
(Fe3+:Fe2+).
A caracterização magnética das partículas compreende a análise do teor
de ferro, o comportamento magnético, avaliando como as partículas se
comportarão frente à aplicação de um campo magnético e a saturação
magnética que avalia até que ponto o aumento da intensidade do campo
59
magnético não mais interfere no aumento da magnetização do material
(DEBRASSI, 2011).
A obtenção das partículas magnética seguiu a metodologia utilizada por
Debrassi (2011) apresentando rendimento final de 28 g de material magnético,
valores de saturação magnética em torno de 54,4 emu/g e teor de ferro igual a
49,80 %. O comportamento magnético das partículas sintetizadas foi
comprovado através da indução do posicionamento das mesmas na direção de
um campo magnético externo.
5.2 Extração do óleo
O óleo total proveniente do processo de extração apresentou coloração
amarelada conforme pode ser observado na figura 20 e odor característico de
material oleoso, com rendimento de 58,2% obtido a partir de 350 g de
sementes trituradas e a densidade encontrada foi de 0,93 g/mL, determinada
por picnometria.
Figura 20. Óleo extraído das sementes da Aleurites moluccana.
60
5.3 Preparação das esferas magnéticas de alginato/cálcio com
derivados da quitosana
É bem conhecido, da literatura, que ao gotejar uma solução de alginato
numa solução contendo íons cálcio, ocorre imediatamente à formação de gotas
de alginato/cálcio, devido ao processo de reticulação do tipo “caixa-de-ovos”
(RUTH, 1999). Posteriormente, esta esferas são mantidas em contato com uma
solução de polímero (OC, OC-Bz e QTS-Bz) para formar uma camada devido
as interações eletrostáticas entre os grupos -OOC-R do alginato e R-NH3+ dos
derivados. Finalmente o contato com uma solução de glutaraldeido induz o
endurecimento da camada externa devido à reação de reticulação entre os
grupos -NH2 e as carbonilas do aldeído (reação de formação de base de Schiff)
(CHAND et al, 2009; SATYARTHI, SRINIVAS, RATNASAMY, 2009).
Todas as esferas preparadas apresentaram forma arredondada, e
superfície lisa, a coloração levemente amarela, muda para preto dependendo
da quantidade de material magnético no seu interior, Figura 21. O diâmetro
médio das esferas foi de 2,3 ± 0,2 mm não sendo dependente do polímero que
a recobria nem do conteúdo de material magnético. As esferas secas
apresentaram forma levemente achatada com diâmetro médio de 0,75 ± 0,12
mm.
Figura 21. Esferas magnéticas de QTS-Bz 500.
A capacidade de intumescimento das esferas foi determinada pela
quantidade de água aprisionada durante o processo de formação das esferas.
61
Na Tabela 1 são mostrados os valores da quantidade de água e porcentagem
de intumescimento, obtida através da quantificação da massa das esferas
antes e depois do processo de secagem.
Tabela 1: Quantidade de água e percentagem de intumescimento das esferas
com diferentes polímeros.
Esfera * Peso da capsulas
úmidas (g)
Peso da capsulas
secas (g)
% de
intumescimento
OC 250 0,3792 0,0152 96,1
OC 500 0,8658 0,061 93,2
QTS-Bz 250 2,3955 0,0811 96,6
QTS-Bz 500 2,1485 0,0628 97,0
OC-Bz 250 2,1082 0,0683 96,7
OC-Bz 500 2,5170 0,1590 93,7
QTS-Bz 2,4570 0,09189 96,0
QTS-Bz 250
s/enzima
2,1070 0,0541 97,6
* As letras se referem ao tipo de polímero e os números á quantidade de material magnético.
Os resultados mostram que a quantidade de água incorporada pelas
cápsulas não muda com o tipo de polímero, quantidade de material magnético
ou presença de enzima. A quantidade de água encontrada, neste trabalho está
muito próxima daqueles relatados na literatura (JEGANNATHAN, CHAN,
RAVINDRA, 2009).
A eficiência de imobilização da lípase nas esferas foi monitorada através
da quantificação de proteína no meio reacional após a separação das esferas.
A quantidade de proteína encontrada no material enzimático foi de 1,46 g/L.
Em todos os casos não foi identificada proteína livre, no meio, após o
processo de imobilização. Portanto conclui-se que a lipase inicialmente
adicionada na solução de alginato ficou imobilizada nas esferas. Este processo
é o resultado do próprio aprisionamento durante a formação da esfera ou
durante a etapa de reticulação com o glutaraldeído (reação entre os grupos
NH2 da proteína, do polímero e carbonilas do aldeído). Este segundo processo
62
é muito utilizado para imobilizar enzimas em suportes contendo grupos NH2
(CHAND et al, 2009; SATYARTHI, SRINIVAS, RATNASAMY, 2009).
Outra possibilidade de imobilização da lípase são as interações não
especificas entre a proteína e os polímeros, tais como interações hidrofóbicas
(parte hidrofóbica da proteína e os grupos aromáticos) e eletrostáticas (grupos
que são protonados NH2 ou –COOH tanto dos polimeros quanto da proteína).
A eficiência na imobilização, neste sistema, é muito maior quando
comparado com dados sobre a imobilização da lípase em esferas k-
carragenina (42 %) (JEGANNATHAN, CHAN, RAVINDRA, 2009), em esferas
de estireno/divinilbenzeno (36,8 %) (YÜCEL et al, 2011).
5.4 Reação de esterificação com ácido láurico
A taxa de conversão do ácido láurico em éster está associada a diversos
fatores que incluem o tempo de reação, a quantidade de catalisador
empregado, o tipo de álcool, o solvente utilizado, o modo de armazenamento
do catalisador, temperatura; os quais tem influência no curso da esterificação.
Estes efeitos foram estudados e os resultados são mostrados abaixo
5.4.1 Efeito do tipo de biocatalisador
As esferas contendo a lípase foram recobertas com três tipos de
polímeros, um com característica hidrofílica (O-carboximetilquitosana), outro
com característica hidrofóbica (N-benzilquitosana) e finalmente um com
característica anfifilica (O-carboximetilquitosana-N-benzilada). Também foram
preparadas esferas contendo diferentes quantidades de material magnético. A
presença deste material está associada á facilidade de remoção do meio
reacional utilizando um separador magnético como pode ser visualizado na
figura 22. Entretanto a sua presença não pode reduzir a atividade enzimática
ou desativar totalmente. Normalmente a reação de esterificação catalisada pela
enzima depende da quantidade de água presente no meio reacional, neste
estudo, a água não foi adicionada ao meio, uma vez que há quantidade
suficiente de água no sistema.
63
Figura 22. Efeito magnético das esferas com derivados da quitosana.
Neste experimento a quantidade de esferas foi mantida constante em
2,0 g o que corresponde a aproximadamente 125 µL de lípase ou 180 µg de
proteína.
Para avaliar o efeito do tipo de polímero e da quantidade de material
magnético, utilizou-se a reação de esterificação clássica empregando o ácido
láurico e o álcool butílico (R1), com algumas modificações descritas na
metodologia (ZAIDAN et al., 2010).
Lipase CH3(CH2)10COOH + CH3CH2CH2CH2OH � CH3(CH2)10COOCH2CH2CH2CH3 + H2O (R1)
Na Tabela 2 são mostradas as taxas de conversão do ácido láurico
empregando os diferentes biocatalisadores. Pode ser observado que as
esferas preparadas com a OC não produziram o éster, mostrando que o
processo de preparação das esferas resultou na desativação da lipase, uma
vez que, como mencionado acima não foi detectado proteína livre no meio
reacional. No caso da OC o polímero apresenta em sua estrutura grupos NH2
livre e COOH que podem estar interagindo com os grupos NH2 e COOH da
proteína, comprometendo o sítio ativo, a desativação de enzima através de
interações eletrostática tem sido documentada na literatura (CHAND et al,
2009; SATYARTHI, SRINIVAS, RATNASAMY, 2009). A partir destas
observações, as esferas preparadas com a OC foram descartadas do restante
do trabalho.
64
As esferas preparadas com o polímero hidrofóbico apresentaram taxa de
conversão bem superior àqueles preparados com polímero anfifílico. A
presença do anel aromático protege os sítios ativo da enzima, melhorando a
taxa de conversão. A lipase imobilizada está na sua forma “aberta” e é
estabilizada pelos grupos hidrofóbicos. A proteção da atividade enzimática de
lipase imobilizada em suportes hidrofóbicos é descrita na literatura (CHEN et al,
2012; JIANG et al, 2009).
As esferas preparadas com OC-BZ (anfifílico) apresentaram atividade,
entretanto, a taxa de conversão foi inferior às esferas preparadas com QTS-Bz.
A presença dos grupos carboximetil provavelmente interage com algum sitio
ativo da lipase, mas a presença dos grupos aromáticos também, de certa forma
protege a enzima. Este comportamento pode ser atribuído a heterogeneidade
do polímero que pode apresentar regiões hidrofóbicas e hidrofílicas distribuídas
de forma aleatória em sua estrutura.
Os dados da Tabela 2 também mostram que a presença do material
magnético tem grande influência na taxa de conversão, isto pode ser
observado quando os valores são comparados com aqueles obtidos para as
esferas sem o material. Como foi mencionado anteriormente, a intenção da
adição era somente para melhorar o processo de separação da enzima
imobilizada, do meio reacional. Entretanto a presença do material magnético
melhorou muito o desempenho do biocatalisador quando comparado com
aquele sem este material, cuja taxa de conversão foi de apenas 17 % nas
mesmas condições reacionais em 72 h de reação.
Não foi obervado uma tendência para os resultados, no caso do QTS-Bz
ocorre uma relação direta entre a taxa de conversão. No caso da OC-Bz foi
observado o comportamento oposto sendo que após 72 h a taxa de conversão
diminui aproximadamente 50 % quando OC-Bz 500 foi utilizada. Uma provável
explicação pode ser a interação entre o material magnético e os polímeros
utilizados na preparação das esferas, permitindo que a lipase permaneça na
forma mais ativa, sendo apenas confinada nestas esferas, sem
comprometimento dos sítios ativos.
Para esclarecer se o material magnético apresentava atividade catalítica,
um experimento foi conduzido empregando esferas preparadas com QTS-Bz
250 sem a lipase, nas mesmas condições. Os resultados obtidos mostraram
65
que o material magnético não tem a capacidade de catalisar a esterificação do
ácido láurico na ausência da enzima.
Como esperado, a taxa de conversão apresentada pela enzima livre é
muito superior àqueles preparados com a enzima imobilizada. O processo de
imobilização, seja ele qual for, provoca alteração no comportamento catalítico
das enzimas, podendo ser devido a bloqueio ou comprometimento dos sítios
ativos ou mudanças na conformação da enzima.
De acordo com as informações mostradas na revisão bibliográfica, a
dificuldade da utilização da lipase livre está relacionada principalmente com o
elevado custo, portanto a sua remoção, recuperação e reutilização quando está
no meio reacional são condições essenciais para o emprego na síntese de
ésteres de cadeia longa em grande escala. Desta forma a relação custo
beneficio entre taxa de conversão e reutilização deve ser levada em conta no
processo.
Tabela 2: Efeito do biocatalisador sobre a taxa de conversão (%) de
esterificação do ácido láurico. (Condições da reação: 2 g de esferas, 0,2 g de
ácido láurico, 0,074 mL de álcool butílico em 30 mL de hexano, temperatura 25
° C).
Tempo de reação (horas)
Esferas 24 48 72 144
Lipase livre 83,1% 96,7% 98,5% *
QTS-Bz NR 7% 17% 24% 1
OC 250 NR NR NR NR
OC 500 NR NR NR NR
QTS-Bz 250 35,2% 86,0% 92,6% 92,6%
QTS-Bz 250 sem
enzima NR NR NR NR
QTS-Bz 500 44,5% 50% 55,6% 51,9%
OC-Bz 250 16,7% 20,4% 35,2% 70,4%
OC-Bz 500 21,3% 38,9% 50% 68,6%
* - dados não coletados; NR - onde não houve conversão do ácido; 1- 96 hrs.
66
A esterificação, assim como a transesterificação são reações reversíveis
e a taxa de reação aumenta inversamente com a acumulação dos produtos
formados. Dessa forma a taxa de conversão obtida deve diminuir com o passar
do tempo, apesar de poder ser prolongada com o objetivo de se obter a
conversão completa do ácido em éster (GANESAN; RAJENDRAN;
THANGAVELU, 2009).
Os dados fornecidos pela Tabela 2 também estão relacionados com a
taxa de conversão em função do tempo reação. Para as esferas preparadas
com QTS-Bz a conversão máxima ocorre após 72 h sendo que em 48 h é
atingido 80 % da conversão máxima, independentemente da quantidade de
partículas magnéticas. Para a QTS-Bz sem material magnético o éster foi
detectado apenas após 48 h (segunda análise) e atinge a conversão máxima
no último período analisado. No caso da OC-Bz a taxa de conversão vai
aumentando com o tempo de reação, também atinge a conversão máxima
após 144 h, tempo limite do estudo. Na maioria dos dados da literatura o tempo
de aumento no tempo de contato entre o biocatalisador e o meio reacional tem
como resultado o aumento na taxa de conversão dos ácidos de cadeia longa
(CHAND et al, 2009; SATYARTHI, SRINIVAS, RATNASAMY, 2009).
Durante o tempo de estudo, não foi obervado a reversão da reação de
esterificação (hidrólise do éster) apenas com a QTS-Bz 500 foi encontrado uma
taxa de conversão um pouco abaixo após 144 h quando comparado com a taxa
máxima obtida.
5.4.2 Efeito do processo de armazenamento das esferas na reação de
esterificação do ácido láurico.
O processo de armazenamento geralmente tem efeito sobre a atividade
catalítica das enzimas imobilizadas. Nesta etapa do trabalho, as esferas
contendo lipase foram congeladas à -6 °C e armazenadas durante 24 h.
Posteriormente as esferas foram descongelas e utilizadas nas reações de
esterificação, empregando as mesmas condições utilizadas para as esferas
armazenadas no refrigerador. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
67
Tabela 3: Efeito do processo de armazenamento das esferas (congelamento)
sobre a taxa de conversão (%) de esterificação do ácido láurico. (Condições da
reação: 2 g de esferas, 0,2 g de ácido láurico, 0,074 mL de álcool butílico em
30 mL de hexano, temperatura 25 ° C).
Tempo de reação (horas)
Esferas Congeladas 24 48 72 144
QTS-Bz 250 12,1% * 46,3% 51,9%
QTS-Bz 500 NR * 38,9% 57,5%
OC-Bz 250 7,5% * 42,6% 55,6%
OC-Bz 500 26% * 57,5% 63%
* - dados não coletados; NR - onde não houve conversão do ácido
A taxa de conversão foi bem menor, para todas as esferas, quando
comparado com o experimento utilizando as esferas armazenadas no
refrigerador. Este comportamento se mantém mesmo quando os experimentos
são estendidos para 144 hrs. A presença de água no interior das esferas é
fundamental para a atividade da lipase (JIKE et al, 2008), o processo de
congelamento altera este ambiente, com provável expulsão da água para o
exterior das esferas.
Outra série de experimentos foi realizada com capsulas desidratadas, o
processo de desidratação foi conduzido mantendo as esferas em refrigerador,
mas sem proteção durante 48 hrs. Os resultados mostraram que após o
processo e desidratação todas as esferas perderam a atividade, não sendo
observada nenhuma conversão do ácido láurico. Portanto para o restante dos
experimentos foram utilizadas esferas armazenadas no refrigerador.
Outro experimento relacionado com o processo de armazenamento foi
conduzido para determinar a estabilidade dos biocatalisadores. As esferas
foram mantidas, no meio reacional, em refrigerador a 4°C durante 7 meses,
sendo em seguida utilizadas na reação de esterificação, empregado o método
padrão. Os resultados mostraram que a taxa de conversão diminui em torno de
42 % quando comparada com a taxa inicial, entretanto esta redução está
dentro dos valores normalmente encontrados na literatura (MICHAUX et al,
2010.)
68
5.4.3 Efeito da quantidade de esferas
Neste experimento a quantidade de esferas foi modificada para avaliar o
seu efeito sobre a taxa de conversão do ácido láurico. Foram escolhidas
quantidades de esferas inferiores àquelas empregadas na primeira etapa do
trabalho. Sistemas reacionais preparados com diferentes quantidades de
esferas (0,10, 0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 g) foram mantidos nas mesmas condições
anteriores, fixando o tempo máximo de reação em 72 horas.
Os resultados do efeito da quantidade de biocatalisador na taxa de
conversão são mostrados na Tabela 4. Como pode ser observada, a
quantidade de esferas, de lipase imobilizada, tem influência da taxa de
conversão. Em quase todos os sistemas estudados, a redução na quantidade
de esferas provocou a diminuição da taxa de conversão, sendo que para
quantidades muito pequenas de esferas não ocorreu nenhuma reação.
Vários estudos mostram que o aumento na quantidade de enzima
durante o processo de imobilização ou o aumento da quantidade de
biocatalisador no sistema reacional provoca o acréscimo na taxa de conversão
ou na atividade enzimática. Também são relatadas situações na qual ocorre
uma saturação do sistema, ou seja, todo o substrato está ligado no sitio
enzimático (KARRA-CHÂABOUNIA et al, 2008) neste trabalho esta situação
não foi observada, pois foi adotado 2,0 g de esferas como limite.
Também de acordo com a literatura a quantidade de enzima tem
influência no tempo necessário para atingir a máxima taxa de conversão
(RONDHANE et al, 2011). Este comportamento é mais visível para as esferas
de QTS-Bz 250 que atinge 74 % da máxima taxa de conversão em 72 hrs para
1,0 g de as esferas e 92,6 % para 2,0 g de esferas, contudo este
comportamento é observado para as outras esferas.
Como a redução na quantidade de esferas diminui muito a atividade da
lipase foi mantida a quantidade de 2,0 g de esferas para o restante do trabalho.
69
Tabela 4: Efeito da quantidade de biocatalisador sobre a taxa de conversão
(%) do ácido láurico (Condições da reação: 0,2 g de ácido láurico, 0,074 mL de
álcool butílico em 30 mL de hexano, temperatura 25 ° C).
QTS-Bz 250
Tempo de reação (horas)
Quantidade de esferas (g) 24 48 72
0,10 NR * *
0,25 NR * *
0,50 7% * *
1,00 7% 51% 74%
2,00 35,2% 86% 92,6%
QTS-Bz 500
0,10 19% * *
0,25 NR * *
0,50 7% * *
1,00 7% 54% 64%
2,00 44,5% 50% 55,6%
OC-Bz 250
0,10 13% * *
0,25 11% * *
0,50 13% * *
1,00 13% 20% 14%
2,00 16,7% 20,4% 35,2%
OC-Bz 500
0,10 13% * *
0,25 11% * *
0,50 13% * *
1,00 13% 20% 14%
2,00 21,3% 38,9% 50%
(* - dados não coletados) (NR - onde não houve conversão do ácido)
70
5.4.4 Efeito da temperatura de reação
O efeito da temperatura sobre a taxa de conversão do ácido láurico nos
diferentes biocatalisadores foi avaliado na faixa de 25-55 °C, utilizando o álcool
butílico como substrato. Os dados são mostrados na Tabela 5, e o
comportamento variou muito dependendo do tipo de esfera utilizada.
De modo geral, o aumento da temperatura acima de 35 °C provoca uma
redução na taxa de conversão do ácido láurico. Os resultados mostraram que
dependendo da esfera utilizada, o aumento da temperatura do meio para 55 °C
pode provocar uma redução de até 58 % na taxa de conversão máxima,
considerando 72 h de reação, como, por exemplo, o QTS-Bz 250. Estes
resultados estão de acordo com a literatura mostrando que a temperatura ótima
para a atividade catalítica da lipase livre, fica em torno de 35-37 °C (KARRA-
CHÂABOUNIA et al, 2008).
Alguns autores mostram também que existe a possibilidade do processo
de imobilização aumentar a estabilidade térmica da lipase, protegendo a
enzima da degradação térmica devido as restrições na conformação tornando-
a mais rígida, aumentando, desta forma, o número de sítios ativos (KHARRAT
et al, 2011; RONDHANE et al, 2011).
Entretanto, neste trabalho não foram observadas diferenças nos valores
da taxa de conversão para a enzima livre, com o aumento da temperatura. O
aumento da temperatura, os experimentos conduzidos a 35 ° tiveram uma taxa
de conversão de 83,1 % em 24 h de reação, quando a temperatura foi mantida
em 55° a taxa de conversão ficou em 82,1 % no mesmo tempo de reação.
No presente estudo, pode ser observado que nas esferas contendo 500
mg de material magnético a taxa de conversão foi alterada apenas levemente
quando a temperatura do meio aumentou para 45 °C. Este comportamento é
muito importante para a aplicação dos biocatalisadores na síntese de biodiesel
utilizado como substrato óleos de cozinha reciclado ou de oleaginosa, pois o
aumento da temperatura diminui a viscosidade do óleo favorecendo a reação.
O aumento da temperatura, do meio reacional, acima de 50 °C deve ser
evitado, principalmente em reações contendo solventes, pois ocorre a
evaporação do solvente (DALLA-VECCHIA et al, 2005).
71
Tabela 5: Efeito da temperatura do meio reacional sobre a taxa de conversão
(%) do ácido láurico (Condições da reação: 2 g de esferas, 0,2 g de ácido
láurico, 0,074 mL de álcool butílico em 30 mL de hexano).
QTS-Bz 250
Tempo de Reação (hs)
Temperatura (°C) 24 48 72 96 144
25 35% 86% 92% * 92%
35 37% 40% 56% * *
45 56% 45% 54% 49% *
55 13% 22% NR * *
QT-Bz 500
25 44% 50% 55% * 52%
35 24% 37% 37% * *
45 40% 43% 54% 67% *
55 16% 16% 16% * *
OC-Bz 250
25 17% 20% 35% * 70%
35 32% 46% 46% * *
45 20% 7% 31% 30% *
55 NR NR NR * *
OC-Bz 500
25 21% 39% 50% * 68%
35 62% 73% 70% * *
45 51% 52% 67% 64% *
55 21% 16% 25% * *
Lipase livre
35 83,1% 96,7% 98,2% * *
55 82,1% * * * *
(* - dados não coletados) (NR - onde não houve conversão do ácido)
5.4.5 Efeito do tipo de álcool
O efeito do tipo de álcool (comprimento da cadeia, primário, secundário,
terciário, linear ou ramificado, aromático) sobre a taxa de conversão do ácido
72
láurico, foi avaliado, em todos os casos a relação estequiométrica mostrada na
R1 foi obedecida. Foram utilizadas as esferas QTS-Bz 500 mg, QTS-Bz 250 e
OC-Bz 500 e os resultados da taxa de conversão são mostrados nas Tabelas
6 e 7.
Tabela 6: Efeito do álcool sobre a taxa de conversão (%) do ácido láurico, a quantidade de álcool equivale 1,0 mmol (Condições da reação: 2 g de esferas, 0,2 g de ácido láurico, 30 mL de hexano, temperatura 25 ° C).
QTS-Bz 500
Tempo de reação (horas)
Álcool 24 48 72
metílico 6,9% * 12,8%
etílico 22,8% * 60%
propílico 45,5% 66% 71,9%
isopropílico 13,7% 9,1% 3,7%
butílico 63,7% * 78,2%
isobutílico 50,0% 75,0% 81,9%
t-butílico NR NR NR
amílico 29,6% 29,6% 50%
hexanol 31,9% 52,3% 63,7%
ciclo hexanol 4,6% * 9,1%
benzílico 70,5% * 80%
octanol 22,8% 27,3% 49,1%
esteárico 66% * 92,8%
QTS-BZ 250
Álcool 24 48 72
n-propílico 39,9% 51,9% 59,3%
n-butílico 20,4% 37,1% 50,1%
esteárico 16,7% 11,2% 11,2%
(* - dados não coletados) (NR - onde não houve conversão do ácido)
Para os alcoóis de cadeia linear, os resultados mostram que o
comprimento da cadeia tem influência na taxa de conversão, sendo menor para
o metanol, considerando a análise após 24 h.
73
A taxa de conversão vai aumentando à medida que o número de
carbonos na cadeia aumenta, sendo maior taxa de conversão foi atingida com
álcool butílico diminuindo a partir de álcoois com 5 carbonos, com exceção do
álcool esteárico que apresentou taxa de conversão máxima de 92,8% com as
esferas de QTS-Bz 500 e atividade reduzido para as esferas QTS-Bz 250 e
OC-Bz 500. Este comportamento pode ser atribuído à partição do álcool entre a
fase orgânica (hexano) e o meio contendo a enzima. A presença dos grupos
hidrofóbicos nas esferas distribui igualmente o álcool nos dois ambientes. Este
resultado fica mais evidente para álcool benzílico. Resultados semelhantes
foram relatados na literatura (ZHOU et al, 2001).
Por outro lado, o aumento da cadeia diminui a intensidade do ataque
nucleofílico do álcool diminuído a sua reatividade, e tendo como consequência
a diminuição da taxa de conversão (ZAIDI et al 2002).
A taxa de conversão também depende da estrutura do álcool. Quando
são comparados os valores da taxa de conversão dos alcoóis primário com
secundário ou terciário observa-se uma redução nos valores, isto é atribuído ao
impedimento estérico (BRUNO et al, 2004). Para o álcool t-butílico não foi
observado a formação do éster em nenhum dos sistemas estudados.
Para avaliar e efeito no tipo de álcool com a quantidade de material
magnético, foram realizados experimentos utilizando como substrato apenas
alcoóis primário com diferentes números de carbonos e a QTS-Bz 250. Os
resultados mostraram que os valores das taxas de conversão seguem o
mesmo comportamento daquelas observada anteriormente sendo
consideravelmente menores quando comparadas com os valores da QTS-Bz
500.
A comparação entre os tipos de polímeros e os alcoóis empregados
como substrato, foram avaliados utilizando esferas de OC-Bz 500, os dados
são mostrados na Tabela 7. Também neste caso foi observado o mesmo
comportamento, apenas os valores das taxas de conversão são menores
quando comparados com aqueles observados para a QTS-Bz 500.
74
Tabela 7: Efeito do álcool sobre a taxa de conversão (%) do ácido láurico, a
quantidade de álcool equivale 1,0 mmol (Condições da reação: 2 g de esferas,
0,2 g de ácido láurico, 0,074 mL de álcool butílico em 30 mL de hexano,
temperatura 25 ° C).
OC-Bz 500
Tempo de reação (horas)
Álcool 24 48 72
metílico 21,3% * NR
etílico 12,1% * NR
propílico 35,2% 58,4% 51,9%
isopropílico 12,1% 21,3% 9,3%
butílico 53,8% * 85,2%
isobutílico 53,8% 63,2% 59,3%
t-butílico NR NR NR
amílico 21,3% 63% 37,1%
hexanol 16,7% 39,9% 27,8%
ciclo hexanol 12,1% * NR
benzílico 35,2% * 26%
octanol 21,3% 21,3% 14,9%
esteárico 21,3% * NR
(* - dados não coletados; NR - onde não houve conversão do ácido)
5.4.6 Efeito do solvente
O uso de enzimas em meio orgânico é de grande interesse uma vez que
permite fazer reações de esterificação que são muito difíceis de ocorrer em
meio aquoso devido a reação de hidrólise que geralmente ocorre. Contudo, é
sabido que a atividade da lipase depende muito do solvente escolhido para o
meio reacional, pois pode provocar a desnaturação da enzima, mudar a
conformação pelo rompimento de ligações de hidrogênio e interações
hidrofóbicas, tendo como resultado a diminuição a sua atividade ou a
desativação completa (KHARRAT et al, 2011).
75
Para avaliar o efeito do solvente na taxa de conversão do ácido láurico
as reações de esterificação foram conduzidas em diferentes solventes,
empregando como substrato o álcool butílico, temperatura 35 °C.
Tabela 8: Efeito do tipo solvente utilizado na reação de esterificação sobre a
taxa de conversão (%) do ácido láurico (Condições da reação: 2 g de esferas,
0,2 g de ácido láurico, 0,074 mL de álcool butílico, temperatura 25 ° C).
QTS-Bz 500
Tempo de reação (horas)
Solvente 24 48 72 144
hexano 44,5% 50% 55,6% 51,9%
tolueno 7,5% 2,8% NR 16,7%
ciclohexano 53,8% 81,5% 81,5% 79,7%
diclorometano NR NR NR NR
QTS-Bz 250
hexano 16,7% 20,4% 35,2% 70,4%
tolueno NR NR NR NR
ciclohexano NR 2,8% 13% 27,6%
diclorometano NR NR NR NR
OC-Bz 500
hexano 21,3% 38,9% 50% 68,6%
tolueno NR * 74,1% 2,8%
ciclohexano 39,9% * 55,6% 61,2%
diclorometano NR * 55,6% NR
(* - dados não coletados; NR - onde não houve conversão do ácido)
De acordo com a literatura solventes com log P<2,0 promovem a reação
com pequenas taxa de conversão, por outro lado log P>3,0 apresentam
elevada taxa de conversão (DALLA-VECCHIA et al 2005; JIKE et al, 2008).
Este comportamento pode ser atribuído ao fato de que solventes muito polares
podem reduzir a quantidade de água ligada ao sitio ativo da lipase diminuindo a
76
sua atividade catalítica. Por outro lado solventes apolares aumentam a
solubilidade o substrato favorecendo a reação (SHU et al, 2006).
Os solventes empregados neste estudo apresentaram valores de log P
hexano (3,5), cilcohexano (3,2) tolueno (2,5) e diclorometano (1,5). Os
resultados da taxa de conversão são mostrados na Tabela 8. O comportamento
relacionado com a taxa de conversão encontrados neste trabalho está de
acordo com a literatura. Como esperado os valores das taxas de conversão
para o tolueno e diclorometano foram menores quando comparado com hexano
e ciclohexano.
5.4.7 Reutilização do biocatalisador
Do ponto de vista econômico, a reutilização dos catalisadores é
fundamental quando se pretende aplicar a produção de ésteres em grande
escala. No caso de biocatalisadores esta etapa é crucial devido ao elevado
custo das enzimas. Para testar a possibilidade de reutilização das esferas
contendo lipase foram realizados 13 ciclos de síntese do éster e lavagem das
esferas com hexano. Em todas as etapas foram empregadas as mesmas
condições reacionais empregadas nos estudos prévios, como substrato foi
escolhido a álcool butílico e as esferas de OC-Bz 500, os experimentos foram
conduzidos a 35 °C, o tempo de reação foi fixado em 24 h.
Na Figura 23 são mostrados os valores da taxa de conversão em função
do número de ciclos síntese/purificação, e como pode ser observado não há
diferença nas taxas de conversão da primeira etapa em torno de 65 % e da
décima terceira etapa.
Estes resultados mostram que as esferas podem ser reutilizadas sem
perder a atividade catalítica, ou seja, a lipase está confinada nas esferas e não
é liberada para o meio reacional durante a reação ou durante o processo de
remoção e purificação. Portanto, esta é a principal vantagem quando
comparada com a enzima livre (83 %), que apesar de apresentar maior taxa de
conversão não pode ser reutilizada.
77
Figura 23. Gráfico dos ciclos de reutilização do biocatalisador com OC-Bz 500.
Os resultados encontrados neste trabalho estão de acordo com dados
da literatura. Li Chen e Tan (2011) relatam comportamento semelhante quando
a manutenção da atividade catalítica de lipase imobilizada em membranas. Em
alguns casos são superiores, quando comparado com aqueles descritos na
literatura para reações de esterificação, utilizado lipase imobilizada, como por
exemplo, em suportes sintéticos, com decréscimo de até 96 % após cinco
ciclos, quando comparado com a atividade inicial (GUILLÉN, BENAIGES,
VALERO, 2012).
5.5 Produção de ésteres de cadeia longa
A atividade das esferas magnéticas contendo lipase, em relação a
produção de ésteres de cadeia longa (biodiesel), foi testada monitorando a
reação de esterificação do óleo de Aleurites moluccana com metanol em
sistema livre de solvente. Foram escolhidas as esferas que apresentaram
melhores resultados nas reações de esterificação do ácido láurico (QTS-Bz 250
e OC-Bz 500) também foram realizados experimentos com a QTS-Bz sem ferro
e enzima livre.
78
As reações foram conduzidas de acordo com a literatura (YANG, SOHN,
KIM, 2009), a razão molar metanol:óleo foi mantida constante em 1:10 e a
quantidade de esferas utilizadas foi de 2,0 g, tempo de reação 72 hrs e
temperatura de 35°C. O processo de adição do metanol foi modificado, sem
que em uma série a quantidade de metanol equivalente foi adicionada em uma
única etapa e em outra série a quantidade foi adicionada em três etapas uma a
cada 12 hrs. A reação de esterificação foi monitorada através de CCD e o
rendimento da reação foi calculado a partir dos dados de RMN (CHAND et al,
2009).
Na Figura 24 é mostrada uma placa de CCD para a reação de
esterificação do óleo de A. mollucana e do meio reacional após 24 horas. A
presença do éster pode ser observado na placa pela marca marrom com o Rf
de aproximadamente 0,75 cm acima da mancha atribuída ao óleo que
apresenta Rf de aproximadamente 0,58 cm.
Figura 24. Placa de CCD da reação de transesterificação com óleo da Aleurites
moluccana, utilizando hexano:acetona:ácido acético (95:5:0,05) como fase móvel e
ácido sulfúrico 10% como revelador.
O espectro de RNM 1H para uma amostra do produto da reação (figura
25) apresentou picos característicos sendo que a região entre 0,88 e 1,00 ppm
representa os hidrogênios referentes aos grupos metílicos terminais; entre 1,25
e 1,30 ppm aos hidrogênios ligados aos carbonos da cadeia principal; entre
2,28 e 2,33 ppm aos hidrogênios do grupo α-metileno do éster e em 3,66 ppm
referente aos hidrogênios do grupo metoxi nos éteres metílicos de ácido graxos
formados (SATYARTHI, SRINIVAS, RATNASAMY, 2009).
79
Figura 25. Espectro de RMN 1H do éster em D2O/CD3COOD à temperatura ambiente.
Os sinais relevantes escolhidos para o cálculo da taxa de esterificação do
óleo foram o singleto dos grupos metoxi em 3,66 ppm e o tripleto entre 2,28 e
2,33 referente aos prótons do grupo α-metileno presentes em todos os
derivados de triglicerídeos. A conversão foi calculada diretamente a partir das
áreas integradas desses dois sinais aplicando a equação 6 de conversão
(CHAND et al, 2009; SATYARTHI, SRINIVAS, RATNASAMY, 2009).
A taxa de esterificação do óleo a A. mollucana em relação às esferas
utilizadas são mostradas na Tabela 9. Os valores mostram que a taxa da
conversão da enzima livre é superior àquelas obtidas para a lipase imobilizada,
este comportamento segue aquele observado para a esterificação do ácido
láurico.
80
Tabela 9: Efeito da adição do álcool em uma única etapa e em três etapas na
reação de transesterificação sobre a taxa de conversão (%) do óleo (Condições
da reação: 2 g de esferas, 5,0 g de óleo, 0,500 mL ou 3 x 0,150 mL de álcool
metílico em 30 mL de hexano, temperatura 35 ° C).
Adição de metanol
Esferas Única etapa Três etapas
QTS-Bz 250 17,9% 38,0%
QTS-Bz NR 9,0%
OC-Bz 500 54,0% 45,2%
Enzima livre 59,5% 62,2%
Óleo de cozinha usado (QTS-Bz 250) 11,2% *
Óleo de cozinha usado (OC-Bz 500) 7,5% *
Óleo de oliva (QTS-Bz 250) 2,8% *
(* - dados não coletados; NR - onde não houve conversão do ácido)
Quando são comparadas as diferentes esferas, contendo o material
magnético a taxa de conversão comporta-se de maneira diferente. Para a
esterificação do óleo, o valor máximo de conversão, considerando uma única
etapa de adição do metanol, e 72 h de reação, foi obtido para a OC-Bz 500,
comportamento contrário ao observado para a esterificação do ácido láurico,
cujo maior taxa de conversão foi obtida com a QTS-Bz 250. A diferença pode
estar relacionada com a mudança do substrato, os ácidos graxos presentes no
óleo são de cadeia longa ou a ausência do solvente.
Também na esterificação do óleo, as esferas preparadas sem o material
magnético não apresentaram a taxa de conversão estando de acordo com o
comportamento observado para a esterificação do ácido láurico.
A adição do metanol em três etapas provocou alteração significativa nos
valore da taxa de conversão para as esferas utilizadas. De acordo com a
literatura um dos fatores limitantes da reação de esterificação de ácidos graxos
de cadeia longa é falta de solubilidade dos dois substratos, no presente caso o
metanol é pouco solúvel no óleo, resultando numa interface que dificulta o
processo de síntese, (GAGNON, VASUDEVAN, 2011) ou pode inibir a
atividade da lipase (JIKE et al, 2008).
81
Portanto uma das maneiras de evitar tal problema é a adição de álcool
em etapas, evitando o excesso momentâneo do álcool. Os resultados
mostrados na Tabela 9 estão de acordo com o que é relatado. Alguns estudos
mostram o efeito da adição do metanol no processo de produção do biodiesel
como, por exemplo, o aumento na conversão de 46 % par 84 % de rendimento
utilizando uma e três etapas de adição do metanol empregando lipase
imobilizadas em fibra têxtil (JIKE et al, 2008). Outro exemplo é o aumento na
taxa de conversão de óleo de cozinha reciclado e óleo de oliva empregando
enzima livre e enzima imobilizada, neste caso o efeito foi do número de etapas
de adição do metanol foi mais pronunciada nas enzimas imobilizadas, com
aumento de até 80 % na taxa de conversão quando três etapas foram
empregadas (YANG, SOHN, KIM, 2009). No presente estudo este
comportamento também foi observado uma vez que para a enzima livre as
taxas de conversão ficaram em 59,5 e 65,3 % para a adição do metanol em
uma e três etapas respectivamente.
Os dados de conversão encontrados nos experimento, após 72 h de
reação, quando esferas contendo material magnético, na faixa de 38 % - 45%
aparentemente são baixo quando comparados com a literatura em geral.
Entretanto, numa análise mais detalhada, no qual a taxa de conversão é
relacionada com a quantidade de proteína utilizada para a conversão do óleo, a
comparação com dados da literatura mostram que o biocatalisador apresenta
eficiência semelhante.
As esferas utilizadas contêm aproximadamente 180 µg de proteína e a
relação enzima imobilizada/óleo é de 36 µg/g com taxa de conversão entre 38 -
45%. Recentemente foi publicado um trabalho no qual a relação proteína/óleo
variou de 450 µg/g á 1000 µg/g e a taxa de conversão obtida variou de 80-100
% (MENDES et al, 2012). Em outro estudo a lipase imobilizada em um sistema
gel-sol é utilizada na relação enzima imobilizada/óleo de 550 µg/g resultando
numa taxa de conversão de 40% (MEUNIER, LEGGE, 2012). Quando a lipase
foi imobilizada em gel de quitosana-alginato a taxa de conversão ficou próximo
de 80 % para uma relação proteína imobilizada/óleo de 183 µg/g, (MENDES et
al, 2010).
A taxa de conversão do óleo encontrada neste trabalho é de 175 (mg de
óleo/mg de proteína imobilizada) para as esferas de OC-Bz 250, bem
82
próxima daquelas encontradas para a síntese do biodiesel a partir do óleo de
babaçu utilizando lipase imobilizada em polihidroxibutirato, que ficou entre 110-
388 (mg de óleo/mg de proteína imobilizada) dependendo da lipase (MENDES
et al, 2012), para lipase imobilizada em sistemas sol-gel a taxa de conversão
foi 29-120 (mg de óleo/mg de proteína imobilizada) (MEUNIER, LEGGE, 2012)
ou para lipase imobilizada em gel de quitosana/alginato 51,7 (mg de óleo/mg
de proteína imobilizada) (MENDES et al, 2010).
Na tabela 9 também são mostrados os valores da taxa de conversão de
outros dois tipos de óleo (óleo de oliva extra-virgem e óleo de cozinha usado),
foram empregadas as mesmas condições de reação, sendo que o metanol foi
adicionado numa única etapa e empregando as esferas contendo o material
magnético. Como pode ser observada, a taxa de conversão do óleo da A.
moluccana é bem superior aquelas obtidas para os outro dois substrato. A
redução na taxa de conversão pode ser atribuída á diferença na composição do
óleo utilizado.
No caso da utilização do óleo de cozinha usado, a elevada acidez e a
presença de água foram indicados como fatores para a diminuição da taxa de
conversão (YANG, SOHN, KIM, 2009), Um alternativa para melhorar a
eficiência do catalisador, neste caso, e fazer um pré-tratamento do substrato,
entretanto deve ser levado em conta a relação custo-benefício para a obtenção
do biodiesel economicamente viável.
5.5.1 Reutilização das esferas
O estudo de reutilização das esferas, na reação de esterificação do óleo
da A. moluccana foi feito empregando as esferas OC-Bz 500, as mais
eficientes, empregando uma única etapa de adição do metanol e tempo de
reação de 24 h. A cada reação, as esferas foram removidas, com auxilio de um
imã, lavadas com hexano e novamente colocadas no meio reacional.
A taxa de conversão relativa foi calculada tendo como base a primeira
etapa. Os resultados mostram que ocorre uma perda da atividade das esferas
na primeira reutilização com relação aos experimentos realizados com 72 h de
reação. Entretanto nas outras duas etapas de reutilização ocorrem uma
alteração significativa, considerando Figura 26. Estes resultados mostraram
83
que as esferas podem ser reutilizadas sem perdas significativas da atividade
catalítica. São encontrados relatos na literatura uma de até 80 % na taxa de
esterificação de óleos (YÜCEL et al, 2011).
Figura 26. Gráfico dos ciclos de reutilização do biocatalisador com OC-Bz 500 na
reação de transesterificação do óleo da A. moluccana.
Segundo a literatura, normalmente a perda da atividade enzimática está
associada á liberação da enzima, ao bloqueio dos sítios de ativos da enzima
provocado pela produção de glicerol ou mudanças da conformação da lipase
(WENLEI, NING, 2010). No sistema utilizado neste estudo a lipase fica
confinada na esfera, portanto perda da enzima para o meio como motivo para a
redução da atividade foi descartada, a mudança conformacional da enzima
também pode ser descartada pelo mesmo motivo. Portanto a provável causa
da perda da atividade é o bloqueio dos sítios ativo da lipase.
84
6 CONCLUSÃO
A O-CMQTS apresentou grau de carboximetilação de 19,2 %, OC-Bz
apresentou grau de substituição de 78,0 % QTS-Bz apresentou grau de
substituição 71,2 %.
O material magnético apresentou comportamento magnético indicado
pela indução de um campo magnético externo.
As esferas contendo a lipase e partículas magnéticas apresentaram
diâmetro de 2,3 ± 0,2 mm, que manteve sua atividade enzimática e
propriedades magnéticas.
As esferas apresentaram taxa de conversão do ácido láurico (padrão)
em torno de 83,1 % em 24 hr e 98,5 %.
As esferas magnéticas sintetizadas com OC-Bz e QTS-Bz apresentaram
taxas de conversão máxima durante a reação de esterificação do ácido láurico
de 70,4 % e 92,6 %, respectivamente, independentemente da quantidade de
ferro empregada.
A taxa de conversão apresentou uma redução em relação à quantidade
de ésteres formados em temperatura superiores à 35 °C.
A maior taxa de conversão foi atingida com álcool butílico, 63,7 % e
benzílico, 70,5 %.
Os solventes com logP acima de 3,0 apresentaram maior taxa de
conversão, pois apresentam menos polaridade favorecendo a reação.
As esferas magnéticas OC-Bz 500 foram reutilizadas 13 vezes,
mantendo a taxa de conversão em torno de 60 % durante as repetições. Esses
resultados indicam que as esferas são eficientes e que podem ser reutilizadas
inúmeras vezes sem perder seu potencial catalítico, favorecendo o processo
economicamente.
O óleo da Aleurites moluccana, utilizado para a reação de
transesterificação, foi extraído e apresentou rendimento final de 52,8 %.
A reação de transesterificação com o óleo da Aleurites moluccana foi
acompanhada através da análise de placas de CCD, apresentando uma
mancha referente aos ésteres sintetizados com Rf 0,75 cm.
85
A taxa de conversão máxima de 62,2 % para a enzima livre, 54,0 % para
a OC-Bz 500 e 38,0 % para QTS-Bz 250, independente da forma de adição do
álcool.
As esferas mostram a manutenção da atividade em trono de 80 % após
a reutilização por três etapas.
Foi possível comprovar a eficiência do sistema biocatalítico em relação à
obtenção de ésteres de cadeia longa através das taxas de conversão do ácido
láurico e do óleo da Aleurites moluccana, bem como a manutenção da
atividade das enzimas após várias reutilizações nas reações de esterificação e
transesterificação. Os resultados demostram que a imobilização do material
biológico na esfera de quitosana e alginato não impediu estericamente os sítios
ativos da lipase, favorecendo a atividade catalítica quando em contato com os
substratos. O processo de imobilização também permitiu a reutilização do
sistema sem decaimento significativo nas taxas de conversão, comprovando a
eficácia da metodologia de imobilização utilizada, a reticulaçãoda quitosana
com alginato e cálcio.
O material magnético foi adicionado ao sistema catalítico com o objetivo
de facilitar a retirada do mesmo da solução, porém foi possível perceber que
pode existir alguma interferência deste componente durante a conversão dos
ésteres. A análise deste comportamento, em pesquisas futuras, pode vir a
explicar as variações das taxas de conversão obtidas, visando uma contínua
otimização do sistema.
86
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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