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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
JOSÉ GUSTAVO PADRÃO TAVARES
UTILIZAÇÃO DO MÉTODO DE PERFUSÃO DE LANGENDORFF DE CIRCUITO FECHADO NO ESTUDO DOS MECANISMOS CARDIOPROTETORES EM RATOS:
PARTICIPAÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO E PURINAS
Mogi das Cruzes – SP2009
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
JOSÉ GUSTAVO PADRÃO TAVARES
UTILIZAÇÃO DO MÉTODO DE PERFUSÃO DE LANGENDORFF DE CIRCUITO FECHADO NO ESTUDO DOS MECANISMOS CARDIOPROTETORES EM RATOS:
PARTICIPAÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO E PURINAS
Orientador: Prof. Dr. Carlos Marcelo Gurjão de Godoy
Mogi das Cruzes – SP2009
Dissertação apresentada à Comissão Pós-Graduação em Engenharia Biomédica da Universidade de Mogi das Cruzes, para obtenção do Título de Mestre em Engenharia Biomédica.
DEDICATÓRIA
.
Dedico este trabalho aos meus filhos Miguel e Thiago,
a distância, a saudade e a falta de vocês me fizeram amá-los ainda mais...
filhos, espero que um dia compreendam a ausência do PAPAI...
AGRADECIMENTOS
À DEUS, agradeço principalmente pela minha saúde física e psicológica, e por me ajudar
a ter paciência e suportar a saudade de meus familiares.
É incrível como o ser humano pode ser, e é cooperativo. Desta forma, este trabalho não
poderia ter resultado sem o auxílio de muitas pessoas, as quais agradeço com todo carinho:
Aos meus pais Edson e Cleuza, pelo investimento e apoio incondicional à minha
formação acadêmica. Pelos seus exemplos de determinação, perseverança, trabalho e honestidade
e por suas sábias lições de esperança que me infundiram a confiança necessária para transpor
obstáculos e prosseguir sempre. Aos meus irmãos pelo incentivo, cooperação e apoio e à Claudia,
pela paciência e compreensão, principalmente no primeiro ano de desenvolvimento deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Carlos Marcelo Gurjão de Godoy, que se mostrou um verdadeiro mestre ao
me orientar. A possibilidade de aprender com sua dedicação, ética e cumplicidade é
enobrecedora. Depois de tantos, é de “coração” que lhe agradeço, pela oportunidade, pela
confiança, pela compreensão e paciência. Levarei seus ensinamentos para minha vida pessoal e
profissional.
Sou muito grato ao admirável Prof. Dr. Afonso Caricati Neto, pela sua co-orientação,
suas observações foram providenciais para condução e conclusão deste trabalho, Além de ter sido
uma honra e um prazer imenso conviver com um exemplo de pesquisador.
Agradeço de forma especial ao Sérgio Gomes da Silva, pois através dele tomei
conhecimento desta Pós-Graduação e também a Beatriz Jordão, João Viannei e Pedro Braga,
principais companheiros de laboratório.
Aos meus colegas de Laboratório, Enio Vasques, Tatiana Boletini, Ivan Vivas, Marília
Ferreira e demais colegas, Kleber Magalhães, Frederico Vasconcelos, Juliana Miranda,
Leandro Suzuki, Maria Carolina, Douglas Moreira, Paulo Gomes, Adriessa dos Santos,
Fabiane Silva, Terezinha Lorena enfim a todos os colegas e companheiros da Pós-Graduação,
que colaboraram direta ou indiretamente para realização desta dissertação.
Sou muito grato à:
Coordenação do Curso de Pós-Graduação;
Fundação de Amparo ao Ensino e Pesquisa - FAEP;
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES , pelo financiamento de minha formação, com a bolsa de Mestrado.
... A cada um de vocês, o meu reconhecido agradecimento por suas presenças afetivas nos
distintos momentos de elaboração e condução deste estudo, tornando-os todos autores deste
trabalho... A TODOS VOCÊS... MUITO OBRIGADO!
EPÍGRAFE
''A mente que se abre a uma nova idéia jamais volta ao seu tamanho original''
(Albert Einstein)
“A morte do homem começano instante em que ele desiste de aprender".
(Albino Teixeira)
RESUMO
Tendo em vista que a adenosina e o Óxido Nítrico (NO) participam na regulação da resposta funcional cardíaca e que estão envolvidos na cardioproteção, propusemos neste trabalho avaliar o possível envolvimento dessas substâncias na queda dos parâmetros cardíacos de coração isolado em montagem de Langendorff em circuito fechado com baixo volume circulante (100ml). Para isso, caracterizamos o papel de agonistas e antagonistas dos receptores destas substâncias etambém os efeitos da estimulação elétrica transmural (EET) sobre a resposta dos coraçõesisolados e perfundidos continuamente com solução nutriente não renovável. Foi caracterizado ainda o efeito do perfusato, obtido do coração perfundido continuamente com solução nutriente não renovável, sobre a atividade elétrica de átrios isolados. Para isso, realizamos as seguintes abordagens: 1ª) Avaliamos o efeito de fármacos envolvidos no metabolismo do óxido nítrico e da adenosina. 2ª) Foi usada a “EET”, por campo elétrico, para testar a possibilidade de reversão da queda dos parâmetros cardíacos. 3ª) Foram banhados átrios direito isolados com solução anteriormente usada para perfundir corações isolados em circuito fechado com 100 ml. Nas duas primeiras abordagens foram quantificados três parâmetros fisiológicos do coração: freqüência cardíaca, pressão ventricular esquerda e fluxo da perfusão cardíaca. Na 3ª abordagem foi quantificada a frequência atrial e testada a inducibilidade de arritmia. Os resultados deste estudo mostram que: (1) É possível reverter parcialmente a resposta funcional do coração, até dez minutos após a parada cardíaca, através da renovação da solução de perfusão com uso da “EET”; (2) Apenas a “EET” não é suficiente para manter a resposta funcional de corações isolados em CF e com baixo volume circulante (100 ml); (3) O aumento do NO no tecido melhora significativamente a resposta funcional de corações isolados em CF e com baixo volume circulante (100 ml), enquanto que sua diminuição melhora somente parcialmente a funcionalidade cardíaca; (4) A adenosina exerce pouca melhora sobre a resposta funcional de corações isolados nestas condições e; (5) A reutilização da solução de K-H para banhar átrios isolados não interfere significativamente na frequência dos mesmos, porém a reutilização desta solução dificulta a indução de arritmias por eletroestimulação. Concluímos que o NO e a adenosina pode desempenhar um papel importante na funcionalidade cardíaca e na cardioproteção, por atenuar a perda da resposta funcional no coração.
Palavras-chave: Preparação de Langendorff, Coração Isolado, Cardioproteção, Óxido Nítrico, Adenosina.
ABSTRACT
It has been showed, in low perfusate volume Closed Circulation (Langendorff preparation of rat hearts), that the depression of cardiac parameters were importantly mediated by substances released by the own heart in the perfusate. These substances were correlated to the intrinsic cardiac autonomic nervous system. In the present study we proposed to evaluate the participation of other important substances to the cardiac function, such as Nitric Oxide (NO) and adenosine, in the same Langendorff preparation (low perfusate volume, 100 ml; Closed Circulation System). Taking this into account, some approaches have been carried out: 1st) Evaluation of drugs involved with the metabolism of NO and Adenosine; 2nd) attempts of cardiac functionality decaying reversion by transmural electric stimulation (TES) and 3rd) Effect evaluation of bath solution taken from a heart perfused in Closed Circulation (100 ml) in isolated right atria. As for the two first approaches, three physiological parameters of the heart were quantified: cardiac frequency, left ventricular pressure and cardiac perfusion flow. In the third approach we quantified right atria frequency and arrhythmia inducibility. The results show that: (1) It is possible to partially revert cardiac depressing functionality by renewing perfusate while using 10 min of cardiac arrest by TES. However, TES alone is not enough to prevent decays of cardiac parameters; (2) Adding L-arginine and Sodium Nitroprusside (NO substrate and NO-donating, respectively) to the perfusate significantly improves cardiac parameters in Closed Circulation with 100 ml, whereas adding NO synthase inhibitor (L-NAME) enhanced the life-time of cardiac functionality. (3) Adenosine seems to exert a minor influence on the cardiac functionality in Closed Circulation. (4) The frequency of isolated right atrium is not altered during perfusion with solution taken from isolated heart in Closed Circulation (100 ml), whereas induction of atrial arrhythmias by TES is difficult in this condition. We concluded that NO and adenosine plays an important role on cardiac functionality and cardioprotection by attenuating the loss of cardiac functional response.
Keywords: Langendorff Preparation; Isolated Heart, Cardioprotection, Nitric Oxide, Adenosine.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Gráfico ilustrando o efeito do tempo sobre: (A) Frequência Cardíaca média (FC); (B) Pressão Ventricular Esquerda média (PVE) e (C) Fluxo da Perfusão (FP) médio nos seguintes grupos: “Circuito Aberto” (N=5), “Fechado 100 ml” (N=5), “Atropina” (N=5), “Fisostigmina” (N=5), “Carbacol” (N=5) e (D) variação da concentração de glicose na solução de perfusão ao longo do tempo de experimento........................................................................................... 23
Figura 2 Representação ilustrativa da enzima NOS....................................................................................................................... 32
Figura 3 Representação da reação de síntese de NO à partir da L-arginina. Inicialmente, ocorre a hidroxilação da L-arginina a L-hidroxiarginina, seguida de oxidação da L-hidroxiarginina formando L-citrulina e NO................................................. 33
Figura 4 Representação esquemática da produção e dos efeitos do óxido nítrico durante o relaxamento vascular.......................................................................................... 41
Figura 5 Representação esquemática do mecanismo de ação do Óxido Nítrico na célula muscular cardíaca.................................................................................................. 46
Figura 6 Estrutura química básica da purina e de seus derivados: adenina, guanina e adenosina............................................................................................................... 48
Figura 7 Esquema representativo do metabolismo da adenosina........................................ 51
Figura 8 Ilustração da montagem de Langendorff completa em circuito aberto..................................................................................................................... 60
Figura 9 Ilustração da montagem experimental de Langendorff de circulação fechada..... 63
Figura 10 Gráfico de calibração do transdutor de pressão utilizado na preparação de Langendorff........................................................................................................... 64
Figura 11 Foto ilustrando a montagem experimental utilizada para preparações com átrio isolado................................................................................................................... 66
Figura 12 Registros A – ECG (amplificado 10.000x) e, B – da pressão ventricular (amplificado 10x) de coração de rato isolado em montagem de Langendorff. IE representa o intervalo espontâneo entre picos do ECG......................................... 68
Figura 13 Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da Freqüência Cardíaca (A), da Pressão Ventricular Esquerda (B) e do Fluxo da Perfusão (C) no grupo Troca de circuito pós-parada cardíaca + “EET” (N = 10) ao longo do tempo de experimento........................................................................................................... 75
Figura 14 Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da Freqüência Cardíaca (A), da Pressão Ventricular Esquerda (B) e do Fluxo da Perfusão (C) no grupo“Fechado +"EET” pré-parada cardíaca” (N = 5) ao longo do tempo de experimento........................................................................................................... 76
Figura 15 Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da freqüência de átrios e corações isolados (N = 8), ao longo do tempo de experimento............................ 78
Figura 16 Gráfico ilustrando a Amplitude do Pulso (expressa em múltiplos inteiros do limiar atrial, LA) necessário para a indução de arritmias nos grupos “controle” e “troca de solução”. Valores expressos como média e erro padrão (N = 4)........ 79
Figura 17 Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da (A) Freqüência Cardíaca, (B) Pressão Ventricular Esquerda e (C) Fluxo da Perfusão nos grupos “Controle Aberto” (N = 5), “Controle fechado” (N = 5), “Nitroprussiato de Sódio”(N = 5), “L-arginina” (N = 4) e “L-NAME”(N = 4), ao longo do tempo de experimento......................................................................................................
82
Figura 18 Gráfico ilustrando a média (erro padrão) da (A) Freqüência Cardíaca, (B) Pressão Ventricular Esquerda e (C) Fluxo da Perfusão nos grupos “Controle Aberto” (N = 5), “Controle fechado” (N = 5), “Teofilina: 10-6 (N = 3); 10-5 (N = 3); 5X10-6” (N = 3) e “Adenosina: 10-4 (N = 4) e 10-5 (N = 4), ao longo do tempo de experimento...........................................................................................
84
Figura 19 Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da Resistência ao Fluxo nos grupos “C. Aberto” (N = 5), “C. Fechado” (N=5), “Nitroprussiato de Sódio”(N = 5), “L-arginina” (N = 4) e L-NAME (N=4) ao longo do tempo experimento.........................................................................................................
85Figura 20 Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da Resistência ao Fluxo nos
grupos “C. Aberto” (N = 5), “C. Fechado” (N=5), e “Teofilina” em diferentes concentrações (N = 9), ao longo do tempo experimento......................................
86Figura 21 Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da Resistência ao Fluxo nos
grupos “C. Aberto” (N = 5), “C. Fechado” (N=5), e “Adenosina” em diferentes concentrações (N = 9), ao longo do tempo experimento...................... 87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Freqüência cardíaca média (bpm) (com erro padrão) nos diferentes grupos durante o tempo experimental (min)....................................................................... 116
Tabela 2 Pressão ventricular esquerda média (mmHg) (com erro padrão) nos diferentes grupos durante o tempo experimental (min)........................................................... 116
Tabela 3 Fluxo médio (ml/min) (com erro padrão) nos diferentes grupos durante o tempo experimental (min).................................................................................................. 117
Tabela 4 Freqüência cardíaca média (bpm) (com erro padrão) nos grupos “Teofilina” e Adenosina”em diferentes concentrações (em Molar – M) durante o tempo experimental (min).................................................................................................. 118
Tabela 5 Pressão ventricular esquerda média (mmHg) (com erro padrão) nos grupos “Teofilina” e Adenosina” em diferentes concentrações (em Molar – M) durante o tempo experimental (min)................................................................................... 118
Tabela 6 Fluxo médio (ml/min) (com erro padrão) nos grupos “Teofilina” e Adenosina” em diferentes concentrações (em Molar – M) durante o tempo experimental(min)........................................................................................................................ 119
Tabela 7 Média com erro padrão da resistência ao fluxo cardíaco nos grupos “Teofilina”e “Adenosina” em diferentes concentrações durante o tempo experimental (min)........................................................................................................................ 121
Tabela 8 Média com erro padrão da resistência ao fluxo cardíaco nos diferentes grupos durante o tempo experimental (min)....................................................................... 121
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ACh Acetilcolina
ADO Adenosina
Ag Prata
Ag/Cl Prata Cloretada
AMPc Monofosfato de adenosina cíclica
AMP Monofosfato de adenosina
bpm Batimentos por minuto
ATP trifosfato de adenosina
Ca+2 Íon Cálcio
ºC Grau Celsius
CA Circuito Aberto
CaM Calmodulina
CF Circuito fechado
CEMEA Comissão de Ética em Manipulação e Experimentação Animal
CF Circuito Fechado
CI Coração isolado
CO2 Dióxido de Carbono
CR Coeficiente de correlação
DG Diacilglicerol
DNA Ácido desoxiribonucléico
ECG Eletrocardiograma
EDRF Fator de relaxamento derivado do endotélio
ELC Cadeia leve essencial da miosina
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
FA Freqüência Atrial
FAD Flavina-adenina dinucleotídeo
FC Freqüência Cardíaca
FMN Flavina mononucleotídeo
FP Fluxo da Perfusão
GCs Guanilato ciclase solúvel
Gi Proteína G Inibitória
GMPc Monofosfato de guanosina cíclica
gt/min Gotas por minuto
GTP Trifosfato de guanosina
HCl Ácido clorídrico
HONOO Ácido peroxinitroso
Hz Hertz
IE Intervalo Espontâneo
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
IMP Inosina monofosfato
IP3 Trifosfato de inositol
K+ Íon potássio
KACh Canais de potássio acetilcolina-dependentes
K-H Krebs-Henseleit
LA Limiar atrial
LARG L-arginina
LEC Laboratório de Eletrofisiologia Cardíaca
LIB Laboratório de Instrumentação Biomédica
L-NAME N(G)-nitro-L-arginine methyl ester
LPS Lipopolissacarídeo
M2 Receptor Muscarínico Subtipo 2
MAPK Proteína-quinase ativada por mitógeno (Mitogen-activated Protein Kinase).
MLC Cadeia leve da miosina (Myosin Light Chain)
MLCK Quinase da cadeia leve da miosina (Myosin Light Chain Kinase)
mM Mili Molar
mmHg Milímetros de Mercúrio
Min Minuto
mL Mililitros
Na+ Íon Sódio
NAD Nicotinamida-adenina dinucleotídeo
NAV Nódulo átrio-ventricular
nNOS Óxido nítrico sintase neuronal
NO Óxido Nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
NO2 Dióxido de nitrogênio
NO3- Nitrato
NO2O3 Trióxido de dinitrogênio
NO2O4 Tetróxido de dinitrogênio
NPS Nitroprussiato de sódio
NSA Nódulo Sinusal
NPT Núcleo de Pesquisa Tecnológica
O2 Oxigênio
O2- Superóxido
OH Hidroxil
ONOO- Peroxinitrito
PA Potencial de Ação
PDE Fosfodiesterase
PLB Fosfolambam
PKA Proteína quinase dependente de AMPc, proteína quinase A
PKC Proteína quinase C
PRPP 5-fosforibosilpirofosfato
PVE Pressão Ventricular Esquerda
Rf Resistência ao fluxo
RLC Cadeia leve regulatória da miosina
RNA Ácido ribonucléico
RyR Canais rionidínicos
SERCA Bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático
SNA Sistema Nervoso Autônomo
TEO Teofilina
TnI Troponina I
TSVs Taquicardia supraventriculares
UMC Universidade de Mogi das Cruzes
UNIFESP Universidade Federal de São Paulo
V Volt
µM Micro Molar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 18
1.1 IMPORTÂNCIA DO MÉTODO DE PERFUSÃO DE LANGERDORFF NA FISIOLOGIA E FARMACOLGIA CARDÍACA...................................................................................................................... 18
1.2 MOTIVAÇÃO DO TRABALHO........................................................................ 21
2 OBJETIVOS................................................................................................................... 25
2.1. OBJETIVOS GERAL............................................................................................. 25
2.1.1 Objetivos específicos................................................................................... 25
3 ÓXIDO NÍTRICO – REVISÃO........................................................................ 26
3.1 EFEITOS DIRETOS E INDIRETOS DO NO.................................................. 27
3.1.1 Efeitos diretos do óxido nítrico.......................................................................... 28
3.1.2 Efeitos indiretos do óxido nítrico........................................................................ 29
3.2 ENZIMAS SINTETIZADORAS DE ÓXIDO NÍTRICO.......................... 30
3.2.1 Óxido nítrico sintase neuronal............................................................................ 31
3.2.2 Óxido nítrico sintase induzível.......................................................................... 34
3.2.3 Óxido nítrico sintase endotelial......................................................................... 34
3.3 EFEITOS BIOLÓGICOS DO ÓXIDO NÍTRICO SOBRE O SISTEMACARDIOVASCULAR..................................................................35
3.3.1 Efeitos do NO sobre o relaxamento vascular...................................................... 38
3.3.2 Efeitos do NO sobre a resposta β-adrenérgica.................................................... 42
3.4 MECANISMOS DE AÇÃO DO NO NA CÉLULA CARDÍACA............ 44
4 ADENOSINA – REVISÃO..................................................................................... 47
4.1 PARTICIPAÇÃO DO NO E DA ADENOSINA NACARDIOPROTEÇÃO...................................................................................... 54
5 METODOLOGIA........................................................................................ 56
5.1 ABORDAGEM GERAL............................................................................ 56
5.2 ANIMAIS................................................................................................................... 56
5.3 SOLUÇÃO FISIOLÓGICA................................................................................... 57
5.4 PREPARAÇÃO BIOLÓGICA.............................................................................. 58
5.5 MONTAGENS EXPERIMENTAIS.................................................................... 59
5.5.1 Montagem de Langendorff de Circuito Aberto.................................................. 59
5.5.2 Montagem de Langendorff de Circuito Fechado................................................ 61
5.5.3 Calibrações das preparações de langendorff (coração isolado).......................... 62
5.6 Montagem de Átrio Isolado................................................................................... 65
5.7 Parâmetros avaliados nos corações isolados.......................................................... 67
5.8 Parâmetros avaliados nos átrios isolados............................................................ 69
6 FÁRMACOS....................................................................................................................... 69
7 GRUPOS EXPERIMENTAIS........................................................................................ 70
7.1 Caracterização de parâmetros em coração e átrios isolados........................................... 70
7.2 Testes com fármacos em coração isolado....................................................................... 71
8 RESULTADOS..................................................................................................................................... 74
8.1 CARACTERIZAÇÃO DE PARÂMETROS EM CORAÇÃO E ÁTRIOS ISOLADOS............................................................................................ 74
8.2 TESTES COM FÁRMACOS EM CORAÇÃO ISOLADO....................... 80
9 DISCUSSÃO................................................................................................................... 88
10 CONCLUSÃO............................................................................................................. 94
REFERÊNCIAS ……..………………………………………………...………………... 95
APÊNDICES...................................................................................................................... 114
18
1 INTRODUÇÃO
1.1 IMPORTÂNCIA DO MÉTODO DE PERFUSÃO DE LANGERDORFF
NA FISIOLOGIA E FARMACOLGIA CARDÍACA
O método de perfusão de Langendorff é uma técnica experimental de grande utilidade no
entendimento da fisiologia e da farmacologia cardíaca. Seu princípio básico consiste em
perfundir as artérias coronárias através de uma cânula de perfusão retrógrada inserida na aorta.
Quando se alcança uma pressão adequada do líquido nutriente, a válvula aórtica se fecha
permitindo o fluxo pelas coronárias, de modo que todo o tecido seja perfundido (BERNAL et al.,
2004).
O primeiro pesquisador a divulgar esta técnica foi um médico fisiologista alemão, Oscar
Langendorff. Langendorff publicou, em 1898, um trabalho intitulado “Investigações sobre a
sobrevivência de corações de mamíferos” na revista Pflügers Archive für der Gesamten
Physiologie, (ZIMMER, 1998). Neste trabalho ele descreveu um método para perfundir e manter
vivo o coração isolado de mamíferos. Desde então, numerosos estudos aplicando esta técnica
produziram avanços significativos no entendimento da função cardíaca e da ação de fármacos
cardioativos (HILL et al., 2005).
Apesar de Langendorff ter sido o primeiro a publicar um trabalho no qual descreve a
técnica de perfusão de corações isolados, foi Carl Ludwig o primeiro a propor, em 1846, um
método para isolar e perfundir um coração de rã (BERNAL et al., 2004). Posteriormente, Elias
Cyon, trabalhando no Instituto de Fisiologia de Carl Ludwig, na Universidade de Leipzig,
Alemanha, descreveu com êxito, em 1866, um método de isolar e perfundir corações de rã.
Graças a esta preparação, Cyon caracterizou pela primeira vez a relação entre a temperatura e a
freqüência cardíaca, e propôs os primeiros conceitos eletromecânicos do sistema de excitação-
contração (ZIMMER, 1998).
Subseqüentes modificações desta técnica permitiram a Henry Pickering Bowditch
descrever o fenômeno de escada (staircase ou treppe) ao estimular eletricamente o ápice
cardíaco. Com estes experimentos também foram possíveis observar a lei do “tudo ou nada” para
19
o disparo do potencial de ação, o período refratário absoluto e a origem da automaticidade
cardíaca. Sydney Ringer deduziu o papel do cálcio na contração cardíaca, enquanto Otto Frank
elaborou em 1895 a famosa lei de Frank-Starling (BERNAL et al., 2004). Alem disso, Otto
Loewi estudando o papel dos nervos autonômicos na regulação da função cardíaca, descobriu, na
década de 1920, que substâncias de origem neural (neurotransmissores) produzidas e liberadas
pelos nervos autonômicos cardíacos controlavam a função cardíaca (BERNAL et al., 2004). Esta
descoberta inaugurou uma nova era na biologia e na medicina, culminado no entendimento
preciso do controle autonômico da função cardíaca e na descoberta de fármacos cardioativos úteis
na terapêutica medicamentosa das várias doenças cardiovasculares, incluindo as arritmias
cardíacas, a insuficiência cardíaca congestiva e outras (BERNAL et al., 2004).
O próprio Langendorff com o uso do método realizou importantes contribuições para a
fisiologia cardíaca. Isto inclui a demonstração de que o coração recebe seus nutrientes e oxigênio
do sangue através da circulação coronariana e que mudanças nesta circulação refletem-se
diretamente na função mecânica do coração (LANGENDORFF, 1898). Langendorff confirmou
também as observações prévias referentes ao efeito cronotrópico negativo mediado pela
estimulação do nervo vago, ou produzido pela administração de agonistas muscarínicos como a
muscarina (alcalóide extraído do cogumelo da espécie amanita muscaria), assim como o efeito
cronotrópico positivo produzido pela administração de atropina (alcalóide extraído da atropa
belladona). Ele também observou que o cloreto de potássio provoca ataque cardíaco
(LANGENDORFF, 1898; TAEGTMEYER, 1995).
Adicionalmente, Langendorff e Bornstein, reconheceram em 1906 que a ocorrência de
sístole no período refratário absoluto do coração desencadeava o aumento da força de contração
dos batimentos subseqüentes. A caracterização deste fenômeno cardíaco, chamado de
potenciação pós-extrasístole, foi fundamental para os estudiosos da função cardíaca, pois
possibilitou o entendimento dos eventos eletrofisiológicos envolvidos na contração cardíaca em
humanos (SKRZYPIEC-SPRING et al., 2007). Além disso, a compreensão deste fenômeno
permitiu o entendimento preciso de alguns tipos de arritmias cardíacas em humanos (DORING &
DEHNERT, 1987).
Após mais de 100 anos depois da introdução desta técnica experimental para o estudo da
função cardíaca por Oscar Langendorff, seu valor para a cardiologia básica ainda é reconhecido
20
pelos fisiologistas, fisiopatologistas, farmacologistas e outros estudiosos das ciências médicas e
biológicas (BERNAL et al., 2004).
Na área de cardiologia clínica, o método de perfusão de coração isolado desenvolvido por
Langendorff tem sido recentemente estudado como uma metodologia alternativa para a
preservação do coração visando o transplante cardíaco (FITTON et al., 2004). Os métodos
convencionais de preservação do coração usados em transplantes cardíacos, como a preservação
normotérmica (ou a quente) e a preservação a frio (preservação hipotérmica) não previnem a
falência completa da função contrátil cardíaca após um período de isquemia prolongada por mais
de 4 horas. A aplicação do método de Langerdorff na preservação do coração, combinado com o
tratamento do tecido cardíaco com substâncias antioxidantes, poderia promover um significativo
avanço nos transplantes cardíacos, pois estas novas técnicas de preservação de tecidos para
transplantes poderiam ser altamente eficazes na redução das lesões causadas por isquemia
prolongada (período de preservação) e a restauração da circulação sanguínea durante o processo
cirúrgico de transplante (reperfusão).
Apesar de sua utilidade como ferramenta na investigação da cardiologia básica e clínica
(transplantes cardíacos), o método apresenta algumas limitações, dentre elas a impossibilidade de
estudo da influência humoral e dos eventos pós e pré-carga não fisiológicos, além das
conseqüências da oxigenação inadequada e não fisiológica do tecido durante a perfusão. Esta
última requer um alto fluxo coronariano, muito acima do fluxo fisiológico (até 10 vezes maior)
para oxigenar adequadamente o tecido cardíaco, evitando assim morte tecidual por isquemia
(BERNAL et al., 2004). Por outro lado, o impacto destas limitações do método é compensado
pela sua reprodutibilidade, pela quantidade de dados que se pode obter e pela facilidade de se
realizar vários protocolos experimentais em uma mesma preparação (SUTHERLAND, 2000).
Além disso, os métodos de captação dos parâmetros biofísicos e bioquímicos foram
melhorados com o passar das décadas, sendo possível controlar a composição química do
perfusato, o que permite estudar de forma mais precisa os parâmetros representativos do
metabolismo tecidual e ações de fármacos sobre o coração (ZIMMER, 1998). Há que se destacar
que os custos para implementação desta técnica são relativamente baixos (SUTHERLAND,
2000) e, desta forma, as vantagens do seu uso predominam sobre as suas limitações, fazendo
desta uma ferramenta bastante útil na investigação da fisiologia e farmacologia cardiovascular
(SKRZYPIEC-SPRING et al., 2007; BERNAL et al., 2004).
21
1.2 MOTIVAÇÃO DO TRABALHO
Ao longo de mais de cem anos, a montagem de Langendorff vem sofrendo adaptações,
para melhor se adequar às necessidades de cada laboratório. O mesmo ocorreu em nosso
laboratório de Eletrofisiologia Cardíaca - LEC, na Universidade de Mogi das Cruzes, quando em
2006, com intuito de viabilizar o uso de fármacos de alto custo, foi desenvolvida uma nova
adaptação da montagem de Langendorff, que possibilitou o uso de um volume pequeno de
solução (100 ml) para perfusão do coração isolado (NECCHI-JR, 2006; NECCHI-JR et. al.,
2006). Com a técnica original de Langendorff necessita-se de um volume de até 600 ml de
solução para cada hora de experimento, devido ao fato desta ser descartada após a perfusão
(Circuito Aberto – CA). No trabalho de Necchi-Jr e colaboradores (2006) foi desenvolvido um
dispositivo de recirculação a vácuo que evita o descarte da solução, fazendo-a recircular pelo
coração durante todo tempo de experimento (Circuito Fechado – CF).
Contudo, apesar de ter sido possível utilizar-se um volume de solução de 100 ml em CF,
ao se realizar os testes experimentais, observou-se uma rápida queda na funcionalidade cardíaca.
Diferentemente do que ocorre na montagem original de Langendorff, houve uma
cardiodepressão, sendo que, aos 70 min de experimento, todos os parâmetros cardíacos avaliados
(Freqüência Cardíaca (FC); Pressão Ventricular Esquerda (PVE); Fluxo da Perfusão (FP))
encontravam-se nulos.
Esta constatação suscitou investigações mais aprofundadas acerca dos fenômenos
envolvidos nesta queda dos parâmetros cardíacos, principalmente considerando que este
procedimento tem sido proposto inclusive para processos de transporte do coração para
transplante (FITTON et al., 2004). Neste sentido, Effitng-Jr e col., em 2007, realizando
experimentos semelhantes ao de Otto Loewi, e fazendo o uso de ferramentas farmacológicas,
como agonistas e antagonistas dos receptores do sistema nervoso autônomo (SNA), concluiu que
uma das principais substâncias envolvidas na queda da funcionalidade de corações isolados em
circuito fechado com baixo volume está na solução circulante e, que a cardiodepressão, nestas
condições experimentais, é mediada de maneira importante por mecanismos colinérgicos
muscarínicos acionados por substância intrínseca do coração (provavelmente acetilcolina). Nas
figuras (1A, 1B e 1C), (obtido de EFFTING-JR et al., 2007; EFFTING-JR; 2008), estão
22
ilustrados os efeitos dos antagonistas e agonistas colinérgicos muscarínicos sobre os parâmetros
cardíacos: Freqüência Cardíaca (A); Pressão Ventricular Esquerda (B); e Fluxo da Perfusão (C),
avaliados ao longo dos experimentos.
Apesar destes resultados indicarem ser a acetilcolina o principal agente responsável pela
queda da funcionalidade cardíaca em circuito fechado, com baixo volume circulante (100ml), o
bloqueio colinérgico muscarínico, com o uso do fármaco (atropina), não foi suficiente para
manter os mesmos valores obtidos nos experimentos realizados em circuito aberto. Isto indica
que outros mecanismos podem estar sendo acionados e que outras substâncias podem estar sendo
liberadas pelo coração em circuito fechado, contribuindo para a falência da resposta funcional.
Partindo destes resultados, propusemos testar outros fármacos com ações em mecanismos que
possivelmente estejam envolvidos na queda dos parâmetros cardíacos.
Diversas moléculas estão envolvidas no funcionamento das células cardíacas que por sua
vez determinam a funcionalidade de todo órgão. Uma importante molécula sinalizadora de
diversas funções intra e extra celular é óxido nítrico (NO). Este gás desempenha, um importante
papel na regulação e na proteção contra lesões do coração (VINTEN-JOHANSEN, 2005). Neste
sentido, considerando que uma das desvantagens do método de perfusão é o aumento do fluxo
coronariano devido à baixa capacidade de transporte de oxigênio pela solução de perfusão,
levantamos a hipótese de que uma disfunção endotelial poderia estar ocorrendo, levando à
alteração nos níveis de Óxido Nítrico produzidos pelo tecido cardíaco. Devido ao NO ser também
uma molécula que exerce múltiplas funções no sistema cardiovascular, entre elas, sinalizar a
vasodilatação coronariana e exercer também influência sobre a incidência de apoptose (NISHIO
et al., 1996; SAM et al., 2001; WOLLERT e DREXLER, 2002; PATTEN et al., 2005; RAZAVI
et al., 2005; DAS et al., 2005), a proliferação celular (WOLLERT e DREXLER, 2002), o
controle das concentrações de cálcio transiente nos cardiomiócitos (STOJANOVIC et al., 2001;
ZIOLO et al., 2001c; ZIOLO et al., 2004), entre outras funções, suscitamos a hipótese de haver
uma participação relevante desta molécula sobre a resposta funcional do coração isolado em
circuito fechado.
23
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
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0,2
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0,6
0,7
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Aberto Atropina Fechado 100ml Fisostigmina Carbacol
Figura 1: Gráfico ilustrando o efeito do tempo sobre: (A) Frequência Cardíaca média (FC); (B) Pressão Ventricular Esquerda média (PVE) e (C) Fluxo da Perfusão (FP) médio nos seguintes grupos: “Circuito Aberto” (N=5),“Fechado 100 ml” (N=5), “Atropina” (N=5), “Fisostigmina” (N=5), “Carbacol” (N=5) e (D) variação da concentração de glicose na solução de perfusão ao longo do tempo de experimento. Os dados dos grupos “Circuito Aberto”, “Circuito Fechado” e da disponibilidade de glicose são referentes ao trabalho de Necchi-Jr (2006), os dados dos demais grupos são referentes ao trabalho de Effting-Jr (2007). Os nomes destes grupos são inerentes aos fármacos adicionados à solução de perfusão.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
0,0
0,1
0,2
0,3
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Aberto Atropina Fechado 100ml Fisostigmina Carbacol
24
É importante salientar que a função cardíaca é multi-mediada. Como vimos, um dos
principais sistema de controle da função cardíaca, o Sistema Nervoso Autonômico (SNA),
utiliza-se de mensageiros químicos (neurotransmissores) e receptores para exercer seu papel
regulatório. Em condições específicas, outros sistemas também exercem, ainda que em menor
grau, importante controle sobre a função cardíaca através de mediadores químicos, como as
purinas, em especial o ATP e a adenosina. Estes podem desempenhar diversos papeis
regulatórios, tais como: vasodilatação coronariana, efeito cronotrópico, dromotrópico e
inotrópico negativo, entre outros (BELLONI et al., 1989; WILLIAMS, 1987). A adenosina
também exerce papel protetor no miocárdio, principalmente sob condições de injúria como, por
exemplo, na isquemia e/ou hipóxia (ÉVORA et al., 1996). Segundo Bernal (2004), mesmo com
altos fluxos de perfusão, o coração isolado pode estar sob uma condição de hipóxia, devido à
baixa capacidade de transporte de oxigênio da solução. Segundo Évora (1996), isto pode levar a
amostra a um distúrbio metabólico. Considerando que a adenosina além de modular a atividade
contrátil, e a síntese e secreção de outros fatores locais de proteção celular, ela também pode
atuar como um fator homeostático local em condições normais ou alteradas do metabolismo
cardíaco. Segundo Vinten-Johansen (2005), a adenosina também é poderoso mecanismo
endógeno de proteção miocárdica. Tendo em vista este conhecimento, também foi proposto neste
estudo verificar a participação da adenosina sobre a deterioração da resposta funcional de
corações isolados em circuito fechado com baixos volumes de solução (100ml),
Desta forma, neste trabalho buscamos dar continuidade aos trabalhos iniciados em nosso
laboratório por Necchi – Jr (2006) e Effting – Jr (2007), elucidando o papel cardioprotetor do NO
e da adenosina sobre corações isolados de rato na preparação de Langendorff em circuito fechado
e de baixo volume circulante (100 ml). Também propomos testar a possibilidade de reversão da
cardiodepressão que ocorre em circuito fechado com 100 ml, através da estimulação elétrica e
sem o uso de fármacos, assim como, o efeito desta solução (100 ml), sobre o automatismo e a
inducibilidade de arritmia em átrios direito isolado de ratos.
A seguir apresentaremos os objetivos deste trabalho.
25
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Adotando o coração isolado de rato montado em sistema de Langendorff de circulação
fechada e de baixo volume circulante como modelo de estudo de mecanismos envolvidos na
regulação da função cardíaca, o presente estudo tem como objetivo investigar a participação do
óxido nítrico e das purinas (adenosina) nesta regulação, assim como na resposta depressora de
corações perfundidos continuamente com solução nutriente recirculante não renovável.
2.1.1 ESPECÍFICOS
1. Caracterizar o efeito de fármacos capazes de aumentar (L-arginina, nitroprussiato de sódio) ou
reduzir (L-NAME) a geração biológica de NO sobre a resposta do coração isolado perfundido
continuamente com solução nutriente recirculante não renovável,
2. Caracterizar o efeito de fármacos capazes de ativar (adenosina) ou bloquear (teofilina) os
receptores purinérgicos sensíveis á adenosina (receptores de adenosina) cardíacos sobre a
resposta do coração isolado perfundido continuamente com solução nutriente não renovável,
3. Caracterizar o efeito da estimulação elétrica transmural sobre a resposta do coração isolado e
perfundido continuamente com solução nutriente não renovável,
4. Caracterizar o efeito do perfusato obtido do coração perfundido continuamente com solução
nutriente não renovável sobre a atividade elétrica e motora de átrios isolados.
26
3 ÓXIDO NÍTRICO – REVISÃO
O óxido nítrico (NO – Nitric Oxide) constitui uma das menores e mais simples moléculas
biossintetizadas (MORRIS et al., 1994). O NO é um radical livre, gasoso, inorgânico, incolor,
que possui sete elétrons do nitrogênio e oito do oxigênio, tendo um elétron desemparelhado
(BECKMAN et al., 1996). Dudzinski, 2006, acrescenta que o NO é um radical difusível e
lipofílico que medeia diversas e significantes funções de sinalização intra e extracelular.
Até meados da década de 1980, o NO era considerado apenas membro de uma família de
poluentes ambientais indesejáveis e carcinógenos potenciais (JAMES, 1995). Atualmente, sabe-
se que o NO participa em alguns dos mais intrigantes e versáteis mecanismos de sinalização
conhecidos, tendo um papel como mensageiro/modulador em diversos processos biológicos
essenciais, o que lhe confere a característica de ser um dos principais alvos da indústria
farmacêutica.
A evidência inicial de óxidos de nitrogênio no metabolismo veio de experimentos que
demonstraram a produção de nitratos em camundongos “germ-free” no início da década de 80
(GREEN et al., 1981). Na seqüência, evidenciou-se que um aminoácido semi-essencial produzido
no organismo, a L-arginina, era o substrato e a L-citrulina era formada como co-produto (HIBBS
et al., 1987). Em 1988, Marletta identificou o óxido nítrico como o produto da reação de
oxiredução da L-arginina.
Quase que simultaneamente, Furchgott (FURCHGOTT et al., 1984) investigava um fator
vasodilatador associado ao endotélio vascular (endothelium-derived relaxing factor – EDRF) que
poucos anos mais tarde, em 1987, Ignarro e seus colaboradores concluíram ser o NO responsável
pela atividade biológica do EDRF (IGNARRO et al., 1987).
Desde a comprovação de que o NO exerce o papel de molécula sinalizadora no
relaxamento vascular, iniciou-se uma grande onda de publicações investigando o papel deste gás
nos diversos sistemas biológicos humanos. Várias informações foram obtidas sobre sua
biosíntese e degradação. Foram também identificadas as enzimas responsáveis pela síntese de NO
e a localização preferencial destas enzimas nos tecidos.
As enzimas sintetizadoras de óxido nítrico (nitric oxide synthases – NOS) convertem o
aminoácido L-arginina em L-citrulina com conseqüente produção de óxido nítrico. Existem três
27
isoformas da NOS: a neuronal (nNOS ou NOS1), a endotelial (eNOS ou NOS3) e a induzível
(iNOS ou NOS2); sendo a função das duas primeiras dependentes da concentração de cálcio.
Devido ao fato de iNOS ser independente das concentrações de cálcio, a produção de NO
derivado desta isoforma é determinada, principalmente, pela expressão da enzima. Alguns
autores sugerem a existência de uma quarta isoforma de NOS, exclusivamente presente nas
mitocôndrias, denominada de isoforma mitocondrial (mtNOS) (GHAFOURIFAR e RICHTER,
1997; LACZA et al., 2003). No entanto, a sua existência como uma isoforma diferente de eNOS
ou iNOS ainda é controversa (ZANELLA et al., 2004; LOPEZ et al., 2006).
As múltiplas funções do NO no sistema cardiovascular estão relacionadas com o tipo de
isoforma expressa, com a quantidade de expressão das enzimas produtoras de NO, com a
compartimentalização destas enzimas, com a disponibilidade de substrato e co-fatores para a
produção de NO e ultimamente, relacionada com a concentração de NO produzido. Além disso,
compostos químicos gerados em decorrência da reatividade química do NO com outras
moléculas, como por exemplo as espécies reativas de oxigênio, podem gerar efeitos biológicos
indiretos.
Em outros sistemas biológicos, os efeitos fisiológicos e patológicos do NO também têm
sido identificados. Dada sua complexidade e variedade, não cabe aqui neste trabalho, uma revisão
ainda mais abrangente dos efeitos biológicos do NO nos seres vivos. Por outro lado, esta pode ser
encontrada em outras fontes (IGNARRO, 2000; MAYER, 2007). De qualquer modo, nas secções
subsequentes será dado enfoque ao papel do NO e derivados na fisiologia cardíaca. Abordaremos
os mecanismos de síntese, formação e localização do NO, apresentando a enzima envolvida, de
extrema importância para o conhecimento fisiológico do NO, a “sintase do óxido nítrico” (nitric
oxide synthase – NOS).
3.1 EFEITOS DIRETOS E INDIRETOS DO NO
Os efeitos do NO podem ser categorizados como efeitos diretos e indiretos (WINK &
MITCHELL, 1998). Os efeitos diretos do NO envolvem a interação direta deste radical livre com
outros ligantes, como complexos metálicos. Já os efeitos indiretos decorrem da produção de
28
compostos intermediários, geralmente derivados da interação de altas concentrações de NO com
oxigênio (O2) e superóxido (O2-).
3.1.1 Efeitos diretos do óxido nítrico
a) Reação do NO com complexos metálicos
A reação mais importante que representa o efeito direto do NO é a ligação com
grupamentos heme, presente no domínio oxidante (figura 2) formando um complexo nitrosil-
metálico (nitrosilação).
Como será descrito adiante, as enzimas sintetizadoras de NO possuem na sua estrutura um
grupamento heme ligante de O2. Existe um mecanismo de retroalimentação negativa pelo qual o
NO pode competir com este sítio de ligação, controlando a atividade da enzima, sendo que eNOS
e nNOS são mais susceptíveis a esta inibição do que iNOS (GRISCAVAGE et al., 1995).
b) Interação de NO com complexos metal-oxigênio
O NO pode interagir com complexos metal-oxigênio, como a oxihemoglobina, dando
origem à metoxihemoglobina com consequênte formação de nitrato (NO3-). Este é considerado
um dos mecanismos de controle das concentrações de NO (LANCASTER, JR., 1994). A
oximioglobina pode interagir com o NO de maneira similar à oxihemoglobina. Publicações
recentes têm sugerido que este é um dos principais mecanismos de neutralização do NO no
músculo cardíaco, podendo servir como um mecanismo protetor contra os efeitos deletérios
conseqüentes da alta produção de NO (WUNDERLICH et al., 2003; GODECKE et al., 2003).
c) Interação de NO com outros radicais
O óxido nítrico pode interagir com radicais lipídicos conseqüentes do estresse oxidativo,
podendo prevenir a peroxidação de lipídios de duas formas: através da interação com oxiradicais
29
que determinam a oxidação de lipídios, causando a terminação da reação em cadeia de
peroxidação de lipídios, por ligar-se a um radical lipídico previamente oxidado (MIRANDA et
al., 2000).
3.1.2 Efeitos indiretos do óxido nítrico
Embora efeitos diretos do NO não possam ser ignorados como causadores de situações
patológicas, o mecanismo de ação mais aceito é a ação indireta do NO, através da interação deste
com espécies reativas de oxigênio, causando a formação de compostos intermediários que
possuem atividade patológica.
As reações mais comuns que ocorrem in vivo parecem ser entre o NO e O2 ou entre o NO
e o superóxido, causando os seguintes efeitos:
a) Estresse oxidativo
Reações de oxidação ocorrem normalmente nos tecidos biológicos. No entanto, são
diferentes das que ocorrem durante o estresse oxidativo, nos quais espécies altamente reativas são
formadas em abundância, causando lesão tecidual como, por exemplo: a oxidação de ácidos
nucléicos, determinando a quebra da fita de DNA; a peroxidação de lipídeos; a oxidação de
proteínas, impedindo processos enzimáticos (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1984).
O óxido nítrico interage com o superóxido formando o peroxinitrito (ONOO-) que é
altamente reativo (Reação 1). Além disso, o peroxinitrito dá origem ao ácido peroxinitroso
(HONOO) quando protonado. O HONOO decompõe-se facilmente em hidroxil (OH) e dióxido
de nitrogênio (NO2), espécies que também são altamente reativas (Reação 2). Outra via de
decomposição do ácido peroxinitroso é através da formação de nitrato (Reação 3)
(1) O2- + NO → ONOO-(2) ONOO- + H+ → HONOO → NO2 + OH(3) HONOO → NO3- + H+O
30
b) Estresse nitrosativo
O óxido nítrico reage com o O2 formando o dióxido de nitrogênio (NO2) (Reação 4). Uma
vez formado, o NO2 pode reagir com o NO formando o trióxido de dinitrogênio (N2O3) ou então
sofrer dimerização formando o tetróxido de dinitrogênio (N2O4) (Reação 5 e 6).
(4) 2 NO + O2 → 2 NO2
(5) NO2 + NO → N2O3
(6) NO2 + NO2 → N2O4
O trióxido de dinitrogênio sofre hidrólise e gera nitrito, enquanto a hidrólise do tetróxido
de dinitrogênio gera nitrato.
No entanto, estas moléculas, e em especial o N2O3, são doadoras de nitrosônio (NO+), que
pode ser transferido para outras moléculas (como hidroxilas, aminas e tióis) levando a formação
de nitrito, N-nitrosaminas e S-nitrosotióis, mediando dessa forma os efeitos indiretos do NO
(WINK et al., 2000). Por exemplo, doadores de NO ativam os canais de cálcio rionidínicos do
retículo sarcoplasmático de músculo estriado cardíaco através da S-nitrosilação destes canais (XU
et al., 1998).
3.2 ENZIMAS SINTETIZADORAS DE ÓXIDO NÍTRICO
Um passo importante para o estudo dos efeitos do NO nos sistemas biológicos foi a
identificação das enzimas, presentes nos seres vivos, capazes de sintetizá-lo. As isoformas
endotelial e neuronal são consideradas constitutivas, por serem expressas em condições basais
nos tecidos. A atividade enzimática destas duas isoformas é dependente de cálcio/calmodulina
(Ca+2/CaM) e, portanto, controlada pelas variações da concentração de cálcio intracelular. A
isoforma induzível de NOS é assim chamada por ser expressa quando as células são estimuladas
por fatores específicos, como certas citocinas. Diferente de eNOS e nNOS, a iNOS é
independente, ou ao menos, pouco dependente (GELLER et al., 1993) das concentrações de
31
cálcio intracelular, sendo a sua atividade enzimática controlada principalmente pela expressão da
enzima.
Em sua estrutura, as enzimas NOS apresentam um domínio C-terminal transportador de
elétrons denominado domínio redutor, um domínio ligante da calmodulina e um domínio
oxidante que forma o sítio catalítico da molécula (FÖRSTERMANN, 2000). No domínio redutor,
encontram-se os sítios de ligação para o co-substrato fosfato de nicotinamida-adenina
dinucleotídeo (NADPH) e para os cofatores flavina-adenina dinucleotídeo (FAD) e flavina
mononucleotídeo (FMN). No domínio oxidante, encontram-se os sítios de ligação para os
cofatores ferroprotoporfirina IV (Heme), tetraidrobiopterina (H4B), para o co-substrato O2 e para
o substrato L-arginina (STUEHR & GHOSH, 2000) (Figura 2).
Entre os domínios redutor e oxidante, encontra-se o domínio de ligação da calmodulina.
Próximo à porção de ligação da FMN, existe uma sequência (alça) de auto-inibição que controla
a ligação da calmodulina. Durante a síntese de NO as flavinas adquirem elétrons do NADPH e
transferem estes para o ferro do grupamento heme, permitindo a ligação do oxigênio e
catalisando a produção do NO a partir da L-arginina (STUEHR, 1997). Em nNOs e eNOS, esta
transferência de elétrons é induzida pela ligação da CaM, diferente de iNOS, para qual a ligação
da calmodulina se dá de maneira quase que irreversível (CHO et al., 1992). Além disso, iNOS
não apresenta o segmento de auto-inibição do sítio de ligação da calmodulina (SALERNO et al.,
1997). Estas observações são consistentes com o fato de que iNOS produz altas doses de NO uma
vez que seja expressa.
Em suma, a síntese de NO pela família da NOS pode ser descrita da seguinte forma: A L-
arginina é inicialmente hidroxilada ao intermediário L-N-hidroxiarginina, em seguida ocorre a
oxidação da L-N-hidroxiarginina formando L-citrulina com geração concomitante de óxido
nítrico, como ilustrado na figura 3.
3.2.1 Óxido nítrico sintase neuronal
Especificamente quanto às isoformas de NOS, a isoforma neuronal foi a primeira
isoforma identificada (BREDT et al., 1990; BREDT & SNYDER, 1990). A NOS neuronal,
32
Figura 2: Representação ilustrativa da enzima NOS
33
Figura 3: Representação da reação de síntese de NO à partir da L-arginina. Inicialmente, ocorre a hidroxilação da L-arginina a L-hidroxiarginina, seguida de oxidação da L-hidroxiarginina formando L-citrulina e NO. Os co-substratos NADPH e O2 também estão representados na figura.
34
apesar de ter sido descrita no tecido nervoso, também pode ser encontrada em diversos outros
tecidos, inclusive na célula muscular cardíaca (XU et al., 1999; BURKARD et al., 2007).
sido descrita no tecido nervoso, também pode ser encontrada em diversos outros tecidos,
inclusive na célula muscular cardíaca (XU et al., 1999; BURKARD et al., 2007).
Sendo esta uma enzima sensível às variações de Ca2+, neurotransmissores ou sinalizadores
celulares, que determinem alterações na concentração intracelular de cálcio, irão regular a
atividade de nNOS. A liberação de NO, derivado desta isoforma, parece ocorrer por curto período
de tempo e não de forma contínua e prolongada.
3.2.2 Óxido nítrico sintase induzível
A isoforma induzível leva este nome pelo fato de não ser constitutiva, tendo sua expressão
induzida por certos fatores como, por exemplo, o LPS (lipopolissacarídeo) e certas citocinas.
A expressão de iNOS é comum em macrófagos em locais onde haja a presença de
inflamação ativa, como nos macrófagos alveolares em regiões inflamadas do pulmão (KOBZIK
et al., 1993). A combinação de alta concentração de óxido nítrico, associado aos outros radicais
de oxigênio, podem mediar diretamente a citotoxicidade celular, sendo assim, o NO, um
componente crítico da resposta imune (MOILANEN & VAPAATALO, 1995). No coração a
isoforma iNOS, tem sua expressão induzida em determinadas situações como, por exemplo,
durante o choque séptico e durante a insuficiência cardíaca.
3.2.3 Óxido nítrico sintase endotelial
A enzima óxido nítrico sintase endotelial foi inicialmente identificada em células
endoteliais (POLLOCK et al., 1991; FORSTERMANN et al., 1991a; FORSTERMANN et al.,
1991b). A eNOS tem papel crucial no mecanismo de relaxamento vascular e, consequentemente,
35
na regulação da pressão sanguínea. Esta enzima também é expressa em outros tipos celulares,
inclusive em células musculares cardíacas (FERON et al., 1996).
Vários mecanismos podem modular a expressão de eNOS, sendo um dos principais
fatores o estresse de cisalhamento sobre o endotélio vascular, causado pelo fluxo sanguíneo, que
causa o aumento na expressão da enzima; enquanto a hipóxia está relacionada com a redução da
expressão de eNOS em células endoteliais pulmonares (FÖRSTERMANN, 2000).
Assim como para a enzima nNOS, o principal mecanismo ativador da eNOS é a variação
intracelular da concentração de cálcio. Adicionalmente, a fosforilação de eNOS também tem sido
relatada. No entanto, a relevância fisiológica deste evento ainda necessita ser determinada
(GARCIA-CARDENA et al., 1996).
Os domínios oxidantes de NOS possuem regiões de consenso para a ligação de
caveolinas, uma família de proteínas de ligação presente nas cavéolas, que são invaginações da
membrana plasmática. A enzima eNOS encontra-se associada à caveolina-1 na célula endotelial
(GARCIA-CARDENA et al., 1996; FERON et al., 1996) e caveolina-3 na membrana da célula
muscular cardíaca (FERON et al., 1996; BAROUCH et al., 2002; DUDZINSK et al., 2006). Esta
associação posiciona a enzima próxima a complexos sinalizadores como, por exemplo, o receptor
adrenérgico-β3. Sugere-se que a estimulação dos receptores adrenérgico-β3 induza a produção
local de NO pela eNOS, o que determina efeitos inotrópicos negativos no coração (GAUTHIER
et al., 1998). A associação de eNOS com as caveolinas contribui para a diminuição da sua
atividade enzimática. Uma vez que a concentração de cálcio aumente, acarretando na ativação da
calmodulina e interação desta com a eNOS, a inibição mediada pela caveolina é revertida
(MICHEL et al., 1997).
3.3 EFEITOS BIOLÓGICOS DO ÓXIDO NÍTRICO SOBRE O SISTEMACARDIOVASCULAR
Processos envolvidos na regulação da contração do músculo liso vascular
36
A camada muscular dos vasos sanguíneos é composta por células musculares lisas, de
formato fusiforme, que regulam através da sua contração o diâmetro interno e a pressão luminal
dos vasos sanguíneos.
A célula muscular lisa é assim chamada por não apresentar padrões repetitivos de
organização dos miofilamentos, como ocorre no músculo estriado esquelético e cardíaco. Embora
os miofilamentos finos e grossos sejam compostos principalmente por actina e miosina
respectivamente, assim como acontece no músculo estriado cardíaco e esquelético, o filamento
fino no músculo liso não apresenta o complexo troponina. A troponina C presente no músculo
estriado, como será descrito adiante, é uma proteína ligante de cálcio que regula a contração
muscular (BERNE & LEVY, 2004).
Apesar do músculo liso não expressar troponina, outras proteínas associadas aos
filamentos finos, como a calponina e caldesmona, parecem estar envolvidas na regulação da
contração muscular. Estas proteínas ligam-se ao filamento fino em baixas concentrações de cálcio
impedindo a interação dos miofilamentos. Em altas concentrações de cálcio, calponina e
caldesmona, ligam-se, preferencialmente, à calmodulina, deixando assim de inibir a interação dos
miofilamentos (SZYMANSKI, 2004). A fosforilação da caldesmona também parece regular a
contração do músculo liso e o remodelamento do citoesqueleto em células não-musculares
(KORDOWSKA et al., 2006).
O principal mecanismo de regulação da contração do músculo liso ocorre no filamento
grosso. A miosina apresenta uma região terminal em formato globular denominada de cabeça da
miosina, que é a região de alta afinidade para a ligação da actina, e uma porção em formato de
bastão, que associada a porções semelhantes de outras moléculas de miosina dá formato a longa
cauda da molécula. Existe uma região de transição, entre a cabeça e a cauda, onde ficam situadas
as cadeias leves da miosina. As cadeias leves da miosina são duas, a cadeia leve essencial (ELC)
e a cadeia leve reguladora (RLC). A cadeia leve reguladora é ligante de cálcio e pode ser
fosforilada, alterando assim a conformação da molécula de miosina (DILLON et al., 1981;
AKSOY et al., 1982).
Durante a contração muscular, a concentração de cálcio livre intracelular aumenta devido
a estímulos mecânicos e/ou químicos. O cálcio se liga à calmodulina e ativa a quinase da cadeia
leve da miosina (MLCK), que fosforila a cadeia leve reguladora da miosina (RLC). A
fosforilação da RLC determina alterações conformacionais na molécula de miosina, fazendo com
37
que os sítios de ligação para actina, presentes na cabeça da miosina, fiquem disponíveis para
ligação. As alterações conformacionais da miosina, decorrentes da fosforilação da cadeia leve
reguladora, também permitem que a atividade da ATPase da cabeça da miosina ocorra. Uma vez
que haja fosforilação da RLC e exposição dos sítios de ligação, existe interação de alta afinidade
entre miosina e actina filamentar que leva à contração muscular (DILLON et al., 1981; AKSOY
et al., 1982; PFITZER, 2001).
A hidrólise de ATP gera energia para a contração muscular. A ligação da molécula de
ATP na ATPase, presente na miosina, determina o desligamento entre a cabeça da miosina e a
actina mas, enquanto houver alta concentração de cálcio citoplasmática, a actina e miosina
continuam interagindo de forma cíclica.
A diminuição da concentração de cálcio intracelular faz com que ocorra menor
fosforilação da RLC, que associada à desfosforilação da RLC determinada pela fosfatase da
cadeia leve da miosina (MLCP), fazem com que a miosina adquira a conformação inicial,
impossibilitando a interação com a actina e determinando o relaxamento muscular. Para manter
baixa a concentração de cálcio intracelular, a célula muscular estoca a maior parte do cálcio
dentro do retículo sarcoplasmático e transporta o restante para o meio extracelular.
O estímulo para contração do músculo liso pode ser gerado através do estiramento da
célula muscular, que resulta em despolarização da membrana e consequênte ativação de canais de
cálcio voltagem-dependentes, ou através da ligação de agonistas em receptores de membrana
associados à proteína G ou aos canais de cálcio. A ligação do agonista aos receptores associados
à proteína G determina a ativação da fosfolipase C, que gera os mensageiros trifosfato de inositol
(IP3) e diacilglicerol (DG). O IP3 liga-se a receptores no retículo sarcoplasmático determinando a
liberação de cálcio, enquanto o DG ativa a proteína quinase C (PKC), que geralmente induz
efeitos promotores da contração muscular como, por exemplo, a fosforilação de canais de cálcio
do tipo L (WEBB, 2003).
Além disso, sabe-se hoje que a enzima Rho-quinase tem papel na promoção e manutenção
da contração do músculo liso por fosforilar a fosfatase da cadeia leve da miosina (MLC),
inativando-a (SOMLYO & SOMLYO, 1998; WEBB, 2003).
Dos mecanismos responsáveis pelo relaxamento do músculo liso vascular, a ativação da
proteína quinase dependente do GMPc (PKG) é provavelmente o mecanismo mais importante.
Como será detalhado abaixo, o NO derivado do endotélio tem ação sobre o músculo liso,
38
ativando a guanilato ciclase solúvel, o que desencadeia a ativação da PKG. No entanto, este não é
o único mecanismo responsável pelo relaxamento vascular. Por exemplo, nas artérias coronárias,
a estimulação β-adrenérgica ativa a proteína quinase dependente de AMPc (PKA), que fosforila a
MLCK, diminuindo a sua atividade e, assim, reduzindo a fosforilação da MLC, o que contribui
para o relaxamento muscular.
3.3.1 Efeitos do NO sobre o relaxamento vascular
É importante observar que o foco deste trabalho não é revisar todos os mecanismos
responsáveis pelo relaxamento muscular, mas sim dar ênfase aos mecanismos mediados pelo NO.
Deve-se ressaltar, que existem outras substâncias vasoativas, como as prostaciclinas, que
exercem efeito suplementar ao NO no processo de relaxamento vascular.
Além do principal efeito do NO sobre os vasos sanguíneos, que é a promoção do
relaxamento vascular, citam-se outros efeitos como a inibição do crescimento das células
musculares lisas dos vasos sanguíneos e a indução da apoptose da célula muscular lisa (NISHIO
et al., 1996) após exposição crônica à altas doses de NO. Talvez o principal efeito do NO nos
vasos sanguíneos, depois do relaxamento da musculatura lisa, seja o controle da adesão e
agregação plaquetária. (LOSCALZO, 2001).
O envolvimento do fator de relaxamento derivado do endotélio, na sinalização do
relaxamento vascular, era evidente antes da sugestão de que este fator pudesse ser o NO.
Furchgott e Zawadzki (FURCHGOTT & ZAWADZKI, 1980), demonstraram que a integridade
do endotélio vascular era necessária para que o relaxamento vascular induzido pela acetilcolina
ocorresse.
A identificação da NO como sendo a molécula derivada do endotélio vascular,
responsável pela sinalização para o relaxamento do músculo liso vascular, foi descrita pelos
pesquisadores Luis Ignarro (IGNARRO et al., 1987a; IGNARRO et al., 1987b) e Salvador
Moncada (PALMER et al., 1987), no ano de 1987, em publicações quase que simultâneas. À
partir daí, começou-se a investigar a participação do NO como molécula sinalizadora em diversos
tecidos.
39
Após a descoberta de que o NO era o fator de relaxamento derivado do endotélio, o grupo
chefiado por Salvador Moncada, demonstrou através do uso de análogos da L-arginina, a
importância da síntese basal de NO na manutenção de valores normais de pressão arterial (REES
et al., 1989).
O estímulo para o relaxamento vascular proveniente do endotélio inicia-se depois que
agentes vasodilatadores como a bradicinina e prostaglandina E2, ligam-se a receptores de
membrana, na célula endotelial, ou através do estresse de cisalhamento sobre o endotélio
vascular. Ainda está pouco esclarecido como a atividade de NOS aumenta após o estímulo
proveniente do estresse de cisalhamento, mas sabe-se que este é um mecanismo importante para a
regulação do fluxo sanguíneo durante o controle da pressão arterial e durante o exercício físico.
Existe evidência de que o estresse de cisalhamento possa ativar os canais de cálcio da membrana
da célula endotelial, e dessa maneira ativar a eNOS. No entanto, o relaxamento mediado pelo
estresse de cisalhamento também pode ocorrer independente de alterações na concentração
intracelular de cálcio (IGNARRO, 2002).
Uma vez que os receptores de membrana, associados à proteína G, são ativados pela
ligação de agonistas, ocorre a ativação da enzima fosfolipase C e consequênte produção de IP3. O
IP3 age sobre os receptores presentes no retículo citoplasmático, determinando a liberação de
cálcio para o citoplasma. O aumento da concentração de cálcio no citoplasma ativa a
calmodulina, que por sua vez, ativa a eNOS, que é a isoforma predominante na célula endotelial.
Vale ressaltar que, em determinadas situações a iNOS e a nNOS , também podem exercer o papel
como sinalizador para o relaxamento do músculo liso.
O mecanismo de ação do NO na célula muscular lisa deve-se principalmente à ativação da
enzima guanilato ciclase. Uma vez produzido pelo endotélio, o NO se difunde até a célula
muscular dos vasos sanguíneos e liga-se à guanilato ciclase sensível ao NO. A guanilato ciclase
solúvel (GCs) representa o maior alvo para o NO na célula muscular. O termo guanilato ciclase
sensível ao óxido nítrico vem sendo usado pois, além de ativar a GCs, o NO é capaz de ativar um
dos dímeros da GC (α2β1) que é encontrado na membrana sináptica (FRIEBE & KOESLING,
2003). No entanto, o NO não é capaz de ativar a GC associada aos receptores de membrana
(FRIEBE & KOESLING, 2003).
O NO liga-se ao grupamento heme presente na GCs aumentando a atividade da enzima de
100 a até 400 vezes (STONE et al., 1995; STONE & MARLETTA, 1995a; STONE &
40
MARLETTA, 1995b). A ativação da GCs gera a produção de GMPc, que consequentemente
ativa a PKG. A PKG pode fosforilar canais de cálcio voltagem-dependentes presentes na
membrana celular, o que determina a diminuição da entrada de cálcio para a célula (TAGUCHI et
al., 1997; HEYDRICK, 2000). Existe evidência de que o NO bloqueie a ação da fosfolipase C,
consequentemente inibindo a liberação de cálcio mediada pelo trifosfato de inositol (IP3)
(HIRATA et al., 1990; CLEMENTI et al., 1995). A PKG também inibe a liberação de cálcio do
RS, por fosforilar e inibir os receptores de IP3 presentes em suas membranas (KOMALAVILAS
& LINCOLN, 1996). Somado a isto, o NO induz o aumento do transporte de cálcio pela bomba
de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA) de maneira independente da GMPc (BUSSE &
FLEMING, 2000) e também, parece aumentar a fosforilação da proteína fosfolambam durante o
relaxamento vascular (KARCZEWSKI et al., 1998). Todos estes efeitos determinam a
diminuição da concentração de cálcio livre no citoplasma e consequentemente contribuem para o
relaxamento muscular.
Outra ação da PKG é a fosforilação de canais de potássio (K+) na membrana celular,
promovendo o aumento do transporte de K+ e consequente repolarização da membrana,
contribuindo assim, para o relaxamento muscular (BUSSE & FLEMING, 2000). O NO também
pode aumentar o fluxo de K+ de maneira direta, por nitrosilar os canais de potássio dependentes
de cálcio, presentes na membrana celular do músculo liso (BOLOTINA et al., 1994).
Outra maneira pela qual a PKG induz o relaxamento do músculo liso é através da
dessensibilização dos filamentos contráteis. A PKG fosforila a MLCK, diminuindo a sua
atividade, e consequentemente, diminuindo a fosforilação da cadeia leve reguladora da miosina.
Aliado a isto, a ativação da PKG aumenta a atividade da MLCP, aparentemente por fosforilação
direta desta enzima ou talvez pelo bloqueio da inibição mediada pela Rho-quinase, o que
contribui para diminuir a fosforilação da MLC (LINCOLN et al., 2001).
A figura 4 Ilustra os mecanismos de produção do NO pelo endotélio vascular e os
mecanismos de ação desta molécula na célula muscular lisa, causando o relaxamento vascular.
41
Figura 4: Representação esquemática da produção e dos efeitos do óxido nítrico durante o relaxamento vascular. As abreviações usadas foram: R, receptores; PLC, fosfolipase C; G, proteína G; Vm, potencial de membrana; IP3, trifosfato de inositol; RC, retículo citoplasmático; CaM, calmodulina; eNOS, óxido nítrico sintase endotelial; iNOS, óxido nítrico sintase induzível; NO, óxido nítrico; sGC, guanilato ciclase solúvel; GTP, guanosina trifosfato; cGMP monofosfato cíclico de guanosina; PKG, proteína quinase dependente de cGMP; RS, retículo sarcoplasmático; PLB, fosfolambano; SERCA, bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático; MLCK, quinase da cadeia leve reguladora da miosina, P-MLC, cadeia reguladora da miosina fosforilada; MLCP, fosfatase da cadeia leve reguladora da miosina. Os símbolos + e – indicam estímulo e inibição de função, respectivamente. O quadro inserido no canto inferior direito indica a maneira pela qual e sGC é ativada pelo NO e está indicado pelo símbolo * na figura representativa da célula muscular lisa. A ligação do NO com o ferro do grupo heme causa a quebra da ligação do ferro com a histidina, o que induz alterações conformacionais na sGC, aumentando a sua atividade enzimática. Reproduzido sob autorização de (DIAS FA., 2007).
42
3.3.2 Efeitos do NO sobre a resposta β-adrenérgica
Existem poucos relatos na literatura com relação aos efeitos do NO sobre a modulação
colinérgica muscarínica. Porém, com relação aos efeitos do NO na resposta do cardiomiócito à
estimulação β-adrenérgica, existem vários relatos nos quais este composto foi descrito como
sendo capaz de atenuar o efeito inotrópico determinado pelo uso de agonista β-adrenérgico.
Animais cuja expressão gênica da enzima eNOS foi silenciada (nocaute), apresentam
aumento da contratilidade cardíaca durante estimulação induzida pelo uso de agonista β-
adrenérgico (BAROUCH et al., 2002), enquanto células isoladas de animais com superexpressão
de eNOS apresentam atenuação da resposta ao agonista β-adrenérgico (CAMPBELL et al., 1996;
MASSION et al., 2004). Um dos mecanismos que explicaria o efeito inibitório da enzima eNOS
sobre a resposta β-adrenérgica, seria a interação entre eNOS e os receptores adrenégicos do tipo
β3. Os receptores β3 exercem efeito inotrópico negativo no coração devido à ativação de proteína
G inibitória (Gαi) (GAUTHIER et al., 1996). Barouch e colaboradores (2002), demonstraram que
o uso do agonista específico dos receptores β3, o composto BRL 37344, não teve efeito em
cardiomiócitos isolados de animais eNOS nocaute quando comparados a animais-controle e
animais nNOS nocaute, nos quais efeitos inotrópicos negativos ocorreram. Utilizando células
isoladas de miocárdio humano, Gauthier e colaboradores (1998) também demonstraram a
interação de eNOS com os receptores β3. Neste trabalho, o efeito do agonista dos receptores do
tipo β3 (BRL 37344) foi atenuado pela incubação com o composto azul de metileno, um inibidor
da ativação da guanilato ciclase solúvel, além dos inibidores da NOS, LNMMA e L-NAME,
demonstrando o papel do NO neste efeito, e também demonstrando que a ação do NO era
mediada pela GCs.
Além disso, existe a sugestão de que eNOS poderia interagir com receptores muscarínicos
no coração (predominantemente M2), mediando os efeitos da estimulação colinérgica. Feron e
colaboradores (1997), demonstraram que após ativação, os receptores muscarínicos sofriam
translocação para as cavéolas, local onde eNOS tem sido associada à caveolina-3. A interação de
M2 com eNOS poderia induzir o desligamento desta com a caveolina e, consequentemente,
atenuar a inibição causada pela caveolina sobre a enzima. Han e colaboradores (1998a)
demonstraram, em células isoladas do nodo sinoatrial, que o efeito da ativação dos receptores
43
muscarínicos era dependente de NOS. Posteriormente, Han e colaboradores (1998b)
demonstraram que o efeito da estimulação dos receptores muscarínicos sobre a corrente de cálcio
através dos canais de membrana, durante a estimulação β-adrenérgica, estava parcialmente
abolida em células de animais eNOS nocaute. No entanto, outro grupo de pesquisadores
observaram que os efeitos da estimulação dos receptores muscarínicos sobre a corrente de cálcio
era independente da atividade da eNOS (BELEVYCH & HARVEY, 2000).
Diferente da isoforma endotelial da NOS, a isoforma neuronal, localizada no
cardiomiócito na membrana do RS (XU et al., 1999), parece determinar efeitos inotrópicos
positivos. Barouch e colaboradores (2002), sugeriram que o NO, produzido pela nNOS, facilitaria
a liberação de cálcio do RS pelos receptores rianodínicos (RyR). A explicação para efeitos
opostos entre eNOS e nNOS deve-se, provavelmente, à compartimentalização destas enzimas
dentro da célula cardíaca. A isoforma neuronal da NOS é expressa nas membranas do RS
próxima aos canais rianodínicos enquanto eNOS está localizada nas cavéolas da membrana
celular, próxima aos receptores β3-adrenérgicos e aos canais lentos de cálcio voltagem–
dependentes (BAROUCH et al., 2002). Como estas enzimas produzem NO em baixas
concentrações e devido ao fato do NO ter meia-vida de apenas alguns segundo, os efeitos deste
composto fica restrito aos alvos próximos da sua fonte de produção, isto é, da isoforma da NOS
de onde o gás originou-se. No entanto, Ashley e colaboradores (ASHLEY et al., 2002)
demonstraram que cardiomiócitos isolados de animais nNOS nocaute ou de animais-controle
onde a nNOS foi preferencialmente inibida (L-VNIO, 500uM), apresentaram aumento na
contratilidade em resposta à estimulação β-adrenérgica, sugerindo um efeito inibitório de nNOS
sobre a contratilidade cardíaca. Além disso, células isoladas de animais nNOS nocaute
apresentaram aumento da contratilidade basal, sugerindo que o efeito da produção basal de NO,
pela nNOS, seria inibitório sobre a recaptação de cálcio pelo retículo sarcoplasmático. Baseado
nestes resultados, ainda é difícil compreender a influência global da nNOS sobre a atividade
cardíaca basal e durante a estimulação β-adrenérgica do coração.
A expressão de iNOS estava associada com a atenuação dos efeitos da estimulação β-
adrenérgica no coração em diversos trabalhos (BALLIGAND et al., 1994; ADAM et al., 1999;
ZIOLO et al., 2001a; ZIOLO et al., 2001b; FUNAKOSHI et al., 2002; GEALEKMAN et al.,
2002; ZIOLO et al., 2004; BARTH et al., 2006). Em trabéculas e cardiomiócitos isolados de
miocárdio humano acometido por insuficiência cardíaca, Ziolo e colaboradores (ZIOLO et al.,
44
2004) demonstraram que a hiporesponsividade ao isoproterenol era revertida após inibição
seletiva da iNOS. A inibição desta isoforma da enzima, também aumentou os picos de cálcio
transiente nas células isoladas.
3.4 MECANISMOS DE AÇÃO DO NO NA CÉLULA CARDÍACA
Os mecanismos de ação do NO na célula cardíaca são mediados pelo aumento da
concentração da GMPc, por efeitos direto do NO sobre proteínas alvo ou por efeitos indiretos
mediados por derivados do NO.
Assim como ocorre na célula muscular lisa, o NO tem como alvo na célula cardíaca a
enzima guanilato ciclase solúvel (GCs). Uma vez ativada, a GCs catalisa a conversão de GTP em
GMPc, que consequentemente ativa a PKG. A PKG pode inibir o influxo de cálcio para a célula,
que ocorre através dos canais de cálcio voltagem-dependentes presentes na membrana celular
(HARTZELL & FISCHMEISTER, 1986; MERY et al., 1991) e pode diminuir a sensibilidade
dos miofilamentos ao cálcio (SHAH et al., 1994; YASUDA & LEW, 1997), provavelmente
através da fosforilação da troponina I (TnI) (LAYLAND et al., 2005).
Quanto à interação da via NO/GMPc e das vias de ativação do AMPc, durante a
estimulação β-adrenérgica, além dos efeitos geralmente opostos que a ativação da PKG
desencadeia (quando comparados aos efeitos desencadeados pela ativação da PKA), existe a
possibilidade de que o GMPc atue sobre as fosfodiesterases presentes no coração (BALLIGAND
et al., 2007). Balligand e colaboradores, sugerem que baixas doses de NO poderiam ativar a
GMPc, que por sua vez inibe a fosfodiesterase III e, dessa forma, poderia potencializar a ação do
AMPc, especialmente sobre o transporte de cálcio através dos canais de cálcio voltagem-
dependentes. No entanto, altas concentrações de NO estimulariam a fosfodiesterase II,
reconhecida como a fosfodiesterase dependente de GMPc, reduzindo dessa forma, a quantidade
de AMPc e determinando a atenuação dos efeitos da estimulação β-adrenérgica.
É importante observar também que efeitos diretos mediados pelo NO podem ocorrer. Hu e
colaboradores (1997) demonstraram que o NO pode atuar de forma direta diminuindo a corrente
de cálcio através dos canais de cálcio voltagem-dependente da membrana. Outro efeito mediados
45
pelo NO, independentes de GMPc, ocorre sobre a respiração celular. Como demonstrado por
Kelm e colaboradores (1997), a depressão na geração de energia pelas mitocôndrias estava
associada à inibição da contratilidade cardíaca induzida pelo NO. Xie e colaboradores (1996),
também demonstraram que o doador de NO, SNAP, foi capaz de inibir a respiração celular em
ventrículo de cães. Adicionalmente, Cleeter e colaboradores (1994), demonstraram que o NO é
capaz de inibir reversivelmente a enzima citocromo c oxidase, in vitro.
Além disso, os efeitos da produção de altas doses de NO podem ocorrer de forma indireta,
através da formação de derivados do NO. Como discutido na secção 3.1, um dos derivados de
alta reatividade e efeitos biológicos deletérios é o peroxinitrito. O peroxinitrito é derivado da
reação entre o NO e o superóxido. O superóxido pode inclusive ser produzido pelas enzimas
produtoras de NOS, quando ocorre o desacoplamento dos homodímeros da NOS. O peroxinitrito
pode causar danos celulares por induzir: lesão direta sobre o DNA (BURNEY et al., 1999),
peroxidação de lipídeos (RUBBO et al., 1994), disfunção mitocondrial (CASSINA & RADI,
1996; CASSINA et al., 2000), além de promover estresse oxidativo, tendo como alvo diversas
proteínas dentro da célula cardíaca (FUKUTO et al., 2000; WINK et al., 2000).
Os efeitos diretos e indiretos do NO estão sumarizados na figura 5. A figura é uma
representação esquemática dos efeitos do NO sobre seus principais alvos dentro da célula
muscular cardíaca.
46
Figura 5: Representação esquemática do mecanismo de ação do Óxido Nítrico na célula muscular cardíaca. As abreviações usadas foram : NE, norepinefrina; β1,2R, receptores β-adrenérgicos do subtipos 1 e 2; AcH, acetilcolina; M2, receptor muscarínico do tipo 2; Cav-3, caveolina-3; eNOS, óxido nítrico sintase endotelial; iNOS, óxido nítrico sintase induzível; nNOS, óxido nítrico sintase neuronal; NO, óxido nítrico; sGC, guanilato ciclase solúvel; PDE, fosfodiesterases; cAMP, monofosfato cíclico de adenosina; cGMP monofosfato cíclico de guanosina; PKA, proteína quinase A; PKG, proteína quinase dependente de cGMP; RS, retículo sarcoplasmático; PLB, fosfolambano; SERCA, bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático; TnI, troponina I; RyR, canais rionidínicos; O2-, superóxido; ONOO-, peroxinitrito. Os canais de cálcio de membrana do tipo L estão representados em amarelo. Os símbolos + e – indicam estímulo e inibição de função, respectivamente. Reproduzido sob autorização de (DIAS FA., 2007).
47
4 ADENOSINA – REVISÃO
A adenosina é um nucleosídeo da família das purinas que, por sua vez, são compostos
orgânicos aromáticos heterocíclicos e são formadas de um anel pirimidínico fundido a um anel
imidazólico. Fazem parte, portanto, do grupo das bases nitrogenadas. A quantidade de purinas
encontradas na natureza é enorme, visto que 50% das bases nitrogenadas encontradas nos ácidos
nucléicos, a adenina e guanina (Figura 6), são purinas.
Os nucleosídeos e nucletídeos purínicos desempenham funções importantes em todas as
células. São precursores do DNA e RNA, são transportadores essenciais de energia química
(ATP) e são componentes dos cofatores: Nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD), Flavina
adenina dinucleotídeo (FAD), S-adenosilmetionina e coenzima A, bem como de mensageiros
celulares secundários, o AMP e GMP cíclico (NELSON DL & COX MM, 2002).
A adenosina é uma substância natural metabólica, que está presente em todas células
vivas, é composta de adenina e d-ribose. Além de ser componente do DNA e RNA, a própria
adenosina é um neurotransmissor. Sob condições fisiológicas e patofisiológicas, a adenosina é
liberada das células e interage com receptores específicos de membrana para modular a função
celular de forma autócrina ou parácrina (BELARDINELLI et al., 1989; SPARKS et al., 1986). A
adenosina está presente nos meios intra e extracelular e possui sua disponibilidade altamente
controlada devido ao papel neuromodulador e homeostático que exerce (CUNHA, 2001). As
concentrações intracelulares de adenosina encontram-se na ordem de 10 a 50 nM, enquanto as
concentrações extracelulares encontradas na fenda sináptica são de aproximadamente 0,5 a 4 µM
(CUNHA, 2001).
A biossíntese e regulação de purinas no organismo são bem conhecidas e ocorrem
principalmente no fígado. Existem dois tipos de vias que levam a formação do anel purínico: as
vias de síntese “de novo” e as vias de salvamento ou recuperação. Na síntese “de novo” a
estrutura do anel de purina é construída a partir do 5-fosforibosilpirofosfato (PRPP), derivado da
ribose-5-fosfato, em um processo multienzimático de adição de átomos provenientes de
aminoácidos (glutamina, glicina, aspartato), folato e CO2, tendo como produtos finais o IMP
(inosina monofosfato), o AMP (adenosina monofosfato) e o GMP (guanosina monofosfato). As
vias de recuperação são mais simples, utilizando purinas livres (adenosina, guanina, hipoxantina),
48
Figura 6: Estrutura química básica da purina e de seus derivados: adenina, guanina e adenosina.
49
originadas da degradação metabólica dos nucleotídeos, as quais reagem com o PRPP para
formar o nucleotídeo correspondente. Assim, a adenosina e outras bases purínicas são, em
grande parte, recuperadas e empregadas novamente na síntese de nucleotídeos, mas uma outra
porção, proveniente também da degradação de nucleosídeos dos ácidos nucléicos, assim como da
própria alimentação, pode ser catabolizada em produtos de excreção final, como o ácido úrico
(NELSON DL & COX MM, 2002).
A adenosina é produto da hidrólise enzimática de dois substratos: (1) a clivagem da S-
adenosilhomocisteína (SHA) pela enzima S-adenosilhomocisteína hidrolase (DUNWIDDIE &
MASINO, 2001); e (2) a degradação do nucleotídeo monofosfatado AMP pela enzima 5’-
nucleotidase citosólica, sendo este último, o principal mecanismo de produção da adenosina nos
cardiomiócitos (BRUNDEGE & DUNWIDDIE, 1997).
A adenosina é transportada através da membrana celular por uma combinação de difusão
simples e difusão facilitada (PATERSON et al., 1981; YONG & JARVIS, 1983). Alterações na
concentração intracelular de adenosina influenciam sua concentração extracelular, devido à
presença de transportadores equilibrativos e bidirecionais específicos de adenosina (WANG et
al., 1997; DHALLA et al., 2001). Devido à alta afinidade de uma enzima chamada adenosina
quinase pela adenosina, sua concentração intracelular é relativamente baixa, favorecendo o
influxo através destes transportadores (BRUNDEGE & DUNWIDDIE, 1997). Em condições de
estresse, como por exemplo, trauma, isquemia ou hipóxia, choque séptico, as concentrações
plasmáticas de adenosina podem aumentar drasticamente, chegando a atingir concentrações de
micromolar, o que favorece o influxo através dos mesmos transportadores (HAGBERG H et al.,
1987). Além da adenosina proveniente dos transportadores, existe uma importante cascata
enzimática que produz adenosina a partir do AMP (PARKINSON et al., 2000). Um esquema das
vias de metabolização da adenosina está representado na Figura 7.
No meio extracelular, a concentração de adenosina é regulada pela ação de ecto-5’-
nucleotidases que correspondem a um conjunto de enzimas que se encontram ancoradas à
membrana plasmática por um ou dois domínios transmembranares e com capacidade de
hidrolisar nucleotídeos extracelulares, uma vez que apresentam seu sítio catalítico voltado para o
meio externo da célula. Assim, essas enzimas agem em substratos específicos como nucleotídeos
das bases púricas (adenina e guanina) ou pirimidínicas (timina, uracila e citosina), solúveis no
50
meio extracelular, tendo como produto dessa hidrólise os respectivos nucleotídeos, ATP, ADP,
AMP (ZIMMERMANN, 2001).
Também no meio extracelular a adenosina é regulada pela ação de uma enzima chamada
adenosina deaminase e pela elevada recaptação das células, seguida de metabolização intracelular
(DEUSSEN A et al., 1999). Produção, captação celular e metabolismo determinam a
disponibilidade de adenosina nos tecidos e órgãos. Estes processos são interdependentes e
altamente regulados.
As primeiras evidências do papel fisiológico da adenosina foram obtidas através de
estudos de Drury & Szent-Gyorgyi em 1929, que demonstraram que a adenosina extraída de
coração de cães era um potente agente cronotrópico negativo e vasodilatador coronário.
Posteriormente, foram observadas ações da adenosina em outras células e sistemas orgânicos
(SAWYNOK J, 1998; DUNWIDDIE TV & MASINO SA, 2001; MCCALLION K et al., 2004;
ADAIR TH, 2005; CONLON BA et al., 2005; VALLON V et al., 2006). Apesar de agir em
praticamente todas as células e órgãos do organismo, seus efeitos mais importantes são
observados no coração, cérebro, rins e células do sistema imunitário. Por sua ação ser
basicamente restrita ao local onde é liberada, a adenosina é considerada principalmente, como um
autacóide [do grego autos – próprio e akos – alívio, cura]. Segundo Fredholm (2007) isto se dá
devido a adenosina possuir uma meia-vida nos fluidos biológicos na ordem de segundos, o que
determina que seus efeitos sejam, em geral, localizados.
Em consequência de sua concentração aumentar em resposta a agressões e de exercer
efeitos protetores locais a agressões tissulares, a adenosina tem sido denominada de metabólito
retaliatório (NEWBY AC, 1984). Este papel protetor é operado por pelo menos dois mecanismos
distintos: 1), diminuição da demanda energética, por um efeito inibitório direto da função celular
(efeito inotrópico negativo no miocárdio) e 2) mobilização de reservas locais de nutrientes
(vasodilatação). Desta forma, a adenosina exerce efeitos protetores amplos em situações como
aquelas representadas por agressão por isquemia/reperfusão e por agentes inflamatórios
(MOYER JD et al., 2001; CROSS HR et al., 2002; CHEN Y & BACHE RJ, 2003; HEADRICK
JP et al., 2003; CONLON BA et al., 2005).
A adenosina exerce seus efeitos nas células cardíacas através da ativação de receptores
específicos, denominados receptores purínicos P1, que são classificados em A1, A2A, A2B e A3
(RALEVIC V e BURNSTOCK G, 1998; FREDHOLM BB et al., 2001; KLINGER M et al.,
51
Figura 7: Esquema representativo do metabolismo da adenosina. ADP = adenosina difosfato; AMP = adenosina monofosfato; ATP = adenosina trifosfato; SAH = S-adenosilhomocisteína (WIN-KUANG & KURACHI Y, 1995).
52
2002; BURNSTOCK G, 2007). Estes receptores pertencem à superfamília de receptores
acoplados à proteína G. Também compõem o sistema purinérgicos os receptores P2, que possuem
maior afinidade pelo ATP e pelo ADP, e uma menor afinidade com a adenosina. Como neste
estudo buscamos caracterizar efeito de fármacos capazes de ativar (adenosina) ou bloquear
(teofilina) os receptores purinérgicos sensíveis á adenosina (receptores de adenosina) cardíacos,
não abordaremos, portanto, os receptores P2.
Os receptores do tipo A1 e A3 são receptores de alta e baixa atividade para a adenosina,
respectivamente, e ambos inibem a atividade da adenilato ciclase. Em contrapartida, os receptores
de alta e baixa afinidade, A2A e A2B, respectivamente, ativam a adenilato ciclase. Além de
regular a atividade desta enzima, os subtipos de receptores de adenosina são também acoplados a
distintas proteínas G, atuando em outros sistemas efetores, incluindo canais de cálcio e potássio,
fosfolipase C, -D, -A2, GMPc, fosfodiesterases, e proteínas quinases ativadas por mitógenos
(MAPK) (KAISER SM & QUINN RJ, 1999; JACOBSON KA & GAO ZG, 2006). Assim, a
resposta final mediada pela adenosina pode variar de acordo com o subtipo de receptor ativado.
Os receptores de adenosina apresentam uma grande contribuição nos efeitos protetores
contra isquemia e hipóxia no miocárdio (LIANG & JACOBSON, 1998; ZHAO et al., 2000). O
efeito vasodilatador provocado pela adenosina é normalmente relacionado à ativação do receptor
A2b. Como exemplo de ações provocadas pelos diversos tipos de receptores, quando ligados a
adenosina, temos que: - o receptor A1 antagoniza a abertura de canais de Ca2+ e atenua a
estimulação adrenoceptora, além de inibir a liberação de catecolaminas; - o receptor A2a medeia
ações vasodilatadoras, inibe agregação plaquetária e inibe a produção de citocinas; - o receptor
A2b também medeia ações vasodilatadoras, inibe o crescimento e função de células
mesenquimais como fibroblastos, além de estimular a proliferação de células endoteliais e; - ao
contrário dos outros receptores de adenosina, o receptor A3 pode mediar um efeito bifásico,
tornando-se um receptor atípico, onde em concentrações nanomolares resulta na proteção celular,
enquanto que em concentrações micromolares leva à indução de morte celular ou apoptose
(JACOBSON et al., 1999). Todos esses receptores ativam a via da PKC e MAPK (mitogen-
activated protein kinase).
RONGEN e col.,. (1997) mostraram que a formação aumentada de adenosina, durante o
processo de isquemia, causa vasodilatação via ações dependentes e independentes do endotélio,
além de inibir a liberação de noradrenalina dos nervos simpáticos (MARSHALL, 2000). A
53
adenosina além de um mediador endógeno, pode também ser sintetizada e usada como fármaco.
Atualmente ela é usada como uma nova classe de antiarrítmicos. Os efeitos transitórios e
específicos da adenosina fazem dela o agente de escolha no tratamento de cura das taquicardias
supraventriculares (TSVs) que têm origem nos NSA e NAV (THOMPSON & BALSER, 2004).
Seu mecanismo se dá via receptor A1, diminuindo a condução nodal através da inibição da
corrente de cálcio, que é provocada pela metabolização e conseqüente redução do AMPc. A
taquicardia atrial provocada pelo aumento do AMPc, é uma rara exceção na qual a adenosina
pode eliminá-la, mediante a inibição da adenilciclase, que é convertida em AMPc através da
fosfodiesterase (PDE).
Em virtude das ações descritas até o momento, a adenosina tem tido na clínica uma
importante aplicação terapêutica no tratamento de arritmias, isquemia e outras disfunções
circulatórias. No entanto, quando em altas concentrações, a adenosina pode também levar a
efeitos antagônicos, com ação pró-arrítmica, podendo originar a pausa ou o bloqueio dos nódulos
sinusal e átrio-ventricular (MUBAGWA & FLAMENG, 2001).
O fato da adenosina ser um catabólito imediato dos nucleotídeos de adenina (ATP, ADP e
AMP), a torna uma molécula sinalizadora adequada tanto para situações fisiológicas como
patológicas, que resultem em degradação dos nucleotídeos de adenina. Dessa forma, todos os
fenômenos biológicos que sofrem interferência da adenosina podem ser modulados por agonistas
e antagonistas de seu receptor ou por compostos capazes de interferir na concentração de
adenosina tecidual.
Metilxantinas, cafeína e teofilina são antagonista competitivos não específicos dos
receptores de adenosina. Assim como os antagonistas, os agonistas dos receptores de adenosina
também são amplamente estudados (YAN L et al., 2003). No entanto, tem um emprego
terapêutico limitado em função de seus efeitos colaterais, em particular, hipotensão, bradicardia,
efeito antidiurético, que são conseqüências da interação ampla nos receptores distribuídos pelo
organismo (KOWALUK EA et al., 1998; KOWALUK EA & JARVIS MF, 2000, JARVIS MF et
al., 2002). Da mesma maneira, a administração de adenosina exógena na terapia de doenças tem
aplicação prática restrita. Administrada sistemicamente, a adenosina exerce efeitos
cardiovasculares que limitam seu uso (ROSS AM et al., 2005).
54
4.1 PARTICIPAÇÃO DO NO E DA ADENOSINA NA CARDIOPROTEÇÃO
Não foi por acaso que escolhemos como objeto de investigação o papel do Óxido Nítrico
e da adenosina na resposta funcional cardíaca. Como vimos na revisão anterior, estas duas
substâncias estão intimamente relacionadas com a funcionalidade cardíaca, tanto em condições
fisiológicas quanto em condições patofisiológicas. A participação dessas substâncias vem sendo
relatada nos últimos anos, principalmente na cardioproteção relacionada a processos de
isquemia/reperfusão. Apesar de serem ainda pouco compreendidos todos os mecanismos por
quais elas atuam, existem fortes indícios que suportam seu envolvimento na cardioproteção. Por
exemplo, atualmente a participação da adenosina na cardioproteção tem sido relatada
principalmente no pós-condicionamento isquêmico, o qual envolve breves, embora intermitentes,
períodos de isquemia durante a reperfusão tecidual. Segundo Kin e colaboradores (2004), estes
períodos de isquemia/reperfusão podem alterar a produção endógena de autacóides, como a
adenosina, a bradicinina ou opióides. Segundo os mesmos autores, a interrupção da reperfusão
pode, ainda, atrasar a eliminação da adenosina endógena ou de outros intermediários purínicos.
Dois relatos sugerem que a adenosina liberada endogenamente está envolvida na
cardioproteção pelo pós-condicionamento. Em estudo realizado por Kin e colaboradores (2004),
relata-se que a liberação de adenosina endógena no perfusato de corações isolados de rato foi
retardada durante o pós-condicionamento. Além disso, estes autores relataram, em um modelo
murínico de oclusão coronária-reperfusão, que o bloqueio dos receptores de adenosina com o uso
de 10 mg/kg teofilina administrada, por via intravenosa cinco minutos antes da reperfusão,
reverteu a redução do infarto observada no pós-condicionamento. Esta observação também foi
apoiada por um trabalho efetuado por Philipp e colaboradores (2004) utilizando um modelo in
situ de oclusão coronária-reperfusão em coelhos.
Kin e colaboradores (2005) sugerem que as ações cardioprotetoras relacionadas a
adenosina durante o pós-condicionamento referem-se a ativação dos receptores A2A e A3, e não
somente aos receptores A1. Tomados juntos, estes dados sugerem que a eliminação da adenosina
liberada endogenamente sofre um retardo, presumidamente, por permitir maiores concentrações
intravasculares de adenosina, que segundo o autor, levaria aos efeitos cardioprotetores.
55
Outros autores relatam que altas concentrações de adenosina endógena podem agir como
um gatilho para a cardioproteção, potencialmente através de sua interação com as proteínas G
acopladas à receptores adrenérgicos. Existe também a hipótese de que a adenosina endógena
possa, durante o pós-condicionamento, atenuar a liberação de substâncias oxidantes e citosinas
por ativar o endotélio vascular coronariano e miócitos (DARLING et al., 2004; GALAGUDZA et
al., 2004; SUN et al., 2004; TSANG et al., 2004; YANG et al., 2004).
No que se refere a participação do NO na cardioproteção, na literatura pesquisada não foi
possível encontrar um mecanismo específico de ação deste gás que explicasse os efeitos
cardioprotetotores por ele exercidos. Por outro lado, existem alguns relatos como um estudo
realizado por Yang e colaboradores (2004) nos quais demonstra-se que a enzima NOS está
envolvida na cardioproteção pelo pós-condicionamento isquêmico. Neste estudo, bloqueando a
NOS com o L-NAME, administrado isoladamente antes da reperfusão, não foi possível obter
efeitos sobre o tamanho da área de infarto. Porém, em conjunto com o pós-condicionamento, o L-
NAME inibiu completamente os efeitos protetores do mesmo. Adicionalmente, Pagliaro e
colaboradores (2004) relataram que os resultados preliminares do pós-condicionamento podem
ser bloqueados pelo L-NAME e por inibidor da guanilato ciclase, sugerindo uma via NO - GMPc.
As NOS podem estar envolvidas em diversos níveis na ischemia/reperfusão pois, o
endotélio vascular saudável libera NO pela atividade da e-NOS. No entanto, a liberação de NO
pelo endotélio vascular coronariano é prejudicada após isquemia e reperfusão (GUO et al., 1996,
Ma X-L et al., 1993). Embora ainda não tenha sido demonstrado por medida direta, a liberação
de NO pelo endotélio vascular em corações pós-condicionados pode estar preservada, tal como
sugerido pela atenuada expressão de P-selectina, decréscimo na aderência de neutrofílos e,
melhora da resposta vasodilatadora a acetilcolina, observada após o pós-condicionamento em
modelos caninos (HALKOS et al., 2004, ZHAO et al., 2003, ZHAO et al 2002).
Estes relatos de participação do NO e da adenosina na cardioproteção fortalecem nossa
hipótese de que essas substâncias podem estar envolvidas na resposta funcional de corações
isolados de ratos na preparação de Langendorff de circulação fechada, possivelmente
desempenhando um papel cardioprotetor.
A seguir, apresentamos a metodologia utilizada neste estudo.
56
5. METODOLOGIA
5.1 ABORDAGEM GERAL
Abordagens experimentais adotadas:
Para corações isolados:
1ª- Foi usada a estimulação elétrica transmural, “EET”, por campo elétrico, para testar a
possibilidade de reversão da queda dos parâmetros cardíacos.
2ª- Foi avaliado o efeito de fármacos envolvidos no metabolismo do óxido nítrico e da
adenosina.
Para átrios isolados:
1ª- Foram banhados átrios direito isolados com solução anteriormente usada para
perfundir corações isolados em circuito fechado com 100 ml.
Dos corações isolados foram quantificados três parâmetros fisiológicos ao longo do tempo
de experimento: freqüência cardíaca (FC), pressão ventricular esquerda (PVE) e fluxo da
perfusão cardíaca (FP).
Para os experimentos com o átrio isolado foi quantificada a freqüência atrial (FA) e
testada a inducibilidade de arritmias.
A seguir apresenta-se uma descrição detalhada destas abordagens experimentais.
5.2 ANIMAIS
Foram utilizadas preparações de coração e átrio isolado de ratos Wistar machos adultos (3
meses) com peso médio de 290 ± 5g (média e erro padrão, N = 57), provenientes do Biotério
Central da Universidade de Mogi das Cruzes (UMC). Os animais foram mantidos em gaiolas de
57
polipropileno (50 cm x 40 cm) padronizadas, com cama de maravalha esterilizada e sob condições
ambientais estáveis (temperatura ambiental de 22 2 ºC, umidade relativa do ar 45% a 75% e
duração do fotoperíodo no regime de 12 horas claro / 12 horas escuro invertido). Os animais
utilizados foram pesados em balança (Ramuza, Ind. Com. Balanças Ltda) antes do início dos
experimentos. Para manter as condições de estabilidade necessária para a espécie, os seguintes
cuidados foram tomados: o número de animais por gaiolas não foi superior a cinco e a troca e
limpeza das gaiolas foram realizadas sempre pela mesma pessoa numa freqüência de três vezes
por semana em dias alternados. Água acidificada com HCl lN (pH entre 2 - 3) e ração comercial
peletizada (Nuvilab® CR-1) foram fornecidas em regime ad libibitum.
5.3 SOLUÇÃO FISIOLÓGICA
Utilizamos solução de Krebs-Henseleit (K-H) composta pelos seguintes reagentes (mM):
NaCl 126,4; KCl 4,6; KH2PO 1,2; MgSO4 1,2; CaCl2 1,5; glicose 11,1, tendo o seu pH
estabilizado em 7,4 com bicarbonato de sódio (NaHCO3 13,6) a 34,5ºC. A solução é
continuamente borbulhada com mistura carbogênica (95% O2 + 5% CO2) para oxigenação da
amostra e estabilização do pH.
Para pesar os reagentes que compunham a solução de K-H foi utilizado uma balança
digital (Ohaus® Corporation E02140), e um pHmetro (Digimed® DM-22) para aferir o pH da
mesma e também foi utilizado um pHmetro portátil (Gehaka® PG 1400) para aferição do pH
durante os experimentos. Após sua homogeneização a solução de K-H é armazenada em uma
geladeira (Continental® Eleganci) na temperatura de aproximadamente 8ºC e reaquecida no dia e
minutos antes do experimento em banho maria (Fanem® 102) a temperatura de 34,5ºC para
experimentos com corações isolados e, 36,5ºC para os experimentos com átrio isolado.
58
5.4 PREPARAÇÃO BIOLÓGICA
1) “Coração Isolado”
Os animais foram submetidos à eutanásia por concussão cerebral, sendo então decapitados
e seus corações retirados após rápida abertura da caixa torácica e dissecção. Este procedimento
está de acordo com o “Canadian Council on Animal Care” (1993) e aprovado pela Comissão de
Ética em Manipulação e Experimentação Animal da Universidade de Mogi das Cruzes (CEMEA).
Após a remoção do coração, o mesmo é colocado em uma placa de Petri e submetido à
limpeza, retirando estruturas circunvizinhas que permanecem junto à amostra, sendo em seguida
posicionado através de ligadura a uma cânula (inserida na artéria aorta) fixada na montagem
experimental (preparação de Langendorff), para assim ser perfundido retrogradamente com
solução de K-H a 34,5ºC.
2) “Átrio Isolado”
Para o isolamento do átrio adotam-se os mesmos procedimentos usados para isolar o
coração, porém, descartamos todas outras estruturas cardíacas, como ventrículos e átrio esquerdo,
isolando apenas o átrio direito, o qual exibe atividade elétrica espontânea devido à presença do
nódulo sinusal. Após isolarmos o átrio, ele é colocado em uma cuba de perfusão previamente
preenchida com solução de K-H, mantida em uma temperatura de 36,5 C e saturada com
carbogênio.
A seguir é apresentada uma descrição detalhada da preparação de Langendorff e da
preparação para átrio isolado.
59
5.5 MONTAGENS EXPERIMENTAIS
Duas configurações básicas da montagem de Langendorff foram adotadas para perfusão
dos corações isolados: 1) Perfusão em circuito aberto - CA (ou não re-circulante) e 2) Perfusão
em circuito fechado - CF (ou re-circulante). Para os experimentos com átrio isolado foi utilizada
uma preparação de átrio isolado.
5.5.1 Montagem de Langendorff de Circuito Aberto
No circuito aberto (figura 8) a solução de perfusão que se encontra no reservatório de
solução, borbulhada constantemente com 5% CO2 e 95% O2, cai por gravidade do reservatório
através de uma tubulação de silicone (coluna de perfusão); entra na artéria aorta através de uma
cânula e, deste modo, perfunde o coração, imerso em uma câmara com solução aquecida, através
das artérias coronárias. A solução é descartada por sucção a vácuo após perfundir o coração. Uma
pressão hidrostática constante de 82 cm de água é mantida no coração nesta configuração.
A figura 8 lustra a montagem experimental com sistema captação, amplificação e
aquisição dos sinais. O eletrocardiograma (ECG) do coração isolado foi captado por 2 eletrodos
(Ag/AgCl) de captação e 1 eletrodo (Ag/AgCl) de referência colocados na solução da cuba de
perfusão. Estes eletrodos foram conectados a um Amplificador de Biopotenciais desenvolvido no
Laboratório de Instrumentação Biomédica (LIB), para amplificar os potenciais elétricos gerados
pelo coração. Este amplificador continha filtro de 1ª ordem passa-alta (3Hz), filtro de 3ª ordem
passa-baixa (100Hz) e filtro Notch (60Hz) do tipo Butterworth, todos acoplados em série.
60
Figura 8: Ilustração da montagem de Langendorff completa em circuito aberto. O percurso da solução de perfusão (KH) do coração isolado (CI) esta indicado pelas setas (do reservatório de solução até o recipiente de vácuo para descarte da solução excedente). O aparato para captação, visualização e aquisição dos parâmetros cardíacos também é ilustrado. O traçado do ECG é captado pelos eletrodos de captação (EC 1 e EC 2) e de referência (ER) e amplificado por amplificador de biopotenciais. A Pressão Ventricular Esquerda é captada através do transdutor de pressão e amplificada por amplificador de biopotenciais. Estes parâmetros são visualizados em um osciloscópio e registrados através de um sistema computadorizado para aquisição de dados. O fluxo da perfusão é captado através da contagem do gotejamento no “cata-bolha”, durante 1 minuto.
61
A pressão gerada no ventrículo esquerdo foi captada por meio de um transdutor de
pressão (Narco® Bio-systems, modelo P100B, cedido pelo Prof. Dr. JWM Bassani,
DEB/FEEC/UNICAMP), acoplado a uma derivação do equipo de perfusão por uma torneira de
três vias posicionada no mesmo nível do coração. O sinal da pressão ventricular esquerda foi
amplificado em 10x por um amplificador diferencial dotado de filtro passa-baixa ativo tipo
Butterworth de 2ª ordem, com freqüência de corte em 22,5Hz.
O fluxo de perfusão do coração foi obtido pela contagem, durante um minuto, do
gotejamento da solução de perfusão em um catabolhas instalado no reservatório de solução.
O ECG e a onda resultante da pressão ventricular esquerda foram visualizados em um
Osciloscópio (Tektronix® TDS210) para monitoramento dos sinais elétricos e mecânicos do
coração. Estes sinais foram armazenados em disco rígido através de um sistema computadorizado
para aquisição de dados. Este sistema é constituído de um microcomputador (LG® processador
Intel, Pentium Core Dual 1.6 Ghz e 100GB Ram, com sistema operacional Windows® XP),
acoplado, via adaptador de rede Ethernet, a uma placa conversora analógica digital – placa A/D –
(Lynx AC1160). O sinal captado foi acondicionado via programa de aquisição de sinal
(AqDados® 7.02), sendo os registros analisados no programa AqDAnalysis® 7 (Lynx Tecn.
Electr. Ltda., São Paulo, SP, Brasil).
Para realizar a estimulação elétrica nos corações isolados, foram utilizados dois eletrodos
em forma de placas de aço inoxidável com 28 mm de largura, submersos 38 mm na solução.
Estes eletrodos estavam acoplados a uma unidade de estimulação isolada que, por sua vez, estava
ligado a um estimulador elétrico de tensão (Grass, S48 – Stimulator; Grass Inst. Div., Astro-Med
Inc., W. Warwick, RI, USA).
5.5.2 Montagem de Langendorff de Circuito Fechado
A principal diferença da montagem em circuito fechado (figura 9) para a montagem de
circuito aberto (figura 8) é que, no circuito fechado, para re-circular a solução, uma bomba (5)
gera vácuo na câmara (A) a qual suga a solução da câmara (C). Em seguida, o vácuo é
interrompido, fazendo com que a solução passe, via válvula passiva (1), da câmara (A) para o
62
reservatório (B), perfundindo novamente o coração isolado (CI). Para que o sistema ora gere
vácuo, ora permita a entrada de ar na câmara (A), é utilizada uma torneira de 3 vias acoplada a
um motor giratório (3). A montagem em circuito fechado está ilustrada na figura 9 sem o sistema
de capitação, amplificação e aquisição de sinais, o qual é o mesmo da montagem em circuito
aberto.
5.5.3 Calibrações das preparações de langendorff (coração isolado)
As calibrações foram realizadas para avaliar o funcionamento dos equipamentos
utilizados para captação dos parâmetros cardíacos durante a experimentação, assim como
estabelecer os valores para conversão dos parâmetros cardíacos avaliados.
O transdutor de pressão foi calibrado, todas às vezes, minutos antes do inicio de qualquer
experimento, através dos botões de autocalibração do aparelho. A figura 10 apresenta a curva de
calibração do transdutor de pressão.
A curva foi obtida através de pressões conhecidas fornecidas por um esfignanômetro,
possibilitando assim determinarmos o fator de calibração utilizado para conversão de Tensão (V)
para milímetros de mercúrio (mmHg). O fator de calibração encontrado foi de 35 mmHg/Volt.
A calibração da montagem que possibilitou a captação do parâmetro “Fluxo da Perfusão”
foi feita através da pesagem das gotas em uma balança digital (Ohaus® Corporation E02140),
estabelecendo que o peso de 13,3 gotas equivalem a 1 ml de solução. Com isso conseguimos
calcular o volume de cada gota e converter gotas por minuto (g/min) em mililitros por minuto
(ml/min).
O osciloscópio também foi devidamente calibrado antes dos experimentos, sendo isto
feito através do sinal de autocalibração do aparelho.
63
Figura 9: Ilustração da montagem experimental de Langendorff de circulação fechada. A solução passa do reservatório (B) por uma coluna com 80cm de altura (2) e perfunde o coração isolado (CI) em uma câmara com solução aquecida (C). Para re-circular a solução, uma bomba (5) gera vácuo na câmara (A) a qual suga a solução da câmara (C). Em seguida, o vácuo é interrompido, fazendo com que a solução passe, via válvula passiva (1), da câmara (A) para o reservatório (B), perfundindo novamente o (CI). Para que o sistema ora gere vácuo, ora permita a entrada de ar na câmara (A), é utilizada uma torneira de 3 vias acoplada a um motor giratório (3). Os sistemas de captação, amplificação e aquisição dos parâmetros cardíacos estão omitidos nesta ilustração.
64
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 1050,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Calibração do Transdutor de Pressão
TE
NSÃ
O P
ICO
A P
ICO
(V
)
PRESSÃO EM mmHg
Figura 10: Gráfico de calibração do transdutor de pressão utilizado na preparação de Langendorff. As pressões de 10 e 100 mmHg representam as pressões fornecidas pelos botões de autocalibração do transdutor e as demais, são fornecidas por um esfignamômetro. CR é o coeficiente de correlação entre as variáveis, para p< 0,05.
65
5.6 Montagem de Átrio Isolado
A figura 11 apresenta a montagem utilizada para átrio isolado. Na parte central da figura
(1) encontra-se a cuba de perfusão cilíndrica onde o átrio foi perfundido continuamente com
solução de K-H. Na parte inferior direita da figura encontra-se o estimulador elétrico de tensão
(5) (Grass, S48 – Stimulator; Grass Inst. Div., Astro-Med Inc., W. Warwick, RI, USA) utilizado
para promover a estimulação elétrica externa. Logo acima do estimulador encontra-se o
amplificador diferencial (4) (World Precision Instruments, Inc; Isso-DAM8) utilizado para
captação e amplificação do sinal obtido durante o experimento. Logo acima do amplificador, está
o osciloscópio digital (3) (Tektronix, TDS-210) utilizado para monitoramento do eletrograma
atrial. Mais ao centro da figura, está a unidade de estimulação isolada (6), Finalmente, no canto
esquerdo da figura (2), tem-se um microcomputador (LG® processador Intel, Pentium Core Dual
1.6 Ghz e 100GB Ram com sistema operacional Windows® XP) equipado com um sistema de
aquisição de sinais acoplado, via adaptador de rede Ethernet, a uma placa conversora analógica
digital – placa A/D – (Lynx AC1160). O sinal captado foi acondicionado via programa de
aquisição de sinal (AqDados® 7.02), sendo os registros analisados no programa AqDAnalysis® 7
(Lynx Tecn. Electr. Ltda., São Paulo, SP, Brasil).
66
Figura 11: Foto ilustrando a montagem experimental utilizada para preparações com átrio isolado. Ao centro da foto observa-se à câmara de perfusão (1), o sistema digital de aquisição de dados (2), o sistema de captação da atividade elétrica atrial: osciloscópio (3) e amplificador (4), o sistema de estimulação elétrica artificial: estimulador elétrico (5), e a unidade de estimulação isolada (6).
67
5.7 Parâmetros avaliados nos corações isolados
A freqüência do coração isolado, expressa em batimentos por minuto (bpm), foi calculada
através da expressão:
Onde, T é o intervalo em segundos (s) entre picos registrados no traçado
eletrocardiográfico (ECG) captado do coração (figura 12) isolado de rato, visualizado no
osciloscópio e registrado no sistema de arquivo de dados.
A pressão ventricular esquerda, captada do coração isolado, expressa em milímetros de
mercúrio (mmHg), foi calculada através da expressão:
Onde, Sv é a tensão (em volts) pico a pico do sinal proveniente do transdutor de pressão e,
fc é o fator de calibração do transdutor: 35 mmHg/Volt (na figura 12 ilustra-se um sinal de
pressão tipicamente obtido nos experimentos).
O fluxo da perfusão, monitorado somente no coração isolado, expresso em mililitros por
minuto (ml/min), foi obtido através da expressão:
Onde, Ng é o número de gotas, por minuto, contadas no “cata-bolhas” instalado no
reservatório de solução; e Vg é o volume de uma gota obtido na calibração da montagem: 0,077
ml.
Resistência ao fluxo de cada coração isolado (Rf) foi calculada em todos os grupos
experimentais por meio da expressão abaixo. Os dados obtidos estão apresentados em anexo e
também em forma resultados.
Pve = Sv x fc (mmHg)
FC (bpm) = 1 x 60 (bpm) T(s)
Fp = Ng x Vg (ml/min)
Rf = Pve ( mmHg x min) Fp ml
68
Figura 12: Registros A – ECG (amplificado 10.000x) e, B – da pressão ventricular (amplificado 10x) de coração de
rato isolado em montagem de Langendorff. IE representa o intervalo espontâneo entre picos do ECG.
69
5.8 Parâmetros avaliados nos átrios isolados
A freqüência dos átrios isolados (FA), expressa em batimentos por minuto (bpm), foi calculada através da expressão:
FA (bpm) = 1 x 60 (bpm) T(s)
Para testar a inducibilidade à arritmias os átrios isolados foram submetidos ao protocolo
experimental para indução de arritmia descrito, por Alves e col. (2008) e com base em Godoy e
cols., (1999). Este protocolo será melhor descrito adiante.
6 FÁRMACOS
Os testes com fármacos foram feitos apenas em corações isolados. Utilizamos fármacos
capazes de interferir com a produção de NO (L-arginina, nitroprussiato de sódio e L-NAME) ou
fármacos capazes de ativar ou bloquear os receptores de adenosina (adenosina e teofilina). Os
fármacos e suas finalidades nos testes experimentais são descritos a seguir:
A. Nitroprussiato de sódio: (doador de NO)
B. L. Arginina: (substrato endógeno da biossíntese de NO mediada pela NO sintetase ou NOS)
C. N(G)-nitro-L-arginine methyl ester - L-NAME: (inibidor não seletivo da enzima da NOS capaz de bloquear a biossíntese de NO)
D. Adenosina: (agonista de receptores de adenosina)
E. Teofilina: (antagonista de receptores de adenosina).
Os fármacos L-NAME, L-Arginina e o Nitroprussiato de sódio foram adicionados à
solução de perfusão numa concentração final de 1 µM, diluídos de soluções estoques mais
70
concentradas no momento do experimento. Já os fármacos Adenosina e Teofilina foram
utilizados em diferentes concentrações finais. Adenosina: 10-4 e 10-5 M; Teofilina: 10-5, 5x10-6 e
10-6 M, também diluídos de soluções estoques mais concentradas no momento do experimento.
Estes fármacos foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Afonso Caricati Neto do Laboratório de
Farmacologia Molecular, Autonômica e Cardiovascular do Setor de Ação de Drogas -
Departamento de Farmacologia - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).
7 GRUPOS EXPERIMENTAIS
7.1 Caracterização de parâmetros em coração e átrios isolados
Análise da recuperação dos parâmetros de corações isolados mediante a estimulação
elétrica transmural
Grupo troca de circuito pós-parada cardíaca + EET
Neste grupo (N = 7), o coração foi mantido inicialmente em circuito fechado até a queda
total dos parâmetros. Esta situação (parada cardíaca), que ocorria tipicamente aos 70 min, era
mantida por 10 minutos, quando então, o coração era passado para circuito aberto (nova solução)
e iniciava-se a EET.
Análise do efeito da estimulação elétrica transmural após o início da queda dos parâmetros
de corações isolados
Grupo circuito fechado + EET pré- parada cardíaca
71
Neste grupo experimental (N = 5), o coração era mantido em circuito fechado durante
todo o tempo de experimento. Nesta condição dava-se início à EET quando a freqüência cardíaca
atingia aproximadamente 50% de seu valor inicial.
Análise do efeito do perfusato cardíaco sobre a resposta elétrica e motora de átrios isolados
Grupo perfusato + átrio isolado
Neste grupo, 25 dos 100 ml usados para perfundir o coração em circuito fechado (N = 4),
foram reutilizados após a queda total dos parâmetros cardíacos, aproximadamente 70 min, para
banhar o átrio de outro animal, isolado em montagem própria (N = 4). No átrio isolado foi
monitorada sua frequência por 120 min, sendo 50 min com solução de (K-H) “normal” e 70 min
com solução de (K-H) proveniente de coração isolado em CF. Os mesmos foram submetidos ao
protocolo experimental para indução de arritmia descrito, por Alves e col. (2008) e com base em
Godoy e cols. (1999).
O protocolo consiste da aplicação de um conjunto de até 6 trens de pulsos com as
seguintes características: 250 pulsos bipolares de tensão, 5 ms de duração, intervalo entre pulsos
de 15 ms. A amplitude do pulso foi ajustada e expressa como múltiplos inteiros do limiar atrial
(LA). Na tentativa de induzir arritmia aplicam-se até 6 trens de pulso com amplitude entre 2x e 6x
o (LA). De acordo com o protocolo, não é possível induzir arritmia com trens de pulsos com
amplitude igual a 1x LA, mesmo aplicando-se mais de 6 trens de pulsos (inducibilidade nula do
protocolo de indução). Por outro lado, a aplicação de trens de pulsos com amplitude igual 6x LA,
implica em indução de arritmia com um único trem (inducibilidade máxima do protocolo de
indução). Assim, a amplitude de estímulos do tren expressa a inducibilidade de arritmia atrial.
7.2 Testes com fármacos em coração isolado
Análise da participação do NO na resposta do coração isolado perfundido em sistema de
circulação fechada
72
Grupo Nitroprussiato de sódio (NPS)
Grupo experimental montado para avaliação do efeito do doador exógeno de NO sobre a
funcionalidade do coração isolado de rato com baixo volume circulante. O grupo foi composto
por corações isolados (N = 5) em circuito fechado com volume circulante de 100 ml e com 1 µM
de Nitroprussiato de sódio na solução de KH.
Grupo L-Arginina (LARG)
Grupo experimental montado para avaliação do efeito do substrato para produção
endógena de NO sobre a funcionalidade do coração isolado de rato com baixo volume circulante.
O grupo foi composto por corações isolados (N = 4) em circuito fechado com volume circulante
de 100 ml e com 1 µM de L-Arginina na solução de KH.
Grupo L-NAME
Grupo experimental montado para avaliação do efeito da inibição da produção endógena
de NO sobre a funcionalidade do coração isolado de rato com baixo volume circulante. O grupo
foi composto por corações isolados (N=4) em circuito fechado com volume circulante de 100 ml
e com 1 µM de L-NAME na solução de KH.
Após 10 min de estabilização em circuito aberto os três grupos supracitados, foram
mantidos em circuito fechado, com os respectivos fármacos durante todo tempo de experimento.
Análise da participação da adenosina na resposta do coração isolado perfundido em sistema
de circulação fechada
Grupo Adenosina (ADO)
Grupo experimental montado para avaliação do efeito da ativação dos receptores de
adenosina cardíacos sobre a funcionalidade do coração isolado de rato com baixo volume
circulante. O grupo foi composto por corações isolados (N = 8) em circuito fechado e com baixo
73
volume circulante (100 ml) com as respectivas concentrações: 10-4 M (N = 4) e 10-5 M (N = 4),
na solução de KH.
Grupo Teofilina (TEO)
Grupo experimental montado para avaliação do efeito do bloqueio dos receptores de
adenosina cardíacos sobre a funcionalidade do coração isolado de rato com baixo volume
circulante. O grupo foi composto por corações isolados (N = 9) em circuito fechado com volume
circulante de 100 ml e com as respectivas concentrações: 10-5 M (N = 3); 5x10-6 M (N = 3) e 10-6
M (N = 3) na solução de KH.
Após 10 min. de estabilização em circuito aberto os grupos supracitados, também foram
mantidos em circuito fechado, com os respectivos fármacos durante todo tempo de experimento.
74
8. RESULTADOS
8.1 CARACTERIZAÇÃO DE PARÂMETROS EM CORAÇÃO E ÁTRIOS
ISOLADOS
A. Grupo Troca de circuito pós parada cardíaca + “EET”
Na figura 13 ilustra-se a recuperação da resposta funcional após a parada cardíaca. Em
circuito fechado, aos 70 min de experimento, o coração sofre uma parada cardíaca que permanece
até os 80 min, quando é feita a renovação da solução de perfusão e inicia-se a “EET”. É possível
notar que a freqüência cardíaca (FC) entre 80 e 90 min manteve-se com a freqüência dos
estímulos elétricos (90 bpm), e após o fim do estímulo ocorre uma diminuição do parâmetro
chegando a 75 bpm aos 120 min de experimento. Após a “EET” e a renovação da solução, foi
possível restabelecer 37,5% da pressão ventricular esquerda (PVE) inicial e 13% do fluxo da
perfusão (FP) inicial.
B. Grupo Fechado + “EET” pré-parada cardíaca
Na figura 14 (A) verifica-se uma queda progressiva da FC até os 50 min de experimento
(185 a 75 bpm). Dos 52 min até 70 min a FC é mantida em 90 bpm devido a “EET”. Ao final da
aplicação da “EET”, a frequência sofre acentuada queda nos 10 min seguintes, quando aos 80
min este parâmetro é nulo.
A “EET” foi ineficiente em reverter a queda dos parâmetros PVE (figura 14 B) e FP
(figura 14 C). Estes parâmetros apresentaram as seguintes variações do início aos 70 min: PVE
de 17,3 para 3,5 mmHg e FP de 7,6 para 0,8 ml/min. Aos 80 min estes parâmetros também eram
nulos.
75
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120-10
01020
3040506070
8090
100110120
130140150160170
A
Circuito Fechado Circuito Aberto
EletroestimulaçãoF
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(bpm
)
Tempo (min)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130-2
0
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Eletroestimulação
Circuito Fechado Circuito Aberto
Tempo (min)
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0
1
2
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4
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7
8
9C
Circuito Fechado Circuito Aberto
Eletroestimulção
Tempo (min)
Flu
xo d
a pe
rfus
ão (
ml/m
in)
Figura 13: Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da Freqüência Cardíaca (A), da Pressão Ventricular Esquerda (B) e do Fluxo da Perfusão (C) no grupo Troca de circuito pós-parada cardíaca + “EET” (N = 10) ao longo do tempo de experimento. A linha tracejada indica o período de tempo em que ocorreu a “EET” e a troca de circuito.
76
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
0
20
40
60
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100
120
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200
220A
Início da "EET"
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Tempo (min)
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26B
Início da "EET"
Pre
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Tempo (min)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
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1
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5
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8
9
C
Início da "EET"
Flu
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ml/m
in)
Tempo (min)
Figura 14: Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da Freqüência Cardíaca (A), da Pressão Ventricular Esquerda (B) e do Fluxo da Perfusão (C) no grupo “Fechado + “EET” pré-parada cardíaca” (N = 5) ao longo do tempo de experimento. A linha tracejada indica o início da “EET”.
77
Grupo perfusato + átrio isolado
NA figura 15, ilustra-se a queda da frequência de átrios isolados comparada com a queda
da freqüência de corações isolados, após ambas amostras terem recebido solução anteriormente
utilizada para perfundir corações mantidos em circuito fechado. Após receber esta solução as
frequências sofrem as seguintes variações: Freqüência atrial de 135,5 para 86 bpm e freqüência
cardíaca de 186 para 55 bpm. A freqüência atrial permaneceu até os 120 min de experimento e a
resposta funcional do coração foi abolida 30 min após receber esta solução.
A figura 16 ilustra a Amplitude do Pulso (expressa em múltiplos inteiros do limiar atrial,
LA) necessários para a indução de arritmias nos grupos “controle (GC)” e “troca de solução
(GTS)”. Com base nos dados representados, a Amplitude média do Pulso, foi 56,5% menor em
relação à do GTS para o GC.
78
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
0
20
40
60
80
100
120
140
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180
200
220 Sol. de K.H proveniente de coração isolado em C.F.Sol. K. Henseleit
Fre
quên
cia
(bpm
)
Tempo (min)
Átrio Isolado Coração Isolado
Figura 15: Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da freqüência de átrios e corações isolados (N = 8), ao longo do tempo de experimento. A freqüência dos corações isolados apresenta-se somente a partir de 30 min para representação do momento da troca de solução, que está indicada pela linha tracejada.
79
Grupo controle Grupo troca de solução0
1
2
3
4
5
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Figura 16: Gráfico ilustrando a Amplitude do Pulso (expressa em múltiplos inteiros do limiar atrial, LA) necessário para a indução de arritmias nos grupos “controle” e “troca de solução”. Valores expressos como média e erro padrão (N = 4).
80
8.2 TESTES COM FÁRMACOS EM CORAÇÃO ISOLADO
D. Participação do NO na resposta do coração perfundido em sistema de circulação fechada
Para melhor ilustrar os resultados, apresentamos na figura 17, os grupos Nitroprussiato de
Sódio e L-arginina juntos com o grupo controle realizado em circuito aberto - CA e em circuito
fechado - FC. Também apresentamos na figura 17, o grupo L-NAME junto com o grupo controle
realizado em circuito fechado - CF.
Na figura 17 é possível notar que, com a adição do Nitroprussiato de Sódio ou da L-
arginina, a resposta funcional permaneceu até os 120 min de experimento, apresentando valores
próximos do grupo CA. Ocorreram as seguintes variações nos parâmetros com a adição do
Nitroprussiato de Sódio: FC de 195,8 para 111,3 bpm (figura 17 A), PVE de 37,1 para 11 mmHg
(figura 17 B) e FP de 10,7 para 3,3 ml/min (figura 17 C). No grupo perfundido com L-arginina
temos as seguintes variações: FC de 198,6 para 106 bpm (figura 17 A), PVE de 23,3 para 18,2
mmHg (figura 17 B) e FP de 11,5 para 7,6 ml/min (figura 17 C).
Com relação ao parâmetro Fluxo da Perfusão, ao final dos experimentos, em relação ao
grupo CA, notamos um aumento de 15,2% para o grupo nitroprussiato de sódio e um valor 95%
maior para o grupo L-arginina. A maior diferença notada no parâmetro fluxo da perfusão se dá no
período de tempo entre 20 e 70 min, chegando neste período, nos grupos nitroprussiato de sódio e
L-arginina, ao dobro do fluxo encontrado no grupo CA (figura 17 C).
Diferente do que ocorre na resposta funcional cardíaca quando se aumenta o NO, ao inibir
sua síntese utilizando o fármaco L-NAME, observamos um efeito inibitório sobre esta resposta.
Nota-se na figura 17 (A) que a função é preservada até os 110 min de experimento, ocorrendo
uma queda mais acentuada até os 40 min, seguida de uma queda mais branda, até a abolição dos
valores aos 120 min.
A alteração mais importante que ocorre neste grupo é sobre a pressão ventricular esquerda,
na (figura 17 B). Nota-se que a queda deste parâmetro está bem próxima à queda que ocorre no
grupo CF, sendo que aos 70 min de experimento ocorre uma perda da resposta contrátil de até
90%, a qual permanece até o final do experimento, aos 120 min. O fluxo da perfusão, apesar de
apresentar valores absolutos superiores ao CF, decai na mesma proporção. Se levarmos em
81
consideração as variações entre os valores iniciais e finais, temos: queda de 86,7% no CF e de
95,2% no grupo L-NAME. Porém é importante ressaltar que aos 70 min este grupo ainda
apresentava 40,8% do seu valor inicial (figura 17 C).
E. Participação da adenosina na resposta do coração perfundido em sistema de circulação
fechada
Para que pudesse ser feita uma comparação, os resultados da Teofilina e da adenosina
também foram apresentados juntos com os resultados dos grupos controle: fechado e aberto (CF e
CA). Na figura 18 ilustra-se o resultado do bloqueio dos receptores purinergicos sensivesis à
adenosina com o uso da teofilina e também os resultados dos experimentos realizados com a
adição à solução solução de perfusão do agonista dos receptores de adenosina (Adenosina). Em
concentrações mais altas de Teofilina, acelera-se o decaimento dos paramêtros, sendo que a
concentração de 10-5 M foi a que levou mais rapidamente a queda total dos paramêtros (20 min
antes da queda em CF). Observamos que os parâmetros decaíram significantemente desde o
inicio do experimento até os 40 min, com as seguintes variações: FC de 198,3 para 38,8 bpm
(figura 18 A), PVE de 11,3 para 1,5 mmHg (figura 18 B) e o FP de 8,4 para 0,92 ml/min (figura
18 C). Na concentração de 5x10-6 M, a resposta funcional do coração foi similar à encontrda em
CF, sendo que aos 70 min de experimento os valores eram nulos. Do início aos 60 min os
paramêtros tiveram as seguintes variações: FC de 198,2 para 28,3 bpm (figura 18 A), PVE de
16,1 para 2,1 mmHg (figura 18 B) e o FP de 7,4 para 0,90 ml/min (figura 18 C). Com a
concentração de 10-6 M ocorre uma queda acentuada dos parametros durantes os primeiros 60
min, quando ocorre uma estabilização que permanece até 90 min, seguida da anulação dos
valores. Neste grupo, do início aos 90 min, temos as seguintes variações: FC de 191,6 para 28,0
bpm (figura 18 A), PVE de 21,4 para 1,8 mmHg (figura 18 B) e o FP de 7,0 para 1,4 ml/min
(figura 18 C). Neste grupo o paramêtro fluxo da perfusão ultrapassa os valores encontrados no
grupo CA nos primeiros minutos de experimento. Este aumento permaneceu até 25 min na
concentração de 10-5 M, e até 50 min nas concentrações de 5x10-6 e 10-6 M, seguidos de uma
queda similar a da FC e PVE (figura 18 C).
Após a adição da Adenosina, em diferentes concentrações, percebe-se uma queda
acentuada da frequência cardíaca durante os primeiros 40 min (figura 18),
82
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
0
20
40
60
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120
140
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Tempo (min)
C. ABERTO C. FECHADO NITROP. DE SÓDIO L-ARGININA
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
0
20
40
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100
120
140
160
180
200
220
A
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pm)
Tempo (min)
C.FECHADO L-NAME
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
0
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Tempo (min)
C. ABERTO C. FECHADO NITROP. DE SÓDIO L-ARGININA
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
0
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20
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Tempo (min)
C. FECHADO L-NAME
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
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Tempo (min)
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0
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14C
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Tempo (min)
C. FECHADO L-NAME
Figura 17: Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da (A) Freqüência Cardíaca, (B) Pressão Ventricular Esquerda e (C) Fluxo da Perfusão nos grupos “Controle Aberto” (N = 5), “Controle fechado” (N = 5), “Nitroprussiato de Sódio”(N = 5), “L-arginina” (N = 4) e “L-NAME”(N = 4), ao longo do tempo de experimento.
83
em relação ao encontrado no grupo CF.
A partir dos 50 min percebe-se uma tendência a estabilização do parâmetro, uma vez que, na
concentração de 10-5 M a queda nos primeiros 40 min é de 66% e nos 60 min seguintes é de
44%, em relação ao valor inicial, chegando a valores nulos aos 120 min de experimento. O
mesmo fato é encontrado na concentração de 10-4 M, na qual ocorre uma queda de
85% nos primeiros 40 min, seguidos de uma queda de 63% nos 60 min seguintes, chegando a
valores nulos aos 110 min de experimento.
Com relação ao parâmetro pressão ventricular esquerda, os valores, nas duas
concentraçoes, estão entre os valores dos grupos CA e CF. As seguintes variações foram
observadas para a concentração de 10-4 M: PVE de 17,6 para 11,6 mmHg. Para a concentração
de 10-5 M: PVE de 22,05 para 2,8 mmHg (figura 18 B).
Diferente dos outros dois parâmetros, o fluxo da perfusão apresenta, na concentração de
10-4 M, valores superiores aos encontrados no grupo CA até os primeiros 60 min de experimento,
com a seguinte variação: FP de 7,14 para 3,5 ml/min. Numa concentração menor (10-5 M), os
valores do FP permanecem superiores ao do grupo CA até os primeiros 30 min, apresentando a
seguinte variação: FP de 9,17 para 0,6 ml/min (figura 18 C).
A média do pH aferido antes do experimento, entre 30 e 50 min e ao final dos
experimentos (N=20), foram respectivamente 7,40; 7,1 e 7,1.
Nas figuras 19, 20 e 21 encontram-se os gráficos ilustrando as médias (com erro padrão)
da resistência ao fluxo nos diferentes grupos experimentais e em diferentes concentrações ao
longo do tempo de experimento.
Destaca-se na figura 19, a queda da resistência ao fluxo com a adição do L-NAME à
solução de perfusão e o aumento da resistência ao fluxo com a adição à solução de perfusão do
nitroprussiato de sódio. Na figura 20 destaca-se a redução na resistência ao fluxo com a adição
de Teofilina, em diferentes concentrações, à solução de perfusão. Na figura 21, destaca-se o
aumento da resistência ao fluxo com a adição da adenosina na concentração de 10-4 M.
84
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
0
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0
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40
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120
140
160
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bpm
)
Tempo (min)
C. ABERTO C. FECHADO ADO 10-4 M ADO 10-5 M
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Tempo (min)
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(ml/m
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Tempo (min)
C. ABERTO C. FECHADO ADO 10-4 M ADO 10-5 M
Figura 18: Gráfico ilustrando a média (erro padrão) da (A) Freqüência Cardíaca, (B) Pressão Ventricular Esquerda e (C) Fluxo da Perfusão nos grupos “Controle Aberto” (N = 5), “Controle fechado”(N = 5), “Teofilina: 10-6 (N = 3); 10-5 (N = 3); 5X10-6” (N = 3) e “Adenosina: 10-4 (N = 4) e 10-5 (N = 4), ao longo do tempo de experimento.
85
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 1200,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Res
istê
ncia
ao
fluxo
da
perf
usão
(m
mH
g x
min
/ml)
Tempo (min)
Circuito Aberto Circuito Fechado NPS L-Arginina L-NAME
Figura 19: Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da Resistência ao Fluxo nos grupos “C. Aberto” (N = 5), “C. Fechado” (N=5), “Nitroprussiato de Sódio” (N = 5), “L-arginina” (N = 4) e L-NAME (N=4) ao longo do tempo experimento.
86
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 1200,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Res
istê
ncia
ao
fluxo
da
per
fusã
o (m
mH
g x
min
/ml)
Tempo (min)
Circuito Aberto Circuito Fechado Teo 10-5 M Teo 5 x10-6 M Teo 10-6 M
Figura 20: Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da Resistência ao Fluxo nos grupos “C. Aberto” (N = 5), “C. Fechado” (N=5), e “Teofilina” em diferentes concentrações (N = 9), ao longo do tempo experimento.
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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 1200,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
Res
istê
ncia
ao
fluxo
da
perf
usão
(m
mH
g x
min
/ml)
Tempo (min)
Circuito Aberto Circuito Fechado Ado 10-4 M Ado 10-5 M
Figura 21: Gráfico ilustrando as médias (com erro padrão) da Resistência ao Fluxo nos grupos “C. Aberto” (N = 5), “C. Fechado” (N=5), e “Adenosina” em diferentes concentrações (N = 9), ao longo do tempo experimento.
88
9 DISCUSSÃO
Visando ampliar nosso conhecimento acerca dos mecanismos envolvidos na regulação da
função cardíaca, estudamos o efeito de fármacos e da estimulação elétrica transmusral sobre a
resposta funcional de corações perfundidos continuamente com solução nutriente recirculante não
renovável (sistema de perfusão de circuito fechado e baixo volume circulante de 100 ml). Neste
sentido, enfocamos especialmente o papel do Óxido Nítrico (NO) e da Adenosina (ADO) nesta
resposta.
Em seu estudo Effting-Jr foi categórico ao afirmar que a(s) substância(s) que causa(m) a
queda da resposta funcional destes corações é (são) liberada(s) pelo próprio coração e
permanece(m) na solução circulante. Effting-Jr (2007), também estudou a participação do sistema
autonômico sobre esta queda da funcionalidade cardíaca, concluindo que: 1) A queda da resposta
funcional é mediada de maneira importante por mecanismos colinérgicos muscarínicos acionados
por substância intrínseca do coração (provavelmente acetilcolina) liberada na solução circulante;
e 2) O sistema β-adrenérgico tem responsabilidade direta sobre a manutenção desta
funcionalidade cardíaca, provavelmente devido ao neurotransmissor (noradrenalina).
Resultados obtidos no presente estudo demonstram a capacidade de reversão da queda da
resposta funcional mesmo após 10 min de ter ocorrido a parada cardíaca. Antes de realizar os
experimentos com “EET”, acreditava-se que, uma vez ocorrida a parada cardíaca, o coração não
encontrava-se em condições de recuperar sua função. No entanto, os resultados encontrados no
grupo Troca de circuito pós parada cardíaca + “EET” indicam que o tecido mantêm, ainda que
parcialmente, condições de recuperar sua funcionalidade. A figura 13 (A2, B2 e C2) ilustra o
quanto foi possível restabelecer dos parâmetros cardíacos avaliados, após realizar a troca de
circuito e estimular eletricamente os corações. É importante ressaltar que a “EET” sem a
renovação da solução de perfusão não é suficiente para restabelecer a função cardíaca e, uma vez
renovada a solução imediatamente após a parada cardíaca, não é necessário estimular
eletricamente o coração para recuperação de sua função. Estes resultados indicam que o baixo
volume de solução e a não renovação da mesma exercem efeitos deletérios ao coração, levando
principalmente à queda dos parâmetros cardíacos.
89
Ainda no que diz respeito aos efeitos deletérios causados pelo baixo volume de solução,
tentamos inibir a queda da resposta funcional por “EET” (figura 14), e demonstramos que, uma
vez em circuito fechado com 100 ml, a “EET” é ineficiente em impedir a queda dos parâmetros
cardíacos. Tendo em vista a variação do pH não poderia explicar estas alterações (COHEN et al.,
2007), estes resultados indicam que a solução nutriente, com as substâncias que possivelmente ali
se encontram, seja o principal agente responsável pela queda da resposta funcional de corações de
ratos perfundidos em circuito fechado. Nossos resultados corroboram resultados encontrados por
Effting-Jr, no qual autor demonstra o efeito cardiodepressor da reutilização desta solução (100
ml) em um coração estabilizado e perfundido previamente em circuito aberto.
Para testar a participação do NO sobre a queda da resposta funcional foram utilizados três
grupos experimentais com diferentes fármacos: Nitroprussiato de sódio, L-arginina e L-NAME.
Os resultados obtidos destes experimentos mostram uma resposta semelhante entre os grupos
realizados com o fármaco Nitroprussiato de sódio e com o fármaco L-arginina. Nestes dois
grupos a resposta manteve-se até os 120 min de experimento e com valores próximos entre si,
apesar destes atuarem de forma diferente, no que concerne aos seus mecanismos e cinética de
liberação do NO e a geração de compostos tóxicos durante sua degradação. Eles exercem comum
papel na amostra, aumentando a quantidade de NO, um por ser considerado um doador de NO e o
outro, segundo Hibbs (1987), por ser o aminoácido importante para sua biosíntese. Nos
resultados com o fármaco L-NAME, esperávamos uma queda mais acentuada da resposta
funcional, devido ao fato deste fármaco ter um efeito oposto ao dos dois citados anteriormente.
Porém a resposta funcional, mesmo com valores inferiores ao dos grupos anteriormente citados,
permaneceu até os 120 min de experimento.
Na literatura não foi possível encontrar trabalhos que abordassem o uso destes fármacos
em corações isolados nas mesmas condições experimentais que utilizamos (circuito fechado 100
ml). No entanto, no que diz respeito aos corações isolados perfundidos retrogradamente (técnica
de Langendorff original), existem relatos de efeitos inotrópicos positivos e negativos mediados
pelo NO. Em alguns trabalhos, como de Kojda e colaboradores (KOJDA et al., 1997a), foram
observados efeitos inotrópicos negativos após a perfusão de corações de ratos com bloqueadores
da NOS (L-NOARG e L-NMMA, 0,1 e 1,0 mM) enquanto, o uso de doadores de NO, causou um
efeito inotrópico positivo. Kojda e colaboradores (KOJDA et al., 1997b), também observaram
efeitos inotrópicos positivos após o uso de doadores de NO em um modelo de ratos que
90
desenvolvem hipertensão espontânea. Estes efeitos foram pequenos, em torno de 7% em ratos
hipertensos e em torno de 4 a 5 % em animais controle. É interessante observar que os efeitos
mediados por doses maiores do doador de NO SNAP (10 µM comparados a 1µM) foram menos
intensos do que os efeitos mediados por doses menores. Como ocorreu em células isoladas, é
provável que doses maiores de doadores de NO, nestes experimentos, pudessem induzir efeito
inotrópico negativo. Assim, parece-nos que o aumento da Pressão Ventricular Esquerda obtido
em nossos experimentos possa ser explicado, pelo menos em parte, pelo efeito inotrópico positivo
causado pelos fármacos Nitroprussiato de Sódio e L-arginina, contribuindo para a permanência
da resposta funcional até os 120 min de experimento.
Segundo Moncada (1991), o NO é um potente vasodilatador dependente do endotélio.
Este efeito exercido pelo NO pode explicar o aumento do fluxo de perfusão observado em nossos
experimentos com Nitroprussiato de sódio e L-arginina. Segundo Jones (1999), o NO derivado da
ecNOS também possui um papel cardioprotetor na isquemia-reperfusão cardíaca, este papel do
NO também pode estar contribuindo para a permanência da a resposta funcional até os 120 min
de experimento na presença dos fármacos Nitroprussiato de sódio e L-arginina.
De acordo com Wunderlich e cols., (2003) e Godecke e cols., (2003), o NO pode interagir
com complexos metal-oxigênio, como a oxihemoglobina, dando origem à metoxihemoglobina
com consequente formação de nitrato (NO3-). Este é considerado um dos mecanismos de controle
das concentrações de NO e têm sido sugerido que este é um dos principais mecanismos de
neutralização do NO no músculo cardíaco, podendo servir como um mecanismo protetor contra
os efeitos deletérios conseqüentes da alta produção de NO (LANCASTER, 1994). Assim como
este mecanismo pode estar sendo acionado em nossos experimentos é possível que os efeitos
indiretos do NO, que decorrem da produção de compostos intermediários e que causam lesão
tecidual devido ao estresse oxidativo, não estejam ocorrendo em nossos experimentos, o que
estaria contribuindo para a longevidade dos parâmetros cardíacos.
Para verificarmos a participação da Adenosina na queda dos parâmetros cardíacos foram
utilizados dois fármacos em diferentes concentrações. Os resultados com o antagonista
inespecífico dos receptores de Adenosina demonstraram respostas dose-dependentes, sendo que
as maiores concentrações aceleraram a queda da resposta funcional. Com a concentração de 10-5
M de Teofilina, os parâmetros cardíacos encontraram-se nulos aos 50 min de experimento.
Provavelmente esta diminuição no tempo da resposta funcional esteja ocorrendo devido às
91
características tóxicas da Teofilina que tem como efeito adverso à ocorrência de arritmias.
Ressaltamos que em todos os nossos experimentos realizados com a concentração de 10-5 M de
Teofilina ocorreram arritmias. O resultados dos experimentos realizados com as concentrações de
5x10-6 e 10-6 M sugerem que o bloqueio dos receptores de adenosina não representa alteração da
resposta funcional do coração nas condições experimentais realizadas, pois os parâmetros
avaliados sofrem uma queda semelhante à do grupo controle fechado, sendo que aos 70 min a
resposta funcional nestes grupos também era nula.
Os resultados encontrados nos experimentos com adição de Adenosina à solução de
perfusão foram semelhantes nas diferentes concentrações utilizadas. Nestes experimentos, chama
atenção a súbita queda da Frequência Cardíaca nos primeiros 30 minutos de experimento,
seguidos por uma tendência a estabilização do parâmetro por mais 70 min. Esta resposta pode ser
explicada pelo fato de a adenosina agir no tecido atrial produzindo um efeito cronotrópico
negativo. De acordo com Win-Kuang (1995), a adenosina age sobre os canais de K acetilcolina-
dependentes (Kach), diminuindo a despolarização espontânea no nódulo sinusal e a velocidade de
condução no nódulo atrioventricular. Este mecanismo de ação da Adenosina pode explicar, pelo
menos em parte, a diminuição da Frequência Cardíaca que ocorreu nestes experimentos.
No que se refere à resistência ao fluxo de perfusão do coração, observamos que a adição à
solução de perfusão de fármacos que levam ao aumento do NO (L-Arginina e Nitroprussiato)
resultam em uma diminuição deste parâmetro em torno de 50% em relação à condição controle
em circuito aberto ou circuito fechado. Por outro lado, a adição de fármaco que leva à diminuição
do NO (L-NAME) resultou numa redução ainda maior no fluxo de perfusão, chegando, em
relação aos grupos nas condições controle em circuito aberto ou circuito fechado, a uma queda de
aproximadamente 90%. Este dados corroboram dados da literatura que estabelecem que o NO
tem importante participação na vasodilatação coronariana (IGNARRO et al., 1987a), o que
confirma o envolvimento ativo, e complexo, do NO nas respostas do coração isolado observadas
no presente trabalho.
Observamos ainda em nossos resultados que a solução proveniente do coração isolado
quando usada para banhar átrios isolados não exerce um efeito bradicardizante. Na figura 9 este
resultado foi contrastado com os resultados de Effting-Jr, que observou ao perfundir corações
reutilizando solução proveniente de corações isolados em circuito fechado, que este sofria uma
acentuada queda da resposta funcional, principalmente no parâmetro Frequência Cardíaca. Em
92
nossos experimentos esta bradicardia provavelmente não ocorreu devido à diferença de amostras
biológicas. Possivelmente, no coração, pode estar ocorrendo uma perda do inotropismo cardíaco
levando a um efeito cronotrópico negativo e não, necessariamente a ação direta no nódulo sinusal
levando à queda da FC.
No que se refere à indução de arritmias nestes átrios que foram banhados pela solução
proveniente de corações isolados, os resultados encontrados indicam maior dificuldade de
indução quando comparados com o grupo controle. Este resultado é conflitante com o que
poderia ser esperado, uma vez que a acetilcolina, provavelmente liberada na solução (EFFTING-
JR; 2008), poderia facilitar a indução de arritmia (FARIA e col., 2008). No entanto,
provavelmente, a facilitação na indução da arritmia não tenha ocorrido devido ao tempo que foi
aguardado para tentativa de indução (70 min), o qual pode ter sido suficiente para a degradação
da Ach.
Diante da complexidade de ações exercidas pelo NO e pela adenosina no coração, torna-
se difícil estabelecer uma relação entre um único mecanismo de ação com os resultados obtidos
em nossos experimentos, ainda mais, considerando que nosso modelo de estudo é uma
abordagem nova e que necessita de mais investigações para se conhecer todos os agentes
envolvidos na resposta funcional destes corações isolados de ratos com solução nutriente
recirculante e não renovável.
Seria imprudente de nossa parte afirmar, categoricamente, que o NO e adenosina
exerceram um papel cardioprotetor em nossa amostra, uma vez que própria queda da resposta
funcional cardíaca pode, por si só, ser um mecanismo de autoproteção, no qual o coração diminui
sua demanda metabólica como uma forma de autopreservação. Porém, é possível afirmar que o
NO e adenosina estão envolvidos nesta resposta funcional, uma fez que os fármacos envolvidos
com seus metabolimos alteram os parâmetros avaliados. Para tanto, faz-se necessário uma
investigação mais aprofundada e principalmente um melhor entendimento de nosso modelo
experimental para que possamos afirmar que a melhora na resposta funcional exercida
principalmente pelo NO seja uma resposta cardioprotetora.
No que diz respeito aos resultados encontrados nas outras abordagens experimentais
utilizadas, é possível concluir que, em corações isolados, dificilmente reverte-se a queda de
resposta funcional sem que se renove a solução de perfusão. Ou seja, a causa da queda da
resposta funcional destes corações isolados em nosso modelo experimental é, sem dúvida, o
93
baixo volume de solução e as substâncias liberadas pelo coração que possivelmente ali se
encontram. Quanto ao uso dessa solução para banhar átrios isolados, a mesma parece não exercer
efeito significante, principalmente sobre a resposta elétrica desta amostra.
Em suma, nossos resultados indicam que existem várias substâncias que afetam
significativamente parâmetros fisiológicos de corações isolados de rato, notadamente àquelas
relacionadas ao sistema nervoso autonômico, ao sistema adrenérgico e ao óxido nítrico. Estes
achados podem contribuir com os estudos de cardioproteção por fornecer novos subsídios
experimentais quantitativos, e elucidativos, acerca do envolvimento de diferentes mediadores
químicos na função cardíaca.
94
10 CONCLUSÃO
Concluímos que:
1) É possível reverter parcialmente a resposta funcional até dez minutos após a parada
cardíaca mediante a renovação da solução e a estimulação elétrica transmural.
2) Apenas a estimulação elétrica transmural não é suficiente para manter a resposta
funcional de corações isolados em Circuito Fechado e com baixo volume circulante (100
ml).
3) O aumento do NO melhora significativamente a resposta funcional de corações isolados
em Circuito Fechado e com baixo volume circulante (100 ml), enquanto que sua
diminuição melhora somente parcialmente a funcionalidade cardíaca.
4) A adenosina exerce pouca melhora sobre a resposta funcional de corações isolados em
circuito fechado com 100 ml de solução.
5) A reutilização da solução de Krebs-Henseleit para banhar átrios isolados não interfere
significativamente na frequência dos mesmos.
6) A reutilização da solução de Krebs-Henseleit para banhar átrios isolados dificulta a
indução de arritmias por eletroestimulação.
EM SUMA:
A melhora da resposta funcional do coração observada em nossos estudos parece resultar
da ação de mecanismos de cardioproteção mediados, de maneira importante, pelo Óxido Nítrico
e/ou pela Adenosina.
95
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114
APÊNDICE A - Dados referentes à média (com erro padrão) da Freqüência Cardíaca, Pressão Ventricular Esquerda e Fluxo da Perfusão nos diversos grupos experimentais.
115
Em anexo encontramos os dados referentes às médias (com erro padrão) da Freqüência
Cardíaca, Pressão Ventricular Esquerda e do Fluxo da perfusão, obtidos a cada 10 minutos
durante o tempo de experimento nos diversos grupos experimentais. (tabelas 1, 2, 3, 4, 5 e 6).
Nas tabelas 7, e 8 encontra-se os dados referentes à média (com erro padrão) da
Resistência ao fluxo, obtido dos diferentes grupos experimentais.
116
Tabela 1: Freqüência cardíaca média (com erro padrão) nos diferentes grupos durante o tempo experimental (min).
TEMPO(min)
C. Aberto(bpm)
C. Fechado 100 ml(bpm)
Troca de circuito pós-parada
cardíaca + EET(bpm)
CF + EET pré-parada cardíaca
(bpm)
Nitroprussiato de Sódio1µM(bpm)
L-Arginina1µM(bpm)
L-Name1µM(bpm)
10 144 (± 14,7) 166 (± 15,4) 149 (± 7,3) 185 (± 5,1) 195,8 (± 13,01) 198 (± 7,3) 180 (± 28,9)20 146 (± 8,3) 107 (± 14,1) 91 (± 12,8) 122 (± 2,5) 176,4 (± 8,3) 158 (± 4,8) 160 (± 16,5)30 145 (± 6,4) 80 (± 2,7) 108 (± 16,1) 81 (± 4,8) 146,5 (± 3,0) 141 (± 5,5) 101 (± 12,9)40 140 (± 4,5) 100 (± 12,0) 98 (± 15,9) 109 (± 3,2) 140,8 (± 2,9) 129 (± 8,2) 97 (± 12,3)50 135 (± 13,7) 79 (± 17,5) 63 (± 13,7) 75 (± 4, 6) 138,7 (± 5,8) 123 (± 8,8) 105 (± 21,2)60 130 (± 10,4) 57 (± 12,1) 46 (± 10,9) 90 (0) 127, (± 6,9) 118 (± 6,0) 102 (± 5,5)70 138 (± 6,7) 0 0 90 (0) 127, (± 7,4) 124 (± 7,8) 76 (± 15,4)80 138 (± 11,2) - 0 90 (0) 128,3 (± 4,8) 120(± 14,8) 78 (± 11,8)90 139 (± 13,6) - 90 (0) 0 123,4 (± 5,8) 110 (± 9,8) 41 (± 16,7)
100 121 (± 12,8) - 88 (± 1,5) - 118,1 (± 7,5) 103 (± 10,3) 35 (± 14,3)110 135 (± 17,0) - 80 (± 1,6) - 114,6 (± 9,0) 116 (± 12,9) 9 (± 5,8)120 142 (± 11,7) - 75 (± 0,9) - 111,3 (± 8,4) 106 (± 12,9) 7 (± 7,6)
Tabela 2: Pressão ventricular esquerda média (mmHg) (com erro padrão) nos diferentes grupos durante o tempo experimental(min).
TEMPO(min)
C. Aberto(mmHg)
Fechado 100 ml
(mmHg)
Troca de circuito pós-parada
cardíaca + EET (mmHg)
CF + EET pré-parada cardíaca
(mmHg)
Nitroprussiato de Sódio1µM
(mmHg)
L-arginina1µM
(mmHg)
L-Name1µM
(mmHg)
10 30,2 (± 1,4) 21,4 (± 4,2) 16,6 (± 2,6) 17,3 (±1,71) 37,1(± 3,3) 23,3 (± 0,9) 26,3(± 6,6)20 24,9 (± 2,4) 15,9 (± 4,2) 17,7 (± 2,5) 15,4 (± 2,02) 32,7 (± 5,5) 26,6 (± 2,1) 22,3 (± 4,5)30 26,4 (± 1,8) 11,3 (± 3,8) 15,2(± 3,0) 11,3 (±1,74) 31,2 (± 5,9) 25,2 (± 2,1) 19,7 (± 3,8)40 21,5 (± 3,0) 10,0 (± 4,8) 12,5 (± 3,0) 9,3 (± 0,84) 27,4 (± 5,2) 26,2 (± 2,9) 11,6 (± 3,0)50 23,3 (± 3,2) 6,7 (± 2,3) 10,6 (± 3,2) 7,3 (± 0,72) 21,3 (± 5,0) 25,1 (± 2,8) 7,9 (± 3,4)60 22,5 (± 2,0) 4,2 (± 0.4) 7,6(± 2,5) 6,5 (± 0,84) 19,1 (± 4,7) 23,9 (± 2,1) 4,4 (± 0,9)70 21,2 (± 3,2) 0 0 3,5 (± 1,01) 17,8 (± 5,1) 23,4 (± 1,6) 2,6 (± 0,5)80 21,2 (± 4,2) - 0 0 14,9 (± 4,8) 22,6 (± 1,1) 2,2 (± 0,3)90 18,2 (± 3,3) - 5,2 (± 0,9) - 15,4 (± 4,9) 19,2 (± 2,4) 1,0 (± 0,3)
100 18,3 (± 2,8) - 4,6 (± 0,6) - 13,3 (± 4,3) 19,0 (± 2,3) 1,0 (± 0,3)110 17,5 (± 3,3) - 5,0 (± 0,9) - 11,4 (± 3,8) 18,7 (± 2,2) 0,6 (± 0,3)120 17,1 (± 3,3) - 4,8 (± 1,1) - 11,0 (± 3,5) 18,2 (± 2,8) 0,3 (± 0,3)
117
Tabela 3: Fluxo médio (ml/min) (com erro padrão) nos diferentes grupos durante o tempo experimental (min).
TEMPO(min)
C. Aberto(ml/min)
Fechado 100 ml
(ml/min)
Troca de circuito pós-parada
cardíaca + EET (ml/min)
CF + EET pré-parada cardíaca
(ml/min)
Nitroprussiato de Sódio1µM
(ml/min)
L-arginina1µM
(ml/min)
L-Name1µM
(ml/min)
10 6,9 (± 0,4) 6,8 (± 1,0) 7,2 (± 0,7) 7,6 (± 0,95) 10,7 (± 0,3) 11,5 (± 0,8) 11,9 (± 0,2)20 6,0 (± 0,2) 4,5 (±0,4) 6,2 (± 0,8) 5,8 (± 0,21) 12,3 (± 0,3) 12,3 (± 0,3) 10,7 (± 0,9)30 5,6 (± 0,1) 3,2 (± 0,5) 4,3 (± 0,7) 4,2 (± 0,97) 11,2 (± 0,7) 12,5 (± 0,4) 10,7 (± 0,4)40 5,2 (± 0,3) 2,6 (± 0,6) 3,0 (± 0,6) 3,3 (± 0,35) 10,4 (± 0,9) 12,0 (± 0,6) 9,5 (± 0,9)50 4,6 (± 0,1) 1,9 (± 0,5) 2,0 (± 0,3) 2,3 (± 0,73) 9,6 (± 1,3) 11,6 (± 0,6) 8,4 (± 0,9)60 4,5 (± 0,1) 0,9 (± 0,4) 1,5 (± 0,3) 1,1 (± 0,21) 8,4 (± 1,5) 11,2 (± 0,5) 6,5 (± 0,8)70 4,4 (± 0,1) 0 0 0,8 (± 0,17) 7,4 (± 1,4) 10,5 (± 0,8) 4,8 (± 1,1)80 4,3 (± 0,1) - 0 0 6,6 (± 1,3) 9,9 (± 0,8) 3,5 (± 0,7)90 4,1 (± 0,07) - 0,7 (± 0,1) - 5,4 (± 1,3) 9,8 (± 0,9) 1,8 (± 0,8)
100 3,9 (± 0.03) - 0,7 (± 0,1) - 4,4 (± 1,2) 8,9 (± 1,1) 1,4 (± 0,6)110 3,9 (± 0.08) - 0,9 (± 0,1) - 3,8 (± 1,1) 8,0 (± 1,2) 0,7 (± 0,4)120 3,9 (± 0.03) - 0,7 (± 0,1) - 3,3 (± 0,9) 7,6 (± 1,2) 0,5 (± 0,3)
118
Tabela 4: Freqüência cardíaca média (bpm) (com erro padrão) nos grupos “Teofilina” e Adenosina”em diferentes concentrações (em Molar – M) durante o tempo experimental (min).
TEMPO(min)
Teofilina(bpm)
Adenosina(bpm)
10-5 M 5X10-6 M 10-6 M 10-4 M 10-5 M10 198,3 (± 24,6) 198,2 (± 16,5) 191,6 (± 4,1) 178,48 (± 10,6) 205,0 (± 10,6)20 179,1 (± 15,0) 144,5 (± 20,1) 140,7 (± 2,1) 85,05 (± 12,0) 108,5 (± 18,5)30 84,7 (± 23,3) 114,8 (± 19,3) 94,9 (± 21,1) 45,66 (± 10,7) 81,7 (± 11,1)40 38,8 (± 19,4) 83,0 (± 14,0) 67,3 (± 20,3) 39,43 (± 5,1) 68,3 (± 17,0)50 0 82,2 (± 21,1) 57,6 (± 19,3) 26,97 (± 2,7) 76,1 (± 4,0)60 28,3 (± 15,1) 33,1 (± 15,3) 28,14 (± 8,0) 41,9 (± 12,6)70 0 36,0 (± 20,1) 26,05 (± 9,2) 40,8 (± 11,8)80 28,8 (± 17,7) 13,57 (± 3,6) 31,1 (± 12,3)90 28,0 (± 17,8) 10,03 (± 1,8) 25,0 (± 11,5)100 0 5,67 (± 0,9) 23,2 (± 13,4)110 0 11,0 (± 7,5)120 0
Tabela 5: Pressão ventricular esquerda média (mmHg) (com erro padrão) nos grupos “Teofilina” e Adenosina” em diferentes concentrações (em Molar – M) durante o tempo experimental (min).
TEMPO(min)
Teofilina(mmHg)
Adenosina(mmHg)
10-5 5X10-6 10-6 10-4 10-5
10 11,3(± 1,3) 16,1 (± 4,9) 21,4 (± 5,4) 17,6 (± 3,8) 22,0 (± 4,9)20 8,4 (± 0,8) 14,1 (± 3,6) 14,9 (± 3,9) 21,0 (± 3,6) 19,8 (± 4,6)30 2,9 (± 1,2) 11,3 (± 4,0) 11,8 (± 4,7) 17,9(± 4,0) 15,3 (± 4,1)40 1,5 (± 0,9) 9,5 (± 3,0) 9,5 (± 4,5) 17,7 (± 3,9) 14,3 (± 4,8)50 0 6,3 (± 2,2) 7,0 (± 3,8) 15,1 (± 4,4) 11,0 (± 4,5)60 2,1 (± 2,1) 5,9 (± 4,0) 12,2 (± 3,4) 8,4 (± 3,3)70 0 3,1 (± 2,3) 10,5 (± 3,7) 8,2 (± 3,3)80 2,3 (± 1,6) 10,6 (± 2,9) 5,4 (± 3,8)90 1,8 (± 1,2) 11,5 (± 2,1) 4,1 (± 2,9)
100 0 11,6 (± 2,4) 3,4 (± 2,4)110 0 2,8 (± 1,9)120 0
119
Tabela 6: Fluxo médio (ml/min) (com erro padrão) nos grupos “Teofilina” e Adenosina”em diferentes concentrações (em Molar – M) durante o tempo experimental (min).
TEMPO(min)
Teofilina(ml/min)
Adenosina(ml/min)
10-5 5X10-6 10-6 10-4 10-5
10 8,4 (± 0,3) 7,4 (± 0,4) 7,0 (± 0,5) 7,1 (± 0,6) 9,1 (± 0,6)20 9,8 (± 0,4) 9,1 (± 0,7) 8,9 (± 1,0) 9,0 (± 0,8) 7,1(± 0,8)30 3,3 (± 1,1) 7,2 (± 1,5) 8,4 (± 1,0) 7,8 (± 0,8) 6,9 (± 0,9)40 0,9 (± 0,3) 5,9 (± 1,1) 5,6 (± 1,2) 7,1 (± 0,9) 5,2 (± 0,8)50 0 3,8 (± 1,2) 4,5 (±1,2) 5,6 (± 0,7) 3,9 (± 0,8)60 0,9 (± 0,9) 3,6 (± 1,0) 5,2 (± 0,9) 2,7 (± 0,6)70 0 2,3 (± 1,2) 4,4 (± 0,9) 2,1 (± 0,5)80 1,9 (± 1,0) 4,0 (± 0,8) 1,5 (± 0,6)90 1,4 (± 0,8) 3,2 (± 0,9) 1,2 (± 0,5)
100 0 3,5 (± 0,7) 0,7 (± 0,4)110 0 0,6 (± 0,3)120 0
120
APÊNDICE B - Dados referentes à média (com erro padrão) da Resistência ao Fluxo, obtidos nos diferentes grupos experimentais.
121
Tabela 7: Média com erro padrão da resistência ao fluxo cardíaco nos grupos “Teofilina” e“Adenosina” em diferentes concentrações durante o tempo experimental (min).
TEMPO(min)
Teofilina Adenosina
10-5 M 5X10-6 M 10-6 M 10-4 M 10-5 M10 1,4 (± 0,1) 2,2 (± 0,7) 3,0 (±0,6) 2,6 (± 0,7) 2,5 (± 0,7)20 0,9 (± 0,1) 1,6 (± 0,5) 1,8 (± 0,6) 2,4 (± 0,4) 2,7 (± 0,4)30 1,1 (± 0,4) 2,0 (± 0,9) 1,4 (±0,5) 2,3(± 0,5) 2,2 (± 0,5)40 2,6 (± 2,2) 1,9 (± 0,8) 1,6 (± 0,5) 2,6 (± 0,6) 2,7 (± 0,7)50 - 2,5 (± 1,2) 1,5 (± 0,6) 2,8 (± 0,9) 2,7 (± 1,0)60 - 2,3 (± 0,7) 1,4 (± 0,8) 2,7 (± 1,0) 3,1 (± 1,2)70 - - 1,5 (± 0,9) 2,8 (± 1,1) 4,2 (± 1,8)80 - - 1,4 (± 0,8) 2,8 (± 0,8) 3,2 (± 1,8)90 - - 1,6 (± 0,6) 4,0 (± 1,0) 3,3 (± 2,0)
100 - - - 3,4 (± 0,8) 5,2 (± 2,5)110 - - - - 5,3 (± 2,3)120 - - - - -
Média 1,5 (± 0,7) 2,1 (± 0,8) 1,7(± 0,7) 2,8 (± 0,8) 3,4 (± 1,4)
Tabela 8: Média com erro padrão da resistência ao fluxo cardíaco nos diferentes grupos durante o tempo experimental (min).
TEMPO(min)
C. Aberto(ml/min)
Fechado 100 ml
(ml/min)
Nitroprussiato de Sódio1µM
(ml/min)
L-arginina1µM
(ml/min)
L-Name1µM
(ml/min)
10 4,4 (± 0,2) 3,5 (± 0,9) 3,4 (± 0,3) 2,3(± 0,2) 2,2 (± 0,6)20 4,1(± 0,4) 3,3 (± 0,7) 2,6 (± 0,4) 2,2(± 0,2) 2,3 (± 0,7)30 4,6 (± 0,3) 3,5 (± 0,8) 2,8(± 0,5) 2,0 (± 0,2) 1,9(± 0,5)40 4,1(± 0,4) 3,9 (± 1,0) 2,8(± 0,7) 2,2 (± 0,3) 1,2 (± 0,3)50 5,0 (± 0,7) 4,7 (± 1,3) 2,9(± 1,3) 2,2 (± 0,3) 0,9(± 0,3)60 4,9 (± 0,4) 3,5 (± 0,3) 3,1(± 1,3) 2,2(± 0,3) 0,7 (± 0,1)70 4,7 (± 0,6) 0 3,5 (± 1,7) 2,3 (± 0,3) 0,6 (± 0,1)80 4,8 (± 0,9) - 3,0 (± 1,3) 2,4 (± 0,3) 0,6 (± 0,1)90 4,4 (± 0,8) - 4,2 (± 2,3) 2,0 (± 0,9) 0,6 (± 0,1)100 4,6 (± 0,6) - 4,4 (± 2,2) 2,1 (± 0,2) 0,9 (± 0,2)110 4,4 (± 0,7) - 4,2(± 2,1) 2,4 (± 0,2) 0,9 (± 0,1)120 4,3 (± 0,7) - 4,6(± 2,4) 2,4 (± 0,3) 0,4 (± 0,3)
Média 4,5 (± 0,5) 3,7 (± 0,8) 3,5 (± 1,4) 2,2(± 0,2) 1,1(± 0,3)
Observação: A resistência ao fluxo média de todos corações estudados é (mmHg x min/ml) 2,87 ± 0, 79
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