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0 UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC UNIDADE ACADÊMICA EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - UNASAU

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

MÁGADA TESSMANN SCHWALM

AVALIÇÃO DE BIOMARCADORES DE NEURODEGENERAÇÃO E DANO COGNITIVO A LONGO

PRAZO EM ANIMAIS SOBREVIVENTES A SÉPSE

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde

Orientadora: Profa. Dra. Cristiane Ritter

Coorientador: Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol

CRICIÚMA

2014

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

S437a Scwalm, Mágada Tessmann.

Avaliação de biomarcadores de neurodegeneração e dano

cognitivo a longo prazo em animais sobreviventes a sépse / Mágada Tessmann Scwalm ; orientadora: Cristiane Ritter; coorientador: Felipe Dal Pizzol. – Criciúma, SC : Ed. do Autor, 2014.

96 p : il. ; 21 cm.

Tese (Doutorado) - Universidade do Extremo Sul

Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Criciúma, SC, 2014.

1. Sepse. 2. Septicemia. 3. Metaloproteinase. 4. Antioxidantes. 5. Sistema nervoso - Degeneração. I. Título.

CDD. 22ª ed. 616.944

Bibliotecária Rosângela Westrupp – CRB 14º/364 Biblioteca Central Prof. Eurico Back – UNESC

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FOLHA INFORMATIVA

A tese foi elaborada seguindo o estilo ABNT e será apresentada no formato tradicional Este trabalho foi realizado nas instalações do Laboratório de Fisiopatologia Experimental

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AGRADECIMENTOS

Agradeço acima de tudo a Deus o criador do céu e da terra, e que por misericórdia e graça se tornou homem e veio para os seus e veio para me salvar.

Agradeço a minha Orientadora Cristiane Ritter, que com empenho me orientou.

Agradeço ao meu coorientador Felipe Dal Pizzol, que compartilhou de seu grande conhecimento para o desenvolvimento desta tese.

Agradeço a minha querida Cristiane Damiani Tomazi e Larissa Constantino que foram essenciais nesta etapa de minha vida. Agradeço a equipe maravilhosa do Laboratório (Fisiopat), com certeza sem o trabalho conjunto não haveria tese.

Agradeço a Dra. Luciane Bisognin Ceretta, que na época de meu ingresso no Doutorado estava Coordenadora do Curso de Graduaçao em Enfermagem e me incentivou de forma especial a buscar qualificação profissional.

Agradeço aos homens da minha vida, meu esposo Hugo e meu filho Lucas por terem compreendido os momentos de ausência e não terem desistido de mim.

Agradeço a minha amiga Vera Rodrigues de Souza, pela incansável oração que tem dispendido há mim dia a dia.

Agradeço a Professora Tatiana Barichello que foi uma das pessoas que me trouxe para a Unesc, obrigado pela confiança.

Agradeço as pessoas que contribuíram com minha qualificação.

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RESUMO

Sobreviventes a sepse apresentam danos cognitivos associados com a diminuição da qualidade de vida e aumento da morbidade a longo prazo. Algumas destas alterações se assemelham aos mecanismos fisiopatológicos de doenças neurodegenerativas. O receptor para produto final de glicolização avançada (RAGE) vem sendo associado à progressão de morte neuronal em muitas doenças neurodegenerativas, como o Alzheimer, além de ser um importante mediador pró-inflamatório. Estudos anteriores mostraram que o uso de Inibidor de metaloproteinase de matriz (MMP) ou antioxidante (ATX) podem auxiliar na redução do dano cognitivo. Analisaram-se parâmetros bioquímicos relacionados à neurodegeneração em animais sobreviventes a sepse e o possível envolvimento do RAGE; o teste de esquiva inibitória e uso de Inibidor de MMP e ATX em animais sobreviventes a sepse. Os animais foram submetidos à sepse por ligação cecal e punção (CLP) e trinta dias após a indução, hipocampo e córtex pré-frontal foram isolados. No primeiro experimento o imunoconteúdo do peptídeo amilóide-β (Aβ), α-sinucleína, sinaptofisina e tau fosforilada foram analisados por western blot. Além disso, verificou-se o imunoconteúdo de RAGE e a presença de S100β. Houve aumento de α-sinucleína, Aβ e tau fosforilada no hipocampo, mas não no córtex pré-frontal. O imunoconteúdo de RAGE esteve aumentado nas duas estruturas e S100β não apresentou diferenças quando comparadas ao controle, em ambas as estruturas. No segundo experimento, foram determinados os níveis de Aβ e sinaptofisina (procedimentos idênticos ao experimento 01) e realizada a esquiva inibitória, onde os dados mostraram que a latência na esquiva inibitória foi significativamente reduzida no grupo sepse quando comparados ao sham, sugerindo dano na memória aversiva. No terceiro experimento foram adotados procedimentos conforme experimento 01 quanto aos animais, com exceção de alguns animais que foram tratados imediatamente a indução da sepse com ATX e inibidor de MMP 2-9 e posteriormente o teste da esquiva inibitória (conforme experimento 02). Apesar do fato de a esquiva inibitoria ser uma tarefa dependente do hipocampo, não foi possível determinar uma diminuição nos níveis de sinaptofisina no hipocampo ou uma relação do aumento dos níveis de Aβ e RAGE no hipocampo com desempenho no teste da

10 esquiva inibitória. No córtex pré-frontal foi observada queda dos níveis de sinaptofisina e com pequeno aumento nos seus níveis de tratamento, melhorou o desempenho da memória. O tratamento com ATX precoce pode diminuir o deficit cognitivo a longo prazo em animais.

Conclui-se que o cérebro dos animais sobreviventes a sepse apresentam vários marcadores de neurodegeneração e o desempenho no teste de esquiva inibitória parece ser dependente dos níveis de alguns destes marcadores, sugerindo um fenômeno neurodegenerativo podendo este ser um fator importante na associação com dano cognitivo a longo prazo em ratos sobreviventes a sepse.

Palavras-chave: sepse; neurodegeneração; RAGE; disfunção cerebral; dano cognitivo a longo prazo, inibidor de metaloproteinase e antioxidantes.

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ABSTRACT

Sepsis survivors have cognitive impairments associated with decreased quality of life and increased long-term morbidity. Some of these changes are similar to the pathophysiology of neurodegenerative diseases. The receptor for advanced glycation end product ( RAGE) has been associated with progression of neuronal death in many neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, and is an important proinflammatory mediator. Previous studies have shown that the use of metalloproteinase inhibitor or antioxidant can assist in reducing cognitive impairment. We analyzed biochemical parameters related to neurodegeneration in animal sepsis survivors and the possible involvement of RAGE, the inhibitory avoidance test and use of Metalloproteinase Inhibitor and Antioxidant in animals surviving sepsis. The animals were subjected to sepsis by cecal ligation and puncture ( CLP ) and thirty days after induction, hippocampus and prefrontal cortex were isolated. In the first experiment the immunocontent the β - amyloid peptide ( Aß ), α - synuclein, synaptophysin and phosphorylated tau were analyzed by western blot. Furthermore, it was found that the RAGE immunocontent the presence of S100β. An increase of α -synuclein, tau and phosphorylated Ab and the hippocampus, but not in the prefrontal cortex. The immunocontent RAGE was increased in the two structures and S100β showed no differences compared to controls in both structures. In the second experiment, we determined the levels of Aß and synaptophysin ( identical to experiment 01 procedures ) and performed the inhibitory avoidance, where the data showed that the inhibitory avoidance latency was significantly reduced in sepsis group compared to sham, suggesting damage to the memory aversive. In the third experiment procedures as experiment 01 were adopted for the animals, except for a few animals that were immediately treated the induction of sepsis with ATX and MMP 2-9 and subsequently testing the inhibitory avoidance (as experiment 02 ). Despite the fact that the inhibitory avoidance task to be a dependent of the hippocampus, it was not possible to determine a decrease in the levels of synaptophysin in the hippocampus or a relationship of increased levels of Aß and RAGE in the hippocampus with test performance of inhibitory avoidance. In the prefrontal cortex

14 synaptophysin levels drop and small increase in their levels of treatment was observed, improved deseempenho memory. The early treatment with antioxidants can decrease cognitive impairment in long-term animals. We concluded that the brains of animals surviving sepsis have several markers of neurodegeneration and performance in the inhibitory avoidance test seems to be dependent on the levels of some of these markers, suggesting a neurodegenerative phenomenon this may be an important factor in cognitive impairment associated with long term rat sepsis survivors. Keywords : sepsis; neurodegeneration; RAGE; brain dysfunction, cognitive impairment in the long term, metalloproteinase inhibitor and antioxidants.

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LISTA DE ILUSTRAÇOES

Figura 1: Sequência de eventos sugerida em uma infecção sistêmic.....35 Figura 2: Fatores envolvidos na fisiopatologia da encefalite associada à Sepse…………………………………………………….….……….....38 Figura 3: Ligação cecal e Perfuração (CLP) …………..…………...…48 Figura 4: Esquiva Inibitória (treino simples).........................................50 Figura 5: Imunoconteúdo de Aβ em hipocampo de animais sobreviventes a sepse…………………………………………….…….53 Figura 6: Imunoconteúdo de Aβ em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse……...……………………………..……….……...…54 Figura 7: Imunoconteúdo de RAGE em hipocampo de animais sobreviventes a sepse.............................................................................38 Figura 8: Imunoconteúdo de RAGE em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse.............................................................................56 Figura 9: Imunoconteúdo de sinaptofisina em hipocampo de animais sobreviventes a sepse………………………….…...………………….57 Figura 10: Imunoconteúdo de sinaptofisina em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse……………………..………………….58 Figura 11: Imunoconteúdo de α-sinucleína em hipocampo de animais sobreviventes a sepse..............………………………………..……….59 Figura 12: Imunoconteúdo de α-sinucleína em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse…………………..…………………….60 Figura 13: Imunoconteúdo de tau fosforilada em hipocampo de animais sobreviventes a sepse.............................................................................61 Figura 14: Imunoconteúdo de tau fosforilada em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse…………………………………………62 Figura 15: Imunoconteúdo de S100β em hipocampo de animais sobreviventes a sepse.............................................................................63 Figura 16: Imunoconteúdo de S100β em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse.............................................................................64 Figura 17: Desempenho no teste de esquiva inibitória relacionado aos níveis de sinaptofisina no córtexpré-frontal...........................................65 Figura 18: Imunoconteúdo de Aβ no hipocampo e córtex pré-frontal dos animais sobreviventes a sepse tratados com ATX e MMP.......................................................................................................58

18 Figura 19: Imunoconteúdo de Sinaptofisina no hipocampo e córtex pré-frontal dos animais sobreviventes a sepse tratados com ATX e MMP..57 Figura 20: Prevenção do déficit cognitivo a longo prazo em animais sobreviventes a sepse por tratamento com ATX ou inibidor de MMP2 e MMP-9...................................................................................................58

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AGEs – Produtos da Glicação (do inglês, Glycation Products) APP – Proteina Precursora Amiloide (do inglês, Amyloid Precursor

Protein) ATP – Trifosfato Adenosina (do inglês, Adenosine Triphosphate) ATX – Antioxidantes Aβ – Beta-Amilóide BACE1 – Enzima da Fenda Local-� APP (do inglês, β-site APP

Cleaving Enzyme 1) CD – Agrupamento de Diferenciação (do inglês, collation of

differentiation) CLP – Ligação Cecal e Perfuração COX – Clicloxigenase c-PGES – Prostaglandina Sintase Citosólica (do inglês, Prostaglandin

Synthase Cytosolic) DA – Doença de Alzheimer DAMPs – Padrão Molecular Associado a Dano ( do inglês, Damage

Associated Molecular Pattern) DFX – Deferoxamina EAS – Encefalopatia Associada a Sepse EEG – Eletroencefalograma eNOS – Oxido Nítrico Sintase Endotelial (do inglês, Endothelial Nitric

Oxide Synthase) EROs – Espécies Reativas de Oxigênio GSH – Glutationa Peroxidase HD – Hidroxila HMGB1 – Proteínas do Grupo de Alta Mobilidade Box 1 (do inglês, High Mobility Group B) HPA – Hipófise-pituitária-adrenal IL – Interleucina iNOS - Óxido Nítrico Sintase Induzível (do inglês, Inducible Nitric

Oxide Synthase) IRAKs– Quinases Receptoras (do inglês, Receptor Kinases) LBP – Proteina de Ligação de Lipopolissacarídeo (do inglês, Lipopolysaccharide Binding Protein) LPS – Lipopolissacarídeo (do inglês, Lipopolysaccharide Protein

Binding)

22 MEC – Matriz Extracelular MMP – Metaloproteinase de Matriz (do inglês, Matrix

Metalloproteinase) MAPK – Mitógeno Ativador da Proteína Quinase (do inglês, Mitogen

Activated Protein Kinase)

MAPs – Proteínas Associadas a Microtubos (do inglês, Microtubule-

Associated Proteins) MCP – Proteína Quimiotática de Monócitos do inglês, Protein

Chemotactic Monocyte) MD – Diferenciação Mielóide ( do inglês, Myeloid Differentiation) MIP – Proteína Inflamatória de Macrófagos (do inglês, Macrophage

Inflammatory Protein) mPGEs-2 – Prostaglandina e Sintase-2 Associada à Membrana (do inglês, Prostaglandin and Synthase-2-Associated Membrane) MyD88 – Fator de Diferenciação Mieloide 88 ( do inglês, Myeloid

Differentiation Factor 88) NAC – N-acetilcisteína. NADPH – Dinucleotídeo Nicotinamida Adenina Fosfato Redzida (do inglês, Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Redzida) NF-kB – Fator Nuclear-kB (do inglês, Nuclear Factor-kB) NO – Óxido Nítrico (do inglês, Nitric Oxide) PAMP – Padrão Molecular Associado a Patógeno (do inglês, Pathogen-

Associated Molecular Pattern) PCT – Procalcitonina PGE2 – Prostaglandina 2 RAGE – Receptor para Produtos Finais de Glicosilação Avançada (do inglês, Receptor for Advanced Glycosylation end Products) SAD – Delirium Associado a Sepse (do inglês, Sepsis-associated

Deliriumi) SAPK/JNK – Proteína Quinase Ativada por Estresse/ c-Jun N-terminal quinase (do inglês, Stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal

kinase) SIRS – Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (do inglês, Systemic Inflammatory Response Syndrome) SNC – Sistema Nervoso Central TCE – Traumatismo Crânio Encefálico TIMP – Inibidores Específicos de MMPs (do inglês, Specific Inhibitors

of MMPs)

24 TIRAP – Proteína Adaptadora do Domínio TIR (do ingles, TIR Adaptor

Protein Domain) TLR – Receptor Toll-Like (do inglês, Toll-like Receptor) TNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa (do inglês, Tumor Necrosis

Factor-alpha)

TRAFs – Fatores Associados ao Receptor do Fator de Necrose Tumoral (do inglês, Tumor Receptor Associated Factor) TRAM – Molécula Adaptadora Relacionada com o TRIF (do inglês, Adaptor Molecule TRIF-Related) TRIF – Proteína Adaptadora do Domínio TIR (do inglês, Adaptor

Protein TIR Domain) UTI – Unidade de Terapia Intensiva

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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO..................................................................................30 1.1 SEPSE: DEFINIÇÃO E ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS.........30 1.2 FISIOPATOLOGIA DA SEPSE......................................................31 1.3 SEPSE E SISTEMA NERVOSO CENTRAL..................................34 1.3.1 Marcadores da Sepse..................................................................39 1.3.2 Antioxidante e Metaloproteinase no tratamento da Sepse.....42 2. OBJETIVOS....................................................................................45 2. 1 OBJETIVO GERAL.......................................................................45 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................45 3. METODOLOGIA...........................................................................46 3.1 DESCRIÇÃO DO EXPERIMENTO 01..........................................46 3.1.1 Animais........................................................................................46 3.1.2 Indução de Sepse.........................................................................47 3.1.3 Análise por Western Blot............................................................48 3.1. 4 Análise Estatística......................................................................49 3.2 DESCRIÇÃO DO EXPERIMENTO 02..........................................49 3.2.1 Animais........................................................................................49 3.2.2 Indução de Sepse.............................................................................49 3.3.3 Análise por Western Blot.............................................................49 3.2.3 Teste de esquiva inibitória..........................................................50 3.3 DESCRIÇÃO DO EXPERIMENTO 03...........................................50 3.3.1 Animais.........................................................................................51 3.3.2 Indução de Sepse..........................................................................51 3.3.3 Análise por Western Blot.............................................................51 3.3.4 Teste de esquiva inibitória..........................................................51 3.3.5 Análise Estatística........................................................................51 4.RESULTADOS.................................................................................52 4.1 RESULTADOS DO EXPERIMENTO 01........................................52 4.1.1 Avaliação do imunoconteúdo de Aβ, RAGE e sinaptofisina em hipocampo e cortex pré-frontal...........................................................52 4.1.2 Avaliação do imunoconteúdo de α-sinucleína, tau fosforilada e S100β em hipocampo e cortex pré-frontal..........................................59 4.2 RESULTADOS DO EXPERIMENTO 02........................................64 4.2.1 Determinação da relação entre níveis de beta-amilóide e sinaptofisina com alterações cognitivas em longo prazo..................64 4.3 RESULTADOS DO EXPERIMENTO 03........................................66 4.3.1 Avaliação do imunoconteúdo de Aβ e tratamento com inibidor de MMP e ATX.....................................................................................66

28 4.3.2 Avaliação do imunoconteúdo de Sinaptofisina e tratamento com inibidor de MMP e ATX..............................................................67 4.2.3 Teste de comportamento.............................................................68 5. DISCUSSÃO.....................................................................................70 REFERÊNCIAS...................................................................................7575

30 1 INTRODUÇÃO

1.1 Sepse: definição e aspectos epidemiológicos

Na ocorrência de um processo infeccioso é desencadeada uma resposta inflamatória no hospedeiro, sendo que, a magnitude desta resposta pode variar de indivíduo para indivíduo. Essa interação complexa entre o organismo e o agente causador resulta no processo fisiopatológico que por muito tempo era denominado como septicemia, sendo atualmente reconhecido como sepse (Vicent & Korkut, 2008).

O uso de uma terminologia específica tornou-se uma necessidade, para que fosse possível complementar as novas descobertas sobre a fisiopatologia da sepse. Sendo assim, o American College of

Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine, definiu em 1991 um consenso sobre terminologia e terapêutica da sepse, definindo-a como resposta clínica decorrente de uma infecção. Entretanto, resposta similar ou mesmo idêntica pode surgir na ausência de infecção documentada, recomendando-se o uso do termo Síndrome de Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS) como o mais apropriado para este quadro clínico. SIRS é então definida como a presença de dois ou mais dos seguintes quadros de inflamação sistêmica: 1) hipertermia ou hipotermia; 2) leucocitose ou leucopenia; 3) taquicardia e 4) taquipnéia ou hiperventilação (Bone et al., 1992).

O consenso Surviving Sepsis Campaign (2012) define sepse como a presença (suspeita ou documentada) de infecção juntamente com manifestações clínicas de inflamação. Ainda, como resposta inflamatória apresenta uma grande variação entre os diferentes indivíduos acometidos e diferentes graus definidos, como: sepse grave e choque séptico. A sepse grave foi definida pela presença de sepse somada à disfunção orgânica ou hipoperfusão tecidual em decorrência da própria sepse. O choque séptico define-se como hipotensão persistente em decorrência da sepse, mesmo com uso de reposição volêmica adequada (Dellinger et al., 2012).

Juntos, choque séptico e sepse grave são considerados importantes causas de problemas de saúde, afetando milhões de pessoa em todo o mundo (Dellinger et al., 2012). A incidência da sepse tem aumentado desde os anos 30 (Dombrovskiy et al., 2007), e a partir das evidências, sugere-se que este aumento persista nos próximos anos (Kung et al., 2008). Dados de mortalidade indicam (desde 2003) que a sepse está entre as 10 causas mais comuns de morte nos Estados Unidos

31 (Kung et al., 2008), onde se relata incidência de pelo menos 11,5 pacientes/100.000 habitantes, com taxa de mortalidade entre 25% e 30% por sepse grave e entre 40% e 70% por choque séptico (Angus, et al., 2001). Dados do datasus mostram que em 2012 ocorreram 84 mil internações por sepse, com 35 mil ótibos (42%). Um estudo brasileiro (Sales Júnior, et al., 2006) que incluiu 75 unidades de terapia intensiva (UTI), mostra que 16,7% dos pacientes foram identificados com sepse, sepse grave ou choque séptico e a mortalidade global após 28 dias da admissão na UTI foi de 46,6%.

1.2 Fisiopatologia da Sepse

Para Portella (2010), os papéis de alguns mediadores na patogênese da sepse, já estão bem esclarecidos e estes mediadores podem induzir grandes alterações na fisiologia da vasculatura e dos órgãos. Dentre os mediadores envolvidos na gênese da sepse, destacam-se as citocinas e quimiocinas, as espécies reativas de oxigênio (EROs) e proteínas do grupo de alta mobilidade Box 1 (HMGB1).

Marshall e colaboradores (2010) consideram a sepse uma consequência indireta da atividade de mediadores inflamatórios derivados do hospedeiro e não resultante de uma ação direta dos microrganismos ou de seus produtos. Considera-se na fisiopatologia da sepse, a complexa interação entre microrganismos infectantes e as respostas imunes, pró-inflamatórias e pró-coagulantes do hospedeiro (Bone, 1996a,b; Hotchkiss & Karl, 2003).

Singer (2008) propõe que processos inflamatórios exagerados estejam associados a complexas interações genéticas, hormonais, metabólicas e da macro e micro disfunção celular do organismo afetado, desencadeado pela hiperativação do complexo de cascatas pró-inflamatórias que provocam a ativação de células do sistema imunológico com intensa produção de citocinas pró-inflamatórias nestas células.

O sistema imune conta com componentes inatos e adquiridos. A imunidade adquirida é mediada por linfócitos T e B, tem alta especificidade para microrganismos através da combinação dos receptores com moléculas dos patógenos. É capaz de ativar fatores de transcrição e de promover secreção de citocinas pró-inflamatórias junto às celulas T, além de aumentar a síntese de citocinas antiinflamatórias (Interleucina - 4 (IL-4), Interleucina – 10 (IL-10), Intermeucina – 13 (IL-13)), modular a expressnao de receptores de citocinas e liberar

32 receptores solúveis e antagonistas, bem como atuar sobre o sistema imune inato (Sikora et al., 2001; Faix, 2013).No entanto o estabelecimento da imunidade adquirida não é rápida o suficiente para a erradicação dos microrganismos, principalmente bactérias extracelulares. Assim, a rápida resposta da imunidade inata tem papel importante na defesa do hospedeiro, durante os estágios iniciais da infecção (Sikora et al., 2001).

As células do sistema imune inato, as quais incluem monócitos, macrófagos e neutrófilos compõe a primeira linha de resposta a infecção e lesão (Wang; Deng., 2008). A imunidade inata é resultante de um sistema inespecífico de defesa imunológico encontrado em organismos multicelulares. Durante a infecção, a imunidade inata faz o reconhecimento de padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs), tais como lipopolissacarídeo (LPS), peptideoglicano, RNA de fita dupla; ou padrões moleculares associados ao dano (DAMPs), tais como proteína do choque térmico, ácido úrico, anexinas, e HMGB1, usando receptores de reconhecimento – como os receptores Toll-like (TLR) 2, 4 e 9 (Brightbill et al., 1999; Wang et al., 1999; Li et al., 2003b).

A sinalização TLR pode induzir a produção de citocinas pro-inflamatórias e aumento da expressão de moléculas co-estimuladoras, as quais são ativadas não apenas pela imunidade inata, como também pela imunidade adquirida (Kaisho; Akira, 2002). As células da imunidade inata infiltram nos tecidos infectados e liberam diversas citocinas, como Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α), IL-1, IL-6, IL-12 e quimiocinas como IL-8, proteína inflamatória de macrófagos (MIP-1s e MIP-2) e proteína quimiotática de monócitos (MCP-1) (Baggiolini & Loetscher, 2000; Luster et al., 2005; Wang & Deng, 2008). Em resposta a infecção ou dano causado pelos microrganismos o sistema imune inato responde imediatamente ao estímulo, removendo os patógenos invasores e após sua eliminação ocorre uma regressão do quadro inflamatório retornando a homeostase imunológica. Os patógenos ou mediadores pro-inflamatórios endógenos podem extravasar para a corrente sanguínea, ocasionando a sepse (Wang & Deng, 2008).

A via mais detalhadamente conhecida para ativação do sistema imune inato depende da ativação de TLR4 pelo LPS. O LPS tem sua maior atividade biológica no componente lipídico - lipídio A - quando liberado na corrente sanguínea, diretamente ou ligado a proteína de ligação de lipopolissacarídeo (LBP), é capaz de se ligar ao agrupamento de diferenciação (CD14), que facilita a ligação LPS-CD14,

33 e a sinalização através do complexo proteína de diferenciação mieloide (TLR-4/MD-2) (Concha, 2010). O LPS pode ligar-se a outros receptores, como o CD11b/ CD18, ou mesmo ser internalizado através de poros da membrana, pelos canais iônicos (Concha, 2010).

Para Van Der Poll (2008), os TLRs interagem com proteínas adaptadoras com a do Fator de Diferenciação Mieloide 88 (MyD88) e utiliza outras proteínas adaptadoras como a proteína adaptadora do TIR (TIRAP), capaz de induzir o interferon-β (TRIF). Interage ainda com a molécula adaptadora relacionada com o TRIF (TRAM), que são recrutadas para o receptor e ativam o complexo composto por quinases associadas ao receptor da IL-1 (IRAKs), e aos Fatores Associados ao Receptor do Fator de Necrose Tumoral (TRAFs) que constituem fatores de transdução de sinal, que conduzem à liberação do fator nuclear-kB (NF-kB) que uma vez translocado para o núcleo, aumenta a expressão gênica de citocinas inflamatórias (Christmann et al., 1998).

O NF-kB, quando ativado, promove a expressão gênica de moléculas pró-inflamatórias, TNF-α, IL-1β IL-6 e também citocinas anti-inflamatórias como IL-10, IL-4, que ativam a resposta imune adaptativa, responsável pela amplificação da imunidade inata (Christmann et al., 1998).

As citocinas desempenham seu papel na fase inicial da resposta imune e inflamatória por compartilhar sinais intracelulares com receptores e distribuirem informações sobre o tipo de infecção e recrutar células efetivas para realização da defesa do hospedeiro (Heeg; Dalpke, 2003). Pacientes com sepse apresentam aumento dos níveis de citocinas como TNFα, IL-1 (Pruitt et al., 1996; Oberholzer et al., 2000). Em animais, quando as citocinas são injetadas, reproduzem características clínicas e laboratoriais de sepse, subsidiando assim ensaios clínicos que utilizem antagonistas de TNF e IL-1, bloqueadores de receptores toll na sepse (Hotchkiss et al., 2013).

Estudos sobre as citocinas em pacientes mostraram em seus resultados que, juntamente com as citocinas pro-inflamatórias, a IL-10 (potente citocina antiinflamatória) está aumentadas, sendo que a alta proporção de IL-10 para TNF- α esta correlacionada com mortalidade dos pacientes com infecção adquirida na comunidade (van Dissel et al., 1998).

Apesar de, tanto o processo pró-inflamatório, quanto o antinflamatório acontecer imediatamente após o início da sepse, de maneira geral há predominância de uma fase hiperinflamatória inicial, em proporções determinadas por diversos fatores que incluem a carga

34 bacteriana, virulência do patógeno, idade, fatores genéticos e comorbidades do hospedeiro. Por exemplo, um adulto jovem com meningococcemia terá uma resposta hiperinflamatória intensa mediada por citocinas, as quais levam febre alta e choque séptico (Hotchkiss et

al., 2013). Já um paciente idoso portador de diabetes, submetido à hemodiálise, que desenvolve pneumonia, por exemplo, não mostra quaisquer sinais óbvios de sepse. Os únicos sinais para o diagnóstico neste paciente podem ser a redução do estado mental, incapacidade de tolerar a diálise por hipotensão; hipotermia e intolerância a glicose, não apresentando nenhuma resposta mais clara da infecção ou de uma reação antinflamatória predominante (Hotchkiss et al., 2013).

1.3 Sepse e Sistema Nervoso Central

O dano cognitivo em longo prazo vem sendo relatado como uma sequela de sepse (Gunther et al., 2012; Semmler et al., 2013). Estudos mostram que a prevalência de dano cognitivo moderado a grave é 10,6% maior em pacientes sobreviventes de sepse grave (Iwashyna et

al., 2010). O cérebro é um dos primeiros órgãos afetados na sepse. O

delirium associado a sepse (SAD) é uma característica frequentemente associada com maior morbidade e mortalidade (Iacobone et al., 2009). Recentemente, foi observado entre sobreviventes de sepse, a diminuição da qualidade de vida e aumento da morbidade a longo prazo associados ao dano cognitivo (Winters et al., 2010). Apesar do seu impacto clínico, a fisiopatologia da disfunção do sistema nervoso central (SNC) durante a sepse permanece pouco compreendida.

O diagnóstico da Encefalopatia Associada à Sepse (EAS) é principalmente clínico. A tomografia computadorizada costuma ser normal. O eletroencefalograma (EEG) mostra lentificação e diminuição principalmente da onda alfa e essas alterações estão relacionadas à diminuição do fluxo sanguíneo cerebral medido nas primeiras 24 h após a indução de endotoxemia por LPS em ratos Wistar (Semmler et al., 2008).

A administração endovenosa de LPS (endotoxemia) ou de bactérias como a Escherichia coli (bacteriemia) é amplamente utilizada para o estudo da sepse, por mimetizar vários efeitos observados em pacientes com sepse e choque séptico, como, por exemplo, as alterações hemodinâmicas e cardiovasculares, diminuição do débito urinário, redução da perfusão tissular, hiporresponsividade a agentes

35 vasoconstritores, coagulação intravascular disseminada e a produção de grandes quantidades de citocinas na circulação (Benjamim, 2001).

Van Gool e colaboradores (2010), afirmam que infecções e drogas podem causar complicações neuropsiquiátricas. Pode ocorrer delirium mesmo sem que a infecção ocorra diretamente no SNC e não haver sinais sistêmicos de sepse. Estes autores demonstraram que as alterações periféricas ocasionadas pelo sistema imunológico são capazes de causar alterações também no SNC a partir dos caminhos que as citocinas percorrem até o cerebro, podendo ser: caminhos neurais diretos (via autônomica) em que o transporte ocorre através da barreira hematoencefalica ou pela região circunventricular, onde já se observaram níveis aumentados de TNF-α, IL-1 e IL-6 em líquor de pacientes sépticos, mesmo na ausência de meningite (Waage et al., 1989).

O TNF-α está associado a ativação da microglia e a liberação de citocinas no tecido cerebral. A microglia geralmente permanece em repouso, porém, sua ativação é essencial para resposta imune inata no cerébro. Devido sua linhagem de macrófagos e monócitos, a microglia é capaz de realizar fagocitose, apresentar antígenos, fazer rápida proliferação e secreção de uma série de mediadores inflamatórios, como citocinas, quimiocinas e proteases (Perry, 2004; Garden & Möller, 2006; Telling & Perry, 2009). Estes alteram a função cerebral, e provavelmente seja a causa de alterações do comportamento resultante de uma infecção sistêmica conforme mostra a figura 1 (van Gool et al., 2010).

Figura 1: Sequência de eventos sugerida em uma infecção sistêmica em A) Condiçao Normal; B) Idade Avançada, doença Neurodegenerativa ou uso de anticolinérgicos onde 1) Inibiçao direta pelo uso de antiinflamatórios; 2)

36 Inibiçao dos efeitos das citocinas; 3) Receptores nicotínicos; 4) Medicamentos colinomiméticos (inibidores da coliesterase). Adaptado de van Gool et al., 2010.

As substâncias toxicas liberadas pela ativação da microglia podem não só causar delirium como também causar danos irreversíveis ao sistema neuronal. Van Gool e colaboradores (2010), relatam que o aumento de TNF-α após 10 meses da administração LPS pode ocasionar perda de substância nigra no cerebro de roedores em taxas de até 40%, pois ocasionam na microglia um circulo vicioso de liberação de substâncias neuroinflamatorias. Em última análise há propenção a neurodegeneração colinérgica, especialmente em idosos, tornando-os assim vulneráveis ao delirium depois de estímulos inocuos, assim como em indivíduos com doencas neurodegenerativas (van Gool et al., 2010).

Teeling e Perry (2009) confirmam que apesar das fortes evidências do papel das citocinas, elas podem não ser os únicos fatores responsáveis pelo EAS. As alterações comportamentais podem surgir junto com a febre. Pode ocorrer ligação dos receptores da citocina ou do LPS expresso na vasculatura cerebral. Estes receptores são ligados a enzima cicloxigenase (COX) que permite a produção de prostraglandinas (PGE2), os leucotrienos e tromboxanos. Há duas formas pelas quais as PGE2 podem ser liberadas: 1) de forma rápida e transitória (COX-1, prostaglandina E sintase citosólica (c-PGES), prostaglandina E sintase-2 associada à membrana (mPGEs-2); 2) de forma lenta, com produção contínua de PGE2 (COX-2, mPGEs-1) (Swiergiel & Dunn 2002; Turrin & Rivest 2004).

As lesões do córtex pré-frontal de camundongos, se associam com desinibição social, descontrole dos impulsos, disfunções organizacionais, de planejamento e atenção, quebra da fluência e retardo de comportamentos espontâneos (Lou, 1996). Déficits regionais do lobo frontal, particularmente do cingulado anterior e córtex frontal, parecem diferenciar de forma consistente os pacientes com transtornos do SNC dos pacientes da população geral (Konarska et al., 1990).

Há muito tempo o conceito de “privilégio imune” é atribuído ao cérebro, acreditando-se que o cérebro não seria acometido e nem contribuiria para a resposta inflamatória. Sabe-se, no entanto, que isso não é verdade. O cérebro apresenta sinais clássicos de inflamação, bem parecido em alguns aspectos com o que se observa em outros órgãos (Flierl et.al., 2010). O aumento da permeabilidade vascular que ocorre na inflamação permite a passagem de mediadores inflamatórios e

37 interação com células do SNC. O SNC não é apenas suscetível, como contribuinte de forma ativa na resposta inflamatória.

As células do SNC percebem insultos periféricos e podem gerar mudanças neuroendócrinas, como em outros tecidos, onde há liberação de citocinas, radicais livres e ativação do complemento que agem localmente causando sintomas neurológicos e a distância perpetuando a resposta inflamatória (Lucas et al., 2006).

O cérebro possui maior taxa de consumo de O2 e dispõe de poucas defesas antioxidantes, o que o torna bastante vulnerável durante sepse. O aumento de marcadores específicos de injúria cerebral, como enolase neurônio específica e a proteína S-100β ocorre na maioria dos pacientes com EAS (Iacobone et al., 2009). Valores de S-100β acima de 4µg/dl estão relacionados a isquemia e hemorragia (visto na tomografia computadorizada), enquanto valores 1-2µg/dl estão associados a infartos microembólicos (visualizada na ressonância magnética). O aumento da S-100β tem associação direta com a alta mortalidade e é um preditor independente de sobrevida na terapia intensiva (Iacobone et al., 2009).

Pressupoem-se que a resposta inflamatória ocorre de maneira semelhante em todos os órgãos (Wilson & Yong, 2003). Citocinas pró-inflamatórias como IL-6, IL-1β e TNF-α encontram-se aumentadas na EAS e estimulam a produção de Oxido Nítrico (NO) induzida pela oxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (Wilson & Yong, 2003). NO é um fator importante para a autoregulação cerebral, é capaz de reagir com fatores oxidantes, induzir a produção de peroxinitrito e interferir na cadeia respiratória mitocondrial (Andersen et al., 2004).

Há uma ineficiência no metabolismo mitocondrial com mudança no potencial de membrana e aumento do consumo de oxigênio. Este aumento pode estar relacionado ao aumento na produção de EROs e ativação da cascata de apoptose (Miranda, 2010). O dano oxidativo ocorre nas primeiras 6 horas no cérebro de animais sépticos e isso está diretamente relacionado a um desequilíbrio de enzimas antioxidantes (Barichello et al., 2007).

A maneira como essas alterações agudas resultam em dano cognitivo a longo prazo é desconhecida. Uma sugestão de fatores envolvidos está representada na figura 2. O tempo de hipóxia, choque e EAS dentro da terapia intensiva parecem ser fatores relevantes. Idosos, que são aproximadamente 60% da população em UTI são mais suscetíveis e apresentam mais comorbidades como doença neurovascular que está associada à alteração neurocognitiva. A

38 permanência em UTI é fator desencadeante e acelerador de demência (Hopkins et al., 2010).

Figura 2: Fatores envolvidos na fisiopatologia da encefalite associada à Sepse partindo da inflamação sistêmica até o desenvolvimento do delirium. Barreira Hematoencefálica; SNC (adaptado de Miranda 2010).

Em modelos animais, a encefalopatia aguda é observada

durante o curso da sepse (Comim et al., 2009), e os sobreviventes apresentam disfunção cognitiva a longo prazo (Barichello et al., 2005). Esses modelos representam uma importante ferramenta para estudar os mecanismos associados à disfunção do SNC durante e depois de sepse. A deficiência colinérgica central é hipotetizado como mecanismo principal para a ocorrência de delirium (van Gool et al., 2010), sendo a conclusão de que se sobrepõe aos mecanismos fisiopatológicos para

delirium, Doença de Alzheimer (DA) e neurodegeneração (Buckingham et al., 2009). Assim, delirium e demência podem representar diferentes pontos ao longo de diversos distúrbios cognitivos.

Semmler e colaboradores (2007) demonstraram a perda neuronal em sub-regiões do hipocampo e no córtex pré-frontal e reduziu a inervação colinérgica de áreas do córtex de animais sobreviventes a sepse - de forma semelhante à observada em pacientes com DA. Essa semelhança também foi demonstrada utilizando rivastigmina para reverter déficits cognitivos a longo prazo em animais sobreviventes sepse (Comim et al., 2009).

39 1.3.1 Marcadores da Sepse

Marcadores de danos cerebrais durante a sepse podem ter um valor considerável no esclarecimento dos mecanismos envolvidos na sepse e quantificar o grau de dano ao cérebro. Um estudo realizado por Larsson e colaboradores (2005) mostra, por exemplo, que a concentração plasmática da proteína S-100β, poderia ser utilizada como possível marcador de danos gliais, pois se encontrou aumentada em pacientes sépticos.

Doenças neurodegenerativas compartilham mecanismos comuns diretamente associados à agregação patológica de proteínas. Estes acumulam como depósitos de fibras de amilóide em regiões vulneráveis do SNC (Tillement et al., 2010). Na DA, as proteínas tau fosforiladas anormalmente formam os emaranhados neurofibrilares, e peptídeo beta-amilóide (Aβ) acumula-se no meio extracelular e forma placas amilóides, causando morte celular neuronal, como consequência da agregação de proteínas hidrofóbicas deformadas (Haapasalo et al., 2010). Da mesma forma, estes parâmetros também são observados em pacientes que sofreram traumatismo crânio-encefálico (TCE) ( Johnson et al., 2010; DeKosky et al., 2007; Ikonomovic et al., 2004). A proteína precursora de amiloide (APP) é sintetizada no citoplasma neuronal e se acumula nos axonios que sofreram dano pelo TCE (Johnson et al., 2010; Li et al., 2010a; Smith et al., 2003). A APP pode ser clivada por diferentes enzimas incluindo a α-secretase, previnindo geração de Aβ, ou BACE1 (do inglês, β-site APP cleaving enzyme 1).

A proteína tau faz parte da família das proteínas associadas aos microtúbulos (MAPs) (Binder et al., 1985). Evidências têm demonstrado que tau total em líquor reflete a intensidade do dano e a degeneração axonal e neuronal. O aumento de tau total em líquor em doenças agudas como acidente vascular encefálico, traumatismo craniano é correlacionado positivamente com o dano tecidual e negativamente com os desfechos clínicos (Hesse et al., 2001; Ost et al., 2006; Zetterberg et al., 2006).

Níveis aumentados de tau total no líquor são associados à rápida progressão do dano cognitivo (Bloom et al., 2009), ao declínio cognitivo em maior velocidade e a maior mortalidade em casos de DA (Samgard et al., 2009; Wallin et al., 2009), logo a tau fosforilada verificada em líquor reflete o grau de fosforilação da proteína tau no SNC (Blennow et al., 2012). Diversos estudos vêm mostrando que a acurácia diagnóstica para a combinação de tau total, tau fosforilada e

40 Aβ é maior que qualquer marcador biológico sozinho (Galasko et al., 1998; Riemenschneider et al., 2002; Maddalena et al., 2003; Zetterberg et al., 2003; Hansson et al., 2006).

Na DA ocorre a deposição de placas Aβ no cérebro. A microglia é ativada por peptídeos Aβ, que inicia a produção de EROs pela Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (NADPH) oxidase. O estresse oxidativo gerado vem apresentando implicações em diversas doenças neurodegenerativas (Hardy; Selkoe, 2002; Choi et al., 2012). O acúmulo de Aβ acarreta alteração da fisiologia celular ocasionando dano ao metabolismo energético e respiração mitocondrial, aumentando o estresse oxidativo, neuroinflamação, falência sináptica e neurodegeneração (Caspersen et al., 2005; Fang et al., 2010; Du et al., 1997; Takuma et al., 2009).

A deposição excessiva de Aβ ativa o NF-κB e induz a secreção de Oxido nitrico sintase induzível (iNOS) e a COX-2, pela microglia (Kang et al., 2001; Martin-Moreno et al., 2011). O peptídeo Aβ também é capaz de desencadear a ativação do receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE), o qual medeia uma variedade de danos, incluindo inflamação e dano oxidativo (Fang et al., 2010; Carrano et al., 2011).

RAGE tem demonstrado papel importante na DA, com um amplo repertório de ligantes, incluindo os produtos da glicação (AGEs) e Aβ (Zong et al., 2010). Evidências vêm demonstrando que a interação do RAGE com seu ligante (por exemplo o Aβ) é capaz de ativar multiplas vias de sinalização intracelular incluindo p38 e MAPK (do inglês, Mitógeno Ativador da Proteína Kinase), SAPK/JNK (do inglês, Stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase) e NF-κB (Takuma et al., 2009; Fang et al., 2010; Carrano et al., 2011; Deane et

al., 2012). Recentemente, verificou-se sua relação com uma variedade de lesões no SNC, como disfunção neuronal, amplificação da neuroinflamação, promoção de estresse oxidativo, aumento do influxo de Aβ pela barreira hematoencefálica (Takuma et al., 2009; Fang et al., 2010; Carrano et al., 2011; Deane et al., 2012).

Estudos sugerem que a ativação de RAGE por seu ligante é capaz de gerar um feedback positivo entre RAGE e NF-κB, o que gera ciclo vicioso entre estresse oxidativo e inflamação, que cursaria com aumento de Aβ e consequente ativação de NF-κB e então aumento da expressão de RAGE. Já o RAGE aumentado, interage com seus ligantes, induzindo a geração de EROs e ativa NF-κB novamente (Bierhaus et al., 1997; Schmidt; Stern 2000; Yeh et al., 2001; Zhang et al., 2013).

41 Adicionalmente, a ativação do RAGE pode ser feita pelo HMGB1, que está aumentado nos fluídos extracelulares durante a sepse, bem como por S100β, uma proteína relevante na disfunção do SNC (Sims et al., 2010).

A família das proteínas S100 modulam uma variedade de funções intracelulares, incluindo homeostase do calcio, organização citoesquelética, progressão do ciclo celular, crescimento e diferenciação celular (Donato et al., 2001; Heizmann et al., 2002). Apesar de suas funções intracelulares, a liberação das S100s acontecem a partir de diferentes tipos celulares durante processos inflamatórios, podendo ser utilizadas como marcadores de atividade na doença (Frosch et al., 2000; Foell et al., 2004), sendo a S100β associada a inflamação no SNC (Foell et al., 2007). Estes eventos celulares são importantes na progressão da neurodegeneração (Tan et al., 2009). A resposta inata da glia ao dano, patógeno ou estimulo de ativação de maneira geral conduziria a desfeschos benéficos, como a fagocitose ou produção de fatores de reparação ou proteção. No entanto, quando a ação da microglia é mantida gera superprodução de mediadores proinflmatórios alterando a homeostase, o que resulta em progressão da doença exacerbando a influencia de fatores que interferem na disfunção neuronal e na progressão da neuropatologia (Lue et al., 2001; van Eldik et al., 2007; Fang et al., 2010) Diversos estudos vem demonstrando que a Aβ é capaz de causar neutoxicidade e exercer danos diretos ou indiretos no SNC, causando disfunção e morte neuronal, levando a quadros de demência.

Distúrbios psiquiátricos como autismo, esquizofrenia, transtorno bipolar e depressão, tem relação com alterações da função sináptica (Wuwongse et al., 2013; Waites et al., 2011; Gonzalez-Burgos et al., 2011). Em pacientes depressivos observou-se perda de volume hipocampal, devido a neurgenese reduzida (Czeh; Lucassen, 2007; Neumeister et al., 2005). Em modelo de estresse crônico moderado, foi verificado níveis baixos de neurogenese e de sinaptofisina (Yang et al., 2011). Em modelo animal verificou-se que o aumento da expressão de proteína pre-sináptica, está relacionada a comportamento tipo depressivo (Furukawa-Hibi et al., 2010).

A sinaptofisina é a proteína mais abundante da vesícula sináptica, geralmente mensurada para tentar quantificar as sinapses. Sugere-se o envolvimento da sinaptofisina na endocitose e reciclagem vesicular (Valtorta et al., 2004; Daly & Ziff, 2002 ). A forma solúvel de Aβ vem sendo relatada como preditora de mudança sináptica no córtex e giro frontal superior na DA (Lue et al., 1999). A ausência de

42 imunoreatividade da sinaptofisina é relatada nas regiões que apresentam apenas a forma oligomérica de Aβ, porém o mesmo não acontece com as formas fibrilar e monomérica (Ishibashi et al., 2006). Sugere-se, sobre a densidade sináptica, que Aβ, nas formas solúvel e oligomérica são tóxicas às sinapses (Clare et al., 2010).

O imunoconteúdo de sinaptofisina na região de cortex pode ser reduzido pela α-sinucleína, de forma dose-dependente (Bate et al., 2012). A α-sinucleína é um marcador histológico na doença de Parkinson, localizada nos terminais pré-sinápticos, regula a formação da vesicula sináptica e liberação de neurotransmissores (Cabin et al., 2002; Bonini & Giasson, 2005), ainda, pode afetar a plasticidade sinaptica durante o aprendizado (Clayton & George, 1998). No entanto, evidências sugerem que pequenos oligomeros da α-sinucleína acumulam-se na membrana pré-sinaptica e provocam degeneração sinaptica na doença de Parkinson (Lee et al., 2006; Kramer et al., 2007; Kazantsev et al., 2008). A perda das sinapses no hipocampo é uma caracteristica de pacientes com doença de Parkinson que desenvolvem demencia (Galvin et al., 1999), bem como em modelo animal de α-sinucleinopatia a perda neuronal é precedida por degeneração sinaptica (Chung et al., 2009). A patologia associada a α-sinucleína acontece de forma similar a tau fosforilada na DA (Braak et al., 2003).

Estas evidências apontam para um possível papel da doença neurodegenerativa a longo prazo na disfunção cognitiva induzida pela sepse, mas até o momento, não existem evidências capazes de confirmar a relação entre esses dois eventos.

Assim, a hipotese desta tese é que a inflamaçao aguda induz o aumento de Aβ no cerebro de sobreviventes de sepse e isso esta relacionado com o dano cognitivo de longo prazo.

1.3.2 Antioxidante e Metaloproteinase no tratamento da Sepse

As metaloproteinases da matriz (MMPs) são enzimas também conhecidas como matrixinas de uma família multigênica de proteases neutras dependentes de zinco (Zhang, et al., 2010). As MMPs vêm se transformando em importantes enzimas reguladoras, tanto com atividade pró como anti vias inflamatórias, por resultarem em condições benéficas na regulação da defesa do hospedeiro e na doença inflamatória. São também mediadores na patologia e na regeneração do SNC e além de suas atividades benéficas apresentam também alguns efeitos adversos (Agrawal & Shukla, 2008).

43 A expressão das MMPs encontra-se sobre o controle de um mecanismo genético sofisticado ocorrendo por três vias principais: regulação da transcrição de genes; regulação da ativação das pró-enzimas e inibição pela ação dos inibidores específicos de MMPs (TIMP), por estes fatores, a degradação da matriz extracelular (MEC) está diretamente relacionada com o equilíbrio entre a produção, ativação e inibição que impedem a proteólise excessiva da MEC (Yong et al., 1998; Nagase et al., 2006).

O controle da expressão gênica das MMP é dado em resposta a estímulos de citocinas (IL-1, IL-4, IL-6 e TNF α) e EROs, NO, hormônios e fatores de crescimento, que se ligam a receptores na superfície da célula desencadeando cascatas de sinalização intracelulares ativando fatores de transcrição que se ligam às regiões responsivas presentes no promotor de genes de diferentes MMPs (Sun, 2010). No que se refere à formaçao de EROs, pode-se dizer que em condições fisiológicas normais do metabolismo aeróbico o O2, sobre redução tetravalente com aceitação de 4 elétrons forma água. Durante este processo são formados intermediários reativos como superoxido, H2O

-, H e o H2O2. Normalmente, a redução completa do O2 ocorre na mitocôndria e a reatividade de EROs é neutralizada pela entrada dos 4 elétrons. Entre as espécies reativas de oxigênio formando o radical superóxido, ocorre em quase todas as células aeróbicas e é produzida durante a atuação máxima de neutrófilos, macrófagos, monócitos e eosinófilos (Ferreira et,al., 1997, Cuzzocrea et al., 2001). O radical peróxido reage com alvos biológicos sendo que o efeito nos tecidos é resultado da formação secundária de novos radicais livres em adição e reação do superóxido com lipídeos, catecolaminas e DNA (Marcathu et

al., 2000, Dix et al., 1996). Entre as EROs, o oxigenio singlet é a forma mais citada do oxigênio molecular e não possui elétrons desemparelhados na última camada, é reconhecido como possível contribuinte para o estresse oxidativo nos sistemas vivos, altamente energéticos e mutagênicos, sendo capaz de oxidar moléculas biológicas (Cuzzocrea et al., 2001, Bozza et al., 2013). O H2O2 é capaz de atravessar camadas lipídicas podendo reagir com a membrana eritrocitária e com proteínas ligadas ao ferro, sendo assim altamente tóxicas paras as moléculas podendo ser aumentada a toxicidade na presença de ferro (Eaton, 1991). A liberação de ferro intracelular diminui a capacidade liquorica de ligação de ferro-proteína e a deficiência de enzimas antioxidantes no SNC ampliam o risco de

44 lesões induzidas pelo trauma com a liberação de ferro. Estas espécies reativas são capazes de reagir indiscriminadamente com qualquer tipo de molécula orgânica extraindo elétrons e gerando novos radicais livres em reação em cadeia altamente citotóxicas (Cuzzocrea et al.,, 2001, Ferreira et al.,, 1997). Quando existe o aumento na produção ou diminuição das defesas oxidantes acontece o estresse oxidativo, em que os radicais livres em excesso começam a produzir danos a lipideos, proteínas, DNA e carboidratos, inibição das enzimas da cadeia respiratória mitocondrial, inativacão de gliceroldeídeo-3-fosfato hidrogenase, inibição da atividade ATPase na membrana sódio-potassio e inativação do cálcio na membrana (Cuzzocrea et al.,, 2001). Intervenções que reduzem a produção de EROs exercem efeitos benéficos em diversos modelos de endotoxinas e choque séptico. Estas intervenções incluem a N-acetilcisteina (NAC) α-tocoferol, alopurinol, deferoxamina (DFX), catalase, superóxido dismutase, miméticos de superoxido dismutase e tempol (Atis et al., 2006, Durante et al., 2004, Xiang et al., 2003, Matejovic et al., 2005). NAC é a precursora artifical de glutationa, é utilizada clinicamente como droga mucolítica e no tratamento de intoxicação por paracetamol. É um scavenger de peróxido de hidrogênio, acido hipocóorico e radical hidroxil e por estas ações inibe a liberação de NTF 2 e a ativação de citocinas pro-inflamatorias e apoptose celular (Sprong et al.,, 1998). Segundo Barichello (2005), evidencias usugerem que a expressão de TNF- é controlado pela transcrição de NF-kB cuja atividade pode ser induzida pelo peroxido de hidrogênio. NAC mostrou inibir a atividade de NF-kB em várias linhagens celulares inclusive em macrófagos peritoniais em ratos. O peróxido de hidrogênio, direta ou indiretamente, através de sua redução do radical hidroxil via reação de Fenton, age como um mensageiro na sintase e ativação de mediadores inflamatórios. O NAC como limpador destes radicais mostrou inibir a liberação destes mediadores (Sprong et al., 1998). O DFX é um quelante de ferro empregado em varias doenças hematológicas. Já existem estudos que mostram que a droga diminui a injúria oxidativa quando usada antes e não depois da indução da sepse melhorando a mortalidade (Messaris et al., 2004).

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2. OBJETIVOS

2. 1 Objetivo Geral

Analisar marcadores de neurodegeneração em cérebro de ratos sobreviventes a sepse e sua relação com dano cognitivo a longo prazo.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar o imunoconteúdo de sinaptofisina no hipocampo e no cortex pré-frontal em ratos sobreviventes ao modelo de sepse, por Ligação cecal e punção (CLP), 30 dias após a indução;

Avaliar tau fosforilada no hipocampo e no cortex pré-frontal em ratos sobreviventes ao modelo de sepse, por Ligação cecal e punção (CLP), 30 dias após a indução;

Avaliar α-sinucleína no hipocampo e no cortex pré-frontal em ratos sobreviventes ao modelo de sepse, por Ligação cecal e punção (CLP), 30 dias após a indução;

Avaliar Aβ no hipocampo e no cortex pré-frontal em ratos sobreviventes ao modelo de sepse, por Ligação cecal e punção (CLP), 30 dias após a indução;

Avaliar S100β no hipocampo e no cortex pré-frontal em ratos sobreviventes ao modelo de sepse, por Ligação cecal e punção (CLP), 30 dias após a indução;

Avaliar RAGE no hipocampo e no cortex pré-frontal em ratos sobreviventes ao modelo de sepse, por Ligação cecal e punção (CLP), 30 dias após a indução.

Avaliar do imunoconteúdo de sinaptofisina no hipocampo e no cortex pré-frontal em ratos sobreviventes ao modelo de sepse após o tratamento com inibidor de MMP e antioxidantes (NAC e DFX).

Avaliar Aβ no hipocampo e no cortex pré-frontal em ratos sobreviventes ao modelo de sepse após o tratamento com inibidor de MMP e antioxidantes (NAC e DFX).

Correlacionar os níveis de sinaptofisina e Aβ com desempenho no teste de esquiva inibitória em ratos sobreviventes ao modelo de sepse por CLP, 30 dias após a indução.

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3. METODOLOGIA

Experimento 01: Determinação da presença de biomarcadores de neurodegeneração em animais sobreviventes à sepse. a) Indução de sepse por CLP com posterior avaliação dos níveis de Aβ, RAGE, tau fosforilada, α-sinucleína, S100B e sinaptofisina; Experimento 02: Determinação da relação entre níveis de beta-amilóide e sinaptofisina com alterações cognitivas em longo prazo. a) Indução de sepse por CLP com posterior avaliação dos níveis de beta amiloide e sinaptosifina e sua relação com a performance na tarefa de isquiva inibitória Experimento 03: Avaliação da efetividade do tratamento com antioxidantes ou inibidor de metaloproteinase sobre níveis de beta-amilóide e sinaptofisina e sobre as alterações cognitivas em longo prazo. a) Indução de Sepse – Modelo de CLP, com posterior avaliação de Aβ e Sinaptofisina do grupo CLP que receberam antioxidantes ou inibidor da metaloproteinase; b) Teste de esquiva inibitória com animais que receberam antioxidantes ou inibidor da metaloproteinase.

3.1 Descrição do Experimento 01: Avaliacao de biomarcadores de neurodegeneracao em animais sobreviventes a sepse

3.1.1 Animais

Neste estudo foram utilizados ratos Wistar machos, entre 2 e 3 meses de idade, pesando aproximadamente 350 g, procedentes do biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense. Os animais foram acondicionados com 5 animais por caixa, ciclo de claro e escuro de 12 horas (06:00 às 18:00) e comida e água ad libitum. O ambiente foi mantido a temperatura de 23 + 1ºC.

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Os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal) para pesquisa utilizando animais. Todos os protocolos realizados foram aprovados pelo comitê de ética em animais da UNESC, com aprovação sob nº 047/2009 CEUA/Unesc.

Durante os experimentos, os animais foram manipulados por pessoas qualificadas, para tratar esses animais de maneira humanitária evitando dores e estresse desnecessários a estes animais. Quando houve indicação, ou ao final dos experimentos, os animais foram devidamente sacrificados sob estrita obediência às prescrições científicas.

3.1.2 Indução de Sepse – Modelo de ligação e perfuração cecal (CLP)

Sepse intra-abdominal foi induzida usando a técnica de CLP conforme previamente descrito (Witchterman et al., 1980) com adaptações (Ritter et al., 2003). Brevemente, os ratos foram anestesiados com uma mistura de cetamina (80 mg/kg) e xilasina (10 mg/kg), por via intraperitoneal, sendo submetidos à laparotomia com incisão mediana abdominal. O ceco foi exposto e ligado logo abaixo da junção íleo-cecal com fio seda 3-0, mantendo assim a continuidade intestinal. O ceco foi perfurado com uma agulha número 14 na face antimesentérica do ceco, e gentilmente comprimido até extrusão de conteúdo fecal. Os planos cirúrgicos foram fechados e os ratos observados em caixa de recuperação por 2 horas.

Como controle, foram utilizados animais submetidos a laparotomia, com manipulação do ceco, mas sem ligação ou perfuração (sham) conforme Figura 03. Os grupos sepse e sham receberam reposição volêmica, realizada com salina, 50 mL/kg, imediatamente e 12 horas após a cirurgia. Após o procedimento cirúrgico os animais receberam suporte básico de antibióticos (cefitriaxona 30 mg/kg e clindamicina 25 mg/kg) a cada 6 horas por 3 dias. A sobrevivência em 7 dias foi de 100% no grupo sham e 43% no grupo sepse, bem como a sobrevivencia apos 30 dias, em concordância com estudos prévios (Ritter et al., 2003). Ao fim dos procedimentos os animais voltaram às caixas com livre acesso a água e comida. Os animais foram distribuidos de forma randomizada entre grupos sham e sepse.

Trinta dias após o procedimento cirúrgico os animais foram mortos por decaptação e isolados hipocampo e cortex pré-frontal (n=15 por grupo).

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Figura 3: Ligação cecal e Perfuração (CLP), adaptado de Wichterman, Baue, Chaudry (1980).

3.1.3 Análise por Western Blot

Os níveis de Aβ, RAGE, tau fosforilada, α-sinucleína, S100B

e sinaptofisina foram mensurados por Western blot utilizando anticorpos específicos. Para executá-lo as amostras foram homogeneizadas em tampão Laemmli (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1% (w/v) de dodecil sulfato de sódio (SDS), 10% (v/v) de glicerol) e quantidades iguais de proteína (30 µg/poço) foram fracionados por eletroforese em gel de poliacrilamida - dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose. A eficiência da eletrotransferência foi verificada por meio de coloração Ponceau S, e a membrana foi bloqueada em Tampão Tween-Tris salina (TTBS: 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, contendo 0,9% de NaCl e 0,1% de Tween-20) com 5% de albumina. As membranas foram incubadas overnight a 4°C, com anticorpo diluído em TTBS (1:1000 – anti-RAGE, R5278, Sigma; anti- Aβ, No. 2454; anti-sinaptofisina, No. 5461, Cell Signaling Tecnology; anti-isoforma de tau de Doença de Alzheimer, A8855,

49 Sigma; anti-α-sinucleína, ab6162, Abcam; anti-S100B, ab41548, Abcam, anti-tau, A8855, Sigma). Anticorpo secundário Anti-IgG de coelho ou rato (de acordo com as espécies que originaram o anticorpo primário) foi incubado com as membranas durante 2 horas em temperatura ambiente (diluição: 1:5000), a membrana foi lavada novamente e a imunorreatividade foi detectada por quimioluminescência utilizando o kit Pierce WestPico Chemiluminescence. A análise densitométrica dos filmes foi realizada com o software ImageQuant. Todos os resultados foram expressos como uma razão relativa entre Aβ, RAGE e sinaptofisina e o imunoconteúdo de proteína β-actina.

3.1. 4 Análise Estatística

Os resultados do imunoblotting são expressos como a média ± DP (desvio-padrão). As diferenças entre os grupos foram comparados pelo teste t. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o SPSS 12.0 para Windows® e foi atribuída significância estatística quando p < 0,05.

3.2 Descrição do Experimento 02: Determinação dos niveis de Aβ e sinaptofisina com alteracoes cognitivas a longo prazo.

3.2.1 Animais

Os procedimentos adotados foram os mesmos dos animais do experimento 01.




Os procedimentos adotados foram os mesmos dos animais do experimento 01 limitado apenas a dosagem de beta-amiloide e sinaptofisina por apresentarem no experimento 01 o aumentos mais significativo.

50 3.2.3 Teste de esquiva inibitória

Para realização de tal avaliação usou-se uma caixa de acrílico na qual o piso é formado por barras paralelas de metal (1mm de diâmetro). Uma plataforma com 7 cm de largura e 2,5 cm de comprimento é colocada junto à parede esquerda do aparelho. Na sessão de treino, os animais são colocados sobre a plataforma e mede-se o tempo que o animal leva para descer com as quatro patas da plataforma. Esse tempo é denominado latência. Imediatamente após descer da plataforma (com as 4 patas), o animal recebe um choque de 0,4 mA durante 2 segundos. Na sessão de teste, o animal é novamente colocado na plataforma e medido o tempo que ele leva para descer (latência), porém não é administrado choque. A latência é um parâmetro clássico de retenção de memória. Os intervalos entre o treino e o teste foram de 24 horas para medir memória de longa duração (Izquierdo, et al., 1998, Quevedo, et al,. 1999).

Figura 4: Esquiva Inibitória (treino simples). Imagem disponibilizada pelo Laboratório de Neurociências/UNESC.

3.3 Descrição do experimento 03: Avaliação da efetividade do tratamento com antioxidantes ou inibidor de metaloproteinase

51 sobre níveis de beta-amilóide e sinaptofisina e sobre as alterações cognitivas em longo prazo.

3.3.1 Animais



Os procedimentos adotados foram os mesmos dos animais do experimento 01 com exceção de que alguns animais foram tratados imediatamente após a indução da sepse com antioxidantes (N-acetilcisteina, 20 mg/kg a cada 6 horas por 24 horas e uma unica dose de deferoxamina 20 mg/kg ambas subcutâneo) ou com inibidor de metaloproteinase 2-9 (inibidor I – Santa Cruz Biotecnologia - 0,3 mg/kg, injetado como uma única dose no ventrículo cerebral com auxílio de um estereotáxico) (n = 15 por grupo).


Foi utilizada a mesma técnica do experimento 01.

3.3.4 Teste de esquiva inibitória


3.3.5 Análise Estatística

Os dados obtidos pelo teste de esquiva inibitória foram comparados pelo teste Mann-Whitney. A análise inter-grupos foi realizada pelo teste Wilcoxon. Para análise dos efeitos dos tratamentos sobre os níveis de marcadores de neurodegeneração e a performace na esquiva inibitória foi realizado teste de ANOVA de uma via seguido do teste de Tukey.

Todas as análises estatísticas foram realizadas com o SPSS 12.0 para Windows® e foi atribuída significância estatística quando p < 0,05.

52

4. RESULTADOS Os resultados serão apresentados em três momentos: Resultados do Experimento 01, Resultados do Experimento 02 e Resultado do Experimento 03:

4.1 RESULTADOS DO EXPERIMENTO 01

4.1.1 Avaliação do imunoconteúdo de Aβ, RAGE e sinaptofisina em hipocampo e cortex pré-frontal

Quando comparado ao grupo sham, o imunoconteúdo de Aβ esteve significativamente aumentado no hipocampo (Figura 5) no grupo sepse, mas não no córtex pré-frontal (Figura 6). Houve aumento da expressão de RAGE no hipocampo e no córtex pré-frontal do grupo sepse (Figuras 7 e 8), comparado ao sham. Ainda, o imunoconteúdo de sinaptofisina diminuiu apenas no córtex pré-frontal do grupo sepse (Figuras 9 e 10).

53

Figura 5: Imunoconteúdo de Aβ em hipocampo de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t e *demonstra diferença significativa entre os grupos sham e sepse (p<0,05), n=15 por grupo.

54

Figura 6: Imunoconteúdo de Aβ em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t. n=15 por grupo.

55

Figura 7: Imunoconteúdo de RAGE em hipocampo de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t e *demonstra diferença significativa entre os grupos sham e sepse (p<0,05), n=15 por grupo.

56

Figura 8: Imunoconteúdo de RAGE em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t e *demonstra diferença significativa entre os grupos sham e sepse (p<0,05), n=15 por grupo.

57

Figura 9: Imunoconteúdo de sinaptofisina em hipocampo de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t, n=15 por grupo.SNP=sinaptofisina.

58

Figura 10: Imunoconteúdo de sinaptofisina em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t e *demonstra diferença significativa entre os grupos sham e sepse (p<0,05), n=15 por grupo.SNP=sinaptofisina.

59 4.1.2 Avaliação do imunoconteúdo de α-sinucleína, tau fosforilada e S100β em hipocampo e cortex pré-frontal

Em hipocampo e cortex pré-frontal de animais do grupo sepse o imunoconteúdo de α-sinucleína foi significativamente maior comparado ao sham (Figuras 11 e 12 ).

Figura 11: Imunoconteúdo de α-sinucleína em hipocampo de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t e *demonstra diferença significativa entre os grupos sham e sepse (p<0,05),

60

Figura 12: Imunoconteúdo de α-sinucleína em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t e *demonstra diferença significativa entre os grupos sham e sepse (p<0,05),

O imunoconteúdo de tau fosforilada, determinado pela utilização de um anticorpo desenvolvido para detectar a isoforma de tau predominante no tecido cerebral de pacientes com DA - “AD-like tau”-, também foi maior no hipocampo do grupo sepse (Figura 13), porém no cortex pré-frontal (Figura 14) não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos.

61

Figura 13: Imunoconteúdo de tau fosforilada em hipocampo de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t e *demonstra diferença significativa entre os grupos sham e sepse (p<0,05),

62

` Figura 14: Imunoconteúdo de tau fosforilada em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t (p<0,05),

Animais dos grupos sham e sepse apresentaram imonuconteúdo se S100β semelhantes em hipocampo e cortex pré-frontal (Figuras 15 e 16).

63

Figura 15: Imunoconteúdo de S100β em hipocampo de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t e (p<0,05),

64

Figura 16: Imunoconteúdo de S100β em córtex pré-frontal de animais sobreviventes a sepse. Imunoblot é representado por amostras individuais de diferentes animais do grupo sham ou sepse. Os gráficos de colunas representam a média ± DP, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. As amostras foram analisadas utilizando o teste t (p<0,05),


4.2.1 Determinação da relação entre níveis de beta-amilóide e sinaptofisina com alterações cognitivas em longo prazo.

A latência na esquiva inibitória no teste, foi significativamente reduzida no grupo sepse, quando comparado com o grupo sham, sugerindo dano na memória aversiva. Quando os animais do grupo sepse foram divididos de acordo com as medianas do teste, observou-se que o pior desempenho foi associado com baixos níveis de sinaptofisina no córtex pré-frontal (Figura 17A), mas a mesma relação não foi observada para imunoconteúdo de Aβ ou RAGE (dados não mostrados). Quando o desempenho da esquiva inibitória foi classificado de acordo com os

65 quartis da relação de sinaptofisina e córtex pré-frontal e desempenho parece adquirir uma "dose-resposta" (Figura 17B). Além disso, os níveis de sinaptofisina e Aβ no córtex pré-frontal foram inversamente correlacionados (R2 = 0,49, p <0,001).

Figura 17: Desempenho no teste de esquiva inibitória relacionado aos níveis de sinaptofisina no córtex pré-frontal. O desempenho no teste de esquiva inibitória foi relacionada com os níveis de sinaptofisina, dividindo de acordo com a

66 mediana da latencia na sessão teste (A), ou pelos quartis da latencia na sessão teste (B). Os grupos sepse são apresentados em gráficos de colunas, representando a média ± DP de sinaptofisina, normalizados por imunoconteúdo de β-actina. Os dados foramanalisadas utilizando o teste t ou ANOVA e * demonstra diferença significativa em relação a ≤mediana ou quartil < 25, #demonstra diferença em relação ao quartil 50-75 (p<0,05), n=15 por grupo.


4.3.1 Avaliação do imunoconteúdo de Aβ e tratamento com inibidor de MMP e Antioxidantes (ATX)

Quando comparado o imunoconteudo de Aβ do grupo sham

com o grupo CLP no hipocampo e cortex percebe-se um aumento significativo em ambos. Quando comparados imunoconteudo de Aβ do grupo CLP com CLP+MMP2-9 e ATX no hipocampo e cortex, percebe-se uma redução significativa do imunoconteudo de Aβ em ambos. Hipocampo Córtex Pré-frontal

67

Figura 18: Imunoconteúdo de Aβ no hipocampo e córtex pré-frontal dos animais sobreviventes a sepse. Immunoblot é representado por a mostras individuais de diferentes animais do grupo sham, grupo sepse, grupo animais tratados com MMP2-9 e animais tratados com ATX. Os gráficos de coluna representam a média ± DP normalizados por imunoconteudo de Aβ. As amostras foram analisadas utilizando por ANOVA e * demonstra diferenças significativas comparando com o grupo sham e # a diferença significativa comparando com o grupo sepse (p < 0,05), n = 15 por grupo.

4.3.2 Avaliação do imunoconteúdo de Sinaptofisina e tratamento com inibidor de MMP e ATX

Quando comparado o imunoconteudo de Sinaptofisina do grupo sham com o grupo CLP no hipocampo e córtex percebe-se uma redução significativa em ambos. Quando comparados imunoconteúdo de Sinaptofisina do grupo CLP com CLP+MMP2-9 e ATX no hipocampo não se percebe alteraçoes significativas porém, no córtex, percebe-se um aumento do imunoconteudo de sinaptofisina após tratamento com MMP2-9 e ATX. Hipocampo Córtex Pré-frontal

68

Figura 19: Imunoconteúdo de Sinaptofisina no hipocampo e córtex pré-frontal dos animais sobreviventes a sepse. Immunoblot é representado por a mostras individuais de diferentes animais do grupo sham, grupo sepse, grupo animais tratados com MMP2-9 e animais tratados com ATX. Os gráficos de coluna representam a média ± DP normalizados por imunoconteudo de Aβ. As amostras foram analisadas utilizando por ANOVA e * demonstra diferenças significativas comparando com o grupo sham e # a diferença significativa comparando com o grupo sepse (p < 0,05), n = 15 por grupo.

4.2.3 Teste de comportamento

A latência na esquiva inibitória no teste foi significativamente reduzida no grupo sepse, quando comparado com o grupo sham, sugerindo dano na memória aversiva, como já demonstrado. Quando os animais do grupo sepse foram tratados com inibidor de MMP2-9 ou ATX, observou-se a melhora do desempenho da mem( Figura 20).

69

Figura 20: Prevenção do déficit cognitivo a longo prazo em animais sobreviventes a sepse por tratamento com ATX ou inibidor de MMP2-9. Sepse foi induzida nos animais tratados ou não com antioxidantes ou inibidor de MMP2-9 e 30 dias depois foi realizado o teste da esquiva. O gráfico de colunas representam mediana e intervalo interquartil do tempo de latência de teste. Os dados foram analisadas por meio de testes de Mann Whitney, com p <0,05, o * representa a diferença grupo sham, sepse, de animais tratados com inibidor de MMP2-9 e animais tratados com ATX.

70

5. DISCUSSÃO Os resultados deste estudo sugerem que a inflamação

sistêmica aguda está associada com marcadores de neurodegeneração no cérebro, que os níveis de sinaptofisina no córtex pré-frontal estão associados com o desempenho no teste de esquiva inibitória e inversamente correlacionados com o conteúdo de Aβ no grupo sepse. Sugerem ainda que o tratamento precoce na sepse com inibidor de MMP-2, MMP-9 e antioxidantes (NAC e DFX) pode melhorar o déficit cognitivo tardio.

Há evidências crescentes de que a inflamação e neurodegeneração são eventos relacionados. Verificou-se níveis de procalcitonina (PCT) no fluido cerebrospinal significativamente aumentados em pacientes com DA, demência vascular, demência com corpos de Lewy e demência fronto-temporal, de forma semelhante ao observado em situações neuroinflamatórias agudas, tais como na encefalite e meningite (Ernst et al., 2007).

Atualmente, as consequências da encefalopatia séptica na função cerebral a longo prazo são pouco compreendidas. Demonstrou-se em modelo animal de que a disfunção comportamental é independente dos níveis de glicose cerebral, mas dependente do gene da iNOS, sugerindo uma relação com a manutenção da ativação da microglia (Weberpals et al., 2009). Já se relatou que as fases iniciais da sepse são caracterizadas pela maior produção de espécies reativas, ocasionando estresse oxidativo (Barichello et al., 2006) e que o tratamento antioxidante durante esta fase aguda preveniu o desenvolvimento de danos cognitivos tardios em modelo animal de sepse (Barichello et al., 2007).

Recentemente foi demonstrado que o bloqueio da síntese de TNF- reduz as múltiplas características marcantes da DA, incluindo o aumento de Aβ e com danos na memória de ratos Tg-DA, preservando os níveis de sinaptofisina (Tweedie et al., 2012). Uma vez que o estresse oxidativo e inflamação são eventos relacionados em ambas, doença neurodegenerativa e sepse, é possível que o estresse oxidativo e ativação da microglia colaborem para danos cognitivos a longo prazo observadas em sobreviventes de sepse.

Microglia é a fonte comum do dano pró-inflamatório e oxidativo em DA, como mostrado pelas observações consistentes de “upregulation” de resposta inflamatória em regiões do cérebro que apresentam níveis elevados de marcadores de DA, tais como o córtex

71 frontal e límbico (Cras et al., 1990; Good et al., 1996). Por outro lado, estes marcadores de inflamação ou de estresse oxidativo estão ausentes ou ou presentes em quantidades mínimas em regiões do cérebro que são tipicamente menos susceptíveis a eventos neurotóxicos relacionados à patologia da DA, tais como o cerebelo (Akiyama et al., 2000). Sugere-se que a inflamação e aumento do estresse oxidativo, tanto antes de um diagnóstico da doença de Alzheimer (ou, pelo menos, no início da DA), devido a super-ativação de determinadas respostas pró-inflamatórias pelos fagócitos mononucleares, reforçando a ideia de que a inflamação cerebral precoce e estresse oxidativo podem estar relacionados com a de marcadores tardios da neurodegeneração (Nunomura et al., 2001; Fagiolo et al., 1993).

Observou-se também que evidências farmacológicas relacionam a deficiência cognitiva a longo prazo associada sepse com doenças neurodegenerativas (Tuon et al., 2008; Comim et al., 2009; Cassol-Jr et al., 2010), portanto, esta evidência está realcionada com o aumento de Aβ, tau fosforilada e α-sinucleína no hipocampo e α-sinucleína em córtex pre-frontal de animais sépticos. Kaul et al., (2001) verificou diferentes os níveis de α-sinucleína nas regioes cerebrais, sendo elevados os níveis em tronco e cortex pre-frontal enquanto em hipocampo e cerebelo não se observou. Esta variabilidade pode explicar os níveis aumentados de α-sinucleína no córtex pré-frontal em nosso estudo. Estas modificações são comuns em condições neurodegenerativas ou processos neurotóxicos agudos, indicando uma disfunção bioquímica resistente no SNC.

Observou-se também, correlação inversa entre os níveis de Aβ e sinaptofisina e sua relação com o desempenho no teste de esquiva inibitória. Essas mudanças sugerem uma correlação temporal com a ocorrência de dano cognitivo no teste dependente do circuito hipocampo-pré-frontais (Tuon et al., 2008), sugerindo uma relação entre estes dois fenômenos. Uma vez que Aβ desempenha um papel central em eventos neurotóxicos celulares relacionados com perturbações neurodegenerativas tais como DA, também investigou-se uma via relacionada com a neurotoxicidade da Aβ nestes animais.

A super-expressão e ativação de RAGE no SNC têm sido crescentemente implicada na progressão da neurodegeneração observada na DA e outras perturbações neurodegenerativas (Yan et al., 2009). Acredita-se que a neurotoxicidade relacionada com a sinalização RAGE no cérebro é relacionada tanto com mecanismos que aumentam a expressão de RAGE e/ou a produção e secreção de ligantes de RAGE,

72 tais como o Aβ, S100B e AGEs (Zhang et al., 2009). Um dos principais alvos intracelulares da activação RAGE é o factor de transcrição NF-kB, que induz a expressão de colônias de macrófagos, fator estimulante que ativa a microglia, perpetuando a resposta inflamatória e do estresse oxidativo no cérebro (Du Yan et al., 1997). Uma vez que o gene RAGE também contém um elemento de resposta para o NF-kB (p65), a ligação de Aβ com RAGE resulta em um ciclo de feedback positivo de indução RAGE, que por sua vez aumenta ainda mais a inflamação do cérebro, o estresse oxidativo e produção de Aβ (Creagh-Brown et al., 2010). Recentemente foi demonstrado que o polimorfismo G82S do RAGE (associada com um aumento da afinidade de ligantes de RAGE) está associada com início precoce da DA e aumento significativo na imunorreatividade de RAGE foi observado no início da DA (Li et al., 2010a).

Além do crescente aumento de dados que apontam para este receptor como um dos principais mediadores da sinalização neurotóxica no cérebro, foi também demonstrado um importante papel para RAGE na progressão da neurodegeneração, a proteína foi identificada como mediadora do transporte de Aβ através da barreira hematoencefálica, assim sendo a principal causa de translocação de Aβ sistêmica para o SNC (Candela et al., 2010). Neste contexto, os nossos resultados sugerem que o cérebro de sobreviventes a sepse são caracterizados por um aumento persistente de vários potenciais mediadores da neurodegeneração da via RAGE, mas, apesar disso, não é possível observar uma relação direta dos níveis de RAGE com o desempenho no teste de esquiva inibitória.

Algumas observações e limitações devem ser abordadas. Primeiro, apesar do fato de a esquiva inibitória ser uma tarefa dependente do hipocampo não foi possível determinar uma diminuição nos níveis de sinaptofisina no hipocampo ou uma relação do aumentos níveis de Aβ e RAGE no hipocampo com desempenho no teste de esquiva inibitória. Isto pode estar relacionado a perda importante de neurônios colinérgicos pré-frontais, como demonstrado por Semmler et

al., (2007), e a dependência parcial das conexões neurais pré-frontais no teste de esquiva inibitória. Ainda, a dependência pré-frontal da esquiva inibitória está relacionada principalmente com a atividade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) (Garrido et al., 2012), em que já se demonstrou relação entre o dano a memória e alterações no eixo HPA em ratos sobreviventes a sepse (Cassol-Jr et al., 2010). Em segundo lugar, não foi possível determinar se a diminuição dos níveis de

73 sinaptofisina pré-frontal está realmente relacionada com Aβ, pois não houve aumento significativo dos níveis de Aβ nesta estrutura (apesar do apresentar uma tendência para aumento dos níveis).

O estudo demonstrou que o tratamento com antioxidantes precoce, pode diminuir o deficit cognitivo a longo prazo em modelo animal. A relação entre os níveis de Aβ e sinaptofisina e déficit cognitivo observado em sobreviventes de sepse deve porem, ser interpretados com cautela (Baruch- Suchodolsky, Ficher, 2009; Soscia et al., 2010). Existem algumas evidências que sugerem Aβ poderia ter atividade antioxidante, anti-inflamatória e também anti-microbiana(Rao et al., 2012).

Assim, o aumento dos níveis de Aβ poderia ser um marcador de inflamação, e não um grande componente de déficit cognitivo associada à sepse. Neste contexto, os efeitos dos antioxidantes e inibidores de metaloproteinase na inflamação também podem diminuir indiretamente Aβ. Os marcadores sinápticos como sinaptofisina reduzem a Inflamação quando o estímulo inflamatório não está presente por muito tempo (Rao et al., 2012).

No córtex pré-frontal, foi observado queda nos níveis de sinaptofisina e com pequeno aumento nos seus níveis de tratamentos melhorou o desempenho da memória. Como os níveis de sinaptofisina não aumentaram no grupo controle, é possível pressupor que os antioxidantese ou os inibidores de MMP-2 e MMP-9 melhoram alguns mecanismos associados ao déficit de memória dos ratos sobreviventes a sepse.

Halliwell e Gutteridge (2007) mencionam que os antioxidantes podem interferir com o NO e seus metabólicos ou com espécies reativas de oxigênio que podem ter ligação com a disfunção da mitocôndria. NAC pode atuar como scavenger (limpador) direto no NO e peroxinitrito. NAC e DFX, pode interferir na geraçao de EROs diminuindo assim o estresse oxidativo e preservando a funcao mitocondrial. Assim prressupoem-se que NAC associado ao DFX possam ter papel terapêutico para o dano cognitivo tardio em sobreviventes de sepse induzida por modelo CLP (Barrichello et al.; 2007).

Conclui-se que foi possível demonstrar que o cérebro dos animais sobreviventes a sepse apresentou vários marcadores de neurodegeneração e o desempenho no teste de esquiva inibitória parece ser dependente dos níveis de alguns destes marcadores, sugerindo que um “fenômeno neurodegenerativo” podendo este ser um fator

74 importante na associação com dano cognitivo a longo prazo em ratos sobreviventes a sepse. Mais estudos podem esclarecer a relação entre dano cognitivo persistente e expressão de RAGE, ativação e produção sistêmica e cerebral de ligantes de RAGE em sobrevivente a sepse.

75

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