universidade de sÃo paulo maria carolina ......de bauru da universidade de são paulo: alexandre ,...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE BAURU

MARIA CAROLINA MARTINS MUSSI

Análise da atividade antimicrobiana dos óleos de co paíba

(Copaifera officinalis) e de melaleuca ( Melaleuca alternifolia) sobre

Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis:

determinação das concentrações inibitórias e bacter icidas mínimas

e efeito de concentrações subinibitórias sobre a ag regação

BAURU

2011

MARIA CAROLINA MARTINS MUSSI

Análise da atividade antimicrobiana dos óleos de co paíba

(Copaifera officinalis) e de melaleuca ( Melaleuca alternifolia) sobre

Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis:

determinação das concentrações inibitórias e bacter icidas mínimas

e efeito de concentrações subinibitórias sobre a ag regação

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas Aplicadas, na área de concentração Patologia Bucal.

Orientador: Prof. Dr. Luís Antônio de Assis Taveira

Versão corrigida

BAURU

2011

Nota: A versão original desta dissertação encontra-se disponível no Serviço de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Bauru - FOB/USP.

Mussi, Maria Carolina Martins M976a Análise da atividade antimicrobiana dos óleos de copaíba

(Copaifera officinalis) e de melaleuca (Melaleuca alternifolia) sobre Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis: determinação das concentrações inibitórias e bactericidas mínimas e efeito de concentrações subinibitórias sobre a agregação / Maria Carolina Martins Mussi. – Bauru, 2011.

122 p. : il. ; 31cm.

Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Odontologia de Bauru. Universidade de São Paulo.

Orientador: Prof. Dr. Luís Antônio de Assis Taveira

Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta dissertação, por processos fotocopiadores e outros meios eletrônicos.

Assinatura:

Data:

FOLHA DE APROVAÇÃO

O Último Discurso

“Desculpem, mas não quero ser um imperador, não é esse o meu

ofício. Eu não quero conquistar e nem governar ninguém. Gostaria de

ajudar a todos sempre que possível, judeus, gentios, negros e brancos.

Todos nós queremos ajudar uns aos outros, os seres humanos são

assim. Desejamos viver para a felicidade do próximo, não para o seu

sofrimento. Não queremos odiar ou desprezar uns aos outros. Nesse

mundo há lugar para todos, a terra é boa e rica e pode prover a todos.

O caminho da vida pode ser livre e belo, mas nós nos perdemos no

caminho. A ganância envenenou a alma do homem, criou uma barreira

de ódio no mundo e nos guiou no caminho da miséria e derramamento de

sangue. Nós desenvolvemos a velocidade, mas nos sentimos enclausurados

dentro dela.

Máquinas, que produzem abundância, tem-nos deixado em penúria.

Os nossos conhecimentos fizeram-nos céticos; nossa inteligência,

empedernidos e cruéis. Pensamos muito e sentimos muito pouco. Mais do

que máquinas, precisamos de humanidade. Mais do que inteligência,

precisamos de bondade e ternura. Sem essas virtudes a vida será de

violência e tudo será perdido.

A aviação e o rádio deixaram-nos mais próximos, a própria

natureza dessas invenções clama pela bondade do homem, clama pela

fraternidade universal e pela união de todos nós...”

Charles Chaplin

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho aos meus pais, César e Neusa, à minha irmã

Juliana, ao meu namorado, Fábio, aos meus familiares e aos meus amigos

que me apoiaram durante a realização deste sonho.

"...Ter saudade até que é bom

é melhor que caminhar vazio.

A esperança é um dom que eu tenho em mim..."

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, César e Neusa, por me apoiarem em minhas

decisões, por estarem sempre presente e fazerem a distância se tornar

insignificante diante do amor que sinto por eles. Vocês são pra mim

exemplos de determinação e postura perante a vida e me fazem ver que

não importa o tamanho dos nossos problemas quando temos uns aos

outros. Amo muito vocês.

À minha irmã, Juliana, por me fazer sorrir quando tive vontade de

chorar, por poder compartilhar meus sonhos e segredos, por pensar tão

diferente de mim e desse modo, me ensinar tanto, por apesar de não

aparentar, ser a menina mais doce que já vi. Te amo muito Ju e sempre

estaremos juntas.

Ao meu irmão Gabriel, que tanto irritei com minha preguiça, mas

que me faz tão feliz pela sua presença e conversas. Por me levar ao

cinema simplesmente para ficarmos juntos conversando e passando o

tempo. Você é muito importante pra mim. Amo você.

Ao meu amor, Fábio, por me apoiar e incentivar a brigar por meus

sonhos. Por me fazer a enxergar a vida com menos seriedade, me ensinar

a dar menos valor aos problemas pequenos, por me ajudar a encontrar

respostas paras minhas inúmeras perguntas e me incentivar diante de

minhas curiosidades. Obrigada por estar sempre por perto e por todas as

noites me fazer dormir melhor após longas conversas. Amo muito você e

espero tê-lo sempre ao meu lado.

Ao meu cunhado Diogo, à Renata e à pequena Sarah, por todo

carinho com que me tratam. À minha sogra Adla Maria Martins (in

memoriam) por ser a pessoa mais gentil e generosa que tive a

oportunidade de conhecer. Você faz falta para todos nós, mas foi uma

honra poder ter convivido com você por todos esses anos.

Aos meus tios, tias, primos, primas e avós por sempre estarem por

perto mesmo distantes. Em especial ao meu tio Roberto à minha tia

Cristina, por sua imensa alegria e companheirismo, à Maiara por nos

abençoar com o querido Cauã e a minha avó, Dona Nena, pelo carinho e

diversão que me proporciona. Amo muito todos vocês e sei me apoiarão

sempre.

Aos meus tios, assim os considero, Paulo e Made, por estarem

sempre torcendo por mim e demonstrando inestimável afeto, amizade e

carinho por toda minha família.

À minha grande companheira, Fer Pigatti, pela cumplicidade,

carinho, lealdade, honestidade e amizade que destinou a mim. Por sempre

que me sentia desanimada diante de uma maldade me oferecia a

esperança. Sempre soube que você era uma pessoa iluminada, mas depois

que morei com você tive ainda mais certeza disso. Muito obrigada pela

companhia e paciência com que ouvia meus medos e por estar sempre ao

meu lado quando precisei. E como Vinicius de Moraes menciona em uma

de suas poesias: “A gente não faz amigos, reconhece-os”.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Luís Antônio de Assis Taveira, por

todo o tempo destinado a mim, pelas palavras carinhosas vindas em

momentos propícios e por todos os ensinamentos durante esses anos.

Agradeço pela oportunidade e por toda sua atenção. Admiro-o pelo seu

comportamento perante aos seus alunos e colegas de trabalho,

mostrando-se sempre disponível a ajudar a todos.

A Profa. Dra. Márcia Pinto Alves Mayer, por ter aberto as portas de

seu laboratório e ter me tratado com imenso carinho e atenção. Agradeço

por todos seus ensinamentos e disponibilidade. Levo dessa convivência de

apenas alguns meses uma imensa gratidão e uma admiração enorme por

sua dedicação aos seus alunos e pela pesquisa. Muito obrigada por tudo.

A todo pessoal do laboratório 110 do ICBII. Adriana, Dione, Ellen,

Erickson, Erika, Gláucia, João, Lucas, Lili, Maike, Talyta, Silvia, Pâmela e

Priscila por me acolherem tão bem e me tratarem como parte do grupo.

Muito obrigado pelo auxílio disponibilizado e pelo carinho. Ao Léo, pelas

aulas de matemática, pela paciência e ajuda imensurável na confecção do

meu trabalho. Sentirei saudade de todos. Agradeço também à Profa. Dra.

Maria Regina Lorenzetti Simionato por disponibilizar seu laboratório

quando foi preciso.

Aos professores da disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de

Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo, Profa. Dra. Denise

Tostes Oliveira, Prof. Dr. Luís Antônio de Assis Taveira e Profa. Dra.

Vanessa Soares Lara pelos ensinamentos e atenção voltados aos alunos,

contribuindo para nosso engrandecimento e ao Prof. Dr. Alberto

Consolaro.

À Cris, secretária do departamento de Patologia Bucal, por sua

alegria, disponibilidade e bom humor indiscutíveis e por todo carinho e

atenção dirigidos a todos, sem distinção.

À Fatiminha, técnica do laboratório de Patologia Bucal, por sua

eficiência e convívio. Ao André, técnico do laboratório de Microbiologia,

pela ajuda e materiais cedidos. À Marilza, à Carla e “Seu” Carlos pela

convivência agradável.

Ao Anderson, funcionário do setor de compras da Faculdade de

Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo, pela imensa

paciência e competência, fazendo sempre o possível e o impossível para

adiantar os materiais. Muito obrigada.

Ao Prof. Dr. João Adolfo Costa Hanemann, pelo exemplo de

seriedade e comprometimento com os alunos. Vejo em você muitas

qualidades das quais almejo alcançar. Muito obrigada por estar sempre

disponível para ouvir minhas dúvidas, agonias e vitórias. Admiro-o como

professor e ser humano.

Ao Prof. Dr. Alessandro Antônio Costa Pereira, pelos ensinamentos

na área e por despertar em mim o amor pela Patologia.

Ao Prof. Dr. Heitor Marques Honório e à Profa. Dra. Daniela Rios

pela amizade, conselhos e ensinamentos.

Aos queridos amigos, Ana Regina, pelos conselhos e carinho; Dryka,

pela coragem e determinação; Heliton, pela alegria e bom humor

inestimáveis, Cris e Karen. A vocês agradeço por todos os momentos de

alegria e tristeza divididos. Obrigada por estarem ao meu lado sempre

que precisei, me dando força para seguir em frente. O curso deste

caminho tornou-se muito mais leve por saber que podia contar com

vocês.

À Priscila, minha companheira e amiga, pelos inúmeros

ensinamentos. Admiro sua coragem de enfrentar os problemas e, mesmo

assim, cultivar a alma de uma menina meiga e capaz de amar, de

maneira ingênua e simples, quem cruze o seu caminho. Muito obrigada

pelas noites de conversa e filmes. Sinto saudade.

À Carol Menezes, pelo carinho, atenção, educação e bons momentos.

À Elo, Natália, Mariana pela alegria e honestidade que vejo em

vocês. Apesar do pouco tempo de convívio tenho muito carinho por todas.

Ao Aroldo (in memoriam), que desde a graduação, foi um exemplo

de integridade, caráter e dedicação a ser seguido.

À Bruna e à Taísa Vilardi pela convivência da qual tirei lições

valiosas.

Aos demais colegas de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia

de Bauru da Universidade de São Paulo: Alexandre, Carolina Goulart,

Carine, Bruno, Diego Maurício, Érika, Kellen, Pati, Simone, Sylvie e

Taiane pela convivência e trocas de experiências desses dois anos.

Aos alunos da XLVIII turma de Odontologia da Universidade de São

Paulo, pela consideração e carinho com que me trataram durante o

desenvolvimento do Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE).

À Ana, ao Bruno e à Celina, que são amigos que já fazem parte da

minha família e mesmo estando longe sei que posso contar com vocês.

Amo muito vocês e sinto muita saudade de nossas conversas. Aos amigos

de Alfenas: Bel, Carioca, Fregnan, Let´s, Moi, Nadine, Talita, Tufo,

Vinição, Lynus, Hermano e Diogo, por me fazerem ficar ansiosa para

revê-los todo fim de ano e me proporcionarem momentos de muita

alegria. Sinto saudade de todos os integrantes do distinto e seleto grupo

Alfêmeas.

À minha amiga, Renata Lílian, ou se preferir, vó Rena, por todo

tempo em que moramos juntas, por sempre se mostrar preocupada em

agradar a todos, ser extremamente carinhosa com as pessoas e sempre

mostrar muita pureza, acreditando em tudo o que lhe dizem. Sinto muita

saudade amiga.

À Dai, Juli, Thiago e ao novo integrante, Leonardo, pela amizade de

longa data e os momentos felizes e inesquecíveis.

A todos que participaram da confecção do trabalho. Sem vocês a

realização desse sonho seria impossível.

AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS

À Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São

Paulo, na pessoa do Prof. Dr. José Carlos Pereira, diretor desta

instituição.

À comissão de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de

Bauru da Universidade de São Paulo, na pessoa do Prof. Dr. Paulo Cásar

Rodrigues Conti.

À Profa. Dra. Denise Tostes Oliveira, coordenadora do Programa de

Pós-Graduação em Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia de

Bauru da Universidade de São Paulo.

Ao Departamento de Microbiologia Oral do Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade de São Paulo pela cedência de materiais e

aparelhos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pela bolsa de Mestrado concedida.

Aos funcionários da Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de

Bauru da Universidade de São Paulo, pela disponibilidade e eficiência.

Aos funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de

Bauru e do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São

Paulo.

“E os saberes sobre as plantas, que curam, se consolidariam como

precursores das ciências farmacêuticas sob novas nomenclaturas

e com outras nacionalidades. Os saberes dos brasilíndios foram

silenciados enquanto cientistas estrangeiros extraíam o princípio

ativo das plantas brasileiras...”

(Marques, 1999)

RESUMO

A cavidade bucal é um habitat microbiano complexo que apresenta mais de 500 espécies bacterianas como componentes da microbiota. A saúde periodontal está estabelecida quando há equilíbrio entre os microrganismos patogênicos e o hospedeiro. O digluconato de clorexidina é um dos antimicrobianos bucais mais utilizados, no entanto, essa substância tem sido associada a alguns efeitos colaterais indesejáveis. Os óleos de copaíba e de melaleuca tem sido estudados como importantes fitoterápicos, devido aos seus diversos efeitos, entre eles ação antibacteriana. Partindo-se do princípio de que o óleo copaíba e de melaleuca possuem atividade antimicrobiana e de que não há dados suficientes na literatura utilizando esses fitoterápicos sobre Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum, foram preparados testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) das bactérias Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586) e Porphyromonas gingivalis (ATCC 3327) frente ao digluconato de clorexidina e aos óleos provindos de Copaifera officinalis e de Melaleuca alternifolia. Realizaram-se ainda testes para determinação de Concentração Subinibitória (CS) e ensaios para determinar a capacidade de autoagregação e coagregação dessas bactérias expostas às concentrações subinibitórias das soluções testadas. Como controles foram utilizados apenas meio de cultura e meio de cultura acrescido de Tween 80. Todos os óleos utilizados tiveram sua composição analisada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. O óleo de melaleuca, após identificação de sua composição, apresentou, respectivamente, os seguintes constituintes em maiores concentrações: terpin-4-ol, γ-terpineno, α-terpineno, terpinoleno e 1,8-cineol. O óleo de copaíba apresentou como principais constituintes, respectivamente, trans-cariofileno, germacreno B, α-humuleno, germacreno D e α-copaeno. Os resultados obtidos como CIM para F.nucleatum foram semelhantes à CBM em todas as soluções testadas. Para a bactéria P.gingivalis, todas as soluções testadas inibiram o crescimento bacteriano, contudo, os resultados obtidos durante a determinação da CBM demonstraram que o óleo de copaíba foi bacteriostático. Todas as soluções testadas inibiram o processo de autoagregação e apenas o óleo de copaíba foi eficiente na inibição do processo de coagregação entre F.nucleatum e P.gingivalis. Esses dados sugerem que as três soluções testadas apresentam relevantes mudanças no desenvolvimento normal de P.gingivalis e F.nucleatum, bem como influenciam no processo de autoagregação de F.nucleatum. O óleo de copaíba demonstrou ter uma notável propriedade de inibir o processo de coagregação entre as bactérias testadas neste estudo. Palavras-chave: Óleos vegetais. Fitoterapia. Fusobacterium nucleatum. Porphyromonas gingivalis.

ABSTRACT

Antimicrobial activity of copaiba ( Copaifera officinalis) and melaleuca (Melaleuca alternifolia) oils on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium

nucleatum: determination of minimum inhibitory and bacterici dal concentrations and subinibitory effect on the aggr egation

The oral cavity is a complex microbial habitat that has more than 500 bacterial

species as components of the microbiota. Periodontal health is established when there is equilibrium between pathogens and host. The chlorhexidine digluconate is one of the most commonly used oral antibiotics, however, this substance has been associated with some undesirable side effects. Copaiba and melaleuca oils have been studied as important herbal medicines because of their effects, including antibacterial action. Based on the principle that the copaiba oil and tea tree have an antimicrobial activity and that is no sufficient data in the literature using these herbal medicines against Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum, Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) tests of Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586) and Porphyromonas gingivalis (ATCC 3327) related to chlorhexidine digluconate and oils coming from Copaifera officinalis and Melaleuca alternifolia, were prepared. Assays were performed to determine the subinibitory concentration and the capacity of those bacteria to autoaggregation and coaggregation when exposed to subinibitory concentrations, previously tested. Medium and medium added Tween 80 were used as a control. All oils used had their composition analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. The tea tree oil mainly chemical compounds were identified as terpin-4-ol, γ-terpinen, α-terpinen, terpinolene and 1,8-cineole while copaiba oil presented as its main constituents trans-caryophyllene, germacrene B, α-humulene, germacrene D and α-copaene. The MIC results for F.nucleatum were similar to the CBM data in all solutions. For the bacterium P. gingivalis, all solutions tested inhibited bacterial growth, however, the results obtained during the determination of CBM showed that the copaiba oil was bacteriostatic. All solutions tested inhibited the autoaggregation process but only copaiba oil was effective in inhibiting the coaggregation between F.nucleatum and P. gingivalis. These data suggest that all the solutions tested in this study have relevant changes in the normal development of P.gingivalis and F.nucleatum as well in the influence of the autoaggregation process of F.nucleatum yet Copaiba oil also demonstrated to have remarkable properties to change coaggregation between the bacteria used in this study. Keywords: Plants oils. Phytotherapy. Fusobacterium nucleatum. Porphyromonas gingivalis.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Tubo de ensaio contendo água acrescida de óleo de copaíba a 100 µL/mL............................................................................ 59

Figura 2 - Soluções de estoque de óleos de copaíba, melaleuca e de digluconato de clorexidina ............................................................... 61

Figura 3 - Placa de ágar demostrando a distribuição das gotas (10 µL) dos inóculos, onde o amarelo representa Fusobacterium nucleatum e o verde Porphyromonas gingivalis. A seta foi utilizada para a identificação das bactérias ............................................................................................... 63

Figura 4 - Microplacas de 96 poços de fundo redondo, mostrando as combinações realizadas entre as bactérias tratadas para o ensaio de coagregação (A) e autoagregação (B), os quais apresentam P.gingivalis, Pg; F.nucleatum, Fn; P.gingivalis que foram expostas ao óleo de melaleuca, Pg(M); P.gingivalis, Pg(C); P.gingivalis tratadas com digluconato de clorexidina, Pg(X); F.nucleatum expostas ao óleo de melaleuca, Fn(M); F.nucleatum expostas ao óleo de copaíba, Fn(C), F.nucleatum expostas ao digluconato de clorexidina, Fn(X) e tampão de coagregação (T). Antes da introdução destes inóculos na microplaca, todos foram lavados duas vezes com tampão de agregação .................................. 67

Figura 5 - Placas de ágar Brucella acrescido de sangue e suplementado como hemina e vitamina K, contendo os agentes testados, inoculadas com inóculos padronizados de F. nucleatum e P. gingivalis. Em (A) placa controle negativo, mostrando crescimento de F.nucleatum (fileira central) e P.gingivalis (fileira direita) Em (B) placa com óleo de copaíba a 20 µL/mL mostrando apenas crescimento de F.nucleatum. Em (C), placa com digluconato de clorexidina a 2µg/mL mostrando crescimento bacteriano. Em (D), placa com óleo de copaíba 100 µL/mL e em (E), placa contendo óleo de melaleuca 20 µL/mL ................................................................ 75

Figura 6 - Microplaca contendo bactérias em processo de coagregação......................................................................................... 80

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Meios de cultura preparados com as soluções ativas

(quantidades para duas placas de Petri) .............................................. 62

Tabela 2 - Analitos identificados no óleo de copaíba ............................................ 72

Tabela 3 - Analitos identificados no óleo de melaleuca ......................................... 73

Tabela 4 - Valores médios de UFC/ml de cultura de P. gingivalis e

F. nucleatum em Abs560nm~0,7 ............................................................. 74

Tabela 5 - Diferença de OD655nm em diferentes intervalos de

tempo em ensaio de autoagregação de F.nucleatum

expostas ao pré-tratamento com concentração

subinibitória de digluconato de clorexidina (X), óleo de

melaleuca (M) e óleo de copaíba (C) e no controle não

tratado (Fn)........................................................................................... 79


tempo em ensaio de coagregação entre F.nucleatum

expostas ao pré-tratamento com P.gingivalis sem

tratamento ............................................................................................ 81


tempo em ensaio de coagregação entre P.gingivalis

expostos ao pré-tratamento e F.nucleatum sem

tratamento ............................................................................................ 82

Tabela 8 – Resultado do processo de coagregação entre

P.gingivalis e F.nucleatum expostas ao pré-tratamento ....................... 83

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

°C Celsius

% Porcentagem

µm

µL

µg

mg

Micrometro

Microlitro

Micrograma

Miligrama

mL

mm

m

Mililitro

Milímetro

Metro

mM Milimolar

p Nível de significância

PBS Solução salina tamponada com fosfato

pH Potencial hidrogeniônico

F.nucleatum Fusobacterium nucleatum

P.gingivalis Porphyromonas gingivalis

FDA

CLSI

g

cm3

KOH

Food and Drug Administration

Clinical and Laboratory Standards Institute

Gramas

Centímetros cúbicos

Hidróxido de potássio

Kg

meq

Quilograma

Miliequivalente

min Minuto

DMSO

UFC

DO

Abs

nm

CIM

CBM

CS

g

BHI

tR

IR

Dimetilsulfóxido

Unidade Formadora de colônia

Densidade óptica

Absorbância

Nanômetro

Concentração Inibitória Mínima

Concentração Bactericida Mínima

Concentração Subinibitória

Força gravitacional

Caldo Infusão de Cérebro e Coração

Tempo de arraste

Índice de retenção

SUMÁRIO

1 Introdução ...................................... ............................................................... 19

2 Revisão de Literatura ........................... ........................................................ 25

2.1 Doença Periodontal: formação de biofilme e progressão .............................. 27

2.2 Fusobacterium nucleatum ............................................................................... 30

2.3 Porphyromonas gingivalis ............................................................................... 32

2.4 Digluconato de Clorexidina ............................................................................. 35

2.5 Fitoterapia: breve histórico .............................................................................. 37

2.6 Copaíba: histórico, aplicações e aspectos gerais ........................................... 40

2.7 Melaleuca: histórico, aplicações e aspectos gerais ........................................ 45

3 Objetivos ....................................... ................................................................ 51

4 Material e métodos .............................. ......................................................... 55

4.1 Análises físico-químicas e cromatográficas dos óleos de

copaíba e melaleuca ....................................................................................... 57

4.2 Preparo das soluções a base de Copaifera Officinalis e

Melaleuca alternifolia ...................................................................................... 58

4.3 Microrganismos .............................................................................................. 59

4.4 Padronização do inóculo................................................................................. 60

4.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) das

soluções testadas ........................................................................................... 60

4.6 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)

das soluções testadas .................................................................................... 63

4.7 Determinação do efeito das substâncias testadas em

Concentração Subinibitória sobre a autoagregação e

coagregação de P. gingivalis e F. nucleatum ................................................. 65

4.7.1 Determinação da Concentração Subinibitória ................................................. 65

4.7.2 Ensaio de Coagregação e Autoagregação ..................................................... 66

5 Resultados ..................................... .............................................................. 69

5.1 Identificação do óleo de Melaleuca alternifolia e de Copaifera

officinalis ......................................................................................................... 71

5.2 Análise da concentração inibitória mínima das soluções

testadas .......................................................................................................... 74

5.2.1 Padronização do inóculo de P. gingivalis e F. nucleatum ............................... 74

5.2.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM) ............................................................ 74

5.3 Concentração Bactericida Mínima (CBM) ....................................................... 75

5.4 Determinação das concentrações subinibitórias ............................................. 77

5.5 Correlação entre as soluções testadas e o controle negativo

em ensaio de autoagregação ......................................................................... 78

5.6 Correlação entre as soluções testadas e o controle negativo

em ensaio de autoagregação ......................................................................... 80

6 Discussão ....................................... ............................................................... 85

7 Conclusão ....................................... ............................................................ 101

Referências ....................................... ..................................................................... 105

1 INTRODUÇÃO

Introdução 21

1 INTRODUÇÃO

A cavidade bucal é um habitat microbiano complexo que apresenta muitas

espécies bacterianas como componentes (OGAWA, 2004). Acredita-se que 1 mL de

saliva contenha mais de 100 milhões de bactérias e que a cavidade bucal seja

habitada por mais de 500 espécies bacterianas (MESTECKY, 2005).

Algumas dessas bactérias possuem características de comensalismo,

portanto apresentam comportamento não prejudicial à saúde bucal, enquanto outras

são consideradas patogênicas. A colonização de bactérias patogênicas na cavidade

bucal depende da relação com os microrganismos comensais (KOLENBRANDER et

al., 2006).

A periodontite é considerada uma doença infecciosa e inflamatória (LINDHE,

1999) causada principalmente pelo acúmulo de biofilme bacteriano nos dentes e

gengiva (NEWMAN et al., 2004).

Alguns microrganismos liberam produtos tóxicos capazes de sensibilizar a

resposta imunológica do hospedeiro, causando a inflamação gengival (MENG et al.,

2007; PATHIRANA et al., 2010). Determinados casos dessa doença podem se

agravar e evoluir para acometimento de outros tecidos periodontais, causando a

periodontite (ABUL et al., 2006; VOGT, 2006), ou seja, as doenças periodontais

representam infecções bacterianas mistas e dinâmicas causadas por associação de

tipos bacterianos e resposta do hospedeiro, que podem variar com o tempo

(CARRANZA, 1983).

Dentre as bactérias envolvidas no processo patológico do periodonto,

algumas têm sido relacionadas como agentes etiológicos primários, como

Porphyromonas gingivalis, Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum,

Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Prevotella

intermedia e Campylobacter rectus. Acredita-se que essas bactérias sejam

responsáveis pela gengivite e periodontites crônica, agressiva e necrosante

(OGAWA, 2004).

O objetivo essencial do tratamento das doenças periodontais é eliminar ou

reduzir seus patógenos (DUMITRESCU, 2011). Para obter sucesso clínico,

22 Introdução

tradicionalmente, utiliza-se uma associação de procedimentos que incluem

educação do paciente em relação ao hábito de escovação bucal diária, limpeza

dentária mecânica (cirúrgica e não cirúrgica) (LINDHE, 1992) e terapia periodontal

de suporte (geralmente em intervalo de 3 a 6 meses) (NEWMAN et al., 2004).

A aplicação tópica de um medicamento para o controle da prevenção da

doença periodontal é desejável, tendo em vista a redução de complicações e

problemas relacionados à medicação utilizada. Ensaios clínicos, que associaram o

uso de antibioticoterapia local à raspagem e ao alisamento radicular no tratamento

da periodontite crônica, sugerem redução de maior profundidade da bolsa

associada, ou não, a ganhos no nível de inserção em pacientes tratados com

adjuvante antimicrobianos administrados localmente, como o digluconato de

clorexidina (DUMITRESCU, 2011).

A utilização de extratos vegetais, com conhecidas propriedades

antimicrobianas, pode ser de grande importância em muitos tratamentos. Muitas

plantas têm sido utilizadas devido as suas características antimicrobianas,

atribuídas, muitas vezes, aos compostos sintetizados no metabolismo secundário da

planta (CARSON et al., 2006; COWAN, 1999).

A copaibeira (Copaifera sp.) é uma árvore de grande porte que possui um

óleo-resina e é uma das plantas medicinais mais utilizadas pela população

amazônica (LOPEZ et al., 2008). O óleo de copaíba tem, descrito na literatura,

inúmeros atributos com potencial para uso na medicina e odontologia, como a sua

ação anti-inflamatória (DWYER, 1951; RAMOS, 2006; VEIGA JUNIOR et al., 2002),

antimicrobiana (PIERI et al., 2010a; PIERI et al., 2010b) e antisséptica (CASCON,

2004; RAMOS, 2006; VEIGA JUNIOR et al., 2002).

Estas características desejáveis podem, futuramente, propiciar seu uso como

um agente quimioterápico no tratamento e prevenção das doenças periodontais

(PIERI et al., 2009). Estudos recentes têm procurado comprovar tais atividades

descritas em ensaios laboratoriais, além de comprovar ação antimicrobiana do óleo

copaíba sobre algumas bactérias formadoras da placa bacteriana (PIERI et al.,

2009; PIERI et al, 2010).

Outra substância utilizada é o óleo de melaleuca (Melaleuca alternifolia), que

apesar de ter se tornado muito popular na última década, tem sido utilizado na

Introdução 23

Austrália por quase cem anos (CARSON et al., 2006). Nos últimos tempos, sua

reputação tem aumentado devido ao seu efeito antisséptico seguro, relativamente

eficaz e natural (COX et al., 2000; HAMMER et al., 2006). Atualmente, é

incorporado como o antimicrobiano principal ou como um conservante natural em

muitos produtos farmacêuticos e cosméticos destinados ao uso tópico (COX et al.,

2000). No campo da Odontologia, o óleo oriundo de Melaleuca alternifolia tem sido

testado contra bactérias encontradas no biofilme bucal (HAMMER et al., 2003;

SHAPIRO et al., 1994). Estes estudos indicam que uma série de bactérias orais é

susceptível ao óleo, sugerindo seu uso em produtos direcionados a promoção da

saúde e na manutenção da higiene bucal (HAMMER et al., 2003).

Partindo-se do princípio de que o óleo copaíba e de melaleuca possuem

características desejáveis a um agente antimicrobiano e de que não há dados

suficientes na literatura utilizando estes fitoterápicos sobre Porphyromonas gingivalis

e Fusobacterium nucleatum, duas importantes bactérias periodontopatogênicas, viu-

se a importância em avaliar a inibição no crescimento e alteração no processo de

coagregação e autoagregação destas bactérias quando em contato com essas duas

soluções.

24 Introdução

2 REVISÃO DE LITERATURA

Revisão de Literatura 27

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Doença Periodontal: formação de biofilme e prog ressão

As doenças periodontais são as patologias que acometem o periodonto, ou

seja, as estruturas circunjacentes ao elemento dental (CARRANZA, 1983) que

incluem tecidos periodontais de proteção (gengiva inserida e livre) e tecidos de

sustentação (osso alveolar, cemento e ligamento periodontal) (LINDHE, 1999;

VOGT, 2006). Suas principais funções são fornecer suporte aos dentes inseridos

aos ossos dos maxilares e manter integridade da mucosa mastigatória da cavidade

bucal (LINDHE, 1999).

A patogênese da doença periodontal destaca a participação de vários fatores

que podem influenciar o seu início, a taxa de progressão, as características clínicas

dessa doença e sua resposta ao tratamento. Esses fatores são a especificidade e a

patogenicidade da microbiota envolvida, respostas imunológica e inflamatória do

hospedeiro, fatores de risco ambientais e adquiridos, características do metabolismo

dos tecidos conjuntivo e ósseo alveolar, assim como fatores de risco genéticos

(LINDHE, 1999).

A complexidade da microbiota gengival vem sendo alvo de estudos desde a

primeira análise microscópica desse ecossistema, realizada por Van Leeuwenhoek,

o qual relatou suas observações à Sociedade Real de Londres, em 1684,

denominando sua descoberta como “pequenos animálculos” (MADIGAN et al., 2004,

SOCRANSKY et al., 1998).

O biofilme dental é uma comunidade bacteriana complexa influenciada por

fatores do meio ambiente externo que podem ser mediados pelo hospedeiro

(NEWMAN et al., 2004). O revestimento de um dente limpo recentemente ocorre

dentro das primeiras horas por uma película na superfície da estrutura dental

constituída por numerosos componentes, incluindo mucina, glicoproteínas, proteínas

ricas em prolina, proteínas ricas em histidina, enzimas, fosfato e outras moléculas

encontradas na saliva e fluido do sulco gengival. A formação da película favorece a

28 Revisão de Literatura

colonização bacteriana inicial, fornecendo superfícies susceptíveis à fixação de

outras bactérias. Os estreptococos são uns dos colonizadores iniciais e ligam-se as

proteínas ácidas ricas em prolina e em receptores encontrados na película

(WHITTAKER et al., 1996). Após a colonização inicial por cocos e bastonetes Gram-

positivos, cocos e bastonetes Gram-negativos passsam então a compor o biofilme,

seguidos pelo aparecimento de Fusobactérias. Finalmente, ocorre o aparecimento

de grande quantidade de espirilos e espiroquetas (THEILADE et al., 1966). O

surgimento clínico da gengivite está correlacionado ao aparecimento das formas

Gram-negativas (SOCRANSKY et al., 2005) .

Os produtos metabólicos de alguns microrganismos podem promover o

desenvolvimento de algumas bactérias ou prevenir o aparecimento de outras. Um

papel chave nesse processo é Fusobacterium nucleatum que possibilita a ligação

entre os colonizadores iniciais e os tardios, especialmente anaeróbios. Na ausência

de Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis não consegue agregar com

a microbiota existente (DUMITRESCU et al., 2011).

De maneira abrangente, a microbiota do biofilme dental e os seus produtos

atuam como agentes irritantes que desencadeiam a resposta inflamatória e

imunológica no tecido gengival contíguo. A resposta inflamatória consiste na

primeira linha de defesa do organismo contra os agentes agressores. O processo

inflamatório envolve a liberação de mediadores químicos que desencadeiam

alterações no plexo vascular, caracterizadas por aumento do fluxo sanguíneo local,

vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular. Simultaneamente, diversos

mediadores químicos e fatores quimiotáticos estimulam a expressão de moléculas

de adesão nas células endoteliais e nos leucócitos, o que favorece a adesão das

células inflamatórias à parede vascular e sua migração para o meio extravascular,

resultando na formação do exsudato (ABUL et al., 2006; VOGT, 2006). À medida

que a deposição do biofilme bacteriano sobre o dente torna-se estruturalmente mais

complexa, os fenômenos inflamatórios se exacerbam e observa-se um aumento no

volume do exsudato inflamatório (LINDHE, 1999; VOGT, 2006).

Apesar das bactérias periodontopatogênicas serem imprescindíveis para a

progressão da doença periodontal, alguns fatores associados ao hospedeiro, tais

como herança genética (DUMITRESCU, 2011), fumo de tabaco (DUMITRESCU,

2011), exposição ao estresse emocional (RAI et al., 2011) e doenças sistêmicas


(BJELLAND et al., 2002), podem participar do agravamento dessa doença. Esses

fatores influenciam na progressão da doença periodontal e alteram a resposta do

hospedeiro, portanto, estão envolvidos na determinação da suscetibilidade à doença

(MENG et al., 2007).

Uma pessoa com gengiva sadia, com hábitos de higiene oral suspensos,

passa a ter acúmulo de bactérias sobre as superfícies dos dentes, predominando,

nas quatro primeiras horas, estreptococos e bacilos Gram-positivos. Esses

microrganismos diminuem durante a gengivite e periodontite. Concomitantemente,

durante a progressão da doença periodontal ocorre um aumento na quantidade de

bactérias Gram-negativas, como: Fusobacterium nucleatum, Prevotella

melaninogenica, Prevotella intermedia, entre outros (LINDHE, 1999; NEWMAN et al.,

2004; OGAWA, 2004).

Alguns microrganismos são importantes para o desenvolvimento da doença

periodontal, participando da perda de inserção do tecido conjuntivo e da perda óssea

característico dessa enfermidade, como Aggregatibacter actinomycetemcomitans,

Tannerella forsythia, Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum, Prevotella

intermedia, Porphyromonas gingivalis, Peptostreptococcus micros e Streptococcus

intermedius (ZAMBON, 1996).

Avaliações de sondagem têm demostrado que algumas espécies bacterianas,

frequentemente, aparecem em associação nas amostras de biofilmes subgengivais

(SOCRANSKY et al., 1998). O processo de coagregação foi primeiramente relatado

por Gibbons & Nygaard, em 1970, e é definido como o reconhecimento entre as

moléculas de superfície de dois tipos de células bacterianas diferentes, culminando

na formação de um agregado de células mistas (WHITTAKER et al., 1996).

Muitas bactérias da cavidade bucal humana estão envolvidas no evento de

coagregação e acredita-se que essas interações tenham um papel importante na

adesão e colonização bacterianas às superfícies (BRADSHAW et al., 1998). As

interações são altamente específicas nas quais diferentes tipos bacterianos

específicos interagem (SOCRANSKY et al., 1998).

Um evento fisiológico inicial de grande importância que pode ocorrer durante

o desenvolvimento de um biofilme, e que pode ser importante na adesão de

colonizadores secundários, é o aumento da produção de substâncias poliméricas


extracelulares. Esses polímeros envolvem as células do biofilme e fortalecem a

adesão entre elas, além de poderem possuir a capacidade de atuar como receptores

para as interações de coagregação (RICKARD et al., 2003).

2.2 Fusobacterium nucleatum

Durante a última década do século XIX, muitos autores observaram bacilos,

fusiformes, encontrados em materiais colhidos da boca humana em estado de saúde

e doença (HOFSTAD, 2006). Knorr, em 1923, propôs o termo Fusobacterium, para

designar bacilos Gram-negativos com aparência fusiforme. A sétima edição do

“Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology” dividiu a família Bacteroidaceae

dentro de três gêneros: Bacteroides, relacionado aos bastonetes com extremidades

arredondadas; Fusobacterium, destinado aos bastonetes com extremidade afilada e

Sphaerophorus, para designar bastonetes que apresentavam extremidades

arredondadas com acentuado pleomorfismo e com a presença incomum de

filamentos.

Contudo, estudos de DNA e fisiologia dessas bactérias, mostraram não haver

evidências suficientes para separar os gêneros Sphaerophorus e Fusobacterium.

Pontanto, na oitava edição do Bergey’s Manual, o gênero Fusobacterium foi

relacionado a bastonetes Gram-negativos, anaeróbios, não esporulados. Esses

microrganismos obtém energia a partir de peptídeos e aminoácidos que quando

fermentados dão origem a uma mistura a de ácido butírico e acético (KAPATRAL et

al., 2002; HOFSTAD et al., 2006).

Até 2006, havia 13 espécies humanas de Fusobacterium adequadamente

descritas: F.nucleatum, F.necrophorum, F.alocis, F. gonidiaformans, F.mortiferum, F.

naviforme, F. necrogenes, F. periodonticum, F. prausnitzii, F. russii, F. sulci, F.

ulcerans e F. Varium, sendo que dessas apenas cinco apresentam-se como

microbiota normal da cavidade bucal, entre elas encontra-se F. Nucleatum

(HOFSTAD et al., 2006).

Fusobacterium nucleatum é uma bactéria anaeróbia estrita, Gram-negativa,

imóvel, não esporulante e uma das mais comuns nas infecções humana e animal

(OGAWA, 2004). Essa bactéria é mais bem isolada da saliva ou da bolsa periodontal


e apesar de ser anaeróbia, cresce na presença de até 6% de oxigênio (HOFSTAD et

al., 2006).

Segundo sua taxonomia, pertence à classe Fusobacteria, ordem

Fusobacteriales, família Fusobacteriaceae, gênero Fusobacterium e espécie

Fusobacterium nucleatum (NCBI, 2010).

Apesar da espécie F.nucleatum ser considera bastante heterogênea

(BOLSTAD, 1996; KAPATRAL et al., 2003), a maioria das suas células bacterianas

mede entre 5 a 10 µm de extensão e apresenta extremidades pontiagudas, no

entanto a morfologia da colônia bacteriana não pode ser considerada um parâmetro

para Fusobacteria e não é suficiente para a diferenciação entre as espécies (TUNÉR

et al., 1992). F.nucleatum pode produzir beta-lactamase, aumentando sua

resistência aos antibióticos beta-lactâmicos, como a penicilina (VOHA et al., 2006).

Esse patógeno é encontrado na cavidade bucal, onde é um dos anaeróbios

Gram-negativos mais abundantes na região subgengival (KAPATRAL et al., 2003;

MOORE et al., 1994). Durante a evolução da doença periodontal, sua massa celular

aumenta muito podendo alcançar 10.000 vezes sua quantidade inicial, tornando-se

uma das espécies de anaeróbios mais abundantes nos sítios doentes (MOORE et

al., 1994). Contudo esses microrganismos também podem ser encontrados em

locais saudáveis da cavidade bucal (KAPATRAL et al., 2003; MOORE et al., 1994).

Na cavidade bucal, essas bactérias podem ser encontradas nas periodontites

laterais e apicais, polpas necrosadas, pericoronarites, abscessos e halitose (LIU et

al., 2009), contudo podem ainda estar envolvidas em doenças em outras partes do

corpo (OGAWA, 2004).

Nos estágios iniciais da doença periodontal, Streptococcus spp. e outras

bactérias aderem e colonizam o esmalte dental e a superfície radicular. Essa fase

inicial permite que posteriormente a coagregação de F.nucleatum com esses

colonizadores iniciais participando, dessa forma, na colonização final para culminar

na formação do biofilme. As Interações físicas são muito específicas entre os vários

gêneros nessa comunidade microbiana complexa (KAPATRAL et al., 2002).

A interação entre as bactérias bucais e as células epiteliais da gengiva é um

aspecto essencial da doença periodontal. Han et al. (2000), em um modelo

experimental in vitro utilizando cultura primária de células epiteliais de gengiva


humana e células KB, observou que F.nucleatum apresentou capacidade de aderir e

invadir ambos tecidos e estimulou a produção da interleucina-8 pelo tecido epitelial.

Essa bactéria também pode coagregar com uma ampla variedade de

microorganismos na cavidade oral e desempenhar um papel importante na formação

do biofilme (BRADSHAW et al., 1998).

Devido as suas diversas propriedades, F. nucleatum permite a adesão de

bactérias importantes para o estabelecimento da doença periodontal como a

Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter

actinomycetemcomitans, Treponema dentícola, entre outros. Em referência a essa

propriedade, é referida como uma “bactéria-ponte” (BOLSTAD et al., 1996). A

interação entre F.nucleatum e P.gingivalis mostra-se muito específica, intercedida

por uma adesina galactose-mediada (METZGER et al., 2009).

2.3 Porphyromonas gingivalis

Porphyromonas gingivalis é um cocobacilo anaeróbico, Gram-negativo, imóvel

(SHAH et al., 1988; GIBSON et al., 2006), pertencente ao filo Bacteroidetes, classe

Bacteroidia, ordem Bacteroidales, família Porphyromonadaceae, gênero

Porphyromonas, espécie Porphyromonas gingivalis (NCBI, 2011).

O gênero Porphyromonas e, em particular, a espécie gingivalis são

classificações relativamente novas e foram delineadas a partir de Bacteroides

melaninogenicus (SHAH et al., 1988). Oliver & Wherry (1921), relataram o

isolamento de bactérias cocobacilos Gram-negativas, morfologicamente

semelhantes, a partir de uma variedade de infecções. Esses microrganismos, após 1

a 2 semanas em anaerobiose a 37ºC, cresceram e produziram colônias contendo

pigmentos enegrecidos quando cultivadas em ágar sangue (OLIVER et al., 1921).

Acreditava-se que o pigmento preto produzido por essas bactérias fosse

melanina, portanto, foi utilizada a denominação de Bacteroides melaninogenicus

(OLIVER et al., 1921). Contudo, Schwabacher et al.(1947) descobriram que o

pigmento enegrecido produzido por esses microrganismos era formado apenas na

presença de sangue e que sua formação coincidia com o desaparecimento de

hemoglobina indicando que provavelmente esse pigmento seria um produto de


degradação da hemoglobina. Na ausência de sangue no meio de cultura, a

P.gingivalis não formava pigmentos (SCHWABACHER et al., 1947).

Desse modo, como os pigmentos foram erroneamente identificados como

melanina, esse fato ocasionou na substituição do seu nome para Bacteroides

nigrescens (OLSEN et al., 1999). Schwabacher et al., em 1947, classificaram esse

grupo de bactérias como membros do gênero Fusiformis e aprovaram o nome

Fusiformis nigrescens para as espécies que produziam colônias pigmentadas de

negro em placas de ágar sangue. O termo Bacteroides voltou a ser utilizado na

sétima edição do “Bergey’s manual”, e o termo Bacteroides melaninogenicus passou

a ser considerado uma designação taxonômica válida (BREED et al., 1957).

No entanto, ainda havia heterogeneidade dentro do grupo Bacteroides, tanto

em relação à formação dos pigmentos quanto em relação às propriedades

bioquímicas. Estudos filogenéticos dessa bactéria demonstraram similaridades

particulares com o gênero Porphyromonas e enfatizaram sua diferença com

Bacteroides e Prevotella (OLSEN et al., 1999).

P. gingivalis cresce rapidamente a 37 � C e inicialmente, quando cultivadas

em ágar contendo sangue, as colônias apresentam coloração esbranquiçada.

Conforme o crescimento bacteriano aumenta, próximo de 4 a 8 dias, estas bactérias

chegam a adquirir uma coloração escura que foi correlacionada à produção de

protoheme e o ágar passa a apresentar a aparência de ágar simples (GIBSON et al.,

2006; SCHWABACHER et al., 1947). Esses microrganismos crescem em meios de

cultura formando colônias convexas, lisas, brilhantes, com 1 a 2 mm de diâmetro

(OLIVER et al., 1921).

Entre as muitas espécies bacterianas provenientes do biofilme subgengival,

há evidencias de que a P.gingivalis seja o principal agente etiológico das

apresentações severas de periodontite crônica (OLSEN et al., 1999; PATHIRANA et

al., 2010; YANG et al., 2004). Yang et.al.(2004) analisaram amostras coletadas de

407 pacientes diagnosticados com doença periodontal e comprovaram a presença

de P.gingivalis em 85,7% das amostras, sugerindo que essa bactéria esteja

intimamente relacionada à patogênese da doença.


Pesquisas realizadas por vários grupos, com a finalidade de analisar a

presença de P. gingivalis em pacientes com o periodonto saudável detectaram

níveis baixos ou a ausência da bactéria nesses pacientes (GRIFFEN et al., 1998).

Embora essa bactéria tenha sido encontrada na língua, tonsila, saliva e em

amostras de biofilme supragengival, acredita-se que Porphyromonas gingivalis

colonize exclusivamente sítios subgengivais da cavidade bucal (SOCRANSKY et al.,

1992). Sua presença na microbiota subgengival de em indivíduos com gengivite é

menor do que 5%, contudo, seu número aumenta drasticamente na doença

periodontal em estágio avançado (GIBSON et al., 2006).

Segundo Rudney et al. (2001), a boca pode fornecer um modelo acessível

para o estudo de interações bacterianas com células humanas in vivo. Utilizando

hibridização fluorescente in situ e microscopia confocal de varredura a laser, os

autores descobriram que as células epiteliais bucais humanas encontravam-se

infectadas com bactérias intracelulares, incluindo os periodontopatógenos

Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Porphyromonas gingivalis. A invasão de

células bucais pode permitir o estabelecimento de bactérias anaeróbias em locais de

aerobiose que, em outros casos, apresentariam um ambiente desfavorável.

Yilmaz et al. (2006), desenvolveram um novo modelo in vitro para o estudo da

dispersão de Porphyromonas gingivalis entre as células epiteliais gengivais. Os

pesquisadores observaram que essa bactéria possuia a capacidade de se

disseminar entre as células sem passar pelo espaço extracelular. Acredita-se

também que consiga propagar-se pelas camadas de células epiteliais gengivais e

podem ainda penetrar a membrana basal adentrando ao tecido conjuntivo.

Gingipain, secretada por P. gingivalis, consegue degradar os componentes da matriz

celular e das junções celulares, permitindo que a bactéria ultrapasse, desse modo,

as barreiras de proteção formadas pelo tecido conjuntivo e pela adesão celular

(ANDRIAN et al., 2004; TRIBBLE et al., 2010).

A periodontite em estágio avançado do adulto possui entre os principais

agentes etiológicos a bactéria Porphyromonas gingivalis e seus fatores de virulência,

como o lipopolissacarídeo, fímbrias, hemaglutininas, vesículas e as proteases

(SLOTS et al., 1984).


Em sua maioria, P.gingivalis apresentam fimbrias distribuídas de modo

peritricoso sobre a sua superfície. Há muitas evidências de que suas fímbrias

participem da sua adesão ao tecido do hospedeiro, inclusive ao tecido bucal, devido

a sua interação adesiva à citoqueratina (SOJAR et al., 2002). Além disso, essa

bactéria possui a capacidade de se aderir aos microrganismos que já colonizaram a

região periodontal (WHITTAKER et al., 1996).

2.4 Digluconato de Clorexidina

O digluconato de clorexidina é o antimicrobiano tópico de uso bucal mais

efetivo, mais estudado, de amplo espectro, que age contra bactérias Gram-

negativas, Gram-positivas, leveduras, dermatófitos e alguns vírus lipofílicos

(DUMITRESCU, 2011). Sua atividade em pH alcalino é melhor do quem em pH

ácido e mostra-se reduzida na presença de matéria orgânica, o que pode ser um

problema devido ao seu uso em sítios subgengivais (SLOTS; 2002).

Como apresenta um potencial antimicrobiano eficaz, o digluconato de

clorexidina foi utilizado em muitos cremes antissépticos para a pele, enxaguatórios

bucais e desinfecção cutânea para execução de procedimentos cirúrgicos. Além

disso, o digluconato de clorexidina ainda foi incorporado aos produtos cosméticos.

No início de 1990, o FDA autorizou três tipos de dispositivos médicos que

contenham essa substância em sua composição: cateteres intravenosos, antibióticos

tópicos para a pele e em tecidos utilizados para implantação cirúrgica (FDA, 1998).

Sua aplicação na Odontologia teve início por Löe & Schiott (1970) e

atualmente é formulada em diferentes produtos, como enxaguatórios bucais, géis,

comprimidos, vernizes, chicletes, entre outros (DUMITRESCU, 2011). Os

enxaguatórios bucais são comercializados como soluções, a base de água ou álcool,

com concentrações que variam entre 0,12% e 0,2% (DUMITRESCU, 2011).

Essa substância exibe efeito bacteriostático quando utilizada em baixas

concentrações e, em altas concentrações, bactericida (OOSTERWAAL et al., 1989).

Essas atuações ocorrem, pois, em PH fisiológico, o digluconato de clorexidina é uma

molécula dicatiônica grande, com carga positiva distribuída ao longo dos átomos de

nitrogênio distribuídos em ambos os lados da ponte de hexametileno. Portanto,


possui a capacidade de adsorver as superfícies carregadas negativamente, como as

paredes bacterianas, local em que age essa substância e consegue adsorver

fortemente aos componentes contendo fosfato (DUMITRESCU, 2011).

O digluconato de clorexidina altera a integridade da membrana celular

bacteriana e é atraída para o seu interior, onde se liga aos fosfolipídios no interior

dessa membrana e induz o aumento da permeabilidade e o extravasamento de

componentes com baixo peso molecular, como íons de potássio (KUYYAKANOND

et al., 1992). Esse antimicrobiano ainda se liga às diferentes superfícies bucais e

também à saliva e à película. Após seu bochecho, a saliva obtém efeito

antimicrobiano por até 5 horas (DUMITRESCU, 2011).

Apesar de ser amplamente utilizado na Odontologia para diferentes situações

(DUMITRESCU, 2011), o digluconato de clorexidina pode apresentar efeitos

colaterais como sabor desagradável, erosão em mucosa, sensação de queimação

dos tecidos moles, dor e ressecamento dos tecidos bucais, lesões descamativas e,

em alguns casos raros, reações de hipersensibilidade e hipertrofia de parótida

(AUTIO-GOLD, 2008). Contudo, os efeitos colaterais mais conspícuos são coloração

castanho amarelada da estrutura dental, língua e nas margens das restaurações,

além das alterações em paladar (DUMITRESCU, 2011).

A alteração da coloração da estrutura dental por essa substância tende a

ocorrer no terço cervical da coroa, nas áreas interproximais, apresentando

exacerbação na área da junção amelocementária, na superfície radicular exposta,

na língua, ou em sulcos e fissuras e, ocasionalmente, em restaurações de resina

composta (AUTIO-GOLD, 2008). A alteração na coloração dos dentes ocorre em um

terço a metade dos pacientes e é geralmente evidente dentro de alguns dias após o

início do bochecho diário com essa substância. A mancha é removível, para isso

uma profilaxia dentária profissional geralmente é necessária após o uso de

enxaguatórios que contenham digluconato de clorexidina (AUTIO-GOLD, 2008). Os

efeitos de coloração devem ser minimizados pela diminuição da ingestão de

determinados alimentos e bebidas, como cafés e chás, durante o tratamento com a

clorexidina (DUMITRESCU, 2011).

Muitos mecanismos foram propostos na tentativa de explicar a coloração

causada pelo digluconato de clorexidina, como a degradação de sua molécula com a

posterior liberação de paracloroanilina, catálise da reação de Maillard (reação


química entre proteínas e açucares redutores que causa a formação de pigmentos

marrons), desnaturação de proteínas com a formação de sulfeto de metal e a

precipitação de cromógenos aniônicos da dieta (AUTIO GOLD, 2008;

DUMITRESCU, 2010).

O digluconato de clorexidina pode ainda estar relacionado à ageusia e à

hipogeusia, perda ou redução subjetiva do paladar, a qual se mostra associada,

especificamente, ao sabor salgado ou amargo, portanto, a capacidade de

reconhecer sabores doces ou cítricos não é modificada. Essa alteração no paladar

perdura por alguns dias após a interrupção do uso de enxaguatórios bucais a base

de digluconato de clorexidina (DUMITRESCU, 2011).

Alguns casos de reações de hipersensibilidade têm sido associados com o

uso tópico de digluconato de clorexidina, intrauretral, como lubrificante em cateteres

urinários e em cateteres impregnados de digluconato clorexidina (FDA, 1998; YONG

et al., 1995). Na Austrália, houve seis casos de reações alérgicas severas ao gel

desta substância utilizado em cateteres urinário (YONG et al., 1995). Em 1998, a

U.S Food and Drug Administration publicou uma notificação alertando sobre o

potencial deste composto em induzir reações de hipersensibilidade (FDA, 1998).

2.5 Fitoterapia: breve histórico

Há aproximadamente dez mil anos atrás, deu-se inicio à agricultura,

considerada um evento histórico que revolucionou a cultura humana e sua relação

com o meio ambiente. A utilização da agricultura permitiu que as pessoas

utilizassem seu tempo livre para desenvolverem outras funções e com isso,

civilizações Incas, Maias, Egípcias, Romanas, Chinesas, Gregas e do Oriente Médio

foram gradualmente se desenvolvendo. Mediante essa evolução, foram

desenvolvidos novos empregos para as plantas, que eram utilizadas de maneira

empírica, dentre eles a sua utilização medicinal (PRANCE et al., 2005).

Em 1873, foi encontrado o “Papyrus Ebers”, data da época do Egito antigo,

cerca de 1.600 a.C. Esse documento é considerado o tratado mais antigo de

medicina egípcia sendo visto como um dos primeiros documentos com abordagem

sobre a utilização das plantas medicinais (PELT, 1979).


A China tem sido um dos países mais importantes na pesquisa e utilização de

fitoterápicos. Historicamente, a medicina fundamentada em plantas medicinais já era

aplicada desde a época dos Estados Guerreiros (475-221 a.C.) e com o tempo

ocorreram muitas descobertas de aplicações terapêuticas contra muitas doenças. A

China ofereceu grandes exemplos da importância dessas plantas, como no caso da

Panax ginseng (ginseng) e Ginkgo biloba (PEIXOTO NETO et al., 2005), os quais

tem apresentado eficácia contra muitas alterações, dentre elas, respectivamente, a

melhora da performance cognitiva e insuficiência cerebral (ALEXANDRE et al.,

2008).

As plantas foram fonte de medicamentos, tintas, venenos e alucinógenos. Os

povos da pré-história tinham que confiar em seus conhecimentos profundos acerca

das plantas existentes em seus habitats para poderem explorar a flora de maneira

eficaz e em seu benefício (PRANCE et al., 2005).

Na era Medieval, o médico suíço Paracelso ganhou destaque por descobrir

inúmeras drogas utilizadas ainda nos dias atuais, dentre elas o ópio, obtido a partir

de espécies de Papaver somniferum. Paracelso, entre outros feitos, popularizou o

uso do ópio na medicina (PEIXOTO NETO et al., 2005; PRANCE et al., 2005).

No Brasil, durante os três primeiros séculos de colonização, até mesmo os

portugueses, embora se tratassem com seus médicos, por vezes aproveitavam-se

dos recursos de plantas medicinais utilizadas pelos indígenas, como a copaíba

utilizada para a cura de feridas (EDLER, 2006).

O primeiro olhar sobre o Novo Mundo resultou em descrições históricas e

literárias da nova terra reunidas em relatos, escritos, tratados e cartas dirigidas ao

rei. Desse modo, os primeiros documentos que abordavam a flora e fauna do Brasil

foram sendo produzidos por cronistas, missionários, como Frei Cristóvão de Lisboa,

autor da História dos Animais e Árvores do Maranhão (escrita possivelmente entre

1624 e 1627), ou ainda por colonizadores (ALMEIDA, 2008).

A primeira descrição de algumas plantas usadas pelos indígenas no Brasil foi

realizada durante uma missão científica, durante a ocupação holandesa (1630-1654)

(PEIXOTO NETO, 2005). A partir das missões foram estabelecidas redes de

comércio entre os diferentes continentes, estando os jesuítas presentes no negócio

das especiarias, sedas e dos remédios (ALMEIDA, 2008).


Os missionários jesuítas aproveitaram da medicina indígena, tornando as

plantas medicinais brasileiras mundialmente famosas. Pelas mãos dos jesuítas, a

Triaga Brasílica, uma panacéia composta de elementos da flora nativa datada de

1766 e encontrada na Collecção de Receitas do Colégio dos Jesuítas da Bahia,

chegou a se tornar uma das principais fontes de renda da ordem jesuítica na Bahia

(RIBEIRO, 1971).

As terras brasílicas revelavam um excelente aproveitamento medicinal de

grande parte da sua exuberante natureza. O território brasileiro mostrava-se cada

vez mais como um grande fornecedor de matéria médica exótica. Muitas das

plantas, árvores e animais abundantes no Brasil serviam de antídoto contra as várias

doenças que na época multiplicavam-se rapidamente. A maioria dos cronistas

portugueses da época, particularmente os jesuítas, ofereceu atenção especial aos

efeitos terapêuticos das várias espécies brasílicas, revelando-se frequentemente

maravilhados com a grande utilidade médica das plantas brasileiras (SEIXAS, 2003).

O padre jesuíta Francisco Soares (1569-1567) em sua obra Coisas notáveis

do Brasil, dá o seguinte título ao capítulo V: “Das ervas que Dioscórides não teve

conhecimento nem fez menção, nem outros autores” e revela seu encantamento

com a quantidade, variedade e potenciais das ervas medicinais existentes nas terras

brasileiras (SEIXAS, 2003).

Os colonizadores, embora se mostrassem preconceituosos em relação aos

elementos culturais indígenas, se interessaram em recolher informações sobre como

os indígenas combatiam as doenças locais. Com isso, os colonizadores após

observarem a utilização dessas plantas, experimentavam, descreviam as

propriedades terapêuticas das novas espécies e seus usos, e divulgavam-nas na

metrópole. Mais tarde, tal informação retornava à colônia em compêndios de

farmacopeia, informando a atividade dos fitoterápicos (EDLER et al., 2005).

Em 1847, Theodor Peckolt chegou ao Brasil e analisou mais de 6.000 plantas,

publicando os resultados desse estudo em mais de 150 artigos (GOTTLIEB et al.,

1979). Embora muitas de suas análises sejam consideradas ultrapassadas pelos

padrões atuais, ele influenciou centenas de outros trabalhos sobre a flora medicinal

brasileira que o sucederam (PEIXOTO NETO, 2005).


Poucos são os trabalhos publicados por pesquisadores brasileiros quando

comparados com publicações de outros países a respeito do assunto e tal fato

contrasta com a riqueza da flora do país (GOTTLIEB, 1979). Os fatores que

contribuem para este panorama são: quantidade insuficiente de pesquisadores

interessados no assunto, falta de integração das diversas áreas da ciência, pouco

suporte financeiro, entre outros (GOTTLIEB, 1997). Em adição, a indústria

farmacêutica mostra pouco interesse no desenvolvimento de medicamentos para o

tratamento de doenças que acometam os países tropicais (DE MOURA et al., 2001).

Entretanto, a natureza não é apenas como uma fonte de moléculas bioativas,

pois, com as constantes devastações há a extinção de espécies e a perda de

inúmeras estruturas químicas biossintetizadas sem que se tome conhecimento

delas. Contudo, é necessário um mapeamento e quantificação da biodiversidade,

para que se possa ultrapassar o simples isolamento de um novo princípio ativo e

permitir o uso da mesma de maneira sustentável (GOTTLIEB, 1997).

2.6 Copaíba: histórico, aplicações e aspectos gerai s

Frei Vicente do Salvador, em um relato de 1627, faz menção a algumas

árvores muito grossas e altas chamadas copaíbas, que golpeadas ou furadas no

tempo do estio gotejam do seu interior um precioso óleo, utilizado na cura de muitas

enfermidades e no tratamento de quaisquer chagas, principalmente de feridas.

As copaibeiras aguçaram o interesse de viajantes, freis jesuítas e

historiadores, desta maneira, desde os primeiros anos de descobrimento, devido às

suas observações, tal planta vem sendo indicada para diversos fins farmacológicos

(PIERI et al., 2009).

Dwyer, em 1951, relatou diferentes usos pelas populações amazônicas do

óleo, dentre eles o seu emprego em infecções de garganta, em feridas, hematomas,

estimulante de apetite e, antes da descoberta de drogas mais efetivas, era utilizado

na América Tropical para o tratamento de hemorroidas e gonorreia.

O óleo de copaíba é um fitoterápico muito utilizado pelos amazonenses, isso

é verificado quando se analisa que, somente na cidade de Belém, as vendas do óleo


de andiroba e de copaíba combinadas atingiram dez mil litros no ano de 1994 e o

triplo disso em 2002 (LOPEZ et al., 2008).

As copaíbas são árvores nativas da América Latina e África Ocidental

(DWYER, 1951; PIERI et al., 2009). Há citação de uma espécie encontrada na Ilha

de Bornéo, na Malásia, chamada de Copaifera palustris, que apresenta

características bastante semelhantes as das espécies africanas (HOU, 1994). Na

América Latina são encontradas espécies na região que abrange desde o México ao

norte da Argentina (DWYER, 1951; VEIGA JUNIOR et al., 2002). No Brasil, essas

árvores estão localizadas principalmente nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e

Amazônica (PIERI et al., 2009; VEIGA JUNIOR et al., 2002).

O nome copaíba tem origem tupi “cupa-yba” e é relacionada à árvore que

contém depósito, ou que tem jazida, em alusão ao óleo que guarda em seu interior.

No Brasil são popularmente conhecidas como copaibeiras, pau d’óleo, copaíba,

copaúva, copai (CASCON, 2004), copaibarana, copaibo, copal e marimari. Seu óleo

é chamado de bálsamo ou óleo de copaíba. Nos demais países da América Latina,

denomina-se a árvore principalmente como “palo-de-bálsamo”. A denominação do

óleo-resina em inglês é “copaiba balsam” e do óleo volátil, “copaiba oil”. Em francês

a árvore é denominada “copayer”, a óleo-resina, “baume de copayer” e o volátil,

“huile de copayer” (CASCON, 2004; PIERI et al., 2009).

No território brasileiro encontra-se mais de vinte espécies da planta (DWYER,

1951). Entre as mais abundantes estão a C. officinalis L., C. guianensis Desf., C.

reticulata Ducke, C. multijuga Hayne, C. confertiflora Bth., C. langsdorffi Desf., C.

coriacea Mart. e C. cearensis Huber ex Ducke (VEIGA JUNIOR et al., 2002). O

gênero Copaifera possui 72 espécies catalogadas na edição de 1996 do livro Index

Kewensis e segundo estudos de Dwyer (1951), dezesseis espécies são encontradas

exclusivamente no Brasil, sendo que o óleo extraído pode variar em relação à

concentração e natureza dos diterpenos e sesquiterpenos presentes de acordo com

variações de espécies (PIERI et al., 2009)

A região Amazônica contém uma grande quantidade destas espécies, das

quais todas apresentam muitas similaridades, principalmente, com relação ao

tamanho da árvore (ROSA et al., 2009). A ocorrência dessas plantas abrange

diferentes habitats, desde matas de solos firmes, margens inundáveis de igarapé ou

rios, terrenos argilosos, matas de cerrado da região central do país até, em alguns


casos, terrenos arenosos (ALENCAR, 1981; ROSA, 2009). Em regiões com período

de seca prolongado, a ocorrência dessa árvore torna-se rara ou ocasional (ROSA et

al., 2009). A distribuição da copaíba abrange desde o médio Tapajós até a

Amazônia Ocidental (Amazonas, Acre e Rondônia), contudo apresenta-se ainda nas

regiões sul de Roraima, norte de Mato Grosso, Minas Gerais, Piauí, Bahia, Ceará e,

em pequena quantidade, nas demais regiões do Brasil (PIERI et al., 2009; ROSA et

al., 2009; VEIGA JUNIOR et al., 2002).

Essas plantas, segundo classificação botânica, pertencem à família

Leguminosae, subfamília Caesalpinoideae e gênero Copaifera (CASCON, 2004;

ROSA et al., 2009; VEIGA JUNIOR et al., 2002). Em alguns casos, podem viver por

até 400 anos e possuem, como característica, altura entre 25 e 40 metros (VEIGA

JUNIOR et al., 2002), casca aromática, madeira pesada, folhagem densa, flores

pequenas e frutos secos, do tipo vagem (ALENCAR, 1981). Suas sementes são

pretas e ovóides, com um arilo amarelo rico em lipídeos (ALENCAR, 1981; DWYER,

1951). A sua casca mostra uma coloração castanho-escura, superfície rugosa, com

aroma característico e agradável, sendo que o diâmetro do tronco, apesar de poder

chegar aos 80 centímetros, geralmente varia de 40 a 50 centímetros (ALENCAR,

1981; ROSA et al., 2009; VEIGA JUNIOR et a., 2002).

Do tronco extrai-se um óleo, cuja coloração varia do amarelo ao marrom, com

propriedades medicinais (PEDREIRA, 2007; PIERI et al.,2010a, PIERI et al., 2010b).

Apresenta folhas pinadas, podendo apresentar pontuações visíveis à transparência

e cheias de glândulas contendo óleo resinoso (ALENCAR, 1981; ROSA et al., 2009).

As folhas, quando recém-brotadas, mostram tonalidades avermelhadas

revestindo toda a copa (ROSA et al., 2009). As flores são sésseis, pequenas,

brancas, apétalas, hermafroditas e de cálice vermelho ferrugíneo (ALENCAR, 1981;

ROSA et al., 2009; VEIGA JUNIOR et al., 2002).

A identificação botânica da árvore é difícil, sendo, muitas vezes, realizada

devido às características das flores, como pelos nas sépalas, comprimento dos

anteros e a condição glaborosa ou não do pistilo (DWYER, 1951). As características

dos frutos são também relevantes, contudo esses são dificilmente encontrados em

coleções botânicas (DWYER, 1951).


Apesar do grande acervo na literatura sobre o óleo de copaíba, poucas

referências citam a identificação botânica da espécie de Copaifera estudada, o que

impossibilita a comparação de resultados entre os diferentes trabalhos realizados

(VEIGA JUNIOR et al., 2002).

O óleo-resina extraído da copaibeira apresenta diversas indicações na

medicina tradicional e tem sido, há vários anos, matéria de muitos estudos, os quais

visam comprovar a eficiência e adaptar o uso dessa planta. No Brasil, óleo de

copaíba tem sido estudado como importante fitoterápico (PEDREIRA, 2007; PIERI

2010a; PIERI et al., 2010b).

Os principais efeitos descritos são: anti-inflamatório (DWYER, 1951; RAMOS,

2006; VEIGA JUNIOR et al., 2002), analgésico (PENNAFORTE, 2003), antisséptico

(CASCON, 2004; RAMOS, 2006; VEIGA JUNIOR et al., 2002), cicatrizante (PIERI et

al., 2009; VEIGA JÙNIOR et al., 2002), antibacteriano, (PIERI et al., 2010a; PIERI et

al., 2010b) expectorante (RAMOS, 2006) e antitumoral (PEDREIRA, 2007).

Na Odontologia, pesquisas recentes têm demonstrado que o óleo de copaíba

apresenta ação antimicrobiana contra as bactérias formadoras do biofilme (PIERI et

al., 2010a). Testes foram empreendidos utilizando o cimento produzido a partir de

óxido de zinco e eugenol, utilizado para adequamento do meio bucal. Nesse

experimento eugenol foi substituído pelo óleo de copaíba devido à baixa toxicidade.

O cimento alterado, obtido a partir da associação do ZnO, Ca(OH)2 e óleo-resina de

Copaifera multijuga Hayne, manteve ou mesmo melhorou as suas propriedades e

mostrou ainda ação antimicrobiana, realizada através do teste de diluição em meio

líquido, frente às cepas padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S.

sanguinis (ATCC 15300) (VASCONCELOS et al., 2008).

Um estudo, realizado na Universidade Federal do Amazonas, comparou a

biocompatibilidade de um cimento experimental (Cop Endo) contendo óleo-resina de

copaíba com três cimentos endodônticos disponíveis no mercado (Endofill, Sealer 26

e AH-Plus). O procedimento experimental consistiu em um teste secundário para

avaliação da compatibilidade tecidual in vivo. Concluiu-se que apesar de todos os

materiais testados mostrarem-se irritantes, o cimento obturador a base de copaíba

(Cop Endo) mostrou ser menos agressivo (GARRIDO, 2004).


Os eventos adversos relatados pelo uso do óleo de copaíba têm se mostrado

leves ou ausentes (SOARES et al., 2006). A agência americana Food and Drug

Administration (FDA) classificou e regulamentou a utilização do óleo de copaíba,

assegurando que essa substância pode ser utilizada de maneira segura desde que

seguida às recomendações da agência (FDA, 2010).

Além da importância do óleo-resina para o tratamento de doenças, as

espécies do gênero Copaifera apresentam características em sua madeira que são

muito difundidas na construção civil (VEIGA JUNIOR et al., 2002) pois é durável,

exibe alta resistência ao ataque de fungos e microrganismos e dispõe de resistência

ao encharcamento por água (RIGAMONTE-AZEVEDO et al. 2004).

O óleo de copaíba tem sido utilizado há muito tempo pelas populações

amazônicas, contudo suas funções estendem-se além das utilidades medicinais,

abrangendo estudos de outras diversas funções como secativo na indústria de

vernizes (CASCON, 2004; RAMOS, 2006; RIGAMONTE AZEVEDO et al., 2006),

solventes em pinturas de porcelanas (VEIGA JUNIOR et al., 2002), aditivo na

confecção de borracha sintética (PIERI et al., 2009), aromatizante de alimentos

aprovado pelo Food and Drug Administration (CASCON, 2004), na indústria de

cosméticos (CASCON, 2004; RAMOS, 2006), na fabricação de cremes, sabonetes,

xampus e amaciantes de cabelos (CASCON, 2004).

O óleo extraído pode variar em relação à concentração e natureza dos

diterpenos e sesquiterpenos presentes de acordo com variações de espécies,

estações do ano e fatores biológicos como insetos e fungos (RAMOS, 2006),

embora alguns estudos com Copaifera duckei não tenham apresentado diferença

significativa na composição de óleos extraídos das mesmas árvores, em épocas

sazonais diferentes (PIERI et al., 2009).

O óleo de copaíba é solúvel em álcool absoluto, o qual é empregado como

teste para detectar adulteração do óleo de copaíba por óleo graxo. Embora o teste

da solubilidade em etanol possa ser útil se for utilizado em conjunto com outras

observações, ele não apresenta resultados conclusivos (VASCONCELOS et al.,

2002).


2.7 Melaleuca: histórico, aplicações e aspectos ger ais

Há muito tempo, antes da chegada dos europeus em suas terras, a população

indígena da Austrália utilizava o extrato da árvore melaleuca para o tratamento de

infecções cutâneas (BARCELOUX, 2008). A história dos aborígines australianos

descreve ainda a crença em lagos ou lagoas que possuíam a capacidade de cura,

os quais continham as folhas de Melaleuca alternifolia que haviam caído das árvores

(ALTMAN, 1988).

A produção comercial do óleo de melaleuca na Austrália teve início em 1920,

pois o uso do óleo em si tornou-se prática comum apenas após os primeiros relatos

de sua atividade antimicrobiana em uma série de trabalhos publicados por Penfold

(CARSON et al., 2006; PENFOLD et al., 1925). Essas pesquisas sugeriam que o

óleo extraído dessa árvore apresentava um agente antibacteriano mais eficaz que o

fenol, principal agente antibacteriano da época (BARCELOUX, 2008).

Segundo Carson et al.(1993), devido à destilação ser o processo utilizado

para extrair o óleo das folhas de M. alternifolia, é pouco provável que esta parte da

planta tenha sido usada pelos aborígines australianos.

Por muitas décadas, o óleo de melaleuca foi produzido através do corte

manual da planta seguido pelo processo de destilação em alambiques

(BARCELOUX, 2008). MacDonald (1930) publicou em um jornal australiano de

Odontologia um artigo em que o óleo de melaleuca foi enaltecido e sua qualidade

antisséptica ressaltada.

Durante a década de 1930, alguns médicos australianos começaram a

documentar o uso do óleo durante a prática profissional (CARSON et al., 1993).

Penfold et al. (1937) relataram várias condições que haviam respondido à aplicação

do óleo de melaleuca, como cicatrização de feridas, paroníquia (infecção na pele

adjacente à unha), empiema, doenças ginecológicas, epidermofitose, condições de

impetigo contagioso, micose e doenças envolvendo a região de garganta e boca.

Contudo, em meados da década de 1940, a produção do óleo começou a

declinar devido à disponibilidade de antibióticos. Nas décadas de 1970 e 1980, os

produtos naturais voltaram a se tornar mais populares, portanto, plantações de

árvores de melaleuca tornaram-se cultivadas na Austrália Ocidental, Nova Gales do


Sul e Queenslândia, os quais produziram o óleo essencial após extração através de

cortes e lascas da planta (BARCELOUX, 2008).

O gênero Melaleuca pertencente, à família Myrtaceae e abrange

aproximadamente 230 espécies, a maioria nativa da Austrália e Ilhas do Oceano

Índico (BARCELOUX, 2008; CARSON et al., 2006). Embora Melaleuca alternifólia

seja a principal fonte comercial de óleo de melaleuca, a hidrodestilação de outras

espécies de melaleuca também podem produzir óleos semelhantes, incluindo:

M.linariifolia, M. dissitiflora, M uncinata, M. cajuputi e M. quenervia (BARCELOUX,

2008).

Podem atingir de 5 a 8 metros de altura e exibem folhas longas, estreitas,

pontiagudas e alternas (PEREIRA, 1857; WHO, 2002). Suas flores são sésseis, com

espinhos e com coloração branca, amarelada ou arroxeada (PEREIRA, 1857).

Essas plantas são usadas principalmente na fabricação de cosméticos, germicidas,

agentes antissépticos, carminativos e no tratamento de várias doenças (FARAG,

2004).

Essa árvore é usualmente conhecida como "tea tree", “Australian tea tree” e

“árvore do chá” (PASTERNAK, 2008; WHO, 2002), embora esses nomes também

sejam utilizados para denominação das muitas outras espécies do gênero Melaleuca

(CARSON et al., 1993). Aetheroleum Melaleucae Alternifoliae é o óleo essencial

obtido a partir da destilação a vapor das folhas e ramos terminais da Melaleuca

alternifolia (WHO, 2002). Mesmo a designação "tea tree oil" mostra-se

potencialmente ambígua, uma vez que vários óleos quimicamente distintos são

destilados a partir de outras espécies de melaleuca (CARSON, 2006).

Apesar de Melaleuca alternifolia ser uma árvore nativa da Austrália

(BARCELOUX, 2008; WHO, 2002), quatro espécies são cultivadas como espécimes

botânicos em alguns jardins no Egito (FARAG et al., 2004).

No Brasil, a produção ainda é inexpressiva obrigando as indústrias de

cosméticos e casas de produtos naturais a adquirirem o produto mediante

importação, ocasionando no repasse final ao consumidor de um produto (cosmético,

farmacêutico e de higiene pessoal) com valores agregados. A baixa produção

brasileira está relacionada a vários fatores como a ausência de informações técnicas

relacionadas à produção de mudas da espécie (CASTRO et al., 2005).


Plantas do gênero Melaleuca são ricas em óleos voláteis (CARSON, 2006;

HAMMER et al., 2003). O óleo de melaleuca é composto por hidrocarbonetos

terpênicos, principalmente monoterpenos e sesquiterpenos, álcoois e seus

componentes. Os terpenos são hidrocarbonetos aromáticos, voláteis e podem ser

considerados polímeros de isopreno (BROPHY, 1989; CARSON et al., 2006).

Brophy et al. (1989) analisaram mais de 800 amostras de óleo de melaleuca

relatando cerca de 100 componentes e seus coeficientes de variação. O óleo de

melaleuca é moderadamente solúvel em água, miscível com solventes apolares

(ISO, 2004; CARSON et al., 2006) e solúvel em álcool a 20°C (WHO, 2002).

Soluções aquosas do óleo podem ser obtidas adicionando-se agentes emulsificantes

tradicionalmente utilizados pela indústria de cosméticos como o Tween 20 ou Tween

80, os quais não interferem nas propriedades antimicrobianas do óleo

(RAMACCIATO, 2000).

Alguns componentes do óleo de melaleuca tem previamente mostrado

propriedades antibacterianas, antifúngicas e anti-inflamatórias (in vivo), como o

terpinenol (terpinen-4-ol) e o α-terpineol, isoladamente ou sinergicamente com um

ou mais componentes menores (HART et al., 2000; PENFOLD et al., 1925). Em

1985, foi criada uma norma de qualidade para óleos de melaleuca na Austrália, que

em 1996 foi revisada e adotada como padrão internacional (BROPHY, 1989; KHAN

et al., 2010). O padrão australiano e a OMS exigem que óleo contenha quantidades

de 1,8-cineol abaixo de 15% e de terpinen-4-ol acima de 30%. O terpinen-4-ol é

encontrado em várias espécies de melaleuca (M. alternifolia, M.dissitiflora e

linariifoolia M.). O óleo deve conter ainda quantidade de sabineno superior a 3,5%, 1

a 6% de α-terpineno; 10 a 28% γ-terpineno; 0,5 a 12% �-cimeno e 1,5 a 8% de α-

terpineol, mensurados por cromatografia gasosa (WHO, 2002; KHAN et al., 2010).

O óleo de melaleuca não mancha, tem boas propriedades de penetração

tecidual, é compatível com sabões, sendo considerado um solvente poderoso

(RAMACCIATO, 2000). As pesquisas realizadas abrangem diversas utilizações

como aplicação tópica para o tratamento sintomático de doenças de pele comuns

(WHO, 2002), tais como acne (BASSETT et al., 1990), tinea pedis ("pé-de-atleta")

(BASSETT et al., 1990), oníchia micótica (WHO, 2002), antisséptico e desinfetante

para o tratamento de feridas (REYNOLDS, 2008), queimaduras (BOLES et al.,

2008), atividade antibacteriana (BANES-MARSHALL et al., 2001; CARSON et al.,


1993; CARSON et al., 2006; COX et al., 2000), antifúngica (BANES-MARSHALL et

al., 2001; COX et al., 2000), antiviral (GAROZZO et al., 2011), anti-inflamatória

(HART et al, 2000) e antitumoral (GREAY et al., 2010) Existem também dados

descritos na medicina popular, sem confirmações experimentais ou clínicas, no

tratamento de colites, tosses, resfriados, impetigo, psoríase, congestão nasal,

amigdalite (WHO, 2002). Jandourek et al. (1998), durante uma pesquisa clínica,

avaliaram a eficácia de uma solução oral a base de óleo de melaleuca para o

tratamento de candidose orofaringeana refratária ao fluconazol em 13 pacientes

portadores de HIV. Os pacientes fizeram uso de 15 mL de uma solução de

melaleuca, por meio de bochecho e gargarejo, quatro vezes ao dia, durante duas a

quatro semanas. Os pesquisadores concluíram que a solução pode ser um

tratamento alternativo para esta patologia.

COX et al. (2000), realizaram experimentos com o objetivo de analisar o

mecanismo de ação do óleo de melaleuca quando aplicado à Escherichia coli

(AG100), Staphylococcus aureus (NCTC 8325) e a Candida albicans. Os

pesquisadores relataram que quando expostos as suas respectivas concentrações

inibitórias mínimas e concentrações bactericidas/fungicidas mínimas, ocorria inibição

da respiração e o aumento da permeabilidade no citoplasma bacteriano e na

membrana plasmáticas de leveduras. As bactérias testadas, Escherichia coli e

Staphylococcus aureus, sofreram ainda efluxo de íons de potássio devido ao contato

com o óleo.

A evidência de quase 80 anos de uso do óleo de melaleuca sugere que o seu

uso tópico é relativamente seguro e que os efeitos adversos são ínfimos e

ocasionais (HAMMER et al., 2006). Contudo alguns dados publicados indicam que o

óleo é tóxico se ingerido em doses elevadas (CARSON et al., 2006; HAMMER et al.,

2006) e pode ainda causar irritação na pele quando utilizado em altas concentrações

(CARSON et al., 2006).

As reações alérgicas ocorrem em indivíduos pré-dispostos, possivelmente

devido aos vários produtos de oxidação formados pela exposição do óleo à luz e/ ou

ao ar (HAMMER et al., 2006). As reações adversas podem ser minimizadas evitando

a ingestão, aplicando somente o óleo diluído por via tópica e com o adequado

armazenamento do produto (HAMMER et al., 2006). Segundo o Scientific

Committee on Consumer Products (2004), apenas um estudo inadequado sobre a


genotoxicidade foi fornecido, portanto, nenhuma conclusão definitiva pode ser

relacionada à mutagenicidade e carcinogenicidade.

Jacobs et al. (1994) descreveram um caso de intoxicação de um menino de 1

ano e 11 meses, o qual apresentava confusão mental e impossibilidade de

locomoção, 30 minutos após a ingestão de uma quantidade inferior a 10 mL de óleo

de melaleuca puro. A criança foi encaminhada para um hospital próximo e

encontrava-se assintomática 5 horas após a ingestão.

A ingestão, de cerca de metade de um copo (120 ml) de óleo de melaleuca

por um paciente, acarretou na indução de um estado de coma com duração de 12

horas, seguido de 36 horas de um estado semiconsciente, acompanhado de

alucinações. Dor abdominal e diarreia com duração de até 6 semanas também

foram descritas (SEAWRIGHT, 1993). Nenhuma morte humana relacionada ao óleo

de melaleuca foi relatada na literatura (CARSON et al., 2006).

3 OBJETIVOS

Objetivos 53

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

A partir de testes in vitro realizados com digluconato de clorexidina e óleos de

copaíba e de melaleuca sobre Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas

gingivalis, propôs-se:

� Contribuir para o estudo sobre as pripriedades antimicrobianas dos óleos de

copaíoba e de melaleuca sobre Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas

gingivalis;

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

� Determinar a Concentração Inibitória Mínima dos óleos de copaíba e de

melaleuca sobre as cepas de Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas

gingivalis;

� Determinar a Concentração Bactericida Mínima das soluções sobre

Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis;

� Verificar a capacidade de coagregação e autoagregação das cepas

estudadas frente ao tratamento com concentrações subinibitórias das

soluções testadas.

4 MATERIAL E MÉTODOS

Material e Métodos 57

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Análises físico-químicas e cromatográficas dos óleos de copaíba e

melaleuca

O óleo de copaíba utilizado nos ensaios foi adquirido da empresa Opção

Fênix Distribuidora de Insumos Farmacêuticos. O óleo utilizado é proveniente de

Copaifera officinalis. Este óleo foi submetido à avaliação relativa à presença de

microrganismos, análise físico-química e cromatográfica. O laudo enviado pela

empresa continha análises microbiológicas e organolépticas. As análises

microbiológicas envolveram ensaios acerca da presença de Pseudomona

aureginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, os quais se mostraram

ausentes, e a contagem total de bactérias, bolores e leveduras, os quais se

revelaram dentro dos padrões especificados. Todas as análises microbiológicas

estavam de acordo com Farmacopeia Brasileira.

A análise organoléptica do óleo de copaíba revelou coloração castanho-

escura, líquido viscoso e odor característico. Os testes físico-químicos revelaram

valor de densidade (25 ºC) de 0,928 g/cm3, índice de acidez de 32,7 mgKOH/g,

índice de saponificação de 113,25 mg KOH/kg, índice de refração de 1,4925, teor de

essência de 40%, índice de iodo de 88 Wijs, índice de peróxido de 0,2meq/kg e

ausência de terebentina e de óleos de parafina. Os resultados se mostraram dentro

dos padrões especificados para confirmação de autenticidade do óleo de copaíba

(VASCONCELOS et al., 2002; BIAVATTI et al., 2006).

O óleo de melaleuca utilizado nos ensaios foi adquirido da empresa Berjé Inc.

O óleo utilizado é proveniente de Melaleuca alternifolia. O laudo enviado pela

empresa continha análises organolépticas, as quais revelavam aspecto líquido

límpido, incolor, odor característico, densidade (20 ºC) de 0,892 g/mL, índice de

refração (20 ºC) de 1,4777 e rotação óptica específica de 8,96. Todos os resultados

encontravam-se dentro dos padrões exigidos (ISO, 2004).

As amostras dos óleos sofreram identificação de seus analitos através da

análise qualitativa por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa.

Para o preparo da amostra, foram pesados 100 mg de cada óleo em balão

58 Material e Métodos

volumétrico de 5 mL e solubilizados com acetato de etila. Injetou-se então 1 µL no

cromatógrafo. O gás de arraste utilizado foi o Hélio, com vazão de 1 mL/min. O

equipamento utilizado foi um cromatógrafo a gás (6890, Hewlett Packard) acoplado a

um detector seletivo de massas (5975, Hewlett Packard). Foi utilizada uma coluna

(30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) (5MS, Hewlett Packard).

O digluconato de clorexidina foi obtido a partir da Deg, importadora de

Produtos Químicos Ltda.

4.2 Preparo das soluções a base de Copaifera officinalis e Melaleuca

alternifolia

Para possibilitar a solubilização dos óleos testados ao meio de cultura, foram

realizados testes de solubilidade com os seguintes reagentes: Tween 20, Tween 80,

álcool e dimetilsulfóxido (DMSO). Dentre essas substâncias, o Tween 80 obteve

comportamento mais estável, pois manteve os óleos solúveis por um período

prolongado, o que o torna eficiente devido à necessidade de solubilização dos óleos

nos meios de cultura por um longo período. A concentração utilizada em todos os

experimentos de Tween 80 foi de, no máximo, 5 µL/mL da concentração final do

meio de cultura acrescido ou não das substâncias testadas. Os testes de

solubilidade abrangeram os meios de cultura líquidos e a confecção de placas com

meios de cultura sólidos. Essas placas continham, por vezes, os óleos testados e

Tween 80. Quando concentrações mais elevadas dos óleos de melaleuca ou de

copaíba são utilizadas em meio de cultura líquido ou em água, esses se tornam

turvos e esbranquiçados, inviabilizando a leitura baseada na turbidez, tanto visual

quanto por espectrofotômetro, como mostra a figura 1.

Todo Tween 80 utilizado durante o experimento foi previamente autoclavado e

a solução de digluconato de clorexidina filtrada em filtro de millipore de 0,22 µm

(Biofil).


Figura 1 – Tubo de ensaio contendo água acrescida de óleo de copaíba a 100 µL/mL.

4.3 Microrganismos

Foram utilizadas cepas de Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) e

Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), obtidas a partir do Laboratório de

Microbiologia Oral do Instituto de Ciências Biomédicas, da Universidade de São

Paulo.

As culturas bacterianas criopreservadas a -80 ºC foram inoculadas em meio

ágar Brucella (Acumedia), suplementado com 5% de sangue desfibrinado de

carneiro (New Prov), 0,2% de extrato de levedura (Acumedia), 5 µg/mL de solução

de hemina (Sigma) e 1 µg/mL de solução de vitamina K (Sigma), seguindo-se

incubação em câmara de anaerobiose (Plas Lab) em atmosfera de 85% N2, 5% CO2

e 10% H2 à temperatura de 37 °C, por 4 dias. Após o desenvo lvimento de colônias

bacterianas, elas foram transferidas para tubos contendo 10 mL de Caldo Infusão de

Cérebro e Coração (BHI) (Acumedia) suplementado com 0,6% de extrato de

levedura, 5 µg/mL de hemina e 1 µg/mL de vitamina K. Após três dias de incubação

em anaerobiose, alíquotas de 100 µL destas culturas foram transferidas para um

novo tubo contendo 10 mL do caldo BHI suplementado. Seguiu-se incubação em

atmosfera de anaerobiose, por 16 horas.


4.4 Padronização do inóculo

Foi determinado o número de UFC e sua relação com a densidade óptica

(DO) das culturas desenvolvidas como descrito nesse item. Após mensuração da

DO em espectrofotômetro (JENWAY) ajustado a 560 nanômetros, a suspensão de

células bacterianas foi ajustada a DO560 ~ 0,7.

A seguir, a cultura foi diluída em série em PBS (pH 7,0), alíquotas de cada

uma das diluições foram semeadas em duplicata em placas contendo ágar Brucella

suplementado com hemina, vitamina K, sangue desfibrinado de carneiro e extrato de

levedura, e espalhadas com auxílio da alça de Drigalski. As placas foram incubadas

a 37 °C, em câmara de anaerobiose, por 72 horas par a posterior contagem das

colônias bacterianas no contador manual (Tecnalise).

4.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) das soluções

testadas

As concentrações inibitórias mínimas de cada substância foram determinadas

pelo método de diluição em ágar, preconizado por Clinical and Laboratory Standards

Institute (CLSI), o qual recomenda a técnica para todas as bactérias anaeróbicas.

Esse método permite uma interpretação e leitura de resultados mais simples quando

comparadas ao método de diluição em caldo (CLSI, 2007).

As placas foram preparadas com o meio ágar Brucella, suplementado com 5

µg/mL de hemina, 1 µg/mL de vitamina K; 0,2 % de extrato de levedura e 5% de

sangue desfibrinado de carneiro adicionado às diferentes concentrações das duas

substâncias testadas (óleo de copaíba e óleo de melaleuca). Placas contendo

diferentes concentrações de digluconato de clorexidina foram preparadas como

controle positivo. Também foram utilizadas, como controle, placas contendo apenas

o veículo (Tween 80) sem adição da substância ativa ao meio de cultura. Como

controle negativo foi utilizado apenas o meio de cultura sólido. O teste foi realizado

em duplicata.


As placas foram preparadas a partir de ágar Brucella suplementado, seguindo

as concentrações adequadas para cada substância (Tabela 1), a partir de soluções

de estoque (Figura 2).

Figura 2 – Soluções de estoque de óleos de copaíba, melaleuca e de digluconato de clorexidina.

200mg de digluconato de clorexidina

9,8mL de água

X1 X2 X3

X4 X5

1mL de X1

9mL de água

1mL de X2

9mL de água

X6

1mL de X3

9mL de água

1mL de X4

9mL de água

1mL de X5

9mL de água

C1 C2 C3

M M2 M4

10mL de óleo de melaleuca

500µL de Tween 80

ÓLEO DE COPAÍBA

ÓLEO DE MELALEUCA

DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA

1mL de M3

9mL de água

1,05mL de C1

8,95mL de água

1mL de C2

9mL de água

10mL de óleo de copaíba

500µL de Tween 80

M3

1mL de M2

9mL de água

1,05mL de M1

8,95mL de água


Tabela 1 - Meios de cultura preparados com as soluções ativas (quantidades para duas placas de Petri)

Substância

ativa (concentração)

Quantidade da

substância (mL)

Meio

(mL)

Água

(mL)

Sangue

(mL)

Copaíba 100 µL/mL 5,25 de C1 42,25 - 2,5

Copaíba 20 µL/mL 1 de C2 42,25 4,24 2,5

Copaíba 2 µL/mL 1 de C3 42,25 4,25 2,5

Copaíba 0,2 µL/mL 1 de C4 42,25 4,25 2,5

Melaleuca 20 µL/mL 1 de M1 42,25 4,25 2,5

Melaleuca 2 µL/mL 1 de M2 42,25 4,25 2,5

Melaleuca 0,2 µL/mL 1 de M3 42,25 4,25 2,5

Melaleuca 0,02 µL/mL 1 de M4 42,25 4,25 2,5

Clorexidina 200 µg/mL 0,5 de X1 42,25 4,75 2,5



Clorexidina 0,2 µg/mL 0,5 de X4 42,25 4,75 2,5



Nota: Siglas e sinais utilizados: - Ausência da substância C1 e M1 Respectivamente, óleo de copaíba e melaleuca acrescido

apenas de Tween 80 C2 e C3 Respectivamente, óleo de copaíba na concentração de 100

µL/mL e 10 µL/mL M2, M3 e M4 Respectivamente, óleo de melaleuca na concentração de

100 µL/mL, 10 µL/mL e 1 µL/mL X1, X2, X3, X4, X5 X6 Soluções de digluconato de clorexidina nas concentrações

de 20 mg/mL; 2 mg/mL; 0,2 mg/mL; 0,02 mg/mL; 0,002 mg/mL; 0,0002 mg/mL.

As placas foram inoculadas com suspensão padronizada de P. gingivalis e

de F. nucleatum, como descrito no item 4.4, correspondendo a 1X107UFC/mL.

Alíquotas de 10 µL de cada suspensão bacteriana foram inoculadas na superfície do

ágar com auxílio de pipeta multicanal, de maneira que cada placa continha 4 gotas

de Fusobacterium nucleatum e 4 gotas de Porphyromonas gingivalis (Figura 3).


.

Figura 3 – Placa de ágar Brucella suplementado demostrando a distribuição das gotas (10 µL) dos inóculos, onde o amarelo representa Fusobacterium nucleatum e o verde Porphyromonas gingivalis. A seta foi utilizada para a identificação das bactérias.

Todas as placas foram incubadas em câmara de anaerobiose por 72 horas a

37 ºC, seguindo-se a leitura visual. As menores concentrações de cada um dos

agentes antimicrobianos testados que corresponderam à ausência do crescimento

bacteriano foram consideradas as concentrações inibitórias mínimas de cada

agente. O experimento foi feito em duplicata.

4.6 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) das soluções

testadas

Visando determinar se a atividade antibacteriana das diferentes

concentrações das soluções antimicrobianas testadas foi bactericida ou

bacteriostática, foi determinada a concentração bactericida mínima.

Foram preparados tubos de caldo BHI suplementados com hemina e vitamina

K. Estes tubos foram acrescidos de concentrações iguais e maiores à CIM de cada

uma das substâncias, determinado no item 4.5.


Para a determinação da CBM da bactéria F.nucleatum, foi adicionado 100 µL

do inóculo aos tubos de ensaio contendo:

� 200 µg/mL e 20 µg/mL de digluconato de clorexidina

� 140 µL/mL, 120 µL/mL e 100µL/mL de óleo de copaíba

� 100 µL/mL, e 20 µL/mL de óleo de melaleuca

Para a determinação da CBM da bactéria P.gingivalis, adicionou-se 100µL do

inóculo aos tubos de ensaio contendo:

� 200µg/mL e 20µg/mL de digluconato de clorexidina

� 100 µL/mL, 20 µL/mL e 2 µL/mL de óleo de copaíba

� 100 µL/mL, e 20 µL/mL e 2 µL/mL de óleo de melaleuca

Como controle, para as duas bactérias, foram preparados tubos contendo

apenas BHI suplementado e tubos contendo meio acrescido de Tween 80 nas

seguintes concentrações: 5 µL/mL; 0,5 µL/mL; 0,05 µL/mL. Como controle negativo

foram feitos tubos contendo apenas o meio de cultura.

Os tubos foram incubados em câmara de anaerobiose a 37 ºC sob agitação

leve em plataforma agitadora para homogeneização das substâncias em óleo. Após

16 horas, todos os tubos foram centrifugados, 2500 x g a 10 ºC (Centrifuge 5804R,

Eppendorf). O sobrenadante foi dispensado e as células bacterianas foram

ressuspendidas em 1 mL de caldo BHI. Alíquotas de 100 µL de cada tubo foram

inoculadas em placas de ágar Brucella suplementado e espalhadas com auxílio da

alça de Drigalski.

Após 72 horas de incubação em câmara de anaerobiose a 37 ºC, as placas

foram analisadas visualmente. A CBM correspondeu a menor diluição que matou

mais de 99,9% das bactérias (não apresentando crescimento algum na placa

referida). Todo experimento foi realizado em duplicata.


4.7 Determinação do efeito das substâncias testadas em Concentração

Subinibitória sobre a autoagregação e coagregação d e P. gingivalis e F.

nucleatum

Este ensaio visou determinar a influência das concentrações subinibitórias

(CS) das três substâncias testadas (digluconato de clorexidina, óleos de melaleuca e

de copaíba) no processo de coagregação entre F.nucleatum e P.gingivalis e de

autoagregação destas bactérias.

4.7.1 Determinação da Concentração Subinibitória

As Concentrações Subinibitórias (CS) foram determinadas segundo o

protocolo utilizado por Cai (1994). Alíquotas de 100 µL de cultura de P. gingivalis ou

F. nucleatum correspondentes a 1X109UFC/ml foram inoculadas em tubos contendo

9,9mL de caldo BHI suplementado acrescido de diferentes concentrações de todas

as substâncias testadas.

Para o óleo de copaíba testado contra F.nucleatum foram utilizadas as

concentrações de 2 µL/mL; 0,2 µL/mL; 0,02 µL/mL e 0,002 µL/mL. O mesmo óleo foi

utilizado nas concentrações de 0,2 µL/mL; 0,02 µL/mL; 0,002 µL/mL e 0,0002 µL/mL

para o ensaio realizado com a bactéria P. gingivalis.

Na execução da CS do óleo de melaleuca contra F.nucleatum foram

utilizadas as concentrações de 2 µL/mL; 0,2 µL/mL; 0,02 µL/mL e 0,002 µL/mL e

contra P.gingivalis nas concentrações de 0,2 µL/mL; 0,02 µL/mL; 0,002 µL/mL e

0,0002 µL/mL.

As concentrações de digluconato de clorexidina utilizadas foram as mesmas

para as duas bactérias: 2 µg/mL; 0,2 µg/mL; 0,02 µg/mL; 0,002 µg/mL e 0,0002

µg/mL.

As DOs iniciais foram medidas em espectrofotômetro ajustado a 560

nanômetros logo após o preparo dos tubos com os inóculos, estabelecendo, deste

modo, as DOs iniciais.

Após 16 horas de incubação a 37 ºC em câmara de anaerobiose foram

mensuradas as DOs finais de cada um das culturas, e estas comparadas com as

DOs iniciais. As concentrações subinibitórias foram as maiores concentrações das

substâncias testadas que possibilitaram o desenvolvimento bacteriano equivalente a


um aumento no valor na densidade óptica (Abs560nm) igual ou mais próximo de 0,4

após 16 horas de incubação. O experimento foi realizado em triplicata.

4.7.2 Ensaio de Coagregação e Autoagregação

Alíquotas de 1 mL de cultura padronizada de F.nucleatum ou P.gingivalis

(1X109UFC/ml) foram inoculadas em 100 mL de caldo BHI suplementado acrescido

das substâncias teste em suas diferentes concentrações subinibitórias. Foi utilizado

o meio sem adição das substâncias como controle. Após 16 horas de incubação em

atmosfera de anaerobiose a 37 ºC foi determinada a capacidade de autoagregação e

coagregação das células bacterianas.

Para este ensaio foram utilizadas microplacas de 96 poços de fundo redondo,

pré-tratadas por PBS com Tween 20 (0,05%) por 30 minutos. Após a secagem da

microplaca dentro de câmara de fluxo laminar, os inóculos das bactérias foram

ajustados (DO660 ~ 1,0). Sucederam-se então a centrifugação a 10 ºC, 6000 x g, por

2 minutos em centrífuga (5402, Eppendorf). O sobrenadante foi removido e as

bactérias foram ressuspendidas em tampão de coagregação (0.1mM CaCl2, 0.1mM

MgCl2, 0.15M NaCl e 0.02% NaN3, dissolvidos em solução Tris 1.0mM e ajustados

em pH 8.0). As células bacterianas foram lavadas mais duas vezes neste tampão.

Para o ensaio de coagregação, cada poço recebeu 50 µL de suspensão padronizada

de F.nucleatum e P.gingivalis desenvolvidas anteriormente na presença ou ausência

de concentrações subinibitórias de cada uma das sustâncias testadas. Para o ensaio

de autoagregação, os poços receberam 50 µL de suspensão de cada bactéria e 50

µL de tampão de coagregação (Figura 4).


Figura 4 - Microplacas de 96 poços de fundo redondo, mostrando as combinações realizadas entre as bactérias tratadas para o ensaio de coagregação (A) e autoagregação (B), os quais apresentam P.gingivalis, Pg; F.nucleatum, Fn; P.gingivalis que foram expostas ao óleo de melaleuca, Pg(M); P.gingivalis expostas ao óleo de copaíba, Pg(C); P.gingivalis tratadas com digluconato de clorexidina, Pg(X); F.nucleatum expostas ao óleo de melaleuca, Fn(M); F.nucleatum expostas ao óleo de copaíba, Fn(C), F.nucleatum expostas ao digluconato de clorexidina, Fn(X) e tampão de coagregação (T). Antes da introdução destes inóculos na microplaca, todos foram lavados duas vezes com tampão de agregação.

As microplacas foram mantidas sob agitação em plataforma agitadora

(230400, Boekel Scientific), a 25 ºC. Após cinco minutos, foi iniciada a leitura da

DO655nm de cada um dos poços em leitor de microplacas (680, Bio Rad). As leituras

foram realizadas por 10 minutos com intervalos de 2 minutos, por mais 30 minutos a

intervalos de 5 minutos, por 20 minutos a intervalos de 10 minutos totalizando 60

minutos de medições. A análise foi realizada a partir das diferenças de densidades

ópticas entre os intervalos mensurados, comparadas ao controle negativo.

Para análise estatística foi utilizado o programa GraphPad Prism (versão

5.04), para avaliação da significância estatística foi aplicada a Análise de Variância

(ANOVA) e o teste de hipótese de Dunnet, que possibilitou a comparação do

comportamento dos diferentes grupos de bactérias tratadas em relação ao tempo

em que foram medidas as DOs e ao controle negativo (bactérias sem tratamento).

Pg Fn

Fn(X) Pg(X)

Fn(M) Pg(M)

Fn(C) Pg(C)

Pg Fn(X)

Pg(C) Fn

Pg(M) Fn

Pg(X) Fn

Pg Fn(C)

Pg Fn(M

)

T Fn

T Fn(X)

T Fn(C)

T Fn

T Pg(C)

T Pg(M)

T Pg(X)

T Pg

T Fn(M)

A

B

5 RESULTADOS

Resultados 71

5 RESULTADOS

5.1 Identificação do óleo de Melaleuca alternifolia e de Copaifera officinalis

Após análise qualitativa por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria

de massas, o óleo de copaíba apresentou como principais constituintes,

respectivamente: trans-cariofileno, germacreno B, α-humuleno, germacreno D e α-

copaeno. Outros analitos foram identificados, entretanto, concentrações menores.

Cinco constituintes não foram identificados, contudo, o que se apresentava em maior

concentração alcançava apenas 0,73% do óleo. Os dados integrais estão

apresentados na tabela 2.

72 Resultados

Tabela 2 - Analitos identificados no óleo de copaíba

tR (min) (a) IR (b) Identificação %rel. (c)

19,22 1335 δ-elemeno 0,53

19,72 1347 α-cubebeno 0,63

20,79 1373 α-copaeno 4,16

21,48 1389 β-elemeno 2,88

21,70 1395 cipereno 0,44

22,66 1419 trans-cariofileno 50,78

23,14 1431 γ-elemeno 0,89

23,25 1433 α-trans-bergamoteno 4,04

23,92 1450 α-humuleno 6,81

24,16 1456 seicheleno 0,47

24,87 1473 γ-muuroleno 1,34

25,02 1477 germacreno D 5,97

25,18 1481 β-selineno 0,75

25,60 1492 biciclogermacreno 0,95

25,79 1496 α-muuroleno 0,38

25,93 1500 α-bisaboleno 0,43

26,16 1506 β-bisaboleno 2,61

26,32 1510 γ-cadineno 0,69

26,71 1520 δ-cadineno 2,77

27,09 1530 M=204 0,43

27,95 1552 germacreno B 7,43

28,41 1565 álcool cariofileno 0,48

30,20 1612 M=222 0,60

31,32 1642 α-muurolol 0,57

31,61 1650 α-cadinol 0,66

33,07 1691 M=222 0,70

41,65 1945 M=262 0,73

44,86 - M=272 0,41

52,09 - ácido copálico 0,47

Nota: As siglas utilizadas significam:

(a) Tempo de arraste (b) Índice de retenção (c) Fração em porcentagem da área total integrada para o cromatograma

Resultados 73

O óleo de melaleuca, após identificação de sua composição, apresentou os

seguintes constituintes, respectivamente, em maiores concentrações: terpin-4-ol, γ-

terpineno, α-terpineno, terpinoleno e 1,8-cineol. Outros analitos foram identificados,

porém em menores concentrações. Todos os constituintes identificados no óleo

estão dispostos na tabela 3.

Tabela 3 - Analitos identificados no óleo de melaleuca

tR (min) (a) IR (b) Identificação %rel. (c)

4,64 926 α-tujeno 1,01

4,81 933 α-pineno 2,41

5,75 973 sabineno 0,42

5,84 977 β-pineno 0,66

6,19 991 β-mirceno 0,73

6,59 1006 α-felandreno 0,47

6,98 1017 α-terpineno 11,17

7,20 1024 para-cimeno 2,07

7,34 1028 limoneno 1,55

7,40 1030 1,8-cineol 3,31

8,36 1059 γ-terpineno 21,22

9,33 1088 terpinoleno 3,55

10,53 1121 cis-para-ment-2-en-1-ol 0,29

12,89 1181 terpin-4-ol 40,17

13,30 1191 α-terpineol 2,97

22,13 1405 α-gurjuneno 0,49

22,51 1415 trans-cariofileno 0,53

23,30 1434 aromadendreno 1,37

24,16 1456 allo-aromadendreno 0,63

24,71 1469 Cis-muurola-4(14),5-dieno 0,45

25,57 1491 α-selineno 1,97

26,70 1520 δ-cadineno 2,09

28,95 1579 globulol 0,47

Nota: As siglas utilizadas significam: (a) Tempo de arraste (b) Índice de retenção (c) Fração em porcentagem da área total integrada para o cromatograma

74 Resultados

5.2. Análise da concentração inibitória mínima das soluções testadas

5.2.1 Padronização do inóculo de P. gingivalis e F. nucleatum

Foram determinados os valores de UFC/mL de cada uma das amostras, após

desenvolvimento por 16 horas em meio BHI suplementado, correspondente à fase

de crescimento exponencial. Os dados de média e desvio padrão de UFC/ml das

culturas padronizadas a Abs 560nm~0,7 estão apresentados na tabela 4.

Tabela 4 - Valores médios de UFC/ml de cultura de P. gingivalis e F. nucleatum em Abs560nm~0,7

Bactérias Média Desvio padrão Coeficiente de

variação (%)

P. gingivalis 2,34 X 10⁹ 2 0,85

F.nucleatum 1,1 X 10⁹ 4 3,6

5.2.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM)

A partir de inóculos padronizados de cada amostra bacteriana, foram obtidos

os resultados de CIM para cada um dos agentes testados e para o agente controle

(digluconato de clorexidina). Houve crescimento bacteriano em todos os meios de

cultura sem adição das soluções teste. Além disso, a adição de Tween 80 na maior

concentração empregada (5µL/mL), como veículo das soluções teste, não resultou

em qualquer inibição do crescimento bacteriano.

A CIM do óleo de copaíba e a de melaleuca mostrou diferentes resultados

para as bactérias testadas, sendo que Fusobacterium nucleatum foi mais resistente

aos dois óleos testados, quando comparada a Porphyromonas gingivalis.

A solução do óleo de copaíba apresentou ação antimicrobiana contra

Porphyromonas gingivalis a partir de 2 µL/mL, enquanto a CIM deste mesmo óleo

contra Fusobacterium nucleatum foi de 100 µL/mL.

O óleo de melaleuca apresentou CIM de 2µL/mL contra Porphyromonas

gingivalis e de 20µL/mL contra Fusobacterium nucleatum.

Resultados 75

Por outro lado, as amostras bacterianas testadas foram igualmente sensíveis

ao digluconato clorexidina, sendo a CIM determinada em 20 µg/mL. As fotografias

do resultado deste experimento podem ser observadas na figura 5.

Figura 5 – Placas de ágar Brucella acrescido de sangue e suplementado como hemina e vitamina K, contendo os agentes testados, inoculadas com inóculos padronizados de F. nucleatum e P. gingivalis. Em (A) placa controle negativo, mostrando crescimento de F.nucleatum (fileira central) e P.gingivalis (fileira direita) Em (B) placa com óleo de copaíba a 20µL/mL mostrando apenas crescimento de F.nucleatum. Em (C), placa com digluconato de clorexidina a 2µg/mL mostrando crescimento bacteriano. Em (D), placa com óleo de copaíba 100µL/mL e em (E), placa contendo óleo de melaleuca 20µL/mL, ambas não mostraram crescimento de nenhuma das bactérias testadas.

5.3 Concentração Bactericida Mínima (CBM)

A CBM foi determinada utilizando-se concentrações dos agentes maiores ou

iguais às CIMs. Os controles negativos contendo Tween 80 e os que continham

apenas o meio de cultura não resultaram em morte das bactérias testadas.

A solução à base de óleo de copaíba foi bactericida em todas as

concentrações testadas contra F.nucleatum, tendo como CBM o valor de 100µL/mL

(CBM=CIM), indicado pela ausência de crescimento da bactéria em ágar Brucella

suplementado. Para P.gingivalis o óleo de copaíba foi bacteriostático nas

concentrações testadas.

B C

D E

A

76 Resultados

Resultados 77

A solução contendo o óleo de melaleuca foi bactericida para F.nucleatum e

P.gingivalis a partir de 20 µL/mL. Portanto, para F.nucleatum, o óleo de melaleuca

apresentou o valor da CBM semelhante ao encontrado na CIM.

O digluconato de clorexidina foi bactericida para F.nucleatum a partir de 20

µg/mL (CIM=CBM) e para P.gingivalis na concentração de 200 µg/mL.

5.4 Determinação das concentrações subinibitórias

Foi determinada a concentração de cada um dos agentes testados que

permitia o crescimento bacteriano similar ao controle, atingindo uma Abs560nm~0,4,

após 16 horas de incubação sob condições padronizadas. Ambas as bactérias se

desenvolveram adequadamente em caldo BHI suplementado sem a adição das

soluções testadas (controle negativo), sendo que a cultura de F. nucleatum atingiu a

Abs560nm~0,48±0,03 e de P. gingivalis Abs560nm~0,43±0,09.

O óleo de copaíba em concentração de 0,02µL/mL para F.nucleatum e de

0,002µL/mL para P.gingivalis, permitiu o crescimento bacteriano.

Foi observado crescimento bacteriano com a adição de óleo de melaleuca

para F.nucleatum na concentração de 0,02µL/mL e para P.gingivalis na

concentração de 0,002µL/mL.

A adição de digluconato de clorexidina nas culturas de P.gingivalis e

F.nucleatum na concentração de 0,2µg/mL permitiu crescimento bacteriano similar

ao controle negativo.

78 Resultados

5.5 Correlação entre as soluções testadas e o contr ole negativo em ensaio de

autoagregação

O ensaio de autoagregação foi realizado com a finalidade de determinar o

efeito de doses subinibitórias de digluconato de clorexidina, óleo de melaleuca e

óleo de copaíba na capacidade de autoagregação. Esse ensaio foi realizado com as

amostras de F. nucleatum (ATCC 25586) e de P. gingivalis (ATCC 33277), contudo,

essa última não foi capaz de se autoagregar nas condições empregadas.

Os dados foram analisados em espectrofotômetro ajustado a 655nm, em que

era mensurada a densidade óptica do agregado de células formado no fundo do

poço.

Quando as células de F.nucleatum foram tratadas com óleo de copaíba houve

redução no processo de autoagregação, em quase todos os intervalos analisados,

quando comparadas a F.nucleatum sem tratamento (Tabela 5).

O tratamento de F.nucleatum com óleo de melaleuca mostrou-se também

bastante eficaz na inibição de autoagregação quando comparado às bactérias sem

tratamento (Tabela 5).

As células de F.nucleatum tratadas com digluconato de clorexidina também

apresentaram inibição de autoagregação, em quase todos os intervalos analisados,

quando comparadas às bactérias do controle negativo (Tabela 5).

Resultados 79

Tabela 5 - Diferença de DO655nm em diferentes intervalos de tempo em ensaio de autoagregação de F.nucleatum expostas ao pré-tratamento com concentração subinibitória de digluconato de clorexidina

(X), óleo de melaleuca (M) e óleo de copaíba (C) e no controle não tratado (Fn) Intervalos (min) Fn Fn (C) Fn (M) Fn (X)

2 a 4 0,011 0,001 ** 0,003 ** 0,001**

4 a 6 0,000 -0,004 0,001 0,002

6 a 8 0,008 -0,001 *** 0,001 ** 0,004 *

8 a 10 0,009 0,000 *** 0,001 *** 0,003 ***

10 a 15 0,014 -0,001 ** -0,003 ** 0,001 **

15 a 20 0,011 0,000 ** -0,001 *** 0,003 **

20 a 25 0,009 -0,001 ** -0,001 ** 0,001 **

25 a 30 0,007 0,000 ** 0,000 ** 0,001 **

30 a 35 0,008 0,000 *** -0,001 *** 0,001 **

35 a 40 0,008 -0,001 *** 0,000 ** 0,001 **

40 a 50 0,006 0,000 ** -0,002 *** -0,002 **

50 a 60 0,007 -0,002 ** -0,003 *** 0,000 **

Notas: Siglas e sinais utilizados: Fn(C) F.nucleatum tratado com óleo de copaíba Fn(M) F.nucleatum tratado com óleo de melaleuca Fn(X) F.nucleatum tratado com digluconato de clorexidina Fn F.nucleatum sem tratamento * Significante (p< 0,5) estatisticamente em relação ao F.nucleatum sem

tratamento ** Muito significante (p< 0,01) estatisticamente em relação ao F.nucleatum sem

tratamento *** Extremamente significante (p< 0,001) estatisticamente em relação ao

F.nucleatum sem tratamento

80 Resultados

5.6 Correlação entre as soluções testadas e o contr ole negativo em ensaio de

coagregação

As células de P. gingivalis e F. nucleatum que se desenvolveram na presença

de doses subinibitórias dos agentes testados foram submetidas a ensaios de

coagregação. Os ensaios foram realizados tratando-se apenas F. nucleatum,

apenas P. gingivalis ou ambas as amostras com as concentrações subinibitórias de

digluconato de clorexidina, óleo de melaleuca, óleo de copaíba e estes comparados

aos dados obtidos ao grupo sem tratamento (controle).

Os dados de coagregação foram também representados pela mensuração da

DO das células bacterianas agregadas precipitadas no fundo do poço. Como

apresentado na figura 5, visualmente, foi possível notar, em alguns poços, a

formação de agregado bacteriano, indicando o processo de coagregação (Figura 6).

Figura 6 - Microplaca contendo bactérias em processo de coagregação

Resultados 81

Os dados relativos à coagregação de F. nucleatum tratados com as diferentes

substâncias e P. gingivalis sem tratamento estão apresentados na tabela 6. Pode

ser observado que apenas o tratamento de F.nucleatum com o óleo de copaíba foi

capaz de inibir a coagregação com P. gingivalis (Tabela 6).

Tabela 6 - Diferença de DO655nm em diferentes intervalos de tempo em ensaio de coagregação entre F.nucleatum expostas ao pré-tratamento com P.gingivalis sem tratamento

Intervalo (min) Fn Pg Fn(C) Pg Fn(M) Pg Fn(X) Pg

2 a 4 0,005 0,000 0,009 0,002

4 a 6 0,003 -0,001 * 0,004 0,002

6 a 8 0,005 0,000 * 0,005 0,004

8 a 10 0,004 0,000 * 0,006 0,004

10 a 15 0,003 -0,002 ** 0,006 0,001

15 a 20 0,002 -0,004 * 0,003 0,002

20 a 25 0,005 -0,006 ** 0,008 0,003

25 a 30 0,000 -0,004 0,001 0,002

30 a 35 0,001 -0,004 * 0,001 0,001

35 a 40 -0,001 -0,005 0,002 0,002

40 a 50 -0,002 -0,007 -0,002 0,000

50 a 60 -0,002 -0,005 -0,001 0,000

Notas: Siglas e sinais utilizados:

Fn(C) Pg F.nucleatum tratado com óleo de copaíba associada à bactéria P.gingivalis sem tratamento

Fn(M ) Pg F.nucleatum tratado com óleo de melaleuca associada à bactéria P.gingivalis sem tratamento

Fn(X) Pg F.nucleatum tratado com digluconato de clorexidina associada à bactéria P.gingivalis sem tratamento

Fn Pg F.nucleatum e P.gingivalis sem tratamento * Significante (p< 0,5) estatisticamente em relação às bactérias sem

tratamento ** Muito significante (p< 0,01) estatisticamente em relação às bactérias sem

tratamento

82 Resultados

Quando o tratamento com uma das três substâncias foi realizado em

P.gingivalis e estes submetidas ao ensaio de coagregação com F.nucleatum sem

tratamento, foi observada uma leve alteração na capacidade de coagregação com

as três soluções em apenas alguns intervalos de tempo (Tabela 7). Deve ser

salientado que o tratamento de P. gingivalis com óleo de melaleuca, e em menor

grau com clorexidina, resultou em maiores valores de DO nos momentos iniciais

(Tabela 7).

Tabela 7 - Diferença de DO655nm em diferentes intervalos de tempo em ensaio de coagregação entre P.gingivalis expostos ao pré-tratamento e F.nucleatum sem tratamento

Notas: Siglas e sinais utilizados: Fn Pg(C) F.nucleatum sem tratamento associada à bactéria P.gingivalis tratado com óleo de

copaíba Fn Pg(M) F.nucleatum sem tratamento associada à bactéria P.gingivalis tratado com óleo

de melaleuca Fn Pg(X) F.nucleatum sem tratamento associada à bactéria P.gingivalis tratado com

digluconato de clorexidina Fn Pg F.nucleatum e P.gingivalis sem tratamento * Significante (p< 0,5) estatisticamente em relação às bactérias sem tratamento - Bactérias apresentaram coagregação maior que o controle negativo (p<0,05)

Quando ambas as amostras bacterianas, F.nucleatum e P.gingivalis, foram

submetidas ao tratamento com uma das três substâncias, foi observado uma

redução na capacidade de coagregação apenas com copaíba, de maneira análoga

ao que ocorreu quando apenas uma das bactérias foi tratada com este agente

Intervalo (min) Fn Pg Fn Pg (C) Fn Pg(M) Fn Pg (X)

2 a 4 0,005 0,012 0,019 - 0,018 -

4 a 6 0,003 0,003 0,007 - 0,005

6 a 8 0,005 0,002 0,007 0,004

8 a 10 0,004 0,001 * 0,005 0,003

10 a 15 0,003 0,000 0,006 0,001

15 a 20 0,002 -0,003 * 0,004 0,001

20 a 25 0,005 -0,004 * 0,007 0,004

25 a 30 0,000 -0,005 * 0,001 -0,001

30 a 35 0,001 -0,004 * 0,001 -0,002

35 a 40 -0,001 -0,005 0,001 -0,001

40 a 50 -0,002 -0,006 * -0,001 -0,003

50 a 60 -0,002 -0,002 0,001 -0,002

Resultados 83

(Tabela 8). Por outro lado, o crescimento com óleo de melaleuca resultou em

aumento da coagregação em relação ao controle em um dos intervalos de tempo

analisados, como havia sido observado anteriormente com o tratamento apenas de

P. gingivalis.

Tabela 8 – Resultado do processo de coagregação entre P.gingivalis e F.nucleatum expostas ao pré-tratamento

Intervalo (min) Fn Pg Fn(C) Pg(C) Fn(M) Pg(M) Fn(X) Pg (X)

2 a 4 0,005 0,002 0,004 0,006

4 a 6 0,003 0,000 0,005 0,003

6 a 8 0,005 0,002 0,003 0,003

8 a 10 0,004 0,001 0,003 0,003

10 a 15 0,003 0,000 0,004 0,000

15 a 20 0,002 0,001 0,003 0,002

20 a 25 0,005 -0,002 *** 0,008 0,005

25 a 30 0,000 -0,002 0,002 0,001

30 a 35 0,001 -0,003 *** 0,003 - 0,001

35 a 40 -0,001 -0,003 0,003 0,000

40 a 50 -0,002 -0,006 -0,001 -0,002

50 a 60 -0,002 -0,005 0,001 -0,002

Notas: Siglas e sinais utilizados:

Fn(C) Pg(C) F.nucleatum tratado com óleo de copaíba associada à bactéria P.gingivalis tratado com o mesmo óleo

Fn(M) Pg(M) F.nucleatum tratado com óleo de melaleuca associada à bactéria P.gingivalis tratado com o mesmo óleo

Fn(X) Pg(X) F.nucleatum tratado com digluconato de clorexidina associada à bactéria P.gingivalis tratado com a mesma substância

Fn Pg F.nucleatum e P.gingivalis sem tratamento *** Extremamente significante (p< 0,001) em relação às bactérias sem

tratamento - Bactérias apresentaram coagregação maior que o controle negativo

(p<0,05)

84 Resultados

6 DISCUSSÃO

Discussão 87

6 DISCUSSÃO

6.1 Escolha dos óleos e bactérias

Atualmente, a distribuição e a gravidade das doenças periodontais variam

entre as diferentes partes do mundo e dentro do mesmo país ou região

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).

Em 2003, o Ministério da Saúde executou um levantamento epidemiológico

de âmbito nacional na área de Saúde Bucal, que englobou 23 municípios, além das

26 capitais brasileiras e o Distrito Federal, com valor representativo das cinco

macrorregiões do país. A percentagem de pessoas sem nenhum problema

periodontal nas faixas etárias de 15 a 19, 35 a 44 e 65 a 74 anos de idade foi,

respectivamente, 46,2%, 21,9% e 7,9%. Chama atenção o grande número de

sextantes excluídos da pesquisa devida a ausência de dentes. Na faixa de 65 a 74,

por exemplo, mais de 80% dos sextantes examinados foram excluídos, ou seja, não

apresentavam nenhum dente presente ou apresentavam apenas um dente funcional

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).

Em âmbito mundial, a doença periodontal é uma das duas doenças que mais

afetam a população. Cerca de 10 a 15% da população mundial adulta contém bolsas

periodontais profundas, com mais de 6 milímetros (PETERSEN et al., 2005).

F.nucleatum é uma das bactérias Gram-negativas que se estabelecem nos

biofilmes e exercem um papel fundamental nas interações físicas entre as bactérias

Gram-negativas e Gram-positivas, o que a torna importante para a colonização,

além de contribuir para o estabelecimento de condições propícias para o surgimento

de bactérias anaeróbias, intolerantes ao oxigênio. Considera-se F.nucleatum um

colonizador intermediário entre as bactérias comensais e os patógenos (SIGNAT et

al.,2011).

Entre as várias bactérias encontradas no biofilme subgengival, acredita-se

que P.gingivalis seja o principal organismo associado com a doença periodontal

crônica (PATHIRANA et al., 2010). Evidências sugerem que a redução dos níveis

dessa bactéria em um sítio doente estava associada com a resolução da doença

88 Discussão

neste local (VAN DYKE et al., 1988). Acredita-se ainda que esta bactéria possua a

capacidade de invadir e se disseminar entre as células epiteliais, além de degradar

os componentes da matriz celular e junções celulares (ANDRIAN et al., 2004;

TRIBBLE et al., 2010).

O metronidazol foi introduzido no tratamento de infecções periodontais e

causa a morte celular devido à interferência na síntese de ácidos nucléicos. Essa

substância é eficaz contra bactérias anaeróbias Gram-positivas e Gram-negativas,

incluindo P. intermedia, P. gingivalis e Fusobacterium sp (POULET et al.,1999).

Portanto, a falta de especificidade do antimicrobiano acaba alterando a microbiota

normal.

A clorexidina tem sido usada efetivamente por mais de 30 anos como

antisséptico bucal (DUMITRESCU, 2010). Entretanto, apesar dos diversos efeitos

colaterais que impossibilitam seu uso prolongado (AUTIO GOLD, 2008;

DUMITRESCU, 2011; FDA, 1998; YONG et al., 1995), um fato raramente

considerado é a possibilidade de interações entre os componentes dos

enxaguatórios à base de clorexidina e os componentes dos dentifrícios, como o lauril

sulfato de sódio e o monofluorfosfato de sódio, os quais podem reagir com o

digluconato de clorexidina e assim participar da formação de sais de baixa

solubilidade com diminuição da eficácia do enxaguatório (BARKVOLL et al., 1988;

BARKVOLL et al., 1989).

A copaíba é uma planta comum a várias regiões do Brasil, sendo, muitas

vezes, utilizada de maneira empírica, principalmente pela população indígena. Na

cidade de Jordão, no Acre, muitas famílias utilizam esse óleo na região do coto

umbilical de recém-nascidos. O óleo de copaíba, em nosso estudo mostrou não

apenas um efeito antimicrobiano, como uma ação inibitória do processo de

agregação bacteriana em concentrações que permitem o desenvolvimento

bacteriano próximo ao normal, ditas concentrações subinibitórias.

O óleo de melaleuca vem tendo um enaltecimento de suas propriedades nas

últimas décadas, como sua atividade anti-inflamatória e antimicrobiana de amplo

espectro, portanto muitas pesquisas têm sido voltadas para sua ação antimicrobiana

contra periodontopatógenos (HAMMER et al., 2003; KULIK et al., 2000; SHAPIRO et

al., 1994; TAKARADA et al., 2004). Nota-se um interesse, no campo da pesquisa

muito maior nesse óleo quando comparado ao óleo de copaíba, esse último muito

Discussão 89

encontrado no Brasil. Os resultados encontrados neste trabalho sugerem que apesar

de apresentarem comportamentos diferentes frente aos experimentos realizados,

ambos foram capazes de inibir o desenvolvimento microbiano e interferir na

interação bacteriana, possivelmente interferindo na formação do biofilme dental.

6.2 Identificação do óleo de melaleuca

O óleo de melaleuca contem vários monoterpenos e sesquiterpenos, assim

como componentes aromáticos. Aproximadamente 100 terpenos podem ser

encontrados no óleo, mais de 60 destas substâncias já foram identificadas

(SCIENTIFIC COMMITTEE ON CONSUMER PRODUCTS, 2004).

Os monoterpenos terpinen-4-ol (40,17%), γ-terpineno (21,22%), α-terpineno

(11,17%), 1,8-cineol (3,31%), para-cimeno (2,07%), α-terpineol (2,97%), α-pineno

(2,41%), terpinoleno (3,55%), limoneno (1,55%) e sabineno (0,42%) são

responsáveis por 88,84% da composição do óleo de melaleuca utilizado em nosso

trabalho, este dado corrobora a determinação do Scientific Committee on Consumer

Products (2004), a qual declara que estes monoterpenos devem ser responsáveis 80

a 90 % da composição do óleo.

Os principais analitos encontrados em nosso óleo (Tabela 2) seguem os

padrões recomendados por World Health Organization (WHO) (2002) e International

Organization for Standardization (ISO) (2004), os quais exigem respetivamente, α-

pineno (1 a 5%; 1 a 6%,), sabineno (até 3,5% pela ISO), α-terpineno (2,7 a 13%; 5 a

13%), ρ-cimeno (0,5 a 8%, 0,5 a 12%), limoneno (1 a 5%; 0,5 a 1,5%), 1,8-cineol

(4.5 a 16.5%; até 15%); γ-terpineno (10 a 28% em ISO e WHO), terpinoleno (1 a 5%;

1,5 a 5%); terpin-4-ol (29 a 45%; 30 a 48%); α-terpineol (1,5 a 8% em ISO e WHO);

aromadendreno (até 3% pela ISO); δ-cadineno (até 3% pela ISO) e globulol (até 1%

pela ISO).

O componente α-tujeno não possui sua porcentagem bem estabelecida,

contudo, nosso óleo apresentou a concentração de α-tujeno próxima à encontrada

em outros estudos (BROPHY et al., 1989; CALCABRINI et al., 2004). As

concentrações de β-pineno, β-mirceno e α-felandreno encontradas em nosso óleo

também se mostram dentro dos padrões (COX et al., 2001).

90 Discussão

Deste modo, o óleo de Melaleuca alternifolia usado neste estudo segue o

recomendado como o padrão internacional para o óleo de melaleuca, tipo terpinen-

4-ol (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION, 2004).

6.3 Identificação do óleo de copaíba

Apesar de poderem apresentar alterações nas quantidades e tipos de

diterpenos e sesquiterpenos, apenas essas classes de substâncias podem estar

presentes na composição do óleo puro (Veiga Junior et al., 2002). O principal

composto do óleo de copaíba é o trans-cariofileno (Cascon et al., 2000; Gomes et

al.,2007). Os sesquiterpenos compreendem aproximadamente 80% dos óleos de

copaíba, os principais são a α-copaeno, trans-cariofileno, β-bisaboleno, α e β-

selineno, α-humuleno, δ-cadineno e γ-cadineno (Veiga-Júnior & Pinto 2002).

No óleo utilizado neste estudo, o trans-cariofileno também foi identificado

como componente majoritário (Tabela 3). Dentre os sesquiterpenos citados, com

exceção de α-selineno, γ-cadideno e β-selineno, todos se encontravam entre os

principais componentes do óleo utilizado no presente estudo. Machado (2011) e

Chen et al. (2009) também não identificaram estes analitos entre os principais

constituintes de suas amostras de óleo extraído do tronco da árvore Copaifera

officinalis.

Bivatti et al. (2006) e Veiga Junior et al. (1997), os quais estudaram a

padronização cromatográfica do óleo de copaíba, observaram que em todas as suas

amostras, independente da espécie, detectou-se o ácido copálico. Contudo, Estevão

et al. (2009) e Gramosa et al. (2005), apesar de comprovarem a autenticidade de

seus óleos, devido aos constituintes químicos identificados, não detectaram o ácido

copálico em suas amostras. No óleo utilizado neste trabalho (Tabela 3), o ácido

copálico também foi identificado, concordando com os resultados encontrados por

Bivatti et al.(2006) e Veiga Junior et al. (1997).

O óleo utilizado no presente estudo continha ainda B e D-germacreno entre

seus principais compostos, (Tabela 3). Machado (2001) identificou os mesmos

compostos nas concentrações de 8% e 5,95%, dados muitos semelhantes aos

encontrados neste trabalho. Outro analito encontrado entre os principais

Discussão 91

componentes de nosso óleo foi o α-trans-bergamoteno, também encontrado em

altas concentrações em várias espécies de Copaifera analisadas (Araújo 2010;

Cascon et al., 2000). Tais dados comprovam a autenticidade do óleo utilizado no

presente estudo.

Há grande quantidade de estudos acerca dos óleos de copaíba, contudo

poucas referências discriminam a espécie de Copaifera que está sendo estudada e

somente cinco espécies têm sua composição química descrita na literatura (VEIGA

JUNIOR et al, 2002).

Observamos, durante a análise dos analitos encontrados no óleo utilizado

nesta pesquisa, falta de coesão nas informações acerca da composição dos óleos

de copaíba, isso pode ocorrer, em partes, devido à grande variação do produto, a

qual acredita-se estar relacionada à concentração e natureza dos diterpenos e

sesquiterpenos presentes de acordo com variações de espécies, fatores biológicos

como insetos e fungos e fatores abióticos como interferência climática (PIERI et al.,

2009; VEIGA JUNIOR et al., 2002). Outro problema importante é a eventual mistura

dos óleos de espécies botânicas variadas, ou ainda de espécimes de idades e locais

distintos. Este fato é agravado pela dificuldade de se proceder à diferenciação

morfológica entre as espécies (TAPPIN et al., 2004).

6.4 Concentração Inibitória Mínima

Protocolos de padronização de procedimentos clínicos e laboratoriais (CLSI,

2007) recomendam o método de diluição em ágar para determinação da CIM para

uma ampla variedade de bactérias anaeróbicas, enquanto que o método de

microdiluição em caldo é recomendado apenas para Bacteroides fragilis. O método

de diluição em ágar tem sido extensivamente utilizado, sendo recomendado como o

método de referência para todas as bactérias anaeróbicas (CLSI, 2007).

O teste de difusão em ágar, além de não ser recomendado para bactérias

anaeróbicas, é inadequado para teste de CIM com óleos essenciais, como o de

melaleuca, pois ocorre a separação dos componentes do óleo através do ágar de

acordo com a afinidade de alguns de seus componentes com a água (SOUTHWELL

et al. 1993).

92 Discussão

Para solubilização dos óleos de copaíba e melaleuca, em altas

concentrações, ao meio de cultura, de maneira que o mesmo permanecesse

homogêneo até sua solidificação, utilizou-se Tween 80 a 5 µl/mL. Essa concentração

não mostrou atividade antimicrobiana nos experimentos realizados. A concentração

de 5µl/mL de Tween 80 também foi utilizada em diversos experimentos que

testavam a atividade antimicrobiana de substâncias oleosas, não influenciando o

crescimento das bactérias testadas (GUSTAFSON et al., 1998).

Com relação ao resultado das CIMs, o digluconato de clorexidina inibiu o

crescimento de P.gingivalis e F.nucleatum a 20 µg/mL, portanto, o resultado obtido

foi compatível aos encontrados em outros trabalhos (AMORIM et a., 2004; KULIK et

al., 2000).

Apesar das duas bactérias serem susceptíveis ao óleo de copaíba,

F.nucleatum foi mais resistente à solução com este óleo quando comparada a

P.gingivalis. Contudo, não se sabe exatamente quais analitos participam ativamente

da atividade antimicrobiana deste óleo e se há possibilidade de isolá-los, o que

poderia amplificar o poder de ação antimicrobiana do óleo. Outra possibilidade é que

os componentes do óleo atuem de maneira sinérgica, impedindo o isolamento de

apenas alguns poucos analitos sem alteração da atividade antimicrobiana.

O óleo de copaíba ainda mostra-se pouco difundido no campo da pesquisa

científica, contando com poucos trabalhos na área da microbiologia. O único

trabalho com enfoque na microbiota bucal (PIERI, 2007) testou o óleo de Copaifera

officinalis contra Streptococcus mutans, encontrando concentração inibitória a partir

de 0,078 µL/mL.

Mendonça et al.(2009) testou o óleo de Copaifera Multijuga sobre as bactérias

Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa encontrando os

valores de CIM de 15,6µL/mL; 31,2µL/mL e 125µL/mL respectivamente.

Nota-se uma escassez de trabalhos publicados com o óleo de copaíba,

principalmente quando voltado às bactérias da cavidade bucal, o que impossibilita a

comparação entre os dados. Os poucos trabalhos encontrados com o óleo de

copaíba voltados à microbiologia geralmente não apresentam a identificação dos

analitos do óleo, o que dificulta estabelecer parâmetros entre os trabalhos da

Discussão 93

literatura. Observa-se ainda que os trabalhos com óleo de copaíba com ênfase na

sua função antimicrobiana são recentes.

F.nucleatum também apresentou maior resistência ao óleo de melaleuca do

que P.gingivalis. Contudo, dentre os constituintes do óleo de melaleuca, acredita-se

que os principais componentes com atividade antibacteriana sejam terpinen-4-ol e α-

terpineol, os quais podem contribuir substancialmente para a atividade

antibacteriana do óleo, apresentando CIMs e CBMs iguais, ou ligeiramente inferiores

aos valores obtidos para o óleo de melaleuca (LOUGHLIN et al., 2008; RAMAN et

al., 1995). Portanto, o descobrimento de sinergismo entre os analitos deste óleo e a

identificação de seus efeitos antimicrobianos viabilizaria o isolamento destes

componentes, o que amplificaria sua ação antimicrobiana.

O resultado da CIM, no presente trabalho, para a bactéria Fusobacterium

nucleatum tratada com óleo de melaleuca foi de 20 µL/mL e para Porphyromonas

gingivalis de 2 µL/mL. Takarada et al., em 2004, realizaram experimentos para

determinar a CIM destas mesmas bactérias expostas ao óleo de melaleuca, contudo

a CIM encontrada para F.nucleatum foi de 0,6µL/mL e para P.gingivalis de

1,3µL/mL. Portanto, apesar das CIMs encontradas para P.gingivalis apresentarem

valores equivalentes entre os dois trabalhos, uma vez que em nosso experimento

foram utilizadas apenas diluições de 1/10, o valor de CIM encontrado para a bactéria

F.nucleatum foi muito superior ao encontrado por Takarada et al(2004).

Além disso, diferente dos nossos dados, Takarada et al. (2004) descreveram

que a bactéria F.nucleatum foi mais susceptível ao óleo de melaleuca do que

P.gingivalis. Essas discrepâncias nos dados podem ter ocorrido devido à

metodologia empregada, uma vez que Takarada et al.(2004) utilizaram microdiluição

em caldo, contrariando, deste modo, a metodologia preconizada pelo Clinical and

Laboratory Standards Institute (2007), que recomenda a diluição em ágar para

bactérias anaeróbicas.

Hammer et al., em 2003, realizaram estudos para determinação de CIM do

óleo de melaleuca sobre mais de vinte gêneros diferentes de bactérias, dentre elas

Fusobacterium sp. Em seus resultados, Fusobacterium spp estavam entre as

bactérias mais resistentes ao óleo de melaleuca, apresentando CIM que variou de

2,5 µL/mL à 20 µL/mL. A bactéria Porphyromonas endodontalis, um importante

patógeno das lesões periapicais, mostrou inibições em seu crescimento que

94 Discussão

variavam de 0,25µL/mL à 1µL/mL. Os resultados encontrados por Hammer et

al.(2003), apesar das bactérias utilizadas serem do mesmo gênero, mas não

necessariamente da mesma espécie que em nosso experimento, foram muito

semelhantes aos nossos resultados.

Shapiro et al.(1994), encontraram, como concentração inibitória mínima, para

a bactéria F.nucleatum um resultado maior ou igual a 6µL/mL e para P.gingivalis

1,1µL/mL, os quais, apesar de realizados pela técnica de microdiluição em caldo,

são semelhantes aos resultados encontrados em nosso trabalho. Os dados

encontrados por Shapiro et al. (1994) corroboram os nossos, demonstrando uma

maior resistência de F.nucleatum quando comparada a P.gingivalis.

Notou-se uma grande variação nos resultados de CIM relatados na literatura,

isso pode ocorrer devido às diferentes metodologias empregadas, à quantidade do

inóculo utilizado ou ainda à composição do óleo empregado no estudo. Apesar de

muitas revistas científicas exigirem a identificação do óleo, muitos trabalhos não

descrevem tal composição detalhadamente, dificultando a comparação entre os

diferentes resultados encontrados. Deve-se notar, também, que os dados não estão

expressos em g/ml, mas em microlitros, e a obtenção dos extratos não é

padronizada, o que poderia justificar também diferenças nas CIM observadas.

Porém, nota-se que há necessidade de maiores estudos acerca dos analitos

isolados dos óleos e suas efetividades antibacterianas, o que poderia possibilitar seu

uso isolado resultando em uma possível amplificação do efeito dos componentes

dos óleos de copaíba ou de melaleuca.

Os resultados de CIM encontrados para o óleo de copaíba não foram

comparados aos resultados encontrados para o óleo de melaleuca devido à falta de

informação acerca do princípio ativo efetivo destes óleos contra as bactérias

testadas. A falta de informação sobre os princípios ativos desses óleos que foram

efetivos na inibição do crescimento de P gingivalis e F nucleatum e suas

quantidades em cada óleo, impossibilitam tal comparação.

Discussão 95

6.5 Concentração Bactericida Mínima

A metodologia empregada na determinação da CBM dos óleos de copaíba e

de melaleuca foi a diluição em caldo (GUSTAFSON et al., 1998), com algumas

modificações, como a lavagem das bactérias em caldo BHI antes de seu

plaqueamento em ágar Brucella suplementado, desse modo, removeu-se o agente

antimicrobiano testado para que o seu resquício não interferisse no resultado.

Com relação ao resultado das CBMs, o digluconato de clorexidina foi

bactericida para F.nucleatum a partir de 20µg/mL e para P.gingivalis na

concentração de 200µg/mL. Portanto, a bactéria F.nucleatum mostrou-se mais

sensível que P.gingivalis ao agente.

Kulik et al. (2000), encontrou CBM de 5µg/mL para F.nucleatum e 16µg/mL

para P.gingivalis, tal resultado mostrou-se compatível com nossos achados para a

bactéria F.nucleatum. A diferença na CBM para P.gingivalis entre os trabalhos pode

estar relacionada à diferença na concentração dos inóculos utilizados, que em nosso

trabalho foi utilizado em maior concentração.

Contudo, em ambos os trabalhos, P.gingivalis mostrou-se mais resistente ao

digluconato de clorexidina. Grenier et al. (1995), observaram que tal resistência pode

estar relacionada às vesículas liberadas por P. gingivalis, as quais podem se

vincular ao digluconato de clorexidina, permitindo assim proteção para si e para

outras espécies bacterianas bucais. Também foi demonstrado que os

lipopolissacarídeos são os principais componentes envolvidos entre a ligação do

digluconato de clorexidina e estas vesículas.

Apesar disso, os resultados corroboram o uso desta substância em solução

aquosa a 0,12% como coadjuvante ao tratamento da doença periodontal, sendo que

ambas as bactérias não mostraram crescimento nessas condições.

Em relação ao óleo de copaíba, os resultados encontrados no presente

trabalho indicaram que o óleo apresentou comportamento bactericida para

F.nucleatum a partir de 100µL/mL, enquanto que para P.gingivalis o óleo foi apenas

bacteriostático. Nos resultados relatados por Pieri (2007), o óleo de Copaifera

officinalis também mostrou um caráter bacteriostático frente à bactéria Streptococcus

mutans.

96 Discussão

Santos et al (2008) encontraram CBM do óleo de Copaifera officinalis para as

bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus

(resistente à meticilina), Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis e Enterococcus

faecalis de 0,0625mg/mL; 0,25mg/mL; 0,0312mg/mL; 0,0312mg/mL e 0,0625mg/mL

respectivamente.

O componente trans-cariofileno, o qual apresenta-se como analito majoritário

do óleo de copaíba, demonstrou um eficiente efeito antimicrobiano, determinado

pela concentração inibitória mínima, contra muitas bactérias, entre elas P.gingivalis,

contudo sua maior eficácia foi verificada frente às bactérias Gram-positivas

Actinomyces naeslundii e Propionibacterium acnes (KANG et al., 1992).

Portanto, no presente estudo, o óleo de copaíba apresentou efeito

bacteriostático perante a bactéria Gram-negativa P.gingivalis, contudo acredita-se

que essa bactéria necessite de outras, como F.nucleatum, para seu estabelecimento

no biofilme (SOCRANSKY et al., 2002). Assim sendo, a eliminação destas bactérias

essenciais para o estabelecimento do biofilme inviabilizaria o estabelecimentos de

outras bactérias consideradas mais patogênicas, como P.gingivalis. Contudo mais

estudos precisam ser realizados, principalmente envolvendo os seus analitos

isolados e o sinergismo entre eles, com a finalidade de verificar se há analitos que

apresentam efeito bactericida ou bacteriostático e se há possibilidade de viabilizar a

utilização destes componentes isolados.

Em nosso experimento, o óleo de melaleuca foi bactericida a partir de 20

µL/mL para as duas bactérias. Takarada et al.(2004), relatou que o óleo de

melaleuca foi bactericida para F.nucleatum e P.gingivalis a partir de 2,5µL/mL e

5µL/mL respectivamente. Tais dados estão de acordo com nossos resultados, dadas

as proporções utilizadas nas diluições.

Hammer et al.(2003), avaliou o efeito bactericida do óleo de melaleuca frente

às bactérias Fusobacterium spp., o qual relatou tal efeito em concentrações que

variavam de 2,5 µL/mL a 20 µL/mL, corroborando nossos achados.

Esses achados podem estar correlacionados com os resultados encontrados

por Cox et al. (2000), que em relação às bactérias Gram-negativas, demonstraram

que o óleo de melaleuca inibiu a respiração, alterou a permeabilidade da membrana

e provocou extravasamento de potássio imediatamente após o contato de

Discussão 97

Escherichia coli com as concentrações inibitórias e bactericidas mínimas do óleo de

melaleuca.

Gustafson et al. (1998) relataram autólise, perda de constituintes celulares e

coagulação do citoplasma das células de Escherichia coli cultivadas na presença

tratada do óleo de melaleuca. Porém, os resultados encontrados por Carson et al.

(2002), demonstraram que embora a membrana citoplasmática da bactéria Gram-

positiva Staphylococcus aureus seja comprometida pelo tratamento com o óleo de

melaleuca, o principal mecanismo de ação deste óleo e de seus componentes não

estava relacionado ao dano à célula culminando na lise celular

Embora tenha sido indicada que a perda de material intracelular,

incapacidade de manter a homeostase e inibição da respiração após o tratamento

com óleo de melaleuca e / ou componentes são consistentes com um mecanismo de

ação envolvendo a perda da integridade da membrana e da função, os mecanismos

antibacterianos do óleo de melaleuca ainda precisam ser mais bem elucidados.

De modos gerais, os óleos fitoterápicos contém um grande número de

componentes e seu modo de ação envolve vários alvos na célula bacteriana. A

maioria dos autores considera a característica lipofílica de seus constituintes como a

propriedade que explicaria a atividade antimicrobiana, característica que permitiria a

partição destes compostos nos lipídeos da membrana celular e da mitocôndria,

aumentando sua permeabilidade e levando ao extravasamento do conteúdo celular.

Baseado nesta hipótese, acredita-se que os terpenos, encontrados em abundância

no óleo de copaíba e de melaleuca, estejam envolvidos no processo de ruptura da

membrana bacteriana devido sua característica lipofílica (COWAN, 1999).

Entretanto, este parece não ser o único mecanismo envolvido na atividade

antimicrobiana dos óleos fitoterápicos, uma vez que o germacreno D, o qual pode

ser encontrado no óleo de copaíba, por ser um hidrocarboneto, apresenta

características lipofílicas acentuadas e não inibiu o crescimento microbiano até a

concentração de 5000 µg/mL (DEUSCHLE et al., 2007).

O óleo de copaíba parece possuir efeitos colaterais amenos, podendo ser

utilizado, no caso de comprovada sua ação antimicrobiana e baixa citotoxicidade,

como um óleo ou apenas como alguns analitos isolados, de maneira prolongada ou

adicionados na composição de dentifrícios, materiais odontológicos e enxaguatórios

98 Discussão

bucais. Contudo, para isso, mais pesquisas devem ser realizadas, principalmente

sobre sua toxicidade, a fim de viabilizar sua possível utilização.

O óleo de melaleuca apresentou eficácia frente às bactérias P.gingivalis e

F.nucleatum e acredita-se que possua baixa toxicidade quando utilizado de maneira

tópica, porém sua ingestão é contraindicada e alguns indivíduos podem apresentar

reações alérgicas quando expostos aos produtos de oxidação do óleo, que são

formados devido à exposição à luz ou ao ar. Portanto, mais estudos precisam ser

realizados para ampliar o conhecimento sobre sua eficácia e sobre sua toxicidade.

O óleo de melaleuca apresenta sua composição, apesar de variável, bastante

padronizada. Contudo, o óleo de copaíba não possui tal característica de

padronização de sua composição, variando muito em sua composição, até em

relação às árvores da mesma espécie. Portanto, apesar de não haver estudos para

comparação de CIM e CBM do óleo de copaíba utilizando as bactérias F.nucleatum

e P.gingivalis, supõem-se que os resultados encontrados futuramente poderão variar

bastante. Para aumentar a relevância dos dados e aumentar sua fidedignidade, o

óleo de copaíba deveria, assim como o de melaleuca, sofrer padronizações e

descrições mais rígidas de seus componentes e de suas concentrações,

relacionadas à espécie da árvore estudada.

Vale ressaltar que o óleo de melaleuca, apesar de apresentar efeito

antimicrobiano contra F.nucleatum e P.gingivalis em nosso trabalho, é um óleo

nativo da Austrália e não é encontrado no Brasil, o que aumenta muito seu custo

financeiro, dificultando sua possível utilização terapêutica, em larga escala, pela

população brasileira.

6.6 Efeito de Concentração Subinibitórias (CS) de óleo de melaleuca e copaíba

na coagregação e autoagregação

6.6.1 Concentração Subinibitória (CS)

A determinação da CS do digluconato de clorexidina e dos óleos de copaíba e

de melaleuca, proposta por Cai (1994) e utilizada em nosso trabalho, foi realizada a

Discussão 99

partir da diluição em caldo de concentrações menores que as encontradas na CIM, a

qual permite um dado mais preciso quando comparada a determinação de CS

através do cálculo de metade do valor encontrada como CIM. Contudo, apesar de

não tão muito precisa, esta última metodologia mostra-se bastante difundida.

Okamoto et al. (2002), relatou como concentração subinibitória para o

digluconato de clorexidina, através do cálculo de metade do valor encontrado em

sua CIM, 4 µg/mL para F.nucleatum (ATCC 25586). Este valor se mostra acima do

encontrado em nosso trabalho, pois em nosso trabalho, procurou-se estabelecer um

valor de CS que permitisse o desenvolvimento bacteriano próximo ao encontrado no

controle negativo.

Millward et al.(1990) relataram a quantidade de 0,75 µg/mL como valor

encontrado para CS do digluconato de clorexidina, o qual permitiu o aumento do

número de células viáveis. Este resultado mostra-se pertinente aos nossos achados,

porém optamos por um valor um pouco abaixo devido à necessidade de alta

concentração de bactérias para realização do ensaio de coagregação e

autoagregação com as bactérias expostas às concentrações subinibitórias das

substâncias testadas, similar ao observado na ausência do agente antimicrobiano.

Em relação às concentrações subinibitórias do óleo de copaíba e do óleo de

melaleuca, não foram encontrados trabalhos que estabelecessem estas

concentrações e descrevessem a metodologia utilizada.

6.6.7 Ensaio de coagregação e autoagregação

Durante o ensaio de coagregação, o óleo de copaíba foi bastante eficaz na

inibição deste processo em células de Fusobacterium nucleatum tratadas com este

óleo, uma vez que apresentou resultado satisfatório quando comparado ao controle

negativo. Esta inibição no processo de coagregação foi menos acentuada quando

P.gingivalis e F.nucleatum foram tratadas com concentrações subinibitórias deste

óleo e ainda mais discreto quando apenas a bactéria P.gingivalis foi submetida à

exposição ao óleo de copaíba. No processo de autoagregação de F.nucleatum, a

adição do óleo de copaíba resultou em diferença estatística quando comparado

controle negativo.

100 Discussão

Santos et al. (2008) avaliaram, através microscopia eletrônica de transmissão

e varredura, células de Staphylococcus aureus tratadas com concentrações

subinibitórias de Copaifera martii e observaram danos na parede celular, liberação

de compostos citoplasmáticos, alteração na morfologia, diminuição do volume

celular e lise da célula. No presente estudo, não houve lise, pois as bactérias

continuaram se desenvolvendo no mesma velocidade que na ausência do óleo, na

concentração empregada, mas possivelmente, o óleo de copaíba exerceu efeito

superfície celular bacteriana, o que poderia influenciar no processo de coagregação

e de autoagregação.

O óleo de melaleuca, assim como o digluconato de clorexidina, inibiu apenas

o processo de autoagregação de F. nucleatum e não mostrou efetividade em relação

à coagregação com P. gingivalis, pelo contrário, em alguns intervalos notou-se um

aumento nas densidades ópticas de bactérias tratadas com estas soluções.

Em relação a este aumento nos valores das densidades ópticas relacionadas

ao processo de coagregação de bactérias tratadas com óleo de melaleuca e com

digluconato de clorexidina, pode-se conjecturar que tal fato devido ao resultado de

divisões incompletas das células bacterianas, originando células mais pesadas que

sedimentariam mais rapidamente no fundo dos poços.

Lee (2001) notou que as bactérias P.gingivalis 381 tratadas com

concentrações subinibitórias de digluconato de clorexidina, apresentavam menos

coagregação com Streptococcus oralis, contudo, esta inibição era dependente da

concentração utilizada. Em nosso trabalho, utilizamos concentrações subinibitórias

que permitissem o desenvolvimento da bactéria próximo do normal, talvez, este fato

tenha possibilitado a coagregação entre as bactérias tratadas com o digluconato de

clorexidina.

Assim, os dados do presente estudo sugerem que o óleo de copaíba e óleo

de melaleuca tem potencial para serem usados como agentes antimicrobianos no

controle da microbiota associada às doenças periodontais, por sua capacidade

bactericida e bacteriostática, bem como por interferir na interação entre as bactérias

quando em baixas concentrações, possivelmente interferindo nos processos de

formação de biofilme.

7 CONCLUSÃO

Conclusões 103

7 CONCLUSÃO

Baseados nos resultados obtidos a partir das metodologias empregadas,

verficamos que:

� O óleo de melaleuca foi eficaz na inibição de crescimento de Porphyromonas

gingivalis e Fusobacterium nucleatum, sendo que esta última bactéria foi mais

resistente ao óleo sugerindo, desta forma, que a bactéria mais agressiva ao

periodonto, Porphyromonas gingivalis, seja mais sensível ao óleo;

� O óleo de melaleuca mostrou-se bactericida para P.gingivalis e F.nucleatum,

sendo que para essa última o valor obtido como CIM foi também bactericida;

� O óleo de copaíba foi eficaz na inibição de crescimento das duas bactérias,

sendo que F.nucleatum mostrou-se mais resistente ao óleo;

� O óleo de copaíba, apesar de bactericida para F.nucleatum, não apresentou o

mesmo comportamento para P.gingivalis até as concentrações testadas;

� O óleo de copaíba inibiu a coagregação entre P.gingivalis e F.nucleatum,

assim como a autoagregação desta última bactéria;

� O óleo de melaleuca inibiu o processo de autoagregação de F.nucleatum,

contudo, foi ineficaz da redução de coagregação entre P.gingivalis e

F.nucleatum;

Assim, podemos concluir que o óleo de copaíba e óleo de melaleuca têm

potencial para serem usados como agentes antimicrobianos no controle da

microbiota associada às doenças periodontais, por sua capacidade bactericida e

bacteriostática, bem como por interferir nos processos de formação de biofilme.

REFERÊNCIAS

Referências 107

REFERÊNCIAS

Abul RA, Mitchell RN. Fundamentos de Robbins & Cotran: patologia. 7th ed; 2006.

Alencar JC. Estudos silviculturais de uma população natural de Copaifera multijuga Hayne - Leguminosaseae, na Amazônia Central: germinação. Acta Amazônica. 1981;12(1):75-89.

Alexandre RF, Bagatini F, Simões CMO. Interações entre fármacos e medicamentos fitoterápicos à base de ginkgo ou ginsen. Rev Bras Farmacogn. 2008;18(1):117-26.

Almeida DS. Entre lojas e boticas: o comércio de remédio entre o Rio de Janeiro e Minas Gerais (1750-1808) [dissertação]. São Paulo: Faculdade de Filosofia e Ciências Humanas, Universidade de São Paulo; 2008.

Altman PM. Australian tea tree oil. Aust J Pharm 1988;69:276-8.

Amorim CV, Aun CE, Mayer MP. Susceptibility of some oral microorganisms to chlorhexidine and paramonochlorophenol. Braz Oral Res. 2004;18(3):242-6.

Andrian E, Grenier D, Rouabhia M. In vitro models of tissue penetration and destruction by Porphyromonas gingivalis. Infect Immun. 2004;72(8):4689-98.

Araujo RC. Óleos essenciais de plantas brasileiras como manipuladores da fermentação ruminal in vitro [tese]. Piracicaba: Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo; 2010.

Autio-Gold J. The role of chlorhexidine in caries prevention. Oper Dent. 2008;33(6):710-6.

Banes-Marshall L, Cawley P, Phillips CA. In vitro activity of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil against bacterial and Candida spp. isolates from clinical specimens. Br J Biomed Sci. 2001;58(3):139-45.

108 Referências

Barceloux DG. Medical toxicology of natural substances: foods, fungi, medicinal herbs, plants and venomous animals. John Wiley & Sons: Hoboken; 2008

Barkvoll P, Rölla G, Bellagamba S. Interaction between chlorhexidine digluconate and sodium monofluorophosphate in vitro. Scand J Dent Res. 1988;96(1):30-3.

Barkvoll P, Rölla G, Svendsen K. Interaction between chlorhexidine digluconate and sodium lauryl sulfate in vivo. J Clin Periodontol. 1989;16(9):593-5.

Bassett IB, Pannowitz DL, Barnetson RS. A comparative study of tea-tree oil versus benzoylperoxide in the treatment of acne. Med J Aust. 1990;153(8):455-8.

BiavattiI MW, Dossin D, DeschampsII FC, Lima MP. Análise de óleos-resinas de copaíba: contribuição para o seu controle de qualidade. Rev Bras Farmacogn. 2006;16(2):230-5

Bjelland S, Bray P, Gupta N, Hirscht R. Dentists, diabetes and periodontitis. Aust Dent J. 2002;47(3):202-7.

Boles MM, Lyra MC, Flório FA, Orgaes S, Marques BPA, Gonella HA. Curativo imediato com hidrogel à base de água, óleo de Melaleuca alternifolia e emulsificantes após queimaduras. Rev Bras Cir Plást. 2008; 23(4):328-31.

Bolstad AI, Jensen HB, Bakken V. Taxonomy, biology, and periodontal aspects of Fusobacterium nucleatum. Clin Microbiol Rev. 1996;9(1): 55-71.

Bradshaw DJ, Marsh PD, Watson GK, Allison C. Role of Fusobacterium nucleatum and coaggregation in anaerobe survival in planktonic and biofilm oral microbial communities during aeration. Infect Immun. 1998;66(10):4729-32.

Breed RS, Murray EGD, Smith NR. Bergey’s manual of determinative bacteriology. 7th ed. Baltimore:Williams & Wilkins, Baltimore; 1957.

Referências 109

Brophy JJ, Davies NW, Southwell IA, Stiff IA, Lyall RW. Gas Chromatographic Quality Control for Oil of Melaleuc Terpinen-4-01 Type (Australian Tea Tree). J Agric Food Chem. 1989;37(5):1330-5.

Buchanan RE, Gibbons NE. Bergey’s manual of determinative bacteriology, 8th ed. Baltimore: Williams & Wilkins Company; 1974.

Cai S. Influência de concentrações subinibitórias de agentes químicos na aderência à hidroxiapatita revestida por saliva e na hidrofobicidade e autoagregação de Streptococcus sanguis e Streptococcus mutans [tese]. São Paulo (SP): Instituto de Ciencias Biomédicas; Universidade de São Paulo; 1994.

Calcabrini A, Stringaro A, Toccacieli L, Meschini S, Marra M, Colone M, Salvatore G, Mondello F, Arancia G, Molinari A. Terpinen-4-ol, the main component of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil inhibits the in vitro growth of human melanoma cells. J Invest Dermatol. 2004;122(2):349-60.

Carranza FA Junior. Periodontia clínica de Glicckman. 5th ed. Rio de Janeiro:Interamericana; 1983.

Carson CF, Hammer KA, Riley TV. Melaleuca alternifolia (Tea Tree) Oil: a Review of Antimicrobial and Other Medicinal Properties. Clin Microbiol Rev. 2006;19(1):50-62.

Carson CF, Mee BJ, Riley TV. Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrob Agents Chemother. 2002;46(6):1914-20.

Carson CF, Riley TV. Antimicrobial activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia. Lett Appl Microbiol. 1993;16(2):49-55.

Cascon V. Copaíba: Copaifera spp. In: Carvalho JCT. Fitoterápicos antiinflamatórios: aspectos químicos, farmacológicos e aplicações terapêuticas. 1st ed. Ribeirão Preto: Tecmedd; 2004.

110 Referências

Cascon V, Gilbert B. Characterization of the chemical composition of oleoresins of Copaifera guianensis Desf., Copaifera duckei Dwyer and Copaifera multijuga Hayne. Phytochemistry. 2000;55(7):773-8.

Castro C, Silva ML, Pinheiro AL, Jacovine LAG. Análise econômica do cultivo e extração do óleo essencial de Melaleuca alternifolia Cheel. Revista Árvore, 2005;29(2):241-9.

Chen F, Al-Ahmad H, Joyce B, Zhao N, Köllner TG, Degenhardt J, Stewart CN Jr. Within-plant distribution and emission of sesquiterpenes from Copaifera officinalis. Plant Physiol Biochem. 200;47(11-12):1017-23.

Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria: approved standard. 7th ed. Wayne:CLSI; 2007.

Cowan MM. Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev. 1999;12(4):564-82.

Cox SD, Mann CM, Markham JL, Bell HC, Gustafson JE, Warmington JR, Wyllie SG. The mode of antimicrobial action of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). J Appl Microbiol. 2000;88(1):170-5.

Cox SD, Mann CM, Markham JL. Interactions between components of the essential oil of Melaleuca alternifolia. J Appl Microbiol. 2001;91(3):492-7.

De Moura KCG, Emery FS, Neves-Pinto C, Pinto MCFR, Danta AP, Salomão K, et al. trypanocidal activity of naftoquinonas from Tabebuia and some heterocyclic derivatives: a review from an interdiciplinary study. Journal Brazil Chemistry Soc. 2002;12(3): 325-38.

Deuschle RAN, Camargo T, Alves SH, Mallmann CA, Heizmann BM. Fracionamento do extrato diclorometânico de Senecio desiderabilis Vellozo e avaliação da atividade antimicrobiana. Rev Bras Farmacogn. 2007;17(2):220-23.

Dumitrescu AL. Antibiotics and atiseptics in periodontal therapy. 1st ed. Berlin: Springer; 2011.

Referências 111

Dwyer JD. The Central American, West Indian and South American species of Copaifera (Caesalpiniaceae). Brittonia. 1951;7(3):143-72.

Edler FC. Boticas & pharmacias: uma história ilustrada da farmácia no Brasil. 1st ed. Rio de Janeiro: Casa da Palavra; 2006.

Estevão LRM, Medeiros JP, Scognamillo-Szabó MVR, Baratella-Evêncio L, Guimarães EC, Câmara CAG, Evêncio-Neto J. Neoangiogênese de retalhos cutâneos em ratos tratados com óleo de copaíba. Pesq Agropec Bras. 2009;44(4):406-12.

Farag RS, Shalaby AS, El-Baroty GA, Ibrahim NA, Ali MA, Hassan EM. chemical and biological evaluation of the essential oils of different Melaleuca Species Phytother Res. 2004;18(1):30-5.

FDA- Food and Drug Administration [homepage na internet] . Maryland: Food and Drug Administration; 1998 [acesso em 2011 jan 6]. Disponível em: http://www.fda.gov/MedicalDevices/Safety/AlertsandNotices/PublicHealthNotifications/ucm062306.htm.

FDA- Food and Drug Administration [homepage na internet] . Maryland: Food and Drug Administration; 2010 [acesso em 2011 jan 15]. Disponível em: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=172.510.

Garozzo A, Timpanaro R, Stivala A, Bisignano G, Castro A. Activity of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Influenza virus A/PR/8: Study on the mechanism of action. Antiviral Res. 2011;89(1):83-8.

Garrido, ADB. Estudo comparativo da biocompatibilidade e propriedades físico-químicas de um novo cimento endodôntico [tese]. Amazonas: Universidade Federal do Amazonas; 2004.

Gibbons RJ, Nygaard M. Interbacterial aggregation of plaque bacteria. Arch Oral Biol. 1970;15(12):1397-400.

112 Referências

Gibson FC, Genco CA. The Genus Porphyromonas. In: Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackebrandt E. The prokaryotes. 3rd ed. vol 7. Springer Science+Business Media: Singapura; 2006. p. 428-54.

Gomes NM, Rezendeb CM, Fontes SP, Matheus ME, Fernandes PD. Antinociceptive activity of Amazonian Copaiba oils. J Ethnopharm. 2007;109(3):486-92.

Gottlieb OR, Mors WB. A Floresta Brasileira: fabulosa reserva fitoquímica. O Correio da Unesco. 1979;7(9):35-8.

Gottlieb OR, Borin MRMB. Natural Products research in Brazil. Ciência e Cultura. 1997;49(5):315-20.

Gramosa MV, Silveira ER. Volatile constituents of Copaifera langsdorffii from the Brazilian northeast. J Essent Oil Res. 2005;17:130-32.

Greay SJ, Ireland DJ, Kissick HT, Heenan PJ, Carson CF, Riley TV, et al. Inhibition of established subcutaneous murine tumour growth with topical Melaleuca alternifolia (tea tree) oil. Cancer Chemother Pharmacol. 2010;66(6):1095-102.

Grenier D, Bertrand J, Mayrand D. Porphyromonas gingivalis outer membrane vesicles promote bacterial resistance to chlorhexidine. Oral Microbiol Immunol. 1995;10(5):319-20.

Griffen AL, Becker MR, Lyons SR,2 Moeschberger ML, Leys EJ. Prevalence of Porphyromonas gingivalis and Periodontal Health Status. J Clin Microbiol. 1998;36(11): 3239-42.

Gustafson JE, Liew YC, Chew S, Markham J, Bell HC, Wyllie SG, Warmington JR. Effects of tea tree oil on Escherichia coli. Lett Appl Microbiol. 1998;26(3):194-8.

Hammer KA, Carson CF, Riley TV, Nielsen JB. A review of the toxicity of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil. Food Chem Toxicol. 2006;44(5):616-25.

Referências 113

Hammer KA, Dry L, Johnson M, Michalak EM, Carson CF, Riley TV. Susceptibility of oral bacteria to Melaleuca alternifolia (tea tree) oil in vitro. Oral Microbiol Immunol. 2003;18(6):389-92.

Han YW, Shi W, Huang GT, Kinder Haake S, Park NH, Kuramitsu H, Genco RJ. Interactions between periodontal bacteria and human oral epithelial cells: Fusobacterium nucleatum adheres to and invades epithelial cells. Infect Immun. 2000;68(6):3140-6.

Hart PH, Brand C, Carson CF, Riley TV, Prager RH, Finlay-Jones JJ. Terpinen-4-ol, the main component of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil), suppresses inflammatory mediator production by activated human monocytes. Inflamm Res. 2000;49(11):619-26.

Hofstad T. The Genus Fusobacterium. In: Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer KH, Stackebrandt E. The prokaryotes. 3rd ed. vol 7. Springer Science+Business Media: Singapura; 2006. p. 1016-28.

Hou, D. Studies in Malesian Caesalpinioideae (Leguminosae). 1. The genera Acrocarpus, Afzelia, Copaifera and Instisia. Blumea. 1994;38: 313-330.

International Organization for Standardization. ISO 4730:2004: Oil of Melaleuca, terpinen-4-ol type (tea tree oil). Genebra: ISO; 2004.

Jacobs MR, Hornfeldt CS. Melaleuca oil poisoning. J Toxicol Clin Toxicol. 1994;32(4):461-4.

Jandourek A, Vaishampayan JK, Vazquez JA. Efficacy of melaleuca oral solution for the treatment of fluconazole refractory oral candidiasis in AIDS patients. AIDS. 1998;12(9):1033-7.

Kang R, Helms R, Stout MJ, Jaber H, Chen Z, Nakatsu T. Antimicrobial activity of the volatile constituents of Perilla frutescens and its synergistic effects with polygodial. J Agric FoodChem.1992;40(11):2328-30

114 Referências

Khan IA, Abourashed EA. Leung’s encyclopedia of commom natural ingredients: used in food, drugs and cosmetics. 3rd ed. Hoboken: John Wiley & Sons; 2010.

Kapatral V, Anderson I, Ivanova N, Reznik G, Los T, Lykidis A, et al. Genome sequence and analysis of the oral bacterium Fusobacterium nucleatum strain ATCC 25586. J Bacteriol. 2002;184(7):2005-18.

Kapatral V, Ivanova N, Anderson I, Reznik G, Bhattacharyya A, Gardner WL, et al. Genome analysis of F. nucleatum sub spp vincentii and its comparison with the genome of F. nucleatum ATCC 25586. Genome Res. 2003;13(6A):1180-9.

Kew Gardens. Index Kewensis. Oxford: Claredon Press: Oxford; 1996. Supplement XX.

Knorr, M. 1923. Uber die fusospirilläre Symbiose, die Gattung Fusobacterium (K. B. Lehmann) und Spirillumsputigenum. II. Mitteilung. Die Gattung Fusobacterium.Zbl. Bakteriol Parasitenk Infektkr Abt. 1923;89:4-22.

Kolenbrander PE, Palmer RJ Jr, Rickard AH, Jakubovics NS, Chalmers NI, Diaz PI. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontol 2000. 2006;42:47-9.

Kulik E, Lenkeit K, Meyer J. Antimikrobielle Wirkung von Teebaumöl (Melaleuca alternifolia) auf orale Mikroorganismen. Acta Med Dent Helv. 2000;5:125-30.

Kuyyakanond T, Quesnel LB. The mechanism of action of chlorhexidine. FEMS Microbiol Lett. 1992;79(1-3):211-5.

Lamont RJ, Jenkinson HF. Oral Microbiology at a Glance. 1st ed. Editora John Wiley and Sons; 201.0

Lee SY. Effects of chlorhexidine digluconate and hydrogen peroxide on Porphyromonas gingivalis hemin binding and coaggregation with oral streptococci. J Oral Science; 43(17)1-7.

Referências 115

Lindhe J. Tratado de periodontia clínica e implantologia oral. 3rd ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan; 1999.

Liu PF, Haake SK, Gallo RL, Huang CM. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 2009;27(10):1589-95.

Löe H, Schiott CR. The effect of mouthrinses and topical application of chlorhexidine on the development of dental plaque and gingivitis in man. J Periodontal Res. 1970;5(2):79-83.

Lopez C, Shanley P, Fantini AC. Riquezas da floresta: frutas, plantas medicinais e artesanato na América Latina. Indonésia: CIFOR; 2008.

Loughlin R, Gilmore BF, McCarron PA, Tunney MM. Comparison of the cidal activity of tea tree oil and terpinen-4-ol against clinical bacterial skin isolates and human fibroblast cells. Lett Appl Microbiol. 2008;46(4):428-33

MacDonald V. The rationale of treatment. Aust J Dent. 1930;34:281-85.

Machado BFMT. Óleos Essenciais: verificação da ação antimicrobiana in vitro, na água e sobre a microbiota da pele humana [dissertação]. Botucatu (SP): Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, 2011.

Madigan MT, Martinko JM, Parker J. Microbiologia de Brock. 10th ed. São Paulo: Prentice-Hall; 2004. .

Meng H, Xu L, Li Q, Han J, Zhao Y. Determinants of host susceptibility in aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 2007;43(1):133-59.

Mestecky J, Bienenstock J, Lamm ME, Mayer L, McGhee JR, Strober W. Mucosal immunology. 3rd ed. Amsterdam: Academic Press; 2005.

Metzger Z, Blasbalg J, Dotan M, Tsesis I, Weiss EI. Characterization of coaggregation of Fusobacterium nucleatum PK1594 with six Porphyromonas gingivalis strains. J Endod. 2009;35(1):50-4.

116 Referências

Millward TA, Wilson M. The effect of sab-inhibitory concentrations of chlorhexidine on the proteolytic activity of Bacteroides gingivalis. J Antimicrob Chemother. 1990;25(1):31-7.

Ministério da Saúde. Condições de Saúde Bucal da População Brasileira 2002-2003. 1st ed. Brasília: MS; 2004.

Moore WEC, Moore LVH. The bacteria of periodontal diseases. Periodontol 2000. 1994;5(1):66-77.

NCBI. National Center for Biotechnology Information. [homepage na internet]. Maryland: National Center for Biotechnology Information; 2010 [acesso em 2011a jan 14].Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/ wwwtax.cgi?mode=Info&id=851&lvl=3&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock.

NCBI. National Center for Biotechnology Information. [homepage na internet]. Maryland: National Center for Biotechnology Information; 2011 [acesso em 2011b fev 18].Disponível em: NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/ Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=431947&lvl=3&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock

Newman MG. Periodontia clínica. .9th ed. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan; 2004.

Ogawa AT. Caracterização das atividades proteolíticas da bactéria anaeróbia Fusobacterium nucleatum [dissertação]. Londrina (PR): Universidade Estadual de Londrina; 2004.

Okamoto AC, Gaetti-Jardim E Junior, Arana-Chavez VE,. Avila-Campos MJ. Influence of subinhibitory concentrations of antimicrobials on hydrophobicity, adherence and ultra-structure of Fusobacterium nucleatum. Braz J Microbiol. 2002;33(2)

Oliver WW, Wherry WB. Notes on some bacterial parasites of the human mucous membranes. J Infect Dis. 1921;28(4):341-4.

Referências 117

Olsen I, Shah HN, Gharbia SE. Taxonomy and biochemical characteristics of Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis. Periodontol 2000. 1999;20:14-52.

Oosterwaal PJ, Mikx FH, van den Brink ME, Renggli HH. Bactericidal concentrations of chlorhexidine-digluconate, amine fluoride gel and stannous fluoride gel for subgingival bacteria tested in serum at short contact times. J Periodontal Res. 1989;24(2):155-60.

Pasternak, J. Perspectivas e implicações terapêuticas no tratamento da escabiose. Einstein. 2008;6(3):380-1.

Pathirana RD, O’Brien-Simpson NM, Reynolds EC. Host immune responses to Porphyromonas gingivalis antigens. Periodontol 2000. 2010;52(1):218-37

Pedreira EM. Avaliação do efeito inibitor tumoral do óleo resina de copaína in natura (Copaifera reticulata) e manipulado artesanalmente no modelo de carcinogênese bucal [tese]. Bauru (SP): Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo; 2007.

Peixoto PAS Neto, Caetano LC. Plantas medicinais: do popular ao científico. 1st ed. Alagoas: EDUFAL; 2005.

Pelt JM. A “revolução verde” da medicina. O Correio da Unesco. 1979;7(9):8-13.

Penfold AR, Grant R. The germicidal values of some Australian essential oils and their pure constituents, together with those for some essential oil isolates, and synthetics. Part III. J. R. Soc. New South Wales. 1925;59:346-49

Penfold AR, Morrison FR. Some notes on the essential oil of Melaleuca alternifolia. Aust J Pharm. 1937;18,274-5.

Pennaforte RJ. Estudo da atividade antiinflamatória de duas espécies de plantas amazônicas [dissertação]. Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz; 2003.

118 Referências

Pereira J. The elements of materia medica and therapeutics. 4th ed. London: Spottoswoode & co. New-street Square; 1857.

Petersen PE, Ogawa H. Review Strengthening the Prevention of Periodontal Disease: The WHO Approach. J Periodontol. 2005;76(12):2187-93.

Pieri FA. Efeito (in vitro/in vivo) do óleo de copaíba (Copaifera officinalis) sobre bactérias formadoras de placa dental em cães (Canis lupus familiaris) [dissertação]. Alfenas(MG): Universidade José do Rosário Vellano; 2007.

Pieri FA, José RM, Galvão NN, Nero LA, Moreira MAS. Antimicrobial activity of autoclaved and non autoclaved copaiba oil on Listeria monocytogenes. Cienc Rural. 2010b;40(8):1797-801.

Pieri FA, Mussi MC, Moreira MAS. Óleo de copaíba (Copaifera sp.): histórico, extração, aplicações industriais e propriedades medicinais. Rev bras plantas med. 2009;11(4): 465-72.

Pieri FA, Mussi MC, Fiorini JE; Schneedor JM. Efeitos clínicos e microbiológicos do óleo de copaíba (Copaifera officinalis) sobre bactérias formadoras de placa dental em cães. Arq Bras Med Vet Zootec. 2010a;62(3):578-85.

Poulet PP, Duffaut D, Lodter JP. Metronidazole susceptibility testing of anaerobic bacteria associated with periodontal disease. J Clin Periodontol. 1999;26(4):261-3.

Prance SG, Nesbitt M. The Cultural History of Plants. 1st ed. New York: aylor & Francis Group; 2005.

Rai B, Kaur J, Anand SC, Jacobs R. Salivary stress markers, stress, and periodontitis: a pilot study. J Periodontol. 2011;82(2):287-92.

Ramacciato JC. Atividade de soluções à base de alho (Allium sativum), óleo de melaleuca (Melaleuca alternifolia) e clorexidina sobre microrganismos totais e estreptococos do grupo mutans: estudo in vivo [tese]. Piracicaba (SP): Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual de Campinas; 2000.

Referências 119

Raman A, Weir U, Bloomfield SF. Antimicrobial effects of tea-tree oil and its major components on Staphylococcus aureus, Staph. epidermidis and Propionibacterium acnes. Lett Appl Microbiol. 1995;21(4):242-5.

Ramos MFS. Desenvolvimento de microcápsulas contendo a fracão volátil de copaíba por spray-drying: estudo de estabilidade e avaliação farmacológica [tese]. Ribeirão Preto (SP): Universidade de São Paulo; 2006.

Reynolds MJ; US Patent. Antimicrobial and pesticidal compositions and methods comprising reduced monoterpene oil extracted from myrtaceae. US 2008/0026083. 2008 jan. 24.

Ribeiro L. Medicina no Brasil colonial. 1st ed. Rio de Janeiro: Sul Americana; 1971.

Rickard AH, Gilbert P, High NJ, Kolenbrander PE, Handley PS. Bacterial coaggregation: an integral process in the development of multi-species biofilms Trends Microbiol. 2003;11(2):94-100.

Rigamonte-Azevedo OC, Wadt PGS, Wadt LHO. Copaíba : ecologia e produção de óleo-resina. 1st ed. Rio Branco: Embrapa; 2004.

Rosa JC, Gomes MAS. Os aspectos etnobotânicos da copaíba. Rev Geografar. 2009;4(1):59-77.

Rudney JD, Chen R, Sedgewick GJ. Intracellular Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis in buccal epithelial cells collected from human subjects. Infect Immun. 2001;69(4):2700-7.

Salvador V. História do Brasil. 1st ed. Rio de Janeiro: Biblioteca Nacional, 1889.

Santos AO, Ueda-Nakamura T, Dias Filho BP, Veiga Junior VF, Pinto AC, Nakamura CV. Antimicrobial activity of Brazilian copaiba oils obtained from different species of the Copaifera genus. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2008;103(3):277-81.

120 Referências

Schwabacher H, Lucas DR, Rimington C. Bacterium melaninogenicum; a misnomer. J Gen Microbiol. 1947;1(2):109-20.

Scientific Committee on Consumer Products. Tea tree Oil. Bruxelas: SCCP; 2004.

Seawright A. Tea tree oil poisoning (comment). Med J Aust. 1993;159:831.

Seixas MLB. A natureza brasileira nas fontes portuguesas do século XVI. 1st ed. Portugal: Passagem editores; 2003.

Shah HN, Collins MD. Proposal for Reclassification of Bacteroides asaccharolyticus, Bacteroides gingivalis, and Bacteroides endodontalis in a New Genus, Porphyromonas. Int J Syst Bacteriol. 1988;38(1):128-31.

Shapiro S, Meier A, Guggenheim B. The antimicrobial activity of essential oils and essential oil components towards oral bacteria. Oral Microbiol Immunol. 1994;9(4):202-8.

Signat B, Roques C, Poulet P, Duffaut D. Fusobacterium nucleatum in Periodontal Health and Disease. Curr Issues Mol Biol. 2011;13(2):25-36.

Slots J, Genco RJ. Black pigmented Bacteroides species, Capnocytophaga species, and Actinobacillus actinomycetemcomitans in human periodontal disease: virulence factors in colonization, survival and tissue destruction. J Dent Res. 1984;63(3):412-21.

Slots J. Selection of antimicrobial agents in periodontal therapy. J Periodontal Res. 2002;37(5):389-98.

Soares AKA, Carmo GC, Quental DP, Nascimento DF, Bezerra FAF, Moraes MO; Moraes MEA. Avaliação da segurança clínica de um fitoterápico contendo Mikania glomerata, Grindelia robusta, Copaifera officinalis, Myroxylon toluifera, Nasturtium officinale, própolis e mel em voluntários saudáveis. Rev bras farmacogn. 2006;16(4):447-54.

Referências 121

Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA, Smith C, Kent RL Junior. Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol. 1998;25(2):134-44.

Socransky SS, Haffajee AD. Periodontal microbial ecology. Periodontol 2000. 2005;38:135-87.

Socransky SS, Haffaje AD. The bacterial etiology of destructive periodontal disease: Current concepts. J. Periodontol. 1992;63(4, Suppl):322-31

Sojar HT, Sharma A, Genco RJ. Porphyromonas gingivalis fimbriae bind to cytokeratin of epithelial cells. Infect Immun. 2002;70(1):96-101.

Takarada K, Kimizuka R, Takahashi N, Honma K, Okuda K, Kato T. A comparison of the antibacterial efficacies of essential oils against oral pathogens. Oral Microbiol Immunol. 2004;19(1):61-4.

Tappin MRR, Pereira JFG, Lima LA, SianiI AC, MazzeiII JL, Ramos MFC. Análise química quantitativa para a padronização do óleo de copaíba por cromatografia em fase gasosa de alta resolução. Quím Nova. 2004;27(2):236-40.

Theilade E, Wright WH, Jensen SB, Loe H. Experimental gingivitis in man. II. A longitudinal clinical and bacteriological investigation. J Periodontal Res 1966; 1:1-13.

Tribble, G. D. and Lamont, R. J. Bacterial invasion of epithelial cells and spreading in periodontal tissue. Periodontology 2000. 2010;52(1):68-83.

Tunér K, Baron EJ, Summanen P, Finegold SM. Cellular fatty acids in Fusobacterium species as a tool for identification. J Clin Microbiol. 1992;30(12):3225-9.

Van Dyke TE, Offenbacher S, Place D, Dowell VR, Jones J. Refractory periodontitis: mixed infection with Bacteroides gingivalis and other unusual Bacteroides species. A case report. J Periodontol. 1988;59(3):184-9.

Vasconcelos AFF, Godinho OES. Uso de métodos analíticos convencionados no estudo da autenticidade do óleo de copaíba Quim. Nova. 2002; 25(6B) 1057-1060.

122 Referências

Veiga VF Junior, Pinto AC. O gênero Copaifera L. Quim Nova. 2002;25(2): 273-286.

Vogt M. Doença periodontal e resultados perinatais adversos em uma coorte de gestantes [dissertação]. Piracicaba: Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas; 2006.

Voha C, Docquier JD, Rossolini GM, Fosse T. Genetic and biochemical characterization of FUS-1 (OXA-85), a narrow-spectrum class D beta-lactamase from Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum. Antimicrob Agents Chemother. 2006;50(8):2673-9.

Whittaker CJ, Klier CM, Kolenbrander PE. Mechanisms of adhesion by oral bacteria. Ann Rev Microbiol. 1996;50(1):513-552.

World Health Organization. WHO Monographs on Selected Medicinal Plants. Genebra; 2002. 357 p.

Wright TL, Ellen RP, Lacroix JM, Sinnadurai S, Mittelman MW. Effects of metronidazole on Porphyromonas gingivalis biofilms. J Periodontal Res. 1997;32(5):473-7.

Yilmaz O, Verbeke P, Lamont RJ, Ojcius DM. Intercellular spreading of Porphyromonas gingivalis infection in primary gingival epithelial cells. Infect Immun. 2006;74(1):703-10.

Yang HW, Huang YF, Chou MY. Occurrence of Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythensis in periodontally diseased and healthy subjects. J Periodontol. 2004;75(8):1077-83.

Yong D, Parker FC, Foran SM. Severe allergic reactions and intra-urethral chlorhexidine gluconate. Med J Aust. 1995;162(5):257-8.

Zambon JJ. Periodontal diseases: microbial factors. Ann Periodontol. 1996;1(1):879-925.

universidade de sÃo paulo maria carolina ......de bauru da universidade de são paulo: alexandre ,...

Documents