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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE BAURU

JEFREY ELIAS ROJAS PAULÚS

Efeito da desmineralização do enxerto ósseo autógeno particulado no reparo de defeitos críticos em calvária de ratos.

Estudo microscópico e microtomográfico

BAURU 2016

Jefrey Elias Rojas Paulús

Efeito da desmineralização do enxerto ósseo autógeno particulado no reparo de defeitos críticos em calvária de ratos.

Estudo microscópico e microtomográfico

Dissertação apresentada a Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências no Programa de Ciências Odontológicas Aplicadas, na área de concentração Rehabilitação Oral-Periodontia Orientadora: Profa. Dra. Maria Lúcia Rubo de Rezende

BAURU 2016

Rojas, Jefrey Efeito da desmineralização do enxerto ósseo autógeno particulado no reparo de defeitos críticos em calvária de ratos. Estudo microscópico e microtomográfico. / Jefrey Elias Rojas Paulus. – Bauru, 2016. 119 p. : il. ; 31cm. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Odontologia de Bauru. Universidade de São Paulo Orientadora: Profa. Dra. Maria Lúcia Rubo de Rezende

R638e

Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta dissertação/tese, por processos fotocopiadores e outros meios eletrônicos. Assinatura: Data:

Comitê de Ética da FOB-USP Protocolo nº: 016/2013 Data: 19 de Agosto 2013

DADOS CURRICULARES

28 de outubro 1988 Nascimento: Santo Domingo

Republica Dominicana

Filiação Olga Paulús

Sigfrido Rojas

2006-2011 Graduação em odontologia pela Faculdade de

odontologia da Universidad Autônoma de Santo

Domingo (UASD)

2012-2013 Curso de Especialização em Prótese Dentaria – Centro

de pós-graduação em odontologia (CPO – UNINGA,

Bauru/SP)

2012-2014 Curso de Especialização em Periodontia – Faculdade

de Odontologia da Universidade de São Paulo

(FOB/USP)

2014 Curso de Aperfeiçoamento em cirurgia Avançada em

Implantodontia – Instituo de Ensino Odontológico (IEO,

Bauru/SP)

2014 Treinamento em tomografia computadorizada de feixe

cônico (FUNBEO, Bauru/SP)

2013-2016 Mestrado em Ciências Odontológicas Aplicadas –

Reabilitação Oral (Periodontia) pela Faculdade de

Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo

(FOB/USP)

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a Deus, porque ele me deu a força e a determinação

para chegar até aqui.

Aos meus pais,

Porque sem eles não teria sido possível chegar até o final desta jornada.

A cada uma das pessoas que fizeram parte desta pesquisa, já que sem ele

não teria sido possível tê-la em nossas mãos.

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço a Deus, pela vida e pela saúde que me deu

durante todo este tempo aqui no Brasil. Por me permitir chegar até o final deste

caminho como mestrando. Pela força e determinação que só o Senhor pode dar.

Quando cheguei pela primeira vez em Bauru nunca pensei que demoraria

tanto minha estadia aqui, mas Ele me fez conhecer pessoas maravilhosas ao longo

desta jornada, sem as quais não teria sido possível conclui-lo, as quais fizeram este

caminho, um pouquinho mais agradável. Obrigado meu Deus por tudo o que o

Senhor tem feito na minha vida, não tenho palavras para agradecer, mas a minha

vida toda estarei sempre grato por tuas bênçãos e milagres que Tu tens feito nela.

Agradeço infinitamente aos meus pais, Sigfrido Rafael Rojas Peña e Olga

Rosalia Paulús Soriano porque sem o apoio deles não tivesse sido possível chegar

até aqui. Eles sabem o quanto amo eles, e como estar longe durante estes quatro

anos tem sido difícil.

Agradeço ao meu irmão Sigfrido Eliezer Rojas Paulús, pela ajuda em cada

uma das coisas que precisei em quanto esteve no Brasil, cada coisa que precisava

na República ele resolvia, obrigado pelo carinho e pela motivação de cada dia para ir

pra frente.

Obrigado a cada um dos meus familiares que acreditaram tanto em mim, me

motivando e compartilhando os meus logros e minhas conquistas. Sempre me

apoiaram nas minhas decisões.

Quero fazer um agradecimento especial aos meus tios Clara y Rodney Moret,

que de maneira desinteressada abriram a porta da sua casa para mim durante 6

meses que fiquei em Michigan na faculdade de Ann Arbor. Eles me brindaram o

carinho, amor e o conforto durante esse tempo. Dando-me tudo como se fossem

meus pais, eu nunca vou esquecer esse grande detalhe e os levarei sempre no meu

coração.

Agradeço minha namorada, Mariza Errera, pela ajuda, amor, dedicação e

compreensão que me deu durante este tempo. Ela sempre compreendeu minhas

ausências e tempo longe e me ajudou a suportar os momentos difíceis. Muito

obrigado meu amor!

Agradeço também ao Departamento de Periodontia da Faculdade de Ann

Arbor, dirigido pelo Prof. Dr. William Giannobile, especialmente, a Dra. Ivonne

Kapila, por me receber durante seis meses no seu laboratório na faculdade de

Odontologia em Ann Arbor. A cada um dos meus companheiros durante esse tempo:

Islam, sempre lembrarei das suas orações, Liu, Adam, Ruma, Kama, Alberto,

Rachel, e os demais que sempre me ofereceram ajuda no meu tempo lá, sempre

lembrarei de cada um de vocês.

Não tenho palavras para agradecer a Igreja Adventista de Greenville, Deus a

colocou no meu caminho e sem cada um dos seus membros não poderia ter sido

possível alcançar cada uma das coisas que consegui. Cada um me brindou seu

sorriso em cada culto e me ofereceram um lar longe de casa, a dissertação não teria

lugar para por cada nome das pessoas que levo no meu coração.

Muito obrigado a Família Contelli-Xavier (Dani, Xavier, Ismenia, João),

Kennerly-Herrera (Pericles, Cilma, Paula, Lais, Lavinha, o vó e a vô) e a família

Bressan (Cristina, Ivaldo, Mariana e Melina). Me mostraram o que era ajudar um

estranho de maneira desinteressada só por cumprir a tarefa que Deus nos deixou de

ajudar ao próximo. Vocês foram minha família em cada momento aqui em Bauru,

quando não sabia pra onde ir, sabia que meu telefone tinha onde ir.

A cada um dos meus amigos de Louvart, pelos momento que passamos

cantando e louvando o senhor.

Agradeço a cada um dos professores da disciplina de Periodontia a Dra. Carla

Damante, Dra. Adriana Campos Passanezi, a Dra. Mariana, ao Dr. Sebastião, chefe

de nosso departamento, ao Dr. Euloir de quem tive o privilégio de obter

conhecimentos na especialização, cada um deles são os responsáveis do meu

conhecimento sobre Periodontia hoje em dia.

A cada um dos meus colegas pós-graduandos, Rafael, Paula Cunha, Paula

Karam, Roberta, Samira, Jorge, Emília, João, Larissa, Monica, Lucas, Isis, Matheus,

Renato, Erika, Rafaela, Luísa e Vitor.

Aos funcionários do Departamento de Periodontia, Marcela, Marcão, Ivania

juntos todos foram uma grande família.

Agradeço especialmente a Maria Alejandra Frias Martinez, da qual sinto

saudade, já que foi minha irmã e meu apoio durante todo este tempo aqui no Brasil.

Agradeço grandemente o Payely Faña, o Gustavo Manfredi e o Jefry Vargas,

porque foram de grande ajuda na cirurgia dos animais.

Agradeço a cada um dos funcionários do biotério, o Elias, Erasmo e os

demais que sempre ofereceram sua ajuda com o agendamento e os protocolos do

biotério.

Agradeço ao Prof. Dr. Heitor Marques Honório, pela ajuda e disposição nas

análises estatísticas deste trabalho.

Agradeço especialmente ao Dr. Daniel Rezende, a Dra. Aline, a Setty, Emilia

e a Dri. Por me suportarem heheheh e por todas as experiências felizes que tivemos

nos cursos de implantes e cirurgia avançada, não tenho palavras para agradecer

eles como me fizeram sentir parte da família.

Quero agradecer ao Prof. Dr. Alberto Consolaro e a Profa. Dra. Renata

Consolaro, já que sem sua ajuda não poderia ter sido feito o análise histológico

deste trabalho.

Ao departamento de endodontia, o Bruno Cavenango, o Murilo, o Pablo

Amoroso, e o Prof. Dr. Marco Antonio Hungaro Duarte, pela ajuda com o empréstimo

do microtomógrafo e nas indicações no processamento das imagens.

E por último mas não menos importante, quero fazer um agradecimento

especial a minha orientadora Profa. Dra. Maria Lucia Rubo de Rezende, quem

durante todo este tempo me guiou na realização deste trabalho, graças a ela hoje

sou uma melhor pessoa no pessoal e no profissional. Posso dizer que quando

comecei o mestrado não tinha nem a ideia de como fazer uma pesquisa, muito

menos uma dissertação de mestrado, já que infelizmente na minha graduação não

teve essa formação. Mas, a professora Malu, me ajudou e me fez entender o

necessário para desenvolver um sentido critico de como fazer as coisas e de como

posso dar o melhor de mim sempre que eu me proponha uma meta. Muito obrigado

Dra. Malu, a senhora não tem ideia do que seus ensinos fizeram em mim e o tanto

que lembrarei da senhora a cada dia.

Se por acaso esqueço de alguém, agradeço a cada um dos que estiveram

comigo durante este tempo, aos que me ofereceram um sorriso, aos que falaram um

oi num corredor, aos que simplesmente estiveram ai para me ouvir nos momentos

difíceis, muito obrigado!!

“Não temas, porque eu sou contigo; não te assombres, porque eu

sou teu Deus; eu te fortaleço, e te ajudo, e te sustento com a

destra da minha justiça”

Isaías 41:10.

RESUMO

O processo de desmineralização óssea tem sido mostrado vantajoso em

procedimentos de enxertia óssea empregando blocos osseos, porem a sua

utilização na periodontia em enxertos osseos autógenos particulados não esta ainda

descrita na literatura. De acordo com a literatura é possível observar que existem

diferentes agentes demineralizantes na pratica clinica os quais podem ser

empregados no processo de desmineralização óssea, razão pela qual este estudo

teve como objetivo comparar dois diferentes agentes desmineralizantes de enxertos

ósseos autógenos particulados (ácido cítrico pH1 a 50% e tetraciclina hidroclorada a

50mg/ml) em diferentes tempos de aplicação, quanto ao efeito produzido no reparo

de defeitos críticos em calvária de ratos. Foram utilizados 120 ratos adultos machos

com aproximadamente 4 meses de vida. Neste estudo foi utilizado o modelo de

defeito crítico de 8 mm, esses animais foram divididos em 8 grupos de estudo

formados por 15 animais (5 em cada período experimental): CN (controle negativo):

os defeitos permaneceram sem enxerto; CP (controle positivo): os defeitos foram

preenchidos por osso particulado não desmineralizado; AC 15: os defeitos foram

preenchidos com osso particulado desmineralizado por ácido cítrico durante 15

segundos; AC 30: os defeitos foram preenchidos com osso particulado

desmineralizado por ácido cítrico durante 30 segundos; AC 60: os defeitos foram

preenchidos com osso particulado desmineralizado por ácido cítrico durante 60

segundos; TCN 15: os defeitos foram preenchidos com osso particulado

desmineralizado por tetraciclina durante 15 segundos; TCN 30: os defeitos foram

preenchidos com osso particulado desmineralizado por tetraciclina durante 30

segundos; TCN 60: os defeitos foram preenchidos com osso particulado

desmineralizado por tetraciclina durante 60 segundos. Foi realizada aeutanasia dos

animais aos 7, 30 e 60 dias para realização de microtomografia computadorizada e

analise histomorfometrica, para avaliar a área, volume e densidade óssea nos

defeitos após os tempos experimentais definidos. Aos 7 dias, não era esperada

formação de tecido ósseo significante, mas surpreendentemente, os espécimes

desmineralizados com ácido cítrico demonstraram precocidade na produção de

eventos regenerativos já nesse período. Durante os períodos experimentais foi

possível observar como os espécimes tratados com acido cítrico apresentavam

maior formação óssea nos defeitos quando comparados com os controles e com os

grupos onde empregados tetraciclina. Efeito provavelmente relacionado com a

eliminação da parte mineral do osso e liberação de Proteinas morfogeneticas ósseas

e fatores de crescimentos, liberados a partir da matriz ossea Concluiu-se que a

desmineralização com ácido cítrico do osso autógeno particulado enxertado em

defeitos críticos promoveu maior área, volume e densidade de formação óssea do

que a desmineralização com tetraciclina e do que a não desmineralização.

Observando-se melhores resultados aos 15 e 30 segundos de desmineralização.

Palavras-chave: Proteinas osseas morfogeneticas, enxerto ósseo, Periodontia, Acido

citrico

ABSTRACT

Effect of demineralization of particulate autogenous bone graft in critical size

defects in rat calvaria. Microscopic and microtomográfic study.

Bone demineralization process has been shown useful in bone grafting

procedures using onlay bone grafting, however its use in periodontics in bony

autogenous particulate graft is not yet described in the literature. According to the

literature you can see that there are different demineralizantes agents in clinical

practice which can be used in bone demineralization process, which is why this study

was to compare two different demineralization agents of bone autogenous particulate

graft (citric acid pH1 the 50% tetracycline Hydrochloride and 50mg / ml) in different

application time, the effect produced in the repair of critical defects in rat calvarium.

120 adult male rats with approximately 4 months of age were used. In this study we

used the 8mm critical defect model, the animals were divided into 8 study groups

consisting of 15 animals (5 in each experimental period): CN (negative control): the

defect remained free graft; CP (positive control): the defects were filled by non-

demineralized bone particles; AC 15: The defects were filled with demineralized bone

particles of citric acid for 15 seconds; AC 30: defects were filled with demineralized

bone particles of citric acid for 30 seconds; AC 60: The defects were filled with

demineralized bone particles of citric acid for 60 seconds; TCN 15: defects were filled

with demineralized bone particles tetracycline for 15 seconds; TCN 30: defects were

filled with demineralized bone particles tetracycline for 30 seconds; TCN 60: defects

were filled with demineralized bone particles tetracycline for 60 seconds. aeutanasia

animals was performed at 7, 30 and 60 days for performing computed

microtomography and histomorphometric analysis to assess the area, bone volume

and density of the defects after the defined experimental times. At 7 days, it was not

expected significant formation of bone tissue, but surprisingly, samples

demineralized with citric acid demonstrated earliness in the production of

regenerative events already during this period. During the experimental periods was

possible to observe how the specimens treated with citric acid showed increased

bone formation in defects when compared to controls and to groups where

employees tetracycline. Effect probably related to the disposal of the mineral part of

bone and release of bone morphogenetic proteins and factors of growth, released

from the bone matrix concluded that the demineralisation by citric acid particulate

autogenous bone graft in critical defects caused greater area, volume formation and

bone density than tetracycline demineralization and demineralization that do not.

Observing better results at 15 and 30 seconds demineralization.

Key words: Bone morfogenetic protein, Bone graft, Periodontics, Citric Acid

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

- FIGURAS

Figura 1 - Sequência de procedimentos cirúrgicos para obtenção das

amostras ............................................................................................. 48 Figura 2 - Tela do computador mostrando as imagens obtidas após

escaneamento das peças com o Microtomografo. ............................... 50 Figura 3 - Tela do computador do programa desenhado para realizar

as medições de área de preenchimento, volume e densidade óssea das amostras ............................................................................ 51

Figura 4 - Tela do computador do Adobe Photoshop com as imagens

dos cortes teciduais.............................................................................. 52 Figura 5 - Reconstruções das amostras ósseas após desmineralização

óssea com Ácido Cítrico aos sete dias A. Amostra desmineralizada por 15 segundos. B. Amostra desmineralizada por 30 segundos. C. Amostra Desmineralizada por 60 segundos ....................................................... 57

Figura 6 - Reconstruções das amostras ósseas após desmineralização

óssea com Ácido Cítrico aos trinta dias A. Amostra desmineralizada por 15 segundos. B. Amostra desmineralizada por 30 segundos. C. Amostra Desmineralizada por 60 segundos ....................................................... 59

Figura 7 - Reconstruções das amostras ósseas após desmineralização

óssea com Ácido Cítrico aos sessenta dias A. Amostra desmineralizada por 15 segundos. B. Amostra desmineralizada por 30 segundos. C. Amostra Desmineralizada por 60 segundos ....................................................... 61

Figura 8 - Controles positivo e negativo após 30 e 60 dias. A. Controle

negativo após 30 dias. B. Controle Negativo após 60 dias. C. Controle Positivo após 30 dias D. Controle Positivo após 60 dias ....................................................................................................... 63

Figura 9 - Cortes histológicos do grupo controle negativo A. Controle negativo após sete dias. B. Controle negativo após 60 dias ................ 65

Figura 10 - Cortes histológicos do grupo controle positivo após 7, 30 e

60 dias. A. Controle Positivo após 7 dias. B. Controle Positivo após 30 dias. C. Controle Positivo após 60 dias..................... 67

Figura 11 - Cortes histológicos do grupo AC15 após 7, 30 e 60 dias. A.

AC 15 após 7 dias. B. AC 15 após 30 dias. C. AC 15 após 60 dias ....................................................................................................... 69





Figura 14 - Cortes histológicos do grupo TCN 15 após 7 e 60 dias. A.

TCN 15 após 7 dias. B. TCN 15 após 60 dias. ..................................... 77 Figura 15 - Cortes histológicos do grupo TCN 30 após 7, 30 e 60 dias.

A. TCN 30 após 7 dias. B. TCN 30 após 30 dias. C. TCN 30 após 60 dias ......................................................................................... 79

Figura 16 - Cortes histológicos do grupo TCN 60 após 7, 30 e 60 dias.

A. TCN 60 após 7 dias. B. TCN 60 após 30 dias. C. TCN 60 após 60 dias ......................................................................................... 81

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Resumo dos principais resultados de estudos sobre reparo

de defeitos críticos de 8mm em calvária de ratos ............................... 37

Tabela 2 - Área média de tecido mineralizado no defeito crítico avaliada

por µ-CT ............................................................................................. 59

Tabela 3 - Volume médio de tecido mineralizado no defeito crítico

avaliado por µ-CT ................................................................................. 61

Tabela 4 - Densidade média de tecido mineralizadono defeito crítico .................. 63

Tabela 5 - Análise histomorfométrica da porcentagem de área ocupada

por tecido mineralizado no interior dos defeitos críticos ....................... 83

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS

BMPs Proteínas ósseas morfogenéticas

FOB-USP Faculdade de Odontologia de Bauru

MMPs Metaloproteinases da matriz

µCT Microtomografia computadorizada

HA Hidroxiapatita

TGF- β Fator de crescimento transformador beta

EDTA Ácido etileno-diamino-tetracético

MEV Microscopia eletronica de varredura

TCN Tetraciclina ácida

DBB Osso desmineralizado bovino

AB Osso autógeno

HA-TCP Hidroxiapatita em associação com fosfato tricálcico

PLGA Ácido poliglicólico

N-HA Derivado da casca do ovo

DFDBA Osso iofilizado desmineralizado alógeno

EMD Proteína derivada na matriz do esmalte

OBS Células osteoblásticas derivadas do tecido adiposo

TCN Células endoteliais derivadas do tecido adiposo

CTDA Células tronco indiferenciadas derivadas do tecido adiposo

CN Controle Negativo

CP Controle Positivo

AC Ácido cítrico

GTCE Granuloma do tipo corpo estranho

TGI Tecido de granulação imaturo

TGM Tecido de granulação maduro

TCFM Tecido conjuntivo fibroso maduro

TCFNO Tecido conjuntivo fibroso com neoformação óssea

ANOVA Análise de variância a dois critérios

GTCE Granuloma do tipo corpo estranho

TGI Tecido de granulação imaturo

TGM Tecido de granulação maduro

LISTA DE SIMBOLOS

% Porcentagem

pH Potencial hidrogeniônico

µm Micrometro unidade de comprimento

mm Milímetro (unidade de comprimento)

mm2 Milímetro quadrado (unidade de comprimento)

g Grama (unidade de massa)

mg Miligrama (unidade de massa)

mm3 Milímetro cubico (unidade de comprimento)

cm3 Centímetro cubico (unidade de área)

mL Mililitro (unidade de volume)

< Menor que

µCT Microtomografia Computadorizada

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 19

2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 25

2.1 DESMINERALIZAÇÃO ÓSSEA .................................................................... 27

2.2 REPARO DE DEFEITOS CRITICOS ............................................................ 30

2.2.1 ESTUDOS HISTOMORFOMETRICOS ........................................................ 31

2.2.2 ESTUDOS EMPREGANDO µCT .................................................................. 35

2.3 MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (µ-CT) ................................. 38

3 PROPOSIÇÃO ............................................................................................. 41

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 45

4.1 SELEÇÃO E OBTENÇÃO DA AMOSTRA .................................................... 47

4.2 PROCEDIMENTO CIRURGICO DE CRIAÇÃO E

PREENCHIMENTO DOS DEFEITOS CRITICOS......................................... 47

4.3 MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (µCT) .................................. 50

4.4 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA QUALITATIVA ............................................ 51

4.4.1 CRITÉRIOS APLICADOS NA ANÁLISE MICROSCÓPICA

QUALITATIVA. ............................................................................................. 52

4.5 ANÁLISE HISTOMORFOMETRICA ............................................................. 53

5 RESULTADOS ............................................................................................. 55

5.1 ANÁLISE POR MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (µ-

CT) ................................................................................................................ 57

5.1.1 ÁREA DE TECIDO ÓSSEO NEOFORMADO NO DEFEITO (mm2)............. 57

5.1.2 VOLUME DE OSSO NEOFORMADO NO DEFEITO (MM3) ........................ 59

5.1.3 DENSIDADE DE OSSO NEOFORMADO NO DEFEITO

(MG/MM3) .................................................................................................... 61

5.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA QUALITATIVA ................................................. 65

5.2.1 GRUPO CN .................................................................................................. 65

5.2.2 GRUPO CP .................................................................................................. 65

5.2.3 GRUPO AC15 .............................................................................................. 69

5.2.4 GRUPO AC30 ............................................................................................. 71

5.2.5 GRUPO AC60 .............................................................................................. 75

5.2.6 GRUPO TCN15 ............................................................................................ 77

5.2.7 GRUPO TCN30 ............................................................................................ 79

5.2.8 GRUPO TCN60 ............................................................................................ 81

5.3 ANÁLISE HISTOMOFOMÉTRICA ................................................................ 83

6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 85

7 CONCLUSÕES ............................................................................................ 95

REFERÊNCIAS ............................................................................................ 99

ANEXOS .................................................................................................... 117

1 Introdução

Introdução 21

1 INTRODUÇÃO

O principal objetivo da terapia periodontal é deter o processo de doença e

regenerar os tecidos periodontais perdidos estimulando a formação de novo osso,

novo cemento e novo ligamento periodontal (PASSANEZI et al., 2011) mantendo as

as características ultraestruturais e morfológicas originais (AVILA et al., 2009;

CORTELLINI; BOWERS, 1995).

A destruição tecidual causada pela progressão da doença periodontal pode

resultar em grandes defeitos ósseos os quais podem ser muito difíceis de reconstruir

(ALFOTAWEI et al., 2014). Assim, os enxertos ósseos foram estabelecidos como

tratamento de defeitos infraósseos, a fim de melhorar o reparo e inserção de novo

osso ao cemento (HEGEDUS, 1923; SCHALLHORN, 1997). Graças aos avanços na

tecnologia e na engenharia tecidual, vários materiais de enxertia óssea têm sido

desenvolvidos para o tratamento desses defeitos, incluindo materiais autógenos,

alógenos, xenógenos e aloplásticos que servem de arcabouço para a formação

tecidual, podendo ajudar na diferenciação de células osteoprogenitoras

(ELDESOQUI et al., 2014).

Entre os diferentes biomateriais, o osso autógeno é reconhecido como

“padrão ouro”, porque reúne características ideais como biocompatibilidade,

capacidade osteogênica e osteoindutiva (CARRULLI et al., 2013) e baixo risco de

reações imune adversas (HSIONG; MOONEY, 2006). Entretanto, alguns problemas

têm sido citados para o uso de material autógeno na região craniofacial, como

morbidade do sitio doador, quantidade limitada de tecido para enxertia,

irregularidades na morfologia, reabsorção imprevisível do enxerto, necessidade de

sítios cirúrgicos adicionais e tempo clínico aumentado (AICHELMANN-REIDY;

YUKNA, 1998, KIM et al., 2012). Por isso, novas técnicas cirúrgicas e novos

biomateriais ainda têm sido alvos de estudos frequentes.

O osso humano liofilizado desmineralizado é reconhecido por estimular a

formação de osso através de osteoindução (LIBIN; WARD; FISHMAN,1975), sendo

que a desmineralização imposta pelo processo de liofilização expõe proteínas

ósseas morfogenéticas (BMPs) localizadas na matriz óssea, que induzem a

22 Introdução

diferenciação de células mesenquimais em células osteoprogenitoras (URIST;

DELANGE; FINERMAN, 1983). Defeitos periodontais preenchidos com biomateriais

contendo BMPs têm resultado em diminuição da profundidade de sondagem e

ganho no nível clínico de inserção periodontal (MEADOWS, et al., 1993; PEARSON;

ROSEN; DEPORTER, 1981; QUINTERO, et al., 1982; SONIS; KABAN; GLOWACKI,

1983).

A exposição artificial de BMPs inerente ao osso liofilizado despertou a

atenção de pesquisadores da Disciplina de Periodontia da Faculdade de

Odontologia de Bauru (FOB-USP) que o relacionaram com o processo fisiológico de

remodelação óssea (REZENDE et al., 2014), já que a reparação óssea se inicia

pela proliferação de células clásticas, que utilizam substâncias ácidas para eliminar

a fase mineral dos tecidos, expondo seu conteúdo proteico previamente à fase de

deposição de novo tecido (LI; ZHANG; KIRNERS, 2003; LORENZO, et al., 1992;

POLSON; PROYE, 1983; GOLDBERG; STEVENSON, 1987; ACCORSI-

MENDONCA, et al, 2008, URIST; DELANGE; FINERMAN, 1983; URIST 1965;

URIST et al., 1968; URIST; DOWELL, 1968; URIST, 1968). A observação desse

processo natural levantou a hipótese de que a desmineralização artificial do osso in

situ pelo uso de ácidos, durante procedimentos cirúrgicos regenerativos poderia

antecipar um dos eventos da remodelação óssea, que é a reabsorção e,

consequentemente, acelerar o processo de reparo.

O uso de substâncias ácidas em Odontologia não é recente. Desde o século

passado, Buonocore (1955) apresentou um método simples para aumentar a adesão

da resina acrílica à superfície do esmalte, onde se verificou que essa adesão era

maior quando o esmalte era desmineralizado com ácido fosfórico a 85% por 30

segundos, do que sem desmineralização. Antes disso, Stewart (1889), na tentativa

de eliminar bactérias de sítios periodontais, já preconizava o uso de ácido clorídrico

ou sulfúrico na superfície radicular, estabelecendo-se como pioneiro para que outros

estudos surgissem no campo da biomodificação de superfícies de dentina e cemento

(BAL; EREN; BALOS, 1990; HERITIER, 1983; LABAHN et al., 1992) e

paralelamente, na desmineralização de enxertos alógenos com o objetivo de

potencializar os processos reparativos em tratamentos cirúrgicos (URIST, 1965;

URIST, et al., 1968; LEWANDROWSKI, et al., 1997).

Introdução 23

A desmineralização ácida também proporciona a liberação de enzimas

proteolíticas chamadas metaloproteinases da matriz (MMPs) das quais a

osteogênese e a remodelação óssea são dependentes, uma vez que osteoblastos e

osteoclastos expressam MMPs (LI; ZHANG; KIRNERS, 2003). A elas se atribui

participação nos processos de formação e remodelação óssea, salientando que as

MMPs-2 e -9, na forma ativa ou inativa, são expressas por células osteogênicas e do

tecido conjuntivo durante as diferentes etapas da regeneração óssea alveolar, na

substituição do coágulo sanguíneo por tecido conjuntivo, durante a formação, na

maturação e na remodelação de novo osso (LORENZO et al., 1992).

O primeiro trabalho a empregar desmineralização óssea in situ com o objetivo

de acelerar o reparo, foi o de Rezende. (2008 ) ao desmineralizar com ácido cítrico

pH 1 a 50% por 3 minutos, as superfícies de contato de enxertos ósseos autógenos

em bloco realizado em calvária de cobaias. A autora observou que nos espécimes

tratados com ácido houve aumento da formação e da densidade do novo osso na

interface enxerto-leito, assim como da extensão das superfícies de consolidação

óssea. A análise dos resultados permitiu a conclusão de que essa nova abordagem

de tratamento promoveu a osteogênese na interface e acelerou a consolidação

desses enxertos. Esses resultados foram posteriormente confirmados em coelhos

por Rodrigues et al. (2012) e Domingues (2013) e em cultura de células por

Rezende et al. (2015), que verificaram que a migração, adesão e proliferação de

pré-osteoblastos em osso fresco desmineralizado eram mais intensas do que em

osso não desmineralizado.

Esses resultados promissores suscitaram a investigação sobre os possíveis

efeitos benéficos da desmineralização ácida quando usada em osso autógeno

particulado no reparo de defeitos ósseos circunscritos, para eventual aplicação em

defeitos periodontais.

Defeitos críticos produzidos em animais têm sido empregados para estudar o

comportamento de diferentes tipos de enxerto quanto ao seu potencial emprego em

periodontia (MOKBEL et al., 2008) e constituem-se em um passo importante e

necessário no estudo de novos biomateriais, para acrescentar informações

indispensáveis para o conhecimento de seu comportamento antes de sua aplicação

clínica (NAGATA, et al., 2009; INODA; YAMAMOTO; HATTORI, 2007; OLIVEIRA et

24 Introdução

al., 2008; SPICER, et al., 2012; MESSORA, et al., 2008; ALHAG, et al., 2011;

DONOS et al., 2011; SCHWARZ, et al., 2009; DE ALMEIDA et al., 2013; NAGATA et

al., 2013; MOKBEL et al., 2013; MARQUES, et al., 2014; CUNHA, et al., 2014).

Entretanto, as imagens obtidas para microscopia óptica não representam o

espécime como um todo, o que pode levar a erros de interpretação de um dado

fenômeno. A microtomografia computadorizada (µCT) revolucionou o diagnóstico

clínico desde sua introdução no início dos anos 1970 e pode compensar essa

deficiência por oferecer visão tridimensional do objeto de estudo como um todo,

antes da amostra ser processada para microscopia (HOUNSFIELD, 1973). A

disponibilidade de sistemas comerciais com resolução microscópica e capacidade

para imagens in vivo e in vitro abriu novas aplicações para µCT como potencial para

substituir a série histológica como padrão de referência e para obtenção de

informação quantitativa para as investigações (HOLDSWORTH; THORNTON, 2002),

inclusive para complementar a análise histomorfométrica no estudo do reparo de

defeitos críticos demonstrando ser este, um modelo confiável e reprodutível para

esse tipo de avaliação (LUVIZUTO, et al., 2011).

À luz dos argumentos expostos, esta dissertação se propôs a avaliar

microscopicamente e por meio de µCT, o comportamento de enxertos ósseos

autógenos particulados desmineralizados em defeitos críticos em calvária de ratos

visando a um futuro emprego no reparo de defeitos periodontais.

2 Revisão de Literatura

Revisão de Literatura 27

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 DESMINERALIZAÇÃO ÓSSEA

O osso é um tecido conjuntivo especializado composto por uma matriz

orgânica e uma matriz inorgânica a qual é composta, em sua maior parte, por cristais

de hidroxiapatita (HA), constituindo a superfície mineralizada do tecido ósseo que

reveste a matriz orgânica. O conteúdo da matriz orgânica, por sua vez, apresenta

95% de fibras colágenas tipo I, proteínas não colágenas e proteoglicanas, as quais

conferem capacidade osteoindutora ao tecido ósseo (BARRÈRE; VAN

BLITTERSWIJK; DE GROOT, 2006).

O primeiro passo do mecanismo de remodelação óssea é a desmineralização

local, por meio da produção de ácidos pelos osteoclastos (MELCHER, 1976). Essas

substâncias ácidas dissolvem a fase mineral e liberam enzimas da superfície óssea,

hidrolisando a matriz orgânica e formando cavidades ou lacunas que logo são

preenchidas por proteínas produzidas pelos osteoclastos as quais atuam como

substrato para a adesão e diferenciação de células osteoprogenitoras em

osteoblastos (DODDS et al., 1995)

A desmineralização óssea artificial ganhou expressão na década de 1960,

quando vários trabalhos de Urist (URIST 1965; URIST et al., 1968; URIST;

DOWELL, 1968; URIST, 1968) demonstraram em animais, a capacidade de indução

óssea intramuscular de diferentes substratos após serem desmineralizados in vitro,

provendo suficiente evidência para a teoria de indução óssea por meio da

desmineralização. Baseado nesses resultados, Urist (1965) foi quem primeiro

utilizou o termo BMP. As BMPs são parte da superfamília do fator de crescimento

transformador beta (TGF- β), essenciais para a formação óssea endocondral (MAIA

et al., 2013). Sua liberação ocorre de acordo com o nível de desmineralização

(PIETRZAK et al., 2012). Mais de 15 BMPs já foram identificadas e caracterizadas,

sendo as únicas, entre os fatores de crescimento a influenciar a proliferação e

diferenciação de osteoblastos, uma vez que têm a capacidade de instituir este

processo a partir de células progenitoras in vitro, bem como in vivo (MAIA et al.,


2013). Possuindo papel osteoindutivo multifacetado, presume-se que as BMPs

funcionam como fatores quimiotáticos que iniciam o recrutamento de células

progenitoras e promovem a maturação destas células em condrócitos, osteoblastos

e osteócitos (KHOJASTEH et al., 2013).

Foi observado que fibras colágenas, fatores de crescimento e outras citocinas

são expostos no processo de desmineralização também de dentina e são capazes

de regular a diferenciação de células osteoprogenitoras (SCHWARTZ et al., 2000).

Sendo o colágeno um dos elementos mais abundantes no osso (WALLACE et al.,

2014), é de se supor que esses mesmos eventos possam ocorrer em superfícies

ósseas desmineralizadas.

Entretanto, poucos trabalhos relataram o potencial efeito da desmineralização

óssea in situ no reparo ósseo. Enxertos em blocos ósseos tipo onlay foram

realizados em calvária de cobaias por Rezende et al. (2014), que verificaram maior

consolidação e densidade do osso neoformado quando a interface enxerto-leito foi

desmineralizada por 3 minutos com ácido cítrico pH 1 a 50 %. Análises

histomorfométricas demonstraram que o procedimento de desmineralização resultou

em neoformação óssea e consolidação dos enxertos aos 30 dias, só alcançados

pelos espécimes não desmineralizados aos 60 dias, antecipando, pois, os eventos

de reparo. Foi sugerido que a desmineralização seria uma alternativa vantajosa

sobre a perfuração e/ou desgaste do leito como métodos para melhorar a

consolidação dos enxertos, por não apresentar risco de reabsorção e preservar a

estrutura óssea já fragilizada pela reabsorção natural.

Resultados semelhantes já haviam sido alcançados por Domingues (2013)

em tíbias de coelhos onde a desmineralização da interface enxerto onlay-leito

receptor foi realizada com ácido cítrico por 3 minutos. Após 15, 30 e 45 dias, foi

observado histomorfometricamente que a desmineralização resultou em maior área

de formação óssea e maior extensão de superfícies ósseas consolidadas,

especialmente aos 30 dias.

O processo de desmineralização também melhorou o comportamento elástico

de enxertos em bloco onlay realizados por Rodrigues et al. (2012) em tíbias de

coelhos. Os autores observaram que o módulo de elasticidade da interface


enxerto/leito receptor desmineralizada por ácido etileno-diamino-tetracético (EDTA)

a 24 % durante 3 minutos foi maior, aos 90 dias, do que em amostras não

desmineralizadas, sugerindo que inserção de implantes nesta interface pode ocorrer

com menor risco de destacamento do enxerto.

Procurando entender os fenômenos que justificariam os bons resultados

observados com a desmineraliação de enxertos ósseos, Rezende et al. (2015)

estudaram em calvária de cobaias, o efeito da desmineralização superficial do osso

fresco com ácido cítrico pH 1 ao 50% durante 15, 30 e 180 segundos sobre o

comportamento de pré-osteoblastos MC3T3-E1 cultivados sobre essas superfícies

por 24, 48 e 72 horas. A microscopia eletronica de varredura (MEV) evidenciou que

a desmineralização ácida produziu maior área óssea de cobertura por células e

diferenciação mais rápida dos pré-osteoblastos em comparação a amostras não

desmineralizadas, especialmente nos tempos de 15 e 30 segundos. Os autores

ressaltaram que o procedimento poderia ser vantajoso nos procedimentos que visam

à regeneração de defeitos ósseos.

Foi também demonstrado recentemente que o procedimento de

desmineralização superficial com ácido cítrico pode alterar a composição química e

a topografia superficial do osso fresco podendo essas alterações, influenciar o

comportamento de células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 (SALMERON, 2015).

Levando-se em conta que o diâmetro médio de uma célula pré-osteoblástica varia

entre 26,82 µm a 41,07 µm (HULE et al., 2008; SONG; MANO, 2013; SUDO et al.,

1983; YOU et al., 2011), Salmeron (2015) verificou que, após a desmineralização

com ácido cítrico a 10% ou 50% durante 30 segundos, formaram-se picos e

depressões de forma regular nas superfícies ósseas de calvárias de ratos. A

distância média entre dois picos foi de aproximadamente 30 µm, compatível

portanto, com o reconhecimento das superfícies pelas células como rugosas

(BRUNETTE, 1986) por encontrarem-se aproximadamente dentro do perímetro

celular, o que inibiria a migração celular, mas favoreceria sua diferenciação

(ALBREKTSSON; WENNERBERG, 2004; SAN MIGUEL et al., 2010). A autora

também verificou que após 24, 48 e 72 horas em cultura, os pré-osteoblastos

recobriam maior área de superfície e em maior espessura de camadas celulares

sobre os espécimes desmineralizados do que nos não desmineralizados. Além

disso, as células apresentaram características morfológicas compatíveis com


estágios mais avançados de diferenciação do que as células cultivadas sobre

superfícies não desmineralizadas. No mesmo estudo, foi verificado por microscopia

confocal, que houve maior expressão de BMP-2, BMP-4 e BMP-7 nas superfícies

desmineralizadas do que nas superfícies controle, o que levou à conclusão de que a

desmineralização de superfícies ósseas parece contribuir para antecipar os eventos

biológicos que resultam na deposição de novo osso.

Uma recente revisão de literatura constatou que a desmineralização artificial

do tecido ósseo antecipa o processo fisiológico dos osteoclastos por meio da

eliminação da parte mineral com o intuito de expor a matriz orgânica, aumentando a

biodisponibilidade de citocinas e fatores de crescimento que estejam contidos nesta

fase orgânica do osso (ROJAS-PAULUS et al., 2015), mas nenhum estudo foi

encontrado empregando a tetraciclina ácida (TCN) como agente desmineralizante.

Em procedimentos periodontais regenerativos, a TCN tem sido empregada como

biomodificador radicular em substituição ao ácido cítrico e ao EDTA (NAGATA et al.,

2005; ABED et al., 2013; MARIOTTI, 2003), com efeitos benéficos como inibição da

colagenase (GOLUB et al., 1985; GOLUB et al., 1991), capacidade antimicrobiana e

anti-inflamatória (GLABER; CREAMER, 1991; WIKESJÖ et al., 1986), inibição da

reabsorção óssea (RIFKIN; VERNILLO; GOLUB,1993) e promoção da formação

óssea (WIKESJO; SELVIG, 1999). Entretanto, outros estudos demonstraram efeitos

nocivos da TCN sobre a neoformação óssea, uma vez que sua presença no meio

pode inibir a expressão de BMPs (MUTHUKURU; SUN, 2013), inibir MMPs (GOLUB

et al., 1991) e causar uma doença pigmentativa conhecida como “black bone

disease” (PANDIT; HADDEN, 2004).

2.2 REPARO DE DEFEITOS CRÍTICOS

O termo defeito crítico é definido como o menor defeito ósseo criado numa

espécie animal que não pode ser regenerado espontaneamente, de forma que, em

lugar de ser preenchido por osso, esse defeito é preenchido por tecido conjuntivo

fibroso (SCHMITZ; HOLLINGER,1986; SPICER et al., 2012). Materiais ou

estratégias para regeneração óssea completa têm sido testados nesses defeitos no

estabelecimento de terapias regenerativas (SPICER et al., 2012). Entretanto, alguma


controvérsia existe com respeito ao diâmetro dos defeitos para que sejam

considerados críticos. Em ratos, o diâmetro de 8 mm tem sido recomendado por

alguns autores (MOKBEL et al., 2008; SPICER et al., 2012; HEO et al., 2015;

MARQUES et al., 2014), enquanto que existem trabalhos que empregaram 9 mm

(LEACH et al., 2006; ACCORSI-MENDONÇA et al., 2011), 7 mm (AGACAYAK et al.,

2012), 6 mm (ELDESOQI et al., 2014), 5 mm (DE ALMEIDA et al., 2013; MARQUES

et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2015) e 4 mm (LEE et al., 2015; NOTODHARDJO et

al., 2010). Cooper et al. (2010) observaram que em pequenos defeitos considerados

não-críticos (2,3 mm) no modelo murino, somente foi alcançado 35% de reparo

ósseo, dados que os levaram a sugerir que embora os ratos tenham sido

considerados um modelo confiável na avaliação de potencial de reparo de

biomateriais, pequenos defeitos não têm o potencial de um modelo de rápido reparo

ósseo craniofacial. Entretanto com os avanços tecnológicos, a cada dia é possível

fazer uma avaliação mais detalhada das diferenças da quantidade e qualidade de

formação óssea em pequenos defeitos.

Nesta revisão de literatura, foram selecionadas apenas as publicações que

consideraram defeitos de 8 mm de diâmetro e com metodologia semelhante à desta

dissertação para facilitar a comparação dos resultados.

2.2.1 ESTUDOS HISTOMORFOMÉTRICOS

Múltiplos biomateriais têm sido testados quanto à efetividade no fechamento

de defeitos críticos. Será dada ênfase aos estudos que tiveram pelo menos um

grupo constituído de osso autógeno ou alógeno para fins de comparação dos

resultados com os desta dissertação.

Um estudo de Oliveira et al. (2008) compararam os resultados da implantação

de osso desmineralizado bovino (DBB) e osso autógeno (AB) em defeitos críticos

criados na calvária de 50 ratos machos de 3 meses de idade aos 7, 14, 21, 30 e 90

dias pós-operatórios (n=5). Seus dados demonstraram superioridade do AB em

todos os períodos estudados. Assim, a porcentagem de tecido ósseo neoformado

nos defeitos foram para AB e DBB respectivamente aos 7 dias, de 4,51% e 1,86%;

aos 30 dias, de 40,23% e 8,87%. Aso 90 dias, os defeitos implantados com AB

estavam completamente fechados enquanto que os tratados com DBB


apresentaram substituição do biomaterial por tecido conjuntivo fibroso já aos 21 dias.

Esses dados levaram os autores à conclusão de que, apesar da presença de BMPs

em enxertos ósseos desmineralizados com seu potencial efeito na indução da

formação óssea, o biomaterial empregado em seu estudo não foi capaz de suplantar

o osso autógeno nesse quesito.

Mais tarde, em 2012, Zambuzzi et al. (2012), que são pesquisadores do

mesmo grupo de Oliveira et al. (2008), estudaram o comportamento do osso

anorgânico bovino como carreador de pré-osteoblastos MC3T3-E1 no reparo de

defeitos críticos semelhantes. Coágulo (controle negativo), osso autógeno (controle

positivo) e o biomaterial sozinho foram empregados para comparação. Depois de 30

dias, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos quanto à

quantidade de osso neoformado, com exceção feita em relação ao osso autógeno

que se comportou muito melhor que os demais grupos, mostrando preenchimento de

cerca de 20% do defeito enquanto que o biomaterial com MC3T3-E1 obteve 10%, o

biomaterial sozinho, cerca de 7% e células apenas e coágulo, ambos com apenas

5% de preenchimento. Em suas conclusões, os autores argumentaram que, embora

não tenha havido superioridade da combinação células + biomaterial sobre o osso

autógeno, o biomaterial apresentou como vantagem, servir como veículo para levar

células osteoprogenitoras para o ambiente da ferida.

Com o intuito de avaliar o efeito de diferentes substitutos ósseos impregnados

com proteína morfogenética óssea recombinante humana-2 (rhBMP-2), Mokbel et al.

(2013) realizaram defeitos críticos de 8 mm na calvária de 24 ratos (Sprague

Dawley). Os defeitos foram preenchidos por um dos seguintes biomateriais: 1) osso

bovino inorgânico e rhBMP-2; 2) osso alógeno liofilizado e rhBMP-2; e 3) osso

autógeno. Um grupo controle foi deixado sem tratamento. Após oito semanas, foi

realizada histomorfometria em cortes teciduais não descalcificados empregando um

programa computadorizado analisador de imagem. Nos cortes, a área média de

formação óssea foi de 4,00 mm2 (50%) no grupo 1; 2,56 mm2 (32%) no grupo 2; e

2,30 mm2 (28,7%) no grupo 3. O grupo controle apresentou apenas 0,82 mm2

(10,25%) de área média de osso neoformado. Os grupos 2 e 3 não apresentaram

diferença estatística entre si. Os autores concluíram que a incorporação de rhBMP-2

aos diferentes substitutos ósseos foi eficaz na melhora da capacidade regenerativa

dos defeitos críticos.


Anos antes, Mokbel et al. (2008) já haviam empregado a mesma metodologia

em 24 ratos Sprague-Dawley de 1 mês de vida, 8 semanas após o preenchimento

com osso desproteinizado bovino (grupo Bio-Oss) coberto (grupo XO) ou não por

membrana reabsorvível (grupo XOCM), enxerto alógeno liofilizado (grupo DFDBA),

Bio-Oss associado a colágeno (grupo XOC) e osso autógeno (grupo controle). Maior

formação óssea nos defeitos foi produzida pelo osso autógeno (2,97 ± 1,82 mm2;

37,1 %) seguido do DFDBA (2,93 ± 1,93 mm; 36,6%) e XOC (2,25 ± 1,94 mm2;

28,1%). Os grupos XO, XOCM e controle não mostraram diferença estatisticamente

significante, apresentando 1,97 ± 1,64 (24,6%), 1,87 ± 1,07 (23,3%) e 1,85 ± 1,04

mm2 (23,1%) respectivamente. Com isso, os autores comprovaram a superioridade

do osso autógeno em relação aos biomateriais testados, mas ressaltaram que estes

apresentam quase os mesmos padrões de cicatrização e propriedades

osteocondutivas que o osso autógeno.

Já a HA em diferentes formas de apresentação foi estudada quanto ao

potencial regenerativo por outros autores. Fleckenstein et al. (2006) enxertaram HA

bifásica micro e macroporosa em associação com fosfato tricálcico (HA-TCP), e com

DFDBA em calvária de 44 ratos (Sprague-Dawley). A análise histomorfométrica

realizada após 10 semanas demonstrou preenchimento de 47% do defeito nos

espécimes enxertados com DFDBA; 19,7% nos espécimes enxertados com HA-TCP

macroporosa e 8,5% com HA-TCP microporosa. Os autores concluíram que a

superioridade da HA-TCP macroporosa pode ser devida à sua característica de

auto-manutenção de espaço e tamanho de poros compatível com a penetração de

vasos neoformados, além de servir como carreador para fatores de crescimento

como BMPs.

Um composto de ácido poliglicólico e HA (PLGA/H) foi desenvolvido e testado

por Kim e Kim (2008) isoladamente ou em associação com osso bovino

desproteinizado (Bio-Oss) para comparação com gel de fibrina no preenchimento de

defeitos críticos (n=6) em ratos machos Sprague-Dawley. Depois de 8 semanas, os

resultados foram comparáveis (cerca de 3,5% de preenchimento dos defeitos), não

havendo superioridade da combinação PLGA/HA sobre o Bio-Oss puro. Além disso,

o PGLA não tinha ainda sido reabsorvido e não houve remodelação das partículas

de HA. Nos defeitos preenchidos apenas com gel de fibrina não houve formação

óssea, estando presente apenas tecido conjuntivo fibroso.


Outro biomaterial alternativo, derivado da casca do ovo (N-HA), também

obteve bons resultados no preenchimento de defeitos críticos de 8 mm realizados

em calvária de ratos em comparação ao Bio-Oss e à combinação N-HA + sulfato de

cálcio (PARK et al., 2009). Uma análise histomorfométrica demonstrou maior

porcentagem de neoformação óssea nos espécimes tratados com N-HA (11,2% e

19,2% às 4 e 12 semanas respectivamente) em comparação a defeitos não

preenchidos (3,9% e 6,4% às 6 e 12 semanas respectivamente), preenchidos com

Bio-Oss (6,4% e 8,2% às 6 e 12 semanas respectivamente) e com a associação N-

HA + sulfato de cálcio (6,3% e 12,6% às 6 e 12 semanas respectivamente). Assim,

foi constatado que N-HA comportou-se como um substituto ósseo osteocondutivo e

que não existe nenhum benefício na adição de sulfato de cálcio ao N-HA.

Outra proposta foi a de verificar o efeito do recobrimento do material

enxertado em defeitos críticos com membranas reabsorvíveis (BioMesh) ou não

reabsorvíveis (Millipore), para conter o material, evitando sua dispersão. Assim, Lim

et al. (2000) após enxertarem DFDBA humano em defeitos criados na calvária de

120 ratos Sprague–Dawley, cobriram os defeitos com as membranas e verificaram

que esse procedimento aumentava significantemente a quantidade de tecido ósseo

neoformado nos defeitos. Os dados histomorfométricos quanto à área de

neoformação óssea foram apresentados em mm2, sendo que aos 7 dias, o DFDBA

não recoberto por membrana apresentou o melhor resultado (7.48 ± 4.51). Às 4 e 8

semanas, maior área de osso neoformado foi vista quando o DFDBA foi recoberto

pela membrana reabsorvível (23.62 ± 6.77 e 49.53 ± 23.70 respectivamente).

Defeitos controle não preenchidos não apresentaram neoformação óssea

significante em nenhum tempo de observação, com predominância de tecido

conjuntivo fibroso. Os autores observaram que é necessário que a membrana

permaneça por no mínimo 5 semanas para que melhores resultados sejam obtidos.

Atribuíram os bons resultados da regeneração guiada pelo melhor controle da

inflamação, especialmente na prevenção da invasão de macrófagos e de tecido

conjuntivo.


2.2.2 ESTUDOS EMPREGANDO µCT

O volume, a área e a densidade de osso neoformado também foram

estudados por Intini et al. (2008) em defeitos críticos de 8 mm realizados em calvária

de 25 ratos (Sprague-Dawley). Os defeitos (n=5) foram preenchidos por 25µl de

proteína derivada na matriz do esmalte (EMD), ou osso liofilizado desmineralizado

(DFDBA), ou por rhBMP-2 em veículo de colágeno liofilizado (controle). Após oito

semanas, foram feitas análises microscópicas e por µCT. Os cortes histológicos

demonstraram que, no grupo controle, o reparo ósseo ficou limitado às margens do

defeito e no centro foi visto apenas um tecido fibrótico maduro bem organizado; no

grupo DFDBA, grânulos não reabsorvidos do biomaterial ainda estavam presentes

em todo o defeito e o reparo ósseo esteve limitado à deposição de osteoide rico em

osteócitos circundando alguns desses grânulos distantes das margens do defeito; os

grupos EMD e controle mostraram limitada quantidade de reparo ósseo apenas nas

margens dos defeitos e o centro foi ocupado por tecido conjuntivo fibroso maduro

bem organizado. As análises por µCT, por outro lado, não demonstraram diferenças

estatísticas quanto ao volume, área, ou densidade de osso formado nos defeitos dos

grupos DFDBA e EMD em comparação ao controle. O volume e a área de osso

neoformado nos dois grupos teste corresponderam a apenas 12,5% e 20%

respectivamente em relação às medidas originais do defeito e se mantiveram

inferiores ao grupo controle. Quanto à densidade, apenas o grupo DFDBA

apresentou um valor significantemente superior aos demais e não distinguível

estatisticamente do osso normal (~620 mg/mm3). Os autores concluíram que o

emprego isolado dos biomateriais estudados não tem efeito no reparo de defeitos

críticos, sugerindo que seja considerado o seu descarte na terapia regenerativa

óssea.

Algumas linhagens de células também foram alvo de estudo no reparo de

defeitos críticos. Cornejo et al. (2012) estudaram células osteoblásticas derivadas do

tecido adiposo (OBS), endoteliais (ECS) e células tronco indiferenciadas derivadas

do tecido adiposo (CTDA) associadas a enxertos ósseos alógenos liofilizados de

origem murina para promover o reparo de 37 defeitos críticos de 8mm realizados em

ratos (Lewis). As células foram adicionadas isoladamente aos enxertos sendo que

em um grupo de animais foi feita a associação entre OBS e ECS. O volume e a


densidade da área enxertada foram avaliados por µ-CT e a vascularidade foi

avaliada por imunohistoquímica. Após oito semanas, o volume ósseo encontrado no

grupo ECS (24,7 mm3) foi significantemente maior do que nos demais grupos,

seguido pelos grupos CTDA (20,5 mm3), ECS+OBS (16,6 mm3) e OBS (16,3 mm3),

esses dois últimos, sem diferença em relação ao grupo controle que foi tratado

apenas com osso autógeno sem associação com células. Embora maior densidade

mineral tenha sido observada no grupo OBS (1,30 ± 0,06 gHA/cm3), seguido pelos

grupos controle (1,29 ± ,004 gHA/cm3), CTDA (1,29 ± 0,07 gHA/cm3) e ECS+OBS

(1,28 ± 0,07 gHA/cm3), essas diferenças não foram estatisticamente significantes. Já

a quantidade de vasos neoformados foi significantemente maior no grupo ECS do

que em todos os demais grupos. Com isso, os autores concluíram que a

angiogênese favoreceu a neoformação óssea, sugerindo que a adição de ECS aos

enxertos merece ser melhor investigada.

A tabela 1 resume os principais resultados desses estudos.


Tabela 1 – Resumo dos principais resultados de estudos sobre reparo de defeitos críticos de 8mm em calvária de ratos.

Autor n Material de preenchimento

Método de análise

Tempo de

avaliação

Resultados

Lim et al. (2000)

5

1- DFDB 2- BioMesh 3- DFDB + BioMesh 4- Millipore 5- Controle vazio

Histomorfometria: área de osso neoformado em mm2

1, 2, 4 e 8 semanas

1 semana: 7.48 (1), 2.88 (2), 6.43 (3), 2.57 (4), 0.43 (5) 4 semanas: 22.28 (1), 5.28 (2), 23.62 (3). 12.73 (4), 3.20 (5) 8 semanas: 33.99 (1), 8.75 (2), 49.53 (3). 37.07 (4), 4.35 (5)

Fleckenstein et al. (2006)

11

HA-TCP HA-TCP c/macro porosidades HA-TCP c/micro porosidade DFDBA

Histomorfometria: % de área ocupada por novo osso

10 semanas

HA-TCP: 6,9% Macro: 19,7% Micro: 8,5% DFDBA: 47%

Intini et al. (2008)

5

EMD DFDBA rhBMP-2 + colágeno liofilizado (controle)

µ-CT: volume (mm3), área (mm2) e densidade (mg/mm3) de osso neoformado

8 semanas

Volume C: ~2; DFDBA:~2,5; EMD: ~1; rhBMP-2: ~17

Área: C: ~40; DFDBA: ~40; EMD: ~30; rhBMP-2: ~230

Densidade: C: ~490; DFDBA: ~610; EMD: ~590; rhBMP-2: ~585

Kim e Kim

(2008)

6

PLGA/HA, BioOss Gel de fibrina

Histomorfometria % de área de novo osso

8 semanas

PLGA/HA: ~3,3; Bio- Oss: ~3,5; Fibrina: 0

Mokbel et al. (2008)

6

XO: BioOss XOCM: BioOss + Bioguide DFDBA XOC: Pep Gen e colágeno AB: osso autógeno

Histomorfometria para áreaa de formação óssea (mm2) e % de preenchimento por novo osso

8 semanas

Área (mm2): XO: 1,97 ± 1,64; XOCM: 1,87 ±1,07; DFDBA: 2,93 ± 1,93; XOC: 2,25 ± 1,94; AB: 2,97 ± 1,82; C: 1,85 ± 1,04 % XO: 24,6; XOCM: 23,3; DFDBA: 36,6; XOC: 28,1; AB: 37,1; C: 23,1%

Oliveira et al.

(2008)

5

AB: Osso autógeno DBB: Osso bovino desmineralizado

Histomorfometria de % de novo osso formado

7, 14, 21, 30 e 90 dias

7dias: AB- 4,51 ± 1,57; DBB - 1,86 ± 1,13; 14 dias: AB- 14,11 ± 6,61; BB - 12,02 ± 8,29 21 dias: AB- 29,93 ± 2,95; DBB- 11,83 ± 2,72 30 dias: AB- 40,23 ± 5,88; DBB- 8,87 ± 6 90 dias: AB- 53,54 ± 6,42; DBB- 15,62 ± 9,32

...continua


...continuação

Autor n Material de preenchimento

Método de análise

Tempo de avaliação

Resultados

Park et al. (2009)

7

Coágulo BO N-HA/CS NHA

Histomorfometria para % de preenchimento por novo osso

6 e 12 semanas

6 semanas: C- 3.9±2.1; N-HA-11.2±3.3; BO- 6.4±4.3; N-HA/CS- 6.3±4.1 12 semanas: C- 6.4±4.8; N-HA- 19.2±6.1; BO- 8.2±3.9 N-HA/CS- 12.6±5.9

Cornejo et al. (2012)

10

Controle CTDA OBS ECS ECS + OBS

µ-CT: Volume (mm3) Densidade (g/ cm3)

8 semanas

Volume Controle: 19.6 ± 2.8; CTDA: 20.5 ± 4.3; OBS: 16.3 ± 3.7; ECS: 24.7 ± 7.3; ECS+OBS: 16.6 ± 5.7 Densidade Óssea: Controle: 1.29±.04; CTDA: 1.29 ± .07; OBS: 1.30 ± .06; ECS: 1.28 ± .07; ECS + OBS: 1.29 ± .10

Zambuzzi et

al. (2012)

ni

Coágulo AB OB anorgânico MC3T3-E1 OB + MC3T3-E1

Histomorfometria para % de preenchimento por novo osso

30 dias

Coágulo: 5% AB: 20% OB anorgânico: 7% MC3T3-E1: 5% OB + MC3T3-E1: 10%

Mokbel et al. (2013)

6

ABBM: BioOss + rhBMP-2 FDBA: Oragraft + rhBMP-2 AUTO Coágulo (C)

Histomorfometria para preenchimento ósseo (mm2) e percentagem de novo osso (%)

8 semanas

Preenchimento ósseo: ABBM: 4,00 ± 1,69; FDBA: 2,56 ± 1,06; AUTO: 2,30 ± 0,34; C: 0,82 ± 0,25 % de novo osso ABBM: 50; FDBA: 32; AUTO: 28,7; C: 10,25%

Publicações que alcançaram maior preenchimento ósseo

Publicações que alcançaram preenchimento ósseo médio

Publicações que alcançaram preenchimentos ósseo mínimo.

DFDBA: Osso alógeno iofilizado desmineralizado; AB: Osso autógeno BO: Bio Oss; CTDA: Células

tronco indiferenciadas derivadas do tecido adiposo; ECS: células endoteliais; OBS: células

osteoblásticas derivadas do tecido adiposo

2.3 MICRO TOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (µ-CT)

A tomografia computadorizada de feixe cônico (TCFC) tem sido preconizada

como um método imaginológico confiável de avaliação tridimensional de estruturas

mineralizadas (ALFOTAWEY et al., 2014). A partir dessa técnica foi desenvolvida a

Micro tomografia computadorizada (µ-CT) que é uma técnica radiográfica sofisticada

que permite uma avalição quantitativa da estrutura óssea em três dimensões. A

principal vantagem da técnica é a redução da dose de radiação quando comparada


com a tomografia convencional (ALFOTAWEY et al., 2014). Mesmo que as margens

dos tecidos regenerados e o osso original sejam quase indiferenciáveis, a µ-CT pode

ser uma ferramenta essencial para investigar a natureza da interface entre os

tecidos calcificados regenerados e o osso próprio previamente existente podendo

explorar a estrutura do cemento remanescente formado em raízes após

procedimentos regenerativos, assim como o padrão de regeneração e trabeculado

ósseo a formar-se após o uso de distintos biomateriais em engenharia tecidual

(ALFOTAWAY et al., 2014; ANNIBALI et al., 2012; LEE et al., 2013).

A µ-CT também pode ser empregada na quantificação da geometria de

arcabouços, análise de osso neoformado, neovascularização, e análise da matriz

pré-óssea (ANNIBALI et al., 2014). Ainda, permite trabalhar menos invasivamente

nos diferentes modelos animais laboratoriais, permitindo a avaliação do mesmo

animal em vários períodos experimentais, reduzindo a quantidade dos mesmos e

também, podendo caracterizar a estrutura dos tecidos moles e detectar anomalias

ósseas (KALLAI et al., 2011; SPICER et al., 2012; ANNIBALI et al., 2014; ZHANG et

al., 2015).

Além disso, a µ-CT tem sido comparada com análises histomorfométricas

empregando microscópio óptico (PARK et al., 2011; LEE et al., 2013; PARK et al.,

2014). Entretanto, as análises histológicas são limitadas a um corte feito no centro

do defeito e suas informações não são imediatas como as da µ-CT (PARK et al.,

2011). Ainda, a µ-CT vem sendo empregada na medicina regenerativa, provendo ao

pesquisador a oportunidade de análises in vivo e ex vivo das características macro e

microestruturais do tecido (KALLAI et al., 2011), bem como do cálculo do volume

ósseo com menor margem de erro (16%) do que com histomorfometria convencional

(MARÉCHAL et al., 2005).

Outra vantagem importante é que a análise realizada por meio de µ-CT pode

ser feita até quando a área de interesse está coberta por membranas de titânio,

estando a mesma sempre concordando com os resultados das análises

histomorfométricas (KIGAMI et al., 2014).

Entre as desvantagens da µ-CT encontra-se o diâmetro da câmara de

escaneamento dos aparelhos, que limita o tamanho das amostras de tecido a serem


analisadas, assim como a não detecção de tecido osteoide devido ao seu baixo

conteúdo mineral (ANNIBALLI et al., 2013). Além disso, protocolos específicos são

necessários para a utilização da µ-CT, podendo alguns demorar até 3,5 horas por

amostra, dependendo do tipo de amostra óssea, tipo de equipamento usado e

experiência do operador (KALLAI et al., 2011).

Resumidamente, a µ-CT funciona por meio de um programa de computador

que converte em imagens tridimensionais as imagens ou cortes obtidos de um

scanner que está conectado ao computador, gerando assim imagens mais reais do

defeito a ser avaliado. O processo requer que as amostras sejam mantidas em um

ambiente estável durante o escaneamento, já que a não estabilidade pode introduzir

distorções ou não viabilizar a reconstrução do objeto no programa (SPICER et al.,

2012).

3 Proposição

Proposição 43

3 PROPOSIÇÃO

O objetivo geral deste trabalho foi comparar dois diferentes agentes

desmineralizantes de enxertos ósseos autógenos particulados (ácido cítrico pH1 a

50% e tetraciclina hidroclorada a 50mg/ml) em diferentes tempos de aplicação,

quanto ao efeito produzido no reparo de defeitos críticos em calvária de ratos.

Os objetivos específicos foram:

• Avaliar por meio de microtomografia computadorizada, a área, volume

e densidade óssea nos defeitos após 7, 30 e 60 dias pós-operatórios;

• Avaliar por meio de análise histomorfométrica, a área, volume e

densidade óssea nos defeitos após 7, 30 e 60 dias pós-operatórios;

• Comparar os dois agentes desmineralizantes entre si, com um controle

negativo desprovido de enxerto e com um controle positivo constituído

de enxerto ósseo não desmineralizado, quanto aos parâmetros

estabelecidos nos itens anteriores.

4 Material e Métodos

Material e Métodos 47

4 MATERIAL E MÉTODOS

Esta pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética no Ensino e Pesquisas

em Animais (processo 016/2013) da Faculdade de Odontologia de Bauru da

Universidade de São Paulo (FOB/USP).

4.1 SELEÇÃO E OBTENÇÃO DA AMOSTRA:

Foram utilizados 120 ratos adultos machos, da linhagem Wistar (Rathus

norvegicus – Var. albinus rodentia mammalia), pesando cerca de 300-400 gramas,

com aproximadamente 4 meses de vida, criados e mantidos no Biotério Central da

Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo. Os animais

receberam uma dieta constituída de ração e água fornecidos à vontade (Labina –

Purina, Paulínia, SP).

4.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO DE CRIAÇÃO E PREENCHIMENTO DOS

DEFEITOS CRÍTICOS:

Neste estudo foi utilizado o modelo de defeito crítico de 8 mm de acordo com

os parâmetros estabelecidos por Spicer et al. (2012). Após pré-anestesia com

cloridrato de xilasina (Anasedan, Vetbrands, Jacareí/SP) à dose de 0,1ml/Kg de

peso corporal, seguido por cloridrato de ketamina (Dopalen, Vetbrands, Jacareí/SP)

à dose de 0,1 ml/Kg de peso. Foi feita a tricotomia na região frontoparietal dos

animais (FIGURA 1A), seguida de antissepsia com digluconato de clorexidina a 2%

(Chlorohex, Johnson Diversey, São Paulo) e infiltração local de xilocaína a 2% com

norepinefrina 1:50000, (Merrell Lepetit Farmacêutica e Industrial, LTDA.) com o

objetivo de promover vasoconstricção prévia à incisão e assim, diminuir o

sangramento. Os animais foram cobertos com campos cirúrgicos estéreis

descartáveis e a partir deste momento os procedimentos foram realizados de forma

a manter a cadeia asséptica (FIGURA 1A). O tegumento da linha média recebeu


uma incisão semilunar com lâmina de bisturi no.15 (Lamedid Comercial e Serviços

Ltda. Barueri, SP) até atingir o periósteo. A partir desta incisão, um retalho total foi

levantado para exposição da cortical óssea, da qual, com uma broca trefina de 8,0

mm de diâmetro interno em baixa rotação e sob irrigação profusa com solução

isotônica de cloreto de sódio a 0,9%, foi removido um disco bicortical (Figura 1B).

FIGURA 1. Procedimento cirúrgico. A. Ratos cobertos por campos cirúrgicos estéreis. B. Defeitos de 8mm criados com broca trefina. C. Osso autógeno raspado desmineralizado após lavagem com soro fisiológico. D. Colocação de osso no defeito criado E. espécime fixado contendo osso hospedeiro e enxerto após o período de reparo dentro de um tubo plástico para centrífuga para ser levado ao microtomógrafo..

Previamente à remoção do disco, para o preenchimento do defeito criado, foi

raspado e coletado osso autógeno da calvaria do rato de uma área periférica ao

defeito com raspador cirúrgico (Rhosse Instrumentos e Equipamentos Cirúrgicos

LTDA EPP, Ribeirão Preto, SP, Brasil) sendo o mesmo imediatamente

desmineralizado por submersão em 5 gotas de ácido cítrico pH 1 a 50% ou 10 gotas

de solução de tetraciclina hidroclorada a 50mg/mL dentro de uma cuba de aço

inoxidável (FIGURA 1C) durante os períodos experimentais como descrito abaixo. A

solução de tetraciclina foi obtida pela diluição de uma cápsula de 500mg de


tetraciclina hidroclorada (Teuto/Pfizer, Anapolis, Goiás, Brasil) em 10 mL de soro

fisiológico, sendo utilizado o sobrenadante, cujo pH foi medido em peagâmetro

resultando em pH = 1,57. Como a densidade dessa solução é mais baixa do que a

do ácido cítrico, foi necessário o dobro de gotas para atingir o mesmo volume de

solução. Após transcorridos os tempos de desmineralização, o osso foi lavado com

soro fisiológico estéril e aspirado por um coletor de osso descartável (Indusbello,

Londrina, Paraná, Brasil) durante 30 segundos antes de ser coletado e transferido

para o defeito crítico criado (FIGURA 1D).

Foram constituídos os seguintes 8 grupos de estudo formados por 15 animais

(5 em cada período experimental):

• CN (controle negativo): os defeitos permaneceram sem enxerto;

• CP (controle positivo): os defeitos foram preenchidos por osso

particulado não desmineralizado;

• AC 15: os defeitos foram preenchidos com osso particulado

desmineralizado por ácido cítrico durante 15 segundos;





• TCN 15: os defeitos foram preenchidos com osso particulado

desmineralizado por tetraciclina durante 15 segundos;


desmineralizado por tetraciclina durante 30 segundos;


desmineralizado por tetraciclina durante 60 segundos.

Após o preenchimento dos defeitos, os tecidos moles foram reposicionados e

suturados com fio reabsorvível 3-0 (Catgut Cromado, Ethicon, Johnson & Johnson).

Os animais receberam analgésicos pós-operatoriamente (200 mg de paracetamol,

EMS, Hortolandia, SP, Brasil).

A eutanásia dos animais foi feita 7 dias, 30 e 60 dias depois das cirurgias por

sobredose de anestésico (3x a dose de anestesia).


4.3 MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (µCT)

Após a eutanásia, foi feita a craniotomia para obtenção de blocos ósseos de

12mm de lado, medidos com sonda periodontal envolvendo o defeito e 2mm de

margem. Os blocos de tecido foram colocados em uma solução tampão de formalina

neutra a 10%, para fixação por no mínimo 24 horas. Esses blocos foram introduzidos

em tubos plásticos para centrífuga de 1,5 ml (FIGURA 1E) para estabilização e

padronização da posição das amostras no microtomógrafo computarizado por raios-

x Skyscan 1072 (SKYSCAN, KONTICH, BÉLGICA) existente na Disciplina de

Endodontia da Faculdade de Odontologia de Bauru (adquirido pelo processo

FAPESP 2010/16072-2). As amostras teciduais contendo os enxertos foram

analisadas em resolução de 27,1 µm por pixel, usando o procedimento de cone

beam. Imagens tridimensionais do volume do defeito crítico e seu conteúdo foram

geradas com o software ANT (versão 2.4; SkyScan) e para cada amostra, 300 cortes

de imagens (1,5 mm) foram selecionados (FIGURA 2).

FIGURA 2. Tela do computador mostrando as imagens obtidas após escaneamento das peças com o Microtomografo.


As medições de volume de osso neoformado no defeito (mm3), superfície de

preenchimento do defeito (mm2) e a densidade do osso neoformado (mg/mm3) foram

realizadas com o mesmo software por um único operador calibrado (FIGURA 3).

FIGURA 3. Tela do computador do programa desenhado para realizar as medições de área de preenchimento, volume e densidade óssea das amostras

4.4 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA QUALITATIVA

As mesmas amostras empregadas para µCT foram descalcificadas

empregando solução Morse por aproximadamente 45 dias e processadas por

histotécnica convencional para coloração por hematoxilina e eosina e coloração com

Tricrômico de Masson, no laboratório de anatomopatologia da Disciplina de

Patologia da FOB-USP. De cada amostra foram escolhidos três cortes da porção

mais central para a análise. Eventos de reparo da ferida como integração das

células do hospedeiro ao enxerto, crescimento de novos vasos sanguíneos e

integração do enxerto foram observados ao microscópio óptico Nikon Eclipse 80i

(Nikon Instruments Inc., Nova York, Estados Unidos) e descritos por um patologista

experiente e cego ao experimento.


4.4.1 CRITÉRIOS APLICADOS NA ANÁLISE MICROSCÓPICA

QUALITATIVA.

Para o registro das imagens dos cortes teciduais, imagens parciais dos

cortes teciduais capturadas com objetivas 4X, 10X, 20X, 40X e 100X em

microscópio optico (Olympus – CX2, Olympus Imaging América Inc.) foram

transferidas para um microcomputador. Empregando o programa Adobe Photoshop

CS, versão 8.0.1 (1990-2003 Adobe Systems Incorporated, USA) foram compostas

imagens completas (FIGURA 4).

FIGURA 4. Tela do computador do Adobe Photoshop com as imagens dos cortes teciduais

Ênfase e atenção especial foi dada à quantificação do tecido ósseo

neoformado na superfície e ao redor das partículas ósseas desmineralizadas nos

diferentes tempos de desmineralização.

Especificamente, um critério de mensuração foi adotado, estabelecendo

escores ou valores numéricos crescentes de 1 a 5 para quantificar estes fenômenos

de natureza reacional e reparatória relacionados à organização celular e tecidual.

Esta progressiva graduação no processo de neoformação óssea, segue abaixo

descrita:


A. Granuloma do tipo corpo estranho........................(GTCE) = ESCORE 1

B. Tecido de granulação imaturo................................ (TGI) = ESCORE 2

C. Tecido de granulação maduro................................ (TGM) = ESCORE 3

D. Tecido conjuntivo fibroso maduro............................(TCFM) = ESCORE 4

E. Tecido conjuntivo fibroso com neoformação óssea (TCFNO) = ESCORE 5

Para cada grupo e tempo experimental foram elaboradas descrições do

quadro microscópico encontrado nas quais se procurou caracterizar o padrão

morfológico reacional ou reparatório.

4.5 ANÁLISE HISTOMORFOMETRICA

Para a avaliação da área de tecido mineralizado dentro do defeito critico, foi

utilizado o programa Image J 1.49 m, National Institute of Health (NIH) –

Bethesda/Maryland/EUA). Com a ferramenta poligono, foi delimitada a área

correspondente aos defeitos. Com a ferramenta Analyse/Measure foi calculada a

área total em µm2. Desse total foram substraidas as áreas correspondentes a tecido

mineralizado em seu interior. O valor resultante foi convertido em porcentagem.

Cada uma dessas medidas foi realizada três vezes, com intervalo de 3 dias entre

elas e a média entre as três foi considerada. Este conjunto de dados foi transferido

para uma planilha do programa Excel (Microsof Office 2007, Windows XP), para o

cálculo da porcentagem do osso neoformado em cada espécime.

4.6 FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS

A normalidade e homogeneidade das variáveis foram verificadas. Cada

parâmetro (área, densidade e volume de novo osso formado) foi avaliado

separadamente. A significância das diferenças entre os grupos foram determinadas

pela análise de variância a dois critérios (ANOVA), seguida pelo pós-teste de Tukey

quando ANOVA indicou uma diferença significativa entre os grupos (p<0.05).


Já na avaliação dos processos histológicos, nos dados totalizados e

contextualizados foram aplicados os testes estatísticos Shapiro Wilk para análise de

normalidade dos resultados. Posteriormente, foram aplicados os testes estatísticos

de Kruskal-Wallis e, para a verificação das possíveis diferenças intergrupos e

tempos experimentais, o teste de Dunn. Foi empregando o programa Statistica 10.0

(StatSoft South América SP, Brazil), para realização de todas as análises

estatísticas.

5 Resultados

Resultados 57

5 RESULTADOS

5.1 ANÁLISE POR MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (µ-CT)

As informações colhidas de cada espécime a respeito de cada parâmetro

avaliado referente à análise por µ-CT encontram-se descritos a seguir.

5.1.1 ÁREA DE TECIDO ÓSSEO MINERALIZADO NO DEFEITO CRÍTICO

(mm2)

Os valores médios da área de tecido mineralizado encontrado no defeito

crítico estão descritos na tabela 2. Aos 7 dias, foi observada escassa neoformação

óssea nos defeitos independentemente do grupo de estudo (Tabela 2). Aos 30 dias,

o grupo AC15 foi o que apresentou maior área de neoformação óssea quando

comparado com os demais grupos, porém essa diferença foi estatisticamente

significante apenas em comparação ao grupo CN (p> 0,005) (Tabela 2). Aos 60 dias,

houve maior área de formação óssea no grupo TCN30 mas com diferença

estatisticamente significante somente quando comparada com o grupo CN

(p<0,005). A figura 5 representa espécimes avaliados aos 7 dias.

FIGURA 5. Microtomografias computadorizadas de espécimes desmineralizados com ácido cítrico aos sete dias A. Espécime desmineralizado por 15 segundos. B. Espécime desmineralizado por 30 segundos. C. Espécime desmineralizado por 60 segundos

Resultados 59

TABELA 2 - Área média de tecido mineralizado no defeito crítico avaliada por µ-CT

Período de

avaliação

Área (mm2) Grupo

CN Grupo

CP Grupo AC15

Grupo AC30

Grupo AC60

Grupo TCN30

Grupo TCN60

7 dias 11,45 ± 4,60

a 14,05 ± 2,05

a 20,62 ± 9,29

b 13,08 ± 3,75a

14,001 ± 4,91 a

22,58 ± 4,79 a

17,06 ± 8,31 a

30 dias 14,02 ± 2,21

a 19,19 ± 6,60

a 22,79 ± 6,81

b 16,49 ± 3,03 a

26,06 ± 9,56 a 16,09 ± 2,23 a

24,06 ± 3,53 a

60 dias 19,38 ± 9,17

a 22,59 ± 7,36

b 25,20 ± 6,06

b 23,78 ± 6,33 b

23,67 ± 7,79 b 26,32 ± 8,91 b

23,67 ± 5,40 b

*Letras diferentes na mesma linha significam diferença estatística significante. (p<0,005)

5.1.2 Volume de tecido mineralizado no defeito (mm3)

Os valores médios do volume de tecido mineralizado dentro dos defeitos

estão descritos na tabela 3. Aos 7 dias, foi observado maior volume ósseo no grupo

CP com diferença estatisticamente significante (p< 0,005) quando comparado ao

grupo CN e TCN 60. Os grupos AC15, AC30, AC60 e TCN30 também apresentaram

valores significantemente maiores do que o grupo CN (Tabela 3), mas sem diferença

entre si. Aos 30 dias, o grupo AC30 foi o que apresentou maior volume ósseo

quando comparado com os demais grupos, observando-se diferença

estatisticamente significante quando comparado com o grupo CN, CP, TCN 30, TCN

60, mas sem diferença estatística entre os grupos AC15 e AC60 (Tabela 3). Aos 60

dias, foi encontrado maior volume de formação óssea no grupo AC15 com diferença

estatisticamente significante apenas em comparação aos grupos TCN30 e TCN60

(Tabela 3). A figura 6 representa espécimes avaliados aos 30 dias.

FIGURA 6. Microtomografias de espécimes desmineralizados com ácido cítrico aos trinta dias A. Espécime desmineralizado por 15 segundos. B. Espécime desmineralizado por 30 segundos. C. Espécime desmineralizado por 60 segundos

Resultados 61

TABELA 3 - Volume médio de tecido mineralizado no defeito crítico avaliado por µ-CT Período

de avaliaçã

o

Volume (mm3)

Grupo CN

Grupo CP Grupo AC15

Grupo AC30

Grupo AC60

Grupo TCN30

Grupo TCN60

7 dias 10,82 ±4,59a

38,15 ± 6,97b 31,14±14,52

ab 31,27±3,92

ab 23,77±1,87

ab 21,09 ± 6,07

ab 9,86 ± 5,84 ac

30 dias 27,79 ± 8,19

bc 25.18 ± 9,76b

46,46±5,58 ac

49,73±7,52a 33,88±7,65

ab 11,96 ± 3,38

b 17,57 ± 2,61b

60 dias 29,23 ± 9,68

ab 44,99 ±12,05

ab 45,84±12,34

b 37,10±10,84

ab 45,64±12,62

b 14,45 ± 3,58

a 21,81 ± 5,39 a


5.1.3 Densidade do tecido mineralizado no defeito (mg/mm3)

Os valores médios da densidade do tecido mineralizado no defeito estão

descritos na tabela 4. Aos 7 dias, foi observada maior densidade óssea no grupo

TCN30 com diferença estatisticamente significante (p< 0,005) quando comparado

com os grupos CN, AC15, AC30, AC60 (Tabela 4). Aos 30 dias, o grupo TCN30 foi

o que apresentou maior densidade óssea, observando-se diferença estatisticamente

significante quando comparado com os grupos CN e CP. Aos 60 dias, foi encontrada

maior densidade de osso neoformado no grupo AC60, mas esse valor não foi

diferente estatisticamente quando comparado com todos os grupos (p> 0,005). A

figura 7 representa espécimes avaliados aos 60 dias.

FIGURA 7. Microtomografias de espécimes desmineralizados com ácido cítrico aos sessenta dias A. Espécime desmineralizado por 15 segundos. B. Espécime desmineralizado por 30 segundos. C. Espécime desmineralizado por 60 segundos

Resultados 63

TABELA 4 - Densidade média de tecido mineralizado no defeito crítico

Período de avaliação

Densidade (mg/mm3)

Grupo CN

Grupo CP

Grupo AC15

Grupo AC30

Grupo AC60

Grupo TCN30

Grupo TCN60

7 dias 0,78 ± 0,35a 2,05 ± 0,70

ac 2,34 ± 1,10ab 1,66 ± 0,91a

1,42 ± 0,26 a

3,89 ± 0,82 c

2,39 ± 1,24 ac

30 dias 0,77 ± 0,24a 1,41 ± 0,68

ab 2,80 ± 0,60bc 2,46 ± 0,41c

2,25 ± 0,37 ac

3,27 ± 0,82 bc

3,12 ± 1,15 bc

60 dias 0,89 ± 0,37a 1,93 ± 0,34a 1,92 ± 0,40a 1,37 ± 0,37a 2,09 ± 1,07a 1,97 ± 0,57a 1,83 ± 0,10

a


FIGURA 8. Microtomografias de espécimes dos grupo controle positivo e negativo após 30 e 60 dias. A. Controle negativo após 30 dias. B. Controle Negativo após 60 dias. C. Controle Positivo após 30 dias D. Controle Positivo após 60 dias

Resultados 65

5.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA QUALITATIVA

5.2.1 GRUPO CN

Neste grupo foi observada pouca atividade celular no período de 7 dias. O

tecido predominantemente observado foi tecido de granulação maduro com escasso

tecido conjuntivo imaturo. Após 30 dias observou-se uma área predominante de

tecido conjuntivo imaturo com escassa formação óssea vinda da periferia do defeito.

Após o período de 60 dias podia-se observar discreta formação óssea a partir das

margens do defeito e fechamento parcial predominantemente por tecido conjuntivo

maduro (FIGURA 9).

FIGURA 9. Fotomicrografia de espécimes do grupo controle negativo aos 7, 30 e 60 dias (A) Especime aos 7 dias apresentando tecido de granulação maduro. (B) Area de tecido conjuntivo inmaturo (seta amarela) com escassa formação óssea vinda da periferia (seta preta (C) Abundante tecido conjuntivo Maduro (seta amarela) com fechamento parcial do defeito com osso vindo da periferia (seta preta) (HE)

5.2.2 GRUPO CP

No período inicial dos sete dias foram observadas predominantes reações de

tipo corpo estranho na maior parte do defeito, circundando as partículas de osso

autógeno, mas nenhuma formação óssea a partir das bordas do defeito. Após 30

Resultados 67

dias foi possível observar pequenas áreas de osteogênese em um dos defeitos

observados, sendo mais abundante um tecido conjuntivo imaturo. Partículas do

material enxertado persistiam em fase de remodelação e algumas circundadas por

granuloma do tipo corpo estranho em fase final. Após 60 dias ainda eram

observadas reações do tipo corpo estranho ao redor do materialem fase final, sendo

observadas escassas áreas de osteogênese ao redor de algumas partículas do osso

autógeno em permeio a extensa área de tecido conjuntivo imaturo. Perifericamente

foi observadaosteogênese em direção ao centro do defeito, o que diminui o tamanho

do defeito (independente do material).(FIGURA 10).

FIGURA 10. Fotomicrografias de espécimes do grupo controle positivo aos. (A) Controle Positivo após 7 dias, são observadas predominantes reações de tipo corpo estranho na maior parte do defeito (setas amarelas), sem nenhuma formação óssea a partir das bordas do defeito. (B) Controle Positivo após 30 dias. Pode-se observar abundante tecido conjuntivo imaturo (setas pretas) com partículas do material enxertado em fase de remodelação e algumas circundadas por granuloma do tipo corpo estranho em fase final (seta amarela) (C). Controle Positivo após 60 dias. Reações do tipo corpo estranho ao redor do material em fase final (setas amarelas). Perifericamente foi observada osteogênese em direção ao centro do defeito, o que diminui o tamanho do defeito, independente do material (seta preta) HE.

Resultados 69

5.2.3 GRUPO AC15

Aos sete dias observaram-se escassas reações de corpo estranho com

predominante tecido conjuntivo imaturo e presença de osso neoformado, associado ao

material de enxerto de permeio a abundante tecido de granulação óssea. Aos 30 dias as

margens do defeito eram praticamente indistinguíveis do osso neoformado a partir da

periferia. Houve predomínio de um intenso processo de osteogênese diretamente

associado ao material enxertado cujas formas assemelhavam-se a camadas de cascas

de cebola. Aos 60 dias as margens do defeito encontravam-se totalmente

indistinguíveis. Observou-se fechamento total do defeito em duas amostras e

fechamento quase completo nas demais. O osso neoformado do defeito possuía

características de estágio avançado de remodelação, inclusive com a presença de

espaços medulares em seu interior (FIGURA 11).

FIGURA 11. Fotomicrografias de espécimes do Grupo AC15. (A). AC 15 após 7 dias eram observadas escassas reações de corpo estranho com predominante tecido c onjuntivo imaturo (setas amarelas) e presença de osso neoformado, associado ao material de enxerto de permeio a abundante tecido de granulação óssea (setas pretas)B. AC 15 após 30 dias. As margens do defeito eram praticamente indistinguíveis do osso neoformado a partir da periferia (seta amarela). Houve predomínio de um intenso processo de osteogênese diretamente associado ao material enxertado (seta preta) C. AC 15 após 60 dias As margens do defeito encontravam-se totalmente indistinguíveis (seta amarela). Observou-se fechamento total do defeito em duas amostras e fechamento quase completo nas demais, inclusive com a presença de espaços medulares em seu interior (setas pretas)

Resultados 71

5.2.4 GRUPO AC30

Nas amostras correspondentes ao período de sete dias foi observado

predominante tecido de granulação imaturo e reações do tipo corpo estranho

associadas às partículas do material, com escassa presença de tecido ósseo

neoformado ao redor das partículas.Já aos 30 dias as margens do defeito eram

ainda facilmente identificáveis, mas com sinais de remodelação e neoformação

óssea a partir delas. Foi observado um aumento significante de tecido ósseo

neoformado, mas ainda com escassas reações de corpo estranho no defeito,

associado ao biomaterial. Nesse grupo aos 60 dias as margens do defeito ainda

eram identificáveis e osteogênese era visível a partir das margens. Entretanto, a

osteogênese era pontual, focal e irregular. Partículas do osso enxertado ainda

estavam individualizadas e circundadas por reações do tipo corpo estranho com

predominante formação óssea ao redor das partículas enxertadas. Neste grupo,

perde-se a característica de casca de cebola, o que é mais marcante no grupo AC15

em todos os tempos de avaliação (FIGURA 12).

Resultados 73

FIGURA 12. Fotomicrografias de espécimes do Grupo AC30. A. AC 30 após 7 dias era observado predominante tecido de granulação imaturo e reações do tipo corpo estranho (seta amarela) associadas às partículas do material, com escassa presença de tecido ósseo neoformado ao redor das partículas (seta preta) dias. B. AC 30 após 30 dias. Margens do defeito facilmente identificáveis, mas com sinais de remodelação e neoformação óssea a partir delas (setas amarelas). Foi observado um aumento significante de tecido ósseo neoformado, mas ainda com escassas reações de corpo estranho no defeito, associado ao biomaterial (setas pretas). C. AC 30 após 60 dias. As margens do defeito ainda eram identificáveis e osteogênese era visível a partir das margens (setas amarelas). Entretanto, a osteogênese era pontual, focal e irregular. É possível partículas do osso enxertado individualizadas e circundadas por reações do tipo corpo estranho (setas pretas) com predominante formação óssea ao redor das partículas enxertadas (setas pretas).

Resultados 75

5.2.5 GRUPO AC60

Aos sete dias era possível observar tecido de granulação maduro com

predominante tecido conjuntivo maduro e escasso tecido ósseo neoformado. Já

após 30 dias a formação óssea era predominante mas ainda apresentavam-se

algumas reações de corpo estranho, com presença de tecido conjuntivo maduro. Já

aos 60 dias era ainda eram observadas escassas reações do tipo corpo estranho,

com abundante formação óssea, observando-se um fechamento quase total dos

defeitos, já que as partículas do material praticamente desapareceram

(FIGURA 13).

FIGURA 13. Fotomicrografias de espécimes do Grupo AC60. A. AC 60 após 7 dias. Tecido de granulação maduro com predominante tecido conjuntivo maduro e escasso tecido ósseo neoformado (setas amarelas e pretas) B. AC 60 após 30 dias. Predominante formação óssea a partir das margens do defeito (seta amarela) mas ainda apresentavam-se algumas reações de corpo estranho, com presença de tecido conjuntivo maduro (seta preta) C. AC 60 após 60 dias Escassas reações do tipo corpo estranho (seta preta), com abundante formação óssea, observando-se um fechamento quase total dos defeitos (seta amarela), já que as partículas do material praticamente desapareceram

Resultados 77

5.2.6 GRUPO TCN15

Aos sete dias, foi possível observar neste grupo abundante tecido de

granulação maduro com escassas reações do tipo corpo estranho. Já aos 60 dias

observaram-se uma ou outra partícula com reação do tipo corpo estranho, com

maior presença de tecido conjuntivo fibroso maduro e tecido de granulação. Neste

grupo não foi possível observar o padrão de formação óssea em forma de casca de

cebola (FIGURA 14).

FIGURA 14. Fotomicrografias de espécimens do Grupo TCN 15 A. TCN 15 após 7 dias. . Abundante tecido

de granulação maduro com escassas reações do tipo corpo estranho (setas amarela e preta). B. TCN

15 após 60 diasObservam-se uma ou outra partícula com reação do tipo corpo estranho, com maior

presença de tecido conjuntivo fibroso maduro e tecido de granulação (setas amarelas e pretas).

Neste grupo não foi possível observar o padrão de formação óssea em forma de casca de cebola.

(HE)

A

B

Resultados 79

5.2.7 GRUPO TCN30

Aos sete dias foi possível observar escassas reações do tipo corpo estranho,

junto com predominante tecido conjuntivo imaturo assim como tecido conjuntivo

fibroso maduro em uma das amostras. Já aos 30 dias as reações do tipo corpo

estranho eram predominantes em todas as amostras e só em uma amostra foi

possível observar escassas áreas de formação óssea relacionada com o material.

Após 60 dias, ainda eram predominantes as reações do tipo corpo estranho com

escassa presença de tecido conjuntivo fibroso maduro (FIGURA 15).

FIGURA 15. Fotomicrografias de espécimes do Grupo TCN 30. A. TCN 30 após 7 dias. Escassas reações do tipo corpo estranho, junto com predominante tecido conjuntivo imaturo assim como tecido conjuntivo fibroso maduro em uma das amostras (setas amarela e preta)B. TCN 30 após 30 dias. Reações do tipo corpo estranho predominantes em todas as amostras e só em uma amostra foi possível observar escassas áreas de formação óssea relacionada com o material (seta amarela e preta).C. TCN 30 após 60 dias Ainda eram predominantes as reações do tipo corpo estranho (seta amarela) com escassa presença de tecido conjuntivo fibroso maduro (seta preta) (HE).

B

C

A

Resultados 81

5.2.8 GRUPO TCN60

No período inicial de sete dias foi possível observar escassas reações do tipo

corpo estranho com predominante tecido de granulação imaturo. Após 30 dias ainda

era possível observar escassas áreas de reações de tipo corpo estranho, associada

às partículas do material enxertado, porém era predominante a presença de tecido

conjuntivo fibroso maturo. Após 60 dias as amostras continuavam com aspecto

semelhante, com escassas áreas de reações do tipo corpo estranho e predominante

tecido conjuntivo fibroso maduro (FIGURA 16).

FIGURA 16. Fotomicrografias de espécimes do Grupo TCN 60. A. TCN 60 após 7 dias.Escassas reações do tipo corpo estranho com predominante tecido de granulação imaturo (setas amarela e preta).B. TCN 60 após 30 dias. Escassas áreas de reações de tipo corpo estranho, associada às partículas do material enxertado (seta preta), porém era predominante a presença de tecido conjuntivo fibroso maturo (seta amarela).C. TCN 60 após 60 dias. As amostras continuavam com aspecto semelhante, com escassas áreas de reações do tipo corpo estranho e predominante tecido conjuntivo fibroso maduro (setas amarela e preta).

B

C

A

Resultados 83

5.3 ANÁLISE HISTOMOFOMÉTRICA

Aos 7 dias o grupo com maior porcentagem de área de preenchimento do

defeito crítico foi o AC 15 (13,28 ± 5,69%), porém, quando comparado com os outros

grupos, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significante. Aos 30

dias o grupo AC 15 continuava apresentando maiores valores de preenchimento

(50,26 ± 26,38%) com diferença estatística significante quando comparado com

todos os demais grupos. O segundo melhor resultado foi o observado no grupo AC

30 (29,49 ± 13,36%), seguido de CN (22,39 ± 4,95%) e AC60 (22,69 ± 8,88%) sem

diferença estatística significante entre eles. Já entre os demais grupos o menor

preenchimento foi exibido pelo grupo CP (7,68 ± 3,56%), sem diferença estatística

significante em relação a TCN 30 e TCN 60, esses dois últimos também não

diferentes entre si. Aos 60, dias o grupo AC15 (61,53 ± 30,91%) e AC30 (57,16 ±

27,58%) apresentaram as maiores porcentagens de preenchimento, sem diferença

estatística entre si, mas com diferença significante em relação a todos os demais

grupos..

A tabela 5 apresenta os valores referentes a análise histomorfométrica das

amostras e o gráfico da figura 17 ajuda a visualização desses resultados.

Tabela 5. Análise histomorfométrica da porcentagem de área ocupada por tecido mineralizado no

interior dos defeitos críticos

Período

de

avaliação

Área de preenchimento dos defeitos (%)

Grupo CN

Grupo CP

Grupo AC15

Grupo AC30

Grupo AC60

Grupo TCN30

Grupo TCN60

7 dias 0 a

4,51 ± 3,21 A

13,28 ± 5,69 a

2,04 ± 0,64 A

0,52±0,27 A

0a 0a

30 dias 22,39 ± 4,95 dc

7,68 ± 3,56 d

50,26±26,38 b

29,49±13,36 Ce

22,69±8,88ac 16,00±3,04 ad

15,57±3,64 Ad

60 dias 29,59 ± 7,77 c

19,99±10,09 Ce

61,53 ±30,91 b

57,16±27,58 B

36,43±12,37c 5,36±1,93 ae

8,44±2,86 ae


84 Resultados

Porcentagem de área de tecido mineralizadono interior dos defeitos críticos

7 dia

s

30 d

ias

60 d

ias

0

20

40

60

80

100controle negativocontrole positivoAC 15AC30AC60TCN30TCN60

Tempo de avaliação

% d

e Á

rea

Figura 17. Gráfico mostrando a porcentagem da área de tecido mineralizado no interior dos defeitos críticos

6 Discussão

Discussão 87

6 DISCUSSÃO

Este estudo comprovou que desmineralização do osso particulado

previamente à enxertia é benéfica no reparo de defeitos críticos, sendo os protocolos

empregando ácido cítrico por 15 e 30 segundos, os mais efetivos na obtenção desse

objetivo.

Embora não tenha sido demonstrada diferença estatisticamente significante

entre alguns grupos, aqueles em que foi empregado ácido cítrico obtiveram maior

formação óssea do que os desmineralizados com tetraciclina ou não

desmineralizados. Aos sete dias, os grupos CP, TCN15, TCN30 e TCN se

comportaram de forma parecida, porém, onde foi usado ácido cítrico, foi possível

observar indícios de formação óssea diretamente associada ao material enxertado.

Aos 7 dias, não era esperada formação de tecido ósseo significante, mas

surpreendentemente, os espécimes desmineralizados com ácido cítrico

demonstraram precocidade na produção de eventos regenerativos já nesse período.

Provavelmente, a capacidade de promover alterações superficiais e de liberar

elementos osteopromotores (URIST et al., 1965; URIST et al., 1968; SALMERON,

2015) contidos na matriz orgânica óssea após a desmineralização possa explicar

esse fenômeno, juntamente com a possibilidade de o ácido cítrico antecipar a ação

dos osteoclastos na remodelação do tecido enxertado (REZENDE et al., 2014;

REZENDE et al., 2015).

Estudos anteriores da equipe de pesquisadores da FOB-USP (RODRIGUES

et al., 2012; REZENDE et al. 2014; REZENDE; DOMINGUES; SALMERON, 2014;

REZENDE et al., 2015; SALMERON, 2015) demonstraram que a desmineralização

óssea superficial contribui positivamente para a diferenciação celular e para a

aceleração da consolidação de enxertos ósseos. Provavelmente no osso

particulado, assim como ocorre em superfícies planas (SALMERON, 2015), também

pode ter havido alteração topográfica das superfícies das partículas, tornando-as

mais propícias à adesão de células osteoprogenitoras. Além disso, foi verificado que

as partículas desmineralizadas por ácido cítrico estavam mais íntegras e intactas

que as não desmineralizadas, as quais sofreram reabsorção antes de serem

88 Discussão

substituídas por novo osso. Assim, deduziu-se que a desmineralização antecipou a

chegada dos osteoblastos à área, iniciando-se a deposição de matriz precocemente.

Desta forma, as partículas deixaram de ser reconhecidas como corpo estranho, o

que também justifica a observação de que as reações de tipo corpo estranho eram

escassas nos grupos desmineralizados com ácido cítrico quando comparadas com

os grupo controle positivo ou onde foi empregada a tetraciclina, nos quais

aparentemente, estão sendo reabsorvidas deixando na área, tecido conjuntivo

fibroso ao invés de tecido ósseo.

Dignos de nota foram os resultados inesperados ocorridos nos grupos

desmineralizados com tetraciclina, já que, possuindo baixo pH (1,54-1,62) e

comportamento favorável em superfícies radiculares (NAGATA et al., 2005; ABED et

al., 2013; MARIOTTI, 2003; GOLUB et al., 1985; GOLUB et al., 1991), era de se

esperar comportamento semelhante também no tecido ósseo. Os resultados dos

grupos tratados por tetraciclina foram ainda piores que os do grupo controle

negativo, sendo observada pouca ou nenhuma formação de novo osso ao redor das

partículas do material do enxerto em todos os períodos de avaliação, assim como

todos os tempos de desmineralização avaliados. Por outro lado, foram encontrados

dados (MUTHUKURU; SUN, 2013; GOLUB et al., 1991) relatando a tetraciclina

como inibidor das BMPs e das MMPs, consequentemente da neoformação óssea, o

que poderia em parte, explicar o pobre comportamento desses grupos em relação à

formação de tecido conjuntivo fibroso em lugar de osso. Outra possível explicação

para esse efeito aparentemente adverso da tetraciclina é que resíduos de

pigmentos da tetraciclina se incorporam a superfície óssea, gerando uma reação de

tipo corpo estranho em lugar de neoformação óssea e interferindo na comunicação e

expressão das BMPs e MMPs (MUTHUKURU; SUN, 2013; GOLUB et al., 1991).

O objetivo da comparação entre ácido cítrico e tetraciclina neste estudo, foi

testar uma segunda opção de agente desmineralizante, já que alguns profissionais

atuantes em centros cirúrgicos enfrentam resistências quanto ao emprego do ácido

cítrico em hospitais devido à inexistência de preparados comerciais estéreis de ácido

cítrico no mercado. A tetraciclina hidroclorada, por sua vez, já vem esterilizada

dentro de cápsulas permitindo seu amplo uso em qualquer ambiente. Não é

conhecido método seguro de esterilização do ácido cítrico sem risco de alteração de

Discussão 89

suas propriedades químicas, embora seja esse um procedimento desnecessário

frente à impossibilidade de crescimento bacteriana em pH tão baixo.

Os resultados aqui apresentados para histomorfometria aos 7 e 30 dias para

o grupo AC 15 (13,28% e 50,26% respectivamente) mostraram-se superiores

quando comparados com os resultados aos 7 e 30 dias do trabalho de Lim et al.

(2000) que obtiveram preenchimento ósseo máximo de 7,48 mm2 e 22,28 mm2

respectivamente empregando DFDB em defeitos críticos. Quando os mesmos

autores usaram DFDB associado à membrana Biomesh, seus resultados foram mais

altos aos 30 dias (23,62 mm2) sendo que aos 60 dias tanto o grupo empregando

DFDB, DFDB e Biomesh e empregando millipore apresentaram menor

preenchimento que os grupos AC 15 (61,53) e AC 30 (57,16) deste trabalho (33,99

mm2) (49,53 mm2), (37,07 mm2), respectivamente.

Os trabalhos de Mokbel et al. (2008) e (2013) também utilizaram diferentes

biomateriais no preenchimento de defeito críticos (BiosOss, BioOss + Bio Guide,

DFDBA, osso autógeno, Pep Gen) e avaliaram o preenchimento através de análise

com µ-CT e análise histomorfometrica. Esses trabalhos mostraram bons resultados

de área de preenchimento com os materiais empregados, porém não é possível sua

comparação com o presente trabalho já que os autores mediram preenchimento a

partir das bordas dos defeitos e no presente trabalho foram utilizadas as

reconstruções da µ-CT para determinar a área de preenchimento.

Os resultados de 60 dias de avaliação apresentados por Intini et al. (2008)

mostraram resultados de volume inferiores aos desta pesquisa em defeitos

preenchidos com DFDBA, EMD e rhBMP-2 após a avaliação com µ-CT . Porém,

densidade e área foram bem maiores em todos os grupos avaliados, em especial

naqueles em que foi empregada a rhBMP-2. Dada à grande diferença entre seus

resultados e os aqui apresentados poder-se-ía especular que tal discrepância possa

ser atribuída à metodologia e ao equipamento empregado por eles, muito mais

sensível às variações de mineralização do que o aqui empregado. Não se pode

deixar de observar, entretanto, que os resultados de Intini et al. (2008) diferem em

muito de todos os demais autores estudados (Tabela 1), fazendo com que a

comparação fique muito prejudicada.

90 Discussão

Por outro lado, Cornejo et al. (2012) apresentaram dados bem inferiores ao

deste estudo quanto ao volume e densidade óssea em defeitos críticos enxertados

com células endoteliais (ECS) e osso autógeno (OBS) após 8 semanas . Seus

valores maiores foram de 24,7 mm3 e 1,30 mg/mm3 para volume e densidade

respectivamente para defeitos tratados com ECS e uma mistura de ECS e OBS

também respectivamente, ao passo que no mesmo período, o grupo AC15 desta

dissertação apresentou volume de 45,84 mm3 e o grupo AC 60 apresentou 2,09

mg/mm3.

Ainda se tratando de análise histomorfométrica, o emprego da

desmineralização de osso autógeno no preenchimento de defeitos críticos teve

excelentes resultados quando comparados com outros trabalhos onde foram

empregados outros biomateriais (MOKBEL et al., 2008, 2013; FLECKENSTEIN et

al., 2006; OLIVEIRA et al., 2008; ZAMBUZZI et al., 2012; KIM; KIM, 2008). Entre

esses trabalhos o que obteve maior preenchimento foi o realizado por Oliveira et al.

(2008) que, após 30 dias e 90 dias alcançaram preenchimento de 40,23% e 53,54%

respectivamente quando empregado osso autógeno. Por outro lado Fleckenstein et

al. (2006) obtiveram preenchimento de 47% com DFDBA após 10 semanas. Bons

resultados foram também observados por Mokbel et al. (2013) que, após 8 semanas

de avaliação, observaram um preenchimento ósseo de 50% quando empregado

ABBM (BioOss + rhBMP-2). Porém esses resultados permaneceram inferiores aos

observados nesta dissertação após 60 dias, onde foi possível alcançar um

preenchimento ósseo de até 61,53% quando realizada a desmineralização do osso

autógeno com ácido cítrico por 15 segundos e de 57,16% quando desmineralizado

por 30 segundos, demonstrando que de fato este processo pode

proporcionarvantagens significativas de ganho ósseo.

Apenas um autor apresentou dados de porcentagem de preenchimento ósseo

por histomorfometria aos 30 dias de avaliação, com resultado máximo de 20% de

preenchimento com o uso de enxerto ósseo autógeno (ZAMBUZZI et al., 2012). No

mesmo período de 30 dias, trabalhos resultados deste estudo demonstraram

preenchimento maior que esse em todos os grupos testes com ácido cítrico AC15

(50,26%), AC30 (29,49 ± 13,36%) e AC60 (29,49 ± 13,36%) e até mesmo no grupo

CN (22,39%).

Discussão 91

O resultado de maior preenchimento ósseo nos tempos de desmineralização

de 15 e 30 segundos encontram ressonância nos trabalhos de Rezende et al.

(2015), que demonstraram maior crescimento e viabilidade de osteoblastos MC3T3-

E1 em espécimes desmineralizados por 15 e 30 segundos e também no trabalho de

Salmeron (2015), que concluiu que a desmineralização de osso autógeno durante 30

segundos parece promover a proliferação e diferenciação celular, alterando a

topografia do osso e proporcionando superfícies com características de composição

e topografia favoráveis para um melhor comportamento das células

osteoprogenitoras. A racionalização para o uso desses tempos de desmineralização

baseiam-se na observação de que o ácido cítrico gera uma remoção mineral da

matriz orgânica, expondo a matriz e aumentando a biodisponibilidade de BMPs,

permitindo a sua participação no processo de formação do osso (ROJAS-PAULUS

et al., 2015; REZENDE et al., 2014; REZENDE; SALMERON, 2015). O período de

15 segundos de desmineralização parece ser suficiente para eliminar essa porção

mineral sem danificar a estrutura das BMPs. Ao contrário, nos grupos TCN30 e

TCN60 foi observado pouco preenchimento ósseo aos 7 dias (nenhum

preenchimento em ambos os gupos)30 dias (16,00 ± 3,04% e5,57 ± 3,64%

respectivamente) e 60 dias (5,36 ± 1,93% e 8,44 ± 2,86% respectivamente), o que

poderia estar relacionado com o potencial de inibição das BMPs e MMPs por parte

das tetraciclinas (MUTHUKURU; SUN, 2013; GOLUB et al., 1991).

Os resultados da avaliação por µCT revelaram dados relativamente altos para

de área de tecido mineralizado no interior dos defeitos em relação à análise

histomorfometrica. Analisando os números encontrados para 7 dias, verifica-se que

a histomorfometria praticamente não encontrou osso neoformado nos defeitos. Já a

µCT considerou as partículas de osso enxertado desmineralizado ou não, tornando a

avaliação precoce, imprecisa, sem correspondência com a realidade do reparo mais

tardio. Aos 30 dias, observou-se superioridade numérica, mas não estatística dos

grupos tratados com ácido cítrico em relação á área de tecido mineralizado no

interior dos defeitos. Uma certa equiparação dos resultados foi encontrada aos 60

dias. Infelizmente, não é possível comparar dados de µCT com os

histomorfométricos porque os primeiros são avaliados em mm2 e os segundos em

porcentagem. demonstraram que o processo de desmineralização de fato é

vantajoso já que foi observada maior área de preenchimento ósseo no grupo TCN

92 Discussão

30 aos 7 dias (22,58 mm2), no grupo AC 60 aos 30 dias (26,06 mm2) e no grupo

TCN 30 aos 60 dias (26,32 mm2). Aos 7 dias não foi observada diferença estatística

entre os grupos, já aos 30 dias sim era possível observar diferença estatística

significante entre o AC15 e CP, AC30, AC60, TCN30 e TCN60.

Os dados relativos à densidade óssea são importantes por informarem,

indiretamente, a respeito do grau de maturidade do osso neoformado. Assim, quanto

maior a densidade, mais maduro está o tecido (INTINI et al., 2008). A análise desse

parâmetro na tabela 4 destaca a densidade apresentada pelo grupo AC 30 aos 30

dias, maior do que todos os demais grupos, mas com significância estatística

apenas com o grupo CN. Do mesmo modo, aos 60 dias, destaca-se o grupo TCN30,

também com densidade numericamente maior que os demais grupos. Mais uma vez,

apenas uma publicação, a de Cornejo et al. (2012) permitiu comparação com os

dados aqui apresentados. Empregando células tronco derivadas do tecido adiposo

de ratos, células endoteliais e osso autógeno, esses autores encontraram aos 60

dias, densidades ósseas inferiores aos grupos desmineralizados deste estudo

(Tabelas 1 e 4).

Os dados de volume complementam os de área e não podem ser avaliados

por histomorfometria, já que se refere a uma grandeza tridimensional. Assim, é

compreensível que aos 7 dias, o grupos controle positiva tenha apresentado os

maiores valores, já que espera-se que o osso não desmineralizado enxertado no

defeito ainda permaneça quase que totalmente não reabsorvido em um período tão

precoce de observação. Todos os grupos em que foi empregada desmineralização

quer com ácido cítrico ou com tetraciclina, apresentaram valores comparáveis entre

si e com o grupo CP.

Aos 30 dias, o que se observou no grupo CP foi uma considerável diminuição

do volume ósseo, o que não ocorreu com os grupos desmineralizados, em especial

naqueles em que foi empregado ácido cítrico. Provavelmente este evento deveu-se

à reabsorção ocorrida com as partículas do osso não desmineralizado previamente à

nova deposição de osso, conforme constatado na avaliação de 60 dias (Tabela 3).

Verifica-se assim, que a desmineralização antecipou a formação óssea, minimizando

a fase de reabsorção.

Discussão 93

Diante do exposto, conclui-se inequivocamente, que a desmineralização de

enxertos ósseos e seus respectivos leitos representam uma linha de pesquisa

merecedora de maiores investimentos científicos para procurar esclarecer vários

pontos ainda obscuros como processos bioquímicos envolvidos, comportamento

celular frente a superfícies desmineralizadas, caracterização dessas superfícies do

ponto de vista físico e molecular, assim como outros estudos in vivo procurando

reproduzir as situações clínicas em que esse procedimento poderia ter efeito

potencialmente benéfico.

7 Conclusões

Conclusões 97

7 CONCLUSÕES

De acordo com os dados colhidos, segundo a metodologia estabelecida e

dentro das limitações apresentadas, pode-se concluir que:

• A desmineralização com ácido cítrico do osso autógeno particulado

enxertado em defeitos críticos promoveu maior área, volume e densidade

de formação óssea do que a desmineralização com tetraciclina e do que a

não desmineralização;

• O protocolo de desmineralização que parece alcançar melhores

resultados em relação aos parâmetros estudados é da aplicação de ácido

cítrico durante 15 ou 30 segundos;

• Tetraciclina não parece ser um bom agente desmineralizante para o

objetivo de acelerar o reparo ósseo de defeitos críticos.

Referências

Referências 101

REFERÊNCIAS

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Anexos

Anexo 119

universidade de sÃo paulo faculdade de … · vida toda estarei sempre grato por tuas bênçãos e...

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