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Universidade de São Paulo Escola Superior de Agronomia “Luiz de Queiroz”
Centro de Energia Nuclear na Agricultura
Aspectos bioquímicos e moleculares de bactérias isoladas de Terra Preta Antropogênica (TPA) na região da Amazônia Brasileira
Luciana Chaves Ferreira
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ecologia Aplicada
Piracicaba 2007
Luciana Chaves Ferreira
Bióloga
Aspectos bioquímicos e moleculares de bactérias isoladas de Terra Preta Antropogênica
(TPA) na região da Amazônia Brasileira
Orientadora:
Profa. Dra. SIU MUI TSAI
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ecologia Aplicada
Piracicaba 2007
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Ferreira, Luciana Chaves Aspectos bioquímicos e moleculares de bactérias isoladas de Terra Preta
Antropogênica (TPA) na região da Amazônia Brasileira / Luciana Chaves Ferreira. - - Piracicaba, 2007.
90 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. Centro de Energia Nuclear na Agricultura, 2007.
Bibliografia.
1. Bioquímica do solo 2. Ecologia microbiana 3. DNA 4. Microbiologia do solo 5Peptídeos 6. Sítio arqueológico – Amazônia Brasileira I. Título
CDD 631.46
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
...Meu filho Rafael Escaleira.....
Por sua presença iluminada em minha vida, com o dom raro de transformar tudo em
amor;
...Meus pais Acacio e Luzia Chaves Ferreira.....
Pessoas enviadas por Deus, para assegurar acima de tudo minha felicidade, por todo apoio e amor
incondicional, sem os quais eu não chegaria até aqui;
... Minhas irmãs Elaine e Natalia......
Meus anjos da guarda, mesmo ausente em alguns momento, senti a presença divina desse amor
torcendo por mim;
DEDICO.
...Tia Cida ...
Um exemplo de coragem, determinação e acima de tudo muita dedicação e amor; sendo capaz de
ajudar a mudar o rumo da minha vida;
....Meus avós Maria e João (in memoriam); Infância e Antônio.....
Pela linda infância recheada de carinho, a qual trago até hoje no coração.
OFEREÇO
4
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela minha vida.
À Profa. Dra. Siu Mui Tsai, pela oportunidade de realização deste trabalho, orientação,
confiança e por compreender minhas limitações e ajudar-me a superá-las.
À Maria Estela Stenico, cuja atuação foi imprescindível para a execução deste trabalho
por toda dedicação, amizade e apoio e principalmente pela paciência;
Aos amigos do Laboratório de Biologia Celular e Molecular, Camila Patreze, Daniela
Campos, Ezio Nalin, Gladys Brandão, Juliana Martinatti, Karla Nishiyama, Othon Abrahão,
Samanta Fedrizzi, que sempre me ajudaram na execução do meu trabalho ao longo deste período;
Aos meus Amigos queridos, por todo carinho e amizade, Caroline Pamplona, Débora
Ronque, Fabiana Cannavan, Jeanedy Maria Pazinato, Ludmila Campos, Paulo Pagliuca, Rafael
Medau, Tânia Cintra, Virginia Bamin, por dividirem as alegrias, as tristezas, as longas conversas,
e por se tornarem parte da minha vida em Piracicaba;
Aos técnicos do Laboratório de Biologia Molecular e Celular, Fábio Rodrigo Sanches
Duarte, Wagner Picinini, Francisco Montrazi e José Elias Gomes, por todo ensinamento e
amizade.
5
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................................... 7
ABSTRACT ................................................................................................................................ 8
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. 9
LISTAS DE TABELAS ............................................................................................................ 10
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................... 11
2 DESENVOLVIMENTO......................................................................................................... 14
2.1 Revisão Bibliográfica .......................................................................................................... 14
2.1.1 Terra Preta Antropogênica ............................................................................................... 14
2.1.2 A biodiversidade da Terra Preta Antropogênica .............................................................. 16
2.1.2.1 Uso da biodiversidade microbiana na biotecnologia..................................................... 17
2.1.3 Metabólitos Secundários .................................................................................................. 18
2.1.3.1 Antimicrobianos ............................................................................................................ 19
2.1.3.2 Sideróforos .................................................................................................................... 19
2.1.4 A diversidade Funcional e Química dos Metabólitos Secundários ou Peptídeos............. 22
2.1.4.1 Biossíntese de peptídeo sintetase não-ribossômica (NRPS).......................................... 23
2.1.4.2 Biossíntese de policetídeo sintase (PKS) ...................................................................... 24
2.1.5 Antimicrobianos ............................................................................................................... 25
2.1.6 Espectrometria de massas (MS) ....................................................................................... 26
2.1.7 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)..................................................................... 26
2.1.8 Produção do antibiótico fenazina por Pseudomonas ........................................................ 27
2.2 Material e Métodos.............................................................................................................. 29
2.2.1 Área de Estudo: Localização das coletas.......................................................................... 29
2.2.2 Amostragem ..................................................................................................................... 30
2.2.3 Caracterização físico-química do solo.............................................................................. 31
2.2.4 Isolamento de bactérias .................................................................................................... 31
2.2.5 Extração do DNA genômico ............................................................................................ 36
2.2.6 Amplificação do gene que codifica o 16S rRNA ............................................................. 36
2.2.7 Purificação do DNA ......................................................................................................... 37
2.2.8 Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA)................................ 37
2.2.9 Seqüenciamento do gene 16S rRNA ................................................................................ 37
6
2.2.10 Análise filogenética das seqüências de 16S rDNA ........................................................ 39
2.2.11 Presença de genes NRPS e PKS..................................................................................... 40
2.2.12 Produção de sideróforo em meio sólido ......................................................................... 40
2.2.13 Análises de sideróforos – propriedades químicas........................................................... 41
2.2.13.1 Análise pelo método de CSÁCKY .............................................................................. 41
2.2.13.2 Análise pelo método de ARNOW ............................................................................... 42
2.2.14 Extração dos metabólitos secundários............................................................................ 42
2.2.15 Ensaios de bioatividade .................................................................................................. 43
2.2.16 Espectrometria de massas............................................................................................... 44
2.2.17 Cromatografia em camada delgada (CCD) .................................................................... 44
2.3 Resultados e Discussão........................................................................................................ 45
2.3.1 Caracterização química do solo........................................................................................ 45
2.3.2 Extração de DNA genômico............................................................................................. 46
2.3.3 Amplificação do gene 16S rRNA..................................................................................... 46
2.3.4 Análise de restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA).................................... 48
2.3.5 Seqüenciamento do gene 16S rRNA ................................................................................ 52
2.3.6 Processamento e análise filogenética das seqüências....................................................... 58
2.3.7 Distribuição dos genes que codificam para NRPS e PKS................................................ 60
2.3.8 Produção de sideróforos em meio sólido.......................................................................... 63
2.3.9 Análise pelos métodos bioquímicos de Csácky e Arnow................................................. 67
2.3.10 Ensaio de Bioatividade ................................................................................................... 69
2.3.11 Cromatografia em camada delgada ................................................................................ 71
2.3.12 Espectrometria de massas............................................................................................... 73
3 CONCLUSÕES...................................................................................................................... 78
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 79
7
RESUMO
Aspectos bioquímicos e moleculares de microrganismos isolados de Terra Preta
Antropogênica (TPA) na região da Amazônia Brasileira
A Terra Preta Antropogênica (TPA) ocorre somente em sítios arqueológicos na região
amazônica. Estes solos de origem antrópica foram enriquecidos em nutrientes, provavelmente pelo manejo de restos orgânicos e do fogo pelas populações pré-colombianas. Em TPA, a presença de material orgânico estável e a grande atividade biológica indicam que este tipo de solo pode ser um local de alta diversidade microbiana, constituindo numa fonte de germoplasma microbiano. Contudo, atualmente não se tem conhecimento da biologia e, sobretudo da estrutura e diversidade das comunidades microbianas deste solo. O conhecimento sobre a diversidade microbiana trará compreensão das funções exercidas pelas comunidades microbianas no solo e o conhecimento das suas interações com outros componentes da biodiversidade, além de benefícios econômicos e estratégicos, como a descoberta de microrganismos potencialmente exploráveis nos processos biotecnológicos. Metabólitos secundários, como antibióticos e toxinas microbianas, podem ser considerados como produtos naturais de importância ecológica. Muitos metabólitos secundários produzidos por fungos e bactérias desenvolvem atividades multifuncionais através da via não-ribossomal, pelas enzimas peptídeo sintetase e policetídeo sintase, que são enzimas multidomínio e podem estar envolvidas na produção de sideróforos e antibióticos. Este estudo teve como objetivo a busca por peptídeos não-ribossômicos produzidos por bactérias isoladas de TPA e suas caracterizações bioquímica e molecular. Através de cultivo, 150 isolados foram selecionados de TPA para análise taxonômica por amplificação e seqüenciamento do gene 16S rRNA, após análise de restrição por enzima de restrição para se conhecer o polimorfismo genético dos isolados. De acordo com o seqüenciamento pôde-se agrupar esses isolados em 17 grupos. Os resultados indicaram a presença dos gêneros Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Janthinobacterium, Staphylococcus e Massili. Metabólitos extracelulares foram extraídos dos cultivos bacterianos, usando acetato de etila e clorofórmio, seguidos pela concentração dos extratos, para determinação da capacidade antimicrobiana e a produção de sideróforo foi avaliada usando-se cromoazurol S (CAS). Os resultados mostraram que treze dos 17 isolados apresentaram genes NRPS ou PKS, ou para ambos os genes, associados à produção de peptídeos não-ribossômicos. De todos os isolados estudados, 97% apresentaram produção de sideróforos e algumas espécies dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter e Janthinobacterium mostraram positivas em inibir o crescimento de cinco bactérias testes. A produção de sideróforos do tipo hidroxamato foi positiva para 8 isolados e 7 isolados para o tipo catecol, sendo que 2 isolados não apresentaram reação. Os resultados obtidos em espectrometria de massas Q-TOF indicaram a presença do antibiótico fenazina para o isolado Pseudomonas putida BCM 20, considerado de importância no controle biológico de diversas bactérias patogênicas. Palavras-chave: Terra preta; Comunidade bacteriana; Seqüenciamento DNA; Compostos
bioativos; Sideróforos; Fenazina
8
ABSTRACT
Biochemical and molecular aspects of microorganisms from Anthropogenic Dark Earth
(ADE) in the Brazilian Amazon
The Anthropogenic Dark Earth (ADE) occurs mainly in archeological sites in the Amazon
region. These soils from anthropic origin were enriched with nutrients, probably by the management of organic residues and fire produced by pre-Colombian populations. In ADE, the presence of stable organic matter and high biological activity indicate that this type of soil can be a site of a highly microbial diversity, appointing as a source of microbial germplasm. However, at the present time there is little knowledge about its biology, and especially the structure and diversity of the microbial communities from these soils. The knowledge about microbial diversity will promote a better understanding of the function promoted by the soil microbial community and the knowledge of its interaction with components from biodiversity, likewise the economical and strategic benefits, as for example the discovery of potential microorganisms for exploring biotechnological processes. Secondary metabolites, like antibiotics and microbial toxins, may be considered as natural products of ecological importance. Many of the secondary metabolites produced by fungi and bacteria develop multifunctional activities via non-ribosomal for peptide enzymes and polypeptide synthesis, that are multi-domain enzymes and can be involved in the production of siderophore and antibiotics. This study had the objective of searching for non-ribosomal peptides produced by bacteria isolated from ADE and its biochemical and molecular characterization. Through cultivation in selective media, 150 strains were isolated from ADE for taxonomic analysis by amplification and sequencing of the 16S rRNA gene, after the restriction analysis by restriction enzyme for knowing the genetic strains polymorphism. From the sequencing, it was possible to select these strains in 17 groups, with predominant genera - Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Janthinobacterium, Staphylococcus and Massili. Extracellular metabolites were extracted from the cultivated bacteria, using ethylacetate and chloroform, followed by detection of antimicrobial metabolites from bacterial supernatants. Siderophore production was evaluated using ChromoBlue S (CAS). The results from the strains representing the 17 groups showed that at least thirteen strains presented NRPS or PKS gene, or for both genes, associated to the production of non-ribosomal peptides. From all the studied strains, it was found that 97% presented the production of siderophore and that several species from the genera Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter and Janthinobacterium proved to be positive on bacterial growth inhibition. The production of hydroxamate-type siderophore was positive to eight strains and seven strains for the cathecol type, and two strains did not present any reaction. The results obtained from the Q-TOF mass spectrometry confirmed the production of 6-hydroxyphenazine-1-carboxylic acid from the isolated identified as Pseudomonas putida BCM 20. This compound belongs to a fully studied group of antibiotics for biological control against several pathogenic bacteria. Keywords: Dark earth; Bacterial community; DNA sequencing; Bioactive composites;
Siderophores; Phenazin
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Algumas fenazinas de origem bacterianas........................................................ 29
Figura 2 – Imagem aérea da localização dos solos de Terra Preta da região Amazônica, obtida através do programa GoogleEarth 4.0.2091 (beta)................................
30
Figura 3 – Local de amostragem de solos de TPA............................................................ 31 Figura 4 – Esquema para extração e análises dos metabólitos secundários....................... 43 Figura 5 – Eletroforese em gel de agarose 1% com produtos de amplificação
(oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene ribossomal 16S rRNA) ..............................................................................................................
47
Figura 6 – Eletroforese em gel de agarose 1,7% com produtos de digestão enzimática com a endonuclease Taq I após a amplificação do gene 16S rRNA................
48
Figura 7 – Freqüência de espécies seqüenciadas isoladas de TPA..................................... 56 Figura 8 – Freqüência de gêneros isolados de TPA........................................................... 56 Figura 9 – Árvore filogenética baseada nas seqüências do gene 16 S rRNA de isolados
de TPA.............................................................................................................. 59
Figura 10 – Produtos amplificados para o gene NRPS e PKS............................................. 60 Figura 11 – Distribuição de genes que codificam para NRPS e PKS dos isolados de
TPA................................................................................................................... 62
Figura 12 – Cultivo dos isolados em meio contendo o complexo CAS............................... 63 Figura 13 – Produção de sideróforos (CAS-agar) de isolados de TPA................................ 66 Figura 14 – - Extração dos metabólitos secundários das bactérias selecionadas com
diferentes solventes: Clorofórmio e Acetato de etila........................................ 69
Figura 15 – Teste de bioatividade do extrato do isolado BCM 20....................................... 70 Figura 16 – CCD dos extratos de 15; 20; 24........................................................................ 72 Figura 17 – Espectros de electrospray (ESI) de extrato de BCM 15, BCM 20 e BCM 24
em modo positivo.............................................................................................. 74
Figura 18 – Fragmentação em MS/MS do composto fenazina de m/z 241.......................... 76 Figura 19 – Estrutura química da 6-hidroxifenazina-1-ácido carboxílico............................ 76
10
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 – Isolados de bactérias de TPA........................................................................ 32 Tabela 2– Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores internos para amplificação
do gene...................................................................................................... 39
Tabela 3 – – Iniciadores de reação que foram utilizados na amplificação de PCR...............................................................................................................
40
Tabela 4 – Características químicas de amostras de solos de TPA dos sítios de Lagoa Balbina...........................................................................................................
45
Tabela 5 – Análise de polimorfismo do DNA genômico, através de enzima de restrição, nos isolados de bactérias de TPA..............................................
50
Tabela 6 – Identificação dos isolados através de seqüenciamento do gene 16S rRNA..............................................................................................................
52
Tabela 7 – - Reagrupamento dos isolados após seqüenciamento, identificando as populações bacterianas encontradas em TPA................................................
54
Tabela 8 – Identificação dos isolados que apresentaram os genes que codificam para NRPS e PKS..................................................................................................
61
Tabela 9 – Identificação dos isolados que produziram sideroforos................................. 64 Tabela 10 – Produção de sideróforos do tipo catecol e hidroxamato pelos isolados de
TPA................................................................................................................ 67
Tabela 11 – Formação de halo de inibição dos extratos demonstrando a ação antimicrobiana................................................................................................
70
Tabela 12 – Rfs das frações dos extratos visualizadas sob lâmpada UV com dois comprimentos de onda 254/366 nm...............................................................
72
11
1 INTRODUÇÃO
A biotecnologia é reconhecida como uma das mais promissoras tecnologias para o século
21, devido às suas características de inovação e impacto na busca e descoberta de recursos
biológicos industrialmente exploráveis e pela importância frente a problemas globais tais como:
doenças, nutrição e poluição ambiental (KATE, 1999). Com isso, a compreensão do papel de
microrganismos no meio ambiente fornecerá subsídios para o desenvolvimento de aplicações
biotecnológicas, além de ser fundamental no estabelecimento de políticas de biossegurança, de
projetos em agricultura sustentável e de programas de desenvolvimento industrial (CANHOS,
1994).
O solo é um habitat bastante peculiar com relação a outros habitats terrestres devido a
sua natureza heterogênea complexa e dinâmica. Estas características permitem que organismos
com metabolismos completamente distintos possam conviver lado a lado, interagindo em estado
de equilíbrio dinâmico, muitas vezes com relações de dependência essenciais para a sua
sobrevivência. Quanto maior a complexidade da comunidade biológica, como ocorre na maioria
dos solos, maior é a sua estabilidade (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002). Os microrganismos que
habitam o solo realizam atividades imprescindíveis para a manutenção e sobrevivência também
das comunidades vegetais e animais. Como citado por Louis Pasteur: “O papel dos infinitamente
pequenos é infinitamente grande”. No solo, as atividades principais dos microrganismos são:
decomposição da matéria orgânica, produção de compostos complexos que causam agregação do
solo, decomposição dos poluentes e controle biológico de pragas e doenças.
A biota do solo inclui representantes de todos os grupos de microrganismos (bactérias,
fungos, algas). A presença de um microrganismo específico em determinado solo é função das
condições ambientais dominadas e dos limites de sua bagagem genética. Algumas espécies de
microrganismos podem sobreviver em condições extremas de salinidade, temperatura, pressão e
pH. Além disso, os microrganismos, de modo geral, são bastante versáteis em adaptar-se a
mudanças ambientais. Limitações físicas (umidade, aeração, porosidade) e químicas
(disponibilidade de nutrientes e toxicidade de elementos como metais pesados) podem ocorrer
nos solos, porém muitas espécies são capazes de se adaptar a essas condições (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2002).
12
A biodiversidade microbiana do solo mesmo sendo pouco conhecida é responsável pela
produção de centenas de substâncias, como enzimas, antibióticos, etc. Tornando cada vez maior o
interesse por microrganismos como fonte potencial na produção desses compostos naturais. Os
produtos de origem biológica têm uma grande vantagem em relação aos compostos de origem
sintética, pois através da biotecnologia é possível acessar genes que codificam enzimas capazes
de produzir estes produtos naturais.
As bactérias representam uma das mais diversas formas de vida da Terra e podem
consistir em mais de um milhão de espécies (KENNEDY, 1999). A versatilidade bioquímica e
diversidade de bactérias representam uma enorme variedade de genes que são ainda
desconhecidos. Está se descobrindo cada vez mais funções gênicas, particularmente, para
remediação ambiental e propósitos industriais. Assim, o uso de bactérias abre novas áreas de
exploração biotecnológica, que dita à necessidade de isolar, caracterizar e determinar a
biodiversidade microbiana em solos.
Os produtos naturais são responsáveis direta ou indiretamente, por cerca de 40% de todos
os fármacos disponíveis na terapêutica moderna, e se considerarmos os usados como antibióticos
e antitumorais (PHILLIPSON, 2000; YUNES; CALIXTO, 2001). Contudo, o número de
linhagens utilizadas em biotecnologia e o número de produtos microbianos são relativamente
limitados. Nas últimas décadas o uso irracional de antimicrobianos determinou o surgimento de
cepas de microrganismos multirresistentes, impulsionando à pesquisa nas áreas de química,
farmacologia e microbiologia para descoberta de novos agentes antimicrobianos (CECHINEL
FILHO, 2000; MACIEL; PINTO; VEIGA, 2002; SOUZA et al., 2003), com triagem desses
compostos em ambientes naturais para a busca de novas drogas.
A região da Amazônia é caracterizada pela enorme diversidade de vida, tanto vegetal
como animal. As TPA’s são solos antrópicos derivados de atividades humanas ainda não
definidas, com elevado teor de nutriente como fósforo, cálcio, potássio, magnésio, além de uma
alta quantidade de artefatos arqueológicos e carvão sempre associados (SOMBROEK, 1966;
SMITH, 1980; KERN, 1988; KERN; KÄMPF, 1989; WOODS; MAcCANN, 1999). Estima-se
que 1 cm de Terra Preta leve pelo menos dez anos para se formar. A presença de material
orgânico estável e a grande atividade biológica indicam que este tipo de solo pode ser um local de
13
alta diversidade microbiana (TSAI et al., 2003), possibilitando a descoberta de microrganismos
potencialmente exploráveis nesse solo.
Porém, a biodiversidade microbiana da Amazônia bem como o seu potencial
biotecnológico não tem sido plenamente estudada. Poucos trabalhos mostram produtos do
metabolismo microbiano com potencial uso em indústrias e mostram menos ainda
antimicrobianos produzidos por isolados bacterianos desta região. Dentro deste contexto, o
objetivo deste trabalho foi verificar o potencial antimicrobiano e caracterização de substância
antimicrobiana produzida por bactérias isolada de solos de Terra Preta na região da Amazônia
Central.
14
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão Bibliográfica
2.1.1 Terra Preta Antropogênica
Na Amazônia Brasileira, ocorrem solos com horizontes superficiais de cor escura e que
apresentam elevados teores de fósforo e cálcio. Esses solos possuem várias denominações tais
como terra preta, terra preta de índio, terra preta arqueológica e terra preta antropogênica
(SOMBROEK, 1966; SMITH, 1980; KERN; KÄMPF, 1989; CUNHA, 2001). Estes horizontes
de coloração escura são denominados no Sistema Brasileiro de Classificação de Solos, de
horizonte A antrópico (EMBRAPA, 1999).
As áreas com Terra Preta são encontradas na região amazônica, sobre os mais diversos
tipos de superfícies geomórficas (LIMA, 2001), e ordens de solos tais como: Latossolos,
Argissolos, Cambissolos, Nitossolos e Plintossolos (CUNHA, 2001; LIMA, 2001; KERN;
KÄMPF, 1989; SMITH, 1980). O horizonte A antrópico, que corresponde à camada de Terra
Preta, possui em média 40 a 50 cm de espessura podendo chegar até mesmo a 200 cm de
profundidade (HARTT, 1885; CUNHA, 2001). A cor preta dos horizontes superficiais das Terras
Pretas foi atribuída ao maior acúmulo de material orgânico nestes solos (KERN; KÄMPF, 1989).
Segundo Smith (1980), as terras pretas ribeirinhas são mais extensas e mais profundas do que
aquelas encontradas nas áreas de interflúvios. A primeira descrição de Terra Preta foi realizada
por Hartt (1885), conhecida naquela época como “terra cotta”. Este termo é baseado numa
seqüência de publicações arqueológicas indicando que naquela época as cerâmicas foram
provavelmente as únicas relíquias das culturas antigas (ZECH; GLASER, 2001).
Várias hipóteses foram levantadas sobre a origem e formação das Terras Pretas. Até
meados do século passado, pesquisadores entendiam que estes solos tenham originados em
função de eventos geológicos: cinzas vulcânicas, decomposição de rochas vulcânicas ou a partir
de sedimentos depositados em fundos de lagos extintos (CAMARGO, 1941; FALESI, 1972;
FARIA 1946; FRANCO, 1962). Tão antigos quanto as investigações das Terras Pretas foram os
15
questionamentos sobre a sua origem; há dois modelos que procuram explicar seu processo de
formação:
a) O surgimento das terras pretas é atribuído ao resultado acidental de um assentamento,
fruto do descarte doméstico e acúmulo de matéria orgânica provenientes de assentamentos
que tiveram um longo-prazo de permanência (SMITH, 1980; KERN; KÄMPF, 1989),
chamado por Kämpf (2003) de “midden model”.
b) O processo de formação de tais solos resulta de ações antrópicas intencionais de
enriquecimento do solo para aumentar a capacidade agrícola dos empobrecidos solos
tropicais, também chamados de modelo agrícola (WOODS; McCANN, 1999).
Estudos atuais constataram que as terras pretas desempenham um importante papel na
produção agrícola da região, devido às grandes concentrações de nutrientes – como P, K, Ca, N e
C – é possível uma alta produtividade agrícola por longos anos, sem o desgaste e lixiviação
característicos aos demais solos Amazônicos (GLASER, 1999; ZECH; HAUMAIER;
HEMPFLING, 1990). Conteúdos mais elevados de carvão na matéria orgânica do solo das Terras
Pretas foram observados em diversos trabalhos, podendo representar até 35% da matéria orgânica
destes solos e que ocorre em todo o horizonte A antrópico, ao passo que nos outros solos, o
carvão ocorre apenas nos primeiros centímetros do horizonte A, em concentrações inferiores a
14% (GLASER,1999, 2000).
Para Glaser (1999; 2004), a retenção de umidade bem como a resistência da matéria
orgânica presentes nos solos de terra preta está associada a uma grande quantidade de carvões
derivados da combustão incompleta de matéria orgânica. Este carvão pirogênico (e não mineral)
possui uma estabilidade química derivada de suas estruturas aromáticas. Esta complexa estrutura
faz com que a matéria orgânica resista muito mais à degradação microbiológica. Portanto, o
carvão pirogênico é um fator chave na manutenção da fertilidade destes solos (GLASER et al.,
2001; 2004). Além do carvão, o fogo também age nas estruturas do solo favorecendo a agregação
de partículas de areia, argila e carvão (além de restos vegetais), que atinge grandes dimensões,
essas grandes partículas dificultariam o processo de lixiviação da matéria orgânica nos solos de
terra preta (TEIXEIRA; MARTINS, 2003).
Muitos trabalhos visam entender tanto o processo de formação desse tipo de solo como
também há tentativas de reprodução dos mesmos (GLASER; ZECH; WOODS, 2004; KERN;
16
COSTA; FRAZÃO, 2004; SOMBROEK et. al., 2002). Esses trabalhos trouxeram muitas
informações a respeito das propriedades químicas e físicas das terras pretas, bem como sua
localização e tamanho. Em geral, assumem dimensões que variam entre cinco a mais de 300
hectares em corpos d’agua, sobre várzeas, em áreas adjacentes aos rios em terraços elevados fora
do nível das inundações, e em áreas de terra firme (KERN et al., 2003).
Pesquisas arqueológicas e pedológicas apontam que 50% dos sítios arqueológicos
documentados com terras pretas no Pará, têm um horizonte A entre uma profundidade média de
30 a 60 cm. Esta profundidade do horizonte A é significativamente maior que dos solos
adjacentes que variam em torno de 15 a 20 cm de profundidade (KERN et al., 2003). As maiores
diferenças existentes entre a Terra Preta e os solos adjacentes são a alta fertilidade, sem
necessidade de adição de insumos ou com a utilização de uma quantidade bem menor de
fertilizantes para agricultura de subsistência e alta atividade biológica. Essa característica justifica
a importância em se estudar este tipo de solo, pois pode contribuir para a produção sustentável
em solos tropicais de baixa fertilidade.
2.1.2 A biodiversidade da Terra Preta Antropogênica
A atividade biológica e a biodiversidade estão relacionadas às características e funções
essenciais para a manutenção da capacidade produtiva dos solos. Os microrganismos são
responsáveis por diversas atividades essenciais para o funcionamento dos ecossistemas
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2002). Através da degradação de diferentes elementos pelos
microrganismos do solo, ocorrem transformações em uma variedade de biomoléculas (DUBEY;
TRIPATHI; UPADHYA, 2006). A composição e a quantidade da biomassa microbiológica do
solo são sensíveis particularmente a alterações ambientais do solo. Esses parâmetros da biomassa
microbiológica têm sido usados freqüentemente como indicadores para ecossistemas perturbados
e estressados (ANDERSON; DOMSCH, 1993). Os processos ecológicos do solo podem ser
afetados pelo uso agrícola predatório, que pode levar a perda da diversidade de organismos.
Uma característica consideravelmente importante da TPA é a sustentabilidade de sua
fertilidade, onde os microrganismos do solo desempenham um papel fundamental para a
persistência dessa fertilidade. Os solos de TPA podem exibir considerável variedade na
distribuição de populações microbianas (THIES; SUZUKI, 2003). Apesar de relativamente
17
poucos trabalhos desenvolvidos para investigar a complexidade genética desta região, sabe-se
que a biodiversidade é enorme na vida microbiana da Amazônia (BENNER et al., 1995).
Vários estudos indicaram a importância da floresta Amazônica não só na biodiversidade
de microrganismos como também na interferência nos ecossistemas (ERWIN, 1988). Trabalhos
realizados por Borneman e Triplett (1997) com solos provenientes da uma região Amazônica,
utilizando técnicas moleculares, mostraram uma imensa variedade de microrganismos presentes
em pequenas quantidades de solo; em análises do espaçador intergênico do RNA ribossomal
também indicaram diferenças significativas na população microbiana dos solos naturais da
floresta e solos adjacentes.
2.1.2.1 Uso da biodiversidade microbiana na biotecnologia
A busca pela biodiversidade e bioprospecção de novos microrganismos tornou-se uns dos
principais focos da era biotecnológica, onde a utilização destes organismos na busca de soluções
vem crescendo de forma acelerada no atual cenário mundial. Os microrganismos são
considerados uma importante fonte de recursos genéticos para o avanço biotecnológico e para o
desenvolvimento sustentável, não apenas pela sua extraordinária capacidade em produzir uma
grande variedade metabólica, mas também pela sua adaptabilidade genética (KURTBÖKE,
SWINGS; STORMS, 2004).
A utilização de recursos microbianos pelo homem pode ser notada em diversas atividades
de importância sócio-econômica, principalmente na área industrial com um grande número de
gêneros utilizados, podendo destacar Arthrobacter, Pseudomonas, Bacillus, dentre outros. Pela
sua eficiência na produção de compostos comerciais como também para a transformação de
substratos em produtos de maior valor agregado os microrganismos são utilizados em diversos
setores como: na agricultura, destacam-se os microrganismos fixadores de nitrogênio e os
empregados no controle biológico de pragas e vetores, na área de alimentos, as linhagens
microbianas são empregadas na produção de ácidos orgânicos, enzimas, dentre outros; e na área
ambiental, com recuperação do meio ambiente através da biorremediação.
O sucesso dos processos biotecnológicos está diretamente relacionado com a diversidade
dos microrganismos e das moléculas que eles produzem como resultado do metabolismo primário
e secundário, bem como com a conservação dos recursos que eles fornecem (HUNTER-
18
CEVERA, 1998). Conseqüentemente, o aumento da diversidade de compostos químicos para os
diferentes setores industriais está associado com a exploração da diversidade microbiana e são
muitos os benefícios científicos esperados como resultado desta exploração (COLWELL, 1997;
HUNTER-CEVERA, 1998). O processo de busca e descoberta de produtos naturais a partir dos
recursos microbianos (BULL; WARD; GOODFELLOW, 2000) vem sofrendo profundas
alterações em função das mudanças de modelos desencadeadas pelos avanços em biologia
molecular, genômica, metagenômica e bioinformática.
2.1.3 Metabólitos Secundários
As atividades metabólicas associadas ao crescimento celular compõem o metabolismo
primário, onde os metabólitos produzidos (conhecidos como metabólitos primários) são
principalmente enzimas, ácidos orgânicos e etanol, entre outros. No entanto em muitos
microrganismos, verifica-se a síntese de compostos não essenciais ao crescimento, os quais são
produzidos no final da fase de crescimento ou durante a fase estacionária. Esses compostos são
denominados metabólitos secundários, sendo produzidos por diversos tipos de microrganismos
(VINING, 1986), e podem ser sintetizados pela via ribossomal e não-ribossomal (KOLTER;
MORENO, 1992; KLEINKAUF; VON DÖHREN, 1996).
O metabolismo secundário torna-se interessante devido a variedade de compostos de
interesse comercial produzido (antimicrobianos, fungicidas, antitumorais, inibidores de enzimas,
toxinas, pigmentos), os quais são moléculas orgânicas complexas que requerem um grande
número de reações enzimáticas para sua síntese, as quais não fazem parte do metabolismo
primário (VINING, 1986).
Os microrganismos do solo têm capacidade de produção de inúmeros metabólitos
secundários, no entanto menos de 1% dos microrganismos que habitam o solo foram cultivados e
identificados (FELSKE et al., 1997; PIMM et al., 1995) dessa forma, supõe-se que ainda exista
uma vasta quantidade desses metabólitos a serem descobertos. A biossíntese de metabólitos
secundários envolve uma interação entre atividades enzimáticas e formação de proteínas
complexas (VON DÖHREN; KELLER; VATER, 1997). A estrutura das enzimas envolvidas na
biossíntese desses metabólitos é caracterizada por um arranjo modular, encontrando-se de forma
correspondente, blocos de seqüências repetitivas nos genes que as codificam (ETCHEGARAY,
19
1998, ETCHEGARAY et al., 2004; MARAHIEL; STACHELHAUS; MOOTZ, 1997; VON
DÖHREN et al., 1997).
2.1.3.1 Antimicrobianos
Uma estratégia de proteção constantemente encontrada na natureza contra
microrganismos patogênicos e utilizada pela grande maioria dos organismos vivos, como, por
exemplo, plantas, animais vertebrados (peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos), animais
invertebrados (insetos e crustáceos) e microrganismos é a produção de metabólitos secundários
ou peptídeos com atividade antimicrobiana. Apesar de possuírem características estruturais
diversificadas, em sua maioria são peptídeos catiônicos, de natureza anfifílica, podendo ser
lineares ou cíclicos, e com tamanho que varia de 30 a 100 resíduos e uma grande variedade de
aminoácidos em sua composição (HWANG; VOGEL, 1998).
Antimicrobianos são substâncias químicas produzidas por diversas espécies de
microrganismos capazes, em pequenas concentrações, de inibir o crescimento de outros
microrganismos. Entretanto, o advento de métodos sintéticos resultou em uma modificação nesta
definição. O termo antimicrobiano se refere agora às substâncias produzidas por microrganismos
ou por síntese química total ou parcial que, em baixas concentrações, inibe o crescimento de
outros microrganismos (JOLIK, 2003). Os antimicrobianos estão amplamente distribuídos na
natureza, onde desempenham importante papel na regulação da população microbiana do solo,
águas e adubos. Estas substâncias diferem tanto quimicamente como em seu mecanismo de ação
e há pouca ou nenhuma relação entre elas, exceto por sua capacidade em afetar adversamente
processos vitais de certos microrganismos (JOLIK, 2003). Estes agentes quimioterápicos
interferem em diversos sítios vulneráveis na célula, como a síntese da parede celular, as funções
da membrana citoplasmática, a síntese protéica, o metabolismo de ácidos nucléicos e o
metabolismo intermediário (HARDMAN, 2003).
2.1.3.2 Sideróforos
Sideróforos são moléculas que desempenham a função de solubilizar especificamente
ferro, em presença de outros íons metálicos, e incorporá-lo ao metabolismo celular. Este processo
é acompanhado por quelação seletiva de Fe3+. São de baixa massa molecular (400 a 2000 Da) e
elevada afinidade pelo substrato (Kd 10-20 a 10-50 ). Podem ser produzidos por uma variedade de
20
microrganismos em resposta a baixa disponibilidade de Fe3+, contudo, diferindo na eficiência de
produção, entre eles estão, bactérias patogênicas, microrganismos do solo, espécies aeróbicas e
facultativamente por espécies anaeróbicas, Gram-positivas e negativas, algumas espécies de
plantas, alguns tipos de leveduras, cianobactérias e algas superiores (BENITE; MACHADO;
MACHADO, 2002).
A biodisponibilidade de ferro microbiano é, em grande parte, determinada pela química
de coordenação associada ao sideróforo. Os processos químicos necessários para a solubilização
e captação de ferro mediado por sideróforos são:
• quelação seletiva de Fe3+;
• reconhecimento molecular do complexo sideróforo-Fe3+;
• transporte de Fe complexado através da membrana celular;
• deposição do Fe dentro de um sítio apropriado na célula
(superfície ou interior celular).
O último processo envolve finalmente a troca do ligante, que pode ou não ser precedida
pela redução de Fe3+ e/ou pela hidrólise do ligante.
Estudos feitos por Braun e Killmann, utilizando espectroscopia de Mössbauer, descrevem
sobre o mecanismo de absorção de Fe mediado por sideróforos (RAYMOND, 1994; BRAUN;
KILLMANN, 1999).
Um diagrama esquemático de uma célula de Escherichia coli, foi descrito a partir do
primeiro uso da espectroscopia de Mössbauer para demonstrar o transporte de ferro dentro de
uma célula. As proteínas receptoras transportam ferro-sideróforo através da membrana externa.
No periplasma estas proteínas liberam Fe3+-sideróforo a compostos que transportam somente o
ferro através da membrana citoplasmática; estas são outras proteínas transportadoras, capazes de
transportar ferro dentro do citoplasma com gasto de ATP. As respectivas ATPases estão
associadas com a entrada de Fe2+ através da membrana citoplasmática. Provavelmente Fe2+ se
difunde através da membrana, sendo transportado por outras proteínas, para finalmente ser
incorporado a trajetórias metabólicas do ser vivo (REIGH; O’CONNELL, 1993; BRAUN;
KILLMANN, 1999; ROLFS; HEDIGER, 1999).
Um aspecto comum a todos os sideróforos é que formam complexos octaédricos com o
Fe3+, possuem pelo menos um ácido hidroxâmico, um catecol e/ou um ácido α-hidroxicarboxílico
como sítios ligantes e são agrupados pelo tipo estrutural (hidroxamatos e fenolatos/catecolatos).
21
Um estudo sobre o mecanismo pelo qual a expressão gênica controla o ferro, envolvido no
metabolismo de pioverdina em Pseudomonas aeruginosa mostrou que a transcrição desses genes
foi reprimida pela presença de ferro no meio de crescimento. Três promotores desses genes foram
clonados e a atividade desses promotores mostrou-se dependente da quantidade de ferro no meio
de cultura (ROMBEL; McMORRAN; LAMONT, 1995). Foi observado também homologia do
DNA entre os genes de síntese de sideróforos no patógeno P. aeuruginosa em animal, e três
espécies associadas a plantas, P. siringae, P. putida e Pseudomonas sp., sendo consistente com a
hipótese de que os genes de síntese de diferentes sideróforos têm o envolvimento de um mesmo
conjunto ancestral de genes (ROMBEL; LAMONT; 1992).
A química de coordenação associada aos sideróforos, que os torna tão versáteis do ponto
de vista biológico, sugere seu uso potencial como agentes farmacológicos e agroquímicos
(GARRETT et al., 1991), com interesse na sua aplicação em diferentes áreas, tais como:
• Aplicações clínicas
Na condição de quelantes de ferro de ocorrência natural, os sideróforos são considerados
os menos nocivos para realizar a remoção de ferro em pacientes que sofrem de siderose
induzida por transfusão.
• Antibióticos baseados em estruturas de sideróforos
Vários antibióticos potentes têm sido descobertos mimetizando o centro de coordenação
de Fé+3 dos sideróforos e, portanto, tendo acesso ao citoplasma da bactéria via sistemas de
transporte destes. Uma vez dentro das células a metade ativa do antibiótico é clivada.
(DIARRA et al., 1996).
• Aplicações agrícolas
Estudos para comprovar se a supressão de doenças era causada pela produção de
sideróforos e/ou antibióticos já foram bem documentados. Kloepper et al. (1980b)
demonstraram que a adição de ferro, na forma de etilenodiamina tetracetato de Fe+3 (Fe-
EDTA), aboliu a ação antagonística “in vitro”. Observaram, também, que o sideróforo
pseudobactina, purificado de P. fluorescens B-10 exibiu atividade bacteriostática contra
Erwinia carotovora, fato que não ocorreu com a pseudobactina-férrica, sideróforo
complexado com ferro. Observaram também, que o sideróforo pseudobactina induziu um
22
aumento significativo no crescimento de plantas de batata, enquanto que o sideróforo
complexado com Fe-EDTA não foi capaz, evidenciando assim, um mecanismo de ação
através da produção de sideróforos, demonstrando a sua capacidade de seqüestrar o Fe+3
da rizosfera (KLOEPPER et al., 1980a).
• Aplicações ambientais
Vários sideróforos produzidos por Pseudomonas apresentaram utilidades em processos de
biorremediação, sendo um deles a fitorremediação, onde solos contaminados por metais
pesados como Cr, Hg e Pb seriam limpos através da quelação pelos sideróforos (BRAUD
et al., 2006).
2.1.4 A diversidade Funcional e Química dos Metabólitos Secundários ou Peptídeos
Os peptídeos foram divididos em vários grupos baseados em sua massa molecular,
estrutura secundária e terciária e presença ou ausência de pontes de dissulfeto (REDDY;
YEDERY; ARANHA, 2004). Os peptídeos são biomoléculas que contém de dois a dezenas de
resíduos de aminoácidos unidos entre si através de ligações peptídicas. Se comparados às
proteínas, são quimicamente mais versáteis, pois podem ser esterificados em suas carboxilas
terminais, acetilados em seus grupos amino terminais, fosforilados ou sulfatados em um ou mais
resíduos (serina, treonina ou tirosina), lineares, semi-cíclicos (geralmente via uma ou mais
ligações dissulfeto intra - ou intercadeias peptídicas) ou cíclicos (via ligação entre os grupos
amino e carboxila dos aminoácidos terminais). Muitos contêm um ácido piroglutâmico como
resíduo N-terminal, outros apresentam D-aminoácidos e outros, ainda, possuem aminoácidos não
usuais (GUTTE, 2000). Os peptídeos são também extremamente diversificados em termos
funcionais. Muitos atuam como hormônios ou fatores liberadores destes, enquanto outros são
neuropeptídeos, neurotransmissores, toxinas ou antibióticos naturais (MIRANDA, 2000; KO,
2002).
Os peptídeos são divididos em duas classes (HANCOCK; CHAPPLE, 1999):
a) Peptídeos sintetizados pela via ribossomal: são produzidos por todas as espécies de vida,
incluindo as bactérias, como o componente principal do sistema de defesa do hospedeiro.
Na síntese ribossômica de peptídeos, a formação das pontes peptídicas é direcionada pelos
23
ribossomos e o RNAm funciona como molde determinando a seqüência do aminoácido do
produto. O número de aminoácidos incorporados naturalmente nos peptídeos ribossômicos
está restrito a 20, codificados pelos códons de RNAm. Os quais podem consistir de mais de
3000 resíduos de aminoácidos.
b) Peptídeos sintetizados pela via não-ribossomal: são drasticamente modificados e
amplamente produzidos por bactérias. São exemplos os glicopeptídeos como a
vancomicina. A síntese não-ribossômica utiliza uma grande variedade de substratos, como
aminoácidos não-protéicos, hidroxiácidos e substâncias policetídicas, especialmente
elaboradas para serem incorporadas na estrutura destes peptídeos. Mais de 300 precursores
diretos são conhecidos. No processo biossintético eles podem ser modificados de várias
maneiras pelos domínios integrados ou pelas funções codificadas por genes separados, o
que propicia uma diversidade enorme de peptídeos lineares ou cíclicos. O tamanho desses
peptídeos varia de 2 a 48 aminoácidos (KLEINKAUF; VON DÖHREN, 1996).
Peptídeos não-ribossômicos freqüentemente contêm aminoácidos não usuais, incluindo
aminoácidos não protéicos ou modificados. A habilidade destes complexos multienzimáticos de
incluir tais aminoácidos e incorporá-los em ambos os peptídeos cíclicos e lineares resulta numa
grande estrutura natural diversa das espécies bacterianas e fúngicas. Os peptídeos não-
ribossômicos podem também atuar como um esqueleto para a biossíntese de estruturas mais
complexas ou podem ser incorporados como ácidos graxos ou policetonas. Tais estruturas podem
ser biossintetizadas por sistemas de peptídeos sintetase mistos ou híbridos e policetídeo sintase. O
número de metabólitos secundários estruturalmente identificados produzidos por este mecanismo
de arranjo de tióis foi rapidamente se expandindo (KLEINKAUF; VON DÖHREN, 1996).
2.1.4.1 Biossíntese de peptídeo sintetase não-ribossômica (NRPS)
As moléculas sintetizadas pelas NRPSs normalmente são cíclicas com uma grande
quantidade de aminoácidos não proteinogênicos e freqüentemente contêm aminoácidos
conectados por ligações diferentes das peptídicas, como as ligações fulfídicas (CHALLIS;
NAISMITH, 2004).
A biossíntese desta via ocorre através de uma série de reações enzimáticas parciais e
repetitivas, os aminoácidos que constituem a estrutura do peptídeo são incorporados
24
seqüencialmente, onde a formação dos peptídeos não ribossômicos está ligada diretamente ao
módulo que corresponde ao segmento de DNA que codifica o sistema multienzimático. A
seqüência de eventos é determinada por um arranjo espacial de domínios catalíticos com os
módulos em NRPS envolvidos na catálise de reações parciais. A enzima utiliza um módulo
composto por cerca de 1.000 aminoácidos, para a incorporação de um aminoácido em um
peptídeo não-ribossômico sendo subdividido em regiões menores, envolvidas em reações
enzimáticas específicas.
Ocorre uma relação linear entre as etapas de biossíntese e a seqüência de módulos. O
primeiro módulo de uma NRPS está envolvido na incorporação e ativação do aminoácido N-
terminal e os demais módulos na incorporação dos aminoácidos subseqüentes. As mínimas
reações de NRPS são condensações, adenilação e tioesterificação (ETCHEGARAY, 1998;
MARAHIEL; STACHELHAUS; MOOTZ, 1997; VON DÖHREN; KELLER; VATER, 1997).
As regiões envolvidas nestas reações parciais estão localizadas em domínios, ou seja, de
adenilação (domínio A), de formação de tioésteres (domínio P) e de condensação (domínio C).
Em analogia a biossíntese de ácidos graxos, onde se tem a proteína carreadora de acilas
(ACP) (MARAHIEL; STACHELHAUS; MOOTZ, 1997) o domínio de formação de tioésteres
também é conhecido como proteína carreadora de peptídeos (PCP). Vários outros domínios já
foram descritos embora não sejam essenciais para a incorporação de aminoácidos.
Ao fim da síntese enzimática de peptídeos o produto é liberado da enzima por meio da
atividade de tioesterase, geralmente catalisada pelo domínio de tioesterase (T). O domínio T está
freqüentemente inserido no último módulo das NRPSs (MARAHIEL; STACHELHAUS;
MOOTZ, 1997). Para as peptídeos sintetases se tornarem funcionais elas necessitam sofrer
modificação, ocorrendo a incorporação do cofator 4’-fosfopantoteína (PAN) ao domínio PCP
através de uma ligação covalente do tipo fosfodiéster ao resíduo de serina (WALSH et al., 1997).
2.1.4.2 Biossíntese de policetídeo sintase (PKS)
A biossíntese de PKS ocorre pela ação de, no mínimo, três domínios por módulo. Os
domínios responsáveis pelas reações mínimas são: acila transferase (AT), proteína carreadora de
acila (ACP) e cetossintase (KS). Para que ocorra a condensação, o domínio KS captura o
agrupamento acila do domínio ACP anterior via ataque nucleofílico em relação à acila já
25
existente no domínio e condensa os dois grupamentos (KEATING; WALSH, 1999). Ao término
da síntese enzimática de policetídeos o produto é liberado do complexo PKS por meio da
atividade de tioesterase, catalisada pelo domínio de tioesterase (T) (DITTMANN; NEILAN;
BÖRNER, 2001). Acetato e malonato são utilizados pelas PKSs como iniciadores de cadeias,
assim como malonato, metilmalonato e etilmalonato são utilizados como unidades de elongação,
contribuindo assim para a diversidade de compostos produzidos por essas enzimas (SIMPSON,
1995)
As PKSs são classificadas de acordo com a semelhança estrutural de ácidos graxos sintases
(FAS). As PKSs modulares são proteínas multifuncionais e são classificadas como tipo I (PKS I)
semelhante ao FAS I de fungos e animais, sendo predominantemente encontradas em
actinobactérias, cianobactérias, mixobactérias e pseudomonas (BODE; MÜLLER 2005). As
PKSs interativas são complexos de multiproteínas constituindo-se de enzimas individuais, sendo
denominadas tipo II (PKS II), como uma FAS II encontrada em bactérias e plantas (JENKE-
KODAMA et al., 2005). As PKSs do tipo III são simples e são tipicamente encontradas em
plantas e bactérias (MOFFITT; NEILAN, 2001). A principal diferença entre NRPSs e PKS está
no fato de que PKSs condensam ácidos carboxílicos a uma cadeia crescente para formar um
produto e NRPSs adicionam aminoácidos.
2.1.5 Antimicrobianos
Uma vez que uma fonte biológica de antimicrobiano é encontrada, esta normalmente
produz um complexo de substâncias as quais devem ser fracionadas em componentes e
compostos bioativos (DUKE et al., 2000a, b). O fracionamento geralmente consiste inicialmente
em separar extratos de uma fonte biológica identificada entre solventes polares e não polares.
Alíquotas são testadas para a atividade biológica e o fracionamento continua na porção que
demonstrar a bioatividade. A cromatografia geralmente é o próximo passo, subfrações são
coletadas e testadas até que um composto puro é obtido. Este processo tem, em muitas vezes,
resultado positivo na descoberta de moléculas bioativas (CHOUDHARY; ATTA-UR-RAHMAN,
1993). Quando os picos são detectados, a partir dos extratos injetados em um cromatógrafo
líquido de alta performance (HPLC), uma fração de cada um é coletada e divergida para análise
estrutural por massa ou por um espectrômetro de ressonância magnética nuclear.
26
2.1.6 Espectrometria de massas (MS)
Utiliza o movimento de íons em campos elétricos e magnéticos para classificá-los de
acordo com sua relação massa-carga. Desta maneira, a espectrometria de massas é uma técnica
analítica por meio da qual as substâncias químicas se identificam, separando os íons gasosos em
campos elétricos e magnéticos. Os instrumentos usados nestes estudos chamam-se
espectrômetros de massas, sob o princípio que os íons podem ser desviados a campos elétricos e
magnéticos. A MS oferece informação qualitativa e quantitativa sobre a composição atômica e
molecular de materiais inorgânicos e orgânicos. (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1990).
2.1.7 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Cromatografia em camada delgada (CCD) consiste na separação dos componentes de uma
mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre
uma superfície plana. Esta somente a partir da década de 60 passou a ser largamente utilizada, de
tal forma que hoje é praticamente indispensável em qualquer laboratório que envolva análise de
substâncias orgânicas e organometálicas.
O grande desenvolvimento desta técnica é conseqüência natural das múltiplas vantagens
que ela oferece, tais como: fácil compreensão e execução, separações em breve espaço de tempo,
versatilidade, grande reprodutibilidade e baixo custo. Pode ser de aplicação analítica ou
preparativa, cuja escala está na dependência da espessura da camada de adsorvente e da amostra
em análise (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1990).
O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno da adsorção.
Entretanto, usando fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica,
o que permite seu emprego tanto na separação de substâncias hidrofóbicas como hidrofílicas. A
CCD é a mais simples e a mais econômica das técnicas cromatográficas quando se pretende
separação rápida e identificação visual. Ela tem demonstrado ser de valor extraordinário na
análise de substâncias orgânicas e inorgânicas, acompanhamento de reações em sínteses e de
processos de purificações. Seria muito difícil relacionar todas as aplicações da CCD; mais fácil
seria citar que ela está presente em quase todos os laboratórios de química ou biologia, face a
fatos como a existência de diferentes fases móveis e estacionárias, diferentes técnicas de
27
desenvolvimento e visualização, a sua rápida execução, a sua reprodutibilidade e ao seu custo não
elevado (COLLINS; BRAGA; BONATO, 1990).
2.1.8 Produção do antibiótico fenazina por Pseudomonas
A família pseudomonadaceae compreende bactérias Gram-negativas, bastonetes,
estritamente aeróbicas e oxidase positivas, possuem motilidade por flagelos. São bactérias que
respiram e são capazes de utilizar componentes do carbono orgânico como fonte de energia.
Apresentam pigmentação amarelada, vermelha, laranja, rosa, e violeta. Algumas podem ser
patogênicas ao homem e também podem promover degradação de alimentos (CULLIMORE,
2000).
Compreende um táxon de organismos muito versáteis metabolicamente, capazes de
utilizar uma grande variedade de compostos orgânicos simples ou complexos.
Conseqüentemente, eles estão distribuídos por solos e água, sendo importantes como patógenos
de plantas, animais e humanos, com algumas estirpes relacionadas à promoção de crescimento de
plantas e biocontrole de fitopatógenos. Existe uma grande diversidade de antibióticos produzidos
pelas diferentes espécies de Pseudomonas. Compostos como fenazinas, pioluteorinas,
pirrolnitrinas, tropolonas, piocianinas e 2,4-diacetilfluoroglucinol têm sido isolados de
Pseudomonas spp. de solo (CAMPBELL; SAINSBURY; SEARLE 1993). Resultados obtidos
pela aplicação de técnicas moleculares e isolamento direto de antibióticos demonstram
efetivamente que estes antibióticos são produzidos na espermosfera e rizosfera e têm grande
importância na supressão de patógenos de plantas existentes no solo (THOMASHOW;
WELLER, 1988; WELLER; THOMASHOW, 1993; KRAES; LOPPER, 1995). Atualmente, a
fenazina e o fluoroglucinol são os metabólitos mais intensamente pesquisados.
Fenazinas são compostos heterocíclicos nitrogenados e pigmentados, dos quais mais de
6.000 compostos tem sido descritos nos últimos anos e menos de 100 são de origem natural, no
entanto, a maior parte desses compostos possui uma ampla atividade de antibióticos em tecido de
bactéria, fungo, planta e animal (LAURSEN; NIELSEN, 2004; SMIRNOV; KIPRIANOVA,
1990). Fenazinas de origem natural são produzidas principalmente por eubactéria. Esses grupos
funcionais são largamente responsáveis pelas diferenças encontradas nas propriedades física e
química da fenazina e, portanto em sua atividade biológica.
28
A diversidade de microrganismos capazes de sintetizar fenazina tem sido documentada
em diversos artigos (BEIFFUS; TIETZE, 2005; CHIN et al., 1998; LAURSEN; NIELSEN, 2004;
PRICE; DIETRICH, 2006; TURNER, 1986). Espécies de bactérias que produzem fenazina são
mais abundantes em linhagens Gram-positivas, no entanto essas espécies também ocorrem em
proteobactérias Gram-negativas (Figura 1). P. aeruginosa é um patógeno oportunista em
humanos e comumente encontrados no solo, foi isolada por Gessard em 1882 como o primeiro
microrganismo produtor de fenazina citado na literatura (BYNG; EUSTICE; JENSEN, 1979;
FLOOD; HERBERT; HOLLIMAN, 1972; HASSAN; FRIDOVICHI, 1980; HOLLIMAN, 1969).
Estudos demonstraram que mais de 50% dos isolados de Pseudomonas que foram
selecionados pela capacidade de antibiose in vitro apresentaram os genes da síntese de fenazina,
indicando que a comunidade de produtores de antibióticos era abundante (BOTELHO et al.,
1998).
A biossíntese de fenazina não está associada somente à inibição de doenças radiculares,
mas, também, à capacidade adaptativa do microrganismo ao ambiente. Trabalhos observaram que
a perda da habilidade em produzir fenazina, resultou na redução da sobrevivência em solo natural
e colonização da rizosfera de trigo (MAZZOLA et al., 1992).
Estudos comprovaram que a inibição do crescimento de Phoma betae (Pleospora betae) e
Rhizoctonia solani, isoladas de sementes e raízes de beterraba, foi obtida através de inoculação
com Pseudomonas spp. fluorescens, associadas à produção de fenazina (LOVIC et al., 1993). Em
análises de PCR e hibridização por ‘southern blot’ foi demonstrado que genes específicos dentro
dos loci biossintéticos para Phl e fenazina são conservados entre várias estirpes de Pseudomonas
largamente distribuídas (RAAIJMAKERS et al., 1997).
29
Piocianina (PYO)
Fenazina-1-ácido carboxílico (PCA)
Fenazina-1-carboxamida (PCN)
1-Hidroxifenazina
D-Alanil-ácido griseolutéico (AGA)
1,6-Dihidroxifenazina 5,10-N-Dióxido (Iodina)
2-Hidroxifenazina 2-Hidroxifenazina-1- ácido carboxílico
Figura 1 – Algumas fenazinas de origem bacterianas
2.2 Material e Métodos
2.2.1 Área de Estudo: Localização das coletas
A área de estudo está localizada no município de Presidente Figueiredo – AM, a 165 km de
Manaus, próxima à Comunidade Rumo Certo e às margens da lagoa da Hidroelétrica Balbina. A
Figura 2 apresenta a localização dos locais onde foram realizadas as coletas.
30
Figura 2 - Imagem aérea da localização dos solos de Terra Preta da região Amazônica, obtida através do programa GoogolEarth 4.0.2091 (beta)
Balbina = latitude 1°53'53.00"S, longitude 59°28'28.00"W e Presidente Figueiredo = latitude 2°2'3.67"S, longitude 60°1'33.15"W.
As amostras obtidas no sítio Terra Preta (Hidroelétrica Balbina) são de solos não
cultivados, na comunidade Rumo Certo, nas proximidades da Hidrelétrica Balbina. Foram
coletadas amostras dos solos de TPA a latitude 01°30’26,4” S e longitude 60°05’34,0”W.
2.2.2 Amostragem
Foram coletadas amostras de solo de uma trincheira em profundidades de 10, 30 e 50 cm de
solos de TPA. Após a coleta realizada em tubos de PVC de 6 cm de diâmetro, as amostras foram
acondicionadas, armazenadas sob baixa temperatura (4oC) e enviadas imediatamente para o
laboratório de Biologia Celular e Molecular do Centro de Energia Nuclear na Agricultura da
31
Universidade de São Paulo em Piracicaba, SP. A Figura 3 apresenta o local de coleta das
amostras de solos de TPA.
Figura 3 – Local de amostragem de solos de TPA
2.2.3 Caracterização físico-química do solo
As análises para a caracterização química do solo de TPA foram realizadas no
Departamento de Ciências do Solo na Escola Superior Luiz de Queiroz – ESALQ/USP. Os
métodos utilizados pela empresa para a extração dos nutrientes do solo foram os seguintes: pH
em água pelo método potenciométrico; matéria orgânica pelo método Walkley-Black modificado
por diferença de densidade óptica; P pelo extrator Mehlich; K e Na por Fotometria de Emissão;
Ca e Mg trocável por Espectrometria de Absorção Atômica; Acidez Potencial (H+Al) pelo
método potenciométrico do SMP (Schmacker, Mclean, Pratt).
2.2.4 Isolamento de bactérias
Foram feitos três cortes em cada tubo de PVC de todas as profundidades contendo as
amostras, misturando 1 g de solo dos três cortes para amostragem. Dessa mistura foi utilizado 1 g
de solo para realizar a diluição em série com 90 mL de solução salina a 0,85%, e então inoculado
0,1 mL do solo diluído sobre o meio de cultivo previamente solidificado utilizando o
Actinomycete Isolation Agar (Difco 212168) como meio de cultivo: caseinato de sódio, 2,0 g/L;
asparagina, 0,1 g/L; propionato de sódio, 4,0 g/L; K2HPO4, 0,5 g/L; MgSO4 · 7H2O, 0,1 g/L;
32
FeO4S · 7H2O, 0,001 g/L; glicerol, 5,0 g/L; ágar, 15,0 g/L. As placas foram incubadas a 28oC e
então procedeu-se o isolamento das bactérias, com a técnica de plaqueamento por espalhamento
em placas de Petri e foram isoladas por purificação de colônias (pescagem). Após o crescimento
das culturas os isolados foram preservados em glicerol 50% a -80oC.
A Tabela 1 descreve todos os isolados usados neste trabalho.
Tabela 1 – Isolados de bactérias de TPA
(Continua)
Isolado Profundidade
BCM 01
0-10 BCM 02 0-10 BCM 03 0-10 BCM 04 0-10 BCM 05 0-10 BCM 06 0-10 BCM 07 0-10 BCM 08 0-10 BCM 09 0-10 BCM 10 0-10 BCM 11 0-10 BCM 12 0-10 BCM 13 0-10 BCM 14 0-10 BCM 15 0-10 BCM 16 0-10 BCM 17 0-10 BCM 18 0-10 BCM 19 0-10 BCM 20 0-10 BCM 21 0-10
33
Tabela 1 – Isolados de bactérias de TPA (Continuação)
Isolado Profundidade BCM 22 0-10 BCM 23 0-10 BCM 24 0-10 BCM 25 0-10 BCM 26 0-10 BCM 27 0-10 BCM 28 0-10 BCM 29 0-10 BCM 30 0-10 BCM 31 0-10 BCM 32 0-10 BCM 33 0-10 BCM 34 0-10 BCM 35 0-10 BCM 36 0-10 BCM 37 0-10 BCM 38 0-10 BCM 39 0-10 BCM 40 0-10 BCM 41 0-10 BCM 42 0-10 BCM 43 0-10 BCM 44 0-10 BCM 45 0-10 BCM 46 0-10 BCM 47 0-10 BCM 48 0-10 BCM 49 0-10 BCM 50 0-10 BCM 51 10-30 BCM 52 10-30 BCM 53 10-30 BCM 54 10-30 BCM 55 10-30 BCM 56 10-30 BCM 57 10-30 BCM 58 10-30 BCM 59 10-30 BCM 60 10-30 BCM 61 10-30 BCM 62 10-30 BCM 63 10-30 BCM 64 10-30
34
Tabela 1 – Isolados de bactérias de TPA (Continuação)
Isolado Profundidade BCM 65 10-30 BCM 66 10-30 BCM 67 10-30 BCM 68 10-30 BCM 69 10-30 BCM 70 10-30 BCM 71 10-30 BCM 72 10-30 BCM 73 10-30 BCM 74 10-30 BCM 75 10-30 BCM 76 10-30 BCM 77 10-30 BCM 78 10-30 BCM 79 10-30 BCM 80 10-30 BCM 81 10-30 BCM 82 10-30 BCM 83 10-30 BCM 84 10-30 BCM 85 10-30 BCM 86 10-30 BCM 87 10-30 BCM 88 10-30 BCM 89 10-30 BCM 90 10-30 BCM 91 10-30 BCM 92 10-30 BCM 93 10-30 BCM 94 10-30 BCM 95 10-30 BCM 96 10-30 BCM 97 10-30 BCM 98 10-30 BCM 99 10-30 BCM 100 10-30 BCM 101 30-50 BCM 102 30-50 BCM 103 30-50 BCM 104 30-50 BCM 105 30-50 BCM 106 30-50 BCM 107 30-50 BCM 108 30-50
35
Tabela 1 – Isolados de bactérias de TPA (Conclusão)
Isolado Profundidade BCM 109 30-50 BCM 110 30-50 BCM 111 30-50 BCM 112 30-50 BCM 113 30-50 BCM 115 30-50 BCM 116 30-50 BCM 117 30-50 BCM 118 30-50 BCM 119 30-50 BCM 120 30-50 BCM 121 30-50 BCM 122 30-50 BCM 123 30-50 BCM 124 30-50 BCM 125 30-50 BCM 126 30-50 BCM 127 30-50 BCM 128 30-50 BCM 129 30-50 BCM 130 30-50 BCM 131 30-50 BCM 132 30-50 BCM 133 30-50 BCM 134 30-50 BCM 135 30-50 BCM 136 30-50 BCM 137 30-50 BCM 138 30-50 BCM 139 30-50 BCM 140 30-50 BCM 141 30-50 BCM 142 30-50 BCM 143 30-50 BCM 144 30-50 BCM 145 30-50 BCM 146 30-50 BCM 147 30-50 BCM 148 30-50 BCM 149 30-50 BCM 150 30-50
36
2.2.5 Extração do DNA genômico
A extração do DNA genômico dos isolados foi realizada a partir de culturas líquidas em
meio de cultivo Actinomycete Isolation Agar (25 mL) sendo as células posteriormente coletadas
por centrifugação. O DNA foi isolado de acordo com Doyle e Doyle (1990) conforme a seguir:
700 µL do tampão de extração (NaCl 1,4 M, Tris-HCl 100 mM pH 8,0, EDTA 20 mM pH 8,0,
PVP-40 1%, CTAB 2%, proteinase K 100 µg/ml e β-mercaptoetanol 0,2%) foram adicionados às
células, seguido de ressuspensão e incubação a 65oC por 30 min. A suspensão foi extraída com
clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) por 3 vezes, precipitada com isopropanol, seca ao ar e
ressuspendida em TE pH 8,0 (Tris-HCl 10 mM e EDTA 1 mM). O DNA foi quantificado através
de espectofotômetro modelo Lambda Bio da Perkin Elmer. Cinco microlitros do DNA foram
analisados em gel de agarose 1%, utilizando como padrão de tamanho de DNA o marcador
molecular 1 kb Plus DNA LadderTM (Invitrogen Life Technologies, São Paulo, Brasil). Os géis
foram documentados utilizando-se o programa “Multi Analyst” do “Fluor-STM Multimager”
(BioRad, Hercules, Califórnia, E.U.A).
2.2.6 Amplificação do gene que codifica o 16S rRNA
O gene 16S rRNA foi amplificado por PCR com os seguintes oligonucleotídeos
iniciadores para o domínio Eubacteria fD1 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) e rD1 (5’-
AAGGAGGTGATCCAGCC-3’) (WEISBURG et al., 1991). Amplificações do gene 16S rRNA
por PCR foram feitas em volume de 50 µL contendo 5 pmols de oligonucleotídeos iniciadores,
200 µM de cada dNTP, 1 X tampão Taq, 1,5 mM de MgCl2, 2 U Platinum Taq DNA polimerase
(Invitrogen Life Technologies, São Paulo, Brasil) e 50 ng de DNA. A PCR foi realizada no
termociclador de modelo GeneAmp PCR System 9700 – Applied Biosystem com o seguinte
ciclo: 3 min. de desnaturação a 94oC, seguido de 30 ciclos com desnaturação a 94oC por 1 min.,
anelamento a 55oC por 30 seg., extensão a 72oC por 30 seg. e extensão final a 72oC por 10 min. A
verificação do tamanho dos amplicons resultantes foi feita por comparação com o padrão de 100
pb (Invitrogen Life Technologies, São Paulo, Brasil), após corrida eletroforética a 90 V por 35
minutos, em gel de agarose 1%. A documentação do gel foi feita pelo programa “Multi Analyst”
do “Fluor-STM Multimager” (BioRad, Hercules, Califórnia, E.U.A).
37
2.2.7 Purificação do DNA
Todo o volume do produto de PCR (45 µL) foi transferido para tubos eppendorf de 500
µL e adicionados 135 µL de isopropanol 100% e 45 µL de água ultrapura (milli-Q) autoclavada.
A mistura foi homogeneizada (vórtex) por alguns segundos. Em seguida, as amostras foram
incubadas por 2 horas a –20oC. Após o período de incubação, as amostras foram centrifugadas a
14.000 rpm por 25 min., a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado totalmente e
adicionado 250 µL de etanol 70% (diluído em água ultrapura imediatamente antes de usar).
Homogeneizou-se (vórtex) por alguns segundos e centrifugou-se a 14.000 rpm, por 5 min., a
temperatura ambiente. O sobrenadante foi totalmente descartado. As amostras foram secas no
concentrador de DNA por 10 min. Os péletes foram ressuspendidos em 50 µL de água ultrapura
autoclavada. Agitou-se em vórtex seguido de um pulso na microcentrífuga. A qualidade do DNA
foi verificada em gel de agarose 1% e o restante foi armazenado em freezer –20oC até a próxima
etapa (digestão com enzimas de restrição).
2.2.8 Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA)
As reações de digestão foram realizadas utilizando-se aproximadamente 500 ng do
produto de PCR resultante da amplificação do gene 16S rRNA universal purificado: 2,0 µL do
tampão da enzima, 0,3 µL da enzima de restrição (10 U/µL) em volume final de 20 µL. As
reações foram incubadas a 65oC para a enzima Taq I. Todo o produto de PCR foi analisado em
gel de agarose 1,7%, utilizando como padrão de tamanho de DNA o marcador molecular 1 Kb
Plus DNA LadderTM (Invitrogen Life Technologies). Os géis foram documentados pelo
programa “Multi Analyst” do “Flúor-STM Multimager” (BioRad, Hercules, Califórnia, E.U.A).
A seguir, encontra-se descrita a enzima de restrição (endonuclease) utilizada neste estudo,
com sua respectiva seqüência de corte:
• Taq I: 5’ – T ↓ CG A – 3’
2.2.9 Seqüenciamento do gene 16S rRNA
A PCR de seqüenciamento dos fragmentos foi feita através do kit de seqüenciamento
DYEnamic ET Terminator Cycle (Amersham Biosciences, Inglaterra, UK). A reação foi para um
38
volume final de 10 µL onde foram utilizados 200 ng dos fragmentos de interesse; 5 pmoles de
oligonucleotídeos iniciadores; 2,0 µL de tampão 2,5 X; 2,0 µL de DYEnamic ET Terminator
Cycle. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados foram: rD1 e fD1, além dos conjuntos de
oligonucleotídeos internos descritos na Tabela 3, visando o fechamento da seqüência do gene 16S
rRNA. As condições de amplificação para o iniciador T7 foram: 2 min. de desnaturação a 96oC,
seguidos de 25 ciclos com desnaturação a 96oC por 45 seg., anelamento a 50oC por 30 seg.,
extensão a 60oC por 4 min., enquanto que para os demais iniciadores tais condições encontram-se
a seguir: 4 min. de desnaturação a 94oC, seguidos de 25 ciclos com desnaturação a 94oC, por 1
min.; anelamento a 55oC por 30 seg. e extensão a 60oC por 4 min.
Após a amplificação dos fragmentos de interesse, procedeu-se a precipitação para a
eliminação dos dNTPs que não foram incorporados. Foi adicionado 1 µL de tampão acetato de
sódio/EDTA, mais 40 µL etanol a 95% (recém preparado). Após a homogeneização por agitação,
os tubos foram centrifugados a 12.000 rpm, por 15 min., a temperatura ambiente. O sobrenadante
foi descartado e 500 µL de etanol 70% foram adicionados. Após a homogeneização, as amostras
foram centrifugadas por 5 min. a 12.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado
incubado por 5 min. a 40oC para secagem. Em seguida o precipitado foi ressuspendido em 10 µL
de formamida (HiDi formamida – Applied Biosystems) em microplacas. A microplaca foi
colocada em um termociclador para a desnaturação do DNA a 96oC durante 5 min. e
imediatamente colocada no gelo por 2 min. A leitura das bases marcadas foi realizada no
Seqüenciador Automático ABI Prism 3100 Genetic Analyser do Laboratório de Biologia Celular
e Molecular – CENA/USP.
39
Tabela 2 – Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores internos para amplificação do gene
Seqüência (5'-3')
Posição de alinhamento na seqüência de E.
coli
AGA GTT TGA TCC TGC CTC AG
8-28FDI eubactéria
AAG GAG GTG ATC CAG CC 1526-1542RDI eubactéria
CCT ACG GGA GGC AGC AG 341-357F
CTG CTG CCT CCC GTA GG 357
TCT ACG SAT TTC ACC (GC) CT AC 704R
GCA ACG AGC GCA ACC C 1099-1114F
GGG TTG CGC TCG TTG C 1114R
2.2.10 Análise filogenética das seqüências de 16S rDNA
Os cromatogramas gerados pelo seqüenciamento dos isolados foram processados
removendo-se as bases de baixa qualidade (<20) através dos programas Phred/Phrap/Conserd em
sistema operacional Linux (EWING et al., 1998; ERWING, 1988; GORDON; ABAJIAN;
GREEN, 1998). As seqüências obtidas foram comparadas com outras seqüências previamente
depositadas no GenBank do National Center for Biotechnology Information (NCBI), utilizando-
se a ferramenta Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) (ALTSCHUL et al., 1990). A
construção e visualização da árvore filogenética foram realizadas com o auxílio do programa
Mega 3.1 (KUMAR et al., 2004). O alinhamento das seqüências foi realizado através do
programa Custal W 1.8 (www.ebi.ac.uk:index.html) (THOMPSON et al., 1994). Posteriormente,
o ajuste das extremidades das seqüências de DNA, de forma que todas elas tivessem o mesmo
número de bases completamente alinhadas foi realizado com o auxílio do programa BioEdit
(HALL, 2001). Para o cálculo da significância estatística da similaridade entre as seqüências foi
utilizada uma re-amostragem para 1.000 replicações (SWOFFORD et al., 1996). O método de
40
distância (“Neighbour Joining”) (SAITOU; NEI, 1987) foi usado na construção da árvore
filogenética.
2.2.11 Presença de genes NRPS e PKS
Para amplificação de seqüências conservadas de NRPS e PKS, utilizou-se um conjunto de
oligonucleotídeos iniciadores descritos na Tabela 4, confeccionado pela Integrated DNA
Technologies, Inc. (Integrated DNA Technologies, INC., Coralville, IA, EUA). A amplificação
foi realizada em solução contendo: tampão para a reação PCR 1 X (Tris HCl 20 mM pH 8,4; KCl
50 mM); 0,2 mM de cada dNTP; MgCl2 5 mM; 1,5 U de Platinum® Taq DNA Polimerase
(Invitrogen); 10 ng de DNA; 5 pmol de cada iniciador; 4% de DMSO (dimetilsulfóxido); água
ultrapura (Milli-Q) esterilizada, para um volume final de 25 µL. A reação foi feita em um
termociclador “Gene Amp PCR System 2400” (Applied Biosystems), nas seguintes condições:
94ºC/2 min; 5 ciclos de 94ºC/1 min, 45ºC/1 min, 72ºC/1 min; 30 ciclos de 94ºC/30 s, 50ºC/1 min,
72ºC/4 min; extensão final a 72ºC/15 min. Uma alíquota de 5 µL do produto da PCR foi
analisada em gel de agarose 1%, utilizando como padrão de tamanho de DNA o marcador
molecular 100 pb (Invitrogen Life Technologies, São Paulo, Brasil). Os géis foram documentados
através do programa “Multi Analyst” do “Fluor-STM Multimager” (BioRad, Hercules,
Califórnia, E.U.A).
Tabela 3 – Iniciadores de reação que foram utilizados na amplificação de PCR
Iniciador Seqüência no sentido 5’-3’
MTF GCN GGY GGY GCN TAY GTN CC
MTR CCN CGD ATY TTN ACY TG
KS+ MGI GAR GCI HWI SMI ATG GAY CCI CAR CAI MG
KS- GGR TCI CCI ARI SWI GTI CCI GTI CCR TG
2.2.12 Produção de sideróforo em meio sólido
A produção de sideróforos foi verificada para as 150 linhagens. A análise de cromoazurol
S (CAS) ágar foi realizada conforme a seguir (SCHWIN; NEILANDS, 1987): 60,5 mg de CAS
41
foram dissolvidos em 50 ml de água destilada e misturada com 10 ml de ferro (FeCl3•6H2O 1
mM em HCl 10 mM). Sob agitação, esta solução foi vagarosamente adicionada a 72,9 mg de
HDTMA (hexadecyltrimethylammonium) dissolvido em 40 ml de água. Estas soluções foram
autoclavadas separadamente. Também foi autoclavado um meio de cultura deficiente em ferro
(MM9) de acordo com PAYNE (1994), modificado por SILVA-STENICO et al. (2005). O meio
era composto de (1 L): 0,3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl e 1,0 g de NH4Cl. Em 100 ml desta
solução foram adicionados 1,2 g de Tris e 18 g de agar, pH 5.6, completado para 1 L e
autoclavada. Esta solução foi suplementada com 30 ml de casaminoácido desferrado 10% (m/v)
(o ferro contaminante foi removido com 3% de 8-hidroxiquinolina em clorofórmio), manitol 2
g/L, 1 ml de MgCl2 1 M e 1 ml de CaCl2 100 mM. Estas soluções foram preparadas e filtradas em
filtro Millipore 0,22 µ. A solução de CAS foi adicionada ao meio MM9-ágar e as placas foram
inoculadas com linhagens de culturas estoques e incubadas a 28oC. A mudança de cor azul para
amarelo do meio CAS foi anotada. Toda a vidraria utilizada foi lavada com HCl 6 N para retirada
de ferro contaminante.
2.2.13 Análises de sideróforos – propriedades químicas
Para estas análises todos os isolados foram cultivados em meio líquido MM9. O
crescimento celular foi verificado pela densidade ótica a 600 nm (DO600) em espectrofotômetro
Perkin-Elmer. A bactéria foi proveniente de um inóculo padrão (100 µl de uma suspensão com
absorbância a 600 nm de 0,5) em frascos de 10 ml contendo 50 ml de meio MM9 e incubado a
28oC em shaker a 150 rpm. As culturas foram centrifugadas e os sobrenadantes utilizados para os
ensaios. Para detectar a análise funcional do sideróforo, dois testes foram realizados:
2.2.13.1 Análise pelo método de CSÁCKY
Essa análise identifica sideróforos do tipo hidroxamato (Csácky, 1948). Uma curva padrão
foi realizada utilizando hidroxilamina em concentrações de 10 a 400 µM. O sobrenadante (1 ml)
da cultura foi hidrolizado com 1 ml de H2SO4 6 N em digestor por 30 min. a 130oC. A solução foi
então tamponada adicionando 3 ml da solução de acetato de sódio 35%. Então, foi adicionado 1
ml da solução de ácido sulfanílico 1% seguido por 0,5 ml de solução de iodina 1,3%. Após 5
min., o excesso de iodina foi removido com 1 ml da solução de arsenito de sódio 2%. Um ml de
42
α-naftalamina 0,15% foi adicionado. A cor se forma entre 20 e 30 min. A absorbância foi lida a
526 nm.
2.2.13.2 Análise pelo método de ARNOW
Esta análise é destinada para sideróforos da classe catecol (ARNOW, 1937). Uma curva
padrão foi realizada utilizando ácido hidroxibenzóico em concentrações de 10 a 590 µM. Para 1
ml de sobrenadante ou solução de sideróforo, foi adicionado na seguinte ordem misturando após
cada adição: 1 ml de HCl 0,5 N, 1 ml de nitrito-molibdato 10% e 1 ml de NaOH 1 N. A cor é
estável por 1 h e a solução tem absorção máxima a 510 nm.
2.2.14 Extração dos metabólitos secundários
Um pré-inóculo foi preparado e inoculado em 300 ml de meio líquido para Actinomycete
Isolation Agar. Os isolados foram cultivados por 24 h e sob agitação a 28oC. Após as culturas
atingirem a fase exponencial de crescimento, 300 ml de cultura foram centrifugados e o
sobrenadante separado em 2 frações de 150 ml para a extração de compostos bioativos
extracelulares. Para cada fração foi adicionado um solvente: clorofórmio e acetato de etila na
mesma proporção, para se testar a melhor eficiência de separação dos compostos. A fase orgânica
foi coletada e evaporada até 2 ml. O meio líquido sem inóculo também foi extraído em acetato de
etila e clorofórmio para ser usado como controle. Estes extratos foram utilizados para atividade
antimicrobiana. A Figura 4 apresenta um esquema para extração e análises dos metabólitos
secundários.
43
Figura 4 – Esquema para extração e análises dos metabólitos secundários
2.2.15 Ensaios de bioatividade
Extratos orgânicos das culturas foram utilizados para o teste de bioatividade. Foram
utilizadas placas de Petri contendo linhagens selecionadas de bactérias, levedura e fungos
fitopatogênicos, da coleção de isolados do laboratório de Ecologia Molecular de Cianobactérias
(CENA-USP), entre eles: Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Micrococcus luteus,
Staphylococcus pasteuri, Bacillus cereus, Paracoccus sp. e Staphylococcus aureus, os fungos
Sclerotium rofsii e Rhizoctonia solani e a levedura Candida cruzeii. As bactérias foram
inoculadas em meio LB (Luria-Bertani) (BERTANI, 1951), os fungos em extrato de malte 3% e a
levedura em meio YEPD. Os testes consistiram em colocar discos de filtro de papel (6 mm φ)
esterilizados contendo 20 µL do extrato orgânico em placas inoculadas com os microrganismos
44
testes. As placas foram inoculadas por 24 h a 28oC ou 37oC para bactérias e levedura e por 7 dias
a 30oC para os fungos. Resultados positivos foram visualizados pelo aparecimento de zonas de
inibição de crescimento.
2.2.16 Espectrometria de massas
A fase orgânica foi separada e analisada em espectrometria de massas usando Q-TOF
(Micromass, Manchester, UK) híbrido de alta resolução (7.000) e alta precisão (5 ppm) equipado
com uma fonte de ionização por electrospray (ESI). As condições para ESI no modo positivo
foram as seguintes: gás de dessolvatação (nitrogênio) foi aquecido a 150ºC; o capilar foi mantido
a um potencial de 3.5 kV e a voltagem do cone foi de 25 kV. A fragmentação do peptídeo
(MS/MS) foi adquirida selecionando-se o íon com a MM alvo usando o analisador de massas
quadrupolo seguido de 20eV, dissociação de colisão induzida usando argônio na célula de colisão
do quadrupolo e análise de massas pelo TOF. Os extratos foram dissolvidos em uma mistura de
metanol:água (1:1 v/v). As amostras foram introduzidas na fonte a 5 µL/min com uma seringa.
2.2.17 Cromatografia em camada delgada (CCD)
A CCD foi realizada para avaliação analítica qualitativa dos componentes dos extratos
orgânicos, utilizando-se cromatoplacas de sílica GF254 em suporte de alumínio, da MERCK. O
solvente de eluição usado foi ácido acético:acetato de etila:n-propanol (0,5:25:15) (v/v).
Os extratos orgânicos obtidos no teste de bioatividade que apresentaram maior halo de
inibição foram aplicados nas cromatoplacas na quantidade de 10 µl, tendo sido aplicado o
controle (extrato do meio de cultura sem inóculo) como referência. As bandas foram identificadas
sob luz ultravioleta no comprimento de onda de 254 nm e 366 nm e o cálculo dos Rfs (fator de
retenção) segundo a seguinte equação:
Rf = Distância do centro da banda à linha de partida
Distância da frente do eluente à linha de partida
45
2.3 Resultados e Discussão
2.3.1 Caracterização química do solo
O clima na região Amazônica é quente e úmido com temperatura média entre 25°C e
35°C, a vegetação é formada pela floresta tropical e há grande predominância de terras
acidentadas e o solo apresenta características arenosas nas áreas mais altas e argila nas áreas mais
baixas. As terras pretas de índio, atualmente denominadas Terra Preta Antropogênica (TPA). Em
geral, assumem dimensões que variam entre 5 a mais de 300 hectares, corpos d’agua sobre
várzeas, em áreas adjacentes aos rios, em terraços elevados fora do nível das inundações, e em
áreas de terra firme (KERN et.al. 2003). Há uma grande variedade de solos, entre eles Ferralsols,
Podzols, Acrisols, Luvisols, Fluvisols, Nitisols, Cambisols e Arenosols, mas a maioria está
relacionada aos Ferralsols e Acrisols e, ocorrem em menos quantidade em Cambisols, Nitisols,
Podzols (KEM et.al.2003). A Tabela 4 apresenta as propriedades químicas dos solos TPA.
Tabela 4 - Características químicas de amostras de solos de TPA dos sítios de Lagoa Balbina 1
Áreas PH Matéria P 3 Ca 5 Mg 5 Al 5 H+Al 6 Soma CTC Sat.
Em CaCl21
Orgânica 2
K 4
Bases Total de Al 1:2,5 dag/dm3 ----- mg/dm3 ---- ------------------------- Cmolc/dm3 ------------ ---- % -----
Lagoa Balbina 1 1 4,7 55 17 0,6 54 8 2 98 62,6 160,6 32 4,6 50 15 0,6 38 5 4 88 43,6 131,6 83 3,6 25 34 0,1 3 1 19 166 4,1 170,1 824 4,0 47 102 0,6 5 2 19 150 7,6 157,6 71
Métodos utilizados pela empresa para a extração dos nutrientes do solo: (1) pH em Água pelo Método Potenciométrico; (2) Matéria Orgânica: Método Walkley-Black modificado por diferença de densidade óptica; (3) P: extrator Mehlich; (4) K e Na: Fotometria de Emissão; (5) Ca e Mg Trocável por Espectrometria de Absorção Atômica; (6) Acidez Potencial (H+Al) pelo Método Potenciométrico do SMP (Schmacker, Mclean, Pratt).
Os solos da região de Presidente Figueiredo caracterizam-se como solos Ferralsols,
Acrissolos de acordo com a classificação de FAO (FAO, 1988). A definição de Ferralsols se
encaixa com a dos Oxisolos, isto é, são solos Lateríticos, ou Latossolos (VIEIRA, 1988). Trata-se
de solos ácidos a fortemente ácidos e de boa drenagem apesar de muitas vezes serem bastante
argilosos. Nesses solos a iluviação é restringida pelo alto grau de estabilidade das argilas
46
(VIEIRA, 1988). Os Acrisols são solos fortemente lixiviados com acumulação de argilas em seu
horizonte com baixa capacidade de troca e de baixa saturação de bases (FAO, 2001).
2.3.2 Extração de DNA genômico
Foi selecionado um total de 150 isolados, sendo 50 isolados de cada profundidade. As
extrações de DNAs genômicos das culturas puras foram realizadas com sucesso usando o
protocolo descrito por Doyle e Doyle (1990). A concentração e a pureza desses DNAs foram
determinadas em espectrofotômetro. Em seguida, os DNAs totais foram diluídos para
padronização, para um total de 10 ng/µl de DNA.
2.3.3 Amplificação do gene 16S rRNA
Os DNAs totais foram amplificados por PCR com os oligonucleotídeos iniciadores do gene
ribossomal 16S rRNA para o Domínio Eubacteria fD1 e rD1. Os produtos de PCR de todos os
isolados foram purificados usando-se precipitação por isopropanol e então ressuspendidos em
água ultrapura esterilizada. Amplificações do gene 16S rRNA por PCR confirmaram a presença
de bactérias entre os isolados.
O DNA alvo (16S, 18S ou ITS) é amplificado usando iniciadores universais ou específicos
e os produtos resultantes são separados de maneira diferentes (WOESE; KANDLER; WHEELIS,
1990; KIRK et al., 2004). O gene 16S rRNA é universal para as bactérias, possui uma região bem
conservada, sendo um excelente marcador molecular, além de possuir um grande número de
seqüências depositadas (LUTON et al., 2002).
A amplificação de seqüências correspondentes ao gene ribossomal 16S rRNA produziu
uma banda única em torno de 1500 pb para todas as linhagens testadas (Figura 5).
47
B 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 M
1500 p
29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 M
58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 M
87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101102 103104105 106107 108109110111112113114115 M
116 117118 119 120 121122 123124 125 126 127128 129130 131 132133 134 135136 137138 139 140 141 142 143 M
Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 1% com produtos de amplificação (oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene ribossomal 16S rRNA). M) marcador molecular 100 pb; B) controle negativo (sem DNA). Os números acima das canaletas correspondem aos isolados indicados na Tabela 1 (Continua)
48
Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 1% com produtos de amplificação (oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene ribossomal 16S rRNA). M) marcador molecular 100 pb; B) controle negativo (sem DNA). Os números acima das canaletas correspondem aos isolados indicados na Tabela 1 (Conclusão)
2.3.4 Análise de restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA)
Posteriormente os produtos de PCR foram submetidos à técnica de restrição ARDRA (do
inglês “Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis”) das seqüências amplificadas do gene
16S rRNA, com o propósito de detectar a variabilidade genética entre os isolados de bactérias de
cada amostra de solo. De acordo com o padrão de clivagem obtido, foi possível observar de 2 a 4
fragmentos, e só os de tamanho acima de 100 pb foram considerados na presente análise. De
acordo com o padrão de clivagem utilizado desta enzima, foi possível observar polimorfismos
entre os isolados deste estudo.
Do total de 150 isolados analisados, todos amplificaram e apresentaram perfis de restrição
(Figura 6).
M 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 M
2072 pb
600 pb
100 pb13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 M
Continua
Figura 6 - Eletroforese em gel de agarose 1,7% com produtos de digestão enzimática com a endonuclease Taq I após a amplificação do gene 16S rRNA. M – marcador molecular 1Kb Ladder. Os números acima das caneletas correspondem aos isolados de TPA, conforme numeração da Tabela 1 (Continua)
49
M 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 M
70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 M
M
99 100 101 102 103 104 105 106107 108109 110 111 112 113 114115 116 117118 119 120 121122 123124 125
126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 M
Figura 6 - Eletroforese em gel de agarose 1,7% com produtos de digestão enzimática com a
endonuclease Taq I após a amplificação do gene 16S rRNA. M – marcador molecular 1Kb Ladder. Os números acima das caneletas correspondem aos isolados de TPA, conforme numeração da Tabela 1 (Conclusão)
Os dados obtidos a partir do ARDRA com a enzima de restrição (Figura 6) foram
combinados. A partir do perfil obtido através da digestão com a enzima Taq I, agruparam-se
esses isolados (Tabela 5).
50
Tabela 5 – Análise de polimorfismo do DNA genômico, através de enzima de restrição, nos isolados de bactérias de TPA (Continua)
No
Amostra
Grupo de isolados
1 BCM1 11, 12 2 BCM 20 17 3 BCM 32 * 4 BCM 41 * 5 BCM 59 48, 52, 53, 55, 66 6 BCM 60 * 7 BCM 99 72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 80, 81, 84, 88, 89, 92, 93, 95, 96, 97, 99,
100, 101, 102, 103, 104 8 BCM 2 * 9 BCM 5 6 10 BCM 9 3, 7 11 BCM 10 * 12 BCM 13 * 13 BCM 15 * 14 BCM 18 19, 21, 22, 34, 35, 36, 37, 38 15 BCM 24 * 16 BCM 26 27, 28, 30, 31 17 BCM 29 * 18 BCM 33 * 19 BCM 39 * 20 BCM 40 * 21 BCM 44 42, 43, 50 22 BCM 46 47, 49, 51, 54, 62 23 BCM 57 64 24 BCM 61 45, 56, 58, 63, 65, 67, 68 25 BCM 69 * 26 BCM 70 * 27 BCM 71 87 28 BCM 82 * 29 BCM 83 * 30 BCM 4 * 31 BCM 78 * 32 BCM 85 * 33 BCM 91 * 34 BCM 98 105, 106 35 BCM 107 112, 117, 118, 119, 120, 121, 124, 125, 115, 116 36 BCM 113 * 37 BCM 114 * 38 BCM 122 * 39 BCM 123 *
51
Tabela 5 – Análise de polimorfismo do DNA genômico, através de enzima de restrição, nos isolados de bactérias de TPA (Conclusão)
No
Amostra
Grupo de isolados
40 BCM 126 127, 128, 133 41 BCM 129 * 42 BCM 130 * 43 BCM 134 * 44 BCM 137 141 45 BCM 138 * 46 BCM 8 * 47 BCM 14 * 48 BCM 16 * 49 BCM 23 * 50 BCM 25 * 51 BCM 86 90 52 BCM 94 * 53 BCM 108 109, 110 54 BCM 111 * 55 BCM 139 131, 132, 140, 135, 136, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 56 BCM 142 * 57 BCM 149 150
* isolados que não se agruparam.
A técnica de ARDRA é um procedimento de alta resolução, baseada nos produtos de PCR,
capaz de produzir caracterizações genótipo-específicas, que podem ser usadas para identificar
amostras desconhecidas. O método não requer um conhecimento primário de dados da seqüência,
ou uma elaborada base de dados dos perfis e, por esta razão, é perfeitamente aplicável como
análise preliminar de material desconhecido (THÓRSSON; SVERRISSON; ANAMTHAWAT-
JÓNSSON, 2000).
A metodologia de ARDRA tem sido aplicada para o estudo da diversidade microbiana a
diferentes solos (CHELIUS; TRIPLETT, 2001). O valor deste método está na sua rapidez e
habilidade para avaliar diferenças entre grupos filogenéticos, efetuando assim análises em vários
níveis de classificação (JORGENSEN; CLUSTER, 1989).
Contudo, pela imensa diversidade genética e fenotípica das comunidades microbianas do
solo, ainda existe limitações na utilização de métodos que representem satisfatoriamente essas
comunidades, pois esses métodos fornecem somente um retrato parcial da diversidade
52
microbiana. É impossível avaliar a eficácia de cada método, o melhor é que se estudem as
populações microbianas nos mais diferentes níveis possíveis (KIRK et al., 2004).
2.3.5 Seqüenciamento do gene 16S rRNA
Após a análise de polimorfismo pelo ARDRA, cinqüenta e sete isolados foram
seqüenciados, sendo editadas as bases de baixa qualidade (<20) através dos programas
Phred/Phrap/Consed em sistema operacional Linux e então analisadas pelo BLASTn contra a
base de dados do NCBI. Os resultados indicaram a presença de diversos gêneros, conforme a
Tabela 6.
Tabela 6 - Identificação dos isolados através de seqüenciamento do gene 16S rRNA
(Continua)
No Amostra Espécie
Grupo de isolados
1 BCM1 Bacillus cereus 11, 12 2 BCM 20 Pseudomonas putida 17 3 BCM 32 Pseudomonas stutzeri * 4 BCM 41 Pseudomonas putida * 5 BCM 59 Pseudomonas veronii 48, 52, 53, 55, 66 6 BCM 60 Pseudomonas fluorescens * 7
BCM 99
Pseudomonas migulae
72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 80, 81, 84, 88, 89, 92, 93, 95, 96, 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104
8 BCM 2 Pseudomonas veronii * 9 BCM 5 Pseudomonas veronii 6 10 BCM 9 Bacillus megaterium 3, 7 11 BCM 10 Bacillus cereus * 12 BCM 13 Bacillus subtilis * 13 BCM 15 Arthrobacter nicotinovorans *
14 BCM 18 Pseudomonas veronii 19, 21, 22, 34, 35, 36, 37, 38 15 BCM 24 Bacillus circulans * 16 BCM 26 Arthrobacter nicotinovorans 27, 28, 30, 31 17 BCM 29 Pseudomonas veronii * 18 BCM 33 Pseudomonas veronii * 19 BCM 39 Pseudomonas veronii * 20 BCM 40 Arthrobacter nicotinovorans * 21 BCM 44 Arthrobacter nicotinovorans 42, 43, 50 22 BCM 46 Pseudomonas veronii 47, 49, 51, 54, 62 23 BCM 57 Pseudomonas veronii 64 24 BCM 61 Pseudomonas fluorescens 45, 56, 58, 63, 65, 67, 68
53
Tabela 6 - Identificação dos isolados através de seqüenciamento do gene 16S rRNA
(Conclusão)
No Amostra Espécie
Grupo de isolados 25 BCM 69 Pseudomonas poae * 26 BCM 70 Pseudomonas stutzeri * 27 CM 71 Bacillus thuringiensis 87 28 BCM 82 Janthinobacterium lividum * 29 BCM 83 Janthinobacterium sp. * 30 BCM 4 Bacillus cereus * 31 BCM 78 Pseudomonas poae * 32 BCM 85 Staphylococcus sp * 33 BCM 91 Pseudomonas poae * 34 BCM 98 Arthrobacter nicotinovorans 105, 106 35 BCM 107 Pseudomonas putida 112, 117, 118, 119, 120, 121, 124,
125, 115, 116 36 BCM 113 Arthrobacter nicotinovorans * 37 BCM 114 Bacillus subtilis * 38 BCM 122 Staphylococcus sp. * 39 BCM 123 Massilia timonae * 40 BCM 126 Pseudomonas putida 127, 128, 133 41 BCM 129 Bacillus subtilis * 42 BCM 130 Bacillus subtilis * 43 BCM 134 Bacillus thuringiensis * 44 BCM 137 Bacillus firmus 141 45 BCM 138 Bacillus subtilis * 46 BCM 8 Bacillus megaterium * 47 BCM 14 Bacillus megaterium * 48 BCM 16 Bacillus megaterium * 49 BCM 23 Pseudomonas putida * 50 BCM 25 Bacillus subtilis * 51 BCM 86 Arthrobacter sp. 90 52 BCM 94 Janthinobacterium lividum * 53 BCM 108 Arthrobacter sp 109, 110 54 BCM 111 Bacillus megaterium * 55 BCM 139 Arthrobacter nicotinovorans 131, 132, 140, 135, 136, 143, 144,
145, 146, 147, 148, 56 BCM 142 Arthrobacter nicotinovorans * 57 BCM 149 Massilia timonae 150
* isolados que não se agruparam.
Após o seqüênciamento foram observados vários isolados da mesma espécie. Com isso foi
necessário um novo agrupamento dos isolados, como mostra a Tabela 7.
54
Tabela 7 - Reagrupamento dos isolados após seqüenciamento, identificando as populações bacterianas encontradas em TPA. (Continua)
Amostra ID % No de acesso
pb e-value
Organismo
Grupo de isolados
1 100% AY224388.1 1.500 0.0 Bacillus cereus
11, 12, 10, 4
9 100% AJ717381.1 1.525 0.0
Bacillus megaterium.
3, 7, 8, 16, 111, 14
13 94% AB325585.1 1.396 0.0 Bacillus subtilis
114, 129, 130, 138, 25
24 99% DQ374636.1 1.530 0.0
Bacillus circulans
*
71
99% AE017355.1 1.542 0.0
Bacillus thuringiensis
87, 134
137 99% AY833571.1 1.486 0.0
Bacillus firmus
141
20 100% AE015451.1 1.518
0.0
Pseudomonas putida
17, 41, 107, 112, 117, 118, 119, 120, 121, 124, 125, 115, 116, 126, 127, 128, 133, 23
70 99% CP000304.1
1.501 0.0 Pseudomonas
stutzeri 32
2 99% AB056120.1 1.526
0.0 Pseudomonas
veronii
48, 52, 53, 55, 66, 5, 6, 18, 19, 21, 22, 34, 35, 36, 37, 38, 29, 33, 39, 46, 47, 49, 51, 54, 62, 57, 64, 59
60 99% DQ178234.1 1483 0.0
Pseudomonas fluorescens
61, 45, 56, 58, 63, 65, 67, 68
99 99% AF074383.1 1525
0.0 Pseudomonas
migulae
72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 80, 81, 84, 88, 89, 92, 93, 95, 96,97,100, 101, 102, 103, 104
69
98% AJ492829 1527 0.0 Pseudomonas poae 78, 91
55
Tabela 7 - Reagrupamento dos isolados após seqüenciamento, identificando as populações bacterianas encontradas em TPA. (Conclusão)
Amostra ID % No de acesso
pb e-value
Organismo
Grupo de isolados
15 99% AY833102.1 1437
0.0
Arthrobacter nicotinovorans
26, 27, 28, 30, 31, 40, 44, 42, 43, 50, 98, 105, 106, 113, 86, 90, 108, 109, 110, 139, 131, 132, 140, 135, 136, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 142
82 99% DQ473538.1 1520 0.0
Janthinobacterium lividum
94
83 95% AJ846273.1 1414 0.0
Janthinobacterium sp.
*
122 100% AB177644.1 1524 0.0
Staphylococcus sp
85
123 99% AY445911.1 1433 0.0 Massilia timonae
149, 150
* isolados que não se agruparam.
Os índices de similaridade encontrados nas seqüências do 16S rRNA dos diferentes isolados
variaram de 95 a 99%. Dos 150 isolados pôde-se diferenciar 17 grupos através dos resultados
obtidos pelo seqüenciamento (Tabela 7).
56
A Figura 7 apresenta a freqüência de espécies seqüenciadas isoladas de TPA.
Figura 7 – Freqüência de espécies seqüenciadas isoladas de TPA
1%
2%
2%
2%
2%
2%
20%
2% 2
% 2% 4
% 4%
5%18
% 6%
12%
14%
B. circulans B. firmus J. lividum P. stutzeriJanthinobacterium sp. Staphylococcus sp.
B. thuringiensis M. timoinae P. poae B. cereus B. subtilis B. megaterium P. fluorescens P. putida P. migulae P. veronii A. nicotinovorans
A Figura 8 apresenta a freqüência de gêneros isolados de TPA.
2% 3% 3%16%
55% 21%
Staphylococcus Janthinobacterium Massilia
ArthrobacterBacillus
Figura 8 – Freqüência de gêneros isolados de TPA
Pseudomonas
57
Um grande número de espécies foi identificado, entre elas estão em maior quantidade as
espécies pertencentes aos gêneros Pseudomonas, Arthrobacter e Bacillus. Seguindo em menor
quantidade as espécies pertencentes aos gêneros Staphylococcus, Janthinobacterium e Massilia.
Poucos trabalhos mostram a biodiversidade microbiana da Amazônia bem como o seu
potencial biotecnológico dos produtos do metabolismo microbiano e mostram menos ainda
antimicrobianos produzidos por isolados bacterianos desta região. A biodiversidade microbiana é
responsável pela produção de centenas de substâncias, como enzimas, antibióticos, etc. Alguns
gêneros encontrados nesse trabalho já foram citados como importantes no processo
biotecnológico, tais como, o gênero Pseudomonas o qual algumas espécies apresentam grande
importância para a indústria de alimentos, pois são microrganismos causadores de deterioração.
Também podem atuar no biocontrole e no crescimento vegetal, estudos demonstraram que muitos
isolados de rizobactérias são promotores do crescimento de plantas, sendo muito freqüente o uso
de isolados do grupo de Pseudomonas, para seleções de bactérias visando promover o
crescimento vegetal (FREITAS; PIZZINATTO, 1997; CHEN et al., 2000; CHANWAY et al.,
2000; BERGGREN et al., 2001; CATTELAN, 2001; RAMAMOORTHY , 2001).
Arthrobacter são conhecidas por produzirem enzimas líticas β-1,3 glucanase e proteases
capazes de lisar células de leveduras (FLEURI; SATO, 2005). As enzimas que lisam a parede
celular de leveduras têm aplicações biotecnológicas na preparação de protoplastos para
melhoramento genético de leveduras e no aproveitamento de massa celular de levedura para
extração de proteínas, enzimas e pigmentos. Outros trabalhos demonstram o uso da bactéria
Arthrobacter sp. no controle de Uromyces phaseoli (ferrugem do feijão), atuando como antibiose
de alta eficiência, podendo ser utilizada no controle biológico desta fitopatologia (CENTURION,
1990).
Bacillus são bactérias conhecidas como patogênicas ao homem, porém este
microrganismo tem grande influência na co-nodulação de raízes de plantas como foi observado
no trabalho de Halverson e Handelsman (1991), que obtiveram um incremento na nodulação de
soja entre 30 a 133% por Bradyrhizobium japonicum nativo, quando trataram as sementes
somente com B. cereus.
Outro gênero encontrado foi o Streptomyces, que tem grande importância biotecnológica,
pois são conhecidos produtores de antibióticos e ocupam um importante papel na biodegradação
58
de polímeros como lignina, quitina e amido (CRAWFORD, 1988; NOLAN; CROSS, 1988), além
de oxidar hidrocarbonetos poliaromáticos como o naftaleno (MESQUITA, 2004).
2.3.6 Processamento e análise filogenética das seqüências
Neste estudo foram amplificadas por PCR e seqüenciadas o gene 16S rRNA dos 17
isolados, sendo sete pertencentes à ordem Bacillares, um à ordem Actinomycelates, três à ordem
Burkoholderiales e seis à ordem Pseudomonadales.
As inferências filogenéticas entre as seqüências de 16S rRNA obtidas neste estudo foram
realizadas através da construçäo de uma árvore filogenética mostrada na figura 9. Outras
seqüências retiradas do banco de dados do GenBank também foram utilizadas nessa análise. A
árvore filogenética foi enraizada usando como grupo externo uma seqüência de nucleotídeos do
gene 16S rRNA da cianobactéria Acaryochloris sp. (AM710387.1). Na árvore filogenética
observa-se que as linhagens pertencentes à ordem Bacillares (gêneros de Bacillus e
Staphylococcus) formaram um agrupamento monofilético numa reamostragem de 100%. Um
clado contendo linhagens pertencentes à ordem Actinomycetales também foi formado numa
reamostragem de 100%. Neste clado observa-se que em 1000 árvores construídas, a linhagem
BCM15 agrupou-se em 100% das vezes com as demais linhagens Arthrobacter. Outros dois
agrupamentos monofiléticos foram formados entre as linhagens pertencentes à ordem
Burkholderiales (gêneros de Massilia, Janthinobacterium e Burkholderia) e à ordem
Pseudomonadales (gênero de Pseudomonas), ambos apresentando reamostragem de 100%.
59
Bacillus circulans (DQ374636.1)
Figura 9 – Árvore filogenética baseada na seqüência do gene 16S rRNA de isolados de TPA, construída pelo método de “ Neighbour Joining”. A árvore foi enraizada utilizando o gene 16S rRNA de Acaryochloris sp. como grupo extremo. Os números acima das linhas são valores de reamostragem obtidos com 1000 replicações
BCM 24100
Bacillus firmus BCM 137
69
Bacillus niacini (AB021194.1) Bacillus foraminis (AJ717382.1) Bacillus boroniphilus (AB198719.1)
85 100
BCM 09 Bacillus megaterium (AY739901.1)
946899
Bacillus licheniformis (DQ523501.1) BCM 13
79100
Bacillus thuringiensis (AY138290.1) BCM 01 Bacillus cereus (AY425946.1) Bacillus anthracis (AY138383.1) BCM 71
94 80
69
Staphylococcus pasteuri (AJ717376.1) BCM 122
100 100
66
Staphylococcus epidermidis (AJ717377.1) Streptomyces californicus (DQ462663.1)
Streptomyces pseudovenezuelae (DQ4626... Arthrobacter ilicis (X83407.1)
Arthrobacter nicotinovorans (X80743.1) Arthrobacter keyseri (AF256196.1) BCM 15
78
100100
100
100
100 54
BCM 123 Massilia sp. (AY177372.2)
94
Massilia aurea (AM231588.1) BCM 83
Janthinobacterium lividum (AY247410.1) BCM 82
Burkholderia cepacia (AB362772.1) BCM 20 Pseudomonas cf. monteilii (AF181576.1) Pseudomonas entomophila (AY907566.1)
BCM 70 Pseudomonas sp.(AM084028.1)
Pseudomonas oleovorans (D84018.1) Pseudomonas oryzihabitans(AM262973.1)
BCM 69 BCM 99 Pseudomonas triviali (AJ492831.1) Pseudomonas lurida (AJ581999.1) Pseudomonas libaniensis (AF057645.1) BCM 2 BC
99
100
100 50100
97100
53100
M 60 Acaryochloris sp.(AM710387.1)
100
100100
8881
70
91
0.02
60
2.3.7 Distribuição dos genes que codificam para NRPS e PKS
Dos 150 isolados, apenas os polimórficos apresentados pela técnica ARDRA e
confirm
ado pelo seqüenciamento foram testados quanto à presença dos genes que codificam para
NRPS e PKS, no total foram 17 isolados. A distribuição dos genes que codificam para NRPS e
PKS dos isolados foi testada através da amplificação por PCR, e estão apresentados na Tabela 8 .
A Figura 10 indica os produtos amplificados para o gene NRPS (A) e PKS (B)
NRPS (A)
PKS (B)
Figur
1 02 09 13 15 20 24 60 69 70 71 82 83 99 122 123 137 A
01 02 09 13 15 20 24 60 69 70 71 82 83 99 122 123 137 A
1000 pb
700 pb
B M 0
B M
a 10 - Produtos amplificados para o gene NRPS (A) e PKS (B). M) Marcador Ladder 100pb DNA;
B) Controle negativo (sem DNA); A) Controle positivo (Fischerella sp CENA 19).Os números acima das canaletas correspondem às amostras indicadas na Tabela 1
61
abela 8 - Identificação dos isolados que apresentaram os genes que codificam para NRPS e PKS T
Isolado Organismo Grupo
NRPS
PKS
1 acillus cereus 11, 12, 10, 4
+
+ B
9 Bacillus megaterium 3, 7, 8, 16, 111, 14 + +
s *
71 , 134
20 Pseudomonas putida 17, 41, 107, 112, 117, 118, 119, 120, 121,
24, 125, 115, 116, 126, 127, 128, 133,
+
+
70 seudomonas stutzeri − −
2 Pseudomonas veronii 52, 53, 55, 66, 2, 5, 6, 18, 19, 21, 22,
34, 35, 36, 37, 38, 29, 33, 39, 46, 47, 49,
60 Pseudomonas fluorescens , 68 − +
99 Pseudomonas migulae
, 84, 88, 89, 92, 93, 95, 96, 97, 99, 100, 101, 102,
69 Pseudomonas poae
−
−
15 Arthrobacter nicotinovorans 28, 30, 31, 40, 44, 42, 43, 50, 98,
105, 106, 113, 86, 90, 108, 109, 110, 139,
82 cterium lividum −
+
123 assilia timonae
49, 150
13 Bacillus subtilis
114, 129, 130, 138, 25
+
+
24 Bacillus circulan
−
+
Bacillus thuringiensis
87
−
−
137 Bacillus firmus 141 −
+
123
32
P
48,
51, 54, 62, 57, 64, 59
61, 45, 56, 58, 63, 65, 67
+
+
72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 80, 81
103, 104
+
+
78, 91
26, 27,
131, 132, 140, 135, 136, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 142
94
−
+
Janthinoba
83 Janthinobacterium sp
*
−
+
122 Staphylococcus sp 85 +
+
M 1 −
−
* isol os que não se agruparam. ad
62
Dos 150 isolados 61% apresentaram o gene que codifica para NRPS e 39% foram
negativo para esse gene, enquanto 94% dos isolados apresentaram o gene para PKS e 6% foram
negativo para esse gene.
A Figura 11 indica a diversidade das bactérias presentes em TPA em relação à presença
dos genes que codificam para as enzimas NRPS e PKS. Verificou-se que a maioria das bactérias
apresentou esses genes, sugerindo que a biossíntese desses compostos pode ser realizada pela via
não-ribossomal.
NRPS PKS
Figura 11 - Distribuição de genes que codificam para NRPS e PKS dos isolados de TPA. A) NRPS; B) PKS. Isolados de TPA que não apresentaram os genes ( ). Isolados de TPA que apresentaram os genes ( )
A via não-ribossomal está envolvida na síntese de um grande número de compostos
biologicamente ativos importantes que são produzidos por microrganismos. Os produtos dessas
complexas vias possuem várias propriedades farmacológicas, incluindo antibióticos, agentes
antitumorais e imunosupressores (JENKE-KODAMA et al., 2005).
Nas últimas décadas têm crescido a busca por metabólitos biologicamente ativos
produzidos por bactérias. A detecção de seqüência de genes envolvidos na síntese de metabólitos
secundários para avaliar o potencial biossintético tem sido descrita (SOSIO et al., 2000;
CHRISTIANSEN et al., 2001; ANDERSON et al., 2002; SIGMUND et al., 2003;) em diferentes
grupos taxonômicos. Essa abordagem pode representar uma alternativa na busca não somente em
94%
6%
positivo negativo
39%
61%
positivo negativo
63
grupos de microrganismos de interesse taxonômico, mas também em isolados selvagens com
elevado potencial metabólico.
2.3.8 Produção de sideróforos em meio sólido
O método mais comum para detecção de produtos de sideróforos por microrganismos é o
método denominado “universal”, desenvolvido por Schwyn e Neilans (1997). Essa análise utiliza
o cromoazurol S em complexo com Fe3+, onde a atuação do sideróforo está no seqüestro de ferro
complexado, sendo o ferro removido da molécula CAS-Fe, acarretando mudança da cor da
solução de azul para amarelo (reação positiva). A solução CAS pode ser usada para testes
quantitativos em meio líquido ou qualitativo em meio sólido (SCHWYN; NEILANDS, 1997).
A produção de sideróforos foi verificada cultivando todos os 150 isolados em meio de
cultura sem a presença de ferro. Os resultados mostraram que as linhagens analisadas foram
capazes de crescer nestas condições (livre de ferro), sem inibição do crescimento (Figura 12).
A
D B
C
Figura 12 – Cultivo dos isolados em meio contendo o complexo CAS, mostrando a formação de halos ao redor das colônias, indicando reação positiva para a produção de sideróforos. A) Arthrobacter nicotinovorans BCM 15; B) Pseudomonas putida BCM 20; C) Bacillus circulans BCM 24; D) Pseudomonas veronii BCM 2
Dos 150 isolados estudados, 145 apresentaram halos ao redor das colônias, os quais
indicam produção de sideróforos como descrito na Tabela 9. O tempo para a produção do halo foi
diferente para cada colônia, apresentando halos entre 5 a 10 dias depois de inoculados em meio
CAS. Esse teste foi repetido por 4 vezes seguidas.
64
Tabela 9 – Produção de sideróforos pelos isolados de TPA
(Continua)
Isolado Organismo Grupo
Sideróforos
1 Bacillus cereus 11, 12, 10, 4
−
9 Bacillus megaterium
3, 7, 8, 16, 111, 14
+
13 Bacillus subtilis
114, 129, 130, 138, 25
+
24 Bacillus circulans
+
71
Bacillus thuringiensis
87, 134
+
137 Bacillus firmus 141
+
20 Pseudomonas putida
17, 41, 107, 112, 117, 118, 119, 120, 121, 124, 125, 115, 116, 126, 127, 128, 133, 23
+
70 Pseudomonas stutzeri 32
+
2 Pseudomonas veronii
48, 52, 53, 55, 66, 2, 5, 6, 18, 19, 21, 22, 34, 35, 36, 37, 38, 29, 33, 39, 46, 47, 49, 51, 54, 62, 57, 64, 59
+
60 Pseudomonas fluorescens
61, 45, 56, 58, 63, 65, 67, 68
+
65
Tabela 9 – Produção de sideróforos pelos isolados de TPA (Conclusão )
Isolado Organismo Grupo
Sideróforos
99 Pseudomonas migulae
72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 80, 81, 84, 88, 89, 92, 93, 95, 96, 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104
+
69 Pseudomonas poae 78, 91
+
15 Arthrobacter nicotinovorans
26, 27, 28, 30, 31, 40, 44, 42, 43, 50, 98, 105, 106, 113, 86, 90, 108, 109, 110, 139, 131, 132, 140, 135, 136, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 142
+
82 Janthinobacterium lividum
94
+
83 Janthinobacterium sp
*
+
122 Staphylococcus sp
85
+
123 Massilia timonae
149, 150
+
* isolados que não se agruparam.
Dos 150 isolados estudados, 97% apresentaram halos ao redor das colônias, os quais
indicaram produção de sideróforos (Figura 13).
66
97%
3%
positivo negativo
Figura 13 - Produção de sideróforos (CAS-agar) de isolados de TPA. Isolados que não formaram halos
( ). Isolados de TPA que formaram halos ( )
A versatilidade dos sideróforos do ponto de vista biológico sugere seu uso potencial como
agentes farmacológicos e agroquímicos (GARRETT et al., 1991), com interesse na sua aplicação
em diferentes áreas.
Isso pode ser observado em diferentes trabalhos como o estudo realizado em 1997 por
Goodell e colaboradores, com uma revisão completa sobre o uso de sideróforos na biodegradação
da madeira e no branqueamento de polpa de papel. Esta observação representa um verdadeiro
ganho econômico e ambiental para a população mundial. Uma vez que sideróforos, na qualidade
de produtos naturais, serão facilmente degradados e não poluentes (GOODELL et al. 1997).
Atuando como catalisadores de reações de transferências de elétrons que irão eliminar radicais
livres, os causadores dos danos (TELFORD et al., 1994).
Rengel e colaboradores (1999) demonstraram o sucesso do uso de sideróforos como
biofertilizantes, visando aumentar a concentração de micronutrientes em grãos destinados ao
consumo humano, principalmente os mais importantes na cadeia alimentar: arroz, feijão e milho
(RENGEL; BATTEN; CROWLEY, 1999).
Estudo demonstra a aplicação de sideróforos no recobrimento de metais, visando
remediar o desgaste natural dos mesmos e aproveitar sua condição de quelantes de ocorrência
67
natural sendo, desta forma, úteis como agentes de preservação ambiental (HERNLEM; VANE;
SAYLES, 1999).
Devido à grande aplicabilidade destes quelantes naturais, existe um interesse em elucidar
o mecanismo de absorção de ferro mediado por sideróforos, buscando, desta forma, análogos
cada vez mais eficientes, e menos tóxicos, que permitam seu uso em larga escala
(ZINELABIDINE et al., 1993; MEYER; TROWITZSCH-KIENAST, 1997). Análogos sintéticos
de sideróforos têm sido usados para investigar não somente o próprio processo de transporte
biológico, mas também as propriedades estruturais e termodinâmicas destes extraordinários
ligantes.
2.3.9 Análise pelos métodos bioquímicos de Csácky e Arnow
O teste de Csácky foi usado para a detecção de sideróforos do tipo hidroxamato enquanto
que o teste de Arnow para a detecção de sideróforos do tipo catecol diretamente do sobrenadante
da cultura de células cultivadas em meio MM9 sem ferro. A concentração destas biomoléculas
sintetizadas em condições de baixo ferro é apresentada na Tabela 10.
Tabela 10 – Produção de sideróforos do tipo catecol e hidroxamato pelos isolados de TPA (Continua)
Amostra
Organismo
Grupo de isolados
µM Ac. Benzóico
(Catecol)
µM
hidroxilamina (Hidroxamato)
1 Bacillus cereus
11, 12, 10, 4
0,0
0,0
9 Bacillus megaterium
3, 7, 8, 16, 111, 14
40,5
21,4
13 Bacillus subtilis
114, 129, 130, 138, 25
0,0
6,9
24 Bacillus circulans
*
74,0
15,0
71
Bacillus thuringiensis
87, 134
19,7
0,0
137 Bacillus firmus 141
0,0
0,0
68
Tabela 10 – Produção de sideróforos do tipo catecol e hidroxamato pelos isolados de TPA (Conclusão)
20 Pseudomonas putida
17, 41, 107, 112, 117, 118, 119, 120, 121, 124, 125, 115, 116, 126, 127, 128, 133, 23
88,3
12,7
70 Pseudomonas stutzeri
32
0,0
62,8
2 Pseudomonas veronii
48, 52, 53, 55, 66, 2, 5, 6, 18, 19, 21, 22, 34, 35, 36, 37, 38, 29, 33, 39, 46, 47, 49, 51, 54, 62, 57, 64, 59
0,0
0,0
60 Pseudomonas fluorescens
61, 45, 56, 58, 63, 65, 67, 68
0,0
0,0
99
Pseudomonas migulae
72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 80, 81, 84, 88, 89, 92, 93, 95, 96, 97, 99, 100, 101,
0,0
21,7
69
Pseudomonas poae
78, 91
0,0
39,6
15 Arthrobacter nicotinovorans
26, 27, 28, 30, 31, 40, 44, 42, 43, 50, 98, 105, 106, 113, 86, 90, 108, 109, 110, 139, 131, 132, 140, 135, 136, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 142
35,2
0,0
82 Janthinobacterium lividum
94
0,0
32,3
83 Janthinobacterium sp.
0,0
0,0
122 Staphylococcus sp
85
0,0
0,0
123 Massilia timonae
149, 150
20,5
0,0
Pode-se observar que o isolado BCM 20 produziu sideróforos do tipo catecol numa elevada
quantidade em relação aos outros isolados, enquanto o isolado BCM 70 apresentou produção
elevada de sideróforo do tipo hidroxamato, sugerindo uma capacidade maior em produzir esse
metabólito.
69
2.3.10 Ensaio de Bioatividade
Nesse teste foram utilizados os extratos obtidos na extração de compostos utilizando os
solventes clorofórmio e acetato de etila. Esses extratos foram obtidos dos 17 isolados
polimórficos caracterizados pelo método ARDRA e identificados pelo seqüenciamento. Os
extratos foram testados quanto à capacidade de inibição pela formação de halo, contra 13
microrganismos testes.
A Figura 14 apresenta a extração dos metabólitos secundários das bactérias selecionadas com
diferentes solventes: Clorofórmio e Acetato de etila.
Fase orgânica
Fase aquosa
Figura 14 - Extração dos metabólitos secundários das bactérias selecionadas com diferentes solventes: clorofórmio e acetato de etila
Os extratos dos isolados com os diferentes solventes indicaram qualitativamente a
habilidade dos metabólitos extraídos de inibir o crescimento de várias espécies.
Na Figura 15 observou-se a capacidade do solvente clorofórmio de extrair os metabólitos
antimicrobianos. Acetato de etila é um bom solvente, dissolve um grande número de substâncias
tais como as gorduras, óleos e resinas e foi o solvente que apresentou melhor resultado no teste
de bioatividade.
70
A
B
Figura 15 - Teste de bioatividade do extrato do isolado BCM 20. A) Meio Actino extraído em clorofórmio (controle); B) Sobrenadante extraído em clorofórmio. Microrganismo teste = Staphylococcus aureus
Na Tabela 11 pôde-se observar maior halo de inibição dos extratos obtidos utilizando o
solvente acetato de etila dos seguintes isolados: BCM 15, BCM 20 e BCM 24. De acordo com
esse resultado esses 3 isolados foram selecionados para análise em Q-TOF para a caracterização
dos compostos. Esses resultados positivos incentivaram o estudo dos compostos químicos dos
respectivos extratos.
Tabela 11 – Formação de halo de inibição dos extratos demonstrando a ação antimicrobiana (Continua)
Halos (mm) (incluindo φ disco)
Bactérias
Extratos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Bacillus cereus BCM 01 AE
CL 00
00
00
00
00
0 0
00
0 7
0 9
0 0
0 0
0 0
0 0
Pseudomonas veronii BCM 02 AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
9 8
8 0
0 0
0 0
0 0
0 0
Bacillus sp BCM 09 AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
7 8
7 0
0 0
9 0
0 0
0 0
Bacillus subtilis BCM 13 AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
7 7
10 0
0 0
8 0
0 0
0 0
Arthrobacter sp., BCM 15 AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
8 8
10 8
0 0
10 0
0 0
0 0
Pseudomonas sp.BCM 20 AE CL
00
00
00
00
00
0 0
09
8 10
15 15
8 0
0 0
0 0
0 0
71
Tabela 11 – Formação de halo de inibição dos extratos demonstrando a ação antimicrobiana (Conclusão)
Halos (mm)
(incluindo φ disco) Bactérias
Extratos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Bacillus circulans BCM 24 AE
CL 00
00
00
00
00
0 0
08
9 10
12 10
0 0
0 0
0 0
0 0
P. fluorescens BCM 60 AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
0 0
0 7
0 0
0 0
0 0
0 0
Controle AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
P. poae BCM 69
AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
70 P. stutzeri BCM 70 AE CL
00
88
00
00
09
100
00
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
Bacillus thuringiensis BCM 71 AE CL
00
70
00
00
07
7 7
00
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
J. lividum BCM 82
AE CL
00
70
00
00
08
9 7
00
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
Janthinobacterium sp. BCM 83 AE CL
00
60
00
00
07
0 0
00
0 0
0 0
8 8
0 0
0 0
0 0
P. migulae BCM 99 AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
Staphylococcus sp. BCM 122 AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
Massilia timonae BCM 123 AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
Bacillus firmus BCM 137 AE CL
00
00
00
00
00
0 0
00
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
1-Bacillus subtilis, 2- Salmonella typhimurium, 3- Rhizoctonia solani, 4 - Sclerotium rolfsii, 5 - Candida cruzeii, 6 - Staphylococcus pasteuri , 7- Bacillus cereus, 8 - Paracoccus sp ,9 - Staphylococcus aureus, 10- Micrococcus luteus, 11 - Escherichia coli, 12 -Rhizobium cn 01, 13 -Rhizobium 5080.
Siglas = CL (clorofórmio); AE (acetato de etila).
2.3.11 Cromatografia em camada delgada
Os extratos dos isolados BCM 15, BCM 20 e BCM 24 que apresentaram maior halo de
inibição, extraídos com acetato de etila, foram submetidos à CCD na tentativa de otimização na
separação dos compostos presentes (Figura 16). Na técnica de CCD pôde-se constatar a presença
no extrato de BCM 20 a presença de 2 “spots”; diferentes do extrato controle (meio de cultura
extraído em acetato de etila). Os “spots” foram visíveis sob lâmpada UV nos comprimentos de
72
onde a 254 nm. Os “spots” dos respectivos extratos foram visualizados e suas distâncias de
migração calculadas (Tabela 12).
1 2 3 4 5
0.86
0.78
0.67
1
Figura 16 - CCD dos extratos de BCM 15, BCM 20, BCM 24, BCM 82. 1) Meio de cultivo extraído em acetato de etila (controle); 2) Extrato de BCM 15; 3) Extrato de BCM 24; 4) Extrato de BCM 20; 5) Extrato de BCM 82. Solvente de eluição: ácido acético:acetato de etila:n-propanol (0,5:25:15) (v/v). Comprimento de onda = 254 nm. Imagem ao lado: BCM 20 com os respectivos “spots” (ACD/ChemSketch Freeware v.10.02).
Tabela 12 - Rfs das frações dos extratos visualizadas sob lâmpada UV com dois comprimentos de onda 254/366 nm.
Extratos Rf 1 Rf 2 Rf 3
Controle 0,67
BCM 15 0,67 0,78
BCM 24 0,67
BCM 20 0,67 0,78 0,86
BCM 82 0,67
73
2.3.12 Espectrometria de massas
Os espectros obtidos em Q-TOF indicaram vários compostos. Esta caracterização
molecular é fundamental no entendimento da bioprospecção de genes funcionais associados à
produção de compostos bioativos.
Os espectros de massas dos isolados BCM 15, BCM 20 e BCM 24, os quais apresentaram
resultados positivos nos testes anteriores foram obtidos por inserção direta do extrato no
equipamento. O espectro foi obtido na faixa de 100 a 2000 Da (Figura 16 A e B) e apresentaram
os íons moleculares, tais como: m/z 403, 469, 506, 552, 619, 815 e 861. A presença destes
compostos não é observada no controle (meio de cultivo extraído em acetato de etila). Para a
elucidação estrutural destas moléculas, posterior fragmentação em MS/MS foi realizada.
A identificação do metabólito presente nos extratos foi feita por ESI através da comparação
de suas massas com dados de um dicionário químico de compostos (CHEMICAL
DICTIONARY, 1997), o qual contém informações sobre substâncias químicas. Através desta
busca pôde-se encontrar um metabólito conhecido por fenazina, produzido pela bactéria
Pseudomonas putida. A Figura 17 apresenta o espectro dos extratos dos isolados BCM 15, BCM
20 e BCM 24.
74
A
B
Figura 17 - Espectros de electrospray (ESI) de extrato de BCM 15, BCM 20 e BCM 24 em modo positivo. A) Meio Actino extraído em acetato de etila (controle); B) Extrato de BCM 15 em acetato de etila. C) Extrato de BCM 20 em acetato de etila. D) Extrato de BCM 24 em acetato de etila. (Continua)
75
C fenazina-ácido carboxílico
Fosfodecina Bulgecina
D D
Figura 17 - Espectros de electrospray (ESI) de extrato de BCM 15, BCM 20 e BCM 24 em modo positivo.
A) Meio Actino extraído em acetato de etila (controle); B) Extrato de BCM 15 em acetato de etila. C) Extrato de BCM 20 em acetato de etila. D) Extrato de BCM 24 em acetato de etila. (Conclusão)
76
Após a obtenção dos espectros foi realizada a fragmentação para a elucidação estrutural
destas moléculas. Apenas o composto fenazina produzido por P. putida BCM 20 foi confirmado
pela fragmentação (Figura 18).
0
100
%
lu20_cid01 23 (0.460) Cm (4:41)241.11
130.06
169.07157.06198.07
l 20 135 (2 651) C (82 137)
Figura 18 - Fragmentação em MS/MS do composto fenazina de m/z 241
Depois de obtido o espectro com a fragmentação do composto, buscou-se em literaturas
específicas a estrutura do composto fenazina. A estrutura pode ser observada de acordo com a
Figura 18.
N
N
CO2H
H
H
OH Figura 19 – Estrutura química da 6-hidroxifenazina-1-ácido carboxílico
As pesquisas sobre a biossíntese da fenazina nas últimas décadas têm sido principalmente
sobre as espécies do gênero Pseudomonas. As recentes descobertas das vias biossintéticas em
bactérias proporcionam oportunidades para explorar e obter uma maior compreensão sobre a
77
evolução biossintética da fenazina assim como os recursos genéticos para exploração
biotecnológica capazes de produzir novas fenazinas de potencial no controle biológico, na
indústria e em aplicações farmacêuticas. Muitas questões ainda precisam ser entendidas sobre o
papel fisiológico da fenazina no seu ambiente natural. Um progresso considerável tem sido
realizado para revelar a complexa regulação de genes que influencia a síntese da fenaziana
particularmente em Pseudomonas (MAVRODI; BLANKENFELDT; THOMASHOW, 2006)
Em relação ao controle biológico segundo Mavrodi (2006) existe uma necessidade de
esclarecer se os fatores que influenciam a síntese de fenazina in vitro são funcionalmente
similares in situ, de como a estrutura da fenazina afeta as funções e se as falhas no controle
biológico que dependem da fenazina são resultados de uma síntese inadequada ou interferência
da atividade do antibiótico devido às condições desfavoráveis do solo.
De fato, estudos relataram a importância de várias Pseudomonas spp. fluorescens no
controle biológico como produtores de sinais N-acil-homoserinas-lactonas (N-acil-HSL) que
regulam genes, que por sua vez, codificam produtos envolvidos na supressão de patógenos. Esses
sinais regulam a expressão da amplitude de várias características bacterianas envolvida nas
interações entre microrganismos e hospedeiro-microrganismo. Todavia, para bactérias
patogênicas, pouco é conhecido a respeito da regulação do gene mediado por N-acil-HSL em
bactérias do controle biológico. O papel do N-acil-HSL é considerado na regulação do antibiótico
fenazina, no controle biológico por Pseudomonas spp. fluorescens (PIERSON, 1998).
Recentes progressos na compreensão do papel da fenazina no contexto ecológico de
comunidades microbianas onde estas são produzidas têm revelado o seu envolvimento em
processos de formação de biofilme. Essas áreas de pesquisas estão em expansão e sem dúvida
aumentará a compreensão de como esses compostos contribuem para sua sobrevivência nos
habitats em que ocupam.
78
3 CONCLUSÕES
Foram isoladas 150 bactérias, estas classificadas em 6 gêneros diferentes. Concluindo-se que os
solos de TPA proporcionam condições favoráveis para alguns gêneros específicos.
Com base nos resultados apresentados pode-se concluir que:
• A bioprospecção de três pontos de profundidade distintos (10, 30 e 50 cm) de solo de TPA
mostrou uma diversidade relativamente baixa de isolados identificados. O cultivo de
microrganismos ficou restrito à profundidade do solo, quanto mais próximo da superfície,
maior foi à diversidade bacteriana.
• De todos os isolados estudados, 97% apresentaram produção de sideróforos, sugerindo que
a maioria dos microrganismos deste solo tem um potencial para produzir uma diversidade
de metabólitos secundários com várias aplicações em biotecnologia, como é o caso de
muitos sideróforos.
• Os genes que codificam para as enzimas NRPS e PKS aparecem em 13 espécies
seqüenciadas.
• Mais de 70% das bactérias seqüenciadas inibiram o crescimento de bactérias testes, como as
espécies de Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Bacillus, Paracoccus e
Micrococcus, sendo estas potenciais patógenas, causadoras de doenças em humanos e
animais, observados pelos testes de bioatividade.
• Pseudomonas putida BCM 20 é a bactéria que apresenta um grande potencial de inibição
contra as bactérias patogênicas testadas.
• O espectro de Q-TOF-MS/MS identificou um composto antimicrobiano produzido pela
Pseudomonas putida BCM 20, denominado de fenazina.
A detecção dos genes NRPS e PKS nestes isolados sugere a produção de compostos
bioativos pela via não-ribossomal e a técnica molecular combinada com a bioquímica mostrou ser
útil para a busca de metabólitos secundários bioativos.
79
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