universidade de sÃo paulo instituto de psicologia …€¦ · para la academia y para la vida. a...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE PSICOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS E
COMPORTAMENTO
WILLIAM EDUARDO PATARROYO SERNA
ADMINISTRAÇÃO DE MORFINA E COCAÍNA EM CONTINGÊNCIAS
OPERANTES E PAVLOVIANAS: DIFERENÇAS GÊNICAS E
COMPORTAMENTAIS EM RATOS
(Versão Corrigida)
São Paulo
2019
WILLIAM EDUARDO PATARROYO SERNA
ADMINISTRAÇÃO DE MORFINA E COCAÍNA EM CONTINGÊNCIAS
OPERANTES E PAVLOVIANAS: DIFERENÇAS GÊNICAS E
COMPORTAMENTAIS EM RATOS
Tese de doutorado apresentada ao
Departamento de Neurociências e
Comportamento (NEC) da Universidade de
São Paulo (USP) como requisito para a
obtenção do título de Doutor
Área de concentração: Neurociências e Comportamento
Orientadora: Profa. Dra. Miriam García Mijares
Coorientador: Prof. Dr. Luciano Freitas Felício
São Paulo
2019
O presente trabalho foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior (CAPES), processo 1453426, e pela Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP), processos 2014/25020-7 e 2016/222210-5.
WILLIAM EDUARDO PATARROYO SERNA
Administração de Morfina e Cocaína em Contingências Operantes e Pavlovianas:
Diferenças Gênicas e Comportamentais em Ratos
Tese de doutorado apresentado apresentada ao Departamento de Psicologia
Experimental da Universidade de São Paulo como requisito para a obtenção do título de
Doutor.
Área de concentração: Psicologia Experimental.
Apresentado e aprovado em: _____ / _____ / _____
Presidente da Banca
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ___________________________ Assinatura:____________________
Banca Examinadora
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ___________________________Assinatura: ____________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ___________________________ Assinatura: ___________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ___________________________ Assinatura: ___________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ___________________________ Assinatura: ___________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ___________________________ Assinatura:____________________
À minha mãe, pelo seu amor e apoio incondicionais.
A good walker leaves no tracks.
A good speech has no flaws to censure.
A good reckoner uses no tallies.
A good door needs no lock, Yet no one can open it.
Good binding requires no knots, Yet no one can loosen it.
The Wise Man is always good at helping people, so that none are cast out; he is always good at saving
things, so that none are thrown away. This is called applied intelligence.
Surely the good man is the bad man's teacher; and the bad man is the good man's business. If the one
docs not respect his teacher, or the other doesn't love his business, his error is very great.
This is indeed an important secret.
(Lao Tzu: Tao Té Ching – Chapter 27)
Agradecimentos
A mi familia, em especial a mi madre, por creer em mí y apoyar mis desiciones, por
educarme y nunca rendirse. Por estar siempre ahí a pesar de la distancia. Por la preocupación
y los Buenos deseos. A mis hermanos, por querer que sea una mejor persona y un mejor
ejemplo cada día. A mi papá Mário, por estar siempre pendiente de mí, de lo que necesito y
de cómo me siento. A Armando, por su especial cariño, por abrirme sus brazos y su corazón.
A todos los que me han brindado su amor y cariño durante mi vida, mostrando su verdadero
interés día tras día, creyendo en mi y apoyando mis sueños, ¡muchísimas gracias!
A minha orientadora, Dra. Miriam Miriam García-Mijares, pela sua guia e orientação
durante o doutorado. Pelas reuniões e discussões que ajudaram à realização desta
dissertação. Por me mostrar novos caminhos, e especialmente, pelo jeito carinhoso em que
me acolheu desde que cheguei ao Brasil.
A Luciano Freitas Felício, meu co-orientador pela sua colaboração na realização
deste estudo e pela confiança que teve comigo desde o começo. Pelas reuniões e pela atenção
sempre disponível.
A Newton Canteras, pela disposição e aconselhamento. Por apoiar e acreditar em
mim e neste estudo de pesquisa. Por permitir a realização de procedimentos experimentais
no seu laboratório no ICB-USP.
A Emilio Ambrósio, mi amigo y orientador en Madrid. Muchas gracias por la
confianza y el cariño, por el tiempo dedicado y en especial por todo lo que me enseñaste,
para la academia y para la vida.
A Marisol Lamprea, por su apoyo todos estos años, sus enseñanzas, sus consejos y
su amistad, que atesoro en lo más profundo de mi pecho
A meus amigos Andeson, Alceu e Rodrigo, pelas incontáveis discussões, pelo
interesse e disposição, pela ajuda constante ante qualquer adversidade, por ser um ombro
para me apoiar e um ouvido para me escutar.
A Raquel e às famílias Reis e Paiva, pelo apoio, carinho e amizade. Por terem sido
um pilar na minha vida.
Aos meus colegas do Laboratório de Psicofarmacologia, em especial Aline (LU3K),
Yulla e Gabriela pela assistência durante os procedimentos cirúrgicos.
Aos meus colegas do Laboratório de Neuroanatomia Funcional, em especial a
Amanda pela ajuda e disposição com os procedimentos experimentais.
A mis colegas del Laboratorio de Psicobiología de las Adicciones, en Madrid, por
las reuniones y discusiones, por abrirme sus puertas y por su amistad. Alberto, Alejandro,
David, Roberto, Mónica y Javier, muchas gracias!
A Rafael, Nicolás y Federico, pela grande amizade e pelo apoio constante e
incondicional, per estar sempre aí para mim e tornar a minha vida mais leve e feliz.
Gracias a Sandrita, Lina y a Nacho, por animarme y ayudarme a levantar en
incontables caídas. Por ayudarme a encontrar mi norte cuando me sentí perdido, por su
amistad.
To Alexia, thank you for bringing light to my path and smiles to my face. Thank you
for your sweetness and understanding.
Aos seguranças, pessoal de manutenção e limpeza, bioteristas e todos aqueles que
com o seu trabalho diário contribuíram e ajudaram direta ou indiretamente à realização deste
trabalho.
Um agradecimento muito, muito especial aos “péssimos exemplos”, por me
mostrarem o que não devo fazer e em quem devo evitar me converter.
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................... 13
Resumo .................................................................................................................................................. 15
Abstract ................................................................................................................................................. 16
Administração de Morfina e Cocaína em Contingências Operantes e Pavlovianas: Diferenças Gênicas
e Comportamentais em Ratos ............................................................................................................... 17
Modelos de Estudo de Administração de Drogas ................................................................................. 26
Controle de Estímulos da procura, consumo e recaída ........................................................................ 30
Pavlovian to Instrumental Transfer ....................................................................................................... 34
Morfina e Cocaína como Drogas de Abuso em Estudos de Dependência ............................................ 44
Objetivos ............................................................................................................................................... 47
Justificativa Geral .................................................................................................................................. 48
Métodos e Equipamentos ..................................................................................................................... 49
Compromisso Ético ................................................................................................................................ 49
Animais .................................................................................................................................................. 49
Alojamento ............................................................................................................................................ 50
Procedimento Cirúrgico......................................................................................................................... 50
Equipamento ......................................................................................................................................... 51
Drogas.................................................................................................................................................... 53
Protocolo Imuno-histoquímico para Fos ............................................................................................ 54
Experimento 1. Expressão do IEG FosB na Administração de Morfina em Contingências Operante e
Pavloviana ............................................................................................................................................. 56
Sujeitos .................................................................................................................................................. 56
Fases Experimentais .............................................................................................................................. 56
Fase 1. Administração de Morfina em Esquema Acoplado ................................................................... 56
Fase 2. Imunohistoquímica Fos ........................................................................................................... 57
Análise de dados.................................................................................................................................... 58
Resultados ............................................................................................................................................. 58
Discussão ............................................................................................................................................... 65
Experimento 2. Procedimento de Respostas de Busca e Administração de Morfina nas Associações
por Contingências Pavloviana e Operante ............................................................................................ 76
Sujeitos .................................................................................................................................................. 77
Fases Experimentais .............................................................................................................................. 78
Fase 1. Treino Associativo de Morfina e S1 em Esquema Acoplado ..................................................... 78
Fase 2. Treino Discriminativo em Contingência Operante ou Pavloviana de Morfina ......................... 79
Fase 3. Treino de Encadeamento das Respostas de Busca e Autoadministração de Morfina. ............. 80
Fase 4. Teste de Transferência Sob o Controle de S1 nas Respostas de Busca e Autoadministração de
Morfina .................................................................................................................................................. 81
Análise de dados.................................................................................................................................... 81
Resultados ............................................................................................................................................. 81
Discussão ............................................................................................................................................... 92
Experimento 3. Associações por Contingências Pavloviana e Operante nas Respostas de Busca e
Administração de COC e a na Expressão de FosB ............................................................................. 100
Sujeitos ................................................................................................................................................ 101
Fases Experimentais ............................................................................................................................ 101
Fase 1. Treino Associativo de COC e S1 em Esquema Acoplado ......................................................... 101
Fase 2. Treino Discriminativo em contingência operante ou Pavloviana de COC ............................... 102
Fase 3. Treino de Encadeamento das Respostas de Busca e Autoadministração de COC .................. 103
Fase 4. Teste de Transferência Sob Controle de S1 nas Respostas de Busca e Autoadministração de
COC ...................................................................................................................................................... 104
Fase 5. Imunohistoquímica Fos ......................................................................................................... 104
Análise de dados.................................................................................................................................. 105
Resultados ........................................................................................................................................... 106
Discussão ............................................................................................................................................. 126
Discussão Geral ................................................................................................................................... 142
Conclusões ........................................................................................................................................... 149
Referências .......................................................................................................................................... 152
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema da caixa operante ................................................................................. 52
Figura 2 - Esquema da disposição das luzes estímulo, buzzer e dos operandos nas caixas
operantes dos experimentos. ................................................................................................ 53
Figura 3 – Média de infusões durante a Fase 1 do Experimento 1.. ...................................... 59
Figura 4 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no mPFC. .................................... 60
Figura 5 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no NAc. ....................................... 61
Figura 6 – Imagem microscópica da marcação de células imunorreativas a ΔFosB no NAc. 61
Figura 7 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Caudado Putamen (CPu). ........ 62
Figura 8 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Hipocampo. ............................ 63
Figura 9 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB na Amígdala. ............................... 64
Figura 10 – Índice discriminativo durante a Fase 2 do Experimento 2. ................................ 82
Figura 11 – Média de infusões durante a Fase 3 do Experimento 2. ..................................... 83
Figura 12 – Frequência de respostas de busca e autoadministração na presença de S1. ........ 84
Figura 13 – Frequência total de respostas de busca e autoadministração. ............................. 85
Figura 14 – Discriminação de S1 na Fase 4.. ....................................................................... 86
Figura 15 – Índice discriminativo por sujeito nas barras de busca e administração. .............. 87
Figura 16 – Preferência por B na presença dos estímulos discriminativos. ........................... 88
Figura 17 – Porcentagem de respostas de busca e administração em S1 e S2.. ..................... 89
Figura 18 – Latência da primeira resposta na Fase 4. ........................................................... 90
Figura 19 – Índice discriminativo durante a Fase 2 do Experimento 3. .............................. 108
Figura 20 – Média de infusões durante a Fase 3 do Experimento 3. ................................... 109
Figura 21 – Frequência de respostas de busca e autoadministração na presença de S1. ...... 110
Figura 22 – Frequência total de respostas de busca e autoadministração. ........................... 111
Figura 23 – Discriminação de S1 na Fase 4. ...................................................................... 112
Figura 24 – Índice discriminativo por sujeito nas barras de busca e administração. ............ 113
Figura 25 – Preferência por B na presença dos estímulos discriminativos.. ........................ 114
Figura 26 – Porcentagem de respostas de busca e administração em S1 e S2. .................... 115
Figura 27 – Latência da primeira resposta na Fase 4. ......................................................... 116
Figura 28 – Células imunorreativas a ΔFosB No Córtex Pré-frontal Nas fases 2 e 4 do
Experimento 3. .................................................................................................................. 117
Figura 29 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Córtex Pre-Frontal Medial
(mPFC) no Experimento 3. ................................................................................................ 119
Figura 30 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Núcleo Acumbente (NAc) no
Experimento 3. .................................................................................................................. 120
Figura 31 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Caudado Putamen (CPu) no
Experimento 3. .................................................................................................................. 122
Figura 32 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Hipocampo no Experimento 3.
......................................................................................................................................... 123
Figura 33 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB na Amígdala no Experimento 3. 125
15
PATARROYO SERNA, William Eduardo. Administração de Morfina e Cocaína em
Contingências Operantes e Pavlovianas: Diferenças Gênicas e Comportamentais em
Ratos. Tese de Doutorado. São Paulo, 2019. Universidade de São Paulo, Instituto de
Psicologia.
Resumo
Estudos reportando que a autoadministração repetida de drogas de abuso causa mudanças
comportamentais, e na expressão de ΔFosB, diferentes às causadas pela administração passiva
repetida da mesma droga, em conjunto com estudos de discriminação de estímulos, têm sido
chaves para compreender a dependência às drogas. Neste estudo se apresentam resultados de
3 experimentos que avaliaram diferenças gênicas e comportamentais entre a autoadministração
de morfina e cocaína sob uma contingência operante, e a administração passiva destas drogas
sob uma contingência Pavloviana, usando um modelo de administração de drogas acoplado e
um protocolo de transferência operante-Pavloviana (PIT) seletiva em ratos. Os sujeitos foram
distribuídos em três grupos: Administração por Contingência Operante (CO), Administração
por Contingência Pavloviana (CP) e Controle (Ctr). No Experimento 1, cada sujeito do grupo
CO foi exposto a sessões de autoadministração endovenosa de morfina. Depois, a expressão
do gene FosB foi medida utilizando uma técnica imuno-histoquímicas em diferentes áreas do
cérebro. No Experimento 2 os ratos foram expostos a um protocolo de PIT, treinando de forma
inicial as contingências operante e Pavloviana separadamente, em associação a S1, utilizando
infusões de morfina como reforçador. Em seguida foi treinado um encadeado de respostas
(busca e administração) e finalmente, os sujeitos foram testados para avaliar o controle de
estímulos que S1 adquiriu sobre as respostas de busca e administração. O Experimento 3 foi
realizado utilizando os métodos dos primeiros dois experimentos, utilizando cocaína como
reforçador. Em conjunto, os dados imunohistoquímicos e comportamentais sugerem que a
maior expressão de FosB em subáreas envolvidas na dependência às drogas, em comparação
entre os grupos CO e CP, está relacionada ao controle de estímulos estabelecido por S1 pelas
diferentes contingências de aprendizagem. Ainda, os resultados apontam que estas áreas em
que se encontrou uma expressão de FosB diferencial por diferentes contingências de
administração de drogas coincidem com algumas das reportadas como envolvidas na PIT. Os
resultados estão em concordância com estudos que reportam que a administração repetida de
uma droga em contingências operantes ou pavlovianas alteram diferencialmente estruturas
cerebrais envolvidas nos processos da dependência às drogas e apoiam a literatura que reporta
que o estabelecimento de controle de estímulos que caracteriza a dependência se pode
estabelecer por processos de aprendizagem na contingência operante e Pavloviana.
Palavras chave: ΔFosB, autoadministração de drogas, cocaína, dependência, morfina, ratos,
transferência operante-Pavloviana.
16
PATARROYO SERNA, William Eduardo. Morphine and Cocaine Administration Under
Operant and Pavlovian Trainings: Genetic and Behavioral Differences in Rats. Doctoral
Thesis. Sao Paulo, 2019. University of Sao Paulo, Psychology Institute.
Abstract
Studies reporting that repeated drug self-administration produces behavioral changes, and in
ΔFosB expression, different from those produced by repeated passive administration of the
same drug have been very important, together with stimulus control studies, have been the key
to understand mechanisms underlying drug abuse. This study presents results from 3
experiments evaluating gene and behavioral differences between self-administration of
morphine and cocaine under an operant contingency, and passive administration of these drugs
under a Pavlovian contingency, using a yoked drug administration model and a selective
Pavlovian to instrumental transfer (PIT) protocol in rats. Subjects were divided into three
groups: Operant Contingency Administration (CO), Pavlovian Contingency Administration
(CP) and Control (Ctr). In Experiment 1, each subject in the CO group was exposed to
intravenous morphine self-administration sessions. Then, expression of ΔFosB gene was
measured using an immunohistochemical technique in different areas of the brain. In
Experiment 2 rats were exposed to a PIT protocol, initially training the operant and Pavlovian
contingencies separately in association with S1, using morphine infusions as a reinforcer. Then
a chain of responses (seeking and taking) was trained and finally, subjects were tested to
evaluate S1 stimulus control over search and administration responses. Experiment 3 was
performed using the methods from the first two experiments, using cocaine as a reinforcer.
Together, immunohistochemical and behavioral data interact and suggest that a higher
expression on ΔFosB expression in subareas involved in drug dependence, in comparison
between CO and CP groups, is related to stimuli control established by S1 through the different
learning contingencies. Moreover, results point out these same areas in which different ΔFosB
expression was found by different drug administration contingencies match some of those
reported as being involved in PIT. Results are in agreement with studies reporting that repeated
administration of a drug in operant or pavlovian contingencies differentially alter brain
structures involved in drug dependence processes and support literature reporting the
establishment of stimulus control characterizing addiction can be establish by learning
processes in the operant and Pavlovian contingencies.
Keywords: ΔFosB, drug self-administration, cocaine, dependence, morphine, Pavlovian to
instrumental transfer, rats.
17
Administração de Morfina e Cocaína em Contingências Operantes e Pavlovianas:
Diferenças Gênicas e Comportamentais em Ratos
Quando uma droga, como cocaína (COC), morfina, anfetaminas (ANF), ou álcool,
ingressa repetidamente em um organismo, pode causar mudanças relativamente permanentes
no Sistema Nervoso Central (SNC) e no comportamento, que podem variar de acordo com as
contingências envolvidas na sua administração (Choi et al., 2011; Jacobs, Smit, de Vries, &
Schoffelmeer, 2003, 2005; Lüscher & Malenka, 2011). Por exemplo, a administração de uma
droga pode ser consequência de um comportamento emitido pelo próprio organismo, ou pode
ser produto de ação de agentes externos sobre o organismo (e.g., uma injeção administrada
por outra pessoa ou uma máquina). O primeiro caso, é comumente chamado de
“autoadministração” ou “administração ativa” e é considerado uma instância de
comportamento operante. O segundo caso, é denominado de “heteroadministração” ou
“administração passiva”.
A administração passiva envolve geralmente o Condicionamento Pavloviano de
respostas aos estímulos ambientais que precedem e acompanham o efeito da droga. Dado que
a relação entres esses estímulos e o efeito da droga é independente das respostas do
organismo, a administração passiva, na sua forma mais básica, pode ser considerada como
um exemplo de Contingência Pavloviana (CP).
Em termos gerais, a contingência Pavloviana consiste em uma relação de contingência
estímulo-estímulo (S-S). Um estímulo incondicional (US) pode evocar uma resposta
incondicional, como no exemplo clássico da salivação de um cão na presença de comida
(Pavlov, 1927). Quando se desenvolve uma relação CS-US entre um estímulo condicional
(CS) e um US, se observa uma resposta condicional (CR), se entende que uma contingência
18
Pavloviana foi estabelecida (Skinner 1937), por exemplo, a salivação do cão na presença do
experimentador encarregado de disponibilizar a comida.
Por outro lado, a autoadministração envolve o condicionamento de respostas do
organismo aos efeitos da droga. Por exemplo, é verificado que o organismo se injeta morfina
quando sua consequência é a diminuição de dor. Dado que o efeito da droga depende da
resposta do organismo, a autoadministração é considerada uma instancia de Contingência
Operante1 (CO).
Na sua forma mais básica, a contingência operante é denotada como RSR (Skinner
1937), que indica a relação de dependência entre o estímulo reforçador (SR), por exemplo,
diminuição da dor, e a classe de respostas (R) que o produz, por exemplo, se injetar morfina
(Siegel, 1976). Porém é amplamente reconhecido que as relações entre respostas e suas
consequências dependem do ambiente em que acontecem, isto é, estímulos do ambiente
estabelecem as condições em que uma classe de respostas determinada terá determinada
consequência. Por exemplo, injetar-se diminuirá a dor apenas se o líquido da seringa for
morfina, mas não se for alguma substância inócua, como salina; portanto, estímulos que
sinalizem que o líquido da seringa é morfina, mas não os que sinalizem que é salina,
controlarão a resposta de se injetar. Essa relação de dependência a estímulos que antecedem a
relação reposta-consequência é denotada como Sd - R SR (Skinner, 1937; 1938). Assim, na
relação de CO, o SR mantém relações condicionais tanto com a R, quanto com o Sd (SR
apenas acontece se R é produzido na presença de Sd).
1 Os termos mais frequentemente achados na literatura em inglês são self-administration (autoadministração) para a contingência operante e passive administration (administração passiva) para a contingência Pavloviana.
19
Em resumo, na contingência operante existe uma relação de dependência entre o
ambiente, o comportamento do sujeito e o efeito da droga, enquanto na contingência
Pavloviana existe relação de dependência entre o ambiente e o efeito da droga. Em qualquer
dos casos, a relação dos eventos antecedentes (CS ou Sd) com as respostas produzidas na sua
presença é denominada de controle de estímulos.
Existe um longo debate nas Ciências do Comportamento sobre os processos
comportamentais que envolvem cada tipo de contingência. Alguns autores argumentam que a
contingência operante e contingência Pavloviana são estratégias de treino diferente que
produzem controle de estímulo por processos comportamentais semelhantes (Bindra, 1972;
Delgado & Hayes, 2014; Donahoe, Burgos, & Palmer, 1993; Rehfeldt & Hayes, 1998).
Outros, no entanto, defendem que tanto o procedimento de treino, quanto os comportamentos
por eles estabelecidos são diferentes (Miller & Konorski, 1928; Pear & Eldridge, 1984;
Rescorla & Solomon, 1967; Skinner 1937). Essa discussão foge do escopo do presente
trabalho, mas trabalhos como os de Burgos (2018), Domjam (2016) e Troisi II e Mauro
(2017) evidenciam que essa questão continua ainda em debate.
Nas neurociências, a diferenciação entre administração passiva e autoadministração de
drogas é abordada pelo estudo dos mecanismos neurais que participam ou são alterados por
cada uma. A literatura a respeito sugere que as mudanças de longo prazo no SNC ocasionadas
pela administração passiva repetida de drogas (não contingente à emissão de uma resposta) é
diferente da autoadministração, (contingente à emissão de uma resposta), e que as mudanças
produzidas pela segunda estão relacionadas a padrões compulsivos de uso de drogas.
Sabe-se que a administração repetida de drogas de abuso como morfina, COC, ANF, e
álcool, entre outras, causam mudanças relativamente permanentes no Sistema Nervoso
Central (SNC), e que parte dessa neuroplasticidade está diretamente associada ao
20
desenvolvimento de dependência (Jacobs et al, 2003). Estudos experimentais na área de
dependência às drogas têm demonstrado que administração repetida de uma droga sob
contingência operante produz mudanças gênicas (no SNC) diferentes às causadas pela
administração repetida sob contingência Pavloviana da mesma droga (Choi et al., 2011;
Jacobs et al., 2003, Lüscher et al, 2011, Miguéns et al.,2008).
Os fatores de transcrição mais estudados pela literatura da área são os genes de
resposta imediata ou IEGs (pela sua sigla em inglês, immediate-early genes). Quando estes
genes são transcritos, ativam proteínas quinases que produzem a fosforilação de várias
proteínas celulares (Nestler, 2014). Famílias de IEGs como Jun e Fos são rapidamente
ativadas pela ação de fármacos como COC, ANF, opióides, nicotina, entre outros; motivo
pelo qual se acredita que a expressão desses genes possa estar implicada direta ou
indiretamente na aquisição, manutenção e recaída da autoadministração e da dependência às
drogas (Nestler, 2012, 2014; Perrotti et al., 2008; Winstanley et al., 2007).
Um membro da família Fos, o FosB, tem sido diretamente ligado a estes
comportamentos relacionados às drogas de abuso, pois com administrações repetidas de
droga, os níveis de FosB acumulam-se gradualmente, sugerindo que tem funções de longo
prazo na regulação da expressão gênica da célula (Nestler, 2012, 2014). Devido a estas
características várias pesquisas têm procurado desvendar o papel do FosB no
comportamento de autoadministração de drogas. Por exemplo, aumentos significativos na
expressão de FosB no núcleo accumbens (NAc) (e outras partes do estriado), e outras áreas
do SNC (associadas ao consumo e dependência de drogas) são causados pela
autoadministração aguda de drogas de abuso como COC, morfina, anfetamina e álcool,
persistindo semanas após a administração da droga ter sido suspensa (Perrotti et al., 2008).
21
Para comparar as mudanças produzidas pelos dois tipos de administração (CO e CP) é
frequentemente utilizado o procedimento de administração acoplada ou operante acoplado.
Esse procedimento permite o estudo simultâneo da administração de uma mesma droga sob
contingência operante (autoadministração) e sob contingência Pavloviana (administração
passiva), separando as histórias de administração sem alterar a dosagem de droga
administrada. O procedimento consiste em conectar ambientes experimentais de treino, de
forma que o desempenho de um sujeito determina a apresentação de estímulos e/ou esquemas
para si mesmo e outro(s) sujeito(s) acoplado(s) a este (Catania, 1999). No caso específico da
administração de drogas, o procedimento padrão com animais se caracteriza pelo
acoplamento de pelos menos três ambientes: contingente, acoplado e controle (ou veículo).
Em cada ambiente é alocado um animal. No ambiente contingente, a emissão de uma resposta
operante (como pressão à barra ou focinhar) tem como consequência a infusão da droga, ou
seja, existe uma relação de contingência entre a resposta e o efeito da droga (i.e., condição
CO). No ambiente acoplado, a administração da droga é independente da resposta do sujeito
alocado nele, mas contingente à resposta do animal alocado no ambiente contingente,
portanto, o animal acoplado recebe a mesma dose de droga simultaneamente ao sujeito no
ambiente contingente; note-se que no ambiente acoplado não é manipulada a relação de
contingência entre a resposta do animal e o efeito da droga e apenas o contexto pode ser
relacionado ao efeito da droga (i.e., condição CP). No ambiente controle, o animal é
submetido a um procedimento similar ao do ambiente acoplado, mas no lugar de uma droga,
uma infusão de veículo é administrada.
Usando um procedimento de administração acoplada como o descrito acima,
diferentes estudos têm reportado diferenças de expressão gênica em áreas cerebrais de
sujeitos que receberam uma droga sob contingência operante ou Pavloviana. Por exemplo,
Kuzmin e Johanson (1999) observaram que em animais que receberam COC sob
22
contingência operante houve aumento do mRNA do c-Fos na amígdala lateral (LA) e
basolateral (BLA), enquanto os animais que receberam COC sob contingência Pavloviana
mostraram uma diminuição no mRNA de c-Fos nas mesmas áreas. Tendo em conta que a
BLA possui conexões eferentes dirigidas ao NAc Core e Shell que ajudam a mediar a
motivação e se acredita esteja implicada na aprendizagem relacionada a estímulos
ambientais/contextuais (Martinez, Carvalho-Netto, Ribeiro-Barbosa, Baldo, & Canteras,
2011; Setlow, Holland & Gallagher, 2002), é uma subárea de grande interesse para o presente
estudo.
Winstanley et al. (2007) reportam a expressão de ΔFosB unicamente em animais que
receberam COC sob CO, mas não sob CP, no Córtex Orbito-frontal (OFC), o qual está
relacionado a comportamentos de meta dirigida (goal-directed, em inglês) e também de
impulsividade, características da procura por drogas na dependência (Barbey, Krueger &
Grafman, 2009). Outro exemplo é reportado por Choi et al. (2011), em um estudo que mostra
que mudanças neurais como a hiper-regulação da expressão de receptores AMPA na Área
Tegmental Ventral (VTA), a qual está implicada na “motivação” da administração de COC,
após administração da droga sob CO, mas não sob CP.
Dois estudos de especial interesse para este trabalho, Perrotti et al. (2008) e
Winstanley et al. (2007), observaram a expressão do fator de transcrição de ΔFosB no NAc
(core e shell) e no Córtex Orbitofrontal (OFC), após a administração de COC sob
contingência operante e Pavloviana em ratos. No estudo de Winstanley et al. (2007), ratos
foram expostos durante três semanas em administração crônica de COC (0,5 mg/kg por
infusão) sob o procedimento de administração acoplada. A expressão de ΔFosB no OFC de
todos os animais foi medida por imunohistoquímica, sendo que este IEG foi expresso apenas
pelos sujeitos sob a contingência operante e não sob a Pavloviana. Segundo os autores, esta é
23
uma região-chave não só regulação de comportamentos de meta dirigida, mas também de
impulsividade, características da procura por drogas na dependência.
No estudo de Perrotti et al. (2008) foram realizados dois experimentos. No primeiro,
ratos foram expostos durante duas semanas em administração crônica de COC (0,5 mg/kg por
infusão) sob o procedimento de administração acoplada. A expressão de ΔFosB foi medida
no NAc Core e Shell, e Caudado-Putamen (CPu) por imunohistoquímica. Não foram
encontradas diferenças significativas na expressão de ΔFosB entre os grupos sob a
contingência operante e sob a Pavloviana, sendo que ambos expressaram amplamente este
IEG. No segundo experimento, ratos receberam por duas semanas injeções intraperitoneais
diárias de uma de quatro substâncias, COC, morfina, etanol e tetraidrocanabinol, isto é, as
drogas foram administradas sob CP. Posteriormente, foram realizadas medidas de ΔFosB por
técnica imunohistoquímica em diferentes áreas do SNC (PFC, estriado dorsal, NAc, septum
lateral e medial, hipocampo, amígdala, substância cinzenta, área tegmental ventral e
substância nigra, entre outros), encontrando que as quatro drogas induziram a expressão deste
IEG em quantidades que variaram em relação à droga e a região, mas tendo todas as quatro
drogas em comum uma forte expressão de ΔFosB no NAc.
Juntos, os resultados dos estudos de Perrotti et al. (2008) e Winstanley et al. (2007),
indicam que: a) a indução por COC de ΔFosB em regiões estriatais (NAc e CPu) se pode dar
emCO ou CP; b) a indução por COC da expressão de ΔFosB no OFC depende do tipo de
contingência de administração, sendo apenas expresso após a autoadministração da droga
(CO). Portanto, os dados sugerem que ainda que ambas as formas de interação do organismo
com a COC produzam alterações em regiões chave na dependência às drogas, associadas com
a integração de informação emocional e cortical (Goto & Grace, 2008), implicação em
atribuir significado motivacional a estímulos pavlovianos (Ambroggi, Ghazizadeh, Nicola, &
Fields, 2011; Everitt, 2001), aquisição de informação de estímulos ambientais que podem
24
modular o comportamento (Saddoris, Stamatakis, & Carelli, 2011), motivação e centro do
prazer responsável pelo processamento da sensação de gosto no reforço positivo (West &
Carelli, 2016), e mediação de funções como aprendizagem de sequências e seleção de
estratégias (Devan, McDonald, & White, 1999); apenas a administração da droga sob
contingência operante causou algumas das mudanças neurais necessárias para desenvolver
dependência.
Ainda que os estudos de Perrotti et al. (2008) e Winstanley et al. (2007) pareçam
direcionar a questão sobre a relação entre autoadministração e administração passiva de
drogas, os procedimentos comportamentais utilizados e os resultados derivados deles podem
não ser úteis para entender as diferencias produzidas na expressão de IEGs pela
administração de droga sob contingências operantes e pavlovianas. Isso porque em nenhum
desses experimentos são manipulados os estímulos que antecedem a emissão da resposta
operante (grupo contingente) ou que apenas antecedem a infusão da droga (grupo acoplado).
Ao não manipular essa variável, a infusão que recebe o grupo acoplado pode não estar
acontecendo sob um CP, pois os efeitos da droga não são contingentes aos estímulos
presentes na câmara experimental desse grupo (i.e. na sua presença e na sua ausência a droga
é infundida). Ainda que pode ser argumentado que, em teoria, alguns estímulos que aparecem
apenas no momento da infusão (e.g. som da bomba de infusão) devem adquirir função de CS
do efeito da droga.
O controle dos estímulos associados aos efeitos da droga é atualmente considerado
chave para se entender a passagem do uso recreativo de drogas ao seu abuso. Entretanto, não
existe consenso entre os processos de controle de estímulos que seriam críticos. Parte dos
estudos da área de dependência propõe que os comportamentos de busca e autoadministração
de drogas de sujeitos dependentes de drogas, são controladas por CSs estabelecidos durante a
administração das drogas (Bachteler, Economidou, Danysz, Ciccocioppo, & Spanagel, 2005;
25
Robinson & Berridge, 1993, 2003, 2008). Em contrapartida, outros autores alegam que os
comportamentos de busca e autoadministração de drogas observados na dependência de
drogas são produto de relações operantes (Chen et al., 2008; Melzack, 1990; Stefanski,
Ladenheim, Lee, Cadet, & Goldberg, 1999), sendo a contingência operante considerada um
processo chave para compreender o comportamento de consumo abusivo e a busca por
drogas (Chen et al., 2008; Heyman, 2010; Herrnstein & Prelec, 1992; Jacobs et al., 2003;
Kuzmin & Johansson, 1999; Melzack, 1990; Stefanski et al., 1999).
Como será evidente posteriormente, a controvérsia entre as propostas acima
mencionadas parece estar associada a alguns equívocos conceituais, como por exemplo, a
distinção entre controle de estímulos operante ou pavloviano estar fundamentada na
controlabilidade ou não que o sujeito tem sobre o próprio comportamento: respostas operantes
seriam controladas pelo próprio sujeito e CRs seriam incontroláveis e involuntárias.
Adicionalmente, será explicado em uma seção posterior como seria possível que um CS tivesse
controle sobre respostas de busca e autoadministração de uma droga, por um processo
comportamental chamado Transferência Pavloviana-operante (PIT). Porém antes de entrarmos
nessa questão, primeiro definiremos os comportamentos alvo do estudo da área de Dependência
de Drogas: procura, consumo e recaída.
No estudo experimental sobre o controle de estímulos de respostas mantidas por drogas,
são frequentemente usados modelos animais que pretendem simular respostas de procura e
autoadministração por drogas, e também recaída a estas. A procura por drogas é definida pelos
comportamentos de busca, aquisição e forrageio da droga (Sanchis-Segura & Spanagel, 2006);,
conseguir o dinheiro para comprar a droga, comprar esta e frequentar os locais onde a droga
está disponível são exemplos destes comportamentos. A autoadministração de drogas pode ser
definida como o comportamento que imediatamente precede a ingestão da droga (por exemplo,
se injetar, cheirar, ingerir ou fumar uma droga são considerados comportamentos de
26
autoadministração). Por último, a recaída é um termo usado para descrever a retomada da
autoadministração de drogas, após algum período de abstinência (Epstein, Preston, Stewart, &
Shaham, 2006). O controle de estímulos da procura, consumo e recaída às drogas são de
particular interesse para este trabalho, pois os dois primeiros os comportamentos que
caracterizam a dependência, e a recaída seria o processo de restabelecimento destes
comportamentos posteriormente à sua extinção. Por esse motivo serão melhor detalhados a
seguir.
Modelos de Estudo de Administração de Drogas
Para o estudo experimental do controle de estímulos da resposta mantida por drogas,
são frequentemente usados modelos animais que pretendem simular os comportamentos de
autoadministração, procura por drogas e recaída. Para este estudo são de particular interesse os
modelos denominados por Sanchis-Segura & Spanagel (2006), de procura e autoadministração
de drogas. No modelo de autoadministração operante (i.e., CO) é comumente utilizada uma
caixa operante (ou caixa de Skinner) a qual está equipada com operandi ou manipulandi que
transmitem uma resposta operante a um (ou mais) dispositivo que se encarrega de entregar um
reforçador. Estas caixas são geralmente adaptadas a depender das necessidades experimentais:
para transmitir a(s) resposta(s) operante(s), com alavancas, rodas, receptores infravermelhos,
entre outros; para entregar um reforçador, como sistema de entrega de comida ou soluções
líquidas, dispositivos de injeção para diferentes rotas (e.g. endovenosa, intragástrica, oral,
intracraniana), e adicionalmente, estas caixas podem ser adaptadas com módulos de luzes, tons,
e outros para seres utilizados como estímulos discriminativos ou reforçadores condicionados.
O procedimento básico de autoadministração consiste em equipar a caixa com um primer
operandum ligado a entrega de um reforçador e um segundo ligado a entrega de um veículo ou
sem consequências programadas. Infinidade de variações podem existir nos procedimentos de
autoadministração, dependendo do operandi, dispositivos de entrega e estímulos
27
discriminativos que possa ter uma pesquisa particular, mas para ser considerado um
procedimento de autoadministração, deve existir minimamente a possibilidade de uma resposta
operante ter como consequência a administração de uma substância. Este modelo oferece maior
flexibilidade de delineamento experimental comparado com modelos não operantes. Enquanto
aos procedimentos de autoadministração de drogas, este tem se mostrado confiável e válido
como modelo de consumo de drogas em humanos (Sanchis-Segura et al., 2006).
No modelo de procura por drogas e recaída, comumente é realizado um treino como o
descrito anteriormente em primeira instância, e posterior ao de autoadministração operante,
os sujeitos são expostos a uma fase de extinção, na qual as suas respostas no operandi não
têm consequências programadas. Finalmente é realizada a fase de teste, em que as respostas
operantes produzem a mesma consequência que no treino inicial (i.e., administração da
mesma dose da substância). Segundo Sanchis-Segura et al. (2006), existe um erro de
definição neste modelo de recaída, pois estritamente falando, prévia à recaída, a
autoadministração de drogas não se passa por uma etapa de extinção, mas sim de privação.
Por este motivo, principalmente, talvez seja adequado definir este como um modelo de
recaída, porém continua sendo um valioso modelo de procura por drogas. O comportamento
de procura por drogas se interpreta como a busca, forrageio e aquisição de uma droga quando
esta não está disponível, fenômeno comumente referido por alguns autores como craving
(Sanchis-Segura et al., 2006). Dado isto, existem algumas opções procedimentais a depender
do estudo para a fase final (teste), comumente chamada de reinstalação. Uma destas é o
priming2, o qual consiste em administrar uma dose não operante nos sujeitos antes do teste,
2 O principal inconveniente metodológico com o priming como estímulo para desencadear (trigger)
comportamentos de busca e de autoadministração é a possível interferência produzida pelos efeitos psicoativos
da droga, a qual pode incrementar ou diminuir a locomoção, resultando em incrementos/decrementos espúrios.
28
interpretando a reinstalação do responder previamente extinto como busca por drogas e
recaída desencadeada por ação farmacológica. Outro possível procedimento no teste é a
apresentação de estímulos previamente condicionados à administração da droga (ou em
alguns casos, condicionados a estímulos estressantes), interpretando a reinstalação do
responder previamente extinto na presença destes estímulos, e não de outros não
relacionados, como busca por drogas e recaída desencadeada por estímulos ambientais
(externas). Uma terceira opção procedimental é expor os sujeitos a algum protocolo de
estresse antes da fase de teste, interpretando a reinstalação do responder previamente extinto
como busca por drogas e recaída desencadeada por estresse.
Comumente, os modelos utilizados para estudar a procura por drogas incluem o treino
prévio da resposta de autoadministração de uma droga na presença de estímulos ambientais,
isto acontece tanto no modelo de autoadministração quanto no modelo de procura e
autoadministração. Em outras palavras, todos os sujeitos aprendem uma associação estímulo-
resposta-consequência. Isto representa um inconveniente procedimental para um estudo que
pretenda interpretar as respostas separadamente, dado que dificulta/impossibilita a
interpretação da CP e da CO por separado (Sanchis-Segura et al., 2006).
No modelo de autoadministração de drogas é geralmente assumido que a contingência
em vigor é de caráter exclusivamente operante, dada a relação resposta-consequência
implícita. Mesmo assim, não se pode descartar que o mesmo ambiente onde é realizado o
ambiente possui (e é em si mesmo) estímulos condicionados à droga, o que implica uma
relações S-S. Em outras palavras, também existe um condicionamento Pavloviano no
condicionamento operante (Donahoe et al., 1994, Colwill & Rescorla, 1988; Rescorla, 1991,
1994). Da mesma forma, no modelo de procura por drogas, no qual a contingência treinada é
operante discriminativa, criam-se relações S-S. A despeito de ambos modelos manipularem
contingências operantes, é assumido por boa parte da literatura que os modelos de procura
29
por droga medem comportamentos condicionados por contingências Pavloviana e que os
modelos de autoadministração informam sobre comportamentos condicionados por
contingências operantes (e.g., Berridge, Robinson & Aldridge; 2009; Robinson & Berridge,
2008; Colwill & Rescorla, 1985). Assim, frequentemente os modelos de procura são
utilizados para pesquisar mudanças neurais relativas a processos em CP e os modelos de
autoadministração são utilizados para pesquisar mudanças neurais relativas a processos em
ACO. Entretanto, por ambos procedimentos envolverem contingências operantes e
possivelmente Pavlovianas, não são os mais adequados para se pesquisar mudanças neurais e
comportamentais produzidas pela CP ou pela CO.
Um modelo pouco usado pela área de dependência às drogas, mas que permite
observar a comparação direta entre CP e ACO, é o modelo de autoadministração acoplada
ou operante acoplado. Este permite o estudo simultâneo da administração de uma droga sob
contingências operantes (autoadministração) e administração da mesma droga sob
contingências Pavlovianas (administração passiva), separando as histórias de administração
sem alterar a dosagem de droga administrada. O modelo operante acoplado consiste na
conexão de ambientes experimentais, de forma que o desempenho de um sujeito determina a
apresentação de estímulos e/ou esquemas para si mesmo e outro(s) sujeito(s) acoplado(s) a
este (Catania, 1999). No caso específico da administração de drogas, o procedimento padrão
com animais se caracteriza pelo acoplamento de pelos menos três ambientes: contingente,
acoplado e controle (ou veículo). Em cada ambiente é alocado um animal. No ambiente
contingente, a emissão de uma resposta operante tem como consequência a infusão da droga,
ou seja, existe uma relação de contingência entre a resposta e o efeito da droga (ACO). No
ambiente acoplado, a administração da droga é independente da resposta do sujeito alocado
nele, mas contingente à resposta do animal alocado no ambiente contingente, portanto, o
animal acoplado recebe a mesma dose de droga simultaneamente ao sujeito no ambiente
30
contingente; note-se que no ambiente acoplado não é manipulada a relação de contingência
entre a resposta do animal e o efeito da droga e apenas o contexto pode ser relacionado ao
efeito da droga (ACP). No ambiente controle, o animal é submetido a um procedimento
similar ao do ambiente acoplado, mas no lugar de uma droga, uma infusão de veículo é
administrada.
O modelo operante acoplado é de grande relevância para o estudo da dependência às
drogas dado que permite distinguir entre os dois tipos de efeitos que causam
neuroplasticidade quando uma droga ingressa em um organismo, um resultante do efeito
farmacológico3 de uma substância de ação central no SNC, como na CP, e outro resultante
dos processos comportamentais associados à autoadministração da droga, como na CO
(Dacher & Nugent, 2011; Lüscher & Malenka, 2011). Por permitir diferenciar entre
mudanças comportamentais produzidas por processos operantes e Pavlovianos na
administração de drogas, além de permitir a análise independente dos dois tipos de mudanças
no SNC produzidas pela autoadministração e a administração passiva, este modelo é uma
valiosa ferramenta para o desenvolvimento deste estudo.
Controle de Estímulos da procura, consumo e recaída
Estímulos ambientais podem adquirir controle sobre comportamentos reforçados por
drogas se foram associados de forma prévia ao efeito da droga. Esse fenômeno é verificado em
animais humanos (e.g. Childress, McLellan, Ehrman, & O'Brien, 1988; O'Brien, Ehrman, &
Ternes, 1986) e em animais não humanos (e.g. Goldberg, Spealman, & Kelleher, 1979; Woods
& Schuster, 1968; Weiss, Kearns, Cohn, Schindler, & Panlilio, 2003). Desde os anos 60,
3 Tendo em conta que não existe um efeito puramente farmacológico em um organismo vivo consciente, pois este está sempre em contato com estímulos ambientais, portanto os efeitos da droga estão sujeitos aos estímulos ambientais presentes no momento da ação central, existindo a probabilidade de aprendizagem, mesmo que não associativa.
31
autores como Thompson e Ostlund (1965) mostraram que é possível que estímulos ambientais
ocasionem que um sujeito retome padrões comportamentais que previamente tiveram a função
de aliviar sintomas de abstinência, e desde então também se tem reportado que sintomas de
abstinência podem ser condicionados a um estímulo especifico e posteriormente ser evocados
por este, como na contingência Pavloviana (Goldberg & Schuster, 1967; Wikler & Pescor,
1967), produzindo padrões comportamentais de uso de drogas de abuso caracterizados como
dependência (McDonald & Siegel, 2004; Siegel, 2005; Siegel & Ramos, 2002) e recaída do
uso após períodos de abstinência prolongada (O’Brien, Childress, Ehrman, & Robbins, 1998;
Robinson & Berridge, 2008).
Fundamentados nessas pesquisas, vários autores da literatura especializada no estudo
da dependência de drogas tem proposto que os padrões de procura autoadministração e recaída
observadas em sujeitos dependentes são função do controle de estímulos ambientais associados
aos efeitos da droga (e.g. Everitt & Robbins, 2005; Kalivas & O'Brien, 2008; Kalivas, Peters,
& Knackstedt, 2006; Robinson & Berrigde 2003; Siegel, 2005; Siegel & Ramos, 2002).
Diferentes autores têm exposto as suas propostas para explicar como um estímulo
ambiental adquire controle sobre respostas de busca e autoadministração de drogas. A teoria
da saliência do Incentivo de Robinson & Berridge (1993, 2003, 2008) é uma das mais citadas
na literatura das neurociências, liderando várias das pesquisas realizadas na área e é usada
como fundamento para distinguir entre os processos pavlovianos e operantes da procura e
recaída (Everitt & Robbins, 2005; Berridge, Robinson & Aldridge, 2009). Por esse motivo,
descrevemos a seguir as propostas principais da teoria.
De acordo com a Teoria da Sensibilização do Incentivo, na sensibilização da saliência
do incentivo, o estímulo produzido pelo uso repetido de drogas em contextos específicos seria
o processo chave que leva à dependência. A sensibilização do incentivo aconteceria porque
32
os sistemas neurais responsáveis pela saliência do incentivo dos estímulos são sensibilizados
pela administração repetida da droga, causando que o indivíduo sensibilizado, quando
exposto à droga ou a estímulos associados a ela, quisesse a droga mesmo não gostando dela
(Robinson & Berridge, 1993, 2003, 2008; Berridge & Robinson, 2016).
A teoria distingue dois processos no desenvolvimento da dependência, “gostar” da
droga e “querer” a droga” (Robinson & Berridge, 2003, 2008; Berridge e Robinson, 2016). O
gostar”4 é usado por estes autores para se referir abreviadamente ao impacto prazeroso de um
SR sobre um organismo, mediado por sistemas neurais não dependentes de dopamina, que
envolvem a saliência do incentivo de um estímulo. Por outro lado, o “querer” 5 seria uma
forma de motivação a qual é mediada por sistemas dopaminérgicos mesolímbicos, um
processo “não racional” que pode instigar e orientar um comportamento em um sujeito, sem
necessariamente ter emoção consciente, desejo ou um objetivo específico, i.e. sem “gostar”
necessariamente. Os autores definem o “querer” como a ativação de processos que envolvem
a saliência do incentivo de um estímulo. Em outras palavras, o querer está associado com CSs
que sinalizam um SR, que fariam esses CSs mais salientes, ou seja, mais chamativos e
atrativos para o organismo (Hickey & Peelen, 2015).
Na autoadministração de drogas não patológica estaria envolvida circuitaria neural do
gostar da droga, i.e., sistema opioide (Smith & Berridge, 2007), porém na dependência de
drogas seria a circuitaria do querer a que estaria envolvida, i.e., sistema dopaminérgico
(Koob, 1992; Pavuluri, Volpe & Yuen, 2017). A passagem do uso recreacional ao uso
compulsivo seria explicado pela sensibilização da circuitaria do querer aos estímulos do
ambiente associados com a droga, o que aconteceria após sua administração repetida. O que
4 Do inglês “liking”. 5 Do inglês “wanting”.
33
se observa em termos comportamentais é que na presença desses estímulos respostas
fisiológicas que são interpretadas como querer ou fissura pela droga são produzidas e a
autoadministração da droga é incontrolável, pois a resposta do sistema neural está aumentada.
Berridge, Robinson e Aldridge (2009) reformularam a Teoria da Sensibilização do
Incentivo em termos da evidência empírica que sustenta a proposta dos diferentes
mecanismos neurofisiológicos de “querer” e “gostar”, mas descartam a correspondência
desses mecanismos com a diferenciação entre processos comportamentais operantes e
Pavlovianos. De acordo com os autores, “Estudos das neurociências dos efeitos de ‘gostar’,
‘querer’, e dos componentes de aprendizagem de recompensas, revelaram que estes processos
psicológicos são mapeados em distintos sistemas cerebrais de recompensa, neuroquímicos e
neurofisiológicos, em um grau determinado” (p. 71)6. Portanto, na teoria mais recente da
sensibilização do incentivo, o “querer” e o “gostar” envolvem mecanismos neuronais de
recompensa diferentes e não necessariamente correspondem exclusivamente a processos
operantes ou Pavlovianos, como afirmado na teoria original. Porém, segundo estes autores, a
ênfase na eliciação produzida por um estímulo condicionado em contingência Pavloviana
seria o mecanismo fundamental na dependência as drogas.
Garcia-Mijares e Silva (2006) apontam que existem vários problemas ao tentar
explicar a dependência em termos de “querer e gostar”, pois não fica claro se “querer” é um
comportamento/resposta ou um estímulo, comprometendo o uso do termo como variável
causal, ao ser definida pelos autores como um estímulo que ativa processos neurais
associados à saliência do estímulo (Robinson & Berridge, 2003). Portanto o processo
psicológico que explicaria a autoadministração de uma droga não está claro. Contudo, para os
6 Original em inglês: “Affective neuroscience studies of ‘liking’, ‘wanting’, and learning components of rewards have revealed that these psychological processes map onto distinct neuroanatomical and neurochemical brain reward systems to a marked degree”.
34
objetivos do presente trabalho, a teoria é relevante por enfatizar que a contingência entre a
apresentação de dois estímulos (um estímulo ambiental e o efeito da droga), assim como a
sensibilização dos sistemas neuronais envolvidos, são os processos básicos da dependência.
Estudos reportam que circuitos dopaminérgicos de animais expostos
intermitentemente a comida ou drogas respondem exageradamente a infusões
autoadministradas de anfetamina, i.e., a resposta desse sistema ao efeito da anfetamina é
sensibilizada (Everitt & Robbins, 2005; Everitt et al., 2008; Robinson & Berridge,1993;
Volkow, Wang, Fowler, & Telang, 2008; Wyvell & Berridge 2001). Estes animais, quando
expostos a estímulos associados a esses reforçadores (CSs) produzem respostas de fissura, ou
seja, iniciam uma cadeia de respostas que se inicia pela sua busca e finaliza com a
autoadministração da droga (em consumo compulsivo). Esses estudos sugerem que tal como
proposto pela teoria do incentivo, a sensibilização é um mecanismo importante na
dependência de drogas.
Em resumo, é essencial à Teoria da Sensibilização do Incentivo a ideia que estímulos
ambientais são condicionados de forma pavloviana aos efeitos da droga, e que na presença
deles se produzem respostas no sistema nervoso central que instigam o sujeito a procurar e
consumir a droga. Portanto, segundo esta lógica, a procura e consumo de droga do
dependente seriam respostas operantes induzidas ou alterados pela presença de estímulos
eliciadores, ou seja, são comportamentos determinados por processos de transferência de
controle Pavloviano-operante, que serão explicados com maior detalhe a seguir.
Pavlovian to Instrumental Transfer
A Transferência Pavloviana-Operante, ou PIT pela sua sigla em inglês (Pavlovian to
instrumental transfer), se encontra comumente na literatura, tanto para descrever um
35
processo comportamental, quanto para fazer referência ao procedimento experimental
desenvolvido para poder observar este processo ou fenômeno.
O procedimento de PIT possui diversas variações, mas todas envolvem, em geral, três
fases: treino Pavloviano (Fase 1), treino operante (Fase 2) e teste de transferência (Fase 3).
Os treinos Pavloviano e operante podem aparecer primeiro em qualquer ordem (ou na Fase 1
ou na Fase 2), a depender do objetivo do estudo, e em seguida um teste é realizado para se
observar o efeito do CS sobre o responder operante. No treino Pavloviano é realizado um
pareamento CS-US, e.g., uma luz pode se tornar um CS ao ser pareada com droga (i.e., US).
No treino operante, o animal recebe droga como consequência de emitir alguma resposta (por
exemplo, pressionar a barra). Uma vez realizados esses procedimentos independentes, o teste
de transferência é realizado em extinção (i.e., sem consequência programada para o
responder), no qual a resposta operante é avaliada na presença do CS e na sua ausência. O
objetivo do teste é verificar se o CS do treino Pavloviano adquire controle sobre a resposta
operante, sem nunca ter sido associado a ela. Em geral, o resultado indica uma maior
ocorrência de respostas operantes na presença do CS do que na sua ausência.
Os primeiros estudos relacionados à PIT datam da década dos 40s. Estes reportaram
que um estímulo associado com comida podia aumentar a frequência de uma resposta
operante que tinha também comida como consequência (Estes & Skinner, 1941; Estes, 1943).
Estes primeiros estudos não propunham os processos comportamentais que estariam
envolvidos na PIT. Posteriormente, foi proposta a Teoria dos Dois Processos (em inglês,
Two-process Learning Theory) sendo estudada inicialmente por Rescorla e Solomon (1967),
postulando que os condicionamentos decorrentes de CPs e a COs poderiam implicar
diferentes processos de aprendizagem. Nesse contexto, a PIT era considerada como a
alteração de um tipo de comportamento (i.e. operante) por manipulações no treino de outro
(i.e., pavloviano).
36
Rescorla e Solomon (1967) consideravam que as respostas emocionais aversivas ou
apetitivas ficavam sob controle pavloviano de dicas ambientais, que quando eliciadas,
interferiam ou facilitavam a ocorrência de uma resposta operante. Por esse motivo, o
procedimento foi muito utilizado para o estudo da influência das respostas emocionais
condicionadas sobre operantes em curso.
Algumas décadas depois, a explicação da PIT foi refinada. Estudos como os de
Dickinson e Dawson (1987) e Balleine (1994) ajudaram a entender a transferência como um
processo caracterizado pela motivação no lugar da emoção. Ainda, neste momento, o fator
‘escolha’, que caracteriza principalmente a PIT, não estava sendo explicado. Com o
desenvolvimento de novas tecnologias no começo do século, as neurociências se uniram ao
estudo da transferência. Dois grandes contribuições foram obtidas: o processo
comportamental foi dividido de acordo em transferência seletiva, não seletiva e
generalizada, caracterizadas por diferentes substratos neurais (Corbit & Balleine, 2005;
2011). No procedimento de transferência seletiva o mesmo US1 (e.g droga) é usado para
treinar um CS1 e uma resposta operante R1. O procedimento de transferência não-seletiva é
uma variação do anterior, que avalia se a transferência depende de se usar o US como SR, e se
ela ocorre de forma seletiva em relação à resposta operante. Por último, o procedimento de
transferência generalizada permite avaliar a ocorrência de PIT para estímulos que foram
associados a reforçadores diferentes dos treinados na Fase 1.
Estudos com procedimentos de PIT, seletiva ou não-seletiva, têm mostrado que
quando o reforçador em um treino operante é o mesmo US, comumente resulta na maior
frequência de resposta na presença do CS do que na sua ausência (Allman, DeLeon, Cataldo,
Holland, & Johnson, 2010; Holland, 2004). Por outro lado, quando o US é aversivo e o
reforçador apetitivo, é comum observar a diminuição da taxa de resposta na presença do CS
(Holland, 2004; Colwill & Rescorla, 1985). Tanto o procedimento, quanto o fenômeno são
37
comumente denominados de desvalorização (e.g., Holland, 2004; Rescorla, 1985). Ainda, o
efeito da PIT (transferência ou desvalorização) possa variar em razão de parâmetros como a
apetitividade ou adversidade de US, a PIT também pode variar em função de diferentes
fatores experimentais como a magnitude do US (van den Bos et al., 2004), a duração e
sincronicidade com que o CS é apresentado na CP (Crombag et al., 2008), a quantidade de
treino e o uso de múltiplos reforçadores (Holland, 2004), a similaridade entre as respostas no
treino operante e no teste de transferência (Baxter & Zamble, 1982), o tempo de exposição do
CS treinado na associação por contingência Pavloviana (Holmes, Marchand & R Coutureau,
2010), entre outros.
Três experimentos foram realizados por Galarce, Crombag e Holland (2007)
utilizando os procedimentos PIT e desvalorização para avaliar o efeito da especificidade do
reforço na transferência Pavloviana-operante, mostrando que, depois do CO, o valor de um
CS (apetitivo ou aversivo) associado a um US, pode alterar a frequência do responder
operante emitido na presença deste CS. No primeiro experimento, inicialmente, os animais
foram expostos ao treino sob contingência Pavloviana com dois tons de diferente intensidade
(CS1 e CS2), sendo CS1 associado à sacarose e CS2 à maltodextrina disponibilizadas em
receptáculos de comida diferentes. Posterirormente, os animais passaram por um treino de
contingência operante (uma barra para receber sacarose próxima a um receptáculo e uma
segunda barra para receber maltodextrina próxima a um segundo receptáculo). Quando os
CSs foram introduzidos em situação de extinção durante o teste de transferência, os animais
apresentaram PIT respondendo significativamente mais na barra que foi associada com cada
CS quando estes estavam presentes durante o treino.
O segundo experimento de Galarce, Crombag e Holland (2007) foi realizado expondo
os mesmos animais do primeiro experimento ao retreino de contingência Pavloviana e
contingência operante prévios. Depois os animais foram alimentados ad-libitum e foram
38
medidos os consumos de sacarose e maltodextrina na presença de CS1 e CS2, sendo
registrado maior consumo de sacarose na presença de CS1 e de maltodextrina na presença de
CS2, o que sugere que a PIT se pode apresentar diretamente na resposta consumatória,
incrementando a administração de uma substância associada previamente a um CS. No
terceiro experimento os animais dos experimentos anteriores foram ainda expostos a um
procedimento de desvalorização. A contingência Pavloviana consistiu na apresentação de
CS1 ou CS2, disponibilizando sacarose ou maltodextrina junto com uma injeção de cloreto de
lítio (LiCl) para produzir aversão ao sabor. Depois de dez dias o teste de desvalorização foi
apresentado. Comportamentos apetitivos (aproximação e entrada ao receptáculo da comida) e
consumatório (consumir a comida) foram examinados na presença de CS1 e CS2, mostrando
a redução de ambos os comportamentos no receptáculo correspondente na presença de CS1 e
CS2. O que sugere que a desvalorização é um processo que pode ter efeito após uma tarefa
ser amplamente treinada e ainda se mostrar específico para uma CR quando várias relações
CS-US foram aprendidas. Juntos, estes três experimentos são um claro exemplo de como se
apresenta a PIT generalizada depois de adquiridas relações CS-US em um condicionamento
Pavloviano, tanto na PIT quanto na desvalorização.
Um exemplo de PIT seletiva são os dois experimentos de Holland (2004) que tinham
como objetivo avaliar a quantidade de treino sobre a PIT. No primeiro experimento, ratos
privados de comida foram treinados sob uma contingência Pavloviana com os tons CS1 e
CS2; um foi pareado com pellets de comida (US1) e outro não (US2), respectivamente. Em
seguida, estes receberam um treino sob contingência operante de pressão à barra para obter o
US1 comida por duas, cinco ou vinte sessões. Depois, foi realizada uma única sessão de
transferência, em que tentativas discretas de CS1 e CS2 foram apresentadas em condições de
extinção. Logo, foi realizada mais uma sessão de treino Pavloviano e uma de treino operante.
Posteriormente, quatro sessões de desvalorização foram efetuadas, disponibilizando US1
39
seguido de uma injeção de LiCl. Foi então realizada mais uma sessão de transferência,
idêntica à primeira, e finalmente foi testada a aversão à comida nas caixas viveiro sem usar
LiCl. No segundo experimento de Holland (2004), outros sujeitos foram condicionados sob
um procedimento similar ao do primeiro experimento. Foram realizados pareamentos com
apresentações contrabalançadas de comida (US1) ou uma solução de sacarose (US2). As
apresentações de US1 e US2 foram randomizadas de modo que fossem iguais os pareamentos
de CS1-comida, CS1-sacarose, CS2-comida e CS2-sacarose. Depois, os ratos foram
distribuídos entre dois grupos e deu-se início ao treino operante das respostas de pressão à
barra (R1) e de pular uma corrente situada no teto da caixa operante (R2). Um dos grupos foi
treinado para responder em R1 e R2 para receber US1 ou US2, respectivamente, o outro
grupo foi treinado para responder em R1 para receber US1 e em R2 e R3 (apertar um painel)
para receber US2. Os sujeitos passaram por mais uma sessão de treino Pavloviano e
posteriormente por duas sessões de transferência nas mesmas condições que no experimento
1 (tentativas discretas de CS1 e CS2 foram apresentadas em condições de extinção), sendo
que uma destas sessões foi realizada disponibilizando unicamente R1 e a outra unicamente
com R2 (responder em R3 não foi registrado). Igual ao primeiro experimento, os animais
receberam mais uma sessão de treino Pavloviano e uma de treino operante (idênticas às
anteriores para cada grupo). Os grupos foram divididos em duas metades e foi realizado um
procedimento de desvalorização apresentando o US1+LiCl ou o US2+LiCl durante quatro
dias. Duas sessões de transferência idênticas às anteriores foram realizadas. Por último, o
US1 foi apresentado nas caixas viveiro.
Estes resultados mostram que a quantidade de treino em contingência operante com
um único reforçador tem efeitos diretamente proporcionais na taxa de frequência do operante
associado na presença do CS quando é de caráter apetitivo, e efeitos opostamente
proporcionais nesta frequência quando o CS e de caráter aversivo, durante a transferência
40
(PIT). Quando múltiplos reforçadores foram usados (Experimento 2), os processos de PIT e
desvalorização foram menos influenciados pela quantidade de treino.
Crombag, Galarce e Holland (2008) mostraram como diferentes relações CS-US
estabelecidas em uma contingência Pavloviana podem influenciar as respostas de busca
(apetitivas e consumatórias), quando o CS é apresentado depois de um treino em CO. Dois
grupos de camundongos foram treinados sob CP. O primeiro grupo foi treinado com um tom
duração de 10s (CS), seguido de leite (US); o outro grupo passou por um treino semelhante,
mas o CS teve uma duração de 2 min. Depois, a resposta de pressão à barra foi treinada
usando o US como reforçador. Finalmente, durante o teste, o CS foi apresentado em extinção
e as respostas na barra registradas. O grupo de animais na condição de treino em contingência
Pavloviana de 2 min mostrou PIT e apresentou significativamente mais respostas em relação
ao grupo na condição de treino Pavloviano de 10s, mostrando que o tempo de exposição entre
a apresentação de CS e US utilizado em uma contingência Pavloviana é um parâmetro que
pode influenciar a aparição de PIT generalizada.
Considerados em conjunto, os experimentos descritos indicam que o fenômeno da PIT
é modulada por diversos parâmetros como o tempo de exposição apresentado entre CS e US
em um condicionamento sob CP, quantidade de treino no treino em contingência Pavloviana
e a quantidade de respostas treinadas no treino de CP. Sugerem, portanto, que o efeito do
estímulo condicionado sobre o responder operante não é um fenômeno de “tudo ou nada” e
que diferentes graus e tipos de transferência podem ser obtidos por manipulação do treino
CS-US. Usando um procedimento semelhante, diferentes autores tem a aparição de PIT com
resultados similares, como Stebbins e Smith (1964) com macacos, Rescorla e Lolordo (1965)
com cães, Morse e Skinner (1958) com pombos e Lansade et al., (2013) com cavalos. A
observação de PIT em diferentes espécies sugere que a PIT é um processo básico do
comportamento.
41
Contudo, a pesquisa de PIT tem focado principalmente nesta transferência como
processo comportamental, medindo variáveis como índice discriminativo frequência de
respostas, e interpretando a interação entre contingência operante e Pavloviana (Holmes,
Marchard & Couterau, 2010), mas não discute o fenômeno comportamental da transferência
em termos de motivação. Como apontado previamente, a autoadministração de drogas é uma
questão de escolha (Balleine, 1994; Dickinson & Dawson;1987) e não unicamente uma
resposta emocional, sem controle, evocada por controle de estímulos em organismos. Ainda,
o estudo dos substratos neurais tem permitido caracterizar a PIT de acordo aos seus substratos
neurais (Corbit & Balleine, 2005; 2011), os quais são diferentes na transferência seletiva e na
transferência generalizada como explicado em seguida.
Diversos estudos apontam o Núcleo Accumbens (Goto & Grace, 2008), a Área
Tegmental Ventral (e.g. Corbit & Janak, 2007), a Amígdala (e.g. Corbit and Balleine, 2005),
e o Córtex Prefrontal (e.g. Ostlund & Balleine, 2007) como as principais áreas que participam
dos processos de PIT seletivo e generalizado.
Estudos do início do século pareciam ser contraditórios em relação às estruturas
neurais que estariam implicadas na PIT. Inicialmente, Hall et. al (2001) e Holland e
Gallagher (2003) reportam que lesões no NAc core, mas não shell, impedem a PIT, e seu
estudo sugere que a Amígdala Central (CeA) e o NAc core, mas não a Amígdala Basolateral
(BLA) nem o NAc shell, estão implicados nos processos de PIT. Entretanto, Blundell et al.
(2001) e Corbit e Balleine (2001) reportaram que lesões o NAc shell, mas não o core, afeta a
PIT, sugerindo de forma contraditória aos outros estudos (Hall et. al, 2001; Holland &
Gallagher, 2003) que o NAc shell cumpre sim um papel dentro dos processos de PIT. Estudos
posteriores realizados por Corbit e Balleine (2005, 2011) identificaram o paradigma fazendo
distinções entre PIT específica e PIT generalizada esclarecem que a primeira é impedida por
lesões de BLA e NAc shell e a segunda é impedida por lesões de CeA e NAc core.
42
O NAc tem conexões diretas com o Córtex Pré-frontal (PFC). Se esperaria o
envolvimento do PFC no PIT dado que regula funções executivas relacionadas com
diferentes aspectos de comportamentos de meta dirigida, como uma sequência de respostas
que levam a obter um reforçador (Barbey, Krueger & Grafman, 2009), além de estar
associado à memória de trabalho e mediação de associações resposta-consequência (Corbit &
Balleine, 2003a) e à aprendizagem operante CS-CR (Tran-Tu-Yen, Marchand, Pape, Scala, &
Coutureau, 2009). Por este motivo, alguns estudos têm sido realizados para observar as
possíveis relações. Ostlund e Balleine (2007) reportam que lesões no Córtex Orbital Frontal
(OFC) do PFC impediu PIT seletiva, porém unicamente quando estas lesões foram realizadas
post-treino e não quando foram feitas prévio ao treino. O que indicaria, segundo os autores, a
função do OFC ventral na PIT seletiva está implicada na aquisição da relação CS-US, mas
não a da R-SR. Adicionalmente, lesões completas de OFC ventral e lateral ocasionaram
déficits na aparição de PIT específica, o que sugere que na PIT específica as subáreas ventral
e lateral do OFC são necessárias para a aquisição do CP. Keistler, Baker e Taylor (2015)
reportam que lesões bilaterais do PFC Pré-limbico (PL) impediram a aparição de PIT
específico e adicionalmente, ao fazer a desconexão entre o Córtex Infralímbico (IL) e Shell,
puderam confirmar que esta via faz parte específica dos circuitos de PIT específico, o que
indica a necessidade desta via e das subáreas implicadas para a aprendizagem a aquisição de
relações CS-US.
Estudos no Estriado Dorsomedial (DMS) e no Dorsolateral (DLS) mostram que a
inativação de estes tem efeitos diferentes na PIT. O estudo de Corbit e Janak (2007)
encontrou que a inativação de DSL impediu a apresentação de transferência seletiva,
enquanto a inativação de DMS impediu a apresentação de transferência generalizada.
Adicionalmente, em um estudo posterior destes autores, a DLS, a DMS anterior ou posterior
foram desativadas durante o CP, encontrando que, durante o teste de transferência, a
43
inativação de DLS junto com a de DMS posterior podem afetar a aquisição da relação CS-
US, enquanto que a inativação de DMS anterior e posterior afetaram a aquisição de
associações R-SR (Corbit & Janak 2010). Juntos, estes estudos que utilizam lesões para
pesquisar as funções e relevância das conexões na PIT, têm aportado importantes dados sobre
as áreas e conexões implicadas na aquisição de associações CS-US e R-SR, para ajudar a
compreensão destes processos de aprendizagem e a sua função na PIT.
Existem vários estudos que indicam que a dopamina (DA) é um neurotransmissores
crítico do processo de PIT, pois (1) lesões na substância nigra (SN), que impedem a
liberação de dopamina no NAc, reduzem a PIT generalizada (El-Amamy & Holland, 2007);
(2) lesões na VTA, que impedem a liberação de DA no NAc, ocasionam redução tanto de PIT
seletiva quanto generalizada (Corbit et al., 2007); (3) a PIT generalizada é potencializado por
agonistas de DA (Pecina et al., 2006), é enfraquecida por antagonistas desse neurotransmissor
(Dickinson et al., 2000).
Leung e Balleine (2015) e Corbit et al. (2007) relataram que ao interromper a via do
Ventral Palladium medial (VP-m) para o VTA se reduze a taxa de respostas da PIT
específica. Os últimos autores argumentam que seus resultados sugerem que o VTA medeia o
“componente motivacional” (taxa global de respostas) da PIT e que o Tálamo Mediodorsal
(MD) media o “componente cognitivo” (o efeito da aprendizagem preditiva na escolha).
Em resumo, os resultados destes estudos reportam estruturas implicadas no processo
de PIT, as quais ao serem lesionadas podem alterar ou impedir o surgimento da transferência,
dada a sua função na aprendizagem operante e/ou pavloviana. Adicionalmente, como
apresentado na seção anterior, a autoadministração (na contingência operante) e a
administração passiva (na contingência Pavloviana) de uma droga podem induzir de forma
diferencial a expressão gênica de FosB, o qual tem sido reportado por ser um importante
44
mecanismo biomolecular nos estudos de dependência às drogas, reportado pela a relação
direta que tem a sua expressão em áreas como o NAc e o aumento na resposta de
autoadministração de uma droga (Olsen, 2011; Robinson & Nestler, 2011; Ruffle, 2014).
Ainda, existe uma importante discussão sobre o controle que os estímulos associados às
drogas por contingência operante e contingência Pavloviana adquirem durante a
aprendizagem, originando a incógnita se realmente é um destes tipos de contingência seria a
chave para que um organismo desenvolva dependência às drogas.
Existe uma lacuna na literatura que permita tentar responder esta pergunta, pois além
dos estudos aqui mencionados, existem poucos estudos que estudem o controle de estímulos
que considerem fatores comportamentais e bioquímicos diretamente relacionados na
dependência às drogas, como o treino ou associação de drogas em contingência operante e
Pavloviana utilizando um esquema acoplado, e a medição da expressão génica de IEGs
usando procedimentos de administração passiva e autoadministração. Ainda, a maioria destes
usam apenas COC como droga de estudo, impossibilitando a comparação com outras drogas
de abuso para determinar aspectos gerais na dependência às drogas.
No presente estudo, propõe-se a morfina e a COC como as drogas a serem estudadas
na administração em contingência operante e Pavloviana, dadas as características que são
mencionadas a seguir.
Morfina e Cocaína como Drogas de Abuso em Estudos de Dependência
A morfina é um agonista dos receptores opióides e faz parte da família dos opióides7,
os analgésicos mais utilizados e eficazes para o tratamento da dor e transtornos afins (Dacher
et al., 2011), sendo amplamente utilizada no âmbito hospitalar. Contudo, também possui
7 Opióides são substâncias de origem endógena ou sintética, referindo-se de forma ampla a todos os compostos relacionados ao ópio.
45
grande potencial para produzir dependência (Christie, 2008; De Vries & Shippenberg, 2002),
caracterizada pelo seu uso indiscriminado, recaída e busca compulsiva ou fissura (Everitt &
Robbins, 2005; Robinson & Berridge,1993). Junto a outros opióides, como o ópio e a
heroína, a morfina é autoadministrada por humanos (Comer et al., 2012) e animais não
humanos, como ratos (Alexander, Coambs, & Hadaway, 1978; Cicero, Aylward, & Meyer
2003; Silva & Heyman, 2001), camundongos (Criswell & Ridings, 1983) e primatas não
humanos (Sanchez-Ramos & Schuster, 1977).
Diferentes efeitos comportamentais podem ser observados quando a morfina é usada
como reforçador, dependendo tanto da dose administrada como do tipo de condicionamento.
Koob (1992) relatou uma função hiperbólica (parabólica), na relação dose-resposta gerada
por esquemas de FR (fixed ratio) baixos, indicando que pouco se pode observar do efeito da
morfina sobre o comportamento quando altas doses são usadas, dado seu efeito sedativo. Por
outro lado, Goldberg e Tang (1977) reportaram uma função linear na relação dose-resposta
quando o esquema utilizado foi de segunda ordem8.
Existe uma extensa literatura que demonstra que os efeitos incondicionados da
morfina são facilmente condicionados a estímulos presentes no ambiente (e.g., McDonald, &
Siegel, 2004; Siegel, 1988, 2001). Por exemplo, o efeito analgésico da morfina pode ser
induzido pela presença de um estímulo condicionado (CS) quando associada previamente a
este em um procedimento Pavloviano (Siegel, 1976; Siegel, Hinson, & Krank, 1978), mesmo
depois de um período de abstinência (Hinson, Poulos, Thomas, & Cappell, 1986). Tolerância
condicionada a diferentes efeitos produzidos pela morfina são adquiridos após alguns dias de
8 Um esquema de segunda ordem consiste basicamente em um esquema composto. Neste, uma sequência de respostas é requerida em um primeiro esquema para apresentar um estímulo condicionado (de um pareamento prévio entre este e um reforçador). Após completar este primeiro esquema múltiplas vezes, como segundo esquema, a consequência é a apresentação do reforçador.
46
administração. Esta tolerância condicionada está ligada aos estímulos ambientais e é
observada de várias formas, como overdose em ratos ao receber uma dose alta, a qual foi
administrada por vários dias, em um ambiente diferente ao usual, ou como hiperalgesia em
ratos que são administrados com um placebo no mesmo ambiente no qual foram
administrados com morfina repetidas vezes (Siegel et al, 1978; Siegel, 1976, 1988, 2001,
2005). Quando a morfina é administrada repetidamente em um ambiente determinado,
observa-se sensibilização condicionada ao efeito ativador psicomotor (Badiani, Oates, &
Robinson, 2000) e preferência condicionada de lugar (PCL) marcada (Reid, Marglin, Mattie,
& Hubbell, 1989).
A cocaína (COC) é um forte estimulante que atua como inibidor da recaptação de
serotonina, norepinefrina e dopamina, motivo pelo qual é utilizada principalmente com fins
recreativos (Pomara et al. 2012). Entre seus efeitos psicoativos se tem reportado a perda do
contato com a realidade, intenso sentimento de felicidade, euforia e agitação (Zimmerman,
2012). A COC também possui algumas aplicações médicas, para produzir adormecimento e
reduzir o sangramento durante cirurgias de condutos lacrimais e nasais (Harper & Jones,
2006), porem sendo pouco utilizada com estas finalidades ao ser facilmente substituível por
anestésicos de uso local que não causam os efeitos secundários que esta produz, como
toxicidade cardiovascular e glaucoma (Dwyer, Sowerby, Rotenberg, 2016).
Esta droga tem sido reportada como reforçadora, sendo autoadministrada por
humanos (Childress, McLellan, Ehrman, & O’Brien, 1987, 1988; Ehrman, Robbins,
Childress, & O’Brien, 1992) e por animais de laboratório (Goldberg & Gardner 1981;
Goldberg, Spealman, & Kelleher, 1979; Koob 1992; Mierzejewski, Koroś, Goldberg,
Kostowski, & Stefański, 2003). Esta autoadministração é caracterizada por ser mantida por
altas taxas de resposta e por depender de apresentações de CSs associados à COC em
contingência operante ou Pavloviana (Goldberg et al. 1979; Katz 1979; Weissenborn,
47
Robbins & Everitt, 1997). Existe um grande número de estudos na literatura que reporta que
estímulos ambientais podem adquirir controle sobre comportamentos reforçados por COC
quando associados previamente a esta (e.g. Childress et al., 1988; Ehrman, et al, 1992;
Goldberg, Spealman, & Kelleher, 1979; Weiss, et. al., 2003; Kruzich, Congelton, & See,
2001).
As propriedades que a COC possui como reforçador são atribuídas a seus efeitos nos
sistemas dopaminérgicos mesolímbicos, ao qual é atribuído o “centro do prazer”, ou em
outras palavras, o sistema do reforço (Pomara et al. 2012; Wise, 1996). Seus efeitos
reforçadores são caracterizados a nível neural pela capacidade que a COC tem para se unir a
transportadores de dopamina (Ritz et al., 1988; Rocha et al., 1998), serotonina (Uhl et al.,
2002), e também pelo seu envolvimento no sistema glutamatérgico (Kalivas, 2004).
Em resumo, os efeitos da morfina e da COC sobre o comportamento estão bem
caracterizados pela literatura e os seus atributos como reforçador estão bem estabelecidos e
documentados, portanto, reproduzíveis. Estas características fazem da morfina e da COC
drogas de abuso ideais para estudar o abuso e dependência de drogas, sendo de grande
relevância. O uso hospitalar de morfina e outros opioides representam o grande desafio
científico de manter as suas potentes propriedades analgésicas, limitando o desenvolvimento
de tolerância e dependência a estas. Adicionalmente, o abuso de opioides, assim como de
COC e seus derivados, traz uma grande preocupação na área da saúde.
Objetivos
O presente trabalho tem como objetivos verificar: i) o efeito da contingência operante
e Pavloviana de morfina e COC sobre a expressão gênica de FosB; e ii) o efeito da
contingência operante e Pavloviana de morfina e COC sobre as respostas de busca e
autoadministração destas drogas. Para atingir os objetivos mencionados foram realizados três
48
experimentos comparando a contingência operante e a Pavloviana de morfina ou COC,
utilizando o modelo de administração acoplado. O primeiro experimento pretendendo
observar e medir a expressão de FosB (o qual se acredita estar associado ao aumento do
valor reforçador de drogas de abuso e, com isso, ao processo que conduz à dependência)
induzida pela contingência Pavloviana e a contingência operante de morfina em diferentes
áreas do cérebro implicadas na dependência às drogas. O segundo experimento pretendeu
observar e avaliar o controle de estímulos nas respostas de busca e autoadministração de
morfina na presença de um estímulo associado à droga por meio de contingência operante ou
Pavloviana. O Experimento 3 pretendeu avaliar tanto a expressão de FosB induzida pela
contingência Pavloviana e a contingência operante de COC em diferentes áreas do cérebro
implicadas na dependência às drogas, quanto o controle de estímulos nas respostas de busca e
autoadministração de COC na presença de um estímulo associado à droga por meio de
contingência operante ou Pavloviana.
Justificativa Geral
Os experimentos propostos no presente estudo têm como finalidade tentar resolver a
incógnita referente à dependência que pode causar ou não a administração repetida de uma
droga sob contingência operante ou Pavloviana, pois como exposto anteriormente, as
contingências envolvidas nestes dois tipos de administração poderiam ser a chave para
compreender os mecanismos relacionados à dependência às drogas. Adicionalmente, a
literatura anteriormente descrita mostra que sujeitos que autoadministram ativamente uma
droga de ação central (em CO) apresentaram diferenças gênicas e comportamentais
(relacionadas à dependência às drogas), comparados com sujeitos que receberam a mesma
droga passivamente (em CP). Foram encontradas na literatura unicamente publicações
usando drogas como COC, ANF e álcool para estudar diferenças gênicas e comportamentais
49
entre contingência operante e Pavloviana, mas nenhuma reportando o uso de morfina, sendo
os dados produzidos pelo presente estudo totalmente inovadores no estudo da dependência do
medicamento anestésico de maior uso hospitalar no mundo.
O presente estudo ainda consolida uma linha nova de pesquisa no Laboratório de
Psicofarmacologia da Universidade de São Paulo e forma parcerias entre três laboratórios de
pesquisa das áreas de Neurociências e Análise do Comportamento. Os experimentos 1 e 2
foram realizados com a coorientação do Prof. Luciano F. Felício (Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da USP) e a colaboração do Prof. Newton Canteras (Instituto de
Ciências Biomédicas da USP). O experimento 3 foi realizado sob a supervisão e tutoria do
professor Emilio Ambrósio, no Laboratório de Psicobiologia da Dependência da Universidad
Nacional de Educación a Distáncia (UNED), em Madri, Espanha.
Método Geral e Equipamentos
Compromisso Ético
O presente estudo foi desenvolvido na sua totalidade com a prévia aprovação de
comités de ética. Os experimentos 1 e 2, executados na USP, Institutos de Psicologia e
Ciências Biomédicas do campus de São Paulo, foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa em
Uso de Animais (CEUA, protocolo 2014/014). Os experimentos 3 e 4, executados na UNED,
Faculdade de Psicobiologia de Madri, foram aprovados pelo Comitê Europeio de ética e
pesquisa em animais (86/609/EEC Directive).
Animais
Foram utilizados na totalidade 120 ratos machos da cepa Wistar, provenientes do
Biotério de Produção de Ratos do Instituto de Ciências Biomédicas da USP, para os
experimentos 1 e 2 realizados na USP; e 72 ratos machos da cepa Lewis, provenientes de
Charles River Laboratories, França, para o experimento 3, realizado na UNED. Os
50
procedimentos experimentais foram iniciados após um período mínimo de adaptação de duas
semanas ao laboratório e após de ter atingido 280-300gr de peso.
Alojamento
Todos os sujeitos foram alojados e manipulados de acordo com as normas dos comités
de ética que aprovaram os estudos. Os sujeitos foram alojados em gaiolas-viveiro individuais
de policarbonato transparente (Euroestandard tipo II, 267 x 207 x 140 mm) com grade
superior para a alimentação. Estas gaiolas-viveiro foram alocadas em estante ventilada
(Alesco) especial para manutenção de animais de laboratórios, isolada acusticamente, com
controle interno de temperatura, ciclo de 12 h claro e 12 h escuro (luzes ligadas às 07:00 h) e
com acesso ad libitum à água e comida durante todas as fases.
Procedimento Cirúrgico
Antes do início dos procedimentos comportamentais, os sujeitos dos experimentos 1 e
2 foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de mescla de cetamina SYNTEC® (75
mg/kg) e xilazina SYNTEC® (9 mg/kg). Os sujeitos dos Experimentos 3 e 4 foram
anestesiados por meio de um sistema de vaporização de descarte de gás passivo (Harvard
Apparatus®), utilizando isoflurano (0,8 lpm) e oxigênio. Um cateter esterilizado de Dow
Corning SILASTIC® (I.D. 0.020 x O.D. 0.037 in., wall 0.010 in.) foi introduzido na veia
jugular direita de cada animal. A parte distal do cateter foi passada sob a pele da região
cervical anterior até a região cervical posterior, e exteriorizada utilizando um botão de acesso
bascular Instech Labs™ (VAB95BS). Na finalização do procedimento, os animais receberam
uma dose única de pentabiótico Pequeno Porte® (benzilpenicilina benzatina, benzilpenicilina
procaína, benzilpenicilina potássica, sulfato de diidroestreptomicina e sulfato de
estreptomicina base, Fort Dodge, Brasil, em dose 1 ml/kg) por via intramuscular, e uma dose
de Banamine® (Flunixina meglumina, Schering-Plough, em dose de 2,5 mg/kg) por via
subcutânea.
51
Todos os locais de incisão foram desinfetados com uma solução de iodo antes e após
o procedimento cirúrgico. Vinte e quatro horas após a cirurgia, e diariamente durante o
transcurso do experimento (antes de depois de cada sessão experimental), os cateteres foram
lavados com uma mistura de 0,1 ml de solução de heparina Hemofol® (500 UI) e salina
bacteriostática a 0,9%, posteriormente com 0,1 ml salina bacteriostática a 0,9%, e finalmente
preenchidos com 0,1 ml de solução de sulfato de gentamicina Gentomicin Syntec® (120
µg/ml).
Equipamento
Foram usadas caixas de condicionamento operante de fabricação Med Associates®, de
dimensões 32 x 25 x 21 cm, isoladas acusticamente. As caixas dispunham de um orifício
circular de 2 cm de diâmetro no centro do teto para permitir a passagem da cânula que
transporta a droga através deste. Todas as caixas foram inseridas em cubículos individuais e
fechados, com ventilação interna e ruído branco para melhor isolamento de sons externos
(Fig. 1). A infusão de droga foi realizada através de um sistema de injeção instalado na parte
externa de cada caixa experimental. Esse sistema consistiu em um suporte giratório
conectado por um extremo a uma bomba de infusão (modelo Med Associates PHM-100-3.33
para os Experimentos 1 e 2 e modelo Harvard 22 para o Experimento 3), e por outro,
conectado ao cateter colocado cirurgicamente no animal.
52
Figura 1 - Esquema da caixa operante. A figura mostra uma esquematização da distribuição do sistema de infusão integrado com a caixa operante e os seus componentes. A. Caixa de isolamento acústico. B. Exaustor. C. Caixa controladora. D. Bomba de infusão. E. Caixa operante. F. Suporte giratório. G. Teto de acrílico com orifício central. H. Parede com operandos e estímulos luminosos e sonoros.
No experimento 1 as caixas equipadas com uma barra retrátil (ENV-112CM MED's
Response Devices) situada no centro da parede direita (a 4 cm de altura da grade) e uma
lâmpada branca de 1 W (colocado 7 cm acima da barra). Para as fases 1 e 2 do Experimento
2, cada caixa foi equipada com uma roda operante (ENV-113M MED's Response Devices),
situado no centro da parede direita (a 4 cm da grade. As caixas também tiveram duas
lâmpadas de 1 W (uma verde e uma branca) colocadas nos cantos superiores (ENV-221M
MED’s Stimulus), esquerdo e direito respetivamente, 7 cm acima do sensor infravermelho.
Adicionalmente foi utilizado um tom de 1,5 kHz (aproximadamente 76 dB). Para as fases
restantes, a roda operante foi removida e duas barras retráteis foram colocadas embaixo de
cada lâmpada (4 cm acima da grade e 7 cm embaixo das lâmpadas), uma em cada canto
inferior (Fig. 2). O funcionamento das caixas, da bomba de infusão e o registro das respostas
foram feitos através de um computador IBM-PC, com programas e interface da Med
Associates.
53
Figura 2 - Esquema da disposição das luzes estímulo, buzzer e dos operandos nas caixas operantes dos
experimentos. A figura mostra uma visão frontal esquemática da parede interior direita das caixas
operantes. No Experimento 1, o estímulo luminoso S1 (luz branca) foi colocado em cima da barra
retrátil, ambos na parte central da parede direita da caixa operante.
No experimento 2, em todas as fases, os estímulos luminosos S1 (luz verde) e S2 (luz
branca) foram colocados nos cantos superiores esquerdo e direito (respeitivamente) da parede
direita da caixa operante. Nas Fases 1 e 2, a roda operante foi localizada na parte central da
caixa, e durante as Fases 3 e 4, esta foi substituído por duas barras retráteis situadas embaixo
das luzes branca e verde. No Experimento 3 o S1 foi um clicker (ENV-135M MED’s
Stimulus) localizado na parte central exterior da parede dos operandos e o S2 foi o som
produzido por um buzzer (2,5 kHz), situado na mesma localização.
Drogas
Para os Experimentos 1 e 2, foi utilizado sulfato de morfina (Laboratório Cristália™,
São Paulo, Brasil) foi dissolvida em veículo salina (0,9% NaCl) para ser administrado por via
i.v. em volume de 3,33 mg/ml na dose de 0,75 mg/kg. A velocidade de infusão foi de 0,1 ml
de solução a cada 3s. Para o experimento 3 foi utilizado cloridrato de cocaína (Agencia
Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, AEMPS) dissolvida em veículo salina
54
(0,9% NaCl) para ser administrado por via i.v. em volume de 3,33 mg/ml na dose de 0,75
mg/kg. A velocidade de infusão foi aproximadamente de 0,1 ml de solução a cada s, sendo
ajustada para cada sujeito individualmente em função do seu peso.
Protocolo Imuno-histoquímico para Fos
Uma hora após o término da última sessão de administração da droga, os ratos foram
anestesiados com uma injeção intraperitoneal de hidrato de cloral 0,2% na proporção 0,4
ml/100 g de peso corpóreo. Em seguida, através de uma bomba peristáltica (Cole Parmer®)
foram perfundidos por via transaórtica inicialmente com 150 ml de uma solução salina 0,9%,
seguida de 500 ml de uma solução fixadora de paraformaldeído a 4% diluído em tampão
fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,4). Os cérebros permaneceram na caixa craniana por 3 h antes
de serem removidos e transferidos para uma solução contendo sacarose 20% em tampão
fosfato de potássio, onde permaneceram por aproximadamente 12 h. Em seguida, cortes
frontais seriados (30m) foram obtidos utilizando-se um micrótomo de congelamento. Os
cortes foram colhidos sequencialmente em 5 compartimentos, de forma que a distância entre
os cortes num mesmo compartimento seja 200 m. Um compartimento foi usado para
detecção imuno-histoquímica de ΔFosB. Os cortes foram incubados inicialmente em uma
solução de tampão fosfato de potássio 0,02M contendo triton X-100 a 0,3%, soro normal de
cabra a 2% e anticorpo policlonal FosB, (102, SC-48/Sta Cruz Biothecnology®) numa
diluição de 1:20.000.
O complexo antígeno anticorpo foi localizado utilizando-se uma variação do sistema
formado pelo complexo avidinabiotina (ABC) (Hsu & Raine, 1981). Após a incubação com o
anticorpo primário, os cortes foram incubados em uma solução contendo anticorpo
biotinilado anti-IgG de coelho, feito em cabra (Ctrector Laboratories®), numa diluição de
1:200, em temperatura ambiente, por 1 hora e 30 minutos e em seguida, colocados em uma
55
solução contendo o composto avidina-biotina-HRP (ABC Elite Kit, Vector Laboratories®)
numa diluição de 1:200, por 1 hora e 30 minutos, para ligar a peroxidase ao complexo
antígeno-anticorpo. Na reação da imunoperoxidase, para a revelação do complexo antígeno-
anticorpo foi utilizado o protocolo de Itoh, Konishi, Nomura, Mizuno, Nakamura, e
Suguimoto (1979). Resumidamente, os cortes foram incubados em uma solução contendo
50mg de tetrahidrocloreto de 3-3’ diaminobenzidina-DAB, 0,6mg de glicose oxidase
(Sigma), 2ml de uma solução aquosa de sulfato de níquel a 10% e 40mg de cloreto de amônia
em 100ml de tampão fosfato de sódio 0,1M, por 5 minutos. Em seguida, foi adicionado -D-
glicose (Sigma), e a reação foi interrompida após 15 min aproximadamente. Os cortes foram
então montados em lâminas recobertas com gelatina, desidratados e recobertos com DPX
(Aldrich Chemical Co.®).
56
Experimento 1. Expressão do IEG FosB na Administração de Morfina em
Contingências Operante e Pavloviana
O objetivo do Experimento 1 foi verificar o efeito da CO e CP de morfina sobre a
expressão gênica de FosB em diferentes áreas do cérebro implicadas na dependência às
drogas, destacando o efeito diferencial entre as duas formas de administração.
Sujeitos
Foram usados 19 ratos albinos machos da cepa Wistar, experimentalmente ingênuos.
As cirurgias foram realizadas quando os sujeitos atingiram 280g-300g de peso. Sete dias após
a recuperação da cirurgia, os animais foram distribuídos aleatoriamente em três grupos:
Administração por Contingência Operante (ACO, n=7), Administração por Contingência
Pavloviana (ACP, n=7) e Controle (Ctrl, n=5), formando trios com um sujeito de cada grupo.
Fases Experimentais
Fase 1. Administração de Morfina em Esquema Acoplado
Os sujeitos do grupo CO foram expostos a uma contingência operante em esquema
CRF (continous reinforcement) de pressão à barra para obter uma infusão i.v. de morfina.
Cada vez que um sujeito do grupo CO recebeu uma dose de morfina, o sujeito do grupo CP e
o do grupo Ctrl a ele acoplados receberam sob contingência Pavloviana uma injeção i.v da
droga na mesma dose ou de veículo (1,0 ml/kg), respectivamente. Cada infusão foi sinalizada
pela apresentação simultânea de uma luz estímulo branca (1W) por 10s nas caixas
correspondentes ao trio, sendo sequenciada por um time out (TO) de 1 min, no qual a barra
retrátil não esteve disponível. Sessões diárias consecutivas foram realizadas durante três
semanas. Cada sessão teve duração máxima de 2 h programadas, mas podia terminar
antecipadamente para um trio se o membro do grupo CO atingisse 20 infusões naquela
sessão.
57
Fase 2. Imunohistoquímica Fos
O procedimento é explicado com detalhe na secção de Métodos e Equipamentos do
presente trabalho. Em resumo, uma hora após o término da última sessão de administração da
droga, os sujeitos foram perfundidos para fixar os tecidos. Os cérebros foran removidos e
posteriormente processados para obter cortes frontais seriados, com 30m de espessura
usando um micrótomo de congelação. Os cortes foram incubados inicialmente em uma
solução de tampão fosfato de potássio 0,02M contendo triton X-100 a 0,3%, soro normal de
cabra a 2% e anticorpo policlonal FosB, (102, SC-48/Sta Cruz Biothecnology®). O
complexo antígeno-anticorpo foi localizado utilizando-se uma variação do sistema formado
pelo complexo avidina-biotina, e após a incubação com o anticorpo primário, os cortes foram
incubados em uma solução contendo anticorpo biotinilado anti-IgG de coelho, feito em cabra,
e em seguida, colocados em uma solução contendo o composto avidina-biotina-HRP, para
ligar a peroxidase ao complexo antígeno-anticorpo. Posteriormente se realizou a revelação do
complexo antígeno-anticorpo incubando os cortes em uma solução contendo 50mg de
tetrahidrocloreto de 3-3’ diaminobenzidina-DAB, 0,6mg de glicose oxidase (Sigma), 2ml de
uma solução aquosa de sulfato de níquel a 10% e 40mg de cloreto de amônia em 100ml de
tampão fosfato de sódio 0,1M, e em seguida, foi adicionado -D-glicose, interrompendo a
reacão após 10 min aproximadamente. Os cortes foram então montados em lâminas
recobertas com gelatina para poder obter as imagens de microscopia que foram analizadas.
Para analisar o material, foi realizada inicialmente uma avaliação semiquantitativa da
expressão das proteínas ΔFosB no NAc (core e shell), regiões do sistema nervoso central nas
quais estas proteínas se expressaram de forma diferencial para CO e CP em um estudo piloto
prévio. Posteriormente foi realizada a contagem de células imunorreativas à proteína ΔFosB
para as áreas neurais de maior interesse (ver Tabela 1) utilizando o software Image Pro Plus®.
58
Tabela 1. Áreas Neurais Estudadas no Experimento 1
ÁREA SUBÁREA
Córtex Pre-Frontal Medial (mPFC) Córtex Cingulado (Cg1) Córtex Prelímbico (PrL) Córtex Infralímbico (IL)
Nucleo Acumbente (NAc) Core Shell
Caudado Putamen (CPu) Lateral Basolateral
Hippocampo Giro Dentado (DG) Corno de Amon 1 (CA1) Corno de Amon 3 (CA3)
Amígdala Basolateral Central Medial
Análise de dados
A diferença de expressão de ΔFosB das diferentes subáreas entre grupos foi calculada
realizando testes não paramétricos para amostras independentes. O teste de Kruskall-Wallis
foi realizado para detectar diferenças estatísticas, e quando achadas estas (p < 0,05), o teste U
de Mann-Whitney com fator de correção Bonferroni foi utilizado como post hoc. Todas as
análises estatísticas foram executadas fazendo uso do software aplicativo IBM SPSS®.
Resultados
Durante a única fase do Experimento 1, a Fase 1 (Administração de Morfina em
Esquema Acoplado), os sujeitos dos três grupos foram expostos a um arranjo experimental no
qual cada vez que um sujeito do grupo CO tinha como consequência do seu responder uma
dose de morfina, o sujeito do grupo CP e o do grupo Ctr a ele acoplados receberam sob
contingência Pavloviana uma injeção i.v da droga na mesma dose ou de veículo (1,0 ml/kg),
respectivamente. A média de infusões (M =5,617, SD = 1,093) esteve dentro do esperado
segundo o que se reporta para estudos de autoadministração de morfina (Mierzejewski et al,
2003; Suto, Wise, & Vezina, 2011).
59
Figura 3 – Média de infusões durante a Fase 1 do Experimento 1. O gráfico mostra a frequência da média de infusões de morfina dos sujeitos integrantes dos grupos CO, CP e Ctr durante as últimas seis sessões da Fase 1.
Após as sessões de administração de morfina, os sujeitos foram perfundidos e as
amostras de tecido foram processadas para imunohistoquímica de ΔFosB. Em seguida são
mencionados os resultados das comparações das médias do número de células imunorreativas
a ΔFosB no mPFC utilizando o teste Kruskall-Wallis, região por região, junto com gráficos
que ilustram as diferenças entre grupos.
Como pode ser observado na Figura 4, a análise estatística revelou diferenças
significativas entre grupos em todas as subáreas estudadas do mPFC. Diferenças entre grupos
para Cg1 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =7,144 p =0,028), com uma mediana de 103,80
para o grupo CO, 94,28 para o CP e 110,20 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com
correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CP x Ctr (p =0,030). Diferenças
entre grupos para PrL (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =7,337 p =0,026), com uma
mediana de 11,93 para o grupo CO, 102,93 para o CP e 107,61 para o Ctr, e o teste pós-hoc
Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x CP (p
=0,020). Adicionalmente, foram achadas diferenças estatisticamente significativas entre
grupos para IL (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =10,694 p =0,005), com uma mediana de
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4 5 6
Infu
ssõ
es
Sessão
ACO1 ACO2 ACO3 ACO4
ACO5 ACO6 ACO7 ACO8
60
126,78 para o grupo CO, 112,97 para o CP e 99,94 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-
Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p
=0,003).
Figura 4 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no mPFC. O gráfico mostra a mediana (-P25 e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do mPFC (Cg1, PrL e IL) no Experimento 1. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
Na Figura 5 se pode observar que existem diferenças estatisticamente significativas
entre grupos em ambas as subáreas do NAc. A análise estatística comparando as médias do
número de células imunorreativas a ΔFosB diferenças estatisticamente significativas entre
grupos para NAc Core (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =15,068 p =0,001), com uma
mediana de 374,78 para o grupo CO, 306,96 para o CP e 135,17 para o Ctr, e o teste pós-hoc
Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x CP (p
=0,006), CO x Ctr (p =0,007) e CP x Ctr (p =0,007). Para NAc Shell, foram encontradas
diferenças estatisticamente significativas entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19)
=13,126 p =0,001), com uma mediana de 171,79 para o grupo CO, 202,28 para o CP e 124,43
para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados
significativos de CO x CP (p =0,033) e Co x Ctr (p =0,030) e CP x Ctr (p =0,007).
61
Figura 5 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no NAc. A figura mostra a mediana (-25P e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do NAc (Core e Shell) no Experimento 1. Krusskal-Wallis mediana *p<0,05 **p<0,01.
A Figura 6 mostra um exemplo das marcações de ΔFosB realizadas, ilustrando à
esquerda um sujeito do grupo CO e à direita um do CP.
Figura 6 – Imagem microscópica da marcação de células imunorreativas a ΔFosB no NAc. A imagem mostra em uma escala de aumento 4X, o número de células imunorreativas a ΔFosB por mm² no CPu Core e Shell em sujeitos dos grupos CO (à esquerda) e CP (à direita) no Experimento 1.
A análise estatística comparativa nas subáreas do CPu revelaram que existem
diferenças significativas entre grupos tanto no CPu Lateral, como no CPu Medial, como pode
ser observado na Figura 7. Diferenças entre grupos para CPu Lateral (Kruskall-Wallis test: H
(2, N= 19) =11,314 p =0,003), com uma mediana de 100,33 para o grupo CO, 105,89 para o
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Core Shell
Cé
lula
s im
un
orr
eat
ivas
po
r m
m²
Grupo
CO CP Ctr** **
**
* ***
CO CP
62
CP e 41,58 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou
resultados significativos de CO x Ctr (p =0,007) e CP x Ctr (p =0,007). Para CPu Medial,
foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre grupos (Kruskall-Wallis
test: H (2, N= 19) =10,773 p =0,005), com uma mediana de 114,56 para o grupo CO, 112,99
para o CP e 58,09 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni
mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p =0,007) e CP x Ctr (p =0,007).
Figura 7 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Caudado Putamen (CPu). O gráfico mostra a mediana (-P25 e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do CPu (Lateral e Medial), no Experimento 1. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
A Figura 8 mostra a comparação entre as subáreas DG, CA1 e CA3 do Hipocampo.
Foram encontradas diferenças estatisticamente significativas em todas estas. Diferenças entre
grupos para DG (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =15,068 p =0,001), com uma mediana de
229,69 para o grupo CO, 257,49 para o CP e 202,91 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-
Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p
=0,007) e CP cx Ctr (p= 0,007). Para CA1, foram encontradas diferenças estatisticamente
significativas entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =10,566 p =0,005), com uma
mediana de 172,85 para o grupo CO, 153,39 para o CP e 105,43 para o Ctr, e o teste pós-hoc
Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p
0
20
40
60
80
100
120
140
Lateral Medial
Cé
lula
s im
un
orr
eat
ivas
po
r m
m²
Grupo
CO CP Ctr
**** **
**
63
=0,007) e CP x Ctr (p =0,007). Para CA3, foram encontradas diferenças estatisticamente
significativas entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =15,916; p <0,001), com uma
mediana de 144,81 para o grupo CO, 71,73 para o CP e 31,49 para o Ctr, e o teste pós-hoc
Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x CP (p
=0,001), CO x Ctr (p =0,007) e CP x Ctr (p =0,007).
Figura 8 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Hipocampo. O gráfico mostra a mediana (-P25 e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do Hipocampo (DG, CA1 e CA3), no Experimento 1. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
Por último são ilustradas as comparações entre as subáreas Basolateral, Medial e
Central da Amígdala. Como pode ser observado na Figura 9, existem diferenças significativas
entre grupos unicamente para as duas primeiras. Diferenças entre grupos para Amígdala
Basolateral (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =9,430 p =0,009), com uma mediana de
160,45 para o grupo CO, 125,40 para o CP e 127,06 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-
Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x CP (p
=0,012) e perto da significância estatística, CO x Ctr (0,053). Para Amígdala Central, foram
encontradas diferenças estatisticamente significativas entre grupos (Kruskall-Wallis test: H
(2, N= 19) =8,754 p =0,013), com uma mediana de 187,90 para o grupo CO, 145,55 para o
CP e 150,89 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni
0
50
100
150
200
250
300
DG CA1 CA3
Cé
lula
s im
un
orr
eat
ivas
po
r m
m²
Grupo
CO CP Ctr****
****
****
**
64
mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p =0,015) e perto da significância estatística,
CO x CP (0,052). Para Amígdala Medial, não foram encontradas diferenças estatisticamente
significativas entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =5,224 p =0,073), com uma
mediana de 165,49 para o grupo CO, 139,34 para o CP e 127,27 para o Ctr.
Figura 9 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB na Amígdala. O gráfico mostra a mediana (-P25 e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas da Amígdala (Basolateral, Central e Medial), no Experimento 1. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
Em resumo, os resultados apresentados do Experimento 1 mostram que a o grupo CO
expressou maior quantidade de FosB comparado com o CP e Ctr no Core e CA3; e o grupo
CP expressou maior quantidade de FosB comparado com o CO e Ctr no Shell e no DG. No
lCPu, mCPu e CA1, o grupo CO e CP tiveram maior expressão que o Ctr (mas não ouve
diferença entre estes). Adicionalmente, no PrL e BLA o grupo CO teve maior expressão que
o CP e no IL e CeA o grupo CO teve maior expressão que o Ctr.
Por serem muitas variáveis dependentes (13 sub-áreas) e duas independentes (tipo de
contingência de administração e droga), elaborou-se uma tabela que mostra todos os
resultados possíveis derivados das comparações entre os grupos. Acredita-se que a Tabela 3
possa auxiliar o acompanhamento dos resultados e a discussão.
0
50
100
150
200
250
Basolateral Central Medial
Cél
ula
s im
un
orr
eat
ivas
po
r m
m²
Grupo
CO CP Ctr
*
*
65
Tabela 3. Resultados possíveis e sua interpretação (mudança de expressão de
DelafosB) de acordo com as variáveis independentes manipuladas (infusão de droga e
contingência de administração)
RESULTADO DROGA CONTINGÊNCIA INTERPRETAÇÃO
CO = CP CO = Ctr CP = Ctr
Não Não Nem a droga, nem a contingência alteraram ΔFosB
CO = CP CO ≠ Ctr CP = Ctr
Não Não Nem a droga, nem a contingência alteraram ΔFosB. A diferença explicada por outra variável
CO = CP CO = Ctr CP ≠ Ctr
Não Não Nem a droga, nem a contingência alteraram ΔFosB. A diferença explicada por outra variável
CO = CP CO ≠ Ctr CP ≠ Ctr
Sim Não A droga alterou ΔFosB independentemente da contingência
CO ≠ CP CO ≠ Ctr CP ≠ Ctr
Sim Sim A contingência operante e Pavloviana alterou ΔFosB de forma diferencial
CO ≠ CP CO ≠ Ctr CP = Ctr
Sim Sim A droga alterou a expressão de ΔFosB só sob CO
CO ≠ CP CO = Ctr CP ≠ Ctr
Sim Sim A droga alterou ΔFosB só sob contingência Pavloviana
CO ≠ CP CO = Ctr CP = Ctr
Não Não Nem a droga, nem a contingência alteraram ΔFosB. A diferença explicada por outra variável
Discussão
O objetivo do Experimento 1 foi explorar o efeito da administração de morfina sob
contingência operante e Pavloviana sobre a expressão gênica de FosB em diferentes áreas
do cérebro implicadas na dependência às drogas. Para isso, ratos de três grupos foram
expostos a um esquema acoplado. Sob esse esquema, cada vez que um animal do grupo CO
girava uma roda operante sob algum valor de FR na presença de um estímulo, uma infusão de
morfina era liberada como consequência; ao mesmo tempo, a droga era também infundida na
presença do mesmo estímulo no sujeito do grupo CP e o do grupo Ctr a ele acoplados.
66
Posteriormente, os ratos foram perfundidos e amostras de tecido das áreas de interesse foram
tomadas para análise imunohistoquímica de FosB.
Os resultados do Experimento 1 confirmam os achados em todas as áreas reportadas
pelo estudo de Perrotti et al. (2008), reportando que a morfina pode induzir a expressão de
FosB no CPF, estriado dorsal, NAc Core e Shell, hipocampo DG e CA3 e amígdala BLA e
CeA. Ainda, de forma mais detalhada, os resultados mostram as subáreas do CPF e estriado
dorsal em que a morfina pode induzir a expressão de FosB, PrL e IL do CPF, e CPu do
estriado dorsal.
Os resultados do Experimento 1 mostraram que a expressão de FosB no NAc Core e
CA3 foi maior no grupo CO comparado com os animais dos outros dois grupos. Estes dados
são consonantes com a literatura que mostra que autoadministração repetida de uma droga
produz mudanças gênicas (no SNC) diferentes às causadas pela administração repetida da
mesma droga de forma passiva (Choi et al., 2011; Jacobs et al., 2002, 2003, 2005; Krawczyk,
2002; Kuzmin & Johansson, 1999; Lüscher & Malenka, 2011; Miguéns et al., 2008; Thomas
et al., 2003; Winstanley et al., 2007). Em contrapartida, os resultados também mostraram que
a expressão de FosB no NAc Shell e DG foi maior no grupo CP comparado com os animais
dos outros dois grupos. Na literatura atual não foram encontrados estudos que reportem que a
administração passiva de uma droga possa produzir uma maior mudança de expressão gênica
em comparação com a autoadministração da mesma. Ainda, dentro dos limites do
conhecimento bibliográfico, este é o primeiro estudo que avalia as diferenças de expressão de
FosB na autoadministração e administração passiva utilizando morfina.
A expressão de FosB no PrL, BLA e CeA foi maior no grupo CO comparado com o
grupo Ctr, mas não comparado com o CP. Parece existir um padrão ou tendência que não
conseguiu ser confirmado estatisticamente neste estudo, em que a expressão de FosB é
67
CO>CP>Ctr nestas três subáreas mencionadas. As variáveis que não mostrem uma diferença
clara entre contingência operante e a Pavloviana não são relevantes para os objetivos desta
pesquisa, ergo, não serão discutidos.
Ainda, os resultados deste experimento parecem sustentar a proposta de que FosB
seria um IEG marcador do efeito reforçador de drogas no NAc e PFC (e.g Colby et al., 2003;
Zachariou et al., 2006).
O PFC regula funções executivas relacionadas com diferentes aspectos de
comportamentos de meta dirigida (Tran-Tu-Yen, Marchand, Pape, Scala, & Coutureau, 2009),
e outras tarefas de aprendizagem operante, como sequência de respostas que levam a obter um
reforçador (Barbey, Krueger & Grafman, 2009), memória de trabalho (Corbit & Balleine,
2003a), processamento de informação emocional, aprendizagem e memória (Hayden & Platt,
2010). Os resultados do Experimento 1 para o PFC revelaram que que a autoadministração de
morfina aumentou a expressão de FosB dos animais do grupo CO, quando comparados com
os animais dos grupos CP no Cg1, e dos animais do grupo CO, quando comparados com os
animais dos grupos Ctr no IL.
O PrL tem sido associado à memória de trabalho e mediação de associações resposta-
consequência (Corbit & Balleine, 2003a), entre outros. As diferencias entre os grupos CO e CP
é consistente com a atribuição dessa função, pois os sujeitos do grupo CO, mas não os do grupo
CP, foram treinados sob uma contingência operante (resposta-consequência). Entretanto, como
não foram observadas diferenças entre o grupo Ctr e os grupos CO e CP, não é possível atribuir
aos efeitos incondicionados ou condicionados da droga a disparidade entre contingência
operante e Pavloviana, nem às contingências de aprendizagem sob as quais cada grupo estava
sendo treinado. Assim, os resultados parecem indicar que a administração de morfina não altera
a expressão de FosB nesta subárea.
68
Os resultados também mostraram que no Cg1 o grupo Ctr apresentou uma maior
expressão de FosB comparado com o grupo CP. O Cg1 tem uma função altamente relevante
para a aprendizagem das consequências que produz um comportamento, tendo um papel no
processamento de informação emocional, aprendizagem e memória relacionados com um
reforçador (Hayden & Platt, 2010). Entretanto, de acordo com os resultados apresentados, a
expressão de FosB não foi alterada pelos efeitos da droga, implicando que esta proteína não
seria um marcador de interesse no Cg1 na administração de morfina, a diferencia dos outros
subnúcleos do CPF. Ainda, esta expressão não se vê afetada pela administração de morfina em
contingência operante ou Pavloviana.
Por outro lado, os resultados no IL, o qual está associado à aprendizagem operante, mais
especificamente, às tarefas de meta dirigida (Tran-Tu-Yen, Marchand, Pape, Scala, &
Coutureau, 2009), mostraram uma diferença entre o grupo CO e o Ctr e CP e Ctr, mas não entre
CO e CP. Este dado está em concordância com o estudo de Perrotti et al. (2008) que indica que
a expressão de FosB no PFC é aumentada pela administração de morfina, esclarece que esta
expressão não depende do tipo de contingência de aprendizagem em que a morfina foi
administrada. Ainda, junto com os resultados de Cg1 e PrL, se especifica as subáreas do PFC
que são susceptíveis a expressão de FosB induzida pela administração de morfina, o qual não
se encontra descrito na literatura.
Os resultados no NAc foram os de maior interesse para a proposta de Winstanley et al.
(2007), que postula que a administração da droga sob contingência operante pode causar
algumas mudanças neurais, como expressão de FosB, que não se dariam em igual forma sob
CP. A expressão de FosB no Core dos sujeitos do grupo CO foi maior comparado com os
grupos CP e Ctr, porém a expressão desse IEg no Shell foi maior no grupo CP do que nos
grupos CO e Ctr, indicando que a contingência sob a qual a morfina é administrada produz
alterações diferencias nessas subáreas do NAC.
69
De acordo com a literatura, mudanças no Core são críticas para a aquisição de
informação de estímulos ambientais que podem modular o comportamento, estando implicado
em tarefas de meta dirigida (Saddoris, Stamatakis, & Carelli, 2011), aprendizagem de tarefas
espaciais (Parkinson, Willoughby, Robbins & Everitt, 2000), PIT e devaluação (Corbit &
Balleine, 2001, 2005, 2011), e tarefas de escolha de reforçadores com atraso (Cardinal &
Cheung, 2005). Os resultados obtidos para o Core estão alinhados com as funções descritas
deste. A maior expressão de FosB no Core após a contingência operante de morfina na
presença de um estímulo, quando comparado com a contingência Pavloviana na presença do
mesmo estímulo, sugere que tanto o tipo de contingência quanto a droga, influenciaram este
resultado, de modo que a droga tivesse aumentado a expressão desta proteína no Core. Este
resultado é inédito na literatura. Se esperava encontrar diferenças na expressão FosB entre os
grupos CO e CP em algumas áreas, como no PFC, como reportado Zachariou et al. (2006), mas
foi surpreendente este achado no Core, pois no estudo de Perrotti et al. (2008), realizado com
COC, se reporta que não ouve diferença entre autoadministração e administração passiva na
expressão FosB no NAc.
O Shell está envolvido em processos de motivação e é frequentemente descrito como o
centro do prazer responsável pelo processamento da sensação de gosto no reforço positivo
(West & Carelli, 2016), assim como por ser sensível a estímulos salientes presentes no
ambiente (Ambroggi, Ghazizadeh, Nicola, & Fields, 2011). Uma maior expressão de FosB
no Shell após a administração passiva de morfina, quando comparado com a autoadministração
da mesma, sugere que tanto a contingencia de administração quanto a droga estiveram
envolvidos como fatores neste resultado, e que para o grupo CP a exposição à morfina em
conjunto com S1 durante o treino Pavloviano poderia ter incrementado a saliência deste
conjunto de estímulos, causando uma maior ativação do Shell, tanto pela sensação de prazer
causada pela morfina, como pela associação com S1.
70
Ainda que já tinha sido reportado na literatura alterações da expressão de FosB no
NAc após autoadministração e administração passiva de COC (Perrotti et al., 2008), não
encontramos dados que mostrassem o efeito diferencial da contingência de administração de
morfina, operante ou pavloviana, sobre a indução desse IEG no Core e Shell do NAc. Em
conjunto, os resultados obtidos para o Core e Shell oferecem uma perspectiva em concordância
com a literatura que reporta estas duas subaéreas codificam informação associada a um
reforçador de forma diferencial, sendo no Core ligado a aspectos operantes e no Shell a aspectos
Pavlovianos da aprendizagem (e.g Saddoris et al., 2011; West & Carelli, 2016).
Os resultados para ambas as subáreas do CPu avaliadas neste estudo, são chamativos:
a morfina causou mudanças em ambas as subáreas avaliadas, lCPu e mCPu,
independentemente da contingência de administração. De acordo à literatura, o lCPu recebe
inputs do córtex somatossensorial e motor, tendo papel na mediação e programação de
movimentos, como mudanças na frequência, duração e amplitude dos movimentos em geral,
incluindo os envolvidos no aprendizado S-R, sendo que sua lesão prejudica a aprendizagem
de contingência S-R (Fricker, Annett, Torres, & Dunnett, 1996). Por outro lado, o mCPu
recebe inputs do mPFC e está implicado na mediação de funções como aprendizagem de
sequências e seleção de estratégias, sendo que a sua lesão impede a aprendizagem de tarefas
que envolvem aprendizagem de posição e de dicas ou estímulos presentes no ambiente, como
no labirinto de Morris e no de oito braços (Devan, McDonald, & White, 1999). Estes
resultados estão em concordância com o estudo de Perrotti et al. (2008), confirmando o
aumento na expressão de FosB na autoadministração de morfina para estas subáreas que
conformam o CPu. Ainda, especifica as subáreas que são sensíveis a expressão deste IEG, o
qual não estava reportado com tal detalhe, e mostra que esta expressão na lCPu e mCPu não
varia em razão da contingência em que a morfina seja administrada.
71
No Hipocampo, a expressão de FosB no DG e CA3 foi alterada pela contingência
sob a qual a droga foi administrada; no CA1 foram também observadas mudanças da
expressão desse IEG, porém decorrentes do efeito da droga e independente da contingência
de administração. Subáreas como CA1 e CA3 têm sido reportadas como críticas para as
associações entre uma droga e estímulos ambientais (Gajewski, Eagle & Robison, 2017),
O DG tem sido reportado por ter funções de codificação conjuntiva (conjunctive
encoding processes), separação de padrões espaciais e separação de padrões contextuais
(Kesner, 2013). Em outras palavras, o DG estaria implicado na associação entre estímulos e a
discriminação destes. Os resultados para esta subárea mostram que o grupo CO e CP tiveram
uma maior marcação de FosB que o grupo Ctr, mas não houve diferença entre contingência
operante e Pavloviana. Este resultado confirma que a administração de morfina no DG pode
causar grande expressão FosB, como descrito por Perrotti et al., (2008). O dado sugere que
o DG é susceptível ao efeito farmacológico que a morfina causa sobre o organismo e não a
contingência de aprendizagem, estando em concordância com as funções atribuídas a esta
subárea, pois estando implicada na associação entre estímulos, se esperaria que ambas as
contingências tivessem um impacto nesta subárea, como mostra o resultado.
A CA1 é subárea descrita frequentemente pela sua relevância para a recuperação de
memória contextual e aprendizagem da ordem temporal de eventos, como em uma tarefa de
identificação de estímulos em sequência (Barrientos & Tiznado, 2016). Sabe-se que o CA1
expressa FosB quando morfina é administrada (Perrotti et al., 2008), porem dado que ambas
as contingências aqui estudadas envolvem a aprendizagem da ordem temporal de eventos,
não se esperavam diferenças entre os grupos CO e CP. Em alinhamento com esta ideia, os
resultados mostraram que, de forma similar ao DG, FosB foi induzido nos grupos CO e CP
em maior medida que no controle, porém sem ter diferença entre os dois primeiros. Isto
72
indica que o CA1 é sensível à administração de morfina, mas é independente do tipo de
contingência em que esta seja administrada.
Por outro lado, o CA3, uma subárea caracterizada (entre outras funções) pelo seu
papel no processamento sequencial de informação em cooperação com CA1 e no
processamento de aspectos geométricos do ambiente em cooperação com o DG (Kesner,
2007). Os resultados mostram que nesta subárea o grupo CO apresentou uma maior marcação
de FosB comparado com os grupos CP e Ctr. Ainda, o grupo CP também apresentou uma
marcação maior deste IEG em comparação com o Ctr. Este resultado confirma o reportado
previamente, que indica que a administração de morfina pode induzir a expressão de FosB
no CA3 (Perrotti, et al., 2008) e mostra que esta expressão é susceptível do tipo de
contingência em que esta é administrada. Isto sugere que o efeito escalonado da manipulação
comportamental sobre a expressão de FosB (CO>CP>Ctr) poderia ser resultado da
sequência de informação mais complexa da contingência operante (Sd R SR), quando
comparada com a da pavlovianda (S R).
Na Amígdala observamos mudanças na expressão de FosB nas subáreas BLA e
CeA, mas não na MeA, após a autoadministração de morfina, mas não após sua
administração passiva.
A BLA possui conexões eferentes dirigidas ao NAc Core e Shell e se acredita que seja
necessária para que em conjunto se possa mediar a motivação implicada na aprendizagem
relacionada a estímulos ambientais/contextuais (Martinez, Carvalho-Netto, Ribeiro-Barbosa,
Baldo, & Canteras, 2011; Setlow, Holland & Gallagher, 2002) e na aprendizagem de
associações entre estímulos em comportamento de meta dirigida (Holland & Gallagher,
2003). De forma similar, na CeA, uma subárea a qual está implicada na atenção da
aprendizagem e está fortemente ligada à motivação em eventos relacionados a estímulos via
73
ação reguladora do sistema dopaminérgico mesolímbico (Haney, Calu, Takahashi, Huges e
Schoenbaum, 2010). Os resultados mostram que em relação à expressão de FosB, para a
BLA o grupo CO foi diferente do CP, mas não do Ctr, e na CeA, o grupo CO foi diferente
comparado com o Ctr, mas não quando comparado com o CP. Estes dados estão em
concordância com o estudo de Perrotti et al. (2008), reportando que a administração de
morfina pode produzir um aumento na expressão de FosB na BLA e CeA.
De forma rigorosa, estes dado da BLA e CeA implicam que nem a morfina nem a
contingência influenciaram a expressão de FosB nestas subáreas e que estas diferenças
seriam explicadas por outras varáveis alheias a este estudo, porém seria de grande interesse
conferir estes resultados em um futuro estudo, pois o teste pós-hoc na BLA para CO x Ctr foi
0,053, e na CeA, para CO x CP foi 0,052, estando próximos a ser considerados diferentes em
termos estatísticos. Se fosse considerado que na BLA e na CeA o grupo CO foi diferente de
CP e Ctr, isto implicaria que a morfina aumentou a expressão de FosB unicamente sob CO,
e estaria em concordância com a função destas áreas na aprendizagem e motivação
relacionados a estímulos ambientais, tendo em conta o treino discriminativo que o grupo CO
teve.
Os resultados do MeA mostraram que não houve diferenças entre grupos. Isto sugere
que nem morfina nem o tipo de contingência pela qual esta foi administrada afeta a expressão
de FosB nesta subárea. A MeA tem um papel no processamento de cheiros e feromônios,
estando também envolvida em respostas aversivas, comportamento social e sexual (Carlson,
2012). Esta função não parece estar relacionada ao comportamento de administração de
drogas, porém a MeA foi incluída dentro do estudo para fazer uma avaliação mais completa
da amígdala.
74
Em resumo, os resultados obtidos no Experimento 1, mostram que a
autoadministração de morfina ocasionou uma maior expressão de FosB que a administração
passiva desta, nas subáreas Core, CA3 e BLA, enquanto a contingência Pavloviana da mesma
droga causou uma maior expressão no Shell e no DG. Alguns destes resultados, como os do
Core e Shell, estão em concordância com dados reportados previamente na literatura sobre
estas subáreas estarem envolvidas na codificação de informação associada a um reforçador de
forma diferencial em relação ao tipo de contingência em que uma droga é repetidamente
administrada (Saddoris et al., 2011; West & Carelli, 2016). Dentro do limite da literatura
conhecida, o estudo aqui apesentado é o único que tem avaliado a expressão de FosB na
contingência operante e Pavloviana de morfina.
Outros dados aqui apresentados confirmam resultados reportado préviamente na
literatura, como os do estudo de Perrotti et al (2008), que mostra às subáreas em que a
morfina causa expressão de FosB. Por outro lado, em relação a este mesmo estudo, os
autores concluem que a indução de ΔFosB no NAc não está em função do tipo de
administração que uma droga é administrada, que estaria aparentemente em oposição aos
resultados apresentados mostrando que o Core e o Shell induziram diferencialmente a
expressão deste IEG em relação à contingencia em que a morfina foi administrada. Porém,
nesse estudo, esta conclusão foi tomada segundo dados de um experimento realizado com
COC. Adicionalmente, os mesmos autores concluem neste estudo que diferentes drogas
podem causar a expressão de FosB em diferentes subáreas cerebrais, portanto os resultados
deste experimento em relação ao Core e Shell não estariam em contradição.
Os resultados como os do NAc Core e Shell são de grande relevância. Dado que no
Core o grupo CO teve uma maior expressão de ΔFosB que a contingência Pavloviana e no
Shell foi de forma invertida. Isto sugere que os tipos de contingência podem produzir em um
75
organismo não são questão de “tudo ou nada”, nem apenas que a administração de uma droga
sob contingência operante pode induzir mais ΔFosB que a administração da mesma sob
contingência Pavloviana, ou vice-versa, mas que a indução de ΔFosB pode variar em
diferentes subáreas cerebrais, segundo o tipo de contingência sob a qual uma droga é
administrada. Adicionalmente, além do Core e NAc, resultados similares foram achados para
outras subáreas, o PrL, CA3, BLA e CeA, mostraram uma maior marcação de ΔFosB sob
contingência operante que sob CP, e o DG apresentou uma maior marcação de ΔFosB sob
contingência Pavloviana que sob a operante. De forma geral, estas subáreas estão implicadas
na dependência às drogas por mecanismos associados ao processamento de informação
relacionada a estímulos presentes no ambiente e no comportamento de meta dirigido.
76
Experimento 2. Procedimento de Respostas de Busca e Administração de Morfina nas
Associações por Contingências Pavloviana e Operante
Nos estudos de Patarroyo, Felício e García-Mijares (2014), ratos do grupo CO foram
expostos a treino discriminativo, obtendo infusões de morfina ao responder na presença de
um estímulo luminoso (S1). Desta forma, os animais dos grupos CP e Ctr acoplados,
receberam treino Pavloviano da relação de contingência entre a presencia de uma S1e a
infusão endovenosa de uma substância, morfina (CP) ou salina (CTR), ao mesmo tempo que
os sujeitos CO se auto administravam a morfina na presença da luz. Os resultados desse
experimento indicaram que sob esse procedimento a probabilidade condicional na relação
US–CS (luz-morfina) durante o condicionamento Pavloviano para os sujeitos CP foi igual ou
inferior a 0,2. Isto porque os animais do grupo CO responderam em torno de 20% das vezes
que S1 foi apresentado. Mesmo assim, a discriminação foi alta para esse grupo, pois
responderam 0% das vezes na ausência de S1. A despeito da baixa frequência de respostas, o
grupo CO, demonstrou bom controle de estímulo no teste de transferência (responderam
preferencialmente na presença do S1 associado com morfina). O grupo CP, porém, não ficou
sob controle se S1 (responderam igualmente na presença e na ausência de S1), mesmo que
recebeu o mesmo número de infusões da droga na presença de S1 do que o grupo CO. Os
autores discutem esses resultados em termos da relação de contingência entre S1-morfina no
treinamento do grupo CP, pois mesmo que as probabilidades condicionais morfina-S1,
morfina-nãoS1, não morfina-S1 e não morfina-nãoS1 fossem as mesmas para ambos os
grupos, a probabilidade de apenas 0,2 de apresentação de morfina na presença de S1 não foi
suficiente para estabelecer o aprendizado sob treino pavloviano.
77
Considerando as limitações do procedimento de Patarroyo, Felício e García-Mijares
(2014), para o estudo adequado da relação entre a contingência de treino e o controle de
estímulos sobre a autoadministração e procura por drogas, ponto principal deste teste, o
objetivo principal do Experimento 2 foi desenvolver um procedimento melhorado para o
estudo do controle de estímulos associado por contingência Pavloviana ou por contingência
operante sobre as respostas de busca e autoadministração de morfina, implementando a
probabilidade CS–US (S1-morfina) durante o contingência operante para 100%. Para tanto, o
procedimento foi modificado para que as probabilidades fossem morfina-S1 =1, morfina-Não
S1 =0, Não morfina-S1 =0 e morfina-Não S1=1. Espera-se que as mudanças permitam
observar aquisição de controle de S1 sob o responder do grupo CP no teste de transferência,
isto é, o fenômeno PIT seja observado como documentado amplamente na literatura (e.g.,
Estes, 1948; Holland, 2004; Rescorla, 1994).
Sujeitos
Foram usados 24 ratos albinos machos da cepa Wistar. As cirurgias foram realizadas
quando os sujeitos atingiram 280g-300g de peso. Sete dias após a recuperação da cirurgia, os
animais foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: Administração por Contingência
Operante (CO, n=8), Administração por Contingência Pavloviana (CP, n=8) e Controle (Ctr,
n=8), formando trios com um sujeito de cada grupo.
78
Fases Experimentais
Fase 1. Treino Associativo de Morfina e S1 em Esquema Acoplado
A resposta de girar 90 graus uma roda operante foi modelada em esquema CRF para o
grupo CO. Os animais dos grupos CP e Ctr foram colocados em caixas operantes iguais às do
grupo CO (com a exceção da ausência do receptáculo) 9.
Cada vez que um sujeito do grupo CO introduziu a cabeça no receptáculo, este
recebeu uma infusão i.v. de morfina em dose eficaz para autoadministração (0,75 mg/kg), e
os sujeitos do grupo CP e do grupo Ctr acoplados a ele receberão sob contingência
Pavloviana uma injeção i.v da droga na mesma dose ou de veículo (1,0 ml/kg),
respectivamente. Para cada trio, as infusões de droga ou salina foram acompanhadas pela
apresentação simultânea10 de S1, uma luz estímulo verde (1W) por 30s, período no qual as
respostas do sujeito do grupo CO foram registradas, mas não tiveram consequências
programadas. Um time out (TO) de 1min seguirá cada apresentação de S1. Cada sessão teve
duração máxima de 2 h programadas, mas poderão terminar antecipadamente para um trio se
o membro do grupo CO conseguir atingir 20 infusões para o seu grupo. Esta fase teve uma
duração de três sessões.
9 As rodas operantes foram localizadas unicamente nas caixas dos sujeitos do grupo CO para evitar o reforçamento acidental (Pear & Eldridge, 1984) da resposta fazer girar a roda operante nos sujeitos dos outros grupos.
10 A apresentação de S1 é acionada simultaneamente ao bombeio da morfina e salina, porém, dado que a infusão demora três segundos em ser completamente realizada, a apresentação de S1 é realmente precedente à infusão, em outras palavras, um estímulo condicionado precedente e contiguo.
79
Fase 2. Treino Discriminativo em Contingência Operante ou Pavloviana de
Morfina
O treino discriminativo para os sujeitos do grupo CO consistirá em 30 apresentações
de 30s de S1 (luz verde) e 30 de apresentações de 30s S2 (luz branca). As respostas foram
registradas quando os sujeitos giravam 90 graus uma roda operante. Uma resposta na
presença de S1 por parte do sujeito CO tinha como consequência uma infusão (i.v.)
contingente de morfina em dose eficaz para autoadministração (0,75 mg/kg), e os sujeitos do
grupo CP e do grupo Ctr acoplados a ele receberam sob contingência Pavloviana uma injeção
i.v da droga na mesma dose ou de veículo (1,0 ml/kg), respectivamente. Para cada trio,
simultânea à resposta do sujeito CO, as infusões de droga ou salina foram acompanhadas pela
apresentação de S1 por 30s. Dessa forma, a apresentação de S1 para os grupos CP e Ctr
estava sob o controle das respostas emitidas pelos ratos do grupo CO11. S2 foi apresentado
simultaneamente aos ratos de cada trio e as respostas na presença deste dos ratos CO não
tiveram consequências programadas.
As apresentações de S1 e S2 foram programadas para se apresentarem de forma
pseudoaleatória durante a sessão, de modo que apareceram no máximo duas vezes
consecutivamente. O critério de estabilidade estabelecido para passar de fase foram duas
sessões consecutivas sem aumento ou diminuição sistemática de infusões, ou seja ±10% de
variação do número de infusões por sessão.
11 Note-se que para o sujeito CO as apresentações de S1 são sempre 30, pois se encontra em treino discriminativo, em quanto que o sujeito CP, S1 é unicamente apresentado quando uma infusão de morfina é administrada. Desta forma, mesmo que o número de S1 não seja igual para os sujeitos destes grupos, se garante que o 100% das vezes S1 é apresentado para o sujeito CP, este recebe morfina.
80
Fase 3. Treino de Encadeamento das Respostas de Busca e Autoadministração de
Morfina.
Os sujeitos não estiveram mais acoplados a partir desta fase e as infusões não foram
acompanhadas por S1. Inicialmente foi treinada a resposta de autoadministração de morfina.
Uma única barra retrátil (contrabalanceando lado esquerdo e direito) foi disponibilizada para
os ratos de todos grupos. Durante duas sessões a resposta de apertar esta barra em esquema
CRF teve como consequência uma dose de morfina, seguida por 30s de timeout (TO), no qual
a barra não estava disponível. Posteriormente foi treinada a resposta de busca por morfina
encadeada à resposta de autoadministração previamente treinada. A barra contralateral foi
disponibilizada no início das sessões de encadeamento. Uma resposta nesta barra (Barra B-
busca) tinha como consequência a disponibilização da outra barra (primeiro elo da cadeia), e
resposta nesta segunda barra (Barra A- autoadministração) teve como consequência uma
infusão de morfina (segundo elo da cadeia), seguida pela retração de ambas as barras (TO
30s). Após cada TO a primeira barra foi reintroduzida sinalizando que a contingência do
encadeado de busca-autoadministração estava disponível novamente. Ambos componentes
(barras) do encadeado estavam em esquema CRF durante duas sessões. O esquema de reforço
para cada elo da cadeia foi incrementado para FR2 (fixed ratio) durante duas sessões, e
posteriormente para FR3 até ser atingido o critério de estabilidade (duas sessões consecutivas
sem aumento ou diminuição sistemática da frequência de respostas – diferença ≤10%). Estas
sessões tiveram uma duração de 35 min, podendo terminar antecipadamente para um trio se o
membro do grupo CO conseguisse atingir 20 infusões para o seu trio.
81
Fase 4. Teste de Transferência Sob o Controle de S1 nas Respostas de Busca e
Autoadministração de Morfina
Para o teste de transferência, ambas as barras, B e A, estavam disponíveis
permanentemente para todos sujeitos. Tentativas discretas de S1 e S2 foram apresentadas
para cada trio durante a sessão, da mesma forma que na Fase 2. As respostas nas barras foram
registradas, porém estavam em condições de extinção12. O teste foi realizado em uma única
sessão de duração de 2 h.
Análise de dados
Para analisar o desempenho dos sujeitos durante a Fase 3 (frequência de respostas e
administrações de morfina), e o desempenho dos sujeitos durante a Fase 4, ID atingido
durante o teste nas respostas de busca e autoadministração de morfina, persistência nas
respostas de busca e autoadministração de morfina durante a sessão de extinção, e latência13 à
primeira resposta; foram realizados testes não paramétricos para amostras independentes. O
teste de Kruskall-Wallis foi realizado para detectar diferenças estatísticas, e quando achadas
estas (p < 0,05), o teste U de Mann-Whitney com fator de correção Bonferroni foi utilizado
como post hoc. Todas as análises estatísticas foram executadas fazendo uso do software
aplicativo IBM SPSS®.
Resultados
12 Usualmente é administrado um veículo no lugar da droga para as sessões de extinção, mas foi decidido não usar infusões em geral para evitar que o som produzido pela bomba de infusão funcionasse como reforçador condicionado.
13 O sorteio de S1 e S2 não afetou a latência aqui apresentada, pois foi tomada desde o momento de aparição de S1 ou S2 até a primeira vez que uma Resposta de Busca ou Autoadministração é emitida durante a duração de um intervalo (de S1 ou S2), sendo restado o tempo anterior se foi um S diferente o apresentado.
82
Para a Fase 1, a média de infusões foi 5,86 (SD = 0,813), o que está de acordo com o
Experimento 1 e com o padrão de autoadministração de morfina por ratos sob esquemas fixos
relatado pela literatura (Mierzejewski et al., 2003; Suto et al., 2011).
Na Figura 10 são mostrados os índices discriminativos (ID) das últimas seis sessões
da Fase 2 dos ratos CO. A figura mostra que todos os animais atingiram 90% ou mais de ID a
partir da sessão 5, que se manteve estável na sessão 6.
Figura 10 – Índice discriminativo durante a Fase 2 do Experimento 2. O gráfico mostra o ID dos sujeitos integrantes do grupo CO durante as últimas seis sessões da Fase 2 (Treino Discriminativo em contingência operante ou Pavloviana de Morfina). Pode-se observar que o ID vai aumentando até chegar a 90% ou superior nas últimas duas sessões.
Como mostrado na Figura 11, durante a Fase 3 (Treino de Encadeamento das
Respostas de Busca e Autoadministração de Morfina), os sujeitos de todos os grupos
atingiram estabilidade de resposta de autoadministração, com média de infusões (M =5,17 SD
= 0,734). Ainda, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre
grupos nas Respostas de Busca (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 21) =5,926 p =0,052), com
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0
1 2 3 4 5 6
Índ
ice
Dis
crim
inat
ivo
SessãoACO1 ACO2 ACO3 ACO4
ACO5 ACO6 ACO7 ACO8
83
uma média de 7,19 para o grupo CO, 8,92 para o CP e 6,07 para o Ctr. Tampouco foram
encontradas diferenças nas Respostas de Autoadministração (Kruskall-Wallis test: H (2, N=
21) =4,883 p =0,087), com uma média de 7,72 para o grupo CO, 9,31 para o CP e 8,14 para o
Ctr. Respostas Totais (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 21) =5,658 p =0,059), com uma media
de 7,78 para o grupo CO, 10,01 para o CP e 8,21 para o Ctr; nem nas Infusões por sessão
entre os grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 21) =1,739 p =0,419), com uma média de
13,22 para o grupo CO, 12,84 para o CP e 10,79 para o Ctr.
Figura 11 – Média de infusões durante a Fase 3 do Experimento 2. O gráfico mostra a média de infusões de morfina dos sujeitos integrantes dos grupos CO, CP e Ctr durante as últimas seis sessões da Fase 3 (Treino de Encadeamento das Respostas de Busca e Autoadministração de Morfina). Pode-se observar que o número de infusões tente se estabilizar durante as últimas sessões.
Na Figura 12 são mostrados os dados da frequência de respostas na barra busca (B) e
na barra de administração (A) na presença de S1. Nota-se na figura que os animais do grupo
CO responderam mais na barra B (primeiro elo da cadeia) na presença de S1 do que os outros
dois grupos. De fato, o teste Kruskall-Wallis revelou diferenças significativas entre a
frequência de respostas e na barra B dos grupos. Diferenças entre grupos para a frequência
total de respostas em S1 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 21) =10,349 p =0,006), com uma
mediana de 52,5 para o grupo CO, 25,5 para o CP e 14,5 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-
Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x CP (p
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6
Mé
dia
de
Infu
ssõ
es
po
r Se
ssão
Sessão
CO CP Ctr
84
=0,042) e CP x Ctr (p =0,024). Para a frequência de respostas na Barra B , foram encontradas
diferenças estatisticamente significativas entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 21)
=15,637 p <0,001), com uma mediana de 46,00 para o grupo CO, 6,00 para o CP e 7,50 para
o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados
significativos de CO x CP (p <0,001) e CP x Ctr (p =0,001). Para a frequência de respostas na
Barra A em S1 (autoadministração) não foram encontradas diferenças estatisticamente
significativas entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 21) =5,417 p =0,067), com uma
mediana de 7,00 para o grupo CO, 19,00 para o CP e 6,00 para o Ctr.
Figura 12 – Frequência de respostas de busca e autoadministração na presença de S1. Os dados representam a mediana (-P25 e +P75) da frequência de respostas na barra A, na barra B e o a frequência total (a somatória das repostas em ambas as barras), na presença de S1, dos sujeitos dos grupos CO, CP e Ctr durante a Fase 4. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
Na Figura 13 são mostrados os dados da frequência das respostas totais, na presença
de S1 e S2. Diferenças entre grupos para a frequência total de respostas (Kruskall-Wallis test:
H (2, N= 21) =10,349 p =0,006), com uma mediana de 59,5 para o grupo CO, 35,00 para o
CP e 24,00 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou
resultados significativos de CO x CP (p =0,001) e CP x Ctr (p =0,001).Para a frequência de
0
10
20
30
40
50
60
70
80
TOTAL B A
Fre
qu
ên
cia
de
Re
spo
stas
Barra
CO
CP
Ctr**
*
**
*
85
respostas totais na Barra B , foram encontradas diferenças estatisticamente significativas
entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 21) =15,637 p <0,001), com uma mediana de
52,50 para o grupo CO, 25,50 para o CP e 14,50 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney
com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x CP (p =0,036), e CO x
Ctr (p =0,048). Para a frequência de respostas totais na Barra A em S1 (autoadministração),
não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre grupos (Kruskall-
Wallis test: H (2, N= 21) =5,417 p =0,067), com uma mediana de 8,00 para o grupo CO,
11,00 para o CP e 13,00 para o Ctr.
Figura 13 – Frequência total de respostas de busca e autoadministração. Os dados representam a mediana (-P25 e +P75) da frequência de respostas na barra A, na barra B e o a frequência total (a somatória das repostas em ambas as barras), na presença de S1 e S2, dos sujeitos dos grupos CO, CP e Ctr durante a Fase 4. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
Na Figura 14 são mostrados os Índices Discriminativos (respostas em S1/respostas
totais) da frequência total de respostas, frequência de respostas na Barra B e frequência de
respostas na barra A de cada grupo na Fase 4. O índice discriminativo permite observar o
controle de S1 sobre ambas as respostas de interesse, busca e autoadministração. Foram
observadas diferenças entre grupos no ID Total em S1 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 22)
=15,932 p =0,000), com uma mediana de 87,13 para o grupo CO, 71,57 para o CP e 57,63, e
o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos
0
10
20
30
40
50
60
70
80
TOTAL B A
Fre
qu
ên
cia
de
Re
spo
stas
Barra
CO
CP
Ctr
**
**
86
de CO x CP (p =0,003), CO x Ctr (p=0,002), e CP x Ctr (p=0,037). Em relação aos indices
discriminativos de cada barra, a análise mostrou que houve diferença entre os grupos no
controle de S1 sob as respostas emitidas na barra B (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 22)
=14,000 p =0,001) e na Barra A (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 22) =13,584; p =0,001). As
análises pós-hoc revelaram que S1 controlou as respostas emitidas pelo grupo CO na barra B
quando comparado com CP (p <0,001) e Crt (p=0,007), mas não se observaram diferenças
entre os grupos CP e Crt (p=1). Por outro lado, quando foi comparado o ID na barra A, a
análise revelou que o grupo CP obteve índices significativamente maiores do que os grupo
CO (p=0,013) e do que o grupo Crl (p=0,002), mas não houve diferenças entre os grupos CO
e Crtl (p=0,243).
Figura 14 – Discriminação de S1 na Fase 4. O gráfico mostra o ID das de respostas de busca, respostas de administração e respostas totais, como mediana (-P25 e +P75), dos sujeitos integrantes dos grupos CO, CP e Ctr durante a Fase 4 (Teste de Transferência Sob o Controle de S1 nas Respostas de Busca e Autoadministração de Morfina). * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
A análise dos IDs por sujeito (Figura 15) permite observar com maior detalhe o
controle de S1 (índice discriminativo) sobre as respostas emitidas nas barras B e A. Nota-se
que S1 controlou as respostas de responder em B, mas não em A, de todos os animais do
grupo CO. Por outro lado, mais da metade dos animais do grupo CP obteve ID maior a 80%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
TOTAL B A
S1/S
1+S
2
Barra
ACO
ACP
Ctr
****
*
*******
87
na barra A. As respostas de apenas um animal do grupo Ctr ficaram sob controle de S1. Desta
forma, é evidente que houve controle diferencial de S1 sobre as respostas emitidas pelos
animais dos diferentes grupos.
Figura 15 – Índice discriminativo por sujeito nas barras de busca e administração. O gráfico mostra por sujeitos o ID das de respostas de busca e de administração, dos sujeitos integrantes dos grupos CO, CP e Ctr durante a Fase 4.
Na Figura 16, mostra-se a distribuição das respostas em percentual entre as barras B e
A na presença de S1 e S2, para cada grupo. Nota-se clara diferença de distribuição das
respostas entres os grupos. Todos os animais do grupo CO mostraram preferência pela Barra
B quando S1 estava presente. Em torno do 90% das respostas foram emitidas na barra B,
indicando uma forte preferência por essa barra. A análise estatística (Kruskall-Wallis test: H
(2, N= 22) =1,609 p =0,447) revelou diferenças significativas entre dois grupos em relação à
preferência pelas barras na presença de S1, e o pós-hoc mostrou resultados significativos de
CO x CP (p <0,001) e CO x Ctr (p=0,013). A análise estatística não revelou diferenças entre
grupos na presença de S2 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 22) =16,273 p =0,00). A diferença
entre os grupos em relação à preferência por B, o teste pós-hoc mostrou que a mediana do
grupo CO foi maior do que as dos grupos CP e Ctr (p=0,001 e p=0,002, respectivamente),
88
porém não houve diferenças entre os grupos CP e Crt (p= 0,143). Como mostrado na mesma
figura, foi também observada diferença entre os grupos em relação à preferência por A,
independentemente do controle de S1 e S2 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 22) =15,043 p
=0,001). Novamente, a prova pós-hoc encontrou diferenças entre CO e CP (p=0,000) e entre
CO e Ctr (p=0,002), mas não entr CP e Ctr (p= 0,425).
Figura 16 – Preferência por B na presença dos estímulos discriminativos. Os dados mostram a distribuição das respostas entre a barra B e a barra A como mediana (-P25 e +P75) do índice de preferência (frequência de respostas em B/frequência de resposta em B + frequência de resposta em A) na presença de S1 e S2 na Fase 4 do Experimento 2, dos grupos CO, CP e Ctr. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
Como mostrado na Figura 17, onde se mostram os dados individuais, todos os ratos
do grupo CO, mas nenhum do grupo CP, preferiram a barra B quando S1 foi apresentado. Já
os animais do grupo CP mostraram maior variabilidade, sendo que a maioria preferiu a barra
A na presença desse estímulo. Quanto o grupo Ctr não se observa algum padrão.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
TOTAL S1 S2
B/B
+A
Estímulo
CO
CP
Ctr
***
****
89
Figura 17 – Porcentagem de respostas de busca e administração em S1 e S2. O gráfico mostra a proporção de respostas na barra de busca (B) e de administração (A) na presença de S1 e S2, dos grupos CO, CP e Ctr, durante a Fase 4.
Por último, na Figura 18 podem ser observadas a latência da primeira resposta emitida
diante S1 e de S2 durante a Fase 4. A análise Kruskall-Wallis revelou diferenças na latência
de resposta em B (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 22) =13,589 p =0,001) e em A (Kruskall-
Wallis test: H (2, N= 22) =15,605 p =0,000) na presença de S1, e em A na presença de S2
(Kruskall-Wallis test: H (2, N= 22) =11,503 p =0,003). Não houve diferenças de latência de
respostas em B na presença de S2 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 22) =5,671 p =0,059). As
análises pós-hoc revelaram que na presença de S1 a latência em B do grupo CO foi menor do
que as latências dos grupos CP (p =0,001) e Ctr (p =0,002), mas foi maior em A (p < 0,001 e
p =0,002, respectivamente). Ainda, foi observado que na presença de S2, a latência de
resposta em A do grupo CO foi maior do que a dos grupos CP (p= 0,01) e Ctr (p= 0,29).
00,1
0,2
0,30,4
0,5
0,60,7
0,80,9
1
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6
%
Sujeitos
S1
CtrCPCO
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6
Sujeitos
S2
BARRA A
BARRA B
CO CP Ctr
90
Figura 18 – Latência da primeira resposta na Fase 4. Os dados mostram a mediana (-P25 e +P75) do tempo em segundos transcorridos desde a 1ª apresentação de S1 ou S2 e a emissão da 1ª resposta na barra A ou na barra B, para cada grupo CO, CP e Ctr durante a Fase 4. *p<0,05 **p<0,01.
Em resumo, os resultados apresentados do Experimento 2 mostram que: a) durante a
Fase 1 os animais receberam um número de infusões de morfina normal dentro do reportado
na literatura, b) os sujeitos do grupo CO atingiram 90% ou mais de ID durante a a Fase 2, c)
os animais dos três grupos atingiram estabilidade no número de infusões de morfina durante a
Fase 3, e não foram encontradas diferenças entre grupos nas respostas de busca e
administração; d) Durante a Fase 4, os sujeitos do grupo CO mostraram maior número de
respostas de busca e respostas totais na presença de S1 comparados com os grupos CP e Ctr;
e) No teste de transferência da Fase 4, o grupo CO mostrou um ID superior a 80% nas
respotas de busca e respostas totais na presença de S1, sendo diferente dos grupos CP e Ctr,
porém o grupo CP mostrou um ID superior a 80% nas respostas de administração na presença
de S1, sendo diferente dos grupos CO e Ctr; e) o grupo CO mostrou preferência pela resposta
de busca na presença de S1 e nas respostas totais quando comparado com os grupos CP e Ctr
durante a fase 4; e f) no teste de transferência, a latência de resposta de busca na presença de
S1 foi menor no grupo CO comparado com o CP e Ctr, enquanto que a latência de resposta
de administração na presença de S1 foi menor no grupo CP comparado com o CO e Ctr.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CO CP Ctr
Tem
po
em
se
gun
do
s
GrupoLat Busc S1 Lat Adm S1 Lat Busc S2 Lat Adm S2
******
**
91
A Tabela 4 mostra todos os resultados possíveis derivados das comparações entre os
grupos. Acredita-se que a tabela possa auxiliar o acompanhamento dos resultados e a
discussão.
Tabela 4. Resultados possíveis e sua interpretação (mudança nos parâmetros comportamentais índice discriminativo ou preferência) de acordo com as variáveis independentes manipuladas (infusão de droga e contingência de administração na Fase I)
RESULTADO DROGA CONTINGÊNCIA INTERPRETAÇÃO
CO = CP CO = Ctr CP = Ctr
Não Não
Ausência de PIT. O estímulo controlou a resposta na Fase 4 independentemente da droga ou da contingência
CO = CP CO ≠ Ctr CP = Ctr
Não Não
Ausência de PIT. O estímulo controlou a resposta na Fase 4 independentemente da droga ou da contingência. A diferença explicada por outra variável
CO = CP CO = Ctr CP ≠ Ctr
Não Não
Ausência e PIT. O estímulo controlou a resposta na Fase 4 independentemente da droga ou da contingência. A diferença explicada por outra variável
CO = CP CO ≠ Ctr CP ≠ Ctr
Sim Não
Houve PIT. O estimulo controlou a resposta de autoadministração na Fase 4 independentemente do treino da Fase 2.
CO ≠ CP CO ≠ Ctr CP ≠ Ctr
Sim Sim
Houve PIT. O estímulo controlou a resposta de autoadministração dos animais na Fase 4 de acordo com o treino da Fase 2.
CO ≠ CP CO ≠ Ctr CP = Ctr
Sim Sim Ausência de PIT. O estímulo controlou apenas a resposta do grupo CO na Fase 3.
CO ≠ CP CO = Ctr CP ≠ Ctr
Sim Sim
PIT apenas pode ser avaliado após observação dos valores. O treino da Fase 3 teve efeito diferencial sobre o desempenho na Fase 4 dos grupos CO e CP.
CO ≠ CP CO = Ctr CP = Ctr
Não Não Ausência de PIT. O controle do estímulo na Fase 4 apenas pode ser avaliado após observação dos valores.
92
Discussão
Este experimento teve como objetivo estabelecer e aperfeiçoar um protocolo de
autoadministração de drogas em esquema acoplado para comparar de forma adequada a
administração sob condicionamento operante e pavloviano separando as respostas de busca e
autoadministração de droga. O experimento consistiu em quatro fases: a) Fase 1, Treino
associativo de morfina e S1 em esquema acoplado; b) Fase 2, Treino discriminativo sob
contingência operante ou Pavloviana de morfina em esquema acoplado; c) Fase 3, Treino de
encadeamento das respostas de busca e autoadministração de morfina; e Fase 4, Teste de
transferência do controle de S1.
Durante a Fase 2, cada vez que um sujeito do grupo CO respondia na roda operante
tinha como consequência uma infusão de morfina e simultaneamente o sujeito do grupo CP e
o do grupo Ctr a ele acoplados receberam sob contingência Pavloviana uma injeção i.v da
droga na mesma dose ou de veículo, respectivamente. Cada infusão foi sinalizada pela
apresentação simultânea de S1. Como no Experimento 1, a média de infusões ficou na faixa
relatada pela literatura, assim como o número de sessões em que a o ID do grupo CO ficou
estável (Mierzejewski et al., 2003; Suto et al., 2011).
Na Fase 3 não foram observadas diferenças entre os grupos, indicando que o treino
realizado na Fase 1 não teve efeito sobre a aquisição da pressão de barra. Isto é, a taxa de
respostas e média de infusão dos animais dos três grupos foi similar a despeito da experiência
prévia com morfina e com diferentes contingências de sua administração. Portanto, a Fase 2
parece não ter ocasionado efeitos de tolerância aos efeitos reforçadores da morfina. Ainda,
esses dados validam os obtidos na Fase 4, uma vez que grandes diferenças no número de
infusões entre grupos durante esta fase poderiam alterar o responder durante a seguinte.
93
Os resultados do teste de transferência (Fase 4) indicaram que os estímulos
antecedentes adquiriram controle sobre a resposta de pressão de barra dos animais do grupo
CO e CP, mas não dos animais do grupo Crt (ID de respostas totais e de respostas na
presença de S1), indicando transferência de controle desses estímulos para um novo operante,
no caso do grupo CO, e PIT para o grupo CP. Entretanto, o controle de S1 sobre a pressão à
barra foi dependente das contingências manipuladas na Fase 2. S1 controlou as respostas dos
ratos do grupo CO só na barra B (aqui denominada “Busca”), primeiro elo da cadeia da Fase
3 e apenas consequênciada com a apresentação da barra A (aqui denominada
“Autoadministração”). Ainda foi observado que os animais desse grupo mostraram
preferência por essa barra na presença de S1, mas não de S2. Por outro lado, S1 controlou as
respostas dos animais do grupo CP só na barra A, porém não foi observada preferência por
essa barra na presença de nenhum dos estímulos.
A transferência do controle de S1 da resposta de girar a roda para a resposta
topograficamente diferente de apertar a barra é um fenômeno esperado e relacionado ao
conceito bem conhecido na literatura de classes de respostas. Uma classe de respostas ou
classe operante é um conjunto de respostas operantes que podem variar em sua topografia,
mas que produzem a mesma consequência (Catania, 1999). Classes operantes são, assim,
funcionalmente equivalente, e essa equivalência é o que define a classe (Barnes-Holmes &
Barnes-Holmes, 2000). Portanto, uma vez que pressionar a barra era mantida pela mesma
consequência do que girar a rodar (i.e., morfina), pode-se dizer que ambas topografias eram
da mesma classe operante. De fato, o controle de S1 sob a pressão de barra seria um
indicador importante desses dois comportamentos serem funcionalmente equivalentes. Deste
modo, a transferência de controle observada no desempenho dos animais do grupo CO indica
que os procedimentos de treino estabeleceram os controles esperados e adequados sobre o
comportamento dos animais.
94
Por outro lado, o controle de S1 sob a resposta de pressão de barra dos animais do
grupo CP é indicador de PIT. Os processos comportamentais envolvidos na PIT não estão
claramente caracterizados na literatura, porém, assim como nas classes operantes, o estímulo
comum (i.e., o mesmo estímulo ter função de SR e o US) é uma das variáveis que facilita sua
ocorrência (Alarcon, Bonardi & Delamater 2018; Cartoni et al., 2016; Delamater &
Oakeshott, 2007).
De caráter complexo é explicar o controle diferencial de S1 sobre as respostas nas
barras A e B dos animais dos grupos CO e CP. Primeiro se pretende explicar o controle de S1
sobre o comportamento do grupo CP e depois o do grupo CO.
A contingência pavloviana da Fase 2 estabelecia relação direta entre os eventos S1 e a
infusão de morfina (relação de contingência) e de contiguidade (relação de contiguidade14).
Na Fase 3, a infusão de morfina era seguida apenas depois da pressão da barra A, sendo que a
pressão da barra B apenas produzia a barra A. Assim, a pressão da barra A estabelecia uma
relação de contingência e contiguidade entre os eventos mais semelhante à da Fase 2 do que a
pressão da barra B, que não era contigua nem tinha relação direta de contingência com a
infusão de morfina.
Delamater e Oakeshott (2007) relatam um experimento onde ratos foram primeiro
treinados sob relações pavlovianas CS1-US1 e CS2-US2 e operantes R1-US1 e R2-US2;
depois, de forma semelhante como a realizada neste experimento, observaram a resposta (R1
ou R2) na presença desses estímulos. Os autores observaram que na presença de CS1 os
animais emitiam R1 e na presença de S2 emitiam R2. Adicionalmente, Corbit e Balleine
(2003b) utilizando comida, e LeBlanc et al. (2012) utilizando COC, realizaram experimentos
14 Após S1 ter adquirido o controle do responder dos ratos do grupo CO, o tempo entre a apresentação de S1 e a infusão de morfina era menor a 1 s.
95
para avaliar PIT em que ratos passaram inicialmente por uma fase em que recebiam comida
ou COC, respectivamente, de forma passiva na presença de um CS. Posteriormente
aprenderam um encadeado de respostas com duas barras, uma de busca e outra de
administração, para ter acesso à comida ou se autoadministrar a COC. Ambas as barras
estiveram presentes ao mesmo tempo durante a fase de teste de transferência e os autores
reportaram que na presença do CS, os sujeitos apresentaram uma maior frequência de
respostas na resposta de administração. Esses resultados, junto com evidências de que o
desempenho observado em experimentos de PIT dependem do aprendizado da relação
temporal entre o CS e o US (Matell & Della Valle, 2018), suportam a ideia de que o controle
de S1 sobre a barra A foi função da relação de contingência e de contiguidade da resposta
nessa barra com a infusão de morfina.
Diferente do grupo CP, ao grupo CO foi ensinada a relação entre S1 e infusão de
morfina por meio de um treino operante em que respostas na presença de S1 sinalizavam a
resposta de girar a roda operante. Como já discutimos, a transferência da resposta de girar a
roda operante a um novo operante, pressionar barras, pode ser explicado usando-se o conceito
de classe operante. A questão de maior interesse é por que S1 controlou a resposta
discriminativa e a preferência pela barra B dos ratos desse grupo. Uma explicação plausível é
que S1 controlou toda a cadeia comportamental ensinada na Fase 3. Isto é, não apenas o
último elo da cadeia (responder na barra A) entrou na classe operante mantida pela morfina,
mas também o elo inicial (responder na barra B). Assim, uma vez que pressionar a barra B é a
primeira resposta a ser emitida na cadeia, então na presença de S1, os animais do grupo CO
pressionavam essa barra. Essa proposta é coerente com o estudo de Bachá-Mendez Reid e
Mendoza-Soylovna (2016), que sugere que sequencias comportamentais de duas respostas
podem se conformar como unidades comportamentais integradas, que são mantidas pelo
reforço “primário” (i.e., a comida fortalece toda a cadeia comportamental e não apenas a
96
resposta do último elo). Também é consistente com dados de Thrailkill & Bouton (2015,
2016) que mostram que a extinção da resposta de procura (primeiro elo da cadeia) diminui o
controle do estímulo sobre a resposta de consumo (segundo e último elo da cadeia) a ela
associada e vice-versa (a extinção da resposta de consumo altera o controle do estímulo sobre
a resposta de procura).
Infelizmente, no momento não está realizada a análise da sequência de respostas que
permita mostrar que os animais emitiam toda a cadeia comportamental, porém, os dados
estão registrados e a análise será feita para complementar a publicação destes dados.
Entretanto, considerando que os animais adquiriram e mantiveram a cadeia comportamental
na Fase 3, é coerente e parcimonioso assumir que depois de pressionarem a barra A, os
animais pressionariam a barra B.
O dado que mostra que a frequência de respostas do grupo CO foi maior do que a do
resto dos grupos durante a Fase 4 parece menos complexo de interpretar. Essa diferença não
poderia ser explicada apenas pelas características motoras da resposta treinada na Fase 2, nem
pelo desempenho na Fase 3, pois como já apontado, a frequência de respostas (i.e.,número de
infusões) foi semelhante entre os grupos. Uma possível explicação para este resultado é que o
CS associado à morfina durante as Fases 1 e 2 foi de curta duração (30 s), o que causaria
segundo alguns autores um responder operante diminuído durante o teste de transferência na
Fase 4 (Lovibond, 1981; van Dyne, 1971) em comparação com um CS de alta duração, o qual
aumentaria esta taxa de respostas (Estes, 1943, 1948; Crombag et al., 2008). Outra possível
explicação poderia ser que mesmo que tanto a contingência operante, quanto a Pavloviana,
podem prover as condições para ter resistência a extinção no teste de transferência (Nevin &
Grace, 2000, 2005), aumentando temporalmente a taxa de respostas observadas (Catania,
1999), esta resistência à extinção se pode ver afetada por muitas variáveis (Lattal & Lattal,
2012) que teriam sido diferentes para as condições dos treinos dos grupos CO e CP, causando
97
esta diferença na taxa de respostas na Fase 4. Por exemplo, o grupo CO teve maior treino
instrumental que o CP, tendo em conta as fases 1 e 2, nas quais o CP não teve nenhum tipo de
controle sobre a morfina. Segundo alguns autores (Holmes et. al., 2010; Lattal & Lattal,
2012), esta quantidade de treino instrumental, poderia ter causado que o grupo CO
apresentasse uma maior taxa de respostas durante a Fase 4, a qual se realizou em condições
de extinção.
A latência da primeira resposta acompanhou o controle de S1 sobre a pressão à barra.
O grupo CO mostrou menor latência de resposta na barra B na presença de S1 e o grupo CP
mostrou a menor latência na barra A na presença de S1. Com frequência, a latência de
resposta não é encontrada como uns dos parâmetros avaliados em estudos de controle de
estímulos, porém, a latência pode oferecer valiosos dados sobre o valor reforçador de um
estímulo (Domjan, 2015; Zeaman, 1949) e a aprendizagem da relação CS-US (Catania, 1999;
Supes et al., 1966). Os resultados da latência de resposta em conjunto com os resultados de
ID, preferência de resposta e frequência de respostas, parecem apontar a um padrão, em que o
tipo de contingência teria causado que o controle de estímulos que se desenvolveu no grupo
CO e CP tenha algumas diferenças. Quando S1 esteve presente na Fase 4, no grupo CO a
latência de resposta foi menor na barra B, teve uma maior taxa de respostas na barra B e uma
clara preferência por esta, assim como um alto ID nesta mesma resposta; por outro lado, no
grupo CP, a latência de resposta foi menor na barra A e a taxa de respostas, preferência de
resposta e ID foram maiores para a barra A.
Em resumo, nossos dados sugerem que o controle de estímulos ambientais sobre a
cadeia comportamental inerente a qualquer autoadministração de droga (i.e.,procura da droga
seguida de consumo) é função das contingências comportamentais sob as quais foi
estabelecida a relação desse estímulo com a droga. Também indicam que tanto
autoadministrada, quanto administrada de forma passiva, o controle de estímulos do ambiente
98
é transferido para novos comportamentos de autoadministração reforçados pela mesma droga,
mesmo quando esses novos comportamentos são adquiridos na ausência desses estímulos.
Ainda, os dados sugerem que o controle de estímulos estabelecido pela contingência operante
foi mais efetivo que o estabelecido pela contingência Pavloviana.
Os dados produzidos por este experimento mostram a adequação do modelo de
administração acoplado (Catania, 1999; Sanchis-Segura& Spanagel, 2006) para o estudo do
efeito das contingências de treino operante e respondente sobre os comportamentos do
dependente de drogas. O delineamento experimental dos estudos prévios (Patarroyo, Felício e
García-Mijares, 2014) não tinha permitido uma probabilidade S1-morfina de 100% para o
grupo CP durante o treino em associação Pavloviana, nem permitia separar as respostas de
busca e autoadministração, o que poderia explicar que naquele estudo não tenha sido
observado PIT ao não ter se formado a relação CS-US para esse grupo (Estes, 1948; Holland,
2004; Rescorla, 1994).
De fato, como apontado por Sanchis-Segura e Spanagel (2006), o processo de
administração de uma droga inclui várias fases, como busca/forrageio, compra/aquisição e
finalmente o consumo. Portanto é importante que estudos que visam compreender a
dependência às drogas estudem estas respostas por separado, pois como mostrado neste
experimento, não todas as respostas no processo de consumo de uma droga são afetadas da
mesma forma por estímulos que foram associados a estas em diferentes histórias de
associação.
Finalmente, ainda destacando que o modelo e o delineamento utilizados neste
experimento sejam adequados estudo para estudar o controle de estímulos, é importante notar
as suas limitações. A Fase 4 dispunha simultânea e permanentemente as barras de busca e
administração, o que permitiu coletar os valiosos dados destas respostas por separado e
99
observar os resultados discutidos, porém, ao estarem apresentadas ao mesmo tempo, não se
apresentou mais uma situação de cadeia de respostas, como treinado previamente, mas uma
situação de escolha. Portanto, a barra de busca não teve mais uma função de busca per se, e
entrou em concorrência com a barra de administração.
100
Experimento 3. Associações por Contingências Pavloviana e Operante nas
Respostas de Busca e Administração de COC e a na Expressão de FosB
O Experimento 3 teve dois objetivos, o primeiro foi observar e comparar o possível
efeito diferencial nas respostas de busca e autoadministração de COC na presença de um
estímulo associado a esta droga por contingência operante ou Pavloviana, avaliando o
controle que estímulos ambientais associados à COC podem exercer em diferentes histórias
de administração. O segundo objetivo foi verificar o efeito da autoadministração e
administração passiva de COC sobre a expressão gênica de FosB em diferentes áreas do
cérebro implicadas na dependência às drogas.
Neste experimento foram realizadas algumas mudanças metodológicas em relação ao
experimento 1 e 2, que são resumidas a seguir.
Primeiro, a droga administrada foi COC em vez de morfina. Os resultados do
Experimento 2 mostraram que a morfina controlou o comportamento de autoadministração
dos ratos, porém as taxas de respostas mantidas foram baixas. Por outro lado, a COC tem
efeitos estimulantes sobre o comportamento e tipicamente produz altas taxas de resposta
(Arroyo, Markou, Robbins & Everitt, 1988; Negus & Mello, 2003) e potencial para causar
uma forte dependência (Deroche-Gamonet, 2004; Kreek et al., 2012; Roberts, Morgan & Liu,
2007). No delineamento de treino utilizado neste estudo, maiores taxas de respostas estão
correlacionadas a maior número de pareamentos entre o efeito da droga e o S1, facilitando a
aprendizagem das contingências (Catania, 1999), consequentemente facilitando a
transferência do pareamento respondente à contingência operante (i.e.,PIT).
Segundo, foram usados ratos Lewis em vez de wistar. Ratos Lewis são uma cepa
susceptível a rápida aquisição de dependência (e.g., Kosten & Ambrósio, 2002; Sánchez-
101
Cardoso et al., 2009). Assim, procurou-se aumentar a probabilidade da droga ser uma
consequência reforçadora para os animais.
Terceiro, a técnica imunohistoquímica foi realizada após duas fases fundamentais,
após as contingências Pavloviana e operantes serem estabelecidas (Fase 2) e após finalizadas
todas as fases de treino, tendo realizado o teste transferência. Isto permitiu ter medidas
comportamentais, medidas imunohistoquímica e de autorradiografia nos momentos em que as
contingências de aprendizagem estavam recém estabelecidas em cada etapa do experimento.
Sujeitos
Foram usados no total 34 ratos albinos machos da cepa Lewis (CO = 12, CP = 12, Ctr
= 10), experimentalmente ingênuos. As cirurgias foram realizadas quando os sujeitos
atingiram 280g-300g de peso. Sete dias após a recuperação da cirurgia, os animais foram
distribuídos aleatoriamente em três grupos: Contingência Operante (CO), por Contingência
Pavloviana (CP) e Controle (Ctr), formando trios com um sujeito de cada grupo. Para realizar
os testes imunohistoquímica os encéfalos de metade dos grupos foram removidos após a Fase
2 (CO = 6, CP = 6, Ctr = 5), e a outra metade após a Fase 4.
Fases Experimentais
As fases experimentais 1, 2, 3 e 4 são similares as do experimento 2. As principais
variações são ajustes aos esquemas de reforço dada a natureza ativadora da CoC em
comparação à morfina utilizada nos experimentos anteriores.
Fase 1. Treino Associativo de COC e S1 em Esquema Acoplado
A resposta de girar 90 graus uma roda operante foi modelada por quatro dias
consecutivos em esquema CRF para o grupo CO, sendo incrementado gradativamente para
FR10 (FR2, FR5, FR10). Os animais dos grupos CP e Ctr foram colocados em caixas
102
operantes iguais às do grupo CO (com a exceção da ausência do receptáculo). Cada vez que
um sujeito do grupo CO respondeu na roda operante, uma infusão endovenosa de COC em
dose eficaz para autoadministração (0,75 mg/kg) foi administrada automaticamente por meio
do cateter alocado cirurgicamente. Os animais dos grupos CP e Ctr receberam
simultaneamente uma dose de COC ou salina, respectivamente. O estímulo S1 (buzzer) esteve
sempre presente nas sessões desta fase para todos grupos.
Cada sessão teve duração máxima de 2 h programadas, podendo terminar
antecipadamente para um trio se o membro do grupo CO atingir 20 infusões para o seu grupo.
O critério de estabilidade estabelecido para passar de fase foram duas sessões consecutivas
sem aumento ou diminuição sistemática de infusões, ou seja ±10% de variação do número de
infusões por sessão.
Fase 2. Treino Discriminativo em contingência operante ou Pavloviana de COC
O treino discriminativo para os sujeitos do grupo CO consistiu em aproximadamente
21 sessões de 2 h utilizando a roda operante como operando e um buzzer como estímulo
discriminativo. Os animais do grupo CO foram treinados em um esquema múltiplo de dois
componentes, esquema FR10 e extinção. O esquema FR10 funcionou na presença do buzzer
(S1) e a extinção funcionou na ausência deste (S2). As apresentações dos componentes
tiveram uma duração de 180 s e foram apresentados de forma pseudoaleatória, sendo
programados para cada um se apresentar no máximo três vezes consecutivas. O responder nos
últimos 10 s de cada componente teve como consequência o aumento deste em 10 s até
nenhuma resposta fosse apresentada, isto com o objetivo de que a contingência do treino
fosse bem estabelecida e evitar assim um efeito de carry over. Para os animais acoplados CP
e Ctr as infusões de COC foram simultâneas (às dos sujeitos CO) e sinalizadas por S1, sendo
controladas sempre pelos sujeitos do grupo CO. As apresentações de S2 também foram
103
simultâneas para os membros de cada trio. Este arranjo permitiu que os grupos CO e CP
tivessem o mesmo número de apresentações de COC pareadas com S1, 100% das vezes.
O critério de estabilidade estabelecido para passar de fase foram duas sessões
consecutivas sem aumento ou diminuição sistemática de infusões, ou seja ±10% de variação
do número de infusões por sessão.
Fase 3. Treino de Encadeamento das Respostas de Busca e Autoadministração de
COC
Os sujeitos não permaneceram mais acoplados durante esta fase e as infusões não
foram acompanhadas por S1. Inicialmente foi treinada a resposta de autoadministração de
COC: uma única barra retrátil (contrabalanceando lado esquerdo e direito) foi disponibilizada
para os ratos de todos os grupos. Durante duas sessões a resposta de apertar esta barra teve
como consequência uma dose de COC, seguida por 10s de timeout (TO), no qual a barra não
esteve disponível, com o fim de evitar uma possível overdose. Posteriormente foi treinada a
resposta de busca por COC encadeada à resposta de autoadministração previamente treinada.
A barra contralateral foi disponibilizada no início das sessões de encadeamento. Uma
resposta nesta barra (Barra B -busca) teve como consequência a disponibilização da outra
barra (primeiro elo da cadeia), e resposta nesta segunda barra (Barra A - autoadministração)
teve como consequência uma infusão de COC (segundo elo da cadeia), seguida pela retração
de ambas as barras (TO 10s). Após cada TO a barra B foi reintroduzida sinalizando que a
contingência do encadeado de busca-autoadministração estará disponível novamente. Ambos
os componentes (barras) do encadeamento estiveram em esquema CRF durante duas sessões,
sendo incrementado gradativamente para FR10 (FR2, FR5, FR10), até ser atingido o critério
de estabilidade (duas sessões consecutivas sem aumento ou diminuição sistemática da
104
frequência de respostas – diferença ≤10%). Estas sessões tiveram uma duração de 2 h,
podendo terminar antecipadamente quando um sujeito atingir 20 infusões.
Fase 4. Teste de Transferência Sob Controle de S1 nas Respostas de Busca e
Autoadministração de COC
Para o teste de transferência, ambas as barras estiveram disponíveis permanentemente
para todos sujeitos. Tentativas discretas de S1 e S2 foram apresentadas de forma simultânea
para cada trio durante a sessão, da mesma forma que na Fase 2. As respostas em ambas as
barras foram registradas, porém estiveram sempre em condições de extinção. Este teste teve
uma duração de 2 h.
Fase 5. Imunohistoquímica Fos
Foi realizada a contagem de células imunorreativas à proteína ΔFosB para as áreas
neurais de maior interesse (ver Tabela 2) utilizando o software Image Pro Plus®. Comparado
com o Experimento 1, neste experimento foi possível realizar a contagem de células
imunorreativas após as fases experimentais 2 e 4, permitindo fazer a comparação entre grupos
e intragrupo em dois momentos relevantes, justo após a contingência discriminativa foi
treinada (Fase 2), ou seja, quando as contingências de CO e CP se mantinham puras para o
grupos, e após o teste de extinção (Fase 4), sendo que para esse então todos animais de todos
grupos tinham aprendido a se autoadministrar a droga, porem nunca sendo treinada uma
contingência operante no grupo de contingência Pavloviana.
O procedimento imunohistoquímico é explicado com detalhe na secção de Métodos e
Equipamentos do presente trabalho. Em resumo, uma hora após o término da última sessão de
administração da droga, os sujeitos foram perfundidos para fixar os tecidos. Os cérebros
foran removidos e posteriormente processados para obter cortes frontais seriados, com 30m
105
de espessura usando um micrótomo de congelação. Os cortes foram incubados inicialmente
em uma solução de tampão fosfato de potássio 0,02M contendo triton X-100 a 0,3%, soro
normal de cabra a 2% e anticorpo policlonal FosB, (102, SC-48/Sta Cruz Biothecnology®).
O complexo antígeno-anticorpo foi localizado utilizando-se uma variação do sistema formado
pelo complexo avidina-biotina, e após a incubação com o anticorpo primário, os cortes foram
incubados em uma solução contendo anticorpo biotinilado anti-IgG de coelho, feito em cabra,
e em seguida, colocados em uma solução contendo o composto avidina-biotina-HRP, para
ligar a peroxidase ao complexo antígeno-anticorpo. Posteriormente se realizou a revelação do
complexo antígeno-anticorpo incubando os cortes em uma solução contendo 50mg de
tetrahidrocloreto de 3-3’ diaminobenzidina-DAB, 0,6mg de glicose oxidase (Sigma), 2ml de
uma solução aquosa de sulfato de níquel a 10% e 40mg de cloreto de amônia em 100ml de
tampão fosfato de sódio 0,1M, e em seguida, foi adicionado -D-glicose, interrompendo a
reação após 10 min aproximadamente. Os cortes foram então montados em lâminas
recobertas com gelatina para poder obter as imagens de microscopia que foram analisadas.
Tabela 2. Áreas Neurais Estudadas no Experimento 3
ÁREA SUBÁREA
Córtex Pre-Frontal (PFC) Córtex Lateral Orbital (LO)
Córtex Pre-Frontal Medial (mPFC) Córtex Cingulado (Cg1) Córtex Prelímbico (PrL) Córtex Infralímbico (IL)
Nucleo Acumbens (NAc) Core Shell
Caudado Putamen (CPu) Lateral Basolateral
Hippocampo Giro Dentado (DG) Corno de Amon 1 (CA1) Corno de Amon 3 (CA3)
Amígdala Basolateral Central Medial
Análise de dados
A diferença de expressão de ΔFosB das diferentes subáreas entre grupos foi calculada
realizando testes não paramétricos para amostras independentes. O teste de Kruskall-Wallis
foi realizado para detectar diferenças estatísticas, e quando achadas estas (p < 0,05), o teste U
106
de Mann-Whitney com fator de correção bonferroni foi utilizado como post hoc. Para
comparar as diferenças intragrupo para as fases 2 e 4 foram realizados Testes de de Wilcoxon
(Willcoxon Signed-Ranks Test). Para analisar o desempenho dos sujeitos durante a Fase 3
(frequência de respostas e administrações de COC), e o desempenho dos sujeitos durante a
Fase 4, ID atingido durante o teste nas respostas de busca e autoadministração de COC,
persistência nas respostas de busca e autoadministração de COC durante a sessão de extinção,
e latência15 à primeira resposta; foram realizados testes não paramétricos para amostras
independentes. O teste de Kruskall-Wallis foi realizado para detectar diferenças estatísticas, e
quando achadas estas (p < 0,05), o teste U de Mann-Whitney com fator de correção
bonferroni foi utilizado como post hoc. Todas as análises estatísticas foram executadas
fazendo uso do software aplicativo IBM SPSS®.
Resultados
Os resultados deste experimento são mais extensos que os dos experimentos
anteriores, dado que incluem resultados comportamentais e bioquímicos. É importante
lembrar que o objetivo deste experimento não foi a replicação dos outros experimentos
anteriores e comparar os resultados comportamentais e bioquímicos entre morfina e COC,
mesmo sendo uma ideia tentadora. Porém, além de ter sido realizado com sujeitos da cepa
Lewis no lugar de Wistar, como nos dois experimentos anteriores, e ter sido usada COC no
lugar de morfina como droga para as infusões, o protocolo experimental sofreu algumas
pequenas alterações de adaptação aos efeitos da nova droga estudada.
Este experimento consistiu em cinco fases, que incluem, duas fases em esquema
acoplado para o treino discriminativo, uma terceira fase de treino de autoadministração sem
15 O sorteio de S1 e S2 não afetou a latência aqui apresentada, pois foi tomada desde o momento de aparição de S1 ou S2 até a primeira vez que uma Resposta de Busca ou Autoadministração é emitida durante a duração de um intervalo (de S1 ou S2), sendo restado o tempo anterior se foi um S diferente o apresentado.
107
estarem os grupos acoplados, e uma fase de teste de transferência (PIT). O que é chamado de
Fase 5 faz referência ao protocolo imuno-histoquímico, realizado de igual forma ao
Experimento 1, em dois momentos cruciais do experimento, justo após culminada a Fase 2,
i.e.,quando os animais dos três grupos tiveram aprendido as associações nas suas respectivas
contingências, operante ou Pavloviana, e após o teste de transferência da Fase 4. Desta forma
só a metade dos 34 sujeitos foram expostos a todas as fases experimentais, pois a outra
metade foi perfundida após a Fase 2 para tomar as amostras necessárias para a imuno-
histoquímica.
Para a primeira fase, a média de infusões (M =19,35 SD = 0,903) esteve entre o
esperado, com a maioria dos sujeitos se administrando as 20 infusões máximas por sessão, o
que permitiu passar rapidamente para a seguinte fase.
Como pode ser observado na Figura 19, a qual ilustra os índices discriminativos (ID)
das últimas seis sessões durante a Fase 2, todos os animais do grupo CO atingiram ID
superior ou igual a 90%. Além da estabilidade e o critério de ID, os sujeitos continuavam
recebendo uma média de infusões igual à da sessão anterior, sendo em CO ou em CP,
atingindo o máximo de 20 infusões em quase todas as sessões diárias.
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1 2 3 4 5 6
Índ
ice
Dis
crim
inat
ivo
Sessão
ACO1 ACO2 ACO3 ACO4 ACO5 ACO6
ACO7 ACO8 ACO9 ACO10 ACO11 ACO12
108
Figura 19 – Índice discriminativo durante a Fase 2 do Experimento 3. O gráfico mostra o ID dos sujeitos integrantes do grupo CO durante as últimas seis sessões da Fase 2 (Treino Discriminativo em contingência operante ou Pavloviana de Morfina). Pode-se observar que o ID vai aumentando até chegar a 90% ou superior nas últimas duas sessões.
Durante a Fase 3 (Treino de Encadeamento das Respostas de Busca e
Autoadministração de Morfina), os sujeitos de todos os grupos aprenderam a tarefa de
encadeamento e atingiram estabilidade de respostas de autoadministração, com uma mediana
de infusões (Md =18,01). Na Figura 20 pode ser observado a média da taxa de infusões por
sessão por grupo das últimas seis sessões na Fase 3. Para esta fase não foram encontradas
diferenças estatisticamente significativas entre grupos, para Respostas de Busca, de
Autoadministração, nem em infusões. Para Respostas de Busca (Kruskall-Wallis test: H (2,
N= 34) =0,464 p =0,793), com uma mediana de 17,92 para o grupo CO, 15,92 para o CP e
15,25 para o Ctr. Respostas de Autoadministração (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 34) =2,126
p =0,345), com uma mediana de 19,54 para o grupo CO, 15,08 para o CP e 14,06 para o Ctr.
Tampouco em Respostas Totais (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 34) =3,256 p =0,196), com
uma mediana de 20,08 para o grupo CO, 13,21 para o CP e 16,06 para o Ctr; nem no número
de Infusões (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 21) =1,739 p =0,419), com uma mediana de
13,38 para o grupo CO, 11,86 para o CP e 9,00 para o Ctr.
14
15
16
17
18
19
20
1 2 3 4 5 6 7 8
Mé
dia
de
Infu
ssõ
es
po
r Se
ssão
SessãoACO ACP Veíc
109
Figura 20 – Média de infusões durante a Fase 3 do Experimento 3. O gráfico mostra a média de infusões de COC dos sujeitos integrantes dos grupos CO, CP e Ctr durante as últimas seis sessões da Fase 3 (Treino de Encadeamento das Respostas de Busca e Autoadministração de COC). Pode-se observar que o número de infusões tente se estabilizar durante as últimas sessões.
Na Figura 21 são mostrados os dados da frequência de respostas na barra busca (B) e
na barra de administração (A) na presença de S1. Nota-se na figura que os animais do grupo
CO responderam mais na barra B (primeiro elo da cadeia) na presença de S1 do que os outros
dois grupos. De fato, o teste Kruskall-Wallis revelou diferenças significativas entre a
frequência de respostas na barra B dos grupos. Diferenças entre grupos para a frequência total
de respostas em S1 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 34) =14,617 p =0,001), com uma mediana
de 122,00 para o grupo CO, 82,00 para o CP e 34,00 para o Ctr, e o pós-hoc mostrou
resultados significativos de CO x CP (p =0,043), CO x Ctr (p=0,001). Para a frequência de
respostas na Barra B, foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre
grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 34) =20,199 p <0,001), com uma mediana de 98,00
para o grupo CO, 45,50 para o CP e 15,50 para o Ctr, e o pós-hoc mostrou resultados
significativos de CO x CP (p =0,003), CO x Ctr (p=0,001) e CP x Ctr (p= 0,006). Para a
frequência de respostas na Barra A em S1 (autoadministração), não foram encontradas
diferenças estatisticamente significativas entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 34)
=3,206 p =0,201), com uma mediana de 30,00 para o grupo CO, 46,00 para o CP e 16,00 para
o Ctr.
110
Figura 21 – Frequência de respostas de busca e autoadministração na presença de S1. Os dados representam a mediana (-P25 e +P75) da frequência de respostas na barra A, na barra B e o a frequência total (a somatória das repostas em ambas as barras), na presença de S1, dos sujeitos dos grupos CO, CP e Ctr durante a Fase 4. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
Na Figura 13 são mostrados os dados da frequência das respostas totais, na presença
de S1 e S2. Diferenças entre grupos para a frequência total de respostas (Kruskall-Wallis test:
H (2, N= 17) =8,710 p =0,013), com uma mediana de 138,50 para o grupo CO, 106,50 para o
CP e 72,00 para o Ctr, e o pós-hoc mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p =0,019).
Para a frequência de respostas totais na Barra B, foram encontradas diferenças
estatisticamente significativas entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =19,258 p ≤
0,001), com uma mediana de 122 para o grupo CO, 82,00 para o CP e 34,50 para o Ctr, e o
teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos
de CO x CP (p =0,043), e CO x Ctr (p =0,001). Para a frequência de respostas totais na Barra
A em S1 (autoadministração), não foram encontradas diferenças estatisticamente
significativas entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =0,487 p =0,784), com uma
mediana de 16,00 para o grupo CO, 21,50 para o CP e 36,50 para o Ctr.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
TOTAL B A
Fre
qu
ên
cia
de
Re
spo
stas
Barras
CO
CP
Ctr**
*
*
**
111
Figura 22 – Frequência total de respostas de busca e autoadministração. Os dados representam a mediana (-P25 e +P75) da frequência de respostas na barra A, na barra B e o a frequência total (a somatória das repostas em ambas as barras), na presença de S1 e S2, dos sujeitos dos grupos CO, CP e Ctr durante a Fase 4. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
Na Figura 23 são mostrados os Índices Discriminativos (respostas em S1/respostas
totais) da frequência total de respostas, frequência de respostas na Barra B e frequência de
respostas na barra A de cada grupo na Fase 4. O índice discriminativo permite observar o
controle de S1 sobre ambas as respostas de interesse, busca e autoadministração. Foram
observadas diferenças entre grupos no ID Total em S1 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17)
=19,477 p ≤0,001) com uma mediana de 87,13 para o grupo CO, 71,57 para o CP e 57,63. Os
testes pós-hoc revelaram diferenças significativas entre o grupo CO e Ctr (p<0,001), e CP e
Ctr (p=0,003). Em relação aos IDs de cada barra, a análise mostrou que houve diferença entre
os grupos no controle de S1 sob as respostas emitidas na barra B (Kruskall-Wallis test: H (2,
N= 17) =14,927 p =0,001) e na Barra A (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =12,876 p
=0,002). As análises pós-hoc revelaram que S1 controlou as respostas emitidas pelo grupo
CO na barra quando comparado com CP (P=0,002) e Ctr (p=0,016), mas não se observaram
diferenças entre os grupos CP e Crt. Por outro lado, quando foi comparado o ID na barra A, a
análise revelou que o grupo CP obteve índices significativamente maiores do que os grupo
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
TOTAL B A
Fre
qu
ên
cia
de
Re
spo
stas
Barras
CO
CP
Ctr
*
**
112
CO (p=0,012) e do que o grupo Crl (p=0,003), mas não houve diferenças entre os grupos CO
e Crtl.
Figura 23 – Discriminação de S1 na Fase 4. O gráfico mostra o ID das de respostas de busca, respostas de administração e respostas totais, como mediana (-P25 e +P75), dos sujeitos integrantes dos grupos CO, CP e Ctr durante a Fase 4 (Teste de Transferência Sob o Controle de S1 nas Respostas de Busca e Autoadministração de Cocaína). * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
A análise dos IDs por sujeito (Figura 24) permite observar com maior detalhe o
controle de S1 (índice discriminativo) sobre as respostas emitidas nas barras B e A. Nota-se
que S1 controlou as respostas de responder em B, mas não em A, de todos os animais do
grupo CO. Por outro lado, perto da metade dos animais do grupo CP obteve ID maior a 80%
na barra A. As respostas de apenas um animal do grupo Ctr ficaram sob controle de S1. Desta
forma, é evidente que houve controle diferencial de S1 sobre as respostas emitidas pelos
animais dos diferentes grupos.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
TOTAL B A
S1/S
1+S
2
Barras
CO
CP
Ctr
****
*** **
*
113
Figura 24 – Índice discriminativo por sujeito nas barras de busca e administração. O gráfico mostra por sujeitos o ID das de respostas de busca e de administração, dos sujeitos integrantes dos grupos CO, CP e Ctr durante a Fase 4.
Na Figura 25, mostra-se a distribuição das respostas em percentual entre as barras B e
A na presença de S1 e S2, para cada sujeito. Todos os animais do grupo CO mostraram
preferência pela Barra B quando S1 estava presente, porém só em torno do 70% das respostas
foram emitidas na barra B. A análise estatística (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 32) =4,926 p
=0,852) revelou que não houve diferenças significativas entre grupos em relação à
preferência pelas barras na presença de S1, nem na presença de S2 (Kruskall-Wallis test: H
(2, N= 32) =3,714 p =0,156). A diferença entre os grupos em relação à preferência por B, o
teste pós-hoc mostrou que a mediana do grupo CO foi maior do que as dos grupos CP e Ctr
(p=0,001 e p=0,002, respectivamente), porém não houve diferenças entre os grupos CP e Crt
(p= 0,143).
0
20
40
60
80
100
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
%
Sujeitos
B
CO CP Ctr
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
Sujeitos
A
CO CP Ctr
114
Figura 25 – Preferência por B na presença dos estímulos discriminativos. Os dados mostram a distribuição das respostas entre a barra B e a barra A como mediana (-P25 e +P75) do índice de preferência (frequência de respostas em B/frequência de resposta em B + frequência de resposta em A) na presença de S1 e S2 na Fase 4 do Experimento 3, dos grupos CO, CP e Ctr. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
Como mostrado na Figura 26, onde se mostram os dados individuais, todos os ratos
do grupo CO, preferiram a barra B quando S1 foi apresentado. Os animais do grupo CP
mostraram maior variabilidade, mostrando que não houve clara preferência por uma das
barras, na presença de S1, como grupo, mas de forma individual, pode-se observar que a
metade dos sujeitos preferiram a barra A e a outra metade a barra B, de forma similar ao
grupo Ctr.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
TOTAL S1 S2
B/B
+A
Estímulo
ACO
ACP
Ctr
**
115
Figura 26 – Porcentagem de respostas de busca e administração em S1 e S2. O gráfico mostra a proporção de respostas na barra de busca (B) e de administração (A) na presença de S1 e S2, dos grupos CO, CP e Ctr, durante a Fase 4.
Na Figura 27 podem ser observadas a latência da primeira resposta emitida diante S1
e de S2 durante a Fase 4. A análise estatística comparando as médias da Latência à Primeira
Resposta durante a Fase 4 utilizando o teste Kruskall-Wallis revelou que houve diferenças
significativas entre grupos. A análise Kruskall-Wallis revelou diferenças na latência de
resposta em B (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =7,566 p =0,023), mas não em A
(Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =3,977 p =0,137) na presença de S1, nem em B
(Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =1,246 p =0,536) ou A na presença de S2 (Kruskall-
Wallis test: H (2, N= 22) =11,503 p =0,003). Não houve diferenças de latência de respostas
em B na presença de S2 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =,205 p =0,201). As análises pós-
hoc revelaram que na presença de S1, a latência em B do grupo CO foi menor do que as
latências do grupo CP (p=0,036).
0
1020
30
4050
60
7080
90100
1 4 7 10 3 6 9 12 2 5 8
%
Sujeitos
S1
CO CP Ctr1 4 7 10 3 6 9 12 2 5 8
Sujeitos
S2
BARRA A
BARRA B
CO CP Ctr
116
Figura 27 – Latência da primeira resposta na Fase 4. Os dados mostram a mediana (-P25 e +P75) do tempo em segundos transcorridos desde a 1ª apresentação de S1 ou S2 e a emissão da 1ª resposta na barra A ou na barra B, para cada grupo CO, CP e Ctr durante a Fase 4. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni.
São apresentados os dados bioquímicos das amostras de tecido processadas para
imuno-histoquímica de ΔFosB após a Fase 2 e a Fase 4. O teste de Kruskall-Wallis foi
realizado para detectar diferenças estatísticas em todas as subáreas de interesse. Estes
resultados são apresentados junto com os gráficos correspondentes. Adicionalmente foram
realizados testes de Wilcoxon para comparar os resultados das amostras tomadas após a Fase
2 com aquelas tomadas após a Fase 4.
A análise estatística comparando as médias do número de células imunorreativas a
ΔFosB no PFC LO utilizando o teste Kruskall-Wallis revelou que existem diferenças
estatisticamente significativas entre grupos na Fase 2, mas não na Fase 4 (Figura 28). Para a
Fase 2, foram encontradas diferenças entre grupos (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 34)
=14,253 p =0,001), com uma mediana de 23,87 para o grupo CO, 17,00 para o CP e 8,00 para
o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados
significativos de CO x CP (p =0,006) e CO x Ctr (p =0,012) e CP x Ctr (0,012); enquanto
que na Fase 4 não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (Kruskall-
0
10
20
30
40
50
60
70
ACO ACP CTrl
Tem
po
em
se
gun
do
s
Grupo
Lat Busc S1 Lat Adm S1 Lat Busc S2 Lat Adm S2
*
117
Wallis test: H (2, N= 17) =5,131 p =0,077), com uma mediana de 31,00 para o grupo CO,
28,00 para o CP e 26,75 para o Ctr.
Figura 28 – Células imunorreativas a ΔFosB no Córtex Pré-frontal nas fases 2 e 4 do Experimento 3. A) O gráfico mostra a mediana (-P25 e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr no Córtex Lateral Orbital (LO) do PFC nas amostras processadas após a Fase 2. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni. B) O gráfico mostra a comparação da marcação de células imunorreativas a ΔFosB nas amostras processadas após a Fase 2 e a Fase 4 para os grupos CO, CP e Ctr no Córtex Lateral Orbital (LO) do PFC.
De forma similar, para todas as subáreas do mPFC, a análise estatística comparando
as médias do número de células imunorreativas a ΔFosB utilizando o teste Kruskall-Wallis
revelou que existem diferenças estatisticamente significativas entre grupos na Fase 2, mas
nenhuma na Fase 4, como pode ser observado na Figura 29. Para a Fase 2, diferenças entre
0
5
10
15
20
25
30
LO
Cé
lula
s im
un
orr
eat
ivas
po
r m
m²
Grupo
CO CP Ctr
****
**
A
0
5
10
15
20
25
30
35
Cé
lula
s Im
un
ore
ati
vas
po
r m
m2
IL_F2 IL_F4
O
P
C
B
118
grupos para Cg1 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =11,912 p =0,003), com uma mediana
de 20,00 para o grupo CO, 16,00 para o CP e 8,00 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-
Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p
=0,012) e CP x Ctr (0,012). Diferenças entre grupos para PrL (Kruskall-Wallis test: H (2, N=
19) =7,542 p =0,023), com uma mediana de 19,25 para o grupo CO, 19,62 para o CP e 12,50
para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados e
perto da significância estatística para CO x Ctr (0,051) e CP x Ctr (0,051). Adicionalmente,
foram achadas diferenças entre grupos para IL (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =10,767 p
=0,005), com uma mediana de 26,00 para o grupo CO, 22,37 para o CP e 17,25 para o Ctr, e
o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos
de CO x Ctr (p =0,025) e CP x Ctr (p =0,025). Na Fase 4 não foram encontradas diferenças
estatisticamente significativas no Cg1 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =1,799 p =0,407),
com uma mediana de 21,75 para o grupo CO, 22,37 para o CP e 20,75 para o Ctr; PrL
(Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =0,901 p =0,637), com uma mediana de 20,05 para o
grupo CO, 21,62 para o CP e 22,75 para o Ctr; nem no IL (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17)
=0,830 p =0,660), com uma mediana de 23,62 para o grupo CO, 24,5 para o CP e 24,50 para
o Ctr.
0
5
10
15
20
25
30
CG1 PrL IL
Cé
lula
s im
un
orr
eat
ivas
po
r m
m²
Grupo
CO CP Ctr
**
*
*
A
119
Figura 29 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Córtex Pre-Frontal Medial (mPFC) no Experimento 3. A) O gráfico mostra a mediana (-P25 e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do mPFC (Cg1, PrL e IL) nas amostras processadas após a Fase 2. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni. B) O gráfico mostra a comparação da marcação de células imunorreativas a ΔFosB nas amostras processadas após a Fase 2 e a Fase 4 para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do mPFC (Cg1, PrL e IL).
Ao serem observados os resultados da análise estatística comparando as médias do
número de células imunorreativas a ΔFosB no NAc utilizando o teste Kruskall-Wallis (Figura
30), foi revelado que existem diferenças estatisticamente significativas entre grupos em
ambas as subáreas na Fase 2, mas nenhuma na Fase 4. Para a Fase 2, diferenças entre grupos
para NAc Core (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =10,290 p =0,006), com uma mediana de
28,62 para o grupo CO, 27,37 para o CP e 14,25 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney
com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p =0,012), e CP x
Ctr (p =0,012). Diferenças entre grupos para NAc Shell (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19)
=10,327 p =0,006), com uma mediana de 34,00 para o grupo CO, 29,37 para o CP e 15,75
para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados
significativos de CO x Ctr (p =0,012), e CP x Ctr (p =0,012). Na Fase 4 não foram
encontradas diferenças estatisticamente significativas no NAc Core (Kruskall-Wallis test: H
(2, N= 17) =3,120 p =0,210), com uma mediana de 31,37 para o grupo CO, 28,12 para o CP e
0
5
10
15
20
25
30
Cé
lula
s Im
un
ore
ati
vas
po
r m
m2
Cg1_F2 Cg1_F4 PrL_F2 PrL_F4 IL_F2 IL_F4
O
P
C
B
120
27,75 para o Ctr; nem para NAc Shell (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =0,171 p =0,918),
com uma mediana de 28,50 para o grupo CO, 30,50 para o CP e 29,00 para o Ctr.
Figura 30 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Núcleo Acumbente (NAc) no Experimento 3. A) O gráfico mostra a mediana (-P25 e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do NAc (Core e Shell) nas amostras processadas após a Fase 2. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni. B) O gráfico mostra a comparação da marcação de células imunorreativas a ΔFosB nas amostras processadas após a Fase 2 e a Fase 4 para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do NAc (Core e Shell).
Para análise estatística comparando as médias do número de células imunorreativas a
ΔFosB no CPu utilizando o teste Kruskall-Wallis, também não foi diferente ao observado nas
outras áreas, revelando que existem diferenças estatisticamente significativas entre grupos em
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Core Shell
Cé
lula
s im
un
orr
eat
iva
s p
or
mm
²
Grupo
CO CP Ctr
* **
*
A
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Cé
lula
s Im
un
ore
ati
vas
po
r m
m2
Core_F2 Core_F4 Shell_F2 Shell_F4
O
P
C
B
121
ambas as subáreas na Fase 2, mas nenhuma na Fase 4, como pode ser observado na Figura
31. Para a Fase 2, diferenças entre grupos para CPu Lateral (Kruskall-Wallis test: H (2, N=
19) =7,144 p =0,028), com uma mediana de 30,50 para o grupo CO, 27,37 para o CP e 14,25
para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados
significativos de CO x Ctr (p =0,012). Diferenças entre grupos para CPu Lateral (Kruskall-
Wallis test: H (2, N= 19) =10,434 p =0,005), com uma mediana de 47,25 para o grupo CO,
45,37 para o CP e 36,25 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de
Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p =0,012), e CP x Ctr (p =0,012).
Na Fase 4 não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas no CPu Lateral
(Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =0,962 p =0,618), com uma mediana de 32,37para o
grupo CO, 28,12 para o CP e 27,75 para o Ctr; nem para CPu Medial (Kruskall-Wallis test: H
(2, N= 17) =0,110 p =0,946), com uma mediana de 49,87 para o grupo CO, 51,12 para o CP e
51,50 para o Ctr.
0
10
20
30
40
50
60
Lateral Medial
Cé
lula
s im
un
orr
eat
iva
s p
or
mm
²
Grupo
CO CP Ctr
*
**
A
122
Figura 31 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Caudado Putamen (CPu) no Experimento 3. A) O gráfico mostra a mediana (-P25 e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do CPu (Lateral e Medial) nas amostras processadas após a Fase 2. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni. B) O gráfico mostra a comparação da marcação de células imunorreativas a ΔFosB nas amostras processadas após a Fase 2 e a Fase 4 para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do CPu (Lateral e Medial).
A análise estatística comparando as médias do número de células imunorreativas a
ΔFosB no Hipocampo utilizando o teste Kruskall-Wallis revelou que existem diferenças
estatisticamente significativas entre grupos para as subáreas DG e CA1 na Fase 2, mas
nenhuma na Fase 4, como pode ser observado na Figura 32. Para a Fase 2, diferenças entre
grupos para DG (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =7,970 p =0,019), com uma mediana de
23,62 para o grupo CO, 19,50 para o CP e 19,75 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney
com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x CP (p =0,045), e perto
da significância estatística, CO x Ctr (0,051). Diferenças entre grupos para CA1 (Kruskall-
Wallis test: H (2, N= 19) =10,447 p =0,005), com uma mediana de 26,50 para o grupo CO,
23,12 para o CP e 18,00 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com correção de
Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p =0,012) e CP x Ctr (0,012).
Adicionalmente, foram achadas diferenças entre grupos para CA3 (Kruskall-Wallis test: H (2,
N= 19) =3,005 p =0,223), com uma mediana de 21,00 para o grupo CO, 24,50 para o CP e
21,75 para o Ctr. Na Fase 4 não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas
0
10
20
30
40
50
60
Cél
ula
s Im
un
ore
ativ
as p
or
mm
2
lCPu_F2 lCPu_F4 mCPu_F2 lCPu_F4
O
P
C
B
123
no DG (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =3,121 p =0,210), com uma mediana de 25,00
para o grupo CO, 23,50 para o CP e 22,75 para o Ctr; CA1 (Kruskall-Wallis test: H (2, N=
17) =0,206 p =0,902), com uma mediana de 23,50 para o grupo CO, 23,37 para o CP e 23,35
para o Ctr; nem no para CA3 (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =0,246 p =0,884), com uma
mediana de 23,87 para o grupo CO, 23,87 para o CP e 24,00 para o Ctr.
Figura 32 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB no Hipocampo no Experimento 3. A) O gráfico mostra a mediana (-P25 e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do Hipocampo (DG, CA1 e CA3) nas amostras processadas após a Fase 2. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni. B) O gráfico mostra a comparação da marcação de células imunorreativas a ΔFosB nas amostras processadas após a Fase 2 e a Fase 4 para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas do Hipocampo (DG, CA1 e CA3).
0
5
10
15
20
25
30
DG CA1 CA3
Cé
lula
s im
un
orr
eat
ivas
po
r m
m²
Grupo
CO CP Ctr
**
*
A
0
5
10
15
20
25
30
35
Cél
ula
s Im
un
ore
ativ
as p
or
mm
2
DG_F2 DG_F4 CA1_F2 CA1_F4 CA3_F2 CA3_F4
O
P
C
B
124
Os resultados da última área aqui apresentados são os da Amígdala. Se observam
diferenças entre grupos em duas das suas subáreas, Basolateral e Central, para a Fase 2,
porém nenhuma na Fase 4. A Figura 33 mostra a comparação das médias do número de
células imunorreativas a ΔFosB na Amígdala. Para a Fase 2, diferenças entre grupos para
Amígdala Basolateral (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =13,346 p =0,001), com uma
mediana de 72,87 para o grupo CO, 55,87 para o CP e 46,75 para o Ctr, e o teste pós-hoc
Mann-Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x CP (p
=0,025), CO x Ctr (p =0,012) e CP x Ctr (p =0,012). Diferenças entre grupos para a
Amígdala Central (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =10,430 p =0,005), com uma mediana
de 29,62 para o grupo CO, 18,00 para o CP e 16,70 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-
Whitney com correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x CP (p
=0,012), e CO x Ctr (0,012). Não foram achadas diferenças entre grupos para a Amígdala
Medial (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 19) =8,686 p =0,013), com uma mediana de 29,62
para o grupo CO, 18,00 para o CP e 16,70 para o Ctr, e o teste pós-hoc Mann-Whitney com
correção de Bonferroni mostrou resultados significativos de CO x Ctr (p =0,025). Na Fase 4
não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na Amígdala Basolateral
(Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =2,170 p =0,338), com uma mediana de 77,87 para o
grupo CO, 73,62 para o CP e 70,65 para o Ctr; Amígdala Central (Kruskall-Wallis test: H (2,
N= 17) =0,052 p =0,974), com uma mediana de 34,50 para o grupo CO, 34,00 para o CP e
33,75 para o Ctr; nem no para a Amígdala Medial (Kruskall-Wallis test: H (2, N= 17) =0,285
p =0,867), com uma mediana de 16,00 para o grupo CO, 16,00 para o CP e 16,75 para o Ctr.
125
Figura 33 – Marcação de células imunorreativas a ΔFosB na Amígdala no Experimento 3. A) O gráfico mostra a mediana (-P25 e +P75) de células imunorreativas a ΔFosB para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas da Amígdala (Basolateral, Central e Medial) nas amostras processadas após a Fase 2. * p<0,05 ** p<0,01 para pós-hoc Mann-Whitney com correção Bonferroni. B) O gráfico mostra a comparação da marcação de células imunorreativas a ΔFosB nas amostras processadas após a Fase 2 e a Fase 4 para os grupos CO, CP e Ctr nas subáreas da Amígdala (Basolateral, Central e Medial).
Foram realizados testes de Wilcoxon para comparar em cada subárea, as medianas das
fases 2 e 4 em todos os grupos. As tabelas dos Anexos 1, 2 e 3 contém a informação dos
valores das medianas, do estatístico Z de Wilcoxon e os valores p. Em negrito são destacados
os valores p<0,05.
Em resumo, os resultados apresentados do Experimento 3 mostram que: a) durante a
Fase 1 os animais receberam um número de infusões de COC normal dentro do reportado na
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Basolateral Central Medial
Cé
lula
s im
un
orr
eat
ivas
po
r m
m²
Grupo
CO CP Ctr
*
*
*
*
*
*
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Cél
ula
s Im
un
ore
ativ
as p
or
mm
2
BLA_F2 BLA_F4 CeA_F2 CeA_F4 MeA_F2 MeA_F4
O
P
C
B
126
literatura, b) os sujeitos do grupo CO atingiram 90% ou mais de ID durante a a Fase 2, c) os
animais dos três grupos atingiram estabilidade no número de infusões de COC durante a Fase
3, e não foram encontradas diferenças entre grupos nas respostas de busca e administração; d)
Durante a Fase 4, os sujeitos do grupo CO mostraram maior número de respostas de busca e
respostas totais na presença de S1 comparado com o grupo CP e Ctr, e os sujeitos do grupo
CP mostraram maior número de respostas de busca na presença de S1 comparado com o
grupo Ctr ; e) No teste de transferência da Fase 4, o grupo CO mostrou um ID superior a 80%
nas respostas de busca e respostas totais na presença de S1, sendo diferente dos grupos CP e
Ctr, porém o grupo CP mostrou um ID superior a 80% nas respotas de administração na
presença de S1, sendo diferente dos grupos CO e Ctr; f) não houve uma clara preferência pela
resposta de busca nem de administração na presença de S1 durante a fase 4; e f) no teste de
transferência, a latência de resposta de busca na presença de S1 foi menor no grupo CO
comparado com o Ctr. Além disto, os resultados imunohistoquímicos mostram que a o grupo
CO expressou maior quantidade de FosB comparado com o CP e Ctr no LO, BLA e CeA.
No DG, MeA e lCPu o grupo CO teve maior expressão que o CP; e no Cg1, IL, Core, Shell,
mCPu e CA1, o grupo CO e CP tiveram maior expressão que o Ctr (mas não ouve diferença
entre estes). Ainda, foi evidente que houve aumento do número de células imunorreativas a
FosB, por mm², da Fase2 à Fase 4, na maioria das subáreas.
As tabelas 3 e 4, localizadas na seção de análise de dados dos experimentos 1 e 2,
respectivamente, podem auxiliar o acompanhamento dos resultados e da discussão deste
experimento.
Discussão
O experimento 3 teve como primeiro objetivo utilizar o protocolo de administração de
drogas aperfeiçoado durante o experimento 2 para observar o controle de estímulos
estabelecido durante os condicionamentos operante e pavloviano. O segundo objetivo foi
127
avaliar o efeito dos condicionamentos operante e pavloviano na autoadministração e
administração passiva de COC, respectivamente, sobre a expressão de FosB em diferentes
áreas do cérebro implicadas na dependência às drogas.
Durante a Fase 1, cada vez que um sujeito do grupo CO respondia na roda operante
tinha como consequência uma infusão de COC e simultaneamente o sujeito do grupo CP e o
do grupo Ctr a ele acoplados receberam sob contingência Pavloviana uma injeção i.v da
droga na mesma dose ou de veículo, respectivamente. A média de infusões para esta fase
esteve entre o normal segundo o reportado outros estudos de autoadministração de COC
(Mierzejewski et al., 2003; Suto et al., 2011). Usualmente, na faixa das doses utilizadas, o
limite de infusões é de 20 em um período de 2h (que é o tempo total de sessão) para evitar
grandes diferenças de administração entre sujeitos, sendo comum que os sujeitos se
autoadministrem as 20 vezes, como aconteceu neste experimento. Uma vez foi estável o
número de infusões, se deu continuidade ao treino discriminativo da Fase 2, no qual os
sujeitos do grupo CO atingiram o critério de ID ≥ 90% nas últimas duas sessões, e se
autoadministraram um número de infusões (com dose programada) dentro do normal segundo
o reportado outros estudos de autoadministração de COC (Mierzejewski et al., 2003; Suto et
al., 2011). Esta fase se desenvolveu também sem imprevistos e de forma similar ao
Experimento 2.
Durante a Fase 3 os sujeitos não estiveram mais acoplados, portanto todos eles
aprenderam a se autoadministrar COC, independentemente do grupo ao qual pertenciam. Não
foram observadas diferenças entre os grupos, indicando que o treino realizado na Fase 1 não
teve efeito sobre a aquisição da pressão de barra. Isto é, a taxa de respostas e média de
infusão dos animais dos três grupos foi similar a despeito da experiência prévia com COC e
com diferentes contingências de sua administração. Esses dados validam os obtidos na Fase
128
4, uma vez que grandes diferenças no número de infusões entre grupos durante esta fase
poderiam alterar o responder durante a seguinte.
Durante a Fase 4 foi realizado o teste de transferência em condições de extinção. Os
estímulos S1 e S2 foram apresentados em intervalos e as respostas de busca e de
autoadministração foram registradas, porém sem terem consequências programadas. Os
resultados indicaram que S1 adquiriu controle sobre a resposta de pressão de barra dos
animais do grupo CO e CP, mas não dos animais do grupo Ctr (ID de respostas totais e de
respostas na presença de S1), indicando transferência de controle desses estímulos para um
novo operante, no caso do grupo CO, e PIT para o grupo CP. Este resultado replica estudos
que utilizaram COC e reportaram a apresentação de PIT (Kruzic, Congelton & See, 2001;
LeBlanc, Ostlund & Maidment, 2012; Saddoris et al., 2011). Como discutido no Experimento
2, a transferência de controle observada indica que os procedimentos de treino estabeleceram
os controles esperados e adequados sobre o comportamento dos animais do grupo CO
(Barnes-Holmes et al., 2000; Catania, 1999) e no grupo CP (Alarcon et al.,2018; Cartoni et
al., 2016; Delamater et al., 2007).
O controle de estímulos estabelecido por S1 se viu refletido não só nos dados de ID,
mas também na frequência e na latência de respostas na presença deste estímulo, sendo que
este estímulo controlou as respostas dos animais do grupo CO unicamente na barra B e
adicionalmente ocasionou um aumento na frequência de resposta nesta barra, assim como
uma menor latência de resposta a esta, comparados com os grupos CP e Ctrl. Ainda se
observou controle de estímulos estabelecido por S1 no grupo CP, o qual teve um ID e uma
frequência de respostas significativamente maior em comparação com o grupo Ctr. Este
padrão foi observado no Experimento 2 e a explicação sobre o controle diferencial de S1
sobre as respostas na barra B e A dos animais dos grupos CO e CP é exposta na discussão dos
dados desse experimento.
129
O controle de estímulos durante o teste de transferência que mostrou o grupo CP sobre
a resposta de autoadministração na presença de S1 é entendível em termos de eficiência de
respostas (Catania, 1999), pois uma vez as duas barras estiveram disponíveis, é mais eficiente
responder na barra que levaria a infusão da droga. Durante um teste de transferência, quando
disponibilizados simultaneamente dois operandos que formaram parte de um treino
encadeado de respostas, existe a tendência de responder no operando que dava acesso direto a
um reforçador. Esta tendência tem sido reportada em estudos de PIT com comida (Corbit &
Balleine, 2003b) e com COC (LeBlanc et al., 2012).
Os resultados do Experimento 3 sugerem que se apresentou um padrão observado no
Experimento 2, porém de forma menos robusta. No experimento 2 se observou uma
tendência do grupo CO responder na barra B e o grupo CP na barra A, tanto na frequência e
ID total, como quando S1 estava presente. Os resultados da latência e de frequência de
respostas sugerem em conjunto com resultados de ID discutidos previamente, que tenha se
originado esta tendência ou padrão, pelo menos para o grupo CO na barra B, pois a latência
na barra B na presença de S1 apresentou diferenças significativas, sendo muito menor no
grupo CO, comparado com o grupo CP. O grupo CP não apresentou uma menor latência de
resposta na barra A comparado com o grupo CO quando S1 foi apresentado pela primeira
vez, porém estas diferenças não foram estatisticamente significativas. Ainda, a frequência de
respostas na barra B foi muito mais alta no grupo CO comparado com o CP. Assim mesmo, a
frequência de respostas na barra B foi maior no grupo CP comparado com o Ctr, sustentando
o padrão observado no Experimento 2, porém de forma parcial, especificamente para o grupo
CO, mas não paro o CP. A formação desta tendência no grupo CO é discutida no
Experimento 2, porém a não formação desta no grupo CP neste experimento não será
discutida, ao não houverem dados suficientes para isto e ao não ser relevante para os
objetivos deste experimento.
130
Os resultados do efeito dos condicionamentos operante e pavloviano na
autoadministração e administração passiva de COC sobre a expressão de FosB em
diferentes áreas do cérebro implicadas na dependência às drogas foram de grande interesse
para os objetivos deste estudo.
No grupo CO (Anexo 1) a diferença de expressão de ΔFosB entre Fase 2 e 4 foi
mínima para quase todas as subáreas, com exceção de LO, na qual ΔFosB continuou se
acumulando até a Fase 4. Este resultado era esperado, pois o grupo CO já devia ter atingido
uma estabilidade na expressão de ΔFosB desde a Fase 2, portanto não é de surpreender que
na Fase 4 não se apresentassem aumentos, porém, a subárea LO continuou acumulando
ΔFosB até a Fase 4, o que é de grande interesse ao destacar o envolvimento desta área, a qual
já foi reportada por Winstanley et al. (2007) por ter um papel importante na CO.
Em geral, para grupo CP, a diferença de expressão de ΔFosB entre Fase 2 e 4 (Anexo
2) teve diferenças estatisticamente significativas para LO, Cg1, PrL, mCPu, DG, BLA e CeA.
Com exceção de LO, as subáreas restantes não tinham sido previamente reportadas como
influenciadas diferencialmente pela contingência operante comparadas à Pavloviana em
experimentos que utilizaram COC como droga de estudo, o que também poderia ser
explicado por diferenças no modelo e delineamento experimental, pois em outros estudos não
terem utilizado o modelo de administração acoplado o qual, como mencionado na sessão
introdutória, é um modelo mais adequado para estudar as diferenças nas diferentes
contingências de aprendizagem da administração de drogas. Independentemente disto, é de
grande interesse e relevância ter indícios destas subáreas estarem implicadas na dependência
às drogas e apresentar diferenças de expressão de ΔFosB a depender do tipo de contingência
em que a COC foi administrada, contingência operante ou Pavloviana.
131
Os resultados da comparação da expressão de ΔFosB entre Fase 2 e 4 para o grupo Ctr
(Anexo 3) mostraram que houve diferenças nas medições entre estas duas fases em quase
todas as sensíveis a ΔFosB (Perrotti et al., 2008; Winstanley et al., 2007) avaliadas neste
estudo. Isto poderia sugerir que em subáreas que apresentaram diferenças significativas entre
grupos CO e CP, mas que não apresentaram diferença no grupo Ctr entre as medições feitas
nas fases 2 e 4, que S1 ao ser apresentado durante a administração nos grupo CO e CP desde
a Fase 1, que também foi treinado discriminativamente e associado à droga na Fase 2, foi um
fator que potencializou a associação S-droga, o que teria levado ao aumento na expressão de
ΔFosB nesta subárea. Dado que até a Fase 2 os sujeitos do grupo Ctr só tinham recebido
salina e durante a Fase 3 aprenderam se autoadministrar COC, o que era esperado era
observar segundo a literatura (Jacobs et al., 2002, 2003, 2005; Lüscher & Malenka, 2011;
Miguéns et al., 2008; Winstanley et al., 2007). Os resultados apresentados neste experimento
estão em concordância com esta literatura ao mostrar o aumento de expressão de ΔFosB em
subáreas sensíveis a esta após a administração de COC.
De forma consistente, nenhuma subárea mostrou diferenças entre grupos na medição
da Fase 4. Este resultado era esperado, pois dado que FosB se acumula gradativamente com
administrações repetidas de uma droga (Nestler, 2012, 2014), para o momento da medição
após a Fase 4, todos os grupos já tinham passado por autoadministração de COC durante a
Fase 3. Portanto, os dados discutidos se focam principalmente nos resultados que mostram as
diferenças entre grupos obtidas nas medições de FosB após a Fase 2.
A seguir se discute os resultados imunohistoquímico nas diferentes subáreas avaliadas
e se menciona a implicação destas na PIT quando reportada previamente. Adicionalmente, se
integram estes dados aos dados comportamentais nas possíveis implicações que poderiam ter
as subáreas, dependendo das suas funções, porém, se destaca que como apontado por Nestler
132
(2012, 2014) e Ruffle (2014), o FosB funcionaria como uma espécie de “interruptor
molecular” que ajuda iniciar e manter o estado de dependência em um organismo, e portanto
uma variação da sua expressão entre animais que se autoadministraram uma droga sob uma
contingência operante e os que a receberam passivamente sob uma contingência Pavloviana,
não necessariamente implicaria uma conexão com diferenças comportamentais entre estes
tipos de contingências. Portanto, as análises estão fundamentadas em possibilidades segundo
os resultados obtidos e a literatura que sugere esta conexão entre contingencia de
aprendizagem e mudanças génicas no SNC (e.g Choi et al., 2011; Jacobs et. al., 2003, 2005;
Lüscher & Malenka, 2011), especialmente a de FosB (Perrotti et al., 2008; Winstanley et
al., 2007).
A primeira subárea avaliada neste experimento foi o LO do OFC, uma área que está
implicada em características da procura por drogas na dependência, como impulsividade,
associações S-R e comportamentos de meta dirigida (Ostlund & Balleine, 2007; Shoenbaum,
Roesch, Stalnaker & Takahashi, 2009). Se sabe que no OFC, a COC produz uma grande
expressão deste IEG em comparação com outras subáreas, especialmente quando esta é
autoadministrada (Perrotti et al. 2008; Winstanley et al., 2007). Ainda se sabe que o OFC tem
sido reportado por estar implicado na PIT, já que lesões nesta área perturbam a manifestação
desta quando realizada antes dos treinos em contingência operante e Pavloviana (Ostlund &
Balleine, 2007). Segundo isto, é esperada a diferença que se observou entre os grupos CO,
CP e o Ctr, pois mesmo observando um padrão na expressão de FosB (CO>CP>Ctr), o
grupo CP teve uma diferença significativa comparada com o Ctr, sugerindo que o efeito
central que produz a COC é suficiente para expressar FosB no LO, mas que o tipo de
contingência, operante ou Pavloviana, pode modular ou potenciar esta expressão.
133
Estes resultados estão em concordância e replicam o dado do estudo de Winstanley et
al. (2007), que reporta que foram encontradas diferenças na expressão de FosB, sendo maior
no grupo que autoadministrou COC em comparação com o que recebeu esta de forma
passiva. Ainda, tendo em conta a função mencionada desta subárea e a sua sensibilidade a
expressar FosB quando COC é administrada, os dados do LO acompanham o observado
comportamentalmente com o resultado que mostra que o grupo CO teve uma maior
frequência de respostas e ID na presença de S1 em comparação com o CP.
Os resultados para as diferentes subáreas avaliadas do PFC no Experimento 3
mostram que não houve diferenças significativas de expressão de FosB entre os grupos CO
e CP nas subáreas do PFC avaliadas, porém no CG1 e no IL se pode observar uma aparente
tendência a uma expressão maior no grupo CO, comparado com os outros. Os dados do PrL
mostraram que o grupo CO teve uma marcação de FosB igual à do grupo CP nesta subárea,
portanto a expressão nesta subárea seria mediada principalmente pelo efeito central da COC.
No Cg1, os grupos CO e CP tiveram diferenças na expressão de FosB, em
comparação com o Ctr, mas não entre estes, porém, os resultados mostraram que poderia
existir uma diferença entre os grupos CO e CP, sendo relevante conferir este dado em futuros
estudos, dado que o Cg1 tem um papel no processamento e aprendizagem das consequências
que produz um comportamento (Hayden & Platt, 2010). Os dados obtidos não são suficientes
para concluir que no Cg1, a COC aumenta a expressão de FosB de forma diferenciada em
função ao tipo de contingência em que esta foi administrada e não unicamente pela ação
farmacológica da droga.
De forma similar, os resultados das medições no IL são interessantes para o presente
estudo, e dada a sua função de associação na aprendizagem operante (Tran-Tu-Yen et al.,
2009), se esperava que o grupo CO apresentasse uma maior expressão de FosB que o CP,
134
porém os resultados mostram diferenças entre o grupo CO comparado com o Ctr, e também
do CP comparado com o controle, mas não entre CO e CP. De forma similar aos resultados
do Cg1, parece existir um padrão de aumento na expressão de FosB regulado pela
contingência (CO>CP>Ctr) o qual seria interessante conferir em futuros estudos.
Como descrito no Experimento 1, o NAc é uma área de integração límbica e cortical
(Goto & Grace, 2008), implicada no processamento de estímulos pavlovianos e o estado
motivacional (Everitt, 2001). O NAc tem um papel importante na PIT. O Core e Shell têm
sido reportados bibliograficamente pelos seus diferentes papeis nesta. Por um lado, as lesões
no Core, mas não no Shell, tem mostrado impedir a PIT generalizada (Cardinal, Parkinson &
Everitt, 2002; Corbit & Balleine, 2005; 2011; Hal, Parkinson, Conor, Dickson & Everitt,
2001). Também tem sido previamente reportado que a PIT específica é impedida por les ões
no Shell e não no Core (Corbit et al., 2001; Corbit & Balleine, 2005; 2011).
Segundo o reportado por Perrotti et al. (2008), não se esperava que os resultados em
relação ao NAc mostrassem diferença na expressão de FosB entre o grupo Ctr e os outros
grupos, pois esta área é comumente reportada por expressar este IEG após a administração
crónica de COC em geral, sem estar esta expressão relacionada à contingência em que esta
droga foi administrada. Em concordância com este estudo, tanto os resultados no Core como
no Shell mostraram que os grupos CO e CP tiveram uma expressão muito maior comparados
com o Ctr, mais não entre estes dois.
Alguns autores têm proposto que o papel do NAc Core é mais relevante para a
autoadministração de COC quando associada a um S, pois a inativação reversível do Core,
mas não do NAc, alterou a reinstalação de COC induzida por um S (Fuchs, Evans, Parker, &
See, 2004). Porém, dado que é consistente que a expressão de FosB não diferencial na
administração de COC sob contingências operante e Pavloviana, no NAc Core e Shell, os
135
resultados comportamentais e imunohistoquímicos de este estudo para essas subáreas não
parecem estar relacionados.
Os resultados para o lCPu mostram diferenças na expressão de FosB entre os grupos
que receberam COC nas contingências operante e Pavloviana, em comparação com o Ctr, o
que sugere que foi o efeito central da droga a causante da indução de expressão gênica, e esta
não se deu em relação às contingências. De forma similar, os resultados para o mCPu
mostraram que houve diferenças significativas entre os grupos CO e Ctr, e CP e Ctr, mas não
entre CO e CP. O conhecimento sobre como o CPu está envolvida na dependência as drogas
é bastante restrito, se limitando, entre outros fatores, às conexões do lCPu com o córtex
somatossensorial e motor, com que em conjunto regulam diferentes aspectos do movimento
(Fricker, et al., 1996), e às conexões que o mCPu recebe do mPFC, regulam funções como
aprendizagem de sequências e seleção de estratégias, (McDonald, & White, 1999).
Os dados obtidos em conjunto para lCPu e mCPu mostram que a administração de
COC induz a expressão de FosB no CPu em geral e que esta expressão não é regulada pelas
contingências e sim pelo efeito central da droga. Isto sugere que o papel que o CPu tem na
dependência às drogas está mais relacionado às conexões com áreas corticais com as que em
conjunto regulam movimentos e aprendizagem de sequências. Os dados obtidos neste
experimento, comportamentais e imunohistoquímico, são insuficientes para interagir com o
que se conhece na literatura destas subáreas para sugerir uma interação entre estes.
Em relação aos resultados no hipocampo, as subáreas DG e CA1 mostraram
diferenças entre grupos, mas estas não se observaram no CA3. Para o DG houve uma maior
marcação no grupo CO em relação ao CP e ao Ctr. Tendo em conta que o DG tem um papel
importante na codificação conjuntiva de informação e na separação de padrões espaciais e
separação de padrões contextuais (Kesner, 2013), este resultado sugere que essas funções
136
poderiam ser atingidas diferencialmente na contingência operante e na contingência
pavloviana, induzindo portanto diferentes níveis de FosB nesta subárea entre grupos. Por
outro lado, os resultados para CA1 mostram marcações maiores nos grupos CO e CP em
comparação ao Ctr, mas não entre estes dois últimos, sugerindo que houve principalmente um
efeito central da COC sobre esta subárea como causa da expressão de FosB, sem ser afetada
pela contingência de aprendizagem. Dado que o mesmo resultado para CA1 foi obtido no
Experimento 1, parece houver consistência que esta subárea seja afetada unicamente pelo
efeito central de uma droga e não pela história de administração desta, porém seria possível
que uma outra droga diferente de morfina ou COC pudesse induzir um efeito diferencial
segundo a contingência, o qual poderia ser conferido em estudos posteriores. Os resultados
do DG e CA1 estão em concordância com o reportado por Perrotti et. al. (2008), em relação
ao aumento na expressão de FosB que a administração de COC causa nestas subáreas.
No CA3, os resultados obtidos não mostram diferenças significativas entre grupos, e
não parece existir um padrão de aumento ou diminuição de expressão de FosB em relação
ao tipo de contingência, pois as medidas de células imunorreativas por mm² são similares nos
três grupos. Como se pode observar na Figura 32, a quantidade de células imunorreativas foi
similar às das outras subáreas e se manteve estável nas medições feitas após a Fase 4, em
relação às primeiras, para todos os grupos, incluindo o Ctr. Dado que não houve diferenças
nesta medição entre os sujeitos que se autoadministraram COC ou receberam esta de forma
passiva com os sujeitos que receveram um veículo (grupo Ctr), e estes último grupo não
mostrou um aumento após ter autoadministrado a droga, o resultado indica que o CA3 não é
vulnerável à administração crónica de COC e que o papel que esta subárea poderia ter em
relação à dependência de COC, se existir, estaria ligado ao processamento sequencial de
informação em cooperação com CA1 e no processamento de geometria do ambiente em
cooperação com o DG (Kesner, 2007).
137
O hipocampo tem sido reconhecido pelo seu papel em aprendizagem e memória e
existe evidência que sugere mudanças na plasticidade e mecanismos moleculares no
hipocampo foram associados a memórias contextuais induzidas por um S previamente
presente durante a administração da droga, levando a busca e autoadministração da droga
(Hou et al., 2009; Taubenfeld, Muravieva, Garcia-Osta, & Alberini, 2010). Estudos
específicos do hipocampo em relação a seu papel na PIT não foram encontrados. Isto
provavelmente porque a maioria destes estudos realizam lesões específicas das áreas de
estudo antes ou depois do treino para observar como se afeta o desempenho da tarefa durante
o teste de transferência. Lesões no hipocampo dificultariam ou impediriam diretamente a PIT,
a depender da subárea lesionada, porém, dado que os mecanismos de memória estariam
sendo afetados diretamente, não se poderia concluir que se a lesão afetou a PIT ou se
simplesmente incapacitou os sujeitos para manter ou recobrar as suas memórias (Knierim,
2004; Mumby, 2002; Palmer, 2002). Os resultados do presente experimento não são
conclusivos e estudos posteriores teriam que ser realizados para ampliar o conhecimento além
do que pode ser concluído com unicamente os dados apresentados. O papel do hipocampo é
realmente importante para compreender a dependência às drogas, dado a conexão que existe
entre Ss presentes no ambiente e o uso de uma droga que poderiam ser induzidos por
plasticidade nesta área (Dacher & Nugent, 2011).
Os resultados para os subnúcleos BLA, CeA e MeA da amígdala são interessantes
para os objetivos deste experimento. Segundo Blundell et al. (2001) e Corbit et al. (2001), a
BLA e o Shell estariam diretamente involucrados na PIT específica, e a CeA e o Core estão
implicados na PIT generalizada (Hall et al., 2001; Holland & Gallagher, 2003). Na BLA se
encontraram diferenças significativas entre o grupo CO comparado com o CP e Ctr,
observando a tendência que tem aparecido em outras subáreas em relação à expressão de
FosB (CO>CP>Ctr). Como mencionado previamente, a BLA possui conexões eferentes
138
dirigidas ao NAc que ajudam a mediar a motivação, e se acredita esteja implicada na
aprendizagem relacionada a estímulos ambientais/contextuais (Martinez et al, 2011; Setlow,
et al., 2002). Este resultado é sem precedentes, pois nos estudos prévios como os de Perrotti
et al. (2008) e Wistanley et al. (2007), não foi avaliada esta subárea ou as outras da amígdala
para ver as diferenças na expressão de FosB na autoadministração e administração passiva
de COC. Segundo este resultado para a BLA, é possível que esta subárea pudesse estar
implicada em resultados comportamentamentais deste experimento, como que o grupo CO
teve uma maior frequência de respostas e ID na presença de S1 em comparação com o CP.
Na CeA mostraram diferenças no grupo CO comparado com o CP e com Ctr, sendo a
expressão de FosB significativamente maior em CO e praticamente igual entre CP e Ctr.
Isto sugere que o efeito farmacológico da COC não tem um efeito relevante na expressão de
FosB na CeA, mas sim na contingência é administrada, sendo induzida apenas pela CO.
Estes resultados na BLA e CeA foram similares no Experimento 1, o que poderia sugerir a
generalização para outras drogas, pelo menos outros opioides e derivados da COC.
Adicionalmente, como pode ser observado nas medições após da Fase 4 (Fig. 33), os
resultados sugerem que a BLA e a CeA se encontram estreitamente ligadas ao processo de
aprendizagem ou associação quando a COC é autoadministrada cronicamente por CO, pois os
níveis das células imunorreativas por mm² se estabilizaram na medição após a Fase 4 ao
mesmo nível que o as marcações no grupo CO na medição após a Fase 2.
Finalmente, os resultados obtidos na MeA não mostram diferenças estatisticamente
significativas entre grupos, sendo similares as medições para todos estes. Dado que as
medições realizadas após a Fase 4 não mostram diferenças com as realizadas após a Fase 2,
sendo similar ao observado nesta subárea no Experimento 1, parece ser que CeA não está
139
implicada na aprendizagem relacionada à dependência às drogas, nem é afetada
diferencialmente em relação à expressão de FosB por CO ou CP.
Winstanley et al. (2007), reportaram que a expressão de ΔFosB, após de
autoadministração, mas não de administração passiva, no OFC. De forma similar, no
Experimento 3 se reporta uma diferença significativa entre estes dois grupos, sendo
claramente maior em CO, comparado com CP. Porém, contrário ao reportado nesse estudo,
neste experimento também se obteve marcação no grupo CP, o qual poderia ser explicado por
diferenças delineamento experimental, tendo em conta que no estudo de Winstanley et al.
(2007) o grupo CP recebeu injeções intraperitoneais e não foi um esquema acoplado com
infusões i.v acompanhadas de um S, como no presente estudo. Segundo esta ordem de ideias,
os resultados sugerem que a contingência S1-droga aprendida durante a contingência
Pavloviana a que teria induzido a expressão de ΔFosB no grupo CP, o que não se conseguiria
unicamente com uma administração passiva por meio injeções de COC.
Como mencionado anteriormente, a expressão gênica pode ser maior em algumas
subáreas cerebrais quando os sujeitos receberam a droga em contingência operante,
comparados com sujeitos que a receberam em contingência Pavloviana (Choi et al., 2011;
Jacobs et al., 2002, 2003, 2005; Krawczyk, 2002; Kuzmin & Johansson, 1999; Lüscher &
Malenka, 2011; Miguéns et al., 2008; Nestler, 2012; Thomas et al., 2003; Winstanley et al.,
2007). Esta expressão gênica tem sido reportada em áreas do SNC implicadas na regulação
do reforço de drogas, como PFC e OFC, nas que drogas como a COC e morfina aumentam a
sensibilidade aos efeitos reforçadores e de ativação locomotora (Colby et al., 2003;
Winstanley, 2007; Zachariou et al., 2006). Coerente com esses dados, os resultados de
Experimento 3 mostram que existem diferenças na expressão de FosB, em áreas cerebrais
implicadas na dependência às drogas, entre os sujeitos que receberam COC em contingência
140
operante e os que receberam a mesma em contingência Pavloviana, assim como dos sujeitos
do grupo Ctr.
Em resumo, os resultados imunohistoquímico obtidos no Experimento 3 estão em
concordância com dados reportados previamente na bibliografia em relação diferenças da
expressão de FosB no OFC (Perrotti et al., 2008; Winstanley et al., 2007). Adicionalmente,
foram obtidos resultados similares para outras subáreas que não foram reportadas
previamente em outros estudos por terem uma expressão de ΔFosB afetada de forma
diferencial pela contingência operante ou Pavloviana na administração repetida de COC,
como o DG do hipocampo, a BLA e a CeA. Adicionalmente, os dados comportamentais
mostraram a transferência, replicando estudos prévios (Kruzic, Congelton & See, 2001;
LeBlanc, Ostlund & Maidment, 2012; Saddoris et al., 2011).
O grupo CP apresentou PIT com o delineamento experimental utilizado, sendo um
excelente indicador do procedimento utilizado, replicando estudos que tem mostrado o
surgimento de PIT em estudos com COC (Kruzic, Congelton & See, 2001; LeBlanc, Ostlund
& Maidment, 2012; Saddoris et al., 2011). Ainda, no estudo de LeBlanc et al., 2012, o qual
também utilizou duas barras para separar as respostas de busca e de autoadministração,
também se reporta uma maior frequência de respostas na resposta de autoadministração
quando o S associado ao efeito da COC foi apresentado durante o teste de transferência.
Resultados como esse em comum com outros estudos mostram consistência no procedimento.
Ainda, os resultados comportamentais mostraram que os sujeitos do grupo CO
apresentaram uma frequência de respostas total e na presença de S1 maior em comparação
com o grupo CP. De forma similar, o ID total e durante a apresentação de S1 foi maior no
grupo CO na resposta de busca, comparado com o CP, e a latência de respostas na barra B foi
141
menor no grupo CO, comparado com o CP. Adicionalmente, na presença de S1, o grupo CP
apresentou um ID na barra A maior em comparação com o grupo Ctr.
Alguns dos resultados imunohistoquímico apoiam com os resultados comportamentais
e sugerem que a maior expressão de FosB no LO e na BLA no grupo CO em comparação ao
CP, estejam relacionados às diferenças entre estes grupos no controle de estímulos
estabelecido por S1 para estes dois grupos, em relação ao ID atingido na presença deste, e
pela diferença entre estes dois grupos na frequência e latência de resposta na barra B.
Poucos estudos são realizados com os fatores considerados no presente estudo para
tentar obter um modelo adequado de estudo de controle de estímulos na autoadministração e
administração passiva de drogas, pois existe um grande custo e variáveis a serem
consideradas ao trabalhar com PIT (Cartoni et. al 2016), assim como inumeráveis
dificuldades que acarretam os procedimentos em si ao estudar controle de estímulos neste
paradigma (LeBlanc et al., 2012).
Estudos posteriores devem ser realizados para conferir os dados aqui apresentados e
brindar valiosa informação complementar ao papel que estas subáreas têm na dependência às
drogas e como estas podem ser afetadas ou não de forma diferencial pela história de
administração de uma droga em contingência operante ou Pavloviana.
142
Discussão Geral
Diferentes abordagens da dependência às drogas parecem concordar em atribuir aos
estímulos ambientais papel determinante sobre a autoadministração, procura por drogas e
recaída observadas em sujeitos dependentes (e.g. Everitt & Robbins, 2005; Kalivas &
O'Brien, 2008; Kalivas, Peters, & Knackstedt, 2006; Robinson & Berrigde 2003; Siegel &
Ramos, 2002). Porém, alguns autores propõem que são as relações pavlovianas estímulo-
droga (CS-US) estabelecidos durante a procura e consumo da droga que determinariam a
dependência a uma droga (Bachteler et al., 2005; Robinson & Berridge, 1993, 2003, 2008),
enquanto outros defendem que são as relações operantes estímulo-resposta-droga (SD-R-SR)
as que determinariam esses comportamentos (Chen et al., 2008; Melzack, 1990; Stefanski et
al., 1999). Os resultados aqui obtidos não parecem apoiar nenhuma das propostas em termos
de priorizar um ou outro processo de aprendizagem como determinante da dependência de
drogas e oferecem um panorama alternativo a essa dicotomia.
Os resultados apresentados poderiam ajudar a dar uma explicação a perguntas como
por que diferentes autores (e corpos teóricos) apontam e mostram resultados contraditórios,
indicando que seriam as associações aprendidas durante a contingência Pavloviana ou as
associações aprendidas durante a contingência operante as que levariam à dependência às
drogas. Como mencionado na introdução desta tese, é possível que a resposta não se ache
focando nos argumentos dados por estes estudos para tentar mostrar que é a contingência
operante ou a Pavloviana a responsável pela dependência a uma droga. Existem fatores em
comum entre estes autores/estudos, que não são contraditórios e que estão em concordância
com os resultados de inumeráveis pesquisas nas áreas da análise do comportamento e das
neurociências.
A controvérsia entre propostas sobre o desenvolvimento de dependência durante a
interação com uma droga em contingência Pavloviana ou operante pode ser consequência de
143
diferentes paradigmas, pois com tantas variações possíveis não é de surpreender que se
obtenham resultados diferentes e aparentemente opostos, dependendo de fatores como o tipo
de PIT reportada, seletiva ou generalizada (Corbit & Balleine, 2005; 2011), a ordem dos
treinos operantes e Pavlovianos, a substância e dose usada como reforçador (ou punidor no
caso da devaluação), sujeitos de estudo, entre outros (Holmes, Marchand & Coutureau,
2010). Os resultados do presente experimento não teriam sido possíveis de obter se o
delineamento experimental não incluísse a separação das respostas. No estudo prévio
realizado no laboratório (Patarroyo et al., 2014), ao não ter a divisão de respostas, os
resultados indicaram a ausência de PIT em um protocolo muito similar ao aqui realizado,
porém, sem a divisão das respostas de busca e autoadministração.
Os resultados de expressão de FosB obtidos nas Fases 1 do Experimento 1 e 3 estão
em concordância com estudos que reportam que a administração repetida de uma droga em
contingências operantes ou pavlovianas alteram diferencialmente a expressão desta em
estruturas cerebrais envolvidas nos processos da dependência às drogas (e.g. Saddoris et al,
2011; West & Carelli, 2016). Perrotti et al. (2008), reportam que a autoadministração de COC
ocasiona uma expressão de FosB no NAc Core e Shell igual à que ocasiona a administração
passiva da mesma, indicando que para estas subáreas a indução deste IEG se dá em função do
efeito farmacológico e não da contingência na qual uma droga é administrada, porém, estes
mesmos autores reportam que a autoadministração de COC ocasiona uma expressão maior de
FosB no OFC que a que ocasiona a administração passiva da mesma, indicando que para
esta subárea não unicamente à exposição à COC a que causou a expressão de FosB, mas a
contingência na qual a droga foi administrada.
De forma similar, Jacobs et al. (2005) reportaram uma maior expressão de FosB no
NAc Core na contingência operante de heroína, que na contingência Pavloviana desta. O
144
Experimento 1 registrou este mesmo dado empregando infusões de morfina, outro opioide,
sugerindo que talvez este efeito se possa generalizar para outras drogas, pelo menos outros
opioides. No Experimento 1 foi encontrado que a contingência operante ocasionou uma
maior expressão de FosB que a contingência Pavloviana em outras subáreas, além do NAc
Core, como o PrL, Core, CA3, BLA e CeA, as quais não têm sido reportadas previamente em
estudos similares medindo a expressão de FosB entre a contingência operante e Pavloviana
de drogas. Comparativamente, no Experimento 3, foi encontrado que a contingência operante
ocasionou uma maior expressão de FosB que a contingência Pavloviana no OFC, resultado
que replica o reportado em Winstanley et al. (2007). Este mesmo resultado também se
observou em áreas não reportadas previamente, o DG do hipocampo, a BLA e a CeA.
Os resultados também mostram algumas subáreas em comum (a BLA e a CeA) em
que a contingência operante de morfina e COC ocasionaram uma forte marcação de FosB
que a contingência Pavloviana destas mesmas, e alguma subáreas que só foram afetadas
diferencialmente pela contingência operante ou Pavloviana de morfina (NAc Shell, CA3) ou
COC (OFC, IL e DG). Esses dados podem indicar efeito específicos da droga, corroborando e
ampliando dados da literatura de que diferentes drogas podem causar a expressão de FosB
em diferentes subáreas Perrotti et al. (2008).
Em conjunto, os resultados dos experimentos 1 e 3 mostraram que a contingência na
qual uma droga é administrada, operante ou Pavloviana, pode induzir de forma diferencial a
expressão de FosB em diferentes áreas cerebrais. A literatura reporta o NAc (Goto & Grace,
2008), a Amígdala (Corbit and Balleine, 2005) e o PFC (Ostlund & Balleine, 2007), como
estruturas envolvidas dos processos de PIT, e os dados comportamentais dos experimentos 2
e 3 apontam uma conexão entre estas áreas envolvidas na PIT e a expressão de FosB
induzida por diferentes contingências de administração de drogas, pois coincidem com áreas
145
em que se acharam diferenças entre os grupos CO e CP nos experimentos 1 e 3. Ainda, em
estruturas como o NAc, a literatura reporta que existe uma conexão direta entre aumento na
autoadministração de uma droga e o aumento na expressão de FosB (Olsen, 2011; Robinson
& Nestler, 2011; Ruffle, 2014).
Saddoris et al. (2011), mostraram que durante o teste de transferência de PIT a
atividade de neurônios no NAc aumentou em animais que se autoadministraram COC e que
receberam esta passivamente em comparação com o grupo controle. Os autores reportam que
no grupo que pasou pelo treino da contingência operante, os neurônios do Core, em
comparação com os do Shell, foram principalmente ativados na presença do CS, na presença
de um reforçador e durante a tarefa operante, sendo esta codificação no Core correlacionada
com o nível de transferência mostrado no teste de transferência da PIT. Por outro lado, em
ratos experimentalmente ingênuos, apenas os neurônios do Shell responderam ante US. De
acordo com o autor, seus dados indicariam que a atividade do Core está envolvida na
aquisição de informação sobre o S no ambiente e a contingência ao responder, enquanto que
o Shell seria importante para usar essas informações para modular o comportamento, sendo
especialmente afetado pela contingência de administração de uma droga, indicando que em
termos de atividade neuronal, ainda que ambos os subnúcleos do NAc se ativem na presença
de um CS ou US, o Core estaria mais envolvido na contingência operante e o Shell mais
envolvido na Pavloviana
Destaca-se a semelhança entre os grupos CO e CP em relação à expressão de FosB
para ambas as subáreas do NAc, Core e Shell, no Experimento 3, pois, a diferença dos
resultados tão característicos do Experimento 1, a administração de morfina sob as
contingências operantes e pavlovianas ocasionaram diferenças marcantes na expressão de
FosB no Shell. Uma possível explicação para a diferença encontrada entre os resultados dos
experimentos e as propriedades de droga e os efeitos que produz no organismo, pois segundo
146
o segundo experimento de Perrotti et al. (2008), ao comparar expressão de FosB induzida
por diferentes drogas em diferentes subáreas cerebrais, cada droga pode pode induzir FosB
em diferentes subáreas. Ainda, o segundo experimento do estudo destes autores e o estudo de
Winstanley et al. (2007) mostram que as contingências sob as quais uma droga é
administrada tem um efeito diferencial na indução de FosB em algumas subáreas cerebrais.
Portanto, segundo esta lógica, é apenas razoável que os resultados de comparação entre
contingências de administração de duas drogas se tenham apresentado em diferentes
subáreas.
Mesmo que este estudo não pretendeu comparar as diferenças em expressão de FosB
causadas pela contingência operante ou Pavloviana entre morfina e COC, é interessante
destacar, que como reportado por Perrotti et al. (2008), diferentes drogas produzem expressão
de FosB em diferentes subáreas. Pois os resultados do Experimento 3, utilizando COC, que
mostraram diferenças de expressão deste IEG produzidas pelas contingências estudadas,
operante e Pavloviana, são em subáreas diferentes às reportadas no Experimento 1, no qual
foi utilizada morfina. Adicionalmente, como apontado por Holmes et al. (2010) as variações
importantes no delineamento (droga utilizada, dosagem, procedimento, modelo, ordem dos
treinos, etc), são fatores que influiriam importantemente nos estudos que avaliam o controle
de estímulos usando um procedimento com tantas variações como a PIT.
Na literatura se considera FosB como o mais importante mecanismo biomolecular
nos estudos de dependência às drogas pois tem sido reportado que aumentos na
autoadministração de uma droga são dependentes da expressão deste IEG no NAc (Olsen,
2011; Robinson & Nestler, 2011; Ruffle, 2014), porém, estes estudos têm focado no efeito
central que produz uma droga durante a autoadministração e portanto os resultados são em
relação a um protocolo simples de autoadministração e não em comparação de contingências
147
de administração. De fato, Nestler (2012, 2014) e Ruffle (2014) sugerem que o FosB seria
uma espécie de “interruptor molecular”, que ajuda iniciar e manter o estado de dependência
em um organismo. Isto indica que ainda que a expressão de FosB induzida por uma droga
possa estar diretamente relacionada com o aumento da autoadministração da mesma, não
necessariamente esta expressão indica o desenvolvimento de dependência ou de controle de
estímulos, pois se fosse desse jeito, não existiriam as diferenças de expressão deste IEG em
diferentes subáreas e dadas por diferentes drogas, como apontado por Perrotti et al. (2008) e
Winstanley et al. (2007). Ainda, segundo este raciocínio, durante um procedimento como o
utilizado neste estudo, a expressão de FosB durante a Fase 2 poderia predizer unicamente de
forma parcial os resultados comportamentais da Fase 4.
No experimento 3, as medições imunohistoquímicas após da Fase 4 foram maiores
para a maioria das subáreas em comparação com as medições realizadas na Fase 2. Ainda,
estas medições na Fase 4 não revelaram diferença entre grupos, o que parece indicar que a
autoadministração da droga na Fase 3 induziu a expressão de FosB entre os grupos ao ponto
de “igualar” o nível de expressão, apoiando a proposta de Nestler, (2012) sobre estabilidade
de acumulação gradativa deste IEG produzida pela administração repetidas de uma droga.
Por outro lado, na Fase 4 houve diferenças importantes de comportamento entre os animais
dos diferentes grupos no Experimentos 2 e 3, que sugerem que o a expressão de FosB está
relacionado não unicamente ao aumento nas respostas de autoadministração de uma droga,
mas também depende da contingência em que esta droga foi administrada inicialmente,
podendo influenciar vaiáveis como ID e latência de resposta.
Tanto no Experimento 2, como no 3, o grupo CP apresentou PIT durante o teste de
transferência, replicando estudos que mostram esta transferência em estudos com drogas
(Kruzic, Congelton & See, 2001; LeBlanc, Ostlund & Maidment, 2012; Saddoris et al.,
148
2011). Ainda, os resultados de estes experimentos apontam ao surgimento de um padrão de
respostas, de forma diferencial entre os grupos CO e CP durante o teste de transferência. Esta
tendência se sustenta nos dados de IDs e de frequência de respostas e de latência de respostas
quando S1 foi apresentado, sugerindo que a contingência operante ocasionou uma tendência a
responder na barra B.
Como exposto na introdução, se considera que o esquema acoplado (Catania, 1999;
Sanchis-Segura& Spanagel, 2006) é o mais adequando para um estudo como o presente,
porém, deve ir acompanhado de métodos como a implantação de cateter para infusões i.v.
para garantir a administração da droga sem a interrupção do procedimento, de uma forma
rápida, asséptica e sem dor, assim como da implementação de uma separação de respostas
(busca e autoadministração) do processo que levam a administração de uma droga (Sanchis-
Segura & Spanagel, 2006), que como visto nos resultados apresentados, pode brindar dados
relevantes para a compreensão do controle de estímulos na dependência às drogas, tendo em
conta que não todas as respostas no processo de consumo de uma droga são afetadas da
mesma forma por estímulos que foram associados a estas em diferentes histórias de
associação.
Os resultados dos três experimentos apresentados nesta tese aportam valiosos dados
desde a perspectivas comportámemtal e bioquímica para o entendimento sobre o controle de
estímulos e a dependência às drogas. Eles estão em concordância com a bibliografia que
suporta que a contingência operante e Pavloviana são processos diferentes de aprendizagem,
como discutido por Pear e Eldridge (1984), Rescorla e Solomon (1967), Rehfeldt e Hayes,
1998, e Skinner (1937), entre outros; e portanto, ainda tendo propriedades em comum,
poderiam influenciar diferencialmente um organismo, especialmente no caso da dependência
às drogas.
149
Conclusões
Desde os estudos de Estes e Skinner (1941) reportando que um S associado com
comida podia aumentar a frequência de uma resposta operante que tinha também comida
como consequência, e a proposta dos dois processos por Rescorla e Solomon (1967), muito se
tem descoberto sobre o controle de estímulos e a sua relevância na dependência às drogas, e
muitas mais incógnitas têm surgido também em relação a estes novos conhecimentos. Se
considera que os objetivos de todos os experimentos foram atingidos durante o
desenvolvimento deste projeto de doutorado. Os resultados dos três experimentos
apresentados nesta tese aportam valiosos dados desde a perspectivas comportamental e
bioquímica para o entendimento sobre o controle de estímulos e a dependência às drogas.
Eles estão em concordância com a bibliografia que suporta que a contingência operante e
Pavloviana são processos diferentes de aprendizagem e, portanto, podem influenciar
diferencialmente um organismo, especialmente em casos como a dependência às drogas. Os
resultados apresentados não só replicam dados de estudos prévios na área, mas aportam dados
novos, não reportados previamente, que se complementam entre si. Ainda foi desenvolvido
um procedimento melhorado para o estudo da contingência operante e Pavloviana de drogas,
mostrando a sua eficácia e consistência.
Os dados em relação à expressão de FosB podem brindar informações valiosas em
relação a processos como aquisição, manutenção e recaída, na dependência às drogas. Mesmo
que não se conhece totalmente seu funcionamento, vale a pena destacar a proposta de Nestler
(2012, 2014) e Ruffle (2014), a qual sugere que o FosB pode ser uma espécie de
“interruptor molecular”, que ajuda iniciar e manter o estado de dependência em um
organismo.
Que além de todas as subáreas em que a autoadministração em contingência operante
causou uma maior expressão de FosB do que a administração passiva em contingência
150
Pavloviana, no Experimento 1, se tenha achado que a contingência Pavloviana causou uma
maior expressão no NAc Shell e no DG, do que a operante, é um resultado que sugere que as
diferenças produzidas em um organismo na aprendizagem que se adquire durante diferentes
histórias de administração de drogas em contingência operante ou Pavloviana, não são
questão de “tudo ou nada”, nem tampouco apresentadas unicamente por uma das
contingências, mas diferentes em relação ao que implica a aprendizagem em cada tipo de
contingência. Isto é apoiado pelos resultados imunohistoquímico do Experimento 3, que
mostraram de forma similar maior expressão no LO, BLA e CeA, e ainda, em conjunto,
replicam e ampliam dados do estudo de Perrotti et al. (2008) que mostram que diferentes
drogas podem induzir a expressão de FosB em diferentes subáreas do SNC relacionadas à
administração de drogas.
De forma indubitável, a inclusão de medidas como IEGs brinda um complemento
ideal ao estudo da dependência às drogas se articulando aos dados comportamentais. Como
mostrado nos resultados apresentados, os dados comportamentais e bioquímicas estão em
concordância entre si, mostrando a compatibilidade e o complemento entre medidas ao
estudar a dependência às drogas.
Por outro lado, se tem proposto neste estudo que a PIT é relevante para a compreensão
dos comportamentos controlados por estímulos ambientais, como comer, beber e consumir
drogas. Dado que o procedimento e o delineamento experimentais utilizados permitiram a
aparição de PIT, se propõem como indicados e adequados para estudar a PIT como processo
básico do comportamento.
Ainda, dentro do limite da bibliografia conhecida, esta é o primeiro estudo
experimental que reporta que a contingência operante e a Pavloviana de uma droga tenha
ocasionado diferentes padrões de respostas, preferência na resposta de busca no grupo CO, e
151
preferência na resposta de autoadministração no grupo CP. Adicionalmente, também é a
primeira vez que se reporta a apresentação de PIT com autoadministração i.v de morfina.
Futuros experimentos poderão utilizar o procedimento aqui desenvolvido indagando
questões que vão além das exploradas neste estudo, aperfeiçoando o procedimento e
adaptando este. Muito pode ser modificado ou adaptado no procedimento em pró de atingir
formas mais adequadas para diferentes questões sobre a dependência às drogas, por exemplo,
a possibilidade de dividir o comportamento de consumo de drogas em mais do que dois
respostas, uso de outras drogas além das clássicas nos estudos de dependência (incluindo
drogas modernas que afetam a saúde da população e a combinação de drogas), uso de
aparelhos que permitam o registro de resposta 24/7 (como as caixas de alojamento com
sistema de infusão), uso de machos e fêmeas, acesso a um ambiente enriquecido, entre outras.
Como cientistas devemos estar cientes das limitações dos nossos estudos, modelos e
procedimentos, que tentam replicar condições naturais isolando variáveis de forma artificial
para ter controle experimental, portanto é imprescindível aumentar as variáveis observadas
simultaneamente para tentar ter uma visão mais molar e natural dos mesmos fenômenos que
estudamos.
152
Referências
Alarcón, D. E., Bonardi, C., & Delamater, A. R. (2018). Associative mechanisms involved in
specific Pavlovian-to-instrumental transfer in human learning tasks. Quarterly Journal
of Experimental Psychology, 71(7), 1607-1625. doi:
10.1080/17470218.2017.1342671.
Alexander, B. K., Coambs R. B., & Hadaway, P. F. (1978). The effects of housing and
gender on morphine self-administration in rats. Psychopharmacology, 58(2), 175–
179. doi: 10.1007/BF00426903.
Ambroggi, F., Ghazizadeh, A., Nicola, S. M., & Fields, H. L. (2011). Roles of Nucleus
Accumbens Core and Shell in Incentive-Cue Responding and Behavioral Inhibition.
Journal of Neuroscience,31(18), 6820-6830. doi: 10.1523/jneurosci.6491-10.2011.
Arroyo, M., Markou, A., Robbins, T. W., & Everitt, B. J. (1998). Acquisition, maintenance
and reinstatement of intravenous cocaine self-administration under a second-order
schedule of reinforcement in rats: Effects of conditioned cues and continuous access
to cocaine. Psychopharmacology, 140(3), 331-344. doi: 10.1007/s002130050774.
Bachá-Méndez, G., Reid, A. K., & Mendoza-Soylovna, A. (2007). Resurgence of Integrated
Behavioral Units. Journal of the Experimental Analysis of Behavior, 87(1), 5-24. doi:
10.1901/jeab.2007.55-05.
Badiani, A., Oates, M. M., & Robinson, T. E. (2000). Modulation of morphine sensitization
in the rat by contextual stimuli. Psychopharmacology, 151(2-3), 273–282. doi:
10.1007/s002130000447.
Balleine, B., 1994. Asymmetrical interactions between thirst and hunger in pavlovian-
instrumental transfer. Q. J. Exp. Psychol. B, Comp. Physiol. Psychol. 47 (2), 211–231.
153
Balleine, B. W., & Ostlund, S. B. (2007). Still at the choice-point: action selection and
initiation in instrumental conditioning. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1104, 147–171.
Barbey, A. K., Krueger, F., & Grafman, J. (2009). Structured event complexes in the medial
prefrontal cortex support counterfactual representations for future planning.
Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences,364(1521),
1291-1300. doi: 10.1098/rstb.2008.0315.
Barnes-Holmes, D., & Barnes-Holmes, Y. (2000). Explaining Complex Behavior: Two
Perspectives on the Concept of Generalized Operant Classes. The Psychological
Record, 50(2), 251-265. doi: 10.1007/bf03395355.
Barrientos, S. A., & Tiznado, V. (2016). Hippocampal CA1 Subregion as a Context Decoder.
The Journal of Neuroscience, 36(25), 6602-6604. doi: 10.1523/jneurosci.1107-
16.2016.
Bachteler, D., Economidou, D., Danysz, W., Ciccocioppo, R., & Spanagel, R. (2005). The
Effects of Acamprosate and Neramexane on Cue-Induced Reinstatement of Ethanol-
Seeking Behavior in Rat. Neuropsychopharmacology, 30(6), 1104-1110.
doi:10.1038/sj.npp.1300657.
Baxter, D. J., & Zamble, E., (1982). Reinforcer and response specificity in appetitive transfer
of control. Anim. Learn. Behav. 10 (2), 201–210.
Berridge, K. C., Robinson, T. E., & Aldridge, J. W. (2009). Dissecting components of
reward: ‘liking’, ‘wanting’, and learning. Current Opinion in Pharmacology, 9(1),
65–73. doi: 10.1016/j.coph.2008.12.014.
154
Berridge, K. C., & Robinson, T. E. (2016). Liking, wanting, and the incentive-sensitization
theory of addiction. American Psychologist, 71(8), 670-679. doi:
10.1037/amp0000059.
Bindra, D. (1972). A unified acount of classical conditioning and operant Training. In:
A. H. Black & W. F. Prokasy (Eds.), Classical conditioning II. New York:
Appleton-Century-Crofts.
Blundell, P., Hall, G., & Killcross, S. (2001). Lesions of the basolateral amygdala disrupt
selective aspects of reinforcer representation in rats. J. Neurosci. 21 (22), 9018–9026.
Burgos, J. E. (2018). Selection by reinforcement: A critical reappraisal. Behavioural
Processes. http://doi.org/10.1016/j.beproc.2018.01.019.
Canteras, N. S., & Goto, M. (1999). Connections of the precommissural nucleus. J. Comp.
Neurol. 408(1), 23-45. doi: 10.1002/(SICI)1096-9861(19990524)408:1<23::AID-
CNE3>3.0.CO;2-J.
Catania, A. (1999). Aprendizagem: Comportamento, Linguagem e Cognição (Deisy das
Graças de Souza, Trad.). Porto Alegre: Artmed Editora.
Cardinal, R. N., & Cheung, T. H. (2005). Nucleus accumbens core lesions retard instrumental
learning and performance with delayed reinforcement in the rat. BMC Neurosci;6:9.
Cardinal, R. N., Parkinson, J. A., Hall, J., & Everitt, B. J. (2002). Emotion and motivation:
The role of the amygdala, ventral striatum, and prefrontal cortex. Neuroscience &
Biobehavioral Reviews, 26(3), 321-352. doi: 10.1016/s0149-7634(02)00007-6.
Carlson, N. (2012). Physiology of behavior. Pearson. p. 336. ISBN 978-0205239399.
Cartoni, E., Balleine, B., & Baldassarre, G. (2016). Appetitive Pavlovian-instrumental
Transfer: A review. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 71, 829-848.
155
Chen, B. T., Bowers, M. S., Martin, M., Hopf, F. W., Guillory, A. M., Carelli, R. M., Chou,
J. K., & Bonci, A. (2008). Cocaine but not natural reward self-administration nor
passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron, 59, 288-297.
doi: 10.1016/j.neuron.2008.05.024.
Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R., & O'Brien, C. P. (1988). Classically conditioned
responses in opioid and cocaine dependence: A role in relapse? In B. A. Ray, Learning
factors in substance abuse. NIDA Research Monograph No. 84, pp. 44-61. Washington,
DC: U.S. Government Printing Office. PMID: 3147384.
Choi, K. H., Edwards, S., Graham, D. L., Larson, E. B., Whisler, K. N., Simmons, D.,
Friedman, A. K., Walsh, J. J., & Rahman, Z. (2011). Reinforcement-Related
Regulation of AMPA Glutamate Receptor Subunits in the Ventral Tegmental Area
Enhances Motivation for Cocaine. Journal of Neuroscience, 31(21), 7927-7937. doi:
10.1523/JNEUROSCI.6014-10.2011.
Christie, M. J. (2008). Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal
and addiction. British Journal of Pharmacology, 154(2), 384-396. doi:
10.1038/bjp.2008.100.
Cicero, T. J., Aylward, S. C., & Meyer, E. R. (2003). Gender differences in the intravenous
self-administration of mu opiate agonists. Pharmacology, Biochemistry, and
Behavior, 74(3), 541-549. doi: 10.1016/S0091-3057(02)01039-0.
Colby, C. R., Whisler, K., Steffen, C., Nestler, E. J, & Self, D. W. (2003). Striatal cell type-
specific overexpression of FosB enhances incentive for cocaine. J Neurosci
23:2488–2493.
156
Colwill, R. M., & Rescorla, R. A. (1985). Instrumental responding remains sensitive to
reinforcer devaluation after extensive training. Journal of Experimental Psychology:
Animal Behavior Processes, 11(4), 520.
Colwill, R.M., & Rescorla, R.A. (1988). Animal Learning & Behavior. 16: 105.
https://doi.org/10.3758/BF03209051.
Comer, S. D., Zacny, J. P., Dworkin, R. H., Turk, D. C., Bigelow G. E., Foltin R. W., et al.
(2012). Core outcome measures for opioid abuse liability laboratory assessment
studies in humans: IMMPACT recommendations. Pain, 153(12), 2315-2324. doi:
10.1016/j.pain.2012.07.035.
Corbit, L. H., Muir, J. L., & Balleine, B.W. (2001). The role of the nucleus accumbens in
instrumental conditioning: evidence of a functional dissociation between accumbens
core and shell. J. Neurosci. 21, 3251–3260.
Corbit, L. H., & Balleine, B. W. (2003a). The role of prelimbic cortex in instrumental
conditioning. Behavioural Brain Research, 146(1-2), 145-157. doi:
10.1016/j.bbr.2003.09.023
Corbit, L. H., & Balleine, B. W. (2003b). Instrumental and Pavlovian incentive processes
have dissociable effects on components of a heterogeneous instrumental chain.
Journal of Experimental Psychology: Animal Behavior Processes, 29(2), 99-106. doi:
10.1037/0097-7403.29.2.99.
Corbit, L. H., & Balleine, B.W. (2005). Double dissociation of basolateral and central
amygdala lesions on the general and outcome-specific forms of pavlovian-
instrumental transfer. J. Neurosci. 25 (4), 962–970.
157
Corbit, L. H., & Janak, P. H. (2007). Inactivation of the lateral but not medial dorsal striatum
eliminates the excitatory impact of Pavlovian stimuli on instrumental responding. J.
Neurosci. 27, 13977–13981.
Corbit, L. H., Janak, P. H., & Balleine, B.W. (2007). General and outcome-specific forms of
pavlovian-instrumental transfer: the effect of shifts in motivational state and
inactivation of the ventral tegmental area. Eur. J. Neurosci. 26 (11), 3141–3149.
Corbit, L. H., & Janak, P. H., (2010). Posterior dorsomedial striatum is critical for both
selective instrumental and pavlovian reward learning. Eur. J. Neurosci. 31 (7), 1312–
1321.
Corbit, L. H., & Balleine, B. W. (2011). The general and outcome-specific forms of
pavlovian-instrumental transfer are differentially mediated by the nucleus accumbens
core and shell. J. Neurosci. 31 (33), 11786–11794.
Criswell, H. E., & Ridings, A. (1983). Intravenous self-administration of morphine by naive
mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 18(3), 467-470. doi: 10.1016/0091-
3057(83)90471-9.
Crombag, H. S., Galarce, E. M., & Holland, P. C. (2008). Pavlovian influences on goal-
directed behavior in mice: the role of cue-reinforcer relations. Learn. Memory (Cold
Spring Harbor, N. Y.) 15 (5), 299–303.
Dacher, M., & Nugent, F. S. (2011). Opiates and plasticity. Neuropharmacology, 61(7),
1088-1096. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.01.028.
Delamater, A. R., & Oakeshott, S. (2007). Learning about Multiple Attributes of Reward in
Pavlovian Conditioning. Annals of the New York Academy of Sciences, 1104(1), 1-
20. doi: 10.1196/annals.1390.008.
158
Delgado, D., & Hayes, L. J. (2014). An Integrative Approach to Learning Processes:
Revisiting Substitution of Functions. The Psychological Record, 64(3), 625–637.
http://doi.org/10.1007/s40732-014-0071-6.
Devan, B. D., McDonald, R. J., & White, N. M. (1999). Effects of medial and lateral caudate-
putamen lesions on place- and cue-guided behaviors in the water maze: Relation to
thigmotaxis. Behavioural Brain Research, 100, 5–14.
Deroche-Gamonet, V. (2004). Evidence for Addiction-like Behavior in the Rat.
Science,305(5686), 1014-1017. doi: 10.1126/science.1099020.
De Vries, T. J., & Shippenberg, T. S. (2002). Neural systems underlying opiate
addiction. Journal of Neuroscience, 22(9), 3321-3325. PMID: 11978806.
Dickinson, A., & Dawson, G. R. (1987). Pavlovian processes in the motivational control of
instrumental performance. Q. J. Exp. Psychol. B, Comp. Physiol. Psychol. 39 (3),
201–213.
Dickinson, A., Smith, J., & Mirenowicz, J. (2000). Dissociation of Pavlovian and
instrumental incentive learning under dopamine antagonists. Behav. Neurosci. 114,
468–483.
Domjan, M. (2015). The Principles of Learning Behavior (7thed). Wadsworth Cengage
learning: Belmon.
Donahoe, J. W., Burgos, J. E., & Palmer, D. C. (1993). A Selectionist Approach to
Reinforcement. Journal of the Experimental Analysis of Behavior, 60(1), 17–40.
Donahoe, J. W., & Palmer, D. C. (1994). Learning and complex behavior. Allyn & Bacon.
159
Dwyer, C., Sowerby, L., & Rotenberg, B. W. (2016). Is cocaine a safe topical agent for use
during endoscopic sinus surgery? The Laryngoscope, 126(8), 1721-1723. doi:
10.1002/lary.25836.
El-Amamy, H., & Holland, P. C. (2007). Dissociable effects of disconnecting amygdala
central nucleus from the ventral tegmental area or substantia nigra on learned
orienting and incentive motivation. Eur. J. Neurosci. 25, 1557–1567.
Epstein, D. H., Preston, K. L., Stewart, J., & Shaham, Y. (2006). Toward a model of drug
relapse: an assessment of the validity of the reinstatement procedure.
Psychopharmacology (Berl), 189(1), 1-16. doi: 10.1007/s00213-006-0529-6
Goto, Y., & Grace, A. A. (2008). Limbic and cortical information processing in the nucleus
accumbens. Trends in Neurosciences, 31(11), 552-558. doi:
10.1016/j.tins.2008.08.002.
Ehrman, R. N., Robbins, S. J., Childress, A. R., & Obrien, C. P. (1992). Conditioned
responses to cocaine-related stimuli in cocaine abuse patients. Psychopharmacology,
107(4), 523-529. doi: 10.1007/bf02245266.
Everitt, B. J., Dickinson, A., & Robbins, T. W. (2001). The neuropsychological basis of
addictive behaviour. Brain Research Reviews, 36(2-3), 129-138. doi: 10.1016/s0165-
0173(01)00088-1.
Everitt, B. J., & Robbins, T. W. (2005). Neural systems of reinforcement for drug addiction:
from actions to habits to compulsion. Nature Neuroscience, 8(11), 1481–1489. doi:
10.1038/nn1579.
Everitt, B. J., Belin, D., Economidou, D., Pelloux, Y., Dalley, J. W., & Robbins, T. W.
(2008). Neural mechanisms underlying the vulnerability to develop compulsive drug-
160
seeking habits and addiction. Philosophical Transactions of the Royal Society B:
Biological Sciences, 363(1507), 3125-3135. doi: 10.1098/rstb.2008.0089.
Estes, W. K., & Skinner, B.F. (1941). Some quantitative properties of anxiety. J. Exp.
Psychol. 29 (5), 390–400.doi: 10.1037/11324-028.
Estes, W. K. (1943). Discriminative conditioning. I. A discriminative property of conditioned
anticipation. Journal of Experimental Psychology, 32(2), 150-155. doi:
10.1037/h0058316.
Estes, W. K. (1948). Discriminative conditioning; effects of a Pavlovian conditioned stimulus
upon a subsequently established operant response. Journal of Experimental
Psychology, 38(2), 173–177. doi: 10.1037/h0057525.
Fricker, R. A., Annett, L. E., Torres E. M., & Dunnett, S. B. (1996). The placement of a
striatal ibotenic acid lesion affects skilled forelimb use and the direction of drug-
induced rotation. Brain Research Bulletin, 41, 409–416.
Fuchs, R. A., Evans, K. A., Parker, M. C., & See, R. E. (2004). Differential involvement of
the core and shell subregions of the nucleus accumbens in conditioned cue-induced
reinstatement of cocaine seeking in rats. Psychopharmacology, 176(3-4), 459-465.
doi: 10.1007/s00213-004-1895-6.
Gajewski, P. A., Eagle, L. A., & Robison, A. J. (2017). Neuroscience of cocaine:
Mechanisms and treatment. Chapter 26 - The Role of the Hippocampus in Cocaine.
Responses London: Academic Press. p259 -268.
Goldberg, S. R., & Gardner, M. L. (1981). Second-order schedules: extended sequences of
behavior controlled by brief environmental stimuli associated with drug self-
161
administration. ehavioral Pharmacology of Human Drug Dependence, (37), 241 -70.
PMID: 6798462.
Goldberg, S. R., Spealman, R. D. &, Kelleher, R. T. (1979). Enhancement of drug-seeking by
environmental stimuli associated with cocaine or morphine injections.
Neuropharmacology, 18(12), 1015-1017. doi: 10.1016/0028-3908(79)90169-2.
Goldberg, S. R., & Schuster, C. R. (1967). Conditioned suppression by a stimulus associated
with nalorphine in morphine-dependent monkeys. Journal of the Experimental Analysis
of Behavior, 10(3), 235-242. doi: 10.1901/jeab.1967.10-235.
Goldberg, S. R., & Tang, A. H. (1977). Behavior maintained under second-order schedules of
intravenous morphine injection in squirrel and rhesus monkeys. Psychopharmacology
(Berl), 51(3), 235-242. doi: 10.1007/BF00431630.
Goto, Y., & Grace, A. A., (2005). Dopaminergic modulation of limbic and cortical drive of
nucleus accumbens in goal-directed behavior. Nat. Neurosci. 8, 805–812.
Hall, J., Parkinson, J. A., Connor, T. M., Dickinson, A., & Everitt, B. J. (2001). Involvement
of the central nucleus of the amygdala and nucleus accumbens core in mediating
Pavlovian influences on instrumental behaviour. European Journal of Neuroscience,
13(10), 1984-1992. doi: 10.1046/j.0953-816x.2001.01577.x.
Haney, R.Z., Calu, D,J., Takahashi, Y.K., Hughes, B.W., & Schoenbaum G. (2010).
Inactivation of the central but not the basolateral nucleus of the amygdala disrupts
learning in response to overexpectation of reward. J Neurosci. 30:2911–2917.
[PubMed: 20181588].
162
Harper, S. J., & Jones, N. S. (2006). Cocaine: What role does it have in current ENT
practice? A review of the current literature. The Journal of Laryngology & Otology,
120(10). doi: 10.1017/s0022215106001459.
Hayden, B. Y., & Platt, M. L. (2010). "Neurons in Anterior Cingulate Cortex Multiplex
Information about Reward and Action". Journal of Neuroscience. 30 (9): 3339–3346.
Heyman, G. M. (2010). Addiction: A disorder of choice. Cambridge, MA: Harvard
University Press.
Herrnstein, R. J., & Prelec, D. (1992). A theory of addiction. In G. Loewenstein & J. Elster
(Eds.), Choice over time (pp. 331-360). New York, NY, US: Russell Sage Foundation
Hinson, R. E., Poulos, C. X., Thomas, W., & Cappell, H. (1986). Pavlovian conditioning and
addictive behavior: Relapse to oral self-administration of morphine. Behavioral
Neuroscience, l 100(3), 368-375. doi: 10.1037/0735-7044.100.3.368.
Holland, P.C., & Gallagher, M. (2003). Double dissociation of the effects of lesions of
basolateral and central amygdala on conditioned stimulus-potentiated feeding and
Pavlovian-instrumental transfer. European Journal of Neuroscience. 17:1680–1694.
[PubMed: 12752386].
Holland, P. (2004). Relations Between Pavlovian-Instrumental Transfer and Reinforcer
Devaluation. Journal of Experimental Psychology. Animal Behavior Processes, 30(2),
104–117. doi: 10.1037/0097-7403.30.2.104.
Holmes, N. M., Marchand, A. R., & Coutureau, E. (2010). Pavlovian to instrumental transfer:
a neurobehavioural perspective. Neurosci. Biobehav. Rev. 34 (8), 1277–1295.
Hickey, C., & Peelen, M. V. (2015). Neural mechanisms of incentivesalience in naturalistic
human vision.Neuron, 85,512–518.http://dx.doi.org/10.1016/j.neuron.2014.12.049.
163
Hyman, S. E., & Malenka, R. C. (2001). Addiction and the brain: The neurobiology of
compulsion and its persistence. Nature Reviews Neuroscience. 2, 695-703. doi:
10.1038/35094560.
Hyman, S. E., Malenka, R. C., & Nestler, E. J. (2006). Neural mechanisms of addiction: the
role of reward-related learning and memory. Annual Review of Neuroscience, 29,
565-598. doi: 10.1146/annurev.neuro.29.051605.113009.
Hsu, S. M. & Raine, L. (1981). Protein A, avidin, and biotin in immunohistochemistry. J
Histochem Cytochem, 29(11), 1349-53. doi: 10.1177/29.11.6172466.
Itoh, K., Konishi A., Nomura S., Mizuno N., Nakamura Y. & Suguimoto T. (1979).
Aplication of coupled oxidation reaction to electron microscopic demonstration of the
horseradish peroxidase: cobalt-glucose oxidase method. Brain Res. 175, 341-346. doi:
10.1016/0006-8993(79)91013-8.
Jacobs, E. H., Smit, A. B., De Vries, T., J., & Schoffelmeer, A. N. (2003). Neuroadaptive
effects of active versus passive drug administration in addiction research. Trends
Pharmacological Sciences, 24(11), 566-573. doi: 10.1016/j.tips.2003.09.006.
Jacobs, E. H., Smit, A. B., De Vries, T., J., & Schoffelmeer, A. N. (2005). Long-Term Gene
Expression in the Nucleus Accumbens Following Heroin administration is subregion-
specific and depends on the nature of drug administration. Adiction Biology, (10), 91-
100. doi: 10.1080/13556210412331284748.
Jacobs, E. H., Spijker, S., Verhoog, C. W., Kamprath, K., De Vries, T. J., Smit, A. B. et al.
(2002). Active heroin administration induces specific genomic responses in the
nucleus accumbens shell. Federation of American Societies for Experimental Biology
Journal, 16(14), 1961–1963. doi: 10.1096/fj.02-0272fje.
164
Jacobs, E. H., Spijker, S., Verhoog, C. W., Kamprath, K., de Vries, T. J., Smit, A. B. et al.
(2002). Active heroin administration induces specific genomic responses in the
nucleus accumbens shell. Federation of American Societies for Experimental Biology
Journal, 16(14), 1961–1963. doi: 10.1096/fj.02-0272fje.
Katz, J. L. (1979). A comparison of responding maintained under second-order schedules of
intramuscular cocaine injection or food presentation in squirrel monkeys. Journal of
the Experimental Analysis of Behavior, 32(3), 419-431. doi: 10.1901/jeab.1979.32-
419.
Kalivas, P. W., & Obrien, C. (2008). Drug Addiction as a Pathology of Staged
Neuroplasticity. Neuropsychopharmacology, 33(1), 166-180. doi:
10.1038/sj.npp.1301564.
Kalivas, P. W., Peters, J., & Knackstedt, L. (2006). Animal Models and Brain Circuits in
Drug Addiction. Molecular Interventions, 6(6), 339-344. doi: 10.1124/mi.6.6.7.
Kesner, R. P. (2007). Behavioral functions of the CA3 subregion of the hippocampus.
Learning & Memory,14(11), 771-781. doi: 10.1101/lm.688207.
Kesner, R. P. (2013). An analysis of the dentate gyrus function. Behavioural Brain Research,
254, 1-7. doi: 10.1016/j.bbr.2013.01.012.
Keistler, C., Barker, J. M., & Taylor, J. R. (2015). Infralimbic prefrontal cortex interacts with
nucleus accumbens shell to unmask expression of outcome-selective Pavlovian-to-
instrumental transfer. Learning & Memory, 22(10), 509-514. doi:
10.1101/lm.038810.115
Koob, G. F. (1992). Dopamine, addiction and reward. Seminaris in Neuroscience, 4, 139–
148. doi: 10.1016/1044-5765(92)90012-Q.
165
Knierim, J. (2004). Faculty of 1000 evaluation for Recollection-like memory retrieval in rats
is dependent on the hippocampus. F1000 - Post-publication Peer Review of the
Biomedical Literature. doi: 10.3410/f.1020949.247667.
Kreek, M. J., Levran, O., Reed, B., Schlussman, S. D., Zhou, Y., & Butelman, E. R. (2012).
Opiate addiction and cocaine addiction: Underlying molecular neurobiology and
genetics. Journal of Clinical Investigation,122(10), 3387-3393. doi: 10.1172/jci60390.
Kruzich, P. J., Congelton, K. M., & See, R. E. (2001). Conditioned reinstatement of drug-
seeking behavior with a discrete compound stimulus classically conditioned with
intravenous cocaine. Behavioral Neuroscience,115(5), 1086-1092. doi:
10.1037//0735-7044.115.5.1086.
Kuzmin, A., & Johansson, B. (1999). Expression of c-Fos, NGFI-A and secretogranin II
mRNA in brain regions during initiation of cocaine self-administration in
mice. European Journal of Neuroscience, 11(10), 3694-3700. doi: 10.1046/j.1460-
9568.1999.00795.x.
Lansade, L., Coutureau, E., Marchand, A., Baranger, G., Valenchon, M., & Calandreau, L.
(2013). Dimensions of Temperament Modulate Cue-Controlled Behavior: A Study on
Pavlovian to Instrumental Transfer in Horses (Equus Caballus). PLoS ONE, 8(6). doi:
10.1371/journal.pone.0064853.
Lattal, K. Matthew, and Kennon A. Lattal. “Facets of Pavlovian and Operant Extinction.”
Behavioural Processes, vol. 90, no. 1, 2012, pp. 1–8., doi:
10.1016/j.beproc.2012.03.009.
LeBlanc, K. H., Ostlund, S. B., & Maidment, N. T. (2012). Pavlovian-to-instrumental transfer
in cocaine seeking rats. Behavioral Neuroscience, 126(5), 681-689. doi:
10.1037/a0029534.
166
Leung, B.K., & Balleine, B. W. (2015). Ventral pallidal projections to mediodorsal thalamus
and ventral tegmental area play distinct roles in outcome-specific pavlovian-
instrumental transfer. J. Neurosci. 35 (12), 4953–4964.
Lüscher, C., & Malenka, R. (2011). Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from
molecular changes to circuit remodeling. Neuron, 69(4), 650–663. doi:
10.1016/j.neuron.2011.01.017.
Martinez, R., Carvalho-Netto, E., Ribeiro-Barbosa, É, Baldo, M., & Canteras, N. (2011).
Amygdalar roles during exposure to a live predator and to a predator-associated
context. Neuroscience, 172, 314-328. doi: 10.1016/j.neuroscience.2010.10.033.
McDonald, R. V., & Siegel, S. (2004). The potential role of drug onset cues in drug
dependence and withdrawal. Experimental and Clinical Psychopharmacology, 12(1),
23-26. doi: 10.1037/1064-1297.12.1.23.
Melzack, R. (1990). The tragedy of needless pain. Scientific American, 262(2), 27-33. doi:
10.1038/scientificamerican0290-27.
Mierzejewski, P., Koroś, E., Goldberg, S. R., Kostowski, W., & Stefański, R. (2003).
Intravenous self-administration of morphine and cocaine: a comparative study. Pol J
Pharmacol. 55(5):713-26. ISSN 1230-6002.
Miguéns, M., Crespo, J. A., Del Olmo, N., Higuera-Matas, A., Montoya, G. L., Garcia-
Lecumberri, C., & Ambrósio, E. (2008). Differential cocaine-induced modulation of
glutamate and dopamine transporters after contingent and non-contingent
administration. Neuropharmacology, 55(5), 771–779. doi:
10.1016/j.neuropharm.2008.06.042.
167
Morse, W. H., & Skinner, B. F. (1958). Some Factors Involved in the Stimulus Control of
Operant Behavior. Journal of the Experimental Analysis of Behavior, 1(1), 103-107.
doi: 10.1901/jeab.1958.1-103.
Mumby, D. G. (2002). Hippocampal Damage and Exploratory Preferences in Rats: Memory
for Objects, Places, and Contexts. Learning & Memory, 9(2), 49-57. doi:
10.1101/lm.41302.
Negus, S. S., & Mello, N. K. (2003). Effects of chronic d-amphetamine treatment on cocaine-
and food-maintained responding under a progressive-ratio schedule in rhesus
monkeys. Psychopharmacology, 167(3), 324-332. doi: 10.1007/s00213-003-1409-y.
Nestler, E. J. (2012). Transcriptional Mechanisms of Drug Addiction. Clinical
Psychopharmacology and Neuroscience, 10(3),136-143. doi:
http://dx.doi.org/10.9758/cpn.2012.10.3.136.
Nestler, E. J. (2014). Epigenetic mechanisms of drug addiction. Neuropharmacology, 76,
259-268. doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.neuropharm.2013.04.004.
Nevin, J. A., & Grace, R. C. (2000). Behavioral momentum and the Law of Effect.
Behavioral and Brain Sciences, 23(1), 73-90. doi: 10.1017/s0140525x00002405.
Nevin, J. A., & Grace, R. C. (2005). Resistance to Extinction in the Steady State and in
Transition. Journal of Experimental Psychology: Animal Behavior Processes, 31(2),
199-212. doi: 10.1037/0097-7403.31.2.199.
O’Brien, C. P., Childress, A. R., Ehrman, R., & Robbins, S. J. (1998). Conditioning factors in
drug abuse: can they explain compulsion? Journal of Psychopharmacology, 12(1), 15–
22. doi: 10.1177/026988119801200103
168
O'Brien, C. P., Ehrman, R. N., & Ternes, J. W. (1986). Classical conditioning in human opioid
dependence. In S. R. Goldberg, & I. P. Stolerman (Eds.), Behavioral analysis of drug
dependence (pp. 329-356). New York: Academic Press.
Olsen, C. M. (2011). Natural rewards, neuroplasticity, and non-drug addictions.
Neuropharmacology, 61(7), 1109-1122. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.03.010.
Ostlund, S. B., & Balleine, B. W. (2007). Orbitofrontal Cortex Mediates Outcome Encoding in
Pavlovian But Not Instrumental Conditioning. Journal of Neuroscience, 27(18), 4819-
4825. doi: 10.1523/jneurosci.5443-06.2007.
Palmer, T. (2002). Faculty of 1000 evaluation for Critical role of the hippocampus in memory
for sequences of events. F1000 - Post-publication Peer Review of the Biomedical
Literature. doi: 10.3410/f.1006559.110758.
Parkinson, J. A., Willoughby, P. J., Robbins, T. W., & Everitt, B. J. (2000). Disconnection of
the anterior cingulate cortex and nucleus accumbens core impairs Pavlovian approach
behavior: further evidence for limbic cortical-ventral striatopallidal systems. Behav
Neurosci 114:42-63.
Patarroyo, W. E. P., Felício, L. F., & García-Mijares, M. (2014). Avaliação do treino com
estímulos discriminativos e condicionados sobre a autoadministração endovenosa de
morfina em ratos. Dissertação de Mestrado, Instituto de Psicologia, Universidade de
São Paulo, São Paulo.
Pavlov, Ivan (1927). Conditioned Reflexes: An Investigation of the Physiological Activity of
the Cerebral Cortex. Classics in the History of Psychology.
169
Pavuluri, M., Volpe, K., & Yuen, A. (2017). Nucleus Accumbens and Its Role in Reward and
Emotional Circuitry: A Potential Hot Mess in Substance Use and Emotional
Disorders. AIMS Neuroscience, 4(1), 52-70. doi: 10.3934/neuroscience.2017.1.52.
Pecina, S., Schulkin, J., & Berridge, K.C. (2006). Nucleus accumbens corticotropinreleasing
factor increases cue-triggered motivation for sucrose reward: paradoxical positive
incentive effects in stress? BMC Biol. 4, 8.
Pear, J. J., & Eldridge, G. D. (1984). The operant-respondent distinction: Future
directions. Journal of the Experimental Analysis of Behavior, 42(3), 453–467. doi:
10.1901/jeab.1984.42-453.
Perrotti, L. I., Weaver, R. R., Robison, B., Renthal, W., Maze, I., Yazdani, S., … & Nestler,
E. J. (2008). Distinct patterns of DFosB induction in brain by drugs of abuse. Synapse,
62, 358–369. doi: 10. 1002/syn.20500.
Pomara, C., Cassano, T., Derrico, S., Bello, S., Romano, A., Riezzo, I., & Serviddio, G.
(2012). Data Available on the Extent of Cocaine Use and Dependence: Biochemistry,
Pharmacologic Effects and Global Burden of Disease of Cocaine Abusers. Current
Medicinal Chemistry, 19(33), 5647-5657. doi: 10.2174/092986712803988811.
Pulvirenti, L. (n.d.). Glutamate Neurotransmission in the Course of Cocaine Addiction.
Glutamate and Addiction, 171-182. doi: 10.1385/1-59259-306-2:171.
Rehfeldt, R. A., & Hayes, L. J. (1998). The operant-respondent distinction revisited:
Toward an understanding of stimulus equivalence. Psychological Record, 48(2),
187–210. http://doi.org/10.1007/BF03395266.
170
Reid, L. D., Marglin S. H., Mattie M. E., & Hubbell C. L. (1989). Measuring morphine's
capacity to establish a place preference. Pharmacology Biochemistry and Behavior,
33(4), 765-775. doi: 10.1016/0091-3057(89)90468-1.
Rescorla, R. A. (1985). Associationism in animal learning. In L. G. Nilsson & T. Archer (Eds.),
Perspectives in learning and memory (pp.39-61). New Jersey: Erlbaum.
Rescorla, R. A. (1994). Transfer of instrumental control mediated by a devalued outcome.
Animal Learning & Behavior, 22(1), 27–33. doi: 10.3758/BF03199953.
Rescorla, R. A., & Lolordo, V. M. (1965). Inhibition of avoidance behavior. Journal of
Comparative and Physiological Psychology, 59(3), 406-412. doi: 10.1037/h0022060.
Rescorla, R. A., & Solomon, R. L. (1967). Two process learning theory: Relationships between
Pavlovian conditioning and instrumental learning. Psychological Review, 74(3), 151–
182. doi: 10.1037/h0024475.
Ritz, M. C., Lamb, R. J., Goldberg, S. R., & J., K. M. (1988). Cocaine self-administration
appears to be mediated by dopamine uptake inhibition. Progress in Neuro-
Psychopharmacology and Biological Psychiatry, 12(2-3), 233-239. doi: 10.1016/0278-
5846(88)90040-1.
Roberts, D. C., Morgan, D., & Liu, Y. (2007). How to make a rat addicted to cocaine. Progress
in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry,31(8), 1614-1624. doi:
10.1016/j.pnpbp.2007.08.028.
Robinson, T. E., & Berridge, K. C. (1993). The neural basis of drug craving: an incentive-
sensitization theory of addiction. Brain Research. Brain Research Reviews, 18(3),
247-291. doi: 10.1016/0165-0173(93)90013-P.
171
Robinson, T. E., & Berridge, K. C. (2003). Addiction. Annual Review of Psychology, 54, 25-
53. doi: 10.1146/annurev.psych.54.101601.145237.
Robinson, T. E., & Berridge, K. C. (2008). Review. The incentive sensitization theory of
addiction: some current issues. Philosophical Transactions of the Royal Society of
London. Series B, Biological Sciences, 363(1507), 3137–3146. doi:
10.1098/rstb.2008.0093.
Robison, A. J., & Nestler, E. J. (2011). Transcriptional and epigenetic mechanisms of
addiction. Nature Reviews Neuroscience, 12(11), 623-637. doi: 10.1038/nrn3111.
Rocha, B., Fumagalli, F., Gainetdinov, R., Jones, S., Ator, R., Giros, B., Miller, G. W., &
Caron, M. (1998). Erratum: Cocaine self-administration in dopamine-transporter
knockout mice. Nature Neuroscience, 1(4), 330-330. doi: 10.1038/1152.
Ruffle, J. K. (Nov 2014). "Molecular neurobiology of addiction: what's all the (Δ)FosB
about?". The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 40 (6): 428–37. doi:
10.3109/00952990.2014.933840.
Saddoris, M. P., Stamatakis, A., & Carelli, R. M. (2011). Neural correlates of Pavlovian-to-
instrumental transfer in the nucleus accumbens shell are selectively potentiated
following cocaine self-administration. European Journal of Neuroscience,33(12),
2274-2287. doi: 10.1111/j.1460-9568.2011.07683.x.
Sánchez-Cardoso, P., Higuera-Matas, A., Martín, S., Miguéns, M., Del Olmo, N., García-
Lecumberri, C., Ambrósio, E. (2009). Strain differences between Lewis and Fischer
344 rats in the modulation of dopaminergic receptors after morphine self-
administration and during extinction. Neuropharmacology, 57, 8–17.
172
Sanchez-Ramos. J. R., & Schuster. C. R. (1977). Second-order schedules of intravenous drug
self-administration in rhesus monkeys. Pharmacology Biochemistry and Behavior,
7(5), 443-450. doi: 10.1016/0091-3057(77)90212-X.
Sanchis-Segura, C., & Spanagel, R. (2006). Behavioural assessment of drug reinforcement
and addictive features in rodents: an overview. Addiction Biology, 11(1), 2–38. doi:
10.1111/j.1355-6215.2006.00012.x.
Setlow, B., Holland, P.C., & Gallagher, M. (2002). Disconnection of the basolateral
amygdala complex and nucleus accumbens impairs appetitive pavlovian second-order
conditioned responses. Beh Neurosci. 116:267–275.
Siegel, S. (1976). Morphine analgesic tolerance: its situation specificity supports a Pavlovian
conditioning model. Science, 193, 323-325. doi: 10.1126/science.935870.
Siegel, S. (1988). State dependent learning and morphine tolerance. Behavioral
Neuroscience, 102(2), 228-232. doi: 10.1037//0735-7044.102.2.228.
Siegel, S. (2001). Pavlovian conditioning and drug overdose: when tolerance fails. Addiction
Research and Theory, 9(5), 503-513. doi: 10.3109/16066350109141767.
Siegel, S. (2005). Drug tolerance, drug addiction, and drug anticipation. Current Directions
in Psychological Science, 14, 296-300. doi: 10.1111/j.0963-7214.2005.00384.x.
Siegel, S., Hinson, R. E., & Krank, M. D. (1978). The role of predrug signals in morphine
analgesic tolerance: Support for a Pavlovian conditioning model of tolerance. Journal
of Experimental Psychology: Animal Behavior Processes, 4(2), 188-196. doi:
10.1037/0097-7403.4.2.188.
173
Siegel, S., & Ramos, B. M. (2002). Applying laboratory research: Drug anticipation and the
treatment of drug addiction. Experimental and Clinical Psychopharmacology, 10(3),
162-183. doi:10.1037//1064-1297.10.3.162.
Skinner, B. F. (1937). Two Types of Conditioned Reflex: A Reply to Konorski and
Miller. Journal of General Psychology, 16(1), 272–279.
http://doi.org/10.1080/00221309.1937.9917951.
Skinner, B. F. (1938). The Behavior of Organisms: an Experimental Analysis. Oxford,
England: Appleton-Century.
Smith, K. S., & Berridge, K. C. (2007). Opioid Limbic Circuit for Reward: Interaction
between Hedonic Hotspots of Nucleus Accumbens and Ventral Pallidum. Journal of
Neuroscience,27(7), 1594-1605. doi: 10.1523/jneurosci.4205-06.2007.
Stefanski, R., Ladenheim, B., Lee, S.H., Cadet, J.L., & Goldberg, S.R. (1999).
Neuroadaptations in the dopaminergic system after active self-administration but not
after passive administration of methamphetamine. European journal of
pharmacology, 371(2-3), 123-135. doi: 10.1016/S0014-2999(99)00094-1.
Suppes, Patrick, et al. “A Model for Response Latency in Paired-Associate Learning.”
Journal of Mathematical Psychology, vol. 3, no. 1, 1966, pp. 99–128., doi:
10.1016/0022-2496(66)90006-x.
Suto, N., & Wise, R. A. (2011). Satiating Effects of Cocaine Are Controlled by Dopamine
Actions in the Nucleus Accumbens Core. Journal of Neuroscience, 31(49), 17917-
17922. doi: 10.1523/jneurosci.1903-11.2011.
174
Suto, N., Wise, R. A., & Vezina, P. (2011). Dorsal as well as ventral striatal lesions affect
levels of intravenous cocaine and morphine self-administration in rats. Neuroscience
Letters, 493(1-2), 29-32. doi: 10.1016/j.neulet.2011.02.011.
Taubenfeld, S. M., Muravieva, E. V., Garcia-Osta, A., & Alberini, C. M. (2010). Disrupting
the memory of places induced by drugs of abuse weakens motivational withdrawal in
a context-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences,
107(27), 12345-12350. doi: 10.1073/pnas.1003152107.
Thrailkill, E. A., & Bouton, M. E. (2015). Extinction of chained instrumental behaviors: Effects
of procurement extinction on consumption responding. Animal Learning and
Cognition, 41(1), 232-246. doi: 10.1037/xan0000064.
Thrailkill, E. A., & Bouton, M. E. (2016). Extinction of chained instrumental behaviors: Effects
of consumption extinction on procurement responding. Learning & Behavior, 44(1),
85-96. doi: 10.3758/s13420-015-0193-y.
Tran-Tu-Yen, D. A., Marchand, A. R., Pape, J., Scala, G. D., & Coutureau, E. (2009). Transient
role of the rat prelimbic cortex in goal-directed behaviour. European Journal of
Neuroscience,30(3), 464-471. doi: 10.1111/j.1460-9568.2009.06834.x.
Troisi, J. R., & Mauro, B. C. (2017). Do Pavlovian Processes Really Mediate Behavioral
Momentum? Some Conflicting Issues. The Psychological Record, 67(4), 597-604. doi:
10.1007/s40732-017-0259-7.
Uhl, G. R., Hall, F. S., & Sora, I. (2002). Cocaine, reward, movement and monoamine
transporters. Molecular Psychiatry, 7(1), 21-26. doi: 10.1038/sj/mp/4000964.
van den Bos, R., van der Harst, J., Vijftigschild, N., Spruijt, B., van Luijtelaar, G., & Maes, R.
(2004). On the relationship between anticipatory behaviour in a pavlovian paradigm
175
and pavlovian-to-instrumental transfer in rats (rattus norvegicus). Behav. Brain Res.
153 (2), 397–408.
Volkow, N. D., Wang, G. J., Fowler, J. S., & Telang, F. (2008). Overlapping neuronal circuits
in addiction and obesity: evidence of systems pathology. Philosophical Transactions of
the Royal Society of London, 363(1507), 3191–3200. doi: 10.1098/rstb.2008.0107.
Weiss, S. J., Kearns, D. N., Cohn, S. I., Schindler, C. W, & Panlilio, L. V. (2003). Stimulus
control of cocaine self-administration. Journal of the Experimental Analysis of
Behavior, 79(1), 111-135. doi: 10.1901/jeab.2003.79-111.
Weissenborn, R., Robbins, T. W., & Everitt, B. J. (1997). Effects of medial prefrontal or
anterior cingulate cortex lesions on responding for cocaine under fixed-ratio and
second-order schedules of reinforcement in rats. Psychopharmacology, 134(3), 242-
257. doi: 10.1007/s002130050447.
West, E. A., & Carelli, R. M. (2016). Nucleus Accumbens Core and Shell Differentially
Encode Reward-Associated Cues after Reinforcer Devaluation. Journal of
Neuroscience,36(4), 1128-1139. doi: 10.1523/jneurosci.2976-15.2016.
Winstanley, C.A., LaPlant, Q., Theobald, D. E. H., Green, T. A., Bachtell, R. K., Perrotti, L.
I., … & Nestler, E. J. (2007). ΔFosB induction in orbitofrontal cortex mediates
tolerance to cocaine-induced cognitive dysfunction. Journal of Neuroscience, 2,
10497-10507. doi: 10.1523/JNEUROSCI.2566-07.2007.
Wise, R. A. 1(996). Neurobiology of addiction. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 243–251. doi:
10.1016/b978-0-12-419239-3.x5036-x.
176
Woods, J. H., & Schuster, C. R. (1968). Reinforcement Properties of Morphine, Cocaine, and
SPA as a Function of Unit Dose. International Journal of the Addictions, 3(1), 231-237.
doi:10.3109/10826086809042898.
Wyvell, C. L., & Berridge, K. C. (2001). Incentive sensitization by previous amphetamine
exposure: Increased cue-triggered “wanting” for sucrose reward. Journal of
Neuroscience, 21(19), 7831-7840. PMID: 11567074.
Zachariou, V., Bolanos, C. A., Selley, D. E., Theobald, D., Cassidy, M. P., Kelz, M. B., Shaw-
Lutchman, T., Berton, O., Sim-Selley, L. J, Dileone, R. J, Kumar, A. & Nestler, E. J.
(2006). An essential role for ΔFosB in the nucleus accumbens in morphine action.
Nature Neuroscience, 9(2), 205-211. doi: 10.1038/nn1636.
Zeaman, David. “Response Latency as a Function of the Amount of Reinforcement.” Journal
of Experimental Psychology, vol. 39, no. 4, 1949, pp. 466–483., doi:
10.1037/h0060477.
Zimmerman, J. L. (2012). Cocaine Intoxication. Critical Care Clinics,28(4), 517-526. doi:
10.1016/j.ccc.2012.07.003.
177
Anexo 1. Valores de Medianas, estatístico Z de Wilcoxon e valores p - Grupo CO
Grupo CO
Subárea Mdn F2 Mdn F4 Z p
PFC LO 23,875 31 -2,201 ,028
mPFC Cg1 20,000 21,750 -0,943 ,345
mPFC PrL 19,250 20,500 -1,051 ,293
mPFC IL 26,000 23,625 -1,367 ,173
NAc Core 28,625 31,375 -1,363 ,172
NAc Shell 34,000 28,500 -1,153 ,249
CPu Lateral 30,500 32,370 -0,736 ,462
CPu Medial 47,250 49,875 -1,153 ,249
Hipp. DG 23,625 25,000 -0,734 ,463
Hipp. CA1 26,500 23,500 -1,472 ,141
Hipp. CA3 21,000 23,875 -9,43 ,345
Amig. Bas 72,875 77,875 -1,682 ,093
Amig. Cen 29,625 34,500 -1,153 ,249
Amig. Med 18,250 16,000 -2,201 0,028
Anexo 2. Valores de Medianas, estatístico Z de Wilcoxon e valores p - Grupo CP
Grupo CP
Sub-área Mdn F2 Mdn F4 Z p
PFC LO 82,284 135,527 -2,201 ,028
mPFC Cg1 77,444 108,301 -2,201 ,028
mPFC PrL 94,990 104,670 -2,201 ,028
mPFC IL 108,301 118,586 -1,472 ,141
NAc Core 132,502 136,132 -0,105 ,917
NAc Shell 142,182 147,628 -0,105 ,917
CPu Lateral 137,947 148,838 -1,214 ,225
CPu Medial 219,627 247,458 -2,201 ,028
Hipp. DG 94,385 113,746 -1,992 ,046
Hipp. CA1 11,931 113,141 -0,105 ,917
Hipp. CA3 118,586 115,561 0 1
Amig. Bas 270,450 356,364 -1,992 ,046
Amig. Cen 87,124 164,569 -2,201 ,028
Amig. Med 78,049 77,444 -0,405 0,686
178
Anexo 3. Valores de Medianas, estatístico Z de Wilcoxon e valores p - Grupo Ctr
Grupo Ctr
Sub-área Mdn F2 Mdn F4 Z p
PFC LO 38,722 129,477 -2,023 ,043
mPFC Cg1 38,722 100,435 -2,023 ,043
mPFC PrL 60,503 110,116 -2,023 ,043
mPFC IL 83,494 118,586 -1,214 ,225
NAc Core 68,973 134,317 -0,944 ,345
NAc Shell 76,234 140,367 -0,405 ,686
CPu Lateral 118,586 151,258 -0,73 ,465
CPu Medial 175,459 249,273 -2,023 ,043
Hipp. DG 95,595 110,116 -1,753 ,080
Hipp. CA1 87,124 112,536 -0,135 0,893
Hipp. CA3 105,275 116,166 -0,271 0,786
Amig. Bas 226,286 342,449 -1,753 ,080
Amig. Cen 77,444 163,359 -2,023 ,043
Amig. Med 72,604 81,074 0 1