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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
COMBINAÇÃO DE DOSE FIXA DE ARTESUNATO-AMODIAQUINA VERSUS CLOROQUINA PARA O TRATAMENTO DE FASE SANGUÍNEA DE INFECÇÃO NÃO-
COMPLICADA DE PLASMODIUM VIVAX: ENSAIO CLÍNICO DE FASE 3 RANDOMIZADO, ABERTO, DE NÃO- INFERIORIDADE
ANDRÉ MACHADO DE SIQUEIRA
MANAUS
2014
ANDRE MACHADO DE SIQUEIRA
COMBINAÇÃO DE DOSE FIXA DE ARTESUNATO-AMODIAQUINA VERSUS CLOROQUINA PARA O TRATAMENTO DE FASE SANGUÍNEA DE INFECÇÃO NÃO-COMPLICADA DE PLASMODIUM VIVAX: ENSAIO
CLÍNICO DE FASE 3 RANDOMIZADO, ABERTO, DE NÃO-INFERIORIDADE
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção grau de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof. Marcus VinÍcius Guimarães de Lacerda
MANAUS
2014
Ficha Catalográfica
S618cSiqueira, André Machado. Combinação de dose fixa de artesunato-amodiaquinaversus
cloroquina para o tratamento de fase sanguínea de infecção não-complicada de Plasmodiumvivax: ensaio clínico de fase 3 randomizado, aberto, de não-inferioridade ./ André Machado de Siqueira-- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2014.
xix,264f. : il. Tese (Doutorado) apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2014.
Orientador: Prof. Dr. Marcus Vinícius Guimarães da Lacerda 1.Malária vivax2. Cloroquina3. Resistência4. Artesunato-
amodiaquinaI. Título. CDU:616.936(043)
Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N Silva,lotada na Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA
FOLHA DE JULGAMENTO
COMBINAÇÃO DE DOSE FIXA DE ARTESUNATO-AMODIAQUINA VERSUS CLOROQUINA PARA O TRATAMENTO DE FASE
SANGUÍNEA DE INFECÇÃO NÃO-COMPLICADA DE PLASMODIUM VIVAX: ENSAIO CLÍNICO DE FASE 3 RANDOMIZADO, ABERTO, DE
NÃO-INFERIORIDADE
ANDRÉ MACHADO DE SIQUEIRA
“Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças
Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-
Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em
convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
______________________________________ Presidente
_____________________________________ Membro
______________________________________ Membro
______________________________________ Membro
______________________________________ Membro
v
DEDICATÓRIA
Às populações que habitam a imensidão da região amazônica, permanecendo longe dos olhos e
interesses de governantes e do restante do Brasil. De nada terá servido este trablaho se os frutos de
seus resultados e, principalmente, o direcionamento da trajetória deste aspirante a pesquisador não
contribuírem para amenizar seu sofrimento e proporcionar-lhes dias mais iluminados e felizes.
vi
AGRADECIMENTOS
Este trabalho não teria sido realizado e concluído não fossem as inúmeras
contribuições diretas e indiretas que o favoreceram, que remontam a períodos longíquos
que culminaram na possibilidade que tão fortuito grupo de pessoas se convergesse para
poder concretizá-lo. Assumo a certeza de que deixarei de mencionar vários personagens
importantes, mas memória e gratidão (ou a falta destas) são suplantadas pela verdade viva
de seus resultados.
Ao professor Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda, que me deu mais
oportunidades do que sempre pude imaginar e ensinamentos infindáveis. Mais do que
orientador, tem sido educador, colega, incentivador, promotor, e, sobretudo e mais
importantemente, amigo. Seu exemplo de racionalidade e determinação em aplicar o
método científico com afinco irrepreensível, justifica a grande admiração que lhe é dirigida
em âmbito local e internacional, porém não sem relativo ônus. Ônus este que é fruto de seu
profissionalismo e rigor, que desviam a atenção de seus impressionantes atributos de
generosidade, sensibilidade e compaixão e dedicação aos mais necessitados.São tantas
as portas abertas que não seria capaz de listá-las.
À professora Maria das Graças Costa Alecrim, diretora da FMT-HVD, por
proprorcionar condições acima das ideais para a realização deste projeto, bem como para
a atuação nesta instituição reconhecida internacionalmente pelo seu comprometimento em
prover assistência de qualidade e evidências científicas para amenizar o sofrimento de
população tão negligenciada.
Ao professor Cleinaldo de Almeida Costa, excelentíssimo reitor da Universidade do
Estado do Amazonas, e professor Darlisom Sousa Ferreira, diretor da Escola Superior de
Ciências da Saúde da UEA, pela manutenção e em lutar para melhoria desta importante
vii
instituição, a que tanto me afeiçoei e onde tive a oportunidade fabulosa de atuar como
professor. Também por manter o apoio ao Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical.
Ao PPGMT-UEA, na pessoa das profa. Maria das Graças Barbosa Guerra, por
propiciar todas as condições para o desenvolvimento deste doutorado. A ConceiçãoTufic e
Altariza Freitas pela disponibilidade em ajudar e tornar sempre o caminho menos sinuoso.
Ao professor Carlos Médicis Morel e à equipe do INCT em Doenças Negligenciadas,
pela oportunidade de realização do Masters em Epidemiologia na London School of
Hygiene & Tropical Medicne, onde importantes conhecimentos e habilidades para a
condução deste projeto e minha formação foram obtidos.
Aos Professores Pedro Alonso e Quique Bassat, pelo acolhimento durante dois
períodos no CRESIB, em Barcelona, onde pude vivenciar o cotidiando de um grupo de
imenso destque no cenário da saúde global.
À equipe de professores de DIP da UEA, pelo companheirismo, compreensão e
ensinamentos na convivência.
À Maria Paula Gomes Mourão, pela amizade e pela sensibilidade excepcional,
sempre atenta e companheira em qualquer situação.
Ao Marcelo Cordeiro dos Santos, um dos melhores infectologistas que habita este
planeta, pela amizade, bom-humor e companheirismo.
À Romina do Socorro Marques de Oliveira, Marilú Barbieri Victoria, Lucilaide Oliveira
dos Santos e Iran Mendonça da Silva, pelo exemplo e esmeiro de educadores e médicos
excepcionais.
Ao professor Hernando del Portillo, pela acolhida em seu laboratório e pela
agradabilíssima experiência de redação conjunta de estudo do baço de paciente com
malária não-tratada.
viii
Ao professor Cláudio Daniel Tadeu-Ribeiro, pelas conversas e ensinamentos e pela
oportunidade de participar do Seminário Laveran & Deane, no início desta caminhada,
além da coordenação deste projeto.
Ao professor José Maria de Souza e professora Valéria Rolla, pelas contribuições ao
melhoramento deste estudo dadas na qualificação.
À Aline Cristiane de Alencar, grande médica, amiga e uma das pessoas mais
fantásticas que conheci, por além de compartilhar os atendimentos médicos neste projeto,
contagiar a todos com seu alto-astral e bom humor.
À Belisa Maria Lopes Magalhães, com quem tive o prazer de conviver intensamente
durante o início da instalação da enfermaria de pesquisa clínica e posteriormente no
doutorado, pelo exemplo ético e convivência fraterna, bem como pela condução dos
trâmites de aprovação ética deste projeto.
À Gisely Cardoso de Melo, com quem aprendi muito sobre determinação e foco,
demonstrando como o tempo é o grande catalizador de sabedoria e aperfeiçoamento.
À Monica Regina Costa Manso, por além de manter e administrar a Gerência de
Malária com grande competência, por ter tido papel fundamental na organização dos
procedimentos laboratoriais deste projeto.
À Andrea Kühn e Omaira Vera Lizcano, pela realização e contribuição na
genotipagem dos parasitos para este estudo.
À Márcia de Araújo de Almeida Alexandre, pela calma e por sempre estar disponível
para ajudar com suas palavras meigas.
Ao Wellington Pinto da Silva, por ser o grande recrutador e responsável pela
manutenção dos pacientes no estudo, além de grande amigo e fotógrafo entusiasta.
ix
À Maria Raimunda Costa, a Raimundinha, grande revelação do projeto, pelo
profissionalismo exemplar, candura no trato com todos, grande fonte de inspiração e
incentivo.
Ao Kim Machado, pela serenidade e profissionalismo, além dos agradáveis diálogos.
Ao Aristóteles Alencar, pelo grande exemplo profissional e humanístico, contribuindo
imensamente com a leitura dos eletrocardiogramas.
À Flávia Regina Moura de Lima, pela gentileza e profissionalismo constantes,
sempre a serviço de executar o trabalho com esmero destacável, essencial para
manutenção dos participantes.
Ao Wuelton Marcelo Monteiro, pela amizade, postura irrepreensivel, caráter
impecável e amizade.
À Marly Marques, pela expertise em HPLC e por realizar as dosagens de cloroquina
na Universidade Federal do Pará e por tantos almoços agradáveis.
Ao professor José Luiz Vieira, a Universidade Federal do Pará, pela contribuição nas
reações de dosagem das drogas, inestimáveis para este estudo.
À professora Ingrid Felger, do Swiss Tropical and Public Health Institute, pela
cessão do laboratório e auxílio na realização dos procedimentos moleculares.
Ao Elcimar Cavalcante Neves Júnior, Paula Vincentin e Eckner Falcão pela
competência na adminsitração do projeto, prestatividade em todas as funções e amizade.
À toda equipe de técnicos da Gerência de Malária pela competência e disposição
para o trabalho, diretamente ao seu Eckner, Vanessa e Aldo pela leitura das lâminas e
Mauro Coelho, por todo auxílio na retenção dos pacientes.
x
Ao professor. Pedro Luis Tauil, pelo exemplo de serenidade e compromisso com a
saúde pública e por ter despertado a paixão pela epidemiologia aplicada às doenças
infecciosas.
Ao professor Carlos Eduardo Tosta da Silva, pela amizade, pela disciplina de
imunologia que considero um marco na minha formação, por ter ampliado o campo de
visão a dimensões muito além das preconizadas no curso e pelas inúmeras oportunidades
de diálogo e reflexão para atuação holística.
Ao professor Luiz Fernando Junqueira Junior, pela orientação na iniciação científica
e pelas conversas edificadoras nas quais muito aprendi por exemplo de como me portar
como cientista.
A meus supervisores na residência no Hospital das Clínicas da FMUSP, na pessoa
da professora Maria Aparecida Shikanai-Yasuda, da professora Marta Heloisa Lopes, Ana
Catarina Santos e Melissa Maschereti, pelas oportunidades, ensinamentos e experiência
para que torna-se um médico infectologista bem formado.
Aos colegas de residência, Hermes Riyoti Higashino, Silvia Vidal Campos, Alan
Neves, Felipe Tuon, Andre Machado Luiz, Luciana Campos, Ralcyon Francis Teixeira da
Cruz, Juliana Yamashiro, Maria Esther Graf e Margareth Vicentine, pelo companheirismo
nos momentos nem sempre suaves da residência e exemplos de profissionais competentes
e comprometidos.
À Dra Silvia Vidal Campos, por me apontar os caminhos que viria a seguir neste
empenho de tornar-me um médico tropicalista com as habilidades e conhecimentos
necessários.
À Sheila Vitor-Silva, Roberto Reyes-Lecca, seu Jubal, e toda a equipe do projeto no
Careiro, pela agradável experiência de atividade de campo naquela comunidade tão
afeiçoável.
xi
Aos colegas do CIPCLIM, Silvana Gomes Benzecry, Vanderson de Souza Sampaio,
Siuellen Rocha, Fernando Val, Raquel Tapajós, Anne Cristine Gomes de Almeida, Marcelo
Augusto Mota Brito, Keillen Monick Martins Campos, Larissa Wanderley Brasil e Raimunda
Ericilda, pelas discussões sempre proveitosas
À Helena Coelho, pela amizade e serenidade e por sempre manter o bom-humor e
atitude positiva.
À Camila Botto Menezes, pela amizade e exemplo profissional, com discussões
sempre engrandeçedoras.
Aos muitos colegas e parceiros que tive o prazer de conhecer e trabalhar durante
estes anos, ampliando a rede de contribuições e partilhando dos meus objetivos e ideais,
especialmente ao professor Fábio Costa, Letusa Albrecht e Stefanie Lopes.
Ao seu Nelson Fé e a Gerência de Entomologia pelo conhecimento impressionante
sobre os vetores da região e ensinamentos mais que proveitosos.
Aos motoristas da FMT-HVD, mencionado aqui Diogo, Assis e Elcimar, pelo
transportes sempre atencioso e cuidado e a convivência agradável.
À equipe da DENPE, Wal Fernandes, Eduardo Jorge Serrão, dona Esmeralda e
dona Cleonice, por sempre proporcionarem o caminho mais suave para a realização dos
trabalhos, sempre com serenidade e gentileza formidáveis,além claro, das pausas para o
café.
À equipe do ambulatório da FMT-HVD, na pessoa da enfermeira Almada e do
senhor Jonas, dando plenas condições para o exercício das atividades de assistência no
setor.
Aos médicos que tive o prazer de conviver e admirar inicialmente como estudante no
ano de 2003 e depois tornar-me colega e muito aprender com seus exemplos, Jorge
xii
Guerra, Flor Ernestina Martinez Espinosa, Franklin Santana, Mauricio Borborema,.Silvio
Fragoso e Antonio Magela.
Aos colegas dos anos de estudante, pela companhia na prazerosa trajetória para o
amudericmento e desenvolvimento humanístico e profissional nos espaços formais e
informais, incluindo a particiapação no movimento estudantil, que possibilitou a ampliação
da visão e compromisso social com esta área, nos quais menciono, Fabiano Alves Gomes,
Bruno Guedes, Lívia Vanessa Ribeiro Gomes, Maria Helena Oliveira, Giliate Cardoso
Coelho e Jerzey Timoteo Ribeiro dos Santos.
Às minhas alunas de iniciação científica Elyana Almeida e Lisiane Risia, pelo
entusiasmo e oportunidade de perceber a necessidade de aprimorar a habilidade de
transmitir o conhecimentos e auxiliar o desenvolvimento de potenciais pesquisadoras.
Aos alunos e residentes com quem tive o prazer de conviver e aprender neste
período, sempre com questionamentos e ânsia de aprendizado e aplicação do
conhecimento.
Aos diversos colegas e mestres que compartilham o compromisso com a medicina
tropical e cujas discussões são sempre engradecedoras, Julio Croda, Gustavo Romero,
João Barberino, entre tantos outros.
Ao Programa Nacional de Controle da Malária, mencionando a Dra Ana Carolina
Santelli, pela oportunidade de contribuir ao combate desta doença no país.
À Sanofi-Aventis, por financiar e possibilitar este trabalho.
Aos meus irmãos, Tiago Machado de Siqueira e Marilia Machado de Siqueira
Camelo, pelo companheirismo e amizades incondicionais e compartilhamento de princípios
e afetos. E às minhas sobrinhas, Gabriela Siqueira Camelo e Daniela Siqueira Camelo,
pela profusão de alegria e beleza que irradiam a cada dia mais.Aos meus avós e tios, pelos
exemplos e base moral.
xiii
À minha esposa, Juliana Montibeller Furtado e Silva, pelo companheirismo
constante, que transcende qualquer barreira física, afeto incondicional e exemplo ético e
moral de quem eu considero a melhor médica que conheço. Sua determinação é
inspiradora e motivadora. Obrigado por sempre ser inspiração e força para buscar o
caminho.
Aos meus pais, Antonio Rodrigues de Siqueira Neto e Maria Montserrat Loureiro
Machado de Siqueira, por todo o apoio e dedicação que sempre tiveram em todos os
aspectos da minha formação e por me educarem e disciplinarem com tanto cuidado e
afeto. Não obstante a situação sempre me senti apoiado e ao mirar seus exemplos sempre
tive a melhor indicação de como agir da forma mais correta. Não chegaria a nenhum lugar
sem seu auxílio incondicional e o exemplo mais que de profissionais respeitados, de seres
humanos fabulosos.
xiv
AGRADECIMENTO ÀS AGÊNCIAS FINANCIADORAS
À FAPEAM, CAPES e CNPq, por financiar a pesquisa na instituição e PPGMT,
possibilitando o desenvoviemento científico e tecnológico local.
xv
EPÍGRAFE
“Quando escrevo, repito o que já vivi antes. E para estas duas vidas, um léxico só não é suficiente. Em outras palavras, gostaria de ser um crocodilo
vivendo no rio São Francisco. Gostaria de ser um crocodilo porque amo grandes rios, pois são profundos como a alma de um homem. Na superfície são muitos vivazes e claros, mas nas profundezas são tranquilos e escuros
como o sofrimento dos homens.“
João Guimarães Rosa
‘No hay problemas pequeños. Los problemas que aparecen pequeños són grandes problemas que no se entienden”
Santiago Ramon y Cajal
“Mas eles ainda não tremem: frio mesmo frio vai ser d'aqui a pouco. ...
- Ei, Primo, aí vem ela...
- Danada!...
- Olh'ele aí... o friozinho nas costas...
E a maleita é a 'danada' ...
- Está custando, Primo Argemiro...
- É do remédio... Um dia ele ainda há-de dar conta da danada!... ...
Mas eles estão esperando é a febre, mais o tremor.”
João Guimarães Rosa
xvi
RESUMO Introdução. Com o aumento nos níveis de resistência do Plasmodium vivax à cloroquina
(CQ) em diferentes partes do mundo é fundamental estudar novas alternativas terapêuticas
para combater este parasito. Não há estudos publicados comparando a utilização de ACTs
com CQ contra P. vivax na América Latina, onde esta espécie predomina, como ainda não
houve avaliação de artesunato-amodiaquina (ASAQ) com CQ. Objetivo. O objetivo deste
estudo foi avaliar a eficácia, segurança e tolerabilidade da combinação em dose-fixa de
ASAQ em comparação com CQ para o tratamento de monoinfecção por P. vivax na cidade
de Manaus. Métodos Ensaio clínico de fase 3, randomizado, aberto, de não-inferioridade.
O desfecho primário foi a resposta clínica e parasitológica (ACPR) após 28 dias de
seguimento corrigida por PCR, sendo desfechos secundários a resposta terapêutica após
14, 28 e 42 dias com e sem correção, além de desfecho relacionados a presença de
gametócitos e parâmetros de segurança.Resultados. Durante janeiro de 2012 e maio de
2013, foram incluídos 380 pacientes (190 CQ; 189 ASAQ - uma exclusão por infecção
mista). Considerando a população por protocolo, foi observada superioridade de ASAQ na
prevenção de recorrências parasitárias até D28 (ASAQ =100% vs CQ=93.6%; p=0.002) e
D42 (ASAQ=97.4% vs CQ=77.7%; p<0.001), além de mais rápido clareamento parasitário
e diminuição do carreamento de gametócitos (p<0.001, ambas análises). CQ apresentou
melhor recuperação hematológica (p<0.001). Houve proporções semelhantes de pacientes
apresentando eventos adversos (EAs) nos dois grupos (ASAQ=41.6% vs CQ=44.7%).
Nenhum paciente no braço CQ apresentou EA sério versus 3 pacientes no grupo ASAQ
requerendo internação por vômitos. Não houve mortes. Correlacionados com dosagens
séricas de CQ e desetil-CQ, estimou-se a prevalência de resistência à CQ em 11.2%
(IC95%=7.1-16.6). Conclusão. Foi observada alta eficácia do ASAQ para o tratamento de
P. vivax na região do estudo. Protocolos comparativos com seguimento prolongado podem
fornecer estimativas mais precisas de resistência à CQ. Deve-se avaliar os benefícios de
substituição da CQ do ponto de vista de tratamento e controle desta infecção.
Palavras Chaves: Plasmodium vivax, cloroquina, artesunato, amodiaquina, ensaio clínico, resistência.
xvii
ABSTRACT
Background. The evidence of increasing Plasmodium vivax resistance to chloroquine (CQ)
in distinct endemic regions makes it essential to evaluate suitable alternatives to treat this
parasite. There are no published studies comparing ACTs to chloroquine for P. vivax
treatment in Latin America, where this parasite in predominant, as there are no studies
comparing the vastly used combination artesunate-amodiaquine (ASAQ) to CQ. Aim. The
aim of this study was to evaluate the efficacy, safety and tolerability of the fixed-dose
combination of ASAQ to that of CQ against uncomplicated P. vivax monoinfection in
Manaus, Brazil. Methods. This was a phase 3 randomized, open-label, non-inferiority
clinical trial; The primary endpoint was the PCR-corrected adequate parasitological and
clinical response (ACPR) rates at day 28 of follow-up, with the secondary endpoints of
therapeutical response at days 14 , 28 and 42, with and without PCR correction,
gametocyte carriage and safety and tolerability parameters. Results. From January 2012
and May 2013 380 patients were enrolled (190 in CQ, 189 in ASAQ – one excluded due to
mixed infection). Considering the per protocol population, ASAQ presented superuir efficacy
at preventing parasite recurrences at D28 (ASAQ =100% vs CQ=93.6%; p=0.002) and D42
(ASAQ=97.4% vs CQ=77.7%; p<0.001), as also did in promoting faster parasitemia
clearance and reducing gametocyte carriage (p<0.001 for both analyses). CQ presented
superior haematological recovery (p<0.001). Similar proportion of patients form both arms
presented adverse events (AEs) (ASAQ=41.6% vs CQ=44.7%). No patients in the CQ
group presented serioes AEs, while three in the ASAQ arm required hospital admission due
to vomiting. There were no deaths. Considering the CQ and desetyl-CQ blood level
measurements, the CQ resistance in the study population was of 11. 2% (95%CI=7.1-16.6).
Conclusion. High efficacy of ASAQ for the treatment of P. vivax was observed.
Comparative studies with longer follow-up period may have the capacity to provide more
accurate estimates of chloroquine resistance.The benefits of substituting CQ as first-line of
therapy must be considered from the treatment and transmission control points of view.
Keywords: Plasmodium vivax, chloroquine, artesunate, amodiaquine, clinical trial, resistance.
xviii
RESUMO LEIGO
A malária é uma doença infecciosa transmitida por mosquitos, havendo cinco diferente
espécies de parasitos do gênero plasmódio que podem causar doença em humanos. No
Brasil, onde mais que 99% da malária é transmitidida na região amazônica, a espécie que
predomina é o Plasmodium vivax. Recentemente, tem sido observado um aumento na
resistência deste parasito à seu tratamento habitual, baseado pelos últimos 60 anos no
uso da cloroquina (CQ). Tal fato leva à necessidade de avaliação de alternativas para o
tratamento da malária na região. Foi realizado estudo comparando o uso de uma
combinação de artesunato com amodiaquina (ASAQ) com a CQ para o tratamento de
malária vivax em Manaus. Foram incluídos 380 pacientes designados aleatoriamente para
cada grupo (190 por tratamento), que receberam tratamento supervisionado de acordo
com o peso. Observou-se que o ASAQ foi mais efetivo na prevenção de novos episódios
de malária vivax no período de 42 dias. A resistência à CQ foi estimada em 11%. Não
houve diferença entre os grupos na ocorrência de eventos adversos. Conclui-se que o
ASAQ é uma alternativa eficaz para malária vivax e que as autoridades devem discutir
qual a melhor opção para o tratamento desta doença.
xix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ilustração do ciclo biológico de desenvolvimento do plasmódio em humanos. ..... 6
Figura 2 - Ilustração esquemática do paroxismo malárico (adaptado de Kitchen & Puttnam: J Natl Malaria Soc 1946;5:57–78). ......................................................................................... 7
Figura 3 - Relação entre o ciclo biológico do parasita e os paroxismos febris da malária (modificado de Neva and Brown, Basic Clinical Parasitology, 6ª ed., 1994). ......................... 8
Figura 4 Espectro clínico relacionado à exposição ao parasito em área de alta transmissão de malária (extraído da referência (29))............................................................................... 10
Figura 5 - Limites de transmissão de P. falciparum no ano de 2010 (fonte: (44)). ............... 11
Figura 6- Limites de transmissão de P. vivax no ano de 2010 (fonte: (45)). ........................ 12
Figura 7 - Mapa da América Latina destacando a área da Amazônia brasileira, onde ocorre a transmissão de malária e as três cidades com maior incidências de malária. .................. 14
Figura 8- Número absoluto total e por espécie de casos no Brasil no período entre 1961-2011 (Fonte: SIVEP). ........................................................................................................... 16
Figura 9 - Mapas ilustrando a transmissão da malária na região amazônica. API = Incidência Parasitária Anual (número de episódios/1000 pessoas-ano) (SIVEP). ............... 18
Figura 10- Risco de recorrência de P. vivax de acordo com a meia-vida de eliminação da droga esquizonticida (preta: curta; cinza escura: intermediária; cinza clara: longa). ........... 26
Figura 11 - Diagrama esquemático das visitas e respectivos procedimentos realizados no estudo. ................................................................................................................................. 42
xx
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Diferenças no ciclo biológico das diferentes espécies
causando malária humana.....................................................
3
Tabela 2: Características da cloroquina e das formulações de ACTs
atualmente disponíveis...........................................................
25
Tabela 3: Descrição de ensaios clínicos comparativos avaliando o uso
de ACTs para tratamento de malária vivax...............................
32
Tabela 4: Esquemas de tratamento de Artesunato-Amodiaquina
(ASAQ) e de Cloroquina a serem utilizados no estudo
conforme o peso do paciente...................................................
40
Tabela 5: Sumário da distribuição das visitas e respectivos
procedimentos realizados.........................................................
45
Tabela 6: Características dos marcadores genéticos polimórficos
escolhidos para análise de genotipagem................................. 48
Tabela 7: Composição da reação primária PCR para na FMT-HVD e
STPH........................................................................................ 49
Tabela 8: Condições de ciclagem para PCR primária aplicadas na
FMT-HVD e STPH.................................................................... 50
Tabela 9: Composição da reação de PCR aninhada para FMT-HVD e
STPH realizada como reação simplex para cada marcador
genético....................................................................................
50
Tabela 10: Condições de ciclagem da PCR aninhada aplicadas............... 50
Tabela 11: Sequências dos iniciadores utilizados nas reações de PCR
primárias e aninhadas.............................................................. 51
xxi
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
µL Microlitro
ACPR Resposta clínica e parasitológica adequada (adequate
clinical and parasitological response)
ACT Terapia combinada com derivados de artemisinina
(Artemisinin-based Combination Therapy)
AM Estado do Amazonas
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOR Razão de chances ajustada (adjusted odds ratio)
API Incidência Parasitária Anual (Annual Parasite Incidence)
ART-LUM Artemeter-lumefantrina
ASAQ Artesunato-Amodiaquina
AS-PIR Artesunato-pironaridina
AS-SP Artesunato-sulfadoxina-pirimetamina
ASMQ Artesunato-Mefloquina
AUC Area sob a curva (area under the curve)
BPC Boas Práticas Clínicas
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino
Superior
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico
CONEP Conselho Nacional de Ética em Pesquisa
CQ Cloroquina
CRF Formulário de relato de caso (clinical report form)
xxii
CYP-450 Citocromo P450
DCQ Desetilcloroquina
dH2O Água destilada
DHAP Dihidroartemisinina-piperaquina
DNA Ácido desoxirribonucleico Deoxyribonucleic acid
DNDi Drugs for Neglected Diseases initative
DOI identificador de objeto digital (digital object identifier)
DSAQ Desetilamodiaquina
DSCQ Desetilcloroquina
EA Evento adverso
EAS Evento adverso sério
EASI Evento adverso de interesse especial
ECG Eletrocardiograma
ETF Falha terapêutica precoce (early treatment failure)
FAPEAM Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas
FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado
G6PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GEE Equação de estimação generalizada (generalized estimating
equation)
HPLC Cromatografia liquida de alta performance (high-performance
liquid chromatography)
IC / CI intervalo de confiança (confidence inteval)
ITT intenção de tratamento (intention-to-treat)
kg Quilograma
xxiii
L Litro
LCF falha clínica tardia (late clinical failure)
LPF falha parasitologica tardia (late parasitological failure)
mg Miligrama
mL Mililitro
MMV Medicines for Malaria Venture
MPC Concentração Parasiticida Mínima (minimum parasiticidal
concentration)
MS2 Microsatélite 2 de P. vivax
MS8 Microsatélite 8 de P. vivax
Msp1F3 Microsatélite 21, bloco 10 de P. vivax
ng Nanograma
OMS / WHO Organização Mundial de Saúde / World Health Organization
OR razão de chances (odds ratio)
P. falciparum Plasmodium falciparum
P. knowlesi Plasmodium knowlesi
P. malariae Plasmodium malariae
P. ovale Plasmodium ovale
P. vivax Plasmodium vivax
pb Pares de bases
PCR Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain
Reaction)
PICM Plano de Intensificação do Controle da Malária
POP Procedimento Operacional Padrão
xxiv
PNCM Programa Nacional de Controle da Malária
PP por protocolo (per protocol)
PQ Primaquina
QT Intervalo QT
QTc Intervalo QT corrigido
RDT Teste diagnóstico rápido Rapid diagnostic test
RRR Taxa de Redução Parasitária (Parasite Reduction Rate)
SIVEP Sistema de Informação em Vigilância Epidemiológica
STPH Swiss Tropical Medicine Institute
SUS Sistema Único de Saúde
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
UEA Universidade do Estado do Amazonas
VIH Vírus da imunodeficiência humana
xxv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
1.1. MALÁRIA .................................................................................................................... 1 1.1.1. DOENÇA CAUSADA PELO PLASMODIUM .................................................................. 1 1.1.2. CICLO BIOLÓGICO DO PLASMÓDIO ......................................................................... 2 1.1.3. ESPECTRO CLÍNICO DA INFECÇÃO PLASMODIAL ...................................................... 6
1.2. A DIMENSÃO MUNDIAL DA MALÁRIA ............................................................................ 10 1.3. EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA NO BRASIL .................................................................... 13
1.3.1. DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO ............................................................................. 18 1.4. MALÁRIA POR PLASMODIUM VIVAX ............................................................................. 20 1.5. PRINCÍPIOS DE TERAPÊUTICA ANTIMALÁRICA ............................................................... 23 1.6. TRATAMENTO DA MALÁRIA VIVAX ............................................................................... 25
1.6.1. CLOROQUINA E DESENVOLVIMENTO DE RESISTÊNCIA ............................................. 27 1.7. ACTS PARA MALÁRIA VIVAX ...................................................................................... 30 1.8. COMBINAÇÃO ARTESUNATO-AMODIAQUINA (ASAQ) .................................................... 34 1.9. JUSTIFICATIVA .......................................................................................................... 35
2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 36
2.1. OBJETIVO PRIMÁRIO ................................................................................................. 36 2.2. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS ......................................................................................... 36
3. MÉTODOS .................................................................................................................... 37
3.1. LOCAL DE ESTUDO .................................................................................................... 37 3.2. DESCRIÇÃO DO ESTUDO ............................................................................................ 37 3.3. PACIENTES ............................................................................................................... 37
3.3.1. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ..................................................................................... 38 3.3.2. CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO .................................................................................... 38 3.3.3. CÁLCULO DO TAMANHO DA AMOSTRA .................................................................. 39
3.4. TRATAMENTOS ......................................................................................................... 39 3.5. PROCEDIMENTOS DO ESTUDO .................................................................................... 40
3.5.1. RECRUTAMENTO E ALOCAÇÃO DO TRATAMENTO ................................................... 40 3.5.2. PROCEDIMENTOS DE SEGUIMENTO ....................................................................... 41
3.6. PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS .............................................................................. 46 3.6.1. MICROSCOPIA .................................................................................................... 46 3.6.2. MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR (PCR): ........................................................ 47 3.6.3. EXAMES DE HEMATOLOGIA E BIOQUÍMICA ............................................................. 52 3.6.4. DOSAGEM DOS NÍVEIS SÉRICOS DAS DROGAS EM ESTUDO ...................................... 52
3.7. COLETA E REGISTRO DAS INFORMAÇÕES .................................................................... 53 3.8. DEFINIÇÕES DOS DESFECHOS ANALISADOS ................................................................. 53
3.8.1. VARIÁVEIS DE EFICÁCIA ...................................................................................... 53
xxvi
3.8.2. VARIÁVEIS DE SEGURANÇA .................................................................................. 54 3.8.3. RESISTÊNCIA À CLOROQUINA............................................................................... 55
ENTRE PACIENTES NO GRUPO DE CLOROQUINA, AMOSTRA FOI CLASSIFICADA COMO RESISTENTE
A CLOROQUINA CASO NO MOMENTO DA DETECÇÃO DA RECORRÊNCIA PARASITÁRIA A SOMA DOS
NÍVEIS SÉRICOS DE CQ/DCQ ESTIVESSE ACIMA DE 100NG/ML, COMO PREVIAMENTE DESCRITO
(68, 137). PARA DETECTAR PREVALÊNCIA DE RESISTÊNCIA DE 10%, COM 80% DE PODER E
PRECISÃO DE 6,5% NO IC95% FOI CALCULADA A NECESSIDADE DE ACOMPANHAR 190
PACIENTES NO BRAÇO DE CLOROQUINA. ............................................................................... 55 3.9. SEGURANÇA ............................................................................................................. 55
3.9.1. TOLERABILIDADE CLÍNICA ................................................................................... 55 3.9.2. TOLERABILIDADE PARACLÍNICA ........................................................................... 55 3.9.3. TOLERABILIDADE BIOLÓGICA ............................................................................... 55 3.9.4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA............................................................................... 56 3.9.5. MONITORAMENTO DOS EVENTOS ADVERSOS ........................................................ 56 3.9.6. DEFINIÇÕES DE EVENTO ADVERSO (EA) E EVENTO ADVERSO SÉRIO (EAS) ........... 56
3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................ 57 3.11. MONITORIA E ANÁLISE DE ÍNTERIM .............................................................................. 59 3.12. ASPECTOS ÉTICOS ................................................................................................. 60 3.13. ESTUDOS COMPLEMENTARES ................................................................................. 61
4. RESULTADOS.............................................................................................................. 62
4.1. ARTIGO 1 ................................................................................................................. 62 4.1.1. FIXED-DOSE ARTESUNATE-AMODIAQUINE COMBINATION VERSUS CHLOROQUINE FOR
TREATMENT OF UNCOMPLICATED BLOOD-STAGE P. VIVAX INFECTION IN THE BRAZILIAN
AMAZON: A RANDOMIZED, OPEN-LABEL, PHASE 3, NON-INFERIORITY TRIAL ...................... 62 4.2. ARTIGO 2 ............................................................................................................... 112
4.2.1. SLOW CLEARANCE OF PLASMODIUM VIVAX WITH CHLOROQUINE AMONGST CHILDREN
BELOW SIX MONTHS OF AGE IN THE BRAZILIAN AMAZON ................................................... 112 4.3. ARTIGO 3 ............................................................................................................... 120
4.3.1. PREVALENCE AND RISK FACTORS ASSOCIATED TO PRURITUS IN PLASMODIUM VIVAX
PATIENTS USING CHLOROQUINE IN THE BRAZILIAN AMAZON .............................................. 120 4.4. ARTIGO 4 ............................................................................................................... 126
4.4.1 INFLUENCE OF AGE ON THE HAEMOGLOBIN CONCENTRATION OF MALARIA-INFECTED
PATIENTS IN A REFERENCE CENTRE IN THE BRAZILIAN AMAZON ......................................... 127 4.5. ARTIGO 5 ............................................................................................................... 136
4.5.1. CHARACTERIZATION OF PLASMODIUM VIVAX-ASSOCIATED ADMISSIONS TO
REFERENCE HOSPITALS IN BRAZIL AND INDIA: IS SEVERE DISEASE THE SAME EVERYWHERE? 136
4.6. ARTIGO 6 ............................................................................................................... 176 4.6.1. SPLEEN RUPTURE IN A CASE OF UNTREATED PLASMODIUM VIVAX INFECTION ......... 177
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................... 186
5.1. AVALIAÇÃO DE ALTERNATIVAS TERAPÊUTICAS PARA P. VIVAX .................................... 186 5.2. SIGNIFICÂNCIA PARA A SAÚDE PÚBLICA .................................................................... 192
xxvii
5.3. PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 195
6. REFERÊNCIAS........................................................................................................... 197
ANEXOS ............................................................................................................................ 232
ANEXO A: DOCUMENTO RELACIONADO À AVALIAÇÃO DE CRITÉRIOS PRIMÁRIOS DE EFICÁCIA .. 233 ANEXO B: DIRETRIZES PARA A GRADUAÇÃO DE ACHADOS EM EXAMES FÍSICOS ..................... 234 ANEXO C: NORMAS PARA A GRADUAÇÃO DE RESULTADOS LABORATORIAIS: ......................... 238 ANEXO D: CRITÉRIOS PARA A MALÁRIA GRAVE (OMS, 2010) ............................................. 242 ANEXO E: TERMOS DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ............................................ 242
1. TCLE PAR ADULTOS ............................................................................................... 242 2. TCLE PARA CRIANÇAS ............................................................................................ 250
ANEXO F: CARTA DE APROVAÇÃO FINAL DO PROJETO NO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ...... 261 ANEXO G: APROVAÇÃO DE PROJETO NA ANVISA .............................................................. 263 ANEXO H: POP DE PREPARO E LEITURA DE LÂMINAS PARA DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA E
QUANTIFICAÇÃO DE PARASITEMIA ....................................................................................... 265 ANEXO I: POP DE ESTUDOS MOLECULARES ........................................................................ 274 ANEXO J: LISTA DE PRODUÇÃO ESCRITA DURANTE O PERÍODO ............................................. 279
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. MALÁRIA
1.1.1. DOENÇA CAUSADA PELO PLASMODIUM
A malária, causada por parasitos do gênero Plasmodium e transmitida por
mosquitos do gênero Anopheles, é considerada a doença parasitária mais importante no
mundo. A descrição desta enfermidade, caracterizada pelo padrão de febre intermitente,
é extremamente antiga, com relatos de sua ocorrência descritos desde o século VI A.C.
(1, 2) e com importantes relatos no Ocidente tendo sido realizados por Hipócrates na
Grécia antiga (1, 3, 4). Com o advento de instrumentos que viabilizassem a microscopia
e com a presença de pigmentos no sangue de indivíduos sofrendo desta enfermidade
sendo observados por proeminentes pesquisadores como Meckel, Virchow e Frerichs
(4), o médico francês Charles Alphonse Laveran foi o primeiro a descobrir e descrever o
agente causador desta doença em 1893 (5, 6). Em 1897 Ronald Ross fez a importante
descoberta da transmissão da malária por mosquitos do gênero Anopheles por Ronald
Ross (7). A estas fundamentais descobertas seguiu-se grande número de importantes
novos achados, como a descrição das diferentes espécies causando infecção em
humanos e animais, da presença de estágio hepático no ciclo do parasito e de
mecanismos fisiopatogênicos do parasito, entre outros (2, 6).
Atualmente reconhece-se a existência de quatro espécies causadoras de malária
entre humanos: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale e P. malariae (8).
Recentemente, tem sido descrito um aumento no número de casos causados pelo
2
parasito de macacos P. knowlesi no sudeste asiático. (9), ainda classificada como
zoonose pela ainda não comprovação de manutenção da transmissão sem a presença
de primatas não-humanos. Diversas outras espécies de Plasmodium com
especificidades de infectar animais são conhecidas, cujo estudo em modelos
experimentais desde em aves até roedores e primatas não humanos, tem prestado
grande contribuição ao entendimento da biologia e imunopatogenia da malária (10-12).
1.1.2. CICLO BIOLÓGICO DO PLASMÓDIO
A malária se caracteriza pela infecção dos eritrócitos pelo plasmódio, cujo ciclo
biológico, porém, caracteriza-se por grande complexidade e particularidades relativas a
cada espécie do parasito, durante as quais este passa por diversas formas evolutivas.
De forma resumida, pode-se descrever o ciclo biológico do plasmódio como tendo três
estágios: i) estágio pré-eritrocítico; ii) estágio eritrocítico assexuado: e iii) estágio sexual
e desenvolvimento no mosquito (4).
O estágio pré-eritrocítico inicia-se no momento da picada com a inoculação de
esporozoítos presentes na salivas de fêmeas de mosquitos anofelinos. Estima-se que
em condições habituais, quantidade inferior a 50 esporozoítos é inoculada em cada
picada (13), com a grande maioria dos parasitos permanecendo na pele e o restante
atingindo a circulação por meio de invasão de capilares ou de vasos linfáticos (14). Em
cerca de 45 minutos os esporozoítos que atingiram a circulação conseguem dar
prosseguimento ao ciclo ao invadir as células parenquimatosas do fígado ou são
clareados. No interior do vacúolo parasitóforo dos hepatócitos, o plasmódio inicia fase de
reprodução assexuada tecidual ao fim da qual há a liberação de grande quantidade de
3
merozoítos à corrente sanguínea por meio de complexas estruturas provenientes da
manipulação da membrana pelo parasito, os merossomos (14, 15). Importante variação
existe entre as diferentes espécies de plasmódio tanto na duração deste ciclo hepático
quanto na quantidade de merozoítos resultantes do processo (4), brevemente descritas
na Tabela 1. Importante destacar a particularidade de alguns dos parasitos de P. vivax e
P. ovale podem diferenciar-se após a infecção dos hepatócitos em formas latentes,
chamadas hipnozoítos, que têm a propriedade de reativar-se e causar novos episódios
de infecção clínica sem a necessidade de novas picadas, o que merecerá atenção mais
detalhada em outra seção (16).
Tabela 1. Diferenças no ciclo biológico das diferentes espécies causando malária
humana.
P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae P. knowlesi
Ciclo hepático
(média de dias) 5,5 8 15 6-7 ?
Ciclo eritrocítico
(média de dias) 2 2 2 3 1
Hipnozoítos
(recaídas) Não Sim Sim Não Não
Merozoítos por
esquizonte
tecidual
30.000 10.000 15.000 2.000 ?
Preferência por
hemácias Todas as idades Reticulócitos Reticulócitos
Hemácias
antigas ?
4
Os merozoítos liberados na corrente sanguínea procedem à invasão de
hemácias, dando início ao estágio eritrocitário assexuado do plasmódio. Tal processo de
invasão ocorre por meio de receptores específicos presentes no complexo apical do
merozoíto que se ligam a proteína da membrana dos eritrócitos, causando a invaginação
do parasito, que é interiorizado para a célula dentro de um vacúolo parasitóforo. Durante
o desenvolvimento intra-eritrocitário, que varia geralmente entre 36 e 72 horas a
depender da espécie infectante, o parasito sofre diversas modificações. Nos estágios
iniciais, formas similares a “anéis”, com denso núcleo de cromatina. À medida que
consome o conteúdo citoplasmático da hemácia, o parasito se desenvolve e aumenta
progressivamente de tamanho. Durante este processo, no qual o parasito é denominado
trofozoíto maduro, é necessário que o heme resultante da degradação da hemoglobina
seja sintetizada para uma forma menos tóxica ao parasito, a hemozoína (17),
reconhecida à microscopia pela característica coloração acastanhada. Em cerca de 36
horas (54 horas para P. malariae), o parasito realiza intenso processo de divisão nuclear,
no qual passar a preencher praticamente todo o volume da célula em estágio conhecido
como esquizonte (ou meronte, como proposto por alguns). Ao fim deste processo a
membrana da hemácia é rompida, liberando entre 6 e 36 merozoítos que rapidamente
invadem outras células dando continuidade ao ciclo, levando a progressão logarítmica
da parasitemia (4). A duração do ciclo assexuado conforme a espécie infectante; 24
horas para P. knowlesi, 48 horas para P. falciparum, P. vivax e P. ovale, e 72 horas para
P. malariae.
Uma subpopulação de parasitos infectando as hemácias sofre diferenciação para
as formas sexuadas, responsáveis pelo início do estágio sexual e desenvolvimento no
5
mosquito. Este processo inicial de diferenciação é chamado de gametocitogonia pela
geração de gametócitos macho e fêmea, distinguidos entre si e das formas assexuadas
pela morfologia peculiar, sendo estas as únicas formas capazes de se desenvolver nos
mosquitos. Seguindo sua ingestão após a picada, os gametócitos passam por ativação
no intestino do inseto, com divisão nuclear do gametócito masculino, gerando até 8
microgametas flagelados, com cada um destes procurando um macrogameta feminino
(18). A fusão e meiose ocorrem dando origem ao zigoto, caracteristicamente diploide,
que em 24 horas assume mobilidade e sendo determinado então oocineto, que penetra
a parede do estômago do mosquito onde se incesta. Em seguida, a forma denominada
oocisto se expande intensamente por divisão azoada, gerando grande quantidade de
esporozoítos que são liberados na cavidade celômica do mosquito e migram para a
glândula salivar onde aguardam a inoculação com a picada em novo hospedeiro. O
processo de desenvolvimento no mosquito é chamado esporogonia e sua duração pode
variar entre 8 e 35 dias a depender das espécies de plasmódio e mosquito envolvidas
(18). Os passos envolvidos no ciclo do parasito são sumariamente expressos na Figura
1.
6
Figura 1 - Ilustração do ciclo biológico de desenvolvimento do plasmódio em humanos (MMV).
1.1.3. ESPECTRO CLÍNICO DA INFECÇÃO PLASMODIAL
Como brevemente já mencionado, a infecção plasmodial se caracteriza
tipicamente por suas manifestações febris; porém, há um vasto espectro de
manifestações clínicas que podem ser observados, desde a infecção assintomática até
importantes complicações em diversos sistemas resultando no desfecho fatal (8, 19).
Entre os fatores que determinam as manifestações clínicas resultantes da infecção,
encontram-se fatores do hospedeiro, como idade, imunidade prévia ao parasito e
condições clínicas associadas, como comorbidades agudas e crônicas, gestação e
7
desnutrição; fatores do parasito, como espécie infectante e virulência da cepa específica;
e do ambiente, como intensidade de transmissão e estrutura do sistema de saúde local
(8, 20-23).
Figura 2 - Ilustração esquemática do paroxismo malárico (adaptado de Kitchen & Puttnam: J Natl Malaria Soc 1946;5:57–78).
O período de incubação inicial tem duração média de 14 dias, podendo variar
entre 8 dias até mesmo anos a depender da espécie e região onde a infecção ocorre (4,
24). Após este período, sintomas inespecíficos, como cefaleia, mialgia, desconforto
abdominal, hiporexia e fadiga, podem manifestar-se antecedendo o característico
8
paroxismo malárico. Os episódios febris caracterizam-se por rápida elevação da
temperatura, geralmente acima de 39ºC, acompanhada de intensas cefaleia e mialgia,
seguidas de calafrios, durando entre 30 e 90 minutos, ao fim do qual há intensa
vasodilatação periférica e sudorese profusa, com a defervescência ocorrendo
usualmente entre 4 e 8 horas (4, 25), como mostrado na Figura 2. A descrição clássica
de paroxismos maláricos intermitentes em intervalos definidos (48 horas para P. vivax,
P. falciparum e P. ovale; 72 horas para P. malariae) guarda relação com o ciclo biológico
do parasita (Figura 3), com a febre ocorrendo como consequência da produção de
citocinas pelo hospedeiro resultante da liberação de merozoítos e produtos parasitários
como glicofosfatidil-inositol (25). Porém, tal padrão intermitente só é habitualmente
observado quando a infecção encontra-se sincronizada, o que pode levar alguns dias,
sendo, portanto, cada vez mais raro com a provisão de diagnóstico e tratamento
precoces (4).
Figura 3 - Relação entre o ciclo biológico do parasita e os paroxismos febris da malária (modificado de Neva and Brown, Basic Clinical Parasitology, 6ª ed., 1994).
9
Quando o tratamento ocorre de forma rápida e eficiente, tais sintomas são
usualmente abreviados sem maiores consequências ao doente. Porém, em proporção
variável dos casos, o indivíduo pode apresentar graves complicações clínicas, sendo
mais comumente descritas, anemia grave, malária cerebral e complicações pulmonares
e renais, com consequências muitas vezes fatais, requerendo cuidados médicos
intensivos para sua recuperação . Tais complicações são geralmente mais frequentes
em infecções pelo P. falciparum e em áreas onde os sistemas de saúde e condições
socioeconômicas apresentam situações precárias (19, 26-28).
No outro extremo do espectro de manifestações clínicas encontra-se a infecção
plasmodial assintomática (29-32). Tal condição ocorre geralmente em indivíduos com
prévia exposição intensa ao plasmódio, sendo esta imunidade clínica reversível com a
ausência prolongada de contato com o parasito (11), como observável na figura 4. Este
fator explica o fato de que em áreas de transmissão estável de malária, praticamente
apenas crianças apresentam complicações e morte pela doença e muitos adultos
infectados não têm sintomas de doença. Apesar da não presença de sintomas e
consequências clínicas marcantes nestes indivíduos, sua detecção e tratamento faz-se
necessária diante de sua importante contribuição para a manutenção da dinâmica de
transmissão local e a possibilidade de a malária agir como um cofator na presença de
outras co-morbidades agudas e crônicas (18, 33-35). É importante ainda destacar outras
manifestações não necessariamente clínicas, mas de grande significância para ilustrar a
carga de doença pela malária, como é o caso de sua associação com baixo
desempenho escolar e prejuízo da função cognitiva (36, 37). Há ainda muito a ser
investigado no que diz respeito aos fatores relacionados à expressão clínica e
10
imunopatogênese da infecção malárica que não são aqui abordados, cuja investigação é
essencial para maior esclarecimento e fundamentação de novas ferramentas ao seu
combate.
Figura 4 Espectro clínico relacionado à exposição ao parasito em área de alta transmissão de malária (extraído da referência (29)).
1.2. A DIMENSÃO MUNDIAL DA MALÁRIA
A malária é um grave problema de saúde público mundial, havendo em 2013, 97
países com transmissão ativa de malária, resultando na existência de aproximadamente
3,4 bilhões de pessoas sob risco de infecção (38). Apesar de a intensificação nas ações
de controle da transmissão terem apresentado importantes resultados em reduzir os
11
números tanto de casos clínicos quanto de óbitos por esta doença, as estimativas de
que 207 milhões de episódios (incerteza: 135-287 milhões) e 627 mil mortes (incerteza:
473-789 mil) teriam ocorrido no ano 2012 demonstram a ainda enorme carga de doença
associada à infecção humana por plasmódio (38). A maioria dos países onde a
transmissão ocorre ativamente está localizados em regiões tropicais ou subtropicais
onde as condições socioeconômicas e os serviços de saúde são precários e em que a
malária age tanto como produto como causador de um ciclo de perpetuação de pobreza
(39-42). A maior proporção desta carga é atribuída à infecção por P. falciparum,
ocorrendo na África, embora nos últimos anos a importância do P.vivax tenha sofrido
considerável valorização diante de sua maior abrangência geográfica e mais lenta
resposta às medidas de controle (38, 43). A diferença na epidemiologia destas duas
espécies pode ser vista nas Figuras 5 e 6.
Figura 5 - Limites de transmissão de P. falciparum no ano de 2010 (fonte: (44)).
12
Figura 6- Limites de transmissão de P. vivax no ano de 2010 (fonte: (45)).
Estima-se que os custos diretos da malária sejam em torno de 12 bilhões de
dólares, porém, os prejuízos socioeconômicos seriam substancialmente maiores,
decorrentes do atravancamento ao desenvolvimento tanto em termos regionais quanto
pessoais (41, 46, 47), o que pode ser minimamente exemplificado pelo pior desempenho
escolar de crianças acometidas por malária (36).
A expressiva redução no número de casos e mortes observados na última década
(25% e 42%, respectivamente) é resultado em grande parte do redirecionamento da
agenda global para o objetivo de erradicação da malária, com a intensificação das ações
de controle, o desenvolvimento de novas ferramentas e o comprometimento de gestores
de saúde e o surgimento de novos atores no cenário global, destacando-se o papel da
Fundo Global contra VIH, Malária e Tuberculose e a Fundação Bill & Melinda Gates (48-
50). Porém, o imenso desafio de eliminar a transmissão de malária do planeta ainda
encontra-se distante, esbarrando em grandes desafios, como o financiamento
13
insuficiente e a falta de ferramentas mais efetivas que possam ser empregadas com este
fim, além da inexistência de sistemas de saúde capazes de desempenhar ações mais
exitosas em muitas das áreas endêmicas (51-53). A comunidade científica tem
respondido ativamente ao identificar lacunas de conhecimento e ferramentas que
precisam ser desenvolvidas para que o objetivo de erradicação seja atingido (43, 52, 53).
1.3. EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA NO BRASIL
O Brasil é o maior país da América Latina, com extensão territorial acima de 8,5
milhões de quilômetros quadrados e população ultrapassando os 200 milhões de
habitantes, se caracterizando por vasta variedade demográfica e ambiental (54). A maior
parte do território brasileiro encontra-se em área tropical, propiciando receptividade
elevada para doenças transmitidas por vetores, como é o caso de dengue, febre amarela
e malária (55).
A história da malária no Brasil é composta de importantes sucessos, bem como
de significativos desafios e barreiras. Até a primeira metade do século 20, a transmissão
da malária ocorria na maior parte de seu território, chegando-se a registrar cerca de 6
milhões de episódios por ano. O fortalecimento do programa de controle da malária, que
ocorre em paralelo com a Campanha Global de Erradicação da Malária, foi capaz de
atingir a interrupção da transmissão da malária nas regiões Sul e Nordeste do país,
incluindo o sucesso notável de eliminar o Anopheles gambiae da região Nordeste (56).
Desta forma, na década de 1960 registrou-se o menor número de casos, abaixo de 53
mil casos por ano, com a transmissão sendo quase inteiramente restrita à região Norte,
que até os dias atuais tem a maior proporção de sua área ocupada pela floresta
amazônica, apresentando áreas de densidade populacional muito baixa e significativas
14
dificuldades logísticos para transporte e fornecimento de medidas eficazes de saúde e
controle de doenças. Em grande parte, o baixo número de casos nesta época era reflexo
tanto da baixa densidade populacional da região quanto da reduzida mobilidade das
populações localmente estabelecidas (56).
No entanto, houve grande mudança a partir dos anos 1970, quando duas
iniciativas do governo federal (a criação do parque industrial na zona franca de Manaus;
e um vasto programa de assentamento agrícola) levaram a uma enorme e desordenada
migração de pessoas para a região amazônica. A maioria da população era proveniente
de áreas não endêmicas de malária, sem imunidade prévia, e que, ao se instalar em
condições habitacionais precárias e com abundância de vetores, proporcionaram
condições ideais para um aumento rápido e sustentado do número de casos de malária
(56, 57).
Figura 7 - Mapa da América Latina destacando a área da Amazônia brasileira, onde ocorre a transmissão de malária e as três cidades com maior incidências de malária.
No Brasil são reportados cerca de 45% dos episódios de malária nas Américas
(38), com transmissão da malária atualmente sendo quase inteiramente restrita à região
15
Norte, onde a maior parte do território é coberto pela floresta amazônica, com a
ocupação humana caracterizada pela dispersão de cidades e áreas de assentamento
rural, resultando em um baixa densidade populacional de cerca de 2.85 habitantes/km² .
A expansão dos centros urbanos e uma série de evoluções econômicas, como as novas
hidrelétricas e campos de petróleo e gás na região, levam a cenários socioeconômica e
ambientalmente dinâmicos, com dificuldades consideráveis para o controle de doenças
infecciosas transmissíveis (55).
No Brasil, são três as espécies causadoras de malária humana, P. falciparum, P.
vivax e P. malariae, esta última de incidência extremamente baixa. A evolução dos casos
anuais de malária, demonstrando a rápida ascensão durante as décadas de 1970 e
1980, é ilustrado na Figura 8. Observa-se claramente que até o final dos anos 1990, as
proporções de P. vivax e P. falciparum eram aproximadamente as mesmas, com cerca
de 50% de casos por cada uma das espécies. A partir da década de 1990, é possível
observar um declínio constante da proporção de casos devido a P. falciparum, com P.
vivax tornando-se a espécie predominante causando malária, responsável por mais de
90% dos casos em 2011. As razões para esta ocorrência não são totalmente
compreendidos, embora alguns marcos importantes na história da saúde pública
brasileira possam ter contribuído para a sua ocorrência. A primeira é a criação do
Sistema Único de Saúde (SUS), que apontando para prestar cuidados de saúde
universal e gratuito a toda a população (55), pode ter contribuído para melhorar o acesso
ao diagnóstico e tratamento e, sendo P. falciparum mais sensível às medidas de
controle, explicar ao menos parcialmente a diminuição da razão Pf:Pv. Durante a
segunda metade da década de 1990, o Ministério da Saúde implementou o Programa de
16
Intensificação do Controle da Malária (PICM), que se baseou principalmente na
expansão e melhoria do diagnóstico e tratamento da malária, com foco na redução do
tempo para iniciar o tratamento, resultando no expressivo resultado de mais de 50% dos
casos sendo tratados dentro de 48 horas de sintomas. Durante este período, a
proporção de P. vivax atingiu um pico de 80% do total em 1999, apesar de um aumento
importante no número total de casos (atingindo mais de 630 mil casos) naquele ano.
Figura 8- Número absoluto total e por espécie de casos no Brasil no período entre 1961-2011 (Fonte: SIVEP).
Durante os seis anos seguintes, embora o número de casos tenha diminuído
consideravelmente, houve uma queda menor na proporção de P. vivax, com sua menor
proporção atingindo 73% em 2005. Isso coincidiu com a decisão do PNCM em modificar
a primeira linha de tratamento de P. falciparum para ACTs, mediante evidência de
aumento da resistência ao esquema de primeira linha prévio que consistia de quinino e
doxiciclina. Observa-se que, em paralelo com a diminuição global do número de
17
episódios relatados, a proporção de P. falciparum diminuiu de forma consistente, com P.
vivax respondendo por mais de 86% dos casos desde 2011. Outra decisão de grande
relevância é a recomendação nacional do uso de primaquina em uma dose única (0,75
mg/kg) em infecções por P. falciparum, como uma droga gametocitocida.
O efeito da mudança na epidemiologia da malária em uma área específica da
região amazônica brasileira no Sul ocidental na fronteira com o Peru na sequência da
adoção de combinação em dose fixa de artesunato-mefloquina (ASMQ) para P.
falciparum no estado do Acre, demonstrado em um recente publicação (58). Nessa área,
uma redução substancial no número de casos pode ser claramente demonstrado, com
um efeito ainda mais importante na redução da razão Pf:Pv e, como consequência, as
taxas de hospitalização. Um aspecto interessante observado pelos autores é que, após a
introdução de ASMQ, o pico sazonal característico de transmissão na região foi reduzido
significantemente, possivelmente como resultado do aumento da proporção de casos de
recidivas, devido a P. vivax, embora isto não tenha sido investigado (58) e pode, pelo
menos em parte, dever-se à proliferação de tanques de piscicultura na região (59).
O progresso no controle de malária pode também ser acompanhado na figura 9.
O mapa demonstra como vem ocorrendo uma redução tanto na extensão territorial
quanto na intensidade de transmissão dentro da região amazônica, caracterizada por um
menor número de municípios nas regiões orientais e boreais, estando as porções
ocidentais e áreas fronteiriças apresentando maior intensidade de transmissão. Tal
sucesso tem levado o PNCM a discutir ativamente novas estratégias focando em médio
prazo a eliminação de P. falciparum, estimulado pelas baixas proporções desta espécie
em grande parte do território.
18
Figura 9 - Mapas ilustrando a transmissão da malária na região amazônica. API = Incidência Parasitária Anual (número de episódios/1000 pessoas-ano) (SIVEP).
1.3.1. DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO
Como parte das ações de controle da malária, houve uma priorização na
prestação de diagnóstico e tratamento na maioria das áreas, com mais de 3.000
unidades de diagnóstico de microscopia na região, que realizaram em 2011 mais de 2,5
milhões de gota espessa em 2011 (60). As ações de diagnóstico da malária consistem
na detecção passiva e ativa de casos e, embora a cerca de 75% de casos positivos
19
sejam detectados através da detecção passiva, a partir de 2007, a maioria das lâminas
de sangue foram realizados como parte da detecção ativa (55,9% em 2010), o que
demonstra a extensão das atividades de vigilância e controle da malária. Mais de 55%
dos casos de malária sintomáticos são tratados dentro de 48 horas de sintomas, o que
tem sido atribuído como um dos principais motivos para atingir uma redução acentuada
na proporção de casos por P. falciparum.
A maior proporção do diagnóstico da malária no Brasil ainda é realizada por meio
de microscopia. Os fatores que determinam esta opção são a alta cobertura de unidades
de saúde equipadas com diagnóstico microscópico, treinamento constante e avaliação
dos microscopistas, e a confiança no método. Testes de diagnóstico rápido (RDT), que
deve ser capaz de identificar infecção por plasmódio não-falciparum, também foram
incluídos no sistema de diagnóstico, mas seu uso tem sido restringido a áreas de difícil
acesso, onde não há microscopia, e para a área extra-amazônica, onde a falta de
experiência e formação pessoal pode levar ao retardo diagnóstico.
O tratamento da malária no Brasil está disponível apenas através de unidades de
saúde governamentais, com a necessidade de um teste confirmatório positivo para
dispensação. Não há antimalárico disponível para compra em farmácias como forma de
evitar o uso inapropriado e retardar o desenvolvimento de resistência aos
medicamentos. A recomendação de tratamento da malária por P. vivax é a cloroquina
(25mg/kg divididos em três dias) e primaquina (3.5mg/kg em 7 ou 14 dias), esta última
não prescrita para mulheres grávidas e crianças com menos de seis meses de idade
(61) . Não há recomendação para avaliar o estado deficiência de G6PD do paciente
antes de prescrever primaquina. A adesão ao tratamento com base na contagem de
20
pílulas em posse do paciente no final do tratamento em um local sul da Amazônia foi
estimado em cerca de 86% (62), mas as avaliações representativas de diferentes áreas
onde ocorre a transmissão da malária ainda é necessária.
Ambos os medicamentos usados contra P. vivax são produzidos em
Farmanguinhos, a fábrica de medicamentos para saúde pública brasileira, o que reduz
consideravelmente os custos. As infecções por P. falciparum são tratados com
artemeter-lumefantrina (ART-LUM) e primaquina na região amazônica ou artesunato-
mefloquina (ASMQ), que é dada apenas fora da região amazônica. Nem quimioprofilaxia
nem administração de medicamentos em massa são adotadas no Brasil. Desde meados
dos anos 1990, artesunato ou artemeter são recomendados para malária grave, o que
também contribuiu para a diminuição da mortalidade, em conjunto com o diagnóstico
precoce.
1.4. MALÁRIA POR PLASMODIUM VIVAX
A agenda de pesquisadores e gestores envolvidos com malária sempre foi
dominada pelo P. falciparum, compreensível devido à maior carga de doença e
gravidade associadas à infecção por este parasito. Porém, recentemente tem havido
uma reavaliação da importância da infecção por P. vivax causada principalmente pela
nova campanha de erradicação da malária, pela desconstrução do caráter de
benignidade atribuída à doença e, ainda, o aumento na resistência medicamentosa por
este parasito (63-68).
Estimativas recentes apontam que aproximadamente 2,85 bilhões de indivíduos
vivem sob risco de infecção por P. vivax, caracterizando-o como a espécie mais
21
amplamente distribuída e causando cerca de 300 milhões de episódios anualmente (45,
67, 69, 70). Os relatos de diversas experiências prévias de localidades onde a malária foi
controlada demonstram que este parasito é relativamente mais difícil de ser eliminado
que o P. falciparum (43, 71). Entre as particularidades envolvidos na maior dificuldade de
eliminação desta espécie estão a existência do hipnozoíta e a produção precoce de
gametócitos (66).
O ciclo de vida do P. vivax apresenta a particularidade, apenas compartilhada
com o P. ovale entre as espécies infectando humanos, de ter uma forma dormente
hepática que recebe o nome de hipnozoíta, o que determina a ocorrência de recaídas da
infecção (72). Tais recaídas ocorrem em intervalos variáveis a depender da região onde
a infecção se dá e à terapia esquizonticida utilizada (24, 73, 74). A não existência de um
marcador que indique a presença do hipnozoíta e o fato de que o único tratamento
efetivo contra esta forma parasitária ser a primaquina, droga com que potencialmente
pode levar a hemólise grave em portadores de deficiência da enzima glicose-6-fosfato
desidrogenase (G6PD) (75, 76), complicam enormemente o controle da transmissão
deste parasito (74, 77, 78).
Adicionalmente, os gametócitos, a forma infectante para o mosquito, de P. vivax
são transmitidos mais eficientemente para os mosquitos (79) e são produzidos mais
precocemente na infecção por P. vivax do que na infecção por P. falciparum, com uma
proporção significativamente maior de casos apresentando-se com gametócitos
detectáveis ao diagnóstico (18, 80, 81). Desta forma, a estratégia de diagnóstico e
tratamento precoce dos casos, capaz de reduzir expressivamente a transmissão de P.
falciparum ao impedir a progressão para as formas infectantes, como pode ser visto no
22
caso brasileiro, tem um impacto significantemente menor na transmissão de P. vivax (43,
78).
O caráter de benignidade atribuído a este parasito, cuja doença foi por muito
habitualmente denominada “febre terçã benigna”, foi progressivamente desconstruído
por diversos relatos de diversas partes do mundo de manifestações clínicas complicadas
da infecção por este parasito (82-85). Tal fenômeno vem despertando grande interesse
da comunidade científica internacional, com o questionamento se tem havido algum fator
relacionado ao aumento de gravidade desta doença, como, por exemplo, uma
associação com resistência (82), ou se o que ocorre é uma percepção maior da
gravidade dos casos (86). Observações prévias provenientes da Fundação de Medicina
Tropical Dr Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), na cidade de Manaus, já apontavam um
aumento no número de internações por P. vivax (87) e, concomitantemente, casos de
malária complicada sem que houvesse simultaneamente qualquer indício de resistência
medicamentosa (84). Estudos de nosso grupo tem realizado grande contribuição ao
demonstrar que as complicações associadas à infecção por P. vivax já vinham sendo
relatadas na “literatura cinza” há alguns anos (21), com uma importante associação com
outras comorbidades. Também foi possível descrever a mais extensa série de autópsias
relacionadas à infecção por P. vivax (88), detalhando as alterações patológicas e
condições mais associadas à morte na presença deste parasito. A necessidade de um
melhor entendimento dos mecanismos fisiopatológicos da infecção por P. vivax vem
sendo seguidamente destacada (66, 86); e as evidências de que genes associados à
gravidade possam estar sendo mais expressos em pacientes com manifestações de
gravidade (89) e também a demonstração da capacidade de adesão de hemácias
parasitadas (90, 91), com a possibilidade de sequestro de parasitos no baço (92),
23
apontando importantes nichos a serem mais investigados quanto à sua significância
clínica.
1.5. PRINCÍPIOS DE TERAPÊUTICA ANTIMALÁRICA
Os objetivos do tratamento antimalárico são: proporcionar a cura do paciente;
evitar a progressão da infecção para formas graves; diminuir a transmissão da doença; e
impedir ou retardar o desenvolvimento de resistência medicamentosa (93-95). Os
primeiros dois objetivos são diretamente relacionados com parâmetros farmacocinéticos
e farmacodinâmicos: (1) a concentração mínima do antimalárico capaz de produzir a
máxima redução de parasitos, Concentração Parasiticida Mínima (MPC); a taxa de
redução parasitária (RRR), que quantifica a fração de parasitas removida em cada ciclo
parasitário; meia-vida de eliminação e área sob a curva (AUC), são parâmetros
farmacocinéticos diretamente relacionados com o sucesso do tratamento (96). Para que
um tratamento seja efiaz, é necessário que a droga encontre-se acima da MPC por pelo
menos 4 ciclos do parasito, usualmente 8 dias (96).
A artemisinina e seus derivados, como artesunato e artemeter, entre outros,
assumiram na última década posição de absoluto destaque no arsenal antimalárico.
Estas drogas se destacam pela alta eficácia antimalárica com alta RRR, levando a
clareamento da parasitemia mais rapidamente do que qualquer outra opção terapêutica,
em decorrência de sua janela terapêutica proporcionar a atuação sobre mais fases do
ciclo do parasito (97), o que fez com que se tornassem rapidamente a primeira linha de
tratamento contra malária grave, inicialmente em adultos (38, 98) e, sequencialmente em
crianças (99, 100).
24
Os derivados de artemisinina possuem meia-vida extremamente curta, sendo
quase que completamente eliminados em 24 horas (97, 101, 102). Esta característica
praticamente inviabiliza seu uso como monoterapia da malária não complicada, já que
exige o uso por no mínimo sete dias para adequadamente eliminar todos os parasitos da
circulação (103, 104). De forma a obter os benefícios de ação rápida e baixa resistência
dos derivados da artemisinina sem submeter o paciente a um esquema posológico
prolongado que poderia comprometer a adesão e levar ao desenvolvimento de
resistência, optou-se por administra-los em combinação com outras drogas de
eliminação mais lenta, configurando a terapia combinada contendo artemisinina (ACT)
(105-107).
As diferentes combinações de ACT compartilham o fato de terem alta eficácia e
bom perfil de segurança, apesar de ainda serem escassos os estudos durante o primeiro
trimestre de gestação e em crianças menores de seis meses de idade (108, 109). Em
suas últimas diretrizes a OMS recomenda que a primeira linha do tratamento de P.
falciparum contenha um ACT, estando atualmente cinco formulações em dose-fixa pré-
qualificadas para uso: artemeter-lumefantrina, artesunato-amodiaquina, artesunato-
mefloquina, dihidroartemisinina-piperaquina e artesunato-sulfadoxina-pirimetamina (100).
As principais características sobre a posologia dos ACTs e da cloroquina são descritas
na tabela 2. Em cada país a decisão a respeito de que esquema utilizar depende do
custo e da existência de resistência à droga-parceira. Além do benefício direto que os
ACTs proporcionam pela rápida eliminação do parasito da circulação, o fato de que
estas medicações impedem o desenvolvimento dos gametócitos faz com que tenham um
significativo impacto na redução da transmissão, configurando-as como importantes
25
ferramentas de controle (109-111), como já constatado em diversas experiências desde
a sua implementação em larga escala (58, 112, 113).
Tabela 2 . Características da cloroquina e das formulações de ACTs atualmente disponíveis
Formulação de ACT Meia-vida terminal¶
Posologia (3 dias)
Custo médio/ tratamento (R$)
Artemeter + Lumefantrina
3,6 dias 4 comprimidos; 12/12h 4,05
Artesunato + Amodiaquina
11 dias 2 comprimidos; 24/24h 2,08
Dihidroartemisinina + Piperaquina
28 dias 3 comprimidos; 24/24h 1,06
Artesunato + Mefloquina
14 dias 2 comprimidos; 24/24h 6,45
Artesunato + Suldoxina-Pirimetamina
6,7 dias SP – 1 dia; Artesunato (1
vez/dia; 3 dias) 3,12
Cloroquina 30-60 dias
Dia 1: 4 comprimidos; dias 2 e 3: 3 comprimidos
0,09
¶ No caso dos ACTs, baseado na droga parceira com maior meia-vida; * custo baseado em referência (114) e cotação do dólar estadunidense em R$ 2,26 de 25/7/2014.
1.6. TRATAMENTO DA MALÁRIA VIVAX
O tratamento da malária causada pelo P. vivax apresenta a peculiaridade já citada
de apresentar recaídas, exigindo, portanto, que ao tratamento do estágio sanguíneo seja
também administrada droga capaz de eliminar o hipnozoíta, para o qual atualmente a
única opção disponível é a primaquina (66, 115), que apresenta a dificuldade de
necessitar um curso longo, entre 7 e 14 dias, para ser efetiva (62, 116, 117), e tem o
problema de causar hemólise em indivíduos com deficiência de G6PD (75, 76, 118). O
problema da deficiência de G6PD é algo que leva a grande preocupação por
profissionais de saúde e pelos formuladores das políticas de saúde, principalmente em
26
regiões onde a prevalência das formas mais graves desta alteração é elevada (119,
120). Mais recentemente, estudos publicaram importantes achados com implicações
para o entendimento da eficácia desta droga: (1) a constatação de que indivíduos com
mutação específica no gene CYP-450 apresentam níveis mais baixos da droga na
corrente sanguínea (121); e que a coadministração com a cloroquina leva a aumento nos
níveis de droga atingidos na circulação (122). O desenvolvimento e demonstração da
eficácia da tafenoquina para a prevenção de recaídas com a administração de dose
única (123), apresentam uma perspectiva importante de nova ferramenta para o
combate desta infecção. Outro aspecto que tem sido apontado como de grande
importância na escolha de terapias contra malária vivax tem sido a capacidade de o
antimalárico permanecer na corrente sanguínea por período de tempo suficiente para
permitir novos episódios decorrentes de recaídas ou re-infecções, chamada de profilaxia
pós-tratamento e diretamente relacioanda com a meia-vida da droga (76, 124), como
demonstrado na figura 10.
Figura 10- Risco de recorrência de P. vivax de acordo com a meia-vida de eliminação da droga esquizonticida (preta: curta; cinza escura: intermediária; cinza clara: longa).
27
1.6.1. CLOROQUINA E DESENVOLVIMENTO DE RESISTÊNCIA
Desde seu desenvolvimento na década de 1940, durante a Segunda Guerra
Mundial, a cloroquina tem se mantido como a primeira linha do tratamento contra o
estágio assexuado de P. vivax. A cloroquina apresenta diversas propriedades que a
alçaram a uma posição de destaque no arsenal de combate a malária nas áreas
endêmicas: baixo custo, posologia simplificada de poucos dias, longo período de ação e
baixa toxicidade, sendo segura inclusive para gestantes e crianças pequenas (68). A
cloroquina é rapidamente absorvida após ingestão oral e usualmente leva a clareamento
da parasitemia em até 72 horas após a primeira dose (125). Sua longa meia-vida
plasmática de 50 horas determina a persistência de níveis séricos terapêuticos por um
período de 21 a 35 dias após o início de tratamento determina que tenha um efeito de
profilaxia pós-tratamento prolongado (126, 127) e, como consequência, suprimiria o
primeiro episódio de recaída, o que não ocorre com drogas de meia-vida mais curta
como o quinino (68). O desenvolvimento e disseminação da resistência do P. falciparum
à cloroquina, que ocorreu quase simultaneamente no Sudeste Asiátio e América do Sul
(4, 128, 129), levou a uma situação extremamente grave de aumento do número de
casos e, principalmente de mortes por malária, com a necessidade de rápida criação de
novas alternativas (130-132).
Diante da inexistência de uma droga ainda capaz de rivalizar com as
propriedades da cloroquina especialmente em relação ao perfil de segurança para
crianças e gestantes e do paralelo do ocorrido com P. falciparum, a preocupação com o
aumento dos relatos de resistência do P. vivax a cloroquina faz-se inteiramente
justificável (68, 133, 134). Desde o primeiro relato de resistência proveniente da ilha de
28
Papua na Indonésia, diversas outras localidades já reportaram taxas de falha terapêutica
maiores que 10%, principalmente no Sudeste Asiático e Oceania (63, 135, 136).
Comparativamente a P. falciparum, existem maiores dificuldades para a
realização dos estudos de eficácia em P. vivax, principalmente a capacidade deste
parasito em causar recaídas; a inexistência de ferramentas que permitam caracterizar os
episódios de recorrência de malária vivax como recrudescências, recaídas ou re-
infecções, e a falta tanto de marcadores moleculares associados a resistência quanto de
cultura para testes de resistência in vitro (68). A monitoração da resistência à cloroquina
tem sido feita principalmente por meio de protocolos in vivo de seguimento de pacientes
por 28 dias, nos quais se caracteriza a resistência como a recorrência de parasitos na
presença de níveis séricos da soma de cloroquina e seu metabólito ativo
desetilcloroquina acima de 100 ng/mL (68, 76, 137). Esta abordagem tem sido adotada
amplamente por seu rigor na definição de resistência e por minimizar a influência de
possíveis recaídas já que em áreas tropicais estas costumam ocorrer geralmente após o
dia 21 de seguimento (68, 138), porém pode-se criticá-la por falhar em detectar
episódios de resistência ocorrendo mais tardiamente, especialmente em áreas de baixa
transmissão, de forma a retardar a detecção mais precoce do desenvolvimento de
resistência. Alguns novos estudos tem tentado desenvolver e aplicar metodologias
baseadas na genotipagem de microssatélites de P. vivax, semelhantemente ao já
adotado para P. falciparum (139), de modo a caracterizar com maior precisão os
episódios de falha terapêutica (140-142), feito com relativo sucesso, porém maior
utilização faz-se ainda necessária para harmonização dos critérios. Alguns métodos para
avaliação in vitro também tem sido explorados (143-147), porém sua aplicação ainda
29
carece de melhor padronização e harmonização, além de métodos de cultura de longa
duração ainda inexistentes.
No Brasil, o esquema de tratamento em uso na região amazônica consiste na
administração de cloroquina durante 3 dias (total de 25mg/kg ou 1500mg) associado à
primaquina durante 7 dias (0.5mg/kg/dia), o que tende a atenuar as taxas de falha
decorrentes da resistência à cloroquina (61, 68, 148). O primeiro relato de resistência do
P. vivax a cloroquina foi feito em Manaus, com a falha ocorrendo em uma criança que
recebeu tratamento com cloroquina (25mg/kg) supervisionado (149), seguido de estudo
mais completo também em Manaus, com 166 pacientes, que encontrou taxa de
resistência de 10,1% após 28 dias de seguimento em indivíduos usando cloroquina
isoladamente e com medidas adequadas dos níveis séricos de cloroquina (150). Em
estudo realizado na mesma área, a detecção de falha terapêutica foi consideravelmente
menor quando a cloroquina foi administrada juntamente com primaquina, demonstrando
a sinergia desta droga como esquizonticida (151). Faltam, no entanto, estudos de maior
representatividade e distribuição geográfica, já que parece haver considerável
heterogeneidade na prevalência de resistência no país (134).
A OMS recomenda a substituição dos esquemas de primeira linha quando estes
atingem um nível de resistência de 10% (100), portanto, colocando o Brasil em situação
de extrema cautela em relação aos resultados obtidos e determinando a necessidade
tanto da confirmação destes dados em novos estudos prospectivos, quanto no estudo de
alternativas terapêuticas que possam efetivamente substituir a cloroquina se este for o
caso.
30
1.7. ACTS PARA MALÁRIA VIVAX
A adoção de ACTs na primeira linha de tratamento de P. vivax atualmente é
restrita a cinco países da Ásia e Pacífico onde a resistência à cloroquina já atingiu níveis
mais elevados (38, 135). As informações sobre a eficácia dos ACTs contra P. vivax
ainda pode ser considerada escassa e restrita a certas regiões de Ásia e Oceania (152-
156). Os estudos existentes demonstram a esperada eficácia dos ACTs, com rápido
clareamento parasitário, redução da biomassa de gametócitos e, em áreas onde a
cloroquina ainda é considerada efetiva, com a mesma eficácia na redução de
recorrências até o dia 28 (135, 155). A escassez de informação sobre a eficácia das
diferentes formulações de ACT contra P. vivax e da real magnitude da resistência à
cloroquina nas diversas áreas endêmicas para este parasito, bem como a falta de
estudos de custo-efetividade desta iniciativa, fazem com que tal estratégia ainda não
seja amplamente recomendada (135). Na América Latina, onde P. vivax é responsável
por mais de 75% dos episódios de malária e cloroquina ainda é a primeira linha de
tratamento esquizonticida, há apenas um estudo não comparativo com uso de ACT para
P. vivax (157), apesar de relatos do desenvolvimento de resistência deste parasito à
cloroquina (134, 150, 158-160). Desta forma, é fundamental a realização de novos
estudos com ACTs para P. vivax, preferencialmente comparativos com a primeira-linha
de tratamento em cada localidade, além, obviamente da produção de evidências que
possam melhor responder questões como a adoção de terapia unificada para P.
falciparum e P. vivax, o efeito que a associação com a primaquina tem sobre as recaídas
e toxicidade e a custo-efetividade da implementação de ACTs para P. vivax mesmo com
um limiar de resistência mais baixo do que o atualmente recomendado pela OMS.
31
Características de estudos que avaliaram o uso de ACTs para tratamento de malária
vivax em comparação entre ACTs ou com cloroquina, baseados em atualização de
revisão sistemática prévia (155) estão descritas na tabela 3.
Entre as opções disponíveis de ACTs, vários fatores devem ser levados em conta
sobre qual utilizar caso se decida substituir a cloroquina. Remontando à tabela 2, além
da facilidade de posologia, custo e, obviamente, medidas de eficácia, a meia-vida
prolongada tem sido defendida como um elemento essencial, devido à possibilidade de
profilaxia pós-tratamento (76, 161).
32
Tabela 3. Descrição de estudos comparativos avaliando o uso de ACTs para tratamento de malária vivax
Local Intervenções† Primaquina n time of
follow-up Proporção de
recorrências até D28 Proporção total de
recorrências
Studies with a Chloroquine comparator arm
Awab et al, 2010 (154)
Afeganistão DHAP No 536 56 0 2,9 (1,4-5,9)
CQ 0 9,1 (6,1-13,3)
Kolaczinski et al, 2007 (162)
Afeganistão AS-SP* No 190 42 1,1 (0,2-6,9) 24,4 (16,7-34,8)
CQ 4,4 (1,7-10,9) 45,6 (35,1-56,4)
Krudsood et al, 2007 (163)
Tailândia ART-LUM No 98 28 2,6 (0,5-13,5) -
CQ
0 -
Phyo et al, 2011 (164)
Tailândia DHAP No 500 63 2,2 (0,9-5,0) 113/205
CQ
6,7 (4,3-10,3) 155/193
Poravuth et al, 2011 (165)
Cambodia, Tailândia, India, Indonesia
AS-PIR No 456 42 2,9 (1,3-6,2) 9/199
CQ
2,0 (0,8-5,1) 15/190
Hwang et al, 2013 (166)
Etiópia ART-LUM No 242 42 75,7 (66,8-82,5) 41,6 (32,8-50,8)
CQ
90,8 (83,6-94,9) 31,8 (23,5-41,0)
Studies with a Chloroquine comparator arm
Karunajeewa et al, 2008 (156)
Tailândia AS-SP* No 195 42 51,5 (35,2-67,5) 64,1 (48,4-77,3)
DHAP
15,8 (7,4-30,4) 27,8 (15,9-44,0)
ART-LUM
48,7 (33,9-63,8) 69,7 (52,7-82,6)
CQ-SP*
45,1 (32,3-58,6) 76,1 (62,1-86,1)
33
Studies comparing ACTs
Ashley et al, 2004 (167)
Tailândia DHAP No 32 63 0 0
ASMQ*
0 0
Ashley et al, 2005 (168)
Tailândia DHAP No 47 63 0 0
ASMQ*
7,1 (1,2-31,5) 7,1 (1,2-31,5)
Hasugian et al, 2007 (169)
Indonesia DHAP No 114 42 0 16,0 (6,3-26,0)
ASAQ*
Nov-43 48,0 (35,0-61,0)
Hutagalung et al, 2005 (170)
Tailândia ART-LUM No 24 28 50,0 (21,5-78,5) 50,0 (21,5-78,5)
ASMQ*
0 0
Ratcliff et al, 2007 (171)
Indonesia DHAP No 175 42 1,5 (0,3-8,2) 1,5 (0,3-8,2)
ART-LUM
25,7 (17,1-36,7) 25,7 (17,1-36,7)
Smithuis et al, 2006 (172)
Mianmar DHAP No 87 42 0 0
ASMQ*
6,5 (2,2-17,5) 6,5 (2,2-17,5)
Smithuis et al, 2010 (173)
Mianmar DHAP No 66 63 0 0
ASAQ
0 0
ART-LUM
62,5 (38,6-83,7) 62,5 (38,6-83,7)
ASMQ¶
0 0
Sutanto et al, 2013 (174)
Indonesia Quinine+PQ Yes 116 28/163 0 19,4 (9,8-35,0)
DHAP
0 5,6 (1,5-18,1)
Pasaribu et al, 2013 (175)
Indonesia DHAP+PQ Yes 331 42 - 42 dias: 0,6 (0,01-
3,4); 1 ano: 9,1 (4,9-15,0)
ASAQ* + PQ
-
42 dias: 0; 1 ano: 11,5 (6,6-18,3)
† Drogas em combinação de dose fixa ao menos que indicado; * combinação não fixa; ¶ tanto em dose fixa quanto não.
34
1.8. COMBINAÇÃO ARTESUNATO-AMODIAQUINA (ASAQ)
A amodiaquina é 4-aminoquinoleína relacionada à cloroquina, compartilhando
com esta ação antimalárica potente (inclusive contra P. falciparum resistente à
cloroquina) e ótimo perfil de segurança (176). Apenas 2% da amodiaquina é excretada
via urinária, já que rapidamente após a ingestão ocorre a biotransformação para o
metabólito ativo desetilamodiaquina. A desetilamodiaquina, por sua vez, apresenta meia-
vida longa, com níveis séricos acima da concentração efetiva mínima durante 9 a 18 dias
após a primeira dose (126, 127).
A associação em dose fixa contendo artesunato e amodiaquina em um único
comprimido é fruto de parceria público-privada entre a empresa Sanofi-Aventis e a
Iniciativa de Medicamentos para Doenças Negligenciadas (DNDi) de forma a otimizar a
relação peso-para-idade (177, 178). Esta combinação incorre na formulação de blísteres
com um estabilizador de pH separando as duas drogas para melhorar a estabilidade e
biodisponibilidade da droga, com proporções fixas da droga (178, 179). A elevada
eficácia antimalárica desta formulação foi demonstrada em diversos ensaios clínicos
conta P. falciparum em comparações de superioridade com drogas em monoterapia ou
em estudos de não-inferioridade com outras combinações de ACT (173, 180-186),
credenciado sua inclusão como opção terapêutica de primeira linha pela OMS (100).
Esta formulação, recebendo o nome de Coarsucam™ apresenta o considerável
benefício de apresentar formulações específicas de acordo com o peso do paciente, o
que simplifica significativamente a posologia ao reduzir o número de comprimidos que
necessitam ser ingeridos (177), fato de suma importância ao considerar a
35
vulnerabilidade de crianças para sofrerem as consequências tanto de subadministração
de droga quanto de falha terapêutica (187, 188).
Apenas dois ensaios clínicos avaliaram a associação de artesunato e
amodiaquina (porém sem combinação em dose-fixa) contra P. vivax, ambas em
comparação com outro ACT (dihidroartemisinina-piperaquina) em área de alta
resistência à cloroquina (169, 175). Em ambos estudos, ASAQ demonstrou boa eficácia
contra os estágios sanguíneos de P. vivax, porém houve mais falhas tardias sem a
coadmnistração de primaquina (169), com desempenho semelhante ao comparador
quando esta foi combinada (175), levando a considerar a influência tanto da alta
intensidade de transmissão quando da taxa de recaídas nas regiões estudadas (76,
138), onde o efeito profilático pós-tratamento assume grande importância. Foi
demonstrado que o grupo recebendo ASAQ apresentou maiores taxas de
recrudescência do que o comparador, bem como maior proporção de pacientes portando
gametócitos. Nenhum estudo comparando ASAQ com cloroquina foi conduzido em áreas
onde esta ainda é utilizada para o tratamento de P. vivax foi realizado.
1.9. JUSTIFICATIVA
Diante do exposto, este estudo é justificado pela grande carga de doença e
socioeconômica mundial da malária e, particularmente, sua grande importância na saúde
pública da região amazônica; bem como pela necessidade de maior conhecimento sobre
o comportamento e resposta terapêutica da infecção por P. vivax. Partindo-se da
realização de estudos para caracterizar a resposta terapêutica deste parasito, pretende-
se contribuir para o desenvolvimento de estratégias que levem a mais efetivo tratamento
e controle desta infecção.
36
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO PRIMÁRIO
O objetivo deste estudo é demonstrar a não-inferioridade da resposta clínica e
parasitológica ajustada por PCR em D28 de ASAQ em comparação à cloroquina.
2.2. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS
2.2.1. Avaliar a não-inferioridade como critério principal quanto ao índice de cura
em D28 antes da correção por PCR; e os índices de cura em D14 e D42
antes e após correção por PCR.
2.2.2. Avaliar a eficácia no clareamento de parasitemia sexuada empregados para
tratamento de malária vivax.
2.2.3. Avaliar a eficácia no clareamento de gametócitos, bem como a prevenção
de seu aparecimento, de acordo com os tratamento empregados.
2.2.4. Comparar a segurança e tolerabilidade clínica e biológica dos tratamentos
empregados para tratamento de malária vivax.
2.2.5. Estimar a prevalência de resistência do P. vivax à cloroquina quando usada
em monoterapia.
37
3. MÉTODOS
3.1. LOCAL DE ESTUDO
O estudo foi realizado nas dependências da Fundação de Medicina Tropical Dr.
Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), localizada na cidade de Manaus, no estado do
Amazonas. A FMT-HVD é unidade de referência para doenças infecciosas no estado
do Amazonas, configurando-se como instituição de excelência para o estudo de
doenças endêmicas da região amazônica. No ano de 2009, tomado como base para o
desenho deste estudo, foram relatados e tratados 5438 casos de malária por P.vivax
e 423 casos de malária por P.falciparum.
A FMT-HVD apresenta enfermaria de pesquisa clínica de 14 leitos e equipe
treinada de acordo com as normas de Boas Práticas Clínicas (BPC), com experiência
na condução de pesquisa clínica.
3.2. DESCRIÇÃO DO ESTUDO
Foi conduzido ensaio clinico de fase III, randomizado, aberto, de não-
inferioridade, comparando a combinação de dose fixa de Artesunato-Amodiaquina
Coarsucam™ com Cloroquina. O protocolo foi elaborado de acordo com as diretrizes
para avaliação de eficácia de antimaláricos formulada pela OMS (189), com tempo de
seguimento de 42 dias.
3.3. PACIENTES
Foram incluídos pacientes procurando atendimento na FMT-HVD diagnosticados
com monoinfecção por P. vivax por microscopia com idade superior a 6 meses e peso
38
superior a 5kg de ambos os sexos. Foram aplicados os seguintes critérios de inclusão e
exclusão:
3.3.1. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Adultos e Crianças com idade acima de 6 meses (peso corporal >5 kg).
Condições de ser tratado por via oral.
Temperatura axilar ≥ 37,5°C ou história de febre durante os últimos 2 dias.
Monoinfecção sintomática por Plasmodium vivax confirmada biologicamente
com parasitemia entre 250 e 100.000 parasitas assexuados /µl de sangue
Consentimento informado por escrito dos pacientes e; para crianças,
consentimento informado por escrito dos pais / representante legal das
crianças. As crianças capazes de entender os objetivos e riscos do estudo
assinavam um termo de assentimento.
3.3.2. CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Planos conhecidos de deixar a área do centro de pesquisas durante o
período de acompanhamento (42 dias).
Paciente que esteja participando de outro estudo clínico em andamento.
Hipersensibilidade a um dos produtos medicinais experimentais ou qualquer
um dos excipientes.
Ingestão de tratamento antimalárico nos últimos 30 dias.
História de comprometimento hepático e (ou) hematológico durante o
tratamento com amodiaquina.
Visão embaçada sugerindo retinopatia.
Presença de pelo menos um sinal de alerta e gravidade de malária (anexo
D): história recente de convulsões (1-2 dentro de 24h), estado inconsciente,
39
letargia, incapaz de beber ou receber aleitamento, vômito constante, incapaz
de se levantar/sentar devido à fraqueza.
Mulheres gestantes ou lactantes.
Mulheres em idade fértil que não estejam dispostas a usar (um) método(s)
anticoncepcional(is) eficaz(es) durante o estudo. A necessidade de um
método eficiente será exigida da paciente (e representante legal) pelo
investigador.
Conhecida doença grave concomitante ou de base, como porfiria ou
psoríase ou distúrbios conhecidos do equilíbrio eletrolítico, como
hipocalemia ou hipomagnesemia.
3.3.3. CÁLCULO DO TAMANHO DA AMOSTRA
O cálculo do tamanho da amostra foi realizado baseado em teste de não-
inferioridade na comparação entre o Coarsucam™ e Cloroquina. Para tanto,
estabeleceu-se a margem de não-inferioridade aceitável () de 5%, precisão de 97,5%
de teste uni-caudado (/2 = 2,5%) e poder de 90% (= 10%).
Com base na predição de taxa de sucesso do tratamento com cloroquina de 90%
(150), sob a hipótese de taxa de sucesso de 95% com o uso de ASAQ, determinou-se a
necessidade de 145 pacientes por grupo. Considerando-se a possibilidade de perda de
seguimento de 15% dos incluídos e um risco de detecção por PCR de 10% e infecção
mista, este número aumenta para 190 pacientes por grupo, resultando em uma amostra
total de 380 indivíduos.
3.4. TRATAMENTOS
40
Ambos os tratamentos foram administrados de forma supervisionada durante 3
dias, em intervalos de 24 horas entre as doses. O esquema posológico administrado
variou de acordo com o peso do paciente, de acordo com a tabela 4. Tratamentos
concomitantes foram devidamente registrados, especialmente em relação ao uso de
antipiréticos. Se necessário, paracetamol foi prescrito para fins de analgesia e
antipirexia.
Tabela 4 – Esquemas de tratamento de Artesunato-Amodiaquina (ASAQ) e de Cloroquina utilizados no estudo conforme o peso do paciente
ASAQ Dose
1 dose/dia Peso do paciente
Cloroquina dose (150mg)
1 dose/dia
1 comp. de 25/67,5 mg ≥ 5kg e <9kg Dia1 : ½ comp.
Dia2 e Dia 3 : ¼ comp.
1 comp. de 50/135 mg
≥ 9kg e<10kg
≥ 10kg e <15kg Dia1 : 1 comp. Dia2 e Dia3 : ½ comp.
≥ 15kg e <18kg Dia1 : 1 comp. Dia2 : 1 comp. Dia3 : 1 comp.
1 comp. de 100/270 mg
≥ 18 kg e < 25 kg
≥ 25 kg e < 35 kg Dia1, Dia2 e Dia3 : 2 comp.
≥ 35 kg e < 36 kg Dia1 : 3 comp.
Dia2 e Dia3 : 2 comp. 2 comp. de 100/270 mg
≥ 36 kg e <50 kg
≥ 50 kg Dia1 : 4 comp. Dia2 e Dia3 : 3 comp.
A primaquina foi prescrita apenas ao final do seguimento (D42), ou quando fosse
detectada falha, na dose de 0,5mg/kg/dia durante 7 dias como recomendado (61).
3.5. PROCEDIMENTOS DO ESTUDO
3.5.1. RECRUTAMENTO E ALOCAÇÃO DO TRATAMENTO
41
Indivíduos com diagnóstico de malária por P. vivax preenchendo os critérios de
elegibilidade foram convidados a participar do estudo após a assinatura do termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE) pelo paciente, ou, no caso de menores, por
um representante legal. Tendo consentido, os participantes passaram por avaliação
clínica e laboratorial minuciosa e, caso não tenha sido constatada nenhuma contra-
indicação à participação no estudo, receberam um código de estudo individual.
Em seguida, os pacientes foram randomizados para um dos dois regimes de
tratamento na proporção 1:1. A lista de randomização foi gerada por computador
previamente ao início do estudo. Cada código de randomização correspondia a um
dos dois grupos de tratamento, com a lista associando cada número de estudo do
paciente a uma superfície opaca escondendo a alocação do grupo de tratamento e
permaneceu disponível apenas para os enfermeiros, responsáveis únicos pela
alocação e administração do tratamento.
3.5.2. PROCEDIMENTOS DE SEGUIMENTO
Para ambos os braços o tratamento foi administrado de forma supervisionada
na FMT-HVD durante três dias em intervalos de 24 horas entre as doses. O período
de acompanhamento pós-tratamento foi de 39 dias, sendo o tempo de seguimento
total de 42 dias. Para a duração do esquema do estudo, foi considerado que um
paciente concluiu o estudo no momento em que tivesse concluído a última visita em
D42, incluindo o parâmetro primário de eficácia em D28. Para o comparecimento às
visitas de seguimento o número de visitas programado e os procedimentos realizados
em cada uma delas podem ser visibilizados na tabela 5 e figura 11, seguida de
descrição detalhada dos procedimentos em cada visita.
42
Figura 11 - Diagrama esquemático das visitas e respectivos procedimentos realizados no estudo.
43
3.5.2.1. Esquema das visitas
3.5.2.1.1. Visita de inclusão: D0
Foram realizados os seguintes procedimentos:
Exame físico, coleta do histórico médico, tratamentos concomitantes e dados
demográficos (idade, sexo), além de peso e altura,
Teste de gravidez para mulheres em idade reprodutiva. Se o resultado fosse
negativo, discutido método anticoncepcional mais apropriado a ser utilizado
durante todo o estudo,
Sinais vitais: pressão arterial, frequência respiratória e de pulso em repouso,
temperatura axilar
Sinais e sintomas clínicos
Análises hematológicas e bioquímicas e glicemia
Exame da gota espessa e coleta de sangue em papel filtro
ECG no período basal (apenas pacientes ≥ 10 anos de idade)
Administração do tratamento
3.5.2.1.2. Visitas em D1 e D2, e D3
Exame físico
Sinais vitais: pressão arterial, frequência respiratória e de pulso em repouso,
temperatura axilar
Sinais clínicos e sintomas
Exame da gota espessa
Em D1 e D2: administração do tratamento
Em D3: controle do primeiro ECG (apenas pacientes ≥ 10 anos de idade)
44
Tratamentos concomitantes
Registro de eventos adversos
3.5.2.1.3. Visitas de acompanhamento pós-tratamento em D7 (+/-1), D14
(+/-1), D28 (+/- 2) e no final do estudo em D42 (+/- 2)
Exame físico
Sinais vitais: pressão arterial, frequência respiratória e frequência de pulso em
repouso, temperatura axilar
Sinais clínicos e sintomas
Análises hematológicas e bioquímicas em D7 e D14 (caso sejam obtidos
resultados anormais em D7) e em D28 e D42 (caso sejam obtidos resultados
anormais em D28)
Coleta de sangue em papel filtro para a dosagem de CQ e DSCQ ou DSAQ em
caso de parasitemia positiva de D4 a D28
Exame da gota espessa (e coleta de sangue em papel filtro para análise de
PCR). Em caso de gota espessa positiva de D4 a D42, será feita uma análise
de PCR na amostra de sangue correspondente.
Tratamentos concomitantes
Eventos adversos
D28: Segundo controle do ECG (apenas pacientes > 10 anos de idade)
D42: Teste de gravidez para mulheres em idade reprodutiva
O protocolo pressupôs ajuda de custeio para que o paciente não arcasse com
os gastos para o transporte para a FMT-HVD a cada visita, sendo ainda
disponibilizado carro com motorista para o transporte de pacientes e seus
45
acompanhantes para o comparecimento às visitas do estudo de forma a minimizar a
ocorrência de perdas de seguimento, caso solicitado.
Tabela 5 – Sumário da distribuição das visitas e respectivos procedimentos
realizados
PARÂMETROS DO ESTUDO D0 V1
Visita de Inclusão
D1 V2
D2 V3
D3 V4
D71d V5
D141d V6
D282d V7
D422d V8
Visita não
programada
História clínica x
Exame clínico/ Sinais vitais/Temperatura axilar
x x x x x x x x x
Gota espessa para determinação inicial da espécie, quantificação da parasitemia e detecção de gametócito
x
x x x x x x x x
Papel filtro para PCR de Plasmodium
x (x) (x) (x) (x) (x)
Papel filtro para DSAQ ou dosagem de CQ no dia da recorrência clínica
x (x) (x) (x)
Hemoglobina, eritrócitos, plaquetas e leucócitos, neutrófilos
x x x x x x
Exames de bioquímica para monitorar eventos adversos
x x X x x
Teste de gravidez para mulheres em idade fértil
x x
ECG (pacientes com idade igual ou acima de 10 anos)
x x x
Administração do tratamento esquizonticida do estudo
x x x
(x) –realizado em caso de recorrência de parasitemia.
46
3.6. PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
3.6.1. MICROSCOPIA
Foram coletadas amostras de sangue dos pacientes para exame da gota
espessa nos dias 0, 1, 2, 3, 7, 14, 28 e 42 ou em qualquer dia em que o paciente
procurou assistência durante o período de acompanhamento. Os exames de gota
espessa obtidos de amostras de sangue coletadas por punção digital foram corados
pela técnica de Giemsa e analisados por técnicos laboratoriais experientes que não
diretamente envolvidos no cuidado do paciente de acordo com técnicas bem
estabelecidas (190) e procedimento operacaional padrão (POP) seguido em nosso
laboratório (anexo G).
Determinando uma lâmina como negativa
O microscopista lê a lâmina até que 200 campos tenham sido contados. A
lâmina apenas foi determinada negativa quando nenhum parasito foi
encontrado em 200 campos.
Caso sejam vistas formas assexuadas de Plasmodium spp.
O microscopista conta parasitos até que o número de 500 leucócitos ou 500
parasitos fosse alcançado.
Este método foi aplicado tanto para infecções únicas ou mistas por
Plasmodium. No segundo caso, os parasitos de cada espécie deveriam ser
contados separadamente.
Para determinação da densidade parasitária em parasitos por μl, a seguinte
fórmula foi utilizada:
Nº de parasitos X Nº de leucócitos do paciente/ Nº de leucócitos lidos = parasitos/μl
47
3.6.2. MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR (PCR):
No momento da inclusão e em caso de resultado positivo no exame da gota
espessa, também foram coletadas amostras em papel filtro (Whatman FTA, cartão
clássico). As amostras foram coletadas por punção venosa ou digital. O sangue foi
colocado sobre um papel filtro em alíquotas de aproximadamente 25 µl por amostra.
As amostras foram identificadas, secas ao ar e armazenadas em pequenas bolsas
seladas, à temperatura ambiente, na presença de agente dessecante. A técnica de
PCR foi realizada na FMT-HVD (anexo H).
3.6.2.1. Genotipagem das amostras
Amostras analisadas
O DNA genômico extraído de papel de filtro das 46 amostras pareadas via
nested-PCR, seguida de eletroforese capilar. Para oito pacientes com recorrência,
amostras de DNA genômico estavam disponíveis para apenas um ponto no tempo, não
sendo permitida a correlação de genótipos. As análises de PCR foram realizadas tanto
na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), em Manaus,
quanto no Swiss Tropical and Public Health Institute (STPH), na Suíça (laboratório da
professora Ingrid Felger). Todas as 92 amostras foram analisadas na FMT-HVD, com 35
amostras tendo sido adcionalmente analisadas no STPH, a fim de assegurar a
comparabilidade e qualidade com laboratório que vem servindo como referência para
este tipo de análise em vários estudos multicêntricos (140, 141, 191, 192).
Escolha de marcadores genéticos polimórficos
48
Regiões de genes altamente polimórficos de P. vivax foram escolhidos de acordo
com a diversidade genética publicado anteriormente na América do Sul. A tabela 6
mostra o número de alelos e a heterozigose esperada (HE, a probabilidade de que um
par de alelos obtidos aleatoriamente a partir de uma amostra da população seja distinto),
determinada em diversos estudos. Os marcadores microssatélites MS2 e MS8 foram
escolhidos devido a seu alto valor de HE. Apesar da diversidade moderada, msp1F3
(também conhecido como o bloco msp1 10), que codifica uma região altamente
polimórfica da proteína de superfície de merozoíto 1 foi incluído devido à reduzida
ocorrência de artefatos de PCR deste marcador (191). Além da diversidade genética, é
importante que os marcadores estejam localizados em regiões genômicas distintas
(193). Este é o caso para os marcadores genéticos escolhidos, como msp1F3 está
localizado no cromossomo 7, MS2 no cromossomo 3 e MS8 no cromossomo 13 (194).
Tabela 6. Características dos marcadores genéticos polimórficos escolhidos para análise de genotipagem.
Marcador Número de alelos
HE
n Origem Referência
msp1F3a 10 0.569 59 Brazil (Manaus) (195)
12 0.886 30 Brazil (196)
MS2 10 0.681 30 Brazil (196)
7 0.634 99 Brazil (197)
8 0.487 53 Brazil (194)
13 0.82 107 Venezuela (198)
12 0.833b 57 Brazil (Manaus) (195)
MS8 12 0.804 99 Brazil (197)
7 0.783 30 Brazil (196)
9 0.758 53 Brazil (194)
14 0.82 107 Venezuela (198)
15 0.874 65 Brazil (Manaus) Marín-Menendez et al., não publicado.
49
PCR para genotipagem
A PCR foi realizada como descrito por Koepfli et al. (140), com pequenas
modificações. A reação de PCR primária foi realizada como uma reação multiplex para
MS2 e msp1F3 (FMT-HVD) ou para os três marcadores genéticos (STPH). A PCR
aninhada foi realizada como reações simplex. A composição de reacções de PCR está
listado nas tabelas 7 e 9 e os nucleotídeos na tabela 11. Em ambos os laboratórios
foram utilizados reagentes doa fornecedores. As variações das condições de mistura de
reação e ciclagem entre laboratórios são devidas a ajustes aos respectivos
termocicladores. Os iniciadores PCR aninhada foram marcados com um corante
fluorescente para permitir a detecção por meio de eletroforese capilar. As condições dos
ciclos para os diferentes tipos de PCR estão listadas nas tabelas 8 e 10. Se nenhum
produto de PCR era obtido, a quantidade de template para a PCR interna foi aumentado
para 3-3,5 L. Para ambas as PCR vários controles negativos contendo dH2O ao invés
de DNA foram realizadas em paralelo. Os produtos de PCR foram analisados num gel de
agarose a 2%. As amostras foram armazenadas a 4 ºC no escuro até o embarque para
Macrogen Inc., Coréia do Sul, para eletroforese capilar.
Tabela 7. Composição da reação primária PCR na FMT-HVD e STPH.
Componente Concentração Volume FMT Volume STPH
ddH2O - 6.55 uL 21.72 µL Tampão B (Solis Biodyne) 10x 1.5 L 5.0 µL
MgCl2 25 mM 1.2 L 7.0 µL
dNTPs 2.5 mM 1.8 L 6.0 µL
Primer msp1F3 F+R 10 m cada 0.4 L 1.25 µL
Primer MS2 F+R 10 m cada 0.4 L 1.25 µL
Primer MS8 F+R 10 m cada 0.4 L 1.25 µL
Taq FirePol (Solis Biodyne) 5 U/ l 0.75 L 2.0 µL
DNA genômico - 2.0 L 3.0 µL
TOTAL 15.0 L 50.0 L
50
Tabela 8. Condições de ciclagem para PCR primária aplicadas.
FMT-HVD
STPH
Passo Temperatura Tempo (min)
Ciclos
Passo Temperatura Tempo (min)
Ciclos
1 95°C 01:00 1
1 94°C 05:00 1
95°C 00:30
94°C 00:15
2 59°C 00:45 30
2 59°C 00:30 30
72ºC 01:00
72ºC 00:40
3 72ºC 05:00 1
3 72ºC 05:00 1
4 8ºC espera 1
4 8ºC espera 1
Tabela 9. Composição da reação de PCR aninhada para FMT-HVD e STPH realizada como reação simplex para cada marcador genético.
Componente Concentração Volume FMT Volume STPH
ddH2O - 9.5 uL 15.9 µL Tampão B (Solis Biodyne) 10x 1.5 L 2.5 µL
MgCl2 25 mM 1.2 L 2.0 µL
dNTPs 2.5 mM 1.2 L 2.0 µL
Primer nested F+R 10 m each 0.375 L 0.6 µL
Taq FirePol (Solis Biodyne) 5 U/ l 0.225 L 0.5 µL
Produto da PCR primária - 1.0 L 1.0 µL
TOTAL 15.0 L 25.0 L
Tabela 10. Condições de ciclagem da PCR aninhada aplicadas.
FMT-HVD
STPH
Passo Temperatura Tempo
Ciclos
Passo Temperatura Tempo
Ciclos (min) (min)
1 95°C 01:00 1
1 94°C 05:00 1
95°C 00:30
94°C 00:15
2 59°C 00:45 25
2 59°C 00:30 35
72ºC 01:00
72ºC 00:30
3 72ºC 05:00 1
3 72ºC 05:00 1
4 8ºC espera 1
4 8ºC espera 1
51
Tabela 11. Sequências dos iniciadores utilizados nas reações de PCR primárias e aninhadas.
Marcador Primer Sequência 5' - 3' Marcador fluorescente
Referência
MS2 primário a diante AGCACGACCAACAAGAGAGG (199) aninhado a diante GAGCTAGCCAAAGGTTCAACA 6-FAM
(200) reverso TGGGGAGAGACTCCCTTTTC
MS8 primário a diante AAACGTAAAACCTTTGGCGG (199) aninhado a diante AGAGGAGGCAGAAATGCAGA 6-FAM
(200) reverso ctgtcttAGCCCCTTTGCGTTCTTTAT
msp1F3 primário a diante GGAGAACATAAGCTACCTGTCC (140)
primário reverse GTTGTTACTTGGTCTTCCTCCC aninhado a diante CAAGCCTACCAAGAATTGATCCCCAA VIC
(140) aninhado reverso
ATTACTTTGTCGTAGTCCTCGGCGTAGTCC
Eletroforese capilar e análise dos dados
Os produtos de PCR foram enviados para Macrogen Inc., Coréia do Sul, para
realização da eletroforese capilar. Foram enviados para a análise 15 l do produto da
PCR, suplementado com 5 mL de dH2O. Como padrão de tamanho de 500-LIZ foi
fornecido e adicionado às amostras pela Macrogen Inc.
Os dados foram analisados usando GeneMarker versão 2.4.2 (SoftGenetics).
Perfis eletroforéticos foram analisadas visualmente para cada amostra em relação ao
comprimento do amplicon e abundância relativa (altura do pico). Os diferentes alelos
detectados foram agrupados em caixas de acordo com o respectivo comprimento de
repetição (msp1F3 - 3 pb, MS2 - 4 pb, MS8 - 3 pb). Picos abaixo de 150 bp não foram
considerados, pois muitas vezes podem ser resultado de dímeros de primers residuais e
estariam abaixo dos tamanhos esperados dos produtos de PCR de 226-372 pb para
Msp1F3, 182-226 pb para MS2 e 222-306 pb para MS8 (140, 200). O valor de corte
52
mínimo para a altura do pico foi definido como 500 unidades de fluorescência relativas, a
fim de excluir os picos resultantes do ruído de fundo.
Classificação dos resultados de genotipagem
Os resultados de eletroforese capilar das duas amostras de cada par (D0,
amostra antes do tratamento e DR, amostra da recorrência) foram comparados com
software GeneMarker. Alelos emparelhados foram classificados como iguais para uma
diferença máxima de tamanho de alelo de 1 pb. De acordo com as orientações da OMS
uma amostra foi classificada como igual (considerado de forma livre para esta análisee
como indicativo de recrudescência ou recaída), se pelo menos um alelo para cada loci
investigado foi detectado em duas amostras pareadas (139, 141). Seguindo as
orientações, classificou-se como genótipo distinto (reinfecção) se todos os alelos para
um gene marcador fossem distintos entre D0 e DR. Caso o status de genótipo distinto
fosse designado a pelo menos um dos marcadores/locus, a amostra foi classificada
como genótipo diferente no resultado global (139).
3.6.3. EXAMES DE HEMATOLOGIA E BIOQUÍMICA
Exames de hematologia e bioquímica foram realizados no Laboratório de
Análises Clínicas da FMT-HVD por meio de métodos automatizados ((Sysmex KX-
21N® e Dimension AR®, respectivamente) como parte do processo de avaliação de
elegibilidade e avaliação de segurança e toxicidade da droga.
3.6.4. DOSAGEM DOS NÍVEIS SÉRICOS DAS DROGAS EM ESTUDO
No caso de parasitemia positiva, foram coletados sobre o papel filtro 50µL de
sangue coletado por punção digital. Foram avaliados os níveis de CQ e Desetil-CQ
53
para verificar a quantidade residual do medicamento do estudo e para caracterizar
resistência à cloroquina. Foram utilizados os métodos de dosagem por HPLC como
previamente descritos (201, 202), com as dosagens sendo realizadas no Laboratório
de Toxicologia da Universidade Federal do Pará (Belém, Pará). Por problemas
técnicos, as amostras de desetilamodiaquina (DSAQ) não puderam ser dosadas
conforme planejado.
3.7. COLETA E REGISTRO DAS INFORMAÇÕES
Os dados clínicos e laboratoriais dos pacientes foram registrados em
formulários clínicos (CRFs) eletrônicos. Os CRFs foram preenchidos no momento da
realização do atendimento ao paciente ou, no caso de exames laboratoriais, assim
que os resultados estivessem disponíveis. Conforme as normas de BPC, todas as
informações dos CRFs deveriam corresponder ao registrado nos documentos-fonte,
no caso, o prontuário de cada paciente na instituição.
3.8. DEFINIÇÕES DOS DESFECHOS ANALISADOS
3.8.1. VARIÁVEIS DE EFICÁCIA
3.8.1.1. Principais variáveis de eficácia
O critério principal adotado foi resposta adequada ao tratamento em D28 para ambos
os grupos de tratamento após correção por PCR segundo as normas preconizadas
pela OMS para avaliação da resposta ao tratamento (189), podendo ser aplicadas as
seguintes classificações de desfecho (anexo A):
ETF (Falha Precoce do Tratamento),
LPF (Falha Parasitológica Tardia)
LCF (Falha Clínica Tardia)
54
ACPR (Resposta Clínica e Parasitológica Adequada)
3.8.1.2. Variáveis secundárias de eficácia
Avaliação das variáveis principais no D28 antes da taxa de cura corrigida
por PCR
Avaliação das variáveis principais nos D14 e D42 antes e depois da taxa
de cura corrigida por PCR
Comparação dos grupos de tratamento em termos de:
o Proporção de pacientes aparasitêmicos em 24, 48 e 72 horas
o Proporção de pacientes sem febre em 24, 48 e 72 horas
o Evolução do número de portadores de gametócitos durante os 42
dias de acompanhamento
o Evolução da média de gametócitos durante os 42 dias de
acompanhamento
o Proporção de pacientes com recidiva entre D28 e D42
o Evolução do valor de hemoglobinas para cada paciente (entre D0 e
D7, D0 e D28).
3.8.2. VARIÁVEIS DE SEGURANÇA
Eventos adversos
Eventos adversos registrados durante o acompanhamento
Eventos adversos sérios
Mortes
Variáveis laboratoriais de segurança
ECG (QTc) (D0, D3, D28) em pacientes com 10 anos de idade ou mais.
55
3.8.3. RESISTÊNCIA À CLOROQUINA
Entre pacientes no grupo de Cloroquina, amostra foi classificada como resistente
a cloroquina caso no momento da detecção da recorrência parasitária a soma dos níveis
séricos de CQ/DCQ estivesse acima de 100ng/mL, como previamente descrito (68, 137).
Para detectar prevalência de resistência de 10%, com 80% de poder e precisão de 6,5%
no IC95% foi calculada a necessidade de acompanhar 190 pacientes no braço de
cloroquina.
3.9. SEGURANÇA
3.9.1. TOLERABILIDADE CLÍNICA
Foram coletados dados sobre incidência e severidade dos eventos adversos. Em
cada visita, o investigador questionou o paciente ou, no caso de menor, o responsável
pelo paciente se ele/ela apresentou qualquer evento adverso desde a visita anterior
(anexo B).
3.9.2. TOLERABILIDADE PARACLÍNICA
Todos os pacientes com idade igual ou acima de 10 anos foram submetidos a um
ECG de 12 derivações para determinação de QTc em D0, D3 e D28.
3.9.3. TOLERABILIDADE BIOLÓGICA
Foram programadas as realizações de avaliações de hematologia e bioquímica
clínica nos dias 0, 7 e 28. Tais avaliações poderiam ser realizadas em qualquer outro dia
se o médico se julgados necessários pelo médico para o cuidado do paciente. As
amostras sanguíneas para hematologia e bioquímica clínica foram obtidas dos pacientes
56
por punção venosa, sendo coletados cerca de 10 ml de sangue de cada paciente para
bioquímica clínica/hematologia durante as visitas (anexo C).
3.9.4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA
A segurança e a tolerabilidade dos tratamentos foram avaliadas a partir do
registro dos Eventos Adversos (EAs) e da classificação das avaliações laboratoriais e
dos sinais vitais. Uma escala de classificação de gravidade, com base nas escalas de
classificação de toxicidade desenvolvida pela OMS e pelos Institutos Nacionais de
Saúde, Divisão de Microbiologia e Doenças Infecciosas, será usada para classificar a
severidade de todos os sintomas, achados do exame físico e resultados de
hemoglobina.
Todas as anormalidades laboratoriais com Grau 2 ou maior para dados biológicos
ou com anormalidades clinicamente significativas (independente do grau) deveriam ser
acompanhadas até a sua resolução ou até estabilização da sua progressão.
3.9.5. MONITORAMENTO DOS EVENTOS ADVERSOS
Todos os eventos devem ser controlados e relatados em conformidade com todas
as regulamentações aplicáveis e incluídas no relatório final do estudo clínico.
Todos os sintomas físicos/clínicos descritos em cada visita foram registrados
como um evento adverso se incidentes ou agravados durante o estudo e fossem
considerados como relacionados ao medicamento do estudo.
3.9.6. DEFINIÇÕES DE EVENTO ADVERSO (EA) E EVENTO ADVERSO SÉRIO (EAS)
57
Foi considerado Evento Adverso (EA) qualquer ocorrência médica não desejada
em um paciente ou participante de estudo clínico a quem se administre um produto
farmacêutico, mesmo que essa ocorrência não necessariamente tenha relação causal
com o tratamento.
Foi considerado evento adverso sério (EAS) qualquer ocorrência médica não
desejada que, em qualquer dose:
o Resultando em morte ou;
o impondo risco à vida ou;
o exigindo a hospitalização do paciente ou o prolongamento de uma hospitalização
já existente ou;
o resultando em invalidez/incapacidade persistente ou significativa ou;
o sendo um defeito de nascimento ou uma anomalia congênita;
o constituindo um evento importante do ponto de vista clínico conforme julgamento
clínico.
3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados demográficos e parâmetros registrados na inclusão foram
descritos de forma descritiva de acordo com os grupos de tratamento da população
de segurança. As avaliações utilizadas como valores do período basal foram as
das últimas avaliações realizadas antes da administração do tratamento.
Para fins de análise, foram definidas duas populações de acordo com a
aplicação do protocolo:
58
População conforme o protocolo (PP): todos os pacientes da população que
completaram o tratamento experimental de acordo com o protocolo do estudo e
que passaram por todas as avaliações especificadas sem infecção mista e sem
violações graves. Essa população foi utilizada para a análise principal.
Intenção de tratamento (ITT): todos os pacientes randomizados que
comprovadamente receberam pelo menos uma dose do tratamento (excluindo-se
os pacientes que rejeitaram ou vomitaram por duas vezes na primeira ingestão).
Todos os testes estatísticos foram realizados com nível de significância de
5% e bilaterais, com exceção da análise de não-inferioridade (intervalo de
confiança uni-caudado). As distribuições de parâmetros foram apresentadas por
média, desvio padrão, mediana, mínimo e máximo. Tais distribuições foram
comparadas por meio do teste t de Student se a hipótese de distribuição normal for
confirmada. Caso contrário, as distribuições foram comparadas com o teste não
paramétrico de Wilcoxon. tabelas de contingência indicando frequências e as
porcentagens correspondentes foram utilizadas para descrever variáveis
categóricas. Para esses parâmetros, foi feito um teste de qui-quadrado (substituído
pelo teste exato de Fisher se a frequência prevista em qualquer das células da
tabela de contingência fosse menor do que cinco).
Para demonstrar a não-inferioridade de ASAQ em comparação com a
Cloroquina, foi determinado intervalo de confiança de 95% (IC9%) da diferença
observada entre as taxas de sucesso dos dois tratamentos. O da diferença
observada na taxa de sucesso entre os dois grupos de tratamento não deve ser
maior que -5%. A não-inferioridade foi demonstrada se o limite inferior do IC 95%
for superior a -0,05, para um risco unilateral de 2,5% (/2). A análise principal foi
59
definida como a análise de não-inferioridade. Se a não-inferioridade fosse
constatada, foi realizada análise exploratória de superioridade com teste bi-
caudado para comparação da eficácia entre os grupos.
Para a análise de recorrências entre a inclusão e o fim do seguimento, foi
feita análise utilizando o estimador de Kaplan-Meier e curvas de sobrevida.
Diferenças foram comparadas pelo teste de log-rank. Para as demais análises foi
utilizado teste de qui-quadrado bi-caudado. Em relação à gametocitemia, foi ainda
realizada análise do risco de desenvolvimento de gametocitemia após o início do
tratamento, análise por meio de curva de sobrevida e teste de log-rank com o
estimador de Kaplan-Meier. Adicionalmente, foi feita análise da densidade de
gametócitos por pessoas-semana utilizando modelo com equações de estimação
generalizada (GEE).
Para análise de segurança e tolerabilidade, a população definida foi a de
todos os indivíduos randomizados para o estudo. A ocorrência de eventos adversos
foi descrita por meio de frequências e mudança nos valores em relação ao basal.
3.11. MONITORIA E ANÁLISE DE ÍNTERIM
A monitoria do estudo foi realizada por pessoa contratada pelo patrocinador. O
papel do monitor foi observar o seguimento das normativas de BPC, com base na
avaliação de cumprimento do protocolo e das medidas para proteção dos sujeitos da
pesquisa. Foi estabelecido, ainda, Comitê de Monitoramento de Dados e Segurança,
constituído por membros com conhecida expertise na condução de estudos com
antimaláricos. Tal comitê teve caráter independente e a função de inicialmente avaliar o
protocolo do estudo e, de acordo com cronograma pré-estabelecido, avaliar o
60
seguimento do estudo. Foi prevista uma análise de ínterim após a inclusão dos primeiros
190 pacientes em que a estimativa de 10% de infecção mista seria avaliada com a
possibilidade de recálculo do tamanho da amostra, não julgado necessário pela
inexistência de infecção mista pela PCR até aquele momento. O comitê seria convocado
no caso da ocorrência de qualquer evento adverso grave para discutir se há algum
indício de relação causal com a droga em estudo. Sendo um estudo de não-inferioridade
não foram estabelecidas regras de término precoce deste ensaio clínico.
3.12. ASPECTOS ÉTICOS
O estudo foi aprovado tanto pelo Comitê de Ética e Pesquisa da FMT-HVD
quanto pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP). Os indivíduos
elegíveis a participar do estudo foram abordados por um dos membros da equipe de
estudo, que explicou todos os procedimentos do ensaio clínico enfatizando a total
liberdade do indivíduo em decidir participar, bem como se disponibilizando a
responder qualquer questionamento que o paciente apresentasse. Para inclusão no
estudo aceitar assinar o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) pelo
paciente ou um representante legal (Anexo E). Em todos os momentos fez-se clara a
total liberdade do paciente optar por retirar seu consentimento em qualquer etapa do
estudo sem qualquer prejuízo quanto ao acompanhamento clínico. Era previsto direito
a indenização de acordo com a Resolução 196 /96 do Conselho Nacional de Saúde
no caso de qualquer prejuízo ao paciente, o que, no entanto, não foi necessário.
O protocolo deste estudo foi aprovado na ANVISA e registrado na base
www.clinicaltrials.gov sob o número identificador NCT01378286.
61
3.13. ESTUDOS COMPLEMENTARES
Adicionalmente ao estudo principal aqui descrito (artigo 1), serão apresentados
nos resultados artigos publicados e em fase avançada para submissão de estudos
realizados de forma complementar. Tais estudos compreendem a avaliação de aspectos
relacionados ao tratamento da malária vivax: (i) eficácia da cloroquina em crianças
(artigo 2); (ii) e a descrição de frequência de prurido após uso de cloroquina (artigo 3); e
sobre aspectos clínicos, epidemiológicos e fisiopatogênicos desta infecção: efeito de
idade e gênero na concentração de hemoglobina relativa ao estado de infecção por P.
vivax e P. falciparum (artigo 4); descrição das manifestações clínicas e fatores
relacionados à malária grave por P. vivax (artigo 5); e estudo da imunopatogênese da
infecção não tratada no baço (artigo 6).
62
4. RESULTADOS
4.1. ARTIGO 1
4.1.1. FIXED-DOSE ARTESUNATE-AMODIAQUINE COMBINATION VERSUS
CHLOROQUINE FOR TREATMENT OF UNCOMPLICATED BLOOD-STAGE P.
VIVAX INFECTION IN THE BRAZILIAN AMAZON: A RANDOMIZED, OPEN-
LABEL, PHASE 3, NON-INFERIORITY TRIAL
63
63
Title Page
Fixed-Dose Artesunate-Amodiaquine Combination versus Chloroquine for
Treatment of Uncomplicated Blood-Stage P. vivax Infection in the Brazilian
Amazon: A Randomized, Open-Label, Phase 3, Non-Inferiority Trial
Authors: Andre M. Siqueira1,2, MD; Aline C. Alencar1,2, MD; Gisely C. Melo1,2,
MSc; Belisa L. Magalhaes1,2, PhD; Kim Machado1, MSc; Andrea Kuehn1,3, PhD;
Omayra Vera,4, PhD; Marly M. Marques1, MSc; Monica Costa Manso1, MSc;
Valerie Lameyre5, MD; Claudio T. Daniel-Ribeiro6, PhD; Marcus V. G. Lacerda1,2,
PhD.
Affiliations: 1 Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Av.
Pedro Teixeira, 25 - Manaus, AM, Brazil; 2 Universidade do Estado do Amazonas,
Av. Pedro Teixeira, 25 - Manaus, AM, Brazil; 3 Barcelona Centre for International
Health Research (CRESIB, Hospital Clínic - Universitat de Barcelona), Barcelona,
Spain; 4 UNICAMP; 5 Access to Medicines Department, Sanofi Aventis Group,
Paris, France. 6 Laboratório de Pesquisa em Malária, Instituto Oswaldo Cruz,
Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil.
Corresponding authors: Andre M Siqueira - Fundação de Medicina Tropical Dr.
Heitor Vieira Dourado, Av. Pedro Teixeira, 25 - Manaus, AM, Brazil –
[email protected] ; Tel: +55(92) 21273443; and Marcus VG Lacerda -
Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Av. Pedro Teixeira, 25 -
Manaus, AM, Brazil – [email protected]; TEL: +55(92)2127-3557
Funding: Sanofi
64
64
ABSTRACT
BACKGROUND: Plasmodium vivax is the main species causing malaria in Latin
America and despite increasing evidence of the development of Chloroquine
(CQ) resistance, there have been no trials comparing its efficacy with that of
artemisinin-combined therapies (ACTs).
METHODS: This phase 3, randomized, open-label, noninferiority trial compared
the antischizontocidal efficacy and safety of 3-days supervised treatment of the
fixed-dose artesunate-amodiaquine Winthrop® (ASAQ) versus CQ for treatment
of uncomplicated P. vivax infection in patients older than 6 months in the
Brazilian Amazon. Patients were randomly assigned. Treatment was concealed
from doctors and laboratory personal responsible for the assessments and
patients followed for 42 days. Primary endpoint was genotype-adjusted adequate
clinical and parasitological response (ACPR) rates at day 28. Non-inferiority of
ASAQ was defined as the lower limit of the two-sided 95% CI for the difference in
ACPR of -5% or higher. If non-inferiority was achieved, superiority was to be
concluded if the lower limit of the 95% CI was greater than 0%. This trial is
registered with ClinicalTrials.gov, number NCT01378286. CQ and
desetylchloroquine (DCQ) blood levels were measured on the day of recurrence
in the CQ arm.
FINDINGS: Between January 2012 and May 2013, 380 patients were included in
the trial of whom 190 were randomly assigned to receive one of the two
treatment arms. Baseline characteristics were similar between arms with dropout
rates slightly higher in the ASAQ arm compared to CQ. In the per-protocol (PP)
65
65
analysis, adjusted-ACPR was achieved in 100% and 93.6% of patients in the
ASAQ and CQ arm (difference 64%, 95% CI 27%; 101%) at day 28 and in
974% and 777%, respectively (difference 197%, 95% CI 129%; 265%), at day
42. Superiority of ASAQ on ACPR was consistent in all genotype-adjusted or
crude analyses conducted. Blood drug levels and genotyping results confirmed
that the difference between treatments was related to a high prevalence of CQ
resistance. In the CQ arm, 19 patients presented CQ/DCQ blood levels above
100ng/mL, resulting in an estimated resistance prevalence of 115% (95%CI: 75-
173). Occurrence of emergent adverse events (AEs) was similar in both arms
(CQ= 117; ASAQ= 111). Although five serious adverse events in 3 patients were
reported in the ASAQ arm, none led to sequelae or treatment discontinuation,
with a safety profile consistent with the previous clinical trial data.
INTERPRETATION: Fixed-dose ASAQ exhibits high efficacy against CQ
resistant P. vivax and should be considered as an alternative in endemic areas.
Comparative protocols with follow-up longer than 28 days and genotype-
adjustment can improve detection of P. vivax resistance to CQ. The clinical and
control benefits of substituting CQ as first-line therapy need to be considered in
endemic areas.
FUNDING: Sanofi
Keywords: P. vivax; malaria; chloroquine; clinical trial; fixed-dose artesunate-
amodiaquine combination
66
66
Introduction
Despite the impressive reduction on the number of cases and related deaths in
recent years, malaria remains a major public health problem in tropical regions
with estimated 207 million episodes and 627,000 deaths in 2012.1 Plasmodium
vivax is the causing parasite species with the widest geographical distribution,
with around 2.85 billion people at risk2 and characterized by a remarkable
tolerance to the currently available control measures even in areas where P.
falciparum could be eliminated.2,3 Alongside with increasing reports of severe
clinical manifestations, these features have contributed to considerably raise the
interest on this parasite,4-8 especially in a context of renewed commitment
towards malaria eradication.9,10 Antimalarials have two fundamental roles in the
fight against this disease: first, to provide cure for infected individuals;11 and
second, to reduce disease transmission by decreasing the parasite reservoir.12
The emergence and dissemination of resistance to antimalarials is, therefore, a
major barrier for elimination, requiring intense and constant monitoring of its
occurrence and the development and evaluation of effective alternatives.13,14
The mainstay of P. vivax treatment for more than 50 years has been a
combination of chloroquine (CQ) as blood schizontocide, with primaquine (PQ),
the only available drug capable of killing hypnozoites and preventing
relapses.15,16 This association’s synergistic schizontocidal effect associated with
the parasite’s usually lower biomass and shorter duration of gametocytes, may
have contributed to the slower development of chloroquine resistance compared
67
67
to P. falciparum,16 however there has been increasing number of reports of CQ
resistance (CQR) in the diverse regions endemic to this parasite,17-20 especially
in Southeast Asia and the Pacific region,21-23 emphasizing the need to develop
and evaluate alternative therapies. Artemisinin combination therapies (ACTs),
now widely implemented against P. falciparum, have demonstrated to provide
faster P.vivax clearance compared to CQ and similar performance in preventing
recurrence during 28 days of follow-up in areas where CQ remains effective.24
Due to high levels of CQR, five endemic countries in the Pacific region have
already adopted ACT as first-line to treat P. vivax-infected patients.1 In Latin
America, where P. vivax is the more prevalent species causing malaria,1 CQ
remains the first line recommended treatment in spite of available evidence of
CQR,18,19,25-27 no studies comparing the efficacy of ACTs to that of CQ have
been conducted, highlighting the urgent need to assess alternative treatments in
the region.
The combination of artesunate-amodiaquine (ASAQ) has been adopted against
P. falciparum in many countries with remarkable efficacy.28 The coadministration
of artesunate and amodiaquine against P. vivax infection has been compared to
other ACTs in two studies conducted in Southeast Asia, with favourable results.
These studies used one fixed-dose combination (FDC), with PQ 29 and a loose
dose one without PQ.30 The ASAQ FDC tested in the present study has been
co-developed with four weigh-band specific formulations by DNDi and Sanofi-
Aventis. These new formulations have additional benefits for both compliance
and reduced risk of emergence of resistance linked to monotherapy. 31,32 with
68
68
analyses showing them to be superior in parasite clearance compared to the
loose combination.28 We conducted this clinical trial in order to evaluate the
efficacy and safety of FDC ASAQ compared to that of CQ against uncomplicated
P. vivax infection.
Methods
Study site and design
Our study was undertaken at Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado (FMT-HVD), a tertiary care centre for infectious diseases located in
Manaus, in the Brazilian Western Amazon region. Malaria transmission in this
region is restricted to the rural areas, of moderate transmission of malaria, where
P. vivax is the predominant species and Anopheles darlingi is the main vector.
Antimalarials are not available for purchase in drug stores and are only provided
in health units upon confirmation of infection by either a thick blood smear (TBS)
or rapid diagnostic test. Current guidelines recommend CQ (25mg/kg over three
days) and PQ (0.5mg/kg/day during seven days) for P. vivax infection
treatment.33 Previous studies in the region have reported therapeutic failure in 28
days as high as 17.4% with CQ monotherapy,18 and lower rates at 5.2% with
concomitant use of PQ.34
We conducted an open-label randomized non-inferiority trial comparing the
efficacy and safety against uncomplicated P. vivax blood stage infection of a
fixed-dose ASAQ combination (ASAQ Winthrop® / Coarsucam™; Sanofi-Aventis,
Morocco) and CQ (Farmanguinhos, Brazil). The study was based on the WHO
antimalarial drug efficacy protocols modified for P. vivax.35,36 Patients were
69
69
followed up for 42 days using a standardized electronic clinical report form (CRF)
to assess drug efficacy and safety.
The primary endpoint was genotype-adjusted adequate cure and parasitological
response (ACPR) rates for both treatment arms at day 28. Secondary endpoints
included the ACPR before genotype adjustment on Day 28 and ACPR before
and after genotype adjustment on days 14and 42 of follow-up, the risk of P. vivax
recurrence, prevalence and incidence of positive asexual parasitaemia and
gametocyte carriage, haemoglobin changes from baseline, and the incidence of
adverse events, including laboratorial and electrocardiographic tolerability.
The study was approved by the Ethics Review Board (ERB) of FMT-HVD
(0426/2011) and the National Brazilian Committee of Ethics (CONEP)
(16532/2011). Written informed consent was obtained from all adult patients and
legal guardians of enrolled children. The trial was registered with clinicaltrials.gov
(NCT01378286).
Patients
Individuals older than 6 months of age and body weight above 5kg with slide-
confirmed P. vivax monoinfection with parasite density between 250 and 100,000
parasites /µL and axillary temperature ≥ 37.5°C or history of fever in the last 48
hours were considered for enrolment. Exclusion criteria comprised the following:
pregnancy or breast-feeding women; plan of leaving the study area in the
following 42 days; known hypersensitivity to one of the investigational products or
any of the excipients; history of hepatic or haematological impairment during
treatment with amodiaquine; blurred vision suggesting retinopathy; presence of
70
70
at least one danger sign of malaria;37 known severe concomitant or underlying
disease; and women of childbearing potential unwilling to use an effective
contraceptive method during the study.
Randomisation and concealment
Eligible patients were randomly assigned to one of the treatment arms by one of
the study nurses through a computer-generated list linking each patient’s
individual study number to an opaque zone concealing the assigned treatment
arm. Once the patient was enrolled, the attending nurse uncovered the
respective designed treatment area and stored the list in an opaque envelope.
Neither the study doctors nor the laboratory personal responsible for reading the
slides and the PCR test had access to the list, remaining blind to the patient’s
allocation throughout the duration of the study.
Procedures
After enrolment, the patient was submitted to a complete clinical and laboratory
assessment by one of the study doctors in which a CRF was filled containing
demographic information, clinical history, signs and symptoms and laboratory
data. The laboratory assessment included total blood cell count, bilirubin,
glycaemia, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT),
creatinine and a blood pregnancy test for women of childbearing age, and an
electrocardiogram (ECG) for individuals above 10 years of age. If no exclusion
criterion was identified the patient was led to the nurses’ office in order to be re-
weighed and to receive the first supervised dose of the assigned medication.
71
71
For both arms all doses were administered supervised by one of the study
nurses, with 24 hours intervals according to body weight as described in table 1.
If necessary, tablets were dissolved in water and administered in a syringe to
minimize the risk of underadministrating the drug for children. Primaquine was
withheld until day 42 or earlier in case of recurrence of infection or patient
withdrawal from the study. Patients were observed for 30 minutes after taking the
drug and the dose was repeated once if vomiting occurred. Patients would return
on the following three days for clinical and microscopy assessments, with further
scheduled follow-up visits on days 7, 14, 28 and 42 after enrolment. Laboratory
blood assessments were repeated on days 7 and 28 and the ECG was done on
days 2 and 28, with additional tests requested at physician’s discretion. Dried
blood spots on filter paper were collected for molecular studies on day zero and
on the day that a recurrence was detected on the blood slide; with additional
samples collected on day 7 and the day of recurrence for the dosage of CQ and
desetylchloroquine (DCQ) blood levels. The latter were determined by high-
performance liquid chromatography (HPLC) as previously described.38
If recurrence was detected during follow-up, patients were treated with fixed-
dose artesunate-mefloquine combination (ASMQ, Farmanguinhos, Brazil).
The microscopic examination was performed by two experienced technicians
who counted the parasites in 500 leukocytes or 500 parasites, whichever was
achieved first. A slide was only considered negative if no parasite was seen in
200 high power fields. Any major discrepancy was resolved by a third read by an
independent technician. The parasite density was calculated using the white cell
72
72
count from the most recent total blood cell count (usually from day 1, day 7 or
day 28). All ECG records were evaluated by a cardiologist and data regarding
heart rate, QT interval and any abnormality was registered with posterior
correction of the QT interval by both the Bazzet and Fridericia formulae.
Molecular analyses
Real-time PCR was performed from filter-paper samples from the day of
inclusion in order to confirm P. vivax monoinfection according to previously
described protocols.39 For the genotyping procedures comparing filter-paper
sample taken at D0 and day of failure, three highly polymorphic gene regions
were chosen according to previously published genetic diversity in the region,
namely, msp1F3, MS2 and MS8.40-42 Initially samples were amplified for each
marker through PCR at the FMT-HVD and at the Swiss Tropical and Public
Health Institute (STPH) in Basel, Switzerland (under supervision of Prof. Ingrid
Felger). For each sample, 15L of the PCR product was sent with 5L of distilled
water to Macrogen Inc. (Korea) for capillary electrophoresis. Data were then
analyzed using GeneMaker version 2.4.2 (SoftGenetics), and resulting
electrophoretic profiles were analyzed visually according to amplicon length and
relative abundance (peak height). Results of both samples for each patient
presenting recurrence were compared and classified as the same genotype if a
maximum difference of allele size of 1 base pair was observed. The samples
were therefore classified as of the same genotype if at least one allele for each
loci investigated was detected in both paired samples; samples were classified
as distinct genotypes if all alleles for a given marker were different between days
73
73
of collection. If no comparison was available for analysis due to lack of sample or
no product was amplified after two reactions, the genotype result was classified
as indefinite. Further detail of the molecular characterization reactions and
results is provided in the Supplemental file 1.
Statistical analysis
On the basis of local data,18 we assumed an efficacy for CQ within 28 days of
follow-up of 90%, defining the non-inferiority margin at 5%. Considering alpha at
25% for the unilateral test and power of 90%, a sample size of 145 individuals
per treatment arm was obtained, which was increased to 171, considering a 15%
lost to follow-up. After taking into account the risk of 10% of mixed infections after
PCR species correction, a required sample size of 190 patients per arm was
defined for the study resulting in a totalling 380 patients.
Three populations were defined for the analyses: the per protocol (PP)
population, consisting of patients who completed a full course of study
medication with a known outcome in each of the evaluated timepoints and for
whom no protocol deviation possibly compromising the efficacy assessment
occurred (i.e. lack of assessment of the primary efficacy endpoint at D28, or
received forbidden medication before or during study, or presented parasite
density at enrolment below 250 parasites/L)the intention-to-treat (ITT)
population, consisting of all patients randomized, regardless of completing
treatment and/or all study procedures, and the safety population: defined as all
randomised patients who received at least one dose of treatment, including
patients with double vomiting or rejection at the first intake.
74
74
The primary endpoint of the study was the assessment of non-inferiority of the
genotype-adjusted efficacy of cure at day 28 in the PP population, as defined in
the protocol and the analysis plan. Non-inferiority was demonstrated if the lower
bound of the 95%CI of the risk difference between the two arms was superior to -
005. Patients with different genotypes were considered as ACPR in a first
moment, with a sensitive analysis censoring these observations also being
performed. Patients with recurrence and indefinite genotype were classified as
failures. If non-inferiority was shown, a superiority test with two-sided 2-test or
Fisher test (if one of the cells of the contingency tables had less than five
observations) was performed. The same statistical approach was adopted for the
analyses with the PP and ITT populations with and without genotype adjustment
to analyse the proportion of patients with ACPR at days 14, 28 and 42. Time to
parasitaemia recurrence and cumulative risk of developing patent
gametocytaemia were assessed by survival curves using the Kaplan-Meier
estimator and logrank tests. The proportion of patients with negative blood slides
for both asexual and sexual parasites and fever clearance was analysed at days
1, 2 and 3. Analyses of the secondary outcomes were performed considering a
5% significance level, using the 2-test or Fisher test for assessing proportions of
categorical variables and the Student t-test for continuous variables with normal
distribution, and the Wilcoxon test for non-normal distributed variables.
Additionally, a general estimating equation (GEE)-model was used to compare
the person-week gametocyte density during follow-up between treatments.
75
75
Descriptive statistics were used for the safety endpoints, which included adverse
events and abnormalities in the laboratory and electrocardiographic evaluations.
Serious adverse events were defined as events resulting in death or life
threatening, required hospitalization, resulted in persistent or significant disability
or incapacity, caused a birth defect or congenital abnormality, or classified as
medically important by the investigators. Incident neutropenia and increase of
ALT were considered as adverse events of special interest (AESIs), according to
the following criteria: (1) neutrophils count below 400/mm3 for children aged 3
months to 12 years old, or below 750/mm3 for children above 12 years-old and
adults; (2) ALT increase exceeding 5 times the upper limit of normality (ULN), or
ALT 3 times above the ULN if ALT higher than the ULN at baseline, and ALT
exceeding ULN combined with total bilirubin above 2 times ULN; (3) pregnancy.
Anaemia was graded according to WHO references.43 The relationship of each
AE with the drug was evaluated according to the temporal relation, improvement
after drug discontinuation and laboratory data. The decision to discontinue the
medication or to withdraw the patient from the study was made by the
investigators and evaluated by the Independent Data Monitoring Committee.
Independent Data Monitoring Committee
The study employed an Independent Data Monitoring Committee for the purpose
of providing an independent advice on the safety of the treatments tested. The
committee was comprised three renowned experts in tropical medicine including
P. vivax malaria. The committee reviewed the study protocol prior to
implementation of the trial and was convened when necessary to review the
76
76
progress of the study. It was notified regularly of study progress and of the
occurrence of any serious adverse events (SAEs). The committee reviewed any
CRFs containing conflicting or questionable efficacy or safety data under blind
conditions and, if necessary, evaluated the potential causal relationship of each
SAE with the study treatments. The committee had the authority to suspend
inclusions in all or part of the study groups. The committee reviewed the
Statistical Analysis Plan and the interim analysis and arbitrated any potential
protocol deviations before database lock. The committee also reviewed this
clinical study report.
Role of the funding source
The study sponsors and study site principal investigators developed the protocol,
interpreted the data, and developed the report. The investigators were
responsible for data collection, all clinical and laboratory assessments, review of
SAP, oversight of the statistical analyses and writing of the manuscipt. Monitoring
was performed by the sponsor. All authors had access to the primary and
analysed data, take responsibility for accuracy and completeness of data
reporting, and had final responsibility for the decision to submit for publication.
Results
Patient enrolment was performed between January 2012 and June 2013 and the
trial profile is shown on Figure 1. Most exclusions occurred due to lack of
possibility to be followed for the study period or presenting parasite densities
below 250 parasites/L of blood. The latter occurred mainly due to imprecision of
the semi-quantitative method used to estimate parasitemia in routine
77
77
assessments and considered for initial screening, which was changed for the
more precise parasite count method during the study. One patient was
retrospectively excluded of the analyses for presenting a mixed infection
detected by PCR at baseline. This patient received ASAQ and was included in
the safety analyses. 908% of the enrolled patients completed the study as
planned, with follow-up for at least forty days or until treatment failure ( 884% in
ASAQ group and 932% in the CQ group). The principal reason for premature
study discontinuation was loss to follow-up, accounting for 29 (82.9%) of the 35
cases. There was a predominance of males (over 70%) and a low proportion of
children (9-11%) in both arms. 905% of patients were resided in Manaus urban
area, which has not active malaria transmission, and acquired malaria during
leisure or work-related activities in surrounding rural and riverine areas (Table 2).
In the PP population, genotype-adjusted ACPR rates at day 28 were of 100% in
the ASAQ arm and 936% in the CQ arm. As non-inferiority of the risk difference
was achieved (975%CI lower-bound = 274), superiority of ASAQ was then
demonstrated for both the genotype-adjusted (risk-difference = 64% 95% CI: 27;
101) and non-adjusted (risk-difference = 76% 95% CI: 36; 115) analyses. The
difference between treatments increased substantially with longer follow-up as
demonstrated by the ACPR rates at D42 (Table 3), as a result of most
recurrences occurring between days 28 and 42. For the ITT population analyses,
the trend was similar and superiority could be demonstrated for the D28 and D42
timepoints (Table 4)
78
78
The Kaplan-Meier analysis was performed to investigate the rates of recurrence
according to treatment in both the PP and ITT populations, also demonstrating
better performance of ASAQ compared to CQ (Figure 2). Considering the ITT
population, the six recurrences in the ASAQ group occurred between days 40
and 44 of follow-up, while in the CQ group 13 out of the 54 failures (241%)
occurred within the first 28 days of follow-up. Using the genotype classification
criteria648% (35/54) parasite samples of patients with recurrence in the CQ arm
(ITT population) had the same genotype, especially for those occurring above 28
days, compared to half (3/6) of patients in the ASAQ arm (Figure 3A and Table
4). From the 54 recurrences in the CQ arm, 19 presented CQ/DCQ blood level
above 100ng/mL at the day of recurrence , which based on this criterion would
result on a CQ resistance prevalence of 115% (95%CI: 75 - 173). This result
was further substantiated by parasites with the same genotype emerging in the
circulation with CQ/DCQ blood levels up to 533ng/mL (Figure 3B).
The proportion of patients clearing parasitaemia was significantly higher for the
ASAQ group during the three first days of follow-up, as was the proportion of
patients clearing fever at day 1 (tables 3 and 4). Considering the ITT population,
at baseline respectively 55.6% and 60% were gametocyte carriers in ASAQ and
CQ groups. From D7 only 2.4% of patient treated with ASAQ and 14.7% in the
CQ group presented microscopically-detected gametocytes during follow-up
(p<0001). The GEE-model also demonstrated a lower overall gametocyte-
positive density in the ASAQ arm compared to that of CQ (47 vs 122
gametocyte-positive-slides/100-person-week, respectively; rate ratio = 039
79
79
95%CI [029-052]; p<0001). Considering the development of gametocytaemia
after treatment initiation in patients with no gametocytes detected at the day of
inclusion (n= 83 in the ASAQ arm and 76 in the CQ arm), there was a
considerable higher risk (p<0.001) in patients receiving CQ (figure 4).
Haemoglobin (Hb) levels were systematically measured at baseline and days 7
and 28 (figure 5). Overall there was a relative decrease of Hb between the day of
inclusion and day 7 for all patients (-25 [SD=84]), with a higher reduction
observed for the ASAQ arm compared to CQ (-42 [74] vs - 09[90]; p<0001), in
the ITT population. This, however, did not result on a higher proportion of
patients presenting grade 2 or higher anaemia at day 7 (3 [16%] vs 2 [11%],
respectively for the ASAQ and CQ arms). At day 28, patients in the ASAQ group
presented a more modest change from baseline of Hb levels compared to the
CQ group (03 [132] vs 37 [120]; p=0005) and there was no difference between
the number of patients presenting anaemia grade 2 or higher (5 [28%] vs 6
[34%]).
Reported adverse events are shown in table 5. No deaths occurred during follow-
up and no patient discontinued the medication due to either vomiting or other
adverse event. Four patients in each arm presented vomiting within 30 minutes
of the first dose requiring the dose to be repeated with no patient presenting
vomiting within 30 minutes of the drug administration on days 0, 1 and 2. Five
serious AEs occurred amongst three patients, all in the ASAQ group. All these
patients were adults and presented vomiting after initiation of the medication
requiring treatment with IV anti-emetic drugs. One patient with chronic gastritis
80
80
had non-ulcerous mucosal inflammation observed in a gastroscopy and was
additionally treated with ranitidine. One patient presented extra-pyramidal
symptoms after medicated with metoclopramide, which was reversed with
promethazine. None of these events required discontinuation of the study
medication and the follow-up was conducted as established. Regarding the pre-
defined AEs of special interest, neutropenia at day 7 was observed in only one
patient in the CQ arm, recovering to the normal levels spontaneously without
clinical consequences. Elevation of alanine aminotransferase (ALT) was detected
in eight (42%) in the ASAQ arm and nine (47%) in the CQ group, being
attributed to a concomitant disease in two and one patients, respectively. One
patient in the ASAQ group got pregnant but decided to terminate it for personal
reasons. Sinus bradycardia was the most frequent drug-related AE, with higher
incidence in the ASAQ group, with no patient, however, presenting any
associated symptoms and with reversion occurring in most cases. This AE was
not associated with increase on QTc, for which a preference was made to
consider the Fridericia formula of correction, due to its better performance in
extremes of heart rate.44
Discussion
This study demonstrates high efficacy of FDC ASAQ against CQ-resistant P.
vivax for the genotype-adjusted and non-adjusted ACPR rates at days 28 and 42.
Likewise, ASAQ performed better than CQ at clearing parasitaemia and fever.
This is the first study comparing the ASAQ combination to chloroquine against P.
vivax infection and also the first trial comparing an ACT to CQ in Latin America,
81
81
where P. vivax is the main species causing malaria and CQ is still the
recommended first-line therapy.1
The most surprising result of this study is probably the high efficacy of ASAQ at
day 42, as the parasitological efficacy assessment results up to day 28 could
have been expected based on the high potency of ACTs to clear parasitaemia of
all human malaria parasites,45,46 and previous estimates of CQ resistance from
the study area.18,34 The interpretation of P. vivax failures occurring after day 28 is
troubled due to the possibility of relapses and re-infections and the lack of
reliable tools to distinguish between them. 16,35 In this context, the capacity of
suppressing future clinical episodes, believed to be associated with the drug’s
elimination half-life and referred to as post-treatment prophylactic effect, has
been praised as an important property of antimalarials against P. vivax.16
Considering the larger half-life of chloroquine and its metabolite compared to that
of amodiaquine,46 and the fact that no primaquine (PQ) was administered until
the end of follow-up, it would be reasonable to expect the number of recurrences
after day 28 to be higher in the arm with shorter half-life as a consequence of
less protection against relapses and re-infections. Indeed, this was reported by a
previous trial in Indonesia without co-administering primaquine; ASAQ showed
lower efficacy against later recurrences when compared to dihydroartemisinin-
piperaquine (DHP), an ACT with considerably longer half-life.29,30 However, we
observed the opposite, with a considerably higher number of recurrences in the
CQ arm compared to ASAQ (for which all recurrences were observed after day
40). Our main hypothesis for such observation is the existence of low-level
82
82
resistance to CQ, which would supress, but not eliminate, asexual parasitemia
below microscopy-detection threshold, which would then return to patent parasite
density with CQ/DCQ blood levels below 100ng/mL. This hypothesis is based in
two important assumptions: (1) very low risk of re-infection, as most patients
(75.6%) in our study resided in Manaus’ urban area where there is no active
malaria transmission; and (2) negligible contribution of relapses to the observed
recurrences. The first assumption is supported by local epidemiological data and
by the low proportion of recurrences presenting genotypes different from baseline
– taking into consideration the limitation of this approach for P. vivax as this
same finding could be due to same genotype early relapses. The second
assumption is based on the lack of activity of the investigational drugs against
hypnozoites and reports of relapses usually occurring after day 35 in the
region.41,47,48
Regarding the gametocyte-related efficacy endpoints, ASAQ had a better
performance in clearing patent gametocytaemia and, most importantly,
preventing post-treatment gametocyte appearance. Patients in the CQ arm
without gametocytes at baseline presented considerably higher incidence of
gametocytaemia in the first days of treatment (figure 4). In the light of strong
evidence demonstrating reduction on P. falciparum transmission after
deployment of ACT,12,49 these findings are of special importance considering the
lack of novel tools against P. vivax transmission and the impossibility of routinely
administering primaquine in many endemic areas, with the additional interest to
83
83
evaluate if associating ACT+PQ will result in even higher gametocytocidal effect
against P. vivax in Latin America.
Patients in the ASAQ group presented a more pronounced reduction in
haemoglobin levels between baseline and day seven. The reasons for its
occurrence are not clear but could be related to a higher inflammatory response
and/or oxidative stress associated to treatment.45 Unfortunately no specific
investigations were performed to assess these hypotheses or other possible
associated conditions (i.e. helminthic infection, and glucose-6-phosphate
dehydrogenase deficiency). Most importantly, no severe anaemia occurred and
the final haemoglobin levels were similar in both groups.
The safety and tolerability of ASAQ was consistent with previous studies using it
as fixed-dose combination. Sinus bradycardia occurred without symptoms or
clinical complications, as was reported by a study with African children with
ASAQ loose-dose combination,50 what suggests the need for further
investigation. There was no difference compared to CQ in the incidence of the
pre-define AESIs, thus ASAQ presented a very favourable safety profile in our
population.
We have used the genotype-adjusted ACPR rates as endpoint in an attempt to
apply a more rigorous case-definition of CQ resistance, although there are clear
limitations. Unlike for P. falciparum, there are no reliable molecular markers
criteria that can differentiate recrudescence from re-infection and relapse,35 and
the use of genotyping in previous P. vivax efficacy assessments has been done
only on an exploratory basis.51,52 The consistency of the estimates demonstrates
84
84
that this can be a useful approach for future studies, especially in areas where
the risk of reinfection can be minimized.
A limitation of our study was the low number of children included. This population
is of special interest as they suffer complications more frequently and are
subjected to a higher risk of treatment failure, especially with the lack of specific
paediatric formulation in the study area.{Siqueira, 2014 #7667;Ursing, 2014
#5855} It would have been interesting to evaluate if the treatment effect would
be distinct in the younger population, for which we propose future studies to
consider stratified sampling. We have not been able to assess the
pharmacokinetic profile of amodiaquine, which should be evaluated as a larger
elimination half-life in this population could be a reason for its efficacy against
late recurrences.
By not co-administering PQ we have not been able to evaluate its potentially
synergistic effect and safety of the combination in an area where it is routinely
administered for P. vivax-infected patients. However this approach allowed us to
perform a more reliable evaluation of the schizontocidal effect of CQ and to
estimate its resistance rate, which at 115% is worryingly high and should prompt
actions by policy makers. Most studies of P. vivax efficacy have restricted follow-
up to 28 days in order to minimize the contribution of relapses and considering
the CQ/DCQ elimination half-life, what can lead to underestimation of resistance
and should guide future studies.
P. vivax has been receiving increased attention lately, requiring the development
of new strategies and tools.4,5 Particularly P. vivax infections require treatment of
85
85
hypnozoites, for which the possible single-dose treatment with tafenoquine would
be attractive when compared to the related 8-aminoquinoline primaquine which
requires 7-14 days regimens.53 The choice of an effective schizontocidal drug,
however, cannot be underestimated. Although CQ is still the first-line therapy in
most endemic countries, resistance is a growing problem, probably
underestimated by co-administration with primaquine and misclassification of
recrudescence as relapses. The decision to substitute chloroquine for an ACT as
the drug of choice to treat P. vivax infections is a complex one, which should be
based on different variables including the prevalence of chloroquine resistant
parasites; the current treatment adopted for P. falciparum; the efficacy of the
partner drug; the interaction of the ACT with primaquine; and, additionally, the
impact it could have in reducing transmission locally.21,54 Policy makers need to
actively discuss the available evidence in order to make decision and define
strategies to accelerate the path towards malaria eradication.
Conflict of Interest Statements
V.L.is employed by Sanofi-Aventis. The other authors declare that they have no
conflicts of interest.
Acknowledgements
We acknowledge the Director-President of FMT-HVD, Prof. Maria Alecrim for the
institutional support and all the personal from the Malaria Laboratory for
86
86
contribution with running the trial. We thank the patients and their families for
taking part in the study.
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Tables
Table 1. Treatment administration regimens according to bodyweight
Drug formulation Body weight Daily dose*
Artesunate (AS) – Amodiauqine (AQ) arm
Tablet: AS 25mg/AQ
675mg ≥5 and <9 kg 1 tablet/day/3 days
Tablet: AS 50mg/AQ 135mg ≥9 and <18 kg 1 tablet/day/3 days
Tablet: AS 100mg/AQ 270mg
≥18 and <36 kg 1 tablet/day/3 days
Tablet: AS 100mg/AQ 270mg
≥36 kg 2 tablets/day/3 days
Chloroquine (CQ)
Tablet: 150mg ≥5 and <10 kg day 1= ½ tablet; day 2 = ¼ tablet; day 3 = ¼ tablet
Tablet: 150mg ≥10 and <15 kg day 1= 1 tablet; day 2 = ½ tablet; day 3 = ½ tablet
Tablet: 150mg ≥15 and <25 kg day 1= 1 tablet; day 2 = 1 tablet; day 3 = 1 tablet
Tablet: 150mg ≥25 and <35 kg day 1= 2 tablets; day 2 = 2 tablets; day 3 = 2 tablets
Tablet: 150mg ≥35 and <50 kg: day 1= 3 tablets; day 2 = 2 tablets; day 3 = 2 tablets
Tablet: 150mg ≥50 kg Day 1=4 tablets; day 2 = 3 tablets; day 3 = 3 tablets
*When administering a fraction of a tablet, this was crushed and dissolved in 10mL of water and the appropriate fraction was administered (i.e. ½ tablet:
5mL; ¼ tablet: 25mL).
95
95
Table 2. Demographic and disease characteristics at baseline (ITT population)
Artesunate-amodiaquine
(n=189)
Chloroquine
(n=190)
Male patients 136 (720%) 144 (758%)
Age (years) 357 (1-68; 16·4) 347 (1-74; 15·9)
< 6 years 7 (37%) 7 (37%)
6-14 years 10 (53%) 14 (74%)
> 14 years 172 (910%) 169 (889%)
Weight 688 (85-1179; 188) 684 (95-1110; 203)
Concomitant illness 25 (132%) 28 (147%)
Residing in Manaus urban area
170 (895%) 174 (916%)
Temperature (C) 372
(349-401; 13)
371
(350-400; 13)
Temperature ≥ 375C 85 (450%) 77 (405%)
Geometric mean
parasite density per L (95%CI)
1746
(1475-2068)
1643
(1412-1912)
Positive gametocytaemia
105 (556%) 114 (600%)
Haemoglobin (g/dL) 133 (73-183; 19) 132 (78-173; 17)
Data are expressed as percentage or mean (range; SD), unless specified otherwise; * for those with positive gametocytaemia.
96
96
Table 3. Adequate clinical and parasitological response (ACPR) by timepoint (per-
protocol population) Artesunate-
amodiaquine (n=165)
Chloroquine (n=172)
Difference (95%CI) p value
Day 28 Genotype-adjusted ACPR
165 (100%) 161 (936%) 64% (27 to 101) 0001
Total Failures 0 11 (6
Late Clinical Failure 0 4 (23%)
Late Parasitological Failure
0 7 (41%)
Genotype classification of failures
Same genotype 0 10 (58%)
Different genotype 0 2 (12%)
Indeterminate 0 1 (06%)
Unadjusted ACPR 165 (1000%) 159 (924%) 76% (36 to 115) <0001
Total Failure 0 13 (75%)
Total Failure 0 4 (23%)
Late Parasitological Failure
0 9 (52%)
Day 42 n=155 n=166
Genotype-adjusted ACPR
151 (974%) 129 (777%) 197% (129 to 265) <0001
Total Failures 4 (26%) 37 (223%)
Late Clinical Failure 2 (13%) 14 (84%)
Late Parasitological Failure
2 (13%) 23 (139%)
Genotype classification of failures*
Same genotype 3(19%) 31 (201%)
Different genotype 2 (13%) 7 (42%)
Indeterminate PCR 1 (07%) 6 (36%)
Unadjusted ACPR 149 (961%) 122 (735%) 226% (153 to 300) <0001
Total Failure 6 (39%) 44(369%)
Late Clinical Failure 2 (13%) 17 (102%)
Late Parasitological Failure
4 (26%) 27 (163%)
Parasite and fever clearance
Parasite cleared at D1 33 (200%) 4 (23%) <0001
Parasite cleared at D2 144 (873%) 77 (448%) <0001
Parasite cleared at D3 164 (994%) 138 (802%) <0001
Fever cleared at D1 164 (994%) 154 (895%) <0001
*Genotyping detailed data available in Table S1.
97
97
Table 4. Efficacy assessments at days 28 and 42 (ITT population). Artesunate-
amodiaquine (n=189)
Chloroquine (n=190)
Difference (95%CI)
p value
Day 28
Genotype-adjusted ACPR
177 (937%) 172 (905%) 31% (-23 to 85) 0.342
Total Failures 12 (63%) 18 (95%)
Late Clinical Failure 0 (00%) 4 (21%)
Late Parasitological Failure
0 (00%) 7 (37%)
Missing data* 12 (63%) 7 (37%)
Genotype classification of failures
Same genotype 0 10 (58%)
Different genotype 0 2 (12%)
Indeterminate PCR 0 1 (06%)
Unadjusted ACPR 177 (937%) 170 (895%) 42% (-14 to 98) 0195
Total Failure* 12 (63%) 20 (105%)
Late Clinical Failure 0 4 (21%)
Late Parasitological Failure
0 9 (47%)
Day 42
Genotype-adjusted ACPR
162 (857%) 136 (716%) 141% (60 to 223) <0001
Total Failures 27 (143%) 54 (284%)
Late Clinical Failure 2 (11%) 15 (79%)
Late Parasitological Failure
2 (11%) 26 (137%)
Missing data* 23 (122%) 13 (68%)
Genotype classification of failures
Same genotype 3 (16%) 35 (184%)
Different genotype 2 (11%) 7 (37%)
Indeterminate PCR 1 (05%) 7 (37%)
Unadjusted ACPR 160 (847%) 129 (679%) 168% (84 to 252) <0001
Total Failure 29 (155%) 61 (321%)
Late Clinical Failure 2 (11%) 18 (95%)
Late Parasitological Failure
4 (21%) 30 (158%)
Parasite and fever clearance
Parasite cleared at D1 38 (201%) 9 (47%) <0001
Parasite cleared at D2 162 (857%) 89 (468%) <0001
Parasite cleared at D3 184 (974%) 153 (805%) <0001
Fever cleared at D1 184 (974%) 168 (884%) <0001
. *Genotyping detailed data available in Table S1.
98
98
Table 5Most frequent adverse events reported in the safety population
Artesunate-amodiaquine
(n=190*)
Chloroquine (n=190)
All adverse events¶
Patients with at least one event 79 (416%) 85 (447%)
Cardiac disorders 35 (184%) 21 (111%)
Skin disorders Infections and infestations
14 (74%)
16 (8.4%)
23 (121%)
21 (11.1%)
Gastrointestinal disorders 16 (84%) 15 (79%)
Psychiatric disorders/Insomnia 8 (42%) 12 (63%)
Oral herpes 9 (47%) 7 (37%)
Drug-related adverse events†
Patients with at least one 59 (311%) 47 (147%)
Sinus bradycardia 28 (147%) 11 (58%)
Pruritus 13 (68%) 19 (100%)
Alanine aminotransferase increased 9 (47%) 8 (42%)
Gastritis 8 (42%) 5 (26%)
Insomnia 2 (11%) 4 (21%)
Vomiting 2 (11%) 1 (05%)
Diarrhoea 2 (11%) 0 (00%)
At least one event of special interest 8 (42%) 9 (47%)
Alanine aminotransferase increase 8 (42%) 8 (42%)
Neutropenia 0 1 (05%)
Serious adverse events¶
Patients presenting at least one SAE* 3 (16%) 0
Vomiting 3 0
Severe gastritis 1 0
Extra-pyramidal syndrome 1 0
¶ Only shown AEs affecting at least 4% in each group; † only shown events affecting at least 1% of the population in each group; *the patient with mixed infection detected by PCR was included in the safety
analyses¶All events classified as SAEs based on the need for IV medication to alleviate the symptoms – there was no investigational product discontinuation nor deaths in the study.
99
99
Figures
Figure 1 – Flowchart of the study. PP – per-
protocol; ITT, intention-to-treat. *some patients
had more than 1 reason for exclusion.
959 patients diagnosed with P. vivax screened
380 patients enrolled and randomized
573 did not meet the eligibility criteria
252 unable to attend all visits
151 parasitemia < 250/L
85 with underlying illness or abnormal lab results
29 antimalarial treatment in the previous 30 days
17 pregnant or breastfeeding women
17 refusals to participate
7 below 6 months-old
1 with severe malaria
1 mixed infection
3052 not screened for eligibility
189 assigned to the ASAQ arm
(intention-to-treat-population) 190 assigned to the CQ arm (intention-to-treat-population)
165 (86.8%) patients in D28 PP population
155 (82.0%) patients in D42 PP population
1 excluded for mixed infection on PCR
24 patients excluded of the PP analysis 12 patients lost to follow-up
(4 incomplete course of treatment)
12 protocol deviations
172 (90.5%) patients in D28 PP population 166 (87.4%) patients in D42 PP population
18 patients excluded of the PP analysis 7 patients lost to follow-up (1 incomplete course of treatment) 11 protocol deviations
100
100
Figure 2- Kaplan-Meier estimates for time to recurrence. A- PCR-corrected per-protocol (PP) population; B- crude
estimate PP population; C- PCR-corrected intention-to-treat population; D- crude estimate ITT population. P-value
from log-rank test.
101
101
Figure 3. A – Genotype of failures in both arms is shown as same (red diamonds) or distinct (black dots) genotype according to day of follow-up (lines show the median day of failure); B – CQ/DCQ blood levels on the day of failure from patients in the CQ arm according to genotype classification (line demarks the 100ng/mL threshold).
Figure 4 – Cumulative risk of gametocyte incidence for patients without
gametocytes at baseline. A- per-protocol population; B- intention-to-treat
population. P-value from the log-rank test.
Figure 5- Change of haemoglobin levels. Haemoglobin concentrations are shown
for D0, D7 and D28 for each treatment arm (Mean; Error bars – 95% confidence
interval).
D0
D7
D28
12
13
14
15
ASAQ
CQ
Me
an
ha
em
og
lob
in c
on
ce
ntr
ati
on
(g
/dL
)
Supplement 1. Methods and results of the molecular characterization and
classification of samples from patients presenting recurrence of parasitaemia.
DNA Extraction
Genomic DNA was extracted from filter paper The extraction of total DNA from whole
blood was performed using the QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen®, USA), according
to the manufacturer’s protocol.
PCR analyses for genotyping
46 paired samples (D0, sample before treatment and DR, sample at reappearance) were
analysed regarding size polymorphisms of genetic markers. The microsatellite markers
MS2 and MS8 had been shown high genetic diversity in South America previously [1–5].
Msp1F3, a highly polymorphic region of the merozoite surface protein 1 was including
due to reduced occurrence of PCR artefacts of this marker [6].
Nested or semi-nested PCR was carried out as described by Koepfli et al. [7] with small
modifications. Primary PCR reaction was performed as a multiplex reaction, nested PCR
was carried out as simplex reactions. PCR analyses were repeated up to two times if
after the first run no PCR product was obtained. The primary PCR reaction volume was
15 µL containing 1.5 µL of Buffer B (Solis BioDyne), 2 mmol/L MgCl2, 0.3 mmol/L dNTPs
(supplier), 0.27 µmol/L of each primer and 3.75 U of Taq DNA polymerase (Firepol [Solis
BioDyne]). 1 µL of genomic DNA was used as template. In nested PCR reactions 0.2
mmol/L dNTPs were used, 0.25 µmol/L of each primer, 1.125 U of DNA polymerase and
1 µL of primary PCR product as template. Cycling conditions for primary PCR were as
follows: initial denaturation for 1 min at 95°C followed by 30 cycles of 30 sec at 95°C, 45
sec at 59°C and 1 min at 72°C. Final elongation was for 5 min at 72°C. For each
experiment at least two negative controls containing dH2O instead of water were
included. Nested PCR was carried out at the same cycling conditions with the exception
of only 25 cycles being carried out. For repetitions, reaction volume was increased to 50
µL for primary PCR and 25 µL for nested PCR, DNA template was increased to 3 - 3.5 µL
and number of cycles was increased to 35 in nested PCR. PCR products were stored at
4ºC in the dark until being analysed.
Capillary electrophoresis and data interpretation
Successful amplification of region of interest was tested by 2 % agarose gel
electrophoresis. PCR products were diluted by adding 5 µL of mQH2O and samples were
sent to Macrogen Inc. (South Korea) for capillary electrophoresis. As size standard 500-
LIZ was applied. Data were analysed with GeneMarker version 2.4.2 (SoftGenetics).
Electrophoretic profiles were evulated visually for each sample with regard to amplicon
length and relative abundance (peak height). Peaks below 150 bp were not considered
and the minimal cut-off value for peak height was set to 500 relative fluorescence units
(rfu) in order to exclude peaks resulting from background noise. So called “stuttering”
(“shadow”) peaks [8] were not considered.
Capillary electrophoresis results of both samples of each pair (D0 and DR) were
compared with GeneMarker software. Alleles of paired sampled were classified as equal
for a maximum difference of allele size of 1 bp. According to WHO guidelines a sample
was classified as recrudescence or relapse if at least one allele for each loci investigated
was detected in both paired samples [9, 10]. The guidelines classify post- treatment
occurring parasitemia as new infection (reinfection) if all alleles for one marker gene are
distinct between D0 and DR. A new infection detected for only one locus investigated
was therefore classified as “new infection” as the overall outcome [9].
1. Rezende AM, Fontes CJF, Souza JM, Couto ADA, Carvalho LH: Microsatellite loci :
determining the genetic variability of Plasmodium vivax. 2010, 15:718–726.
2. Marín-Menéndez A, Bardají A, Martínez-Espinosa FE, Bôtto-Menezes C, Lacerda M V,
Ortiz J, Cisteró P, Piqueras M, Felger I, Müeller I, Ordi J, del Portillo H, Menéndez C,
Wahlgren M, Mayor A: Rosetting in Plasmodium vivax: a cytoadhesion phenotype
associated with anaemia. PLoS Negl Trop Dis 2013, 7:e2155.
3. De Araujo FCF, de Rezende AM, Fontes CJF, Carvalho LH, Alves de Brito CF:
Multiple-clone activation of hypnozoites is the leading cause of relapse in
Plasmodium vivax infection. PLoS One 2012, 7:e49871.
4. Orjuela-Sánchez P, da Silva NS, da Silva-Nunes M, Ferreira MU: Recurrent
parasitemias and population dynamics of Plasmodium vivax polymorphisms in
rural Amazonia. Am J Trop Med Hyg 2009, 81:961–8.
5. Chenet SM, Schneider K a, Villegas L, Escalante A a: Local population structure of
Plasmodium: impact on malaria control and elimination. Malar J 2012, 11:412.
6. Koepfli C, Ross A, Kiniboro B, Smith TA, Zimmerman PA, Mueller I, Felger I:
Multiplicity and diversity of Plasmodium vivax infections in a highly endemic
region in Papua New Guinea. PLoS Negl Trop Dis 2011, 5:1–7.
7. Koepfli C, Mueller I, Marfurt J, Goroti M, Sie A, Oa O, Genton B, Beck H-P, Felger I:
Evaluation of Plasmodium vivax genotyping markers for molecular monitoring in
clinical trials. J Infect Dis 2009, 199:1074–1080.
8. Oda S, Oki E, Maehara Y, Sugimachi K: Precise assessment of microsatellite
instability using high resolution fluorescent microsatellite analysis. Nucleic Acids
Res 1997, 25:3415–20.
9. WHO: METHODS AND TECHNIQUES FOR CLINICAL TRIALS ON ANTIMALARIAL
DRUG EFFICACY : genotyping to identify parasite populations. WHO, Geneva 2008.
10. Barnadas C, Koepfli C, Karunajeewa H a, Siba PM, Davis TME, Mueller I:
Characterization of treatment failure in efficacy trials of drugs against Plasmodium
vivax by genotyping neutral and drug resistance-associated markers. Antimicrob
Agents Chemother 2011, 55:4479–81.
Table S1. Results of the PCR genotyping procedures and classification of parasites presenting at recurrences according
to the baseline genotypes.
Msp1F3 MS2 MS8 (bp)
Outcome all
markers
SampleID Individual/time point
Amplicon Length (bp)
Outcome Amplicon
Length (bp) Outcome
Amplicon Length (bp)
Outcome
002_D0 1 D0 271 Re/Re
216 Re/Re
235 Re/Re Re/Re
002_DR 1 DR 271 216 235
005_D0 2 D0 230/298 Re/Re
193/213 Re/Re
n/a no result Re/Re
005_DR 2 DR 230 193 293
014_D0 3 D0 271 Re/Re
197 Re/Re
235 Re/Re Re/Re
014_DR 3 DR 271 197 235
015_D0 4 D0 230/271 Re/Re
193/216 Re/Re
235/293 Re/Re Re/Re
015_DR 4 DR 230/271 193/216 235/293
043_D0 5 D0 263 Re/Re
193 Re/Re
224 no result Re/Re
043_DR 5 DR 230/263 193 n/a
065_D0 6 D0 230 Re/Re
193 Re/Re
293 Re/Re Re/Re
065_DR 6 DR 230 193 293
099_D0 7 D0 271 Re/Re
228 Re/Re
287 no result Re/Re
099_DR 7 DR 271 228 n/a
105_D0 8 D0 230 Re/Re
193 Re/Re
293 Re/Re Re/Re
105_DR 8 DR 230 193 293
106_D0 9 D0 230/271 Re/Re
193 Re/Re
224 Re/Re Re/Re
106_DR 9 DR 230 193 224
114_D0 10 D0 230 Re/Re
193 Re/Re
293/232 Re/Re Re/Re
114_DR 10 DR 230 193 293
118_D0 11 D0 230/271 Re/Re
193 New infection
n/a no result New infection
118_DR 11 DR 230 212 259
135_D0 12 D0 230 no result
267 no result
259 no result no result
135_DR 12 DR n/a n/a n/a
137_D0 13 D0 230 Re/Re 193/212 Re/Re 285/293 no result Re/Re
137_DR 13 DR 230 193 n/a
149_D0 14 D0 272 Re/Re
260/263 Re/Re
296 Re/Re Re/Re
149_DR 14 DR 272 263 296
151_D0 15 D0 230 Re/Re
213 New infection
n/a no result New infection
151_DR 15 DR 230/299 162/197 n/a
157_D0 16 D0 272 Re/Re
213/263 Re/Re
n/a no result Re/Re
157_DR 16 DR 272 263 296
159_D0 17 D0 230/280 Re/Re
201 Re/Re
224 no result Re/Re
159_DR 17 DR 181/230 202/209/21
3 n/a
169_D0 18 D0 272 Re/Re
224 Re/Re
218 Re/Re Re/Re
169_DR 18 DR 272 224 218/244
178_D0 19 D0 230/271 Re/Re
193 New infection
235/293 New infection
New infection 178_DR 19 DR 272 263 296
184_D0 20 D0 271 Re/Re
216 Re/Re
235 Re/Re Re/Re
184_DR 20 DR 271 173/216 235/262/288
185_D0 21 D0 271 Re/Re
216 Re/Re
235 Re/Re Re/Re
185_DR 21 DR 271 216 235
186_D0 22 D0 271 Re/Re
216 Re/Re
n/a no result Re/Re
186_DR 22 DR 271 217 n/a
193_D0 23 D0 230 Re/Re
197 Re/Re
293 Re/Re Re/Re
193_DR 23 DR 230 197 293
206_D0 24 D0 230 Re/Re
212 Re/Re
258 Re/Re Re/Re
206_DR 24 DR 230 212 258
207_D0 25 D0 230/271 Re/Re
197 Re/Re
235 Re/Re Re/Re
207_DR 25 DR 271 197 235
209_D0 26 D0 272 New infection
205/263 New infection
296 no result New infection
209_DR 26 DR 182/230 209/213 n/a
211_D0 27 D0 271 New infection
194/263 Re/Re
n/a no result New infection
211_DR 27 DR 230 194 n/a
213_D0 28 D0 217/224/230 Re/Re
193 Re/Re
n/a no result Re/Re
213_DR 28 DR 230 193 293
227_D0 29 D0 230/272 Re/Re 197/228/26 New 235/296 Re/Re New infection
3 infection
227_DR 29 DR 230 212 235
233_D0 30 D0 272 Re/Re
197/260 Re/Re
296 New infection
New infection 233_DR 30 DR 272 225/260 218
238_D0 31 D0 230/272 Re/Re
212/267/276 Re/Re
n/a no results Re/Re
238_DR 31 DR 230 276 225/258
246_D0 32 D0 263/313 Re/Re
193 Re/Re
224 Re/Re Re/Re
246_DR 32 DR 263/271 193 224/250
248_D0 33 D0 230 Re/Re
209 Re/Re
299 Re/Re Re/Re
248_DR 33 DR 230 209 299
249_D0 34 D0 230 Re/Re
193 Re/Re
293 Re/Re Re/Re
249_DR 34 DR 230 193 293
265_D0 35 D0 230 Re/Re
202 Re/Re
224 Re/Re Re/Re
265_DR 35 DR 230 202 224
267_D0 36 D0 272 Re/Re
259 Re/Re
296 Re/Re Re/Re
267_DR 36 DR 272 259 296
276_D0 37 D0 230/276/280 Re/Re
212 Re/Re
235 Re/Re Re/Re
276_DR 37 DR 230/273/280 212 235
282_D0 38 D0 273/299 Re/Re
197 Re/Re
218 Re/Re Re/Re
282_DR 38 DR 299 197 218
283_D0 39 D0 298 Re/Re
197 Re/Re
218 New infection
New infection 283_DR 39 DR 298 197 235
285_D0 40 D0 272 Re/Re
197 Re/Re
236 Re/Re Re/Re
285_DR 40 DR 272 197 235
295_D0 41 D0 230 Re/Re
271/275 no result
259 no result Re/Re
295_DR 41 DR 230/271 213/275/27
9 n/a
314_D0 42 D0 n/a no result
n/a no result
n/a no result no result
314_DR 42 DR 230/270 213 258
322_D0 43 D0 230 Re/Re
213 Re/Re
236 Re/Re Re/Re
322_DR 43 DR 230/272 213 236
331_D0 44 D0 272 Re/Re 240 Re/Re 302 no result Re/Re
331_DR 44 DR 272 240 n/a
335_D0 45 D0 257 Re/Re
208 Re/Re
273 Re/Re Re/Re
335_DR 45 DR 257 208 273
343_D0 46 D0 230 Re/Re
194 Re/Re
296 no result Re/Re
343_DR 46 DR 230/272 194 n/a
349_D0 47 D0 230 Re/Re
201 Re/Re
287 Re/Re Re/Re
349_DR 47 DR 230 201 288
371_D0 48 D0 263/268
New infection
209
Re/Re
255 New
infection New infection
371_DR 48 DR 181/257/230/
272 119/213/20
9 294
n/a - no PCR product obtained Re/RE - relapse or recrudescence
112
4.2. ARTIGO 2
4.2.1. SLOW CLEARANCE OF PLASMODIUM VIVAX WITH CHLOROQUINE
AMONGST CHILDREN BELOW SIX MONTHS OF AGE IN THE BRAZILIAN
AMAZON
Siqueira, A. M., L. I. Coutinho, R. L. Gurgel, W. C. S. Su, L. M. Carvalho, S. G.
Benzecry, A. C. C. Alencar, M. A. A. Alexandre, M. G. C. Alecrim and M. V. G.
Lacerda (2014). "Slow clearance of Plasmodium vivax with chloroquine amongst
children below six months of age in the Brazilian Amazon." Memorias do Instituto
Oswaldo Cruz [Aceito], DOI: 10.1590/0074-0276130068.
113
114
115
116
117
118
119
120
4.3. ARTIGO 3
4.3.1. PREVALENCE AND RISK FACTORS ASSOCIATED TO PRURITUS IN
PLASMODIUM VIVAX PATIENTS USING CHLOROQUINE IN THE BRAZILIAN
AMAZON Ballut, P. C., A. M. Siqueira, A. C. Orlando, M. A. Alexandre, M. G. Alecrim and M.
V. Lacerda (2013). "Prevalence and risk factors associated to pruritus in
Plasmodium vivax patients using chloroquine in the Brazilian Amazon." Acta
Tropica 128(3): 504-508.[DOI: 10.1016/j.actatropica.2013.07.008].
121
122
123
124
125
126
127
4.4. ARTIGO 4
4.4.1 INFLUENCE OF AGE ON THE HAEMOGLOBIN CONCENTRATION OF MALARIA-INFECTED PATIENTS IN A REFERENCE CENTRE IN THE BRAZILIAN AMAZON
Siqueira, A. M., Cavalcante, J. A., Vitor-Silva, S., Reyes-Lecca, R. C., Alencar, A. C.,
Monteiro, W. M., Alexandre, M. A. A., Mourão, M. P. G., Guinovart, c., Bassat, Q.,
Alecrim, M. G. C., and M. V. G. Lacerda (2014). “Influence of age on the haemoglobin
concentration of malaria-infected patients in a reference centre in the Brazilian Amazon."
Memorias do Instituto Oswaldo Cruz [Aceito].
128
129
130
131
132
133
134
135
136
4.5. ARTIGO 5
4.5.1. CHARACTERIZATION OF PLASMODIUM VIVAX-ASSOCIATED ADMISSIONS
TO REFERENCE HOSPITALS IN BRAZIL AND INDIA Artigo submetido para BMC Medicine em 18/07/2014. Aceito em 222/2015
137
Characterization of Plasmodium vivax-associated admissions to reference hospitals in Brazil and India
André M Siqueira1,2,3 Email: [email protected]
Marcus VG Lacerda1,2,4,* Email: [email protected]
Belisa M L Magalhães1,2 Email: [email protected]
Maria PG Mourão1,2 Email: [email protected]
Gisely C Melo1,2 Email: [email protected]
Márcia AA Alexandre1,2 Email: [email protected]
Maria GC Alecrim1,2 Email: [email protected]
Dhanpat Kochar5 Email: [email protected]
Sanjay Kochar5 Email: [email protected]
Abhishek Kochar5 Email: [email protected]
Kailash Nayak5 Email: [email protected]
Hernando del Portillo6,7 Email: [email protected]
Caterina Guinovart6,8 Email: [email protected]
Pedro Alonso6,8 Email: [email protected]
Quique Bassat6,8 Email: [email protected]
138
1 Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, Universidade do Estado do Amazonas, Av. Pedro Teixeira, 25, Manaus, AM, 69040-000, Brazil
2 Gerência de Malaria, Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado, Av. Pedro Teixeira, 25, Manaus, AM, 69040-000, Brazil
3 Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Av. Brasil, 4365, Rio de Janeiro, RJ, 21040-360, Brazil
4 Centro de Pesquisas Leônidas e Maria Deane, Fundação Oswaldo Cruz, Rua Teresina, 476, Manaus, AM, 69027-070, Brazil
5 Sardar Patel Medical College, SP Medical College Road, PBM Hospital, Bikaner, Rajasthan 334001, India
6 ISGlobal, Barcelona Institute for Global Health, Hospital Clínic - Universitat de Barcelona, Carrer Rosselló 132, 5º2ªE, 08036, Barcelona,, Spain
7 Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), Passeig Lluís Companys, 23, 08010, Barcelona, Spain
8 Centro de Investigação em Saúde de Manhiça (CISM), Vila da Manhiça, Bairro Cambeve, Rua 12, Distrito da Manhiça, 1929, Maputo, Mozambique
* Corresponding author. Centro de Pesquisas Leônidas e Maria Deane, Fundação Oswaldo Cruz, Rua Teresina, 476, Manaus, AM, 69027-070, Brazil
Abstract
Background
The benign character formerly attributed to Plasmodium vivax infection has been
dismantled by the increasing number of reports of severe disease associated with
infection with this parasite, prompting the need for more thorough and
comprehensive characterization of the spectrum of resulting clinical complications.
Endemic areas exhibit wide variations regarding severe disease frequency. This
study, conducted simultaneously in Brazil and India, constitutes, to our knowledge,
the first multisite study focused on clinical characterization of P. vivax severe
disease.
139
Methods
Patients admitted with P. vivax mono-infection at reference centers in Manaus
(Amazon - Brazil) and Bikaner (Rajasthan - India), where P. vivax predominates,
were submitted to standard thorough clinical and laboratory evaluations in order to
characterize clinical manifestations and identify concurrent co-morbidities.
Results
In total, 778 patients (88.0% above 12 years old) were hospitalized at clinical
discretion with PCR-confirmed P. vivax mono-infection (316 in Manaus and 462 in
Bikaner), of which 197 (25.3%) presented at least one severity criterion as defined
by the World Health Organization (2010). Hyperlactatemia, respiratory distress,
hypoglycemia, and disseminated intravascular coagulation were more frequent in
Manaus. Noteworthy, pregnancy status was associated as a risk factor for severe
disease (OR = 2.03; 95%CI = 1.2-3.4; P = 0.007). The overall case fatality rate was
0.3/1,000 cases in Manaus and 6.1/1,000 cases in Bikaner, with all deaths occurring
among patients fulfilling at least one severity criterion. Within this subgroup, case
fatality rates increased respectively to 7.5% in Manaus and 4.4% in Bikaner.
Conclusion
P. vivax-associated severity is not negligible, and although lethality observed for
complicated cases was similar, the overall fatality rate was about 20-fold higher in
India compared to Brazil, highlighting the variability observed in different settings.
Our observations highlight that pregnant women and patients with co-morbidities
140
need special attention when infected by this parasite due to higher risk of
complications.
Keywords
Plasmodium vivax, Severe malaria, Clinical complications, India, Brazil
Background
Malaria is a major public health problem in most tropical regions, and despite
impressive reductions in the number of cases and deaths in the last decades,
malaria resulted in an estimated 207 million episodes and 627,000 deaths in 2012
[1]. Although the attention of the scientific community has focused in past decades
on the burden and consequences of P. falciparum infections [2,3], in recent years
there has been a renewed interest in P. vivax-associated morbidity, as a result of the
increasing report of its potential hazards to health [4-7].
P. vivax is the most geographically widespread parasite causing malaria in humans,
with over 2.5 billion individuals exposed to the risk of infection; it is the predominant
species in Latin America and some areas of the Asian and Pacific regions [1,8]. In a
context of renewed and intensified commitment of the international community
towards malaria eradication [4,9,10], a surge of interest has emerged regarding this
species, possibly because of the major challenges posed for its control, ensuing from
its poorly understood ability to present clinical relapses [5,10], but also due to its
capacity to cause a more complicated disease [11-13]. P. vivax benign clinical
course has now been completely reconsidered, as the evidence of life-threatening
disease has been reported from diverse endemic areas, such as Latin America
141
[7,14,15], India [16,17], and Southeast Asia and the Pacific regions [18,19]. In spite
of the World Health Organization (WHO) recognition as early as 2006 of the potential
of P. vivax to cause severe disease [20], there are still several gaps in knowledge to
be filled [5,11,21,22].
The diverse range and rate of occurrence of clinical complications associated to P.
vivax infection widely differ according to reports from different endemic regions,
suggesting that many unaccounted factors, including those related to the parasite,
the host, or the context in which the infection is produced may interact in causing the
clinical presentation [12]. Indeed not all endemic areas have been reporting severity
attributed to infection with this parasite, such as the Thailand-Myanmar border,
where severity was reported only very recently [23]. In the absence of adequate
experimental models, or the paucity of postmortem samples to further elucidate the
pathophysiology of this infection [5,13,24], systematic multisite clinical studies
become a unique opportunity to better understand this geographic variability and
characterize the severe vivax malaria syndrome. Indeed, comprehensive reviews of
the literature demonstrate that severe vivax malaria occurrence is an old, and not
infrequent, phenomenon that was not being properly recognized [12,25,26].
We have used a common protocol in order to prospectively follow vivax malaria
patients admitted to two distinct reference centers located in Brazil and India, aiming
to comprehensively characterize and compare the clinical complications of P. vivax
infection.
142
Methods
Study sites
The enrollment of cases was performed at two different reference tertiary hospitals
located in Brazil and India. Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado
(FMT-HVD) is located in the city of Manaus, in the Brazilian Western Amazon, with
150 beds for hospitalization. This hospital is the reference tropical medicine and
infectious disease center for the area, and receives patients from all over the
Amazonas state, referred or not to this service. Admission is free of charge, and
admission criteria for malaria patients are any clinical complications suggestive of
severe malaria, or complications impacting proper antimalarial treatment, such as
severe vomiting. Six other hospitals in town are the reference for pediatric diseases.
Anopheles darlingi is the major malaria vector in the region, with transmission
occurring continuously throughout the year with peaks in the beginning of the dry
and the wet season. In recent years there has been a decrease in the number of
reported episodes paralleled to an increase in the proportion of cases attributed to P.
vivax, which is now responsible for more than 90% of cases of malaria in the region
[27]. Sardar Patel Medical College (SPMC) hospital is located in Bikaner in the
Rajasthan state of India, where, as a result of environmental and climatic reasons,
malaria transmission has a well-defined seasonal pattern with practically no cases
being reported during the dry season, and P. vivax is responsible for 50% of the
cases [28]. An. stephensi, An. culifascies, and An. annularis are the major malaria
vectors in the region (Figure 1). The hospital includes around 500 beds for
hospitalization in general, and a specific malaria ward, which remains closed except
for the duration of the malaria season. The hospital receives referrals from the entire
143
Rajasthan state, although other hospitals (including private ones) are also available
for patients in the area. Admission is free with the exception of certain subsidized
procedures, and during the malaria season most of the patients are routinely
admitted to this ward, often because they are being referred. Neither of the two
hospitals is a specifically pediatric referral center, although pediatric patients may be
admitted in both.
Figure 1. Epidemiological profile of the two studied sites: P. vivax 2010 annual
parasite index in Brazil (A) and India (B) (reproduced from the Malaria Atlas
Project [8]); malaria transmission scenarios in the rainforest, Manaus, Brazil
(C) and in the desert, Bikaner, India (D); reference tertiary care center façades
in Manaus (E) and Bikaner (F).
Study design and patient selection
This was a hospital-based study of patients admitted with vivax malaria at the two
study centers, regional references mostly for the adult population. Enrollment in
Manaus occurred in two distinct periods (between April 2009 and March 2010, and
between January 2011 and December 2011), while in Bikaner patients were
recruited between August 2009 and October 2010. All initial microscopy-confirmed
P. vivax infections (or patients with negative thick blood smears (TBSs) but with
history of previous recent diagnosis in use of antimalarials) requiring admission, at
clinician’s discretion (for example, for the presence of jaundice, thrombocytopenia,
bleeding, vomiting, diarrhea, abdominal pain, non-lithiasic cholecystitis, spleen
rupture, or overall compromised clinical status), regardless of age, were eligible for
enrollment provided patients or their legal representatives signed an informed
consent. All enrolled patients were hospitalized in separate wards designed for
144
clinical research and were followed and evaluated daily until discharge, when the
final outcome of each case was registered after consensual discussion performed by
the clinical team involved in the study.
The same protocol for clinical and laboratory investigations was applied at both sites,
including standard operating procedures (SOPs) and questionnaires. The study
procedures were standardized and supervised by co-investigators from both sites
and supervised by study monitors from ISGlobal (authors QB and CG) to minimize
potential discrepancies in their application.
Clinical evaluation and management
At enrollment all patients underwent an initial comprehensive clinical assessment
based on a clinical history and physical examination. Data were prospectively
collected using a standardized questionnaire, which included the description of the
duration and intensity of the clinical symptoms, a thorough clinical examination, and
complementary tests (complete blood cell count and biochemical analyses). The
history of previous malaria infections and antimalarial use was obtained through
medical history and health surveillance and health unit records revision. Blood
samples were collected for PCR confirmation of P. vivax mono-infection and for a
detailed evaluation of coexisting acute and chronic morbidities, when suspected by
the clinicians, while women of reproductive age were additionally tested routinely for
their pregnancy status. When available at each site, and according to individual
clinical presentation, imaging exams were performed, such as abdominal or trans-
vaginal ultrasound, computerized tomography, and fundoscopy. Treatment was
provided according to WHO recommendations and national guidelines, with the use
of chloroquine (25 mg/kg over 3 days) in non-complicated patients, or parenteral
145
artemether or artesunate in patients with suspicion of severe malaria or severe
vomiting, followed by primaquine (3.5 mg/kg over 7 days in Brazil, and over 14 days
in India) [29,30]. In India, patients with severe criteria were also systematically
prescribed wide spectrum antibiotics upon admission. Clinical assessments and TBS
were performed on a daily basis. Additional and follow-up laboratory tests were
performed at the physician’s discretion.
Diagnosis of malaria
For the diagnosis and quantification of parasitemia, the TBS was prepared as
recommended by the Walker technique [31]. In addition to the reading performed for
patients’ diagnosis, each blood slide was analyzed independently by two
microscopists. A slide was recorded as negative if no parasite was detected in the
200-field reading. If parasites were detected on the slide, quantification was
performed by counting the number of asexual and sexual parasites until either 500
leukocytes or 500 parasites were counted (whichever occurred first). In case of
discordance (species-specific, or in the density quantification whenever discrepancy
was higher than 10%), a third reading was performed by a different microscopist.
The parasite density was calculated by the arithmetic mean of two concordant
readings and the white blood cell count obtained from the total blood count analysis
as previously described [32]. In addition, species-specific real-time PCR for
Plasmodium was performed to confirm P. vivax mono-infection status and exclude P.
falciparum co-infection. P. malariae was not tested considering previous data from
both sites confirming the absence of circulation of this species in the study areas.
The extraction of total DNA from whole blood was performed using the QIAamp DNA
144 Blood Mini Kit® (Qiagen, USA), according to the manufacturer’s protocol, and
146
amplification was done in an Applied Biosystems 7500 Fast System® using primers
and TaqMan fluorescence labeled probes [33].
Case definitions and classification
Patients were classified in relation to their clinical symptomatology and laboratory
results. The presence of the WHO-defined severe malaria criteria and syndromes
was systematically assessed at admittance and during the whole length of
hospitalization at both sites, with cases being classified accordingly to the criteria
described in Table 1 [30]. The results for the worst tests were recorded in the Case
Report Form (CRF) and the last results were used for case closure purposes. The
systematic assessment at admission consisted of full blood count, biochemistry
analyses (creatinine, urea, bilirubin, aspartate aminotransferase, alanine
aminotransferase, gamma-glutamyltransferase, albumin, and venous lactate), urine
analysis, pregnancy tests for women between 12 and 50 years of age, and chest X-
rays. We also classified patients according to the number of severe criteria fulfilled
as a proxy of higher severity, for which more specific and easier applicable criteria
[7] were used: severe anemia (hemoglobin <7 g/dL in adults and <5 g/dL in children);
respiratory distress/acute lung injury; circulatory shock (systolic blood pressure < 90
mmHg refractory to fluid); acute renal failure; and cerebral malaria. A cut-off was
decided to categorize cases as more severe if they presented three or more severe
criteria.
Table 1. Demographic and epidemiological characteristics of enrolled patients at both sites
Severe N = 197
Non-severe N = 518
P
Female sex 133 (55.5%) 225 (43.5%) 0.003
Age < 12 years old 10 (5.1%) 23 (5.0%) 0.422
147
Duration of fever (days): Mean (SD) 5.4 (3.8) 5.7 (7.1) 0.453*
First malarial infection 27 (12.7%) 88 (16.5%) 0.187
Antimalarials in the preceding 30 days 41 (18.6%) 78 (14.2%) 0.030
Geometric mean P. vivax density on admission (parasites/mm3; 95%CI) ¶
2,267 (1,872-2,745)
1,902 (1,667-2,169)
<0.001
Pregnancy (among females of reproductive age)
37/114 (32.5%) 97/227 (18.5%)
0.004
Any co-morbidity 31 (15.9%) 92 (17.8%) 0.527
Heart rate (beats/min): Mean (SD) 87.1 (12.8) 85.0 (11.8) 0.032*
Respiratory rate (breaths/min): Mean (SD) 18.8 (4.0) 19.4 (4.9) 0.126*
Temperature (°C): Mean (SD) 37.9 (1.1) 37.5 (1.1) <0.001*
Hepatomegaly 47 (21.6%) 141 (25.8%) 0.217
Splenomegaly 68 (31.2%) 131 (24.0%) 0.041
Hemoglobin (g/dL): Mean (SD) 7.7 (3.1) 10.9 (2.6) <0.001*
White blood cell count (x 1,000 cells/mm3): Mean (SD)
8.6 (10.4) 6.5 (3.8) <0.001*
Platelets (x 1,000 cells/mm3): Mean (SD) 74.1 (88.9) 72.5 (90.9) 0.824*
Creatinine (mg/dL): Mean (SD) 1.4 (1.6) 0.9 (0.4) <0.001*
Urea (mg/dL) : Mean (SD) 51.2 (49.7) 38.9 (20.3) <0.001*
Total bilirubin (mg/dL): Mean (SD) 2.9 (5.9) 2.2 (3.5) 0.0498*
ALT (U/L): Mean (SD) 50.5 (85.6) 42.2 (81.3) 0.222*
Lactate (mmol/L): Mean (SD) 5.0 (13.4) 2.0 (2.5) 0.010*
P-value obtained by chi-square test or Student t test with the latter identified (*); ¶ restricted to patients without prior exposure to antimalarials (P-value derived from Poisson regression).
Table 2. Description of chronic and acute co-morbidities diagnosed in P. vivax-infected patients admitted to two reference centers in Brazil and India
n
Chronic co-morbidities* 84
Arterial hypertension 34
Diabetes 28
Chronic hepatitis C infection1 14
HIV/AIDS2 8
Chronic hepatitis B infection3 8
Chronic renal failure 2
Acute co-morbidities and investigations 87
Blood culture
Dengue fever4 68
Pneumonia 9
Enteric fever 3
Lepstopirosis5 2
Hepatitis A infection6 2
Varicella-zoster virus meningoencephalitis 1
Sickle cell disease crisis 1
148
Diphteria 1 1Defined by positive anti-HCV serology; 2defined by serology; 3defined by positive HBsAg; 4defined by positive PCR and/or NS1 test; 5defined by positive IgM; 6defined by positive IgM anti-HAV. *Uncertain denominators as investigations were made at attending physician’s discretion.
The performance of additional investigations for co-morbidities was triggered either
for specific manifestations and/or at the physician’s discretion. These criteria
included: i) severe anemia: hemoglobinopathies investigation and glucose-6-
phosphate dehydrogenase (G6PD) assessments, and abdominal ultrasound; ii)
respiratory distress: chest X-rays, blood gas, chest computerized tomography (CT)
scan, and blood cultures; iii) ALT. 200 U/L: serology against hepatitis A, hepatitis E
(only in India), and dengue; iv) creatinine > 3 mg/dL: renal ultrasound, 24-h
proteinuria measurement and creatinine clearance; v) cerebral malaria: CT scan and
lumbar puncture (if not contraindicated); and vi) severe abdominal pain: abdominal
ultrasound. HIV testing (serology) was conducted for all admitted patients.
Additionally, co-infection with dengue fever (by serology and PCR), and leptospirosis
(serology) were systematically investigated in all admitted patients in Manaus. Blood
cultures were performed in Bikaner, although samples were collected after patients
had been started on antibiotics, a practice which is routine among patients with
severity criteria. In Manaus, two blood culture samples were drawn for all admitted
patients with severe criteria (10 mL of blood). Chronic co-morbidities were
determined based on patients’ provided information and assessment of medical
records. For these analyses, patients admitted due to primaquine-induced hemolysis
(only observed in Manaus) were excluded, and the details concerning its
presentation and outcomes will be presented in a separate publication (in
preparation).
149
Statistical analysis
All the data were double entered in forms designed in the Open Clinica® online
platform, with the discordances and inconsistencies corrected according to a pre-
established protocol. Only hospitalized patients with PCR-confirmed P. vivax mono-
infection were included for the analyses. The demographic and clinical
characteristics of patients were described in terms of proportions and compared
using the chi-square or Fisher test as appropriate. Unadjusted simple logistic
regression analyses were also performed considering different outcomes, especially
the fulfillment of WHO severe criteria for P. falaciparum [20] and death. Further
description and analyses were performed for each of the main severe complications
observed in order to provide a broader picture of the clinical spectrum of this
infection. Unadjusted linear regression was undertaken to explore the association
between number of severe criteria and risk factors. Multiple analyses were not
performed, because the sample size did not offer sufficient power for that purpose.
The diagnostic performance of laboratorial parameters for identifying severity or
multiplicity of severity criteria was assessed by means of receiver operating
characteristic (ROC) curves. The analyses were performed using SPSS® version
16.0 for Windows (SPSS Inc. ® Chicago, IL, USA) and Stata version 13.1
(StataCorp®, College Station, TX, USA).
Ethical considerations
The study was approved by the Ethics Review Board (ERB) of Hospital Clínic,
Barcelona, Spain (4510/2008), the ERB of Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor
Vieira Dourado, Manaus, Brazil (1943/2008), the National Brazilian Committee of
150
Ethics (CONEP) (343/2009), and the ERB of Sardar Patel Medical College &
Associated Groups of Hospitals, Bikaner, India (24/12/2008).
Results
Study subjects
During the study period, 316 and 462 patients were admitted with vivax malaria in
Manaus and Bikaner respectively (Figure 2) with three and seven associated
fatalities per site. Among the patients with fatal outcome, there was a predominance
of women (eight patients), four of them pregnant, with patients from Manaus
presenting higher age and number of co-morbidities compared to Bikaner. The
characteristics of the 10 patients with fatal outcome are presented in Additional file 1:
Table S1. Only in Manaus was P. falciparum/P. vivax co-infection seen in one patient
with severe criteria. Among patients without WHO criteria, no deaths were observed.
On admission, 24 patients had a negative TBS, all of them having initiated
antimalarials in other health units, of which PCR was positive for P. vivax in 14 of
them. There were 47 patients admitted in Manaus due to primaquine-associated
hemolysis and associated complications, all of them with G6PD deficiency, with no
patient being diagnosed with this condition in Bikaner.
Figure 2. Number of diagnosed, hospitalized, severe, and deceased patients
with P. vivax malaria, during the study period in Manaus (A) and Bikaner (B).
{AU Query: Please see 2 lines below in the next paragraph. Instead of Table 1,
should we refer to Table 3?} – Yes, thank you!
151
Regardless of the frequency of specific complications, in Manaus more patients with
co-morbidities were admitted, however with similar proportion of deaths (Table 3).
Antibiotics were administered to 24 patients in Manaus, for treatment of pneumonia
in 16 patients, cellulitis in 4 patients, amebiasis in 2, and enteritis in 2. Although
blood and urine cultures were obtained from all these patients prior to therapy, only
in one patient was a microorganism identified (Staphylococcus aureus associated
with cellulitis). In Bikaner, antibiotics were administered to 230 patients (with 62.7%
of those with at least one severe criterion receiving them). Additional investigations
were performed, as aforementioned, at physicians’ discretion or triggered by specific
manifestations, limiting the estimation of its occurrence within the study population.
The main chronic and acute co-morbidities diagnosed in these patients are
described in Table 3. Dengue fever co-infection, due to its high occurrence and
public health importance in Manaus, has been described in another publication [34].
Table 3. Epidemiological and clinical characteristics of P. vivax patients admitted to tertiary care centers in Brazil and India, with the diagnosis of severe malaria according to WHO criteria
Manaus (Brazil) Bikaner (India) P
Demographic and epidemiological characteristics
Female sex 16/40 (40.0%) 98/157 (62.4%) 0.010
Age <12 years old 7/40 (17.5%) 3/157 (1.9%) <0.001
First malarial infection 25/40 (62.5%) 149/150 (99.3%)
<0.001
Pregnancy (among females of reproductive age)
11/16 (68.8%) 67/98 (68.4%) 0.976
Clinical characteristics
Severe anemia (Hb < 5 g/dl if age < 12 and Hb < 7 if age ≥ 12)
19/40 (47.5%) 83/157 (53.2%) 0.519
Acute renal failure (Creatinine > 3 mg/dL and/or urinary output < 0.5 ml/kg/h for 6 hours)
9/40 (22.5%) 18/157 (11.5%) 0.073*
Hyperlactatemia (lactate > 5 mmol/L)
5/40 (15.2%) 4/157 (2.6%) 0.343*
152
Respiratory distress (PaO2/FiO2 ≤ 300 mmHg and/or bilateral opacities on X-ray)
7/40 (17.5%) 5/157 (3.2%) 0.002*
Hypoglycemia (blood glucose < 40 mg/dL)
4/40 (10.0%) 1/157 (0.7%) 0.001*
Shock (SBP > 90 mmHg refractory to fluid resuscitation)
3/40 (7.6%) 7/157 (4.6%) 0.463*
DIC (prolonged aPTT, platelet < 50x109/L and elevated FDP)
2/40 (5.0%) 0/157 (0%) 0.005*
Cerebral malaria GCS ≤ 9 in adults or BCS ≤ 2 in children and/or repeated convulsions)
1/40 (2.5%) 5/157 (3.2%) 0.817*
Two or more complications 20/40 (50.0%) 75/157 (47.8%) 0.801
Three or more complications 5/40 (12.5%) 16/157 (10.2%) 0.673*
Presence of any other acute co-morbidity 6/40 (15.0%) 6/157 (0.6%) <0.001*
Presence of any chronic co-morbidity 14/40 (35.0%) 4/157 (2.5%) <0.001*
Death 3/40 (7.5%) 7/157 (4.4%) 0.434*
P-value obtained by chi-square test or Fisher test with the latter identified (*); Hb, hemoglobin; PaO2, partial pressure of arterial oxygen; FiO2, fraction of inspired oxygen; SBP, systolic blood pressure; DIC, disseminated intravascular coagulation; aPTT, activated partial thromboplastin time; FDP, fibrinogen degradation product; GCS, Glasgow Coma Scale; BCS, Blantyre Coma Scale.
Clinical manifestations and severity
Patients presented a varied array of clinical complications associated with P. vivax
mono-infection, including atypical complications seen only on imaging exams.
Anemia was the more frequent complication at both sites, followed by acute renal
failure. Respiratory distress, hyperlactatemia, hypoglycemia, and disseminated
intravascular coagulation, although rare, were mostly seen in Manaus (Table 2).
There was a higher proportion of patients presenting with three or more
complications in Bikaner compared to Manaus (16.2% versus 10.7%, respectively; P
= 0.063), with no further discrepancies observed between sites.
For the outcome of presenting at least one of the WHO severe malaria criteria, there
was association with female gender, first malarial infection, and pregnancy. For
153
multiple severity criteria, the only variable showing evidence of association was the
presence of chronic co-morbidity, with borderline evidence for an association with
both pregnancy status and female gender. There was evidence of association of
female gender as a risk factor for death among P. vivax admitted patients, and
although the proportions of individuals with chronic co-morbidities and non-pregnant
women were higher among the patients who died, the differences were not
meaningful and the lack of power needs to be taken into consideration (Table 4).
Similar findings resulted when the same analysis was performed per site (data not
shown). Further characterization of specific manifestations is shown below. An
additional linear regression analysis on the association with the number of severe
criteria in each patient with the same investigated risk factors was also undertaken,
with the only variables with significant association being female gender (coefficient =
0.45; P = 0.001), pregnancy status (coefficient = 0.81; P = 0.002), and the presence
of any chronic co-morbidity (coefficient = 0.45; P = 0.049).
154
Table 4. Univariate analysis of risk factors associated to WHO severe disease, three or more severity criteria, and death, in P. vivax patients admitted to two tertiary care centers in Brazil and India
Severe n/N (%) Non-severe n/N (%)
OR (95%CI) P Presence of three or more severe criteria n/N (%)
Absence of three or more severe criteria n/N (%)
OR (95%CI) P Dead n/N (%) Survived n/N (%)
OR (95%CI) P
Female gender 114/197 (57.9) 230/518 (44.4) 1,7 (1.2-2.4) 0.001 14/21 (66.7) 330/694 (47.6) 1.7 (1.1-2.7) 0.022 8/10 (80.0) 336/705 (47.7) 2.6 (0.8-8.4) 0.119
Age < 12 years old 10/197 (5.1) 21/518 (4.0) 1.3 (0.6-2.9) 0.476 2/21 (9.5) 25/694 (3.6) 1.3 (0.4-4.5) 0.647 0/10 (0) 27/705 (3.8) - 0.440
First malarial infection 174/190 (91.6) 431/501 (86.0) 1.8 (1.1-3.1) 0.044 3/20 (15.0) 83/671 (12.4) 1.0 (0.5-2.2) 0.725 7/10 (70.0) 598/681 (87.8%)
0.3 (0.1-1.3) 0.090
Pregnancy¶ 36/114 (31.6) 40/230 (17.4) 2.3 (1.3-3.8) 0.003 8/14 (57.1) 65/330 (19.7) 3.2 (1.7-6.1) <0.001 4/8 (50.0) 78/336 (23.3) 2.6 (0.7-10.1) 0.157
Peripheral parasitemia >5,110 parasites/mm3*
18/98 (18.4) 43/149 (28.9) 0.6 (0.3-1.0) 0.063 10/46 (21.7) 51/201 (25.4) 0.8 (0.4-1.8) 0.607 4/9 (44.4) 57/238 (24.0) 2.5 (0.7-9.8) 0.175
Duration of fever prior to admission >7 days
32/197 (16.5) 156/517 (30.3) 0.5 (0.3-0.8) 0.008 2/21 (12.0%) 157/694 (22.7) 0.5 (0.2-1.2) 0.098 1/10 (10.0) 184/705 (26.2) 0.4 (0.1-2.9) 0.329
Presence of any acute co-morbidity 7/197 (3.6) 31/518 (6.0) 0.7 (0.3-1.6) 0.439 4/21 (19.0) 38/694 (5.5) 1.3 (0.4-3.9) 0.648 2/10 (20.0) 38/705 (5.4) 5.3 (0.7-24.0) 0.084
Presence of any chronic co-morbidity
18/197 (9.1) 60/518 (11.6) 0.9 (0.5-1.4) 0.349 6/21 (28.6) 72/674 (10.4) 1.1 (0.5-2.0) 0.008 3/10 (30.0) 75/705 (10.6) 4.0 (1.2-13.3) 0.051*
¶ Analysis restricted to women of reproductive age (12-50 years-old); * restricted to patients not in use of antimalarials at the initial assessment (5,110 parasites/mm3 was the
lower limit of the highest quartile).
155
Severe anemia
Severe anemia was the most common clinical complication at both sites, occurring
among 102 (51.8%) of the admitted patients, with a higher proportion of females
compared to males (18.6% versus 5.0%; P < 0.001), with more pregnant women
presenting severe anemia (37.2% versus 19.1%; P = 0.001). Surprisingly, age, chronic
co-morbidities, previous malaria history, and report of antimalarial use in the preceding
30 days were not associated with severe anemia. The proportion of patients presenting
with jaundice, splenomegaly, and hepatomegaly did not differ between patients with and
without severe anemia. No hemoglobinopathies were detected among our cohort,
reflecting the low prevalence in both study areas. Blood transfusions were administered
to 69 patients, corresponding to 67.6% of individuals fulfilling the severe anemia criteria,
illustrating its effectiveness in identifying the most severe cases. Six patients with severe
anemia experienced fatal outcomes (fatality rate = 6.0%).
Acute renal failure
Acute kidney injury was characterized in a total of 27 patients from both sites, 26 above
the age of 12. A similar proportion of both genders was affected, with only two pregnant
women presenting this complication. The mean creatinine at presentation for these
patients was 4.1 mg/dL (SD = 2.8), with 41.1% presenting abnormal renal ultrasound
characterized by hyperechogenicity in the cortex, usually associated with interstitial
nephritis. Dialysis therapy was undertaken in 11 (40.7%) of these patients, with a total of
nine patients being admitted to the ICU and five patients with this complication dying
(fatality rate = 18.5%).
156
Respiratory distress
Respiratory distress in our series was observed with considerably higher frequency in
Manaus (Table 3). Major changes in chest X-rays were observed for eight patients
(66.7%), mainly characterized by bi-basal interstitial opacities. No children presented with
acute respiratory distress syndrome (ARDS), and there was no association with gender
or pregnancy status in its occurrence. There was, however, strong evidence of
association of ARDS with having initiated antimalarials previously to admission. Six of the
patients presented respiratory distress upon admission, which was characterized as
acute lung injury, and of these five had begun antimalarials within the preceding 72
hours. Two patients developed ARDS as part of a systemic inflammatory response
syndrome with multi-organ dysfunction and subsequent death. One hundred nineteen
patients arrived with the previous diagnosis of P. vivax infection and use of chloroquine
(with or without primaquine) prescribed at other health services. Considering the clinical
presentation on admission, patients who used antimalarials in the preceding 72 hours
were more likely to present with respiratory distress (OR = 10.7; 95%CI 2.1-55.9). Four
patients with ARDS died, resulting in a fatality rate of 33.3%.
Cerebral malaria
Cerebral malaria was characterized, following the WHO guidelines, as impaired
conscience or repeated convulsions. It was more common in India, affecting five patients,
while only one was diagnosed in Brazil (Table 3). Of the six patients with central nervous
system syndromes, four were male, and their ages ranged from 17 to 75 years of age. All
patients had impaired consciousness on admission, with one 22-year-old Indian female
157
patient also presenting with repeated seizures. Lumbar puncture was performed on three
patients without significant changes in any of them. In one male patient from Manaus,
varicella-zoster virus was identified in the cerebrospinal fluid (there were no changes in
the cerebrospinal fluid analysis). CT scans were performed for three patients without
pathological findings.
Other syndromes
Besides the aforementioned severity criteria, patients also presented with
hyperlactatemia, hypoglycemia, and disseminated intravascular coagulation (Table 3).
Furthermore, clinical complications outside the WHO severe criteria definitions were also
characterized among the admitted patients, such as mild hepatitis (ALT > 200u/mL) in 20
patients, acalculous cholecystitis in 9 patients, and splenic rupture or infarction in 3
patients. From the three cases with spleen-related complications, two were diagnosed
with spleen rupture characterized by very low hemoglobin concentrations (4.7 mg/dL and
4.2 mg/dL) and spleen hematoma observed at the CT scan, while the patient with spleen
infarction, as characterized by both abdominal ultrasound and CT scan, presented with
intense upper right quadrant abdominal pain, with none of them presenting any other
severe manifestation, such as circulatory shock. All of them were managed
conservatively and recovered without further sequelae.
All pregnant women were submitted to obstetric ultrasound and appropriate testing, and
were followed up to determine the pregnancy outcome through a parallel ongoing study
protocol. Apart from one patient presenting subchorionic hematoma with subsequent
abortion at 12 weeks of pregnancy, no other pregnancy-associated complications were
158
observed on admission. Among the 36 pregnant women with severe manifestations, with
the most common complications being severe anemia (28), ARDS (6), cerebral malaria
(2) and acute kidney injury (2). All four pregnant women who died presented with ARDS,
with three of them also presenting with anemia and one of them also presenting with
acute kidney injury and circulatory shock. Although no autopsies were performed, no
additional causes of death were suggested.
Discriminant performance
The performance of laboratorial tests (hematology, biochemistry, and parasitemia) to
discriminate severe cases, deaths, or cases with multiple severity criteria was assessed
using ROC curves. Except for total serum bilirubin, which presented a reasonable
discriminative performance (AUC = 0.743; 95% CI = 0.611-0.875; P < 0.001), with values
above 2.5 mg/d presenting a sensitivity of 47.0% and a specificity of 96.3%, resulting in
an overall accuracy of 76.7% (Figure 3) no other parameters presented good accuracy
for any of the evaluated outcomes. Parasite density among patients who had not
received antimalarials prior to admission presented a very poor accuracy to discriminate
patients with three or more severity criteria (AUC = 0.538; 95% CI = 0.421-0.657; P >
0.05), as did platelet counts and alanine aminotransferase (AUC = 0.417 and 0.499,
respectively), indicating that these parameters should not be used as criteria to identify
patients with P. vivax-associated complications.
Figure 3. ROC curves depicting the discriminatory performance of peripheral
parasitemia before the use of antimalarials (A) (AUC = 0.538; 95% CI = 0.421-0.657;
P > 0.05); and serum total bilirubin (B) (AUC = 0.743; 95% CI = 0.611-0.875; P <
159
0.001) for differentiating P. vivax-associated three or more criteria of severity. AUC:
area under the curve; green line: reference.
Discussion
This is, to our knowledge, the first multisite study conducted in two very distinct
geographical areas, trying to comprehensively describe severe vivax malaria cases after
an adequate diagnosis, with PCR confirmation of exclusive P. vivax mono-infection as an
important strength. Through additional investigations, we have been able to identify a
high number of associated co-morbidities, although by not performing a systematic
investigation in all admitted cases from both sites, there was an important limitation on
estimating the prevalence of their occurrence and association with severe syndromes, an
important issue to consider [35,36]. Furthermore, although we have tried to ascertain the
presence of previous chronic co-morbidities through medical interviews and patient
record revisions, the possibility of underreporting and underdiagnosis must be
considered. Indeed, one of the main concerns of the protocol was to exclude
misdiagnosis and co-infection with P. falciparum by applying validated and standardized
molecular methods [33], as microscopy can frequently miss out or even misdiagnose a
varied proportion of cases. Our data provide yet again a robust confirmation of the
potential of this species to cause significant morbidity and even mortality, a fact now
widely recognized by the scientific community and by WHO in its recently published
severe malaria monograph [37]. Indeed, the associated case fatality rate (CFR) among
admitted patients to the study in the Brazilian Amazon (0.9%) and Indian Rajasthan
(1.5%) is not negligible, and is comparable to CFRs previously described in Papua New
160
Guinea [38] and Indonesia [18], and not too dissimilar to those for P. falciparum in Africa
[2]. These findings must be taken cautiously, as the low incidence of P. falciparum in the
study areas and the hospital-based design can limit comparisons and estimates of
community CFRs. However, when compared the overall hospitalization and fatality rates,
a striking difference could be observed between Manaus and Bikaner, as the latter
presented much higher rates, up to 20-fold higher for fatality.
Conducting multisite studies allows for an active comparison of the different clinical
complications and associated rates that would be expected by the very distinct
demographic, socioeconomic characteristics, health systems features, and, especially,
the local malaria transmission dynamics in the different P. vivax endemic areas. The
influence of these factors could already be observed by comparing the descriptions of
clinical epidemiology of complications associated with this infection from different sites,
showing that in areas of higher transmission intensities, children are the most frequently
affected population [18,19,39,40], while in areas of moderate and low intensities, adults
contribute more to the proportion of severe cases [7,14,41]. Our study highlighted many
of these differences. For instance, when comparing patients hospitalized at both sites,
there was evidence that the higher proportion of patients being admitted in India was
secondary to a higher frequency of first malarial infections in that location, reflecting
distinctive transmission dynamics, including a differential pattern of relapse rates that
could contribute to some degree of clinical immunity among Brazilian patients [42,43].
The spectrum of clinical complications in both sites was broadly similar, with severe
anemia being by far the most frequent of the complications, as previously described in
other P. vivax endemic settings [14,17,18,44], and followed by acute renal failure, a
161
complication that seems to be particularly frequent in the two countries where the study
was conducted albeit rare elsewhere [37]. The presence of three or more severity criteria
was also frequent and common at both sites. The proportion of severe malaria cases with
acute lung injury/respiratory distress was, however, significantly higher among Brazilian
patients. This particular difference could be due to a number of factors, including a higher
proportion of Indian patients being systematically treated with antibiotics, or differences in
parasite virulence or host genetics, which could not be assessed in this study and should
be considered in future studies. However, our data point to the beginning of antimalarial
treatment as a triggering phenomenon of respiratory distress, which needs further
investigation. There were only six episodes of cerebral malaria among our patients, with
one of them presenting co-infection with varicella-zoster virus (VZV) isolated by PCR
from the CSF, in agreement with data from other settings showing low rates of
occurrence [45].
There were 10 deaths among our admitted patients’ series, and although there was low
power for assessment of prognostic factors, there was evidence that female gender
(probably confounded by the risk conferred by pregnancy) and chronic co-morbidities
were associated with a higher risk of dying. One of the most striking findings in this study
was the confirmation that pregnancy seems to be a clear risk factor for severe vivax
malaria and even for death (despite being only borderline significant). It has been argued
that, unlike P. falciparum, P. vivax rarely causes severe malaria in pregnant women
[37,46-48]; however, our series confirms a very high and almost identical proportion
(above 2/3 in both sites) of pregnancies among the cases of severe malaria occurring in
women of reproductive age, and four maternal deaths (all occurring in Bikaner). Pregnant
162
women were systematically evaluated for obstetric complications, allowing us to diagnose
an abortion occurring as a consequence of a subchorionic hematoma which we attributed
to a malaria-related complication, leading us to hypothesize that further studies aimed at
this population could properly detect and estimate the pregnancy-related burden of P.
vivax infection. We were also able to detect the frequent occurrence of pregnancy-related
complications such as subchorionic hematoma. On the other hand, the histopathological
evidence in the literature points to minor damage of P. vivax-infected placentas [49,50].
Ongoing studies specifically targeting malaria in pregnancy in malaria endemic areas
should help clarify the specific contribution of this parasite in causing maternal morbidity
and death.
The occurrence of co-morbidities has been associated with higher morbidity of malaria in
different African locations, starting with HIV infection but also including other viral and
bacterial co-infections [51-54], stressing the importance of investigating their occurrence
and possibly promoting joint management strategies for common concurrent conditions in
many tropical areas [55]. Bacterial systemic concurrent infections were rarely observed in
Manaus, which could be a potential reflection that among adult patients the concomitant
occurrence of bacterial infection seems much rarer than that among P. falciparum-
infected children [56]. Yet other studies have reported similar rates affecting both age
groups [57], in which factors associated with each setting could be playing a higher role,
a topic we could not explore due to the systematic use of antibiotics in Bikaner. There
were, however, important differences in the prevalence of co-morbidities in Manaus and
Bikaner, with the former presenting considerably higher frequencies of both acute and
chronic illnesses. The difference in the observed proportions of co-morbidities between
163
malaria endemic areas is a reflection of the local epidemiology influenced by the
demographic and socioeconomic structures, and also of the health systems’ capacities to
diagnose and detect concomitant illnesses. Previous studies from the Brazilian Amazon
region had already described the joint occurrence of malaria simultaneously with other
health conditions, either acting as a contributing factor for severe manifestation or
eventually being an incidental finding in patients with other severe diseases leading to
critical illness or even fatal outcomes [14,25, 58]. In a scenario where many tropical
regions are facing epidemiological transition, the occurrence of P. vivax infection in
individuals with chronic diseases is likely to become an important problem in these areas
[59-61], putting a great deal of stress on and requiring effective recognition and
management by local health systems.
We have been able to characterize a diverse range of clinical complications among the
included patients, including a higher risk for death among the patients developing ARDS,
which was more frequent in patients who had started antimalarials prior to hospitalization,
similar to previously described cases [12,62]. Other clinical syndromes were also
observed to occur with considerable frequency, noteworthy anemia requiring transfusion
and acute renal failure, with cerebral malaria remaining a rare and intriguing
manifestation within this infection [45]. The WHO severe malaria criteria were initially
developed to identify individuals with P. falciparum infection at higher risk of death [63],
and there have been discussions among experts on the need to define specific severity
criteria to be applied for P. vivax infection. Our study demonstrates that the application of
the WHO criteria can reliably identify the patients at higher risk of complications, who
therefore require more urgent and intensive care, which further agrees with previous
164
pediatric data from the same research group [15]. A comprehensive analysis of the array
of complications observed among the patients in our study and in the published literature
provides reassurance of these findings by demonstrating that the spectrum of clinical
manifestations is broadly covered by these definitions [12, 25], with unusual
manifestations being rarely reported. However, it seems important to highlight that
severity derived from the use of primaquine among G6PD-deficient individuals, or splenic
rupture, two well-known complications mostly seen in vivax infections [58,64], are not
included in the current WHO definitions and should be carefully considered by clinicians
working in vivax endemic areas. Furthermore, one must consider that in primary and
community healthcare units, the characterization of the fulfillment of all WHO criteria is
not possible due to the unavailability of laboratory facilities. More easily applicable
guidelines to identify severely ill patients regardless of etiology must be used by health
professionals to assist with decisions on referral or more aggressive management.
Although it is not currently possible to reliably estimate the total parasite biomass in P.
vivax infection due to the difficulty of assessing the extent of cytoadhesion [65] and
spleen sequestration [66], we were able to observe that parasite densities within the
higher quartile were associated with higher risk of severity. Among the clinical and
laboratory markers, only total bilirubin presented a high discriminative performance to
identify more than three criteria of severe disease, showing that although jaundice was
justifiably excluded from the WHO severe malaria criteria, it still has an important
prognostic value and should not be dismissed by health professionals in their initial
assessment of P. vivax-infected patients. Intense abdominal pain and low hemoglobin
165
levels should prompt health professionals to consider the diagnosis of spleen rupture or
infarction and take the appropriate diagnostic and management procedures [64].
Our study has some clear limitations that need to be addressed. We decided to focus on
providing a more comprehensive description of the clinical manifestations and
complications associated with P. vivax infection in detriment to comparing disease
expression between sites due to lack of adequate power and heterogeneity of
procedures, undermining what could have been an important output from this study. The
unrepresentativeness of children at both sites probably reflects the fact that neither of the
sites is a reference center for pediatric populations, albeit publications from both locations
have previously described severe manifestation among P. vivax-infected children [15,16].
The fact that the decisions to admit patients were made at the attending physician’s
discretion may have resulted in added selection bias, which we tried to minimize by
applying the WHO severe malaria criteria and determining the occurrence of more than
three criteria (as a surrogate for more severe disease). Note also that there are important
differences in the health system organization as well as particular disparities in the
management of cases, such as for example the systematic use of antibiotics upon
admission in India. Ensuring that both sites followed the common protocol proved also to
be challenging, and in some cases probably hinders some of the comparisons in this
study, especially regarding the presence of co-morbidities, such as malnutrition and other
co-infections. Also, by not systematically measuring some immune molecules that have
been associated with clinical complications of this infection, such as superoxide
dismutase-1 [67], an opportunity was missed to properly evaluate the prognostic value of
some promising biomarkers that could be of potential utility for future case management.
166
Conclusions
This study has provided robust evidence asserting the role of P. vivax as a cause of
severe human disease and death. Indeed, this infection commonly progresses with
severe manifestations, and the development of severe symptomatology seems to be
more frequent among females, pregnant women, individuals presenting with their first
malarial infection, and those with acute or chronic co-morbidities. Although the overall the
overall fatality rates are in consonance with findings from other P. vivax endemic areas,
we observed differences between sites on specific disease manifestations and outcomes,
which still require further and more comprehensive studies to be conducted to better
elucidate the mechanisms and factors influencing disease expression. Only by
understanding the underlying pathophysiological mechanisms by which this species
initiates and modifies organ functions, ultimately leading to clinical disease, as well as the
role of the socioeconomic and health systems, will we be able to start answering the
many pending questions related to this never-to-be-called-again benign parasite.
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
Authors’ contributions
Conceived and designed the study: MVGL, DK, HP, CG, PA, and QB. Performed the experiments: AMS, BMLM, MPGM, GCM, MAAA, MGCA, SK, AK, and KN. Enrolled patients: AMS, BMLM, MAAA, SK, AK, and KN. Analyzed the data: AMS, MVGL, and
167
QB. Wrote the first draft of the manuscript: AMS and MVGL. All authors read and approved the final manuscript.
Acknowledgments
The Clinical Research Ward in Manaus, where patients from this study were hospitalized, was supported by the Brazilian Network of Clinical Research (RNPC), the Projects and Studies Funding Agency (FINEP), and the Innovation in Neglected Diseases National Institute of Science and Technology (INCT-IDN), coordinated by Dr. Carlos Morel. Thanks to Prof. Simon Hay, for providing the P. vivax malaria maps used in this publication (Malaria Atlas Project: http://www.map.ox.ac.uk/) from India and Brazil. This paper is dedicated to El Molí de Vent (Sant Andreu de Llavaneres, Catalonia, Spain).
Funding
This work was mainly supported by Fundació Cellex, and also by PRONEX Malaria Network, funded by the Brazilian Ministry of Science and Technology (MCT), the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq), the Brazilian Ministry of Health (DECIT/SCTIE/MS), and the Research Support Foundation of Amazonas (FAPEAM) (grant 555.666/2009-3). MVGL is a level 1 CNPq fellow and HAP is also funded by Science without Borders (CsF), from CNPq. QB has a fellowship from the program Miguel Servet of the ISCIII (grant number: CP11/00269). The funders had no role in the study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
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173
Figures
Figure 1. Epidemiological
profile of the two studied
174
sites: P. vivax 2010 Annual Parasite Index in Brazil (A) and India (B); malaria
transmission scenarios in the rainforest, Manaus, Brazil (C) and in the desert, Bikaner,
India (D); reference tertiary care centers’ façades in Manaus (E) and Bikaner (F).
Figure 2. Number of diagnosed, hospitalized, severe and deceased patients with P. vivax
malaria, during the period of the study, in both Manaus (A) and Bikaner (B).
175
Figure 3. ROC curves depicting the discriminatory performance of peripheral parasitemia
before the use of antimalarials (A) (AUC=0.538; 95% CI=0.421-0.657; p>0.05); and
serum total bilirubin (B) (AUC=0.743; 95% CI=0.611-0.875; cut-off=2.5mg/dL; p<0.001)
for differentiating P. vivax-associated three or more criteria of severity. AUC: area under
the curve; green line: reference.
176
Supplementary Table 1 . Demographic and clinical characteristics of patients admitted with P. vivax infection that presented fatal outcome
Gender Parasite density at arrival (parasites/mm3)
Previous malaria infection
Days of disease previous to admission
Number of severe WHO criteria
Previous Comorbidities / Concomitant Conditions
Days from admission to death
Presumed mechanism of death
Manaus, Brazil
M Negative * Yes 9 2 No 0.5 SA and ARF F 41251.6 Yes 3 9 Hypertension 14 Subarachnoid
hemorrhage F 995.2 Yes 3 12 Pneumonia 1 MODS
Bikaner, India
F 4850.2 No 10 9 No 6 MODS
M 22140.0 No 5 5 No 2 ARF, MODS
F 11537.8 No 4 4 Pregnant 6 ARDS, ARF
F 804.3 No 4 10 Pregnant 19 ARDS, ARF
F 11443.6 No 4 4 Pregnant 1 ARDS, CM
F 1633.8 No 5 8 Pregnant 10 ARDS, CM
F 8318.0 No 5 4 No 0 ARDS, MODS
The age range of patients was 21-75 years of age (individual data suppress to preserve anonymity); * Received antimalarial previous to admission; SA- severe anemia; MODS – multiple organ dysfunction syndrome; ARF – acute renal failure; CM – cerebral malaria
177
4.6. ARTIGO 6
4.6.1. SPLEEN RUPTURE IN A CASE OF UNTREATED PLASMODIUM VIVAX INFECTION
Machado Siqueira, A., B. M. Lopes Magalhaes, G. Cardoso Melo, M. Ferrer, P. Castillo, L. Martin-Jaular, C. Fernandez-
Becerra, J. Ordi, A. Martinez, M. V. Lacerda and H. A. del Portillo (2012). "Spleen rupture in a case of untreated
Plasmodium vivax infection." PLoS Negl Trop Dis 6(12): e1934.
178
179
180
181
182
183
Table S1. Phenotypic in situ characterization of cells in the spleen of the P. vivax
patient.
MARKER APPLICATION MAIN FINDINGS
CD20, CD79a B-cell lineage Mild follicular hyperplasia
CD10, bcl-6 Follicular center cells Mild follicular hyperplasia
CD68 KP1 Monocytes,
macrophages and
myeloid cells
Expansion monocytes and
macrophages
CD138 Plasma cells Plasma cells and plasmablasts
expansion in subcapsular and
perivascular areas
MUM-1 Plasma cells and
activated T-cells
Plasma cells and plasmablasts
expansion in subcapsular and
perivascular areas
Ki67 Proliferating cells Expression in subcapsular and
perivascular areas
IgD Delta-chains of human
IgD
Main expression in B-cells
IgA Alpha-chains of human
IgA
No expression
184
IgM Mu-chains of human
IgM
Main expression in B-cells
IgG Gamma-chain human
IgG
Main expression in plasma cells
Lambda-light
chains
Lambda light chain Polytipic expression in plasma
cells
Kappa-light chains Lambda light chain Polytipic expression in plasma
cells
Granzyme B Cytotoxic granules No significant changes
CD2,CD3,CD5,CD7 T-cell lineage Mild cord hyperplasia
CD4 T-helper cells and
antigen presenting cells
No significant changes
CD8 T-cytotoxic cells, littoral
cells of the spleen
No significant changes
CD16 NK cells, histiocytes No significant changes
CD31 Endothelial cells No significant changes
CD33 Myeloid and monocytic
cells
No significant changes
185
CD34 Endothelial cells, stem
cells
No significant changes
CD56 Natural killer (NK) cells No significant changes
CD57 T follicular helper cells No significant changes
CD61 Megakariocytes No significant changes
CD123 Plasmocytoid dendritic
cells
No significant changes
FOX P3 T-regulatory cells No significant changes
TCR beta Alpha-beta T-cells No significant changes
Myeloperoxidase Neutrophil granulocytes
and monocytes
No positive cells
CD235a,
glycophorin A
Normal erythroid cells at
all differentiation stages
No positive erythroid precursors
186
5. DISCUSSÃO
5.1. AVALIAÇÃO DE ALTERNATIVAS TERAPÊUTICAS PARA P. VIVAX
Neste estudo foi possível demonstrar a alta eficácia da combinação em dose fixa
de artesunato-amodiaquina contra malária vivax em uma área de transmissão baixa a
moderada de malária. Comparativamente à cloroquina, o ASAQ apresentou melhor
desempenho em todos os parâmetros de eficácia com exceção da recuperação nos
níveis de hemoglobina, apresentando também resultados favoráveis do ponto de vista de
segurança e tolerabilidade. Acreditamos que estes resultados prestam grande
contribuição tanto a melhor caracterização da resposta terapêutica do P. vivax na região
bem como ao entendimento de aspectos relacionados à avaliação da eficácia de
antimaláricos e sua relação com aspectos do parasito e da epidemiologia local. Nossas
estimativas da resistência de P. vivax à cloroquina acrescentam à evidência disponível
de dados prévios da região que devem ser considerados na interpretação.
O uso de antimaláricos eficazes e de forma apropriada é fundamental para reduzir
a carga de doença malárica e para que se possa perseguir de forma contundente e
sustentável o objetivo de eliminação de sua transmissão (78, 203, 204). Neste contexto a
emergência e dispersão de resistência aos antimaláricos (205), bem como a alta
quantidade de medicamentos falsos nas áreas onde a malária tem transmissão mais
elevada (206-208), são importantes desafios a serem superados e que para tanto
exigem o engajamento da comunidade científica no desenvolvimento tanto de métodos
mais eficazes de monitoramento da eficácia de drogas quanto na descoberta de novas
alternativas terapêuticas (209, 210).
187
Os derivados de artemisinina compõem a classe de medicamentos mais potente
contra todas as espécies de malária (211), proporcionando rápida redução da
parasitemia e, por conseguinte, reduzindo tanto o desenvolvimento de manifestações de
gravidade, bem como prejudicando a gametocitogênese (212, 213), impactando desta
maneira tanto nas taxas de hospitalização quanto na redução da transmissão da malária.
Sua associação com drogas parceiras de meia-vida mais longa visa tanto melhorar a
posologia, e, portanto aderência ao tratamento, como prevenir e retardar o
desenvolvimento de resistência a esta classe (105-107). O problema de resistência aos
antimaláricos historicamente tem sido mais intenso na infecção por P. falciparum, devido
provavelmente a sua maior biomassa no hospedeiro, sendo, portanto mais difícil eliminar
todos os parasitos se a droga não permanecer na corrente sanguínea acima da MPC
pelo tempo necessário, e por uma maior capacidade de mutação conferindo tolerância
às medicações utilizadas (128, 214). Igualmente interessante é constatar que a
resistência aos antimaláricos, e verdadeiramente, também para outros antibióticos, tem
muito frequentemente tido a região do Sudeste Asiático e Pacífico como epicentro de
surgimento e intensidade (68), no quais fatores genéticos de parasitos e hospedeiros,
bem como o mercado negro de drogas falsificadas, podem justificar tal peculiaridade,
ainda a ser mais bem esclarecida (128, 215, 216).
Embora a cloroquina venha sendo empregada como a primeira linha de
tratamento esquizonticida contra P. vivax por quase sete décadas, o surgimento e
disseminação da resistência, novamente mais intensa naquela região do mundo (68),
ressaltam a necessidade do desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Por
óbvios motivos, sempre houve prioridade no desenvolvimento de novas drogas e
188
ferramentas voltadas para P. falciparum, com o atraso na pesquisa possibilitando o
maior entendimento da biologia e epidemiologia do P. vivax tendo sido classificado por
muitos autores como negligência (65, 70, 217, 218). Tais movimentos andaram em
paralelo com o estabelecimento de novas parcerias entre a comunidade científica
identificando prioridades na pesquisa relacionada a este parasito (66, 86).
No campo da terapêutica, grande destaque tem sido dado à criação de
alternativas à primaquina, principalmente voltadas a contornar dois de seus grandes
fatores limitantes: o longo-curso de tratamento e a toxicidade (115, 117, 118). Em
relação ao primeiro ponto, a maior esperança está relacionada aos favoráveis resultados
da fase 2 da tafenoquina, demonstrando que esta droga administrada em dose única
tem eficácia similar à da primaquina na prevenção de recaídas (123). A fase 3
atualmente sendo conduzida certamente fornecerá evidência mais consistente para a
avaliação de sua utilização como primeira linha contra este parasito (219, 220). Porém,
sendo a tafenoquina também uma 8-aminoquinoleína, a preocupação com os potenciais
riscos de toxidade, especialmente de hemólise grave em indivíduos deficientes de
G6PD, uma das mutações genéticas mais comuns no mundo (221), permanecerá um
problema de difícil solução por um período ainda prolongado (118), prejudicando ações
de controle (71). Tal fator é ainda mais complicado pela ausência de um teste que possa
identificar indivíduos com a deficiência no campo (222), o que leva a muitos países e
profissionais de saúde a não prescrever a primaquina para não colocar potenciais
portadores sob risco. Tais fatos levam a uma ainda maior importância na necessidade de
aperfeiçoar as ferramentas disponíveis, o que leva à necessidade de avaliação de
189
terapias esquizonticidas contra P.vivax, já que há um grande número de alternativas
entre as formulações de ACTs já padronizadas para P. falciparum.
O método preferencial para estimar a prevalência da resistência à cloroquina tem
sido a condução de estudos in vivo do tipo de coorte, geralmente com duração de 28
dias em que se correlaciona a ocorrência de recorrência parasitária com os níveis
séricos de cloroquina e desetilcloroquina. Convencionou-se classificar resistência como
o surgimento de parasita na presença de nível sérico acima de 100ng/mL (76, 137). Tal
abordagem caracteriza-se por considerável rigor, pois desta forma é capaz de minimizar
a influência de recaídas nas estimativas de falha terapêutica, especialmente em áreas
onde tanto reinfecção quanto recaídas ocorrem com intervalo curto do ataque primário.
Há, porém, limitações quanto a esta abordagem, como, acreditamos, nossos achados
demonstraram.
Em nossa opinião, comparado aos métodos tradicionais de monitoração de
resistência de resistência do P. vivax à cloroquina, o ensaio clínico com grupos paralelos
ao comparar dois ou mais tratamentos, apresenta a vantagem de proporcionar
estimativas mais relevantes dos pontos de vista tanto clínicos quanto epidemiológico. Tal
afirmativa é embasada em nossos achados, que de forma surpreendente demonstraram
que o melhor desempenho do ASAQ deu-se especialmente no período entre os dias 28
e 42. Caso a estimativa de resistência tivesse sido realizada de forma tradicional,
certamente se subestimaria a prevalência de resistência à cloroquina, já que os
episódios mais tardios seriam atribuídos a recaídas decorrentes da não administração da
primaquina. Porém, realizando o estudo comparativo com ensaio clínico randomizado,
190
podermos levantar outras hipóteses para tal ocorrência, sob a afirmativa de que a
resistência à cloroquina vem sendo subestimada nos estudos de monitoramento.
Nosso achado vem em direção oposta à nossa hipótese prévia baseada no
potencial de profilaxia pós-tratamento esperada para cada um dos braços do estudo.
Tendo a cloroquina meia-vida de eliminação superior a 28 dias, consideravelmente maior
do que a da amodiaquina e seu metabólito de 211 horas (127, 181, 223), seria razoável
esperar que durante o período mais tardio de seguimento poderia haver uma
aproximação das eficácias de ASAQ e cloroquina devido a maior contribuição de
recaídas e re-infecções, com vantagem para a última que preveniria de forma mais
eficiente, inclusive, novos episódios com parasitas sensíveis. Nossa hipótese é que a
resistência à cloroquina na região é relativamente de baixo grau, na qual haveria uma
supressão da parasitemia a níveis submicroscópicos que em momento mais tardio, ao
haver a redução do nível plasmático de CQ/DCQ, deixaria de ser inibida levando a seu
aumento e a novo ataque clínico. Tais episódios não seriam, no entanto, caracterizados
com seguimento de apenas 28 dias, nem tampouco, com o rigor da associação de níveis
de droga acima de 100ng/mL no momento da detecção do parasito. Idealmente, esta
hipótese deveria ser confirmada com a utilização de métodos moleculares
ultrassensíveis que permitissem detectar parasitemias subpatentes durante o
seguimento clínico do paciente, o que, infelizmente, não fomos capazes de realizar até o
momento.
Uma fortuita confluência de fatores nos possibilitou constatar tais fenômenos que
talvez não fossem facilmente observados em outros locais. Primeiro, nos beneficiamos
do fato de uma considerável proporção de indivíduos com diagnóstico de malária
191
procurando a FMT-HVD é habitante da área urbana de Manaus (dados pessoais, FVS-
AM), onde não há transmissão ativa de malária, minimizando desta forma, o risco de
reinfecções em nossa coorte de pacientes. Outro fato positivo, apesar de os dados
existentes serem escassos, diz respeito à possibilidade de que as recaídas em nossa
área ocorram com intervalo maior do que 35 dias, diferentemente de outras áreas
tropicais em que ocorrem em intervalos consideravelmente mais curtos (138, 169). À luz
dos estudos previamente realizados na mesma localidade (150, 151), as estimativas de
resistência à cloroquina que encontramos são consistentes. A comparação realizada por
meio de ensaio clínico randomizado com alternativa altamente eficaz proporcionou
adcionalmente, minimizar a contribuição de recaídas e reinfecções no nosso cenário e
abrir uma nova perspectiva na interpretação de dados de falha terapêutica.
No que diz respeito à segurança e tolerabilidade, verificou-se um bom perfil para o
ASAQ. Apesar de cinco eventos adversos sérios terem sido registrados neste grupo,
todos foram reversíveis sem consequências e sua causalidade com o tratamento é difícil
de ser diretamente estabelecida. Quanto à queda mais pronunciada de hemoglobina
entre os dias zero e sete de tratamento no grupo de ASAQ comparado ao de cloroquina,
nossos dados se assemelham com dados prévios de comparação entre cloroquina e
artesunato-pironaridina (165). Uma das hipóteses para tal ocorrência seria a de que a
rápida redução da biomassa parasitária e, portanto, das hemácias infectadas, mediaria o
processo fisiopatogênico da redução mais acentuada da hemoglobina (224), bem como
um possível efeito do derivados de artemisinina em inibirem a eritropoiese na medula
óssea (224, 225). Tais hipótese no entanto vão em direção contrária a estudo em
crianças infectadas com P. falciparum, no qual a redução de hemoglobina foi maior no
192
grupo tratado com amodiaquina do que nos grupos tratados com aretsunato e com a
combinação artesunato-amodiaquina (226), ressaltando a necessidade de maior
investigação dos fatores associados com este fenômeno. Apesar da queda mais
acentuada da hemoglobina, não houveram casos de anemia grau 3 ou 4 em nenhum
dos grupos.
Nossas hipóteses, se comprovadas, têm, a nosso ver, duas implicações
importantes para estudos futuros. Primeiro a de relativizar o efeito profilático pós-
tratamento em áreas de baixa a média transmissão e onde o intervalo de recaídas é
prolongado. Segundo, apresentar importante proposta de mudança na abordagem de
avaliação de eficácia da cloroquina em áreas endêmicas.
5.2. SIGNIFICÂNCIA PARA A SAÚDE PÚBLICA
Recentemente a importância da infecção por P. vivax tem sido redimensionada e
obtido maior atenção por parte de cientistas, financiadores e gestores públicos (45, 66,
227), se refletindo, por exemplo, na inédita formulação de uma Estratégia Global contra
P. vivax, liderada pela OMS a ser lançada em 2015. Sendo a espécie mais frequente a
causar malária em áreas como a América Latina (38), o desenvolvimento de estratégias
mais efetivas ao se controle pode significar a eliminação da malária da maior parte do
globo terrestre. Estudos conduzidos na FMT-HVD tem prestado grande serviço a
demonstrar a grande carga de doença e social da malária na região amazônica (36, 228,
229), explorando de forma minuciosa as manifestações clínicas e condições associadas
(21, 88, 230, 231), além da elucidação de importantes aspectos fisiopatogênicos desta
193
infecção (90, 91, 232). Tais contribuições ressaltam a importância desta infecção no
contexto regional e global e a necessidade de fortalecimento das ações de combate.
No que diz respeito ao tratamento, as descrições de resistência do P. vivax aos
antimaláricos data de 1999 (233), seguida de novos estudos de eficácia de cloroquina
com e sem associação com primaquina (150, 151). No âmbito deste estudo, fomos
capazes de descrever de forma retrospectiva que crianças abaixo de 6 meses têm pior
resposta à cloroquina (187), o que pode ser devido tanto à subadministração da droga,
fatores farmacocinéticos relacionados à distribuição de líquido e droga no organismo
(188), e, a imaturidade da resposta imune, o que deixaria esta população mais suscetível
a parasitos com grau de resistência baixa (234). Diante destes achados, defendemos
que a população pediátrica deve receber especial atenção em estudos de resposta
terapêutica, especialmente considerando-se a falta de formulações pediátricas de
cloroquina que a expõe a maior risco de subdosagem (187, 188).
A preocupação com a adesão ao tratamento já havia sido levantada e investigada
em área da Amazônia brasileira (62), tendo importância tanto relacionada ao controle de
transmissão quanto ao desenvolvimento de resistência. Neste aspecto, é importante
ressaltar a facilidade posológica como uma grande vantagem do ASAQ, com dose fixa
diária, bem como a existência de formulações infantis com boa aceitação.
Para o entendimento dos processos envolvidos na adesão ao tratamento, é
importante investigar os fatores relacionados, entre eles a ocorrência de eventos
adversos. Tivemos a oportunidade nestes dois estudos de mensurar a ocorrência dos
eventos adversos relacionados à cloroquina e ao ASAQ. Foi possível descrever que o
194
prurido relacionado à cloroquina, bem descrito em populações africanas (235-237),
ocorre com frequência não desprezível em nossa região (238). A discrepância entre os
nossos achados iniciais e os obervados neste estudo ressaltam a preferência por
ensaios clínicos prospectivos, já que há o risco de viés de observação e seleção que
pode ter elevado à superestimação da prevalência (238). O conhecimento dos eventos
adversos mais frequentes é importante para que os profissionais de saúde estejam
preparados para o seu reconhecimento e condução apropriados.
Do ponto de vista de saúde pública e o impacto da política de tratamento na
efetividade das ações de controle de transmissão, são inúmeras as evidências
demonstrando que medicamentos mais efetivos apresentam maior impacto na redução
(58, 111, 239-241). A redução no carreamento de gametocitemia patente observada no
grupo de pacientes que receberam ASAQ, em consonância com achados prévios (213),
pode ter um importante impacto na transmissão, com destaque potencial para o início do
tratamento, já que indivíduos infectados são mais atraentes para mosquitos
transmissores (242).
A decisão de mudança do tratamento de primeira linha é complexa e envolve
considerações relativas à prevalência de parasitos resistentes; eficácia da droga
parceira; associação com a primaquina; e, adicionalmente, estimativas do possível
impacto na redução de transmissão (133, 161). Sobre este último aspecto, um
importante estudo ressalta a importância de parâmetros de farmacocinética e
farmacodinâmica no possível impacto em reduzir a transmissão, neste caso
demonstrando em Uganda que num período de quatro anos houve expressiva redução
da incidência de malária e internações entre crianças randomizadas para receber
195
dihidroartemisinina-piperaquina comparada com artemeter-lumefantrina (243). A grande
extensão territorial, heterogeneidade das estimativas de resistência (134), e complexas
fronteiras são fatores complicadores destas decisões no contexto brasileiro. Pessoas
envolvidas nas esferas de decisão devem ter todos estes elementos à disposição para
embasar a formulação de políticas e estratégias que sejam as mais efetivas acelerando
o progresso em direção à eliminação da malária.
5.3. PERSPECTIVAS
Os resultados deste estudo nos levam a recomendar que onde a cloroquina ainda
é utilizada como primeira linha para o tratamento de P. vivax, que se priorize a
realização de estudos comparativos com ACTs para minimizar o risco de subestimação
da real prevalência de resistência a esta droga. Deve ainda considerar-se a sinergia
exercida pela primaquina e sua capacidade de ao promover melhor resposta terapêutica,
de mascarar a prevalência de resistência à cloroquina, com desconhecidas
consequências a médio e longo prazo.
Novos estudos atualmente sendo realizados na região amazônica brasileira, com
outros ACTs com e sem coadministração de primaquina, além da condução da fase 3 da
tafenoquina, vão fornecer uma quantidade consideravelmente maior de alternativas
terapêuticas e estimativas de eficácia a serem consideradas pelo programa nacional de
controle da malária.
O desenvolvimento de novas ferramentas que possam melhor caracterizar
recrudescências e diferenciá-las de recaídas e reinfecções, por meio tanto de métodos
moleculares quanto sorológicos, deve ser perseguida e sua obtenção em muito auxiliará
196
a obtenção de estimativas mais precisas da eficácia de antimaláricos contra P. vivax. Foi
demonstrada, neste estudo, a aplicabilidade destas ferramentas em nosso contexo, no
qual a comparação proporcionada por ensaio clínico comparativo, ao nosso ver, é capaz
de reforçar seu valor. Tais estudos são ainda importantes na exploração de marcadores
moleculares de resistência à cloroquina, ainda incipiente em nossa região.
O maior entendimento da resposta terapêutica do P. vivax a diferentes
alternativas, bem como a avaliação e produção de evidência de qualidade também
relacionada a estratégias inovadoras e efetivas de manejo desta infecção são essenciais
para que se possa caminhar para o controle sustentável com diminuição do número de
pessoas que sofre esta doença devastadora com o objetivo de eliminação de sua
transmissão na região com vistas a atingir a erradicação de forma mais acelerada.
197
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ANEXOS
233
ANEXO A: DOCUMENTO RELACIONADO À AVALIAÇÃO DE CRITÉRIOS PRIMÁRIOS DE
EFICÁCIA
Normas para avaliação da resposta ao tratamento – métodos da OMS para a vigilância da eficácia de fármacos contra a malária, 2009.
Falha precoce do tratamento (ETF)
- Sinais de perigo ou malária grave nos dias 1, 2 ou 3, juntamente com parasitemia;
- Parasitemia no dia 2 maior que no dia 0, independentemente da temperatura axilar;
- Parasitemia no dia 3 com temperatura axilar ≥ 37,5 °C; e
- Parasitemia no dia 3 ≥ 25% do valor no dia 0.
Falha clínica tardia (LCF)
- sinais de perigo ou malária grave na presença de parasitemia em qualquer dia entre o dia 4 e o dia 28 (dia 42) em pacientes que anteriormente não preencheram nenhum dos critérios de falha precoce do tratamento; e
- presença de parasitemia em qualquer dia entre o dia 4 e o dia 28 (dia 42) com temperatura axilar ≥ 37,5° C em pacientes que anteriormente não preencheram nenhum dos critérios de falha precoce do tratamento.
Falha parasitológica tardia (LPF)
Presença de parasitemia em qualquer dia entre o dia 7 e o dia 28 (dia 42), com temperatura axilar < 37,5°C em pacientes que anteriormente não preencheram nenhum dos critérios de falha precoce do tratamento ou falha clínica tardia.
Resposta clínica e parasitológica adequada (ACPR)
Ausência de parasitemia no dia 28 (dia 42), independentemente da temperatura axilar, em pacientes que anteriormente não preencheram nenhum dos critérios de falha precoce do tratamento, falha clínica tardia ou falha parasitológica tardia.
234
ANEXO B: DIRETRIZES PARA A GRADUAÇÃO DE ACHADOS EM EXAMES FÍSICOS Grau 1
LEVE Grau 2 MODERADO
Grau 3 GRAVE
Grau 4 AMEAÇA À VIDA
Fraqueza
Leve diminuição das atividades, ainda brincando
Diminuição moderada das atividades, brincando pouco
Não participa das atividades habituais, não brinca
Letargia
Dores mus-culares e/ou articulares *
Queixas leves localizadas
Queixas leves difusas Fraqueza objetiva; funções restritas
N/A
Dor de
cabeça*
Leve, sem necessidade de tratamento
Passageira, moderada; necessidade de medicação
Grave; responde a tratamento inicial com narcótico
Intratável; requer tratamento constante com narcótico
Anorexia
Diminuição do apetite, mas ainda aceita alimentos sólidos
Diminuição do apetite, evitando alimentos sólidos
Recusa a amamentação, apetite bastante diminuído, não ingere sólidos nem líquidos (< 2 anos ≤ 12 horas; > 2 anos ≤ 24 horas)
Recusa a amamentação, apetite bastante diminuído, não ingere sólidos nem líquidos (< 2 anos ≤ 12 horas; > 2 anos ≤ 24 horas)
Náusea*
Leve desconforto; mantém razoável ingestão
Desconforto moderado; diminuição significativa da ingestão; algumas atividades limitadas
Forte desconforto; não se observa ingestão significativa; atividades restritas
Mínima ingestão de líquidos
Vômito
Emese passageira
Vômitos ocasionais ou moderados
Hipotensão ortostática ou necessidade de soro EV
Choque hipotensivo ou hospitalização necessária para soro EV
Dor abdominal *
Leve
Moderada – sem necessidade de tratamento
Necessidade de tratamento moderada a forte
Grave – hospitalização para tratamento
Diarréia
Passageira 3-4 evacuações anormais/dia
5-7 evacuações anormais /dia
Hipotensão ortostática ou > 7 evacuações líquidas /dia ou necessidade de soro IV
Choque hipotensivo ou hospitalização necessária para soro EV
Tosse
Passageira – sem necessidade de tratamento
Contínua, com necessidade de tratamento
Descontrolada
Cianose, estridor, grave falta de ar
Prurido
Prurido sem erupções cutâneas
Erupções cutâneas pruríticas, prurido sem erupções cutâneas que perturba o sono
Leve urticária
Urticária grave, anafilaxia, angioedema
Zumbido*
Leve som de campainha ou ruídos
Som de campainha ou ruídos moderados
Som forte de campainha ou ruídos com perda auditiva associada
N/A
Alterações comporta-
Leve dificuldade de concentração; leve confusão ou agitação;
Confusão ou agitação moderada; certo grau de limitação das
Grave confusão ou agitação; necessidade de auxílio nas atividades
Psicose tóxica; necessidade de
235
mentais atividades do cotidiano não comprometidas; sem tratamentot
atividades do cotidiano; tratamento mínimo
do cotidiano; necessidade de tratamento
hospitalização
“Gripe” (URI viral)
Leve congestão nasal, leve rinorréia, sem tosse
Congestão nasal moderada, rinorréia moderada, tosse presente
N/A (se grave, classificar sintomas individuais)
N/A (se impuser risco à vida, classificar sintomas individuais)
Convulsão N/A N/A Episódio localizado ou generalizado
Estado epilético
* Avaliar apenas em crianças > 3 anos de idade. Responder N/A para crianças e pessoas incapazes de responder.
† Referência – Baseado na Escala de Graduação da Toxicidade da OMS para a Determinação da Gravidade de Eventos Adversos.
236
ANEXO B (CONT) DIRETRIZES PARA A GRADUAÇÃO DE ACHADOS EM EXAMES FÍSICOS
Grau 1 LEVE
Grau 2 MODERADO
Grau 3 GRAVE
Grau 4 AMEAÇA À VIDA
Temperatura* (membrana timpânica)
38,0 – 38,4C
38,5 – 40,0C
> 40,0C
Febre persistente igual ou superior a 40,0C
por mais de 5 dias
Desidratação **
Turgescência e toque normais da pele, membranas mucosas úmidas, presença de lágrimas, olhos normais, moleira lisa, SNC – consolável, pulso regular, produção
normal de urina
Pele seca com perda de elasticidade, membranas mucosas secas, olhos fundos, diminuição das lágrimas, moleira plana, SNC – irritável, pulso levemente
aumentado, diminuição da produção de urina
Pele pegajosa com falta de turgescência, membranas mucosas ressecadas/rachadas, olhos muito fundos, ausência de lágrimas, moleira afundada, SNC – letargia, pulso elevado, sem produção de urina
Edema facial
Presente, leve inchaço dos olhos
Inchaço moderado dos olhos e da face
Grave inchaço comprometendo os olhos, face e membranas mucosas; incapacidade de abrir os olhos
Comprometimento das vias aéreas
Icterícia Leve amarelamento da esclerótica e conjuntiva
Amarelamento moderado da esclerótica e conjuntiva, amarelamento das membranas mucosas
Grave amarelamento da esclerótica e da conjuntiva, amarelamento da pele
N/A
Tórax Pequeno aumento da RR (para idade, temperatura), sons
pulmonares adventícios passageiros ou localizados
Moderado aumento da RR, sons pulmonares adventícios difusos ou
persistentes
Rápida RR (< 2 meses > 60, 2-12 meses > 50, 1-5 anos > 40, adultos >
30)* alargamento do nariz, retrações
Cianose
Abdome Sons intestinais normais, sensibilidade leve e localizada, e/ou fígado palpável 2-4 cm abaixo da margem costal direita (RCM), e/ou baço palpável, e/ou hérnia umbilical presente
Sons intestinais normais ou com pequena anormalidade, sensibilidade moderada ou difusa; e/ou fígado levemente ou moderadamente aumentado (4-6 cm abaixo da RCM) e/ou baço palpável até a metade entre o umbigo e a sínfise púbica
Sons intestinais bastante anormais, forte sensibilidade à palpação. Indícios de irritação peritoneal e/ou aumento significativo do fígado (> 6 cm abaixo da RCM) e/ou baço palpável em mais de metade entre o umbigo e a sínfise púbica
Ausência de sons intestinais. Rigidez involuntária
Pele† Erupções cutâneas
localizadas, eritema, ou prurido
Erupções cutâneas
difusas, maculopapulares, descamação seca
Vesiculação, descamação
úmida, ou ulceração
Dermatite exfoliativa,
envolvimento das membranas mucosas ou eritema multiforme ou suspeita de Stevens-Johnson ou necrose com necessidade de cirurgia
* Referência - DMID Pediatric Toxicity Tables, May 2001, Drug Fever (Rectal) ** Referência – The Harriet Lane Handbook, 15th edition, 2000 † Referência – Escala de Graduação da Toxicidade para a Determinação da Gravidade de Eventos Adversos – OMS.
237
DIRETRIZES PARA A GRADUAÇÃO DOS ACHADOS EM EXAMES FÍSICOS
Grau 1 LEVE
Grau 2 MODERADO
Grau 3 GRAVE
Grau 4 AMEAÇA À VIDA
Audição < 4 anos: N/A ≥ 4 anos: Diminuição da audição em um ouvido
< 4 anos: N/A ≥ 4 anos: Diminuição da audição em ambos os ouvidos ou grave comprometimento de um ouvido
< 4 anos: Qualquer indício de comprometimento da audição ≥ 4 anos: Grave comprometimento de ambos os ouvidos
N/A
Teste do comprimido
Dificuldade de segurar o comprimido, mas capaz de pegá-lo
Incapacidade de pegar o comprimido sem derrubar
Incapacidade de segurar o comprimido
N/A
Sintomas / sinais clínicos (não especificados de outro modo)
Sem tratamento; observar o quadro
Pode necessitar de mínima intervenção e monitoria
Requer cuidados médicos e possível hospitalização
Requer intervenção médica ativa, hospitalização, ou tratamento em asilo
238
ANEXO C: NORMAS PARA A GRADUAÇÃO DE RESULTADOS LABORATORIAIS:
TABELAS DE TOXICIDADE PEDIÁTRICA (ACIMA DE 3 MESES DE VIDA)
Grau 1 Leve
Grau 2 Moderado
Grau 3 Grave
Grau 4 Ameaça à vida
Hemoglobina para crianças com mais de 6 meses e menos de 2 anos de idade
9,0-9,9 gm/dL 7,0-8,9 gm/dL
< 7,0 gm/dL Insuficiência cardíaca decorrente de anemia
Hemoglobina para crianças com mais de 2 anos de idade
10-10,9 gm/dL 7,0-9,9 gm/dL
< 7,0 gm/dL Insuficiência cardíaca decorrente de anemia
Contagem Absoluta de Neutrófilos
750-1200/mm3 400-749/mm3
250-399/mm3 < 250/mm3
Plaquetas ------- 50.000-75.000/mm3
25.000 – 49.999/mm3
< 25.000/mm3
Bilirrubinas (quando acompanhado de aumento de qualquer outro teste de função hepática)
1,1 - < 1,25 x ULN
1,25 - < 1,5
x ULN
1,5 – 1,75 x
ULN
> 1,75 x ULN
Bilirrubinas (quando os demais testes de função hepática estão dentro da faixa normal)
1,1 - < 1,5 x ULN
1,5 - < 2,0 x
ULN
2,0 – 3,0 x
ULN
> 3,0 x ULN
AST (SGOT) 1,1 - <2,0 x ULN
2,0 – <3,0 x
ULN
3,0 – 8,0 x
ULN
> 8 x ULN
ALT (SGPT)
239
1,1 - <2,0 x ULN 2,0 – <3,0 x ULN
3,0 – 8,0 x ULN
> 8 x ULN
CREATININA
3 meses - 2 anos de idade
0,6-0,8 x ULN 0,9-1,1 x ULN 1,2-1,5 x ULN
> 1,5 x ULN
2 - 12 anos de idade
0,7-1,0 x ULN 1,1-1,6 x ULN 1,7-2,0 x ULN
> 2,0 x ULN
Mais de 12 anos
de idade 1,0-1,7 x ULN 1,8-2,4 x ULN 2,5-3,5 x
ULN > 3,5 x ULN
Outros valores laboratoriais não especificados na tabela
Anormais, mas sem necessidade
de intervenção imediata;
acompanhamento
Anormalidade suficiente para se avaliar a
causalidade e talvez realizar
leve intervenção terapêutica, mas não tão grave que justifique
alterações imediatas no medicamento experimental
Gravidade suficiente para se realizar
avaliação e tratamento, incluindo-se a suspensão pelo menos temporária
do medicamento experimental
Gravidade com ameaça à vida,
exigindo avaliação imediata,
tratamento e em geral
hospitalização; o medicamento deve
ser suspenso imediatamente e
não deve ser reiniciado até que se verifique com
certeza que a anormalidade foi
causada por outro mecanismo e não pelo medicamento
experimental
DIVISÃO DE MICROBIOLOGIA E DOENÇAS INFECCIOSAS (DMID) Tabelas de toxicidade pediátrica, Novembro 2007
240
DIRETRIZES PARA A GRADUAÇÃO DE RESULTADOS LABORATORIAIS: ADULTOS
HEMATOLOGIA
Grau 1 Leve
Grau 2 Moderado
Grau 3 Grave
Grau 4 Ameaça à vida
Hemoglobina
9,5 - 10,5 g/dL
8,0 - 9,4g/dL
6,5 - 7,9 g/dL
< 6,5 g/dL
Contagem Absoluta de Neutrófilos
1.000 - 1.500/mm3
750 - 999/mm3
500 - 749/mm3
< 500/mm3
Plaquetas
75.000 - 99.999/mm3
50.000 - 74.999/mm3
20.000 - 49.999/mm3
< 20.000/mm3
Leucócitos 11.000 - 13.000/ mm3
13.000 - 15.000 /mm3
15.000 - 30.000/mm3
> 30.000 ou < 1.000 /mm3
PERFIL BIOQUÍMICO
Grau 1
Leve
Grau 2
Moderado
Grau 3
Grave
Grau 4
Ameaça à vida
Hiperbilirrubinemia (quando acompanhada de aumento em qualquer outro teste de função hepática)
1,1 - < 1,25 x ULN
1,25 - < 1,5 x ULN
1,5 - < 1,75 x ULN
> 1,75 x ULN
Hiperbilirrubinemia (quando os demais testes de função hepática estiverem na faixa normal)
1,1 - < 1,5 x ULN
1,5 - < 2,0 x ULN
2,0 - < 3,0 x ULN
> 3,0 x ULN
Creatinina
1,1 - < 1,5 x ULN
1,6 - < 3,0 x ULN
3,1 - < 6 x ULN
> 6 x ULN ou necessidade de diálise
ENZIMAS
Grau 1 Leve
Grau 2 Moderado
Grau 3 Grave
Grau 4 Ameaça à vida
AST (SGOT)
1,1 - < 2,0 x ULN
2,0 – < 3,0 x ULN
3,0 – 8,0 x ULN
> 8 x ULN
241
ALT (SGPT) 1,1 - < 2,0 x ULN
2,0 – < 3,0 x ULN
3,0 – 8,0 x ULN
> 8 x ULN
DIVISÃO DE MICROBIOLOGIA E DOENÇAS INFECCIOSAS (DMID) TABELA DE TOXICIDADE DE ADULTOS Novembro 2007 COMO ESTIMAR A GRAVIDADE Para anormalidades NÃO encontradas nas Tabelas de Toxicidade, use a escala abaixo para estimar a gravidade: GRAU 1 Leve: Desconforto passageiro ou leve (< 48 horas); sem intervenção
médica / necessidade de medicação GRAU 2 Moderada: Limitação leve a moderada das atividades – pode haver a
necessidade de algum auxílio; nenhuma ou mínimaa intervenção médica / necessidade de medicação
GRAU 3 Grave: Limitação acentuada das atividades, podendo ser necessário algum auxílio; intervenção médica / necessidade de medicação, hospitalizações possíveis
GRAU 4 Ameaça à vida: Limitação extrema das atividades, auxílio significativo necessário; necessidade de intervenção médica / tratamento significante, provável hospitalização ou tratamento em asilo.
242
ANEXO D: CRITÉRIOS PARA A MALÁRIA GRAVE (OMS, 2010) Malária Grave Características clínicas: – inconsciência ou coma irreversível – prostração, isto é, fraqueza generalizada que impossibilita o paciente de andar ou se levantar sem auxílio – incapacidade de se alimentar – convulsões múltiplas – mais de dois episódios em 24 horas – respiração profunda, angústia respiratória (respiração acidótica) – colapso ou choque circulatório, pressão arterial sistólica < 70 mm Hg em adultos e < 50 mm Hg em crianças – icterícia clínica mais indícios de outra disfunção em órgão vital – hemoglobinúria – sangramento anormal espontâneo – edema pulmonar (radiológico) Achados laboratoriais: – hipoglicemia (glicose no sangue < 2,2 mmol/l ou < 40 mg/dl) – acidose metabólica (bicarbonato no plasma < 15 mmol/l) – anemia normocítica grave (Hb < 5 g/dl, volume do concentrado de eritrócitos < 15%) – hemoglobinúria – hiperparasitemia (> 2%/100.000/μl em áreas de baixa intensidade de transmissão ou > 5% ou 250.000/μl em áreas de alta porém estável intensidade de transmissão da malária) – hiperlactatemia (lactato > 5 mmol/l) – comprometimento renal (creatinina sérica > 265 μmol/l).
ANEXO E: TERMOS DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
1. TCLE PAR ADULTOS
Título do estudo: UM ESTUDO RANDOMIZADO COMPARATIVO PARA AVALIAR A EFICÁCIA E TOLERABILIDADE DE TRATAMENTOS ESQUIZONTICIDAS SANGUÍNEOS COM ARTESUNATO AMODIAQUINA WHINTROP® / COARSUCAM (ASAQ) VERSUS CLOROQUINA (CQ) PARA MALÁRIA NÃO COMPLICADA POR MONOINFECÇÃO DE PLASMODIUM VIVAX.
Número do Estudo: ARAMF_C_05370
Composto: Coarsucam™ / Artesunato Amodiaquina da Winthrop® (uma associação de dose fixa de artesunato com amodiaquina)
Patrocinador do Estudo: Grupo Sanofi-aventis
Nome do Investigador Principal: Dr. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda
Instituição: Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (Gerência de Malária)
Endereço: Av. Pedro Teixeira, 25 - Manaus - Amazonas - Brasil – CEP: 69040-000
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA ADULTOS 243
Favor leia estas informações com atenção. Tome o tempo necessário para fazer as perguntas que você quiser. A equipe do estudo explicará qualquer palavra ou informação que você não entenda claramente.
INTRODUÇÃO
Você está sendo convidado para participar de um estudo clínico. O seu médico do estudo (o médico que vai conduzir o estudo) acha que você tem as condições iniciais para poder participar deste estudo. Antes de concordar em participar neste estudo, é muito importante que você entenda o que a sua participação envolverá, entendendo as informações fornecidas neste documento. Este termo descreve o objetivo, os procedimentos, os benefícios, os riscos, os desconfortos e as precauções do estudo. Também descreve os procedimentos alternativos que estão disponíveis para você e seus direitos de se retirar do estudo a qualquer momento.
Você deve ser bem sincero com o médico a respeito do seu histórico de saúde, incluindo o uso anterior e atual de outras medicações. Caso contrário, você poderá prejudicar a si mesmo com a participação neste estudo. O médico do estudo lhe fará perguntas sobre o seu histórico de saúde. Será necessário que você converse sobre o uso anterior e atual de outras medicações.
Se você não puder ler ou escrever, uma testemunha, que é uma pessoa independente do patrocinador e do médico, lerá este documento para você. Se você concordar em participar, a sua impressão digital (carimbo do seu dedo polegar) substituirá a sua assinatura.
OBJETIVO DO ESTUDO
Você apresenta sinais de malária. A malária é uma doença causada por 4 diferentes tipos de parasitas (todos da mesma família), transmitidos por picadas de mosquitos. Um destes tipos de parasita foi encontrado no seu sangue.
A malária pode causar febre, dor de cabeça, dor e fraqueza. Pode ser muito séria e pode até levar à morte se não tratada correta e imediatamente.
Atualmente, um dos tratamentos recomendados pelas autoridades de saúde internacionais contém artesunato amodiaquina; esta medicação combinada é conhecida pelo nome de Artesunato
Amodiaquina da Winthrop® /Coarsucam (ASAQ). Este medicamento, ainda não aprovado para uso no Brasil, demonstrou a sua eficácia e segurança contra outro parasita da malária (Plasmodium falciparum) na África e na Colômbia. Este estudo tem o objetivo de juntar ainda mais informações sobre o medicamento, por isso a eficácia e segurança de ASAQ contra outro parasita da malária (Plasmodium vivax) será comparada a um medicamento anti-malária comumente utilizado no Brasil, chamado cloroquina.
DESCRIÇÃO DO ESTUDO
Este estudo clínico será realizado em um centro de saúde em Manaus - Estado do Amazonas (Brasil) com aproximadamente 380 pacientes com mais de 6 meses de idade.
Se você concordar em participar deste estudo e se você tiver as condições para ser selecionado, você será tratado com artesunato amodiaquina (ASAQ) ou cloroquina. Você será sorteado para receber um destes tratamentos (semelhante à retirada de um número de um chapéu). A duração do tratamento será de 3 dias e o acompanhamento durará 39 dias. Você deverá ir ao centro de saúde pelo menos 7 vezes, além de hoje.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA ADULTOS 244
Se você não tiver as condições de seleção, ou se escolher não participar do estudo, não haverá nenhum problema para receber o tratamento padrão contra malária; você receberá a mesma qualidade de tratamento por parte do pessoal do centro de saúde.
PROCEDIMENTOS DO ESTUDO
Se você concordar em participar do estudo, o médico realizará um exame físico, coleta de amostra e
verificará o seu histórico médico, também as medicações anteriores e atuais, para determinar se
você pode participar do estudo.
Visitas
Nos 3 primeiros dias, você virá ao centro todas as manhãs para receber o seu tratamento oral (pela
boca).
A partir daí, você retornará ao centro no 4º, 8º, 15º, 29º e 43º dias.
Ao final de cada visita, o seu médico marcará a data da próxima visita.
Exames
Em cada visita, será realizado um exame clínico e físico, incluindo medir sua temperatura corporal e a pressão do sangue.
Na 1ª visita e durante as visitas sem coleta de amostra de sangue para exame laboratorial, uma pequena quantidade de sangue será retirada por meio de uma picada no dedo para pesquisar os parasitas da malária e outra amostra de sangue será coletada e guardada em papel de filtro para análises complementares.
Nas visitas do 1º dia, 8º dia e 29º dia, uma amostra de sangue, igual a uma colher de café, será coletada de uma veia do seu braço para exames laboratoriais e para a análise complementar. Uma coleta de sangue adicional poderá ser realizada no 15º e no 43º dia, dependendo do seu estado, ou se os resultados anteriores forem anormais. A equipe buscará reduzir a uma coleta de sangue por visita.
Análises complementares são:
Uma para confirmar a espécie de malária do qual você foi infectado, realizado no primeiro dia e no dia que você tiver um novo sinal de malária (se isso ocorrer).
Outra para estudar a dosagem do medicamento no dia 7 e no dia que você tiver um novo sinal de malária (se isso ocorrer). Especificamente para a dosagem do medicamento artesunato de amodiaquina, a sua amostra de sangue será analisada num país estrangeiro, mantendo a sua confidencialidade adequadamente, conforme requerido pelos regulamentos internacionais e nacionais.
Um exame será realizado para uma análise complementar no futuro. Esta amostra de sangue será tomada no primeiro dia ou no dia em que seu médico achar que você está doente novamente. Esta amostra de sangue será usada no futuro para ajudar a ter um melhor conhecimento sobre os
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA ADULTOS 245
parasitas da malária. Sua amostra de sangue poderá ser armazenada por 5 anos, de acordo com as leis do Brasil, no hospital, sob responsabilidade da instituição e do médico do estudo.
Atenção: Para estas análises complementares, nenhum sangue extra será retirado de você se forem realizados no mesmo dia do teste de laboratório. Mas se não forem, estas análises serão feitas de uma pequena picada onde apenas uma gota será obtida.
Estes exames não atrasarão o início do tratamento da doença.
O tratamento neste estudo não é recomendado durante os primeiros três meses da gravidez. Por este motivo, se você for uma mulher que pode engravidar, deverá concordar em utilizar um método contraceptivo eficaz durante o estudo, conforme indicado pelo seu médico do estudo. Além disso, no primeiro dia você realizará um teste de gravidez pela urina. Se este teste for negativo, você poderá participar deste estudo.
Em caso de teste de gravidez positivo, você receberá o tratamento recomendado nas diretrizes das Autoridades de Saúde utilizadas no Brasil para o tratamento de malária em uma mulher grávida.
Um segundo teste de gravidez será realizado no 43º dia; caso seja positivo, a sua saúde e a do seu bebê serão acompanhadas até o final da sua gravidez e nascimento, pelo tempo necessário.
Na visita no 1º, 3º e 29º dia, será realizado um eletrocardiograma, que é um exame do coração com equipamento especial, que não penetra no corpo. Este exame não causa dor.
Todos os resultados destes exames serão comunicados a você e permanecerão confidenciais.
Se o tratamento dado a você não estiver funcionando bem, um novo tratamento será imediatamente administrado, sem custos para você.
RISCOS OU INCONVENIÊNCIAS RAZOAVELMENTE PREVISÍVEIS
Nos estudos anteriores, não foram informados sinais de intolerância graves em relação a estes tratamentos; mas, caso você sinta algo incomum, favor informar ao seu médico assim que possível. Não interrompa o tratamento por sua própria vontade. Todos os sinais listados abaixo em geral são reversíveis e leves.
O uso de ASAQ pode envolver os efeitos colaterais a seguir:
- Eventos mais freqüentes: perda de apetite (fome), dificuldade para dormir, sono, dor de barriga, náusea (enjôo), fraqueza, cansaço, tosse.
- Eventos não comuns: bronquite aguda, problema no estômago, diminuição na contagem de celular vermelhas do sangue (anemia), hipoglicemia (pouco açúcar no sangue), alucinação, formigamento e dormência dos membros, amarelamento do olho, tontura, distúrbios do batimento do coração, diarréia, vômito, coceira, feridas na pele, inchaço da face, problemas na pele, dor nas juntas, inchaço dos membros, febre.
Efeitos colaterais que podem estar ligados à amodiaquina, um dos ingredientes ativos de ASAQ:
- Baixa contagem de células brancas do sangue (que podem lhe tornar mais sujeito a infecções), problemas graves da função do fígado, problemas de visão, cor cinza na pele, especialmente dos dedos e das partes mucosas (dentro da sua boca), problemas no sistema nervoso e muscular.
O uso de Cloroquina pode envolver os efeitos a seguir:
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA ADULTOS 246
- Eventos freqüentes: visão anormal ou embaçada, dor de cabeça, problema no estômago, náusea (enjôo), vômito, dor de barriga, coceira.
- Eventos menos freqüentes: cansaço, nervosismo, ansiedade, fraqueza, coloração azul da boca, das unhas e da pele, branqueamento do cabelo, perda de cabelo, feridas na pele.
- Eventos raros: irritabilidade, agitação, agressividade, confusão, alteração da consciência (efeitos sobre o comportamento), alteração da saúde do coração pelo resultado do exame de eletrocardiograma, baixa contagem de alguns tipos de células do sangue, fraqueza muscular, problemas de audição.
A coleta de sangue pode causar algum desconforto, sangramento ou mancha roxa, mas raramente causa tontura. Antes de cada amostra de sangue, o braço ou o dedo será desinfetado e uma nova seringa e agulha serão utilizadas para coletar o sangue.
Durante o período do estudo, você poderá apresentar efeitos colaterais ou desconfortos que não estão listados neste termo. Informe o médico ou a equipe do estudo imediatamente se você apresentar algum problema. Você receberá assistência médica adequada.
BENEFÍCIOS RAZOAVELMENTE ESPERADOS
Este estudo clínico oferece benefício individual direto para o participante, porque o medicamento em teste já está aprovado em alguns países e a sua eficácia já é conhecida. Os exames laboratoriais permitirão que o Médico do estudo determine se você está ou não infectado pelo parasita da malária. Se você estiver infectado, este tratamento poderá melhorar a sua saúde e você será monitorado de perto por 42 dias.
Além disso, você deverá retornar à clínica para avaliação adicional e/ou tratamento se for verificado que você está doente. Outras doenças relacionadas ao estudo que ocorram durante o período do estudo serão tratadas.
A sua participação nos ajudará a entender melhor esta medicação e a atingir os objetivos do estudo. A sua comunidade também poderá se beneficiar dos resultados deste estudo no futuro.
PROCEDIMENTOS OU TRATAMENTOS ALTERNATIVOS
Mesmo se você decidir não participar do estudo, você receberá um tratamento adequado. Se você tiver dúvidas a respeito de suas alternativas de tratamento, favor fazer as suas perguntas ao seu médico do estudo. Você e o seu médico podem decidir qual tratamento é o melhor para você.
PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA NO ESTUDO - RETIRADA DO ESTUDO
A sua participação neste estudo é totalmente voluntária. Você tem o direito de sair deste estudo a
qualquer momento e por qualquer motivo. A recusa em participar ou se você sair do estudo não
afetará o seu tratamento médico, nem causarão uma perda de benefícios aos quais você tem direito,
de outra forma. A recusa não afetará a sua relação com o seu médico.
A sua participação neste estudo será interrompida pelos motivos a seguir, você concorde ou não:
Se você não seguir os procedimentos do estudo,
Se, na opinião do médico do estudo, for o melhor para você,
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA ADULTOS 247
Se o patrocinador do estudo encerrar o estudo por qualquer motivo,
Se as autoridades regulatórias responsáveis, ou o Comitê de Ética, decidir encerrar o estudo.
Caso ocorra uma interrupção, o Comitê de Ética Institucional será informado sobre as razões do
término do estudo, para que possa aprovar esta interrupção. A interrupção deste estudo, por
qualquer razão, não prejudicará de forma alguma o acompanhamento médico ao qual você tem
direito.
CASO SEJA NECESSÁRIO CONTINUAR O SEU TRATAMENTO CONTRA MALÁRIA APÓS O FINAL DO ESTUDO, O MÉDICO DO ESTUDO IRÁ GARANTIR O SEU RETORNO AOS CUIDADOS USUAIS PRATICADOS NESSA INSTITUIÇÃO.
O ACESSO AO MEDICAMENTO EM TESTE LHE SERÁ ASSEGURADO CASO O ESTUDO COMPROVE QUE ELE É MELHOR DO QUE O TRATAMENTO CONVENCIONAL E VOCÊ TENHA PRESCRIÇÃO DE SEU INVESTIGADOR PRINCIPAL PARA USÁ-LO.
Caso você se retire do estudo antes da sua conclusão, solicitamos que participe dos procedimentos programados (exame físico, coleta de sangue, etc.), para a sua própria segurança.
Antes de sua participação no estudo clínico, o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido deverá ser pessoalmente assinado e datado por você, ou por uma testemunha independente do médico se você não puder ler ou escrever (neste caso você fornecerá sua impressão digital) e pela pessoa que conversou sobre o consentimento livre e esclarecido. Antes de assinar este termo (ou de deixar a sua impressão digital como assinatura), você deverá fazer todas as perguntas que tiver sobre o que você não entender. A equipe responsável pelo estudo responderá às suas perguntas.
Você receberá uma via deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e poderá solicitar informações adicionais, a qualquer momento durante o estudo, do médico no centro, ou poderá entrar em contato no número de telefone que neste termo.
RESPONSABILIDADES DO PACIENTE/ RECOMENDAÇÕES PRÁTICAS
A partir do primeiro dia e até o final do estudo, você não deverá tomar qualquer outra medicação sem conversar antes com o médico. Se você atualmente toma outros medicamentos, é importante que informe ao médico.
Se você faltar a uma consulta, uma pessoa do centro de saúde lhe visitará em casa para verificar porque você faltou à consulta e lhe trará ao centro de saúde para avaliação.
CUSTOS, NÃO REMUNERAÇÃO E COMPENSAÇÃO
O(s) medicamento(s) do estudo, COARSUCAM™(artesunato amodiaquina da Winthrop®) e CLOROQUINA, se necessário PRIMAQUINA, serão dados a você sem nenhum custo durante o estudo. O patrocinador do estudo, sanofi-aventis, arcará com as despesas relacionadas a todos os exames requeridos pelo estudo. Portanto, sua participação neste estudo não terá nenhum custo para você. Quando for necessário, os custos de transporte até o hospital e os custos para sua alimentação nos dias de visita ao centro de estudos serão ressarcidos. No entanto, sua participação neste estudo não será remunerada.
Se você/sua parceira é mulher em idade fértil, e caso seja necessário, o método contraceptivo indicado será fornecido gratuitamente pelo patrocinador do estudo, mediante prescrição médica.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA ADULTOS 248
Mesmo assim, se você/sua parceira engravidar durante o estudo, você deve informar o médico do estudo imediatamente, e ele irá lhe orientar sobre os procedimentos/cuidados necessários. Seu médico do estudo será responsável por acompanhar e assistir você ou sua parceira até o final da gravidez e avaliar você/sua parceira e o estado do recém nascido. Se necessário, a assistência médica apropriada será fornecida pelo seu médico para você e/ou seu bebê.
A sanofi-aventis possui um seguro para cobrir riscos relacionados à participação no estudo.
Caso ocorra algum dano, mencionado ou não neste termo, que tenha sido resultante de sua participação no estudo, a sanofi-aventis lhe assegura o tratamento e acompanhamento médico necessário, bem como uma eventual compensação.
CONFIDENCIALIDADE
A garantia de sigilo e privacidade dos seus dados, de acordo com as normas brasileiras, será assegurada.
Toda informação obtida durante este estudo, incluindo os registros médicos, dados pessoais e da pesquisa são confidenciais. Sua identidade pessoal, quer dizer, seu nome, endereço e outros dados, permanecerão sob sigilo, no centro de estudos. A forma de garantir este sigilo será identificá-lo(a) através de um código numérico e data de nascimento. Somente a equipe do estudo será capaz de ligar o código numérico ao seu nome completo. Durante sua participação neste estudo clínico, seu médico irá coletar seus dados pessoais e os dados sobre sua saúde. Estes dados serão repassados ao patrocinador do estudo de forma codificada. Estas informações serão guardadas por pelo menos 15 anos.
Você tem o direito de acessar seus dados junto ao médico do estudo e pedir correções, caso estes estejam errados ou incompletos.
Caso você seja acompanhado por um médico pessoal, e caso você concorde com isso, o médico do estudo informará este médico sobre sua participação no estudo.
O patrocinador irá analisar os dados estatisticamente para determinar a eficácia e a segurança do COARSUCAM™ / ARTESUNATO AMODIAQUINA DA WINTHROP®, assim como obter informações gerais sobre sua doença. Além disto, seus dados codificados podem ser usados em publicações científicas.
NOVAS INFORMAÇÕES DISPONÍVEIS
VOCÊ SERÁ INFORMADO PELO SEU MÉDICO O QUANTO ANTES DE TODA NOVA INFORMAÇÃO RELEVANTE QUE SE TORNE DISPONÍVEL NO DECORRER DESTE ESTUDO E QUE POSSA AFETAR SUA DECISÃO EM PARTICIPAR. SEU MÉDICO DISCUTIRÁ COM VOCÊ SE VOCÊ DESEJA OU NÃO CONTINUAR NO ESTUDO. SE VOCÊ DECIDIR SE RETIRAR, SEU MÉDICO TOMARÁ PROVIDÊNCIAS PARA QUE VOCÊ CONTINUE RECEBENDO OS CUIDADOS MÉDICOS NECESSÁRIOS.
OUTRAS INFORMAÇÕES RELEVANTES
O Investigador Principal deste estudo, médico do estudo, é o Dr. Marcus V. G. de Lacerda, que pode ser encontrado no seguinte endereço: Av. Pedro Teixeira, 25 - Manaus - Amazonas - Brasil – CEP: 69040-000 e telefone (horário comercial e fora do horário comercial) (92) 2127 3537 Celular (92) 9114 7633.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA ADULTOS 249
EM QUALQUER FASE DO ESTUDO, VOCÊ TERÁ ACESSO AO INVESTIGADOR E SUA EQUIPE PARA COMUNICAR SINTOMAS INESPERADOS E NÃO HABITUAIS DURANTE O ESTUDO, ESCLARECER DÚVIDAS OU PEDIR INFORMAÇÕES ADICIONAIS.
ESTE ESTUDO FOI APROVADO POR UM COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA EM SERES HUMANOS E ESTÁ DE ACORDO COM AS NORMAS NACIONAIS E INTERNACIONAIS PARA SUA REALIZAÇÃO. SE VOCÊ TIVER ALGUMA DÚVIDA OU QUISER ALGUMA INFORMAÇÃO ADICIONAL SOBRE SEUS DIREITOS COMO SUJEITO DE PESQUISA OU SOBRE OS ASPECTOS ÉTICOS DO ESTUDO, ENTRE EM CONTATO COM O COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS NO ENDEREÇO AV. PEDRO TEIXEIRA, 25 - MANAUS - AMAZONAS – CEP: 69040-000 E TELEFONES (92) 2127-3402 / (92) 2127-3432.
1. Eu li ou leram para mim o termo de consentimento livre e esclarecido para esse estudo. Recebi
todas as explicações sobre a natureza, objetivo, duração, efeitos e riscos previsíveis do estudo, assim como sobre as minhas responsabilidades. As minhas perguntas foram respondidas satisfatoriamente.
2. Concordo em participar desse estudo. Concordo em cooperar totalmente com o médico do estudo e entrarei em contato com ele/ela imediatamente caso eu apresente quaisquer sintomas inesperados ou não usuais durante o estudo. Durante o período do estudo, eu informarei ao médico do estudo sobre quaisquer outros tratamentos médicos que eu possa vir a precisar.
3. Informei ao médico do estudo sobre todas as minhas doenças e medicações que venho usando, além de informar sobre todas as minhas consultas médicas recentes.
4. Informei também ao médico do estudo sobre qualquer participação minha em outros estudos clínicos no último ano.
5. Estou ciente de que se não cooperar com os pedidos e as orientações do médico do estudo, posso vir a me prejudicar ao participar deste estudo.
6. Entendo que minha participação no estudo é voluntária e que posso me recusar a participar ou posso sair do estudo a qualquer momento. Caso eu recuse participar deste estudo, não serei penalizado de nenhuma forma e minha decisão não prejudicará qualquer cuidado médico ao qual tenho direito. Entendo ainda que quaisquer informações que possam surgir durante a condução do estudo, que possam afetar minha decisão em participar, me serão passadas assim que possível.
7. Representantes do patrocinador, Comitê de Ética em Pesquisa e autoridades regulatórias nacionais e ou internacionais poderão examinar e copiar meus registros médicos para verificar as informações neles coletadas. Ao assinar este documento, autorizo este uso de meus registros.
8. Receberei uma via assinada deste consentimento. Nome do paciente: ______________________________________________________________ (a ser preenchido pelo paciente - ou representante legal/ testemunha, quando aplicável)
Assinatura do paciente: _____________________________________________ Data:________ (ou impressão digital, ou nome e assinatura do representante legal, se aplicável)
Nome da testemunha:_____________________________________________________________ (a ser preenchido pela testemunha, quando aplicável)
Assinatura da testemunha:____________________________________________ Data:________ (se aplicável)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA ADULTOS 250
Razão para a necessidade de testemunha:____________________________________________ (se aplicável)
Investigador/Sub-investigador ou pessoa que conduziu a discussão sobre o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Confirmo que expliquei pessoalmente a natureza, propósito, duração, efeitos e riscos previsíveis do estudo ao paciente acima mencionado. Nome: _______________________________________________________ Assinatura: ________________________________________ Data:_________
2. TCLE PARA CRIANÇAS
Título do estudo: UM ESTUDO RANDOMIZADO COMPARATIVO PARA AVALIAR A EFICÁCIA E TOLERABILIDADE DE TRATAMENTOS ESQUIZONTICIDAS SANGUÍNEOS COM ARTESUNATO AMODIAQUINA WHINTROP® / COARSUCAMTM (ASAQ) VERSUS CLOROQUINA (CQ) PARA MALÁRIA NÃO COMPLICADA POR MONOINFECÇÃO DE PLASMODIUM VIVAX.
Número do Estudo: ARAMF_C_05370
Composto: Coarsucam™ / Artesunato Amodiaquina da Winthrop® (uma associação de dose fixa de artesunato com amodiaquina)
Patrocinador do Estudo: Grupo Sanofi-aventis
Nome do Investigador Principal: Dr. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda
Instituição: Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (Gerência de Malária)
Endereço: Av. Pedro Teixeira, 25 - Manaus - Amazonas - Brasil – CEP: 69040-000
Por favor, leia estas informações com atenção. Tome o tempo necessário para fazer as perguntas que você quiser. A equipe do estudo explicará qualquer palavra ou informação que você não entenda claramente.
INTRODUÇÃO
Seu filho(a) está sendo convidado(a) a participar de um estudo clínico. O médico do estudo (o médico que conduz o estudo) acha que seu filho(filha) tem as condições iniciais para poder participar do estudo. Antes de concordar que seu filho (a) participe do estudo, é muito importante que você entenda o que participação dele envolverá, entendendo as informações fornecidas neste documento. Este termo descreve o objetivo, os procedimentos, os benefícios, os riscos, os desconfortos e as precauções do estudo. Descreve também os procedimentos alternativos que estão disponíveis para seu filho(a) e seu direito para se retirar do estudo a qualquer momento.
Você deve ser bem sincero com seu médico a respeito do histórico de saúde de seu filho(a), incluindo o uso anterior e atual de outras medicações. Caso contrário, seu filho(a) poderá ser prejudicado ao participar desse estudo. O médico do estudo lhe fará perguntas sobre o histórico da saúde de seu filho(a). Será necessário que você fale sobre o uso anterior e atual de outras medicações.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA REPRESENTANTE LEGAL DE MENORES DE IDADE
251
Se não puder ler ou escrever, uma testemunha, que é uma pessoa independente, do patrocinador e do médico lerá este documento para você. Se concordar com a participação de seu filho(a), sua impressão digital (carimbo do seu dedo polegar) substituirá a sua assinatura.
OBJETIVO DO ESTUDO
Seu filho(a) apresenta sinais de malária. A malária é uma doença causada por 4 diferentes tipos de parasitas (todos da mesma família) transmitidos por picadas de mosquitos. Um desses tipos de parasita foi encontrado no sangue de seu filho(a).
A malária pode causar febre, dor de cabeça, dor e fraqueza. Pode ser muito séria e até levar à morte se não for tratada correta e imediatamente.
Atualmente, um dos tratamentos recomendados pelas autoridades de saúde internacionais contém artesunato de amodiaquina; essa medicação combinada é conhecida pelo nome de Artesunato Amodiaquina Winthrop® / CoarsucamTM (ASAQ). Esse medicamento, ainda não está aprovado para uso no Brasil, demonstrou sua eficácia e segurança contra outro parasita da malária (Plasmodium falciparum) na África e na Colômbia. Este estudo tem o objetivo de juntar ainda mais informações sobre o medicamento, por isso a eficácia e segurança de ASAQ contra outro parasita da malária (Plasmodium vivax) será comparada a um medicamento anti-malária comumente utilizado no Brasil, chamado cloroquina.
DESCRIÇÃO DO ESTUDO
Este estudo clínico será realizado em um centro de saúde em Manaus – Estado do Amazonas (Brasil) com aproximadamente 380 pacientes com mais de 6 meses de idade.
Se você concordar que seu filho(a) participe desse estudo e se ele tiver as condições para ser selecionado, ele será tratado com artesunato amodiaquina (ASAQ) ou cloroquina. Seu filho(a) será sorteado para receber um desses tratamentos (como se fosse tirar um número de um chapéu). A duração do tratamento será de 3 dias e o acompanhamento durará 39 dias. Seu filho(a) deverá ir ao centro de saúde pelo menos 7 vezes, além de hoje.
Se seu filho(a) não tiver as condições de seleção ou se você escolher para que ele(a) não participe do estudo, não haverá nenhum problema para seu filho receber o tratamento padrão contra malária; ele terá direito a receber a mesma qualidade de tratamento por parte do pessoal do centro de saúde.
PROCEDIMENTOS DO ESTUDO
Se você concordar com a participação de seu filho(a) no estudo, o médico realizará um exame físico e coleta de amostra de seu filho(a) e verificará seu histórico médico, bem como as medicações anteriores e atuais, a fim de determinar se ele pode participar do estudo.
Visitas
Nos 3 primeiros dias, seu filho(a) deverá comparecer ao centro todas as manhãs para receber o tratamento oral (pela boca).
A partir daí, ele deverá retornar ao centro nos dias 4º, 8º, 15º, 29º e 43º.
Ao final de cada visita, seu médico marcará a data da próxima visita.
Exames
Em cada visita, será realizado um exame clínico e físico, incluindo medir temperatura corporal e a pressão do sangue do seu filho(a).
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA REPRESENTANTE LEGAL DE MENORES DE IDADE
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Na primeira visita e durante as visitas sem coleta de amostra de sangue para exames laboratoriais, uma pequena quantidade de sangue será retirada por meio de uma picada no dedo para pesquisar os parasitas da malária e outra amostra de sangue será coletada e guardada em papel-filtro para análises complementares.
Nas visitas dos dias 1, 8 e 29, uma amostra de sangue igual a uma colher de café será coletada de uma veia do seu braço para exames laboratoriais e análise complementar. Uma coleta de sangue adicional poderá ser realizada nos dias 15 e 43 dependendo do estado de seu filho(a) ou se os resultados anteriores forem anormais. A equipe buscará reduzir a uma coleta de sangue por visita.
Análises complementares são:
Uma para confirmar a espécie de malária do qual seu filho (a) foi infectado, realizado no primeiro dia e no dia que ele/ela tiver um novo sinal de malária (se isso ocorrer).
Outra para estudar a dosagem do medicamento no dia 7 e no dia que ele/ela tiver um novo sinal de malária (se isso ocorrer). Especificamente para a dosagem do medicamento artesunato de amodiaquina, a amostra de sangue será analisada num país estrangeiro, mantendo a confidencialidade adequadamente, conforme requerido pelos regulamentos internacionais e nacionais.
Um Exame será realizado para uma análise complementar no futuro. Esta amostra de sangue será tomada no primeiro dia ou no dia em que o médico achar que seu filho (a) está doente novamente. Esta amostra de sangue será usada no futuro para ajudar a ter um melhor conhecimento sobre os parasitas da malária. A amostra de sangue poderá ser armazenada por 5 anos, de acordo com as leis do Brasil, no hospital, sob responsabilidade da instituição e do médico do estudo.
Atenção: Para estas análises complementares, nenhum sangue extra será retirado de você se forem realizados no mesmo dia do teste de laboratório. Mas se não forem, estas análises serão feitas de uma pequena picada onde apenas uma gota será obtida.
Esses exames não atrasarão o início do tratamento da doença.
O tratamento nesse estudo não é recomendado durante os primeiros três meses de gravidez. Por este motivo, se sua filha for uma moça jovem que pode engravidar, ela deverá concordar em usar um método contraceptivo eficaz durante o estudo, como indicado pelo seu médico do estudo. Além disso, no primeiro dia sua filha deverá fazer um teste de gravidez pela urina. Se este teste for negativo, sua filha poderá participar desse estudo. Em caso de teste de gravidez positivo, sua filha receberá o tratamento recomendado pelas diretrizes das Autoridades de Saúde usadas no Brasil para o tratamento de malária em uma mulher grávida.
Um segundo teste de gravidez será realizado no 43º dia; caso seja positivo, a saúde de sua filha e do bebê serão acompanhadas até o final da gravidez e nascimento, pelo tempo necessário.
Se seu filho(a) tiver 10 anos de idade ou mais, nas consultas dos dias 1, 3 e 29 será realizado um eletrocardiograma, que é um exame do coração com equipamento especial que não penetra no corpo Este exame não causa dor.
Todos os resultados desses exames serão comunicados a você e permanecerão confidenciais.
Se o tratamento dado ao seu filho(a) não estiver funcionando bem, um novo tratamento será imediatamente administrado, sem custos para você.
RISCOS OU INCONVENIÊNCIAS RAZOAVELMENTE PREVISÍVEIS
Nos estudos anteriores, não foram informados sinais de intolerância graves em relação a esse tratamento; mas, caso seu filho(a) sinta algo incomum , favor informar ao seu médico assim que possível. Não interrompa o tratamento por sua própria vontade. Todos os sinais listados abaixo em geral são reversíveis e leves.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA REPRESENTANTE LEGAL DE MENORES DE IDADE
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O uso do ASAQ pode envolver os seguintes efeitos colaterais:
- Eventos mais frequentes: perda do apetite (fome), dificuldade para dormir, sono, dor de barriga, náusea (enjôo), fraqueza, cansaço, tosse.
- Eventos não comuns: bronquite aguda, problema no estômago e intestino, fungo oral, diminuição na contagem de células vermelhas do sangue (anemia), hipoglicemia (pouco açúcar no sangue), alucinações, formigamento e dormência dos membros, amarelamento dos olhos, tontura, distúrbios do batimento do coração, diarréia, vômitos, coceira, feridas na pele, inchaço na face, problemas na pele, dor nas juntas, inchaço dos membros, febre.
Efeitos colaterais que podem estar ligados à amodiaquina, um dos ingredientes ativos do ASAQ:
- Baixa contagem de células brancas do sangue (que podem lhe tornar mais sujeito a infecções), problemas graves da função do fígado, problemas de visão, cor cinza na pele, especialmente dos dedos e partes mucosas (dentro da sua boca), problemas no sistema nervoso e muscular.
O uso de Cloroquina pode envolver os seguintes efeitos:
- Eventos frequentes: Visão anormal ou embaçada, dor de cabeça, problemas no estômago e intestino, náuseas (enjôo), vômitos, dor de barriga, coceira.
- Eventos menos frequentes: cansaço, nervosismo, ansiedade, fraqueza, coloração azul da boca, unhas e pele, branqueamento dos cabelos, perda de cabelo, feridas na pele.
- Eventos raros: irritabilidade, agitação, agressividade, confusão, alteração da consciência (efeitos sobre o comportamento), alteração da saúde do coração pelo resultado do exame de eletrocardiograma , contagem baixa de alguns tipos de células do sangue, fraqueza muscular, problemas de audição.
A coleta de sangue pode causar algum desconforto, sangramento ou mancha roxa, mas, raramente causa tonturas. Antes de cada coleta de amostra de sangue, o braço ou dedo será desinfetado e será usada uma nova seringa e agulha para coletar o sangue.
Durante o período do estudo, seu filho(a) pode apresentar efeitos colaterais ou desconfortos que não estão listados neste termo. Informe ao médico ou à equipe do estudo imediatamente se seu filho(a) apresentar algum problema. Seu filho(a) receberá assistência médica adequada.
BENEFÍCIOS RAZOAVELMENTE ESPERADOS
Esse estudo clínico oferece benefício individual direto para os participantes porque o medicamento em teste já está aprovado em alguns países e sua eficácia já é conhecida. Os exames laboratoriais realizados permitirão ao médico do estudo determinar se seu filho(a) está ou não infectado pelo parasita da malária. Se seu filho(a) estiver infectado, esses tratamentos poderão melhorar sua saúde e seu filho(a) será monitorado de perto por 42 dias.
Além disso, você deverá retornar à clínica para futuras avaliações e/ou tratamentos se seu filho(a) estiver doente. Outras doenças relacionadas ao estudo que ocorram durante o período do estudo serão tratadas.
A participação de seu filho(a) nos ajudará a entender melhor essa medicação e atingir os objetivos do estudo. A sua comunidade também poderá se beneficiar dos resultados deste estudo no futuro.
PROCEDIMENTOS OU TRATAMENTOS ALTERNATIVOS
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA REPRESENTANTE LEGAL DE MENORES DE IDADE
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Mesmo se você decidir que seu filho(a) não deve participar do estudo, ele receberá um tratamento adequado. Se tiver dúvidas a respeito das alternativas de tratamento, favor fazer as suas perguntas ao seu médico do estudo. Você e seu médico podem decidir qual o melhor tratamento para seu filho(a).
PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA NO ESTUDO – RETIRADA DO ESTUDO
A participação de seu filho(a) neste estudo é totalmente voluntária. Você tem o direito de retirar a participação de seu filho(a) a qualquer momento e por qualquer razão. Recusar-se a participar ou descontinuar o estudo não afetará a assistência médica ao seu filho(a) ou perda de benefícios aos quais ele tenha direito de outra forma. A recusa não afetará sua relação com o seu médico.
A participação de seu filho(a) neste estudo será interrompida pelos motivos a seguir , você concorde ou não:
Se seu filho(a) não seguir os procedimentos do estudo,
Se, na opinião do médico do estudo, for o melhor para seu filho(a),
Se o patrocinador do estudo encerrar o estudo, por qualquer motivo,
Se as autoridades regulatórias responsáveis ou o Comitê de Ética decidir encerrar o estudo.
Caso ocorra uma interrupção, o Comitê de Ética Institucional será informado sobre as razões do término do estudo, para que possa aprovar esta interrupção. A interrupção deste estudo, por qualquer razão, não prejudicará de forma alguma o acompanhamento médico ao qual seu filho(a) tem direito.
Caso seja necessário continuar o seu tratamento contra malária após o final do estudo, o médico do estudo irá garantir o seu retorno aos cuidados usuais praticados nessa instituição.
O acesso ao medicamento em teste lhe será assegurado caso o estudo comprove que ele é melhor do que o tratamento convencional e você tenha prescrição de seu investigador principal para usá-lo.
Caso você retire a participação de seu filho(a) no estudo antes da sua conclusão, solicitamos que ele/ela participe dos procedimentos programados (exame físico, amostra de sangue, etc.) para a própria segurança de seu filho(a).
Antes da participação de seu filho(a) no estudo clínico, o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido deve ser pessoalmente assinado e datado por você, ou por uma testemunha independente do médico, se você não puder ler ou escrever (neste caso você fornece sua digital) e pela pessoa que conversou sobre o consentimento livre e esclarecido. Se seu filho(a) for capaz de entender esse estudo, ele/ela deverá assinar um termo de assentimento após ler (ou ouvir quando o documento for lido) ou, se não souber ler, deve imprimir a digital. Antes de assinar esse termo (deixar sua impressão digital como assinatura), você deverá fazer todas as perguntas que tiver sobre o que você não entendeu. A equipe responsável pelo estudo responderá suas perguntas.
Você receberá uma via deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e poderá solicitar informações adicionais a qualquer momento durante o estudo, do médico no centro ou poderá entrar em contato no número de telefone que está neste termo.
RESPONSABILIDADES DO PACIENTE/RECOMENDAÇÕES PRÁTICAS
A partir do primeiro dia e até o final do estudo, seu filho(a) não deverá tomar qualquer outra medicação sem conversar antes com o médico. Se atualmente seu filho(a) estiver tomando outros medicamentos é importante que você informe ao médico .
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA REPRESENTANTE LEGAL DE MENORES DE IDADE
255
Se seu filho(a) faltar a uma consulta, uma pessoa do centro de saúde lhe visitará em casa para verificar porque ele/ela faltou à consulta e trará você e seu filho(a) ao centro de saúde para avaliação.
CUSTOS, NÃO REMUNERAÇÃO E COMPENSAÇÃO
O(s) medicamento(s) do estudo, COARSUCAM™(artesunato amodiaquina da Winthrop®) e CLOROQUINA, se necessário PRIMAQUINA, serão dados a você sem nenhum custo durante o estudo. O patrocinador do estudo, sanofi-aventis, arcará com as despesas relacionadas a todos os exames requeridos pelo estudo. Portanto, a participação de seu filho(a) neste estudo não terá nenhum custo para você. Quando for necessário, os custos de transporte até o hospital e os custos para alimentação nos dias de visita ao centro de estudos serão ressarcidos. No entanto, a participação de seu filho(a) neste estudo não será remunerada.
Se sua filha/parceira de seu filho é uma jovem mulher em idade fértil, e caso seja necessário, o método contraceptivo indicado será fornecido gratuitamente pelo patrocinador, mediante prescrição médica.
Mesmo assim, se sua filha/parceira de seu filho engravidar durante o estudo, vocês devem informar o médico do estudo imediatamente, e ele irá orientar sobre os procedimentos/cuidados necessários. Seu médico do estudo será responsável por acompanhar e assistir sua filha ou parceira de seu filho até o final da gravidez e avaliar sua filha/parceira de seu filho e o estado do recém nascido. Se necessário, a assistência médica apropriada será fornecida pelo seu médico para você e/ou seu bebê.
A sanofi-aventis possui um seguro para cobrir riscos relacionados à participação no estudo.
Caso ocorra algum dano, mencionado ou não neste termo, que tenha sido resultante de sua participação no estudo, a sanofi-aventis lhe assegura o tratamento e acompanhamento médico necessário, bem como uma eventual compensação.
CONFIDENCIALIDADE
A garantia de sigilo e privacidade dos dados de seu filho(a), de acordo com as normas brasileiras, será assegurada.
Toda informação obtida durante este estudo, incluindo os registros médicos, dados pessoais e da pesquisa são confidenciais. A identidade pessoal de seu filho(a), quer dizer, seu nome, endereço e outros dados, permanecerão sob sigilo, no centro de estudos. A forma de garantir este sigilo será identificá-lo(a) através de um código numérico e data de nascimento. Somente a equipe do estudo será capaz de ligar o código numérico ao nome completo. Durante sua participação neste estudo clínico, seu médico irá coletar dados pessoais e os dados sobre a saúde de seu filho(a). Estes dados serão repassados ao patrocinador do estudo de forma codificada. Estas informações serão guardadas por pelo menos 15 anos.
Você tem o direito de acessar os dados de seu filho(a) junto ao médico do estudo e pedir correções, caso estes estejam errados ou incompletos.
Caso seu filho(a) seja acompanhado por um médico pessoal, e caso você concorde com isso, o médico do estudo informará este médico sobre a participação de seu filho(a) no estudo.
O patrocinador irá analisar os dados estatisticamente para determinar a eficácia e a segurança do COARSUCAM™ / ARTESUNATO AMODIAQUINA DA WINTHROP®, assim como obter informações
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256
gerais sobre sua doença. Além disto, seus dados codificados podem ser usados em publicações científicas.
NOVAS INFORMAÇÕES DISPONÍVEIS
Você será informado pelo seu médico o quanto antes de toda nova informação relevante que se torne disponível no decorrer deste estudo e que possa afetar sua decisão em seu filho(a) participar. Seu médico discutirá com você se seu filho(a) deseja ou não continuar no estudo. Se você decidir retirar seu filho(a), seu médico tomará providências para que ele/ela continue recebendo os cuidados médicos necessários.
OUTRAS INFORMAÇÕES RELEVANTES
O Investigador Principal deste estudo, médico do estudo, é o Dr. Marcus V. G. de Lacerda, que pode ser encontrado no seguinte endereço: Av. Pedro Teixeira, 25 - Manaus - Amazonas - Brasil – CEP: 69040-000 e telefone (horário comercial e fora do horário comercial) (92) 2127 3537 Celular (92) 9114 7633.
Em qualquer fase do estudo, você terá acesso ao investigador e sua equipe para comunicar sintomas inesperados e não habituais durante o estudo, esclarecer dúvidas ou pedir informações adicionais.
Este estudo foi aprovado por um Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos e está de acordo com as normas nacionais e internacionais para sua realização. Se você tiver alguma dúvida ou quiser alguma informação adicional sobre seus direitos como sujeito de pesquisa ou sobre os aspectos éticos do estudo, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas no endereço Av. Pedro Teixeira, 25 - Manaus - Amazonas – CEP: 69040-000 e telefones (92) 2127-3402 / (92) 2127-3432.
1. Eu li ou leram para mim o termo de consentimento livre e esclarecido para esse estudo. Recebi todas as explicações sobre a natureza, objetivo, duração, efeitos e riscos previsíveis do estudo, assim como sobre as minhas responsabilidades. As minhas perguntas foram respondidas satisfatoriamente.
2. Concordo que meu filho(a) participe desse estudo. Concordo em cooperar totalmente com o médico do estudo e entrarei em contato com ele/ela imediatamente caso meu filho(a) apresente quaisquer sintomas inesperados ou não usuais durante o estudo. Durante o período do estudo, eu informarei ao médico do estudo sobre quaisquer outros tratamentos médicos que meu filho(a) possa vir a precisar.
3. Informei ao médico do estudo sobre todas as doenças de meu filho(a) e medicações que ele/ela usa, além de informar sobre todas as consultas médicas recentes.
4. Informei também ao médico do estudo sobre qualquer participação de meu filho(a) em outros estudos clínicos no último ano.
5. Estou ciente de que se não cooperar com os pedidos e as orientações do médico do estudo, meu filho(a) pode vir a se prejudicar ao participar deste estudo.
6. Entendo que a participação de meu filho(a) no estudo é voluntária e que ele/ela pode recusar a participar ou sair do estudo a qualquer momento. Caso ele/ela recuse participar deste estudo, não será penalizado de nenhuma forma e esta decisão não prejudicará qualquer cuidado médico ao qual meu filho(a) tenha direito. Entendo ainda que quaisquer
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informações que possam surgir durante a condução do estudo, que possam afetar minha decisão em meu filho(a) participar, me serão passadas assim que possível.
7. Representantes do patrocinador, Comitê de Ética em Pesquisa e autoridades regulatórias nacionais e ou internacionais poderão examinar e copiar registros médicos de meu filho(a) para verificar as informações neles coletadas. Ao assinar este documento, autorizo este uso dos registros de meu filho(a).
8. Receberei uma via assinada deste consentimento.
Anexo – INFORMAÇÕES PARA PACIENTES MENORES DE IDADE
O médico descobriu que você está com uma doença chamada malária.
Essa doença é causada por um parasita (parasita é um bichinho muito pequeno, microscópico, que vive em seu corpo) e que entrou em seu sangue por uma picada de mosquito.
Já existem medicamentos para essa doença, mas, alguns não são totalmente eficazes, por isso devemos continuar a procurar por medicamentos que possam funcionar melhor.
O médico que sabe muito a respeito dessa doença gostaria de convidá-lo a experimentar um novo medicamento chamado Artesunato Amodiaquina (ASAQ). Esse tratamento ainda não é utilizado no Brasil. Outros pacientes, em outros países, particularmente na África, já foram tratados com esse medicamento e ele demonstrou sua eficácia e segurança contra um outro parasita responsável pela malária. O parasita que foi encontrado em seu corpo é da mesma família daquele que existe na África. A eficácia e a segurança do ASAQ serão comparadas neste estudo com um remédio para malária comumente utilizado em seu país, chamado de cloroquina.
Sempre que os pacientes estejam testando esse medicamento, e mesmo depois, eles serão acompanhados por um médico. Terão a assistência de outras pessoas que conhecem tudo sobre a malária e sobre experimentos com medicamentos.
Existem leis e regulamentos muito precisos que protegem os pacientes que estão testando os medicamentos; que serão seguidos pelo médico e o pessoal que organizou este estudo.
O médico já falou com seus pais (ou com a pessoa que cuida de você) a respeito deste estudo.
Ele explicou, com detalhes, como será realizado este teste.
Seus pais concordaram que seu médico falasse com você a respeito deste teste e sabem que também estamos solicitando seu consentimento.
Se você concorda em participar do estudo, o médico realizará alguns exames na primeira consulta:
Retirada de uma amostra de sangue, o que significa que o médico usará uma agulha para retirar uma pequena quantidade de sangue de uma veia em seu braço e irá coletá-la em um pequeno tubo. Esse sangue será examinado mais tarde para medir as coisas que contêm. Você poderá sentir alguma dor na área onde a agulha picar e, às vezes, poderá aparecer uma pequena mancha roxa.
Quando não for coletada nenhuma amostra de sangue, umas poucas gotas de sangue
serão retiradas de seu dedo. Você poderá sentir um pouco de dor ou ter medo quando seu dedo for picado. O sangue será colocado sobre um pequeno vidro e sobre um pequeno pedaço de papel. Isso será usado para estudar a malária em seu corpo.
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A temperatura de seu corpo e sua pressão sanguínea serão medidas. Exames da saúde do coração serão realizados com equipamentos especiais que não
entram no seu corpo e não causam dor (esse teste só será realizado em pacientes com 10 anos de idade ou mais).
Se você é uma moça jovem que pode engravidar, o médico pedirá que você use um método anticoncepcional durante o estudo e faça um exame de urina para verificar se você está grávida ou não, porque o tratamento desse estudo não é recomendado durante o primeiro trimestre da gravidez. Se o resultado do teste for negativo, será possível que você participe do estudo.
Um segundo teste de gravidez será feito no 43º dia; caso o resultado seja positivo, será realizado um acompanhamento até o fim da sua gravidez para verificar sua saúde e a do seu futuro bebê.
Após estes testes, o médico decidirá se você pode tomar o medicamento.
Para decidir qual tratamento você vai receber no estudo, se ASAQ ou cloroquina, será feito como um sorteio. A cada manhã, nos primeiros 3 dias do estudo, você visitará o médico para tomar o medicamento pela boca.
Você deverá retornar ao médico 7 vezes após esta primeira visita, para verificar se tudo está indo bem. Durante cada visita de acompanhamento, o médico repetirá alguns dos exames realizados na primeira visita. O sangue colhido com uma picada no dedo será retirado no máximo 7 vezes. Será necessária uma pequena amostra de sangue que será retirada de seu braço. Isto acontecerá somente duas vezes. Sua temperatura será medida em cada visita. Se você tiver até 10 anos de idade, faremos dois exames do coração.
Após 42 dias, o estudo será encerrado.
Se o médico decidir que você não pode tomar este medicamento, você será tratado com outro tratamento padrão para malária e receberá a assistência de seu médico com a mesma qualidade.
As vantagens e as desvantagens dos medicamentos utilizados neste estudo são conhecidas. Você pode sentir-se um pouco mal e ter enjôos, vômitos, dor de barriga, perda de apetite, dor de cabeça, tontura, problemas no sono, tosse, problemas de visão, sentir cansado e nervoso, coceira, feridas na pele, cor azulada da boca, unhas e pele.
Mas o medicamento poderá apresentar alguns efeitos indesejáveis ou alguns efeitos que ainda não sabemos. Se algo fora do normal acontecer com você, não deixe de informar aos seus pais, ao médico ou à sua equipe. Você tem liberdade para informar seus pais e seu médico, a qualquer momento, quanto às suas preocupações ou dúvidas. O médico também forneceu informações aos seus pais sobre o que fazer caso você tenha algum problema ou fique doente durante o estudo.
Se alguma coisa não estiver clara para você ou se não entendeu tudo, faça todas as perguntas que quiser ao seu médico (ou a alguém da equipe dele), até que você tenha entendido tudo.
Se você decidir participar do estudo, seus pais (ou a pessoa que cuida de você) também deverão concordar.
Se você não concorda em participar desse estudo, poderá dizer não sem qualquer problema, mesmo se seus pais tenham concordado. A escolha é sua. O médico continuará a cuidar de você e ninguém ficará preocupado ou chateado com você. Você não tem que participar desse estudo para ser tratado pelo médico.
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Se você concordar em participar, o médico pedirá que assine um termo de assentimento (que lhe será apresentado após ter lido estas informações), ou para ser assinado com seu nome ou para fazer sua impressão digital (carimbo do polegar).
Entretanto, mesmo se disser agora que concorda, poderá mudar de idéia a qualquer momento e dizer que não quer mais participar do estudo.
Você deve discutir a respeito com seus pais (ou com a pessoa que cuida de você) e com o médico, para que possa ser tratado de outra forma.
O médico estará autorizado a falar com você a respeito da sua participação nesse estudo, apenas com você, seus pais (ou a pessoa que cuida de você) ou com as pessoas que trabalham no estudo. O médico não falará a respeito com ninguém mais, só se você ou seus pais (ou a pessoa que cuida de você) concordarem. As informações sobre você que serão coletadas do estudo serão guardadas e ninguém, exceto o médico e sua equipe, poderá vê-las. Qualquer informação a seu respeito receberá um número no lugar do seu nome. Apenas o médico e sua equipe saberão qual é o seu número.
Quando tivermos terminado a pesquisa, informaremos a você e aos seus pais o que foi aprendido.
Use o tempo que precisar para pensar a respeito antes de tomar sua decisão e não hesite em falar sobre este estudo com seus pais (ou a pessoa que cuida de você) ou com qualquer pessoa de sua confiança.
Nome do Paciente: ___________________________________________________________
(a ser preenchido pelo paciente ou seu representante legal/testemunha, se aplicável)
Assinatura do Paciente: ______________________________________________Data:___________ (assinatura do paciente ou impressão digital, se aplicável)
Nome do Representante Legal: _______________________________________________________ (a ser preenchido pelo representante legal ou testemunha, se aplicável)
Assinatura do Representante Legal: ____________________________________Data:__________ (assinatura do representante legal ou impressão digital, se aplicável)
Nome da Testemunha: ____________________________________________________ (a ser preenchido pela testemunha, se aplicável)
Assinatura da Testemunha: __________________________________________Data:___________ (se aplicável)
Razão da necessidade de Testemunha: ______________________________________ (se aplicável)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA REPRESENTANTE LEGAL DE MENORES DE IDADE
260
Pesquisador/Sub-pesquisador ou pessoa que liderou as discussões a respeito do Termo de Consentimento Informado/ Consentimento
Confirmo que expliquei, pessoalmente, a natureza do estudo, seu propósito, sua duração, seus riscos e seus efeitos previsíveis para o paciente acima mencionado.
Nome: _______________________________________________________________
Assinatura:__________________________________________ Data: ____________
261
ANEXO F: CARTA DE APROVAÇÃO FINAL DO PROJETO NO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA
262
263
ANEXO G: APROVAÇÃO DE PROJETO NA ANVISA
264
265
ANEXO H: POP DE PREPARO E LEITURA DE LÂMINAS PARA DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA
E QUANTIFICAÇÃO DE PARASITEMIA
266
POP_MAL_LB_001_v01_PT
Procedimento Operacional Padrão
Gerência de Malária
Código POP POP_MAL_LB_001_v01_PT
Título Preparo e leitura de lâminas para detecção de Plasmodium spp.
Idioma da versão original Português
Escrito ou traduzido por: Revisado por: Aprovado por: Data de aplicação:
André M. Siqueira; Camila
Menezes
Data & assinatura
Data & assinatura Data da próxima
Data & assinatura
revisão:
Emenda Razão da emenda
1 OBJETIVOS Descrever os procedimentos para preparo, coloração, leitura e registro de resultado de lâminas para detecção de Plasmodium spp. utilizando gota espessa.
1. DEFINIÇÕES Não se aplica.
7. APLICÁVEL A Todas as lâminas coletadas para detecção de Plasmodium spp. durante os estudos PregVAx, “Epidemiologia da Malária no Município do Careiro, Amazonas” e “Caracterização Clínica da Malária Complicada por Plasmodium vivax”.
15. RESPONSABILIDADES Pessoal encarregado da coleta das amostras, técnicos e microscopistas, chefia do laboratório.
267
24. POP'S RELACIONADOS Seguimento dos participantes no estudo “Epidemiologia da Malária no Município do Careiro, Amazonas” (versão atual do POP_MAL_TC_002). Triagem e seguimento dos pacientes no estudo de malária grave por Plasmodium vivax (versão atual do POP_MAL_HO_001). 6 PROCEDIMENTOS
6.1 Coleta e identificação das amostras
A depender do protocolo do estudo, em cada local (campo, unidade básica de saúde ou hospital) serão coletadas:
duas gotas espessas por indivíduo; ou quatro lâminas por pessoa - duas com duas gotas espessas na mesma lâmina e duas com esfregaço.
Após limpar a polpa do dedo anelar com algodão embebido em álcool a 70%. Fazer a punção digital com lanceta estéril. Comprimir o dedo suavemente. Duas gotas espessas serão preparadas na mesma lâmina, alternativamente a uma gota espessa e um esfregaço. Confeccionar uma gota espessa homogênea de 1,5 x 1,0 cm na lâmina de vidro. Uma etiqueta de identificação, contendo código de barras e números únicos, será colada na margem da lâmina, como segue:
IIII
IIII
IIII
II
I 00
55
00
11
1
IIII
IIII
IIII
II
I 00
55
00
11
1
Gota Gota espessa 1 espessa 2
Os três formulários seguintes serão preenchidos no momento da coleta da lâmina no hospital, na unidade básica de saúde ou no campo:
Uma Ficha de amostras de laboratório Cada estudo tem uma diferente Ficha de amostras de laboratório, onde os tipos de amostras coletadas de cada estudo são especificados. Uma etiqueta de identificação de amostra será pregada e o nome o número de identificação no estudo de cada paciente será preenchido.
Um formulário de Resultado da primeira leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A01) e de Resultado da segunda leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A02).
Uma etiqueta de identificação será colada em cada formulário, que também será preenchido com nome e número de identificação permanente (NIP) do paciente no estudo, além da data de coleta da lâmina.
6.2 Recepção de amostras no laboratório
As lâminas serão levadas inicialmente para o laboratório mais próximo ao local da coleta (campo, unidade básica de saúde ou hospital) onde serão devidamente coradas (seção 6.3) e será realizada a leitura rápida. Para leitura de densidade parasitária, as lâminas serão enviadas ao laboratório da Gerência de Malária acompanhadas de:
Uma Ficha de amostras de laboratório para cada paciente, acompanhada de:
268
Um formulário de Resultado da primeira leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A01) e um de Resultado da segunda leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A02) para cada paciente
Quando as amostras chegarem ao laboratório, a pessoa encarregada da recepção checará se todas as amostras registradas na Ficha de amostras de laboratório foram entregues.
A Ficha de amostras de laboratório será preenchida no local da coleta em ordem de data. Após a recepção, caso não sejam realizada a leitura da densidade parasitária no mesmo momento da chegada, estas serão aramazenadas conforme procedimento descrito na seção 8.
6.3 Coloração 6.3.1 Reagentes
Azul de metileno fosfatado Solução alcoólica de Giemsa estoque Solução alcoólica de Giemsa diluída 1:10 Água tamponada
6.3.1.1 Preparação
Azul de metileno fosfatado
Azul de metileno medicinal em pó 16H
18ClN
3S 200 mg
Fosfato de sódio monobásico NaH2PO4 600 mg Fosfato de potássio bibásico K2HPO4 200 mg Água destilada H2O 250 mL Filtrar para retirar as impurezas
Solução alcoólica de Giemsa estoque Corante Giemsa em pó C14H14ClN3S 750 mg Álcool metílico PA CH3OH 65 mL Glicerina PA CH2(OH)CH(OH)CH2OH 35 mL Agitar bem (várias vezes por dia) em garrafa contendo pérolas de vidro.
Manter o recipiente tampado em forma de estoque.
Filtrar quando necessário.
Solução alcoólica de Giemsa diluída 1:10 Solução alcoólica de Giemsa estoque 1 gota Água tamponada 1mL
Água tamponada Fosfato bibásico de sódio Na2HPO4 6 g Fosfato monobásico de potássio KH2PO4 4 g Misturar em gral de porcelana.
Diluir 1 g da mistura em 1000 mL de água destilada.
6.3.1.2 Armazenamento dos reagentes
Os reagentes utilizados nesse procedimento devem ser armazenados em temperatura ambiente.
6.3.2 Procedimento 1ª fase: Desemoglobinização pela solução hipotônica de azul de metileno.
Aplicar a solução de azul de metileno fosfatado sobre a gota espessa de sangue, por dois segundos.
Enxaguar a lâmina com água tamponada (sem jato forte).
269
2ª fase: Coloração pela solução de Giemsa para coloração da gota espessa.
As lâminas devem ser coradas dentro de 72 horas com uma solução de Giemsa a 10% com água tamponada.
Colocar a lâmina com o lado da gota voltada para a superfície da placa de coloração. Preparar uma solução de Giemsa na proporção de uma gota de corante para 1ml (1 gota) de água tamponada. Homogeneizar Aplicar esta solução na placa côncava de coloração, sob a lâmina invertida. Deixar corar por 10 minutos. Enxaguar com água tamponada (sem jato forte). Secar ao calor suave ou sob ventilação.
3ª fase: Coloração do esfregaço método de Giemsa
Fixar o esfregaço com álcool metílico por um minuto. Deixar secar.
Colocar a lâmina invertida sobre a placa de coloração. Despejar a diluição do corante de Giemsa na proporção de uma gota do corante para 1ml de água tamponada.
Deixar corar por 20 a 30 minutos. Enxaguar com jato forte de água tamponada. Secar ao calor suave ou sob ventilação.
4ª fase: Montagem das lâminas (no caso de a leitura da densidade parasitária não for realizada no mesmo dia da coloração, realizar a montagem, como segue):
Pingar duas a três gotas de Entelan® em cada lâmina. Colocar uma lamínula sobre as gotas.
Deixar secar sob temperatura ambiente. 6.4 Controle de qualidade da coloração de lâminas
A solução de Giemsa deve ser controlada antes do uso. Isto é realizado preparando a solução de Giemsa 1:10 que será usada e corando uma lâmina sabidamente positiva. Não deve haver coloração das hemácias.
Cada nova preparação de Giemsa deve ser submetida a controle de qualidade. O tampão de pH deve ser checado utilizando pHmetro ou fita, estando o pH a 7,2. O pH deve ser ajustado se necessário. O tampão deve ser analisado ao menos duas vezes por semana se for preparado em grandes quantidades.
6.5 Leitura
Antes do início da contagem, o equivalente a 0.25 Ml de sangue (aproximadamente 100 campos utilizando uma ocular de 10X e uma objetiva de 100X) deverá ser examinado para determinar a espécie do parasito e estágios que possam estar presentes.
Coloque uma gota de óleo de imersão sobre a lamínula. Ligue o microscópio. Cheque a presença de ocular de 10X.
Com o condensador elevado, a lâmina corada é colocada no suporte e a fonte de luz é ajustada visibilizando pela ocular e pela objetiva de 100X.
POP_MAL_LB_001_v01_PT
Ao mover lentamente a objetiva de imersão, uma camada de óleo será formada entre a lâmina e a lente. O ajuste fino é usado para focar o campo; a lente não deve tocar a lâmina. O exame microscópico deve ser sistemático e padronizado. Ele deve iniciar pela extremidade esquerda da lâmina. A leitura é iniciada da periferia do campo e termina no centro. Quando o campo
270
está lido, move-se a lâmina longitudinalmente para examinar os campos adjacentes. Move-se a lâmina verticalmente para que outra fileira/largura seja lida. Há cerca de 100 campos em um eixo de 2 cm da lâmina; No início será realizada a leitura rápida das lâminas para guiar o tratamento e, após, será feita a quantificação da densidade parasitária para determinar o resultado final.
6.5.1 Leitura rápida
As lâminas serão lidas imediatamente após a coleta para guiar o tratamento. Tal leitura será realizada tanto no posto de saúde / hospital, quanto para as lâminas que sejam levadas diretamente para o laboratório.
A leitura rápida será realizada conforme a prática padrão em cada centro. Os resultados da leitura rápida serão transcritos no formulário apropriado de cada estudo (versões atuais de POP_MAL_TC_002_A01, POP_MAL_TC_002_A02, POP_MAL_HO_002_A01, POP_MAL_HO_002_A02)
6.5.2 Leitura da densidade parasitária: parasitos por l
Uma vez coradas, as lâminas serão colocadas em caixas e distribuídas com o formulário de primeira leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A01) ao microscopista que realizará a primeira leitura. Para contagem de parasitos e leucócitos separadamente, dois contadores devem ser usados, um para as formas assexuadas do parasito e outro para os leucócitos. Caso detecte-se infecção mista, outro contador deverá ser utilizado para a contagem de formas da outra espécie.
Determinando uma lâmina como negativa O microscopista irá ler a lâmina até que 200 campos tenham sido contados.
A lâmina apenas será determinada negativa quando nenhum parasito for encontrado em 200 campos.
Caso sejam vistas formas assexuadas de Plasmodium spp. O microscopista contará parasitos até que o número de 500 leucócitos ou 500 parasitos seja alcançado. Caso o microscopista já tenha contado 500 leucócitos ou mais quando o primeiro parasito for visto, a leitura será interrompida. A contagem de parasitos ou leucócitos não será interrompida até que o campo inteiro seja lido. Este método será usado tanto para infecções únicas ou mistas por Plasmodium. No segundo caso, os parasitos de cada espécie deverão ser contados separadamente. A contagem parasitária em relação à contagem de leucócitos pode ser convertida a parasitos
por l usando a seguinte fórmula matemática:
Nº de parasitos X 8000 / Nº de leucócitos = parasitos por l
Está fórmula será calculada para cada espécie de parasito encontrada. Caso o número de leucócitos para cada participante seja conhecido ( ex: estudo de malária vivax grave), a densidade pode ser calculada mais precisamente com a seguinte fórmula:
Nº de parasitos X Nº de leucócitos / Nº de leucócitos = parasitos por l
A contagem de gametócitos será feita de forma específica para cada espécie. Este procedimento é semelhante aos métodos diagnósticos preconizados pelas diretrizes do CLSI do CDC (contagem superior a 500 parasitos ou 1000 leucócitos) e também similar às diretrizes da OMS (que para densidades < 10 parasitos por 200 leucócitos propõe contar acima de 500 leucócitos, mas que para densidades superiores a 10 parasitos por 200 leucócitos propõe parar a contagem ao atingir 200 leucócitos). Após a primeira leitura, as lâminas serão mantidas na mesma ordem na bandeja ou caixa para serem lidas posteriormente por outro microscopista. As lâminas serão entregues conjuntamente com o formulário de segunda leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A02) ao microscopista
271
que realizará a segunda leitura, assegurando-se que não seja a mesma pessoa que realizou a primeira leitura e que esta pessoa não tenha acesso aos resultados no formulário de primeira leitura de lâmina.
6.6 Registro dos resultados
O microscopista registrará os resultados da leitura em l nos formulários de primeira e segunda leitura de lâmina. A primeira seção do formulário, incluindo a etiqueta de identificação da amostra, já haverá sido preenchida no momento da coleta da amostra. A seção de Resultados será preenchida pelo microscopista com a seguinte informação:
Caso a lâmina for negativa, o número de campos examinados será registrado (deve ser 200) e o número de parasitos deverá ser 0 para todas as espécies. Caso a lâmina for positiva, o número de leucócitos contados e o número de formas assexuadas de parasitos contados para cada espécie deverão ser registrados.
O número de gametócitos para cada espécie também deverá ser registrado. Caso a lâmina não possa ser lida, o motivo deverá ser registrado (não encontrada, quebrada, má qualidade). O microscopista assinará e datará o formulário com a data da leitura e registrará seu código do estudo. O microscopista que realizar a primeira leitura registrará os resultados no formulário de primeira leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A01) e o que realizar a segunda leitura registrará os resultados no formulário de segunda leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A02). Os formulários Resultado de primeira leitura e Resultado de segunda leitura serão enviados diariamente ao centro de registro de dados para serem inseridos nas bases de dados. Tais formulários serão então armazenados pelos investigadores.
7 CÁLCULO DA DENSIDADE PARASITÁRIA E CONTROLE DE QUALIDADE INTERNA
Todas as lâminas serão lidas duas vezes independentemente e os resultados registrados em diferentes formulários de resultados de leitura de lâmina (primeira e segunda leituras), que serão inseridos nas bases de dados.
As lâminas que NÃO caírem nos seguintes critérios deverão ser lidas uma terceira vez: Ambas as lâminas positivas, tendo ambas as leituras > 400 parasitos por l e a proporção de densidades de ambas as leituras (maior contagem / menor contagem) < 2. Ambas as lâminas positivas e uma ou ambas tem contagem < 400 parasitos por l e a maior contagem é menos que um log 10 superior à menor contagem.
Ambas as lâminas negativas. Um programa de computador gerará uma lista com as lâminas que devem ser lidas uma terceira vez, baseado na proporção das densidades das duas primeiras leituras. No centro de dados o programa produzirá impresso que será a ficha de Resultado de terceira leitura de lâmina e incluirá o número de identificação de amostra, o número de identificação permanente, a posição na caixa e os códigos dos microscopistas que realizaram as primeira e segunda leituras. No laboratório a lâmina será retirada da posição na caixa correspondente e será lida a terceira vez por um microscopista. O microscopista que realiza a terceira leitura registrará os resultados no impresso, que será então devolvido ao centro de dados e inserido nas bases de dados. O resultado definitivo (após a segunda leitura no caso de concordância ou após a terceira leitura caso não haja concordância entre as duas primeiras) será calculado por um programa de computador e levará em conta os seguintes critérios:
Caso ambas as leituras sejam negativas, o resultado final será negativo. Caso as duas lâminas sejam positivas e haja concordância, o resultado final será a média geométrica das duas leituras. Caso uma leitura seja positiva e a outra negativa e a terceira leitura seja positiva, o resultado final será a média geométrica das duas densidades positivas. Caso a terceira leitura seja
272
negativa, o resultado final será negativo. Caso as três leituras sejam positivas, o resultado final será a média geométrica das duas leituras com densidades mais próximas.
Todos os resultados de leituras de lâminas serão armazenados pelos investigadores.
8 ARMAZENAMENTO DAS LÂMINAS
As lâminas serão levadas a um(a) técnico(a) de laboratório designado(a). Este deverá conferir conjuntamente com o investigador que as trouxe a presença das lâminas e o correto preenchimento dos formulários correspondentes. No caso de a lâmina não haver sido montada com o Entelan® após a coloração, tal procedimento deverá ser realizado, após a leitura do segundo microscopista para que a lâmina seja armazenada. Em seguida as lâminas deverão ser armazenadas nas caixas apropriadas, sendo o local de cada lâmina registrado nos formulários de Resultado de primeira leitura de lâmina e Resultado de segunda leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A01 e POP_MAL_LB_001_A02).
As caixas serão numeradas à medida que forem preenchidas. As datas das lâminas que ocuparem a primeira e a última posição em cada caixa deverão estar escritas no exterior da caixa. A partir do registro da posição das lâminas nas caixas, o microscopista retirará as lâminas à medida que realizar as leituras de densidade parasitária. O segundo microscopista deverá atentar para o número da caixa e a posição da lâmina detalhados na ficha de Resultado de segunda leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A02) para recolocar a lâmina na posição correta após a leitura. Caso uma terceira leitura seja necessária, a lâmina será retirada da caixa e colocada novamente na mesma posição quando a terceira leitura for encerrada. As duplicatas das lâminas serão mantidas em uma caixa de lâminas distinta e armazenadas no laboratório, sendo usadas apenas no caso de perda ou quebra da primeira lâmina. As datas das lâminas que ocuparem a primeira e a última posição em cada caixa deverão estar escritas no exterior da caixa. As caixas de armazenamento devem ser mantidas num local trancado no laboratório, sob condições apropriadas de temperatura e umidade e protegidas de luz direta.
9 REFERÊNCIAS
WHO manual for malaria diagnostic in developing countries. Diagnoses and management of severe falciparum malaria. WHO/CDS/CPE/SMT/2000.4
Diagnostic procedures for blood specimens. Diagnostic for Parasitic Diseases, CDC, Atlanta. Manual de diagnóstico laboratorial da malária. Brasília: Secretaria de Vigilância em Saúde/Ministério da Saúde; 2005.
273
POP_MAL_LB_01_A1
Gerência de Malária Projeto COARSUCAM
1. Data da coleta (dd/mm/aa) |__|__|/|__|__|/|__|__|
2. Número de identificação no estudo |__|__|__|
3. Nome |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
4. Sobrenome |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
5. Número de leucócitos ou campos lidos |__|__|__|
6. P. vivax Número de parasitos assexuais |__|__|__| Gametócitos |__|__|__|
7. P. falciparum Número de parasitos assexuais |__|__|__| Gametócitos |__|__|__|
8. P. malariae Número de parasitos assexuais |__|__|__| Gametócitos |__|__|__|
9. Se a lâmina não foi lida, motivo (1=não encontrada, 2=qualidade inadequada, 3=quebrada, 9=não se aplica) |__|
10. Número da caixa |__|__|__|
11. Posição na caixa |__|__|__|
12. Iniciais, assinatura e data da leitura |__|__|__| __________________ |__|__|/|__|__|/|__|__|
274
ANEXO I: POP DE ESTUDOS MOLECULARES
275
276
277
278
279
ANEXO J: LISTA DE PRODUÇÃO ESCRITA DURANTE O PERÍODO
1. Lista de artigos publicados
1. Rawlinson, T., Siqueira, A.M., Fontes, G., Beltrao, R.P., Monteiro, W.M., Martins, M.,
Silva-Junior, E.F., Mourao, M.P., Albuquerque, B., Alecrim, M., and Lacerda, M.V., From
haiti to the Amazon: public health issues related to the recent immigration of haitians to
Brazil. PLoS Negl Trop Dis, 2014. 8(5): p. e2685.
2. Lopes, S.C., Albrecht, L., Carvalho, B.O., Siqueira, A.M., Thomson-Luque, R.,
Nogueira, P.A., Fernandez-Becerra, C., Del Portillo, H.A., Russell, B.M., Renia, L.,
Lacerda, M.V., and Costa, F.T., Paucity of Plasmodium vivax Mature Schizonts in
Peripheral Blood Is Associated With Their Increased Cytoadhesive Potential. J Infect
Dis, 2014. 209(9): p. 1403-7.
3. Andrade, F.G., Furtado-Silva, J.M., Goncalves, B.A., Thuler, L.C., Barbosa, T.C.,
Emerenciano, M., Siqueira, A., Pombo-de-Oliveira, M.S., and Brazilian Collaborative
Study Group of Infant Acute, L., RAS mutations in early age leukaemia modulated by
NQO1 rs1800566 (C609T) are associated with second-hand smoking exposures. BMC
Cancer, 2014. 14: p. 133.
4. Santana, M.S., Monteiro, W.M., Siqueira, A.M., Costa, M.F., Sampaio, V., Lacerda,
M.V., and Alecrim, M.G., Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficient variants are
associated with reduced susceptibility to malaria in the Brazilian Amazon. Trans R Soc
Trop Med Hyg, 2013. 107(5): p. 301-6.
5. Pohlit, A.M., Lima, R.B., Frausin, G., Silva, L.F., Lopes, S.C., Moraes, C.B., Cravo, P.,
Lacerda, M.V., Siqueira, A.M., Freitas-Junior, L.H., and Costa, F.T., Amazonian plant
natural products: perspectives for discovery of new antimalarial drug leads. Molecules,
2013. 18(8): p. 9219-40.
6. Coelho, H.C., Lopes, S.C., Pimentel, J.P., Nogueira, P.A., Costa, F.T., Siqueira, A.M.,
Melo, G.C., Monteiro, W.M., Malheiro, A., and Lacerda, M.V., Thrombocytopenia in
Plasmodium vivax malaria is related to platelets phagocytosis. PLoS One, 2013. 8(5): p.
e63410.
280
7. Martins-Campos, K.M., Pinheiro, W.D., Vitor-Silva, S., Siqueira, A.M., Melo, G.C.,
Rodrigues, I.C., Fe, N.F., Barbosa, M., Tadei, W.P., Guinovart, C., Bassat, Q., Alonso,
P.L., Lacerda, M.V., and Monteiro, W.M., Integrated vector management targeting
Anopheles darlingi populations decreases malaria incidence in an unstable transmission
area, in the rural Brazilian Amazon. Malar J, 2012. 11: p. 351.
8. Magalhaes, B.M., Alexandre, M.A., Siqueira, A.M., Melo, G.C., Gimaque, J.B., Bastos,
M.S., Figueiredo, R.M., Carvalho, R.C., Tavares, M.A., Naveca, F.G., Alonso, P.,
Bassat, Q., Lacerda, M.V., and Mourao, M.P., Clinical profile of concurrent dengue fever
and Plasmodium vivax malaria in the Brazilian Amazon: case series of 11 hospitalized
patients. Am J Trop Med Hyg, 2012. 87(6): p. 1119-24.
9. Lanca, E.F., Magalhaes, B.M., Vitor-Silva, S., Siqueira, A.M., Benzecry, S.G.,
Alexandre, M.A., O'Brien, C., Bassat, Q., and Lacerda, M.V., Risk factors and
characterization of Plasmodium vivax-associated admissions to pediatric intensive care
units in the Brazilian Amazon. PLoS One, 2012. 7(4): p. e35406.
10. Lacerda, M.V., Mourao, M.P., Alexandre, M.A., Siqueira, A.M., Magalhaes, B.M.,
Martinez-Espinosa, F.E., Filho, F.S., Brasil, P., Ventura, A.M., Tada, M.S., Couto, V.S.,
Silva, A.R., Silva, R.S., and Alecrim, M.G., Understanding the clinical spectrum of
complicated Plasmodium vivax malaria: a systematic review on the contributions of the
Brazilian literature. Malar J, 2012. 11: p. 12.
11. Lacerda, M.V., Fragoso, S.C., Alecrim, M.G., Alexandre, M.A., Magalhaes, B.M.,
Siqueira, A.M., Ferreira, L.C., Araujo, J.R., Mourao, M.P., Ferrer, M., Castillo, P.,
Martin-Jaular, L., Fernandez-Becerra, C., del Portillo, H., Ordi, J., Alonso, P.L., and
Bassat, Q., Postmortem characterization of patients with clinical diagnosis of
Plasmodium vivax malaria: to what extent does this parasite kill? Clin Infect Dis, 2012.
55(8): p. e67-74.
12. Costa, F.T., Lopes, S.C., Albrecht, L., Ataide, R., Siqueira, A.M., Souza, R.M., Russell,
B., Renia, L., Marinho, C.R., and Lacerda, M.V., On the pathogenesis of Plasmodium
vivax malaria: perspectives from the Brazilian field. Int J Parasitol, 2012. 42(12): p. 1099-
105.
281
13. Pablo Quintero, J., Siqueira, A.M., Tobon, A., Blair, S., Moreno, A., Arevalo-Herrera, M.,
Guimaraes Lacerda, M.V., and Herrera Valencia, S., Malaria-related anaemia: a Latin
American perspective. Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz, 2011. 106: p. 91-104.
14. Guerra, J.A., Coelho, L.I., Pereira, F.R., Siqueira, A.M., Ribeiro, R.L., Almeida, T.M.,
Lacerda, M.V., Barbosa, M., and Talhari, S., American tegumentary leishmaniasis and
HIV-AIDS association in a tertiary care center in the Brazilian Amazon. Am J Trop Med
Hyg, 2011. 85(3): p. 524-7.
15. Fragoso, S.C., Alexandre, M.A., Santos, P.J., Mourao, M.P., Passos, L.N., Magalhaes,
B.M., Siqueira, A.M., and Lacerda, M.V., Hypovolaemic shock triggered by P. vivax
infection in a patient with mild haemophilia A. Haemophilia, 2011. 17(1): p. 159-60.
16. Siqueira, A.M., Alexandre, M.A., Mourao, M.P., Santos, V.S., Nagahashi-Marie, S.K.,
Alecrim, M.G., and Lacerda, M.V., Severe rhabdomyolysis caused by Plasmodium vivax
malaria in the Brazilian Amazon. Am J Trop Med Hyg, 2010. 83(2): p. 271-3.
17. Oliveira, G.S.S.d., Nicodemo, A.C., Carvalho, V.C.d., Zambrini, H., Siqueira, A.M.,
Amato, V.S., and Mendes-Correa, M.C., Hepatite grave e icterícia durante a evolução de
infecção pelo vírus da dengue: relato de caso. Revista da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical, 2010. 43(3): p. 339-341.
18. Alexandre, M.A., Ferreira, C.O., Siqueira, A.M., Magalhaes, B.L., Mourao, M.P.,
Lacerda, M.V., and Alecrim, M., Severe Plasmodium vivax malaria, Brazilian Amazon.
Emerg Infect Dis, 2010. 16(10): p. 1611-4.
2. Produção adcional selecionada
1. Produção de Panorama da malaria vivax no Brasil (“Brazil Plasmodium vivax Landscape
Brief”) a ser integrada ao Plano Estratégico Global para P. vivax 2016-2025 da OMS.
2. Colunista do site MalariaWorld (www.malariaworld.com) desde janeiro de 2014.