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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
A RELAÇÃO DA ATIVIDADE NEUTROFÍLICA COM A RESPOSTA AO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO -CIRÚRGICO
Alessandra Areas
Rio de Janeiro2002
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
A RELAÇÃO DA ATIVIDADE NEUTROFÍLICA COM A RESPOSTA AO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO CIRÚRGICO
Alessandra Areas
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade do Rio de Janeiro para obtenção
do grau de Mestre em Odontologia (Periodontia).
Rio de Janeiro2002
FICHA CATALOGRÁFICA
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
A RELAÇÃO DA ATIVIDADE NEUTROFÍLICA COM A RESPOSTA AO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO CIRÚRGICO
Alessandra Areas Orientador: Carlos Marcelo da Silva Figueredo
Aprovada em de de 2002 pela banca examinadora:
Areas, Alessandra
A relação da atividade neutrofílica com a resposta ao tratamento periodontal não cirúrgico / Alessandra Areas- 2002
Orientador: Carlos Marcelo da Silva FigueredoDissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Odontologia.
1- Elastase 2- Fluido crevicular gengival 3- Periodontite. I- Figueredo, Carlos Marcelo da Silva II- Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Odontologia. III- Título
Prof. __________________________
Prof.___________________________
Prof.___________________________
RIO DE JANEIRO
2002
“PENSAMENTO”
“DEDICATÓRIA”
AGRADECIMENTOS
A DEUS,
Ao Professor Ricardo Guimarães Fischer,
Ao Professor Carlos Marcelo da Silva Figueredo,
Ao Instituto Karolinska, Suécia especialmente ao Professor Anders
Gustafsson
Aos meus pais, Acir e Vera
Às minhas irmãs, Aline e Vanessa
Ao meu namorado Marcio
Aos meus amigos da turma de mestrado, área de concentração em
Periodontia: Roberta, Luís, Júlio, Gilberto e Luciano.
Ao funcionário Nilson Reis
A Disciplina de Periodontia da Universidade do Estado do Rio de janeiro
e a todos que auxiliaram direta ou indiretamente na realização deste trabalho.
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIAÇÕES
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIAÇÕES
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
1- INTRODUÇÃO
2- REVISÃO DE LITERATURA
2.1 – NEUTRÓFILOS
2.2- HIPERATIVIDADE NEUTROFÍLICA
2.3- ELASTASE
2.4- ELASTASE E DOENÇA PERIODONTAL
2.5- LACTOFERRINA
2.6- FLUIDO GENGIVAL
3- PROPOSIÇÃO DO ESTUDO
4- MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 – SELEÇÃO DE PACIENTES
4.2- PARÂMETROS CLÍNICOS UTILIZADOS
4.3- SÍTIOS SELECIONADOS
4.3.1 – SÍTIOS CONTROLE
4.3.2 – SÍTIOS EXPERIMENTAIS
4.4 – DADOS RELATIVOS À COLETA
4.5- TRATAMENTO PERIODONTAL
4.6- REAVALIAÇÕES CLÍNICAS
4.7- ANÁLISES BIOQUÍMICAS
4.7.1- ANÁLISE QUANTITATIVA DA ATIVIDADE DE ELASTASE
4.7.2- CONFECÇÃO DA CURVA PADRÃO DE ELASTASE
4.7.3- ANÁLISE QUANTITATIVA DA ELASTASE LIVRE
4.7.4- ANÁLISE QUANTITATIVA DE LACTOFERRINA
4.7.5- TAXA DE ATIVIDADE DE ELASTASE POR NEUTRÓFILO
4.8 – ANÁLISE ESTATÍSTICA
5- RESULTADOS
6- DISCUSSÃO
7- CONCLUSÃO
8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi avaliar se a atividade excessiva dos neutrófilos, antes do
tratamento, em pacientes com periodontite crônica generalizada influencia na resposta ao
tratamento periodontal não cirúrgico. 17 pacientes foram selecionados e, no início do estudo,
amostras do fluido gengival foram coletadas com o método de lavagem intrasulcular, dos sítios
selecionados. Os sítios foram divididos em sítios sem destruição tecidual (sítios GP) e com
destruição tecidual (sítios PP). Os parâmetros clínicos para a seleção destes sítios foram índice de
placa (IP), índice gengival (IG), profundidade de bolsa à sondagem (PBS) e nível de inserção
(NI). Os pacientes receberam, então, tratamento periodontal não-cirúrgico, que consistiu de
instrução de higiene oral, raspagem supra e subgengival nos quatro quadrantes, polimento
coronário e aplicação de flúor. Foram realizadas reavaliações 30 e 90 dias após o término do
tratamento periodontal. Após a análise de 90 dias, os pacientes foram divididos em dois grupos,
de acordo com a resposta ao tratamento periodontal não-cirúrgico: respondentes e não-
respondentes. Eram considerados respondentes os pacientes que apresentassem diferença entre o
nível de inserção inicial (NI 1) e o de 90 dias (NI 3) maior ou igual a 2 mm, e não-respondentes
os que não apresentassem essa diferença. Os parâmetros bioquímicos iniciais dos dois grupos
foram comparados (atividade total de elastase, lactoferrina, taxa de atividade de
elastase/lactoferrina, atividade total de elastase livre, taxa de atividade de elastase livre/ lacto e
porcentagem de elastase livre). No presente estudo observamos que a atividade excessiva dos
neutrófilos antes do tratamento em pacientes com periodontite crônica generalizada não
influenciou a resposta ao tratamento periodontal não cirúrgico.
ABSTRACT
The aim of this study was to investigate whether the excessive activity of neutrophils,
before treatment, in patients with chronic generalized periodontitis influences the response to
non-surgical periodontal treatment. 17 patients were selected and , in the begining of the study,
samples of gingival crevicular fluid were taken with the intrasulcular wash method, from the
selected sites. The sites were divided in sites without tissue destruction (GP sites) and sites with
tissue destruction (PP sites). The clinical parameters used for the selection of these sites were
Plaque Index (PI), Gingival Index (GI), Pocket Probing Depth (PPD) and Attachment Level
(AL). The patients received non-surgical periodontal treatment, which consisted of oral hygiene
instruction, supra and subgingival debridement, coronal polishing and fluoride aplication. Re-
evaluations were performed 30 and 90 days after completion of the treatment. At the 90-day
evaluation, the patients were divided in two groups, according to the improvement after therapy:
respondents and non-respondents. Patients were considered to be respondents when they had a
difference between the initial attachment level (AL 1) and the 90-day attachment level (AL 3)
greater than 2 mm and non-respondents when these difference didn’t exist. The biochemical
parameters of both groups were compared (elastase total activity, lactoferrin, elastase
activity/lactoferrin, free elastase activity, free elastase activity/lacto and free elastse percentage).
In the present study the excessive activity of neutrophils, before treatment, in patients with
chronic generalized periodontitis did not influence the response to non-surgical periodontal
treatment.
1-INTRODUÇÃO:
A destruição tecidual na periodontite pode ser descrita como uma reação específica
mediada por células do hospedeiro em resposta a um acúmulo de bactérias. Os neutrófilos
polimorfonucleares constituem a primeira linha de defesa do organismo contra agentes
agressores, mas também estão associados com destruição tecidual em várias doenças
inflamatórias crônicas, como o enfisema pulmonar (TRAVIS et al. 1994), a artrite reumatóide
(NURCOMBE,1991) e, atualmente, a periodontite (FIGUEREDO & GUSTAFSSON 1998b).
O dano tecidual causado pelos neutrófilos pode ser gerado pelo aumento do seu número
no processo inflamatório pela sua proximidade das fibras colágenas do periodonto, e por
apresentarem uma liberação extracelular de potentes enzimas proteolíticas, como por exemplo a
elastase (WILTON et al. 1988). A elastase é uma das várias proteases liberadas por neutrófilos
na destruição tecidual e na infecção microbiana. É uma endopeptidase sérica, que cliva substratos
naturais como colágeno e proteoglicanas. Sua atividade é responsável pela maior parte da
atividade de protease no fluido crevicular gengival (FCG) (COX & ELLEY 1989a).
Estudos recentes demonstram que os níveis de elastase no FCG de indivíduos com
periodontite são mais elevados que em indivíduos com gengivite crônica (FIGUEREDO et al.
1999). Como a elastase é liberada por neutrófilos ativados, a medida da sua atividade no FCG
pode fornecer uma estimativa da atividade tecidual dos neutrófilos. Vários estudos mostraram
uma maior ativação de neutrófilos em pacientes com periodontite (GUSTAFSSON et al. 1992,
MURRAY 1995), e estudos longitudinais mostram que níveis mais elevados da atividade de
elastase foram considerados predictores de evolução de doença periodontal (PALCANIS 1992,
ARMITAGE 1994).
A atividade exacerbada dos neutrófilos, que pode ser mensurada pela liberação aumentada
de radicais de oxigênio e/ou pela liberação extracelular de enzimas proteolíticas, parece
contribuir para a destruição tecidual na periodontite. Estudos demonstraram a presença de
neutrófilos hiperativos tanto na corrente sangüínea (ÅSMAN 1988; GUSTAFSSON & ÅSMAN
1996; FREDRIKSSON 1998; FIGUEREDO et al. 1999) quanto no fluido gengival
(GUSTAFSSON et al. 1994). A hiperatividade neutrofílica durante a periodontite pode ser
constitucional (intrínseca) ou induzida pela doença inflamatória.
Nossa hipótese primária é que a hiperatividade neutrofílica é induzida por uma liberação
excessiva de substância pró-inflamatórias (FIGUEREDO et al. 1999, OFFENBACHER 1996),
geradas pela agressão do biofilme bacteriano. Como os neutrófilos apresentam um meia-vida na
circulação de 6-7 horas e de 1-4 dias no tecido, a remoção do estímulo inflamatório levaria a
uma diminuição dessa hiperatividade, e conseqüentemente não influenciaria no tratamento
periodontal.
Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar se a atividade excessiva dos neutrófilos
antes do tratamento em pacientes com periodontite crônica generalizada influencia na resposta ao
tratamento periodontal não cirúrgico.
2- REVISÃO DA LITERATURA
2.1 – NEUTRÓFILOS
A destruição tecidual durante a periodontite é mediada por uma resposta aberrante do
hospedeiro ao acúmulo de placa no sulco gengival, levando à degradação de fibras colágenas e
migração apical do epitélio juncional. Os neutrófilos constituem mais de 90% dos leucócitos
presentes em sítios sadios e inflamados, tendo um importante papel na defesa do organismo por
serem as primeiras células de defesa a agirem contra a agressão bacteriana (PAGE &
SCHOREDER, 1976). No entanto, eles também estão envolvidos no processo de destruição
(MILLER et al. 1984).
Os neutrófilos são leucócitos do tipo granulócitos. São determinados de
polimorfonucleares devido à forma de seus núcleos, a qual pode variar de bi à pentalobulado.
Essa característica contribui para a elasticidade da célula e permite que ela se contraia para passar
através das fortes junções localizadas entre as células endoteliais. Os neutrófilos são os leucócitos
que predominam no sangue com um percentual de 50 a 70% dos leucócitos circulantes (VAN
DYKE & VAIKUNTAM, 1994). São produzidos na medula óssea, pelos mieloblastos, e estágios
subseqüentes na diferenciação celular vão produzindo diferentes características nos neutrófilos. A
primeira diferenciação ocorre no estágio de promielócitos, produzindo os grânulos primários. A
síntese proteica separa completamente as células e prepara-as para o estágio mielócito. Durante
este estágio, as enzimas para os grânulos específicos são sintetizadas e armazenadas. A fase de
maturação dos neutrófilos começa com o metamielócito e é caracterizada pela segmentação
nuclear. O término desta fase origina os neutrófilos maduros. A granulopoiese é concluída em
torno de 9 dias. A meia-vida dos neutrófilos é curta, em torno de 6-7 horas. Se não foram
recrutados para uma região inflamada, estas células são degradadas no baço (PIPPIN et al. 2000).
Já foram identificados 50 produtos tóxicos provenientes dos neutrófilos. Segundo WEISS
(1989), estes produtos podem ser divididos em dois grupos, de acordo com as localizações
assumidas no interior da célula: na membrana plasmática ou nos grânulos intracelulares.
A estrutura do neutrófilo está diretamente adaptada às numerosas funções desempenhadas
por esta célula. Talvez os componentes estruturais mais importantes dos neutrófilos sejam os
grânulos citoplasmáticos, que foram classificados em três categorias de acordo com suas
características ultra-estruturais e citoquímicas. Eles são divididos em grânulos primários ou
azurófilos, grânulos específicos ou secundários e grânulos terciários (VAN DYKE &
VAIKUNTAM, 1994). A liberação do conteúdo dos grânulos para o meio extracelular ocorre
durante o movimento celular e em resposta a algum estímulo específico. Nos grânulos primários
são encontradas proteases neutras (elastase, catepsina G/B/D), hidrolases ácidas (fosfatase ácida,
glucoronidase), lisozimas, mieloperoxidase e defensinas. Nos grânulos secundários encontramos
a lactoferrina, colagenase e lisozima. Os grânulos terciários contêm fosfatase alcalina e gelatinase
(BENTWOOD & HENSON, 1980).
Os neutrófilos podem ser encontrados em três estágios: quiescentes, pré-ativados e
ativados. Os neutrófilos pré-ativados são aqueles que estão aguardando um estímulo para
desencadear o sistema NADPH oxidase, que somente é utilizado por neutrófilos ativados. Os
neutrófilos utilizam o NADPH oxidase como um mecanismo gerador de produtos e metabólitos
oxigenados reativos. A elastase é uma enzima independente dos metabólitos oxigenados no que
diz respeito à sua ativação (WEISS, 1989). Os neutrófilos ativados podem liberar substâncias
antimicrobianas através de 4 processos: fagocitose, degranulação, surtos respiratórios, apoptose
(McNAMARA et al. 1988). Foi demostrado em um estudo in vitro, que PMNs humanos e seus
produtos produzem descamação (proteases) e lise de células epiteliais do tecido gengival (agentes
oxidantes). In vivo ao autores sugerem que NADPH e proteases funcionam concomitantemente,
ativando proteases inativas, inativando os inibidores de proteases, permitindo a ação danosa das
proteases sobre os tecidos gengivais (ALTMAN et al. 1992).
2.2 - HIPERATIVIDADE NEUTROFÍLICA
O termo hiperatividade se refere a uma maior atividade neutrofílica em um sítio
inflamado, enquanto hiperreatividade se refere a uma maior reatividade de neutrófilos periféricos
após ativação in vitro. A hiperatividade dos neutrófilos, com liberação aumentada de radicais de
oxigênio e enzimas proteolíticas parece contribuir para a destruição tecidual na periodontite. A
hiperatividade neutrofílica durante a periodontite pode ser constitucional(intrínseca) ou induzida
pela doença inflamatória. Está relacionada com um aumento na quantidade de liberação da
enzima por neutrófilo e não pelo aumento no número de neutrófilos nos sítios com periodontite.
Estudos de neutrófilos periféricos em pacientes com periodontite juvenil, usando a
produção de radicais livres de oxigênio como marcadores de atividade neutrofílica, mostraram
uma hiperreatividade após estímulo com receptor Fc (ÅSMAN 1988, SHAPIRA et al. 1991). O
mesmo fenômeno foi descrito em adultos com periodontite (GUSTAFSSON & ÅSMAN 1996,
FREDRIKSSON et al. 1998). Também foram demostrados neutrófilos periféricos hiperreativos
em pacientes com periodontite, medidos através da liberação de elastase (ÅSMAN 1988,
FIGUEREDO et al. 1999).
2.3- ELASTASE
A elastase é uma enzima que tem habilidade de solubilizar fibras elásticas. Descrita
inicialmente por OPIE ( ), a elastase tem sido considerada uma potente protease neutra capaz de
causar uma grande destruição tecidual em sítios inflamados (PAAKO et al. 1996). A elastase é
uma protease serina (33 kDa), formada por uma cadeia simples de polipeptídeos com um pH
fortemente básico (10 a 11). Tem 22,8% de carboidratos, dos quais 21,2% são hexose, sendo
portanto considerada uma glicoproteína. É uma enzima estável à temperatura, retendo 94% de
suas atividades após 30 minutos sob temperatura de 56 C (STARKEY et al. 1977). É sintetizada
primeiramente por promielócitos e estocada nos grânulos azurófilos dos neutrófilos maduros na
forma de pró-enzima (WEISS 1989) ou na forma ativa na quantidade de 3 picogramas por célula.
Portanto, a elastase está presente tanto na forma ativa quanto na forma de pró-enzima dentro dos
grânulos azurófilos (GARDI et al. 1991) porém o mecanismo que controla a transição de uma
forma para outra não é totalmente entendido.
A pré-ativação é um processo que aumenta a habilidade da célula em responder a um
segundo estímulo. Neutrófilos pré-ativados com formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP)
liberam quase duas vezes mais elastase do que a ativação causada somente pelo fMLP
(TAMURA et al. 1998). Um aumento na resposta de neutrófilos pré-ativados podem refletir um
aumento na susceptibilidade de neutrófilos se pré-ativarem ou um aumento na quantidade de
substâncias com um efeito pré-ativador. Essas substâncias podem ser originárias do hospedeiro,
como citocinas pró-inflamatórias, produtos de degradação ou de origem bacteriana, como o
fMLP e lipopolissacarídeo (LPS). Apesar dos neutrófilos possuírem uma grande quantidade de
elastase, eles não possuem RNAm trancriptase, o que demonstra que neutrófilos maduros não
podem produzir esta enzima.
O turnover fisiológico do tecido conjuntivo é função da elastase secretada por histi;ocitos,
das células da musculatura lisa e dos fibroblastos. Porém quando ocorre hidrólise de
macromoléculas da matriz pela elastase proveniente dos neutrófilos, normalmente é reflexo de
um processo patológico (JANOFF 1983). Em condições patológicas, a elastase destrói uma
grande variedade de proteínas e glicoproteínas, como colágeno (JANOFF 1985), elastina
(JANOFF 1983), laminina (DECLAUX et al. 1996), e também de proteínas plasmáticas
(imunoglobulinas, fatores de coagulação e proteínas do complemento) (JANOFF 1985).
A elastase pode degradar inibidores teciduais das metaloproteinases (WEISS 1989) e,
algumas vezes, pode estar envolvida na ativação de metaloproteinases latentes (FERRY et al.
1997). A elastase é capaz de ativar a pró-gelatinase B, que é um fator de grande importância para
a migração do neutrófilo através da membrana basal (DECLAUX et al. 1996), causando grandes
danos nesta membrana, pela degradação da laminina (ALTMAN et al. 1992).
A capacidade destrutiva da elastase liberada é normalmente compensada pelos inibidores
de proteases. Ela é inibida nos tecidos por -1 inibidor de protease ou -1 anti-tripsina (A1AT) e
-2 macroglobulina (A2MG) (WEISS 1989; GIANNOPOULOU et al. 1992). A1AT é uma
molécula de baixo peso molecular (53 kDa), enquanto A2MG é uma molécula de peso molecular
de 725 kDa (JANOFF 1985). A elastase e o inibidor A1AT encontram-se nos grânulos azurófilos
dos neutrófilos, sendo que a elastase tem tendência a se localizar na periferia da matriz dos
grânulos, enquanto A1AT não demonstra nenhuma preferência de localização (MAÇONS ET
AL, 1991). A1AT é produzido localmente por macrófagos e neutrófilos (PAAKO ET AL, 1996)
bem como por hepatócitos (JANOFF 1985). A2MG é produzido principalmente no fígado e
sintetizado localmente pelos macrófagos e fibroblastos (JANOFF, 1985). A meia-vida dos
complexos protease-inibidor é de 2 a 5 minutos e eles são eliminados pelo sistema retículo-
endotelial (TRAVIS, 1983).
A1AT inativa virtualmente todas as proteases serinas dos mamíferos. Porém, a taxa de
inibição demonstra que a atividade de elastase é inativada por A1AT numa taxa muito maior do
que outras proteases, indicando que a função primária do inibidor A1AT é a de controlar a
atividade de elastase do neutrófilo (TRAVIS 1983). Quando o A2MG se liga à elastase, esta
enzima continua com a possibilidade de hidrolizar substratos de baixo peso molecular, pois não
há interação direta entre o sítio catalítico e A2MG. No entanto, a enzima não pode hidrolizar
substratos de alto peso molecular devido à sua conformação esteroidal. Portanto, denomina-se de
elastase funcional a elastase livre e a elastase inibida por A2MG (TRAVIS 1988).
A presença de A2MG no fluido gengival foi relatada por diversos pesquisadores
(GIANNOPOULOU et al. 1992), e a sua grande concentração no fluido gengival foi descrita
como o resultado de sua síntese no local e não apenas como resultado de um aumento da
permeabilidade capilar. Os inibidores tornam-se mais abundantes durante uma reação
inflamatória (GIANNOPOULOU et al. 1992) e podem ser sintetizados localmente por células
gengivais quando a inflamação aumenta (GIANNOPOULOU et al. 1990).
Apesar da elastase ter um efeito benéfico no “turnover” dos tecidos, em conjunto com
uma infecção, a sua excessiva liberação, principalmente em situações que comprometam a função
reguladora dos inibidores, pode provocar uma grande destruição tecidual levando assim a um
amplo espectro de doença, inclusive à doença periodontal. O uso local de inibidores de elastase
de diversas origens pode ser uma esperança no aumento do nível das antiproteinases para que a
homeostasia possa ser mantida, e a destruição tecidual paralisada (TRAVIS 1983).
2.4- ELASTASE E DOENÇA PERIODONTAL
A elastase ativa pode ser detectada ocasionalmente no tecido gengival bioquimicamente
(ELEY & COX 1990) ou histoquimicamente (KENNET 1995), e é provavelmente detectada
apenas em sua forma ativa, quando há um desequilíbrio no inibidor da enzima. Isso é visto
normalmente adjacente ao epitélio juncional onde os PMNs estão migrando para o sulco ou em
tecido de granulação na região de avanço da lesão (KENNET 1995).
Os níveis de elastase no FCG se correlacionam significantemente com aumento de
inflamação gengival, profundidade de bolsa, nível de inserção à sondagem e perda óssea (ELEY
& COX 1992a, 1992b) e seu nível também reduz significantemente após tratamento periodontal
(COX & ELEY 1992). Níveis muito baixos ou nulos estão presentes em sítios saudáveis, níveis
baixos a moderados em sítios com gengivite e níveis muito altos em sítios com periodontite
(ELEY & COX 1993).
ZAFIROPOULOUS et al. (1991), num estudo transverso, avaliaram a inter-relação entre a
elastase encontrada no fluido gengival, coletado com micropipetas com os parâmetros clínicos e a
presença de bactérias periodontopatogênicas. O nível de elastase no fluido gengival foi
determinado através do método de ELISA disponível, que marcava a elastase inibida por A1AT.
Foram analisados 388 sítios periodontais em 8 pacientes portadores de periodontite do adulto. Os
parâmetros clínicos foram índice de placa (IP), índice gengival (IG), profundidade de bolsa à
sondagem (PBS) e perda óssea alveolar. A presença de Actinobacillus actinomicetemcomitans,
Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia foi testada na placa subgengival através de
microscopia de imunofluorescência direta. Foi encontrada uma forte correlação entre os níveis de
elastase inibida com estes periodontopatógenos. Os autores sugerem que a elastase inibida por
A1AT poderia ser útil na avaliação dos sítios periodontais.
MEYLE et al. (1992) correlacionaram o nível de elastase com medidas de higiene oral. Os
autores analisaram 11 pacientes com gengivite após um rígido controle das medidas de higiene
oral executado durante 5 semanas. Após este período amostras do fluido gengival foram
coletadas com pontas de papel. A concentração enzimática foi estabelecida e o nível de elastase
era avaliado através da técnica de ELISA. Avaliaram a elastase total e a elastase inibida por
A1AT, como forma de calcular a elastase livre. Concluíram que a atividade da elastase funcional
continua presente nas amostras mesmo após a instituição das medidas de higiene oral, quando
houve uma significativa melhora dos parâmetros clínicos. Segundo os autores, este fato poderia
estar relacionado a uma diminuição do inibidor A1AT, mesmo em sítios saudáveis.
DARANY et al. (1992) compararam a capacidade de diferenciar sítios saudáveis, sítios
com gengivite, sítios com periodontite moderada e sítios com periodontite severa utilizando o
fluxo do fluido gengival e a atividade de elastase. Os critérios utilizados para o diagnóstico foram
IG, PBS e perda óssea visualizada através de radiografia bite-wing. 56 pacientes foram
selecionados e o fluido gengival foi coletado com pontas de papel. Concluíram que a taxa de
fluido gengival e a atividade de elastase podem ser utilizadas para determinar o grau de
inflamação, havendo uma forte correlação entre o fluxo de fluido gengival e a atividade de
elastase. Esse estudo verificou que a atividade total de elastase está elevada em sítios com
periodontite, comparada com sítios saudáveis ou com gengivite. O fluxo do fluido gengival
indicou ser mais sensitivo para detectar os estágios iniciais da inflamação.
ELEY & COX (1992b) observaram o efeito do tratamento periodontal nos níveis de
elastase no fluido gengival coletado com pontas de papel. Foram examinados 247 sítios de 10
pacientes com periodontite do adulto antes do tratamento, três semanas após raspagem e
alisamento radicular e também 3 meses e 5 meses após a cirurgia. O nível de atividade de elastase
diminuiu significantemente após a terapia periodontal.
GIANNOPOULOU et al. (1992) demostraram o aumento dos níveis de elastase no fluido
gengival em processos inflamatórios. Os autores observaram que tanto níveis de elastase
antigênica (elastase inibida por A1AT e elastase livre) quanto a elastase funcional (elastase
inibida por A2MG e elastase livre), como os níveis de antiproteinases (A1AT e A2MG)
aumentaram com o desenvolvimento da gengivite, porém não encontraram elastase livre nas
amostras de fluido gengival coletado.
ELEY & COX (1992a) avaliaram 528 sítios, em 20 pacientes não tratados, com idade
variando de 30 a 65 anos, portadores de periodontite crônica, e correlacionaram diferentes
proteases com os seguintes parâmetros clínicos: IP, IG, PBS e NI. A coleta de fluido gengival era
realizada com tiras de papel. Analisaram a atividade total de elastase e a concentração de elastase
no fluido gengival. Concluíram que a correlação entre os parâmetros clínicos e a atividade total
de elastase é muito mais forte do que a correlação entre os parâmetros clínicos e a concentração
de elastase. Sugerem como causa desse fato a diluição das enzimas pelo aumento do exsudato,
proporcionalmente aumentado de acordo com o grau de inflamação do sítio coletado. Encontram
as mais fortes correlações entre atividade enzimática e os parâmetros clínicos na ordem a seguir:
PBS, NI, IG, Índice de sangramento e IP. Encontram uma fraca correlação entre o paciente como
uma unidade influenciando a atividade enzimática e uma grande correlação entre o sítio
influenciando a atividade enzimática.
GUSTAFSSON ET AL (1992)
GUSTAFSSON ET AL (1994)
MURRAY ET AL (1995)
SMITH ET AL (1995)
KENNET ET AL. (1997)
MEYER ET AL (1997)
FIGUEREDO ET AL (1999)
PALCANIS et al. (1992) realizaram o primeiro estudo longitudinal de 6 meses usando um
kit teste para medida de elastase. A amostra consistiu de 30 pacientes com periodontite crônica
não-tratada, com idade variando entre 21 e 73 anos. As medidas clínicas(IG,IP,PBS,NI) foram
realizadas a cada 2 meses, juntamente com a análise do fluido gengival, e os exames
radiográficos foram realizados no início e no fim dos 6 meses. Esse estudo usou limites pequenos
de perda de inserção medidos com Florida Probe e a perda óssea foi detectada por subtração
radiológica para determinar quando ocorreu perda de inserção. Foram demonstradas diferenças
significantes na atividade total de elastase no baseline em sítios que progrediram e não
progrediram na avaliação após 2-6 meses. Ao considerarem a presença de perda óssea e perda de
inserção clínica maior do que 1,0 mm no período de 6 meses do estudo, acompanhada por IG
com escore 2, os testes de elastase apresentaram uma sensibilidade de 82% e especificidade de
66%.
ARMITAGE et al. (6) avaliaram o efeito da elastase no fluido gengival como predictor da
progressão da doença periodontal num período de seis meses em 31 pacientes com periodontite e
32 controles saudáveis. Os pacientes receberam apenas raspagem supragengival e instrução de
higiene oral no início do estudo. A progressão da doença era determinada através da perda óssea
analisada por meio de radiografia de subtração e sondagem com sonda automatizada (Alabama
Probe). A análise de elastase foi coletada com tiras de papel e avaliadas através de fluorescência .
O autor encontrou que sítios com níveis mais elevados de elastase tem maior risco de perda óssea
progressiva, quando avaliados com subtração radiográfica.
JIN et al. (1995) mediram a elastase no fluido gengival de pacientes considerados como
respondentes ou não-respondentes ao tratamento periodontal, acompanhados por um período de 5
anos. Encontrou que os não respondentes tinham uma maior concentração de elastase que os
respondentes, nos sítios com bolsas profundas. Nos pacientes não respondentes havia uma
significante diferença entre os sítios com gengivite e os sítios com periodontite. Os níveis de
elastase em sítios saudáveis de respondentes e não-respondentes foi similar, enquanto os sítios
saudáveis após tratamento nos não-respondentes tinham quatro vezes mais elastase que os sítios
equivalentes nos respondentes. Isso indica que nesses sítios há um estímulo para reação
inflamatória que não pode ser detectado com parâmetros clínicos. Nos respondentes, níveis
similares de elastase foram encontrados em sítios com gengivite e periodontite, independente da
profundidade de bolsa, sugerindo que a atividade de elastase está mais relacionada com a
inflamação do que com o grau de destruição tecidual.
ELEY & COX (1996) realizaram um estudo longitudinal de 2 anos. 75 pacientes com
periodontite crônica receberam tratamento periodontal e manutenção. Monitoramento clínico
(Florida Probe), bioquímico e radiográfico (subtração radiográfica) foi realizado. Todos os
parâmetros clínicos e níveis enzimáticos diminuíram significantemente após terapia periodontal
básica. Durante os 2 anos, houveram 119 sítios em 48 pacientes com perda de inserção
confirmada, com uma taxa anual de 4,96% dos sítios. 89 desses sítios em 36 pacientes mostraram
perda de inserção rápida, episódica (RAL) e 30 sítios em 21 pacientes demonstraram ganho de
inserção gradual progressivo (GAL) que ocorreu em um longo período de tempo. Níveis acima
dos valores críticos escolhidos para atividade total de elastase e concentração enzímática estavam
presentes em todos os sítios RAL tanto no momento da reavaliação e 3 meses previamente(tempo
predicitivo). Eles eram todos estatisticamente significantemente maiores que os valores dos sítios
controles nos mesmos pacientes. Esses níveis também demonstraram ser predictivos de perda de
inserção através de teste diagnóstico no tempo predictivo. Ainda, os níveis médios em 2 anos e os
registros mais altos em sítios GAL eram ambos maiores que os valores críticos respectivos e
eram significantemente maiores que os valores dos sítios controles do mesmo paciente.
Finalmente, todas as comparações dos valores médios em pacientes com ou sem perda de
inserção foram estatisticamente significantes.
BADER & BOYD (1999) realizaram um estudo retrospectivo para avaliar se um teste
para atividade de protease no FCG poderia fornecer indicação precoce de atividade de doença em
sítios específicos. 38 pacientes com periodontite crônica, tratados e em manutenção a cada 3-6
meses foram avaliados clinicamente e bioquimicamente por um período médio de 26 meses. Os
resultados indicam que o teste aparentemente diferenciou sítios com inflamação crônica sem
perda de inserção e sítios com perda de inserção progressiva.
2.5- LACTOFERRINA
A lactoferrina é uma glicoproteína, também denominada de lactotransferrina, cujo peso
molecular é de 70 kDa (POLLANEN et al. 1988). Possui diferentes atividades biológicas, entre
elas: regula a produção de citocinas (CROUCH et al. 1992), diminui a produção de anticorpos
(KULLICS & KILJSTRA 1987), aumenta a atividade das células assassinas (NK), estimula o
crescimento de linfócitos (SHAU et al. 1992), modula o sistema de complemento (KULLICS &
KILJSTRA 1987), exacerba a motilidade dos neutrófilos e a produção de metabólitos de oxigênio
(GARR et al. 1991). Facilita também a capacidade adesiva dos neutrófilos às células endoteliais,
e também a agregação dos neutrófilos. Esses efeitos parecem ser independentes de sua saturação
pela molécula de ferro (GARR et al. 1991).
A lactoferrina contém dois sítios para ligação com a molécula de ferro. Ela pode existir
livre do ferro (apo-lactoferrina), ou saturada por este elemento (holo-lactoferrina). Entretanto, a
precisa relação entre estas duas formas de lactoferrina precisa ser determinada. Dentro dos
grânulos específicos dos neutrófilos, a lactoferrina encontra-se saturada pela molécula de ferro
(ANDERSON et al. 1989). Foram reportados efeitos bactericidas e bacteriostáticos contra
bactérias, fungos e protozoários da lactoferrina (DERIY 2000). Portanto, a lactoferrina pode agir
sinergicamente com outras substâncias antimicrobianas dos neutrófilos. A atividade
antimicrobiana da lactoferrina pode ser influenciada por fatores físico-químicos como
temperatura, pH e força iônica (DERIY 2000).
Não é conhecida nenhuma doença associada somente à deficiência de lactoferrina, porém
existem algumas patologias que promovem a diminuição da lactoferrina e de outros fatores da
defesa do hospedeiro, simultaneamente (BRETON-GORIUS et al. 1980).
A concentração de lactoferrina no fluido gengival de pacientes saudáveis é de 500 g/ml.
No fluido gengival de pacientes com periodontite, a quantidade de lactoferrina pode atingir 1500
g/ml, devido ao aumento do número de neutrófilos no sítio inflamado (ADONOGIANAKI,
1993). Apesar deste fato, o papel da lactoferrina na doença periodontal é desconhecido. No
ambiente da bolsa periodontal, acredita-se que a lactoferrina não esteja ligada ao ferro, devido ao
baixo potencial de oxi-redução estabelecido na bolsa periodontal (KENNEY & ASH 1996). A
ação da lactoferrina sobre os microorganismos também não está esclarecida.
Em um estudo in vitro, de 1998, POLLANEN et al. demostraram que tanto a lactoferrina
saturada pelo ferro como a não saturada impedem a adesão celular, o crescimento e a expansão de
colônias celulares de uma forma dose-dependente. Estes dados sugerem que a lactoferrina não
afeta a proliferação de células epiteliais, mas promove um atraso no reparo das células epiteliais
aderidas diretamente ao dente durante o processo inflamatório.
A lactoferrina é estocada nos grânulos secundários dos neutrófilos e liberada durante a
migração celular num estágio anterior à liberação dos grânulos primários (CAVARA et al. 1997).
A lactoferrina atua como um sistema de feedback negativo, ou seja, quando há proliferação da
população de neutrófilos secretando lactoferrina, há uma inibição na maturação ou na
proliferação dos neutrófilos na medula óssea (STARKEY et al. 1977). Ela é utilizada como um
marcador do número de neutrófilos nos sítios onde o fluido gengival é coletado para análise de
sua composição (ADONOGIANAKI 1993).
2.6- FLUIDO GENGIVAL
Análises de fluido crevicular gengival tem sido relatadas na literatura por mais de 100
anos (BLACK 1882) (GUSTAFSSON 1996). O exsudato inflamatório da microcirculação
gengival atravessa os tecidos periodontais, carregando moléculas de interesse potencial para a
reação inflamatória local, como proteínas plasmáticas, produtos de degradação e leucócitos
(CIMASONI 1983; PAGE 1992). O estudo dessas moléculas pode fornecer informações úteis
sobre a resposta do hospedeiro.
O fluido gengival é composto por: a) Elementos celulares: células bacterianas, epiteliais e
leucócitos; b) Eletrólitos: cálcio, sódio, magnésio, fosfato, potássio; c) Produtos da placa
bacteriana: enzimas bacterianas, substâncias citotóxicas, LPS e metabólitos; d) Componentes do
tecido do hospedeiro: complemento, fibrina, fibronectina, colágeno, osteocalcina, osteonectina,
proteoglicanas; e) Produtos das células inflamatórias: enzimas lisossomiais, imunoglobulinas,
citocinas, proteínas da fase aguda da inflamação, prostaglandinas (CIMASONI 1983).
Em termos de aplicação de testes diagnósticos, amostras de FCG possuem vantagens
análogas à retirada de sangue pelo médico: (1) fácil acesso, (2) coleta relativamente atraumática,
(3) rápido equilíbrio com o conjunto intracrevicular, (4) variação de tempo e sítio da amostra, (5)
capacidade de repetir coleta (McCULLOCH 1994).
A análise dos componentes do fluido gengival é influenciada pela técnica de coleta e
execução laboratorial. Dentre as variáveis na coleta de fluido estão: 1) escolha do modo de coleta,
2) tempo de coleta, 3) taxa de fluido. Além disso: 4) uso adequado dos dispositivos de coleta, 5)
perda potencial da amostra (com tempo), 6) contaminação por componentes séricos. Não há
consenso sobre protocolos com menor bias, maior reproducibilidade e validade mais forte.
Existem três métodos disponíveis para coletar amostras de FCG: 1) tubos capilares, 2)
lavagens gengivais, 3) tiras de papel ou pontas de papel (GUSTAFSSON 1996).
Tubos capilares podem ser usados para medir o volume do fluido, mas o tempo
prolongado de coleta (até 15 minutos) resulta em trauma considerável aos vasos sangüíneos
gengivais, alterando o fluxo de FCG e as concentrações de vários componentes (EGELBERG
1966).
Lavagens gengivais não causam trauma significante aos vasos sangüíneos. Várias técnicas
tem sido descritas, mas a mais utilizada foi descrita por Skapski & Lehner (1976) e modificada
por SALONEN & PAUNIO (1991). No entanto, lavagens intracreviculares não permitem
medidas de volume, que são necessárias para ressaltar a influência do volume aumentado em
bolsas profundas (GUSTAFSSON 1992). Esse problema pode ser evitado pelo uso de uma
substância de referência.
Nas amostras de FCG coletadas com tiras, a lactoferrina tem servido como um marcador
para o número de neutrófilos (GUSTAFSSON et al. 1994), e a transferrina e o conteúdo total de
proteína tem servido como marcadores de clivagem de plasma (ÅSMAN et al. 1988; DARANY
et al. 1992). A técnica de tiras é a mais comumente usada para coletar amostras de FCG. Ela
permite determinações de volume através da pesagem das tiras ou através da determinação de sua
capacidade elétrica com o Periotron®.
Durante os últimos anos, o interesse na análise da resposta do hospedeiro através do
fluido gengival vem despertando grande interesse com objetivos de diagnóstico. Esses estudos
centram seus objetivos na identificação de mecanismos específicos do hospedeiro que estão
envolvidos no desenvolvimento das lesões periodontais, e a relação desses indicadores com a
progressão da doença periodontal (LAMSTER 1989).
Estudos dos indicadores da resposta inflamatória aguda no fluido gengival são numerosos
e incluem produtos do ácido araquidônico, enzimas e outros constituintes intracelulares liberados
por neutrófilos como, por exemplo, elastase, colagenase, aspartatoaminotrasferase, bem como a
atividade de inibidores de proteases (LAMSTER 1992;GUSTAFSSON 1996; PAGE 1992).
Correlações têm sido encontradas entre a elastase do neutrófilo presente no fluido gengival e o
estado periodontal (GUSTAFSSON et al. 1992; PALCANIS et al. 1992). Em contraste, há cada
vez menos evidências na associação entre a atividade de doença periodontal e a presença de
enzimas proteolíticas produzidas por certos periodontopatógenos. Os estudos têm priorizado a
qualidade do fluido, mais do que a sua quantidade, tentando relacionar possíveis marcadores com
progressão da doença periodontal (PALCANIS et al. 1992) e com a susceptibilidade do
hospedeiro.
3- PROPOSIÇÃO DO ESTUDO
O objetivo deste estudo foi verificar se pacientes com periodontite crônica que apresentam
hiperatividade neutrofílica apresentam uma pior resposta ao tratamento periodontal não cirúrgico.
4- MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 - SELEÇÃO DE PACIENTES
Foram selecionados 17 pacientes portadores de periodontite crônica generalizada,
classificados de acordo com a Academia Americana de Periodontia de 1999 (AAP). X eram do
sexo feminino e x do sexo masculino, sendo x fumantes. A média de idade era x ( X).
Os pacientes selecionados foram encaminhados pela clínica de Diagnóstico Bucal da
Faculdade de Odontologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) para tratamento
periodontal. Não apresentavam patologia sistêmica relatada e não haviam utilizado antibióticos
ou anti-inflamatórios nos seis meses anteriores ao início do estudo, e possuíam, no mínimo, 20
dentes. Nenhum dos participantes do estudo havia recebido tratamento periodontal prévio. O
objetivo do estudo foi explicado e um termo de consentimento foi assinado pelos pacientes
selecionados.
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da UERJ.
4.2 - PARÂMETROS CLÍNICOS UTILIZADOS
1- Índice de placa (IP), Silness & Löe (1964).
2- Índice gengival (IG), Löe (1967).
3- Medida de profundidade de bolsa (PB) à sondagem: caracterizada pela distância da margem
gengival até o fundo da bolsa ou sulco.
4- Medida do nível de inserção (NI) à sondagem: caracterizada pela distância da junção amelo-
cementária até o fundo da bolsa ou sulco.
Os exames clínico e periodontal foram realizados por um único examinador. As medidas de PB e
NI foram determinadas com uma sonda periodontal manual do tipo Williams (HU-Friedy). As
medidas foram realizadas em 6 faces de todos os dentes dos pacientes: mesio-vestibular, médio-
vestibular, disto-vestibular, mesio-lingual, médio-lingual, disto lingual. Para o monitoramento
longitudinal dos pacientes foram confeccionadas moldeiras individuais de acrílico que receberam
marcações para padronização dos locais de sondagem para futuros re-exames.
4.3 – SÍTIOS SELECIONADOS
4.3.1 – SÍTIOS CONTROLE (GP)
Foram selecionados 5 sítios por paciente, com NI e PB menor ou igual a 3 mm e IG entre 1 e 2,
para que possuíssem fluido gengival suficiente. Na Tabela 1 são apresentados os parâmetros
clínicos dos sítios selecionados para a coleta do fluido gengival nos sítios GP por paciente.
4.3.2 – SÍTIOS EXPERIMENTAIS (PP)
Foram selecionados 5 sítios por paciente, com NI e PB maior ou igual a 5 mm e IG entre 1 e 2.
Foram selecionados os sítios com maior perda de inserção e maior profundidade de bolsa em
cada paciente. Na tabela 2 são apresentados os parâmetros clínicos dos sítios selecionados para a
coleta do fluido gengival nos sítios PP por paciente.
4.4 – DADOS RELATIVOS À COLETA
Os sítios selecionados eram isolados com rolete de algodão, a placa supragengival era removida
quando necessário, e a região era secada com jato de ar. Aguardava-se 30 segundos para que
houvesse afluxo de fluido gengival. Amostras nos dois grupos de sítios avaliados foram coletadas
por um aparelho denominado de Fill-Master tipo 251 (Delta Scientific medical, Dinamarca) para
liberação controlada de solução salina tamponada, conectada à unidade suctora. O cabo coletor
era gentilmente aproximado da margem gengival. O sulco ou a bolsa era, então, lavados pelo
sistema de liberação lenta, e uma alíquota de 0,5 ml de solução salina tamponada (pH 7.4) era,
simultanemente, drenada através do cabo coletor para dentro do tubo de Eppendorf. Após a
coleta, o tubo era preenchido até 1,0 ml com a solução salina tamponada. Em um intervalo
máximo de 30 minutos, o tubo de Eppendorf era centrifugado (modelo centrífuga) durante 5
minutos a x rpm. O sobrenatante era transferido para um novo tubo de Eppendorf e transportadas
para um freezer com temperatura de -70 C, sendo estocado até o momento da análise. Após o
término das coletas, o material foi embarcado sob condições adequadas para o Instituto
Karolinska em Estocolmo, Suécia, onde foram feitas as análises bioquímicas.
4.5 – TRATAMENTO PERIODONTAL
Todos os pacientes foram submetidos a tratamento periodontal não-cirúrgico que consistiu de
instrução de higiene oral e controle de placa, raspagem supragengival e subgengival (curetas
gracey 7-8, 11-12 e 13-14), alisamento radicular (limas de Hischfield) e polimento coronário em
até quatro consultas de 40 minutos cada. As raspagens foram realizadas com instrumentos
manuais e por um único operador.
4.6 – REAVALIAÇÕES CLÍNICAS
Consultas para reavaliações foram realizadas 30 e 90 dias após o término do tratamento.
Com o auxílio de moldeiras individuais de acrílico, novas medidas de PB e NI, foram realizadas.
Os escores de IP e IG também foram registrados. Foram feitos uma nova raspagem
supragengival, polimento coronário e reforço nas medidas de higiene oral, quando necessário.
Após a última reavaliação, os pacientes foram divididos em quatro grupos: CRT-ni (Com
Resposta ao Tratamento,critério nível de inserção); SRT-ni (Sem Resposta ao Tratamento,critério
nível de inserção); CRT-pb (Com Resposta ao Tratamento, critério profundidade de bolsa); SRT-
pb (Sem Resposta ao Tratamento,critério profundidade de bolsa). Eram considerados
respondentes os pacientes que apresentassem diferença igual ou maior que 2mm, e não-
respondentes os que não apresentassem essa diferença. Essa avaliação era utilizada tanto para
profundidade de bolsa quanto para nível de inserção, dependendo na análise.
4.7 – ANÁLISES BIOQUÍMICAS
Neste trabalho, a presença de elastase no fluido gengival é utilizada como um indicador da
liberação dos grânulos azurófilos por neutrófilos ativados, enquanto a presença de lactoferrina é
utilizada como uma medida de liberação dos grânulos específicos durante a migração dos
neutrófilos, traduzindo, assim, o número de neutrófilos nos diferentes sítios (ADONOGIANAKI,
1993).
4.7.1 – ANÁLISE QUANTITATIVA DA ATIVIDADE DE ELASTASE
A atividade de elastase foi medida com um substrato de baixo peso molecular (445 Da) L-
piroglutamil-L-propil-L-valina-p-nitroanilina (S-2484) (Chromogenix AB, Molndall, Suécia) que
é altamente específico para elastase do neutrófilo (tanaka,94). Esse substrato foi diluído numa
primeira etapa em dimetilsulfóxido a 8 mmol/l para armazenagem, e posteriormente, em uma
diluição de trabalho a 2 mmol/l em solução salina tamponada.
Em uma placa de análise (Nunc Maxisorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca), com 96 orifícios, foram
misturados 100 l das amostras de fluido gengival com 67 l da diluição do substrato S-2484. A
mistura foi incubada a 37 C, por 5 horas, e a absorção de luz foi lida em um espectrofotômetro
com amplitude de 405 nm (Millenia Kinetic Analyser, Diagnostic Product Corporation, Los
Angeles, CA, EUA).
4.7.2 – CONFECÇÃO DA CURVA PADRÃO DE ELASTASE
Para cada placa foi elaborada uma curva padrão para comparar as amostras. As diluições padrões
foram feitas com elastase obtida da degranulação de neutrófilos homogeneizados da circulação
periférica. Os neutrófilos foram purificados do sangue através de gradientes de câmara dupla em
Percoll (Kabi Pharmacia, Uppsala, Suécia) seguindo o método descrito por BERGSTRÖM &
ASMAN (12).
As células purificadas e lavadas foram contadas no contador de células (Coulter Eletronics, IC,
Hialeah, FL, EUA), centrifugadas a 3500g por 5 minutos, ressuspensas em água destilada e
depois congeladas a - 70 C.
Para produzir degranulação de elastase, as células purificadas foram repetidamente descongeladas
com ultra-som, suspensas em meio líquido e, novamente, congeladas. Esta seqüência de
procedimentos foi realizada 3 vezes. Finalmente, foi executada uma nova centrifugação a 1500g
por 10 minutos e o sobrenatante foi congelado a - 70 C. A elastase de 2200 neutrófilos
homogeneizados liberaram 1nmol de pNA/5h (p-nitroanilida) do substrato S-2484, sendo assim a
atividade de elastase medida neste imunoensaio foi expressa em equivalentes celulares x 103 /ml.
4.7.3. ANÁLISE QUANTITATIVA DA ELASTASE LIVRE
Para distingüir entre a atividade derivada da elastase livre da elastase unida à A2MG, foi
adicionada a quantidade de 10 l do inibidor A1AT a 0,1 % (Sigma Chemical Co., St Louis, MO,
EUA) a 90 l das amostras e agitado por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a inibição,
as amostras foram testadas contra a atividade de elastase, da mesma forma descrita acima. A
elastase inibida por A1AT foi considerada como elastase livre; a atividade remanescente, como a
elastase inibida por A2MG.
4.7.4 – ANÁLISE QUANTITATIVA DE LACTOFERRINA
A liberação de lactoferrina foi medida com um teste sanduíche ELISA. Os orifícios da placa de
análise foram cobertos com anticorpos monoclonais de rato contra lactoferrina humana (Hy-test,
Turku, Finlândia) e incubados durante a noite, a uma temperatura de + 4 C. Após a incubação, os
orifícios foram lavados 5 vezes com solução salina tamponada 7,4 com 0,05% Tween 20 %
(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, EUA). 100 l de amostras de fluido e curvas padrões foram
adicionadas aos orifícios e incubadas por uma hora e lavados novamente. Um segundo anticorpo
policlonal de coelho anti-lactoferrina (Dako-immunoglobulins a/s, Glostrup, Dinamarca) foi
então adicionado aos orifícios da placa de análise. As placas foram incubadas por uma hora a
37 C e lavadas 5 vezes, quando então, foi adicionado o terceiro anticorpo, um anticorpo
policlonal de cabra conjugado à fosfatase alcalina(ALP) (Dako-immunoglobulins a/s, Glostrup,
Dinamarca) contra IgG de coelho, e incubado por uma hora. Após uma lavagem final, foi
adicionado o substrato p-nitro-fenol-fosfatase e a absorção a 405 nm foi analisada num
espectrofotômetro após 10 minutos. Cada placa incluía uma curva padrão obtida por uma diluição
seriada de um padrão comercial de lactoferrina.
4.7.5 – TAXA DE ATIVIDADE DE ELASTASE POR NEUTRÓFILO
Para calcular-se a quantidade de elastase liberada por célula, foi calculada uma taxa através da
divisão do valor de atividade total de elastase pelo total de lactoferrina. A presença de elastase no
fluido gengival, neste trabalho, é tida como um indicador da liberação de grânulos azurófilos das
células ativadas, enquanto a lactoferrina é utilizada como um marcador do número de neutrófilos
nos diferentes sítios.
4.8 – ANÁLISE ESTATÍSTICA
Testes não paramétricos foram utilizados. O teste de Wilcoxon foi usado para comparar valores
obtidos nos diferentes exames (inicial, 30 e 90 dias). O nível de significância foi determinado em
% (p< ). Os valores obtidos nos resultados estatísticos das amostras analisadas (média e desvio
padrão) foram aproximados para duas casas decimais após a vírgula. O teste de Mann-Whitney
foi usado para comparar valores bioquímicos entre o grupo respondente e não-respondente.
5- RESULTADOS
Na Tabela 1 são apresentados a idade, o sexo, a existência ou não do hábito de fumar e os
dados bioquímicos dos pacientes analisados (n=17), dos sítios teste (PP) e controle (GP).
Os dados clínicos (IP, IG, PBS e NI) iniciais e pós-tratamento estão dispostos nas tabelas
2 (sítios GP) e 3 (sítios PP).
Na tabela 4, encontra-se uma comparação entre os parâmetros clínicos iniciais e após 30 e
90 dias, dos sítios teste, nos 17 pacientes. Houve uma diferença estatisticamente significante
entre a PBS inicial e após 30 (P< 0,001) e 90 dias (P<0,01). Houve uma diferença
estatisticamente significante entre o NI inicial e após 30 e 90 dias (P<0,001). Não foi encontrada
diferença entre o NI de 30 e 90 dias após o tratamento.
Com base no critério estabelecido para resposta ao tratamento, baseado no nível de
inserção, os pacientes foram divididos em respondentes (n=10) e não-respondentes (n=7) (Tabela
5). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os parâmetros
bioquímicos dos dois grupos (Tabela 6).
6- DISCUSSÃO
No presente estudo observamos que a atividade excessiva dos neutrófilos antes do
tratamento em pacientes com periodontite crônica generalizada não influenciou a resposta ao
tratamento periodontal não cirúrgico. Tal fato foi observado por não haver diferenças
significantes entre respondentes e não-respondentes quando os níveis de elastase e as taxas de
elastase/lactoferrina foram comparados. A hiperatividade neutrofílica durante a periodontite pode
ser constitucional (intrínseca) ou induzida pela ação de agentes pró-inflamatórios. Os resultados
encontrados sugerem que após a remoção do estímulo inflamatório, mesmo os pacientes com
hiperatividade neutrofílica inicial podem responder satisfatoriamente ao tratamento periodontal
não-cirúrgico, após 3 meses.
Os métodos atualmente disponíveis para identificar progressão de doença periodontal
envolvem monitoramento longitudinal de sítios para alterações no nível de inserção à sondagem e
alterações radiográficas no osso alveolar (ORINGER et al. 1998). O diagnóstico de progressão de
doença periodontal ocorre quando um valor limite preestabelecido de mudança clínica ou
radiográfica é detectado. Esse valor limite geralmente se baseia nas limitações tanto do
instrumento como do operador com relação à resolução e reproducibilidade (JEFFCOAT &
REDDY 1991). Vários investigadores usaram uma alteração de 2 a 3 mm para identificar um
sítio como tendo uma perda de inserção significante, entre dois exames(HALAZONETIS et al.
1988; GRBIC et al. 1991). No presente estudo, o limite estabelecido para definir uma boa
resposta ao tratamento foi de 2 mm, considerando a margem de erro da sondagem manual
(REFXXXX).
Estudos longitudinais em pacientes com periodontite crônica geralmente são realizados
com uso de sondas com pressão controlada ou eletrônicas. No presente estudo, devido à falta
destes recursos, foi usada uma sonda manual, operada por um único examinador. O uso de uma
sonda manual para a avaliação de profundidade de bolsa e nível de inserção juntamente com o
uso de placas acrílicas apresenta maior confiabilidade nas medidas (BADERSTEN et al. 1984;
CLARK et al. 1987) e não compromete os resultados deste estudo. PERRY et al. (1994)
compararam três tipos de sondas: convencional, manual com pressão controlada e eletrônica.
Apesar de ter sido encontrada alguma diferença estatística entre as sondas, os autores relataram
não haver diferença clínica significante.
A resposta ao tratamento não-cirúrgico encontrada pode ter sido influenciada por vários
fatores, como: habilidade do paciente em remover a placa supragengival, habilidade do operador
em promover uma limpeza subgengival apropriada, composição da microbiota subgengival,
eficácia da resposta do hospedeiro. Até o momento, não há estudos que avaliem a contribuição
relativa de cada fator individualmente para o resultado da terapia (LINDHE, 1999). Apesar de em
geral, os pacientes responderem bem à terapia periodontal, grandes variações nas respostas
clínicas podem ocorrer entre as pessoas tratadas. Uma resposta cicatricial ruim após raspagem
pode ser devido à composição da microbiota subgengival. Após instrumentação subgengival
ocorre uma alteração na microbiota. Há uma diminuição das bactérias subgengivais e dos
patógenos periodontais suspeitos Porphyromonas gingivalis, Prevotela intermedia e
Actinobacillus actinomicetemcomitans (Aa) (SLOTS 1979; MAGNUSSON 1984; SHILOAH &
PATTERS 1996). Aa é dificilmente erradicado por raspagem (RENVERT 1990). MOMBELLI et
al. (1994 a,b) relataram que a permanência do Aa após raspagem foi correlacionada com os
níveis da bactéria anteriores ao tratamento e com a PBS inicial. VAN STEENBERGEN et al.
(1993) demonstraram que, apesar da permanência do Aa, bons resultados clínicos podem ser
obtidos em pacientes com periodontite moderada.
O papel dos neutrófilos na destruição tecidual é cada vez mais claro, não só na doença
periodontal, mas também em várias outras doenças inflamatórias crônicas como enfisema
pulmonar, artrite reumatóide, síndrome da angústia respiratória aguda. Estudos sobre
medicamentos que inibem enzimas proteolíticas tem sido desenvolvidos, e uma série de
inibidores de elastase tem sido aplicados em estudos in vitro e em animais, como ONO-5046
(TOMIZAWA et al. 1999), tetraciclina 3 quimicamente modificada (CARNEY et al. 2001),
ranitidina (OKAJIMA et al. 2000), FR901277 (FUJIE et al. 1999a), FR134043 (FUJIE et al.
1999b), SIVELESTAT (HAGIO et al. 2001) entre outros. Os resultados obtidos têm sido
promissores na diminuição da injúria tecidual mediada pela elastase neutrofílica em casos de
enfisema pulmonar (FUJIE et al. 1999a), síndrome da angústia respiratória aguda (CARNEY et
al. 2001), injúrias à mucosa gástrica induzidas por stress (OKAJIMA ET AL., 2000).
Vários estudos têm considerado os níveis de elastase como predictores de perda futura de
inserção periodontal (PALCANIS 1992, ARMITAGE 1994, ELEY & COX 1992), porém
nenhum estudo até o momento avaliou os efeitos da hiperatividade neutrofílica no tratamento
periodontal. Estudos em pacientes tratados com raspagem subgengival e manutenção regular
relatam uma tendência a uma menor concentração de elastase no fluido gengival após o
tratamento (ELEY & COX 1992), o que demonstra que quando há remoção do estímulo, a
hiperatividade pode cessar. JIN et al. (1995) mediram a elastase no fluido gengival de pacientes
considerados como respondentes ou não-respondentes ao tratamento periodontal, acompanhados
por um período de 5 anos. Encontrou que os não respondentes tinham uma maior concentração de
elastase que os respondentes, nos sítios com bolsas profundas. Nos pacientes não respondentes
havia uma significante diferença entre os sítios com gengivite e os sítios com periodontite. Os
níveis de elastase em sítios saudáveis de respondentes e não-respondentes foi similar, enquanto
os sítios saudáveis após tratamento nos não-respondentes tinham quatro vezes mais elastase que
os sítios equivalentes nos respondentes. Isso indica que nesses sítios há algum estímulo para
reação inflamatória que não pode ser detectado com parâmetros clínicos. Nos respondentes,
níveis similares de elastase foram encontrados em sítios com gengivite e periodontite,
independente da profundidade de bolsa, sugerindo que a atividade de elastase está mais
relacionada com a inflamação do que com o grau de destruição tecidual.
Os pacientes fumantes e não-fumantes não foram avaliados separadamente.
Posteriormente essa comparação poderá realizada. PERSSON et al. (1999) não encontraram
diferenças nos níveis de elastase em pacientes fumantes e não-fumantes com gengivite. ALAVI
et al. (1995) encontraram o mesmo número de neutrófilos em pacientes com periodontite crônica,
fumantes e não-fumantes.
Mais estudos são necessários para determinar a importância da detecção de neutrófilos
hiperativos em pacientes com periodontite crônica e sua influência no tratamento e prognóstico.
Ainda, métodos terapêuticos visando uma diminuição da agressão tecidual mediada por
neutrófilos devem ser desenvolvidos, para minimizar os danos ao periodonto causados pela
doença periodontal e para que o tratamento de pacientes com periodontite produza resultados
mais satisfatórios e duradouros.
7- CONCLUSÃO
No presente estudo observamos que a atividade excessiva dos neutrófilos antes do
tratamento em pacientes com periodontite crônica generalizada não influenciou a resposta ao
tratamento periodontal não cirúrgico.
8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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