UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA

NÚCLEO BIOTECNOLÓGICO

MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIA E BIOTECNOLOGIA

MARLENE RAIMUNDA ANDREOLA PERAZZOLI

EFEITO HEPATOPROTETOR DO ÁCIDO GÁLICO E DODECIL GALATO NO DANO

HEPÁTICO PROMOVIDO POR TETRACLORETO DE CARBONO

Videira – SC,

2015

MARLENE RAIMUNDA ANDREOLA PERAZZOLI

EFEITO HEPATOPROTETOR DO ÁCIDO GÁLICO E DODECIL GALATO NO DANO

HEPÁTICO PROMOVIDO POR TETRACLORETO DE CARBONO

Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Ciência e Biotecnologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito parcial para obtenção do título de MESTRE.

Orientadora: Prof. Dra. Claudriana Locattelli

Co-Orietador: Prof. Dr. César Milton Baratto

Videira – SC,

2015

Sou uma sonhadora, sou uma lutadora e não posso desistir, quero ser cada dia melhor.

Quero sonhar, quero acreditar que quem luta sabe fazer acontecer, e faz acontecer.

Tenho medo, mas sigo enfrente, por que acredito em mim e acima de tudo em Deus.

Quando me deparo com caminhos tortuosos e dias difíceis, olho sempre para frente

e nunca para os obstáculos, porque preciso ultrapassá-los.

Abro os olhos e o coração para lutar pelas vitórias e sempre com humildade, nos

erros me torno forte e com eles eu aprendo.

É preciso acreditar, é preciso sonhar, é preciso lutar.

O importante é continuar.

Marlene Raimunda Andreola Perazzoli

MARLENE RAIMUNDA ANDREOLA PERAZZOLI

EFEITO HEPATOPROTETOR DO ÁCIDO GÁLICO E DODECIL GALATO NO DANO

HEPÁTICO PROMOVIDO POR TETRACLORETO DE CARBONO

Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Ciência e Biotecnologia da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito para obtenção do título de MESTRE.

Aprovada em: / / .

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dra. Claudriana Locattelli

Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC- Videira

Prof. Dr. César Milton Baratto

Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC- Videira

Prof.Dr. Geisson Marcos Nardi

Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC- Joaçaba

Prof.Dr. Glauber Wagner

Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC- Joaçaba

Suplente Prof.Dra. Elisandra Minotto

Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC - Videira

Prof. Dra Jane Mari Lafayette Neves Gelinski

Coordenadora PPGC&B da Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC

Dedico este trabalho a minha família,

Pelo incentivo companheirismo durante

toda a minha caminhada, em especial

meus filhos Tamara e Ari Junior.

AGRADECIMENTOS

Neste momento em que este projeto se encerra, cabe ressaltar que ele só foi

possível através de um ideal, somado aos meus esforços, às minhas necessidades

e aos objetivos que tanto buscava. Agradeço a Deus, por ter me dado forças interior

para superar as dificuldades, e me guiado mostrando os caminhos nas horas de

incerteza nos momentos de desanimo. À minha família a qual amo muito, pelo

carinho e paciência em especial meu esposo Ari Antônio, aos meus filhos Tamara e

Ari Junior que entenderam a minha ausência. Agradeço aos meus pais Hilda e

Itamar Andreola, por me ensinarem a permanecer na simplicidade e na humildade

porque sinto que sem isso não teria chegado ao fim. Aos meus irmãos Marilene,

Izair, Marilúcia e Valdecir Andreola, que sempre torceram por mim. À minha

orientadora Drª Claudriana Locatelli pela insistência, me mostrando o caminho da

ciência. Ao meu co- orientador Dr. Milton Cesar Barato sempre disponível quando

procurado e disposto a ajudar. A coordenadora do Curso de mestrado DrªJane

Gelinski por ter dado oportunidade com sua insistência para que o curso fosse

implantado na universidade. Vocês não foram somente orientadora, co-orientadora e

coordenadora, em alguns momentos, foram conselheiras, (o) confidentes, e amigas

(o). Vocês são referência profissional e pessoal. Obrigada por estarem ao meu lado

e acreditarem em mim. Gostaria também de agradecer aos professores do

Mestrado, todos aqueles os quais tive a honra de poder compartilhar de seus

conhecimentos, em especial Dr. Prof. Geison Nardi e Drª Elisandra Minotto seja

durante as disciplinas, nos seminários, palestras e corredores. Aos meus colegas do

mestrado em especial ao Cássio G. Freri, Marta Buss, Fernanda Megiollaro, Sallis D.

Narloch, Elis R. D. Schutz, Schelen Rapp, Ketlin Schneider, Auro Schwab e

Marcelina M. Debiasi, Adriana Genuario, Deise F. de Sousa, por compartilharem às

dificuldades, os risos, as angustias e pelas amizades construídas. Agradeço aos

meus chefes Dr. Marcelo Fabricius Andreani e a Drª Claúdia Pinz Baungarthem da

Clínica Gastrocare por me liberar para que pudesse fazer as pesquisas, por me

incentivar e acreditar em mim. A minha Colega de trabalho Fernanda Dambroz

Iurkevicz por trabalhar sozinha na minha ausência.

Obrigada.

“Tenho em mim todos os sonhos do mundo, cujo pensamento sintetiza o meu sonho

agora realizado”.

(Fernando Pessoa)

RESUMO

As doenças hepáticas constituem um dos maiores problemas de saúde pública no

mundo, a fibrose hepática e a cirrose representam as manifestações patológicas

mais comuns e as maiores causas de morte humana. O tetracloreto de carbono

(CCI4) é um composto químico, capaz de promover danos hepáticos, uma vez que

durante seu processo de metabolização gera espécies reativas. Compostos

fenólicos como o ácido gálico e seus derivados apresentam atividade antioxidante

anti-inflamatória, antitumoral, antiviral ente outras, sendo assim, este estudo teve

como objetivo investigar o efeito hepatoprotetor do ácido gálico (GA) e do dodecil

galato (DGA) contra o estresse oxidativo, induzido pelo tetracloreto de carbono

(CCl4) em modelo experimental in vivo, e seu papel na expressão do gene p53. No

presente estudo foram utilizados ratos machos albinos Wistar com 18 semanas de

idade. O dano hepático foi induzido pela administração de CCl4 intraperitoneal, o

tratamento foi realizado com GA ou DGA nas doses de 50 e 100 mg/Kg. No final do

tratamento os animais foram sacrificados, o sangue coletado para investigação dos

marcadores séricos de função hepática (ALT, AST, -GT, Bilirrubina total, albumina)

e lipídeos. O tecido hepático foi pesado e processado para análise histopatológica,

dos marcadores de estresse oxidativo (TBARS, GSH, GPx, GST e CAT) e gene p53.

Os resultados demonstraram claramente que o GA e DGA apresentam proteção

contra o dano hepático agudo e crônico induzido pelo CCl4 com redução significativa

nos níveis séricos das enzimas ALT, AST e da concentração de bilirrubina total,

observou-se também uma redução significativa na peroxidação lipídica hepática e

um aumento nos níveis hepáticos de glutationa. Além disso, verificou-se uma

redução nas enzimas antioxidantes hepáticas; catalase, glutationa peroxidase,

glutationa-S-transferase e glutationa redutase, enquanto o gene p53 foi aumentado

com o tratamento de GA e DGA. Os dados histológicos revelaram uma diminuição

na progressão da fibrose hepática nos animais tratados com GA e DGA. Estes

resultados indicam que o GA e DGA promovem um aumento da expressão do gene

p53, o que induz uma regulação das enzimas antioxidantes, sugerindo um efeito pró-

oxidativo do GA e DGA que parece ser seletivo para hepatócitos danificados. Assim,

estes resultados sugerem que a GA e DGA tem o potencial para prevenir a fibrose

hepática induzida por drogas como o tetracloreto de carbono.

Palavras-chave: enzimas antioxidantes, hepatotoxicidade, gene p53

ABSTRACT

Liver diseases are one of the major public health problems worldwide, liver fibrosis

and cirrhosis are the most common pathological manifestations and the major

causes of human death. Carbon tetrachloride (CCl4) is a chemical compound

capable of promoting liver damage, since during its metabolization process it

generates reactive species. Phenolic compounds such as gallic acid and its

derivatives have anti-inflammatory, antioxidant, antitumor and antiviral activities,

among others, and therefore, this study aimed to investigate the hepatoprotective

effect of gallic acid (GA) and dodecyl gallate (DGA) against oxidative stress induced

by carbon tetrachloride (CCl4) in in vivo experimental model, and its role in the

expression of the p53 gene. In the present study, Wistar albino male mice of

approximately 8 weeks-old were used. The liver damage was induced by CCl4

intraperitoneal administration and the treatment was performed with GA or DGA at

doses of 50 and 100 mg/kg. After the treatment the animals were sacrificed and their

blood was collected for serum markers investigation of the liver function (ALT, AST,

y-GT, total bilirubin, albumin), and lipids. The liver tissue was weighed and processed

for histopathological analysis of markers of oxidative stress (TBARS, GSH, GPx,

GST and CAT) and p53 gene. The results clearly demonstrate that GA and DGA

show protection against acute and chronic liver damage induced by CCl4 with a

significant reduction in serum levels of the enzymes ALT, AST and total bilirubin

concentration; it was also observed a significant reduction in hepatic lipid

peroxidation and an increase in glutathione liver levels. Moreover, there is a

reduction in liver antioxidant enzymes; catalase, glutathione peroxidase, glutathione-

S-transferase, and glutathione reductase, while the p53 gene was increased by

treatment with GA and DGA. The histological data showed a decrease in the

progression of hepatic fibrosis in animals treated with GA and DGA. These results

indicate that DGA and GA promote an increase in the expression of the p53 gene,

which induces the regulation of antioxidant enzymes, suggesting a pro-oxidative

effect of GA and DGA, which seems to be selective for damaged hepatocytes. Thus,

these results suggest that GA and DGA have the potential to prevent liver fibrosis

induced by drugs such as carbon tetrachloride.

Keywords: antioxidant enzymes, hepatotoxicity, p53 gene.

LISTA DE SIMBOLOS E ABREVIATURAS

AG Ácido gálico

ANOVA Análise de Variança

AST Aspartatoamonotransferase

ALT Alanina Aminotransferase

CAT Catalase

CCI4 Tetracloreto de Carbono

CCI3 Triclorometil

CDNB 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno

CEH Células Estreladas Hepáticas

COOH Ácido Carboxílicos

DEPC Dietilpirocarbonato – inibidor de RNAase

DGA Dudecil galato

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido Desoxirribonucleico

DPPH 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil

DGA Dodecilgalato

DTNB Ácido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzóico

EPM Média Padrão de Erro

ERNs Espécies Reativas de Oxigênio

EROS Espécies Reativas de Oxigênio

FA Fosfatase Alcalina

FAD Flavina-Adenina-Dinucleotídeo

FADH2 Flavin Adenina Dinucleotide

GA Ácido Gálico

GPx Glutationa peroxidase

GR Glutationa redutase

GSH Glutationa Reduzida

GSSG Glutationa Oxidada

GST Glutationa trasferase

GSTS Glutatina-s- transferase

H&E Hematoxilina e Esonina

HDN Hesperidin

H2O Água

HO2

•

Radical Hidroperoxil

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

HOOC Ácidos Dicarboxílicos

I.p. Intraperitoneal

53KDA Peso Molecular

µmol Micromol

µl Microlitro

mM Milimol.

MAD Malonaldeido

MEC Matriz Extracelular

NaCI Cloreto de Sódio

NADP+

Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (forma oxidada)

NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (forma reduzida)

NH2 Amina

nM Nanômetro

OH Hidroxila

OOCCI Triclorometilperoxil

PCR Reação em Cadeia de Polimerase

PDGE Fator de Crescimento de Plaquetas

PH Potencial Hidrogeniônico

PHGPX Hidroperoxido de Fosfolipídio Glutations Peroxidase

P53 Proteína Citoplasmática

P450 Citocromo

RPM Rotação por minuto

RO2H Peróxidos Orgânicos

ROH Proteína Procariótica

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

RNAS Ácido Ribonucleico

RT- PCR Transcrição reversa da reação em cadeia da polimerase

TA Temperatura ambiente

TBA Ácido Tiobarbitúrico

TBARS Espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico

TCA Ácido Tricarboxilo

TG Triglicerídeo

TNB Ácido 5-tio-2-nitrobenzóico

TNF-a- Fator de necrose tumoral alfa

TGF-B- Fator de crescimento beta

SH Tiol

SOD Superóxido Dismutase

UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul

VHC Vírus Hepatite C

GT Gama Glutamiltransferase

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1 – Representação esquemática das principais funções hepáticas. ......... 21

Esquema 2 – Mecanismo de toxicidade do CCl4 no organismo. .............................. 27

Esquema 3 - Equilíbrio pró-oxidante-antioxidante. .................................................... 28

Esquema 4 – Sistema enzimático Antioxidante. ........................................................ 30

Esquema 5 – Mecanismo de ação do complexo glutationa. ..................................... 31

Esquema 6 – Interações do p53 com o sistema imune. ............................................ 36

Esquema 7 – Análises realizadas na indução do dano hepático agudo. ................... 41

Esquema 8 – Análises realizadas na indução do dano hepático crônico. ................. 43

Esquema 9 – Possível mecanismo do efeito hepatoprotetor do ácido gálico e dodecil

galato em modelo de fibrose hepática induzida pelo tetracloreto de

carbono. ............................................................................................. 69

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Fórmula molecular do ácido gálico e dudecil galato. ................................ 33

Figura 2 – Efeito do tratamento com GA e DGA nas alterações histológicas

hepáticas em ratos intoxicados com CCl4. ............................................... 55

Figura 3 – Efeito do tratamento com GA e DGA nas alterações histológicas

hepáticas em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4. ................... 60

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Efeito do tratamento com GA e DGA no ganho de peso corporal e peso

relativo do fígado em ratos intoxicados com CCl4. ................................ 51

Gráfico 2 – Efeito do tratamento com GA e DGA na indução da peroxidação lipídica

e redução da concentração de glutationa hepática reduzida promovida

pela administração de dose única de CCl4. ........................................... 53

Gráfico 3 – Efeito do tratamento com GA e DGA na atividade das enzimas

antioxidantes em ratos intoxicados com CCl4. ....................................... 54

Gráfico 4 – Efeito do tratamento com GA e DGA no ganho de peso corporal e peso

relativo do fígado em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4. ..... 56

Gráfico 5 – Efeito do tratamento com GA e DGA na peroxidação lipídica (TBARS) e

concentração de glutationa reduzida hepática em ratos com fibrose

hepática induzida por CCl4. ................................................................... 58

Gráfico 6 – Efeito do tratamento com GA e DGA na atividade das enzimas

antioxidantes em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4. ........... 59

Gráfico 7 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalato na expressão do gene p53 em

ratos com fibrose hepática induzida por CCl4. ....................................... 61

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Oligonucleotídeos utilizados na reação de qPCR. .................................. 49

Tabela 2 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalatono dano hepático agudo induzido

por CCl4. ................................................................................................ 52

Tabela 3 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalato nos parâmetros séricos de ratos

com fibrose hepática induzida pelo tratamento crônico com CCl4. ........ 57

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 18

2 REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................... 20

2.1 FÍGADO – IMPORTANTE ÓRGÃO ENVOLVIDO NA

BIOTRANSFORMAÇÃO DE XENOBIÓTICOS ............................................ 20

2.2 FIBROSE HEPÁTICA ................................................................................... 22

2.3 TETRACLORETO DE CARBONO (CCI4), COMO MODELO

EXPERIMENTAL DE INDUÇÃO DE FIBROSE HEPÁTICA. ........................ 25

2.4 ESTRESSES OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES ......................... 27

2.5 ÁCIDO GÁLICO E DERIVADOS .................................................................. 32

2.6 GENE P53 E O PROCESSO DE ESTRESSE OXIDATIVO ......................... 34

3 OBJETIVOS ................................................................................................. 38

3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 38

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 38

4 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 39

4.1 REAGENTES ............................................................................................... 39

4.2 ANIMAIS ....................................................................................................... 39

4.3 INDUÇÃO DA HEPATOTOXICIDADE AGUDA E TRATAMENTO ............... 40

4.4 INDUÇÃO DA HEPATOTOXICIDADE CRÔNICA E TRATAMENTO ........... 42

4.5 PARÂMETROS AVALIADOS APÓS A INDUÇÃO DO DANO HEPÁTICO ... 43

4.5.1 Avaliação do Ganho de Peso (GP) dos Animais ...................................... 43

4.5.2 Peso Relativo (PR) do Fígado .................................................................... 44

4.5.3 Análises de Parâmetros Bioquímicos no Soro ........................................ 44

4.5.3.1 Análise Laboratorial de Lipídios Sérico ......................................................... 44

4.5.3.2 Análise de Biomarcadores Séricos de Dano Hepático ................................. 44

4.5.4 Marcadores de Estresse Oxidativo Hepático ........................................... 44

4.5.4.1 Preparação dos homogenatos ...................................................................... 44

4.5.4.2 Lipoperoxidação - Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) . 45

4.5.4.3 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH) ..................... 45

4.5.4.4 Medida da Atividade da Catalase ................................................................. 46

4.5.4.5 Medida da Atividade da Glutationa Peroxidase ............................................ 46

4.5.4.6 Medida da Atividade da Glutationa Redutase ............................................... 46

4.5.4.7 Medida da Atividade da Glutationa-S-transferase ........................................ 47

4.5.5 Dosagem de Proteínas ............................................................................... 47

4.5.6 Preparo da Amostra para realização do ensaio da Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR) e análise de transcrição do P53. ................................ 47

4.5.6.1 Extração de RNA .......................................................................................... 47

4.5.6.2 Síntese de cDNA .......................................................................................... 48

4.5.6.3 Curva de eficiência da reação de PCR ......................................................... 48

4.5.6.4 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) ............................ 49

4.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ................................................................... 50

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................. 50

4.8 DESENHO EXPERIMENTAL ....................................................................... 50

5 RESULTADOS ............................................................................................. 51

5.1 EFEITO DO ÁCIDO GÁLICO E DODECILGALATO NO DANO HEPÁTICO

AGUDO CAUSADO PELO CCL4 .................................................................. 51

5.2 EFEITO DO ÁCIDO GÁLICO E DODECILGALATO NO DANO HEPÁTICO

CRÔNICO CAUSADO PELO CCL4 .............................................................. 55

6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 62

7 CONCLUSÃO............................................................................................... 68

8 PERSPECTIVAS FUTURAS ........................................................................ 70

REFERÊNCIAS ............................................................................................ 71

18

1 INTRODUÇÃO

O fígado é um orgão vital que desempenha um papel importante na

conjugação de fármacos e desintoxicação. Sua função é prejudicada, geralmente

por exposição excessiva à xenobióticos ou infecções, as quais levam a cirrose ou

lesão maligna em casos não tratados. Milhões de pessoas sofrem de lesões

hepaticas induzida por álcool, produtos químicos e infecções (DONG et al., 2013).

As doenças hepáticas constituem um dos maiores problemas de saúde

pública no mundo, a fibrose hepática e a cirrose representam as manifestações

patológicas mais comuns e figuram entre as maiores causas de mortalidade humana

(ELSHARKAWY, OAKLEY; MANN, 2005,LOTERSZTAJN et al., 2005,SCHUPPAN,

AFDHAL, 2008). A apresentação clínica varia desde a ausência de sintomas até a

falência total do órgão, que é determinada pela natureza e gravidade da

hepatotoxidade subjacente e da magnitude da fibrose estabelecida, a qual pode

progredir para cirrose e deterioração irreversível do órgão (TSUKADA, PARSONS,

RIPPE, 2006).

Estudos experimentais com tetracloreto de carbono (CCl4) tem mostrado que

um dos principais fatores indutores da fibrose hepática, é o aumento de espécies

reativas no fígado, em especial, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, que são

as responsáveis por danos a proteínas, lipídios e ao DNA, resultando na injuria

hepática (KHAN, KHAN, SAHREEN, 2012). O comprometimento do sistema

antioxidante está relacionado com a evolução de algumas doenças hepáticas como

a fibrose hepática, o emprego de agentes antioxidantes em especial os compostos

fenólicos são sugeridos como tratamento em doenças crônicas hepáticas

(ALMEIDA, 2009)

Os antioxidantes são substâncias capazes de inibir a oxidação, podendo ser

de natureza enzimática e não enzimática, como os α-tocoferóis (vitaminas E), β-

caroteno, ascorbato (vitamina C) e os compostos fenólicos (flavonóides)

(HALIWELL, 2001; SOUSA et al., 2007). Os compostos fenólicos estão presentes

em um grande número de plantas e retardam a formação de radicais livres,

substâncias reativas associadas a doenças causadas pelo estresse oxidativo, que

geram dano celular. (DROGE, 2002). Dentre os compostos fenólicos o 3,4,5-ácido

trihidroxibenzóico ou ácido gálico e seus derivados, apresenta um potencial para o

19

uso terapêutico em doenças hepáticas crônicas, embora não tenham sido realizados

muitos estudos clínicos em pacientes (FIGUEIREDO, 2012).

O ácido gálico (GA), um trifenol natural encontrado em plantas, e os seus

derivados têm sido estudados extensivamente quanto sua atividade antitumoral,

antimicrobiana, antiviral e antioxidante(OW; STUPANS, 2003; LOCATELLI et al.,

2009). Alguns derivados do GA, tais como metil, propil, octil e dodecil galatos são

amplamente utilizados na indústria de alimentos, farmacêutica e cosmética devido

ao seu potencial antioxidante (OW; STUPANS, 2003; LOCATELLI et al., 2009).

A ação antioxidante do ácido gálico e seus derivados está associada ao fato

de que estes compostos induzem o aumento intracelular na atividade das enzimas

antioxidantes como a catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase e

glutationa redutase, essas enzimas são responsáveis pela metabolização de

espécies reativas, transformando-as em outras substâncias mais estáveis e menos

reativas ou oxidativas (CHUANG et al., 2010).

Diante disso, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito do ácido gálico

(GA) e dodecilgalato (DGA) contra o estresse oxidativo induzido pelo tetracloreto de

carbono (CCl4) em modelo experimental in vivo e seu papel na expressão gene p53.

20

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 FÍGADO – IMPORTANTE ÓRGÃO ENVOLVIDO NA BIOTRANSFORMAÇÃO

DE XENOBIÓTICOS

O fígado, um dos maiores órgãos do corpo humano, pesa cerca de 1,2 a 1,5

kg, está situado na cavidade abdominal, abaixo do diafragma. Suas unidades

morfológicas, os lóbulos hepáticos direito e esquerdo são separados por uma prega

do peritônio denominado ligamento falciforme (SHERLOCK et al., 2004), este é um

órgão hematopoiético com capacidade regenerativa e que possui microambientes

imunológicos exclusivos (WATANABE et al., 2008).

O fígado tem mais de 250 funções distintas, das quais as mais importantes

(Esquema 1) são o armazenamento e a liberação de açúcar no sangue (glicose)

para produção de energia; a classificação e processamento de vitaminas e minerais,

decomposição de toxinas em substâncias menos nocivas; reciclagem de células

sanguíneas e a formação de plaquetas que contribui no processo de coagulação

(GUYTON, 2002).

A principal função é a biotransformação de substâncias não polares que são

excretadas através da bile e da urina. O envolvimento do fígado na toxicidade

induzida por drogas se deve a sua localização anatômica que é a principal porta de

entrada para as drogas ingeridas (GRATTAGLIONO et al.,2009)

Essas substâncias são transformadas em formas inativas por reações que

ocorrem nos hepatócitos. O retículo endoplasmático liso dos hepatócitos contém

uma variedade de enzimas e co-fatores que são responsáveis pela transformação

química de substâncias. Enzimas, no reticulo endoplasmático, catalisam compostos

como ácido glicurônico, glicina ou glutationa. As transformações tornam compostos

mais hidrossolúveis (BERNE M. R. LEVY N. MATTHEUS, 2000).

O fígado sintetiza todos os aminoácidos não essenciais, além de sintetizar as

principais proteínas plasmáticas incluindo as lipoproteínas, albumina, globulinas,

fibrinogênio e outras proteínas que participam da coagulação sanguínea. Além disso

faz o armazenamento do ferro e das vitaminas lipossolúveis A, D, E e K, excreta e

transforma hormônios, medicamentos (drogas) e toxinas (GUYTON, 2002).

21

Esquema 1 – Representação esquemática das principais funções hepáticas.

Fonte: adaptado Renz (2003).

As reações de biotransformação se dividem em dois grupos, de oxidação e

redução (fase I), e de conjugação e hidrólise (fase II). Nas reações de oxidação que

acontece na fase I da biotransformação na qual o composto é oxidado a uma

substância mais polar, pela adição ou exposição dos grupos funcionais polares,

como hidroxila (OH), tiol (-SH) ou amina (-NH2). As enzimas da fase I catalisam

reações que geralmente resultam na introdução de um grupo funcional na molécula

de substrato. As enzimas envolvidas nas reações da fase I são as monooxigenases

do citocromo P450 (SCHROER et al.; 2010). As citocromo P450 monooxigenases,

75% desempenham papel importante no metabolismo de drogas, mediado pelas

22

enzimas P450. Esses metabólitos são mais reativos e podem ser secretados sem

erro qualquer modificação (GUENGERICH FP. 2006).

As reações de biotransformação na fase II seguem o processo de

detoxificação, resultando em metabólitos inativos (WILLIAMS et al.; 2002). As

reações da fase II modificam os compostos através da ligação de grupamento

hidrofílicos, como os ácidos glicurônico, criando conjugados mais polares

(SCHROER et al., 2010). Fatores intrínsecos e extrínsecos, como a combinação de

idade, sexo, genética, hormônios, doenças hepáticas e fatores ambientais, resultam

em resposta que influenciam a células a um dano tóxico (ZIMMERMANN, 1999). Um

equilíbrio entre a bioativação, detoxificação e os mecanismos de defesa, determinam

se um composto irá provocar um efeito tóxico ou não (WILLIAMS et al., 2002)

O fígado está preparado para eliminar as toxinas e evitar ou minimizar os

danos causados por intermediários reativos tóxicos. Apesar de muitas vias

enzimáticas e não enzimáticas de bioativação estarem presentes no fígado;

intermediários reativos podem escapar do processo de desintoxicação e dar início a

reações em cadeia de radicais. A relação entre a bioativação e a ocorrência de lesão

hepática não é simples. Estas espécies reativas podem ser diretas e indiretas, que

causam uma lesão tóxica na célula e iniciam uma reação imunológica (LEE, 2003b;

WALGREN et al., 2005).

2.2 FIBROSE HEPÁTICA

A fibrose hepática é o resultado das doenças crônicas que afetam o fígado,

causando desequilíbrio entre a síntese e a degradação da matriz extracelular,

incluindo o colágeno, as glicoproteínas, os polissacarídeos e as aminas

(FRIEDMAN, 2003), e faz parte do processo cicatricial no fígado e ocorre na

tentativa de conter a agressão, consistindo no acúmulo de componentes da matriz

extracelular (MEC). Os mecanismos que regulam a deposição do tecido fibroso no

fígado têm sido elucidados nos últimos anos graças à evolução nos conceitos do

binômio inflamação-fibrogêneses. A fibrogênese hepática é um processo dinâmico

que envolve a síntese, a remodelação e a degradação da matriz extracelular

(TOROK N. J. 2008), os elementos celulares envolvidos na fibrogêneses

(Brown 2000). O fígado produz vários elementos celulares capazes de sintetizar e

depositar os componentes da matriz extracelular fibroblastos, miofibrosplastos e até

23

os próprios hepatócitos (GEERTS 2001). A fibrose é uma resposta evolutiva

altamente conservada para limitar o dano tecidual e serve como uma resposta

genérica à lesão hepática crônica independente da etiologia (FALLOWFIELD e

IREDALE 2004). Evidências de regressão de fibrose tem sido estudas em uma série

de hepatopatias crônicas, como hepatites auto-imunes, hepatites virais, obstrução

biliar, sobrecarga de ferro e esteato-hepatite não alcoólica (FRIEDMAN; BANSAL,

2006).

A fibrose é a via final da maioria das lesões que acometem o fígado e ocorre

em resposta a quase todas as agressões crônicas hepáticas (TOROK NJ. 2008).

Elas desencadeiam uma cascata de eventos, que, se mantidos de forma crônica,

podem resultar em diferentes graus de fibrose, sendo a cirrose o estágio mais

avançado (FRIEDMAN, 2008). A fibrose acontece com a destruição tecidual

substancial decorrente de um desequilíbrio entre as atividades hepáticas

fibrogênicas e fibrolíticas (KUMAR et al.;2008b). Essa condição caracteriza-se pela

presença de fibrose grave com distorção da arquitetura lobular hepática, septos,

nódulos de regeneração, além de alteração no fluxo sanguíneo. (FRIEDMAN, 2008).

Indiretamente à etiologia da cirrose, a regressão da fibrose envolve mecanismos de

inativação a apoptose das principais células precursoras da fibrogênese hepática, as

células estreladas hepáticas (CEH) RAPPAPORT et al;1954). Essas células

correspondem aproximadamente 15% das células hepáticas que tem sua origem na

crista neural (FRIEDMAN, 2000).

A matriz extracelular do fígado tem características diferentes nos espaços

porta, no interior dos lóbulos e na região em torno da veia centrilobular. Os

componentes da matriz extracelular são sintetizados pelos fibroblastos portais (nos

espaços porta), pelas células perisinusoídais armazenadoras de gordura (células de

Ito ou células estreladas) e pelas células endoteliais dos sinusóides, nos espaços de

Disse (FRIEDMAN, 2000). O fígado cronicamente doente, as células de Ito

proliferam e adquirem características de miofibroblastos, com ou sem as inclusões

lipídicas (GEERTS, 2001). Está célula é armazenadora de gordura e vitamina A, que

sob a ação de citocinas fibrogênicas, (TGF-b, TNF-a,), se diferencia em

miofibroblasto e fibroblasto, ativa síntese dos elementos da matriz, colágenos,

elastina, proteoglicanos e proteínas inibindo fatores fibrogênicos, mas os melhores

resultados, até o momento, e a possibilidade de regressão da fibrose são quando a

causa é removida (ANDRADE, 1989; ARTHUR, 2002). Sob tais condições, estas

24

células são observadas próximo aos hepátocitos lesionados causando a fibrose

(BOGLIOLO, 1981).

A apoptose de hepatócitos pode induzir a fibrose hepática, que é uma

importante forma de morte celular desencadeada através da ativação das proteases

de cisteína durante a progressão da doença hepática crônica (JEULIN et al., 2013).

A apresentação clínica da doença hepática varia desde a ausência de

sintomas até a falência total do órgão, que são determinadas pela natureza e

gravidade da hepatotoxidade subjacente e da magnitude da fibrose estabelecida

(FRIEDMAN, 2003; TSUKADA; PARSONS; RIPPE, 2006).

O tratamento é outro problema crucial da fibrose hepática (ARTHUR, 2002).

Muitos fármacos têm sido estudados, mas nenhum com eficácia comprovada

(ARTHUR, 2002).

A compreensão das bases fisiopatológicas da fibrogênese está levando a

novas abordagens terapêuticas, sendo a estratégia mais eficaz para reversão da

fibrose com uso de substâncias antifibróticas, que inibe a deposição de matriz, a

síntese de colágeno e a modulação da ativação de células estreladas, reforçando a

degradação da matriz, ou a estimulação da morte celular ou apoptose das células

estreladas hepáticas (ÖZÇELIK, 2011). Em virtude do grande problema hepático,

muitas pesquisas a respeito desta doença são realizadas em todo mundo,

objetivando testar substâncias e técnicas que possam converter em tratamento e

busca da cura, ou ao menos aumentar a sobrevida dos pacientes, evitando a

progressão da doença. Procedimentos em seres humanos são limitados por

considerações éticas, reforçando a necessidade de modelos em animais que

reproduzem o quadro patológico da fibrose e da cirrose (LALEMAN et al., 2006).

A cirrose hepática é uma doença crônica que provoca dano permanente na

formação do tecido cicatrizal, levando ao dano na estrutura do fígado, bloqueando o

fluxo de sangue diminuindo a capacidade do fígado de processar nutrientes,

hormônios, fármacos e toxinas (GUYTON, 2002).

Nos países ocidentais, a etiologia mais comum de cirrose é o abuso de álcool,

seguido por hepatite e alterações das vias biliares. Alguns pacientes afetados são

assintomáticos, sendo identificados por testes de função hepáticos anormais

(BRANDÃO et al., 2006).

Outros fatores que podem desencadear doenças hepáticas são as reações

severas a medicamentos, ou exposição a toxinas ambientais, um exemplo é o

25

tetracloreto de carbono usado nas indústrias de lavagem a seco, esse composto é

reativo, que age nas membranas do retículo endoplasmático rugoso, causando

dispersão dos ribossomos, inibindo a síntese proteica e a esteatose hepática

(LALEMAN et al., 2006).

A cirrose hepática é um processo difuso, decorrente de ação continuada e

mantida por uma agressão ao órgão, caracterizado por fibrose progressiva e

substituição da arquitetura hepática normal por nódulos estruturalmente anormais,

uma condição terminal que o fígado é levado por variadas etiologias (GUYTON,

2002). O que faz a peculiaridade da cirrose é um processo generalizado de

regeneração nodular do parênquima, acompanhado de um complexo de alterações

vasculares (POPPER, 1977, FRIEDMAN, 2000).

2.3 TETRACLORETO DE CARBONO (CCI4), COMO MODELO EXPERIMENTAL

DE INDUÇÃO DE FIBROSE HEPÁTICA.

O tetracloreto de carbono (CCI4) é um composto quimico, hidrocarboneto

halogenado e toxico, que ocasiona dano hepático, gera radicais livres formados

durante a sua metabolização. O primeiro estudo realizado para avaliar o dano

hepático causado pelo (CCl4) foi descrito em 1936 por Cameron e Karunarate,

utilizando como modelo animais (BASU, 2003).

Estudos tem mostrado que a toxicidade do (CCl4) é devido a formação de

metabólitos halogenados produzidos durante a biotransformação, causando dano na

estrutura celular via estresse oxidativo (EL-HALAWANY 2014, DINE, et al., 2014).

O tetracloreto de carbono é uma molécula pequena, lipofílica e, distribui-se

facilmente nos compartimentos lipídicos do corpo, é metabolizado no fígado, o

mecanismo para a sua toxicidade envolve a bioativação do CCl4, que é mediada

pelo P450 (CYP) e a indução de peroxidação dos lipídios na membrana

(BOELSTERLI, 2007). O fígado apresenta aparência inchada e macia, com elevação

dos níveis séricos de bilirrubina e enzimas hepáticas como aspartato

aminotransferase (AST), e redução dos níveis séricos de proteínas como albumina e

fibrinogênio. Além destes efeitos, causa esteatose hepática, que induz um processo

de inflamação, e necrose com maior progressão para fibrose no tecido formador do

órgão (MURIEL; ESCOBAR, 2003). Promove alterações nucleares, às quais estão

26

associadas ao desenvolvimento de genotoxicidade, neoplasia, hiperplasia e no

desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (KHAN; KHAN; SAHREEN, 2012b).

A solubilidade do CCI4 em lipídios faz com que atravesse a membrana celular,

atingindo órgãos como, fígado, rins, coração, pulmões, testículos, cérebro e sangue

(BASU, 2003). Os primeiros sinais de lesão hepatocelular em ratos abrange a

dissociação de polissomas e ribossomas do reticulo endoplasmático rugoso,

desorganização do reticulo endoplasmático liso, inibição da síntese proteica e

acumulação de triglicerídeos. A necrose celular ocorre entre as 24 e 48 horas

(TIRKEY et al., 2005). A hepatoxicidade induzida pelo CCI4 interfere com moléculas

celulares, tendo como consequência alterações na fisiologia celular, aumento da

peroxidação lipídica, redução da quantidade de glutationa e consequentemente dano

ou morte celular. Alterações proliferativas no órgão resultam em esteatose hepática,

necrose celular, fibrose e cirrose, podendo levar ao câncer (LIMA; FERNANDES-

FERREIRA; PEREIRA-WILSON, 2007).

A quantidade de CCl4 metabolizado em determinado órgão está relacionada

com a expressão de CYP2E1 no tecido. No fígado, os metabólitos do CCl4

acumulam-se em uma concentração maior na região centrilobular, que possui altos

níveis de expressão desta enzima (BERGMAN, 1983). O dano hepático agudo por

CCl4 se caracteriza histologicamente por marcada necrose de região centrilobular,

esteatose microvesicular e forte presença de infiltrado inflamatório no tecido

hepático (RAHMAN, HODGSON, 2000). A principal consequência da toxicidade do

CCl4 está relacionada a peroxidação lipídica que causa rompimento da membrana

celular, resultando na perda da sua integridade. Estudos mostraram que após

tratamento com CCl4 observam-se mudanças extensivas na morfologia do fígado,

incluindo esteatose, inflamação, balonização dos hepatócitos, dilatação dos

sinusóides e da veia centrolobular do fígado e necrose, além de infiltração celular

(ROY et al., 2011).

27

Esquema 2 – Mecanismo de toxicidade do CCl4 no organismo.

Fonte: U. S. Enviromental Protection Agency (2010).

2.4 ESTRESSES OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES

Oxidação é um processo metabólico que leva à produção de energia

necessária para as atividades essenciais das células, no entanto durante este

processo metabólico uma quantidade significativa de espécies reativas é gerada, as

quais podem desencadear o surgimento do estresse oxidativo (SOARES, 2002).

O estresse oxidativo é definido como um estado de desequilíbrio entre a

produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a capacidade antioxidante

28

endógena como representado no (Esquema 3), sendo que tal desequilíbrio está

associado ao desenvolvimento de doenças crônicas, incluindo danos em órgãos

essenciais como o fígado, além de estar associado ao surgimento de doenças

neurodegenerativas e câncer (REIS et al. 2008).

As espécies reativas de oxigênio (ROS) mais comuns são: os radicais

superóxido (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio singlet (1O2) os quais

apresentam uma capacidade de oxidação superior ao oxigênio molecular em seu

estado fundamental, esses compostos formam-se durante as reações metabólicas

dos organismos, sendo inevitáveis para o metabolismo dos organismos aeróbicos

(ANGELOVA et al., 2000).

Esquema 3 - Equilíbrio pró-oxidante-antioxidante.

Fonte: Trauma Ozono (2005).

Os fatores que induzem o estresse oxidativo dividem-se em externos e

internos, físicos e químicos (STOCKER, KEANEY, 2004). Os fatores físicos incluem

variação de temperatura, luz e radiação. Os químicos envolvem compostos que em

contato com o organismo causam aumento nos níveis de espécies reativas. Os

fatores internos estão relacionados com o processo metabólico que o organismo

realiza diariamente (STOCKER, KEANEY, 2004).

O processo conduz a oxidação de biomoléculas e consequente perda de suas

funções biológicas, cuja manifestação são o dano oxidativo contra células e tecidos,

levando a desenvolver um processo etiológico de inúmeras enfermidades crônicas

(GREEN, BRAND, MURPHY, 2004).

Os antioxidantes são substâncias presentes em menores quantidades que as

do substrato oxidável, capazes de atrasar ou inibir a oxidação de maneira eficaz,

29

podem agir diretamente, neutralizando a ação dos radicais livres e espécies não

radicais e participando indiretamente dos sistemas enzimáticos (HALLIWELL,

WHITEMAN, 2004).

O sistema de defesa antioxidante é formado por antioxidantes enzimáticos e

não enzimáticos, protegendo o organismo dos danos causados por espécies

reativas de oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN) e, portanto,

aumentam a defesa imunológica, atenuando o risco de desenvolvimento de doenças

relacionadas às espécies reativas (CHATTERJEE et al., 2007).

Os antioxidantes não enzimáticos são substâncias naturais produzidas por

plantas, estes compostos fenólicos têm sido estudados extensivamente devido a sua

capacidade de sequestrar os radicais livres (DECKER, 1997. BARREIROS,

et.al.,2006. STUMPF et.al., 2012). Dentre os compostos fenólicos os mais estudados

devido a sua ação, principalmente sobre a peroxidação lipídica encontram-se os

ácidos cafeico, elágico e gálico (HARTMAN, SHANKEL, 1990; HALLIWELL et al.,

1995).

O mecanismo de ação dos compostos fenólicos pode inibir os processos da

oxidação em alguns sistemas, mas a sua utilização não protege os tecidos de todos

os tipos de danos oxidativos, podendo causar efeito pró-oxidante em alguns

sistemas (DECKER, 1997. BARREIROS, et.al.,2006. STUMPF et.al., 2012).

O sistema enzimático age evitando o acumulo de ânion radical superóxido e

do peróxido de hidrogênio (Esquema 4) que é formado pelas enzimas, destacando

superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), e a glutationa peroxidase (BELLÓ

2002).

30

Esquema 4 – Sistema enzimático Antioxidante.

Fonte: Adaptado de RENZ (2003)

No Esquema 4, a atividade protetora da glutationa é expressa pela redução

de espécies oxidantes, e consequentemente oxidação da glutationa reduzida (GSH)

à glutationa dissulfeto ou glutationa oxidada (GSSG) (BELLÓ 2002). A GSH pode

ser considerada um dos agentes mais importantes do sistema de defesa

antioxidante da célula, protegendo-a contra a lesão resultante da exposição a

agentes tóxicos, diminuindo a suscetibilidade à lesão decorrente da ação oxidativa

da célula ou promovida por substâncias administradas exógenamente como os

medicamentos quimioterápicos, portanto, participa da detoxificação de agentes

químicos e da eliminação de produtos da lipoperoxidação (FERREIRA;

MATSUBARA, 1997).

A glutationa (GSH) tem um importante papel na biotransformação e

eliminação de xenobióticos, atuando na defesa das células contra o estresse

oxidativo, sua quantificação no tecido hepático é importante para avaliar o dano

celular (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).

As glutationa transferases (GSTs), também conhecida como glutationa-S-

transferases, compreendem uma família de enzimas multifuncionais que catalisam o

ataque nucleofílico da forma reduzida da glutationa (GSH) a compostos que

apresentam um carbono, um nitrogênio ou um átomo de enxofre eletrofílico. As

GSTs geralmente se encontram no meio biológico como homo ou heterodímeros

(outros complexos também podem existir), apresentando dois sítios ativos por

31

dímero cujas atividades são independentes uma da outra. Glutationa-S-Transferase

(GST) enzima de ligação, sua atividade encontra-se em níveis apreciáveis apenas

nos rins, pâncreas, fígado, baço e no intestino delgado, alem de participar na

transferência de aminoácidos através da membrana celular e no metabolismo da

glutationa (MOTTA, 2000).

A glutationa GSH e GSSG são interconvertidas pela ação de enzimas, a

glutationa peroxidase GSH-PX e a glutatina redutase GSH-R respectivamente,como

mostra a (Esquema 5). A GSSSG é reduzida por regenerar GSH em uma reação

catalizada pela enzima GSH-R, está reação necessita de NAPH como doador de

hidrogenio.

Esquema 5 – Mecanismo de ação do complexo glutationa.

Fonte: RENZ (2003)

A Glutationa redutase GSH é uma enzima responsável pela redução da

GSSG a GSH. Os sítios ligantes para GSSG estão situados na interface das duas

subunidades que constituem a estrutura quaternária da glutationa redutase, sendo

que cada uma tem um domínio, com um sitio ligante para NADPH (AVILEZ, et al.,

2008).

Outro importante sistema enzimático de defesa contra radicais livres envolve

as glutationas peroxidases GSH-PX encontradas em muitos tecidos de origem

animal. Estas enzimas são bastante particulares no que se refere à sua constituição,

32

pois incorporam um resíduo de seleno cisteína no seu sítio ativo (AVILEZ, et al;

2008).

A catalase é uma proteína citoplasmática que catalisa a redução do H2O2 a

H2O e O2, encontrada no sangue, na medula óssea, mucosas, nos rins e no fígado,

sua atividade é dependente de NADPH. A catalase exógena previne a oxidação da

GSH e inibe as lesões oxidativas do DNA (BELLÓ 2002). O estresse oxidativo

decorrente de agressões térmica nos eritrócitos diminui a atividade da catalase

durante o processo hemolítico termo dependente (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).

2.5 ÁCIDO GÁLICO E DERIVADOS

Ervas, plantas e chás são alvos mais importantes na busca por antioxidantes

naturais. O homem tem usado estes produtos desde a época pré-histórica não

somente para aromatizar os alimentos, mas também devido as suas propriedades

anti-sépticas e medicinais (DELAPORTE, 2002). A utilização de plantas medicinais

e seus componentes ativos estão se tornando uma alternativa cada vez mais

atraente para o tratamento terapêutico de várias doenças entre pacientes que não

respondem ao tratamento com medicamento convencional. As plantas contêm um

grande número de substâncias de natureza polifenólica com capacidade de reduzir

processos inflamatórios, consequentemente aumentar a resistência a determinadas

enfermidades incluindo o câncer (BENGMARK, MESA, GIL, 2008).O

desenvolvimento de fármacos a partir de fontes naturais tem se tornado um alvo

promissor para a indústria farmacêutica a nível mundial (PANDEY 1998). Entre os

compostos fenólicos mais estudados encontram-se, o ácido gálico, e seus

derivados, devido ao potencial antioxidante, parece reduzir a incidência de doenças

como a aterosclerose e o câncer, sendo assim, pode-se investigar a ação

hepatoprotetora do ácido gálico e seus derivados (LOCATELLI et al., 2009). O ácido

gálico foi usado como protótipo para a síntese de vários análogos simples com

potencial para estudos em Química Medicinal (KROES,1992).

Os flavonóide presente nos vegetais, frutas, chás, vinho tinto, representa um

antioxidantes de origem vegetal com maior potencial antioxidante (DAJAS et al.,

2003), em sua estrutura química possui grupos hidroxila fenólicos, o que lhes

conferem uma ação antioxidante com importante potencial terapêutico, contra muitas

doenças como doenças isquêmicas do coração, arterosclerose, fibrose hepática,

33

lesão renal e obstrução biliar crônica. O ácido gálico, que apresenta capacidade

antioxidante, pode impedir ou diminuir a progressão da fibrose, reduzindo a ação

dos radicais livres, que estão relacionados com o estresse oxidativo, causando dano

hepático. (PERES et al., 2000b, MORALES et al., 2006, TOKYOL et al., 2006).

O ácido gálico (Figura 1) consiste em uma estrutura fenólica tri-hidroxilada, é

um intermediário do metabolismo vegetal secundário, e é frequentemente um

componente de taninos hidrolisáveis em plantas. (GRUNDHÖFER et al., 2001). O

ácido gálico é encontrado na noz-de-galha, no sumagre, na hamamélis, nas folhas

de chá, no súber do carvalho (GRUNDHÖFER et al., 2001).

Figura 1 – Fórmula molecular do ácido gálico e dudecil galato.

Fonte: Cordova (2011). Universidade Federal de Santa Catarina.

Os n-alquil ésteres conhecidos como galatos, em especial o galato de propila,

octila e dodecila, são amplamente utilizados como antioxidante pelas indústrias de

alimentos, cosméticos e medicamentos. (ABDELWAHED A, 2007).

Os avanços na compreensão das bases fisiopatológicas da fibrogênese estão

levando a novas abordagens terapêuticas, sendo a estratégia mais eficaz para

reversão da fibrose com uso de substâncias antifibróticas, inibindo a deposição de

matriz, síntese de colágeno, a modulação da ativação de células estreladas,

reforçando a degradação da matriz, ou a estimulação da morte celular ou apoptose

das células estreladas hepáticas (ÖZÇELIK B, 2011).

Estudos têm mostrado que o ácido gálico possui uma variedade de ações

farmacológicas, incluindo as atividades antioxidantes, anti-inflamatórias,

antimicrobiana, antiviral e antitumoral (LOCATELLI et al., 2009). Em modelos

animais, ácido gálico reduz o estresse oxidativo e melhoram os níveis de glutationa

34

(GSH), peroxidase de GSH, GSH redutase e GSH-S-transferase em tecido hepático,

bem como catalase (BRUN, 2005).

O ácido gálico é conhecido por induzir a morte celular ou parada do ciclo

celular em várias linhagens de células tumorais (HAZRA S, 2004).

2.6 GENE P53 E O PROCESSO DE ESTRESSE OXIDATIVO

O DNA, lipídeos, proteínas e açúcares, são as principais moléculas que

sofrem ataque das ERO, os fatores que determinam a preferência do ataque podem

ser o local onde a espécie reativa é gerada, a habilidade relativa de uma

biomolécula ser oxidada e a disponibilidade de íons metálicos associados a essa

biomolécula (EVANS, et. al., 2004. BERRA et. al., 2006).

No DNA, a indução dos danos oxidativos ocorre assim que as bases

nitrogenadas reagem com EROS. A oxidação direta dos ácidos nucleicos pode levar

a formação de quebras em uma das cadeias do DNA, ou quebras simples em

posições aproximadamente simétricas nas duas cadeias do DNA. Durante a fase de

replicação celular as quebras simples geradas pelo estresse oxidativo podem gerar

quebras duplas. Foram identificados mais de 20 tipos de danos nas bases do DNA,

quando a biomolécula é exposta a diferentes formas de extresse oxidativo, induzidos

tanto in vitro quanto in vivo (SLUPPHAUG, et.al. 2003).

Entre as bases nitrogenadas a guanina exibe o menor potencial de ionização,

sido estudada preferencialmente nas reações de oxidação, sendo utilizada como

modelo no estudo da oxidação de bases nitrogenadas. A guanina pode reagir com o

radical hidroxila (•OH) e com o oxigênio Singlete (1O2), a hidratação de radicais

catiônicos da guanina leva, predominantemente, à formação de 8-oxodGuo

(OLINSKI, et.al. 2003; CADET, et.al. 2008).

A importância biológica da guanina oxidada é relacionada ao

emparelhamento errôneo com a adenina, gerando uma transversão de GC para TA,

o 8-oxodGuo parece ser capaz de bloquear a transcrição. O reparo do DNA está

interligado ao ciclo celular e a regulação dos mecanismos de transcrição e

replicação utiliza em partes fatores comuns (EVANS, et. al., 2004).

Quando a capacidade de reparo é superada pelo tipo e quantidade de danos

os mecanismos celulares essenciais podem ser afetados seriamente, caso as lesões

não sejam removidas podem levar a morte celular, incorporação de mutações no

35

genoma, provocar efeitos genotóxicos severos até o aparecimento do câncer

(COSTA, et.al. 2005; CADET, et.al. 2008).

Estudos realizados com diferentes linhagens celulares têm demonstrado que

a utilização de compostos antioxidantes como o ácido gálico e seus derivados

promovem a citotoxidade, (ALBINI, 2007, LOCATELLI, 2009).

O ácido gálico por ser um composto doador de elétrons é capaz de neutralizar

os radicais livres, sendo capaz também de intervir na ativação de proteínas que

atuam nas vias de sinalização e nas proteínas de supressão tumoral como as

proteínas p53, atuando como inibidores da transformação do ciclo celular (KASTAN,

et.al.1991; LARSEN, 1994; KIM, 2007).

O gene p53 é uma proteína sintetizada pela própria célula. As mutações

somáticas no gene supressor tumoral p53 são encontradas em aproximadamente

50% de todos os tumores humanos (MORI T. 2002).

Um dos genes supressores mais estudados em tumores humanos é o p53.

Este gene codifica uma fosfoproteína nuclear (p53) que tem papel ativo na parada

do ciclo celular e indução da expressão de genes de reparo de DNA lesado. Quando

há lesão no DNA o nível de p53 na célula aumenta e após o reparo o nível diminui.

Dependendo da intensidade do agravo, o p53 pode induzir a morte das células

geneticamente alteradas (NAKAMURA S, 2002).

Os genes supressores de tumores estão localizados no braço curto do

cromossomo humano 17, é codificado pela fosfoproteína p53, sendo hoje a principal

linha de pesquisa para descoberta de novos tratamentos contra o câncer

(ROBERTIS Jr., 2003).

A proteína codificada pelo gene p53, atua como um freio que impede o

agente carcinogênico que é ativado por situações de estresse como o estresse

oxidativo (EROs e ERNs), através dos raios ultravioletas, raios gama, hipóxia, perda

de contato entre as células. Quando detectado dano no DNA, o p53 interrompe o

ciclo celular para reparar ou se não for possível leva a apoptose (SOUSSI et al.,

1994).

36

Esquema 6 – Interações do p53 com o sistema imune.

Fonte: Adaptado de Lowe, et.al. (2013).

O gene p53 como mostra a (Esquema 6) é ativado quando o sistema imune

recebe sinais exógenos como danos ao DNA, infecções por vírus e doenças,

também é ativado por fatores endógenos como a geração de EROs e ERNs, hipóxia

e proliferação celular fora do controle, ativando a rede transicional levando a

resposta imune inata no organismo (redox e sinalização) e a imunidade adaptativa

acontece levando a ativação das células T e NK. A expressão do gene p53 pode

afetar o crescimento e morte de células envolvidas diretamente na formação de

tumores, modificar a imunidade do organismo e provocar melhoras em casos de

inflamações (LOWE, et.al.; 2013). O gene p53 atua em todas as fases da

carcinogênese, além dessa função de proteger, funciona como fator de transcrição,

produzindo micro RNAs, essas moléculas regulam negativamente a expressão de

outros genes. O p53 atua na regulação da atividade metabólica e exerce um

importante papel na fixação do embrião no útero e na diferenciação de tecidos

37

embrionários. Um dos desafios encontrados pelos pesquisadores é aplicar o

conhecimento adquirido do p53 na prática, para diagnóstico, como para prognóstico

do câncer (WU et al., 2002). O p53 mutado é observado em 75% das famílias, a

uma possível associação entre etnia e polimorfismos constitucionais do p53, que

confere um risco aumentado para câncer de pulmão por afetar a função da proteína

p53 (WU et al., 2002).

O mecanismo de ação da proteína p53, durante a fase G1 da divisão celular,

faz uma verificação quanto a mutações na sequência do código genético decorrente

de um eventual erro de replicação, caso seja encontrado o erro de pareamento de

bases, é função da proteína p53, através do desdobramento de uma cascata de

reações químicas no interior da célula impedir que ocorra a mitose e se complete a

divisão de uma célula mutante (ROBERTIS Jr., 2003).

Dois caminhos podem ser seguidos, a correção da mutação através das

proteínas de reparo do DNA ou, na impossibilidade de correção, a indução da

apoptose celular. Na correção ou indução da morte celular, a proteína p53 é

considerada um elemento chave na prevenção e desenvolvimento de tumores,

sendo gene codificador classificado como gene supressor de tumor. (ALVES et al.,

2004).

A importância da p53 e a compreensão dos mecanismos da função desta

proteína é um dos principais desafios (BAI; ZHU, 2006).

38

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Investigar o efeito hepatoprotetor do ácido gálico e dodecilgalato contra o

estresse oxidativo induzido pelo tetracloreto de carbono (CCl4) em modelo

experimental in vivo.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar a integridade hepática após administração de CCl4, ácido gálico ou

dodecilgalato em ratos através da análise das enzimas séricas,

aspartatoamonotrasferase (AST), alanina aminotransferas (ALT), gama

glutamiltransferase (-GT), bilirrubina e por meio de análise histopatológica;

Avaliar o efeito protetor do ácido gálico e dodecilgalato contra o estresse

oxidativo induzido pelo CCl4 em ratos através da determinação dos níveis de

peroxidação lipídica, determinação de glutationa e da atividade das enzimas

Glutationa peroxidase, glutationa redutase, glutationa-S-transferase e

Catalase;

Investigar o efeito do tratamento com tetracloreto de carbono, ácido gálico e

dodecilgalato na expressão do gene p53 após administração de CCl4 em

ratos.

39

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 REAGENTES

Os conjuntos de reagentes para as determinações do colesterol total,

triglicerídeos, alaninaaminotransferase (ALT) e aspartatoaminotransferase (AST),

gama-glutamiltransferase (GGT), bilirrubina total e albumina foram obtidos da

empresa Labtest Diagnóstica S.A. (Lagoa Santa – MG).

Os reagentes relacionados a seguir foram adquiridos da Sigma (Steinheim,

Alemanha ou St. Louis, EUA): reagente de Folin-Ciocalteau, bicarbonato de sódio,

ácido tiobarbitúrico (TBA), albumina sérica bovina, ácido 5,5-ditio-bis (2-

nitrobenzóico) (DTNB), glutationa reduzida (GSH), ácido tricloroacético (TCA),

glutationa redutase, ácido gálico, dodecilgalato, hidróxido de sódio, ácido clorídrico,

butanol, clorofórmio, ácido ortofosfórico, ácido metafosfórico, peróxido de hidrogênio

e fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) foram adquiridos da empresa VETEC

(Rio de Janeiro, RJ); ácido perclórico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ,

hidroperóxido de tert-butil, fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4.H2O), sulfato de

magnésio (MgSO4).

Carbonato de sódio, hidróxido de sódio, sulfato de cobre, tartarato de sódio e

potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio, peroxido de hidrogênio, tampão Pi,

tampão TRIS-HCl, NADPH, Tris-HCl, Etanol absoluto, NONIDET P 40, cloreto de

sódio, T.E., buffer, RNase, agarose, ácido acético, brometo de etídio, reagentes

adquiridos de outras marcas nacionais.

Todas as soluções foram preparadas com água ultrapura (Milli-Q Direct-Q 3

UV-R, Millipore - Billerica, MA, Estados Unidos), com sais de pureza analítica.

4.2 ANIMAIS

Para realização do estudo foram utilizados ratos da espécie Rattus

norvergicus linhagem Wistar, adultos, machos, pesando aproximadamente 250

gramas, advindos do biotério central da Universidade Federal de Santa Catarina –

UFSC. Os animais foram mantidos no biotério da Universidade do Oeste de Santa

Catarina/Campus Videira durante o período experimental, em caixas plásticas com 3

ratos em cada uma, de 47x34x18cm, forradas com maravalha. Os animais foram

40

mantidos em ambiente climatizado 22 ± 3ºC com ciclo de doze horas claro/escuro,

com alimentação e água fornecidas ad libitum. Os animais foram submetidos à

ambientalização por 30 dias antes do início dos experimentos. Ao final do

experimento foram anestesiados com éter para coletada de sangue via punção

ocular e eutanasiados para retirada do fígado. O estudo foi aprovado pelo Comitê de

Ética no Uso de Animais da Universidade do Oeste de Santa Catarina, parecer

CEUA no 004/2014 respeitando-se todas as regras e utilizando de meios para

garantir o estresse mínimo dos animais assegurando assim seu bem-estar durante o

período experimental.

4.3 INDUÇÃO DA HEPATOTOXICIDADE AGUDA E TRATAMENTO

A lesão hepática aguda foi induzida pela administração de CCl4 (0,5ml/Kg de

peso em óleo de oliva, injetado intraperitonealmente (i.p) de acordo com o método

descrito por CARBONARI et al., 2006. Os ratos foram aleatoriamente divididos em

quatro grupos experimentais com seis animais cada grupo. O tratamento com

veículo (1% de DMSO (dimetilsulfóxido) em solução salina), ácido gálico (GA) ou

dodecilgalato (DGA) foi realizado através de gavagem oral conforme segue:

Grupo controle: tratado com veículo diariamente durante 7 dias;

Grupo CCl4 (tetracloreto de carbono): tratado com o veículo diariamente

durante 7 dias, seguido da administração i.p de CCl4 no sétimo dia, 30

minutos após a última administração do veículo;

Grupo GA: tratado com 100mg/Kg de GA diariamente durante 7 dias, seguido

da administração i.p de CCl4 no sétimo dia, 30 minutos após a última

administração de GA;

Grupo DGA: tratado com 100mg/Kg de DGA diariamente durante 7 dias,

seguido da administração i.p de CCl4 no sétimo dia, 30 minutos após a última

administração de DGA.

A dose de GA ou DGA foi escolhida com base em estudos prévios in vivo,

sendo a dose de 100mg/Kg escolhida, pois não mostrou alterações nas enzimas

hepáticas alanina aminotransferase (ALT) e aspartatoaminotransferase

(AST)(RASOOL et al., 2010;KARTKAYA et al., 2013).

Vinte e quatro horas após a administração i.p. de CCl4, o sangue foi coletado

para as análises dos marcadores séricos de função hepática. As amostras de

41

sangue foram centrifugadas a 4000 rpm por 10 minutos, o soro imediatamente

recolhido e armazenado a -20ºC até as análises. Após os animais foram

eutanasiados, a cavidade abdominal dos animais foi aberta, expondo o fígado, que

foi rapidamente incisado, lavado com solução de cloreto de sódio a 0,9%, seco

cuidadosamente em gaze estéril, pesado e em seguida, o lóbulo central foi retirado e

imediatamente fixado por imersão em solução de formalina a 10% tamponada com

tampão fosfato de sódio 100 Mm pH 7.4 para a avaliação histológica. O restante do

fígado foi processado para análise dos marcadores de dano oxidativo e ensaio das

enzimas antioxidantes.

Esquema 7 – Análises realizadas na indução do dano hepático agudo.

42

4.4 INDUÇÃO DA HEPATOTOXICIDADE CRÔNICA E TRATAMENTO

A indução do dano hepático crônico foi realizado através da administração de

uma dose subletal de CCl4 i.p. aos animais durante 4 semanas de acordo com

método estabelecido por KHAN; KHAN; SAHREEN, 2012.Os ratos foram

aleatoriamente divididos em seis grupos experimentais com seis animais cada

grupo. O tratamento com veículo (1% de DMSO (dimetilsulfóxido) em solução

salina), ácido gálico (GA) ou dodecilgalato (DGA) foi realizado através de gavagem

oral (v.o) conforme segue:

Grupo Controle: recebeu somente o veículo (1ml/Kg v.o) e óleo de oliva

(3ml/Kg i.p) duas vezes por semana por 4 semanas;

Grupo CCl4: recebeu o veículo (1ml/Kg v.o) duas vezes por semana por 4

semanas 30 minutos antes da administração de CCl4 i.p. (30% em óleo de

oliva, 3ml/Kg) para indução do dano hepático crônico;

Grupo GA 50mg/Kg: recebeu uma dose de GA de 50mg/Kg v.o duas vezes

por semana por 4 semanas 30 minutos antes da administração de CCl4i.p

(30% em óleo de oliva, 3ml/Kg);

Grupo GA 100mg/Kg: recebeu uma dose de GA de 100mg/Kg v.o duas

vezes por semana por 4 semanas 30 minutos antes da administração de

CCl4i.p (30% em óleo de oliva, 3ml/Kg);

Grupo DGA 50mg/Kg: recebeu uma dose de DGA de 50mg/Kg v.o duas

vezes por semana por 4 semanas 30 minutos antes da administração de

CCl4i.p (30% em óleo de oliva, 3ml/Kg);

Grupo DGA 100 mg/Kg: recebeu uma dose de DGA de 100 mg/Kg v.o duas

vezes por semana por 4 semanas 30 minutos antes da administração de

CCl4i.p (30% em óleo de oliva, 3ml/Kg).

Vinte e quatro horas após o último tratamento, o sangue foi coletado para as

análises dos marcadores séricos de função hepática. As amostras de sangue foram

centrifugadas a 4000 rpm por 10 minutos, o soro imediatamente recolhido e

armazenado a -20ºC até as análises. Após os animais foram eutanaziados, a

cavidade abdominal dos animais foi aberta, expondo o fígado, que foi rapidamente

excisado, lavado com solução de cloreto de sódio a 0,9%, seco cuidadosamente em

gaze estéril, pesado e em seguida, o lóbulo central foi retirado e imediatamente

43

fixado por imersão em solução de formalina a 10% tamponada com tampão fosfato

de sódio 100 Mm pH 7.4 para a avaliação histológica. O restante do fígado foi

processado para análise dos marcadores de dano oxidativo, ensaio das enzimas

antioxidantes e do gene p53.

Esquema 8 – Análises realizadas na indução do dano hepático crônico.

4.5 PARÂMETROS AVALIADOS APÓS A INDUÇÃO DO DANO HEPÁTICO

4.5.1 Avaliação do Ganho de Peso (GP) dos Animais

Os animais submetidos à indução da toxicidade hepática crônica foram

pesados no início e término do tratamento e determinou-se então o ganho de peso

dos animais através da seguinte equação: GP= (Peso final - Peso inicial).

44

4.5.2 Peso Relativo (PR) do Fígado

O fígado dos animais submetidos ao tratamento crônico foi pesado após ser

submergido em solução cloreto de sódio 0,9% para retirada do excesso de sangue.

Em seguida, utilizou-se a gaze para retirada do excesso de liquido do órgão. O PR

do fígado, expresso por 100g de animal, foi calculado a partir da seguinte equação:

PR= (peso do fígado/peso corporal) x100).

4.5.3 Análises de Parâmetros Bioquímicos no Soro

4.5.3.1 Análise Laboratorial de Lipídios Sérico

As concentrações séricas de colesterol total (CT) e dos triglicerídeos (TG)

foram determinadas pelos métodos automatizados e colorimétricos (reação de

Trinder), utilizando-se kits reagentes da Labtest Diagnóstica S.A.®, conforme

especificações do fabricante (Labtest, Lagoa Santa-MG).

4.5.3.2 Análise de Biomarcadores Séricos de Dano Hepático

A função hepática foi avaliada por meio das determinações dos níveis séricos

de aspartatoaminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT), gama

glutamiltransferase (-GT) por método cinético e da concentração de albumina por

reação de ponto final. Em tais determinações, foram utilizados kits reagentes da

Labtest Diagnóstica S.A.®, conforme especificações do fabricante (Labtest, Lagoa

Santa-MG).

4.5.4 Marcadores de Estresse Oxidativo Hepático

4.5.4.1 Preparação dos homogenatos

Os homogenatos foram obtidos em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7.4

contendo 0,1% de Triton X-100 e 150mM de cloreto de sódio na proporção de 1:10

(p/v). A homogeneização foi mantida a 4oC, com cerca de 20 impactos em

homogeneizador, seguidos de centrifugação a 4ºC, em 10000 rpm durante 10

45

minutos. Os sobrenadantes foram mantidos a -20ºC até a sua utilização para a

dosagem da atividade da catalase, glutationa redutase, glutationa peroxidase e

glutationa-S-transferase através de espectrofotometria. A avaliação da

lipoperoxidação foi realizada em homogenato fresco, ou seja, logo após a sua

preparação, assim como a determinação da glutationa reduzida (GSH) através de

espectrofotometria.

4.5.4.2 Lipoperoxidação - Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)

A avaliação da peroxidação lipídica no fígado foi realizada através da

detecção dos derivados dos produtos de oxidação, substâncias que reagem com o

ácido tiobarbitúrico, destacando-se o malondialdeído (MDA), conforme procedimento

descrito por BIRD; DRAPER, 1984. Alíquotas de 250µl de homogenato foram

misturadas com 1 ml de ácido tricloroacético 12%. Ácido tiobarbitúrico 1,0% (1ml),

recém-preparado, foi adicionado e a mistura foi incubada a100ºC, por 60 min. Após

resfriamento em água com gelo, centrifugados a 10000 rpm por 5 min. As

absorbâncias do sobrenadante foram lidas em 532 nm. Os resultados foram

expressos em µmol/mg de proteína.

4.5.4.3 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH)

Para determinação da mesma foi retirado 0,1 g de fígado, o qual foi

submetido à ação do ácido tricloroacético (TCA) a 12%. O TCA promove a

precipitação de proteínas deixando no sobrenadante o tripeptídeo glutationa, o qual

foi quantificado utilizando-se o ácido 5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzóico (DTNB) conforme

método descrito por TIETZE, 1969. Nesse método, os grupamentos sulfidrilas da

GSH interagem com o DTNB, originando a GSTNB (forma oxidada de GSH).

Concomitantemente à formação de GSTNB e GSH, há liberação de ácido 5-tio-2-

nitrobenzóico (TNB), um composto de coloração amarela. Sendo assim, a

intensidade de cor produzida pelo TNB é diretamente proporcional aos níveis de

GSH intracelular, a qual foi monitorada espectrofotometricamente em 412 nm. Os

resultados foram expressos em mmol/mg de proteína.

46

4.5.4.4 Medida da Atividade da Catalase

A atividade da catalase foi quantificada através do monitoramento da

decomposição do H2O2 durante 2 min em 240 nm (AEBI, 1984). O sistema de

reação continha tampão fosfato50 mM pH 7,0, H2O2 0,3 M e amostra (homogenato).

Uma unidade de catalase equivale à quantidade de enzima que hidrolisa 1 mol de

substrato por minuto e por miligrama de proteína. Os resultados foram expressos em

mmol/mg de proteína/minuto.

4.5.4.5 Medida da Atividade da Glutationa Peroxidase

A atividade da glutationa peroxidase (GPx) foi avaliada pelo método de

FLOHÉ; GÜNZLER, 1984. O sistema de reação continha tampão fosfato 0,1M pH

7,0, ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA) 0,005M, glutationa redutase (GR)

0,1U/ml, glutationa reduzida (GSH), t-butilhidroperóxido (t-BuOOH), NADPH e

amostra (homogenato). Neste ensaio a GPx presente na amostra dismuta o t-

BuOOH do ensaio, gerando para isso uma ponte dissulfeto entre duas GSH, que por

sua vez volta ao estado reduzido por ação da GR. A GR age mediante a oxidação

de NADPH, assim o ensaio é uma medida indireta que consiste em registrar a

diminuição de NADPH. Os resultados foram expressos em µmol/mg de

proteína/minuto.

4.5.4.6 Medida da Atividade da Glutationa Redutase

O método utilizado para análise da atividade desta enzima foi proposto por

CARLBERG; MANNERVIK, 1985, onde se verifica, durante 60 segundos, em 340

nm, a taxa de oxidação do NADPH devido à redução da GSSG pela GR presente na

amostra. O sistema de reação continha tampão fosfato 0,1M pH 7,0, ácido

dietilenotriaminopentaacético (DTPA) 0,005M, NADPH, glutationa oxidada (GSSG) e

amostra (homogenato). Os resultados foram expressos em µmol/mg de

proteína/minuto.

47

4.5.4.7 Medida da Atividade da Glutationa-S-transferase

A atividade da glutationa-s-transferase (GST), foi estimada pelo método de

HABIG; PABST; JAKOBY, 1974. O sistema de reação continha 0,5 M de tampão

fosfato (pH 6,5), 30 mM de 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB), 30 mM de GSH e

amostra (homogenato) a absorbância foi avaliada em 340 nm durante 60 segundos.

A atividade foi expressa em mmol/mg de proteína/minuto.

4.5.5 Dosagem de Proteínas

A dosagem de proteína no homogenato de fígado foi realizada pelo método

de LOWRY et al., 1951. O método baseia-se numa mistura contendo molibdato,

tungstato e ácido fosfórico (Folin-Ciocalteau), o qual na presença do catalisador

cobre (II) em meio alcalino, reage com proteínas sofrendo uma redução e

produzindo um composto com absorção máxima em 750nm. Na determinação da

concentração de proteína amostra (diluídas 1:4 (v/v) em água foi adicionada a um

meio contendo solução alcalina, carbonato de sódio, hidróxido de sódio, tartarato de

sódio e sulfato de cobre). Após um período de incubação de 10 minutos em

temperatura ambiente, foi adicionado o reagente de Folin previamente diluído e

incubado por mais 30 minutos. A leitura foi realizada em 750 nm e as concentrações

foram obtidas através de uma curva padrão utilizando albumina sérica bovina (BSA).

4.5.6 Preparo da Amostra para realização do ensaio da Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR) e análise de transcrição do P53.

4.5.6.1 Extração de RNA

O RNA total da amostra de fígado foi extraído com de TRIZOL® (Invitrogen)

logo após sua retirada. Após incubação à temperatura ambiente (TA), às amostras

foi adicionado clorofórmio e as mesmas foram agitadas e incubadas por 3 minutos a

TA. As amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 12000 rpm (2-8ºC). A fase

aquosa foi coletada e transferida para um novo tubo onde adicionou-se mais álcool

isopropílico. Agitou-se, incubou-se por 10 minutos a TA e centrifugou-se por 10

minutos a 12000 rpm.O sobrenadante foi removido, o decantado foi lavado com

48

etanol 75% e posteriormente centrifugados por 5 minutos a 7500 rpm (2-8ºC). O

sobrenadante foi removido, o decantado foi seco a TA e o RNA foi dissolvido em 20

µL de água DEPC. O RNA extraído foi quantificado por leitura espectrofotométrica e

a pureza foi avaliada através da razão 260/280 e 260/230. Dois microgramas de

RNA foram tratados com DNAse 1 (Invitrogen) segundo protocolo do fabricante.

4.5.6.2 Síntese de cDNA

A síntese de DNA complementar (cDNA) foi realizada utilizando

o kit High-Capacityc DNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, Foster City,

CA, EUA). Em um microtubo de 0,2 mL o volume de RNA correspondente à

concentração de 2 µg foi acrescido de 2 μl de iniciadores randômicos e água até o

volume final de 10 μl. A reação foi incubada a 65°C por 5 minutos. Em seguida, o

microtubo foi mantido em gelo e foram acrescentados 8μl da mistura da reação

contendo 2 μl de tampão 10X, 0,8 μl de 25X dNTP (100mM), 1,0 μl da enzima

transcriptase reversa MultiScribeTM, 0,4 μl de Inibidor de RNAse (RNAsin;Promega,

Madison, WI, EUA) e 3,8 ul de água. A reação foi incubada a 25°C por 10 minutos,

seguido por 37°C por 2 h e finalmente a 85°C por 5 minutos. Assim foi obtido um

volume final de 20 μl de cDNA armazenado a -20°C até sua utilização para as

reações de amplificação por reação em cadeia da polimerase quantitativo (qPCR).

Todas as incubações foram realizadas em termociclador Biocycler.

4.5.6.3 Curva de eficiência da reação de PCR

Visando determinar a eficiência da reação de PCR em tempo real,

uma curva foi feita com diferentes concentrações de cDNA (1/25, 1/125,

1/625, 1/3125) para os pares de oligonucleotídeos (tabela 1). A amplificação foi

realizada utilizando o Power SYBR-Green PCR MasterMix (AppliedBiosystems,

Foster City, CA, EUA), conforme recomendação do fabricante. A análise da

regressão linear dos valores de Cts em função do logarítmo da respectiva diluição

forneceu o coeficiente angular da reta (a, em y=ax+b) que foi utilizado para o cálculo

da eficiência da amplificação dos produtos.

49

Tabela 1 – Oligonucleotídeos utilizados na reação de qPCR.

Gene Senso Antisenso Produto

p53 5´GTAAACGCTTCGAGATGTCC-3´ 5´-GACTGGCCCTTCTTGGTCT-3´ 123

GAPDH 5´-GTGTCCGTCGTGGATCTGAC-3 ´5´-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3´ 132

4.5.6.4 Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR)

A análise da expressão gênica foi realizada através da quantificação relativa

de cada gene em relação a um gene de expressão constitutiva. Esta quantificação

foi possível de ser realizada já que todos os oligonucleotídeos apresentaram

eficiências semelhantes ao controle endógeno e próximas a 100%. A quantificação

relativa descreve mudanças de nível de expressão de um gene de interesse em uma

amostra teste, relacionando esses valores a uma amostra utilizada como calibrador.

Este calibrador pode, por exemplo, ser uma amostra que não recebeu o tratamento

em estudo. A partir destes critérios, pode-se utilizar o método comparativo 2–ΔΔCt

(LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). A quantificação relativa permite uma acurada

comparação dos níveis de expressão de gene de interesse em uma amostra em

relação à outra amostra.

A expressão do gene p53 foi quantificada por meio do método de PCR

quantitativo (qPCR) utilizando GAPDH como controle endógeno e o kit Power SYBR-

GreenPCR Master Mix® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) conforme

indicações do fabricante. O ensaio de PCR em tempo real foi realizado em

termociclador ABI 7900HT (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA), nas seguintes

condições: 50°C por 2 m, 95 °C por 10 minutos, 40 ciclos de 15s a 95°C para

término do processo de desnaturação e por fim anelamento e elongação dos

oligonucleotídeos a 57°C por 1 minuto. Para todos os experimentos, o limiar de

amplificação (Ct) foi determinado automaticamente pelo software. Após o processo

de amplificação, as amostras foram submetidas acurva de dissociação dos

amplicons que representa a relação entre a temperatura e a quantidade de emissão

de fluorescência da reação de PCR. Acurva de dissociação permite verificar a

formação de dímeros de oligonucleotídeos, amplificações inespecíficas, possíveis

erros e contaminações.

50

4.6 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA

Os tecidos de fígado foram processados por técnicas histopatológicas padrão

e seccionados em pedaços de 5-8 m de largura com um micrótono rotatório a

temperatura ambiente e fixados a uma solução de formalina a 10 % preparada em

tampão fosfato a pH neutro. As amostras foram então coradas com hematoxilina e

eosina (H & E) e observados pelo patologista em microscópio ótico de maneira

“cega” com magnificação de 400 X.

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM).

Para a análise estatística, foram utilizados os programas GraphPadPrism 5. Foi

utilizada a análise de variância de uma via (ANOVA), seguido do pós-teste de

Dunnett (fixando 1 grupo controle). As diferenças observadas durante a análise

foram consideradas estatisticamente significativas quando a probabilidade foi menor

que 0,05 (5%).

4.8 DESENHO EXPERIMENTAL

O efeito hepatoprotetor do ácido gálico e dodecilgalato foi avaliado em ratos

intoxicados com CCl4 (Esquema 7 e 8). Os parâmetros avaliados incluíram a

variação do peso corporal, peso relativo do fígado, avaliação sérica da função

hepática, dosagens de lipídios plasmáticos, avaliação anatomopatológica, de

estresse oxidativo e investigação do gene p53.

51

5 RESULTADOS

Visto que o dano hepático causado pelo CCl4 está associado a presença de

EROs neste estudo verificamos a capacidade do ácido gálico e dodecilgalato,

importantes antioxidantes, em reverte ou prevenir o dano hepático agudo e a fibrose

hepática causada pelo CCl4 em ratos.

5.1 EFEITO DO ÁCIDO GÁLICO E DODECILGALATO NO DANO HEPÁTICO

AGUDO CAUSADO PELO CCL4

No modelo de dano agudo os animais receberam durante 7 dias uma dose de

100mg/Kg de ácido gálico ou dodecilgalato e no 7 dia, trinta minutos após a última

administração, uma dose única i.p de CCl4. Neste modelo observou-se que os

animais tratados com GA, DGA ou CCl4 não tiveram variação significativa no ganho

de peso (Gráfico 1A), no entanto, a administração de uma única dose de CCl4 foi

capaz de levar a um aumento de aproximadamente 40% no peso relativo do fígado,

o qual foi prevenido pelo pré tratamento com DGA 100mg/Kg (Gráfico 1B).

Gráfico 1 - Efeito do tratamento com GA e DGA no ganho de peso corporal e peso relativo do fígado em ratos intoxicados com CCl4.

Os animais foram tratados durante 7 dias com GA (ácido gálico) ou DGA (dodecilgalato) na dose de 100 mg/Kg e no 7º dia 30 minutos após a última dose de GA ou DGA receberam uma dose de CCl4. (A) Ganho de peso corporal em 7 dias de tratamento; (B) Peso relativo do fígado. Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.

52

A avaliação bioquímica do soro (Tabela 2), mostrou alterações significativas

nos valores de bilirrubina total, ALT, AST e -GT nos animais tratados com dose

única de CCl4, quando estes foram comparados com os animais controle (sem

tratamento). O pré-tratamento dos animais com GA ou DGA foi capaz de prevenir a

lesão aguda causando uma redução significativa nos marcadores de dano hepático

(Tabela 2). Os valores de triglicerídeos, colesterol total e albumina não mostraram

alterações significativas em relação ao grupo controle em nenhum dos tratamentos

realizados.

Tabela 2 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalatono dano hepático agudo induzido por CCl4.

Grupo TGmg/dl CTmg/dl Albumina g/dl

BTmg/dl ALT (U/L)

AST (U/L)

-GT (U/L)

Controle 59,7 ± 4,21

115 ± 15 2,88 ± 0,15

0,34 ± 0,021

48,7 ± 3,98

104 ± 2,32

37,5 ± 0,5

CCl4 78 ± 8,9 91,8 ± 6,06

2,70 ± 0,04

0,8 ± 0,045*

335,2 ±

28,5*

426,2 ± 72,4*

171,2 ± 19,5*

CCl4 + GA 100mg/Kg

86 ± 7,2 93,6 ± 6,43

2,83 ± 0,070

0,5 ± 0,056#

202,7 ± 65*#

289 ± 86,6*#

142 ±20*

CCl4+ DGA 100

mg/Kg

55,2 ± 8,3

84 ± 7,3 2,7 ± 0,11 0,58 ± 0,057#

195 ± 13,7*#

293 ± 46*#

47,2 ± 5,32#

GA (ácido gálico), DGA (dodecilgalato), TG (triglicerídeos), CT (colesterol total), BT (bilirrubina total),

AST (aspartatoaminotransferase), ALT (alanina aminotransferase), -GT (gama glutamiltransferase); *p< 0,05 diferença significativa em relação ao controle; # p<0,05 diferença significativa em relação ao CCl4.

No (Gráfico 2) pode-se verificar que o tratamento prévio com GA e DGA

100mg/Kg foi capaz de inibir a peroxidação lipídica causada no fígado de ratos

tratados com dose única de CCl4 e impedir a depleção na concentração de

glutationa hepática reduzida (GSH).

53

Gráfico 2 – Efeito do tratamento com GA e DGA na indução da peroxidação lipídica e redução da concentração de glutationa hepática reduzida promovida pela administração de dose única de CCl4.

Os animais foram tratados durante 7 dias com GA (ácido gálico) ou DGA (dodecilgalato) na dose de 100 mg/Kg e no 7º dia 30 minutos após a última dose de GA ou DGA receberam uma dose de CCl4. (A) Concentração de TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico); (B) Concentração de GSH (glutationa reduzida). Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.

Os animais intoxicados com CCl4 e tratados com GA 100mg/Kg mostram um

aumento significativo na atividade da catalase (Gráfico 3A), enquanto os animais

tratados com DGA 100mg/Kg mostraram aumento significativo na atividade das

enzimas GR e GST (Gráfico 3B e C).

54

Gráfico 3 – Efeito do tratamento com GA e DGA na atividade das enzimas antioxidantes em ratos intoxicados com CCl4.

Os animais foram tratados durante 7 dias com GA (ácido gálico) ou DGA (dodecilgalato) na dose de 100 mg/Kg e no 7º dia 30 minutos após a última dose de GA ou DGA receberam uma dose de CCl4. (A) Atividade da catalase; (B) Atividade da GR (Glutationa redutase) ;(C) Atividade da GST (Glutationa-S-Transferase). Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.

A análise histológica mostrou que todos os animais tratamentos com CCl4

apresentaram necrose de coagulação centro a médio lobular, circundada por

hepatócitos totalmente vacuolizados (Figura 2B). O grupo que recebeu tratamento

prévio com GA 100 mg/Kg mostrou necrose de coagulação centro médio lobular, no

entanto, com número variável de hepatócitos vacuolizados, sendo que um animal

apresentou necrose coagulativa individual (Figura 2C e D). Os animais que

receberam tratamento prévio com DGA 100 mg/Kg três apresentaram necrose de

coagulação individual com degeneração vacuolar difusa do citoplasma dos

hepatócitos; dois necrose coagulativa centro a médio lobular e outros dois além de

necrose coagulativa centro a médio lobular apresentaram vacuolização nos

hepatócitos (Figura 2 E e F).

55

Figura 2 – Efeito do tratamento com GA e DGA nas alterações histológicas hepáticas em ratos intoxicados com CCl4.

As alterações histológicas são mostradas capôs coloração com hematoxilia/eosina (H&E 40x). (A) Foto representativa do fígado do grupo controle; (B) Foto representativa do fígado do grupo tratado com CCl4 (0,5 ml/Kg em óleo de oliva); (C) e (D) Fotos representativas do grupo tratado com GA 100 mg/Kg 7 dias e co-tratados com CCl4 0,5 ml/Kg em óleo de oliva no 7º dia; (E) e (F)) Fotos representativas do grupo tratado com DGA 100 mg/Kg 7 dias e co-tratados com CCl4 0,5 ml/Kg em

óleo de oliva no 7º dia. necrose coagulativa; hepatócitos vacuolizados.

5.2 EFEITO DO ÁCIDO GÁLICO E DODECILGALATO NO DANO HEPÁTICO

CRÔNICO CAUSADO PELO CCL4

Neste modelo os animais foram tratados com CCl4 duas vezes por semana

durante 4 semanas, juntamente com GA ou DGA (50 ou 100mg/Kg). O (Gráfico 4A)

mostra que os animais que receberam CCl4 tiveram uma perda significativa de peso

quando comparados ao grupo controle, enquanto os animais tratados com CCl4

56

associado ao GA (50 e 100mg/Kg) ou DGA (50 e 100mg/Kg) mostraram um

aumento no peso corporal, embora menor do que o grupo controle.

Gráfico 4 – Efeito do tratamento com GA e DGA no ganho de peso corporal e peso relativo do fígado em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4.

Os animais foram expostos ao CCl4duas vezes por semana por 4 semanas e nos mesmos dias tratados com GA (ácido gálico 50 ou 100 mg/Kg) ou com DGA (dodecilgalato 50 ou 100 mg/Kg) (A) Ganho de peso corporal em 4 semanas de tratamento; (B) Peso relativo do fígado. Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.

O (Gráfico 4B) mostra que os animais tratados com CCl4 tiveram um aumento

significativo no peso relativo do fígado de aproximadamente 26% quando

comparados ao grupo controle, enquanto o tratamento com GA 50 e 100 mg/Kg e

DGA 50 mg/Kg foi capaz de inibir o aumento relativo deste órgão, no entanto, o

tratamento com DGA 100 mg/Kg não conseguiu impedir o efeito do CCl4 no aumento

do fígado.

A (Tabela 3) mostra os parâmetros séricos de lipídios, albumina, bilirrubina

total, transaminases (ALT e AST) e gama-glutamiltransferase (-GT) de animais com

fibrose hepática induzida por CCl4 e tratados com GA e DGA nas doses de 50 e 100

mg/Kg. O grupo tratado com CCl4 e que não recebeu nenhuma dose de GA ou DGA

mostrou alterações significativas nos valores de triglicerídeos, bilirrubina total (BT),

ALT, AST e -GT quando comparado ao grupo controle. Os animais que receberam

57

GA nas doses de 50 e 100 mg/Kg mostraram redução significativa nos valores das

transaminases (ALT e AST) e -GT quando comparados aos animais tratados

somente com CCl4, embora os valores de BT nos animais tratados com GA 100

mg/Kg mostrem alterações significativas em relação ao grupo controle. O tratamento

com DGA 50 mg/Kg parece ter sido mais efetivo do que o tratamento com a dose de

100 mg/Kg, visto que os valores de triglicerídeos, BT, ALT, AST e -GT mostram

reduções significativas quando comparado ao grupo tratado somente com CCl4,

chegando a valores séricos destes parâmetros comparáveis ao grupo controle.

Tabela 3 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalato nos parâmetros séricos de ratos com fibrose hepática induzida pelo tratamento crônico com CCl4.

Grupo TG mg/dl

CT mg/dl

Albumina g/dl

BT mg/dl ALT (U/L)

AST (U/L) -GT (U/L)

Controle 66 ± 1,88

90,5 ± 3,92

2,86 ± 0,056

0,31 ± 0,029

57,6 ± 3,88

113 ± 2,3 52 ± 5,46

CCl4 101 ± 7,7*

75,5 ± 5,23

2,75 ± 0,13 0,99 ± 0,11*

324 ± 30*

445,2 ± 16*

161,8 ±25*

CCl4 + GA

50mg/Kg

92 ± 9,4

84,8 ± 5,6

2,95 ± 0,12 0,51 ± 0,081#

138,2 ± 25*#

147,2 ± 44#

99,2 ± 20,2#

CCl4+ GA 100

mg/Kg

91 ± 11

81,5 ± 9,7

2,87 ± 0,102

0,87 ± 0,15*

82,5 ±12,4#

61,7 ± 3,52#

95,2 ± 11,65#

CCl4 + DGA

50mg/Kg

48 ± 2,31#

84,5 ± 7,19

2,93 ± 0,025

0,48 ± 0,058#

99 ± 13,4#

97,7 ± 13,5#

164,7 ± 13*

CCl4+ DGA 100

mg/Kg

107 ± 16*

105 ±4,91

2,71 ± 0,22 1,02 ± 0,13*

154,7 ± 65*#

175,2 ± 13,9#

161 ± 5,26*

GA (ácido gálico), DGA (dodecilgalato), TG (triglicerídeos), CT (colesterol total), BT (bilirrubina total),

AST (aspartatoaminotransferase), ALT (alanina aminotransferase), -GT (gama glutamiltransferase); *p< 0,05 diferença significativa em relação ao controle; # p<0,05 diferença significativa em relação ao CCl4.

O (Gráfico 5) mostra que o tratamento com CCl4 durante 4 semanas foi capaz

de depletar os níveis hepáticos de GSH e induzir um significativo aumento da

peroxidação lipídica, efeito este revertido pelo tratamento com GA e DGA nas doses

de 50 e 100 mg/Kg.

58

Gráfico 5 – Efeito do tratamento com GA e DGA na peroxidação lipídica (TBARS) e concentração de glutationa reduzida hepática em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4.

Os animais foram expostos ao CCl4duas vezes por semana por 4 semanas e nos mesmos dias tratados com GA (ácido gálico 50 ou 100 mg/Kg) ou com DGA (dodecilgalato 50 ou 100 mg/Kg) (A) Concentração de TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; (B) Concentração de GSH (glutationa reduzida). Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.

O (Gráfico 6) mostra o efeito do tratamento com GA e DGA 50 ou 100 mg/Kg

na atividade das enzimas antioxidantes de ratos com fibrose hepática induzida por

CCl4. Observa-se neste gráfico que com exceção ao tratamento com GA 50 mg/Kg

na atividade da GR (Gráfico 6C) todos os tratamentos incluindo o tratamento com

CCl4 induziram redução significativa na atividade das enzimas antioxidantes quando

comparados ao grupo controle.

59

Gráfico 6 – Efeito do tratamento com GA e DGA na atividade das enzimas antioxidantes em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4.

Os animais foram expostos ao CCl4duas vezes por semana por 4 semanas e nos mesmos dias tratados com GA (ácido gálico 50 ou 100 mg/Kg) ou com DGA (dodecilgalato 50 ou 100 mg/Kg) (A) Atividade da catalase; (B) Atividade da GPx (Glutationa peroxidase); (C) Atividade da GR (Glutationa redutase); (D) Atividade da GST (Glutationa-S-transferase). Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.

A (Figura 3) mostra a análise histológica do fígado dos animais expostos ao

CCl4 e tratados com GA e DGA nas doses de 50 e 100 mg/Kg duas vezes por

semana durante 4 semanas. Observou-se formação de acentuada fibrose hepática;

degeneração gordurosa e hiperplasia de ductos biliares moderada, além de discreta

megalocitose e necrose no fígado dos animais que receberam somente CCl4 (Figura

3B). No grupo tratado com GA 50 e 100 mg/Kg foi observado em ambas as doses

uma discreta fibrose, hiperplasia de ductos biliares e megalocitose, no entanto, foi

possível observar com maior frequência a incidência de mitose no tratamento com

GA 50 mg/Kg e leve degeneração gordurosa em ambos os tratamentos (Figura 3 C

e D respectivamente). O tratamento com DGA na dose de 50 e 100 mg/Kg mostrou

discreta fibrose e hiperplasia de ductos biliares, com presença de degeneração

gordurosa e mitose moderada, sem observar-se nestes grupos a presença de

megalocitose (Figura 3 E e F respectivamente).

60

Figura 3 – Efeito do tratamento com GA e DGA nas alterações histológicas hepáticas em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4.

Os animais foram expostos ao CCl4 duas vezes por semana por 4 semanas e nos mesmos dias tratados com GA (ácido gálico 50 ou 100 mg/Kg) ou com DGA (dodecilgalato 50 ou 100 mg/Kg). As alterações histológicas são mostradas após coloração com hematoxilia/eosina (H&E 40x). (A) Foto representativa do fígado do grupo controle (sem alterações); (B) Foto representativa do fígado do grupo tratado com CCl4; (C) Foto representativa do fígado do grupo tratado com GA 50 mg/Kg; (D) Foto representativa do fígado do grupo tratado com GA 100 mg/Kg; (E) Foto representativa do fígado do grupo tratado com DGA 50 mg/Kg; (F) Foto representativa do fígado do grupo tratado com DGA

100 mg/Kg. fibrose hepática; megalocitose; mitose.

O (Gráfico 7) mostra que o tratamento com GA e DGA nas doses de 50 e 100

mg/Kg foi capaz de promover um aumento significativo na expressão do gene p53

quando comparado aos grupos controle e tratado com CCl4.

61

Gráfico 7 – Efeito do ácido gálico e dodecilgalato na expressão do gene p53 em ratos com fibrose hepática induzida por CCl4.

Os animais foram expostos ao CCl4 duas vezes por semana por 4 semanas e nos mesmos dias tratados com GA (50 ou 100mg/Kg) ou com DGA (50 ou 100mg/Kg). A avaliação da expressão gênica foi realizada por PCR quantitativo em tempo real utilizando GAPDH como controle endógeno. Cada barra representa a Média ± EPM (n=6). Os dados foram expressos em relação ao controle animais sem tratamento considerado como 100%. Valores de *p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o controle sem tratamento e #p,0,05 foram considerados estatisticamente significativos quando comparados com o grupo tratado com CCl4, usando ANOVA seguido do teste de Dunnet.

62

6 DISCUSSÃO

O fígado regula importantes funções metabólicas do organismo, sendo assim,

injurias hepática estão associadas com alterações metabólicas resultando em sérios

problemas de saúde. Entre os principais fatores que podem desencadear doenças

hepáticas encontram-se drogas como o álcool, infecções virais e produtos químicos

como o tetracloreto de carbono. Neste contexto o tetracloreto de carbono (CCl4) é

amplamente utilizado como modelo animal de injuria hepática na busca de

compostos com atividade contra toxinas hepáticas.

Estudos mostram claramente que a clivagem da ligação carbono-cloro (C-Cl)

na molécula de tetracloreto de carbono leva a formação do radical triclorometil

peroxido (CCl3.O2-), o qual está envolvido na patogênese da injúria hepática Slater;

Cheeseman; Ingold, (1985). A hepatotoxicidade causada pelo CCl4 é caracterizada

por vários graus de degeneração do hepatócito e morte celular, os quais resultam da

formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), incluindo o radical hidroxil e

superóxido que são conhecidos pela capacidade de promover a fibrose hepática Wu;

Danielsson; Zern, (1999); Na et al., (2015).

Dinçer et al.,(2002) e Miyazaki et al., (2005), mostram que a administração de

uma única dose de CCl4 em ratos induz um dano hepático agudo sem causar

fibrose, enquanto a administração de doses repetidas por um período de no mínimo

quatro semanas pode levar ao desenvolvimento de fibrose hepática. Nossos

resultados mostram claramente que a administração de CCl4 foi capaz de promover

injúria hepática com alterações nos valores séricos das transaminases (ALT e AST)

e -GT e bilirrubina total (Tabelas 2 e 3) e que estas alterações estão relacionadas a

capacidade do CCl4 induzir um estresse oxidativo evidenciado pelos resultados de

TBARS e GSH (Gráfico 2 e 5).

Um dos mais sensíveis marcadores de injúria hepática é a liberação das

enzimas transaminases (ALT e AST), -GT e BT na circulação. O aumento destes

marcadores hepáticos séricos indicam uma perda da integridade da membrana

celular do fígado, o que pode estar diretamente relacionado com o aumento das

EROs induzido pelo tratamento com CCl4 Cequera, (2014); Al-rasheed et. al., (2015).

Sendo assim, o uso de substâncias antioxidantes pode auxiliar no tratamento de

doenças hepáticas associadas ao excesso de produção de EROs.

63

Neste contexto vários estudos vêm sendo realizados com extrato de plantas

ou com substâncias antioxidantes isoladas na tentativa de encontrar um tratamento

efetivo para as doenças hepáticas associadas ao dano oxidativo, em especial a

fibrose hepática.

Estudo realizado por Khan; Khan; Sahreen, (2012) utilizando a rutina no

tratamento da hepatotoxicidade induzida por CCl4 mostrou resultados similares aos

nossos, com redução significativa nos valores das enzimas séricas ALT, AST e -

GT, da lipoperoxidação hepática evidenciada pelos valores de TBARS e um

aumento de GSH no fígado dos animais tratados com rutina nas doses de 50 e 70

mg/Kg. Tirkey et al.,(2005), utilizou como tratamento a hesperidina nas doses de 100

e 200 mg/Kg evidenciando resultados semelhantes em relação as enzimas séricas e

valores de TBARS e GSH. Estes resultados evidenciam que o uso de substâncias

antioxidantes pode auxiliar no tratamento do dano hepático agudo ou em casos de

fibrose visto que, a maioria dos danos hepáticos induzidos por drogas ou toxinas

está associado ao aumento nos níveis de EROs.

O tratamento com CCl4 em ambos os modelos mostrou redução significativa

na atividade das enzimas antioxidantes CAT, SOD, GPx, GR e GST (Gráfico 3 e 6).

Estes resultados colaboram com os encontrados por outros autores que

evidenciaram tanto na indução do dano hepático agudo quanto da fibrose hepática

uma redução expressiva na atividade das enzimas antioxidantes hepáticas (Ferreira

et al., (2010); Wang et al., (2014). No entanto, Al-rasheed et al., (2015) verificou que

o tratamento com CCl4 é capaz de promover um aumento na atividade da GR do

tecido hepático após 8 semanas de tratamento, fato este não observado em nosso

estudo com 4 semanas de tratamento.

Embora ocorra uma redução expressiva na atividade das enzimas

antioxidantes, o que possivelmente resulte no dano hepático, principalmente a

promoção da fibrose após exposição ao CCl4, vários trabalhos mostram que o

tratamento com substâncias antioxidantes são capazes de reverter este quadro

(Dinçer et al., (2002); Khan; Khan; Sahreen, (2012);Al-sayed et al., (2014); El-sayed

et al., (2015). Nossos resultados são semelhantes a estes estudos com

antioxidantes, o GA e DGA impedem a lipoperoxidação e redução de GSH

provocada pelo CCl4 (Gráfico 2 e 6), no entanto, somente no modelo de dano agudo

nas doses de 100 mg/Kg são capazes de aumentar a atividade da CAT, GR e GST

significativamente em comparação ao tratamento com CCl4 (Gráfico 3). No modelo

64

de fibrose hepática ambos os tratamentos 50 mg/Kg e 100 mg/Kg foram incapazes

de reverter o efeito que o tratamento com CCl4 provocado na atividade das enzimas

CAT, GPx, GR e GST (Gráfico 6).

Conforme se pode verificar no (Gráfico 5) com exceção ao tratamento com

GA 50 mg/Kg que aumentou a atividade da GR, todos os demais tratamentos não

foram capazes de reverter o efeito do CCl4. O aumento na atividade da GR induzido

pelo GA 50 mg/Kg pode melhorar o status antioxidante evitando um dano hepático

mais expressivo, isto é evidenciado pelos resultados da análise histopatológica

(Figura 3 C). A GR apresenta efeito antioxidante visto que esta atua no ciclo de

redução da GSSG (Glutationa oxidada). O aumento de EROs leva um consumo de

GSH para rápida eliminação destas espécies reativas resultando na formação de

GSSG, a qual pode ser rapidamente convertida em GSH (glutationa reduzida) pela

atividade da GR Czeczot et al., (2006).

Neste estudo em ambos os modelos testados verificamos que o peroxidade

lipídica foi significativamente aumentada no tecido hepático dos animais expostos ao

CCl4 indicando a oxidação de lipídios que resulta na injuria do tecido. O conteúdo de

GSH constitui a primeira linha de defesa contra as EROs. A redução de GSH

observada com o tratamento com CCl4 está provavelmente relacionada a diminuição

na síntese deste tripeptideo provocada pela doença hepática ou pode estar

associada ao seu rápido consumo para eliminação das EROs no fígado fibrótico, Al-

rasheed et al., (2015).

A SOD (superóxido dismutase) é uma enzima de defesa extremamente

importante que converte o aníon superóxido em peróxido de hidrogênio, o qual pode

ser degradado pela atividade da CAT ou da GPx que além do peróxido de

hidrogênio metaboliza outros hidroperóxidos a produtos não tóxicos bloqueando a

reação em cadeia de formação de lipoperóxidos e consequentemente o dano da

membrana celular, Al-rasheed et al., (2015).

Além destas enzimas antioxidantes a GST apresenta papel fundamental na

detoxificação de xenobióticos principalmente no tecido hepático. Devido ao seu

papel na biotransformação, a GST é considerada um potente antioxidante que

apresenta elevada capacidade de proteção contra o estresse oxidativo. No presente

estudo observamos uma redução significativa nos valores de GST do grupo tratado

com CCl4, o qual foi revertido pelo tratamento prévio com GA ou DGA 100 mg/Kg, no

65

entanto, no modelo de fibrose não observamos a reversão do efeito de CCl4 (Gráfico

3 e 6).

Em estudo realizado por Vijaya Padma et al., (2011) a administração de GA

50 mg/Kg associado ao lindano durante 30 dias, foi capaz de reverter o efeito tóxico

do lindano aumentando significativamente os valores de GST quando comparado ao

grupo tratado somente com lindano 100 mg/Kg, os autores sugerem que isto pode

ter acontecido devido ao alto poder antioxidante do GA. Apesar de termos utilizado

as doses de 50 e 100 mg/Kg não observamos este efeito, no entanto, visto que o GA

e DGA apresentam grupos hidroxila fenólicos, os quais são eficazes para atividade

antioxidante da molécula a eliminação das EROs pode ter ocorrido diretamente pela

ação do GA e DGA sem alterar a atividade da GST e das outras enzimas

antioxidantes especialmente no modelo de fibrose onde observamos uma redução

expressiva nos valores de CAT, GPx, GR e GST.

A redução na atividade das enzimas antioxidantes pode ter ocorrido, visto que

a presença de substâncias antioxidantes (GA e DGA) pode suprimir a produção de

EROs resultando na diminuição da atividade destas enzimas, Kim et al., (2013)

mostrou resultados semelhantes quando os animais foram submetidos ao

tratamento com extrato de fruta rico em compostos fenólicos, neste estudo os

autores verificaram uma redução na atividade da SOD.

Estudos recentes com antioxidantes mostram que o efeito hepatoprotetor

destes compostos está associado a capacidade de aumentar a concentração

hepática de GSH e a atividade das enzimas antioxidantes principalmente CAT e

SOD Al-olayan et al., (2014); Al-sayed et al., (2014); li, (2015); Liang et al., (2015);

Vladimir-knežević et al., (2015), resultados estes não observados neste estudo, visto

que o tratamento com GA e DGA no modelo de fibrose não foi capaz de reverter o

efeito do CCl4 na atividade das enzimas antioxidantes CAT, GPx, GR e GST. No

entanto, o tratamento foi efetivo na redução do dano hepático promovido pelo CCl4.

O efeito hepatoprotetor do GA e DGA, portanto, pode não estar associado a

capacidade antioxidante mas sim ao aumento na expressão do gene p53, resultado

do aumento de cálcio intracelular, visto que alguns trabalhos mostram que o cálcio

modula a expressão de p53. Chang et al., (2015); Van Ginkel et al., (2015).

Sabe-se que o p53 está envolvido em várias funções biológicas, incluindo a

parada do ciclo celular, senescência celular e apoptose. É por isso que é chamado

de o guardião celular Lane, (1992). Mesmo assim, como p53 determina o destino

66

das células continua a ser uma questão importante. Muitos estudos tem relatado

ligações entre p53 e EROs, Ahmed et al., (2014); Hussain et al., (2004); Kang et al.,

(2012); Vurusaner; Poli; Basaga, (2012). Um aumento celular de EROs favorece a

expressão do p53 que induz a transcrição de genes pró-oxidantes contribuindo

assim, para a morte celular. No entanto, outros trabalhos relatam que o p53 está

associado à expressão de genes antioxidantes tais como o da GPx e SOD,

mostrando que o p53 também tem função protetora e participa no sistema de defesa

antioxidante. Sendo assim o p53 pode apresentar um efeito tanto pró-oxidante como

antioxidante e o que determina isso é a quantidade de EROs presente na célula Tan

et al., (1999).

No presente estudo observamos um aumento significativo na expressão do

gene p53 nos grupos tratados com GA ou DGA associado ao CCl4, sendo este

aumento mais expressivo nas doses menores de 50 mg/Kg (Gráfico 7). Associado

ao aumento do gene p53 observamos uma redução significativa na atividade das

enzimas antioxidantes CAT, GPx e GST e um aumento no conteúdo hepático de

GSH nos grupos de fibrose. No entanto, na indução de dano agudo não observamos

estas alterações. Estes resultados podem ser explicados pelo conteúdo de EROs

gerado durante cada tratamento, visto que quanto maior o conteúdo de EROs maior

será a expressão do p53 e menor a expressão de genes antioxidantes relacionados

a transcrição das enzimas SOD, GPx e CAT Ahmed et al., (2014); Hussain et al.,

(2004); Rhee et al., (2013); Vurusaner; Poli; Basaga, (2012).

Estudos realizados por Hussain et al., (2004); Kodydková et al., (2014); Rhee

et al., (2013); Sablina et al., (2005), mostram que o efeito pró-oxidante ou

antioxidante do gene p53 está diretamente relacionado com seus níveis

intracelulares. Uma supressão no gene p53 associado ao aumento no conteúdo

celular de EROs, apresenta um efeito pró-oxidante aumentando a expressão de

proteínas como a Bax favorecendo o processo de apoptose. Níveis basais normais

de p53 associado à presença de EROs favorece a expressão das enzimas

antioxidantes, entretanto, alta expressão do gene p53 associado ao excesso de

EROs favorece o efeito pró-oxidante inibindo a expressão das enzimas SOD e GPx,

mas em contrapartida aumenta o conteúdo celular de GSH protegendo a célula da

peroxidação lipídica.

Nossos resultados são, portanto, condizentes com os estudos apresentados

por Hussain et al., (2004); Rhee et al., (2013); Sablina et al.,(2005), pois observamos

67

um aumento expressivo do gene p53 com redução na atividade das enzimas

antioxidantes GPx, GST e CAT e um aumento significativo no conteúdo hepático de

GSH. Diante disso, podemos supor que o efeito hepatoprotetor do GA e DGA está

relacionado com o aumento do gene p53, o qual pode levar a apoptose seletiva

induzida pelo GA e DGA, visto que a análise histopatológica mostra morte celular

associada a um aumento na mitose nos grupos tratados com GA e DGA.

O efeito seletivo do GA e DGA na morte celular em nosso estudo é

condizente com os resultados apresentados por Chang et al., (2015) o qual relata

que o tratamento com GA de células hepáticas estreladas ativadas induz a morte

das mesmas, entretanto quando hepatócitos normais são tratados com GA a

viabilidade é cerca de 10 vezes maior, este efeito pode estar associado a menor

atividade do sistema antioxidante nas células estreladas, visto que os autores

sugerem que o GA exerce um efeito pró-oxidante aumentando a quantidade de

EROs.

Van Ginkel et al., (2015) mostra que produtos antioxidantes naturais como o

resveratrol e a quercetina exercem um efeito pró-oxidante em células tumorais,

efeito este não observado em células não alteradas. O aumento de EROs iduzido

pelos antioxidantes naturais em células tumorais leva a uma liberação de cálcio do

reticulo endoplasmático resultando no acúmulo de cálcio na mitocôndria e

consequentemente um desequilíbrio no potencial de membrana o que provoca a

apertura do poro mitocondrial e liberação do citocromo c resultando em apoptose.

Os mesmos autores também mostram que o aumento de cálcio intracelular modula a

expressão do gene 53 o que pode induzir tanto a parar no crescimento celular

quanto a apoptose.

Sendo assim, a partir dos resultados obtidos neste estudo pode-se dizer que

o GA e DGA parecem exercer um efeito antioxidante quando administrado por

períodos curtos (7 dias) aumentando a atividade das enzimas antioxidantes

reduzindo assim o estresse agudo induzido pelo CCl4. Quando administrado por um

período de 4 semanas parecer exercer um efeito pró-oxidante o que induz um

aumento na expressão do gene p53 resultando na diminuição da atividade das

enzimas antioxidantes.

68

7 CONCLUSÃO

Os resultados do presente trabalho nos permitem concluir que:

A indução de dano hepático promovida pelo tratamento com CCl4 está

diretamente associada a presença de espécies reativas geradas durante a

sua biotransformação, sendo que o tratamento com doses repetidas durante 4

semanas pode induzir a fibrose hepática evidenciada pelas alterações nos

parâmetros bioquímicos séricos e na análise histopatológica;

O tratamento prévio com GA e DGA na dose de 100 mg/Kg foi capaz de

prevenir o dano hepático agudo promovido pelo CCl4, sendo este efeito

associado ao poder antioxidante destes compostos;

O tratamento dos animais com GA e DGA no modelo de fibrose hepática

permite-nos inferir que estes compostos são capazes de inibir o dano

hepático promovido pelo CCl4 evidenciado pelos parâmetros bioquímicos

séricos e pela análise histológica. No entanto, esta atividade não está

relacionada necessariamente ao potencial antioxidante destes compostos,

visto que observamos uma redução na atividade das enzimas antioxidantes

CAT, GPx e GST. Este efeito, no entanto, pode ter relação com o aumento na

expressão do gene p53 que foi evidenciado com o tratamento com GA e DGA

neste modelo. No entanto, mais estudos moleculares são necessários para

comprovar o potencial do GA e DGA no tratamento do dano hepático em

especial os quadros de fibrose.

O Esquema 9 pode resumir de maneira mais clara as conclusões obtidas a

partir dos resultados encontrados neste estudo e relacionados a estudos

prévios realizados por outros autores utilizando modelos de cultura celular.

69

Esquema 9 – Possível mecanismo do efeito hepatoprotetor do ácido gálico e dodecil galato em modelo de fibrose hepática induzida pelo tetracloreto de carbono.

70

8 PERSPECTIVAS FUTURAS

A partir dos resultados obtidos e estudos prévios realizados por outros

autores pretende-se continuar investigando o mecanismo de hepatoproteção

do ácido gálico e dodecil galato visto que observamos que o efeito protetor

não está ligado ao efeito antioxidante, mas sim ao seu potencial pró-oxidante.

Sendo assim, pretende-se verificar se o aumento na expressão do gene p53

está relacionado com a capacidade do GA e DGA aumentar os níveis

hepáticos de EROS em especial nas células lesadas ou isso ocorre pelo

aumento nas concentrações intracelulares de Ca2+ como relatado em outros

estudos;

Pretende-se também verificar se a diminuição na atividade das enzimas CAT,

GPx, GR e GST no modelo de fibrose hepática está associado ao aumento do

p53 ou ao aumento de EROs promovido pelo GA e DGA;

Outras perspectivas são verificar o efeito do GA e DGA no modelo de fibrose

na expressão das proteínas p53, Bcl2, BclX, Bax, Bad e Bak, citocromo c,

assim como o potencial de membrana mitocondrial.

71

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