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1 INTRODUÇÃO

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O arsênio inorgânico é onipresente no meio ambiente, onde se apresenta,

principalmente, como compostos de arsenito (As3+) e arsenato (As5+), presentes em

pequenas quantidades nas rochas, no solo, na água, no ar e em certos alimentos

(FISHBEIN, 1981). Os seres humanos, expostos ao arsênio oriundo destas fontes

naturais, apresentam uma ingestão diária, geralmente, na faixa de 12-40 µg/dia

(UTHUS, 1994; THORNTON, 1996). Contudo, certas áreas distribuídas ao redor de

todo o mundo, como em Taiwan, México, Chile, Índia, Argentina e Estados Unidos,

contêm depósitos minerais naturais com quantidade suficiente de arsênio inorgânico

para contaminar a água e comprometer a saúde populacional (BORUM &

ALBERNATHY, 1994; CANTOR, 1996). Na Índia, por exemplo, os níveis de

arsênio excedem 300 µg/l e 1 mg/l, respectivamente, em 27% e 5% dos suprimentos

de água (CHAPELL et al., 1997), sendo muitas vezes superior ao nível máximo

permitido nos Estados Unidos, que é de 50 µg/l. Apesar de os reservatórios de água

dos Estados Unidos apresentarem, em geral, baixas concentrações de arsênio,

existem relatos de contaminação por este poluente em porções do Sudeste, onde os

níveis de arsênio na água atingem até mais de 1 mg/l (CHAN & HUFF, 1997;

WARNER et al., 1999; ATSDR, 1993).

Além destas fontes naturais de arsênio inorgânico, algumas atividades

humanas, como a mineração, a queima do carvão mineral e a aplicação de pesticidas,

herbicidas ou desfoliantes arsenicais, também podem introduzir o arsênio no meio

ambiente (HOOD, 1985). Apesar da exposição oral e crônica por meio da ingestão de

água e alimentos contaminados ser a forma mais comum de contaminação humana e

animal, a via inalatória também é tóxica e pode comprometer a saúde de indivíduos

3

que trabalham ou residem nas imediações de regiões com contaminação do ar por

este metal (ATSDR, 1993; HUGHES et al, 1995).

A preocupação com a contaminação ambiental por este metal pesado e suas

possíveis conseqüências para a saúde populacional tem crescido substancialmente em

diferentes países (NAS, 1999). Particularmente nos Estados Unidos, onde o arsênio

inorgânico constitui-se em um dos principais contaminantes ambientais, vultosos

fundos têm sido dispensados no sentido de se estudar tanto os possíveis efeitos

deletérios deste metal pesado a nível populacional, como o seu máximo nível

aceitável, não tóxico, na água (CARLSON-LYNCH et al, 1994; CANTOR, 1996).

A absorção e a toxicidade do arsênio são dependentes tanto da forma de

exposição, quanto do metabolismo particular de cada animal ou indivíduo. As

espécies inorgânicas solúveis são as melhores absorvidas pelo trato gastro-intestinal,

sendo que as taxas de absorção variam de 40 a 100 % (PONTIUS et al., 1994). Após

a absorção ocorre a biotransformação, que consiste na redução do arsenato, a forma

pentavalente do arsênio inorgânico, em arsenito, sua forma trivalente (NEMETI &

GREGUS, 2002). O arsenito é a forma mais tóxica do arsênio inorgânico, sendo

altamente reativa com vários componentes tissulares, dada a sua alta afinidade por

grupos sulfidril. Em seres humanos, bem como na maioria das espécies de mamíferos

estudadas, este último sofre metilação, primariamente no fígado, formando os ácidos

metil-arsônico e dimetil-arsínico, que são excretados, sobretudo, na urina (VAHTER,

1999). O papel da metilação do arsênio é enigmático. O mesmo pode ser considerado

um mecanismo de detoxificação, uma vez que os metabólitos finais são menos

reativos com os constituintes dos diversos órgãos e tecidos, menos tóxicos e mais

facilmente excretados na urina (VAHTER & CONCHA, 2001). Porém, por outro

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lado, há evidências de que os metabólitos metilados do arsênio também possam

contribuir para a carcinogenicidade e a genotoxicidade deste metal pesado

(GOERING et al., 1999). Em seres humanos, a avaliação da metilação baseia-se,

principalmente, nas quantidades relativas dos diferentes metabólitos na urina, que

contém, em média, 10-30% de arsênio inorgânico, 10-20% de ácido metil-arsônico e

60-80% de ácido dimetil-arsínico (VAHTER & CONCHA, 2001). A capacidade de

metilação do arsênio inorgânico possui grande variabilidade intra e inter-espécies, o

que justifica, pelo menos em parte, as diferenças de susceptibilidade entre indivíduos

da mesma espécie e entre diferentes espécies (GOLUB, 1998; VAHTER, 1999).

Estudos comparando a toxicidade sistêmica do arsênio inorgânico em diferentes

animais sugerem ser o camundongo o modelo mais apropriado para o estudo da

toxicidade aguda por este metal (MITCHELL et al, 2000), justificando a sua escolha

no presente estudo.

O arsênio inorgânico é bem conhecido em saúde pública pela sua associação

com a ocorrência epidêmica de doenças cárdio-vasculares, cânceres e alterações de

pele nas áreas com elevada exposição a este agente (LIANFANG & JIANZHONG,

1994; CHEN et al., 1996). Estudos epidemiológicos têm mostrado que a exposição

crônica ao arsênio inorgânico pode promover lesões hepáticas, neuropatia periférica,

além de aumento da incidência de câncer de pulmão, pele, bexiga e fígado em seres

humanos (IARC, 1982). Este metal pesado também tem sido exaustivamente

estudado como um agente teratogênico em mamíferos, sendo o seu potencial para

promover toxicidade ao concepto durante o seu desenvolvimento intra-útero

(toxicidade desenvolvimental) investigado em algumas espécies de animais de

laboratório (HOOD, 1972; HOOD & BISHOP, 1972; HOOD & HARRISON, 1982;

5

HOOD et al., 1988; DOMINGO et al., 1995; TABOCOVA et al, 1996; GOLUB et

al, 1998).

Dados oriundos de estudos com animais demonstraram que o arsênio

inorgânico pode causar malformações e óbito fetais, bem como retardo de

crescimento intra-útero em pelo menos quatro espécies de mamíferos (hamsters,

camundongos, ratos e coelhos) (HOOD, 1972; HOOD & BISHOP, 1972; HOOD &

HARRISON, 1982; HOOD et al., 1988; DOMINGO et al., 1995; TABOCOVA et al,

1996; GOLUB et al, 1998). Os efeitos são dependentes da dose, da via e do tempo de

exposição, bem como do dia da gestação no qual a exposição ocorre (TABOCOVA

et al, 1996; NEMEC et al, 1998). Em relação à via de administração deste agente,

estudos com diferentes modelos animais mostraram que o arsênio pode produzir

toxicidade desenvolvimental quando administrado tanto pela via oral (através da

administração do mesmo por sonda oro-gástrica), como pela injeção intra-peritoneal

(HOOD et al, 1988; NEMEC et al, 1998). Quando a mesma dose é administrada por

ambas as vias, os níveis séricos materno-fetais atingidos são maiores com a

utilização da segunda. Desta forma, a via injetável possibilita a administração de uma

dose menor, passível de promover a ocorrência de toxicidade fetal, na ausência de

efeitos adversos maternos.

Informações sobre a toxicidade desenvolvimental do arsênio inorgânico em

seres humanos limitam-se a uns poucos estudos epidemiológicos de populações

expostas a este contaminante pelas vias oral e inalatória (HOOD, 1972; IARC, 1982;

CARLSON-LYNCH et al., 1994; USEPA, 1996; GOLUB et al., 1998). Alguns

destes estudos evidenciaram um aumento na incidência de abortamento espontâneo,

natimortalidade e baixo peso ao nascer na prole das populações expostas. Contudo, a

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interpretação destes dados é complicada, devido à exposição concomitante destas

populações a diversos poluentes e à possível presença de outras variáveis não

analisadas nestes estudos, o que dificulta a análise dos efeitos isolados da

contaminação arsenical no sistema reprodutivo de seres humanos (HOOD, 1972;

IARC, 1982; CARLSON-LYNCH et al., 1994; USEPA, 1996; GOLUB et al., 1998).

Dadas a escassez de informações e as limitações acima descritas, torna-se relevante a

obtenção de dados originados de estudos bem conduzidos em animais, para

tentarmos predizer os possíveis riscos da exposição humana a este contaminante no

que se refere a sua potencial toxicidade embrionária e fetal.

Alguns estudos evidenciaram que o arsênio produz uma grande variedade de

respostas de estresse em células de mamíferos, incluindo anormalidades metabólicas

acompanhadas de inibição do crescimento e, eventualmente, de apoptose (BRISON

& SCHULTZ, 1997; MIRKES & LITTLE, 1998; LAROCHETTE et al, 1999;

BERNSTAM & NRIAGU, 2000). A desorganização de elementos estruturais do

citoesqueleto, vital para a integridade celular, aparentemente, é responsável pelas

alterações morfológicas presentes em algumas das linhagens de células estudadas e

expostas a este metal (CLARKSON, 1987; DEMEESTER et al., 1998; BERNSTAM

& NRIAGU, 2000). Contudo, detalhes das mudanças ultra-estruturais produzidas

pelo arsênio permanecem pobremente estabelecidos. Algumas evidências recentes

também sugerem que o arsênio promove, nas populações expostas a este elemento,

mutações oncogênicas, afetando algumas das enzimas relacionadas à replicação e ao

reparo do DNA, e aberrações cromossômicas. (HEI et al., 1998; GOLUB et al., 1998;

BERNSTAM & NRIAGU, 2000; LIU et al., 2001) A sensibilidade do fuso mitótico

ao arsênio, particularmente de seus componentes orgânicos, explica as aberrações

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cromossômicas bem documentadas em indivíduos que residem em áreas

contaminadas (CLARKSON, 1987; DEMEESTER et al., 1998; BERNSTAM &

NRIAGU, 2000). Contudo, não encontramos, na literatura, estudos sobre os possíveis

efeitos do arsênio na promoção de anomalias do fuso celular meiótico e aberrações

cromossômicas em células germinativas femininas, o que, pelo menos em parte,

explicaria a toxicidade desenvolvimental atribuída a este agente.

O arsênio compromete a função mitocondrial e estimula a produção de

radicais livres do oxigênio em diferentes espécies e tipos celulares (HEI et al., 1998;

LAROCHETTE et al., 1999; BELZACQ et al., 2001; LIU et al., 2001). Existem

numerosas evidências de que o estresse oxidativo, dependendo de sua severidade,

pode promover a danificação de diversas proteínas intracelulares (STADTMAN,

1992; BERLETT & STADTMAN, 1997), algumas das quais são importantes para a

organização do fuso celular (ANTONIO et al. 2000; FUNABIKI & MURRAY,

2000; ABRIEU et al., 2001) e, ao mesmo tempo lesar, diretamente, o DNA e induzir

o mal alinhamento cromossômico (BECKMAN & AMES, 1998; LIMOLI et al.,

1998). Alguns estudos, por sua vez, demonstraram que a administração de

antioxidantes, como a N-acetil-cisteína e o L-ascorbato, preveniu a produção de

radicais livres do oxigênio e alguns dos efeitos tóxicos promovidos pelo arsênio

inorgânico (BARCHOWSKY et al., 1996; CHATTOPADHYAY et al., 2001),

sugerindo serem estes efeitos mediados, pelo menos em parte, pelo estresse

oxidativo. O estresse oxidativo também pode promover a apoptose em embriões pré-

implantação (SLATER et al., 1996). A apoptose, também denominada morte celular

programada, ocorre em embriões que falham na execução de eventos essenciais para

seu adequado desenvolvimento durante o primeiro ciclo celular (JURISICOVA et al.,

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1998). Como previamente nós demonstramos que o comprometimento da função

mitocondrial produz importantes efeitos tóxicos na oogênese e no desenvolvimento

embrionário (LIU et al., 2000c, 2000d), e como o arsênio inorgânico sabidamente

altera a atividade desta organela celular e provoca estresse oxidativo e apoptose em

diferentes tipos celulares, nós levantamos a hipótese de que o arsênio inorgânico

poderia comprometer a meiose oocitária e o desenvolvimento embrionário, bem

como estimular a apoptose embrionária, eventos estes mediados, pelo menos em

parte, pela produção de radicais livres do oxigênio.

A meiose é uma fase do ciclo celular especialmente sensível aos efeitos

deletérios de diversos agentes estressantes. Em seres humanos, a duração da primeira

divisão meiótica pode ser extremamente longa, uma vez que a mesma se inicia

durante a vida intra-uterina e se completa no menacme, somente se ocorrer a

ovulação. Durante esta longa prófase da primeira divisão meiótica, os oócitos estão

susceptíveis a diversos agentes externos, incluindo possíveis poluentes ambientais,

entre os quais talvez possamos incluir o arsenito, bem como às conseqüências

inexoráveis do envelhecimento celular. A má qualidade oocitária é uma das

principais causas do declínio da fertilidade feminina relacionado ao envelhecimento

(NAVOT et al., 1991). Em seres humanos é bem documentado o aumento

significativo da incidência de aneuploidias oocitárias e embrionárias com o avanço

da idade (HASSOLD & CHIU, 1985; PLACHOT et al., 1988). A maioria das

aneuploidias embrionárias é derivada, por sua vez, de erros iniciados na primeira

divisão meiótica oocitária (BATTAGLIA et al., 1996; ANGELL, 1997; VOLARCIK

et al., 1998). Apesar dos mecanismos envolvidos na gênese das anomalias meióticas

não serem bem compreendidos (NICOLAIDIS & PETERSEN, 1998; PETERSEN &

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MIKKELSEN, 2000), sabemos que as mesmas podem contribuir para a falência do

desenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do

oócito em completar o processo de maturação, tornando-se incapaz de ser fertilizado,

até a ocorrência de erros variáveis no processo de maturação meiótica que não

impossibilitam a fertilização, mas, contudo, podem comprometer o desenvolvimento

embrionário pré e/ou pós-implantação, assim como a viabilidade futura do concepto

(PAVLOK et al., 1992; LONERGAN et al., 1994; ARMSTRONG, 2001). Os

achados acima referidos justificam a importância desta fase particular do ciclo

celular, bem como o interesse em se estudar os possíveis agentes capazes de

comprometer a sua normalidade.

As anomalias meióticas podem ser identificadas, do ponto de vista

morfológico, pela presença de aberrações no fuso celular e/ou na distribuição

cromossômica. O fuso celular é constituído, principalmente, pelos microtúbulos, cujo

elemento estrutural predominante é a tubulina, sendo crucial para a normalidade do

alinhamento e da separação cromossômicos, durante a primeira e a segunda dividão

meióticas. A imensa maioria dos estudos descritos na literatura tem utilizado a

imuno-coloração e a microscopia de fluorescência para documentar estas

modificações (MARO et al., 1984, 1986; SCHATTEN et al., 1985; HARAGUCHI et

al., 1989; KIM et al., 1996; HEWITSON et al., 1997). Contudo, esta metodologia

apesar de permitir a avaliação detalhada, não apenas do fuso celular, como também

do alinhamento e da separação cromossômicos, requer a fixação e a coloração do

material a ser analisado. Isto inviabiliza a sua aplicabilidade clínica na análise de

oócitos humanos, que serão utilizados em técnicas de reprodução assistida (WANG

et al., 2001a, 2001b; .WANG & KEEFE, 2002).

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Uma outra técnica utilizada, mais recentemente, para a avaliação morfológica

do fuso celular, é a microscopia de polarização, também denominada de pol-scope

(OLDENBOURG et al., 1996, 1999; LIU et al., 2000a). Esta técnica possibilita a

análise de estruturas birrefringentes em células vivas, sem a necessidade de fixação

ou de coloração. A birrefringência é uma propriedade óptica, característica de

algumas estruturas biológicas, como o resultado do seu arranjo molecular próprio,

presente no fuso celular. Isto permite a avaliação detalhada desta estrutura pelo pol-

scope, conforme descrito em estudos anteriores (LIU et al., 2000a, 2000b; WANG et

al., 2001a, 2001b). Entretanto, como os cromossomos são minimamente

birrefringentes, não podem ser diretamente avaliados por esta metodologia. Todavia,

se forem confirmados os achados de que a grande maioria das anomalias do fuso

celular é acompanhada por alterações cromossômicas, esta técnica também poderia

ter aplicabilidade prática na predição de possíveis anomalias cromossômicas

associadas a alterações do fuso celular, o que precisa ser mais bem investigado

(WANG & KEEFE, 2002). A comprovação da inocuidade desta tecnologia na

análise de oócitos vivos, inclusive humanos, é outra vantagem descrita deste método,

que poderá ser aplicado futuramente nas clínicas de reprodução humana, no sentido

de se realizar a triagem de anomalias dos fusos celulares oocitários, previamente à

utilização dos mesmos nas técnicas de reprodução assistida, o que poderá ter

implicações vantajosas (WANG et al., 2001a, 2001b; WANG & KEEFE, 2002).

A apoptose é um mecanismo fisiológico suicida, normalmente responsável

pela preservação da homeostase orgânica, incluindo o adequado desenvolvimento

embrionário (WYLLIE, 1994). Contudo, a regulação inadequada deste processo pode

resultar em uma série de condições patológicas, o que tem sido investigado nos

11

últimos anos. Como citado anteriormente, este processo de morte celular ocorre em

embriões que falham na execução de eventos essenciais para seu adequado

desenvolvimento durante o primeiro ciclo celular (JURISICOVA et al., 1998), o que

ressalta a importância deste processo na regulação do desenvolvimento embrionário

e a relevância de se estudar agentes passíveis de comprometer a sua regulação.

Os dois modelos distintos de morte celular, a apoptose e a necrose, podem ser

distinguidos com base nas suas diferenças morfológicas, bioquímicas e moleculares.

Em geral, as células sofrendo o processo de morte celular programada evidenciam

um padrão clássico de mudanças estruturais nucleares e citoplasmáticas, sendo os

achados morfológicos clássicos do início deste processo a presença de condensação e

de fragmentação da cromatina nucleares (WYLLIE et al., 1980; HARMON et al.,

1998). Vários métodos têm sido utilizados para a identificação deste processo de

morte celular. Como a endonucleólise é considerada um evento chave, que resulta na

lise do DNA nuclear e na formação de fragmentos pequenos de oligonucleotídeos, a

mesma é comumente utilizada para a detecção da apoptose por meio de diferentes

métodos. Um destes, denominado método de TUNEL (terminal desoxynucleotidyl

transferase mediated d-UTP nick and labeling), consiste na marcação enzimática dos

fragmentos do DNA, por meio do uso de uma enzima que se liga a porção 3’-

hidroxi-terminal destes fragmentos, a desoxinucleotidil transferase, e de nucleotídeos

marcados com fluorisceína, com a sua posterior identificação por meio do uso de

microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo. Este método possibilita não

apenas a identificação, como também a quantificação da apoptose, tanto em tecidos,

como em células isoladas, sendo rápido, preciso e, relativamente, de fácil execução

(GORCZYCA et al., 1993a, 1993b; GOLD et al., 1994).

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Dada a escassez de informações disponíveis no momento sobre os possíveis

riscos da exposição animal e, em última instância, da exposição humana ao arsênio,

elemento claramente reconhecido como contaminante ambiental, torna-se imperativo

a obtenção de dados, inicialmente, de estudos in vitro bem conduzidos e, a seguir, de

estudos in vivo, com o intuito de se determinar os seus potenciais efeitos deletérios

sobre a meiose oocitária e o desenvolvimento embrionário pré-implantação, bem

como estímulo à apoptose embrionária. Dentre os dois principais compostos do

arsênio inorgânico, optamos pelo estudo dos efeitos do arsenito, em virtude da sua

maior toxicidade, quando comparada à do arsenato, e ao fato deste agente ser o

principal responsável pelos efeitos tóxicos atribuídos a este metal (GOLUB et al.,

1998).

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2 OBJETIVOS

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Neste estudo, objetivamos avaliar os efeitos do arsenito na meiose oocitária,

no desenvolvimento embrionário pré-implantação e na apoptose embrionária em

camundongos.

Foram especificamente avaliados:

1. Os efeitos do tratamento in vitro com arsenito na meiose de oócitos

submetidos à maturação in vitro (artigo 1);

2. Os efeitos do tratamento in vitro com arsenito na presença do antioxidante

N-acetil-cisteína, na meiose de oócitos submetidos à maturação in vitro

(artigo 1);

3. Os efeitos do tratamento in vivo com arsenito na meiose tanto de oócitos

in vivo ovulados, como in vitro maturados (artigo 2);

4. Os efeitos do tratamento in vivo com arsenito no desenvolvimento

embrionário pré-implantação de embriões provenientes de oócitos

fertilizados in vivo (artigo 2).

5. Os efeitos do tratamento in vivo com arsenito na promoção de apoptose

em blastocistos cultivados in vitro, provenientes de oócitos fertilizados in

vivo (artigo 2).

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3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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26

4 ARTIGO 1

27

O arsenito promove anomalias na meiose oocitária que podem ser

prevenidas pela co-administração de N-acetil-cisteína

Paula A. A. S. Navarroa,b,c, Lin Liua,b, Rui A. Ferrianic e David L. Keefea,b,d

a Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Women & Infants Hospital, Brown

University, Providence, Rhode Island 02905

b Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusetts 02543

c Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo 14049-000, Brasil

d para quem as correspondências devem ser endereçadas: Marine Biological

Laboratory, 7 MBL Street, Woods Hole, MA, 02543, USA. E-mail:

dkeefe@wihri.org

APOIO FINANCEIRO

P.A.A.S. Navarro foi financiada por uma bolsa de Doutorado-Sanduíche concedida

pela Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) – Brasil.

28

RESUMO

Objetivo: Determinar se o tratamento in vitro com arsenito promoveria anomalias na

meiose de oócitos de camundongo maturados in vitro na presença deste agente.

Definir se a co-administração do antioxidante N-acetil-cisteína poderia prevenir as

anomalias meióticas induzidas pelo arsenito.

Desenho experimental: Realizamos um estudo morfológico.

Local de desenvolvimento do estudo: Laboratório de Medicina Reprodutiva,

situado no Marine Biological Laboratory.

Animais: Camundongas CD-1 com 6 semanas de idade submetidas a superovulação

por meio da administração de gonadotrofina sérica de éguas prenhas.

Intervenção: Oócitos imaturos foram submetidos à maturação in vitro na presença

de arsenito ou de arsenito mais N-acetil-cisteína e avaliados a seguir por meio de

microscopia de polarização (pol-scope) ou de fluorescência.

Principal resultado avaliado: O estudo avaliou características morfológicas do fuso

celular e da distribuição cromossômica.

Resultados: O tratamento in vitro com arsenito promoveu anomalias meióticas,

dependentes da dose e do tempo de exposição a este agente. A exposição a 2 µg/ml

de arsenito por 12-14 h ou a 8 µg/ml por 2 h produziu um completo bloqueio da

maturação oocitária. A exposição a 2 ou 4 µg/ml de arsenito por 2 h causou

anormalidades meióticas, respectivamente, em 75% e 80% dos oócitos in vitro

maturados (60% e 80% de aberrações na meiose I, respectivamente) e atraso no

processo de maturação in vitro, após 12-14 h em cultura. Todavia, após 15-17 h em

cultura, 65.2% dos oócitos tratados com 2 µg/ml de arsenito por 2 h atingiram a

metáfase II, dos quais 66,7% exibiram anormalidades. A co-administração de N-

29

acetil-cisteína, aparentemente, preveniu as anomalias meióticas e o retardo no

processo de maturação in vitro, induzidos pelo arsenito.

Conclusões: Nossos dados demonstraram que o arsenito causou anomalias meióticas

durante o processo de maturação in vitro de oócitos de camundongos, que foram,

aparentemente, prevenidas pela co-administração de N-acetil-cisteína. Estes achados

sugeriram que as aberrações meióticas induzidas pelo arsenito possam ser mediadas

pela produção de radicias livres do oxigênio.

Palavras chave: Arsenito, meiose, maturação in vitro, N-acetil-cisteína, antioxidante

30

ABSTRACT

Objectives: To determine whether in vitro treatment with arsenite could cause

meiotic abnormalities in mouse oocytes during in vitro maturation (IVM). We also

investigated the effect of co-administration of an antioxidant, N-acetylcysteine, on

arsenite-induced meiotic abnormalities

Design: Morphological study.

Setting: Laboratory for Reproductive Medicine, Marine Biological Laboratory,

Brown University.

Animal(s): Six-week-old CD-1 mice superovulated with pregnant mare’s serum

gonadotropin (PMSG).

Intervention: Imature oocytes were submited to IVM in the presence of either

arsenite or arsenite plus N-acetylcysteine and evaluated either by pol-scope imaging

or fluorescent microscopy.

Main outcome measure: The study examined meiotic spindle morphologic features

and chromosome alignments.

Results: In vitro arsenite treatment produced oocyte meiotic anomalies,

characterized by spindle disruption and/or chromosomal misalignment, which were

dose and time dependent. Exposure to either 2 µg/ml of arsenite during 12-14 h or 8

µg/ml for 2 h arrested completely oocyte maturation. Exposure to 2 or 4 µg/ml of

arsenite for 2 h caused meiotic anomalies, respectively, in 75% and 80% of in vitro

treated oocytes (60% and 80% of abnormal MI oocytes, respectively) after 12-14 h in

culture. However, after 15-17 h in IVM culture, many oocytes (65.2%) treated with 2

µg/ml of arsenite for 2 h reached MII stage, with 43.5% exhibiting abnormalities.

Co-administration of N-acetylcysteine prevented meiotic abnormalities and the delay

31

in IVM induced by arsenite treatment, producing rates of normal MII oocytes after

12-14 h in IVM culture comparable to control cultures.

Conclusions: Our data demonstrate that in vitro arsenite treatment caused meiotic

abnormalities, which apparently could be prevented by in vitro co-administration of

N-acetylcysteine. These findings also suggest that arsenite-induced meiotic

aberrations can be mediated by reactive oxygen species.

Key words: arsenite, meiosis, in vitro maturation, N-acetylcysteine, antioxidant

32

INTRODUÇÃO

O arsênio inorgânico é um elemento onipresente no meio ambiente, onde

aparece principalmente como compostos de arsenito (As3+) e arsenato (As5+).

Pequenas quantidades de arsênio inorgânico estão normalmente presentes nas rochas,

no solo, na água, no ar e em certos alimentos (1). Entretanto, altos níveis deste

elemento podem resultar em contaminação ambiental, como a presente em diversos

países, distribuídos ao longo de todo o mundo (2,3). A preocupação com a

contaminação ambiental por este metal pesado e suas possíveis conseqüências para a

saúde populacional tem crescido continuamente em diferentes países.

Particularmente nos Estados Unidos, onde o arsênio inorgânico constitui-se em um

dos principais contaminantes ambientais, vultosos fundos têm sido dispensados no

sentido de se estudar os possíveis efeitos deletérios deste metal pesado a nível

populacional (4,5).

Este elemento tem sido exaustivamente estudado como um agente

teratogênico em mamíferos. O seu potencial para promover toxicidade

desenvolvimental tem sido investigado tanto em algumas espécies de animais de

laboratório, como, epidemiologicamente, em seres humanos (5-13). Apesar do

grande número de estudos sobre a toxicidade desenvolvimental do arsênio

inorgânico, não encontramos, na literatura, estudos sobre os seus possíveis efeitos na

promoção de anomalias na meiose oocitária. A meiose é uma fase do ciclo celular

especialmente sensível aos efeitos deletérios de diversos agentes estressantes. Em

seres humanos, a duração da primeira divisão meiótica pode ser extremamente longa,

uma vez que a mesma é iniciada durante a vida intra-uterina e somente se completa

no menacme, se ocorrer a ovulação. Durante esta longa prófase da primeira divisão

33

meiótica, os oócitos estão susceptíveis a diversos agentes externos, incluindo

possíveis poluentes ambientais, entre os quais talvez possamos incluir o arsenito. Ao

mesmo tempo, existem diversas evidências de que distúrbios desta fase constituem-

se em uma das principais causas de aneuploidias humanas (14-16), o que justifica o

interesse particular no estudo de possíveis agentes capazes de comprometer esta fase

do ciclo celular.

O arsênio compromete a função mitocondrial e estimula a produção de

radicais livres do oxigênio em diferentes espécies e tipos celulares (17-19). Existem

numerosas evidências de que o estresse oxidativo, dependendo de sua severidade,

pode promover a danificação de diversas proteínas intracelulares (20,21), algumas

das quais são importantes para a organização do fuso celular (22-24) e, ao mesmo

tempo lesar, diretamente, o DNA e induzir o mal alinhamento cromossômico (25,26).

Alguns estudos, por sua vez, demonstraram que a administração de antioxidantes,

como a N-acetil-cisteína, preveniu a produção de radicais livres do oxigênio e alguns

dos efeitos tóxicos promovidos pelo arsênio inorgânico (27), sugerindo serem estes

efeitos mediados, pelo menos em parte, pelo estresse oxidativo. A N-acetil-cisteína é

um precursor da glutationa, o antioxidante intracelular mais abundante, importante

para a manutenção da integridade celular e envolvido na proteção contra o estresse

oxidativo induzido pelo arsênio inorgânico (28). Estes dados estimularam a nossa

hipótese de que o arsenito poderia comprometer a meiose oocitária através da

produção de radicais livres do oxigênio, o que, pelo menos em parte, poderia ser

revertido com uso de antioxidantes, como a N-acetil-cisteína. Devido à escassez de

informações disponíveis no momento sobre os possíveis riscos da exposição animal

e, em última instância, da exposição humana ao arsênio, elemento claramente

34

reconhecido como contaminante ambiental, torna-se imperativo a obtenção de dados,

inicialmente, de estudos in vitro bem conduzidos, com o intuito de se determinar a

sua potencial toxicidade meiótica em células germinativas, o que, pelo menos em

parte, justificaria a sua toxicidade desenvolvimental.

Alguns estudos experimentais, realizados no sentido de se procurar elucidar

os efeitos in vitro deste poluente ambiental em diferentes espécies e tipos celulares,

demonstraram que o camundongo é o melhor modelo animal para o estudo da

toxicidade aguda pelo arsênio inorgânico (29), o que justifica a sua seleção no

presente estudo. Dentre os dois principais compostos do arsênio inorgânico, optamos

pelo estudo dos efeitos do arsenito, a forma trivalente do arsênio inorgânico, em

virtude de sua maior toxicidade quando comparada à forma pentavalente (arsenato) e

ao fato de ser este o principal agente arsenical responsável pelos efeitos tóxicos

atribuídos a este metal (13).

No presente estudo foram investigados os efeitos in vitro do arsenito na

meiose de oócitos submetidos à maturação in vitro, bem como o efeito da co-

administração de N-acetil-cisteína na prevenção das anomalias meióticas induzidas

por este agente.

MATERIAIS E MÉTODOS

Reagentes e Animais

Todos os reagentes foram comprados da Sigma Chemical Co. (St. Louis,

MO), com exceção dos listados a seguir. A gonadotrofina sérica de égua prenha

(PMSG), que foi utilizada para a superovulação, foi comprada da Calbiochem (La

Jolla, CA). Foram utilizadas, no presente estudo, camundongas CD1 com 6 semanas

35

de vida, compradas do Charles River Laboratory (Boston, MA). Os animais foram

aclimatizados por 1 semana antes de serem incluídos nos experimentos e estiveram

sob um ciclo de 14 horas na presença de luz e 10 horas no escuro. O presente projeto

de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Cuidados Animais do Marine Biological

Laboratory e do Women and Infants Hospital e os animais receberam os cuidados

estabelecidos pelo protocolo de cuidados animais aprovados por estes dois comitês.

As camundongas foram submetidas a superovulação por meio da injeção intra-

peritoneal de 5 IU de PMSG, seguida após 44-48 horas pelo sacrifício dos animais

para a obtenção dos oócitos imaturos, que foram utilizados nos experimentos de

maturação in vitro (IVM).

Tratamento In Vitro

A solução de estoque de arsenito sódico (1 mg/ml) foi preparada em água

duplamente destilada e esterilizada por meio do uso de um filtro de 0,22 µm. As

soluções de trabalho utilizadas no presente estudo (2, 4 e 8 µg/ml) foram obtidas pela

diluição da solução de estoque em meio de cultivo para maturação in vitro (IVM).

Foram determinados os efeitos in vitro de diferentes concentrações (2, 4 e 8 µg/ml) e

tempos de exposição ao arsenito (durante as 2 primeiras horas da cultura para IVM

ou durante todo o processo de IVM, ou seja, 12-14 horas) na progressão meiótica de

oócitos de camundongos submetidos à IVM.

A solução de estoque de N-acetil-cisteína (100 mg/ml) foi preparada em água

duplamente destilada e esterilizada por meio do uso de um filtro de 0,22 µm. A

solução de trabalho utilizada no presente estudo (30 mM) foi obtida pela diluição da

solução de estoque em meio de cultivo para IVM contendo 2 µg/ml de arsenito.

Excluído: camundongos

Excluído: , seguida após 46-48 horas da injeção intraperitoneal de 5 IU de gonadotrofina coriônica humana (hCG)

36

Obtenção de Oócitos Imaturos e Maturação In Vitro

O isolamento e o cultivo dos oócitos imaturos foram realizados de acordo

com protocolos descritos previamente (30). Para a obtenção de oócitos imaturos, as

fêmeas foram sacrificadas por deslocamento cervical 44-48 horas após a injeção do

PMSG. Foi realizada a ooforectomia bilateral e a punção dos folículos ovarianos em

HKSOM a 34-37°C, para a obtenção dos oócitos imaturos envoltos pelos complexos

de células do cumulus. Os oócitos desnudos, não envoltos pelas células do cumulus,

não foram utilizados nos experimentos. Os complexos intactos de células do cumulus

e oócitos em estágio de vesícula germinal foram lavados 3 vezes em meio de cultivo

para maturação in vitro (Minimum Essential Medium – GIBCO, Grand Island, NY,

suplementado com 10% de albumina fetal bovina e 5 IU de PMSG/ml) e, após,

colocados em poços contendo: 1. apenas meio de cultivo para IVM (grupo controle);

2. meio de cultivo para IVM suplementado com diferentes concentrações e tempos

de exposição ao arsenito (2, 4 ou 8 µg/ml de arsenito apenas durante as 2 primeiras

horas da cultura para IVM ou 2 µg/ml de arsenito durante 12-14 ou 15-17 horas); 3.

meio de cultivo para IVM suplementado com 2 µg/ml de arsenito + 30 mM de N-

acetil-cisteína apenas durante as 2 primeiras horas da cultura para IVM. As placas de

Petri contendo os complexos oócitos-cumulus foram colocadas na incubadora a

37°C, em 7% de CO2 e em ar umidificado. Nos experimentos em que foi utilizada a

exposição in vitro ao arsenito ou ao arsenito + N-acetil-cisteína apenas durante as 2

primeiras horas do processo de IVM, as placas de Petri foram retiradas da incubadora

após este período, os complexos oócitos-cumulus, lavados pelo menos 3 vezes em

meio de cultura para IVM, e, após, mantidos neste meio até se completar 12-14 ou

15-17 horas de cultura. No grupo controle e no tratado com 2 µg/ml de arsenito por

37

12-14 horas, as placas de Petri foram mantidas na incubadora durante todo o

processo de IVM (12-14 horas). Após este tempo em cultura, as células do cumulus

foram removidas através de delicada pipetagem em HKSOM contendo 0,03% de

hialuronidase. Os oócitos livres das células do cumulus foram lavados 3 vezes em

HKSOM para a completa remoção da hialuronidade, lavados novamente 3 vezes em

KSOM pré-equilibrado e então colocados na incubadora por 30 minutos, a 37°C, em

7% de CO2 e em ar umidificado, para serem posteriormente submetidos a avaliação

pela microscopia de polarização (pol-scope) ou fixação para realização de

microscopia de fluorescência, para a avaliação do fuso celular e da distribuição

cromossômica, como descrito a seguir.

Todos os procedimentos de manipulação oocitária foram realizados em placas

de Petri colocadas sobre uma placa aquecida para a adequada manutenção da

temperatura entre 34-37°C.

Microscopia de Fluorescência da Tubulina e da Cromatina

Os oócitos desnudos foram fixados e extraídos durante 30 minutos a 37°C em

um tampão estabilizador de microtúbulos (31,32). O oócitos foram lavados pelo

menos 3 vezes e bloqueados dutante a noite, a 4°C, em um meio de lavagem (PBS

suplementado com 0,02% de NaN3, 0,01% de Triton X-100, 0,2% de leite desnatado,

2% de soro de cabra, 2% de albumina sérica bovina e 0,1 M de glicina). Após, os

oócitos foram incubados com anticorpos monoclonais de camundongo anti β-

tubulina (1:150), lavados e então incubados com isotiocianato de fluorisceína (FITC)

conjugado com IgG anti imunoglobulina de camundongo (1:200; Molecular Probes,

OR) a 37°C durante 2 horas. Após serem lavadas novamente, as amostras foram

38

colocadas sobre uma lâmina de vidro, coradas com Hoechst 33342 (10 µg/ml) em

meio de montagem constituído por Vectashield (H-1000, Vectyor) e presas pela

colocação de lamínulas. As amostras foram analisadas em um microscópio invertido

de fluorescência (Zeiss Axiovert 100T) e as imagens foram capturadas pelo software

Axio Vision 3.0.

Microscopia de Polarização (Pol-Scope)

Os fusos celulares de alguns oócitos foram imageados usando um

microscópio invertido (Zeiss Axiovert 100), equipado com uma vídeo câmera Cohu e

o com o hardware do pol-scope, o qual consiste de cristais elétricos e de um

controlador eletro-óptico (Cambridge Research & Instrumentation, Boston, MA)

(33,34). Os grupos de cristais elétricos foram controlados pelo computador através

do software MetaMorph (Universal Imaging Corp., Boston, MA). Os oócitos foram

imageados a 37°C, em poços de 100 µl de HKSOM, em placas de Petri revestidas

com vidro na parte inferior (MatTek Corp., Ashland, MA), colocadas sobre uma

placa aquecida a 37-38°C. O microscópio ficava contido em uma câmara isolada de

aço inoxidável, permitindo o adequado controle térmico que foi mantido em torno de

37 -38°C.

Para controlar algumas variações experimentais entre os oócitos,

especialmente a temperatura e o tempo após a coleta dos mesmos, foram realizadas,

para cada grupo, 3-4 réplicas de experimentos, sendo que apenas 4-5 oócitos foram

analisados em cada experimento.

O pol-scope, como descrito em estudos anteriores (33-37), possibilita a

visualização de estruturas birrefringentes em células vivas, sem a necessidade de

39

fixação ou coloração. Os fusos celulares são estruturas birrefringentes e, portanto,

passíveis da avaliação não invasiva por esta tecnologia. A racionalidade do uso do

pol-scope neste estudo foi avaliar se as anomalias do fuso celular causadas pelo

arsenito, caso confirmadas, poderiam ser detectadas por meio desta técnica inócua e

não invasiva, o que poderia ter implicações clínicas potenciais.

Caracterização das Anomalias da Meiose

Definimos como anomalias meióticas a presença de alterações do fuso celular

(perda total ou parcial da integridade de suas fibras e/ou de sua forma normal de

barril) e/ou mal alinhamento cromossômico (deste 1 único cromossomo mal alinhado

até o completo desalinhamento e/ou espalhamento cromossômico no interior celular).

A microscopia de fluorescência possibilita a avaliação detalhada destas 2 variáveis,

ao passo que a microscopia de polarização (pol-scope), como já descrito

anteriormente, possibilita a adequada análise apenas da morfologia do fuso celular.

RESULTADOS

Anomalias na meiose oocitária durante o processo de maturação in vitro

O tratamento in vitro com arsenito produziu anomalias meióticas em oócitos

de camundongo submetidos à maturação in vitro (Tab. 1 e 2; Fig 1 e 2).

Pela microscopia de fluorescência (Tab. 1), evidenciamos que no grupo

controle, vinte e seis de 27 oócitos (96,3%) completaram adequadamente o processo

de maturação in vitro (IVM), atingindo com normalidade a metáfase II após 12-14 h

em cultura. Na Fig. 1A visualizamos a imagem de um oócito controle, apresentando

o fuso celular morfologicamente normal em metáfase II e os cromossomos

40

apropriadamente distribuídos e alinhados. A exposição a 2 µg/ml de arsenito por 12-

14 h ou a 8 µg/ml por 2 h, bloqueou a maturação oocitária no estágio de vesícula

germinal (em respectivamente, 64.7% e 20% dos oócitos avaliados), ou de GVBD

(em respectivamente, 35.3% e 80% dos oócitos estudados), após 12-14 h de cultura.

A exposição a 2 ou 4 µg/ml de arsenito por 2 h causou atraso no processo de IVM e

anormalidades meióticas em, respectivamente, 75% e 80% dos oócitos avaliados.

Quatorze dos 20 oócitos (70%), submetidos à IVM na vigência de 2 µg/ml de

arsenito por 2 h, e 16 dos 20 oócitos (80%), submetidos à IVM na vigência de 4

µg/ml de arsenito por 2 h, apresentaram aberrações na primeira divisão meiótica,

após 12-14 h em cultura. Todavia, após 15-17 h em cultura, 15 dos 23 (65.2%)

oócitos tratados com 2 µg/ml de arsenito por 2 h atingiram a metáfase II, dos quais

66,7% (10 dos 15 oócitos que atingiram a segunda divisão meiótica) exibiram

anormalidades (Tab. 1). Nas Fig. 1B, C e D visualizamos exemplos de oócitos

apresentando anomalias meióticas, caracterizadas por perda da integridade do fuso

celular e mal alinhamento cromossômico, após 12-17 horas de IVM na vigência de 2

µg/ml de arsenite por 2 horas (vide legenda para maiores detalhes).

Pela microscopia de polarização (Tab. 2), evidenciamos que no grupo

controle, todos os 19 oócitos avaliados completaram o processo de maturação in vitro

(IVM), apresentando fusos celulares morfologicamente normais após 12-14 h em

cultura (Fig. 2A). A exposição a 2 µg/ml de arsenito por 12-14 h ou a 8 µg/ml por 2

h, bloqueou a maturação oocitária no estágio de vesícula germinal (em

respectivamente, 80% e 20% dos oócitos avaliados), ou de GVBD (em

respectivamente, 20% and 80% dos oócitos estudados), após 12-14 h de cultura. A

exposição a 2 ou 4 µg/ml de arsenito por 2 h causou atraso no processo de IVM e

41

anormalidades meióticas em, respectivamente, 75% e 90,9% dos oócitos avaliados.

Oito dos 12 oócitos (66,7%), submetidos à IVM na vigência de 2 µg/ml de arsenito

por 2 h, e 10 dos 11 oócitos (90,9%), submetidos à IVM na vigência de 4 µg/ml de

arsenito por 2 h, apresentaram aberrações no fuso celular da primeira divisão

meiótica, após 12-14 h em cultura. Entretanto, após 15-17 h em cultura, oito dos 11

(72,7%) oócitos tratados com 2 µg/ml de arsenito por 2 h atingiram a metáfase II, dos

quais 62,5% (5 dos 8 oócitos que atingiram a segunda divisão meiótica) exibiram

anormalidades (Tab. 2). Nas figuras 2B e C, são apresentados, respectivamente,

fusos celulares completamente ou parcialmente desintegrados de oócitos submetidos

à IVM na vigência de 2 µg/ml de arsenito nas 2 primeiras horas do processo de IVM

(vide legenda para maiores detalhes).

Obtivemos dados similares com o uso da microscopia de polarização e de

fluorescência no presente estudo.

Co-administração de N-acetil-cisteína e anomalias meióticas induzidas pelo

arsenito durante o processo de maturação in vitro

Enquanto a exposição a 2 µg/ml de arsenito nas 2 primeiras horas do processo

de IVM promoveu anormalidades meióticas em 80% e 75% dos oócitos avaliados,

respectivamente, pela microscopia de fluorescência e de polarização, após 12-14

horas de cultura, a co-administração de N-acetil-cisteína completamente preveniu a

detecção das anomalias meióticas induzidas pelo arsenito. Dos oócitos analisados,

submetidos à exposição concomitante a 2 µg/ml de arsenito e 30 mM de N-acetil-

cisteína durante as 2 primeiras horas do processo de IVM, 96,4% e 100%

42

alcançaram normalmente a metáfase II, segundo a análise, respectivamente, pela

microscopia de fluorescência e de polarização (Tab. 3; Fig. 3).

DISCUSSÃO

Os nossos dados demonstraram que a exposição in vitro ao arsenito promoveu

anomalias meióticas durante o processo de maturação in vitro de oócitos de

camundongo. As anomalias meióticas secundárias à administração do arsenito foram

dependentes da dose e do tempo de exposição a este agente. Desta forma, a

exposição a uma baixa concentração de arsenito (2 µg/ml), durante todo o processo

de maturação in vitro (12-14 horas), ou a uma elevada concentração (8 µg/ml),

apenas durante as 2 primeiras horas deste processo, bloqueou completamente a

maturação oocitária. Já a exposição a baixas concentrações de arsenito (2 ou 4

µg/ml) apenas durante as 2 primeiras horas do processo de IVM causou tanto atraso

no processo de IVM, uma vez que a maioria dos oócitos avaliados não atingiu a

segunda divisão meiótica após 12-14 horas em cultura, como elevada incidência de

anormalidades meióticas, sobretudo aberrações na metáfase da primeira divisão

meiótica. A prolongação do tempo de cultura para 15-17 horas reverteu parcialmente

este bloqueio do processo de IVM, uma vez que a maioria dos oócitos tratados com 2

µg/ml de arsenito durante as 2 primeiras horas da IVM (65.2%) atingiu a segunda

divisão meiótica, sem, contudo, prevenir a ocorrência de anomalias meióticas.

Apesar da microscopia de polarização permitir a avaliação apenas das características

do fuso celular, não possibilitando a análise do alinhamento cromossômico, houve

similaridade entre os dados obtidos por este método e pela microscopia de

fluorescência. A provável justificativa deste achado foi a concomitância de

43

anomalias do fuso celular e da distribuição cromossômica na imensa maioria dos

oócitos que apresentaram anormalidades meióticas produzidas pelo arsenito. Este

fato sugeriu que a utilização da microscopia de polarização poderia ser útil na

triagem de possíveis anormalidades, não só do fuso celular, como, indiretamente, do

alinhamento cromossômico, em células germinativas femininas, expostas a este

elemento. Como alguns estudos evidenciaram ser esta uma técnica inócua em oócitos

humanos (38-40), sugerimos que o pol-scope poderia ter aplicabilidade prática na

triagem de possíveis anomalias meióticas em oócitos humanos, oriundos de mulheres

expostas a este contaminante ambiental, previamente aos procedimentos de

reprodução assistida, o que precisa ser mais bem avaliado.

Como citado anteriormente, este metal pesado tem sido exaustivamente

estudado como um agente teratogênico em mamíferos, sendo que o seu potencial

para promover toxicidade desenvolvimental tem sido investigado em algumas

espécies de animais de laboratório (7-13). Dados oriundos de estudos com animais

demonstraram que o arsênio inorgânico pode causar malformações e óbito fetais,

bem como retardo de crescimento intra-útero (7-13). Informações sobre a toxicidade

desenvolvimental do arsênio inorgânico em seres humanos limitam-se a uns poucos

estudos epidemiológicos de populações expostas a este contaminante pelas vias oral

e inalatória (5,6,13). Alguns destes estudos evidenciaram um aumento na incidência

de abortamento espontâneo, natimortalidade e baixo peso ao nascer na prole das

populações expostas. Contudo, a interpretação destes dados é complicada, devido à

exposição concomitante destas populações a diversos poluentes e à possível presença

de outras variáveis não avaliadas nestes estudos, o que dificulta a análise dos efeitos

isolados da contaminação arsenical no sistema reprodutivo de seres humanos. Os

44

mecanismos responsáveis pela toxicidade desenvolvimental atribuída ao arsenito não

foram elucidados até o presente. Torna-se relevante a investigação se a exposição

ambiental a este poluente é capaz de promover disfunção oocitária e embrionária em

animais e mulheres residentes em áreas contaminadas. Todavia, os dados do presente

estudo, ao evidenciarem a capacidade do arsenito de promover, in vitro, anomalias

meióticas em células germinativas, podem dar subsídios, pelo menos em parte, para

se justificar a toxicidade reprodutiva deste metal pesado, o que precisa ser mais bem

avaliado por meio de estudos dos efeitos in vivo deste agente.

Os mecanismos responsáveis pelos efeitos tóxicos do arsenito na meiose

oocitária não foram bem esclarecidos até o momento, contudo, presumivelmente

envolvam a disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo (17-19,41,42). Como

descrito anteriormente, o arsenito pode comprometer a função mitocondrial e

estimular a produção de radicais livres do oxigênio em diferentes espécies e tipos

celulares (17-19). O estresse oxidativo, por sua vez, pode danificar diversas proteínas

intracelulares (20,21), algumas das quais são importantes para a organização do fuso

celular (22-24) e, ao mesmo tempo ou independentemente, lesar o DNA e induzir o

mal alinhamento cromossômico (25,26), produzindo, desta forma, anormalidades no

ciclo celular. Inclusive, há evidências de que o arsenito seja capaz de ocasionar estes

efeitos deletérios sobre o fuso celular e a integridade cromossômica em alguns tipos

celulares, possivelmente em virtude da indução da produção de radicais livres do

oxigênio (43). As anomalias meióticas podem, por sua vez, contribuir para a falência

do desenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade

do oócito em completar o processo de maturação, tornando-se incapaz de ser

fertilizado, até a ocorrência de erros variáveis no processo de maturação meiótica que

45

não impossibilitam a fertilização, mas, contudo, podem comprometer o

desenvolvimento embrionário pré e/ou pós-implantação, bem como a viabilidade

futura do concepto (44-46).

Os nossos achados de que as anomalias meióticas induzidas pelo arsenito

puderam ser revertidas pela co-administração de N-acetil-cisteína, corroboraram os

dados da literatura (27) e sugeriram que a produção de radicais livres do oxigênio

possa estar envolvida na toxicidade deste agente à meiose oocitária. A análise da

viabilidade funcional dos oócitos expostos in vitro, concomitantemente, ao arsenito e

à N-acetil-cisteína, por meio da realização de fertilização in vitro e avaliação do

desenvolvimento embrionário pré e pós-implantação, seria de grande valia no sentido

de determinarmos se este antioxidante é capaz de prevenir, não somente as anomalias

morfológicas meióticas, como também as possíveis anomalias funcionais destas

células germinativas.

Nossos dados demonstraram que a exposição in vitro ao arsenito induziu

anomalias na meiose oocitária, dependentes da dose e do tempo de exposição a este

agente. A co-administração de N-acetil-cisteína preveniu, pelo menos aparentemente,

as anomalias meióticas induzidas pelo arsenito, sugerindo serem as mesmas, pelo

menos em parte, decorrentes do estresse oxidativo estimulado por este metal pesado.

Este estudo também forneceu um modelo para a avaliação dos efeitos in vitro de

outros metais pesados na meiose oocitária, durante o processo de maturação in vitro .

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51

Tabela 1. Microscopia de fluorescência do fuso celular e dos cromossomos de oócitos de camundongos, tratados in

vitro com diferentes concentrações de arsenito, após cultura para maturação in vitro.

Arsenito

(ug/ml)

Tempo

Exposição

(h)

No.

Total

Oócitos

GV

n

GVBD

n

Metáfase I

Normal Anormal

n n

Telófase I

Normal Anormal

n n

Metáfase II

Normal Anormal

n n

0 12-14 27 1 26

2 12-14 17 11 6

2 2 20 1 12 2 2 2 1

2* 2 23 8 5 10

4 2 20 3 16 1

8 2 25 5 20

GV: vesícula germinal; GVBD: vesícula germinal breakdown. *: 15-17h em cultura para maturação in vitro; Demais: 12-14h em cultura para maturação in vitro. Anormal: anomalias no fuso celular e/ou no alinhamento/distribuição cromossômicos.

Tabela 2. Microscopia de polarização do fuso celular de oócitos de camundongos, tratados in vitro com diferentes

concentrações de arsenito, após cultura para maturação in vitro.

Arsenito

(ug/ml)

Tempo

Exposição

(h)

No.

Total

Oócitos

GV

n

GVBD

n

Metáfase I

Normal Anormal

n n

Telófase I

Normal Anormal

n n

Metáfase II

Normal Anormal

n n

0 12-14 19 19

2 12-14 10 8 2

2 2 12 1 7 1 1 1 1

2* 2 11 3 3 5

4 2 11 9 1 1

8 2 10 2 8

GV: vesícula germinal; GVBD: vesícula germinal breakdown. *: 15-17h em cultura para maturação in vitro. Demais: 12-14h em cultura para maturação in vitro. Anormal: anomalias no fuso celular.

52

Tabela 3. Microscopia de fluorescência e de polarização de oócitos de camundongos, tratados in vitro com arsenito ou

com arsenito e N-acetil-cisteína, após cultura para maturação in vitro.

Método

Tratamento Tempo

Exposição

(h)

No.

Total

Oócitos

Metáfase I

Normal Anormal

n n

Telófase I

Normal Anormal

n n

Metáfase II

Normal Anormal

n n

M. Fluorescência As 2 20 13 2 2 2 1

As+NAC 2 28 1 27

M. Polarização As 2 12 1 7 1 1 1 1

As+NAC 2 11 11

M: microscopia; As: arsenito; NAC: N-acetil-cisteína. Dose: 2ug/ml de arsenito por 2 h; 30 mM de NAC por 2 h; Tempo em cultura para maturação in vitro: 12-14 h.

53

54

55

5 ARTIGO 2

56

EFEITOS DO ARSENITO NA MEIOSE, NO DESENVOLVIMENTO

EMBRIONÁRIO PRÉ-IMPLANTAÇÃO E NA APOPTOSE EMBRIONÁRIA

DE CAMUNDONGOS

Paula A. A. S. Navarro1,2,3 , Lin Liu1,2, Rui A. Ferriani3 e David L.

Keefe1,2,4

1 Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Women & Infants Hospital,

Brown University, Providence, Rhode Island 02905

2 Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusetts 02543

3 Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de

Ribeira o Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo

14049-000, Brasil

4Correspondência para: Dr. David L. Keefe Brown University, Women and Infants Hospital, and Marine Biological Laboratory 7 MBL Street Woods Hole, MA 02543 USA Tel: (508) 289 7649 Fax: (508) 540 6902 E-mail: dkeefe@wihri.org

Título curto: Arsenito, meiose e desenvolvimento embrionário pré-implantação

Palavras chave: arsenito, anomalias meióticas, desenvolvimento embrionário pré-

implantação, apoptose.

57

RESUMO

O arsênio inorgânico, um contaminante ambiental, produz uma série de

respostas de estresse em células de mamíferos, incluindo o comprometimento da

função mitocondrial, acompanhado por inibição do crescimento celular e

carcinogênese. Como previamente identificamos efeitos deletérios do

comprometimento da função mitocondrial e dos radicais livres do oxigênio na

oogênese, investigamos os efeitos do arsenito na meiose, no desenvolvimento

embrionário pré-implantação e na apoptose embrionária em camundongos.

Camundongas com 6 semanas de idade foram tratadas com baixa (0,16 mg) ou média

dose de arsenito (0,32 mg), por meio de 7 injeções intraperitoneais, 1 a cada 2 dias,

durante 14 dias. Os controles foram injetados com solvente. A incidência de

anomalias meióticas, caracterizadas por anormalidades do fuso celular e/ou mal

alinhamento cromossômico, foi significantemente aumentada tanto nos oócitos in

vivo ovulados, como nos in vitro maturados, oriundos dos animais tratados com

arsenito. Foram detectadas reduções significativas das taxas de clivagem (24 horas

de cultivo), de formação de mórula (72 h) e de desenvolvimento para blastocisto (96

h), nos embriões dos grupos tratados com arsenito. Apesar do número total de

núcleos não ter diferido significativamente entre os blastocistos dos grupos controle e

de tratamento, a percentagem de núcleos apoptóticos foi significantivamente maior

nos blastocistos derivados dos animais tratados com a dose média de arsenito. Estes

dados sugerem que o arsenito causa aberrações meióticas, que podem contribuir

tanto para o comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação,

como para a apoptose embrionária.

58

ABSTRACT

Inorganic arsenic, an environmental contaminant, produces a variety of stress

responses in mammalian cells, including mitochondrial uncoupling accompanied by

growth inhibition and carcinogenesis. Because previously we identified detrimental

effects of mitochondrial uncoupling, and reactive oxygen species (ROS) on

oogenesis, we investigated effects of arsenite on meiosis, early embryo development,

and apoptosis in mice. Six-week-old CD-1 mice were treated with either low

(0.16mg) or medium (0.32mg) doses of arsenite every two days by 7 intraperitoneal

injections for 14 days, and controls were injected with solvent. The incidence of

meiotic anomalies, characterized by spindle disruption and/or chromosomal

misalignment or spreading, was significantly increased in both in vivo and in vitro

treated oocytes. Further, we found a significant decrease in cleavage rates at 24h,

morula formation at 72h, and development to blastocyst at 96h in treated groups.

Although the total number of nuclei in developed blastocysts did not significantly

differ between the treated and control groups, the percentage of apoptotic nuclei was

significantly increased in blastocysts derived from the medium dose treated group.

These data suggest that arsenite causes meiotic aberrations, which may contribute to

decreased cleavage and preimplantation development, as well as increased apoptosis.

Short title: Arsenite, meiosis, and preimplantation development

Key words: arsenite, meiotic abnormalities, preimplantation development, apoptosis.

59

INTRODUÇÃO

O arsênio inorgânico é onipresente no meio ambiente, onde aparece

principalmente como compostos de arsenito (As3+) e arsenato (As5+). Pequenas

quantidades de arsênio estão normalmente presentes nas rochas, no solo, na água, no

ar e em certos alimentos [1], entretanto, altos níveis podem resultar em contaminação

ambiental. Os seres humanos geralmente estão expostos ao arsênio oriundo de fontes

naturais, apresentando uma ingestão diária tipicamente na faixa de 12-40 µg/dia

[2,3]. Contudo, existem depósitos minerais naturais, em certas regiões dispersas pelo

mundo, como em Taiwan, México, Argentina, Índia e Estados Unidos [4,5], com

quantidades suficientes de arsênio inorgânico para contaminar os reservatórios de

água e se constituírem em risco potencial para a saúde populacional. Na Índia, por

exemplo, os níveis de arsênio excedem 300 µg/l em cerca de 27% dos suprimentos

de água e 1 mg/l, em 5% dos reservatórios [6], sendo muitas vezes superior ao nível

máximo permitido nos Estados Unidos, que é de 50 µg/l. Apesar de os reservatórios

de água dos Estados Unidos apresentarem, em geral, baixas concentrações de

arsênio, existem relatos de contaminação por este poluente em porções do Sudeste,

onde os níveis de arsênio na água atingem até mais de 1 mg/l [7,8]. Além da

exposição oral e crônica por meio da ingestão de água e alimentos contaminados pelo

arsênio, a exposição pela via inalatória também é tóxica e pode comprometer os

indivíduos que trabalham ou residem nas imediações de regiões com contaminação

do ar por este metal [9,10].

A preocupação com a contaminação ambiental por este metal e suas possíveis

conseqüências para a saúde populacional é tamanha, que numerosas agências

internacionais têm procurado reduzir os níveis aceitáveis do mesmo na água de 50

Excluído:

Excluído: e de outras partes do país

Excluído: c

Excluído: c

Excluído: ocorrer

Excluído: em

60

para 10 µg/l. Particularmente nos Estados Unidos, onde o arsênio inorgânico

constitui-se em um dos contaminantes ambientais presente tanto na Lista de

Prioridades Nacionais dos Estados Unidos [11], como na da Agência de Proteção

Ambiental Norte Americana, vultosos fundos têm sido dispensados no sentido de se

estudar os efeitos deletérios deste metal pesado a nível populacional e as possíveis

formas de se controlar e prevenir a contaminação ambiental [12].

Estudos epidemiológicos têm mostrado que a exposição crônica ao arsênio

inorgânico pode promover lesões hepáticas, neuropatia periférica, além de aumento

da incidência de câncer de pulmão, pele, bexiga e fígado em seres humanos [13].

Este metal pesado também tem sido exaustivamente estudado como um agente

teratogênico em mamíferos, sendo que o seu potencial para promover toxicidade

desenvolvimental tem sido investigado em algumas espécies de animais de

laboratório [14-21]. Dados oriundos de estudos com animais demonstraram que o

arsênio inorgânico pode causar malformações e óbito fetais, bem como retardo de

crescimento intra-útero [14-21]. A toxicidade desenvolvimental deste metal é

dependente da dose, da via de administração e do tempo de exposição [21].

Informações sobre a toxicidade reprodutiva e desenvolvimental do arsênio

inorgânico em seres humanos limitam-se a uns poucos estudos epidemiológicos de

populações expostas a este contaminante pelas vias oral e inalatória [11-14, 21].

Alguns destes estudos evidenciaram um aumento na incidência de abortamento

espontâneo, natimortalidade e baixo peso ao nascer na prole das populações

expostas. Contudo, a interpretação destes dados é complicada, em virtude da

exposição concomitante destas populações a diversos poluentes e da possível

presença de outras variáveis não analisadas nestes estudos, o que dificulta a análise

Excluído: c

Excluído: c

Excluído: c

Excluído: c

Excluído: dada

Excluído: à

Excluído: à

61

dos efeitos isolados da contaminação arsenical no sistema reprodutivo de seres

humanos [11-14, 21]. Devido à escassez de informações e às limitações acima

descritas, torna-se relevante a obtenção de dados originados de estudos bem

conduzidos, utilizando modelos animais adequadamente estabelecidos, para

tentarmos predizer os possíveis riscos da exposição humana a este contaminante no

que se refere a sua potencial toxicidade embrionária e fetal.

Apesar do grande número de estudos sobre a toxicidade desenvolvimental do

arsênio inorgânico, dados acerca de seus possíveis efeitos na meiose, no

desenvolvimento embrionário pré-implantação e na promoção de apoptose

embrionária são bastante escassos e limitam-se a uns poucos estudos dos efeitos in

vitro deste metal. O arsênio compromete a função mitocondrial e estimula a

produção de radicais livres do oxigênio em diferentes espécies e tipos celulares de

mamíferos [22-25]. O estresse oxidativo, dependendo de sua severidade, pode

promover apoptose em embriões pré-implantação [26]. Recentemente, evidenciou-se,

em diferentes modelos animais, que a apoptose ou morte celular programada

ocorrem em embriões que falham na execução de eventos essenciais para seu

adequado desenvolvimento durante o primeiro ciclo celular [27]. Contudo, até o

presente momento, desconhece-se se a exposição a contaminantes ambientais, como

o arsênio inorgânico, promove estresse oxidativo e apoptose em embriões de

mamíferos. Como previamente demonstramos que o comprometimento da função

mitocondrial produz importantes efeitos tóxicos aos oócitos e ao desenvolvimento

embrionário [28,29], e como o arsênio inorgânico sabidamente altera a atividade

desta organela celular e provoca estresse oxidativo e apoptose em diferentes tipos

celulares, levantamos a hipótese de que o arsênio inorgânico poderia comprometer a

Excluído: Dada

Excluído: a

Excluído: a

Excluído: desenvolvimental

Excluído: c

Excluído: c

Excluído: a

Excluído: c

Excluído: nos

Excluído: no

Excluído: c

Excluído: c

62

meiose oocitária e o desenvolvimento pré-implantação, bem como estimular a

apoptose embrionária. Dentre os dois principais compostos do arsênio inorgânico,

optamos pelo estudo dos efeitos do arsenito, a forma trivalente do arsênio inorgânico,

em virtude da sua maior toxicidade quando comparada à forma pentavalente

(arsenato) e ao fato de ser este o principal agente arsenical responsável pelos efeitos

tóxicos atribuídos a este metal [21].

No presente estudo foram investigados os efeitos do tratamento in vivo com

arsenito na meiose de oócitos in vivo ovulados e in vitro maturados, no

desenvolvimento embrionário pré-implantação e na apoptose embrionária, em

camundongos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Reagentes e Animais

Todos os reagentes foram comprados da Sigma Chemical Co. (St. Louis,

MO), com exceção dos listados a seguir. A gonadotrofina sérica de égua prenha

(PMSG), que foi utilizada para a superovulação, foi comprada da Calbiochem (La

Jolla, CA). Foram utilizados no presente estudo camundongos CD1 (fêmeas com 6

semanas de vida e machos com 2-3 meses) comprados do Charles River Laboratory

(Boston, MA). Os animais foram aclimatizados por 1 semana antes de serem

incluídos nos experimentos e estiveram sob um ciclo de 14 horas na presença de luz

e 10 horas no escuro. O presente projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de

Cuidados Animais do Marine Biological Laboratory e do Women and Infants

Hospital e os animais receberam os cuidados estabelecidos pelo protocolo de

Excluído: c

Excluído: e

Excluído: c

Excluído: e

Excluído: e

Excluído: 8 a 10 semanas

Excluído: camundongos

63

cuidados animais aprovados por estes dois comitês. As camundongas foram

submetidas a superovulação por meio da injeção intra-peritoneal de 5 IU de PMSG.

Tratamento com Arsenito

Uma solução de estoque de arsenito sódico (1 mg/ml) foi preparada em água

duplamente destilada e esterilizada por meio do uso de um filtro de 0,22 µm. As

soluções de trabalho utilizadas no presente estudo foram obtidas pela diluição da

solução de estoque em água duplamente destilada.

Previamente à indução da ovulação, as camundongas foram tratadas ou com

baixa (8 mg/kg ou 0,16 mg) ou com média dose de arsenito (16 mg/kg ou 0,32 mg)

por meio de 1 injeção intraperitoneal (ip) a cada 2 dias durante 14 dias, totalizando 7

injeções para cada animal. Os controles foram submetidos à injeção ip de água

destilada.

Nestes experimentos, visávamos determinar se o arsenito poderia causar

anomalias meióticas oocitárias, comprometimento do desenvolvimento embrionário

pré-implantação e apoptose embrionária em animais expostos a este poluente

ambiental, mesmo na ausência de toxicidade materna, o que poderia ser útil na

avaliação do risco potencial de populações vivendo em regiões contaminadas por

este metal pesado sem a evidência de comprometimento orgânico. Foi utilizada,

portanto, uma dose baixa de arsenito, sendo escolhida a dose de 8 mg/kg, em virtude

de estudos prévios terem determinado ser esta a menor dose capaz de produzir

toxicidade desenvolvimental em camundongas grávidas, na ausência de promoção de

efeitos adversos maternos [30].

Excluído: , seguida após 46-48 horas da injeção intraperitoneal de 5 IU de gonadotrofina coriônica humana (hCG)

Excluído: como a

64

Estudos comparando a administração do arsenito por injeção parenteral (ip) e

por sondagem oro-gástrica evidenciaram que, quando se administrava a mesma dose

por ambas as vias, a freqüência de óbito embrionário e de malformações fetais era

maior pela via injetável do que pela enteral, ao mesmo tempo em que a mortalidade

materna era menor pela via parenteral [21]. Estes dados justificam a seleção pela via

de administração ip neste estudo.

Foi estabelecida a administração do arsenito ao longo de 14 dias para

mimetizarmos uma curta exposição crônica ao referido metal e a cada 2 dias para

evitarmos o alto nível de estresse ao qual os animais foram submetidos

secundariamente às injeções, o que poderia simular efeitos adversos a este metal,

mimetizando um possível efeito tóxico secundário ao tratamento com arsenito nos

animais tratados.

Ambas as doses de arsenito utilizadas ao longo do presente estudo não foram

tóxicas para todos os animais tratados.

Obtenção de Oócitos e de Embriões e Cultivo In Vitro

Para a obtenção dos oócitos maduros ovulados in vivo, as fêmeas foram

sacrificadas por deslocamento cervical 14 horas após a injeção de 5 IU ip de

gonadotrofina coriônica humana (hCG), a qual foi administrada 46-48 horas após a

administração do PMSG. Os complexos oócitos-cumulus foram liberados da ampola

do oviduto em meio de cultivo otimizado com potássio e tamponado com HEPES

(HEPES-buffered potassium simplex optimized médium, HKSOM) a 34-37°C. Os

demais procedimentos também foram realizados em placas de Petri colocadas sobre

uma placa aquecida para a adequada manutenção da temperatura entre 34-37°C. As

65

células do cumulus foram removidas através de delicada pipetagem em HKSOM

contendo 0,03% de hialuronidase [31]. Os oócitos livres das células do cumulus

foram, então, lavados 3 vezes em HKSOM para completa remoção da hialuronidade,

lavados novamente 3 vezes em KSOM pré-equilibrado e então colocados na

incubadora por 30 minutos, a 37°C, em 7% de CO2 e em ar umidificado, para serem

posteriormente submetidos a avaliação pela microscopia de polarização (pol-scope)

ou fixação para realização de microscopia de fluorescência, para avaliação do fuso

celular e da distribuição cromossômica, como descrito a seguir [32,33].

O isolamento e o cultivo dos oócitos imaturos foram realizados de acordo

com os protocolos descritos previamente [34]. Para a obtenção de oócitos imaturos,

as fêmeas foram sacrificadas por deslocamento cervical 44-48 horas após a injeção

do PMSG. Foi realizada a ooforectomia bilateral e a punção dos folículos ovarianos

em HKSOM a 34-37°C, para a obtenção dos oócitos imaturos envoltos pelos

complexos de células do cumulus. Os oócitos desnudos, não envoltos pelas células

do cumulus, não foram utilizados nos experimentos. Todos os procedimentos de

manipulação oocitária foram realizados em placas de Petri colocadas sobre uma

placa aquecida para a adequada manutenção da temperatura entre 34-37°C. Os

complexos intactos de células do cumulus e oócitos em estágio de vesícula germinal

foram lavados 3 vezes em meio de cultivo para maturação in vitro (Minimum

Essential Medium – GIBCO, Grand Island, NY, suplementado com 10% de

albumina fetal bovina e 5 IU de PMSG/ml) e colocados na incubadora a 37°C, em

7% de CO2 e em ar umidificado, durante 12-14 horas. Após este tempo em cultura,

as células do cumulus foram removidas através de delicada pipetagem em HKSOM

contendo 0,03% de hialuronidase [31]. Os oócitos livres das células do cumulus

66

foram lavados 3 vezes em HKSOM para a completa remoção da hialuronidade,

lavados novamente 3 vezes em KSOM pré-equilibrado e então colocados na

incubadora por 30 minutos, a 37°C, em 7% de CO2 e em ar umidificado, para serem

posteriormente submetidos à avaliação pela microscopia de polarização (pol-scope)

ou fixação para realização de microscopia de fluorescência, para avaliação do fuso

celular e da distribuição cromossômica, como descrito a seguir [32,33].

Os oócitos fertilizados in vivo foram obtidos de fêmeas submetidas à

superovulação com PMSG, indução da ovulação com hCG e cópula com machos

CD-1 com 2 a 3 meses de idade e fertilidade comprovada. Imediatamente após a

injeção ip de 5 UI de hCG, cada fêmea foi colocada, individualmente, com um

macho. As fêmeas foram avaliadas após 20-21 horas em contato com os machos,

sendo que aquelas que apresentavam placas vaginais esbranquiçadas, indicativas da

presença da cópula, foram sacrificadas por deslocamento cervical. Os zigotos

envoltos pelas células do cumulus foram coletados dos ovidutos das fêmeas e

colocados em placas de Petri contendo HKSOM. As células do cumulus foram

removidas através de delicada pipetagem em HKSOM contendo 0,03% de

hialuronidase. Os zigotos livres das células do cumulus foram, então, lavados 3 vezes

em HKSOM para a completa remoção da hialuronidade e lavados novamente 3 vezes

em KSOM pré-equilibrado. A manipulação in vitro destes oócitos foi realizada em

HKSOM a 34-37°C sobre uma placa aquecida. Os oócitos fertilizados in vivo foram

cultivados em poços de 50 µl de KSOM, suplementado com aminoácidos essenciais

e 2,5 mM de HEPES [35-37], sob óleo mineral, a 37°C, em 7% de CO2 e em ar

umidificado. Os embriões foram avaliados quanto à clivagem após 24 horas em

cultivo, à formação de mórula após 72 horas e ao desenvolvimento para blastocisto

67

após 96 horas de cultura. Após a última avaliação com 96 horas de cultura, os

blastocistos foram fixados e o número de células apoptóticas determinado, como

descrito a seguir.

Microscopia de Fluorescência da Tubulina e da Cromatina

Os oócitos desnudos foram fixados e extraídos durante 30 minutos a 37°C em

um tampão estabilizador de microtúbulos [32,33]. O oócitos foram lavados pelo

menos 3 vezes e bloqueados dutante a noite, a 4°C, em um meio de lavagem (PBS

suplementado com 0,02% de NaN3, 0,01% de Triton X-100, 0,2% de leite desnatado,

2% de soro de cabra, 2% de albumina sérica bovina e 0,1 M de glicina). Após, os

oócitos foram incubados com anticorpos monoclonais de camundongo anti β-

tubulina (1:150), lavados e então incubados com isotiocianato de fluorisceína (FITC)

conjugado com IgG anti imunoglobulina de camundongo (1:200; Molecular Probes,

OR) a 37°C durante 2 horas. Após serem lavadas novamente, as amostras foram

colocadas sobre uma lâmina de vidro, coradas com Hoechst 33342 (10 µg/ml) em

meio de montagem constituído por Vectashield (H-1000, Vectyor) e presas pela

colocação de lamínulas. As amostras foram analisadas em um microscópio invertido

de fluorescência (Zeiss Axiovert 100T) e as imagens foram capturadas pelo software

Axio Vision 3.0.

Microscopia de Polarização (Pol-Scope)

Os fusos celulares de alguns oócitos foram analisados usando-se um

microscópio invertido (Zeiss Axiovert 100), equipado com uma vídeo câmera Cohu e

o com o hardware do pol-scope, o qual consiste de cristais elétricos e de um

68

controlador eletro-óptico (Cambridge Research & Instrumentation, Boston, MA)

[38,39]. Os grupos de cristais elétricos foram controlados pelo computador através

do software MetaMorph (Universal Imaging Corp., Boston, MA). Os oócitos foram

avaliados a 37°C, em poços de 100 µl de HKSOM, em placas de Petri revestidas com

vidro na parte inferior (MatTek Corp., Ashland, MA), colocadas sobre uma placa

aquecida a 37-38°C. O microscópio ficava contido em uma câmara isolada de aço

inoxidável, permitindo o adequado controle térmico que foi mantido em torno de 37-

38°C.

Para controlar algumas variações experimentais entre os oócitos,

especialmente a temperatura e o tempo após a coleta dos mesmos, foram realizadas

3-4 réplicas de experimentos para cada grupo, sendo que apenas 4-5 oócitos foram

analisados em cada experimento.

O pol-scope, como descrito em estudos anteriores [38,39], possibilita a

visualização de estruturas birrefringentes em células vivas, sem a necessidade de

fixação ou coloração. Os fusos celulares são estruturas birrefringentes e, portanto,

passíveis da avaliação não invasiva por esta tecnologia. A racionalidade do uso do

pol-scope neste estudo foi avaliar se as anomalias do fuso celular causadas pelo

arsenito, caso confirmadas, poderiam ser detectadas por meio desta técnica inócua e

não invasiva, o que poderia ter implicações clínicas potenciais.

Caracterização das Anomalias da Meiose

Consideramos como um fuso celular normal em metáfase aquele

caracterizado pela presença de fibras distribuídas simétrica e radialmente com o

formato de barril, com orientação paralela à membrana cortical, presença de 2 polos

Excluído: μ

69

anastrais e cromossomos alinhados ao longo de sua parte média. As anomalias

meióticas foram definidas pela presença de alterações do fuso celular (perda total ou

parcial da integridade das suas fibras e/ou da sua forma normal de barril) e/ou mal

alinhamento cromossômico (deste 1 único cromossomo mal alinhado até o completo

espalhamento cromossômico no interior da célula).

Quando analisados pelo pol-scope, os fusos celulares em metáfase foram

caracterizados pela presença de fibras birrefringentes distribuídas radialmente, com a

forma de barril e orientadas paralelamente à membrana cortical. Como os

cromossomos são minimamente birrefringentes, apareceram com uma região escura

ao longo da porção média do fuso celular metafásico. As anomalias meióticas foram

definidas segundo esta técnica pela presença de anormalidades apenas do fuso celular

(perda total ou parcial da integridade das suas fibras, e/ou da sua forma normal de

barril e/ou o seu completo desaparecimento).

Detecção de Apoptose Embrionária

Os embriões foram fixados em paraformaldeído a 3,7% diluído em PBS

contendo 0,1% de polivinilpirrolidona. A fragmentação do DNA nuclear embrionário

foi detectada pelo método TUNEL (terminal desoxynucleotidyl transferase mediated

d-UTP nick and labeling), utilizando o Kit de Detecção de Morte Celular In Situ

(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Os núcleos foram corados com PI

(propidium iodine 50 µg/ml; Molecular Probes, Eugene, OR), como descrito

previamente [28,40,41]. A fluorescência foi detectada pelo uso de um microscópio

invertido (Zeiss Axiovert 100). Em adição à análise acima descrita, também foi

70

avaliada a presença de perda da integridade celular e de condensação nuclear como

indicativos de apoptose [42,43].

Análise Estatística

A análise de variância (ANOVA) e o teste exato de Fisher, usando o software

StatView do SAS (Cary, NC), foram utilizados para as comparações das médias. O

teste do Chi-Quadrado foi utilizado para as comparações das percentagens. Foi

considerado como estatisticamente significante a presença de P < 0,05.

RESULTADOS

Efeitos do Tratamento In Vivo com Arsenito na Meiose de Oócitos de

Camundongo Ovulados In Vivo

A incidência de anomalias na meiose oocitária, caracterizadas por alterações

no fuso celular e/ou na distribuição cromossômica, evidenciadas por microscopia de

fluorescência, foi significantemente maior (p < 0,05) em ambos os grupos tratados

com arsenito (presença de 25 % de anomalias no grupo tratado com a dose baixa e

62,5 %, com a dose média), do que no grupo controle, que exibiu fusos celulares

normais e adequada distribuição cromossômica em todos os oócitos ovulados in vivo.

No grupo tratado com a dose baixa, quatro oócitos (7,2%) apresentaram perda da

integridade do fuso celular, sem comprometimento da distribuição cromossômica,

cinco oócitos (8,9%) exibiram anomalias da distribuição cromossômica, sem

alterações do fuso celular e cinco oócitos (8,9%) evidenciaram tanto alterações do

fuso celular, quanto da distribuição cromossômica. No grupo tratado com a dose

média, dois oócitos (5%) foram ovulados no estágio de vesícula germinal (GV) e seis

Excluído: ¶

71

(15%), na metáfase da meiose I (MI), apresentando anomalias tanto do fuso celular,

como da distribuição cromossômica, evidenciando um bloqueio in vivo da maturação

oocitária. Neste mesmo grupo, dezenove oócitos (47,5%) exibiram anomalias da

metáfase da meiose II (MII; sendo que 1 oócito apenas exibiu anormalidades da

distribuição cromossômica e 18, alterações tanto do fuso celular, quanto da

distribuição cromossômica). Neste grupo, apenas 13 oócitos (32,5%) apresentaram

fusos celulares normais em metáfase da MII, exibindo cromossomos alinhados na

sua porção mediana (Tab. 1 e Fig. 1). Na Fig. 1 evidencia-se a presença de: 1.

cromossomos adequadamente alinhados e distribuídos na porção mediana de um fuso

celular morfologicamente normal na metáfase da MII de um oócito do grupo

controle; 2. mal alinhamento de alguns poucos cromossomos, distribuídos sobre um

fuso celular morfologicamente anormal em um oócito do grupo tratado com a baixa

dose de arsenito; 3. completa desintegração do fuso celular, que se apresenta como

aglomerados de microtúbulos dispersos pelo citoplasma oocitário, associada à

desintegração ou condensação cromossômicas, características do processo inicial de

fragmentação oocitária, presentes em dois oócitos do grupo tratado com a dose média

de arsenito.

Quando utilizamos a microscopia de polarização (pol-scope), detectamos

anomalias no fuso celular em 15,4% (2 de 13 oócitos) e 46,2% (6 de 13 oócitos) dos

oócitos dos grupos tratados, respectivamente, com a baixa e a média dose de arsenito

(Tab. 2 e Fig. 2). Como descrito previamente, o pol-scope possibilita a visualização

de fusos celulares normais e anormais em oócitos vivos, sem a necessidade de

fixação e de coloração. Contudo, os cromossomos não são adequadamente avaliados

por esta técnica, por serem estruturas minimamente birrefringentes. Assim sendo, a

72

menor percentagem de anomalias meióticas detectada pela microscopia de

polarização (baixa dose: 15,4% e média dose: 46,2%), quando comparada com a

microscopia de fluorescência (baixa dose: 25% e média dose: 62,5%), provavelmente

se deve à habilidade limitada do pol-scope em avaliar a distribuição cromossômica.

Na Fig. 2 evidencia-se que o pol-scope possibilitou a visualização detalhada das

fibras birrefringentes de um fuso celular normal em oócitos controles, bem como a

perda da integridade das fibras e/ou da forma do fuso celular em oócitos tratados

com ambas as doses de arsenito.

Efeitos do Tratamento In Vivo com Arsenito na Meiose de Oócitos de

Camundongo Maturados In Vitro

O tratamento in vivo com arsenito também produziu anomalias meióticas em

oócitos de camundongo coletados imaturos e submetidos à maturação in vitro. Pela

microscopia de fluorescência (Tab. 3 e Fig. 3), evidenciamos que no grupo controle,

48 de 50 oócitos (96%) completaram in vitro o processo de maturação, atingindo a

metáfase II após 12-14 h em cultura e apresentando fusos celulares

morfologicamente normais, com cromossomos apropriadamente distribuídos e

alinhados (Fig. 3A). No grupo tratado com a baixa dose de arsenito, 3 de 64 oócitos

permaneceram no estágio de vesícula germinal ou de GVBD (vesícula germinal

breakdown), e 51 oócitos (79,7%) atingiram a metáfase II, contudo destes, 12

(18,8%) exibiram anomalias meióticas, caracterizadas por mal alinhamento de uns

poucos cromossomos sobre fusos celulares intactos (Fig. 3B) ou completo

desalinhamento cromossômico sobre fusos celulares com perda da integridade

morfológica (Fig. 3C). No grupo tratado com a dose média de arsenito, trinta e nove

Excluído: sobre as

73

oócitos (81,2%) atingiram a metáfase II após 12-14 h em cultura. Contudo, a

percentagem de anomalias meióticas detectada neste grupo (52,1%) foi

significantemente maior do que a apresentada pelo grupo tratado com a dose baixa

deste metal pesado (28,1%). A dose média de arsenito produziu, além de uma maior

percentagem, também uma maior severidade de anormalidades meióticas, sendo que

dos 19 oócitos deste grupo com aberrações na metáfase II, dezoito (94,7%)

evidenciaram cromossomos completamente desalinhados e fusos celulares

desintegrados (Fig. 3D).

Pela microscopia de polarização (Tab. 4), detectamos anomalias no fuso

celular em 31,6% e 46,7% dos oócitos imaturos oriundos de animais tratados,

respectivamente, com as doses baixa e média de arsenito, após 12-14 h em cultura

para maturação in vitro, achados estes comparáveis aos obtidos pela microscopia de

fluorescência. Na fig. 4A evidencia-se, com o uso do pol-scope, a visualização

detalhada de um fuso celular normal em metáfase II em um oócito controle. Nas

figuras 4B e 4C, são apresentados, respectivamente, fusos celulares parcial ou

completamente desintegrados, após o tratamento com as doses baixa e média de

arsenito, respectivamente.

Efeitos do Tratamento In Vivo com Arsenito sobre o Desenvolvimento e a

Apoptose em Embriões Pré-implantação

Os zigotos de camundongos CD-1 do grupo controle clivaram normalmente

(93,6%) após 24 h em cultivo, bem como se desenvolveram adequadamente para

mórula (86,1%) após 72 h e para blastocisto (84,8%) após 96 h em cultura. Os

zigotos, provenientes dos animais tratados com a baixa e a média dose de arsenito,

Excluído: ssomo

Excluído: mente

74

apresentaram, respectivamente, taxas de clivagem de 71,4% (n = 98) e 51% (n = 96),

de formação de mórula de 65,3% e 45,8% e de desenvolvimento para blastocisto de

63,3% e 44,8%. Observamos uma redução significativa das taxas de clivagem e de

desenvolvimento para mórula e blastocisto nos grupos tratados com ambas as doses

de arsenito, quando comparados entre si e com o grupo controle (Tab. 5 e Fig. 5),

sugerindo que o comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação

induzido pelo arsenito é dependente da dose de administração. A percentagem de

fragmentação, observada nos zigotos após 24 h em cultura, foi similar entre os

grupos tratados, porém, mostrou-se significativamente maior nestes do que nos

controles (Tab. 5).

Os blastocistos que se desenvolveram a partir dos oócitos fertilizados

coletados do grupo controle contiveram, em média, 60,5 núcleos, dos quais 2,5%

eram apoptóticos, como evidenciado pela coloração pelo método do TUNEL (Tab.

6), resultado este similar aos descritos na literatura [40]. Não detectamos diferença

significativa na média do número total de núcleos dos blastocistos provenientes do

grupo controle e do tratado com a dose baixa de arsenito (60,5 e 62,5 núcleos,

respectivamente). Entretanto, evidenciamos uma redução significativa na média do

número total de núcleos dos blastocistos provenientes do grupo tratado com a dose

média de arsenito (53,8 núcleos), quando comparada com a do grupo controle e a do

tratado com a dose baixa deste metal. Não observamos diferença significativa na

percentagem de núcleos apoptóticos dos blastocistos provenientes do grupo controle

e do tratado com a dose baixa de arsenito (2,5 e 2,1%, respectivamente). Entretanto,

evidenciamos uma elevação significativa na percentagem de núcleos apoptóticos dos

blastocistos provenientes do grupo tratado com a dose média de arsenito (6,3%),

75

quando comparada com a do grupo controle e a do tratado com a dose baixa deste

metal.

DISCUSSÃO

Os nossos dados demonstraram que o arsenito promoveu anomalias meióticas

tanto nos oócitos ovulados in vivo, como nos maturados in vitro, provenientes de

camundongas tratadas in vivo com este metal pesado, independentemente da

detecção de qualquer efeito adverso nos animais tratados. Estes dados confirmaram

os nossos achados prévios de que o arsenito induz, in vitro, anormalidades na meiose

oocitária (dados não publicados; vide artigo 1) e estimularam a suposição de que este

poluente ambiental possa ser capaz de causar aberrações na meiose oocitária de

diferentes espécies de mamíferos, incluindo de seres humanos, mesmo na ausência

de efeitos tóxicos evidenciáveis clinicamente, o que precisa ser mais bem elucidado.

As anomalias meióticas secundárias à administração do arsenito foram dependentes

da dose administrada, sendo mais freqüentes e severas nos oócitos oriundos dos

animais tratados com a maior dose. Os mecanismos responsáveis pelos efeitos

tóxicos do arsenito na meiose oocitária não foram bem esclarecidos até o momento,

contudo, presumivelmente envolvam disfunção mitocondrial e estresse oxidativo

[22-25, 44,45]. Como descrito anteriormente, o arsenito pode comprometer a função

mitocondrial e estimular a produção de radicais livres do oxigênio em diferentes

espécies e tipos celulares [22-25]. O estresse oxidativo pode danificar diversas

proteínas intracelulares [46,47], algumas das quais são importantes para a

organização do fuso celular [48-50] e, ao mesmo tempo ou independentemente, lesar,

diretamente, o DNA e induzir o mal alinhamento cromossômico [51,52]. As

Excluído:

Excluído:

76

anomalias meióticas podem, por sua vez, contribuir para a falência do

desenvolvimento celular por meio de diferentes vias, que vão desde a inabilidade do

oócito em completar o processo de maturação, tornando-se incapaz de ser fertilizado,

até a ocorrência de erros variáveis no processo de maturação meiótica que não

possibilitam a fertilização, mas, contudo, podem comprometer o desenvolvimento

embrionário pré e/ou pós-implantação, bem como a viabilidade futura do concepto

[53-55].

As mitocôndrias desempenham um papel crucial nos estágios iniciais da

apoptose [56-59]. Em vários organismos, a liberação de fatores pró-apoptóticos,

como o citocromo c e o fator indutor de apoptose, do espaço intermembrana

mitocondrial para o citosol, está envolvida na ativação da caspase e na indução de

apoptose nuclear [56-59]. Estudos têm mostrado que tanto a perda da integridade da

membrana mitocondrial externa, com conseqüente liberação do citocromo c, como a

despolarização da membrana mitocondrial interna são responsáveis pela ativação da

caspase e desencadeamento da cascata de apoptose via Bcl-XL [60]. Em estudos

anteriores, demonstramos que alguns agentes capazes de comprometer a função

mitocondrial e estimular a produção de radicais livres do oxigênio podiam induzir

apoptose em zigotos de camundongos [28,29]. Os achados de que quando submetido

ao estresse oxidativo, o citoplasma oocitário era capaz de transmitir o potencial

apoptótico para o núcleo oocitário saudável, após a reconstrução do oócito por

transferência nuclear, reforçaram a importância central das mitocôndrias no

desencadeamento da morte celular programada também em células germinativas

[29]. Em estudos prévios [dados não publicados], demonstramos que o arsenito

promoveu disfunção mitocondrial em oócitos de roedores. Outros autores, como

77

descrito a seguir, demonstraram que o estresse oxidativo, secundário à estimulação

da produção de radicais livres do oxigênio, estava envolvido na genotoxicidade e na

apoptose induzidas pelo arsenito em diferentes tipos celulares [61,62]. Applegate e

colaboradores [61] demonstraram que o arsenito induziu o aumento da expressão de

hemeoxigenase e peroxidase, enzimas características do estresse oxidativo, em várias

linhas de células de mamíferos. Por outro lado, a ativação de enzimas antioxidantes,

como a superóxido desmutase, reduziu a incidência da genotoxidade induzida pelo

arsenito em linfócitos humanos cultivados in vitro [45]. Wang e Huang [62],

utilizando células ovarianas de hamster chinês, mutantes caracterizadas por

deficiência em reparar seu DNA, evidenciaram que o arsenito induziu um aumento

dependente de dose na produção de micronúcleos, característicos da fase inicial do

processo de morte celular programada. Os dados do presente estudo corroboraram os

da literatura e demonstraram que o arsenito foi responsável pelo desencadeamento de

apoptose durante o desenvolvimento pré-implantação de embriões de camundongo,

identificada tanto pela presença de condensação e de fragmentação da cromatina

nucleares, que se constituem em achados morfológicos clássicos do início do

processo de apoptose [42,43], como pelo método de TUNEL. Este efeito foi

claramente dependente da dose, uma vez que apenas os blastocistos oriundos dos

animais tratados com a maior dose do arsenito apresentaram uma elevação

significativa da percentagem de núcleos apoptóticos. Sugerimos que, provavelmente,

a indução da apoptose embrionária, induzida pelo arsenito, foi secundária à disfunção

mitocondrial promovida pelo mesmo. Os nossos dados também evidenciaram que o

arsenito comprometeu o desenvolvimento embrionário pré-implantação de zigotos

fertilizados in vivo e originados de camundongas tratadas in vivo com este agente,

78

previamente à indução da ovulação. Este efeito, caracterizado pela redução

significativa das taxas de clivagem e de desenvolvimento para mórula e para

blastocisto, foi dependente da dose de arsenito administrada, sendo mais acentuado

nos embriões oriundos dos animais tratados com a dose maior deste metal.

Sugerimos que o mesmo possa ser decorrente dos efeitos deletérios do arsenito na

meiose oocitária e da indução de apoptose embrionária, o que merece maior

investigação. Se a exposição ambiental a este poluente é capaz de promover

disfunção oocitária e embrionária em mulheres residentes em áreas contaminadas

também precisa ser mais bem elucidada, uma vez que se comprovado, tal achado

apresentaria inúmeras aplicações práticas ao nível de saúde reprodutiva populacional.

Nossos dados demonstraram que o arsenito induziu anomalias na meiose

oocitária, comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação e

apoptose em embriões de camundongos, mesmo na ausência de efeitos adversos aos

animais tratados. Estes efeitos foram dependentes da dose e, presumivelmente,

estejam correlacionados, uma vez que as anomalias meióticas podem ter contribuído

tanto para o aumento da apoptose, como para o comprometimento do

desenvolvimento embrionário pré-implantação. Este estudo também forneceu um

modelo para a avaliação dos efeitos de outros metais pesados na meiose e no

desenvolvimento pré-implantação de roedores.

Agradecimentos P.A.A.S. Navarro agradece o apoio financeiro fornecido pela

Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

na forma de uma bolsa de Doutorado-Sanduíche.

79

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86

Tabela 1. Microscopia de fluorescência do fuso celular e dos cromossomos de oócitos ovulados in vivo,

provenientes de camundongas, tratadas in vivo com arsenito.

Arsenito

(mg/kg/2d)

No.

Total

Oócitos

GV

n

Metáfase I

Nl AF + CM

n n

Metáfase II

Nl SD CM AF+ CM

n n n n

Percentagem

Total de

Anomalias (%)

0 63 63 0.0 a

8 56 42 4 5 5 25.0 b

16 40 2 6 13 1 18 62.5 c

GV: vesícula germinal; n = número; Nl = normal; AF = anomalia do fuso celular; CM = mal alinhamento cromossômico. Diferentes superinscrições (a,b,c) dentro da mesma coluna indicam diferença significante (p < 0,05).

Tabela 2. Microscopia de polarização do fuso celular de oócitos ovulados in

vivo, provenientes de camundongas, tratadas in vivo com arsenito.

Arsenito

(mg/kg/2d)

No.

Total

Oócitos

Metáfase II

Normal Fuso Anormal

n n

Percentagem

Total de

Anomalias (%)

0 15 15 0.0

8 13 11 2 15.4

16 13 7 6 46.2

87

Tabela 3. Microscopia de fluorescência do fuso celular e dos cromossomos de oócitos maturados in vitro,

provenientes de camundongas, tratadas in vivo com arsenito.

As No.

Total

Oócitos

GV

n

GVBD

n

Metáfase I

Nl AF + CM

n n

Telófase I

Nl AF + CM

n n

Metáfase II

Nl AF CM AF + CM

n n n n

Percentagem

Total de

Anomalias (%)

0 50 1 1 48 0,0 a

8 64 1 2 2 5 2 1 39 3 9 28,1b

16 48 2 6 1 20 1 18 52,1c

As: arsenito (mg/kg/2d); GV: vesícula germinal; GVBD: vesícula germinal breakdown; n = número; Nl = normal; AF = anomalia do fuso celular; CM = mal alinhamento cromossômico. Diferentes superinscrições (a,b,c) dentro da mesma coluna indicam diferença significante (p < 0,05).

Tabela 4. Microscopia de polarização do fuso celular de oócitos maturados in vitro, provenientes de camundongas,

tratadas in vivo com arsenito.

Arsenito

(mg/kg/2d)

No. Total

Oócitos

Vesícula

Germinal

n

Metáfase I

Normal Fuso Anormal

n n

Metáfase II

Normal Fuso Anormal

n n

Percentagem Total

de Anomalias

(%)

0 18 18 0,0

8 19 1 2 12 4 31,6

16 15 8 7 46,7

88

Tabela 5. Desenvolvimento embrionário pré-implantação de zigotos de camundongos do grupo controle

e dos grupos tratados in vivo com arsenito.

Treatmento Número

Embriões

Cultivados

24 horas

2 células 1 célula Frag.

n % n % n %

48 horas

4-8 células

n %

72 horas

Mórula

n %

96 horas

Blastocisto

n %

Controle 79 74 93.6a 1 1.3 4 5.1b 68 86.1a 68 86.1 a 67 84.8 a

As 0.16 mg* 98 70 71.4b 4 4.1 24 24.5a 67 68.4b 64 65.3 b 62 63.3 b

As 0.32 mg** 96 49 51.0c 26 27.1 21 21.9a 47 48.9c 44 45.8 c 43 44.8 c

As: arsenito; *: As 0.16mg/ 2 dias/ 7 injeções i.p. **: As 0.32mg/ 2 dias/ 7 injeções i.p. Frag: fragmentação. Diferentes superinscrições (a,b,c) dentro da mesma coluna indicam diferença significante (p < 0,05).

Tabela 6. Indução de apoptose, detectada pelo método de TUNEL, em blastocistos de camundongos do

grupo controle e dos grupos tratados in vivo com arsenito.

Arsenito

(mg/kg/2d)

Número

Embriões

No. de núcleos

anormais ± Std

No. de núcleos

apoptóticos ± Std

No. total de

núcleos ± Std

% de núcleos

apoptóticos ± Std

0 43 58.9 ± 12.0 1.5 ± 1.2 60.5 ± 12.3a 2.5 ± 1.8c

8 29 61.2 ± 7.4 1.3 ± 0.9 62.5 ± 6.8a 2.1 ± 1.7c

16 20 50.4 ± 11.8 3.4 ± 1.6 53.8 ± 11.4b 6.3 ± 4.0d

Os valores são dados em média ± SD (desvio padrão). a versus b e c versus d indicam diferença significante (p < 0,05).

89

90

91

92

Excluído: ¶ ¶¶¶

93

6 CONCLUSÕES

94

Considerando especificamente os objetivos iniciais desta tese, foi possível

concluir que:

1. O arsenito promoveu anomalias meióticas, dependentes da dose e do tempo de

exposição, em oócitos de camundongo submetidos à maturação in vitro na

presença deste agente;

2. A co-administração de N-acetil-cisteína preveniu as anomalias meióticas

induzidas pelo arsenito em oócitos de camundongos submetidos à maturação in

vitro na presença concomitante destes dois compostos;

3. O tratamento in vivo com arsenito também promoveu anomalias na meiose,

evidenciadas tanto nos oócitos ovulados in vivo, como nos maturados in vitro;

4. O tratamento in vivo com arsenito comprometeu, de uma forma dependente da

dose administrada, o desenvolvimento embrionário pré-implantação, produzindo

uma redução significativa das taxas de clivagem e de desenvolvimento para

mórula e blastocisto, nos dois grupos tratados;

5. O tratamento in vivo com arsenito aumentou significativamente a apoptose nos

blastocistos provenientes do grupo tratado com a maior dose de arsenito (efeito

também dependente da dose administrada).