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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRÃO PRETO
LARISSA MOREIRA SPINOLA DE CASTRO
OSTEOGÊNESE IN VITRO SOBRE VITROCERÂMICA 100% CRISTALINA E
ALTAMENTE BIOATIVA (BIOSILICATO®): EFEITOS DO CONDICIONAMENTO DE
SUPERFÍCIE E DOS PRODUTOS DE DISSOLUÇÃO IÔNICA
RIBEIRÃO PRETO
2009
LARISSA MOREIRA SPINOLA DE CASTRO
OSTEOGÊNESE IN VITRO SOBRE VITROCERÂMICA 100% CRISTALINA E
ALTAMENTE BIOATIVA (BIOSILICATO®): EFEITOS DO CONDICIONAMENTO DE
SUPERFÍCIE E DOS PRODUTOS DE DISSOLUÇÃO IÔNICA
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para
a obtenção do título de Mestre em Odontologia.
Área de Concentração: Biologia Oral
Orientador: Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira
RIBEIRÃO PRETO
2009
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação na Publicação
Serviço de Documentação Odontológica
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
Castro, Larissa Moreira Spinola de
Osteogênese in vitro sobre vitrocerâmica 100% cristalina e altamente bioativa (Biosilicato®): efeitos do condicionamento de superfície e dos produtos de dissolução iônica. Ribeirão Preto, 2009.
98 p. : il. ; 30 cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Biologia Oral.
Orientador: Oliveira, Paulo Tambasco de.
1. Vitrocerâmica bioativa. 2. Cultura de células.
3. Osteogênese. 4. Reações de superfície.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Larissa Moreira Spinola de Castro
Osteogênese in vitro sobre vitrocerâmica 100% cristalina e altamente bioativa
(Biosilicato®): efeitos do condicionamento de superfície e dos produtos de
dissolução iônica.
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para
a obtenção do título de Mestre em Odontologia.
Aprovado em: ____/____/____
Banca Examinadora
Prof. Dr.____________________________________________________________
Instituição:________________________Assinatura: _________________________
Prof. Dr.____________________________________________________________
Instituição:________________________Assinatura: _________________________
Prof. Dr.____________________________________________________________
Instituição:________________________Assinatura: _________________________
DEDICATÓRIA
A Deus, que está presente em minha vida, me iluminando e guiando sempre.
Aos meus pais, Eduardo Augusto e Maria da Glória, fonte inesgotável de
amor e compreensão. Os sacrifícios e o incentivo de vocês tornaram possível esta
conquista.
Aos meus avós Pedruca (in memoriam) e Diva e à tia Sonia, por todos esses
anos de apoio e acolhida que tornaram possível ao desenvolvimento deste trabalho.
À vó Eduarda e à tia Yvette, por todo o carinho que sempre tiveram por mim.
À tia Doly (in memoriam), pelo amor incondicional e por todos os exemplos
maravilhosos que deixou, que nos fazem lembrá-la sempre com muita saudade.
Aos meus irmãos Alessandra, Fábio e Rafaela, que mesmo quando distantes
estiveram sempre presentes em minha vida.
Aos meus cunhados Leandro e Thaís, pela amizade e conselhos, e às minhas
sobrinhas Marina e Beatriz, por fazerem minha vida mais feliz.
Ao meu noivo Walter, pelo amor, companheirismo e lealdade. É difícil colocar
em palavras o quanto seu apoio e carinho representaram para mim durante esses
anos de convivência, mas posso dizer que foram essenciais ao cumprimento desta
etapa.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira, por sempre ter
acreditado em meu trabalho e por todos esses anos de amizade e aprendizado,
essenciais ao meu crescimento pessoal e profissional.
Ao amigo Lucas Novaes Teixeira, pelos conselhos, pela paciência, pelas
risadas e por estar sempre disposto a ajudar as pessoas à sua volta. Suas ações
falam por você e estou certa de que te farão atingir seus objetivos.
Ao amigo Roger Rodrigo Fernandes, por ter sido sempre compreensivo,
atencioso e dedicado. Reconheço todos os sacrifícios que faz por seus amigos e
pelo laboratório e devo a você muitas das coisas que sei hoje.
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo,
representada por seu diretor, Prof. Dr. Osvaldo Luiz Bezzon, pela acolhida durante
os cursos de graduação e pós-graduação.
Ao Prof. Dr. Adalberto Luiz Rosa, pela iniciativa e empenho em desenvolver
os Laboratórios de Cultura de Células e de Biologia Molecular da Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto, onde desenvolvi este trabalho.
Aos Profs. Drs. Márcio Mateus Beloti e Karina Fittipaldi Bombonato-Prado,
pela disponibilidade, paciência e amizade.
À Fabiola Singaretti de Oliveira, pela amizade e pelo auxílio nos experimentos
de expressão de RNAm e Western blotting.
Ao Prof. Dr. Antonio Nanci e ao Dr. Ji-Hyun Yi, ambos do Laboratory for the
Study of Calcified Tissues and Biomaterials da Université de Montréal, pelos ensaios
de microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica.
Aos amigos do Laboratório de Cultura de Células: Larissa Bellesini, Alice
Petri, Annelissa Zorzeto, Grasiele Crippa, Karina Pereira, Luciana Maia, Luciana
Batista, Olívia Cherubim, Renan, William Maximiano, Rayana, Glauce, Maidy e
Karen Sebastião, pelos bons momentos compartilhados e por fazerem do
Laboratório um excelente ambiente de trabalho.
Aos Profs. Drs. Oscar Peitl Filho e Edgar Dutra Zanotto, da Universidade
Federal de São Carlos, pela solicitude em me atender e esclarecer minhas dúvidas.
Aos funcionários do Laboratório de Materiais Vítreos da Universidade Federal
de São Carlos (LaMaV-UFSCar), pelo preparo do material utilizado neste estudo e
do Centro de Caracterização e Desenvolvimento de Materiais (CCDM-UFSCar),
pelos ensaios de quantificação iônica.
Às alunas de iniciação científica Nayra, Emanuelle e Nathália, pelas
contribuições ao desenvolvimento deste projeto.
À Junia Ramos, pelo auxílio prestado nos procedimentos do Laboratório.
Aos amigos e colegas de graduação e pós-graduação, por tornarem mais fácil
o cumprimento desta etapa.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo
auxílio financeiro ao trabalho e pela bolsa de mestrado FAPESP concedida.
Aos funcionários da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho.
RESUMO
xii
RESUMO
CASTRO, L. M. S. Osteogênese in vitro sobre vitrocerâmica 100% cristalina e
altamente bioativa (Biosilicato®): efeitos do condicionamento de superfície e
dos produtos de dissolução iônica. 2009. 98 p. Dissertação (Mestrado) –
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão
Preto, 2009.
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do condicionamento de superfície
de uma vitrocerâmica 100% cristalina e altamente bioativa (Biosilicato®) e de seus
produtos de dissolução iônica sobre diferentes parâmetros do desenvolvimento do
fenótipo osteogênico in vitro. Previamente ao plaqueamento de células osteogênicas
de calvárias de ratos, discos de Biosilicato® foram condicionados, por 3 dias, em
meio de cultura suplementado, com ou sem soro fetal bovino a 10%. Células
osteogênicas expostas aos produtos de dissolução iônica do Biosilicato® foram
também cultivadas sobre lamínulas de vidro bioinerte. Discos de Biosilicato e
lamínulas de vidro foram utilizados como controles. Os resultados mostraram que o
tratamento de superfície de Biosilicato® aumenta expressivamente a concentração
de silício e cálcio no meio de cultura. Em 1, 3 e 7 dias, foram determinados os
maiores valores de viabilidade celular em superfícies de Biosilicato® condicionado,
enquanto que entre os grupos de lamínulas de vidro, observou-se menor viabilidade
em culturas expostas aos produtos de dissolução iônica do Biosilicato®. Em 3 dias,
células sobre todas as superfícies de Biosilicato® apresentavam-se menos
espraiadas quando comparadas àquelas sobre lamínulas de vidro; neste período, a
topografia das superfícies dos grupos de Biosilicato® caracterizava-se por rede de
xiii
cavidades na submicro e nanoescala, enquanto que a lamínula apresentava
superfície plana. Alterações no padrão de marcação das proteínas citoesqueléticas
actina, vimentina, tubulina e vinculina, da subunidade de integrina α5 e da
fibronectina eram observadas apenas em células crescidas sobre as superfícies de
Biosilicato®. Ao final da fase proliferativa (7 dias), foram observados maiores níveis
relativos de expressão de RNA mensageiro para Runx2, sialoproteína óssea (BSP) e
fosfatase alcalina (ALP) em culturas crescidas sobre superfícies condicionadas de
Biosilicato®; a exposição aos produtos de dissolução iônica aumentou a expressão
de Runx2 e ALP nos grupos de lamínula de vidro. Em 14 dias, culturas sobre
Biosilicato® condicionado em meio de cultura com soro exibiam áreas mais extensas
de mineralização. Os resultados deste estudo mostraram que o condicionamento de
superfícies de Biosilicato® previamente ao plaqueamento celular favorece aspectos
da interação célula-substrato, promovendo maior viabilidade celular e aumentando
e/ou acelerando o desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro. A exposição
aos produtos de dissolução iônica do Biosilicato® inibe a progressão de culturas
osteogênicas sobre lamínulas de vidro bioinerte, apesar de aumentar a expressão
de marcadores osteoblásticos.
Palavras-chave: osteogênese, cultura de células, vitrocerâmica bioativa, tratamento
de superfície, dissolução iônica, diferenciação celular.
xiv
ABSTRACT
xv
ABSTRACT
CASTRO, L. M. S. In vitro osteogenesis on a highly bioactive glass ceramic
(Biosilicate®): effects of surface conditioning and of its ionic dissolution
products. 2009. 98 p. Thesis (Masters Degree) – Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.
The aim of the present study was to evaluate the effect of surface conditioning
of a highly bioactive, fully crystalline glass-ceramic in the Na2O-CaO-SiO2-P2O5
system (Biosilicate®) and of its ionic dissolution products on key parameters of the
development of the osteogenic phenotype in vitro. Rat calvaria-derived osteogenic
cells were plated on Biosilicate® discs that were pre-conditioned either with
supplemented culture medium or serum-free medium for 3 days. In addition,
osteogenic cells grown on bioinert glass coverslips were exposed to the ionic
dissolution products of the Biosilicate®. The results showed that the supplemented
culture medium used for the Biosilicate® surface conditioning exhibited a high
concentration silicium and calcium. At 1, 3, and 7 days, cell viability was significantly
higher for the conditioned Biosilicate® sufaces, whereas reduced cell viability was
observed for cultures grown on glass coverslips and exposed to the ionic dissolution
products of Biosilicate®. At day 3, cells grown on Biosilicate® groups were less
spread compared with those on glass coverslips. At the same time point, whereas
the surface topography of glass coverslips was smooth, Biosilicate® discs exhibited a
network of submicron and nanoscale pits. Changes in the labeling pattern of the
cytoskeleton proteins actin, vimentin, tubulin and vinculin, and of α5 integrin and
fibronectin were only observed for cells grown on Biosilicate® surfaces. At the end of
xvi
the proliferative phase (day 7), expression levels of Runx2, alkaline phosphatase
(ALP) and bone sialoprotein (BSP) mRNAs were significantly higher for cultures
grown on conditioned Biosilicate® surfaces; the exposure of cells to the ionic
dissolution products increased Runx2 and ALP mRNA levels. At day 14, significantly
more extensive areas of matrix mineralization were detected for cultures grown on
Biosilicate® discs that were pre-conditioned with supplemented culture medium. The
results showed that the conditioning of Biosilicate® surfaces with culture medium prior
to cell plating supports key aspects of cell-substrate interactions, increasing and/or
accelerating expression of the osteoblastic cell phenotype. Furthermore, the
exposure of cells to the ionic dissolution products of Biosilicate® inhibits the
progression of osteogenic cell cultures on bioinert glass coverslips, despite its
positive effect on expression of osteoblastic markers.
Key-words: osteogenesis, cell culture, bioactive glass-ceramic, surface conditioning,
ionic dissolution products, osteoblast, cell differentiation.
xvii
LISTA DE FIGURAS
xviii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura de culturas osteogênicas crescidas
sobre superfícies de lamínula de vidro (A e B) e Biosilicato® (C-H), em diferentes
condições, aos 3 dias. Nos grupos de Biosilicato®, as células estavam menos
espraiadas e interagiam com substrato cuja topografia caracterizava-se pela
presença de cavidades na submicroescala (detalhe em D e F). Notem-se em E
(cabeças de seta), formações esféricas associadas à superfície celular, que ocorriam
apenas nos grupos de Biosilicato®. Asteriscos em D, F e H indicam superfície celular
adjacente ao substrato. Barras de escala: A, B, C, E e G = 10 µm; D, F e H = 1 µm;
D e F (detalhe) = 0,5 µm. .........................................................................................60
Figura 2. Rugosidade de superfície por MFA (áreas de 5x5 e 1x1 µm; média ±
desvio padrão, em nm) de lamínulas de vidro e discos de Biosilicato®, em diferentes
condições, após 3 dias de exposição às condições de cultura, em áreas destituídas
de células. ................................................................................................................61
Figura 3. Topografia por MFA (A, C, E e G, 5x5 µm; B, D, F e H, 1x1 µm) de
superfícies de lamínulas de vidro (A e B) e Biosilicato® (C-H), em diferentes
condições, após 3 dias de cultivo celular, em áreas destituídas de células. ............62
Figura 4. Epifluorescência de culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de
lamínula de vidro (1-3) e Biosilicato® (4-6), em diferentes condições, em 1 dia.
Marcações em verde (A e D) e branco pálido (B e C) indicam citoesqueleto de actina
e, em azul, núcleos celulares (A-D). Em vermelho, as proteínas citoesqueléticas
xix
vinculina (B), vimentina (C) e tubulina (D). Notem-se alterações no padrão de
marcação das proteínas citoesqueléticas e menor espraiamento de células
cultivadas nas três superfícies de Biosilicato® (4-6). Barra de escala para A-C = 50
µm e para D = 20 µm. ..............................................................................................65
Figura 5. Epifluorescência de culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de
lamínula de vidro (1-3) e Biosilicato® (4-6), em diferentes condições, em 3 dias. (A)
Células viáveis exibem fluorescência verde, enquanto que células mortas,
fluorescência vermelha (LIVE/DEAD®). (B e C) Duplas marcações (B) actina (em
branco pálido)/vimentina (em vermelho) e (C) actina (em verde)/tubulina (em
vermelho), em que se notam alterações citoesqueléticas em células sobre as
superfícies de Biosilicato®, as quais exibem menor espraiamento. Nesses grupos, a
distribuição de vimentina e tubulina era predominantemente perinuclear, com áreas
circulares semelhantes a vacúolos, destituídas de marcação (C4 e C5, cabeças de
seta). (D) Marcação para vinculina (em vermelho) ocorre, em células sobre lamínulas
de vidro, em região perinuclear e em pontos de adesão focal, enquanto que em
células sobre superfícies de Biosilicato®, concentra-se ao redor dos núcleos. Áreas
circulares destituídas de marcação eram também visualizadas (D5 e D6, cabeças de
seta). (E e F) Dupla marcação subunidade de integrina α5 (E, em
vermelho)/fibronectina (F, em verde) evidencia padrões de marcação semelhantes,
indicando colocalização. Sobre superfícies de Biosilicato®, a reduzida marcação para
α5 associa-se à redução da fibrilogênese de fibronectina (E4-6 e F4-6). Em azul,
núcleos celulares (B-F). Barra de escala para A e B = 50 µm; para C e D=20 µm e
para E e F = 25 µm. .................................................................................................67
xx
Figura 6. Epifluorescência de culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de
lamínula de vidro (1-3) e Biosilicato® (4-6), em diferentes condições, em 7 dias.
Fluorescência vermelha indica, em A, marcação para BSP, e em B, a atividade, in
situ, de ALP (em detalhe, aspecto macroscópico). Notem-se áreas mais extensas
imunomarcadas para BSP e com atividade de ALP em culturas sobre superfícies de
Biosilicato®. Em azul, núcleos celulares. Barra de escala para A1-3 = 50 µm, para
A4-6 e B1-6 = 100 µm e para detalhes em B1-6 = 2 mm. ........................................69
Figura 7. Viabilidade celular (média ± desvio padrão, em densidade óptica) de
culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de lamínulas de vidro e
Biosilicato®, em diferentes condições, determinada pelo ensaio colorimétrico MTT,
em 1, 3 e 7 dias. .......................................................................................................70
Figura 8. Epifluorescência de culturas osteogênicas crescidas sobre superfície de
lamínula de vidro (A e B) e Biosilicato® (C e D), aos 3 dias. Fluorescência vermelha
indica células no ciclo celular, em atividade proliferativa (Ki-67 positivas). Em verde,
citoesqueleto de actina e em azul, núcleos celulares. Note-se que, sobre a superfície
de Biosilicato, a maioria das células Ki-67 positivas exibe também marcação pela
faloidina. Barra = 100 µm. ........................................................................................71
Figura 9. Índice de proliferação celular (média ± desvio padrão) de culturas
osteogênicas crescidas sobre lamínulas de vidro e superfícies de Biosilicato® (D-F)
em diferentes condições, determinado pela proporção de células Ki-67 positivas em
3 dias. .......................................................................................................................72
xxi
Figura 10. Número total de células (média ± desvio padrão) de culturas
osteogênicas sobre superfícies de lamínulas de vidro e Biosilicato®, em diferentes
condições, em 7 dias. ...............................................................................................72
Figura 11. Expressão relativa de RNAm (média ± desvio padrão) para os
marcadores de diferenciação osteoblástica Runx2, BSP e ALP em culturas
osteogênicas sobre superfícies de lamínula de vidro e Biosilicato®, em diferentes
condições, aos 7 dias. Os valores foram normalizados pelo gene constitutivo
GADPH e calibrados pelos valores obtidos para o grupo Lamínula. ........................74
Figura 12. Atividade de ALP (média ± desvio padrão, em µmol de timolftaleína/h/mg
de proteína) em culturas osteogênicas sobre superfícies de Biosilicato®, em
diferentes condições, em 10 dias. ............................................................................75
Figura 13. Formação de matriz calcificada (média ± desvio padrão) em culturas
osteogênicas sobre superfícies de Biosilicato®, em diferentes condições, em 14 dias ..76
Figura 14. Aspectos macroscópicos de culturas osteogênicas sobre superfícies de
Biosilicato®, em diferentes condições, coradas por Fast red, em 10 dias (A, C e E), e
por vermelho de Alizarina, em 14 dias (B, D e F). Enquanto que a atividade de ALP
foi maior sobre Biosilicato em 10 dias, áreas mais extensas de matriz calcificada
(escuras) foram observadas no grupo B+MS. Barra de escala = 3 mm....................76
xxii
LISTA DE TABELAS
xxiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Concentração (em ppm) dos elementos cálcio, fósforo e silício em meios
de cultura suplementados, com ou sem soro fetal bovino, utilizados para o
condicionamento de discos de Biosilicato® por 3 dias..............................................59
Tabela 2. Análise comparativa (Pós-teste de Fischer) da rugosidade de superfície, por
MFA, de lamínulas de vidro e discos de Biosilicato®, em diferentes condições.............62
Tabela 3. Valores de média ± desvio padrão e significância estatística encontrados
nos ensaios de viabilidade celular (MTT) em 1, 3 e 7 dias; índice de proliferação
celular (% de Ki-67 positivas) aos 3 dias e número total de células em 7 dias, em
culturas osteogênicas sobre lamínulas de vidro e Biosilicato®, em diferentes
condições ..................................................................................................................73
Tabela 4. Análise comparativa (Pós-teste de Fischer) da viabilidade celular (MTT)
em 1, 3 e 7 dias; índice de proliferação celular (% de Ki-67 positivas) aos 3 dias e
número total de células em 7 dias, em culturas osteogênicas sobre lamínulas de
vidro e Biosilicato®, em diferentes condições ...........................................................73
Tabela 5. Expressão relativa de RNAm (média ± desvio padrão) para Runx2, BSP e
ALP aos 7 dias; atividade de ALP aos 10 dias e mineralização aos 14 dias em
culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de lamínula de vidro e
Biosilicato®, nas diferentes condições ......................................................................77
xxiv
Tabela 6. Análise comparativa (Pós-teste de Fischer) da expressão relativa de
Runx2, BSP e ALP aos 7 dias; atividade de ALP aos 10 dias e mineralização aos 14
dias em culturas osteogênicas crescidas sobre lamínulas de vidro e Biosilicato®, nas
diferentes condições .................................................................................................77
xxv
SUMÁRIO
xxvi
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................28
2 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................32
3 PROPOSIÇÃO.......................................................................................................43
4 MATERIAL E MÉTODO.........................................................................................45
4.1 Preparação dos biomateriais ...........................................................................46
4.2 Isolamento das células e cultura primária de células osteogênicas.................47
4.3 Grupos experimentais......................................................................................48
4.4. Análise da dissolução dos elementos cálcio, fósforo e silício pelo método de espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP-OES).................................................................................49
4.5 Avaliação das respostas celulares...................................................................49
4.5.1 Análise da morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e caracterização da topografia de superfície por microscopia de força atômica (MFA)....................................................................................................49
4.5.2 Imunolocalização de proteínas citoesqueléticas, da matriz extracelular e da subunidade de integrina α5.........................................................................50
4.5.3 Viabilidade, proliferação celular e número total de células........................51
4.5.4 Expressão de RNAm para marcadores da diferenciação osteoblástica....53
4.5.5 Atividade de ALP.......................................................................................55
4.5.6 Formação de matriz calcificada.................................................................56
4.6 Análise estatística............................................................................................57
xxvii
5 RESULTADOS.......................................................................................................58
5.1 Análise da dissolução dos elementos cálcio, fósforo e silício por ICP-OES ....59
5.2 Análise da morfologia celular por MEV e caracterização da topografia de superfície por MFA ................................................................................................59
5.3 Imunolocalização de proteínas citoesqueléticas, da matriz extracelular e da subunidade de integrina α5 ....................................................................................63
5.4 Viabilidade, proliferação celular e número total de células ..............................70
5.5 Expressão de RNAm de marcadores da diferenciação osteoblástica .............74
5.6 Atividade de ALP .............................................................................................75
5.7 Formação de matriz calcificada .......................................................................75
6 DISCUSSÃO..........................................................................................................78
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................85
8 REFERÊNCIAS......................................................................................................87
1 INTRODUÇÃO
29
1 INTRODUÇÃO
Pesquisas na área de Biomateriais buscam o desenvolvimento de materiais
para implantação que favoreçam o reparo tecidual rápido e controlado, resultando
em regeneração tecidual (BRUNSKI; PULEO; NANCI, 2000). Os benefícios desses
biomateriais incluem facilidades para sua produção e esterilização, além de
proporcionar reduzida morbidade (MOORE; GRAVES; BAIN, 2001).
A produção de biomateriais deve ser baseada na compreensão e
quantificação das reações celulares em substratos naturais e artificiais. Esse
princípio baseia-se em evidências de que a superfície do material se constitui em
fator crítico na determinação de sua biocompatibilidade e no processo de integração
com os tecidos biológicos (NANCI et al., 1998). Segundo Schwartz e Boyan (1994),
eventos biológicos na interface osso-implante são influenciados por diversas
características da superfície do biomaterial, tais como composição química, energia
de superfície e topografia.
Entre os principais biomateriais para implantação em osso utilizados nas
áreas de Odontologia e Ortopedia estão os vidros e as cerâmicas de cálcio e fósforo
(por exemplo, Bioglass® 45S5 e hidroxiapatita, respectivamente), os metais (titânio e
aço cirúrgico) e os polímeros (poli (ácido lático) e polimetilmetacrilato). No espectro
de biocompatibilidade, as cerâmicas de cálcio e fósforo e alguns vidros, como o
Bioglass® 45S5, são considerados materiais bioativos (HENCH; WILSON, 1984).
O desenvolvimento de vitrocerâmicas a partir da cristalização total ou parcial
de vidros com composições semelhantes à do Bioglass® 45S5 tem o objetivo de
aprimorar as propriedades mecânicas do material para a produção de arcabouços
(scaffolds) para aplicação em defeitos ósseos. Entre as vitrocerâmicas, destaca-se o
30
Biosilicato®, um material nacional altamente bioativo e 100% cristalino desenvolvido
pelo Laboratório de Materiais Vítreos da Universidade Federal de São Carlos
(LaMaV-UFSCar; ZANOTTO et al., 2004). Moura et al. (2007) demonstraram que o
Biosilicato® apresenta bioatividade semelhante à do Bioglass® 45S5 quando imerso
em fluido corporal simulado K-9, com níveis superiores quando comparado a
vitrocerâmicas disponíveis no mercado.
Respostas teciduais favoráveis à implantação de materiais vítreos bioativos
são atribuídas, pelo menos em parte, às reações de trocas iônicas ocorridas em sua
superfície, que resultam na formação de uma camada de hidroxicarbonatoapatita,
que, por sua vez, irá promover a ligação desse material à matriz extracelular do
tecido ósseo (HENCH, 1991). Estudos in vitro demonstram que esses materiais
bioativos podem afetar o processo de formação óssea não somente pelo contato
direto com sua superfície, mas também pelos efeitos de seus produtos de sua
dissolução iônica (VALERIO et al., 2004). De fato, o perfil de expressão gênica de
células osteoblásticas humanas é modificado quando culturas são expostas aos
produtos de dissolução iônica do Bioglass® 45S5 (SEPULVEDA; HENCH, 2002;
XYNOS et al., 2000a; 2000b; 2001), com a estimulação de sete famílias de genes
que incluem reguladores do ciclo celular e de apoptose, além daqueles relacionados
a fatores de crescimento (XYNOS et al., 2001).
Quando em contato com fluidos biológicos, as reações que ocorrem na
superfície de materiais vítreos bioativos promovem liberação de íons e alterações do
pH local e de sua topografia. Além disso, tanto em condições experimentais in vitro
como in vivo, ocorre adsorção de proteínas do plasma/soro na superfície reativa
desses vidros. É, portanto, fundamental a participação dessas proteínas adsorvidas
no processo de interação de células com o material (ANSELME, 2000). Assim, uma
31
das estratégias que visam a favorecer a neoformação tecidual nos sítios de
implantação é a modificação bioquímica da superfície de vidros, incluindo o
condicionamento com soluções contendo proteínas (DUCHEYNE; QIU, 1999). No
caso dos materiais vítreos bioativos, não só ocorrerá adsorção seletiva de proteínas,
como também alteração na dinâmica de crescimento e maturação da camada de
fosfato de cálcio (EFFAH-KAUFMANN et al., 2000).
Apesar de a cristalização do Biosilicato® permitir a formação de áreas mais
extensas de matriz mineralizada quando comparada à de vidros bioativos (MOURA
et al., 2007), ainda não se conhecem os efeitos do condicionamento prévio de sua
superfície e dos seus produtos de dissolução iônica sobre diferentes parâmetros do
desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro. A melhor compreensão desses
fenômenos, por certo, trará contribuição significativa para o entendimento da
dinâmica do processo de diferenciação osteoblástica e de formação de matriz óssea
sobre vitrocerâmicas bioativas.
32
2 REVISÃO DA LITERATURA
33
2 REVISÃO DA LITERATURA
A perda de um órgão ou de uma parte do corpo gera, além de importantes
alterações funcionais, transtornos sociais e psicológicos. Muitas lesões do tecido
ósseo não são adequadamente tratadas devido à dificuldade deste em regenerar
defeitos extensos (MARTINA et al., 2005). Além disso, com o aumento da
expectativa de vida da população, tornam-se mais freqüentes as fraturas,
diagnósticos de neoplasias e, consequentemente, a necessidade de se
desenvolverem técnicas e materiais que promovam a regeneração óssea (GREEN
et al., 2002; RODRIGUES et al., 2003).
Avanços na Medicina e Odontologia modernas têm possibilitado o
desenvolvimento de procedimentos terapêuticos que proporcionam uma melhor
qualidade de vida. Nesse contexto, a reconstrução de defeitos ósseos tornou-se um
procedimento realizado com frequência em cirurgias periodontais, buco-maxilo-
faciais e ortopédicas. O desenvolvimento e a aplicação de biomateriais como
substitutos ósseos têm facilitado o tratamento de pacientes com inúmeros problemas
estéticos e funcionais. A disponibilização dessas técnicas proporciona novas opções
terapêuticas aos pacientes mutilados, como a substituição total ou parcial de ossos
por implantes.
Materiais autógenos, alógenos e xenógenos têm sido aplicados como
substitutos ósseos (SEPULVEDA; JONES; HENCH, 2002). Embora o osso autógeno
seja considerado o padrão ouro para este procedimento, desvantagens associadas à
sua disponibilidade, necessidade de uma segunda cirurgia e morbidade pós-
operatória do sítio doador limitam sua utilização (AICHELMANN-REIDY; YUKNA,
1998; BANWART; ASHER; HASSANEIN, 1995; YOUNGER; CHAPMAN, 1989).
34
Apesar de materiais alógenos e xenógenos representarem alternativas ao osso
autógeno, sua utilização pode ser limitada por sua baixa capacidade osseoindutora,
menores taxas de osseointegração, riscos de transmissão de doenças e rejeição
(HELM; DAYOUB; JANE, 2001; PILITSIS; LUCAS; RENGACHARY, 2002).
Em virtude dessas dificuldades, muitos estudos vêm sendo realizados nos
últimos anos visando ao desenvolvimento e à produção de materiais, naturais ou
sintéticos, capazes de substituir o tecido ósseo (PULEO et al., 1991). Esses
materiais, genericamente conhecidos como biomateriais, devem apresentar
propriedades mecânicas semelhantes às do osso e permitir a osseointegração, com
a deposição de matriz óssea diretamente sobre sua superfície, além de incluir
facilidades em sua disponibilização, esterilização e proporcionar reduzida morbidade
pós-operatória (MOORE; GRAVES; BAIN, 2001).
Inicialmente, biomateriais desenvolvidos para substituir tecidos perdidos
tinham como princípio apresentar características que possibilitassem sua função
com mínima reação adversa do hospedeiro (HENCH; POLAK, 2002), ou seja, estes
materiais deveriam ser quimicamente bioinertes (BEST et al., 2008; HENCH, 1980).
Nesse sentido, foram produzidos biomateriais como o aço inoxidável, ligas de
cromo-cobalto e de titânio, vários polímeros (HENCH et al., 2000) e algumas
cerâmicas, como a de alumínio e zircônia (NAVARRO et al., 2008). Embora a
aplicação de materiais bioinertes possa ser interpretada como clinicamente
satisfatória, o que justificaria seu uso atual, a possibilidade de formação de cápsula
fibrosa na interface osso-implante representaria um fator limitante para a utilização
desses materiais no tecido ósseo (HULBERT et al., 1987; KOKUBO; KIM;
KAWASHITA, 2003).
35
Com o intuito de aprimorar as interações entre elementos teciduais (células e
matriz extracelular) e biomateriais, estabeleceram-se várias estratégias, como o
desenvolvimento de diferentes topografias, a produção de materiais reabsorvíveis e
o uso de materiais com reatividade de superfície controlada (HENCH, 1980). Com
efeito, superfícies de biomateriais bioinertes que induziam a formação de cápsula
fibrosa, quando modificadas em sua topografia, apresentavam aumento significativo
de propriedades osseocondutoras (GRIZON et al., 2002), resultado de maior
embricamento mecânico e conseqüente redução da mobilidade do implante em
relação aos tecidos circunjacentes (HENCH, 1980). Materiais reabsorvíveis, cujo
objetivo final é sua total reposição por tecido regenerado, são representados por
polímeros, como o poli (ácido lático)-poli (ácido glicólico) e as cerâmicas, como a de
tricálcio fosfato. Apesar de alguns resultados satisfatórios obtidos com o uso desses
materiais e de seu potencial como carreador de moléculas biologicamente ativas
(CARSON; BOSTROM, 2007), sua fragilidade mecânica, propriedades adesivas
deficientes e a formação de subprodutos ácidos em sua decomposição os tornam
inadequados para aplicação óssea (GENTLEMAN; POLAK, 2006; HENCH, 1980;
HENCH, 1991).
Outra estratégia utilizada para solucionar os problemas de adesão da
interface tecido-implante foi o desenvolvimento de materiais bioativos, ou seja,
capazes de induzir respostas biológicas específicas na região interfacial que
resultem na íntima ligação da matriz extracelular à sua superfície (HENCH; WEST,
1996). Essa classe de biomateriais inclui vidros bioativos (Bioglass® 45S5),
vitrocerâmicas bioativas (Ceravital® e A-W), hidroxiapatita densa (Calcitite®) e
compósitos bioativos (Palavital®, PE-HA, e Bioglass® reforçado por metais) (HENCH,
1991).
36
Na década de 70, Hench publicou os primeiros trabalhos sobre o Bioglass®
45S5, um vidro bioativo pertencente ao sistema quaternário de óxidos (46.1% SiO2,
24.4% Na2O, 26.9% CaO e 2.6% P2O5, em mol) (HENCH et al., 1971). Diversos
estudos ratificaram a bioatividade desse material vítreo, demonstrando sua
capacidade em promover a proliferação e diferenciação de células da linhagem
osteoblástica (DUCHEYNE; QIU, 1999; HATTAR et al., 2005; LOSSDORFER et al.,
2004; XYNOS et al., 2000b).
Apesar de seus efeitos benéficos no reparo ósseo, o uso do Bioglass® 45S5 e
de outros vidros bioativos em engenharia de tecido ósseo tem sido limitado, em
virtude de suas propriedades mecânicas inadequadas à produção de arcabouços
(scaffolds) (DIEUDONNE et al., 2002). O desenvolvimento de vitrocerâmicas, obtidas
por meio da cristalização controlada de vidros (CHEN; THOMPSON; BOCCACCINI,
2006; JAMES, 1995), tem buscado não apenas melhorar as propriedades mecânicas
dos materiais vítreos, como as vitrocerâmicas Ceravital® e A-W, contendo apatita e
wolastonita (ERNEST LEITZ, 1975; KOKUBO et al., 1985), como também
proporcionar outras propriedades importantes ao material, como a usinabilidade
(Bioverit®; HENCH; WILSON, 1993). Todavia, apesar de apresentarem propriedades
mecânicas superiores às dos vidros bioativos, a introdução de algumas fases
cristalinas poderia diminuir acentuadamente sua bioatividade (HENCH; WEST,
1996). Estudo relacionado a uma nova vitrocerâmica, pertencente ao sistema
quaternário P2O5-Na2O-CaO-SiO2, 100% cristalina, denominada Biosilicato® (patente
WO 2004/074199; ZANOTTO et al., 2004), desenvolvida pelo Laboratório de
Materiais Vítreos da Universidade Federal de São Carlos (LaMaV-UFSCar), mostrou
que a cristalização total de um vidro com composição semelhante à do Bioglass®
45S5, além de aprimorar suas propriedades mecânicas, proporciona índice de
37
bioatividade superior aos de vitrocerâmicas comercializadas atualmente (MOURA et
al., 2007).
Evidências de estudos sobre o mecanismo de interação de materiais bioativos
com o tecido ósseo sugerem que, quando em contato com fluidos corpóreos, ocorre
uma mudança gradual em sua superfície em função de alterações no pH que
resultam em dissolução, precipitação e reações de trocas iônicas (HENCH; POLAK,
2002). Essas alterações de pH estão relacionadas à composição do material, à
razão área de superfície por volume de solução e à dosagem e taxa de agitação do
sistema (ZHANG; HUPA; HUPA, 2008). Minutos após a exposição a fluidos
corpóreos, ocorre a perda de íons sódio da superfície do material pela troca com
íons hidrogênio ou hidrônio (Estágio 1). A depleção de sódio causa quebra da rede
sílica, bem como das ligações Si-O-Si (Estágio 2). Como resultado, ocorre a
formação de grupos silanóis, Si(OH)4, que se repolimerizam em uma camada de
sílica-gel, SiO2 (Estágio 3) (LEVY et al., 2007). Em seguida, íons cálcio e fosfato
migram e se agregam sobre esta superfície, formando uma camada de fosfato de
cálcio amorfo (Estágio 4). A incorporação de íons hidroxila e carbonato, provenientes
dos líquidos circundantes, induzem à nucleação e cristalização de hidroxiapatita
carbonatada, muito semelhante à fase mineral da matriz óssea (Estágio 5)
(SARAVANAPAVAM et al., 2003).
Estudos demonstram que o efeito bioativo do Bioglass® 45S5 sobre células
osteoblásticas ocorre tanto pelo contato direto com a superfície quanto por seus
produtos de dissolução iônica (SILVER; DEAS; ERECIŃSKA, 2001; XYNOS et al.,
2000a). Effah-Kaufmann; Ducheyne e Shapiro (2000) demonstraram que
osteoblastos próximos a discos de Bioglass® 45S5 porosos exibiam atividade de
fosfatase alcalina (ALP) significativamente maior se comparada à de células
38
crescidas diretamente sobre a superfície do material. De fato, pelo menos sete
famílias de genes são ativadas quando osteoblastos humanos em culturas primárias
são expostos aos produtos da dissolução iônica de vidros bioativos, incluindo genes
que codificam proteínas relacionadas à proliferação e diferenciação celulares
(HENCH et al., 2000; LOTY et al., 2001; XYNOS et al., 2001). Mais recentemente,
Tsigkou et al. (2009) demonstraram que os produtos de dissolução iônica do
Bioglass® 45S5 aumentam a expressão de RNAm para osteonectina, sialoproteína
óssea (BSP) e ALP, além de favorecer a deposição e mineralização da matriz
extracelular em osteoblastos fetais humanos cultivados em meio de cultura não
suplementado. Os autores sugerem que esses efeitos sejam devidos ao aumento na
concentração de silício no meio extracelular.
Matsuoka et al. (1999) demonstraram que o cálcio, presente na composição
de materiais vítreos bioativos, induz a quimiotaxia e proliferação de células da
linhagem osteoblástica. O fosfato inorgânico também exerce várias funções, como a
indução de expressão de osteopontina, proliferação e apoptose (CHRISTODOULOU
et al., 2005), estimulando a diferenciação terminal dos osteoblastos (BRAN et al.,
2008). Esse íon também atua como molécula sinalizadora do início da
mineralização, através do aumento da produção local de fatores de crescimento
(IGF-I, insulin-like growth factor I, e TGF-β1, transforming growth factor β1, da sigla
em inglês) e de prostaglandina E2 (LOSSDÖRFER et al., 2004). Estudos
demonstraram que a sílica possui efeito mitogênico sobre osteoblastos (VALERIO et
al., 2004) e estimula a síntese de colágeno tipo I (REFFITT et al., 2003). Além disso,
os abundantes grupos silanóis (SiOH) encontrados na superfície da sílica-gel e
resultantes da ligação da sílica com o hidrogênio presente nos fluídos corpóreos,
contribuem para a nucleação da apatita (LI et al., 1992).
39
Concomitantemente às alterações de superfícies que materiais bioativos
sofrem quando em contato com fluidos corpóreos, ocorrem outros eventos, como os
efeitos da solução e do substrato sobre atividade celular e a adsorção de proteínas e
fatores de crescimento na superfície do material (DUCHEYNE; QIU, 1999). Essas
moléculas, uma vez adsorvidas, se ligam a integrinas presentes na membrana
plasmática, ativando vias de sinalização celular (RADIN et al., 2005). Assim, todos
esses fenômenos culminarão com a incorporação gradual destes materiais ao tecido
ósseo em formação (DUCHEYNE, 1994).
Muitos fatores são conhecidos por afetar a dissolução e os processos
subsequentes que levam à formação da camada de hidroxicarbonatoapatita e a
bioatividade dos materiais vítreos. Entre eles, a razão área de superfície/volume de
solução (SEPULVEDA; JONES; HENCH, 2002) e o tipo de solução utilizada (RADIN
et al., 1997; RADIN et al., 2000). A maioria dos métodos de avaliação in vitro da
bioatividade desses materiais utiliza a taxa de formação da camada de apatita como
medida qualitativa (GATTI et al., 2006). A solução comumente utilizada para essas
avaliações, o fluido corpóreo simulado, contém íons inorgânicos em concentrações
que correspondem àquelas encontradas no plasma sanguíneo humano (PELTOLA
et al., 2000). Contudo, segundo El-Ghannam, Ducheyne e Shapiro (1997), o uso de
soluções contendo apenas eletrólitos para avaliar as reações que resultam na
formação de mineral não é adequado, uma vez que no organismo, o material é
exposto a fluidos mais complexos, que apresentam macromoléculas. De fato, um
dos primeiros eventos a ocorrer in vivo é a adsorção de proteínas na superfície do
material (CHEN; THOMPSON; BOCCACCINI, 2006).
Por outro lado, trabalhos demonstram que quando vidros bioativos são
expostos a soluções que mimetizam o ambiente fisiológico, ou seja, na presença de
40
proteínas, a maturação do fosfato de cálcio amorfo em hidroxiapatita não ocorre
prontamente. A presença de uma camada protéica adsorvida à superfície interfere
em suas reações de trocas iônicas com a solução, aumentando a dissolução de íons
silício e atrasando a nucleação e o crescimento da hidroxiapatita (DUCHEYNE; QIU,
1999; FOPPIANO et al., 2006; EFFAH-KAUFMANN et al., 2000; RADIN et al., 1997;
SEPULVEDA; JONES; HENCH, 2002). Matsuoka et al. (1999) observaram que a
adição de componentes orgânicos ao fluido corporal simulado utilizado para o
condicionamento da cerâmica A-W reduz significativamente a taxa de crescimento
dos cristais de hidroxiapatita. Em outro estudo, Lu, Pollack e Ducheyne (2001)
mostraram que a adsorção de uma única proteína (fibronectina) reduz
significativamente a eletronegatividade inicial da superfície do Bioglass® 45S5,
retardando a formação da camada de fosfato de cálcio amorfo. Esses autores
atribuíram o atraso na formação da hidroxiapatita ao fato de as proteínas adsorvidas
ao material competirem pela ligação com íons cálcio, promovendo redução em sua
disponibilidade para a formação da camada de fosfato de cálcio amorfo. Este fato
leva à exposição da rede de sílica subsuperficial, gerando um aumento em sua
dissolução (RADIN et al., 2000). De fato, Moura et al. (2007) observaram que,
quando exposto às condições de cultura na ausência de células por períodos de até
72 h, a superfície do Biosilicato® sofre reações que resultam na formação de uma
camada de fosfato de cálcio amorfo sobre sílica gel, não sendo observada a
formação da camada de hidroxiapatita. A presença das proteínas, contudo, não
bloqueia as reações de superfície desses materiais. A difusão do cálcio e do fósforo
conduz a um contínuo espessamento da camada de fosfato de cálcio amorfo sob a
camada de proteínas adsorvidas (DUCHEYNE; QIU, 1999).
41
O processo de imersão do Bioglass® 45S5 em meio de cultura para a
deposição da camada de fosfato de cálcio amorfo previamente ao plaqueamento
celular mimetiza o que ocorre no sítio de implantação in vivo, pois nessa condição, o
material se torna perfundido com fluidos corpóreos (OONISHI et al., 1997). Além
disso, esse procedimento atenua as variações de pH decorrentes da liberação de
íons básicos dos materiais bioativos, minimizando os danos celulares relacionados
ao pH (PRICE et al., 1997) e promove a adsorção de moléculas biológicas à camada
de fosfato de cálcio amorfo em formação (XYNOS et al., 2000b). A presença de uma
camada protéica adsorvida à superfície de vidros e vitrocerâmicas bioativos é
importante por fornecer sítios para ancoragem para células do tecido ósseo, como
osteoblastos e células osteoprogenitoras (DUCHEYNE; QIU, 1999).
Estudos recentes têm buscado favorecer a interação de vidros bioativos e
tecidos através da modificação de sua superfície com a adsorção de proteínas que
promovam respostas celulares específicas (CHEN et al., 2007; EL-GHANNAM;
DUCHEYNE; SHAPIRO, 1995; GARCÍA; DUCHEYNE; BOETTIGER, 1998;
NAVARRO et al., 2008; SODERLING et al., 1996). Esse método baseia-se na
crescente informação sobre o papel da membrana celular e das proteínas
matricelulares na adesão e crescimento celulares (DETTIN et al., 2006). É aceito na
literatura que as células não se aderem diretamente a nenhum substrato, sejam
estes matrizes extracelulares ou substratos artificiais. Essa ligação ocorre por meio
de componentes da matriz extracelular, como a fibronectina e o colágeno, que são
adsorvidos ao substrato natural ou sintético (CHEN et al., 2008).
El-Ghannam, Ducheyne e Shapiro (1995) demonstraram que o tratamento
prévio de um vidro bioativo para produzir uma superfície de fosfato de cálcio amorfo,
seguido pela incubação em soro a 10% previamente ao plaqueamento celular,
42
resulta em rápida invasão de células que expressam o fenótipo osteoblástico e
depositam extensa área de matriz extracelular calcificada (EL-GHANNAM;
DUCHEYNE, SHAPIRO, 1995). García, Ducheyne e Boettiger (1998), em estudo
avaliando o efeito do tratamento de superfície de vidros bioativos para produzir
fosfato de cálcio amorfo ou uma camada de HCA, demonstraram que essa
estratégia promove uma maior adesão celular, mediada por fibronectina, em
comparação com superfícies não tratadas, vidro não reativo e hidroxiapatita
estequiométrica sintética. Os autores concluíram que esse fenômeno é resultante de
uma melhor interação entre célula-receptor de fibronectina, o que sugere que o
aumento na adesão celular dependente de substrato resultou de alterações na
conformação da fibronectina adsorvida.
Em estudo recente, Moura et al. (2007) mostraram que o Biosilicato® 100%
cristalino promove o aumento significativo do potencial osteogênico de células
derivadas de calvárias de ratos em relação aos controles de Biosilicato® vítreo e
Bioglass® 45S5, favorecendo a formação de áreas mais extensas de matriz
mineralizada ao final de 14 dias de cultura primária. Todavia, ainda são necessários
estudos para avaliar o potencial bioativo dos produtos de dissolução iônica deste
biomaterial e/ou o efeito de seu condicionamento de sua superfície com proteínas do
soro.
43
3 PROPOSIÇÃO
44
3 PROPOSIÇÃO
O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do condicionamento de
superfície e dos produtos da dissolução iônica do Biosilicato® sobre os seguintes
aspectos da osteogênese in vitro: 1) concentração dos elementos cálcio, fósforo e
silício nos meios utilizados para os condicionamentos; 2) morfologia celular e
topografia de superfície em 3 dias; 4) organização do citoesqueleto e expressão de
marcadores da diferenciação osteoblástica em 1, 3 e 7 dias; 5) viabilidade,
proporção de células no ciclo celular e número total de células em 1, 3 e 7 dias; 6)
atividade de fosfatase alcalina em 7 e 10 dias e 7) detecção de áreas de matriz
calcificada em 14 dias.
45
4 MATERIAL E MÉTODO
46
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 Preparação dos biomateriais
Discos de Biosilicato®, de 12 mm de diâmetro e 2,5 mm de espessura, foram
adquiridos junto ao LaMaV-UFSCar (São Carlos, SP). Sílica de alta pureza,
carbonato de cálcio, carbonato de sódio e fosfato de sódio foram usados para obter
a composição do Biosilicato® vítreo. Os materiais foram pesados e misturados por 30
min em garrafa de polietileno. A fusão ocorreu em temperaturas entre 1250 e
1380°C por 3 h em forno elétrico (Rapid Temp 1710 BL, CM Furnaces Inc.,
Bloomfield, NJ, EUA). As amostras foram, então, colocadas em molde cilíndrico de
grafite nas dimensões de 10 mm por 30 mm e submetidas à fusão a 460°C por 5 h.
Para obtenção do Biosilicato® 100% cristalino, os cilindros contendo Biosilicato®
vítreo passaram por ciclo de tratamento térmico. Os cilindros de Biosilicato® foram
cortados em discos na espessura de 3 mm, usando lâmina de diamante. Por fim, os
discos, de 12 mm de diâmetro, foram polidos com lixas de carbeto de silício na
gramatura de 400, imersos em álcool isopropílico e limpos em ultrassom. Em
seguida, estes foram lavados e armazenados em álcool isopropílico, para evitar
modificações na superfície causadas pela umidade do ar. Para os experimentos com
cultura de células, os discos foram previamente esterilizados em calor seco a 180°C
em forno de Pasteur por 2 h. Dispositivos de Teflon em forma de argola, com
diâmetro interno de 9 mm e externo de 10 mm e 1 mm de altura, foram produzidos
pela Oficina de Precisão da PCARP-USP e, previamente à sua utilização, foram
lavados em ultrassom e autoclavados. Lamínulas de vidro bioinerte (Fisher
Scientific, EUA), utilizadas nos experimentos, foram também autoclavadas para os
experimentos com cultura de células.
47
4.2 Isolamento das células e cultura primária de células osteogênicas
Para a obtenção de células da linhagem osteoblástica, utilizou-se o modelo
experimental de cultura primária de calvárias de ratos recém-nascidos (BELLOWS et
al., 1986; NANCI et al., 1996; IRIE et al., 1998). Células osteogênicas foram obtidas
por meio de digestão enzimática sequencial, com solução de tripsina (Gibco,
Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) e colagenase tipo II (Gibco), de fragmentos de
calvárias de ratos Wistar recém-nascidos, com 2 a 4 dias de vida pós-natal (DE
OLIVEIRA et al., 2003). Foram utilizadas apenas células isoladas na 2ª e 3ª
digestão, de 15 e 25 minutos, respectivamente, já que aquelas obtidas na 1ª
digestão, de 5 minutos, não são capazes de desenvolver formações nodulares
mineralizadas (BELLOWS et al., 1986).
As células enzimaticamente isoladas, em suspensão, foram contadas em
hemocitômetro e plaqueadas na densidade de 2x104 células/poço sobre discos de
Biosilicato® e lamínulas em diferentes condições (descritas no item 4.3), em placas
de poliestireno de 24 poços (Corning Inc., Corning, NY, EUA). As células foram
cultivadas em meio essencial mínimo, modificação α (α-MEM; Gibco), suplementado
com 10% de soro fetal bovino (Gibco), 50 µg/mL de gentamicina (Gibco), 5 µg/mL de
ácido ascórbico (Gibco), 7 mM de β-glicerofosfato (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e
incubadas a 37°C em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 e 95% de ar
atmosférico. O meio de cultura foi trocado a cada 2-3 dias e a progressão da cultura,
avaliada por microscopia de fase em culturas crescidas sobre lamínulas de vidro
(transparentes), visto que discos de Biosilicato® são opalescentes e não permitem a
visualização de células por luz transmitida.
48
4.3 Grupos experimentais
Para avaliar os efeitos do condicionamento de superfície e dos produtos da
dissolução iônica do Biosilicato® sobre diferentes aspectos da osteogênese in vitro,
foram utilizadas estratégias que resultaram na definição dos seguintes grupos
experimentais:
a) Biosilicato, constituído de discos de Biosilicato®;
b) B+MS, em que discos de Biosilicato® foram condicionados por imersão em
1 mL de meio de cultura com suplementos por 3 dias, incluindo soro fetal bovino a
10%, previamente ao plaqueamento celular;
c) B+M, cujos discos de Biosilicato® foram condicionados por 3 dias por
imersão em 1 mL de meio de cultura com suplementos, mas destituído de soro fetal
bovino, previamente ao plaqueamento celular;
d) Lamínula, de lamínulas de vidro bioinerte (Fisher Scientific);
e) L+B, de lamínulas de vidro bioinerte (Fisher Scientific), expostas, durante o
cultivo celular, aos produtos de dissolução iônica de discos de Biosilicato®,
posicionados a 1 mm das lamínulas pela interposição de argolas de Teflon (Oficina
de Precisão, PCARP-USP);
f) L+MSc, em que células sobre lamínulas de vidro bioinerte (Fisher Scientific)
foram expostas, durante os três primeiros dias de cultura, ao meio utilizado para a
preparação do grupo B+MS.
49
4.4. Análise da dissolução dos elementos cálcio, fósforo e silício pelo método
de espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente
(ICP-OES)
A quantificação de cálcio, fósforo e silício nos meios de cultura utilizados para
condicionar as superfícies de Biosilicato® dos grupos B+MS e B+M foi realizada no
Centro de Caracterização e Desenvolvimento de Materiais (CCDM UFSCar/UNESP,
São Carlos, SP), utilizando ICP-OES (Vista, Varian Inc., Palo Alto, CA, EUA)
(MONTASER; GOLIGHTLY, 1992). Para calibração do ICP-OES, foram utilizadas
soluções analíticas preparadas de soluções estoque de 1000 mg/L de cálcio, fósforo
e silício em meio aquoso. Amostras de meio de cultura com suplementos, com ou
sem soro fetal bovino a 10%, foram utilizadas como controles. Os resultados foram
expressos em ppm.
4.5 Avaliação das respostas celulares
4.5.1 Análise da morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e
caracterização da topografia de superfície por microscopia de força atômica (MFA)
Aos 3 dias de cultura primária, a morfologia das células aderidas e espraiadas
foi avaliada por MEV. As células foram fixadas com solução de glutaraldeído a 5%
(Sigma) tamponada com cacodilato de sódio a 0,06 M, pH 7,2 (Sigma), desidratadas
em série crescente de alcoóis e secas a vácuo. As amostras foram avaliadas em
microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM-7400F (Jeol, Tóquio, Japão),
operado a 1-2 kV. No mesmo tempo experimental, a topografia das superfícies de
Biosilicato® e lamínula de vidro bioinerte foi caracterizada, qualitativa e
quantitativamente na escala nanométrica, por MFA em modo de contato intermitente
50
(JEOL JSPM-5200, Jeol, Tokyo, Japão), utilizando-se áreas de 5x5 e 1x1 µm.
Ambas as análises foram realizadas no Laboratory for the Study of Calcified Tissues
and Biomaterials, da Universidade de Montreal (Montreal, QC, Canadá). As imagens
digitalizadas foram processadas com o programa Adobe Photoshop (versão 7.0.1).
4.5.2 Imunolocalização de proteínas citoesqueléticas, da matriz extracelular e da
subunidade de integrina α5
Em 1, 3 e 7 dias, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% em
tampão fosfato a 0,1 M, pH 7,2 (PB), por 10 min à temperatura ambiente (TA), ou em
solução de acetona e metanol (1:1, Merck, Darmstadt, Alemanha) por 10 min a 4°C
(para integrina α5). Em seguida, foram processadas rotineiramente para
imunofluorescência indireta (DE OLIVEIRA; NANCI, 2004; SCHWARTZ FO et al.,
2007; DE OLIVEIRA et al., 2007). A permeabilização foi feita com solução de Triton
X-100 a 0,5% em PB por 10 min, seguida de bloqueio com leite desnatado a 5% em
PB por 30 min. Foram utilizados anticorpos primários para BSP (1:200, WVID1-9C5,
Developmental Studies Hybridoma Bank – DSHB, Iowa City, IA, EUA), fibronectina
(1:100, clone IST-3, Sigma), vinculina (1:400, clone hVIN-1, Sigma), vimentina
(1:100, clone V9, Dako Cytomation, Copenhagen, Dinamarca), tubulina (1:200,
Sigma) e para a subunidade de integrina α5 (1:1000, Chemicon-Millipore, Lawrence,
MA, EUA), seguidos de anticorpos secundários conjugados com fluoróforo Alexa
Fluor 594 (fluorescência vermelha; 1:200, Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) ou
Alexa Fluor 488 (fluorescência verde; 1:200, Molecular Probes). Eventualmente, foi
utilizada faloidina conjugada com Alexa Fluor 488 (fluorescência verde; 1:200,
Molecular Probes) para visualização do citoesqueleto de actina. Todas as
incubações dos anticorpos foram feitas em atmosfera úmida por 60 min à TA. Entre
51
cada incubação, as amostras foram lavadas três vezes (5 min cada) em PB. Antes
da montagem para observação microscópica, as amostras foram lavadas,
rapidamente, com água destilada e os núcleos celulares, marcados com 4',6-
diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI, Molecular Probes) a 300 nM por 5
min. Os discos foram montados diretamente em lâminas de vidros e, em seguida,
após montagem de lamínula de vidro Fisherbrand 12 mm (Fisher Scientific) com
meio de montagem anti-fade (Prolong Gold®, Molecular Probes) sobre as superfícies
contendo células, as amostras foram examinadas utilizando microscópio de
fluorescência Leica modelo DMLB (Leica, Bensheim, Alemanha) acoplado a uma
câmara digital Leica DC 300F. As imagens adquiridas foram processadas com o
programa Adobe Photoshop (versão 7.0.1).
4.5.3 Viabilidade, proliferação celular e número total de células
Nos tempos de 1, 3 e 7 dias, a viabilidade celular foi determinada,
quantitativamente, pelo ensaio colorimétrico MTT (Tretrazolium {brometo de [3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio]} (Sigma). O MTT é um sal de cor amarela que é
reduzido em cristais de formazan, de cor púrpura, por proteinases mitocondriais,
ativas apenas em células viáveis (MOSMANN, 1983). Para realização do
experimento, alíquotas de MTT a 5 mg/mL em solução salina tamponada (PBS,
phosphate buffered saline) foram preparadas, procedendo-se à incubação das
culturas primárias com essa solução a 10% em meio de cultura, por 4 h a 37°C, em
atmosfera úmida contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico. Após esse período,
as culturas foram lavadas com 1 mL de PBS aquecido. Em seguida, foi adicionado 1
mL de solução de isopropanol ácido (100 mL de isopropanol e 134 µL de HCl) em
cada poço sob agitação por 5 min., para a solubilização completa do precipitado
52
formado. Alíquotas de 100 µL foram retiradas dos poços e transferidas para placa de
96 poços para medida colorimétrica em espectrofotômetro (570–650 nm; µQuanti,
Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, EUA). Os dados foram expressos em
densidade óptica. Qualitativamente, a viabilidade celular foi avaliada, em 3 dias, pelo
kit comercial para determinação de viabilidade/citotoxicidade LIVE/DEAD®
Viability/Cytotoxicity for mammalian cells, de acordo com as instruções do fabricante
(Molecular Probes). Células viáveis foram marcadas com fluorescência verde, pela
reação da calceína com esterase intracelular, enquanto que células mortas,
evidenciadas por fluorescência vermelha, pela ligação do homodímero-1 de etídio a
ácidos nucléicos.
Em 3 dias, foi determinado o índice de proliferação celular pela
imunomarcação ao antígeno nuclear Ki-67, cuja expressão ocorre apenas em
células em atividade proliferativa (SCHOLZEN; GERDES, 2000). Células foram
fixadas em paraformaldeído a 4% em PB, por 10 min à TA. Em seguida, as células
foram processadas para imunofluorescência indireta, como descrito anteriormente.
Utilizou-se anticorpo primário anti-Ki-67 (1:70, Diagnostic BioSystems, Pleasanton,
CA, EUA), seguido de anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 594
(fluorescência vermelha; 1:200, Molecular Probes). Foram avaliadas, por
epifluorescência, 5 amostras de cada grupo, em objetiva de 20X, determinando-se a
proporção de células Ki-67 positivas presentes em 5 campos microscópicos por
amostra.
Aos 7 dias, foi realizada a contagem do número total de células por
hemocitômetro. O meio de cultura foi aspirado e os poços, lavados três vezes com
PBS a 37°C, para remoção de células não aderidas. Em seguida, os poços foram
preenchidos com solução de 1,5 mL de EDTA a 1 mM, 1,3 mg/mL de colagenase e
53
tripsina a 0,25% em PBS, para remoção das células aderidas. Essa etapa foi
monitorada pela observação em microscópio de fase invertido. Amostras da
suspensão de células em solução enzimática foram utilizadas para a contagem e os
resultados foram expressos como número total de células por poço.
4.5.4 Expressão de RNAm para marcadores da diferenciação osteoblástica
A análise da diferenciação osteoblástica por reação em cadeia da polimerase
em tempo real (Real-time PCR) foi realizadas utilizando-se o sistema TaqMan, no
aparelho ABI7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Após 7 dias de
cultivo celular, ao final da fase proliferativa e início da fase de diferenciação
osteoblástica, foi realizada a extração do RNA total através do kit SV Total RNA
Isolation System (Promega, Madison, WI, EUA), de acordo com as especificações do
fabricante. Em seguida, o RNA total foi quantificado em diferentes comprimentos de
onda (260, 280, 230 e 320 nm) e sua integridade, avaliada através de eletroforese
em gel de agarose desnaturante a 1,5% (m/v). Os tampões para a realização da
eletroforese foram preparados com água previamente tratada com
dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma). Para o preparo da água, foi adicionado 1 mL de
DEPC em 999 mL de água deionizada, sendo essa mistura incubada à TA por 24 h
e autoclavada por 40 min. O gel foi preparado dissolvendo-se 3 g de agarose
(Gibco) em 144 mL de água previamente tratada com DEPC. Em seguida, a mistura
foi aquecida e, então, foram adicionados 20 mL de tampão de corrida (10X) (50 mM
acetato de sódio, Merck; 5 mM EDTA, Merck; 100 mM de ácido 3-[N-
morfolino]propanosulfônico, MOPS, Sigma) e 36 mL de formaldeído a 12,3 M
(Merck). A mistura foi despejada em fôrmas adequadas para moldagem do gel.
54
Para o preparo das amostras, foram adicionados, para um volume final de
10µL: a) cerca de 4 µg de RNA total; b) 2 µL de tampão de corrida (5X); c) 3,5 µL de
formaldeído a 12,3 M; e, d) 10 µL de formamida (Merck). Essa mistura foi aquecida a
85°C por 10 min e, em seguida, submetida a resfriamento a 4°C. No momento de
aplicação das amostras no gel, foram adicionados 2 µL de brometo de etídeo (10
mg/mL, Sigma). A eletroforese foi conduzida a 40 V durante 2 h, utilizando-se
tampão de corrida (1X). Após esse período, o gel foi visualizado através de
iluminação com luz ultravioleta (UV) a 300 nm. A integridade do RNA foi verificada
pela visualização de duas subunidades ribossômicas características das células
eucarióticas (18S e 28S). Em seguida, foi confeccionada a fita de cDNA a partir de
1µg de RNA total. Esse procedimento foi realizado em termociclador Mastercycle
Gradient (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) por meio de reação com a enzima
transcriptase reversa, utilizando-se o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription
Kit (Applied Biosystems).
Para a reação de PCR em tempo real, foram utilizadas sondas TaqMan®
(Applied Biosystems), sendo as reações feitas em aparelho ABI7500 (Applied
Biosystems). As reações foram realizadas em triplicata, com volume final de 15 µL e
quantidade de cDNA correspondente a 12,5 ng do RNA inicial. A reação de
amplificação foi composta por: a) 50°C por 2 min; b) 95°C por 10 min e, c) 40 ciclos
a 95°C por 15 s e 60°C por 1 min (desnaturação e extensão). Os resultados foram
analisados com base no valor de Ct (cicle threshold ou ciclo limiar), sendo esse o
ponto correspondente ao número de ciclos em que a amplificação das amostras
atinge um limiar (determinado entre o nível de fluorescência dos controles negativos
e a fase de amplificação exponencial das amostras), permitindo a análise
quantitativa da expressão do fator avaliado. Foi analisada a expressão de RNAm
55
para os seguintes genes: fator de transcrição relacionado ao runt 2 (Runx2), ALP e
BSP. Como controle endógeno, foi utilizada a expressão de GADPH, gene
constitutivo. Os valores de Ct do controle endógeno foram aplicados para a
normalização dos níveis de expressão do gene alvo. Uma amostra negativa (água)
foi submetida à reação com cada par das sequências dos primers utilizados. O
método comparativo de 2-ddCt foi utilizado para comparar a expressão de RNAm das
culturas primárias crescidas sobre discos de Biosilicato® e lamínulas de vidro
bioinerte, nas diferentes condições experimentais.
4.5.5 Atividade de ALP
No período de 7 dias, foi realizado ensaio para visualização da atividade de
ALP in situ. O meio de cultura foi removido e os poços foram lavados com Solução
de Hank’s (Hank’s Balanced Salts,Sigma), 9,8 g/L e NaHCO3 Hybrimax® (Sigma),
350 mg/L), aquecida a 37ºC. Após esse procedimento foi incubado, em cada poço, 1
mL de solução tampão Tris (Sigma) a 120 mM, pH 8,4; contendo Fast red TR
(Sigma) a 1,8 mM, naftol-ASMX-fosfato (Sigma) a 0,9 mM e dimetilformamida
(Merck) 1:9, por 30 min em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 e 95% de ar
atmosférico. Após esse período, os poços foram lavados com solução de PB e os
núcleos celulares, marcados com DAPI, como descrito anteriormente. As
preparações foram visualizadas por microscopia de fluorescência, em epiluminação.
Para a quantificação da atividade de ALP, primeiramente determinou-se o
conteúdo de proteína total, usando o método de Lowry modificado (LOWRY et al.,
1951). Aos 10 dias de cultura primária sobre discos de Biosilicato®, as proteínas
foram extraídas inicialmente de cada poço por choque térmico, com 5 ciclos de
temperatura entre -20°C e 37°C por 3 h. Em seguida, foram misturadas com solução
56
de Lowry (Sigma), na proporção 1:1, por 20 min à TA. O extrato foi diluído em
reagente de fenol de Folin e Ciocalteau (Sigma) por 30 min à TA. A absorbância foi
avaliada a 680 nm utilizando espectrofotômetro (Cecil CE 3021, Cambridge, Reino
Unido). O conteúdo de proteína total foi calculado através de curva padrão
determinada a partir de albumina bovina e expresso em µg/mL. A atividade de ALP
foi, então, avaliada através da liberação de timolftaleína por hidrólise do substrato de
timolftaleína monofosfato, utilizando kit comercial, de acordo com as instruções do
fabricante (Labtest Diagnóstica, Belo Horizonte, MG, Brasil). Para isso foram
utilizados tubos de ensaio branco, padrão e testes. Em todos os tubos foram
adicionados 50 µL de substrato e 0,5 mL de tampão dietanolamina a 0,3 mmol/mL,
pH 10,1. No tubo padrão foram acrescentados 50 µL da solução padrão. Os tubos
foram mantidos a 37ºC por 2 min. Em seguida, foram adicionados, em cada tubo
teste, 50 µL do lisado de células dos mesmos poços utilizados para medida da
proteína total. Os tubos foram mantidos a 37ºC por 10 min. Após esse período,
foram adicionados em todos os tubos, branco, padrão e testes, 2 mL do reagente de
cor (Na2CO3 a 0,09 µmol/mL e NaOH a 0,25 µmol/mL) e, em seguida, a absorbância
foi medida em espectrofotômetro (Cecil), utilizando-se comprimento de onda de 590
nm. A atividade de ALP, em µmol de timolftaleína/h/mL, foi calculada a partir da
medida do tubo padrão e normalizada pelo conteúdo de proteína total.
4.5.6 Formação de matriz calcificada
Aos 14 dias, culturas primárias crescidas sobre discos de Biosilicato®, nas
diferentes condições experimentais, foram lavadas em solução de Hanks (Sigma),
fixadas em álcool etílico a 70% a 4ºC por 60 min e lavadas em PBS e água
destilada. Em seguida, foram coradas com vermelho de Alizarina (Sigma) a 2%, pH
57
4,2, à TA por 15 min, lavadas profusamente em água destilada, deixadas a secar, e
observadas por microscopia de fluorescência, em epiluminação. A proporção de
áreas marcadas com vermelho de Alizarina nas culturas primárias foi determinada a
partir das imagens macroscópicas das superfícies dos discos, obtidas digitalmente
com câmara de alta resolução (Canon EOS Digital Rebel, 6.3 megapixels, com lente
macro EF100 f/2.8) e processadas nos programas Adobe Photoshop e Image Tool
(UTHSC, San Antonio, TX, EUA) (DE OLIVEIRA et al., 2008).
4.6 Análise estatística
Para cada cultura primária (pelo menos 2 para cada análise), os experimentos
foram realizados em quintuplicata e os resultados quantitativos, submetidos ao teste
não-paramétrico de Kruskal-Wallis, para dados independentes e mais de duas
amostras (nível de significância: 5%). Quando apropriado, foi aplicado o pós-teste de
comparações múltiplas de Fischer, baseado em postos.
58
5 RESULTADOS
59
5 RESULTADOS
5.1 Análise da dissolução dos elementos cálcio, fósforo e silício por ICP-OES
A análise por ICP-OES revelou que o condicionamento do Biosilicato® por 3
dias em meio de cultura, na presença ou não de soro fetal bovino, promoveu
aumento expressivo da concentração de cálcio, respectivamente, da ordem de 240 e
210%, e de silício, de 3200 e 2100%. Não se detectaram alterações relevantes na
concentração de fósforo em ambos os condicionamentos (Tabela 1).
Tabela 1. Concentração (em ppm) dos elementos cálcio, fósforo e silício em meios de cultura
suplementados, com ou sem soro fetal bovino, utilizados para o condicionamento de discos de
Biosilicato® por 3 dias
Cálcio Fósforo Silício
Meio de cultura com soro 78 225 2,4
Meio de cultura com soro + Biosilicato® 188 231 77
Meio de cultura sem soro 70 238 3,5
Meio de cultura sem soro + Biosilicato® 150 233 73
5.2 Análise da morfologia celular por MEV e caracterização da topografia de
superfície por MFA
Aos 3 dias de cultura primária, as células estavam aderidas e espraiadas
sobre as superfícies planas de lamínulas de vidro, exibindo morfologia poligonal,
com projeções citoplasmáticas alongadas e contatos célula-célula (Figura 1, A e B).
Sobre as superfícies de Biosilicato®, as células apresentavam-se aderidas, com
morfologia poligonal ou fusiforme, mas menos espraiadas, interagindo com substrato
constituído de cavidades na submicroescala (Figura 1, C-H). Algumas células
exibiam acúmulos de formações arredondadas em sua superfície, com aspectos
semelhantes aos do substrato (Figura 1, E). Além disso, observou-se que células
60
espraiadas sobre as diferentes superfícies de Biosilicato® pareciam ocupar plano
inferior ao do substrato circunjacente (Figura 1, D-H).
Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura de culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de lamínula de vidro (A e B) e Biosilicato® (C-H), em diferentes condições, aos 3 dias. Nos grupos de Biosilicato®, as células estavam menos espraiadas e interagiam com substrato cuja topografia caracterizava-se pela presença de cavidades na submicroescala (detalhe em D e F). Notem-se em E (cabeças de seta), formações esféricas associadas à superfície celular, que ocorriam apenas nos grupos de Biosilicato®. Asteriscos em D, F e H indicam superfície celular adjacente ao substrato. Barras de escala: A, B, C, E e G = 10 µm; D, F e H = 1 µm; D e F (detalhe) = 0,5 µm.
61
A análise da topografia dos materiais por MFA revelou diferenças
estatisticamente significantes para os valores de rugosidade de superfícies de
lamínulas de vidro e Biosilicato® em áreas de 5x5 e 1x1 µm (p<0,05 e p<0,01,
respectivamente). Em ambas as análises, a rugosidade de lamínulas de vidro
(0,6±0,2 e 0,4±0,1 nm, respectivamente) era significativamente menor se comparada
às dos grupos de Biosilicato® (Figuras 2 e 3, e Tabela 2). Enquanto que os três
grupos de Biosilicato® apresentavam rugosidades semelhantes entre si em leituras
de 5x5 µm (Biosilicato = 110,1±19,5; B+MS = 114,6±10,6; B+M = 114±33,7, em nm),
a superfície B+MS exibia rugosidade na nanoescala (22,9±6,7) com valores
inferiores aos observados para os grupos Biosilicato (47±13,4) e B+M (39,1±8,1), em
análise de 1x1 µm (Figuras 2 e 3, e Tabela 2).
Figura 2. Rugosidade de superfície por MFA (áreas de 5x5 e 1x1 µm; média ± desvio padrão, em nm) de lamínulas de vidro e discos de Biosilicato®, em diferentes condições, após 3 dias de exposição às condições de cultura, em áreas destituídas de células.
62
Tabela 2. Análise comparativa (Pós-teste de Fischer) da
rugosidade de superfície, por MFA, de lamínulas de
vidro e discos de Biosilicato®, em diferentes condições
5x5 µ m 1x1 µ mBiosilicato x Lamínula 1% 0,1%Biosilicato x B+MS NS 0,1%Biosilicato x B+M NS NSLamínula x B+MS 1% 1%Lamínula x B+M 0,1% 0,1%B+MS x B+M NS 1%
ComparaçãoMFA
Figura 3. Topografia por MFA (A, C, E e G, 5x5 µm; B, D, F e H, 1x1 µm) de superfícies de lamínulas de vidro (A e B) e Biosilicato® (C-H), em diferentes condições, após 3 dias de cultivo celular, em áreas destituídas de células.
63
5.3 Imunolocalização de proteínas citoesqueléticas, da matriz extracelular e da
subunidade de integrina α5
No tempo de 1 dia, as células apresentavam-se aderidas e espraiadas sobre
todas as superfícies avaliadas, com expressiva redução em seu espraiamento sobre
as superfícies de Biosilicato® (Figura 4).
Sobre os grupos de lamínulas de vidro, o citoesqueleto de actina organizava-
se em feixes de fibras de estresse (stress fibers), distribuídos por todo o citoplasma,
estendendo-se aos limites celulares (Figura 4, A1-3). Células menos espraiadas
podiam ser observadas mais frequentemente nos grupos L+B e L+MSc. Sobre as
superfícies de Biosilicato®, as células apresentavam alteração no padrão de
marcação para faloidina, com redução expressiva das fibras de estresse, o que
dificultava a visualização dos limites celulares (Figura 4, compare A4-6 com A1-3).
Embora células aderidas às superfícies condicionadas de Biosilicato® também
apresentassem essa alteração, isso ocorria em menor intensidade, sendo possível
visualizar células com citoesqueleto de actina aparentemente inalterado (Figura 4,
A5 e 6).
Células cultivadas sobre lamínulas de vidro exibiam marcação para vinculina
predominantemente na região perinuclear e em pontos de adesão focal (Figura 4,
B1-3). Nos grupos de Biosilicato®, a ausência de marcação para vinculina ocorria em
células que apresentavam regiões citoplasmáticas destituídas de actina (Figura 4,
B4-6). Além disso, raramente se observava padrão compatível com o de adesões
focais. Notadamente, a expressão de vinculina era menor no grupo Biosilicato
quando comparada àquela observada nas células crescidas sobre as superfícies
condicionadas (Figura 4, compare B4 com B5 e 6).
64
No mesmo período, marcação para vimentina nos grupos de lamínula de vidro
revelava rede de filamentos citoplasmáticos mais densamente distribuída em região
perinuclear, estendendo-se à periferia das células, mas aquém dos limites celulares
(Figura 4, C1-3). Nas superfícies de Biosilicato®, as células, menos espraiadas,
exibiam vimentina predominantemente perinuclear. No entanto, com a ausência de
marcação por faloidina, não se notava também a expressão de vimentina (Figura 4,
C4-6).
A marcação para tubulina em superfícies de lamínula de vidro caracterizou-se
por arranjos complexos de filamentos densamente agrupados em região perinuclear,
estendendo-se a domínios periféricos do citoplasma, próximos à rede de actina
cortical (Figura 4, D1-3). Sobre as superfícies de Biosilicato®, a tubulina distribuía-se,
predominantemente, em região perinuclear (Figuras 4, D4-6).
65
Figura 4. Epifluorescência de culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de lamínula de vidro (1-3) e Biosilicato® (4-6), em diferentes condições, em 1 dia. Marcações em verde (A e D) e branco pálido (B e C) indicam citoesqueleto de actina e, em azul, núcleos celulares (A-D). Em vermelho, as proteínas citoesqueléticas vinculina (B), vimentina (C) e tubulina (D). Notem-se alterações no padrão de marcação das proteínas citoesqueléticas e menor espraiamento de células cultivadas nas três superfícies de Biosilicato® (4-6). Barra de escala para A-C = 50 µm e para D = 20 µm.
66
Apesar de, em 1 dia, terem sido observadas alterações no padrão de
marcação de proteínas citoesqueléticas em células sobre as superfícies de
Biosilicato®, a análise qualitativa de viabilidade celular em 3 dias, utilizando o kit
Live/Dead®, revelou que a maioria das células aderidas às superfícies de Biosilicato®
e de lamínulas de vidro era viável (Figura 5, A1-6), embora se observasse reduzida
densidade celular nos grupos L+B e L+MSc. Aos 3 dias, as células se distribuíam
mais uniformemente nas superfícies de lamínulas de vidro e Biosilicato®, apesar de
em algumas áreas iniciarem a formação de agregados celulares (Figura 5, B1-6).
Nos grupos de lamínulas de vidro (Figura 5, 1-3), as proteínas citoesqueléticas
actina (Figura 5, B e C), vimentina (Figura 5, B), tubulina (Figura 5, C) e vinculina
(Figura 5, D) mantinham o mesmo padrão descrito no dia 1, sendo mais evidente o
menor espraiamento e menor densidade celular nos grupos L+B e L+MSc (Figura 5).
Em todas as superfícies de Biosilicato®, a redução no espraiamento celular era ainda
mais evidente em 3 dias, o que estava diretamente relacionado à redução das
dimensões nucleares. Alterações no padrão de marcação de proteínas
citoesqueléticas eram mais evidentes no grupo Biosilicato se comparado aos grupos
B+MS e B+M. Enquanto que a marcação para actina mantinha-se semelhante ao
observado em 1 dia, com exceção para áreas de agregados celulares, em que se
notavam fibras de estresse, vimentina, tubulina e vinculina (Figura 5, B4-6, C4-6 e
D4-6, respectivamente) distribuíam-se perinuclearmente, com áreas circulares
semelhantes a formações vacuolares destituídas de marcação. Em culturas sobre
lamínulas de vidro, a integrina α5 colocalizava-se frequentemente com a fibronectina
extracelular (Figura 5, E1-3 e F1-3, respectivamente), mas não com a vinculina.
Sobre superfícies de Biosilicato®, a reduzida marcação para α5 relacionava-se à
redução da fibrilogênese de fibronectina (Figura 5, compare E1-3 com E4-6).
67
Figura 5. Epifluorescência de culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de lamínula de vidro (1-3) e Biosilicato® (4-6), em diferentes condições, em 3 dias. (A) Células viáveis exibem fluorescência verde, enquanto que células mortas, fluorescência vermelha (LIVE/DEAD®). (B e C) Duplas marcações (B) actina (em branco pálido)/vimentina (em vermelho) e (C) actina (em verde)/tubulina (em vermelho), em que se notam alterações citoesqueléticas em células sobre as superfícies de Biosilicato®, as quais exibem menor espraiamento. Nesses grupos, a distribuição de vimentina e tubulina era predominantemente perinuclear, com áreas circulares semelhantes a vacúolos, destituídas de marcação (C4 e C5, cabeça de seta). (D) Marcação para vinculina (em vermelho) ocorre, em células sobre lamínulas de vidro, em região perinuclear e em pontos de adesão focal, enquanto que em células sobre superfícies de Biosilicato®, concentra-se ao redor dos núcleos. Áreas circulares destituídas de marcação eram também visualizadas (D5 e D6, cabeça de seta). (E e F) Dupla marcação subunidade de integrina α5 (E, em vermelho)/fibronectina (F, em verde) evidencia padrões de marcação semelhantes, indicando colocalização. Sobre superfícies de Biosilicato®, a reduzida marcação para α5 associa-se à redução da fibrilogênese de fibronectina (E4-6 e F4-6). Em azul, núcleos celulares (B-F). Barra de escala para A e B = 50 µm; para C e D=20 µm e para E e F = 25 µm.
68
Aos 7 dias, ao final da fase proliferativa, as culturas sobre os diferentes
substratos exibiam confluência, com formações de multicamadas celulares. Nessas
áreas, observava-se marcação para BSP, predominantemente perinuclear, em
região compatível com complexo de Golgi, e em grânulos de secreção, distribuídos
por todo o citoplasma. Nas três superfícies de Biosilicato®, áreas de multicamadas
celulares, BSP positivas, eram mais extensas se comparadas àquelas observadas
em lamínulas de vidro, em que as marcações eram apenas ocasionais (Figura 6, A1-
6).
Macroscópica e microscopicamente, a atividade de ALP in situ era
substancialmente mais intensa nos substratos bioativos, em áreas de multicamadas
celulares, destacando-se nos grupos B+MS e B+M. Em lamínulas de vidro, foram
observadas áreas positivas para Fast red em menor quantidade e extensão, não
necessariamente associadas a formações de multicamadas (Figura 6, B1-6).
69
Figura 6. Epifluorescência de culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de lamínula de vidro (1-3) e Biosilicato® (4-6), em diferentes condições, em 7 dias. Fluorescência vermelha indica, em A, marcação para BSP, e em B, a atividade, in situ, de ALP (em detalhe, aspecto macroscópico). Notem-se áreas mais extensas imunomarcadas para BSP e com atividade de ALP em culturas sobre superfícies de Biosilicato®. Em azul, núcleos celulares. Barra de escala para A1-3 = 50 µm, para A4-6 e B1-6 = 100 µm e para detalhes em B1-6 = 2 mm.
70
5.4 Viabilidade, proliferação celular e número total de células
O ensaio colorimétrico MTT revelou diferenças significantes na viabilidade das
culturas crescidas sobre as diferentes superfícies avaliadas nos tempos de 1, 3 e 7
dias (p<0,01 para cada tempo; Figura 7 e Tabelas 3 e 4). Em 1 dia, foram
observados maiores valores de densidade óptica nos grupos B+MS, B+M e
Lamínula. Aos 3 dias, células crescidas sobre os grupos B+MS e Lamínula exibiam
maior viabilidade, seguidas pelas culturas sobre os demais grupos de Biosilicato®.
Aos 7 dias, grupos de Biosilicato® condicionado (B+MS e B+M) apresentaram
maiores valores de viabilidade celular, seguidos pelas superfícies controles de
Biosilicato® e Lamínula. Lamínulas expostas aos produtos de dissolução iônica do
Biosilicato® exibiam os menores valores de viabilidade celular ao final do 7° dia.
Figura 7. Viabilidade celular (média ± desvio padrão, em densidade óptica) de culturas osteogênicas crescidas sobre superfícies de lamínulas de vidro e Biosilicato®, em diferentes condições, determinada pelo ensaio colorimétrico MTT, em 1, 3 e 7 dias.
O ensaio de imunolocalização da proteína nuclear Ki-67 revelou que a maior
parte da população celular sobre superfícies de lamínulas de vidro encontrava-se em
71
proliferação (Figura 8, compare A com B). Nos grupos de Biosilicato®, células Ki-67
positivas eram mais frequentemente associadas a áreas de multicamadas celulares
(Figura 8, compare C com D). A determinação da proporção de células Ki-67
positivas mostrou diferenças estatisticamente significantes no índice de proliferação
dos diferentes grupos avaliados (p<0,01; Figura 9 e Tabelas 3 e 4). Foram
observados valores maiores de proliferação em células crescidas sobre Lamínula e
L+MSc aos 3 dias, embora fosse baixa a densidade celular nos campos
microscópicos observados no grupo L+MSc. Não houve diferença estatisticamente
significante entre a proporção de células Ki-67 positivas presentes nos três grupos
Biosilicato® e L+B.
Figura 8. Epifluorescência de culturas osteogênicas crescidas sobre superfície de lamínula de vidro (A e B) e Biosilicato® (C e D), aos 3 dias. Fluorescência vermelha indica células no ciclo celular, em atividade proliferativa (Ki-67 positivas). Em verde, citoesqueleto de actina e em azul, núcleos celulares. Note-se que, sobre a superfície de Biosilicato, a maioria das células Ki-67 positivas exibe também marcação pela faloidina. Barra = 100 µm.
72
Figura 9. Índice de proliferação celular (média ± desvio padrão) de culturas osteogênicas crescidas sobre lamínulas de vidro e superfícies de Biosilicato® (D-F) em diferentes condições, determinado pela proporção de células Ki-67 positivas em 3 dias.
Diferenças estatisticamente significantes foram observadas no número total
de células em 7 dias (p<0,01; Figura 10 e Tabelas 3 e 4), sendo maior para B+MS,
seguido de B+M e Biosilicato. Lamínulas de vidro exibiam os menores valores
(Lamínula = L+MSc > L+B).
Figura 10. Número total de células (média ± desvio padrão) de culturas osteogênicas sobre superfícies de lamínulas de vidro e Biosilicato®, em diferentes condições, em 7 dias.
73
Tabela 3. Valores de média ± desvio padrão e significância estatística encontrados nos ensaios
de viabilidade celular (MTT) em 1, 3 e 7 dias; índice de proliferação celular (% de Ki-67 positivas)
aos 3 dias e número total de células em 7 dias, em culturas osteogênicas sobre lamínulas de
vidro e Biosilicato®, em diferentes condições
% de Ki-67 positivas Número de células1 dia 3 dias 7 dias 3 dias 7 dias
Lamínula 0,08±0,01 0,16±0,01 0,15±0,03 86,33±4,81 11,06±3,98L+B 0,04±0,01 0,05±0 0,09±0,02 72,52±6,46 6,77±1,71L+MSc 0,05±0,01 0,09±0,02 0,09±0,03 76,44±13,34 9,42±2,6Biosilicato 0,05±0,01 0,08±0,01 0,16±0,02 63,96±9,39 14,1±2,95B+MS 0,08±0,01 0,16±0,01 0,23±0,04 66,83±13,27 20,4±3,85B+M 0,08±0,01 0,14±0 0,23±0,03 64,59±7,14 16,93±3,3Kruskal-Wallis p<0,01 p<0,01 p<0,01 p<0,01 p<0,01
GruposMTT
Tabela 4. Análise comparativa (Pós-teste de Fischer) da viabilidade celular (MTT) em 1, 3 e 7
dias; índice de proliferação celular (% de Ki-67 positivas) aos 3 dias e número total de células
em 7 dias, em culturas osteogênicas sobre lamínulas de vidro e Biosilicato®, em diferentes
condições
% de Ki-67 positivas Número de células1 dia 3 dias 7 dias 3 dias 7 dias
Biosilicato x L+B 5% NS 0,1% NS 0,1%Biosilicato x Lamínula 0,1% 0,1% NS 0,1% 1%Biosilicato x B+MS 0,1% 0,1% 0,1% NS 0,1%Biosilicato x L+MSc NS NS 0,1% 5% 0,1%Biosilicato x B+M 0,1% 1% 0,1% NS 5%L+B x Lamínula 0,1% 0,1% 0,1% 1% 0,1%L+B x B+MS 0,1% 0,1% 0,1% NS 0,1%L+B x L+MSc 1% 5% NS NS 1%L+B x B+M 0,1% 0,1% 0,1% NS 0,1%Lamínula x B+MS NS NS 0,1% 1% 0,1%Lamínula x L+MSc 0,1% 0,1% 0,1% NS NSLamínula x B+M NS 5% 0,1% 0,1% 0,1%B+MS x L+MSc 0,1% 0,1% 0,1% NS 0,1%B+MS x B+M NS 5% NS NS 5%L+MSc x B+M 0,1% 5% 0,1% 5% 0,1%
MTTComparação
74
5.5 Expressão de RNAm de marcadores da diferenciação osteoblástica
Em 7 dias, os ensaios de PCR em tempo real mostraram diferenças nos
níveis de expressão de Runx2, BSP e ALP (p<0,01 para cada marcador; Figura 11 e
Tabelas 5 e 6). Culturas crescidas sobre B+MS e B+M apresentaram os maiores
níveis de Runx2. Para os grupos de lamínulas de vidro, os maiores valores foram
observados em L+B e L+MSc. A expressão de BSP foi significativamente maior no
grupo B+M, seguido de B+MS. Não houve diferença estatisticamente significante
para a expressão de BSP em culturas sobre Biosilicato e Lamínula, enquanto que
L+B e L+MSc apresentaram os menores valores. A expressão de ALP foi maior em
culturas crescidas sobre B+MS e B+M, sendo os menores valores observados para
Biosilicato. Entre os grupos de lamínula de vidro, L+MS apresentava níveis
estatisticamente superiores a L+B e Lamínula.
Figura 11. Expressão relativa de RNAm (média ± desvio padrão) para os marcadores de diferenciação osteoblástica Runx2, BSP e ALP em culturas osteogênicas sobre superfícies de lamínula de vidro e Biosilicato®, em diferentes condições, aos 7 dias. Os valores foram normalizados pelo gene constitutivo GADPH e calibrados pelos valores obtidos para o grupo Lamínula.
75
5.6 Atividade de ALP
Em 10 dias, a atividade de ALP foi significativamente maior em culturas
osteogênicas sobre Biosilicato, quando comparado a B+MS e B+M (p<0,01; Figura
12 e Tabelas 5 e 6). Não foi possível avaliar a atividade de ALP nas culturas sobre
lamínulas de vidro, uma vez que estas se destacavam do substrato entre o 8º e o
10º dia.
Atividade de ALP
05
1015202530354045
Biosil icato B+MS B+M
Grupos Experimentais
µmol
de
tim
olft
aleí
na/h
/mg
Figura 12. Atividade de ALP (média ± desvio padrão, em µmol de timolftaleína/h/mg de proteína) em culturas osteogênicas sobre superfícies de Biosilicato®, em diferentes condições, em 10 dias.
5.7 Formação de matriz calcificada
Aos 14 dias, culturas osteogênicas sobre as superfícies de Biosilicato®
exibiam áreas fortemente coradas por vermelho de Alizarina, as quais eram mais
extensas no grupo B+MS. Áreas focais nos limites de alguns discos exibiam
coloração vermelha mais clara. A análise quantitativa revelou áreas
significativamente maiores de matriz calcificada para B+MS, não havendo diferenças
entre Biosilicato e B+M (p<0,01; Figuras 13 e 14 e Tabelas 5 e 6).
76
Mineralização
0
10
20
30
40
50
60
70
Biosilicato B+MS B+M
Grupos Experimentais
% d
e m
atri
z m
iner
aliz
ada
Figura 13. Formação de matriz calcificada (média ± desvio padrão) em culturas osteogênicas sobre superfícies de Biosilicato®, em diferentes condições, em 14 dias.
Figura 14. Aspectos macroscópicos de culturas osteogênicas sobre superfícies de Biosilicato®, em diferentes condições, coradas por Fast red, em 10 dias (A, C e E), e por vermelho de Alizarina, em 14 dias (B, D e F). Enquanto que a atividade de ALP foi maior sobre Biosilicato em 10 dias, áreas mais extensas de matriz calcificada (escuras) foram observadas no grupo B+MS. Barra de escala = 3 mm.
77
Tabela 5. Expressão relativa de RNAm (média ± desvio padrão) para Runx2, BSP e ALP aos 7
dias; atividade de ALP aos 10 dias e mineralização aos 14 dias em culturas osteogênicas
crescidas sobre superfícies de lamínula de vidro e Biosilicato®, nas diferentes condições
Atividade de ALP MineralizaçãoRunx2 BSP ALP 10 dias 14 dias
Lamínula 1,0±0,06 1±0,06 1±0,07 - -L+B 1,21±0,15 0,52±0,02 1,02±0,06 - -L+MSc 1,33±0,04 0,3±0,02 1,17±0,09 - -Biosilicato 1,77±0,17 0,95±0,07 0,62±0,01 34,18±7,99 51,93±5,31B+MS 2,7±0,08 2,41±0,15 2,3±0,03 26,82±7,8 59,84±3,49B+MS 2,86±0,14 6,57±0,16 2,57±0,03 24,9±7,67 45,85±7,19Kruskal-Wallis p<0,01 p<0,01 p<0,01 p<0,01 p<0,01
GruposRNAm em 7 dias
Tabela 6. Análise comparativa (Pós-teste de Fischer) da expressão relativa de Runx2, BSP e
ALP aos 7 dias; atividade de ALP aos 10 dias e mineralização aos 14 dias em culturas
osteogênicas crescidas sobre lamínulas de vidro e Biosilicato®, nas diferentes condições
Atividade de ALP MineralizaçãoRunx2 BSP ALP 10 dias 14 dias
Biosilicato x L+B 1% 1% 1% - -Biosilicato x Lamínula 0,1% NS 1% - -Biosilicato x B+MS 5% 0,1% 0,1% 1% 5%Biosilicato x L+MSc 5% 0,1% 0,1% - -Biosilicato x B+M 1% 0,1% 0,1% 0,1% NSL+B x Lamínula 5% 0,1% NS - -L+B x B+MS 0,1% 0,1% 0,1% - -L+B x L+MSc NS 5% 1% - -L+B x B+M 0,1% 0,1% 0,1% - -Lamínula x B+MS 0,1% 1% 0,1% - -Lamínula x L+MSc 0,1% 1% 1% - -Lamínula x B+M 0,1% 0,1% 0,1% - -B+MS x L+MSc 0,1% 0,1% 5% - -B+MS x B+M NS 5% 5% NS 1%L+MSc x B+M 0,1% 0,1% 0,1% - -
ComparaçãoRNAm em 7 dias
78
6 DISCUSSÃO
79
6 DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo mostraram que o pré tratamento de
superfícies de Biosilicato® por 3 dias com meio de cultura, na presença ou não de
soro fetal bovino, afeta eventos iniciais de interação célula-substrato de culturas
osteogênicas, aumentando a viabilidade, a proliferação e a população celular nos 7
primeiros dias, com maior expressão de Runx2, BSP e ALP. Áreas mais extensas de
matriz calcificada foram observadas em superfícies de Biosilicato® condicionadas em
meio com soro. Além disso, células sobre Biosilicato® exibiam menor espraiamento e
alterações no padrão de marcação de proteínas citoesqueléticas, quando
comparadas àquelas sobre lamínulas de vidro. A presença dos produtos de
dissolução iônica do Biosilicato® reduziu significativamente a viabilidade e o número
total de células aderidas a lamínulas de vidro, embora tenha promovido maior
expressão de Runx2 nessas células.
Em Medicina Regenerativa, o desenvolvimento de vitrocerâmicas a partir de
composições de vidros bioativos fundamenta-se na necessidade de se produzirem
arcabouços (scaffolds) capazes de preencher defeitos ósseos, proporcionando não
apenas propriedades mecânicas adequadas, mas também bioatividade, com a
indução à diferenciação osteogênica e interação química com a matriz extracelular
(HENCH, 1991). Apesar de estudo anterior comprovar a alta bioatividade do
Biosilicato® e sua capacidade de promover o aumento de áreas de matriz
mineralizada in vitro quando comparado a vidros bioativos, incluindo Bioglass® 45S5
(MOURA et al., 2007), torna-se necessário compreender os efeitos da interação da
superfície desses materiais com fluidos biológicos contendo proteínas e o impacto
que esse fenômeno exerce sobre a neoformação tecidual na região interfacial. De
80
fato, estratégias de condicionamento/tratamento de superfícies bioativas, assim
como de disponibilização de proteínas ou peptídios bioativos, têm sido exploradas
experimentalmente com o objetivo de se estimular a resposta celular nos processos
de reparo tecidual quando esses materiais são implantados no organismo (EL-
GHANNAN et al., 1995; EL-GHANNAM; DUCHEYNE; SHAPIRO, 1997; GARCÍA;
DUCHEYNE; BOETTIGER, 1998; MORTIN; SHELTON, 2003). No presente estudo,
utilizou-se o pré tratamento de superfície de Biosilicato® com meio de cultura por 3
dias com base nas observações de Moura et al. (2007), indicando que após 72
horas em condições de cultura sem células, com RÁrea/Volume igual a 1 cm-1, ocorria a
formação de camada superficial de fosfato de cálcio amorfo (estágio 4 das reações
de superfície; HENCH, 1991). Com isso, nos grupos B+MS e B+M, as células, no
momento do plaqueamento, interagiam com superfícies de Biosilicato® com
características químicas e topográficas que diferiam daquelas encontradas no
controle (MOURA et al., 2007). De fato, demonstrou-se por MEV e MFA que o grupo
Biosilicato exibia, após 3 dias de cultivo celular, superfície com topografia
caracterizada por rede de cavidades na submicro e nanoescala. Além disso, o
tratamento prévio do Biosilicato® por 3 dias reduzia substancialmente a exposição
das células aos produtos de dissolução iônica gerados pelas reações de superfície.
Os meios de cultura utilizados para condicionamento apresentavam níveis elevados
de silício e cálcio, detectados por ICP-OES, sendo aqueles suplementados com
soro, avaliados em relação aos seus efeitos sobre o crescimento e a diferenciação
celular sobre superfícies bioinertes, de lamínulas de vidro.
No modelo de cultura primária de células osteogênicas derivadas de calvária
de ratos, a digestão enzimática sequencial de fragmentos de osso imaturo promove
o isolamento de população celular heterogênea constituída de células
81
osteoprogenitoras, pré-osteoblastos, osteoblastos diferenciados, osteócitos e
fibroblastos (BELLOWS et al., 1986; AUBIN, 1998; NANCI et al., 1996; DE
OLIVEIRA et al., 2003). Em condições osteogênicas padrão, desenvolvem-se, in
vitro, formações nodulares que se assemelham a aspectos do tecido ósseo imaturo,
e que resultam da expansão clonal de células osteoprogenitoras e de seu processo
de diferenciação osteoblástica (NANCI et al., 1996; BELLOWS et al., 1986;
BELLOWS; AUBIN, 1989; STEIN; LIAN, 1993). Durante esse processo, formam-se
estruturas tridimensionais de multicamadas celulares, as quais estão relacionadas
ao início da diferenciação osteoblástica in vitro, ao final da fase proliferativa, por
volta de 7 dias; nessa fase, observa-se a expressão do fator de transcrição Runx2
(MARIE, 2008; PERINPANAYAGAM et al., 2005), da proteína matricelular BSP
(BECK, 2003; HUNTER; GOLDBERG, 1993) e da enzima ALP (STEIN; LIAN, 1993),
razão pela qual são utilizados frequentemente como marcadores osteoblásticos. A
expressão do fenótipo osteogênico in vitro pode ser influenciada por: 1) taxa de
adesão e proliferação das células osteogênicas, incluindo as osteoprogenitoras, 2)
proporção de osteoblastos ativos e seu tempo de vida (JILKA et al., 1998; JILKA et
al., 1999) e 3) nível de atividade osteoblástica.
Neste trabalho, os tratamentos de superfícies de Biosilicato® promoveram
aumento da viabilidade celular e do número total de células, associado ao de
expressão de marcadores da diferenciação osteoblástica, se comparados à
superfície não tratada. Isso se deve, provavelmente, ao fato de as células dos
grupos B+MS e B+M interagirem, nos momentos iniciais, com superfícies menos
reativas/mais estáveis do material bioativo (camada de fosfato de cálcio amorfo),
proporcionando ambiente mais adequado aos processos de adesão, proliferação e
diferenciação celulares (EL-GHANNAM; DUCHEYNE; SHAPIRO, 1997; MORTIN;
82
SHELTON, 2003). De fato, em culturas sobre lamínulas de vidro expostas aos
produtos de dissolução iônica do Biosilicato® (grupos L+B e L+MSc), observou-se
redução significativa da viabilidade celular, embora as células viáveis aos 7 dias
exibissem maior expressão de Runx2 se comparada ao controle (grupo Lamínula).
Concentrações elevadas de silício e cálcio, como as observadas nos meios
utilizados para condicionamento, podem afetar a viabilidade de células em cultura
(CHRISTODOULOU et al., 2005), embora se atribuam a esses elementos, efeitos
relevantes sobre proliferação e diferenciação celulares (MATSUOKA et al., 1999;
TSIGKOU et al., 2009; XYNOS et al., 2000a; 2000b).
Análises morfológicas por MEV e microscopia de fluorescência mostraram
que as células estavam menos espraiadas sobre as superfícies de Biosilicato®, se
comparadas às de lamínula de vidro, o que tem sido relacionado, para a linhagem
osteoblástica, a um maior grau de diferenciação celular (HENCH et al., 2000;
XYNOS et al., 2000b). Apesar de a redução do espraiamento ser descrita em células
crescidas sobre substratos vítreos bioativos, devido provavelmente à sua alta
energia de superfície (MORTIN; SHELTON, 2003), não se pode excluir a
possibilidade de aspectos topográficos na submicro e nanoescala das superfícies de
Biosilicato® terem contribuído para a ocorrência desse fenômeno (JAGER et al.,
2007; SHWARTZ FO et al., 2007). Além disso, como se observaram células menos
espraiadas nos grupos L+B e L+MSc, a presença dos produtos de dissolução iônica
devem também exercer algum papel nesse processo.
A avaliação por epifluorescência revelou alteração nos padrões de marcação
das proteínas citoesqueléticas actina, vinculina, vimentina e tubulina, da subunidade
de integrina α5 e de fibronectina nos grupos com superfícies de Biosilicato®,
bioativas. Em trabalho anterior, Moura et al. (2007) relataram redução expressiva da
83
marcação para actina em células osteogênicas sobre vidros bioativos e Biosilicato®
nos primeiros dias de cultura, a qual estava associada a alterações na montagem da
fibronectina extracelular, e que a reorganização da actina em fibras de estresse
ocorria em áreas de formação de multicamadas celulares. No presente estudo, a
estratégia de condicionar as superfícies com meio de cultura previamente ao
plaqueamento celular não impediu que essas alterações ocorressem, apesar de
observadas em menor freqüência e intensidade. A análise por MEV revelou que
parte dessas alterações poderia ser atribuída à ocorrência de formações globulares
sobre as células, as quais se assemelhavam às características da superfície do
material, e que possivelmente impediam a visualização das marcações em áreas
focais. Ao que parece, as alterações citoesqueléticas estão relacionadas ao contato
direto das células com o substrato bioativo e não aos seus produtos de dissolução,
uma vez que células dos grupos L+B e L+MSc e aquelas em multicamadas sobre
Biosilicato®, que interagem entre si e não diretamente com o substrato,
apresentavam os aspectos usuais de marcação para as proteínas avaliadas.
Estudos posteriores deverão verificar se as alterações citoesqueléticas estão
associadas com modificações nos níveis de expressão de RNAm e de proteínas.
Apesar de os 3 grupos de Biosilicato® terem exibido expressiva formação de
matriz calcificada em 14 dias, o que está relacionado à sua alta bioatividade, áreas
maiores foram observadas para o grupo tratado com meio de cultura contendo
proteínas do soro (B+MS). Nesse grupo, a adsorção de proteínas durante os 3 dias
de condicionamento possivelmente afetou as interações célula-substrato nos
momentos iniciais da cultura (GARCÍA; DUCHEYNE; BOETTIGER, 1998), sendo
que para os demais grupos isso ocorreu mais tardiamente. Para o grupo B+MS, a
adsorção prévia de proteínas deve ter contribuído para o desenvolvimento de
84
topografia de dimensões menores na nanoescala, maior viabilidade celular aos 3
dias, assim como maior número de células ao final da fase proliferativa, os quais
poderiam justificar a ocorrência de áreas mais extensas de matriz calcificada. Com
efeito, pequenas diferenças em topografias na nanoescala podem afetar parâmetros
de diferentes tipos celulares, incluindo o fenótipo osteoblástico (OH et al., 2009;
MILNER; SIEDLECKI, 2007; KUNZLER et al., 2007; NGUYEN et al., 2007). No
entanto, não houve correlação, nos tempos avaliados, entre os níveis de expressão
de RNAm dos marcadores osteoblásticos utilizados e de atividade de ALP e a
quantidade de matriz calcificada dos grupos de Biosilicato®. No caso da ALP,
trabalhos recentes têm demonstrado não haver uma relação direta entre níveis de
atividade dessa enzima e a quantidade de matriz óssea-símile in vitro (HOEMANN;
EL-GABALAWY; MCKEE, 2008; DE OLIVA et al., 2009). Além disso, há evidências
de que a expressão de BSP é variável em osteoblastos diferenciados (LIU;
MALAVAL; AUBIN, 1997). Esses aspectos justificam a busca de pesquisadores por
novas moléculas que desempenhem papel fundamental durante a sequência de
diferenciação osteoblástica e cujos níveis estejam diretamente relacionados à
formação óssea (MOFFATT et al. 2008; MOFFATT; THOMAS, 2009).
Os resultados do presente estudo reforçam a necessidade de se
desenvolverem tratamentos prévios de superfícies de vidros e vitrocerâmicas
bioativos com soluções contendo ou não proteínas como estratégia importante para
se promoverem respostas biológicas ainda mais satisfatórias.
85
7 CONCLUSÃO
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7 CONCLUSÃO
Com base nos resultados deste estudo, pode-se concluir que:
• O condicionamento de superfícies de Biosilicato® por 3 dias com meio de
cultura, adicionado ou não de soro, resulta em aumento de sua bioatividade,
favorecendo a adesão, viabilidade e proliferação celular e expressão de
marcadores da diferenciação osteoblástica, observando-se áreas mais
extensas de matriz mineralizada para o grupo B+MS.
• A presença dos produtos de dissolução iônica do Biosilicato®, com níveis
elevados de silício e cálcio, reduz significativamente a proliferação e
viabilidade celulares, mas aumenta o potencial osteogênico de culturas sobre
lamínulas de vidro bioinerte.
• As alterações no padrão de marcação de proteínas do citoesqueleto, da
subunidade de integrina α5 e da proteína matricelular fibronectina ocorre em
períodos iniciais das culturas sobre superfícies de Biosilicato® e estão
provavelmente relacionadas ao contato direto das células com o substrato
bioativo.
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8 REFERÊNCIAS
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8 REFERÊNCIAS
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