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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO

PRETO DEPARTAMENTO DE PSICOLOGIA E EDUCAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

“Distribuição da proteína Fos no encéfalo de ratos durante o medo

condicionado ao som e contexto”.

Marcos Galdiano Lopes

Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP,

Como parte das exigências para obtenção do

Título de Mestre em Ciências, Área: Psicobiologia.

RIBEIRÃO PRETO – SP

- 2006 –

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO

PRETO DEPARTAMENTO DE PSICOLOGIA E EDUCAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

“Distribuição da proteína Fos no encéfalo de ratos durante o medo

condicionado ao som e contexto”.

Marcos Galdiano Lopes

Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP,

Como parte das exigências para obtenção do

Título de Mestre em Ciências, Área: Psicobiologia.

Orientador: Prof. Dr. Marcus Lira Brandão

RIBEIRÃO PRETO – SP

- 2006 –

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL

DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU

ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE

CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Lopes, Marcos Galdiano

Distribuição da proteína Fos no encéfalo de ratos durante o

medo condicionado ao som e contexto como estímulos

condicionados. Ribeirão Preto –SP. Ribeirão Preto, 2006.

70 p. : il. ; 30cm

Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP – Área de

concentração: Psicobiologia. Orientador: Brandão, Marcus Lira.

1.Medo condicionado. 2. Congelamento. 3.

Imunoistoquímica. 4. Proteína Fos.

Dedico este trabalho

Ao meu pai, Euripedes Mendes Lopes (in memorian) que está sempre em

meus pensamentos e é sempre lembrado com muito amor e carinho, mas, agradeço

principalmente minha mãe Gessi Vaz Galdiano Lopes, que com muito amor,

paciência e compreensão me ensinou a lutar pelos meus objetivos sem nunca

desistir. Amo vocês!

A toda minha família, em especial, minha irmã Mônica pelo carinho e

incentivo sempre presentes e também aos meus sobrinhos Marília e Marcelo pelos

momentos de descontração!

A minha namorada Ana Paula, pelo amor, paciência, sensibilidade e

compreensão. Você tem sido meu porto seguro, me ajudado a crescer e já faz parte

de minha vida, por isso te amo muito. Obrigado!

AGRADECIMENTOS

À Deus, por me dar força e persistência para concluir mais esta etapa da minha vida.

Ao Prof. Dr. Marcus Lira Brandão, por confiar na minha capacidade profissional, e ter me

orientado.

À banca examinadora, pela atenção dispensada na análise deste trabalho.

Aos meus amigos e colegas, pelos bate-papos e conselhos. Vocês tornaram esse período muito

especial.

Aos amigos de laboratório, Raquel, Carlos Eduardo, Jorge, Karina, Cristina, Lucas, Amanda,

Júlia, Ana Carolina, Fernanda, Sueli, Cecília, Milene, Adriano, Lucas Baptista, Caio, Luciana e

Alicia, pelo agradável convívio e por me ajudarem, de alguma maneira, na realização deste

trabalho.

Ao Jorge, Raquel, Karina, Cristina e Carlos Eduardo pela contribuição especial.

Aos amigos do setor de Psicobiologia que, de uma forma ou de outra, contribuíram para a

conclusão de mais essa etapa em minha vida.

À Renata BV, pela dedicação profissional e momentos agradáveis.

À Cida e Sueli pela amizade e sinceridade.

Ao Carlos Augusto (Guto) pelo apoio técnico e amizade.

À todos da secretaria de Pós – graduação da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de

Ribeirão Preto pelos serviços prestados.

Ao Biotério Central do câmpus pelo fornecimento dos animais.

À CAPES, pelo apoio financeiro.

VOCÊ MESMO

”Lembre-se de que você mesmo é o melhor secretário de sua tarefa, o mais eficiente propagandista de seus

ideais, a mais clara demonstração de seus princípios, o mais alto padrão do ensino superior que seu espírito

abraça e a mensagem viva das elevadas noções que você transmite aos outros.

Não se esqueça, igualmente, de que o maior inimigo de suas realizações mais nobres, a completa ou

incompleta negação do idealismo sublime que você apregoa, a nota discordante da sinfonia do bem que

pretende executar, o arquiteto de suas aflições e o destruidor de suas oportunidades de elevação - é você

mesmo." Francisco Cândido Xavier

Abreviações

AHA: Área hipotalâmica anterior, parte central

BLA: Núcleo basolateral da amígdala

CeA: Núcleo central da amígdala

Cg: Córtex cingulado 1 e 2

CnF: Núcleo cuneiforme

DMH: Hipotálamo dorsomedial

DMPAG: Substância cinzenta periaquedutal, parte dorsomedial

DLPAG: Substância cinzenta periaquedutal, parte dorsolateral

DR: Núcleo dorsal da rafe

Ent: Córtex entorrinal

HP: Hipocampo, áreas CA1, CA2 e CA3

IC: Colículo inferior

IL: Córtex infra-límbico

LC: Locus Coeruleus

LH: Hipotálamo lateral

LPAG: Substância cinzenta periaquedutal, parte lateral

MeA: Núcleo medial da amígdala

MnR: Núcleo mediano da rafe

PaAP: Hipotálamo paraventricular

PMD: Núcleo pré-mamilar, parte dorsal

PrL: Córtex pré-limbico

PVA: Tálamo paraventricular

SC: Colículo superior

VLPAG: Substância cinzenta periaquedutal, parte ventrolateral

VMH: Hipotálamo ventromedial, parte dorsomedial

ANOVA: Análise de variância

EI: Estímulo incondicionado

EC: Estímulo condicionado

SUMÁRIO

Resumo 11

Abstract 13

Introdução 15

Objetivos 21

Materiais e Métodos 21

Animais 21

Equipamentos 22

Procedimento Experimental 23

Delineamento Experimental 24

Histologia 25

Imunoistoquímica para detecção da proteína Fos 26

Análise Quantitativa da Expressão da Proteína Fos 27

Análise Estatística 29

Resultados 31

Discussão Geral 43

Referências Bibliográficas 53

___________________________________________________________________RESUMO

Resumo____________________________________________________________________________________11

No condicionamento clássico de medo, os animais são treinados a associar um estímulo

neutro, por exemplo, som ou contexto a um estímulo aversivo incondicionado (EI), como um

choque elétrico nas patas. Após alguns pareamentos, a presença do estímulo neutro passa

isoladamente a eliciar um estado de medo no animal, gerando uma resposta condicionada. O

congelamento é a resposta mais proeminente dos animais expostos ao estímulo condicionado,

previamente pareados com choques nas patas, sendo usualmente utilizado como medida do medo

condicionado. A técnica de imunoistoquímica para a detecção de proteína Fos foi utilizada para

mapear as estruturas encefálicas de ratos submetidos a dois tipos de condicionamento: contextual

e ao som. Duas horas após a sessão teste, os ratos foram sacrificados e perfundidos com

paraformaldeído. As estruturas encefálicas ativadas foram identificadas através da análise da

expressão neuronal da proteína Fos e um aumento significativo na expressão de núcleos neuronais

imunorreativos foram encontrados no, núcleo central (CeA) e basolateral da amígdala (BLA),

tálamo paraventricular (PVA) , área hipotalâmica anterior (AHA), substância cinzenta

periaquedutal ventrolateral (VLPAG) e núcleo cuneiforme (CnF) nos animais submetidos a

ambos tipos de condicionamento, entretanto, o córtex pré-limbico (PrL), hipotálamo

paraventricular (PaAP) e as partes dorsomedial, dorsolateral, lateral da substância cinzenta

periaquedutal e o colículo inferior (IC) apresentaram uma maior densidade de imunorreatividade

Fos ao som e o núcleo mediano da rafe (MRN) ao contexto aversivo que os grupos controles MC-

0,3 mA e CD-0,6 mA. Estes resultados confirmam o envolvimento destas estruturas no medo

condicionado e, sugerem que diferentes circuitos neurais estão subjacentes ao medo condicionado

contextual a ao som.

______________________________________________________________________________

________________________________________________________________ABSTRACT

Abstract____________________________________________________________________________________13

______________________________________________________________________________

It has been shown that unconditioned and conditioned fear activates different neural

circuits in the brain. Since conditioned fear can be elicited by several neutral stimuli such as

context, tones or light (CS) previously paired to an aversive unconditioned stimulus (e.g. foot

shocks-UCS) this work was aimed at examining the brain neural substrates that underlie the fear

behavior induced by different conditioned fear stimuli. Rats were submitted to classical fear

conditioning using tones or context as CS and foot shocks as UCS. Freezing behavior in the test

sessions induced by both types of conditioned stimuli was qualitative and quantitatively similar.

However, a distinct Fos immunoreactivity could be observed depending on the type of fear

conditioning. While the median raphe nucleus (MRN) was activated only by the contextual fear

conditioning tone-CS caused unique labeling in the inferior colliculus (IC), dorsal parts of the

periaqueductal gray, paraventricular hypothalamus (PaAP) and prelimbic area (PrL). Central

(CeA) and basolateral amygdala (BLA), paraventricular thalamus (PVA), anterior hypothalamus

(AHA), ventrolateral periaqueductal gray (VLPAG) and cuneiform nucleus (CnF) showed

significant labeling to both types of conditioned stimuli. These results support the existence of

distinct neural circuits mediating the freezing behavior triggered by tone and context as

conditioned fear stimuli. The brain activation induced by contextual fear appears to recruit brain

circuits from the MRN, whereas tone-CS recruits fear-mediated circuits from the midbrain

tectum. A core neural substrate comprised of amygdala, PVA, AHA, VLPAG and CnF seems to

subserve the fear conditioning independent of the type of the CS used.

_____________________________________________________________INTRODUÇÃO

Introdução__________________________________________________________________________________15

______________________________________________________________________________

A origem da ansiedade e de outras alterações emocionais está intimamente relacionada

com as reações de defesa dos animais, as quais ocorrem em resposta aos estímulos ou situações

de perigo normalmente encontradas no ambiente em que vivem (GRAEFF; GUIMARÃES,

1999). A ansiedade pode ser entendida como um estado emocional resultante do estado de

apreensão, incerteza e medo, freqüentemente experimentados na espécie humana e outros

mamíferos (DARWIN, 1872). Esses estados emocionais são relatados subjetivamente como

desconfortáveis e são, em grande parte, acompanhados por diversas alterações fisiológicas,

comportamentais e psicológicas, tais como taquicardia, sudorese, hiperventilação, aumento da

tensão muscular, inquietude e alerta (NUTT, 1990). Quando manifestada em níveis adequados

ou normais, a ansiedade também pode ter um valor adaptativo, à medida que contribui para a

execução de tarefas e, em última análise, para a sobrevivência dos indivíduos. Em contrapartida,

a ansiedade deve ser considerada patológica quando manifestada em excesso ou de modo

desproporcional às circunstâncias, prejudicando o desempenho dos indivíduos, ou ainda quando

associada a outros distúrbios afetivos (GRAEFF, 1993; DRATCU; LADER, 1993; NUTT,

1990).

Um conceito importante para se diferenciar medo e ansiedade é o de direção defensiva,

segundo o qual comportamentos distintos são observados quando um animal deixa uma área

onde há um predador (perigo real) ou entra em uma área onde um predador esteve ou pode estar

(perigo potencial), (BLANCHARD; BLANCHARD, 1990). Esses pesquisadores definiram como

resposta de medo aqueles comportamentos evocados na presença do predador, e como respostas

de ansiedade, os comportamentos evocados na sua ausência, por sinais associados ao mesmo

(por exemplo, seu odor). Outro conceito importante é a distância defensiva, pois diferentes tipos

de comportamentos são observados em diferentes distâncias do predador. Quando o mesmo

Introdução__________________________________________________________________________________16

______________________________________________________________________________

estiver próximo surgem respostas relacionadas ao medo e se estiver distante surgem

comportamentos relacionados à ansiedade (BLANCHARD; BLANCHARD, 1987, 1988).

Diversos trabalhos têm sido conduzidos em laboratório com o objetivo de estudar o

estresse e a ansiedade. Em ratos e em outras espécies de roedores, a apresentação de estímulos

estressantes e aversivos é capaz de promover uma condição antropomorficamente relacionada ao

medo (ALBONETTI; FARABOLLINI, 1995; BRAIN et al., 1991; VAN DIJKEN et al., 1992).

Para grande parte dos vertebrados, a presença de um predador constitui uma situação aversiva

que prontamente elicia reações de medo e ansiedade (BLANCHARD; BLANCHARD, 1988;

BLANCHARD et al., 1990). Nestas situações é freqüente o desenvolvimento de uma série de

respostas autonômicas características e a manifestação de comportamentos de defesa espécie-

específica, que teriam a finalidade de preparar os animais para a fuga ou confronto, e desta

forma, possibilitar a continuidade da espécie. Por exemplo, ratos confrontados ou ameaçados

com um predador geralmente emitem vocalizações ultra-sônicas e manifestam comportamentos

defensivos tais como alerta, congelamento, fuga e ou luta. Adicionalmente, os animais

apresentam defecação, micção e uma forte ativação do sistema nervoso simpático, que promove

piloereção, midríase, taquicardia e aumento da pressão arterial e do fluxo sangüíneo para a

musculatura estriada. Observa-se ainda um aumento característico dos níveis plasmáticos de

corticosterona e de catecolaminas.

Os modelos animais de ansiedade são divididos em dois grupos principais: modelos

baseados em medos inatos ou etologicamente fundamentados e modelos baseados em

aprendizagem associativa, descritos a seguir. Os modelos etologicamente fundamentados usam

estímulos que desencadeiam respostas incondicionadas de medo em diferentes espécies animais

frente a situações e/ou estímulos naturalmente aversivos – lugares novos e/ou intensamente

Introdução__________________________________________________________________________________17

______________________________________________________________________________

iluminados, presença de co-específicos e confronto com predadores. Esses modelos oferecem

várias vantagens sobre os modelos de punição por não empregarem estímulos nocivos, como

choques elétricos, privação de água ou de alimento e por apresentarem baixo custo operacional

(LISTER, 1990; PELOW et al., 1985).

Muitos modelos animais de ansiedade envolvem processos de aprendizagem associativa

baseados no condicionamento clássico e/ou operante do medo. No âmbito do condicionamento

clássico, podemos utilizar uma série de estímulos, originalmente neutros (EC) que, pareados com

estímulos aversivos incondicionados (EI) geram, por si só, uma resposta defensiva ao final do

condicionamento. Nesse sentido uma série de estímulos pode desempenhar este papel. No

paradigma de medo condicionado, o pareamento de um estímulo sonoro com um EI de natureza

aversiva (choque nas patas) gera, durante o teste, uma resposta condicionada de medo

(congelamento) quando um dos ECs é apresentado isoladamente (LANDEIRA-FERNANDEZ,

1996). Deste modo, esse estímulo neutro passaria a desencadear a resposta de medo/ansiedade

em decorrência de antecipar para o animal a apresentação de um estímulo aversivo. Já pelo

condicionamento operante, os animais aprendem determinadas estratégias ou tarefas, a fim de

diminuir ou suprimir as conseqüências negativas associadas com a apresentação do estímulo

aversivo. Na punição, há uma diminuição do comportamento após o estímulo aversivo. Caso as

respostas sejam seguidas pela retirada do estímulo aversivo temos a fuga e, quando são seguidas

pela evitação da apresentação do estímulo aversivo, temos a esquiva (GELLER; SEIFTER,

1960; VOGEL et al., 1971).

A resposta condicionada contextual de medo é induzida pela reexposição de um animal a

um ambiente, no qual tenha previamente recebido um estímulo aversivo ou estímulo

incondicionado. Os estímulos contextuais ou polimodais, onde os choques nas patas são

Introdução__________________________________________________________________________________18

______________________________________________________________________________

liberados têm também sido utilizados como EC (FANSELOW, 1980). O ambiente adquire,

portanto, características aversivas através do pareamento repetitivo com estímulos aversivos,

como os choques nas patas. Essa resposta de medo condicionado se expressa principalmente pelo

comportamento de congelamento, caracterizado como ausência total de movimentos do corpo e

das vibrissas (AVANZI et al., 1998, 2003; FANSELOW; BOLLES, 1979; FANSELOW;

BAACKES, 1982; FANSELOW, 1984; HELMSTETTER; TERSHNER, 1994; VIANNA et al.,

2003). O tempo da resposta de congelamento é predominantemente determinado pelas

características do choque, variando em razão do aumento da intensidade e/ou da duração do

mesmo (FANSELOW, 1986), assim como pelo tipo de EC apresentado ao animal, ou seja, se o

estímulo é uma luz ou som (SAKAGUCHI; LEDOUX; REIS, 1983), ou ainda o contexto

(FANSELOW, 1980). As respostas defensivas aos diferentes ECs de medo podem representar as

diversas formas em que a ansiedade se expressa (AVANZI; SILVA; MACEDO; BRANDÃO,

2003).

Existem dois sistemas neurais que comandam a reação de defesa nos animais: o Sistema

Encefálico Aversivo (SEA) e o Sistema de Inibição Comportamental (SIC). As reações

comportamentais nesses dois sistemas são acompanhadas por componentes subjetivos e

neurovegetativos, apresentando um grande valor na luta pela sobrevivência. (GRAEFF, 1981)

propôs a existência de um SEA que estaria envolvido com a geração de comportamentos

defensivos e a elaboração de estados motivacionais e emocionais aversivos. Esse sistema é

representado por estruturas envolvidas nos processos que compreendem agressão/defesa, tais

como hipotálamo medial, amígdala, matéria cinzenta periaquedutal dorsal, colículo inferior e

camadas profundas do colículo superior (BRANDÃO et al., 1999; GRAEFF, 1990). O SEA

processa principalmente estímulos incondicionados, produzindo um aumento expressivo da

Introdução__________________________________________________________________________________19

______________________________________________________________________________

atividade dirigida para o ataque e fuga, além de ECs que produzem respostas de esquiva ou

congelamento. Enquanto o SEA compreende as estruturas relacionadas com as estratégias de

defesa observadas em situações ameaçadoras ou de perigo iminente, o SIC é ativado em

situações conflitantes. Esse sistema seria representado principalmente pelo sistema septo-

hipocampal (SSH), o qual é constituído pelo hipocampo, córtices entorrinal, subicular, cingulado

posterior e área septal, além de suas interconexões e vias monoaminérgicas ascendentes que

inervam estas estruturas prosencefálicas. (GRAY; MCNAUGHTON, 2000).

Existe um número considerável de trabalhos mostrando que a ansiedade está associada a

um conjunto de estruturas encefálicas e pode ser modulada por alterações em sua atividade

neuronal (GRAEFF, 1990; GRAY, 1982). Entretanto, a maioria das evidências neuroanatômicas

obtidas são originárias de estudos comportamentais utilizando técnicas de lesão, estimulação ou

a manipulação farmacológica de estruturas específicas. Apesar de serem de grande utilidade,

esses métodos não avaliam o funcionamento integrado de estruturas do encéfalo em situações de

ameaça, mas apenas indicam o envolvimento de áreas isoladas na mediação da ansiedade.

O desenvolvimento recente de diversas técnicas imunoistoquímicas nos permite um

melhor conhecimento dos múltiplos sistemas neuroquímicos cerebrais envolvidos na produção

de respostas defensivas. Nelas, são utilizados anticorpos capazes de reconhecer e ligar-se

especificamente a neurotransmissores ou a suas enzimas sintetizadoras, hormônios e substâncias

neuroativas. Estes anticorpos podem ser marcados e identificados de diversas maneiras e desta

forma serem utilizados para sinalizar a localização e a distribuição encefálica de seus respectivos

antígenos bem como de neurônios contendo um neurotransmissor ou outra substância específica

que se deseje estudar (HERRERA; ROBERTSON, 1996).

Introdução__________________________________________________________________________________20

______________________________________________________________________________

Recentemente foi verificado que o processo de transcrição de alguns tipos de genes, entre

os quais o c-fos (marcador funcional da atividade neuronal), pode estar aumentado em neurônios

ativados. Esses genes pertencem à categoria dos proto-oncogenes que, em condições fisiológicas,

estão envolvidos com a regulação do crescimento e a divisão celular. Porém, os oncogenes foram

descritos primeiramente como a informação genética responsável pela indução de tumores por

vírus contendo RNA, da classe dos retrovírus. Assim, os oncogenes podem ser também

considerados como genes cuja expressão pode resultar em uma alteração celular patológica

(MORGAN; CURRAN, 1991).

Os genes celulares normais, dos quais os oncogenes retrovirais foram derivados, são mais

corretamente referidos como “proto-oncogenes”, significando que eles representam os

precursores dos oncogenes (KOVÁSCS, 1998). Os proto-oncogenes são também conhecidos

como genes de ação precoce ou imediata e caracterizados pela transcrição induzida de maneira

rápida e transitória em resposta a estímulos que promovem ativação neural (MORGAN;

CURRAN, 1991, 1995).

Em nosso estudo, utilizamos a técnica imunoistoquímica para avaliar a expressão de Fos

em estruturas encefálicas, envolvidas com a geração de estados emocionais após a reexposição

de ratos a diferentes tipos de estímulos condicionados como contexto ou som associados ao

choque nas patas (EI).

Objetivos/Materiais e Métodos__________________________________________________________________21

_____________________________________________________________________________

Objetivos

- Analisar comparativamente as respostas de congelamento, induzidas pela apresentação de

diferentes estímulos condicionados (contexto e som) em testes de aprendizagem associativa.

- Analisar a distribuição da proteína Fos em estruturas encefálicas durante a resposta de

congelamento, induzido pelo contexto e som.

Materiais e Métodos

Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando entre 230-280g, provenientes do biotério

central da Universidade de São Paulo, campus de Ribeirão Preto. Os animais foram alojados em

grupos de seis animais em gaiolas de polipropileno (30 x 32 x 18 cm), forradas com serragem,

com livre acesso a água e alimento durante todo o experimento. Os animais permaneceram em

um biotério com temperatura controlada (22 ± 2°C) e ciclo claro-escuro de 12 h, sendo o início

do período claro às 07:00h. Estes animais foram transportados individualmente para a sala

experimental em uma caixa de polipropileno forrada com serragem, medindo 28 x 17 x 13 cm.

Objetivos/Materiais e Métodos ______________________________________________________________22

______________________________________________________________________________

Equipamentos

Caixa de condicionamento:

Nos experimentos de condicionamento foram utilizadas duas caixas distintas: mesmo

contexto (caixa A) e contexto diferente (caixa B). A caixa A medindo 30 x 20 x 25 cm, possui as

duas paredes laterais e de fundo em acrílico opaco e a frente e o teto em acrílico transparente. O

assoalho da caixa é constituído por barras de metal de 5 mm de diâmetro, distando 1,2 cm entre

si, permitindo a administração de choques elétricos por meio de um gerador de choque com

misturador de voltagem (Albarsh, Brasil). A caixa B, diferente e maior, medindo 60 x 25 x 25

cm, com as paredes de acrílico pintadas de preto, frente e teto em acrílico transparente e o piso

de grades, de 5 mm de diâmetro, distando 1,5 cm entre si. A apresentação dos choques e

estímulos foi controlada por meio de um microprocessador (Insight Equipamentos, Brasil). Os

estímulos condicionados utilizados consistiram de um estímulo sonoro (som de 85 dB, 1000 Hz,

GW, Model GAG-808-G, USA), ou ainda estímulo contextual (caixa A), onde os animais foram

condicionados. Os animais dos grupos controles foram condicionados no mesmo contexto (caixa

A), com uma intensidade de choque de 0,3 mA e contexto diferente (caixa B) com uma

intensidade de choque de 0,6 mA. 24 horas após o condicionamento, todos os animais foram

testados na caixa A, onde permanecem por 10 min cada, sem apresentação de choque. Terminada

a sessão de cada animal, duas horas após a sessão teste, os animais foram perfundidos e seus

encéfalos retirados para ensaio imunoistoquímico.


______________________________________________________________________________

Procedimento Experimental

Sessão de condicionamento:

Os animais foram submetidos a um período de 5 min de habituação e, posteriormente, a

uma sessão de condicionamento que consiste de 10 pareamentos entre choques nas patas com

som e choque nas patas com ausência de som. A ausência do som caracteriza o grupo contexto,

que é pareado com duas intensidades de choques, 0,3 mA (condicionamento moderado) e 0,6

mA (condicionamento forte). O EI (choque) foi apresentado durante o último segundo dos 10

segundos do som (EC), com intervalo variável entre 30 e 120 segundos, totalizando 10 minutos

de teste. Os animais dos grupos controles foram condicionados na (caixa A) com intensidade de

choque igual a 0,3 mA e condicionados na (caixa B) com intensidade de choque igual a 0,6 mA,

segundo delineamento experimental.

Sessão teste:

No dia seguinte à sessão de condicionamento todos os animais foram submetidos à

sessão teste na (caixa A) durante 10 minutos. Nesta sessão, foi avaliada a resposta de

congelamento ao estímulo condicionado (som ou contexto) e os animais não receberam choque

nas patas.

O congelamento, como dito anteriormente, é caracterizado, como ausência total de

movimentos do corpo e das vibrissas. Os animais foram transportados em caixas de

polipropileno forradas com serragem para suas caixas de origem no biotério e duas horas após o

término do teste, foi realizado o ensaio de imunoistoquímica, para verificação da expressão da


______________________________________________________________________________

proteína Fos. Após esse tempo, os animais foram sacrificados e os encéfalos processados

de acordo com a rotina do laboratório para os ensaios de imunoistoquímica, como descrito a

seguir.

O

____________________________________________________________________________________________________________

bjetivos/Materiais e Métodos _____________________________________________________________________________________________________25

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Expressão da proteína Fos no encéfalo de ratos induzida por diversos tipos de condicionamento aversivo

GRUPOS

CONDIÇÃO

HABITUAÇÃO

CONDICIONAMENTO

10 pareamentos c/ intervalos de 30s – 120s

TESTE (10 min)

Imunoistoquímica

1 Contexto 5’ Contexto A x choque (1 seg, 0,3 mA) Contexto A Fos 2 Contexto 5’ Contexto B x choque (1 seg, 0,6 mA) Contexto A Fos

Fos 3 Contexto 5’ Contexto A x choque (1 seg, 0,6 mA) Contexto A (controle) Fos 4 Som 5’ Som (10 seg) x choque B (1 seg, 0,6 mA)

24 H

OR

AS

APÓ

S

Som A

EI (1 seg)

EC (10 seg)

0 10

Perfusão

2 H

OR

AS

APÓ

S

Congelamento (seg)

- EC: Estímulo condicionado: (Contexto A ou B e Som) - EI: Estímulo Incondicionado: (Choque nas patas) - Contexto A: Mesmo contexto - Contexto B: Contexto diferente - OBS: Pareamentos entre EC e EI foram realizados conforme esquema ao lado

Objetivos/Materiais e Métodos __________________________________________________________________26

_____________________________________________________________________________

Histologia

Duas horas após o teste, intervalo necessário para a síntese e acúmulo da proteína Fos no

sistema nervoso central (MORGAN; CURRAN, 1991), os animais foram anestesiados com

uretana a 25% (5 ml/ kg, i.p., Sigma, USA) e submetidos à perfusão intracardíaca com solução

de salina em tampão fosfato (PBS 0,1M; pH: 7,3) seguido de paraformaldeído (PFA) 4% em

(PBS 0,2 M; pH 7,4) para fixação do tecido encefálico. Os encéfalos foram removidos da caixa

craniana e imersos em PFA 4 % por duas horas, em seguida foram transferidos para solução

crioprotetora de sacarose a 30 % em PBS 0,1 M e a 4°C, por aproximadamente 48 horas. Após

este período, os encéfalos foram imersos em isopentana e congelados em gelo seco, a

temperatura de aproximadamente -40°C, durante 30 segundos. Uma vez congelados, os

encéfalos foram cortados em secções coronais com o uso de um criostato (-19 °C). Para cada

região foram coletados 3 cortes histológicos coronais, seriados, com espessura de 40 µm. Um

corte foi coletado em cubeta com PBS 0,1M, para o ensaio de imunoistoquímica, o segundo

corte foi colocado em lâmina previamente gelatinizada e posteriormente corada com NISSL,

sendo útil para localização e comparação neuroanatômica, e o terceiro corte foi colocado em

ependorf com solução anti-congelante, armazenado no freezer -20ºC para uma eventual

necessidade. Os cortes tiveram como referência as seguintes coordenadas no sentido antero-

posterior: Bregma 3.2, 1.7, -1.4, -1.8, -2.8, -4.16, -7.8, -8.0, -8.72 e -9.68 mm, segundo Atlas

(PAXINOS; WATSON, 1997).


_____________________________________________________________________________

Imunoistoquímica para detecção da proteína Fos

Duas horas após a sessão teste, os animais foram anestesiados com uretana (1,25 g/kg, ip;

Sigma, USA) e perfundidos transcardiacamente com 0,1M de PBS+ seguido por

paraformaldeído a 4% em 0,1M PBS (pH 7,4). Os encéfalos foram removidos, imersos (4°C)

durante 2 horas e transferidos para uma solução de sacarose a 30% em 0,1M PBS para

crioproteção. Foram congelados com isopentana e gelo seco a uma temperatura de (-40°C) e

transferidos para o criostato onde permaneceram a (-16°C). Três séries adjacentes de cortes

foram obtidas de 40μm tendo como referência (PAXINOS; WATSON, 1997). Com uma série

foi feito o NISSL, usado para comparações neuroanatômicas, outra série foi mantida como

reserva em uma solução crioprotetora a -20°C e a última série de cortes foi submetida a

sucessivas lavagens e incubações para revelação da proteína Fos, conforme o seguinte protocolo:

uma lavagem com PBS 0,1 M (5 min); incubação com 1% H2O2 em PBS 0,1 M durante 10 min

(para redução da atividade da peroxidase endógena); quatro lavagens com PBS 0,1 M (5 min

cada); incubação com o anticorpo primário (1:2000, anticorpo policlonal anti-Fos, produzido em

coelho, Santa Cruz, USA, SC-52) em PBS+ acrescido de soro albumina bovina (BSA, 1mg/ml,

Sigma) e do detergente triton - X (2µl/ml; Sigma) durante 12 horas. As secções foram lavadas

três vezes (5 minutos cada) e incubadas com anticorpo secundário (1:400, anticorpo secundário

biotinilado, kit ABC Elite, Vectastain) em PBS+ durante 1 hora. O tecido foi novamente lavado

por três vezes (5 min cada) em PBS 0,1 M e incubados por 1 hora com a solução de avidina-

biotina peroxidase (1:1500 reagentes A e B, kit ABC Elite, Vectastain), para formação dos

complexos entre a avidina e a peroxidase biotinilada, e novamente três lavagens em PBS a 0,1 M

(5 min cada); 10 min de incubação com solução de tetracloreto de 3,3’- di-amino-benzidina


_____________________________________________________________________________

(DAB, SIGMA), contendo 0,02% H2O2 em PBS 0,1M para revelação da atividade da peroxidase.

A di-amino-benzidina é um cromógeno que na presença de H2O2, propicia a formação de um

precipitado de cor marrom que pode ser visualizado no interior dos núcleos neuronais contendo

proteína Fos. Finalmente, os cortes foram submetidos a três lavagens consecutivas com PBS 0,1

M.

Os cortes foram montados em lâminas previamente gelatinizadas e após a secagem das

lâminas, foram desidratados através de imersão em gradiente alcoólico e xilol e cobertos com

Permount e lamínulas.

Análise quantitativa da expressão da proteína Fos

A imunorreatividade à proteína Fos (Fos-IR) foi visualizada como um produto marrom

depositado no interior dos núcleos neuronais. A contagem de células Fos-positivas foi realizada

com o auxílio de um microscópio (Olympus BX-50) acoplado a uma videocâmara (Hamatsu

Photonics C2400) a qual envia a um microcomputador uma imagem digitalizada da estrutura

selecionada. A mesma é processada por um programa de análise de imagem (Image Pro-Plus 5.0,

Media Cybernetics, USA). A contagem de células Fos-positivas foi realizada em uma área pré-

delimitada pelo experimentador, previamente definida entre 10 e 80µm2 com uma magnificação

x 100. O número total de objetos que correspondia aos sinais positivos da Fos-IR foi dividido

pela área, obtendo-se a densidade das células que apresentaram imunorreatividade Fos positiva.

Os núcleos foram contados individualmente e expressos como número de células Fos-positivas

por 0,1 mm2 (BORELLI et al., 2005; FERREIRA-NETTO,; BORELLI.; BRANDÃO, 2005;

LAMPREA et al., 2002). A nomenclatura utilizada foi baseada no Atlas de (PAXINOS;

WATSON, 1997).


Figura 1: Esquema representativo da revelação imunoistoquímica da proteína Fos. DAB: 3,3’- di-amino-benzidina Fonte: (SILVEIRA, et al., 1996)._____________________________________________________________________________


_____________________________________________________________________________

Análise Estatística

Os dados estão apresentados como média + EPM. Os resultados comportamentais foram

analisados por meio da ANOVA de uma via.

Para análise estatística da imunorreatividade à proteína Fos, foi utilizado também a

ANOVA de uma via. Em caso de significância estatística, foi aplicado o teste post-hoc de

Newman-Keuls, para a identificação de diferenças estatísticas entre os grupos. Para ambos os

testes, um valor p igual ou inferior a 0,05 foi considerado significativo.

______________________________________________________________RESULTADOS

Resultados__________________________________________________________________________________32

_____________________________________________________________________________

Resposta de congelamento

A figura 1 ilustra a média do tempo de congelamento dos quatro grupos de animais deste

estudo na sessão teste. A ANOVA de uma via indicou uma diferença estatística no tempo de

congelamento entre os grupos (F =21,48; p ≤ 0,05). A análise post hoc de Newman-Keuls

indicou que a exposição dos animais ao MC-0,6 mA e SOM-0,6 mA, provocou um aumento

significativo no tempo de congelamento quando comparado aos grupos controles MC-0,3 mA e

CD-0,6 mA (figura 1).

3, 28

Imunorreatividade à proteína Fos

Nos animais dos grupos controles, células expressando imunorreatividade à proteína Fos

foram encontradas esparsamente distribuídas, sem formar aglomerados celulares em ambos os

hemisférios cerebrais, enquanto que nos grupos submetidos ao condicionamento, estas células

apresentaram imunorreatividade Fos em várias estruturas analisadas no experimento, variando

entre moderada a alta densidade de núcleos neuronais.

A análise quantitativa da imunorreatividade Fos realizada nas estruturas telencefálicas

mostrou que houve um aumento significativo no número de neurônios Fos-IR nos núcleos

central e basolateral da amígdala dos grupos MC-0,6 mA e Som-0,6 mA, enquanto que o núcleo

pré-limbico mostrou uma significativa expressão Fos no grupo Som-0,6 mA quando comparados

aos controles MC-0,3 mA e CD-0,6 mA (tabela 1, figuras 2 e 5).

Resultados __________________________________________________________________________________33

_____________________________________________________________________________

A imunorreatividade Fos foi também realizada e quantificada na região diencefálica,

mostrando um aumento significativo de neurônios Fos-IR nas regiões PVA dos grupos MC-0,6

mA e Som-0,6 mA, PaAP do grupo Som-0,6 mA e AHA dos grupos MC-0,6 mA e Som, quando

comparados aos controles MC-0,3 mA e CD-0,6 mA (tabela 1, figuras 3 e 6).

A análise realizada na região mesencefálica evidenciou um aumento significativo no

número de neurônios Fos-IR nas estruturas: DMPAG, DLPAG e LPAG do grupo Som-0,6 mA,

VLPAG e CnF dos grupos MC-0,6 mA e Som-0,6 mA, MRN do grupo MC-0,6 mA e IC do

grupo Som-0,6 mA, quando comparados aos controles MC-0,3 mA e CD-0,6 mA (tabela 1,

figuras 4 e 7).

Resultados __________________________________________________________________________________34

_____________________________________________________________________________

Estruturas MC x choque 0,3mA

CD x choque 0,6mA

MC x choque 0, 6mA

SOM x choque 0, 6mA

Estatística

MÉDIA±EPM MÉDIA±EPM MÉDIA±EPM MÉDIA±EPM F P

PrL 10,18±2,50 9,16±2,57 10,27±2,75 18,29±2,58 * F3,28=2,64 0,06

IL 6,76±2,01 7,06±2,02 9,16±2,69 14,42±2,34 F3,28=2,40 0,08

Cg1 13,43±1,77 15,02±3,08 14,66±3,06 21,52±2,98 F3,28=1,71 0,18

Cg2 9,83±2,56 11,29±3,45 9,64±1,97 15,41±2,57 F3,28=0,99 0,41

Ent 9,33±1,79 10,10±0,74 11,02±2,49 8,78±0,29 F3,28=0,37 0,77

CeA 2,98±0,33 3,28±0,52 7,05±0,58 * 6,63±1,38 * F3,28=7,02 0,001

MeA 7,09±0,91 8,45±1,33 6,48±1,30 10,07±0,68 F3,28=2,12 0,11

BLA 4,21±1,06 5,08±0,95 7,42±0,60 * 6,99±0,92 * F3,28=2,87 0,05

CA1 1,02±0,12 1,75±0,42 1,04±0,18 1,04±0,21 F3,28=1,86 0,16

CA2 1,45±0,27 2,42±0,38 2,04±0,37 1,83±0,31 F3,28=1,41 0,25

CA3 1,66±0,35 2,27±0,63 2,11±0,42 1,74±0,31 F3,28=0,43 0,72

PVA 18,51±1,27 22,50±3,56 34,67±3,34 * 31,83±4,44 * F3,28=6,51 0,005

PaAP 10,84±1,22 20,13±4,45 18,96±3,53 29,06±1,28 * F3,28=6,26 0,002

AHA 8,78±1,16 11,77±1,77 13,56±1,36 * 14,08±0,76 * F3,28=3,29 0,03

LH 9,04±0,82 8,71±1,58 8,41±1,25 10,49±1,09 F3,28=0,57 0,63

DMH 12,18±2,15 13,33±2,85 14,17±2,08 20,63±2,60 F3,28=2,40 0,08

VMHDM 20,40±2,67 17,62±2,96 17,51±2,77 18,76±3,20 F3,28=0,21 0,88

PMD 15,12±2,29 14,62±3,50 19,26±3,74 20,26±3,18 F3,28=0,78 0,51

DMPAG 7,95±1,61 10,28±2,63 12,75±2,06 17,78±2,05 * F3,28=3,93 0,01

DLPAG 7,63±1,08 9,12±2,73 12,73±1,53 15,91±1,75 * F3,28=3,92 0,01

LPAG 6,86±1,50 7,66±2,12 10,15±1,20 13,69±1,51 * F3,28=3,58 0,02

VLPAG 7,53±1,01 8,05±1,75 14,08±0,97 * 14,87±1,70 * F3,28=7,59 0,0007

MRN 3,52±0,62 5,56±0,78 6,70±0,86 * 5,82±0,98 F3,28=2,66 0,06

SC 6,62±0,90 10,04±2,23 9,09±1,57 11,96±0,69 F3,28=2,56 0,1

IC 11,59±1,04 12,06±2,52 12,16±2,03 23,49±2,21 * F3,28=8,13 0,0004

CnF 5,00±0,88 5,91±1,43 10,61±2,77 * 13,57±1,24 * F3,28=5,40 0,004

LC 8,08±1,69 9,12±1,89 12,74±1,66 12,93±1,36 F3,28=2,22 0,1

Tabela 1. Dados obtidos de ratos submetidos ao medo condicionado contextual e ao som. Número de células Fos-IR (média + EPM) em áreas encefálicas de 0,1mm N=8 animais por grupo. * indica diferenças significativas dos grupos, MC-0,6 mA e SOM-0,6 mA em relação aos grupos controles MC-0,3 mA e CD-0,6 mA. O teste post hoc de Newman – Keuls foi utilizado para detectar diferenças entre os grupos. P ≤ 0,05.

2.

Resultados __________________________________________________________________________________35

**

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

MC-0,3 CD-0,6 MC-0,6 SOM-0,6

Con

gela

men

to (s

)

Figura 1. Média do tempo de congelamento em segundos (+ EPM) no condicionamento contextual (MC-0,6 mA) e som (SOM-0,6 mA). * indica diferenças estatísticas no tempo de congelamento em relação aos controles (MC-0,3 mA) e (CD-0,6 mA). p ≤ 0,05 foi utilizado o teste post hoc de Newman – Keuls.

_____________________________________________________________________________

Resultados __________________________________________________________________________________36

_____________________________________________________________________________

Figura 2. Fotomicrografias de cortes coronais dos núcleos do córtex pré-limbico (PrL) e núcleo

central da amígdala (CeA), de ratos mostrando a distribuição da imunorreatividade Fos após o

teste nos diferentes grupos CD - 0,6 mA, MC - 0,6 mA e Som - 0,6 mA. Barra = 200μm.

Figura 3. Fotomicrografias de cortes coronais dos núcleos do tálamo paraventricular (PVA) e da

área hipotalâmica anterior, parte central (AHA) de ratos mostrando a distribuição da

imunorreatividade Fos após o teste nos diferentes grupos CD - 0,6 mA, MC - 0,6 mA e Som - 0,6

mA. Barra = 200μm.

Figura 4. Fotomicrografias de cortes coronais dos núcleos da substância cinzenta periaquedutal,

parte dorsomedial (DMPAG), substância cinzenta periaquedutal, parte ventrolateral (VLPAG) e

colículo inferior (IC) de ratos mostrando a distribuição da imunorreatividade Fos após o teste nos

diferentes grupos CD - 0,6 mA, MC - 0,6 mA, e Som - 0,6 mA. Barra = 200μm.

As figuras 2, 3 e 4 são apresentadas seqüencialmente nas páginas seguintes. Como em nenhuma

estrutura o número de células com imunorreatividade Fos entre os grupos: mesmo contexto 0,3

mA e contexto diferente 0,6 mA se mostrou estatisticamente diferente, optamos por apresentar

nas figuras somente este último grupo CD-0,6 mA.

Resultados _____________________________________________________________________________________________________________________37

Resultados _____________________________________________________________________________________________________________________38

ltados _____________________________________________________________________________________________________________________39 Resu

Resultados __________________________________________________________________________________40

* *

*

* *

0

5

10

15

20

25

30

35

40

PrL IL Cg 1 Cg 2 Ent CeA MeA BLA CA1 CA2 CA3

Méd

ia d

o nú

mer

o de

neu

rôni

os F

os -

Posi

tivos

/ 0,

1mm

2 MC-0,3

CD-0,6

MC-0,6

SOM-0,6

_____________________________________________________________________________

Figura 5 Número de neurônios Fos-IR em estruturas telencefálicas (0,1mm2 ) de ratos nas sessões teste, (MC-0,3 mA; CD-0,6 mA; MC-0,6 mA e Som-0,6mA). As colunas representam as médias e as barras o EPM. * indica diferenças estatísticas em relação aos grupos controles MC-0,3 mA e CD-0,6 mA. PrL: Córtex pré-limbico, IL: Córtex infra-límbico, Cg: Córtex cingulado 1 e 2, Ent: Córtex entorrinal, CeA: Núcleo central da amígdala, MeA: Núcleo medial da amígdala, BLA: Núcleo basolateral da amígdala, HP: Hipocampo, áreas CA1, CA2 e CA3. P ≤ 0,05 foi utilizado o teste post hoc de Newman Keuls.

Resultados __________________________________________________________________________________41

*

*

*

*

*

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

PVA PaAP AHA LH DMH VMH PMD

Méd

ia d

o nú

mer

o de

neu

rôni

os F

os -

Posi

tivos

/ 0,

1mm

2

MC-0,3

CD-0,6

MC-0,6

SOM-0,6

Figura 6 Número de neurônios Fos – IR em estruturas diencefálicas (0,1mm2) de ratos nas condições de teste, (MC-0,3 mA; CD-0,6 mA; MC-0,6 mA e Som-0,6mA). As colunas representam as médias e as barras o EPM. * indica diferenças estatísticas em relação aos grupos controles MC-0,3 mA e CD-0,6 mA. PVA: Tálamo paraventricular, PaAP: Hipotálamo paraventricular, AHA: Área hipotalâmica anterior, parte central, LH: Hipotálamo lateral, DMH: Hipotálamo dorsomedial, VMH: Hipotálamo ventromedial, parte dorsomedial, PMD: Núcleo pré-mamilar, parte dorsal. P ≤ 0,05 foi utilizado o teste post hoc de Newman Keuls.

_____________________________________________________________________________

Resultados __________________________________________________________________________________42

*

*

* *

*

****

0

5

10

15

20

25

30

35

40

DMPAG DLPAG LPAG VLPAG MRN SC IC CnF LC

Méd

ia d

o nú

mer

o de

neu

rôni

os F

os -

Posi

tivos

/ 0,

1mm

2

MC-0,3 CD-0,6 MC-0,6 SOM-0,6

Figura 7 Número de neurônios Fos – IR em estruturas mesencefálicas (0,1mm2) de ratos nas condições de teste, (MC-0,3 mA; CD-0,6 mA; MC-0,6 mA e Som-0,6mA). As colunas representam as médias e as barras o EPM. * indica diferenças estatísticas em relação aos grupos controles MC-0,3 mA e CD-0,6 mA. DMPAG: Substância cinzenta periaquedutal, parte dorsomedial, DLPAG: Substância cinzenta periaquedutal, parte dorsolateral, LPAG: Substância cinzenta periaquedutal, parte lateral, VLPAG: Substância cinzenta periaquedutal, parte ventrolateral, MnR: Núcleo mediano da rafe, SC: Colículo superior, IC: Colículo inferior, CnF: Núcleo cuneiforme, LC: Locus Coeruleus. P ≤ 0,05 foi utilizado o teste post hoc de Newman Keuls.

_____________________________________________________________________________

________________________________________________________DISCUSSÃO GERAL

Discussão Geral______________________________________________________________________________44

_____________________________________________________________________________

A reação de defesa é o resultado de alterações do padrão comportamental e

cardiovascular frente a estímulos ameaçadores ou estressantes (BANDLER; CARRIVE, 1988).

Quando um animal é confrontado com uma ameaça à sua integridade física ou à própria

sobrevivência, seja esta representada por um predador ou um agressor da mesma espécie, seja por

uma simples mudança no ambiente, ele apresenta um conjunto de respostas comportamentais e

neurovegetativas que caracterizam a reação de medo. Esse conjunto de respostas, características

da espécie, foi chamado de reações espécies-específicas (BOLLES, 1970).

A aprendizagem desempenha um papel importante quando um estímulo ativa o sistema

de medo. Estímulos neutros como som ou luz, que isoladamente não eliciam resposta de medo,

podem produzi-las através do condicionamento Pavloviano, onde o estímulo condicionado é

capaz de produzir alguma resposta condicionada de medo. Isto ocorre quando um estímulo neutro

é indicador de um estímulo naturalmente aversivo, como um choque elétrico.

Em ratos e camundongos a reação de defesa mais comum é o congelamento. O

congelamento é uma maneira efetiva de evitar um provável perigo, quando a fuga e a esquiva são

impossíveis; é uma das respostas proeminentes quando os animais são recolocados no contexto

onde receberam choques nas patas, sendo usualmente utilizado como medida do medo

condicionado, e é caracterizado, como ausência total de movimentos do corpo e das vibrissas

(BOLLES; COLLIER, 1976).

O tempo de congelamento varia com a intensidade e o número de choques, sugerindo que

esse comportamento pode ser indicativo de medo (FANSELOW; BOLLES, 1979). Neste

trabalho, a análise comportamental dos animais submetidos ao condicionamento aversivo

evidencia um aumento significativo no tempo de congelamento nos grupos MC-0,6 mA e Som-

0,6 mA em relação aos grupos controles MC-0,3 mA e MC-0,6 mA, indicando que a reexposição

Discussão Geral______________________________________________________________________________45

_____________________________________________________________________________

ao contexto ou ao som previamente pareados a choques nas patas, resultou em maior tempo de

congelamento. Estes resultados confirmam que a medida de congelamento é um método bastante

conveniente e sensível para o estudo do medo condicionado (BOUTON; BOLLES, 1980;

FANSELOW; BAACKES, 1982).

Um número considerável de trabalhos mostra que a ansiedade está associada a regiões

encefálicas específicas e pode ser modulada por alterações na atividade neuronal nestas estruturas

(GRAEFF, 1990; KUHAR, 1986; PRATT, 1992). Alguns autores têm proposto que diferentes

respostas de defesa seriam organizadas por diferentes estruturas encefálicas, de acordo com as

características do ambiente e com a intensidade de perigo ou ameaça, associadas à situação

(BLANCHARD; BLANCHARD, 1988; FANSELOW, 1991; GRAEFF, 1993, 1994).

Conhecendo-se todo o repertório de defesa de uma dada espécie, pode-se explorar o

substrato neural subjacente a cada nível de defesa pelos métodos clássicos da neurofisiologia –

ablação, estimulação elétrica e química ou pelos modernos métodos de análise de imagens

funcionais do encéfalo. Essas últimas podem compreender tanto métodos moleculares (por

exemplo, imunorreatividade da proteína Fos), que exigem o sacrifício dos animais de estudo,

quanto técnicas que permitem visualizar a atividade encefálica do organismo intacto, como a

tomografia e a ressonância magnética nuclear funcional (GRAEFF ; GUIMARÃES, 1999).

A análise imunoistoquímica da expressão da proteína Fos no tecido nervoso pode

representar uma ferramenta útil na caracterização do mapeamento metabólico neuronal

(BULLITT, 1990; SAGAR; SHARP; CURRAN, 1988). Nos experimentos conduzidos neste

estudo, esta técnica foi empregada com o objetivo de mapear as estruturas ativadas no encéfalo de

ratos pela apresentação de diferentes estímulos aversivos.

Discussão Geral______________________________________________________________________________46

_____________________________________________________________________________

Foram analisadas neste estudo, áreas encefálicas marcadas pela indução de proteína Fos

durante a resposta de congelamento induzido pelo contexto aversivo (CS) e pelo som previamente

pareados a um choque elétrico nas patas. Quanto às áreas telencefálicas, foi constatado um

aumento na densidade de núcleos neuronais Fos – IR no córtex pré-limbico (PrL) no grupo

condicionado ao som e nos núcleos central (CeA) e basolateral da amígdala (BLA) nos dois tipos

de condicionamento. Nas estruturas diencefálicas, houve uma significativa marcação de Fos no

tálamo paraventricular (PVA), no hipotálamo paraventricular (PaAP) e na área hipotalâmica

anterior, parte central (AHA), no condicionamento contextual e condicionamento ao som. No

mesencéfalo, encontramos marcação de Fos no teto mesencefálico parte dorsal, lateral e colículo

inferior (IC) no condicionamento ao som, VLPAG e CnF no grupo contextual e ao som, e MRN

no grupo MC-0,6 mA.

Do ponto de vista anatômico, vários experimentos têm demonstrado que o sistema

cerebral aversivo SCA possui um padrão altamente complexo de interconexões com outras

estruturas encefálicas que também participam da organização neural do comportamento

emocional. Assim, o SCA estabelece contato anátomo-funcional com o sistema septo-

hipocampal, o tálamo intralaminar e o córtex pré-frontal (GRAY, 1982).

O córtex pré-frontal está classicamente relacionado à memória, planejamento ou execução

de ações, organizando temporalmente o comportamento, formando, com suas conexões, memória

de seqüências comportamentais e planos ou esquemas de ação (FUSTER, 1989, 2001). O

aumento de neurônios Fos positivos em sub-regiões do córtex pré-frontal medial como córtex

pré-limbico e a ausência da participação do giro do cíngulo e córtex motor M1, revelam que estas

estruturas estão particularmente envolvidas no processo de aquisição do medo condicionado. O

córtex pré-limbico estabelece conexões diretas e indiretas com estruturas límbicas como a

Discussão Geral______________________________________________________________________________47

_____________________________________________________________________________

amígdala, estrutura olfatórias, núcleo accumbens, hipotálamo e hipocampo. A expressiva

marcação Fos no PRL já era esperada devido a evidências anteriores que apontam sua

participação na organização neural do medo induzido por estímulos sonoros (ELSWORTH, et al.,

1999; MARIEKE; MATTHEW, 2005).

As estruturas que foram marcadas neste estudo, como o tálamo paraventricular, parecem

também participar do processamento de informações associados ao medo condicionado

(BHATNAGAR et al., 2003), enquanto que o hipotálamo está diretamente envolvido nos

mecanismos neurais que controlam as funções hipofisiárias, comandando assim os aspectos

endócrinos que acompanham o comportamento emocional (PANKSEPP, 1990).

Estes resultados sugerem haver um maior envolvimento de estruturas hipotalâmicas na

reação de defesa em vista da função modulatória proposta para estas estruturas (ADAMEC, 1990;

DAVIS, 1992; GRAEFF, 1990, 1994; SHAIKH; SIEGEL, 1994). Uma das regiões hipotalâmicas

que recebe influências modulatórias provenientes direta ou indiretamente da amígdala é o núcleo

paraventricular do hipotálamo (KRETTEK; PRICE, 1978; SAWCHENKO; SWANSON, 1983),

estrutura relacionada à organização das alterações neuroendócrinas que são induzidas por

estímulos estressantes ou ameaçadores. Este núcleo é integrante do eixo hipotálamo-hipófise-

adrenal e controla a secreção de ocitocina, de vasopressina e de CRF (Fator Liberador de

Corticotropina). O CRF promove a secreção de corticotrofina pela glândula pituitária, que por sua

vez estimula a liberação de corticosterona, na corrente sangüínea, pelo córtex adrenal. Este

mecanismo, conhecido como resposta hormonal ao estresse, pode estar exarcebado em alguns

distúrbios emocionais como a depressão, a ansiedade e o pânico (GERACIOTTI et al., 1990;

HARBUZ; LIGHTMAN, 1992). Por outro lado, lesões de certos núcleos da amígdala parecem

Discussão Geral______________________________________________________________________________48

_____________________________________________________________________________

diminuir a ativação do eixo hipotálamo-hipofisiário que é causada pela apresentação de estímulos

estressantes (FELDMAN et al., 1994).

Foi proposto que esta ampla distribuição do CRF no encéfalo pode fornecer o substrato

anatômico necessário para a coordenação das respostas adaptativas metabólicas, comportamentais

e circulatórias a situações estressantes (CHROUSOS; GOLD, 1992; MC EWEN, 1995).

Efetivamente, os resultados obtidos neste estudo indicam que o núcleo paraventricular do

hipotálamo é uma estrutura consistentemente ativada por diferentes tipos de estímulos

estressantes (ARNOLD et al., 1992; CECCATELLI et al., 1989; CHASTRETTE; PFAFF;

GIBBS, 1991; DUNCAN; JOHNSON; BREESE, 1993; IMAKI et al., 1992; PEZZONE et al.,

1992; SHARP et al., 1991; UMEMOTO et al., 1994).

O hipocampo é outra região implicada no processamento de estímulos aversivos e na

fisiopatologia da depressão e da ansiedade que forneceria informações para circuitos emocionais

(DEAKIN; GRAEFF, 1991; DEAKIN; GRAEFF; GUIMARÃES, 1992; GRAY, 1982; GRAEFF

et al., 1996). Esta estrutura também parece estar envolvida na execução de tarefas de orientação

espacial e na organização de respostas frente a alterações do ambiente externo e a situações

novas. Curiosamente, o hipocampo foi pouco marcado nos experimentos do presente estudo.

Desta forma, a ativação do hipocampo, neste não pode ser descartada, em vista de novos estudos

utilizando outras abordagens.

O hipotálamo medial é uma região que recebe grande número de projeções provenientes

da amígdala, assim como a substância cinzenta periaquedutal dorsal. Ambas as regiões

apresentaram-se fortemente ativadas pela apresentação de estímulos condicionados e

incondicionados (PEZZONE et al., 1993). Esses resultados reforçam a idéia da existência de

Discussão Geral______________________________________________________________________________49

_____________________________________________________________________________

conexões excitatórias recíprocas, interligando estas estruturas relacionadas a processos aversivos

(BEART et al., 1988; BEITZ, 1989).

Vários estudos sobre a neurobiologia do medo e da ansiedade utilizando a estimulação

elétrica de estruturas do SNC em diversas espécies de animais, inclusive o homem, demonstraram

que a amígdala (AM), o hipotálamo medial (HM) e a substância cinzenta periaquedutal dorsal

(DLPAG), constituem o principal substrato neural responsável pela elaboração das respostas

comportamentais, afetivas e autonômicas decorrentes da apresentação de estímulos aversivos ou

situações de perigo (FERNANDEZ DE MOLINA; HUNSPERGER, 1959; NASHOLD;

WILSON; SLAUGHTER, 1969). A substância cinzenta periaquedutal, portanto, é uma estrutura

crucial na coordenação e elaboração das estratégias apropriadas a serem desenvolvidas pelos

animais em resposta a diferentes estímulos ameaçadores. Assim, as colunas dorsomedial,

dorsolateral e lateral da substância cinzenta periaquedutal estariam relacionadas à elaboração das

respostas de defesa adequadas como alerta, congelamento luta e/ou fuga.

Recentemente, foi constatado que além de seu papel fundamental na organização do medo

incondicionado a parte dorsal da substância cinzenta periaquedutal particularmente a sua coluna

dorsomedial, está envolvida embora em menor escala, na aquisição de informações condicionadas

de medo (MARTINEZ et al., 2006; MC. NAUGHTON, 2004). Neste trabalho obtivemos

evidências neste sentido com significativa marcação imunoistoquímica da coluna dorsomedial do

teto mesencefálico. As colunas dorsolateral e lateral também apresentaram uma maior densidade

de células Fos, mas em extensão menor que a dorsomedial.

A coluna ventrolateral do teto mesencefálico apresentou uma expressiva marcação de

células Fos em associação com o condicionamento contextual e ao som. Estes últimos achados

Discussão Geral______________________________________________________________________________50

_____________________________________________________________________________

confirmam resultados de trabalhos anteriores implicando a VLPAG no medo condicionado

(CARRIVE, 2000; LE DOUX et al., 1987). A coluna ventrolateral do teto mesencefálico seria,

portanto, recrutada tanto em situações ameaçadoras que não ofereçam possibilidade de fuga como

após encontros estressantes ou dolorosos. Na primeira circunstância, esta região teria a função de

promover o congelamento, com o objetivo de minimizar as chances de o animal ser detectado

pelo predador. Já na fase pós-encontro, a substância cinzenta periaquedutal ventrolateral

promoveria quiescência e hiporreatividade, com o objetivo de propiciar a recuperação do

organismo e de diminuir o impacto de encontros traumáticos (BANDLER; SHIPLEY, 1994;

FANSELOW, 1991; LOVICK, 1991, 1993; FANSELOW et al., 1995; P. WALKER; P.

CARRIVE, 2003).

Segundo (MELIK et al., 2000), vias serotonérgicas NMR-septo-hipocampo estariam

envolvidas na regulação da ansiedade relacionada ao condicionamento de medo, desencadeada

pelo estímulo contextual, sugerindo que o medo contextual é regulado por esta estrutura. Muitos

estudos têm demonstrado que o NMR está criticamente envolvido na regulação do

comportamento defensivo e respostas autonômicas de medo (HILLEGAART, 1990). Neste

estudo, o núcleo mediano da rafe apresentou importante marcação Fos após o medo condicionado

muito próximo de significância estatística (p = 0,06). Corroborando os estudos acima e outros

desenvolvidos neste laboratório (AVANZI ET AL., 1998, 2003; SILVA, 2004; BORELLI et al.,

2005) a análise post hoc indicou significativa expressão de células Fos neste núcleo após o medo

condicionado contextual.

Os colículos superior e inferior recebem projeções provenientes da substância cinzenta

periaquedutal dorsal (RADMILOVICH et al., 1991; CAMERON et al., 1995b) e são estruturas

do tronco encefálico, classicamente relacionadas à visão e à audição. No entanto, o colículo

Discussão Geral______________________________________________________________________________51

_____________________________________________________________________________

inferior e as camadas profundas do colículo superior também vêm sendo implicadas no

processamento de informações aversivas (BRANDÃO; MELO; CARDOSO, 1993; BRANDÃO,

1994). A estimulação elétrica com a microinjeção de aminoácidos excitatórios ou de antagonistas

do GABA nestas regiões provocam alterações autonômicas e comportamentais semelhantes às

observadas após a estimulação da substância cinzenta periaquedutal dorsal, que podem ser

atenuadas pelo pré-tratamento com benzodiazepínicos (SCHENBERG; DE AGUIAR; GRAEFF,

1983; BRANDÃO et al., 1988; DEAN; MITCHELL; REDGRAVE, 1988; BAGRI; DI SCALA;

SANDNER, 1991; CARDOSO; COIMBRA; BRANDÃO, 1994).

Adicionalmente, observou-se que a microinjeção de agentes serotonérgicos no colículo

inferior é capaz de induzir diminuição de ansiedade no labirinto em cruz elevado (MELO;

BRANDÃO, 1995). A expressiva marcação Fos no colículo inferior no condicionamento com o

som já era esperada em vista das inúmeras evidências apontando esta estrutura na organização

neural do medo induzido por estímulos sonoros (BRANDÃO et al., 1999).

Também não surpreende a significativa marcação do núcleo cuneiforme nos dois tipos de

condicionamento. O núcleo cuneiforme é uma estrutura mesencefálica, de localização

imediatamente ventral ao colículo inferior, que entre suas aferências recebe influências

provenientes da substância cinzenta periaquedutal dorsal (CAMERON et al., 1995a, b) e das

camadas profundas do colículo superior (MITCHELL; DEAN; REDGRAVE, 1988). Esta região é

componente da chamada área locomotora mesencefálica, classicamente relacionada ao controle

central da locomoção (SKINNER; GARCIA-RILL, 1984).

Os experimentos conduzidos neste estudo permitiram identificar uma serie de regiões encefálicas

que são ativadas pela apresentação de diferentes estímulos condicionados aversivos e que

Discussão Geral______________________________________________________________________________52

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provavelmente são responsáveis pela organização de respostas defensivas características do

medo e, provavelmente, relacionadas à ansiedade.

_______________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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