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I
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
AVALIAÇÃO DOS MÉTODOS DIAGNÓSTICOS E URBANIZAÇÃO DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR NA CIDADE DE MANAUS
EDNELZA DE ALMEIDA BENÍCIO
MANAUS 2012
II
EDNELZA DE ALMEIDA BENÍCIO
AVALIAÇÃO DOS MÉTODOS DIAGNÓSTICOS E URBANIZAÇÃO DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR NA CIDADE DE MANAUS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para Obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientadora: Profa. Dra. AnetteChrusciakTalhari Co-orientadores: Prof. Dr. Sinésio Talhari Prof. Dr. Nicolaus Albert Scheriefer
MANAUS
2012
Ficha Catalográfica
B467aBenício, Ednelza de Almeida. Avaliação dos métodos diagnósticos e urbanização da
leishmaniose tegumentar na cidade de Manaus/Ednelza de Almeida Benício. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2012.
xiv. 67f. : il.
Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2012.
Orientadora: Profa. Dra. AnetteChrusciakTalhari Co-orientador: Prof. Dr. Sinésio Talhari 1.Leishmaniose. 2. Métodos diagnósticos3. UrbanizaçãoI.
Título. CDU: 616.9
Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Sheyla Lobo Motalotada na Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA
IV
RESUMO
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), as leishmanioses constituem importante problema de saúde pública. Sãoocasionadas por diversas espécies de protozoários do gêneroLeishmania. Ocorrem em regiões tropicais e subtropicais do velho e novo mundo. O tratamento da leishmaniose tegumentar americana (LTA) ainda constitui desafio, pois a maioria dos medicamentos é injetável, e, além disso, é provável que as diferentes espécies de Leishmania tenham influência nas respostas terapêuticas. O presente trabalho tem por finalidade colaborar na investigação dos diferentes métodos diagnósticos da leishmaniose.Outro aspecto, também discutido é a urbanização da leishmaniose na cidade de Manaus.Avaliamosos métodos diagnósticos da leishmaniose em pacientes procedentes do município de Manaus. Foram comparados a histopatologia, a PCR e a cultura.A possibilidade de a transmissão da leishmaniose estar ocorrendo na cidade de Manaus também é investigada. Foram incluídos180pacientes portadores de leishmaniose cutânea (LC), com diagnóstico clínico e confirmação laboratorial através do exame direto (escarificação em lâmina). Fez-se, também, cultura e PCR. Posicionamento de coordenadas geográficas das residências dos pacientes, (GPS), plotagem de dados para satélite de alta definição, com o sitema de informação geográfica (GIS).A combinação dos diferentes métodos diagnósticos utilizados, PCR+histopatológico possibilitou o diagnóstico de 94% dos casos. A combinação PCR + histopatológico + cultura foi, também, positiva em 94%.A cultura + histopatológico possibilitou o diagnóstico de 50% dos casos. O PCR (mini-exon e HSP 70), isoladamente, foi positivo em 89% dos casos. Quanto à urbanização da leishmaniose, observou-se que 67% dos pacientes são procedentes da área urbana e 33% da zona rural.Isoladamente, o melhor método diagnóstico foi a reação em cadeia da polimerase (PCR-70 andmini-exon), com 89% de sensibilidade. A cultura e a histopatologia foram positivas para LTA em 52% e 51% dos casos, respectivamente. A melhor combinação foi a PCR (PCR 70 e mini-exon) e histopatologia, que possibilitou o diagnóstico de 94% dos pacientes.A combinação cultura + histopatologia + PCR foi, também, positiva em 94%. É importante ressaltar que todos os pacientes tinham exame direto positivo e de acordo com os resultados, o exame direto seria mais sensível para os casos iniciais ou teria havido erro diagnóstico no exame direto.Porém, todos os pacientes do estudo eram casos clínicos de leishmaniose, foram medicados para LTA e responderam adequadamente ao tratamento, indicando que o exame direto estava correto. Destacou-se também a urbanização do parasito causador da Leishmaniose na cidade de Manaus, onde se pode observar que o vetor consegue infectar a população na região periurbana da cidade. Palavras-chaves: Leishmaniose. Métodos Diagnósticos. Urbanização.
V
ABSTRACT
According to the World Health Organization (WHO), leishmaniasis is an important public health problem. Are caused by various species of protozoa of the genus Leishmania. Occur in tropical and subtropical regions of the old and new world. Treatment of American cutaneous leishmaniasis (ACL) is still challenging because most drugs are injectable, and furthermore, it is likely that different species of Leishmania have influence on therapeutic responses. This study aims to collaborate on research of different diagnostic methods of leishmaniasis. Another aspect to be discussed is the urbanization of leishmaniasis in the city of Manaus. We evaluated the diagnostic methods of leishmaniasis in patients from the city of Manaus. Histopathology, PCR and culture were compared. The possibility of transmission of leishmaniasis to be occurring in the city of Manaus is also investigated. 180 patients with cutaneous leishmaniasis (CL) were included, with a clinical diagnosis and laboratory confirmation through the direct examination (scarification on blade). It was also made culture and PCR. Positioning of geographical coordinates of the residences of patients (GPS), data plotting to high definition satellite, with sitema geographic information (GIS). The combination of different diagnostic methods used PCR allowed + histopathological diagnosis in 94% of cases. The PCR combination histopathological + + culture was also positive in 94%. The culture + histopathological diagnosis allowed 50% of cases. The PCR (mini-exon and HSP 70) alone was positive in 89% of cases. As the urbanization of leishmaniasis, it was observed that 67% of patients are coming from urban areas and 33% in rural areas. Alone, the best diagnostic method was the polymerase chain reaction (PCR-70 and mini-exon), with 89% sensitivity. The culture and histopathology were positive for LTA in 52% and 51% of cases, respectively. The best combination was the PCR (PCR and mini-exon 70) and histopathology, which allowed the diagnosis of 94% of patients. The combination histopathology + culture + PCR was also positive in 94%. Importantly, all patients had positive direct and according to the results of examination, direct examination would be more sensitive to the initial cases or misdiagnosis would have been in direct examination. However, all patients in the study were clinical cases of leishmaniasis were treated for LTA and adequately responded to treatment, indicating that the direct examination was correct. Also notable was the urbanization of the parasite that causes leishmaniasis in the city of Manaus, where one can observe that the vector can infect the population in the peri-urban area of the city. Keywords: cutaneous leishmaniasis. Diagnostic Methods.Urbanization.
VI
Aos meus pais, Ademar e Luzia, ao Marinho, e
aos meus irmãos, dedico este trabalho.
VII
AGRADECIMENTOS
A Deus, por nossa existência.
Aos meus pais, e meu esposo pelo apoio constante e irrestrito.
A Dra. AnetteTalhari minha orientadora pela oportunidade, sei que foi um
grande desafio,um exemplo de determinação no trabalho e dedicação a
Ciência.
A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, aFundação de
Amparo à Pesquisa do Estado Amazonas – FAPEAM pelofinanciamento,
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPQ).
Ao Dr.Nicolaus Albert Scheriefer pelo grande apoio e incentivo, por acreditar no
meu trabalho, por me orientar de maneira singular mesmo que de longe, e
pelos sábios conselhos sobre ciência e sobre a vida.
Aos pacientes que participaram deste estudo, pela confiança que depositaram
em nosso conhecimento.
A Dra. Cintia Mara pela colaboração através dos ensinamentos das técnicas de
biologia molecular.
Aos dirigentes, médicos, enfermeiros, farmacêuticos, biólogos, outros
profissionais da área de saúde e demais funcionários da FMTHVD, muito
obrigado por todo empenho para o êxito deste trabalho.
Ao Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, e seus respectivos
representantes, principalmente da Coordenação Nacional de Controle das
Leishmanioses, sempre atentos aos nossos trabalhos.
Aos professores e alunos do curso de mestrado da Universidade do Estado do
Amazonas, que sempre me estimulam a aprender mais e pelos maravilhosos
momentos juntos. E atodos os membros da equipe envolvida neste trabalho, e
seus respectivos colaboradores: Ellen Priscila, Cintia Oliveira, Leandro Ourives,
Renata Galvão, Lorena Roque, Felipe Sardinha, AnetteTalhari, nada seria
possível sem vocês! Muito obrigado!
VIII
LISTA DE FIGURAS
Figura1: Densidade de casos, circuito de leishmaniose tegumentar
americana por município, Brasil, 2004 a 2006 e casos em
2007...........................................................................................2
LISTA DE QUADROS
Quadro1: Leishmaniose Tegumentar Americana – subgêneros e espécies patogênicas para o homem descritas nas Américas.............,,.................................................................3,4
LISTA DE TABELAS
Tabela1: Sensitivities of different procedures used in the diagnosis of ATL………………………………………………………………….17
IX
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
• % - por cento
• 1X – 1 vez
• A – Adenosina
• ALT - Alanina aminotransferase
• AM – Estado do Amazonas
• ATP – Trifosfato de adenosina
• BA – Estado da Bahia
• Ca2+ - Íon Cálcio
• CEP – Comité de Ética em Pesquisas
• dL– decilitro(s)
• DMSO – Dimetilsulfóxido
• DNA – ácido desoxirribonucléico
• DST- Doença sexualmente transmissível
• EDTA – Ácido tetra-acético de etilenodiamina
• FMT-HVD - Fundação de Medicina Heitor Vieira Dourado
• g – grama(s)
• h – hora(s)
• HAE - HumanAmnionEpithelial
• HCl– Ácido clorídrico
• Hg – Mercúrio
• Hsp 70 – Heat-shockprotein 70
• HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana (HumanImmnodeficiencyVirus)
• IC – Intervalo de Confiança
• ICAM - Inter-CellularAdhesionMolecule
• KCl– Cloreto de Potássio
• kg– kilograma(s)
• L – litro(s)
• L. – Leishmania
• LC – Leishmaniose Cutânea
• LCD – Leishmaniose Cutânea Difusa
• LD – Leishmaniose Disseminada
X
• LM – Leishmaniose Mucosa
• LTA – Leishmaniose Tegumentar Americana
• LV – Leishmaniose Visceral
• mg– miligrama(s)
• Mg2+ - Íon Magnésio
• MgCl2 – Cloreto de Magnésio
• MHC – Complexo Maior de Histocompatibilidade
• min– minuto(s)
• mL– mililitro(s)
• mm – milímetro(s)
• mM – milimol
• MS – Ministério da Saúde
• OMS – Organização Mundial de Saúde
• ºC– grau(s) Celsius
• p– valor p (α)
• PCR – Reação em cadeia pela polimerase
• RNA – Ácido Ribonucleico (RiboNucleicAcid)
• RFLP- Comprimento do fragmento de restrição polimórfico
• RAPD- Amplificação aleatória de DNA polimórfico
• s – segundo(s)
• SF- Soro fisiológico
• taq – Thermusaquaticus
• T – Tiamina
• TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
• U – unidade(s)
• V. – Viannia
• μ – micro
• μg – micrograma(s)
• μL – microlitro(s)
XI
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 1 1.1 Aspectos epidemiológicos da Leishmaniose.............................................
1
1.2 Aspectos epidemiológicos da Leishmaniose no Brasil e na Amazônia.....
2
1.3 Etiopatogenia da Leishmaniose................................................................
4
1.4 Aspectos clínicos terapêuticos e diagnósticos da Leishmaniose............. 5 2 OBJETIVOS................................................................................................
7
2.1 Objetivo Geral...........................................................................................
7
2.2 Objetivo Específico...................................................................................
7
3 MATERIAL E MÉTODO..............................................................................
8
3.1 Tipo de Estudo..........................................................................................
8
3.2 Desenho do Estudo................................................................................... 8 3.3 População de Estudo................................................................................
8
3.4 Tamanho da Amostra................................................................................
8
3.5 Seleção de pacientes................................................................................
9
3.5.1 Critério de Elegibilidade.........................................................................
9
3.5.2 Critérios de Exclusão.............................................................................
9
3.6 Pacientes: Definições de casos................................................................
9
3.7 Diagnóstico laboratorial e coleta das amostras........................................
10
3.7.1Exame direto..........................................................................................
10
3.7.2 Biópsia...................................................................................................
10
3.8 Isolamento dos parasitos a partir de biópsias das lesões........................
10
3.9 Extração do DNA genômico a partir das culturas dos parasitos..............
11
3.10 Identificações das espécies de Leishmania para PCR-
XII
RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism).............................................. 11 3.11 Posicionamento geográfico por GPS......................................................
12
3.12 Considerações Éticas............................................................................. 12 4 RESULTADOS............................................................................................
13
5 CONCLUSÃO.............................................................................................
28
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................
30
7 ANEXOS......................................................................................................
34
Anexo A. Equipe científica..............................................................................
34
Anexo B. Cronograma.....................................................................................
35
Anexo C. Orçamento.......................................................................................
36
Anexo D. TCLE...............................................................................................
38
Anexo E. Ficha Clínica do participante do estudo.......................................... 44 Anexo F. Aprovação do CEP..........................................................................
46
Anexo G. POP´s..............................................................................................
48
Anexo H.Tamanho da amostra...................................................................... 52
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos epidemiológicos da Leishmaniose
As leishmanioses são doenças zoonóticas de transmissão vetorial, sendo
consideradas pela Organização Mundial de Saúde (OMS)importante problema
de saúde pública. A OMS estima que 350 milhões de pessoas estejam
expostas ao risco, com registro anual, aproximado, de dois milhões de
novoscasos das diferentes formas clínicas. Atualmente, as leishmanioses
ocorrem em 88 países; a prevalência é estimada em 14 milhões de casos e o
total de óbitos, em 59 mil (1, 2).
As leishmanioses compreendem grupo de doenças infecciosas crônicas,
causadas por diversas espécies de protozoários do gêneroLeishmania (ordem
Kinetoplastida, família Trypanosomatidae).Essas doenças predominam em
regiões tropicais e subtropicais do Velho e Novo Mundo, podendo atingir as
vísceras (leishmaniose visceral), a pele e/ou mucosas (leishmaniose
tegumentar ou leishmaniosecutâneo-mucosa). Em todo o mundo, estima-se
que, anualmente, 1,5 a 2 milhões de indivíduos apresentemleishmaniose, um a
1,5 milhão de casos correspondem à forma tegumentar (3,4).
No Novo Mundo, a forma que provoca lesões na pele ou mucosasdo
homem ouanimais silvestres e domésticosé denominada leishmaniose
tegumentar americana (LTA)(5).Constitui importante causa de morbidade em
populações docontinente americano, sendo observadadesde o sul dos Estados
Unidos até o norte da Argentina. Não há casos registrados no Chile e
Uruguai.Nos últimos vinte anos foram registrados 549.309 casos de LTA no
Brasil. O coeficiente médio de detecção da LTA em nosso país é de 16,2
casos/100.000 habitantes; na região norte, a detecção é de 76,8 casos/100.000
habitantes (5,6).
2
1.2 Aspectos Epidemiológicos da Leishmaniose Tegumentar no Brasil e na Amazônia
No Brasil, a LTA é ocasionada por diversos agentes, reservatórios
evetores,apresentando diferentes padrões de transmissão.(5).
Na Amazônia, as formas clássicas de LTA podem resultar da infecção
humana por diferentes espécies de Leishmania, sendo aL. guyanensis e a L.
braziliensisas mais frequentes. A leishmaniose mucosa (LM), desencadeada
pela L.braziliensis é a forma mais grave de LTA – acomete principalmente a
boca, nariz e mucosa faríngea, podendo levar a quadros clínicos desfigurantes
(2,7).
No estado do Amazonas, principalmente em Manaus, predomina a
leishmaniose cutânea(LC) (8,9).Em Manauspredomina a L. (V.)
guyanensis(10).ALTA é primariamente uma zoonose (1,9) com ciclo de
transmissão ocorrendo entre os flebotomíneos e os animais silvestres. É
comum o homem infectar-se ao alterar o ambiente, interpondo-se ao ciclo
silvestre ao penetrar nesse ecossistema(9,11).
3
No homem, a transmissão faz-se através da picada das fêmeas de diversas
espécies de flebótomos (Díptera, Psychodidae, Phlebotominae), dos gêneros
Lutzomyia,Nyssomyia,Bichromomyia, Trichophoromyiae Psychodopygus.
Estudo realizado em focode LTA na área periurbana de Manaus destacou a
importância das espéciesNyssomyiaumbratilis, N.anduzei, Bichromomyia
olmeca nociva e B. flaviscutellata como potenciais vetoresna região(12).
No município de Manaus, mais precisamente na periferia da cidade, onde
se registra mais da metade doscasos de LTA do Estado do Amazonas, a
exposição dos indivíduos está relacionada diretamente aos processos de
ocupaçãodesordenada ou às invasões de áreas periféricas, antes com densa
floresta tropical.Nesse caso, a transmissão também pode ocorrer nointra e
peridomicílio, pelaproximidade das residências com as áreas de floresta e
provável adaptação do vetor a esse novo ambiente (12,13).
Quadro 1 - Leishmaniose tegumentar americana – principais subgêneros e espécies patogênicas para o homem descritas no continente americano
Subgêneros Espécies
Viannia L. (V.) braziliensis - Vianna, 1911
Lainsone Shaw, 1987 L. (V.) guyanensis - Floch, 1954
L. (V.) panamensis - Lainsone Shaw, 1972
L. (V.) peruviana - Velez, 1913
L. (V.) lainsoni - Silveira et al., 1987
L. (V.) naifi - Lainson e Shaw, 1989
L. (V.) shawi - Lainsonet al, 1989
L. (V.) colombiensis - Kreutzeret al., 1972
L. (V.) equatoriensis - Grimaldiet al., 1972
4
L. (V.) lindenbergi - Silveira et al., 2002
Leishmania L. (L.) mexicana - Biagi, 1953
Ross, 1903 L. (L.) amazonensis- Lainsone Shaw, 1972
L. (L.) pifanoi - Medina e Romero, 1959
L. (L.) venezuelensis - Bonfante e Garrido, 1980
L. (L.) garnhami - Scorzaet al, 1979
Fontes: Lainson e Shaw, 1987
1.3 Etiopatogenia da leishmaniose
A maioria dos casos é limitada e,frequentemente, regride espontaneamente
através de mecanismos imunológicos. As célulasda imunidade inata, tais como
os mastócitos, macrófagos e células dendríticas, responsáveis pela detecção
de parasitas e recrutamento de células pró-inflamatória, limitam a ação do
patógeno, impedindo a progressão para doença (14).
A infecção pela leishmania se dá através das células do sistema fagocítico
mononuclear da pele ou das mucosas. Duranteo repasto sanguíneo, a fêmea
do flebotomíneo regurgita formas promastigotas do parasita, presentes no seu
tubo digestivo. Juntamente com as leishmânias regurgitadas estes insetos
inoculam saliva contendo peptídeos inflamatórios potentes, responsáveis por
reação inflamatória imediata e atração de células fagocíticas para o local.
Neste momento, a maioria das leishmânias é destruída pela ação lítica do
complemento e pelos eosinófilos e polimorfonucleares recrutados para o local.
Entretanto, as formas infectantes (promastigotasmetacíclicas) apresentam na
sua membrana citoplasmática moléculas (lipofosfoglicanos e glicoproteinas)
que impedem a ação lítica do complemento, dando prosseguimento para o
quadro clínico da doença(15, 16,17).
Os parasitas apresentam duas formas: amastigota, que é obrigatoriamente
parasita intracelular em mamíferos, e promastigotas, presente no tubo digestivo
5
do inseto transmissor. Os agentes da LTA são classificados nos subgêneros
Leishmania e Viannia; no primeiro, os parasitas se desenvolvem somente nos
intestinos médio e anterior, enquanto no último, o desenvolvimento dos
parasitas ocorre nos intestinos anterior, médio e posterior dos flebotomíneos
(18).
1.4 Aspectos clínicos, terapêuticos e diagnósticos da leishmaniose.
ALTAapresenta as seguintes formas clínicas: cutânea (LC), com lesões
únicas ou múltiplas; disseminada (LD), difusaou anérgica(LCD) e mucosa (5).
Aproximadamente, 3-5% dos pacientes com LC podem desenvolver lesões
mucosas,durante a evolução da lesão cutânea evários meses ou anos depois
da sua cicatrização. ALM podeocasionar graves mutilações da face e extensas
cicatrizes na orofaringe(7).
A LCpode apresentar-se com lesões ulceradas, papulosas, nodulares,
verrucosas, impetigóides, framboesóides e outros aspectos dermatológicos.
Geralmente são indolores, podendo ser únicas ou múltiplas(19).
A forma disseminada foi descrita na Bahia e caracteriza-se por numerosas
lesões cutâneas, disseminadas. Apresentam boa imunidade e resposta
terapêutica similar aos pacientes com LC clássica. (20).
A leishmaniose cutânea difusa caracteriza-se por lesões pápulo-tuberosas,
isoladas e confluentes, disseminadas, repletas de parasitas ao exame
microscópico; raramente acomete a mucosa. No Brasil, a única espécie isolada
nessa forma clínica é a L. (L.) amazonensis. O paciente é anérgico em sua
resposta imunológica à leishmania, possibilitando a disseminação cutânea do
parasita. Não há manifestação sistêmica e não há cura dessa variedadeclínica
(21).
A LM inicia-se com ulceração do septo nasal ou da orofaringe, havendo
obstrução nasal, eliminação de crostas e epistaxe.As lesões ulceradas,
6
inicialmente discretas, podem aumentar de tamanho, ocasionando a perfuração
do septo cartilaginoso e mesmo a sua destruição, levando ao desabamento da
parte anterior do nariz e o aspecto denominado “nariz de tapir”. As ulcerações
da orofaringe também podem ser muito extensas, ocasionando disfagia,
odinofagia, rouquidão, dispneia e tosse; cicatrizam com fibroses e retrações
após o tratamento (22). O tratamento da LC pode ser prolongado, com
respostas inadequadas ao tratamento, necessidade de mudança da medicação
e retratamentos, por falhas terapêuticas.
Em geral, no presente momento, a resposta ao tratamento em todas as
formas clínica de leishmaniose é muito baixa, verificando-se eficácia de 53,6%
ao antimonial e 57,8% com a pentamidina, as drogas de primeira linha
recomendadas pelo Ministério da Saúde (10,23).
7
2. OBJETIVOS 2.1 Objetivogeral
2.1.1. Avaliar os diferentes métodos diagnósticos empregados para o
diagnóstico da leishmaniosee urbanização da LTA no município de Manaus
2.2 Objetivos específicos 2.2.1Comparar a sensibilidade dacultura,exame histopatológico e PCR em
pacientes com exames direto positivo para LTA.
2.2.2Avaliar os principais aspectos relacionados à possível urbanização da
leishmaniose cutânea na cidade de Manaus.
8
3.MATERIALE MÉTODOS
3.1 Tipo de Estudo
Estudo Descritivo, Prospectivo.
3.2 Desenho do Estudo
O estudofoirealizado na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado (FMT- HVD), no ambulatório da Gerência de Dermatologia/DST/AIDS
e Laboratório de Entomologia da FMT-HVD.Foram avaliadas 185 amostras de
pacientes portadores de leishmaniose cutânea (LC) com diagnóstico clínico
confirmado por exame direto (escarificação em lâmina), cultura e PCR para a
caracterização da espécie, e que atenderam aos critérios de elegibilidade para
o estudo.
3.3 População de estudo
Foram incluídos pacientesdiagnosticados com LCque procuraram a FMT-
HVD no período compreendido entre 2009 e 2010, e que concordaram em
participar do estudo, mediante assinatura do Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE – Anexo D).
3.4 Tamanho da amostra
As amostras utilizadasforamàs mesmas do estudo: “Estudo clínico
randomizado comparando antimoniato de Meglumina, Pentamidina e
Anfotericina B para o tratamento da Leishmaniose cutânea ocasionada por
Leishmania Guyanensisem centro de referência de Manaus, Amazonas”. Onde
os pacientes arrolados em ambos os projeto foram os mesmos, com base
nisso, seguindo mesmo cálculo amostral.(ANEXO I)
9
3.5 Seleção de pacientes
3.5.1 Critério de elegibilidade
Para ser elegível, o paciente teve que atender aos seguintes critérios:
• Exame direto positivo para Leishmania spp.;
• Sexo: pacientes do sexo masculino ou feminino;
• Clínica compatível com leishmaniose cutânea (LC): lesão(ões)
cutânea(s) ulcerada(s);presença de, no mínimo,uma lesão ulcerada,
com até 5 cm de diâmetro;
• Tempo de doença: entre um e três meses de evolução;
• Número de lesões: máximo de seis lesões (leishmaniose cutânea
localizada - LCL);
• Assinatura do TCLE pelo paciente ou por pessoa responsável no caso
de menores de idade (ANEXO D), através de assinatura ou impressão
digital;
• Ausência de história de tratamento prévio com antimoniais
pentavalentes ou drogas leishmanicidas nos últimos seis meses;
3.5.2 Critérios de Exclusão
• Pacientes com exame direto negativo
• Pacientes com cultura negativa
• Pacientes com recidiva de Leishmaniose
3.6 Pacientes: Definições de casos.
• Leishmaniose cutânea: Foi definida pela presença de uma ou mais
lesões cutâneas ulceradas,sem evidência de envolvimento de mucosas.
O diagnóstico de LC foi realizado pela detecção de parasitos na cultura
de tecido, ou por uma lesão típica acompanhada de dois dos seguintes
critérios: positividade no exame direto (escarificação), e caracterização
10
histopatológica de fragmento proveniente de lesão suspeita compatível
com leishmaniose.
3.7 Diagnóstico laboratorial e coleta das amostras
3.7.1 Exame direto
O exame direto do material foi obtido por escarificação das bordas da
lesão,seguida pela coloração da lâmina pelo GIEMSA ou Panótico.
3.7.2 Biópsia
A coleta das amostras foi realizada no Ambulatório da Gerência de
Dermatologia/DST/AIDS da FMT-HVD. Após realização de antissepsia com
gaze ou algodão, sabonete líquido, solução de cloreto de sódio a 0,9%, ou
álcool 70%, e anestesia local com lidocaína a 2%, sem vasoconstritor, na borda
da lesão que apresentasse maiores sinais de atividade clínica. Foram utilizados
punch de 3 mm ou 4 mm, obtendo-se dois fragmentos: um para PCR (reação
em cadeia pela polimerase) e cultura, e outro para exame histopatológico;
conservados em solução fisiológica a 0,9% e formaldeído a 10%,
respectivamente.
3.8Isolamento dos parasitos a partir de biópsias das lesões.
Os fragmentos obtidos das biopsias foram estocados em micro-
tuboseppendorfs contendo SF 0,9% e gentamicina até o momento da
semeadura, que foi feita no mesmo dia da coleta. Para a semeadura em meio
de cultura cada fragmento de tecido foi triturado em peneira metálica utilizando-
se o êmbolo de uma seringa descartável. A semeadura foi então realizada em
11
meio LIT/NNN a 25°C. Após crescimento em LIT/NNN por duas a três
semanas, os parasitos foram transferidos para meio Schneider e incubados até
alcançarem à fase logarítmica tardia de crescimento, e então foram estocados
em DMSO a –180°C.
3.9Extração do DNA genômico a partir das culturas dos parasitos.
O DNA genômico foi obtido das massas parasitárias usando o Kit Invitek
Spin Tissure, de acordo com as instruções do fornecedor.
3.10 Identificação das espécies de leishmania por PCR-RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism).
A análise para identificação das cepas foi realizada de acordo com
Garcia et al 2004, utilizando-se os primers L hsp70 sen (5’ GAC GGT GCC
TGC CTA CTT CAA 3’) e L hsp70 ant (5’ CCGCCCATGCTCTGGTACATC
3’).O resultado da amplificação foi um fragmento de 1.300 pares de bases. A
visualização foi feita em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio,
usando 5μl de produto de PCR.
Para digestão de cada amostra, o produto da PCR foidigerido com
HaeIII; para cada amostra foi feito um mix com 0,5 μL de enzima Hae III e 2,5
μLdetampão NE 10X (100 mMKCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 mM EDTA, 10
mM 2-mercaptoetanol, 500 μg/mL BSA e glicerol 50% 1X = 50 mMNaCl, 10 mM
Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 m mM DTT, pH 7,9 a 25oC). Adicionou-se 3 μL
desse mix a 20 μL de produto de PCR; em seguida, as amostras foram
incubadas a 37oC, por duas horas. O resultado da digestão foivisualizado em
gel de agarose 3%, corado com brometo de etídio. Para identificação das
cepas, o padrão de digestão enzimática de cada amostra foi comparado com
cepa padrão de Leishmaniabraziliensis.
12
3.11 Posicionamento geográfico por GPS Para análise sobre a urbanização, foi realizado um posicionamento de
coordenadas geográficas das residências dos pacientes, pelo sistema Brunton
Multi-Navigator global (GPS), aparelho (A Co. Brunton, WY/EUA), que tem uma
precisão gama de 15 metros. Os dados foram plotados para a inspeção visual
para um satélite de alta definição, com o sitema de informação geográfica
(GIS).O agrupamento dos casos foi realizado por análise com Kernell software,
emputido no pacote de GIS, ArcInfo versão 8.3 (Environmental Systems
Research Institute Inc., CA / EUA).
3.12 Considerações Éticas
Este projeto foi elaborado segundo as diretrizes éticas internacionais para
pesquisas Biomédicas envolvendo seres humanos (Resolução 196/96 CNS,
1996) e submetido ao julgamento pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) em
Seres Humanos da FMT-HVD. (AnexoF).
Antes do ingresso na pesquisa, todos os pacientes forneceram
consentimento voluntário após informação, por escrito (TCLE), o qual constava
de todas as informações sobre a mesma, incluindo exames e tratamentos a
que seriam submetidos, além da garantia de que continuariam a receber a
devida assistência médica caso se recusassem a fazer parte do estudo ou que
dele quisessem se retirar (Anexo D).
13
4. RESULTADOS
O Resultado e discussão desta pesquisapossibilitou a publicação de
doisartigos: “Combining diagnostic procedures for the management of
Leishmaniasis in areas with high L. guyanensis prevalence”, apresentado a
seguir segundo as normas de publicação do An Bras Dermatol e “Urbanization
of cutaneous leishmaniasis in a major city of the Amazon”,que já foi aceito e
aguarda publicação.
14
• Artigo 1-AnBrasDermatol. 2011 Nov-Dec;86(6):1141-4.
Combining diagnostic procedures for the management of Leishmaniasis in areas with high L. guyanensis prevalence
Ednelza Benicio, Mayara Cordeiro, Cintia Oliveira, Ellen Priscilla Nunes Gadelha, AnetteTalhari, Jorge Guerra, Roberto Moreira da Silva Jr, Luis Carlos Ferreira, Marcelo
Távora Mira, Paulo Roberto Lima Machado, Sinésio Talhari, Albert Schriefer
Gerência de Leishmaniose and Departamento de Ensino e Pesquisa, Fundação de Medicina Tropical da Amazônia, Manaus, Brazil; Pontifícia Universidade Católica do
Paraná, Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Curitiba, Brazil; Serviço de Imunologia, Hospital Universitário Professor Edgard Santos, Universidade Federal da
Bahia, Salvador, Brazil; Departamento de Biointeração, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Salvador, Brazil; Instituto Nacional de Ciência e
Tecnologia – Doenças Tropicais (INCT-DT), Brazil
ABSTRACT. The Amazon responds for approximately 40% of the leishmaniasis cases in Brazil. Here we report a prospective study with 180 patients conducted at a health care unit that diagnoses 10% of leishmaniasis cases in the Brazilian Amazon, addressing how combination of procedures improves diagnosis in areas with high prevalence ofLeishmania guyanensis. All subjects were amastigote-positive in direct microscopic examination of lesion scarifications. We found that parasite cultivation and lesion biopsy histopathology detected half of the infections each, and their combination detected three quarters of infections. PCR detected almost ninety percent of infections when two amplification protocols were used (mini-exon and HSP-70). HSP-70 specific PCR matched the sensitivity of parasite cultivation plus histopathology. The best combination was PCR plus histopathology, which increased diagnostic sensitivity to 94%. Species discrimination by PCR disclosed prevalences of human infections with L. guyanensis of 94% and with L. braziliensis of 6% for this region.
15
The leishmaniases are neglected diseases that cause a burden of about two million disability adjusted life years (DALYs) world-wide (1). Ninety percent of all cases of tegumentary forms of these disorders concentrate in five countries, including Brazil (2) where approximately twenty thousand new cases of American tegumentary leishmaniasis (ATL) occur every year (3). The Amazon region responds for approximately 40% of these ATL cases, with Leishmania guyanensis as the most prevalent parasite (4-6). There are no previous studies that specifically address how combination of diagnostic procedures improves case management in areas affected by ATL with high prevalence of this leishmania species. In order to help fill this gap, we carried out a prospective study that enrolled 180 consecutive amastogote-positive ATL patients and tested the sensitivities of PCR, histopathology and parasite cultivation in detecting their infections. The research was conducted at the Tropical Medicine Foundation (FMTAM) in Manaus, Capital of the Amazon state and one of the largest cities in the country with 2.5 million inhabitants. FMTAM drains over 70% of all cases in the Amazon state, which is responsible for over 15% of infections in the entire Brazilian Amazon region (4).
One hundred and eighty consecutive cases of ATL, confirmed by direct microscopic examination of giemsa stained specimens from lesion scarifications, were enrolled. There were 141 (78%) males and 39 (22%) females in the sample. Ages varied from 5 to 65, averaging 29 years. Inclusion criteria consisted of any individual of confirmed infection, with fewer than six lesions, willing to participate in the study and signing the informed consent form. Exclusion criteria consisted of current or recent (less than 90 days) treatment with anti-leishmania drugs, treatment with immune system suppressive drugs, pregnancy, and/or reported chronic conditions that might interfere with immunity against the parasite and thus bias their detection like diabetes mellitus, AIDS and cancer. Histopathology, cultivation of parasites in LIT/NNN and Leishmaniaviannia specific PCR with discrimination between L. braziliensis and L. guyanensis, evaluating two different genomic targets (i.e. HSP-70 and mini-exon loci), were performed for lesion biopsy specimens of all subjects, following protocols previously reported (7-10).
Table one summarizes the results obtained for each of the procedures and for several combinations of them. While the traditional and wide spread methods of parasite cultivation and lesion biopsy histopathology proved capable of detecting only half of the infections each, their combination improved sensitivity to detect approximately three quarters of infected ATL patients. The single most sensitive technique was PCR that detected almost ninety percent of all infections, when the two tested amplification protocols (i.e. using primers for mini-exon and HSP-70) were employed. PCR had the same sensitivity as the combination of parasite cultivation and biopsy histopathology when only HSP-70 specific primers were used. The mini-exon protocol was employed only as a rescue protocol to detect infection and differentiate species in those samples that were negative for HSP-70 PCR. In these cases, the mini-exon specific PCR presented a sensitivity of 54%. Combination of HSP-70 and mini-exon PCR protocols with parasite cultivation resulted in no improvement, while combination with biopsy histopathology increased diagnostic sensitivity to 94%. Besides the higher sensitivity among all procedures, PCR also carries the advantage of allowing for species discrimination. In the current sample, 152 subjects were positive for L. guyanensis and 9 for L. braziliensis among the 161 patients with positive PCR.
16
This indicates that prevalences of human infections with L. guyanensis is 94% and with L. braziliensis is 6% in the region of influence of FMTAM.
The data here reported show that PCR is a very sensitive procedure for confirming clinical suspicion of ATL, which could be easily implemented within secondary and tertiary health care units of L. guyanensis prevalent areas. In these diagnostic stances, PCR should be coupled to direct microscopic investigations of giemsa stained scraping or impression smears, and biopsy histopathology. Since diagnosis by all these techniques can be accomplished within twenty four hours of patients’ initial consultations, anti-leishmania specific treatment might be rapidly initiated for positive patients. Negative cases would then undergo differential diagnosis for other causes of skin disease with clinical features overlapping ATL and further leishmaniasis investigation by specimen cultivation in LIT/NNN. However, cultivation takes weeks for detecting infection and presents lower sensitivity than PCR and its combination with histopathology.
The enrollment of patients with positive direct microscopic examination of skin scrapes in this study served the purpose of minimizing false diagnosis, while allowing for the better comparison of top sensitivities for each test and their combinations in detecting ATL in areas with high endemicity for L. guyanensis. However, the sensitivities here reported must be expected to drop markedly when cases negative at the direct microscopic examinations are considered. It is also possible that prospective evaluations of patients, testing positive and negative for Leishmaniaspp in direct microscopic examinations, result in correction of the prevalences here observed among the two species. This would be expected if their amastigote frequencies in lesions prove different.
There are several reported protocols of conventional PCR for detecting Leishmaniaspp (10). Some explore the nuclear genome of these parasites (7-9), other take advantage of the high copy number of kDNA mini-circles in the kinetoplast of these protozoa to heighten the sensitivity of the test. One such assay has been evaluated for its ability to detect L. guyanensis in the past (11). Although the kDNA PCR proved highly sensitive, approaching 100% in that study, the sample was comprised of only 35 ATL patients. Furthermore, all subjects were culture positive for the parasite, which may have biased the results towards increased sensitivity. However, the major drawback of that technique for day-to-day application was that it did not allow species identification.
The two protocols tested in the current study combine good overall sensitivity with the ability of discriminating species. This last feature is of great importance in the Amazon region because part of the infections will be due to L. braziliensis, which leads to aggressive mucosal involvement more often than other leishmania. Furthermore, L. guyanensis and L. braziliensis present different sensitivities to the drugs used for treating ATL. Thus addition of these PCR procedures to the regular diagnostic steps would not only help increase detection of ATL, but also improve its management. For example, patients with L. braziliensis would undergo immediate detailed investigation for mucosal lesions and be advised of returning for eventual reassessments of mouth, throat and nose involvement, while L. guyanensis infected individuals might be put straight to pentamidine treatment, since this species is less sensitive to antimonials (12).
17
ACKNOWLEDGEMENTS. Wethank Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas – FAPEAM for fundingthisstudy. EB, MC, MTM and AS were recipients of FAPEAM scholarships linked to the proposal that resulted in the current research.
AUTHORS ADDRESSES: Albert Schriefer, MD PhD. Associate Professor, Universidade Federal da Bahia. Serviço de Imunologia, Hospital Universitário Professor Edgard Santos, Rua João da Botas s/n, Canela. Salvador, Bahia, Brazil. 40.110-160. Phone: (55-71) 3237-7353, Fax: (55-71) 3245-7110. [email protected].
Marcelo T. Mira, PhD. Associate Professor, Pontificia Universidade Católica do Paraná. Rua Imaculada Conceição, 1155, PPGCS/CCBS. Curitiba, Paraná, Brazil. 80.215-901. Phone: (55 41) 3271 2030; Fax (55 41) 3271 1657.
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18
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Table 1. Sensitivities of different procedures used in the diagnosis of ATL.
Procedures Numberof positive cases* Percent positive cases*
Parasite culture 93 52%
Biopsyhistopathology 90 50%
PCR1 (HSP-70)& 135 75%
PCR2 (HSP-70 and mini-exon)+ 161 89%
Culture + Histopathology 130 72%
PCR2 + Culture 164 91%
PCR2 + Histopathology 170 94%
PCR2 + Culture + Histopathology 170 94%
* Results consist of patients testing positive for either or combined techniques. Patients positive for more than one technique in the assessment of combinations were counted only once.
&PCR protocol using primers specific for HSP-70 locus (7, 8). +Separate PCR protocols using primers specific for HSP-70 (7, 8) and mini-
exon loci (9).
19
Artigo 2- Aprovado e aguardando publicação
TITLE: Urbanization of cutaneous leishmaniasis in a major city of the Amazon
AUTHORS:Ednelza Benício1, Mayara Cordeiro1, Hannah Monteiro1, Marco Antônio
Saboia Moura1, Cintia Oliveira1, Ellen Pricilla Nunes Gadelha1, Anette Chrusciak-
Talhari1, Carolina Talhari1, Luiz Carlos de Lima Ferreira1, Marcelo Távora Mira2, Paulo
Roberto Lima Machado3, 4, Sinésio Talhari1, Albert Schriefer3,4
AUTHOR AFFILIATIONS:1Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus,
Brazil; 2Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, Brazil; 3Universidade
Federal da Bahia, Salvador, Brazil; 4Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia –
Doenças Tropicais (INCT-DT), Brazil.
*CorrespondingAuthor. Mailing address: Serviço de Imunologia, Hospital
Universitário Professor Edgard Santos, Universidade Federal da Bahia. Rua João das
Botas s/n, 5o andar, Canela. 40.110-160. Salvador/Bahia/Brazil. Phone: (5571) 3237-
7353. Fax: (5571) 3245-7110. E-mail: [email protected];
Thisworkwasfundedbythe Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas –
FAPEAM, Brazil.
Running title: Urbanization of ATL in Manaus, Brazil.
Wordcounts: Abstract=49, Text=1200.
Key Words: American Tegumentary Leishmaniasis, cutaneous leishmaniasis, Leishmania guyanensis, urbanization, Amazon.
ABSTRACT: This study investigated the urbanization of cutaneous leishmaniasis in
Manaus. Data from prospectively enrolled patients and notification databases were
analyzed. Patients distributed widely throughout Manaus and their homes were
frequently located close to residual forest inside the city. The data also suggest that
transmission close to homes is frequent.
Article summary line: We conclude that cutaneous leishmaniasis due to Leishmania
guyanensis is widespread within the city of Manaus in the Brazilian Amazon.
20
INTRODUCTION
The burden of leishmaniases accounts for about two million disability adjusted
life years (DALYs) world-wide (1). Ninety percent of all cases of tegumentary forms of
these disorders concentrate in five countries, including Brazil (2) where approximately
thirty thousand new cases occur every year (3). The Brazilian Amazon region is
responsible for approximately 40% of American tegumentary leishmaniasis (ATL)
cases, with Leishmania guyanensis as the most prevalent parasite (4). The city of
Manaus is one of the largest human settlements located within the Amazon rain forest
with a population of approximately 1.7 million inhabitants. This study investigated
whether urbanization of ATL within this large community is in part responsible for the
greater burden of leishmaniasis in this region. The research was conducted at the
Tropical Medicine Foundation (FMTAM) in Manaus. FMTAM diagnoses and treats over
70% of all cases in the Amazonas state, which is responsible for over 15% of infections
in the entire Brazilian Amazon region (5).
STUDY
One hundred and eighty consecutive cases of ATL attending the outpatient
dermatology clinics in FMTAM between January 2008 and August 2010 were enrolled.
ATL was confirmed in all cases by direct microscopic examination of Giemsa stained
specimens from skin lesions. Inclusion criteria consisted of any individual with
confirmed infection, willing to participate in the study and signing the informed consent
form. Histopathology and Leishmaniaviannia specific PCR with discrimination between
L. braziliensis and L. guyanensis, targeting two different genomic sites (i.e. HSP-70
and mini-exon loci), were performed on skin biopsy specimens from all subjects,
following protocols previously reported (6-8).
High resolution geographic positioning of urban ATL cases enrolled at the
FMTAM in Manaus was determined by acquisition of geographic coordinates of
patients’ residences, by a Brunton Multi-Navigator global positioning system (GPS)
apparatus (The Brunton Co., WY/USA), which has a 15-meter range precision.
Collected data were plotted for visual inspection onto a high definition satellite
photograph of Manaus (Inpa/Brazil) with the geographic information system (GIS)
ArcInfo Version 8.3 (Environmental Systems Research Institute Inc., CA/USA).
Clustering of cases within the target area was detected by Kernell analyses with
software built into the GIS package.
21
Frequency distribution of historic cases of ATL among age and geographic
strata of patients was evaluated by secondary notification data from cases that
occurred in Manaus between 2001 and 2009, maintained in the Brazilian Ministry of
Health SINAM database (9). These cases were classified according to their rural or
urban residence, and to the age strata: 01-10, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, and
>71 years of age.Frequencies of ATL among age strata of urban cases were compared
by student’s t test.
Research approved by FMTAM institutional review board.
RESULTS
One hundred and eighty cutaneous leishmaniasis patients, attending the
dermatology clinic at the FMTAM, were prospectively enrolled at diagnosis. Of the 180
patients, 120 (67%) lived in the city and 60 (33%) were from the rural surroundings of
Manaus; 141 (78%) were male; and 94% were infected with L. guyanensis. Ages
varied from 5 to 65 years (mean 29). Of note, a large proportion (31%) belonged to the
age stratum 0-20 years (table 1), suggesting that transmission may occur close to their
domiciles.
The range of ATL spread within the city was evaluated after acquisition of
geographic coordinates of the place of residence of the 120 urban cases. The GPS
data plotted onto a geo-referenced photograph of Manaus in figure 1 reveal that ATL
cases distributed widely throughout several neighborhoods of Manaus, not confined to
the outskirts adjacent to the Amazon rain forest. Kernel analysis identified several
areas of case aggregation, which may indicate that certain areas of the city expose the
residents to a greater risk of disease acquisition (Figure 1). Inspection of the seven
major clusters revealed that the majority of the patient’s homes were located in close
vicinity of residual forest patches occurring inside the city. As an example, of the seven
patients shown (yellow dots) in the representative photograph of the major clusters’
core (Figure 2, encircled in figure 1), five lived right next to forest patches and the other
two lived only two blocks away from these areas.
To further investigate the hypothesis of transmission of the parasites close to
their domiciles and validate that these prospectively enrolled study subjects reflected
the actual spectrum of tegumentary leishmaniasis occurring in the region, we analyzed
historic cases of ATL diagnosed in Manaus between 2001 and 2009, notified to the
Brazilian Ministry of Health and listed in the SINAM database. During this period, a total
22
of 9,510 cases were notified (67% urban; 33% rural origins), with 76% being male.
Thus, these data show similar proportions of gender and origin of the subjects
prospectively enrolled at FMTAM.
The distributions of ATL cases diagnosed in Manaus between 2001 and 2009
stratified by age and origin are depicted in table 1. Urban and rural cases had similar
age distributions with 3,344 (35%) of 9,510 cases occurring in the young age group (0-
20 years). The yearly incidence of urban ATL in Manaus from 2001 to 2009 between
the age strata of 0-20 and 21-40 are shown in table 2. There were 244 ± 45 and 308 ±
37 (mean ± SD) cases in the 0-20 and 21-40 age groups, respectively. The difference
between the two groups was not significant (Student t test p=0.3), suggesting that
acquisition of infection close to the patients homes is probably frequent.
DISCUSSION
ATL commonly affects rural populations, small towns of the country-side or the
outskirts of larger cities. In marked contrast, here in this study, we found ATL affecting
an urban population close to two million inhabitants in the Amazon region. The data
suggest that L. guyanensis transmission close to or within the homes of the dwellers of
Manaus is frequent, particularly in houses located in the vicinity of the Amazon rain
forest and the forest preservation areas within the city.
American visceral leishmaniasis (AVL) reportedly has a greater urbanization
tendency than ATL (10). Major urban centers in Brazil, like capital cities of Fortaleza,
Natal and Belo Horizonte, have well documented endemicity of AVL (11-13).
Interestingly the gender ratio and age groups reportedly affected by urban AVL are
similar to those found for ATL in Manaus in this study.
Exposure to Leishmaniaspp among individuals younger than 20 years of age is
thought to be more common in the peri-domiciliary areas, while the 21-40 years-old
comprises one of the most economically active age groups, thus at greater risk of
occupational acquisition of the infection. In the current study, there was no difference
among these two strata. Although the large proportion of urban patients found to
belong to the younger age group may reflect strong peri-domicile transmission cycle of
the parasites, the reasons for the disproportionate male to female ratio of ATL found in
this study and those for AVL may not share the same explanation.
23
The findings in this study describe the current situation regarding vector borne
disease spread in Brazil due to human settlements encroaching into the Amazon and
other rain forests. Nonetheless future epidemiology studies based in Manaus may
identify risk factors for ATL other than living near the forest and preserved areas. Such
knowledge may help to prevent and control urbanization of cutaneous leishmaniasis.
ACKNOWLEDGEMENTS
We are deeply indebted to Lee W. Riley for careful revision of this manuscript.
Thisworkwasfundedbythe Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas –
FAPEAM, Brazil. AS, MTM were recipients of research scholarships from FAPEAM.
EB, MC, HM were recipients of PAIC scholarships from FAPEAM.
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443-9.
25
Table 1. ATL cases notified in the city of Manaus and listed in the SINAM database of
the Brazilian Ministry of Health between 2001 and 2009, stratified by residence status.
Number of ATL cases notified between 2001 and 2009
Age strata Urban Rural
0-10 782 477
11-20 1416 669
21-30 1647 771
31-40 1123 553
41-50 776 401
51-60 410 187
61-70 154 81
>70 45 18
26
Table 2. Urban ATL cases notified in the city of Manaus and listed in the SINAM
database of the Brazilian Ministry of Health between 2001 and 2009, stratified by age
groups.
Number of ATL cases notified per age group*
Year 0-20 yearsold 21-40 yearsold
2001 333 345
2002 301 349
2003 539 562
2004 185 245
2005 178 274
2006 229 299
2007 226 313
2008 111 207
2009 96 176
TOTAL 2198 2770
*Student’s t test all p>0.05 for the comparison of ATL frequencies between the two age
groups.
27
LEGENDS TO FIGURES
Figure 1. Composite image showing the distribution of urban ATL cases diagnosed in
the city of Manaus between January 2008 and August 2010. Polygons in satellite
photograph correspond to neighborhoods of Manaus. Green areas in color picture and
rough areas in black and white georeferenced image correspond to vegetation, while
red and smooth black and white areas correspond to populated districts. Yellow dots
are ATL patients living sites. Yellow circle surrounds the major cluster of ATL cases
observed, located in the Cidade Nova neighborhood.
Figure 2. Distribution of seven representative cases found at the center of the major
cluster of ATL patients in Cidade Nova neighborhood, depicted within the yellow circle
in figure one. Green areas correspond to vegetation. Yellow dots are ATL patients
living sites.
28
5. CONCLUSÃO
Artigo 1
Isoladamente, o melhor método diagnóstico foia reação em cadeia da
polimerase (PCR-70 andmini-exon), com 89% de sensibilidade; a cultura e a
histopatologia foram positivas para LTA em 52% e 51% dos casos,
respectivamente.
A melhor combinação foi a PCR2 (PCR 70 e mini-exon) e histopatologia,
que possibilitou o diagnóstico de 94% dos pacientes.A combinação cultura +
histopatologia + PCR foi, também, positiva em 94%.
É importante ressaltar que todos os pacientes tinham exame direto positivo
e de acordo com os resultados, o exame direto seria mais sensível para os
casos iniciaisou teria havido erro diagnóstico no exame direto. Porém, todos os
pacientes do estudo eram casos clínicos de leishmaniose, foram medicados
para LTA e responderam adequadamente ao tratamento, indicando que o
exame direto estava correto.
Um aspecto, também importante a ser destacado é a possibilidade de se
identificar a espécie de Leishmania através da PCR. Como pode ser visto nos
resultados a sensibilidade da cultura é menor e as espécies deixariam de ser
identificadas em número em 42% dos casos.
Através da PCR verificou-seque a espéciepredominante foi
Leishmaniaguyanensis - 94% dos casos; aLeishmaniabraziliensisfoi identificada
em 6%.
29
Artigo 2
Neste artigo, utilizando-se metodologias modernas de
georeferenciamento de pacientes, demonstrou-se que número significativo de
pacientes, provavelmente, adquiriu leishmaniose em Manaus, através de
infecção com vetores infectados, existentes em áreas de mata, primária ou
secundária, ainda existentes na cidade. Este é um fato novo, pois, até o
momento, tinha-se a ideia que os pacientes adquiririam a doença em matas da
periferia da cidade ou em visitas a sítios e balneários no final de semana. Ao
todo, 65%dos casos estudados teriam adquirido a enfermidade “dentro” de
Manaus.
30
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Leishmaniasis. World Health Organization, Geneva, Switzerland; 2008.
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34
7ANEXOS ANEXO A: Equipe científica de apoio ao desenvolvimento do projeto de dissertação.
Nome Formação (Titulação)
Instituição de trabalho
Atividades no Plano de Dissertação
Ednelza de Almeida Benício
Farmacêutica- Bioquímica
FMT- HVD Desenvolvimento do trabalho, coleta do material biológico, realização dos testes.
Anette C. Talhari Médica, PhD FMT-HVD Orientadora.
SinésioTalhari Médico, PhD. FMT-HVD Co-Orientador.
Albert Schriefer Médico, PhD Universidade Federal da Bahia
Co-Orientador.
Marcelo M. Mira Farmacêutico- Bioquímico, PhD.
PUC- PR Investigador colaborador.
Cíntia Mara Costa Oliveira
Bióloga, PhD FMT-HVD Investigador colaborador.
Leandro Ourives Neves
Médico, Ms FMT-HVD Investigador colaborador.
Roberto Moreira Jr. Biólogo, Ms FMT-HVD Investigador colaborador.
Ellen Priscila Gadelha Enfermeira FMT-HVD Investigador colaborador
35
ANEXO B: Cronograma deexecução física
INÍCIO: 03/2010 TÉRMINO: 09/ 2012 DURAÇÃO EM MESES = 30 meses
Item ATIVIDADES MESES 1º. Ano
mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan
01 Créditos X X X X X X X X X
02 Revisão Bibliográfica visando atualização das informações sobre o assunto
X
Item ATIVIDADES MESES 2º. Ano
fev mar abr mai jun Jul ago set out nov dez Jan a set
01 Revisão Bibliográfica visando atualização das informações sobre o assunto
X X X X X X X X X
04 Coleta de dados X X X X X X X X
02 Elaboração do Projeto X X X X X X
03 Aula de qualificação X
05 Análise dos dados X X X X X X X X
07 Redação do artigo X X X X X X X
08 Defesa Dissertação X
36
ANEXO C: Orçamento
ITEM UNIDADE VALOR UNITÁRIO QUANT. TOTAL
REAGENTES E SUPRIMENTOS (CUSTEIO)
Frascos para cultura de células – em poliestireno de alta transparência, estéril, 9X5X2,5 cm.
Frasco de 60 ml R$ 20,00 700 R$ 14.000,00
Tubos de 15 ml para centrifugação – em polipropileno, com graduação de volume
1.000 unid. R$ 180,00 3.000 R$ 540,00
Glicerol P.A. (Merck) Frasco com 1 litro R$ 60,00 2 R$ 120,00
Brainheart Agar (Merck) Frasco com 500g R$ 600,00 3 R$ 1.800,00
Soro bovino fetal Frasco com 1 litro R$ 600,00 2 R$ 1.200,00
Microtubos de 1,5 ml Unid. R$ 0,10 1.000 R$ 100,00
Kit extração kiagen para tecidos Kit para 250 peças R$ 2.500,00 1 R$ 2.500,00
Tubos Falcon de 50 ml Unid. R$ 0,55 3.000 R$ 1.650,00
Tampão TBE 1 litro R$ 200,00 3 R$ 600,00
Ponteiras 200 µl Pacote com 1.000 unid. R$ 0,05 30 R$ 1,50
Ponteiras 1000 µl Pacote com 1.000 unid. R$ 0,05 30 R$ 1,50
Ponteiras 10 µl Pacote com 1.000 unid. R$ 0,06 30 R$ 1,80
Ponteiras com filtro e rack 2 a 20 µl Rack com 100 unid. R$ 13,23 30 R$ 396,90
37
Ponteiras com filtro e rack 20 a 200 µl
Rack com 100 unid. R$ 13,23 30 R$ 396,90
Ponterias com filtro e rack de 1000 µl Rack com 100 unid. R$ 30,00 30 R$ 900,00
Rack para microbubos de 1,5 ml Unid. R$ 25,00 20 R$ 500,00
Taq DNA Polimerase Tubo com 500U da enzima R$ 180,00 20 R$ 3.600,00
Marcadores de peso molecular (DNA,100 pares de base)
Tubo com 10 ug de marcador R$ 450,00 2 R$ 900,00
Marcadores de peso molecular (DNA,1 kilobase)
Tubo com 10 ug de marcador R$ 780,00 3 R$ 2.340,00
Dntp Tubo com dATP, dTTP, dGTP, dCTP a 100 mmolar
R$ 550,00 2 R$ 1.100,00
Agarose (500g) Frasco com 500 g R$ 1.400,00 2 R$ 2.800,00
Meio de cultivo Schneider Frasco de 500 mL R$ 270,00 5 R$ 1.350,00
SUBTOTAL REAGENTES E SUPRIMENTOS R$ 51.862,80
TOTAL GERAL R$ 51.862,80
38
ANEXO D: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE Ao assinar este documento, você está concordando em participar de uma pesquisa médica chamada: “AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA TERAPÊUTICA E SEGURANÇA DA FARMACOTERAPIA NA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA.
Este estudo está sendo realizado simultaneamente em quatro locais: Manaus, Corte de Pedra (Bahia), Ribeirão Preto, São Paulo e Brasília na UNB em colaboração com o Patrocinador do mesmo que é o Ministério da Saúde/FINEP.
O objetivo deste estudo é avaliar a eficácia terapêutica e segurança da farmacoterapia na Leishmaniose tegumentar americana dos medicamentos: Antimoniato de meglumina,isotionato de pentamidina ou desoxicolato de anfotericina B. Você será tratado com uma dessas três drogas a ser previamente definida ao acaso.
A leishmaniose cutânea é uma doença que afeta muitas pessoas no Brasil e em outros, países do mundo. Ela é causada por micróbios que são transmitidos por picadas de mosquitos. Os medicamentos atualmente disponíveis para o tratamento são todos a base de injeções e podem apresentar efeitos colaterais, e em certos casos até morte. Se o tratamento funcionar, o benefício que isso representará para você será o tratamento com um medicamento mais eficaz e que parece ser de baixa toxicidade ao invés de uma droga mais tóxica e menos eficaz.
Explicação do Termo de Consentimento
Título do estudo: “Avaliação da eficácia terapêutica e segurança da farmacoterapia na leishmaniose tegumentar americana.”
Investigadores principais: Dra. AnetteChrusciakTalhari e Dr. Sinésio Talhari da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Dr. Paulo Roberto Lima Machado da Universidade Federal da Bahia, Dra. Raimunda Nonata Ribeiro Sampaio e Dra. Eloísa Dutra Caldas da Universidade de Brasília e Dra. Ana Maria Ferreira Roselino da USP – Ribeirão Preto.
39
INFORMAÇÃO SOBRE A PARTICIPAÇÃO. Você foi diagnosticado como tendo leishmaniose cutânea. A leishmaniose cutânea é causada por micróbios que são transmitidos por picadas de uma espécie de um pequeno mosquito, conhecidos popularmente como "asa de palha", "mosquito palha" ou "cangalinha". Os micróbios invadem a pele e provocam feridas (úlceras). O tratamento padrão é feito com um medicamento à base de antimônio (Antimoniato de Meglumina). Embora esta droga seja geralmente eficaz, as atuais desvantagens do tratamento são o tempo prolongado (injeções diárias por pelo menos 21-28 dias), falta de resposta ao tratamento, recaídas e toxicidade cardíaca, hepática e pancreática.
Você foi convidado a participar de uma pesquisa médica. É importante que você entenda os princípios gerais que se seguem e que serão aplicados a todos os participantes deste estudo: (1) Sua participação é totalmente voluntária - você decide se quer participar ou não (2) Você poderá interromper sua participação antes ou em qualquer momento do estudo. Sua recusa em participar não envolverá punição ou perda de seus direitos constituídos. (3) Depois de lidas as explicações, você pode fazer qualquer pergunta necessária para o claro entendimento da natureza do estudo. (4) Se você estiver grávida, não poderá participar deste estudo.
PROCEDIMENTOS A SEREM SEGUIDOS: Se você concordar em participar deste estudo, uma história médica e um exame físico serão realizados. Serão também colhidos sangue, urina e material da lesão de pele para que o diagnóstico de sua doença seja confirmado. Este material será armazenado e poderá ser utilizado em demais projetos de pesquisa realizados na FMT-AM. Estes exames são importantes para sua inclusão no estudo. Se você for do sexo feminino e estiver em idade de procriação, parte de sua amostra de sangue será utilizada para realização de teste de gravidez, dois dias antes do início do estudo. Se você estiver grávida, não poderá participar do estudo. Se você não estiver grávida você poderá participar do estudo desde que concorde em fazer uso de algum método contraceptivo durante e até por 2 meses após o final do tratamento. Neste caso os médicos do estudo irão orientá-la e fornecer o método contraceptivo mais conveniente para o seu caso.
Durante e após o término do tratamento você será examinado por um médico que fará exames em busca de sinais de cura da doença.
Se por acaso você não for curado com o esquema terapêutico inicial, você será tratado mais uma vez com o mesmo medicamento. Neste caso o período em que você permaneceu sendo tratado não deverá apresentar risco adicional ao tratamento da Leishmaniose cutânea, uma vez que a doença é crônica e progride lentamente no decorrer de meses.
Em duas diferentes ocasiões ao longo de 6 meses, serão realizados exame físico para verificar sua resposta ao tratamento. Você deverá voltar para uma consulta médica no primeiro,segundo, quarto e sexto mês após a alta. Isso é necessário para que se tenha certeza de que você ficou curado. Depois da última visita (sexto mês), a sua participação no estudo estará encerrada.
MEDICAÇÃO EM INVESTIGAÇÃO: Os medicamentos em investigação já foram aprovados pelo Ministério da Saúde do Brasil somente para o
40
tratamento da Leishmaniose cutânea.
DURAÇÃO DA SUA PARTICIPAÇÃO: 6 meses
RISCOS, DANOS E DESCONFORTOS. É importante que você saiba que há riscos envolvendo o tratamento de leishmaniose cutânea independente da medicação utilizada. A doença evolui cronicamente e podem ocorrer lesões mucosas após a cicatrização da lesão cutânea.
Os medicamentos atualmente utilizados no tratamento de leishmaniose cutânea, antimoniais (Glucantime) também podem provocar efeitos colaterais inclusive morte. Além do mais, todos têm que ser administrados através de injeções. Nenhum dos tratamentos disponíveis funciona em todos os casos de leishmaniose cutânea. Para que possamos detectar possíveis efeitos colaterais do medicamento e o seu efeito sobre a doença, será preciso coletar sangue antes do início e semanalmente durante as 4 semanas do tratamento. O volume de sangue a ser coletado não causará nenhum efeito adverso. O inconveniente da retirada de sangue é somente uma discreta dor no local da punção.
Outro inconveniente do estudo é que você deverá retomar para uma revisão no primeiro,segundo, quarto e sexto mês após o término do tratamento. Embora isso possa ser difícil para você, estas revisões são importantes para termos certeza que você está realmente curado. Se você for paciente voluntário do sexo feminino é importante saber que existe uma possibilidade do medicamento poder causar danos a um feto em desenvolvimento como, por exemplo, deformidades. Portanto, como foi dito acima, se você for mulher e tiver vida sexual ativa, você deverá evitar filhos durante o tratamento e até por 2 meses após o término do mesmo.
Somente pessoas qualificadas irão administrar medicamentos e colher sangue dos pacientes voluntários desta pesquisa. Eles observarão você cuidadosamente para prevenir qualquer reação e estarão preparados para tratá-lo prontamente, se necessário.
BENEFÍCIOS. Os medicamentos que serão utilizados podem curá-lo da leishmaniose. Entretanto, nós não podemos garantir que isso irá ocorrer em todos os pacientes. Os medicamentos serão administrados por via endovenosa ou intramusucular. Se você ficar curado, você estará contribuindo para esclarecer quais os medicamentos mais eficazes e que produzem menor efeito colateral. Além disso, você estará colaborando em um estudo científico que beneficiará outras pessoas que porventura tenham a mesma doença.
A não ser pelo atendimento médico, você não receberá nenhum benefício financeiro pela sua participação neste estudo. Você também não terá gastos decorrentes de sua participação no estudo.
COMPROMISSO DE CONFIDENCIALlDADE DA IDENTIDADE DO VOLUNTÁRIO. Os registros de sua participação como sujeito do estudo serão mantidos confidenciais. Entretanto, estes registros poderão ser do
41
conhecimento dos representantes da Fundação e Medicina Tropical do Amazonas, Faculdade de Medicina da USP Ribeirão Preto, Universidade Federal da Bahia, Universidade de Brasília, Fundação Nacional de Saúde/Ministério da Saúde (Brasil), como parte daresponsabilidade destes órgãos em acompanhar a pesquisa. Seu nome nunca será usado em nenhum relatório deste estudo.
SUA PARTICIPAÇÃO PODE SER SUSPENSA SEM SUA PERMISSÃO. Sua participação neste estudo poderá ser interrompida se você apresentar condições de saúde que representem riscos para você na opinião dos médicos do estudo. Você não poderá participar deste estudo se estiver grávida. Se você engravidar durante o tratamento sua participação no estudo terá que ser interrompida.
NOVOS ACHADOS SIGNIFICATIVOS. Qualquer informação importante que surgir durante sua participação no estudo e que possa afetar a sua saúde será levada ao seu conhecimento.
NÚMERO DE VOLUNTÁRIOS ENVOLVIDOS NO ESTUDO. 395 pacientes serão admitidos neste estudo.
INDENIZAÇÕES E RESSARCIMENTOS. Caso fique comprovado que você foi prejudicado devido a sua participação no estudo, você terá direito a tratamento médico e à indenização conforme previsto no item V.6 da Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde do Ministério da Saúde sobre pesquisas médicas envolvendo seres humanos que estabelece: "Os sujeitos da pesquisa que vierem a sofrer qualquer tipo de dano previsto ou não no termo de consentimento e resultante de sua participação, além do direito á assistência integral, tem direito à indenização"
PESSOAS E LOCAIS PARA RESPOSTAS A PERGUNTAS E MAIORES INFORMAÇÓES RELACIONADAS COM O ESTUDO. Por favor, entre em contato com uma das pessoas abaixo caso você tenha perguntas relacionadas com esta pesquisa médica:
Em Manaus: Dr. Sinésio Talhari (Tel: 2127-3402 / 3236-9738)
Dra. Anette C. Talhari (Tel: 2127-3428/3429 / 3236-9738)
Dr. Leandro Ourives Neves (Tel: 36568269 / 21273433)
Em Corte de Pedra: Dr. Paulo Machado (71- 3237-7353)
Em Brasília:Dra.RaimundaNonata Ribeiro Sampaio (61- 3438-5535 / 3234-2159 / 2745-9188 )
Em Ribeirão Preto: Dra. Ana Maria Ferreira Roselino (16 3602-2715 )
42
Se os sintomas da doença voltar, por favor, entre em contato com o hospital onde você foi tratado imediatamente, SE VOCE NÃO ENTENDEU ALGUMA PARTE DESTE DOCUMENTO/EXPLICAÇÃO, PERGUNTE AO INVESTIGADOR ANTES DE ASSINAR.
TERMO DE CONSETIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA MENORES
Eu___________________________________, com 18 anos de idade ou mais, detentor de integral
(nome do pai ou responsável)
competência para dar consentimento a ___________________________________________________
(nome do paciente)
faço deste menor, por força deste documento, voluntário para participar no estudo denominado “AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA TERAPÊUTICA E SEGURANÇA DA FARMACOTERAPIA NA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA”.
Compreendo que se minha filha estiver grávida, não poderá participar deste estudo. As implicações de sua participação voluntária, incluindo a natureza, duração e objetivo do estudo, os métodos e meios através dos quais deve ser conduzido e as inconveniências e riscos que podem ser naturalmente esperados foram explicados a mim. Tive a oportunidade de esclarecer outras duvidas que eu tinha a respeito do estudo e obtive resposta para esta dúvidas. Entendo também que em qualquer momento posso revogar meu consentimento e retirar meu filho/filha do estudo sem sofrer nenhuma punição ou perda de direitos. Minha recusa em participar não resultará em punições ou perdas dos benefícios a que ele/ela tem direito. Eu receberei uma cópia da declaração e do documento de consentimento.
__________________________
Nome do voluntário
________________________
Assinatura do Pai ou Responsável
_________________________
Data e hora da assinatura
Eu presenciei a explicação acima descrita, posso confirmar a oportunidade concedida ao voluntário de fazer perguntas e neste documento testemunhar a assinatura do mesmo.
________________________
Nome da testemunha
_________________________
Assinatura
__________________________
Data e hora da assinatura
Declaração do investigador
Expliquei o objetivo deste estudo ao voluntário. No melhor do meu conhecimento, ele entendeu o objetivo, procedimentos, riscos e benefícios deste estudo. Declaro também que o paciente recebeu uma cópia do termo de consentimento.
43
TERMO DE CONSETIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA ADULTOS
Eu__________________________, em pleno gozo das minhas faculdades mentais,
(nome do voluntário)
Com 18 anos de idade ou mais me faço voluntário para participar no estudo denominado “AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA TERAPÊUTICA E SEGURANÇA DA FARMACOTERAPIA NA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA”.
Compreendo que se estiver grávida, não poderei participar deste estudo. As implicações de minha participação voluntária, incluindo a natureza, duração e objetivo do estudo, os métodos e meios através dos quais deve ser conduzido e as inconveniências e riscos que podem ser naturalmente esperados foram explicados a mim. Tive a oportunidade de esclarecer outras duvidas que eu tinha a respeito do estudo e obtive resposta para esta dúvidas. Eu concordo voluntariamente em participar deste estudo. Entendo também que em qualquer momento posso revogar meu consentimento e retirar-me do estudo sem sofrer nenhuma punição ou perda de direitos. Minha recusa em participar não resultará em punições ou perdas dos benefícios a que tenho direito. Eu receberei uma cópia da declaração e do documento de consentimento.
_____________________________Nome do voluntário
__________________________
Assinatura ou impressão digital
_____________________________Data e hora da assinatura
Eu presenciei a explicação acima descrita, posso confirmar a oportunidade concedida ao voluntário de fazer perguntas e neste testemunhar a assinatura do mesmo. Declaro também que o paciente recebeu uma cópia do termo de consentimento.
__________________________
Nome da testemunha
__________________________
Assinatura
__________________________
Data e hora da assinatura
Declaração do investigador
Expliquei o objetivo deste estudo ao voluntário. No melhor do meu conhecimento, ele entendeu o objetivo, procedimentos, riscos e benefícios deste estudo.
__________________________
Nome do investigador
__________________________
Assinatura do investigador
44
ANEXO E: Ficha clínica do participante do estudo Formulário de acompanhamento de caso de LTA
Paciente: _______________________________________________________
Data: ____/____/____
D0
1.Triagem
�Exame direto: �Positivo �Negativo
�Dados clínicos básicos coletados
�Paciente alocado no projeto: �1 �2 �3
�Inclusão / exclusão 1: �Incluído �Excluído
�TCLE assinado
�TTO randomizado: �1 �2 �3
2.Biópsias e sangue para genética
�Biópsia em formol coletada
�Biópsia em Tissuetek coletada
�Biópsia em RPMI coletada
�Sangue para genética coletado
3.Atendimento médico 1
�Forma de LTA identificada: �LC � �Outra:______________________
4.Recolhimento e armazenamento das biópsias
�Biópsia em formol encaminhada à patologia
�Biópsia em Tissuetek colocada no nitrogênio líquido
�Biópsia em RPMI cultivada em LIT/NNN a 25°CD1
45
5.Exames complementares
�Exames anexados ao prontuário em ____/____/____D3
6. Atendimento médico 2: Introdução TTO
� Inclusão / exclusão 2: �Incluído �Excluído
� TTO introduzido: �12 �3
D7-21
7. Avaliação das culturas em LIT/NNN
� Cultura – em ____/____/____ � Cultura + em ____/____/____ � Laudo anexado ao prontuário médico em ____/____/____
� Massa parasitária expandida e congelada 5x em ____/____/____
D50
8. Atendimento médico 3
� Respondeu ao TTO � Não respondeu ao TTO
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ANEXO F: Aprovação do CEP
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ANEXO G(Procedimento Operacional Padrão – POP)
APLICAÇÃO DO TERMO DE CONSENTIMENTO
OBJETIVO:
Garantir a entrada do sujeito na pesquisa, dando início aos procedimentos de
estudo.
Garantir ao sujeito seus direitos como voluntário, e confiabilidade na equipe.
RESPONSÁVEL:
• médico assistente do ambulatório
PRECAUÇÕES:
Ter sempre cópias avulsas do TCLE disponíveis no setor.
Certificar se as cópias do TCLE possuem as páginas corretas.
Além de explicar o TCLE ao sujeito, dar um tempo a ele para ler e se
interar melhor da pesquisa, evitando imprevistos posteriores.
Não iniciar outros procedimentos antes de certificar a assinatura do
sujeito, testemunha e investigador principal. Caso o sujeito seja analfabeto, a assinatura poderá ser digital (polegar
direito).
MATERIAL:
1. Uma cópia avulsa do Termo de Consentimento.
2. Caneta preta.
3. Almofada para carimbo (caso necessário).
PROCEDIMENTO:
1. Fornecer a via avulsa do TCLE para o sujeito.
2. Ler o TCLE, explicando os procedimentos a que será submetido.
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3. Certificar se todas as dúvidas foram sanadas.
4. Caso seja necessário, permitir que o sujeito leia novamente o TCLE.
5. Fornecer as duas vias do TCLE ao paciente, testemunha e principal
investigador para que seja assinada em locais devidos.
6. Fornecer uma via ao sujeito e a outra ficará arquivada no CRF.
COLETA DA BIÓPSIA
OBJETIVO:
Utilizar a mesma metodologia para todos os sujeitos da pesquisa.
MATERIAL NECESSÁRIO:
1- Um frasco com formol tamponado a 10% contendo ± 20ml para uma biópsia
de 3 mm;
2- Um punch 3mm estéril descartável;
3- Anestésico lidocaína 2% sem vasoconstritor;
4- Gazes e material de anti-sepsia;
5- Tesoura ponta curva pequena;
6- Pinça anatômica pequena;
7- Seringa de 1 ou 3ml com agulha 27x8 ou 25x8, e agulha tipo insulina;
8- Gancho com cabo tipo anzol;
9- Pinça dente de rato para sutura;
10- Fio de sutura mononylon 4.0;
11- Gaze e esparadrapo para curativo.
PRECAUÇÕES:
• Verificar existência de materiais para este fim.
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• Escolher para o exame a maior úlcera, procurando-se coletar o material
da borda que mostrar sinais de “atividade” (eritema, infiltração e/ou
edema).
PROCEDIMENTO:
1- Identificar o frasco contendo formol tamponado 10% na etiqueta do próprio
tubo (colocar sempre código e iniciais do paciente).
2- Explicar ao paciente o procedimento.
3- Fazer a assepsia.
4- Fazer anestesia intralesional no local escolhido.
5- Retirar a biópsia com punch na borda da lesão.
6- Evitar comprimir o tecido. Caso necessário, utilize agulhas hipodérmicas
estéreis para facilitar o manuseio.
7- Colocar a biópsia no formol tamponado 10%, imediatamente. 8- Fazer a sutura do local biopsiado, quando necessário.
9- Fazer o curativo oclusivo.
10- Agendar o paciente para retirada de pontos, conforme rotina do serviço,
caso necessário.
11- Preencher formulário de solicitação do exame histopatológico.
12- Enviar para laboratório de histopatologiaaté oito horas após o ato da biópsia.
EXAME HISTOPATOLÓGICO
OBJETIVO:
Utilizar a mesma metodologia para todos os sujeitos da pesquisa.
MATERIAL:
Fragmento de lesão cutânea biopsiada.
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PRECAUÇÕES:
• Verificar existência de materiais para este fim.
• O espécime deve ser cortado ao meio e incluído todo o material.
• As lâminas devem ter 6 cortes de 5 micrômetros.
• Deve-se ter uma lâmina para hematoxilina-eosina e outra pelos métodos
de Fite-Faraco ou Wade-Klingmuller.
• A cada bateria de lâminas é necessária uma lâmina de controle positiva
para BAAR.
PROCEDIMENTOS:
1. Retirar cuidadosamente o espécime do frasco com formol;
2. O espécime deve ser cortado ao meio e incluído todo o material.
EXAME HISTOPATOLÓGICO
Lâminas para exame histopatológico nas colorações de
hematoxilina-eosina (HE)
Descrição dos achados histológicos (leitura microscópica)
Realizado na magnitude de 10, 25 e 40X
Leitura Microscópica (descrever as alterações histológicas
observadas.
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ANEXO H: Tamanho da Amostra
O tamanho da amostra foi calculado para um estudo que utiliza um teste de diferença entre proporção e que considera os Erros Alfa e Beta.
Com uma estimativa de cura para o grupo experimental ................... de 0,8 e para o
grupo controle ....................... de 0,565, com um nível significância de 95% e com um
poder de teste de 80%.
Onde;
• Variância expressa como , em que
• Para o valor de alpha de 0.05, ou seja, um intervalo de confiança de 95%
desejado (teste bicaudal);
• Paa o valor de beta de 0.20, sendo equivalente a 20% de erro beta. Portanto
80% de poder do teste ajustado (monocaudal);
• A diferença a ser detectada ( ) é de 0.3, ou diferença maior, entre o sucesso
(sobrevida) do grupo experimental e do grupo-controle ( i. e., 23,5% de
diferença , pois ; )
A diferença a ser detectada para o experimento pode ser verificada com um
tamanho de amostra de 62 indivíduos em cada grupo. Considerando um estudo
do tipo (2;2;1) e adicionando 20% de perda na amostra, ou seja, dois grupos de
74 e um de 37, totalizando 185 indivíduos estudados.
( )PP −1 68,0=P ( ) 32,01 =− p
96,1=αz
84,0=βz
d
8,0=EP 565,0=CP
( ) ( )( )2
2 1.2.
d
PPZZN
−+= βα
( ) ( )( )
62055,041,3
235,0)32,0).(68,0.(2).84,7(
235,068,0168,0.2.84,096,1
22
2
===−+
=N