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Universidade de Lisboa

Faculdade de Farmácia

Departamento de Química Farmacêutica e Terapêutica

COMPOSTOS HÍBRIDOS DA ARTEMISININA

Direccionamento para as fases sanguínea e hepática do

parasita da malária

Rita Sofia Salvador Simões Capela

Doutoramento em Farmácia

(Química Farmacêutica e Terapêutica)

2011

Universidade de Lisboa

Faculdade de Farmácia

Departamento de Química Farmacêutica e Terapêutica

COMPOSTOS HÍBRIDOS DA ARTEMISININA

Direccionamento para as fases sanguínea e hepática do

parasita da malária

Rita Sofia Salvador Simões Capela

Tese orientada pela Professora Doutora Francisca Lopes

e Professor Doutor Rui Moreira

Doutoramento em Farmácia

(Química Farmacêutica e Terapêutica)

2011

i

… a todos aqueles que estiveram, estão e irão estar

presentes na minha vida.

iii

As estradas da ciência são o caminho para a evolução, não percorrê-las é limitar o

sonho e a liberdade de toda a civilização

v

Agradecimentos

Embora seja difícil expressar a minha gratidão a todas as pessoas que, directa ou

indirectamente, contribuíram na realização deste trabalho, deixo aqui os meus profundos

agradecimentos.

À Doutora Francisca Lopes pelo incentivo, orientação e toda a dedicação e

amizade fornecida na elaboração deste trabalho e na evolução do meu pensamento

científico.

Ao Doutor Rui Moreira pelos conhecimentos científicos transmitidos durante a

realização desta dissertação.

Ao Doutor Philipp Rosenthal pelo apoio científico e pelos resultados obtidos de

actividade antimalárica e inibição enzimática da falcipaína, em São Francisco, Estados

Unidos América, assim como ao Doutor Jiri Gut.

Ao Doutor Miguel Prudêncio, à Doutora Maria Mota e ao Dr. Ghislain Gabal

pelos ensaios in vivo realizados no IMM, Faculdade de Medicina de Lisboa, relativamente

aos híbridos da artemisinina-primaquina.

À Doutora Rosário Bronze pelo estudo de estabilidade efectuado por HPLC-MS-

MS e pelo traçado dos espectros de massa dos compostos sintetizados, assim como pela

simpatia.

Pelos ensaios enzimáticos efectuados na inibição da chabaupaína-1 e

babesipaína-1, agradeço às Doutoras Ana Domingos e Lídia Gonçalves, da Faculdade de

Farmácia de Lisboa.

Ao Doutor Carlos Afonso que gentilmente cedeu as instalações no Instituto

Superior Técnico e as condições necessárias para poder efectuar a reacção de ozonólise.

Às Doutoras Emília, Ana Bela, Margarida, Ana Paula e Maria de Jesus pelos

ensinamentos e companheirismo que me dedicaram ao longo destes quase dez anos.

Aos colegas e amigos, principalmente à Ana Sofia, Ana Newton, Cátia,

Daniela,Verónica, João, Praveen, Tiago e Fábio, e a todos os que passaram pelo

laboratório, que me presentearam com a sua boa disposição, paciência e amizade durante

o trabalho de laboratório e fora dele.

Aos técnicos Francisco e Helena Brito pela amizade e que sempre se mostraram

prestáveis para ajudar no necessário, assim como à D. Lurdes e à D. Maria do Carmo.

vi

A todos os que doaram sangue para os estudos de estabilidade em plasma humano

e que fizeram alguns quilómetros por mim nas idas ao aparelho de RMN na Faculdade de

Ciências, o meu obrigado.

Graças à química agradeço igualmente às minhas amigas Lara, Célia, Raquel,

Luísa e Lina que ao longo destes anos sempre se encontraram presentes.

Ao Carlos e ao Luís que partilharam comigo estes anos de trabalho de

investigação.

À minha mãe pela paciência ao longo destes tempos.

Por último quero agradecer à Fundação para a Ciência e Tecnologia, pela

concessão da bolsa de doutoramento, SFRD/BD/30418/2006, para a investigação na

Faculdade de Farmácia de Lisboa, assim como o apoio financeiro para a participação em

reuniões científicas internacionais.

vii

Resumo

A terapia combinada na administração de artemisininas (ACT) é a principal

estratégia no controlo da malária sugerida pela OMS. Esta terapia tem como fundamento

a combinação de um derivado da artemisinina com outro fármaco antimalárico que tenha

maior tempo de semi-vida, com o objectivo de evitar a recrudescência e o

desenvolvimento de estirpes resistentes de Plasmodium falciparum.

Fármacos híbridos combinam dois farmacóforos diferentes numa única entidade

química com modos de acção distintos. Esta abordagem surgiu recentemente como uma

estratégia de modo a desenvolver novos fármacos eficazes e pode representar uma

alternativa para a terapia de combinação clássica. Nesta tese, descreve-se o design, síntese

e avaliação biológica de compostos híbridos baseados na artemisinina, com o objectivo de

actuarem nas fases sanguínea e/ou hepática da infecção. Foram sintetizados compostos

híbridos de modo a actuar nas fases sanguíneas da infecção, contendo

dipeptidilvinilsulfonas covalentemente ligadas à artemisinina através de uma ligação

C10-O ou C10-C. As vinilsulfonas são inibidores reconhecidos de proteases de cisteína do

P. falciparum, as falcipaínas, envolvidas no processo de degradação da hemoglobina do

hospedeiro, que ocorre no vacúolo alimentar do parasita. Foram sintetizadas

dipeptidilvinilsulfonas contendo as sequências Gly-Phe, Phe-Phe, Phe-hPhe e Leu-hPhe e

acopladas aos ácidos artelínico e artesúnico, originando os compostos híbridos C10-oxa.

Estes híbridos apresentaram actividade antimalárica potente, com valores de IC50 entre

2,08 e 4,81 nM para a estirpe W2 do P. falciparum resistente à cloroquina e actividade

inibitória na falcipaína-2 na ordem dos µM. Os híbridos contendo a sequência Leu-hPhe

foram os inibidores mais potentes desta enzima, onde o derivado ácido artelínico-Leu-

hPhe-VSMe apresentou um valor de IC50 de 350 nM para a falcipaína-2. Estes compostos

também foram capazes de inibir as proteases de cisteína de Plasmodium chabaudi e

Babesia bigemina. Os derivados do ácido artesúnico também exibiram elevada actividade

antimalárica e inibição da falcipaína-2, mas reduzida estabilidade química e enzimática.

Os análogos C10-carba contendo a sequência Leu-hPhe ligada a uma vinilsulfona,

vinilsulfonamida ou vinilsulfonato também foram sintetizados. Estes híbridos exibiram

igualmente elevada potência antimalárica e inibitória da falcipaína-2, aliada à alta

estabilidade em tampão fosfato pH 7,4 e plasma humano. A única excepção foi o

viii

derivado sulfonato de etilo, que em tampão fosfato pH 7,4 apresentou um tempo de semi-

vida de 32 horas.

Foram também sintetizados compostos híbridos artemisinina C10-oxa e C10-carba

contendo a primaquina com o objectivo de actuar nas fases sanguíneas e hepáticas da

infecção. Os derivados C10-oxa e C10-carba foram acoplados à primaquina através de uma

função amida ou amina. Estes compostos foram capazes de inibir o desenvolvimento da

estirpe W2 de P. falciparum com valor de IC50 reduzido na ordem dos nM. Quando

testado in vivo num modelo de ratinhos infectados com P. berghei, o híbrido C10-carba

com ligação amida foi capaz de suprimir a parasitémia por 15 dias, quando administrado

por via intraperitoneal. A actividade inibitória in vitro na fase hepática foi determinada

utilizando células Huh7 infectadas com esporozoítos de P. berghei. Todos os compostos

híbridos mostraram valores de IC50 entre 5,1-12,5 nM, superiores aos obtidos para a

primaquina (IC50= 3,3 µM). Quando testados in vivo, em ratinhos infectados com

esporozoítos de P. berghei, os híbridos 4.2 e 4.3 demonstraram reduzir significativamente

a infecção no fígado, quando comparados com a primaquina.

Palavras-Chave: malária, artemisinina, dipeptidilvinilsulfonas, primaquina, fármacos

híbridos, inibidores da falcipaína

ix

Abstract

Artemisinin Combination Therapy (ACT) is now the cornerstone of the strategy

for malaria control suggested by WHO. ACTs involve the combination of an artemisinin

derivative with a partner drug that clear parasites at a slower rate than arteminisin, in

order to avoid recrudescence and development of resistant Plasmodium falciparum

strains.

Hybrid drugs combine two different pharmacophores in a single chemical entity

with a dual mode of action. This approach has recently emerged as a strategy to develop

new efficient drugs, and in the case of malaria therapy, may represent an attractive

alternative to classical ACTs. In this thesis we describe the design, synthesis and

biological evaluation of hybrid compounds based on the artemisinin scaffold, targeting

either (i) the blood-stage of infection or (ii) both the blood- and liver-stages of infection.

Hybrid compounds targeting the blood-stage of infection were designed to contain

dipeptidyl vinyl sulfones linked to the artmesinin scaffold via C10-O or C10-C bonds.

Vinyl sulfones are well known inactivators of cysteine proteases from P. falciparum,

called falcipains, that are involved in the degradation process of the host hemoglobin that

take place in the digestive vacuole of the parasite. Dipeptidyl vinyl sulfones containing

the Gly-Phe, Phe-Phe, Phe-hPhe and Leu-hPhe sequences were synthesized and coupled

to artelinic and artesunic acids to give rise to C10-oxo hybrid compounds. These hybrids

displayed potent antiplasmodial activity, with IC50 values against the chloroquine-

resistant P. falciparum W2 strain ranging from 2.08 to 4.81 nM, and falcipain-2

inhibitory activity in the low microM region. Those hybrids containing the Leu-hPhe

sequence were the most potent enzyme inhibitors, with the artelinic acid-Leu-hPhe-VS-

Me derivative presenting an IC50 of 350 nM against falcipain-2. These compounds were

also able to inhibit the cysteine proteases from P. chabaudi and Babesia bigemina.

Artesunic acid counterparts also showed high antiplasmodial and falcipain-2 inhibitory

potencies, but reduced chemical and enzymatic stability.

The C10-carba analogues containing the Leu-hPhe sequence and a vinyl sulfone,

sulfonamide and sulfonate moieties were also synthesized. These hybrids also displayed

high antiplasmodial and falcipain-2 inhibitory potencies, coupled to high stability in pH

7.4 phosphate buffer and human plasma. The only exception was the ethyl sulfonate

counterpart, that hydrolyzed with an half-life of 32 h in pH 7.4 phosphate buffer.

x

C10-oxo and C10-carba hybrid compounds containing primaquine were designed to

target both the blood- and liver-stages of infection. The C10-oxo and C10-carba derivatives

were linked to primaquine with either an amide or amine group. All compounds were able

to inhibit the development of P. falciparum W2 in low nM region. When tested in vivo in

a P. berghei infected mice model, the C10-carba hybrid was able to suppress parasitaemia

for 15 days when given intraperitonealy. The in vitro inhibitory activity against the liver

stage was determined using Huh7 cells infected with sporozoites of P. berghei. All hybrid

compounds showed IC50 values within the range of 5.1-12.5 nM, that compare favourably

to that displayed by primaquine, with a IC50 of 3.3 microM. When tested in vivo, using

mice infected with P. berghei sporozoite, hybrids 4.2 and 4.3 were shown to significantly

reduce liver infection, when compared to primaquine.

Keywords: malaria, artemisinin, dipeptidylvinylsulfones, primaquine, hybrid drugs,

falcipain inhibitors

xi

ÍNDICE GERAL

Agradecimentos v

Resumo vii

Abstract ix

Índice Geral xi

Lista de Abreviaturas e Símbolos xv

Índice de Figuras xviii

Índice de Esquemas xxi

Índice de Tabelas xxiii

Índice de Gráficos xxiv

CAPÍTULO I - Introdução

1.1 Malária 3

1.2 Artemisinina e derivados 4

1.2.1 Potenciais alvos das artemisininas 5

1.2.1.1 Interacção com o heme 5

1.2.1.2 Alquilação de proteínas 7

1.2.1.3 Interacção com PfATP6 8

1.2.1.4 Membranas do parasita 9

1.2.1.5 Mitocôndria 10

1.2.1.6 Via das flavinas 11

1.2.2 Vantagens das artemisininas 12

1.2.3 Derivados semi-sintéticos de primeira geração 12

1.2.4 Derivados semi-sintéticos de segunda geração 14

1.2.5 Derivados peroxídicos de síntese 16

1.3 Falcipaínas, as proteases de cisteína 18

1.3.1 Falcipaínas como alvo terapêutico 18

1.3.2 Inibidores das falcipaínas 19

1.4 8-aminoquinolinas 22

1.5 Combate à resistência 29

1.5.1 Terapia combinada 30

xii

1.5.2 Fármacos híbridos 33

1.5.2.1 Híbridos com artemisininas 35

1.5.2.2 Híbridos com endoperóxidos sintéticos 40

1.6 Âmbito da tese 46

CAPÍTULO II - Híbridos de artemisininas C10-oxa e dipeptidilvinilsulfonas

2.1 Híbridos baseados no ácido artelínico 49

2.1.1 Análise retrossintética 49

2.1.2 Síntese de derivados aminoacilo do ácido artelínico 49

2.1.3 Síntese de dipeptidilvinilsulfonas 53

2.1.4 Síntese dos híbridos de ácido artelínico e dipeptidilvinilsulfona 54

2.1.5 Caracterização estrutural 57

2.1.5.1 Ressonância Magnética Nuclear 59

2.1.5.2 Espectrometria de Massa 69

2.1.6 Actividade antimalárica in vitro 72

2.1.7 Avaliação da estabilidade 79

2.2 Híbridos baseados no ácido artesúnico 82

2.2.1 Síntese dos híbridos de ácido artesúnico e dipeptidilvinilsulfonas 82





CAPÍTULO III - Híbridos de derivados C10-carba da artemisinina

3.1 Híbridos C10-carba da artemisinina 93

3.1.1 Análise retrossintética 93

3.1.2 Híbridos C10-carba dipeptidilvinilsulfona 95

3.1.3 Híbridos C10-carba dipeptidilvinilsulfonato e vinilsulfonamida 99





xiii

CAPÍTULO IV - Híbridos de artemisinina e primaquina

4.1 Síntese de híbridos de artemisinina e primaquina 117

4.1.1 Híbridos C10-oxa de artemisinina e primaquina 118

4.1.2 Híbridos C10-carba de artemisinina e primaquina 121


4.1.3.1 - Ressonância Magnética Nuclear 123

4.1.4 Actividade antimalárica para a fase sanguínea 129

4.1.4.1 Estudos in vitro 129

4.1.4.2 Estudos in vivo 130

4.1.5 Actividade para a fase hepática 134

4.1.5.1 Estudos in vitro 134

4.1.5.2 Estudos in vivo 138


CAPÍTULO V Conclusões

5.1 Conclusões 147

CAPÍTULO VI – Parte Experimental

6.1 Equipamento 153

6.2 Reagentes e Solventes 154

6.2.1 Solventes 154

6.2.2 Reagentes 155

6.3 Síntese de híbridos C10-oxa de artemisinina e dipeptidilvinilsulfona 155

6.3.1 Síntese de híbridos C10-oxa do ácido artelínico 155

6.3.2 Síntese de derivados aminoacilo do ácido artelínico 157

6.3.3 Síntese da unidade dipeptidilvinilsulfona 161

6.3.3.1 Sintese da sulfona 161

6.3.3.2 Síntese da amida de Weinreb 162

6.3.3.3 Síntese do aldeído 163

6.3.3.4 Síntese da vinilsulfona 164

6.3.3.5 Síntese da dipeptidilvinilsulfona 166

xiv

6.3.3.6 Síntese de híbridos C10-oxa do ácido artelínico e

dipeptidilvinilsulfona 169

6.3.4 Síntese de híbridos C10-oxa do ácido artesúnico 177

6.4 Síntese de híbridos C10-carba da artemisinina 180

6.4.1 Síntese do derivado ácido C10-carba da artemisinina 180

6.4.2 Síntese de híbridos da artemisinina e dipeptidilvinilsulfona 184

6.4.3 Síntese do híbrido da artemisinina e dipeptidilvinilsulfonato 186

6.4.3.1 Síntese do dipeptidilvinilsulfonato 186

6.4.3.2 Síntese do híbrido da artemisinina e

dipeptidilvinilsulfonato 189

6.4.4 Síntese do híbrido da artemisinina e dipeptidilvinilsulfonamida 190

6.4.4.1 Síntese da dipeptidilvinilsulfonamida 190

6.4.4.2 Síntese do híbrido da artemisinina e

dipeptidilvinilsulfonamida 193

6.5 Síntese de híbridos da artemisinina e primaquina 195

6.5.1 Derivados híbridos C10-oxa da artemisinina e primaquina 195

6.5.1.1 Híbrido com ligação amida 195

6.5.1.2 Híbrido com ligação amina 196

6.5.2 Derivados híbridos C10-carba da artemisinina e primaquina 199

6.5.2.1 Híbrido com ligação amida 199

6.5.2.2 Híbrido com ligação amina 200

6.6 Estabilidade dos híbridos da artemisinina 203

6.6.1 Estabilidade em tampão fosfato 203

6.6.2 Estabilidade em plasma humano 204

6.6.3 Estabilidade em microssomas de fígado de rato 204

Referências Bibliográficas 209

xv

Lista de Abreviaturas e Símbolos

Ac2O - anidrido acético

ACN - acetonitrilo

AcOEt - acetato de etilo

ACT - Terapia Combinada da Artemisinina (Artemisinin-based Combination Therapy)

Ar - arilo

ATP - trifosfato de adenosina (adenosine triphosphate)

Boc - tert-butiloxicarbonilo

COSY- COrrelation SpectroscopY

CP-1 - chabaupaína-1

CQ - cloroquina

Cys - cisteína

d - dupleto

Da - dalton

DCC - diciclohexilcarbodiimida

DCE - dicloroetano

DCM - diclorometano

DMAP - 4-dimetilaminopiridina

DMF - dimetilformamida

DMSO - dimetilsulfóxido

ESI-MS - Electrospray Ionization Mass Spectrometry

EtOH - etanol

FDA - Food and Drug Administration

FP-1 - falcipaína-1

FP-2 - falcipaína-2

GFP - Green Fluorescent Protein

His - histidina

HMBC - Heteronuclear Multiple-Bond Correlation Spectroscopy

HMQC - Heteronuclear Multiple-Quantum Correlation Spectroscopy

HOBt - 1-hidroxibenzotriazole

hPhe - homoPhe, homofenilalanina

HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Resolução (Hight Performance Liquid Chromatography)

Hz - hertz

IC50 - concentração inibitória 50 %

IV - infravermelho

xvi

J - constante de acoplamento

kobs - constante de velocidade observada

Leu - leucina

log D - coeficiente de distribuição

log P - coeficiente de partição

m - multipleto

Me - metilo

MeOH - metanol

MOE - Molecular Operating Environment

MDR - multi drug resistance

MS - Mass Spectrometry

m/z - razão entre massa e carga do ião

NOESY - Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY

OMS – Organização Mundial de Saúde

PBS - tampão fosfato isotónico (Phosfate Buffer Saline)

Pf - Plasmodium falciparum

p.f. - ponto de fusão

Ph - fenilo

Phe - fenilalanina

ppm - partes por milhão

q - quarteto

Rf - retention factor

SD - standard deviation

SERCA - sarco/endoplasmic reticulum Ca2+

-ATPase

t - tripleto

t.a. - temperatura ambiente

tr - tempo de retenção

t½ - tempo de semi-vida

TBTU - tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilamínio

TCTP - translationally controlled tumour protein

TEA - trietilamina

TFA - ácido trifluoroacético

THF - tetrahidrofurano

TLC - cromatografia em camada fina (Thin Layer Chromatography)

UV - ultravioleta

VS - vinilsulfona

xvii

η - rendimento em %

δ - desvio químico

ν - frequência em cm-1

λ - comprimento de onda

xviii

Índice de Figuras

Figura 1.1 - Ciclo de vida do parasita da malária no homem………………………………...pág. 4

Figura 1.2 - Formação de radicais primários e secundários de carbono na artemisinina pela acção

do Fe2+

………………………………………………………………………………………....pág. 6

Figura 1.3 - Alquilação do heme (modelo éster dimetílico) no carbono β, por um radical primário

de carbono formado após activação da artemisinina pelo

Fe2+

…………………………………………………………………………………………….pág. 7

Figura 1.4 - Quebra heterolítica induzida pelo Fe2+

e formação de espécies reactivas de oxigénio

após reacção de Fenton ……………………………………………………………………….pág. 7

Figura 1.5 - Mecanismo proposto para a peroxidação lipídica das membranas celulares......pág. 10

Figura 1.6 - Metabolização do arteméter, 1.5…………………………………………..…...pág. 13

Figura 1.7 - Mecanismo de inibição das proteases de cisteína pelas vinilsulfonas ………...pág. 20

Figura 1.8 - Estrutura geral dos inibidores dipeptídicos vinilsulfonas……………………...pág. 21

Figura 1.9 - Via metabólica proposta para a cadeia lateral da primaquina………………....pág. 24

Figura 1.10 - Actual distribuição Mundial dos países com e sem ACT……………….……pág. 33

Figura 1.11 - Mecanismo de acção do artefleno, endoperóxido de segunda geração…....…pág. 44

Figura 2.1 - Mecanismo reaccional para a formação de 10β-ácido artelínico……………pág. 51

Figura 2.2 - Mecanismo descrito para a obtenção da vinilsulfona, de acordo com a reacção de

Horner-Wadsworth-Emmons…………………..………………………………………...…..pág. 55

Figura 2.3 - Mecanismo reaccional geral do reagente de acoplamento TBTU com um

aminoácido, na presença de base.………………………………………………………...….pág. 56

Figura 2.4 - Espectro COSY para a artemisinina e alguns acoplamentos 1H-

1H ...………...pág. 59

Figura 2.5 - Estrutura 3D dos dois isómeros α e β da dihidroartemisinina…………………pág. 61

Figura 2.6 - Atribuição dos sinais C12-H e C10-H nos dois isómeros α e β da dihidroartemisinina,

no espectro de 1H-RMN………………………………...…………………………………....pág. 61

Figura 2.7 - Conformação β em C10 para o ácido artelínico e ângulo diedro entre H9 e

H10……..…………………………………………………………………………...……...…pág. 63

Figura 2.8 - Parte do espectro de 1H-RMN do composto 10β-ácido artelínico, onde é possível ver

os protões metilénicos diastereotópicos Ha e Hb e o sistema aromático AA´BB´ (espectro

efectuado em CDCl3)………………..……………………………………………………….pág. 64

Figura 2.9 - Padrão do desdobramento obtido para os protões metilénicos -P(OCH2CH3)2 dos

derivados fosfonatos 2.9 e o espectro de protão obtido para os protões assinalados ….……pág. 67

Figura 2.10 - Espectro de protão do isómero E na unidade vinilsulfona, onde se podem ver os

acoplamentos vicinais e a longa distância…………………………..……………….…...….pág. 68

xix

Figura 2.11 - Parte do espectro do derivado 2.7 (R2= -CH2CH2C6H5) onde se pode ver a

atribuição dos protões metilénicos diastereotópicos…………………………………....……pág. 68

Figura 2.12 - Sinal dos protões diastereotópicos do grupo metilénico do aminoácido fenilalanina,

no derivado hidroxamato 2.5 (Espectro A) e aldeído 2.7 (espectro B)……………………...pág. 69

Figura 2.13 - Hipótese de fragmentação proposta para os fragmentos m/z 163, 221 e 267

existentes na dihidroartemisinina e derivados…………………………………..………...…pág. 70

Figura 2.14 - Espectro de massa (ESI, modo positivo) do híbrido 2.12c e a atribuição de alguns

picos…..……………………………………………………………………………………...pág. 71

Figura 2.15 - Parte do espectro de 1H-RMN do ácido artesúnico, referente ao sinal de H10 e

respectiva constante de acoplamento…………………………………………………...…....pág. 86

Figura 2.16 - Parte da estrutura do ácido artesúnico, onde se podem ver as interacções entre H9 e

H10: trans-diaxiais (α-ácido artesúnico) e cis-equatorial-axial (β-ácido

artesúnico)………………………………………………………………………....................pág. 86

Figura 3.1 - Provável mecanismo catalisado pelo ácido de Lewis, ZnCl2, para a síntese do

derivado alilo 3.4……………..…………………………………………………………...…pág. 96

Figura 3.2 - Mecanismo para a síntese do derivado ácido da artemisinina, 3.6, obtido através da

oxidação do derivado 3.4 com KMnO4 e NaIO4………………………….………………....pág. 98

Figura 3.3 - Conformação para o derivado α-C10-acetato, 3.2, e ângulo diedro entre C9-H e C10-

H …………………………………………………………………………………….……..pág. 104

Figura 3.4 - Espectro de 1H-RMN e atribuição dos sinais C12-H e C10-H nos derivados acetato,

benzoato e alilo da dihidroartemisinina………………………………….…………...…….pág. 105

Figura 3.5 - Adição de aliltrimetilsilano ao ião oxónio 2.2, com a correspondente consequência

estereoquímica……….………………………………………………………………...……pág.105

Figura 3.6 - Desdobramento obtido para o protão H10 do derivado alilo 3.4……….....…..pág. 106

Figura 3.7 - Parte do espectro de 1H-RMN do derivado alilo 3.4, e a atribuição dos respectivos

protões…………………………………………………………………………………...….pág. 106

Figura 3.8 - Desdobramento obtido para o protão Hb do derivado alilo 3.4……………....pág. 107

Figura 3.9 - Derivado anidroartemisinina 3.5, e sinal apresentado pelo grupo metilo em C9 e pelo

protão em C10-H no espectro de 1H-RMN……………………………………..…...............pág. 108

Figura 3.10 - Espectro de 1H-RMN do derivado ácido C10-carba da artemisinina....……...pág. 109

Figura 3.11 - Espectro de 1H-RMN do híbrido final 3.8…………………………..……....pág. 110

Figura 3.12 - Representação gráfica que demonstra o desaparecimento de 3.10 em função do

tempo……………………………………………………………………………………….pág. 113

Figura 4.1 - Espectro parcial de 1H-RMN da primaquina (protões quinolínicos).………...pág. 125

Figura 4.2 - Padrão de desdobramento obtido para os protões quinolínicos H4 e H5, no híbrido

4.3..........................................................................................................................................pág. 125

xx

Figura 4.3 - Parte do espectro de 1H-RMN do híbrido 4.3, e atribuição dos protões

diastereotópicos.....................................................................................................................pág. 126

Figura 4.4 - Espectros de 1H-RMN dos híbridos 4.1 e 4.2, onde são evidenciadas nas zonas a

sombreado, as principais diferenças entre os dois compostos...............................................pág. 128

Figura 4.5 - Resultados do tratamento in vivo após infecção de ratinhos C57BL/6 por injecção

intraperitoneal de eritrócitos infectados com esporozoítos (106) que expressam a GFP…...pág. 132


intravenosa de esporozoítos (105) que expressam a GFP……………………………...…...pág. 133

Figura 4.7 - Resultados da inibição in vitro após infecção hepática por P. berghei, para os

híbridos 4.2 e 4.3………………………………………………………………………...…pág. 135


híbridos 4.2 e 4.3…………………………………………………………………………...pág. 136


híbridos 4.1 e 4.4…………………………………………………………………………...pág. 137

Figura 4.10 - Resultados da carga parasitémia in vivo no fígado dos ratinhos após infecção

hepática por P. berghei, para os híbridos 4.2 e 4.3………………….……………………...pág. 139

Figura 4.11 - Resultados da inibição da infecção in vivo na fase hepática por P. berghei, através

da administração oral dos híbridos 4.2 e 4.3………………………..……………………...pág. 141

xxi

Índice de Esquemas

Esquema 2.1 - Análise retrossintética dos híbridos C10-oxa da artemisinina-

dipeptidilvinilsulfona…………………………………………………………………….......pág. 50

Esquema 2.2 - Síntese do derivado aldeído através da amida de Weinreb (R2= CH2Ph,

CH2CH2Ph)…………………………………………………………………………………..pág. 53

Esquema 2.3 - Síntese da sulfona……………………………………………………….......pág. 54

Esquema 2.4 - Síntese da vinilsulfona………………………………………………………pág. 54

Esquema 2.5 - Síntese geral dos híbridos C10-oxa da artemisinina, pela via de síntese b).pág. 58

Esquema 2.6 - Reacção efectuada para obtenção do ácido artesúnico……………………...pág. 83

Esquema 3.1 - Análise retrossintética dos derivados híbridos C10-carba da artemisinina-

dipeptidilvinilsulfona……………………………………………………………………...…pág. 94

Esquema 3.2 - Proposta de síntese do composto C10-carba 3.3 a partir do derivado acetato da

dihidroartemisinina 3.2……………………………………………………………………....pág. 95

Esquema 3.3 - Síntese dos derivados benzoato, 3.1, e alilo, 3.4, a partir da dihidroartemisinina,

1.4……………………………………………………………………………………………pág. 96

Esquema 3.4 - Síntese do derivado ácido C10-carba da artemisinina, 3.6…………….….....pág. 97

Esquema 3.5 - Esquema reaccional proposto para a síntese de ésteres vinilsulfonatos e

vinilsulfonamidas……………..……………………………………………………………...pág. 99

Esquema 3.6 - Esquema reaccional para a síntese do trietilfosfonometanossulfonato...….pág. 100

Esquema 3.7 - Formação do sal tetrabutilamónio sulfonato 3.17………………………....pág. 100

Esquema 3.8 - Esquema reaccional para a síntese do éster fenil

fosfonometanossulfonato………………………………………………………………...…pág. 101

Esquema 3.9 - Síntese de N-fenil-N-metil fosfonometanossulfonamida 3.21………......…pág. 101

Esquema 4.1 - Reacção de acoplamento entre o ácido artelínico e a primaquina difosfato para

obtenção de 4.1………………………………….………………………………………….pág. 118

Esquema 4.2 - Síntese do derivado aldeído 4.5…………………………….…………...…pág. 119

Esquema 4.3 - Síntese do híbrido 4.2, através da reacção de aminação redutiva entre o aldeído 4.5

e a primaquina neutra 1.44……………………………………………………………….…pág. 120

Esquema 4.4 - Síntese do híbrido 4.3, através da reacção de acoplamento entre o derivado ácido

C10-carba 3.6 e o difosfato de primaquina…..…………………………………………...…pág. 121

Esquema 4.5 - Síntese do híbrido 4.4, através da reacção de aminação redutiva entre o aldeído 4.7

e a primaquina neutra 1.44...………………………………………………………………..pág. 121

Esquema 4.6 - Síntese do derivado aldeído 4.7……………………………………………pág. 122

Esquema 4.7 - Reacção de ozonólise………………………………………………….…...pág. 122

xxii

Esquema 4.8 - Transformação enzimática de p-nitrofenol a p-nitrocatecol, através de

CYP2E1…………………………………………………………………………………….pág. 142

xxiii

Índice de Tabelas

Tabela 1.1 - ACTs em desenvolvimento ou presentemente em uso…………………….......pág. 32

Tabela 2.1 - Derivados aminoacilo sintetizados…………………………………………….pág. 52

Tabela 2.2 - Híbridos C10-oxa do ácido artelínico e dipeptidilvinilsulfona sintetizados……pág. 57

Tabela 2.3 - Atribuição dos sinais obtidos nos espectros de 1H-RMN e

13C-RMN para a

artemisinina…………………………………………………………………………………..pág. 60

Tabela 2.4 - Desvio químico e multiplicidade do sinal dos grupos metilo na artemisinina, 1.1,

dihidroartemisinina, 1.4, e ácido artelínico, 2.1, no espectro de 1H-RMN ………………….pág. 65

Tabela 2.5 - Derivados aminoacilo do ácido artelínico, actividade antimalárica in vitro (PfW2) e

log D7,5……………………………………………………………………………………….pág. 72

Tabela 2.6 - Actividade antimalárica em estirpes de P. faciparum para os híbridos C10-oxa

derivados do ácido artelínico e valores de log P………………………………………..……pág. 73

Tabela 2.7 - Actividade inibitória da falcipaína-2 e chabaupaína-1, para os híbridos C10-

oxa………………………..………………………………………………………………......pág. 76

Tabela 2.8 - Inibição da babesipaína-1 (IC50/µM) obtida para alguns híbridos C10-oxa…....pág. 79

Tabela 2.9 - Tempos de retenção obtidos para os híbridos C10-oxa, em função do eluente

utilizado…………………………………………………………………………………...…pág. 80

Tabela 2.10 - Valores de kobs e t½ obtidos para os compostos em tampão fosfato isotónico pH 7,4

e plasma humano, a 37ºC e respectivos valores de log P…………………………………....pág. 81

Tabela 2.11 - Actividade antimalárica em várias estirpes de P. falciparum e inibitória para FP-2

nos híbridos C10-oxa derivados do ácido artesúnico………………...…………………….…pág. 87

Tabela 2.12 - Valores de kobs e t½ obtidos para os compostos em tampão fosfato isotónico pH 7,4

e plasma humano a 37ºC, e os respectivos valores de log P…………….………………...…pág. 88

Tabela 3.1 - Híbridos C10-carba sintetizados e rendimentos do último passo

reaccional……………………………………………………………………………….......pág. 102

Tabela 3.2 - Actividade antimalárica in vitro para os híbridos C10-carba da

artemisinina………………………………………………………………………………....pág. 111

Tabela 3.3 - Valores de kobs e t½ obtidos para os híbridos C10-carba em tampão fosfato isotónico

pH 7,4 e plasma humano, a 37ºC……………………………………………………….......pág. 113

Tabela 4.1 - Condições reaccionais para a reacção de aminação redutiva………………...pág. 120

Tabela 4.2 - Condições reaccionais para a reacção de aminação redutiva………………...pág. 122

Tabela 4.3 - Actividade antimalárica (PfW2) para os híbridos artemisinina-

primaquina………………………………………………………………………………….pág. 129

Tabela 4.4 - Valores de kobs e t½ obtidos, assim como o eluente utilizado, para os híbridos

artemisinina-primaquina……………………………………………………………………pág. 142

xxiv

Índice de Gráficos

Gráfico 2.1 - Gráfico que correlaciona o log P em função de IC50 dos híbridos

(PfW2)………………………………………………………………………………………..pág. 74

Gráfico 2.2 - Gráfico que correlaciona o log kobs em função de log P para os híbridos C10-oxa

derivados do ácido artelínico………….…………………………………………………......pág. 82

Gráfico 3.1 - Correlação entre o log P e o valor de IC50 para os híbridos C10-

carba………………………………………………………………………………...……....pág. 112

Gráfico 3.2 - Correlação entre o log P e o valor de log kobs para os híbridos C10-

carba………………………………………………………………………………………...pág. 114

CAPÍTULO I

Introdução

Introdução

2

Introdução

3

1.1 - Malária

Actualmente, a malária constitui um dos principais problemas de saúde pública

nos países subdesenvolvidos, afectando cerca de 200 a 300 milhões de pessoas em todo o

mundo e originando anualmente cerca de 1 milhão de mortes, sendo a maioria crianças

com idades inferiores a 5 anos e mulheres grávidas. Estima-se que a cada 45 segundos

uma criança morra de malária em África 1,2

.

A malária é causada por parasitas do género Plasmodium. Das mais de 100

espécies de Plasmodium conhecidas, apenas cinco infectam os humanos: falciparum,

vivax, malarie, ovale e knowlesi. Os casos graves são devidos maioritariamente por

P. falciparum, a mais perigosa das cinco espécies. Neste caso, os glóbulos vermelhos

infectados formam trombos nos capilares e comprometem a microcirculação. Quando tal

ocorre no cérebro, pode conduzir a delírio, convulsões, coma e morte. Assim, a malária

cerebral é de longe a forma mais perigosa da infecção 3-6

.

O ciclo de vida do parasita (Figura 1.1) começa pela inoculação de esporozoítos na

corrente sanguínea do Homem, aquando da picada de um mosquito fêmea Anopheles

infectado. Os esporozoítos viajam pelo sistema linfático e sanguíneo até ao fígado onde se

desenvolvem em esquizontes hepáticos ou formas “exo-eritrocíticas”, através de um

processo chamado esquizogonia, que origina os merozoítos. Após estes fenómenos de

diferenciação, os merozoítos são libertados na corrente sanguínea, onde invadem os

eritrócitos do hospedeiro, sofrendo modificações morfológicas até à formação de

trofozoítos que evoluem para esquizontes. A reprodução assexuada por esquizogonia, os

ciclos de invasão eritrocítica e a libertação de inúmeros merozoítos produz uma rápida

multiplicação de parasitas que origina os níveis de infecção responsáveis pela doença.

Nos eritrócitos alguns parasitas não sofrem esquizogonia mas transformam-se em

gametócitos dimorficamente sexuados (feminino e masculino). Estes gametócitos chegam

ao aparelho digestivo do mosquito durante a refeição de sangue e completam o seu

desenvolvimento sexual até à forma de gâmetas. Os gâmetas fundem-se para formar um

zigoto, originando um oocineto móvel, que migra para a parede exterior do estômago,

onde se forma o oocisto, que sofre várias divisões mitóticas originando numerosos

esporozoítos. Quando o oocisto se rompe, liberta os esporozoítos que atingem as

glândulas salivares para completar o ciclo 7-10

. O controlo desta doença tem sido

severamente afectado pelo aparecimento de parasitas resistentes a quase todos os

fármacos antimaláricos utilizados na profilaxia e tratamento, pelo que a procura de novos

Introdução

4

antimaláricos seguros e eficazes, tornou-se um dos principais objectivos para o controlo

da doença e redução da elevada taxa de mortalidade 3-4

.

Figura 1.1 - Ciclo de vida do parasita da malária no homem

Figura 1.1 - Ciclo de vida do parasita da malária no homem (adaptado de 9).

1.2 - Artemisinina e derivados

Na década de 70, foi isolado o composto cristalino artemisinina, 1.1, da planta

Artemisia annua, usada na China há mais de 2000 anos devido às suas propriedades

antipiréticas 4, 9

.

Hepatócito

Refeição de Sangue

Refeição de Sangue

Macrogâmeta Esquizonte

Trofozoíto

Sangue

Anel

Eritrócito

Merozoítos

Esquizontes

Hepáticos Fígado

Ciclo Pré-eritrocítico

Esporozoítos

Glândulas

Salivares

Formação de oocistos

Ciclo Eritrocítico

Assexual

Ciclo no

Homem

Ciclo no

Mosquito

Microgâmeta

Gametócitos

Fase Sexual Fertilização

Zigoto Parede do Estômago

Oocineto

Introdução

5

O

O

O

O

O

H

1

23

54

6 7

8

910

11

1213 12a

8a

5a

15

16

14

1.1

A artemisinina é um agente antimalárico extremamente activo e o único para o

qual não é reconhecida resistência clínica. Estruturalmente é uma lactona sesquiterpénica

que contém uma ponte endoperoxídica, fundamental para a actividade antimalárica. Esta

classe de antimaláricos é eficaz em estirpes multi-resistentes de P. falciparum,

apresentando actividade na fase sanguínea tanto para as formas assexuais como para as

formas sexuais, o que pode contribuir para a redução da doença em áreas de baixa

transmissão 11-14

.

Além da actividade antimalárica, existem análogos da artemisinina que

apresentam actividade contra outros parasitas do género Trypanossoma, Leishmania e

Toxoplasma 15

. Existem também exemplos de derivados da artemisinina com actividade

antitumoral 16-17

e antifúngica 18

.

1.2.1 - Potenciais alvos da artemisinina

Apesar da artemisinina ser um agente antimalárico utilizado em terapêutica

clínica, o seu mecanismo e local de acção continuam a ser debatidos na comunidade

científica. Existem várias teorias sobre o modo de acção da artemisinina e seus derivados,

porém todas elas apontam para a necessidade da presença de Fe2+

11, 19

.

1.2.1.1 - Interacção com o heme

Na fase sanguínea, o Plasmodium degrada a hemoglobina num organito

especializado, o vacúolo alimentar, fazendo uso de uma série de proteases, originando

péptidos e aminoácidos essenciais para o seu desenvolvimento e criando espaço no

eritrócito. Durante este processo liberta-se o grupo heme, potencialmente tóxico para o

parasita. De modo a evitar esta toxicidade, o plasmódio desenvolveu um mecanismo não

enzimático de destoxificação do heme, originando um polímero insolúvel e não tóxico,

Introdução

6

denominado hemozoína ou pigmento da malária. Uma das teorias para o mecanismo de

acção da artemisinina defende que a molécula é activada no vacúolo alimentar pelo Fe2+

,

reagindo depois com o grupo heme, impedindo deste modo a sua destoxificação 20-22

.

A ligação do Fe2+

(ferro hémico ou ferro livre não hémico) com o oxigénio 1 da

artemisinina, Figura 1.2, (Via 1), origina um radical de oxigénio que sofre rearranjo para

originar um radical de carbono primário, através de uma cisão da ligação C3-C4.

Alternativamente, a ligação com o oxigénio 2, Figura 1.2 (Via 2), produz igualmente uma

espécie radicalar de oxigénio, que através de uma migração 1,5 de hidrogénio produz o

radical de carbono secundário. Estes radicais podem alquilar o grupo heme, resultando na

morte do Plasmodium 23-27

.

O

O

O

O

O

O

O

H2C

O

O

O

O

OOH

O

O

.

.

O

O

O

O

O.

O

O

O

O

O

H

.FeIII

Fe (II)

FeIII

1

2

Via 1

Via 2

FeIIICisão

C3-C4

Migração

1,5-HFeIII

3

4

Figura 1.2 - Formação de radicais primários e secundários de carbono na artemisinina

pela acção do Fe2+

.

A alquilação do heme pela artemisinina foi reportada pela primeira vez por

Meshnick 28-29

, após identificação de aductos heme-artemisinina por espectrometria de

massa. A alquilação do grupo heme pode acorrer nos átomos de carbono α, β e δ

(Figura 1.3).

Introdução

7

H3COOC

NNH

N NH

COOCH3

O

OHO

O

O

Figura 1.3 - Alquilação do heme (modelo éster dimetílico) no carbono β, por um radical

primário de carbono formado após activação da artemisinina pelo Fe2+

.

Verificou-se igualmente que a incubação da hemozoína com a artemisinina a um

valor de pH próximo do existente no vacúolo do parasita (pH 5,5), resultou na perda da

estrutura da hemozoína, indicando que a sua estrutura pode ser destruída através da

interacção com este tipo de fármacos, originando a hematina livre 25, 30

.

O facto da artemisinina ser tóxica para o parasita em concentrações

submicromolares e serem necessárias concentrações micromolares para haver toxicidade

nas células humanas, aliado à acumulação de ferro hémico dentro do vacúolo alimentar

do parasita, pode explicar a selectividade inerente à artemisinina e derivados 4, 29

.

1.2.1.2 - Alquilação de proteínas

Haynes e colaboradores propuseram que o Fe

2+ actuava como um ácido de Lewis,

facilitando a activação iónica e não radicalar da artemisinina, com a consequente abertura

do anel. Ocorre assim uma quebra heterolítica, que através de uma reacção de Fenton

origina espécies radicalares reactivas de oxigénio, capazes de oxidar determinados

resíduos alvo de aminoácidos (Figura 1.4) 19, 26

.

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

O

O

Quebra Heterolítica

+-

Reacção de Fenton

HO

+

O2-.

. Ácido Lewis (Fe2+)

Figura 1.4 - Quebra heterolítica induzida pelo Fe2+

e formação de espécies reactivas de

oxigénio após reacção de Fenton.

γ

δ

α

β

Introdução

8

Estudos in vitro demonstraram igualmente que a artemisinina e derivados

marcados isotopicamente com [3H] alquilam determinadas proteínas do parasita, mas que

não alquilam proteínas em eritrócitos não infectados, o que sugere a associação entre a

alquilação de proteínas e a actividade antimalárica destes compostos. Em outro estudo in

vitro verificou-se, que estes compostos se ligam a hemoproteínas, como a catalase,

citocromo c e hemoglobina e à albumina humana, mas sendo necessária a activação pelo

Fe2+

11, 31-34

. Na alquilação da albumina humana, a artemisinina reage com os grupos

amina e tiol, o que levou a identificar posteriormente aductos entre os radicais derivados

da artemisinina e o aminoácido cisteína ou a glutationona reduzida 35

. Verificou-se que as

artemisininas inibem igualmente as falcipaínas, proteases de cisteína envolvidas na

degradação da hemoglobina pelo parasita e que o mecanismo de inibição é favorecido

com o aumento da concentração de heme 11

. Pandey et al

36 demonstraram igualmente que

a actividade das proteases de cisteína dentro de vacúolos digestivos de P. yoelli, podia ser

inibida pela artemisinina de modo similar ao E64, um potente inibidor destas proteases.

Um outro exemplo de alquilação de proteínas foi verificado com a proteína

homóloga TCTP (translationally controlled tumour protein). As funções moleculares

desta proteína em vários organismos, estão relacionadas com a ligação ao Ca2+

e a

microtúbulos. Verificou-se que a dihidroartemisinina, um derivado da artemisinina,

alquila esta proteína, na presença de heme, originando a morte do parasita, facto que

ainda não está totalmente elucidado, devido a pouco se saber da função fisiológica desta

proteína no Plasmodium. Sabe-se que a TCTP é segregada pelo parasita provocando

processos inflamatórios no hospedeiro e o aumento da sua expressão está relacionado

com um aumento de resistência. A relação entre a TCTP e a existência de resistência

parece ser consistente com a teoria de que esta proteína poderá ser um potencial alvo das

artemisininas 24, 31, 37, 38

.

1.2.1.3 - Interacção com PfATP6

A activação da artemisinina pelo Fe2+

existente no vacúolo alimentar, começou a

ser questionada por alguns grupos, devido ao facto da artemisinina agir em todos os

estados de desenvolvimento do parasita, incluindo aqueles em que não se liberta o heme e

não há formação da hemozoína. Embora a artemisinina actue predominantemente nas

fases onde a actividade metabólica é elevada, também pode actuar nas fases iniciais

Introdução

9

poucas horas após a infecção e nas fases sexuais sanguíneas, metabolicamente pouco

activas 2, 13

.

Krishna et al 14, 26

sugeriram que a clivagem endoperoxídica ocorre no citoplasma,

catalizada por uma fonte citoplasmática de Fe2+

. Segundo estes autores, as espécies de

carbono reactivas, resultantes da activação da artemisinina pelo ferro inibem uma bomba

de Ca2+

dependente de ATP, localizada no retículo endoplasmático e denominada de

PfATP6. Esta bomba é homóloga da ATPase de Ca2+

existente no retículo

sarco/endoplasmático de mamíferos (SERCA), cuja função é reduzir as concentrações

citosólicas de Ca2+

livre 30, 39-41

. Sabe-se que a interacção da artemisinina activada com

PfATP6 é preferencialmente de natureza hidrofóbica. Porém, o modo como a inibição da

PfATP6 origina a morte rápida do parasita ainda continua por esclarecer. Quando

expressa em oocistos de Xenopus laevis, a actividade de PfATP6 é inibida pela

artemisinina com potência similar à da tapsigargina, uma lactona sesquiterpénica

inibidora específica da SERCA, mas não pela quinina ou cloroquina. Assim, segundo esta

teoria, a PfATP6 é um alvo da artemisinina que exerce a sua acção por um mecanismo

dependente e activado pelo Fe2+

presente no citoplasma 11

.

1.2.1.4 - Membranas do parasita

A artemisinina pode ainda actuar por peroxidação lipídica 4. Quando incubada

com eritrócitos normais, a artemisinina aumenta a concentração de metahemoglobina e

reduz os níveis de glutationa intracelular e a concentração de ácidos gordos na membrana,

resultando na lise da célula. É de salientar que estes resultados foram obtidos com doses

103-10

5 vezes superiores à concentração eficaz de fármaco in vitro. Os radicais de

carbono provenientes da activação da ponte peroxídica pelo Fe2+

do grupo heme, vão

localizar-se na vizinhança dos hidrogénios alílicos das camadas bilipídicas insaturadas,

podendo abstrair um desses hidrogénios e formar radicais de carbono alílicos que em

contacto com oxigénio molecular formam hidroperóxidos lipídicos. A peroxidação

lipídica fornece espécies de oxigénio reactivas, tais como o radical hidroxilo e o anião

superóxido (Figura 1.5). Este mecanismo de acção foi suportado experimentalmente,

quando se verificou que o dano causado na membrana do vacúolo alimentar originava a

sua ruptura e consequente autodigestão do parasita 4, 11, 42

. Embora a peroxidação lipídica

seja uma ideia estabelecida, alguns autores afirmam que a morte do parasita não deve ser

maioritariamente devida a danos na célula provocados por estas espécies reactivas de

Introdução

10

oxigénio, mas sim pelas espécies radicalares de carbono, mencionadas anteriormente, e

pela alquilação de proteínas específicas, como por exemplo, a PfATP6 4, 40

.

O

O

O

O

O

R R´

H

R R´

O

OH

Fe (II)1

23

4

Radicais de Carbono

Abstracção de H dos lípidos .

O2

Peroxidação Lipídica

Espécies Reactivas de Oxigénio

HO Radicais Hidroxilo

. O2

- Superóxido

.

Figura 1.5 - Mecanismo proposto para a peroxidação lipídica das membranas celulares.

1.2.1.5 - Mitocôndria

Verificou-se que a artemisinina e seus derivados, quando marcados

isotopicamente com [3H] e [

14C], além de se acumularem dentro do vacúolo alimentar e

nas suas membranas, também se acumulavam na mitocôndria 29

. O mecanismo de acção

da artemisinina foi estudado em leveduras (Saccharomyces cerevisiae) e verificou-se que

inibia o desenvolvimento das leveduras através de alterações das funções mitocondriais

43. Num outro estudo, foi analisado o potencial da membrana mitocondrial de parasitas da

malária (P. berghei), verificando-se uma despolarização mitocondrial, possivelmente

provocada pelas espécies radicalares de oxigénio, que podem causar uma perda do

potencial da membrana mitocondrial, interrompendo o seu normal funcionamento e

eventualmente originando a morte celular. Neste mesmo estudo verificou-se selectividade

da artemisinina, para a mitocôndria do parasita relativamente à dos mamíferos 44-45

.

A mitocôndria porém, enquanto um possível alvo de acção deste tipo de

compostos é um assunto controverso. Estudos mostraram que eritrócitos infectados com

trofozoítos da estirpe D10, quando submetidos a elevadas concentrações de artemisinina

apresentavam perda de integridade no vacúolo alimentar, o que sugere que a artemisinina

exerce a sua actividade através da alquilação de proteínas e lípidos constituintes da

membrana do vacúolo digestivo. Com o dobro da quantidade de artemisinina, verificou-se

a desintegração da maior parte das membranas existentes no parasita. Porém, no mesmo

estudo não se verificou qualquer perda significativa das funções mitocondriais, mesmo

Introdução

11

com 40 vezes a quantidade de artemisinina, indicando que a mitocôndria não deve ser um

local de acção da artemisinina 46

.

1.2.1.6 - Via das flavinas

A artemisinina é uma molécula que pode transferir um electrão ou aceitar dois

electrões na ausência de ferro. Esta característica faz com que estes compostos interfiram

com os cofactores da flavina envolvidos na função de enzimas, como a glutationa

redutase, necessárias para manter a homeostase redox, favorecendo o stress oxidativo e

levando à morte do parasita 47, 48

.

O sinergismo existente entre o azul de metileno, 1.2, e a artemisinina levou a

sugerir este modo de acção. O azul de metileno, exibe actividade antimalárica in vitro

contra o Plasmodium falciparum e afecta o comportamento redox das dissulfureto

redutases dependentes da flavina existentes no parasita, como a glutationa reductase que

controla o stress oxidativo no plasmódio 48, 49

.

S

N

NNCH3

CH3CH3

CH3+

S

N

NNCH3

CH3CH3

CH3

1.2 1.3

A redução de 1.2 pelo cofactor flavina adenina dinucleótido (FADH2) da

glutationa reductase origina o azul de leucometileno, 1.3, cuja oxidação pelo oxigénio

origina a regeneração de 1.2, com formação de espécies reactivas de oxigénio. O

NADPH, por sua vez necessário para a redução de FAD em FADH2, passa a ser utilizado

na redução de 1.2 a 1.3. Esta interferência na função da glutationa reductase, aumenta o

stress oxidativo no parasita.

Através de estudos efectuados in vitro, verificou-se que a artemisinina pode de

igual modo perturbar o balanço redox no parasita, através da oxidação de FADH2 da

glutationa reductase do parasita e iniciando a auto-oxidação de FADH2 pelo oxigénio com

geração de espécies reactivas de oxigénio, levando à morte do parasita 48, 49

.

Introdução

12

É de salientar que estes processos não necessitam da presença de Fe2+

e que esta

teoria é incompatível com a hipótese da formação de radicais de carbono activados pelo

ferro, como provável mecanismo de acção.

1.2.2 - Vantagens das artemisininas

A artemisinina provoca a morte dos parasitas da malária, provavelmente por

geração de mais de um tipo de intermediários citotóxicos. São compostos versáteis, que

produzem diversos tipos de intermediários altamente reactivos (radicais de oxigénio e de

carbono) e vários tipos de electrófilos neutros (epóxidos, aldeídos e compostos

dicarbonílicos). Esta variedade de espécies pode explicar a dificuldade do parasita da

malária em desenvolver resistência 14, 23

. Existem vários outros factores pelos quais a

resistência às artemisininas ainda não foi desenvolvida 4, 29

:

a) têm tempo de semi-vida (t½) reduzido e consequentemente os parasitas ficam

expostos a concentrações subterapêuticas de fármaco durante pouco tempo;

b) através da sua actividade gametocitocida, estes derivados reduzem a

transmissão, diminuindo a possibilidade de infecção a outros mosquitos;

c) não exercem o seu efeito antimalárico apenas num único alvo biológico, mas

sim em vários alvos simultaneamente, com elevada precisão e eficiência. Estes alvos

envolvem inibição enzimática, peroxidação lipídica e efeitos na destoxificação do heme;

d) frequentemente são utilizados em combinação com outros antimaláricos.

1.2.3 - Derivados semi-sintéticos de primeira geração

A artemisinina tem problemas de solubilidade em água e em óleo, o que originou

a procura de novos derivados semi-sintéticos. A redução da lactona na artemisinina levou

à formação do hemiacetal dihidroartemisinina, 1.4. Posteriormente surgiram os derivados

éteres da dihidroartemisinina, o arteméter, 1.5, e arteéter, 1.6, ambos caracterizados por

um grupo acetal, sendo o arteméter mais utilizado na terapêutica e apresentando

actividade antimalárica in vitro superior em relação à artemisinina 12

. Comparativamente

à dihidroartemisinina, o arteméter é mais lipofílico e melhor absorvido no tracto gastro-

intestinal, permitindo administração oral. Os derivados 1.5 e 1.6 sofrem desalquilação

Introdução

13

oxidativa originando a dihidroartemisinina, o que sugere que possa ser este o metabolito

activo 4, 50, 51

.

O

O

O

O

OH

O

O

O

O

OR

1.4 1.5, R= CH3

1.6, R= C2H5

1.7, R= -C(O)CH2CH2CO2Na

1.8, R= - CH2C6H4-4-CO2Na

Após a desalquilação oxidativa ocorre rapidamente hidroxilação no fígado nas posições 5,

7 e 15 (Figura 1.6). Alguns dos metabolitos hidroxilados têm actividade antimalárica, mas

são eliminados através de reacções metabólicas de Fase II, na forma de glucoronidos

solúveis em água, com t½ de eliminação de 40-60 minutos, o que faz com que estes

derivados tenham de ser administrados diariamente durante um período de 5-7 dias,

originando pouca aderência ao tratamento e a recrudescência 4, 23, 24, 50, 52

.

O

O

O

O

OH O

O

O

O

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

HOOC

OH

Hidroxilação

GlucoronizaçãoArteméter

Desmetilação Oxidativa

Figura 1.6 - Metabolização do arteméter, 1.5.

Um outro derivado semi-sintético da artemisinina, é o artesunato de sódio, 1.7,

que devido ao grupo carboxilato, é solúvel em água e pode ser administrado por via

intravenosa, bastante importante em casos de malária cerebral. Este fármaco pode

também ser administrado por via intramuscular, rectal ou oral 53

. O artesunato é

rapidamente hidrolisado, libertando a dihidroartemisinina e é eliminado com um t½

inferior a 10 min., enquanto que o seu metabolito, a dihidroartemisinina, é eliminada com

Introdução

14

um t½ de 40-60 minutos, semelhante ao obtido para o arteméter 23

. O artelinato de sódio,

1.8, outro derivado hidrossolúvel da artemisinina, possui um grupo acetal

metabolicamente mais estável e um grupo carboxilato, tal como o artesunato, e tem t½ de

1,5-3 horas 4, 50

.

A neurotoxicidade é a maior preocupação com todos os derivados da artemisinina

que por biotransformação originam a dihidroartemisinina, um agente potencialmente

neurotóxico. A neurotoxicidade verificada em estudos efectuados com modelos animais,

até ao momento não foi observada em humanos, apesar do uso alargado da artemisinina

na China há mais de 30 anos 54, 55

. A artemisinina e os seus derivados são tóxicos para os

parasitas da malária em concentrações na ordem dos nM, mas para ocorrer toxicidade em

células dos mamíferos são requeridas concentrações na ordem dos µM 4, 24

. Em relação à

profilaxia da malária, o uso da artemisinina e seus derivados é proibido devido ao

possível risco de neurotoxicidade e para minimizar o aparecimento de resistência 24

.

1.2.4 - Derivados semi-sintéticos de segunda geração

De modo a ultrapassar os problemas apresentados pelos derivados de primeira

geração da artemisinina (t½ reduzido e formação de dihidroartemisinina), foram

desenvolvidos derivados semi-sintéticos de segunda geração 4, 12, 50, 56,

57

.

A maioria das variações foram efectuadas na posição C10 da artemisinina, onde o

átomo de oxigénio exocíclico foi substituído por substituintes de carbono de modo a

reduzir a sensibilidade metabólica do grupo acetal. Foram desenvolvidos vários

compostos contendo resíduos alquilo (1.9, 1.10, 1.11), arilo (1.12), e heteroarilo (1.13,

1.14). Foram também sintetizados derivados contendo variações na posição C16, como o

exemplo 1.15, e ainda dímeros, 1.16 57-59

. O composto TDR 40292, 1.11, não origina a

dihidroartemisinina como metabolito e contém uma cadeia lateral que origina um sal

solúvel em água, apresentando valores de actividade in vitro superiores aos do arteméter e

artesunato 4, 60

.

De um modo geral foram sintetizados compostos com actividade antimalárica in

vitro superior aos derivados da artemisinina de primeira geração, por vezes com

resultados promissores de actividade in vivo, mas nenhum dos derivados atingiu a fase

clínica.

Introdução

15

Foi igualmente desenvolvidos outros derivados de segunda geração, 1.17-1.20,

contendo substituintes de azoto em C10 e originando derivados N,O-acetal da artemisinina

4, 12, 50, 56.

O derivado 1.17, artemisona, apesar de não ter sido o composto mais activo, foi o

candidato mais promissor. Demonstrou ser 2-5 vezes mais activo in vivo que o artesunato,

não se verificando qualquer neurotoxicidade ou citotoxicidade, razão pela qual este

derivado esteve em ensaios clínicos de Fase IIa, mas presentemente os seus estudos estão

suspensos 50, 61, 62, 63

.

O

O

O

O

H

N

SO O

O

O

O

O

H

NH

F

O

O

O

O

H

N

N

N N

O

O

O

O

H

N

O

1.17 1.18 1.19 1.20

O

O

O

O

H

O

O

O

O

H

OH

O

O

O

O

H

N N

CF3

O

O

O

O

H

O

O

1.9 1.10 1.11 1.12

O

O

O

O

H

N

O

O

O

O

H

O

O

O

O

O

H

CF3

O

O

O

O

H

O

O

O

O

H

O O

1.13 1.14 1.15 1.16

Introdução

16

1.2.5 - Derivados peroxídicos de síntese

A desvantagem de todos os derivados semi-sintéticos da artemisinina é o facto de

esta ser de origem natural e de acesso limitado. De modo a evitar este problema e sendo a

estrutura endoperoxídica fundamental para a actividade antimalárica, desenvolveram-se

inúmeros análogos peroxídicos totalmente sintéticos, nomeadamente 1,2,4-trioxanos,

1.21-1.23, 1,2,4-trioxolanos, 1.24-1.26, tetraoxanos, 1.27-1.29, e outras estruturas

endoperoxídicas, 1.30-1.31. Estes derivados, tal como as artemisininas são activados pelo

Fe2+

e exercem o seu modo de acção através da formação de espécies radicalares 4, 12, 50, 56,

64.

OO

O

F

F

O

O

O

H

H

R

MeO

R= FR= COOH

O

O

O

H

O OP

O

OO

1.21 1.22 1.23

OO

OR

R=OH, OR, NHRonde R= arilo, alquilo

OO

O

OO

O

ONH NH2

1.24 1.25 1.26

O

OO

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OO

1.27 1.28 1.29 1.30

Introdução

17

O

O

O

O

O

1.31

Dos 1,2,4-trioxanos apresentados, é de referir o composto Fenozan BO-7, 1.21,

constituído por um trioxano fundido com um anel espiro, que apresentou uma actividade

in vitro promissora (IC50 = 7,3 nM) 12

. Dos 1,2,4-trioxolanos, salientam-se os compostos

1.25, contendo um anel ciclohexano e um anel adamantano de cada lado do trioxolano

(IC50 = 3,7 nM), e o composto OZ-277, 1.26, com um anel adamantano e um resíduo

aminoacilo, promovendo a polaridade e a solubilidade adequada, que se traduz num

melhor perfil farmacológico e numa actividade elevada contra o Plasmodium falciparum

(IC50 = 0,47 nM). Tendo em conta os resultados obtidos, este último composto OZ-277,

ou arterolano, foi apresentado como um candidato promissor, e está actualmente em

ensaios clínicos de Fase III, em terapia combinada com a piperaquina 4, 12, 50, 56, 65

. Dos

tetraoxanos apresentados, o 1.28 apresenta um IC50 de 3 nM, inferior ao da artemisinina.

Verificou-se que, de um modo geral, este tipo de análogos apresenta valores de actividade

superiores aos da artemisinina e quando administrados oralmente em ratinhos são

bastante eficazes e não apresentam efeitos tóxicos 4, 12, 50, 56

.

Além dos compostos apresentados anteriormente, existem presentemente em

avaliação mais três endoperóxidos sintéticos, que apresentam potente actividade

antimalárica: o CDRI 97/78, 1.32, em Fase I; o CDRI 99/411, 1.33, em Fase pré-clínica,

que pertencem à classe dos 1,2,4-trioxanos; e o OZ-439, 1.34, um 1,2,4-trioxolano. Este

último derivado tem a vantagem de apresentar um valor de t½ vinte vezes superior ao

derivado OZ-277, 1.26, e encontra-se em estudos clínicos de Fase IIa 63, 66,

67

.

O

OO

OO

O

O

OH

O

OO

1.32 1.33

Introdução

18

O

N

O O

OO

1.34

Existindo diversos endoperóxidos sintéticos e artemisininas em estudo e apesar de

o alvo terapêutico ser o mesmo, esperam-se que as diferenças estruturais existentes entre

estes dois tipos de compostos sejam úteis para ultrapassar eventuais problemas de

resistência que possam vir a aparecer.

1.3 - Falcipaínas, as proteases de cisteína

1.3.1 - Falcipaínas como alvo terapêutico

A hidrólise da hemoglobina pelo parasita parece ser um processo cooperativo,

envolvendo vários tipos de proteases específicas (aspárticas, de cisteína e

metaloproteases). Este processo ocorre num organito acídico (pH 5,5) especializado,

desenvolvido pelo parasita, o vacúolo alimentar. As falcipaínas-1, -2 e -3 68, 69

e a

falcipaína-2B 70

, descoberta posteriormente, são principalmente expressas nos trofozoítos

do P. falciparum e parecem estar localizadas no vacúolo alimentar, o local da hidrólise da

hemoglobina. As falcipaínas-1 e -3, são capazes de clivar a hemoglobina nativa, enquanto

a falcipaína-2 tem maior actividade para a hemoglobina desnaturada. Os péptidos

menores, produzidos pelas falcipaínas são finalmente degradados pela metaloprotease

falcilisina. As falcipaínas-2 (FP-2) e -3 (FP-3) são as principais proteases de cisteína

existentes nos trofozoítos e apesar de ambas necessitarem de um meio acídico para uma

actividade óptima, a FP-3 demonstra uma maior dependência do pH. A concentração de

FP-2 é cerca de 1,8 vezes superior em relação à FP-3, porém a FP-3 é capaz de clivar a

hemoglobina nativa duas vezes mais rápido do que a FP-2. Deste modo a contribuição

destas duas enzimas na hidrólise da hemoglobina nativa é essencialmente equivalente 68,

69, 71, 72. Sabe-se que a FP-1 desempenha também um papel importante na produção de

oocistos durante o desenvolvimento do parasita, apesar de o seu papel ainda não estar

totalmente elucidado. Das várias proteases de cisteína, a FP-2 é a protease com

Introdução

19

caracterização bioquímica, expressão recombinante, localização celular, análise estrutural

e função biológica, melhor estudada até ao momento 70

.

1.3.2 - Inibidores das falcipaínas

Inibidores específicos das falcipaínas-2 e -3 bloqueiam a degradação da

hemoglobina e o desenvolvimento do parasita, conduzindo à sua morte, o que suporta a

hipótese de que estas falcipaínas são as proteases de cisteína requeridas nos passos

iniciais da degradação da hemoglobina 68, 73-75

.

Várias estratégias têm sido desenvolvidas para o design de inibidores de proteases

de cisteína. Os peptidilaldeídos, 1.35, e nitrilos, 1.36 são inibidores reversíveis destas

proteases que formam hemitioacetais, e tioimidatos, respectivamente, com o tiol do

resíduo de cisteína do sítio activo. Como exemplos de inibidores irreversíveis, existem os

derivados epoxisuccinilo, como o E64, 1.37, e os aceitadores de Michael peptídicos,

como as aciloximetilcetonas, 1.38, diazometilcetonas, 1.39, halometilcetonas, 1.40, e

vinilsulfonas, 1.41, que inactivam irreversivelmente as proteases de cisteína através da

alquilação do resíduo de cisteína do sítio activo. Verificou-se que 1.35 76

, 1.40 75, 77

, e

1.41 72, 75

bloqueiam o desenvolvimento de culturas de plasmódio 71

. Além destes

inibidores, existem ainda várias classes de inibidores reversíveis não-peptídicos 78

.

OH

H

O

NH

O

NH

NH

NHNH2

COOH

1.35 1.36 1.37

1.38 1.39 1.40

NH

H

O

Péptido

R1O

NH NPéptido

R1

NH

O

O

O

Péptido

R1

R2

NH

O

NN

Péptido

R1

-+

NH

X

O

Péptido

X= Cl, F

R1

Introdução

20

NH

SOO

R1

Péptido R2

1.41

O facto das vinilsulfonas serem inibidores da protease de cisteína do Trypanosoma

cruzi e a semelhança estrutural do local activo desta protease com a falcipaína-2, sugeriu

que estes inibidores podiam ser um ponto de partida útil para a elaboração e design

racional de novos antimaláricos 68

. As vinilsulfonas são um grupo funcional bastante

utilizado em química orgânica e química medicinal, participando em reacções de

adição-1,4 e cicloadição e têm a capacidade de inibir diversos processos enzimáticos,

nomeadamente os que envolvem proteases de cisteína 79

.

Na Figura 1.7 está representado o mecanismo de inibição de proteases de cisteína

por vinilsulfonas, através da adição conjugada do tiol do resíduo de cisteína existente no

sítio activo, estabilizado pela histidina (par iónico His/Cys) 79, 80

. As vinilsulfonas

dipeptídicas são potentes inibidores da falcipaína-2 e do desenvolvimento do parasita com

valores de IC50 in vitro da ordem dos nM. Também demonstraram possuir elevada

eficácia em modelos murinos de malária, quando administradas oralmente. Outra

observação importante foi o facto das vinilsulfonas bloquearem a degradação da

hemoglobina, dado que é consistente com a inibição de enzimas envolvidas neste

processo 78, 81

.

Figura 1.7 - Mecanismo de inibição das proteases de cisteína pelas vinilsulfonas.

Foi testada a actividade antimalárica contra o Plasmodium falciparum, de vários análogos

de vinilsulfonas 78, 81

incluindo vinilsulfonas peptídicas, vinilsulfonatos e

vinilsulfonamidas, com a estrutura geral apresentada na Figura 1.8, onde P1 e P2

representam as cadeias laterais dos aminoácidos; R1 representa o substituinte vinilsulfona,

sulfonamida ou éster sulfonato; R1´

um substituinte variado, e S1 e S2 os sub-sítios da

enzima que reconhecem o substrato. Considerando as mesmas variações de aminoácidos,

RNH

SO2R

H

S H His

RNH

SO2R

H

H HisS

Cys

RNH

S

SO2R

Cys

Cys+-

+

-

R1R1 R1

Introdução

21

verificou-se relativamente à actividade para a falcipaína-2, que os ésteres vinilsulfonato

têm maior actividade que as vinilsulfonamidas, e estas por sua vez maior actividade que

as vinilsulfonas peptídicas. Estudos indicam também que inibidores com a sequência

Leu-homoPhe conduzem a uma forte inibição da falcipaína-2 (IC50 ∼ 9 nm), enquanto que

a sequência Phe-homoPhe conduz a uma inibição muito modesta (IC50 ∼ 105 nm) 81

.

NH

NH

S

O

O

O O

R1´

P1

P2

R1

S2

S1

S1´

Figura 1.8 - Estrutura geral dos inibidores dipeptídicos vinilsulfonas.

O sítio S2 é o local de reconhecimento primário para a maioria das proteases de

cisteína e é predominantemente de natureza hidrofóbica na falcipaína-2, pelo que existe

uma forte preferência para substratos com um resíduo hidrofóbico, em particular Leu na

posição P2. Em estudos efectuados por Sabnis et al 69

verificou-se que inibidores com um

grupo benziloxicarbonilo, tinham maior afinidade para a cavidade S2 da FP-2 do que para

a FP-3. Este facto é justificado pela presença de dois resíduos de leucina (L84 e L172) na

cavidade S2 da FP-2, que são substituídos por tirosina (Y93) e prolina (P181),

respectivamente, na FP-3, tornando a cavidade S2 mais estreita em FP-3 do que em FP-2.

Esta alteração no efeito estéreo, parece ser a principal diferença entre estas duas

proteases. Apesar do sítio S2 ser uma das principais diferenças entre estas duas

falcipaínas, ambas têm uma especificidade semelhante: uma forte preferência para a

leucina na posição P2 81, 82

.

O composto 1.42, Mu-Leu-hPhe-VSPh, onde Mu representa a unidade

4-morfolinocarbonilo, é um exemplo de um inibidor contendo o dipéptido ideal para o

reconhecimento enzimático, sendo activo contra a falcipaína-2 (IC50 = 3,5 nM) e em

culturas de P. falciparum (IC50 = 22 nM) 76, 77, 80, 81,83

.

Introdução

22

O

N NH

NH

S

O

O

Ph

Ph

O O

1.42

1.4 - 8-aminoquinolinas

A pamaquina, 1.43, sintetizada em 1926, foi uma das primeiras 8-aminoquinolinas

com acção antimalárica. Este composto tinha a vantagem de exibir acção gametocitocida

quando utilizado em combinação com a quinina, mas apresentava as seguintes

desvantagens: a) era um esquizontocida sanguíneo fraco; b) era pouco eficiente em

terapia profiláctica; c) mesmo administrado em terapia combinada com a quinina não

conseguia prevenir as recidivas de Plasmodium vivax: d) apresentava elevada toxicidade,

nomeadamente hemólise e metahemoglobinémia. Estas desvantagens levaram ao seu

abandono e à procura de novos fármacos, de onde surgiu a primaquina, 1.44, sintetizada

em 1946 84-87

.

N

MeO

NH

CH3

N

N

MeO

NH

CH3

NH2

2

3

45

*

7

1.43 1.44

A primaquina tem sido largamente utilizada na erradicação de formas hepáticas

latentes do parasita, responsáveis pelas recidivas em infeccções de P. vivax e P. ovale.

Tem também actividade na fase sexual do parasita, sendo um gametocitocida e

controlando a transmissão da doença. Este fármaco é rapidamente absorvido, atinge a

concentração máxima no plasma duas horas após administração, mas tem um t½ de

aproximadamente oito horas, o que faz com que permaneça activo contra os parasitas

apenas durante alguns dias. A OMS recomenda o uso da primaquina numa única toma

oral, juntamente com um esquizonticida sanguíneo eficaz para reduzir a transmissão em

Introdução

23

zonas endémicas. Em zonas onde o programa de tratamento é eficaz, os pacientes

geralmente recebem o tratamento um ou dois dias após o pico da infecção, ou

aproximadamente três ou cinco dias antes da maturação dos gametócitos 88

.

A resistência do Plasmodium à primaquina é extremamente baixa e apesar da

existência de alguns casos de reaparecimento da malária causada por P. vivax, após

tratamento com este fármaco, a sua frequência, intensidade e distribuição não aparentam

ser alarmantes 87

.

Apesar da primaquina ser uma quinolina, o seu modo de acção parece ser

completamente distinto do das 4-aminoquinolinas, como a cloroquina, cujo modo de

acção, está relacionado com a acumulação no vacúolo digestivo acídico e ligação ao

grupo heme, impedindo a sua destoxificação 21, 89-91

. O mecanismo exacto pelo qual a

primaquina consegue exercer a sua actividade antimalárica ainda continua incerto, mas

acredita-se que sofre metabolização no fígado originando uma quinonimina activa, que

interfere com o funcionamento mitocondrial do parasita e com a ubiquinona, que

participa no transporte de electrões da cadeia respiratória. Existem estudos que indicam

que a exposição à primaquina afecta a proliferação mitocondrial do Plasmodium e inibe o

desenvolvimento de certas fases que necessitam de acção mitocondrial 87,

92,

93,

94

. Deste

modo, o mecanismo de acção da primaquina pode estar relacionado com a acção das

naftoquinonas, como a atovaquona, que se sabe inibir o complexo citocromo bc1

existente na cadeia respiratória e colapsar o potencial de membrana mitocondrial 95-97

.

Basso et al 98

, comprovaram recentemente que a estrutura da primaquina é capaz de

causar uma desordem ao nível da estrutura dos lípidos constituintes das membranas da

mitocôndria, o que pode influenciar o normal funcionamento de determinadas proteínas

constituientes do meio lipídico

Outra hipótese de mecanismo está relacionada com a possibilidade da primaquina

gerar metabolitos altamente reactivos que originam potenciais oxidativos intracelulares

desfavoráveis ao parasita 87,

92-94

. Os metabolitos reactivos resultantes actuam suprimindo

as defesas celulares, ao mesmo tempo que atacam macromoléculas essenciais. Contudo, e

embora não exista ainda informação conclusiva que demonstre se a actividade

antimalárica da primaquina é devida à sua acção directa ou mediada pelos metabolitos

resultantes, a metabolização destas 8-aminoquinolinas parece ser necessária tanto para a

sua eficácia como para a sua toxicidade 87, 98

.

A primaquina é rapidamente absorvida ao nível do tracto gastrointestinal,

apresenta baixa biodisponibilidade oral, sendo rapidamente metabolizada com formação

Introdução

24

da carboxiprimaquina, 1.45, o principal metabolito da primaquina identificado em ratos,

macacos e humanos. Adicionalmente, este agente antimalárico origina outros metabolitos,

alguns já identificados e outros ainda não, detectados tanto na urina como no plasma. De

acordo com estudos in vitro e in vivo, os principais metabolitos da primaquina podem ser

compostos hidroxilados, diméricos, contendo um átomo de enxofre e a carboxiprimaquina

87, 99, 100.

A carboxiprimaquina, 1.45, foi o primeiro metabolito identificado e descrito,

ocorrendo a sua formação por uma via metabólica com elevada actividade da enzima

monoamina oxidase (MAO) existente na fracção mitocrondrial e independente da acção

do citocromo P450 (Esquema 1.9). Deste modo, ocorre a biotransformação da cadeia

lateral da primaquina, por acção das oxidases, com formação de um derivado contendo a

função aldeído, que é convertido maioritariamente pela acção da enzima aldeído

desidrogenase em 1.45 ou no derivado contendo a função álcool por acção da enzima

álcool desidrogenase 87, 100

.

N

MeO

NH

CH3

NH2

N

MeO

NH

CH3

H

O N

MeO

NH

CH3

OH

N

MeO

NH

CH3

OH

O

MAO

mitocôndria

ÁlcoolDesidrogenase

AldeídoDesidrogenase

1.45

Esquema 1.9 - Via metabólica proposta para a cadeia lateral da primaquina, (adaptado de 100

).

O facto da carboxiprimaquina apresentar menor actividade antiplasmódica do que

a primaquina, sugere que o grupo amina terminal da cadeia alifática é importante para a

actividade destes compostos. Este metabolito não é detectado na urina, o que indica a

ocorrência de transformações adicionais, prévias à sua excreção, com provável formação

de espécies reactivas e tóxicas 87

. Ao contrário da carboxiprimaquina, alguns metabolitos

Introdução

25

resultantes da hidroxilação da primaquina foram identificados nos fluidos biológicos de

alguns animais após tratamento, destacando-se a 5- hidroxiprimaquina, 1.46, e a

6-metoxi-8-hidroxilaminoquinolina, 1.47. Ambos os metabolitos são potencialmente

responsáveis pela formação de meta-hemoglobina, hemólise dos eritrócitos e deplecção

da actividade da glutationa 101, 102, 103

.

N

MeO

NH

CH3

NH2

OH

N

MeO

NHOH

N

OH

NH

CH3

NH2

OH

1.46 1.47 1.48

N

MeO

NH2

OH

N

OH

NH2

OH

1.49 1.50

Foram ainda identificados outros metabolitos como, por exemplo, a

5,6- dihidroxiprimaquina, 1.48, a 6-metoxi-5-hidroxi-8-aminoquinolina, 1.49, e a

5,6-dihidroxi-8-aminoquinolina, 1.50. Alguns destes metabolitos demonstraram

interacção in vitro com os eritrócitos e a hemoglobina humana e verificou-se que os

metabolitos hidroxilados eram mais eficazes na oxidação da hemoglobina do que a

primaquina, promovendo os efeitos tóxicos inerentes à primaquina. Os metabolitos 1.46,

1.48 e 1.50 sofrem rapidamente oxidação em condições fisiológicas, com formação de

H2O2 e de derivados quinona-imina 87, 104

.

A primaquina apesar de apresentar a vantagem de actuar nas fases gametocíticas

do parasita e nas formas latentes do P. vivax e P. ovale, apresenta também algumas

desvantagens, nomeadamente: a) a existência de alguma resistência, porém não tão

efectiva como ocorre com os fármacos 4-aminoquinolínicos; b) meta-hemoglobinémia, ou

seja, acumulação anormal de meta-hemoglobina, o produto resultante da oxidação do Fe2+

da hemoglobina em Fe3+

; c) hemólise eritrocítica, principalmente em indivíduos com

deficiência na enzima glucose-6-fosfato desidrogenase, provocada por stress oxidativo

com origem em reacções redox nos metabolitos da primaquina. É de referir que uma toma

Introdução

26

única de primaquina (45 mg por adulto) pode resultar numa redução dos níveis de

hemoglobina e em anemia severa 92, 105-107

. A hemólise observada na administração de

primaquina está relacionada com a deficiência na enzima glucose-6-fosfato-

desidrogenase, uma vez que nestes casos a oxidação de Fe2+

a Fe3+

encontra-se

favorecida, o que causa um aumento da concentração de meta-hemoglobina no

organismo. Porém a hemólise, não é restrita a indivíduos com esta deficiência enzimática,

tendo sido observada em áreas com baixa prevalência desta deficiência. É fundamental

antes do inicio da terapia, a realização de um teste prévio à actividade desta

enzima 87,

88, 107, 108, 109

.

O mecanismo de acção e a toxicidade da primaquina ainda não estão

completamente esclarecidos. Os metabolitos da primaquina gerados in vitro incluem

quinona-iminas reactivas, como 1.51, que reagem com espécies nucleofílicas (Nu), tais

como os grupos tióis da glutationa. Além disso, os eritrócitos e hepatócitos contêm Fe2+

que facilita a formação de espécies radicalares de oxigénio 110

.

N

MeO

N

CH3

N

O

Nu

1.51

Têm sido sintetizados alguns derivados da primaquina, com o objectivo de

aumentar a actividade antimalárica nas fases sanguínea e tecidular e reduzir a toxicidade.

A bulaquina, 1.52, um análogo da primaquina é um potente agente antimalárico, menos

tóxico do que a primaquina, causando apenas um terço da metahemoglobinémia causada

pela primaquina. Exibe actividade profiláctica contra os esporozoítos em infecções de

Plasmodium cyanomolgi em macacos rhesus, além de não exibir acção teratogénica em

estudos de toxicidade efectuados em ratos e macacos rhesus. Completou os ensaios

clínicos de Fase II/III e é actualmente comercializado na Índia (Aablaquine™) para uso

clínico contra a malária vivax 65, 111, 112

. Outro análogo da primaquina, a tafenoquina

(WR238605), 1.53, encontra-se presentemente em ensaios clínicos de Fase IIb/III, como

fármaco de toma única para o tratamento de infecções por P. vivax. Apresenta maior

actividade, maior t½, menor toxicidade do que a primaquina e actividade esquizonticida

Introdução

27

sanguínea e tecidular, podendo ser administrado em profilaxia, apesar de poder gerar a

espécie quinona-imina 1.54, que pode reagir com espécies nucleofílicas 63, 113-115, 110.

N

MeO

NH

CH3

NH

CH3

OO

N

MeO

NH

CH3

NH2

OMe

OF

F

F

1.52 1.53

N

O

NH

CH3

NH2

O

OF

F

F

Nu

1.54

Além destes derivados, também têm sido sintetizados vários outros análogos da

primaquina ao longo dos tempos e estudada a sua relação estrutura actividade. Muitos

deles exibiram igual ou superior actividade à primaquina, tendo-se efectuado as principais

alterações estruturais no núcleo quinolínico, através da introdução de grupos substituintes

nas posições 2, 3, 4, 5 e 7 do anel quinolínico e na cadeia lateral. Verificou-se que no anel

quinolínico, se deve manter o grupo metoxi na posição C6 e que as restantes substituições

favoráveis ocorreram na posição C2 e C4 com substituintes alquilo e em C5 com

substituintes alquiloxi, flúor e fenoxi. Em relação à cadeia lateral, verificou-se melhor

actividade antimalárica na presença de uma cadeia alquílica ramificada com 4 a 5 átomos

de carbonos entre o C8 quinolínico e a amina terminal 116-117

. Como exemplo de análogos

da primaquina, entre os inúmeros que têm sido sintetizados, temos o 1.55 com variações

na cadeia lateral, contendo uma imidazolidin-4 ona 118

e 1.56 e 1.57 com um substituinte

em C5 e C2 no anel quinolínico, respectivamente, todos eles com actividade antimalárica

semelhante ou melhor do que a primaquina 117,

119

. A formação da espécie quinona-imina

e da carboxiprimaquina levou à síntese de derivados com grupos substituintes no anel

quinolínico em C5 e à modificação da amina primária terminal, respectivamente.

Introdução

28

NH

N

N

MeO

NH

CH3

O

R1R2

R3

NH2

N

MeO

NH

CH3

O CH3

CF3

NH2

N

MeO

NH

CH3

CH3

C(CH3)3

1.55 1.56 1.57

A primaquina apresenta um carbono quiral, mas não é considerada uma mistura

racémica, uma vez que o l-isómero existe em maior quantidade do que o d-isómero 87

.

Devido à presença deste centro estereogénico, seria de esperar que cada isómero tivesse

uma actividade diferente, considerando o provável envolvimento de enzimas no

mecanismo de acção. Porém, verificou-se que os isómeros isoladamente e a sua mistura

têm actividade antimalárica similar, com base na cura radical de macacos rhesus

infectados com esporozoítos de P. cynomolgi. Em relação à toxicidade aguda em ratinhos,

o d-isómero apresenta uma toxicidade quatro vezes maior do que o l-isómero e duas vezes

do que a primaquina. De modo a determinar a diferença nos dois isómeros em relação à

sua transformação na correspondente carboxiprimaquina, que apresenta menor formação

de meta-hemoglobina comparativamente à primaquina, verificou-se maior velocidade de

conversão para o l-isómero do que para o d-isómero, o que parece explicar a maior

toxicidade do d-isómero. Sabe-se que a biotransformação da primaquina está relacionada

com a sua toxicidade e actividade antimalárica, e que envolve reconhecimento quiral,

apesar de até ao momento o exacto mecanismo ainda não estar estabelecido 87, 120

.

Introdução

29

1.5 - Combate à resistência

O parasita da malária desenvolveu resistência à maioria dos fármacos

antimaláricos usados em clínica, como por exemplo à cloroquina, sulfadoxina-

pirimetamina, amodiaquina e mefloquina, chegando mesmo nalguns casos a desenvolver

resistência no próprio ano da introdução do fármaco, como no caso da sulfadoxina-

pirimetamina 63

. A resistência à cloroquina resulta de mutações numa proteína de

transporte, chloroquine resistance transporter, existente no Plasmodium falciparum

(PfCRT). Esta proteína está situada na membrana do vacúolo digestivo do parasita e

parece controlar a acumulação de cloroquina dentro do vacúolo. No caso da cloroquina e

fármacos quinolínicos a resistência parece estar relacionada com o aumento do efluxo.

Mutações encontradas no PfCRT, como K76T, estão perfeitamente associadas à

resistência à cloroquina pelo P. falciparum verificada in vitro em diversas zonas

geográficas. A sensibilidade à cloroquina também está associada a mutações pontuais no

gene mdr1 (multi-drug resistance), principalmente no codão 86. O polimorfismo em

Pfmdr1 modula o nível de resistência à cloroquina in vitro no fenótipo MDR. Sabe-se que

estes dois genes (Pfmdr1 e Pfcrt) codificam proteínas transportadoras de membrana que

controlam a sensibilidade à cloroquina 121-124

.

Vários estudos têm vindo a ser efectuados de modo a detectar qual o possível

mecanismo de resistência desenvolvido pelo Plasmodium às artemisininas e recentemente

Chavchich et al 125

verificaram amplificação e aumento de expressão do gene Pfmdr1, o

que pode estar relacionado com a existência de resistência. O mesmo mecanismo de

efluxo observado para a cloroquina pode também estar presente nas artemisininas.

Um dos possíveis modos de acção da artemisinina está relacionado com a inibição

da PfATP6. Verificou-se que alguns polimorfismos na enzima PfATP6 estão associados a

uma diminuição da actividade antimalárica da artemisinina e estudos in vitro

demonstraram que a mutação L263E retira a acção inibitória da artemisinina, sugerindo

que as mutações em PfATP6 são um factor de possível resistência 123, 126-128

.

Apesar de até ao momento não existirem evidências clínicas relevantes de

resistência do plasmódio às artemisininas, foi verificada uma diminuição da

susceptibilidade dos parasitas ao tratamento com artemisininas na fronteira entre a

Tailândia e o Camboja, demonstrando o possível desenvolvimento de parasitas resistentes

ao fármaco. As três principais razões para o aparecimento deste fenómeno de resistência

Introdução

30

às artemisininas provavelmente são devidas: a) ao uso de monoterapia; b) às doses

subterapêuticas administradas; c) à falsificação deste produto no mercado 11, 121

.

Esta situação emergente de possível resistência, levou a OMS a recomendar o uso

de terapia combinada na administração das artemisininas (ACT – Artemisinin-based

Combination Therapy) como fármacos de primeira linha para o tratamento da malária

desde 2001 129

.

1.5.1 - Terapia combinada

O princípio de combinar diferentes fármacos de modo a melhorar as suas

propriedades farmacêuticas não é novo e tem sido aplicado no tratamento de infecções

bacterianas como a tuberculose 120

, o HIV 121

e na quimioterapia de vários tipos de cancro

122.

A combinação de antimaláricos pode aumentar a sua eficácia, diminuir o tempo de

duração do tratamento, aumentar a aceitação por parte do doente ao tratamento e mais

importante ainda, diminuir o risco de desenvolvimento de parasitas multi-resistentes. Os

primeiros exemplos de terapia combinada na malária, incluem a

pirimetamina/sulfadoxina, pirimetamina/dapsona e a quinina combinada com tetraciclinas

4. Posteriormente a mefloquina foi combinada com a pirimetamina/sulfadoxina e a

atovaquona com o proguanilo. Porém, surgiu resistência a todas estas combinações, quer

pelo facto dos compostos terem modos de acção relacionados, susceptíveis à mesma

mutação do parasita, ou porque já foi desenvolvida resistência para um dos compostos 51,

63, 133-135. No caso da terapia sulfadoxina-pirimetamina, a sulfadoxina actua pela inibição

da enzima dihidropteroato sintetase, enquanto a pirimetamina inibe a enzima

dihidrofolato redutase, ambas as enzimas essenciais na via de biosíntese dos folatos. A

resistência a esta combinação resulta de mutações nos genes que codificam estas duas

enzimas no parasita 136,

137, 138

.

A artemisinina, sendo o antimalárico mais eficaz actualmente em uso, diminuindo

a parasitémia rapidamente e sem resistência reconhecida, foi o candidato ideal

recomendado pela OMS para combinar com outro fármaco, reduzindo os parasitas

capazes de desenvolver mutações ao segundo fármaco, diminuindo o período de

tratamento e prevenindo recrudescências 129,

139

. É de salientar que o t½ relativamente

baixo da artemisinina apresenta a vantagem da resistência por parte dos parasitas ser

Introdução

31

menos provável, mas tem a desvantagem de um elevado risco de recrudescência,

principalmente em monoterapia 14

.

Geralmente a artemisinina e derivados, são combinados com outros antimaláricos

que tenham t½ prolongados. Presentemente, o arteméter é administrado conjuntamente

com a lumefantrina, (Coartem

ou Riamet

) e o artesunato é o principal fármaco

utilizado na terapia combinada baseada em artemisininas e geralmente associado com a

mefloquina. Recentemente, comprovando o sucesso desta terapia, foi verificada na

Tailândia uma diminuição da resistência à mefloquina, resultante da eficácia na

combinação da mefloquina com o artesunato 51,

140, 141

. A mefloquina é o fármaco de

eleição na ACT, potenciando o efeito antimalárico, enquanto a cloroquina e a

pirimetamina apresentam antagonismo com a artemisinina 14,

24

. Em alguns países as

artemisininas são também administradas conjuntamente com a combinação sulfadoxina-

pirimetamina, em casos não complicados de malária provocada pelo P. falciparum 136

.

Apesar de a artemisinina reduzir o número de formas assexuais dos parasitas e

gametócitos imaturos em circulação, verificou-se que pacientes tratados com este

fármaco, podiam ainda infectar os mosquitos, ou seja, contribuir para a transmissão da

malária. A primaquina, sendo o único fármaco reconhecido com acção contra os

gametócitos maduros, é muito mais eficaz do que as artemisininas na transmissão, porém

apresenta algumas limitações ao seu uso devido aos problemas de hemólise. Alguns

estudos indicam uma redução da infecção por P. falciparum, tanto em zonas de reduzida

como de elevada transmissão da malária após a administração de artemisinina em

combinação com a primaquina. Uma das questões fulcrais é saber se é vantajoso

administrar a primaquina em toma única (0,5 a 0,75 mg/Kg) juntamente com a

artemisinina para a redução da transmissão. A introdução desta terapia combinada foi

efectuada em algumas zonas, existindo até ao momento poucas evidências da sua eficácia

e segurança em termos toxicológicos. Existe a necessidade de realizar estudos dose-efeito

em relação a esta terapia combinada, mantendo a actividade gametocitocida da

primaquina, mas reduzindo a hemólise como efeito secundário ou a incorporação de outro

agente gametocitocida seguro. A tafenoquina, devido ao facto de apresentar maior valor

de t½, é uma possível alternativa ao uso da primaquina, apesar de ainda não estar

licenciada e provocar igualmente hemólise, ou a bulaquina, que apresenta menor

hematotoxicidade 88, 107, 108, 109

.

Introdução

32

Na Tabela 1.1 é possível ver várias combinações entre artemisininas e outros

fármacos antimaláricos, em que apenas as quatro primeiras ACTs foram recomendadas

pela OMS em 2001 e foram adoptadas por 81 países até 2009 121, 142, 143

. É de salientar

que a utilização destas combinações está condicionada por variados factores, como a

disponibilidade e o preço, além de factores regionais e políticos.

Tabela 1.1 - ACTs em desenvolvimento ou presentemente em uso.

Tipo de

ACT

Número de

Países em Uso

Nome

Comercial

Artesunato-mefloquina 8 -

Artesunato-amodiaquina 23 Coarsucam

Arteméter-lumefantrina 50 Coartem

Artesunato-sulfadoxina/pirimetamina 12 -

Artesunato-pironaridina - Pyramax

Artesunato-ferroquina - Ferroquine

Dihidroartemisinina-piperaquina - Eurartesim, Artekin

Duocotexin

Presentemente as combinações dihidroartemisinina-piperaquina e artesunato-

pironaridina estão em fase de registo, mas infelizmente nem todas as combinações foram

continuadas, como o caso de cloroproguanilo-dapsona (Lapdad)-artesunato (Dacart),

cujo desenvolvimento foi cancelado com base em ensaios clínicos de Fase III, pois

verificou-se que o seu uso diminuia a concentração de hemoglobina, originando anemia

63, 144. O programa de desenvolvimento da ACT tem sido internacionalmente suportado

pela Medicines for Malaria Venture (MMV).

Alguns grupos continuam a estudar outras combinações possíveis, obtendo

resultados satisfatórios in vitro e in vivo, na associação de artemisininas com diversos

compostos, como por exemplo: derivados de chalconas 145

, fosfato de naftoquina 146

,

curcumina 147

e antibióticos 148

.

Na Figura 1.10 é possível ver a actual distribuição mundial dos países que têm em

vigor a terapia combinada com as artemisininas.

Introdução

33

Figura 1.10 – Actual distribuição Mundial dos países com e sem ACT (adaptado de 149

).

1.5.2 - Fármacos híbridos

Um fármaco híbrido, pode ser definido como uma entidade composta por dois ou

mais fármacos com efeito diferente, ligados covalentemente, com o objectivo de criar

uma molécula mais eficaz comparativamente aos seus componentes individuais. Pode-se

dizer que os fármacos híbridos actuam através de dois ou mais farmacóforos distintos,

cada um deles com diferentes mecanismos moleculares de acção. Os fármacos podem

estar ligados directamente ou através de um linker susceptível de clivagem 150, 151

. De

acordo com Morphy e Rankovic 152

as moléculas híbridas podem ser classificadas em:

- Conjugados: os farmacóforos para cada alvo específico estão ligados por um

linker, que não faz parte dos fármacos separadamente,

- Conjugados Lábeis: o linker é susceptível de metabolização, libertando os dois

fármacos que actuam independentemente em cada alvo,

- Híbridos Ligados: o tamanho do linker é tal modo reduzido, que a estrutura dos

farmacóforos está praticamente em contacto,

- Híbridos Fundidos: utilizando a vantagem das funções químicas dos

farmacóforos, estes estão directamente ligados originando uma molécula mais pequena.

Não existe especificamente um linker entre os dois fármacos, mas uma fusão entre duas

estruturas.

Países com P. falciparum e sem ACT

Países com ACT como 1ª linha de

tratamento

Introdução

34

Os fármacos são normalmente ligados através de linkers lábeis, com funções éster,

amida, carbamato e outras, que podem ser clivadas enzimaticamente e quimicamente de

modo a libertar as moléculas de fármaco activas no local de acção no organismo.

Inúmeras doenças são tratadas através da combinação de agentes terapêuticos,

administrados em dosagens separadas. Porém, existem potenciais vantagens em

administrar os fármacos numa única entidade química, comparativamente à mistura

separada dos agentes, tais como: a) melhorar a distribuição e propriedades

farmacocinéticas facilitando a distribuição dos fármacos nos locais específicos de acção,

através do design apropriado de linker(s) hidrolisáveis; b) melhorar as propriedades

físico-químicas (como solubilidade e polaridade), comparativamente às exibidas nas

moléculas em separado; c) melhorar a estabilidade química da formulação e a estabilidade

metabólica; d) maior sinergismo entre os dois fármacos, devido à sua proximidade; e)

menores efeitos secundários 151, 153-154

.

Existem fármacos híbridos com acção nas mais variadas áreas terapêuticas.

Híbridos da aspirina 155

e do ibuprofeno 156

foram sintetizados para o tratamento da

inflamação assim como o antibiótico sultamicilina 150

, que é uma combinação sinergística

da ampicilina e do sulbactam, um inibidor da β-lactamase. Existem também híbridos com

acção anti-histamínica 157 e anti-depressiva

158.

A principal desvantagem destes fármacos híbridos é de serem geralmente

moléculas grandes com elevado peso molecular, muitas vezes superior a 500 Da, violando

uma das Regra de Cinco de Lipinsky 159

, e como tal não são moléculas favoráveis para o

desenvolvimento de uma administração oral, tópica ou para actuarem no sistema nervoso

central. Porém, é de salientar que existem fármacos em que os cinco critérios de Lipinsky

não são totalmente cumpridos. Um fármaco híbrido ideal deve conseguir ser estável o

suficiente para suportar o desenvolvimento da formulação, mas não pode ser demasiado

estável, de modo a não conseguir libertar os fármacos in vivo. Outro aspecto interessante

no design de fármacos híbridos é o seu significado em termos toxicológicos. Sendo

consideradas entidades químicas novas, independentemente dos seus fármacos

constituintes o serem ou não, têm de ser tratados como novos xenobióticos pela Food and

Drug Administration (FDA), uma vez que são fármacos novos que nunca foram

anteriormente administrados em humanos. Por esta razão, os ensaios toxicológicos devem

ser efectuados nestes fármacos até ao seu desenvolvimento clínico 150

.

Introdução

35

Na terapia antimalária e devido à necessidade de utilizar pelo menos dois

fármacos diferentes de modo a evitar resistência, também se desenvolveu o design de

fármacos híbridos 160, 161

. Diversos grupos desenvolveram sínteses de fármacos híbridos

para o tratamento da malária, cuja diferença principal é a variação no farmacóforo, mas o

objectivo é comum, melhorar a actividade antimalárica e diminuir o aparecimento de

resistência. A maior parte dos híbridos em desenvolvimento contêm pelo menos um

destes dois farmacóforos: o núcleo quinolínico, fundamental na inibição da formação da

hemozoína, levando à morte do parasita 89, 90,

162

e a ligação endoperoxídica pelas razões

anteriormente descritas.

Nesta introdução vão-se discutir apenas híbridos contendo a unidade

endoperoxídica, que pode ter origem na artemisinina ou num derivado totalmente

sintético.

1.5.2.1 - Híbridos com artemisininas

O núcleo quinolínico está presente em várias classes de antimaláricos. Nalguns

casos, o parasita já desenvolveu resistência, como por exemplo para a cloroquina.

Existem alguns exemplos de híbridos com o núcleo quinolínico e a artemisinina. No caso

do híbrido 1.58 é possível verificar a ligação covalente entre a quinina, 1.59, e a

artemisinina, onde o grupo vinil da quinina foi modificado para permitir a ligação à

dihidroartemisinina. Este composto apresenta uma actividade superior in vitro

(IC50= 8,95 nM (Pf 3D7), 9,59 nM (Pf FcB1)) comparativamente à artemisinina isolada

(IC50= 49,4 nM (Pf 3D7), 50,0 nM (Pf FcB1)), à quinina isolada (IC50= 149 nM (Pf 3D7),

96,8 nM (Pf FcB1) ou a uma mistura 1:1 de ambos (IC50= 31,8 nM (Pf 3D7), 27,9 nM

(Pf FcB1)). As estirpes 3D7 e FcB1 de Plasmodium falciparum, são sensíveis e

resistentes à cloroquina, respectivamente 163

.

Introdução

36

O

O

O

O

O

O

NOH

N

MeO

NOH

N

MeO

1.58 1.59

O´Neill et al 164

associaram derivados C10-carba da artemisinina com uma

4-aminoquinolina, originando os híbridos com a estrutura geral 1.60, e os melhores

resultados de actividade foram obtidos para o derivado 1.60b (IC50 = 5,40 nM, n=2).

Muitos dos análogos sintetizados são mais potentes do que a artemisinina

(IC50 = 11,23 nM) e a cloroquina (IC50 = 15,62 nM), nas estirpes estudadas (3D7 e K1).

1.60

Vários híbridos resultantes da conjugação entre o derivado da artemisinina com o

grupo CF3 em C10 e a mefloquina foram sintetizados, com variações no linker 165

. É de

salientar o derivado 1.61 com uma ligação estável entre as duas moléculas e o derivado

1.62, cuja ligação entre os dois farmacóforos é efectuada por um linker diéster, facilmente

hidrolisável. Ambos foram activos in vitro em várias estirpes na escala nanomolar e o

O

O

O

O

Linker N

Cl

NH

n

a, Linker= -C(O)NH-, n=2, IC50=9,34 nM (3D7)

b, Linker= -CH2NH-, n=2, IC50=5,40 nM (3D7)

c, Linker= -CH2NH-, n=3, IC50=11,51 nM (3D7)

d, Linker= -CH2NH-, n=4, IC50=12,61 nM (3D7)

e, Linker= -CH2NH-, n=5, IC50=24,25 nM (3D7)

Introdução

37

composto 1.62 apresenta valores de IC50 inferiores a 1.61 e à mefloquina isolada e

semelhantes ao arteméter.

1.61 1.62

Lombard et al. 166, 167

sintetizaram recentemente híbridos de artemisinina-aminoquinolina,

1.63, e dímeros artemisinina-aminoquinolina, 1.64, com vários tipos de linkers entre as

duas unidades. Os compostos demonstraram actividade antimalárica in vitro superior ou

igual à da cloroquina, contra estirpes de Plasmodium falciparum sensíveis (D10) e

resistentes à cloroquina (Dd2), não sendo no entanto superior à da dihidroartemisinina.

NH

NCl

O

O

O

O

OR

NH

NCl

O

O

O

O

H

O

O

O

O

H

OR

O

1.63 1.64

O ferroceno pelas suas propriedades físico-químicas únicas, como forma, volume,

lipofília e paramêtros electrónicos, geralmente afecta o comportamento farmacodinâmico

do fármaco a que se encontra covalentemente ligado. Esta alteração verifica-se na ligação

do ferroceno à cloroquina, originando a molécula de ferroquina, 1.65, pelas alterações no

comportamento farmacológico da cloroquina 168-171

. No drug design da ferroquina, a

IC50= 15,7 nM (F32), 12,7 nM (Thai) IC50= 6,6 nM (F32), 4,5 nM (Thai)

17,2 nM (FcB1), 10,6 nM (K1) 5,4 nM (FcB1), 2,4 nM (K1)

Mefloquina, IC50= 23,2 nM (F32), 15,5 nM (Thai), 12,7 nM (FcB1), 2,8 nM (K1)

NO

O

O

O

CF3

OH

NCF3

CF3

O

O

O

O

CF3

OO

O

O

O

N

NH

CF3

CF3

Introdução

38

adição covalente da molécula de ferroceno teve os seguintes fundamentos:

a) incorporação de uma molécula sem qualquer tipo de actividade antimalárica quando

administrada isoladamente, mas que potenciasse os efeitos da cloroquina, e sem

toxicidade inerente; b) incorporação de Fe2+

, de modo a diminuir a resistência do parasita

à cloroquina, com base na afinidade do Plasmodium pelo Fe2+

livre 172

. Demonstrou-se

que a molécula de ferroceno necessita de estar covalentemente ligada à cloroquina para

inibir a resistência no parasita e que por sua vez o ferroceno isolado não exibe actividade

antimalárica, mas aumenta a eficácia da cloroquina 173

.

Com base neste raciocínio, Delhaes et al 174

desenvolveram fármacos híbridos a

partir da incorporação de unidades ferrocenilo na artemisinina. Vários compostos foram

sintetizados, sendo de salientar 1.66, o mais activo contra o P. falciparum, apresentando

valores de actividade in vitro (14 nM (Dd2), 11 nM (SGE2), 12 nM (HB3)) similares aos

da artemisinina, em estirpes sensíveis (SGE2 e HB3) e resistente (Dd2) à cloroquina.

NH

Cl

N CH3

CH3Fe

O

O

O

O

O NH

Fe

1.65 1.66

O´Neill et al 164, 175

efectuaram a associação de derivados C10-carba da artemisinina com a

acridina, composto com actividade antibacteriana, antiparasitária e antitumoral e fizeram

a avaliação em P. falciparum 3D7 e em linhas celulares tumorais. Deste estudo salienta-

se o derivado 1.67a com boa actividade contra Pf3D7 (IC50= 5,96 nM),

comparativamente à dihidroartemisinina (IC50= 2,30 nM) e ao arteméter (IC50= 3,53 nM).

Todos os compostos sintetizados apresentaram também resultados promissores na

actividade antitumoral, induzindo morte celular por apoptose.

Introdução

39

1.67

Foram realizadas variações na função química do linker (amida vs amina) nesta

associação. Foi sintetizado o híbrido 1.67d, com uma função amina, obtendo-se um valor

de IC50 de 12,52 nM, demonstrando menor actividade comparativamente a 1.67a,

contendo a função amida.

O mesmo grupo conjugou a artemisinina à espermidina, 1.68, uma poliamina

natural existente na maioria dos seres eucariontes, e que pode ser utilizada como vector

para a distribuição de fármacos, no sistema de transporte de poliaminas. Esta amina é

essencial para o crescimento celular, proliferação e diferenciação do plasmódio e devido

ao carácter básico dos azotos permite uma acumulação no vacúolo alimentar acídico do

parasita. Foram sintetizados vários híbridos com variações no linker (amida vs amina) que

foram testados in vitro (estirpe 3D7), como o derivado 1.69 (IC50 = 0,21 nM), que

apresentou melhor actividade antimalárica que a artemisinina (IC50 = 9,2 nM) 16, 176-178

.

NH2

NH

NH2

O

O

O

O

NHN N

H

Boc

Boc

1.68 1.69

O

O

O

O

NCl

OMe

NHLinker

n

a, Linker= -C(O)NH-, n=1, IC50=5,96 nM (3D7)

b, Linker= -C(O)NH-, n=2, IC50=22,42 nM (3D7)

c, Linker= -C(O)NH-, n=3, IC50=20,34 nM (3D7)

d, Linker= -CH2NH-, n=1, IC50=12,52 nM (3D7)

Introdução

40

Griesbeck et al 179

sintetizaram moléculas híbridas contendo a artemisinina

acoplada a um 1,2,4-trioxano totalmente sintético. Os compostos retêm a elevada

actividade da artemisinina e o derivado 1.70 quando testado in vitro em P. falciparum

NF54 resulta numa razão de IC50 com a dihidroartemisinina de 0,54.

O

O

O

O

O

O

O

O

1.70

Não podendo ser considerados híbridos, uma vez que têm unidades iguais, existem

estudos com dímeros, trímeros e mesmo tetrâmeros de unidades de artemisininas e a

maior parte destes compostos apresenta actividade comparável ou melhor do que a

artemisinina. Apesar do elevado peso molecular destes compostos, nunca foi referido

como sendo uma desvantagem nos estudos efectuados 180-182

.

1.5.2.2 - Híbridos com endoperóxidos sintéticos

Meunier et al foram os primeiros a criar um híbrido recorrendo a um

endoperóxido totalmente sintético, neste caso um trioxano associado a um farmacóforo

quinolínico, 1.71. Esta classe de híbridos, denominada trioxaquinas apresenta a vantagem

dos trioxanos, nomeadamente a sua fácil obtenção e elevada actividade antimalárica, com

a conhecida capacidade das aminoquinolinas penetrarem nos eritrócitos levando à morte

do parasita 64, 183

. Nos compostos 1.71 realizaram-se variações no tamanho do linker,

sendo de salientar a presença de aminas secundárias que conferindo basicidade à

molécula permitem uma melhor acumulação no vacúolo alimentar acídico do parasita 184

.

Introdução

41

1.53

1.71

O composto 1.71a foi o mais activo (IC50= 2-18 nM) in vitro e a sua actividade foi

superior à obtida para a cloroquina isolada (IC50= 19-155 nM), indicando um efeito

sinergístico na ligação covalente entre a unidade aminoquinolina e trioxano 164, 184, 185

.

Foram desenvolvidas outras trioxaquinas com a estrutura geral 1.72, onde se

manteve a unidade 4-aminoquinolina e se fizeram alterações no grupo R1 e R

2 do

trioxano. Os resultados de actividade antimalárica obtidos (IC50 = 4-49 nM) para os

híbridos deste género, demonstraram que os compostos exibem melhor actividade que os

respectivos trioxanos isolados e permitiram tirar as seguintes conclusões: a) o tamanho do

linker não afecta significativamente a actividade dos híbridos; b) apesar destas moléculas

conterem mais do que um centro quiral, quando se testaram os vários isómeros em

separado não se verificaram diferenças significativas, indicando que o alvo destes

compostos não é quiral 184-188

. Em outra série de derivados, sintetizou-se 1.73, utilizando

o farmacóforo 8-aminoquinolina da primaquina, porém os resultados obtidos (IC50= 108-

176 nM) in vitro contra estirpes de P. falciparum resistentes (FcB1 e FcM29) e sensível

(Nigerian) à cloroquina demonstraram que a presença de uma 4-aminoquinolina é

essencial para a actividade 184

.

1.72 1.73

O O

O

NCl

NH n

NH

Ph

Ph

a, n=2, IC50= 9 nM (FcB1), 18 nM (FcM29), 2 nM (Nigerian)

b, n=3, IC50= 60 nM (FcB1), 17 nM (FcM29), 86 nM (Nigerian)

c, n=4, IC50= 17 nM (FcB1), 34 nM (FcM29), 34 nM (Nigerian)

O

O

NCl

NH n

NH

OR1

R2

O O

O

Me

N

MeO

NHNH

H

IC50= 176 nM (Nigerian), 112 nM (FcB1), 108 nM (FcM29)

Introdução

42

Em geral, todos estes compostos foram activos nas fases assexuais do parasita,

mas também nos gametócitos (fase sexual), o que sugere que estes compostos poderão

conduzir a uma diminuição na taxa de transmissão da doença.

Outra classe de híbridos existentes são as trioxolaquinas, que combinam os

trioxolanos com uma unidade aminoquinolina, 1.74, ou aminoacridina, 1.75. Estudos de

estabilidade e actividade permitiram concluir que a presença do grupo adamantano é

essencial não só para estabilizar a estrutura do ozonido (1,2,4-trioxolano) mas contribui

também para a actividade antimalárica, com baixos valores de IC50 na ordem dos nM 164,

189. O híbrido 1.75 contém a unidade aminoacridina que apresenta a vantagem de facilitar

a acumulação do hídrido no vacúolo alimentar acídico do parasita, do mesmo modo que

as aminoquinolinas e de devido à sua fluorescência permite seguir a molécula híbrida no

parasita através de microscopia confocal de varrimento laser 164

.

1.74 1.75

As trioxolaquinas 1.74 e 1.75 exibem uma actividade ligeiramente melhor do que

os híbridos baseados na estrutura das artemisininas, 1.60 e 1.67, respectivamente. Nestas

trioxolaquinas 1.74 e 1.75 não se verificou uma diferença significativa nos valores de

actividade da unidade quinolina para acridina, tal como não existe grande variação na

actividade para os diferentes linkers 164

. As trioxaquinas e trioxolaquinas têm a enorme

vantagem de poderem ser facilmente convertidas em sais solúveis em água, devido às

propriedades básicas do sistema quinolínico, permitindo uma administração oral ou

intravenosa 164

.

A utilização de tetraoxanos conjugados covalentemente com sistemas

quinolínicos, originou outra classe de híbridos denominados tetraoxaquinas. Os

tetraoxanos são caracterizados por actividade antimalárica na ordem de grandeza dos nM

e por não apresentarem toxicidade in vitro e in vivo 190

. Nas tetraoxaquinas 1.76 e 1.77, o

farmacóforo tetraoxano está incorporado entre dois anéis ciclohexilo ou ligado a um

N

Cl

O

O

OLinker

a, Linker = -NH(CH2)2NH- ,

IC50= 6,56 nM (3D7), 3,60 nM (K1)

b, Linker = -N(CH2CH2)2N- ,

IC50= 12,61 nM (3D7), 26,21 nM (K1)

N

Cl

MeO

O

O

O

Linker

a, Linker = -NH(CH2)2NH- ,

IC50= 9,67 nM (3D7), 7,20 nM (K1)

b, Linker = -N(CH2CH2)2N- ,

IC50= 12,32 nM (3D7), 6,76 nM (K1)

Introdução

43

esteróide. Nestas duas séries de tetraoxaquinas, o linker pode ter um grupo amina, mais

estável, ou uma amida, facilmente hidrolisável, sendo que os últimos apresentam melhor

actividade antimalárica 190

.

1.76 1.77

É de salientar que estas tetraoxaquinas não apresentaram toxicidade e que se

mostraram activas numa estirpe de Mycobacterium tuberculosis, evidenciando o facto

destes compostos poderem ser utizados em outras doenças infecciosas 190

.

Considerando os resultados obtidos de actividade antimalárica para as

trioxaquinas, trioxolaquinas e tetraoxaquinas pode concluir-se que o acoplamento da

unidade quinolínica não melhora consideravelmente a actividade in vitro, pois os híbridos

apresentam resultados similares aos correspondentes trioxanos, trioxolanos e tetraoxanos

isolados 190

. Nestes híbridos uma melhor actividade antimalárica pode estar

comprometida, pelo facto do sistema quinolínico facilitar a acumulação dentro do vacúolo

alimentar, não permitindo qualquer tipo de acção fora deste organelo, como por exemplo

PfATP6 40

.

Além do sistema quinolínico existem outros farmacóforos que podem ser

associados aos endoperóxidos sintéticos. As chalconas são conhecidas pelas suas

propriedades antimaláricas 191

, e mais especificamente por serem inibidores das proteases

de cisteína 192

. Existem inúmeras destas proteases no Plasmodium e nos humanos, daí que

um dos problemas destes inibidores seja a falta de selectividade. Tendo em conta estes

factores, foram sintetizados os híbridos 1.78, que na presença de ferro livre sofrem

activação, libertando a chalcona no seu local de acção, ou seja, o vacúolo alimentar do

parasita 188,

193

. A actividade destes compostos foi da ordem dos nM, porém não foram

seleccionados para estudos posteriores devido ao seu complicado processo de

síntese 4, 193

.

OO

O O

LinkerNH

N Cl a, Linker = -C(O)NH- ,

IC50= 2,33 nM (D6), 2,00 nM (W2)

b, Linker = -CH2NH- ,

IC50 = 9,05 nM (D6), 5,76 nM (W2)

LinkerNH

N ClOO

OO H

OAc

OAc

a, Linker = -(CH2)2C(O)NH- ,

IC50= 6,53 nM (D6), 4,47 nM (W2)

b, Linker = -(CH2)3NH- ,

IC50= 33,45 nM (D6), 22,95 nM (W2)

Introdução

44

1.78 1.79 1.80

O derivado 1.78 apresenta analogia estrutural com o endoperóxido artefleno, 1.79,

sintetizado com base num endoperóxido de origem natural, o yinghaosu, 1.80. O artefleno

apresenta um valor de IC50 de 3nM e 10 nM in vitro, para as estirpes HB3 e K1,

respectivamente. Este 1,2-dioxano é quimicamente mais estável, ocorrendo menor

metabolização e eliminação, comparativamente aos 1,2,4-trioxanos, pelo que o artefleno

apresenta menor taxa de recrudescência do que o arteméter e o artesunato. Por estas

razões foi seleccionado para ensaios clínicos, mas foi abandonado nos testes clínicos de

Fase II, devido a resultados inconsistentes, possivelmente devido a uma fraca

biodisponibilidade oral 12, 194-197

. O´Neill et al 4, 198

definiram recentemente o mecanismo

de acção para este endoperóxido, que envolve a fragmentação mediada pelo Fe2+

,

originando um radical de carbono que é acompanhado pela formação de uma enona

estável, capaz de agir como um potencial aceitador de Michael de grupos tióis e inibir as

proteases de cisteína, levando à morte do parasita (Figura 1.11).

O

OO

F3C CF3

O

O

O

F3C CF3

O

F3C CF3

OO

Fe(II)

Fe(III).

Fe(III)+ .

Inibição das Proteases de Cisteína

Alquilação de Biomoléculas Vitais

Morte do Parasita

Figura 1.11 - Mecanismo de acção do artefleno, endoperóxido de segunda geração.

OAc

OO

R

a, R = H , IC50= 34 nM (K1)

b, R = F , IC50= 29 nM (K1)

c, R = Cl , IC50= 23 nM (K1)

O

OO

F3C CF3

O

OO

OH

OH

Introdução

45

O ferroceno também pode ser acoplado aos endoperóxidos sintéticos, originando

neste caso o exemplo da molécula híbrida trioxaferroquina, 1.81 199

. Este híbrido tem por

base a unidade ferroquina, que consiste na ligação covalente do ferroceno com a

cloroquina. A ferroquina isolada apresenta boa actividade antimalárica e bons parâmetros

farmacocinéticos, razão pela qual se encontra presentemente em ensaios clínicos de

Fase IIa 168, 169, 200

.

1.81

No híbrido 1.81, o ferroceno funciona como linker entre os dois farmacóforos,

contribuindo para o aumento da actividade da 4-aminoquinolina, devido à presença do

átomo de Fe2+

. Este híbrido é uma das trioxaferroquinas mais activas e tem valores de

actividade semelhantes a trioxaquinas similares. Por esta razão, actualmente estão em

progresso modificações estruturais neste híbrido de modo a melhorar a actividade desta

molécula 168

.

O único composto híbrido até ao momento que se encontra em estudos pré-

clínicos é o SAR116242, 1.82, uma trioxaquina desenvolvida pelos laboratórios Sanofi e

Palumed 61

.

O

O O

NCl

NHNH

1.82

O

O ONH

NH

Cl

Fe

IC50 = 20 nM (FcB1), 17 nM (FcM29)

Introdução

46

1.6 - Âmbito da tese

A recomendação da OMS referente ao uso da artemisinina e seus derivados em

terapia combinada foi o principal ponto de partida para a síntese dos compostos descritos

nesta tese, uma vez que a existência de diferentes alvos e mecanismos de acção poderá ser

bastante vantajosa no combate à resistência. Deste modo, pretendem-se sintetizar duas

classes de compostos híbridos baseados no farmacóforo 1,2,4-trioxolano, presente na

artemisinina, e dirigidos para actuarem (i) exclusivamente na fase sanguínea e (ii) nas

fases sanguínea e hepática do ciclo de vida dos parasitas da malária.

A estratégia proposta para os compostos híbridos dirigidos exclusivamente para a

fase sanguínea, consiste na ligação de dipeptidil vinilsulfonas, vinilsulfonamidas e

vinilsulfonatos - conhecidos inibidores da falcipaína-2 - à unidade de artemisinina

(estruturas 1.83-1.85), através dum braço de ligação. Relativamente aos compostos

híbridos dirigidos para actuarem nas fases sanguínea e hepática, o segundo componente

escolhido foi uma 8-aminoquinolina, a primaquina, originando o híbrido 1.86. Os

híbridos 1.83-1.86 podem conter uma ligação C-O ou uma ligação C-C entre a unidade de

artemisinina e o braço de ligação, com o objectivo de modular a estabilidade metabólica e

química, sem afectar a actividade antimalárica. Nesta tese será descrito o desenho, síntese

e avaliação da actividade antimalárica e inibitória da falcipaína-2 dos novos compostos,

bem como a estabilidade química e enzimática dos compostos híbridos desenvolvidos.

1.83 - R3 = alquil ou aril 1.86

1.84 - R3 = NHR

1.85 - R3 = OR

O

O

O

O

NH

NH

O

SO OO

Linker

R1

R2

R3

O

O

O

O

NH

NH

N

MeO

Linker

CAPÍTULO II

Híbridos de artemisininas C10-oxa e dipeptidilvinilsulfonas


48


49

2.1 - Híbridos baseados no ácido artelínico

2.1.1 - Análise retrossintética

O híbrido da artemisinina pretendido pode ser sintetizado por três processos, de

acordo com a análise retrossintética apresentada no Esquema 2.1. Começaram-se por

sintetizar os derivados aminoacilo do ácido artelínico, resultantes da via a), para posterior

adição da unidade vinilsulfona acoplada ao segundo aminoácido. Além deste método de

síntese, os híbridos sintetizados também podem sintetizados recorrendo à via b) ou c).

2.1.2 - Síntese de derivados aminoacilo do ácido artelínico

Os híbridos pretendidos têm um dipéptido ligado à unidade da artemisinina. Por

esta razão iniciou-se a síntese pelo acoplamento de um aminoácido a esta unidade,

seguindo a via de síntese a) do Esquema 2.1. Sabe-se que o acoplamento de aminoácidos a

fármacos antimaláricos reduz a toxicidade e melhora a solubilidade aquosa. Vários

derivados peptídicos e aminoacilo de antimaláricos, como a primaquina e outras

8-aminoquinolinas foram sintetizados de modo a reduzir as vias metabólicas oxidativas e

a toxicidade do fármaco inicial 118, 201,

202,

203, 204

. Verificou-se que estes derivados

apresentam uma melhor relação actividade/toxicidade quando comparados com os

fármacos originais, o que pode ser atribuído a uma redução da inactivação metabólica ou

a uma hidrólise selectiva por parte do parasita 202,

203

. O acoplamento de aminoácidos ou

péptidos a fármacos é também reportado como um meio de aumentar a solubilidade

aquosa 205

. Assim, este acoplamento pode originar fármacos mais eficazes através da

redução da toxicidade e melhorar o perfil farmacocinético.

Sintetizaram-se derivados contendo apenas um aminoácido acoplado à

artemisinina e estudou-se a sua actividade antimalárica. O acoplamento do aminoácido à

unidade endoperoxídica é efectuado através da utilização de um linker. O linker utilizado

contém um anel aromático e o composto final na sua forma ácida origina o ácido

artelínico, 2.1, com actividade antimalárica reconhecida.


50

BocHN CO2H

BocHN CHO

BocHN SO2

NH

SO2

BocHN

O

P

O

SO2

EtO

EtO

O

O

O

O

OH

O

O

O

O

OCOOH

OHCOOH

BocHN SO2

O

O

O

O

OCOOH

OHBocHN

O P

O

SO2

EtO

EtO

NH

SO2

O

NH

O

O

O

O

OO

O

O

O

O

OO

NH

O

OH

NH

O

NH

O

O

O

O

OO O

H

R1

R2

R2

R3

R2

R3

R1

R3

+

+

+

+

R2

R3

+R1

+

+

R3

a

b

c

b

c

a

R2

R3

R1

R1

R2

R1

Esquema 2.1 - Análise retrossintética dos híbridos C10-oxa da artemisinina-

dipeptidilvinilsulfona.


51

O

O

O

O

OCOOH

Linker

2.1

A síntese do ácido artelínico 2.1 foi efectuada a partir da dihidroartemisinina, 1.4,

e do ácido 4-hidroximetil-benzóico na presença de eterato de trifluoreto de boro

(BF3.Et2O) como catalisador. No mecanismo de síntese pode-se ver a formação do

isómero C10-β aquando do ataque do álcool primário do reagente ácido 4-hidroximetil-

benzóico à dupla ligação do catião oxónio, 2.2, formado em consequência da saída do

grupo hidroxilo auxiliado pelo ácido de Lewis (Figura 2.1) 206

.

O

O

O

O

OH

O

O

O

O

OH

B FF

F

O

O

O

O

Ar

OH

O

O

O

O

OAr

COOHAr =

BF3.Et2O

+

-

+

2.11.4

- H+

2.2

Figura 2.1 - Mecanismo reaccional para a formação de 10β-ácido artelínico.

A dihidroartemisinina utilizada na síntese foi por sua vez obtida por redução da

artemisinina com borohidreto de sódio 207

. É de salientar que a ponte peroxídica não é

afectada pelo tratamento com borohidreto de sódio. A estabilidade da ponte peroxídica na

artemisinina é um dos aspectos mais interessantes neste composto. A artemisinina é

estável durante vários dias em solventes neutros a uma temperatura até 150º C, só

ocorrendo destruição da ponte peroxídica a 180-200º C. A ponte peroxídica é instável na

presença de ácidos concentrados e sendo a artemisinina mais sensível a bases, na presença

de carbonato de potássio ocorre também quebra da ponte peroxídica. Porém, a redução

com borohidretos não provoca qualquer alteração na ponte peroxídica 3,

208-210

. A reacção

de redução foi seguida por cromatografia em camada fina (TLC) e a revelação efectuada

com uma mistura de ácido sulfúrico e metanol (1:1) e aquecimento 208, 211,

212-214

.


52

A síntese do derivado aminoacilo da artemisinina é baseada na química

convencional de síntese de péptidos. A ligação do aminoácido ao ácido artelínico 2.1 foi

efectuada com um agente de acoplamento da classe das carbodiimidas, a

diciclohexilcarbodiimida (DCC) 203

. Os aminoácidos utilizados foram a glicina,

fenilalanina e prolina e o facto de apresentarem diferentes lipofilias e propriedades

electrónicas permitiu estabelecer uma relação estrutura-actividade. Na síntese destes

derivados verificou-se que o aminoácido deve estar protegido na função ácida, sob a

forma de éster, uma vez que a síntese com o aminoácido na forma de zwiterião originou

uma mistura complexa. Sintetizaram-se vários derivados aminoacilo, 2.3, com bons

rendimentos (Tabela 2.1).

O

O

O

O

O

O

N

OR1

R2

OR3

2.3

Tabela 2.1 - Derivados aminoacilo sintetizados.

Derivado R1 R

2 R

3 ηηηη / %

2.3a H CH2C6H5 -CH2CH3 84

2.3b H H -CH2CH3 68

2.3c -CH2CH2CH2- -CH3 77

2.3d H CH2C6H5 H 79

2.3e H H H 64


53

2.1.3 - Síntese de dipeptidilvinilsulfonas

As peptidilvinilsulfonas, inibem selectivamente várias proteases de cisteína a

baixa concentração, com IC50 na ordem dos nM. Vários grupos sintetizaram diversas

peptidilvinilsulfonas, efectuando variações nos grupos R1´

, R1, P1 e P2 indicados na

Figura 1.9, como o exemplo do derivado 1.42 83,

215, 216

. Este facto levou-nos a sintetizar

derivados dipeptídicos da vinilsulfona e a ligá-los covalentemente à unidade do ácido

artelínico.

De acordo com a via a) do esquema de retrossíntese, ao derivado aminoacilo do

ácido artelínico vai-se adicionar o segundo aminoácido acoplado à unidade vinilsulfona,

sendo para tal necessário sintetizar esta unidade. Num esquema geral, o aminoácido 2.4

protegido na função amina com o grupo Boc (tert-butiloxicarbonilo) tem de ser

transformado no aldeído 2.7 para posteriormente ser acoplado à unidade sulfona. Para

isso o aminoácido é convertido ao hidroxamato 2.5, que posteriormente é reduzido com

hidreto de alumínio e lítio (LiAlH4) ao respectivo aldeído (Esquema 2.2) 217, 218

. O

hidroxamato sintetizado é vulgarmente conhecido por amida de Weinreb, tendo ocorrido

a conversão da função ácido carboxílico numa N-metoxi-N-metil amida 219

. Esta amida

foi sintetizada na presença do agente activante (tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-

N,N,N’,N’-tetrametilamínio (TBTU) e da respectiva N,O-dimetilhidroxilamina

(Esquema 2.2). Sabendo que para melhor reconhecimento enzimático, estes inibidores das

falcipaínas devem conter o aminoácido homo-fenilalanina em P1, este aminoácido e a

fenilalanina foram os escolhidos para estarem directamente ligados à unidade

vinilsulfona.

BocNH

O

OHBocNH

O

HN

CH3

OBocNH

O

CH3 N

CH3

OBocNH

OHLi

CH3

R2 R2 R2 R2

ii) b)i) ii) a)

Esquema 2.2 - Síntese do derivado aldeído através da amida de Weinreb (R2= CH2Ph,

CH2CH2Ph). Reagentes e condições: i) TBTU, TEA, DCM, N,O-dimetilhidroxilamina.HCl, t.a., ii)

a) LiAlH4, THF seco, 0ºC, b) KHSO4. A ligação a tracejado é não covalente.

Um dos maiores problemas na síntese de aldeídos é a sua posterior redução a

alcoóis. O método utilizado permite a síntese do aldeído com um rendimento elevado

2.4 2.5 2.6 2.7


54

(∼80%; devido a uma complexação intramolecular com o sal de lítio, 2.6) e

suficientemente puro para não ser necessária purificação adicional.

A sulfona 2.9 pretendida é obtida a partir da oxidação do correspondente fosfonato

2.8 com peróxido de hidrogénio 30% (Esquema 2.3). É de referir que foram sintetizadas

sulfonas, onde o substituinte R3 é um grupo arilo, 2.9a, ou metilo, 2.9b

220, 221

.

P

O

SEtO

EtOP

O

SO2

EtO

EtOR3 i) R3

2.8 2.9

Esquema 2.3 - Síntese da sulfona. Reagentes e condições: i) CH3COOH, H2O2 30%, 85ºC.

A vinilsulfona 2.10 (Esquema 2.4) é obtida de acordo com a reacção de Horner-

Wadsworth-Emmons entre a sulfona 2.9 e o aldeído 2.7 78,

222,

223

.

BocNH CHOP

O

SO2

EtO

EtO BocNH SO2

i)R2

R3

R2

R3

+

Esquema 2.4 - Síntese da vinilsulfona. Reagentes e condições: i) NaH, THF seco, t.a..

Na Figura 2.2 está representado o mecanismo descrito para a reacção de Horner-

Wadsworth-Emmons, sendo de salientar que a reacção não é estereoespecífica e existe a

possibilidade da formação dos isómeros E ou Z. A razão entre os isómeros está

dependente da estereoquímica obtida no momento da adição e do equilíbrio entre os

intermédios formados 224, 225, 226

. Na síntese de 2.10 apenas foi identificada a formação do

isómero E (ver discussão em Caracterização Estrutural).

2.1.4 - Síntese dos híbridos de ácido artelínico e dipeptidilvinilsulfona

De acordo com a via a) da retrossíntese (Esquema 2.1), o passo final será o

acoplamento entre os dois aminoácidos, com a presença do agente de acoplamento

TBTU. O aminoácido acoplado à vinilsulfona está protegido na função amina com o

grupo Boc e para o acoplamento dos dois aminoácidos, esta função amina teve de ser

desprotegida com ácido trifluoroacético (TFA) em DCM, originando o respectivo sal

trifluoroacetato 2.11

2.7 2.9 2.10


55

BocHN

O

H

BocHN SO2

O2S P

OOEt

OEtH H

O2S P

OOEt

OEtBocHN

O

HSO2

POEt

OEt

O

BocHN

O

HSO2

POEt

OEtO

P

O

O

OEtEtO

-

R2

R2

R3+

Base

R3 R3

R2R3

R2

R3

Figura 2.2 - Mecanismo descrito para a obtenção da vinilsulfona, de acordo com a reacção de

Horner-Wadsworth-Emmons.

O híbrido final 2.12a (R1

= Gly, R2

= Phe) foi sintetizado de acordo com a via a)

da retrossíntese, porém verificou-se que este método na síntese do híbrido 2.12b

(R1

= Phe, R2

= Phe) não era adequado, uma vez que na análise dos espectros de 1H-RMN

observou-se desdobramento de todos os sinais, incluindo os sinais característicos da dupla

ligação, o que parece indicar a formação de isómeros. Este facto levou a optar pela via b)

da análise retrossintética, onde se fez o acoplamento entre os dois aminoácidos na

unidade vinilsulfona, originando a dipeptidilvinilsulfona e só posteriormente se acoplou o

ácido artelínico.

Deste modo, a 2.11 adicionou-se o segundo aminoácido, seguindo-se a química de

síntese de péptidos e utilizando o TBTU, no acoplamento dos dois aminoácidos como em

2.12a. Este agente de acoplamento pertence à classe dos sais de amínio, e activa o grupo

carbonilo, tal como o DCC. O TBTU na forma cristalizada contém dois isómeros N-óxido

guanidínio e as duas formas coexistem em solução, reagindo ambas com o grupo

carboxilo, e originando o intermediário éster activado. Na Figura 2.3 pode-se ver o

mecanismo geral para este tipo de sais de amínio 227, 228, 229

. Para o acoplamento dos dois

aminoácidos, além do TBTU, utilizou-se a trietilamina (TEA) como base, a

dimetilformamida (DMF) como solvente e o 1-hidroxibenzotriazole (HOBt).

A racemização e a formação de produtos secundários é um problema existente na

síntese de péptidos. De modo a evitar este problema, recorre-se ao HOBt, que geralmente

é utilizado no acoplamento de aminoácidos pela via das carbodiimidas, mas que pode

também ser utilizado conjuntamente com os sais de amínio 78, 230

. O HOBt é um aditivo,

também denominado de nucleófilo auxiliar, e apesar de permitir igualmente o ataque


56

nucleofílico da amina ao carbono activado, diminui a ocorrência de racemização dos

aminoácidos e de reacções laterais, através da formação de uma ligação éster menos

reactiva e mais estável 228, 231

.

O

OH

O

ON

NO

NN

N

O

O

N

N

O

NN

N

O

NN

N

O

H2N-

O

NN

N

O

NH

O

NH

N

NO

O

O

NN

N

O

NN

N

O

N

N

OO

N

N-

BF4

Base

+

+

Base

R1 R1 R1

R1

R2

R1

R2-

R1R2

R1

R1

+

TBTU

-

Figura 2.3 - Mecanismo reaccional geral do reagente de acoplamento TBTU com um

aminoácido, na presença de base.

Após desprotecção da função amina na dipeptidilvinilsulfona 2.13 com TFA,

originando o sal trifluoroacetato, 2.14, efectuou-se o acoplamento ao ácido artelínico 2.1

originando os híbridos finais C10-oxa com a estrutura geral 2.12. Este acoplamento foi

efectuado através da utilização de TBTU e TEA em DMF (Esquema 2.5).

Todos os híbridos finais C10-oxa foram sintetizados pela via retrossintética b) com

bons rendimentos, com excepção do derivado 2.12a, sintetizado pela via a). Em relação à

análise retrossintética, a via c) não chegou a ser efectuada, pelo facto da -maioria das

reacções se efectuarem na presença da unidade endoperoxídica da artemisinina, e de esta

poder apresentar alguma instabilidade durante os vários passos reaccionais realizados. No

Esquema 2.5 estão demonstradas todas as reacções efectuadas pela via b) para obter os

derivados finais 2.12.


57

Sintetizaram-se vários compostos híbridos C10-oxa a partir do ácido artelínico

contendo a unidade dipeptidilvinilsulfona (Tabela 2.2). São apresentados os rendimentos

do último passo reaccional.

Tabela 2.2 - Híbridos C10-oxa do ácido artelínico e dipeptidilvinilsulfona sintetizados.

2.1.5 - Caracterização Estrutural

Todos os compostos intermédios foram caracterizados por RMN e a

espectroscopia de infra-vermelho (IV) foi utilizada durante a síntese sempre que se achou

necessário comprovar a estrutura sintetizada, principalmente na alteração de determinados

grupos funcionais. No ácido artelínico, 2.1, comparativamente ao reagente

dihidroartemisinina, verificou-se a existência de uma banda bem definida a 1702 cm-1

no

espectro de IV, característica do stretching do grupo carbonilo da função ácida e de outra

banda fraca e larga a 3396 cm-1

atribuída ao stretching do grupo OH do ácido.

Todos os híbridos finais foram submetidos à espectroscopia de IV, onde é possível

identificar as bandas dos principais grupos funcionais, nomeadamente os carbonilos das

amidas (1630 cm-1

), a sulfona (1319 cm-1

e 1160 cm-1

) e a ponte peroxídica (990 cm-1

).

Também foi efectuada a análise elementar e a espectrometria de massa de alta resolução

dos híbridos finais e cujos resultados se encontram no capítulo da Parte Experimental.

Híbridos C10-oxa do ácido artelínico R1 R

2 R

3 ηηηη / %

NH

SO2

O

NH

O

O

O

O

O

O

R2

R3

R1

2.12a H CH2C6H5 C6H5 66

2.12b CH2C6H5 CH2C6H5 C6H5 62

2.12c CH2CH(CH3)2 CH2CH2C6H5 C6H5 53

2.12d CH2C6H5 CH2CH2C6H5 C6H5 77

2.12e CH2CH(CH3)2 CH2CH2C6H5 CH3 65

2.12f CH2C6H5 CH2CH2C6H5 CH3 59


58

BocNH CO2H BocNH CONMe

OMeBocNH CHO

P

O

SEtO

EtOP

O

SO2

EtO

EtO

BocNH SO2

NH

SO2

BocNHO

O

O

O

O

O

O

O

O

O

X

H3N SO2

NH

SO2

H3NO

R2

i)R2

ii)

iv)

R2

R3 iii) R3

R2

R3

v)

R2

R3

R1

viii)vii)

X= OH

X= OCH2C6H4-4-CO2H

ix)

2.12

2.1

2.13

2.4 2.52.7

2.9

2.10

1.41.1

2.8

R2

R3

2.11

+CF3COO

-

vi)

R2

R3

R1

2.14

+CF3COO

-

x)

Esquema 2.5 - Síntese geral dos híbridos C10-oxa da artemisinina, pela via de síntese b).

Reagentes e condições: i) TBTU, TEA, HN(Me)OMe.HCl, DCM, t.a.; ii) LiAlH4, THF, 0ºC; iii)

H2O2, CH3COOH, 85ºC; iv) NaH, THF, t.a.; v) TFA, DCM, t.a.; vi) BocAA’OH, TBTU, HOBt,

TEA, DMF, t.a.; vii) TFA, DCM, t.a.; viii) NaBH4, MeOH, 0-5ºC; ix) BF3.Et2O, HOCH2C6H4-4-

CO2H, t.a.; x) TBTU, TEA, DMF, t.a..


59

2.1.5.1 - Ressonância Magnética Nuclear

A caracterização espectroscópica da artemisinina por 1H-RMN foi possível com o

auxílio de técnicas de RMN bidimensionais e da literatura 232- 235

. Na Figura 2.4 pode-se

ver o espectro de COSY obtido para a artemisinina e os acoplamentos 1H-

1H, cuja

interpretação foi auxiliada com as correlações heteronucleares (HMQC e HMBC).

Figura 2.4 - Espectro COSY para a artemisinina e alguns acoplamentos 1H-

1H (espectro

efectuado em CDCl3).

A atribuição dos sinais obtidos no espectro de 1H-RMN e

13C-RMN para a artemisinina é

apresentada na Tabela 2.3.

H12

H9 H4 H4

H5 H8

H8a

H7

C3-CH3

H5, H5a, H6

C9-CH3

C6-CH3

H8

H7

O

O

O

O

O

12

76

3

54 5a

9

8

8a

10

12a

1

2


60

Tabela 2.3 - Atribuição dos sinais obtidos nos espectros de 1H-RMN e

13C-RMN para a

artemisinina (espectro efectuado em CDCl3).

Posição

1H

13C

δδδδ / ppm Multiplicidade J / Hz δδδδ / ppm

3 - - - 105,4

3-CH3 1,44 s - 25,21

4 2,49-2,37; 2,10-1,95 m - 35,91

5 2,10-1,95; 1,53-1,46 m - 24,86

5a 1,43-1,31 m - 50,07

6 1,43-1,31 m - 37,54

6-CH3 0,990 d 5,6 19,85

7 1,82-1,72; 1,15-1,03 m - 33,61

8 1,93-1,84; 1,15-1,03 m - 23,42

8a 1,82-1,72 m - 44,98

9 3,45-3,34 m - 32,90

9-CH3 1,20 d 7,2 12,57

10 - - - 172,1

12 5,86 s - 93,72

12a - - - 79,51

s - singuleto; m - multipleto;

d - dupleto

É importante salientar alguns aspectos dos espectros de RMN dos compostos

descritos neste capítulo, nomeadamente:

a) Dihidroartemisinina, isómeros αααα e β

A redução da artemisinina pelo borohidreto de sódio origina a dihidroartemisinina

numa mistura 1:1 de isómeros α e β, facto comprovado pela espectroscopia de RMN 235

.

A duplicação dos sinais nos espectros de 1H- e

13C-RMN indica a existência de duas

moléculas, correspondentes aos dois isómeros. O volume reduzido do átomo de

hidrogénio e do grupo metilo na posição C9 contribuem para a formação da mistura 1:1 de

isómeros em C10.


61

α-dihidroartemisinina β-dihidroartemisinina

Figura 2.5 - Estrutura 3D dos dois isómeros α e β da dihidroartemisinina.

Os protões vicinais H9 e H10 no isómero α estão ambos em posição axial, devendo

originar um ângulo diedro de cerca de 180º, com uma constante de acoplamento entre 7 e

14,5 Hz, enquanto no isómero β a relação axial-equatorial entre estes dois protões deve

originar um ângulo diedro de cerca de 60º e uma constante de acoplamento entre 2 e 6 Hz

(Figura 2.5). Estes valores de J têm por base a curva de Karplus e estudos efectuados por

Cabri et al que demonstraram que os ângulos diedros obtidos experimentalmente para a

dihidroartemisinina (178,7º (isómero α) e 53,1º (isómero β)) estão de acordo com os

valores teóricos 210

. Na Figura 2.6 pode-se ver parte do espectro de 1H-RMN da

dihidroartemisinina e a atribuição destes sinais.

O

O

O

O

OH

H

H

109

O

O

O

O

OH

H

H

109

Figura 2.6 - Atribuição dos sinais C12-H e C10-H nos dois isómeros α e β da dihidroartemisinina,

no espectro de 1H-RMN (espectro efectuado em CDCl3).

Hax

Hax

Heq

Heq

φHax- Hax ~180º → 7< J <14,5 Hz

φHeq- Hax ~60º → 2< J <6 Hz

H9 H10

H10

H9 H12 H12

Isómero β Isómero α

C12-H(β)

C12-H(α)

C10-H(α) C10-H(β)


62

Os dois sinais a 5,63 e 5,41 ppm, correspondentes ao C12-H são indicação de que

estamos na presença de uma mistura de diastereoisómeros, uma vez que no espectro da

artemisinina, este protão aparece como um sinal único a 5,85 ppm. De igual modo, os

sinais a 5,33 e 4,77 ppm correspondentes ao C10-H, evidenciam a redução do carbonilo e

a formação do hemiacetal. O sinal a 5,33 ppm (anómero β) é um dupleto com J = 3,2 Hz,

enquanto que o sinal a 4,77 é igualmente um dupleto com J = 9,2 Hz, indicando que o

sinal a menor desvio químico é característico do anómero α, devido ao maior valor de

constante de acoplamento com C9-H. A atribuição de H12 nos dois isómeros foi possível

através do espectro de NOESY, onde se verificou apenas acoplamento bidimensional

entre H10 do isómero α com o sinal a 5,41 ppm, indicando ser este referente a H12 do

isómero α, uma vez que se encontram espacialmente para o mesmo lado, como se pode

ver na Figura 2.6. Em estudos descritos na literatura verificou-se que a razão existente

entre os isómeros α e β é principalmente dependente do solvente, apesar de existirem

outros factores que possam afectar este equilíbrio, como o pH, tempo, temperatura e força

iónica 210

. Através de estudos teóricos, verificou-se que a razão entre os dois isómeros

depende de várias propriedades do solvente, em particular da capacidade deste estabelecer

pontes de hidrogénio com o soluto. Uma maior estabilização do isómero α foi obtida na

presença de solventes dadores de pontes de hidrogénio, pelo facto deste isómero ser mais

polar e acídico 210

. Foi analisada uma proporção entre os isómeros α:β de 1:1,35 em

CD2Cl2, 2:1 em MeOH e acetona, 3:1 em DMSO, e 4,5:1 em 50% H2O/EtOH, de acordo

com o aumento da polaridade do solvente 210

.

A estrutura da dihidroartemisinina, origina um espectro 1H-RMN de difícil

interpretação na zona entre 2-1 ppm, pela quantidade de sinais sobrepostos. A sua

elucidação foi possível pela comparação com a artemisinina e com espectros descritos na

literatura 210, 235, 236

.

A reacção de redução da artemisinina a dihidroartemisinina foi também

comprovada por espectroscopia de IV, através do desaparecimento da banda do grupo

carbonilo da artemisinina (νC=O = 1736 cm-1

) e o aparecimento de uma nova banda

(νOH = 3368 cm-1

) característica do grupo hidroxilo.


63

b) Estereoquímica β em C10 para o ácido artelínico

O ácido artelínico, 2.1, apresenta uma estereoquímica β em C10. A atribuição da

estereoquímica deste composto foi efectuada com base no valor da constante de

acoplamento obtido entre C9-H e C10-H. A constante de acoplamento de 3,6 Hz obtida

entre estes dois protões está relacionada com um ângulo diedro teórico de cerca de 60º.

Através da mecânica molecular e utilizando o programa MOE (Molecular Operating

Environment, Amber99 force field), o valor teórico do ângulo diedro foi comprovado uma

vez que se obteve um valor de 39º (Figura 2.7). Este ângulo e a constante de acoplamento

indicam uma relação axial-equatorial entre os dois protões C9-H e C10-H. A presença da

dupla ligação no catião oxónio 2.2, favorece um ataque nucleofílico preferencialmente

axial do reagente ácido 4-hidroximetil-benzóico, devido ao efeito anomérico do anel

contendo a ponte endoperoxídica.

Figura 2.7 - Conformação β em C10 para o ácido artelínico e ângulo diedro entre H9 e H10.

Os espectros de RMN obtidos experimentalmente e a comparação com os dados

existentes na literatura para os dois isómeros α e β, levam-nos a afirmar que se sintetizou

o isómero β 184, 206, 233, 237,

238

. Foi também efectuado o espectro NOESY deste composto e

verificou-se o acoplamento entre H9 e H10, tal como esperado para a estereoquímica β,

uma vez que os protões estão orientados para o mesmo lado.

H10

H9

39º


64

c) Sistema AA´BB´ e protões metilénicos diastereotópicos do ácido artelínico

Os protões do sistema aromático substituído em para do ácido artelínico não são

magneticamente equivalentes, e por esta razão, têm diferentes desvios químicos (8,12 e

7,44 ppm), a mesma constante de acoplamento (J = 8,4 Hz) e apresentam um

comportamento característico do sistema AA´BB´. Os protões BB´ encontram-se mais

desblindados e com maior desvio químico (8,12 ppm), devido ao facto de estarem mais

perto da função ácido carboxílico. As atribuições efectuadas foram determinadas nos

espectros de RMN 1D e 2D. No espectro da Figura 2.8 é possível ver parte do espectro de

1H-RMN do ácido artelínico que mostra estes protões aromáticos.

Devido à proximidade de vários centros assimétricos na unidade da artemisinina,

os dois protões metilénicos Ha e Hb (Figura 2.8) não são equivalentes, uma vez que não

estão sujeitos ao mesmo ambiente magnético. Estes dois protões designam-se de

diastereotópicos, e por isso geralmente originam desvios químicos diferentes. Na

molécula do ácido artelínico, Ha e Hb apresentam acoplamento geminal entre eles

(J = 13,4 Hz) mas com desvios químicos diferentes (∆δ = 0,39 ppm) 239,

240

.

Figura 2.8 - Parte do espectro de 1H-RMN do composto 10β-ácido artelínico, onde é possível ver

os protões metilénicos diastereotópicos Ha e Hb e o sistema aromático AA´BB´ (espectro


d) Desvio químico dos grupos metilo na artemisinina e derivados

Analisando a estrutura da artemisinina, 1.1, em relação aos três grupos metilo

existentes, é de esperar que dois deles apresentem um dupleto como sinal no espectro de

1H-RMN e que o outro seja um singuleto. Este comportamento veio-se a comprovar,

O

O

O

O

O

Hb

Ha

COOH

A

A´

B

B´

H12

H10 Ha

Hb

Sistema AA´BB´


65

também na dihidroartemisinina e no ácido artelínico, mas como se pode ver na Tabela 2.4,

existe uma alteração no desvio químico dos grupos metilo em C9 e C6, para os vários

compostos.

Tabela 2.4 - Desvio químico e multiplicidade do sinal dos grupos metilo na artemisinina, 1.1,

dihidroartemisinina, 1.4, e ácido artelínico, 2.1, no espectro de 1H-RMN.

Composto

C3-CH3 C6-CH3 C9-CH3

δδδδ / ppm sinal δδδδ / ppm Sinal δδδδ / ppm Sinal

1.1 1,44 s 0,99 d, J = 5,6 Hz 1,20 d, J = 7,2 Hz

1.4 (α, β) 1,45 s 0,98 d, J = 6,0 Hz 0,970 d, J = 7,2 Hz

2.1 1,49 s 0,97 d, J = 6,4 Hz 1,01 d, J = 7,2 Hz

Nos três compostos, o CH3 em C3 apresenta-se como um singuleto e a desvio

químico mais alto. Porém, verifica-se que apenas na artemisinina e no ácido artelínico, o

grupo metilo mais blindado está em C6, enquanto que na dihidroartemisinina, o C9-CH3

está a menor desvio químico, quase sobreposto ao C6-CH3. O grupo metilo em C9 é o

mais afectado pelas alterações efectuadas em C10, daí que a presença de um grupo atractor

de electrões em 1.1, ou dador de electrões, em 1.4, provoque a troca de desvio químico

relativamente a este grupo.

O

O

O

O

H

O

9

63

O

O

O

O

H

OH

9

63

O

O

O

O

O

H

CO2H

9

6

3

1.1 1.4 2.1

Nos derivados sintetizados a partir do ácido artelínico não existe alteração no

comportamento destes grupos CH3 e atendendo à sobreposição de picos nesta zona do

especto, esta conclusão foi possível com o auxílio de técnicas de RMN bidimensionais.


66

e) Acoplamento com o núcleo de 31

P

O núcleo de 31

P tal como o de 1H tem spin nuclear I=½, podendo ocorrer

acoplamentos entre os dois átomos (1H-

31P), e igualmente com o núcleo de carbono (

13C-

31P). Na estrutura geral 2.9, seria de esperar um singuleto, tripleto e quarteto

relativamente ao padrão de desdobramento dos sinais -SO2CH2-, CH3CH2O- e CH3CH2O-

respectivamente, porém o acoplamento com o fósforo altera este padrão, como se pode

ver no espectro de protão da Figura 2.9. O sinal de -SO2CH2- apresenta-se como um

dupleto com uma constante de acoplamento 1H-

31P de 16,8 Hz, enquanto que os grupos

metilo de CH3CH2O- em virtude do acoplamento com o fósforo apresentam-se como dois

tripletos sobrepostos (J = 7,3 Hz). Relativamente aos protões metilénicos de CH3CH2O- o

seu sinal apresenta um padrão mais complexo, como se pode ver no diagrama do padrão

de desdobramento da Figura 2.9. Porém é de realçar, que o sinal obtido

experimentalmente, não corresponde ao desdobramento esperado. O mesmo tipo de

comportamento é verificado no espectro de 13

C-RMN, uma vez que para o CH2 e o CH3

do grupo etoxilo são obtidos dois sinais para cada, indicativo de desdobramento do

carbono pelo átomo de fósforo.

O padrão de desdobramento dos grupos metilénicos tem sido bastante discutido

neste tipo de fosfonatos de ésteres etílicos e a razão deve-se ao facto destes protões serem

magneticamente não equivalentes. Este comportamento pode ser atribuído ao facto dos

grupos etoxilo estarem ligados ao átomo de fósforo, que por sua vez tem três substituintes

diferentes (=O, -OCH2CH3 e -CH2SO3R3). Consequentemente estes protões metilénicos

estão num ambiente internamente assimétrico e possuem diferentes desvios químicos. Foi

igualmente verificado que a remoção desta assimetria interna resulta em protões

metilénicos equivalentes e que existe uma dependência no desdobramento destes protões

com o solvente 241- 246

.


67

P

O

SCH3CH2O

CH3CH2O

O

O

R3

2.9

JHP=7,6 Hz

J3=7,3 Hz J3=7,3 Hz

Figura 2.9 - Padrão do desdobramento obtido para os protões metilénicos -P(OCH2CH3)2 dos

derivados fosfonatos 2.9 e o espectro de protão obtido para os protões assinalados (espectro


f) Unidade dipeptidilvinilsulfona (isómero E e protões diastereotópicos)

Os sulfonatos α,β-insaturados podem ser obtidos como misturas de isómeros E e

Z. A atribuição da estereoquímica é baseada nos valores das constantes de acoplamento

obtidos para os protões vinílicos vicinais, onde no caso do isómero E, a constante de

acoplamento é de cerca de 15 Hz e no caso do isómero Z é de 11 Hz 224, 239

. Nas

vinilsulfonas sintetizadas obteve-se uma constante de acoplamento entre Ha e Hb de cerca

de 15 Hz, indicativa do isómero E. Na Figura 2.10 é possível ver os acoplamentos e as

constantes obtidas para os protões Ha, Hb e Hc. É de referir que na frequência utilizada

(400 MHz) foi possível verificar na maior parte dos compostos sintetizados, o

acoplamento a longa distância entre Hb e Hc com um valor de J de cerca de 2 Hz. O

desvio químico para o protão Ha nos isómeros E e Z também pode ser um critério para a

atribuição da estereoquímica, pois de acordo com a literatura, Ha para o isómero E (Ha cis

relativamente a SO2R) aparece a um maior desvio químico (~ 6,98 ppm) em comparação

com o isómero Z (~ 6,4 ppm), como resultado do efeito anisotrópico do grupo sulfonato

no protão em Ha 224, 239

. O desvio químico de Ha de cerca de 6,95 ppm obtido para os

-OCH2CH3 -PCH2SO2- -OCH2CH3


68

derivados sintetizados é concordante com a estereoquímica E. A atribuição foi

confirmada com base nos espectros bidimensionais COSY, HMQC, HMBC e nos

respectivos acoplamentos.

Figura 2.10 - Espectro de protão do isómero E na unidade vinilsulfona, onde se podem ver os

acoplamentos vicinais e a longa distância (espectro efectuado em CDCl3).

Na síntese do hidroxamato 2.5 e do aldeído 2.7, a partir do correspondente

aminoácido fenilalanina e homo-fenilalanina, pelo facto destes aminoácidos terem um

carbono quiral, os protões metilénicos comportam-se como diastereotópicos. No espectro

de 1H-RMN estes dois protões são caracterizados como multipletos, por vezes a

diferentes desvios químicos. Na Figura 2.11 pode-se ver a atribuição dos dois grupos

-CH2 existentes no aminoácido homo-fenilalanina para o aldeído 2.7. É de salientar que

nestes compostos com a função aldeído foi sempre identificado o protão do aldeído a um

desvio químico de cerca de 9,5 ppm.

Figura 2.11 - Parte do espectro do derivado 2.7 (R2= -CH2CH2C6H5) onde se pode ver a

atribuição dos protões metilénicos diastereotópicos (espectro efectuado em CDCl3).

BocNH SO2

R2

R3

Ha

Hb

Hc

Acoplamento Vicinal3J=15 Hz

Acoplamento Vicinal3J=5 Hz

Acoplamento a Longa Distância

4J=2 Hz

Ha Hb

BocNH

O

H

CH2CH2C6H5

CHaHbCH2C6H5 CHaHbCH2C6H5


69

É interessante verificar que no caso da fenilalanina (R2= -CH2C6H5), o padrão dos

protões diastereotópicos no hidroxamato 2.5 muda quando se tem o aldeído 2.7, o mesmo

não se verificando na homo-fenilalanina (R2= -CH2CH2C6H5). Apesar dos protões

continuarem a ser diastereotópicos, ocorreu uma alteração no ambiente magnético, e os

dois multipletos quase coalescem. Este fenómeno quando ocorre denomina-se de

isocronia acidental e por vezes pode originar um singuleto. Na Figura 2.12 pode-se ver a

diferença de padrão relativamente a este grupo -CH2 do hidroxamato (Espectro A) para o

aldeído (Espectro B) com o aminoácido fenilalanina.

Figura 2.12 - Sinal dos protões diastereotópicos do grupo metilénico do aminoácido fenilalanina,

no derivado hidroxamato 2.5 (Espectro A) e aldeído 2.7 (espectro B).

2.1.5.2 - Espectrometria de massa

Esta técnica foi utilizada para a caracterização de todos os híbridos finais e para

alguns dos intermédios sintetizados, quando necessário. As razões entre a massa e a carga

(m/z) obtidas para os compostos analisados encontram-se no capítulo da Parte

Experimental.

Verificou-se que a dihidroartemisinina e seus derivados, quando injectados no

espectrómetro de massa, apresentavam três picos em comum com m/z 163, 221 e 267.

Estes fragmentos estão descritos na literatura 247, 248

e na Figura 2.13 é descrita a hipótese

de fragmentação que os justifica.

Na Figura 2.14 pode-se ver o espectro de massa do híbrido 2.12c, onde se podem

ver estes fragmentos, além de outros característicos deste composto. Em alguns derivados

analisados por massa, o pico base corresponde ao ião molecular juntamente com a massa

do átomo de sódio, [M+Na+]. A origem deste átomo vem das condições experimentais

utilizadas na espectrometria de massa.

Espectro A Espectro B

-CHaHbC6H5 -CHaHbC6H5

-CH2C6H5


70

O

O

O

O

H

OR

O

OH

O

O

OR

O

O

O

O

H

O

O

O

O

OH

O

O

O

O

O

O O

+

+

+

+

m/z 163

H+

m/z 267

m/z 221

H+

H+

Figura 2.13 - Hipótese de fragmentação proposta para os fragmentos m/z 163, 221 e 267

existentes na dihidroartemisinina e derivados (adaptado de 247, 248

).


71

Figura 2.14 - Espectro de massa (ESI, modo positivo) do híbrido 2.12c e a atribuição de alguns picos.

2.12c


72

2.1.6 - Avaliação antimalárica in vitro

A actividade antimalárica dos compostos híbridos 2.12a-f foi testada in vitro em

estirpes do Plasmodium falciparum e expressa em IC50 (50 % de concentração

inibitória). Estes estudos foram realizados no grupo do Professor Phillip Rosenthal

(Department of Medicine, San Francisco General Hospital, University of California,

San Francisco, USA). As culturas de várias estirpes de P. falciparum em eritrócitos

humanos (2% de hematócrito e 10% de soro humano) com meio RPMI foram

devidamente tratadas e sincronizadas. A sincronização dos parasitas nas culturas foi

mantida através de vários tratamentos com 5% d-sorbitol. Os compostos híbridos foram

colocados em culturas de parasitas, no início da fase de anel, durante 48 horas. Após

este tempo foram efectuados esfregaços corados com Giemsa e as formas de anel

contabilizadas e comparadas com o controlo (cultura em 0,1% DMSO). Os valores de

IC50 obtidos para a inibição do crescimento dos parasitas foram determinados com o

software GraphPad Prism, a partir da percentagem de parasitémia da cultura tratada com

o composto híbrido, relativamente ao controlo 81

.

Na Tabela 2.5 podem-se ver os derivados aminoacilo do ácido artelínico

sintetizados, os resultados obtidos da actividade antimalárica in vitro para alguns e a

relação existente com o log D7,5 (Coeficiente de Distribuição a pH 7,5).

Tabela 2.5 - Derivados aminoacilo do ácido artelínico, actividade antimalárica in vitro (PfW2)

e log D7,5.

Composto R1 R

2 R

3 IC50 ± SD/ nM log D

a7,5

2.3c -CH2CH2CH2- -CH3 2,08 ± 0,10 4,87

2.3e H H H 54,4 ± 0,57 1,33

ART -- -- -- 5,71 ± 0,36 2,86

DHART -- -- -- 1,18 ± 0,28 4,01

Ác. Art. -- -- -- 5,66 ± 0,58 2,08

CQ -- -- -- 78,1 ± 6,9 1,71

a

- calculado através do programa SPARC V4.1 249

; SD - Desvio Padrão; ART

- artemisinina;

DHART - dihidroartemisinina; Ác. Art.

- ácido artelínico; CQ

- cloroquina

O

O

O

O

O

O

N

OR1

R2

OR3


73

Apenas dois compostos foram testados in vitro relativamente à sua actividade

antimalárica na estirpe W2 do P. falciparum. Dos resultados obtidos verifica-se que o

composto 2.3c apresenta melhor actividade antimalárica do que a artemisinina e o ácido

artelínico, provavelmente como reflexo da maior lipofilia, enquanto o composto 2.3e

apresenta pior actividade e menor lipofilia. Estes resultados sugerem que a lipofilia

pode afectar a actividade antimalárica, uma vez que a actividade aumenta com o valor

de log D 7,5.

A actividade antiplasmódica in vitro dos híbridos foi estudada em várias estirpes

de Plasmodium falciparum 250. O coeficiente de partição (log P) destes compostos foi

também calculado (Tabela 2.6).

Tabela 2.6 - Actividade antimalárica em estirpes de P. faciparum para os híbridos C10-oxa

derivados do ácido artelínico e valores de log P.

NH

SO2

O

NH

O

O

O

O

O

O

R2

R3

R1

2.12

Composto IC50 ± SD/ nM

log Pa W2 FCR3 3D7 V1/S D6

ART 12,0±1,9 5,38±0,54 9,71±4,2 4,24±0,54 14,5±1,2 2,90

Ác. Art. 5,66±0,58 ND ND ND ND 3,79

2.12a 4,09±0,13 1,75±0,32 3,11±0,72 1,59±0,11 4,71±0,12 4,94

2.12b 2,27±0,73 ND ND ND ND 5,96

2.12c 2,08±0,89 ND ND ND ND 6,08

2.12d 3,94±0,28 ND ND ND ND 6,26

2.12e 4,21±0,56 1,89±0,10 2,48±0,41 1,65±0,11 4,96±0,66 5,34

2.12f 4,81±0,12 2,00±0,02 2,50±1,5 2,25±0,24 4,75±0,37 5,55

2.13 >10.000 ND ND ND ND 4,06

CQ 78,1±6,9 51,1±0,10 11,6±1,1 65,0±4,1 16,9±2,1 4,63

SD - Desvio Padrão; ART

- artemisinina; Ác. Art.

- ácido artelínico; CQ

- cloroquina;

a - calculado através do programa ALOGPS 2.1

251


74

Todos os híbridos testados exibiram actividade antimalárica na ordem de

grandeza de nM (2,08 - 4,81 nM), sendo mais activos do que a própria artemisinina, 1.1,

(12,0 nM) e equipotentes ao ácido artelínico, 2.1, (5,66 nM), para a estirpe W2

(resistente à cloroquina 252

). Os híbridos 2.12a, 2.12e e 2.12f foram igualmente testados

em mais quatro estirpes adicionais de Plasmodium falciparum com diferentes fenótipos:

FCR3 (resistente à cloroquina e à atovaquona 253

), 3D7 (sensível à cloroquina 252

), D6

(sensível à cloroquina e resistente à mefloquina 254

) e V1/S (multirresistente 255, 256

). Os

valores de IC50 para todas as estirpes acima mencionadas, mostram uma actividade

antimalárica superior dos híbridos testados, relativamente à da cloroquina e

artemisinina.

Efectuou-se o traçado do Gráfico 2.1, onde se pode ver a relação entre a

actividade antimalária expressa em IC50, em função do parâmetro de lipofilia, log P.

Gráfico 2.1- Gráfico que correlaciona o log P em função de IC50 dos híbridos (PfW2).

O gráfico permite-nos tirar a conclusão de que os melhores resultados de

actividade foram obtidos para os compostos mais lipofílicos. Apesar de não serem

diferenças muito acentuadas, pode-se ver que dos híbridos estudados, os três mais

lipofílicos (2.12b, 2.12c e 2.12d) exibem menor valor de IC50.

A introdução da unidade dipeptidilvinilsulfona, como mencionado antes, deverá

inibir a protease de cisteína, falcipaína. Por esta razão, estudou-se a actividade inibitória

dos híbridos relativamente à falcipaína-2, sendo este estudo efectuado no laboratório do

Professor Phillip Rosenthal (Tabela 2.7). Diferentes concentrações dos híbridos em

DMSO foram incubadas com igual quantidade de falcipaína-2 recombinante (1nM) em

acetato de sódio (100 mM, pH 5,5) e ditiotreitol (DTT, 10 mM) durante 30 minutos à

1

2

3

4

5

6

4,5 5 5,5 6 6,5

IC50 (

nM

)

log P

2.12a

2.12b

2.12e

2.12c

2.12d

2.12f


75

temperatura ambiente. Após este tempo adicionou-se o substrato benzoxicarbonil-Leu-

Arg-7-amino-4-metil-coumarina (Z-Leu-Arg-7-AMC, concentração final 25 µM) e

monitorizou-se a fluorescência (excitação 380 nm, absorvância 460 nm) durante 30

minutos à temperatura ambiente, com intervalos de 30 segundos continuamente. O

substrato fluorogénico Z-Leu-Arg-AMC, com especificidade para a protease em estudo,

após hidrólise enzimática liberta o derivado cumarínico 7-AMC, que provoca um

aumento de fluorescência facilmente detectável por meios visuais e/ou utilizando uma

fonte de radiação UV 81, 257-259

. A determinação da actividade da enzima (fluorescência

vs tempo), permitiu determinar os valores de IC50 a partir dos valores da actividade em

função da concentração de enzima, através do software GraphPad Prism 81

.

O Plasmodium chabaudi é uma das quatro espécies que infectam roedores, além

do P. berghei, P. vinckei e P. yoelii e é utilizado em laboratório pois apresenta a

vantagem de fácil utilização e transmissão pelo Anopheles gambiae. O facto de partilhar

elevada homologia na maior parte dos aspectos estruturais, bioquímicos e de ciclo de

vida com o Plasmodium falciparum faz com que seja um bom modelo para o estudo do

parasita humano. No Plasmodium chabaudi foram isolados dois genes que codificam

para as proteases de cisteína, chabaupaína-1 e -2, sendo homólogas da falcipaína-1 e -2

no P. falciparum, razão pela qual se testaram estes híbridos em relação à inibição destas

proteases 260

. O estudo da actividade inibitória destes híbridos na chabaupaína-1 foi

efectuado na Faculdade de Farmácia de Lisboa e no Instituto de Higiene e Medicina

Tropical da Universidade Nova de Lisboa (CMDT), com a colaboração da Doutora

Lídia Gonçalves e da Doutora Ana Domingos (Tabela 2.7). Foi utilizado como controlo

positivo o epoxisuccinilo E64 (1.37) com reconhecida inibição das proteases de cisteína.

Estudos anteriores de relação estrutura-actividade (SAR) para a inibição da

falcipaína-2 revelaram que a unidade dipeptidilvinilsulfona com o resíduo de Leu na

posição P2 e a hPhe na posição P1 são os mais activos, com valores de IC50 na ordem

dos nM, como verificado em estudos anteriores para o inibidor 1.42 (IC50 = 3,5 nM) 83

.


76

Tabela 2.7 - Actividade inibitória da falcipaína-2 e chabaupaína-1, para os híbridos C10-oxa.

NH

SO2

O

NH

O

O

O

O

O

O

R2

R3

R1

2.12

ART

- artemisinina; Ác. Art.

- ácido artelínico; ND - Não Determinado

Os resultados experimentais obtidos demonstraram que os híbridos com a

sequência Leu-hPhe (2.12c, IC50 = 4,95 µM e 2.12e, IC50 = 0,350 µM) originam uma

maior inibição da falcipaína-2 quando comparada com as das sequências Phe-hPhe

(2.12d, IC50 = 9,22 µM e 2.12f, IC50 = 21,6 µM) ou Phe-Phe (2.12b, IC50 = 22,4 µM), de

acordo com o que seria de esperar. Relativamente à inibição da CP-1, o resíduo de Leu

em P2 (2.12c, IC50 = 2,29 µM) não foi o que apresentou melhor inibição, mas sim o

híbrido com o resíduo Phe (2.12b, IC50 = 0,400 µM e 2.12d, IC50 = 0,538 µM),

indicando que provavelmente esta enzima apresenta uma diferença estrutural

relativamente à falcipaína-2, fundamental para o reconhecimento molecular nesta

posição.

O derivado 2.13 (R1

= Leu, R2

= hPhe, R3

= Ph) foi igualmente testado, com o

objectivo de verificar a acção inibitória da unidade dipeptidilvinilsulfona nestas

proteases de cisteína, sem a presença da unidade da artemisinina. Este composto exibiu

Composto R1 R

2 R

3

IC50 / µM

FP-2 CP-1

2.12a H CH2C6H5 C6H5 16,5 56,8

2.12b CH2C6H5 CH2C6H5 C6H5 22,4 0,400

2.12c CH2CH(CH3)2 CH2CH2C6H5 C6H5 4,95 2,29

2.12d CH2C6H5 CH2CH2C6H5 C6H5 9,22 0,538

2.12e CH2CH(CH3)2 CH2CH2C6H5 CH3 0,350 ND

2.12f CH2C6H5 CH2CH2C6H5 CH3 21,6 ND

2.13 CH2CH(CH3)2 CH2CH2C6H5 C6H5 0,210 ND

ART -- -- -- ND ND

Ác. Art. -- -- -- ND ND

E64 -- -- -- 0,0840 0,009


77

uma actividade inibitória da FP-2 superior, relativamente aos híbridos C10-oxa,

indicando que a presença de uma unidade endoperoxídica na posição R1´ não é

favorável para a interacção com a cavidade S1´ (ver Figura 1.9), resultando na perda da

potência inibitória. Os resultados obtidos para 2.12c (IC50 = 4,95 µM), 2.13

(IC50 = 0,21 µM) e para o derivado 1.42 (IC50 = 0,0035 µM) permitem concluir que

grupos volumosos na posição R1´ (unidade endoperoxídica, grupo Boc e morfolina,

respectivamente) são prejudiciais para a inibição da falcipaína-2, obtendo-se uma razão

de 1650:70:1 para o valor de IC50. Finalmente, na posição R3 foram testados os grupos

fenilo e metilo, não se verificando nenhuma relação directa entre estes grupos e a

actividade, parecendo haver dependência essencialmente da sequência dipeptídica. Nos

híbridos com a sequência dipeptídica Leu-hPhe obteve-se melhor actividade com o

grupo metilo em R3 (2.12e, IC50 = 0,350 µm), comparativamente a 2.12c (R

3 = Ph),

enquanto que na sequência de aminoácidos Phe-hPhe, o melhor resultado de actividade

foi obtido para 2.12d, com o grupo fenilo em R3, em vez do grupo metilo,

2.12f. Nos

híbridos com o dipéptido Phe-hPhe, o aumento na actividade inibitória do grupo metilo

(2.12f, IC50 = 21,6 µM) para o grupo fenilo (2.12d, IC50 = 9,22 µM) em R3, está de

acordo com o descrito para as vinilsulfonas Mu-Phe-hPhe. Nestes inibidores das

proteases de cisteína e derivados da morfolina, obteve-se melhor actividade antimalárica

em Mu-Phe-hPhe-VSPh (IC50 = 0,08 µM), comparativamente a Mu-Phe-hPhe-VSMe

(IC50 = 1 µM) 83.

Os valores de IC50 obtidos para a inibição das proteases de cisteína e para o

desenvolvimento do P. falciparum são uma forte evidência de que o farmacóforo

endoperoxídico da artemisinina é o principal responsável para a actividade antimalárica

destes compostos. Estudos anteriores demonstraram que a existência de vacúolos

alimentares inchados nos trofozoítos, são uma consequência da acumulação de

hemoglobina não degradada, consistente com o bloqueio da hidrólise da hemoglobina

por parte dos inibidores das proteases de cisteína, como por exemplo as

dipeptidilvinilsulfonas e o E64 261- 263

. A ausência destes vacúolos alimentares inchados

aquando da incubação dos híbridos C10-oxa, comprova que a actividade se deve

principalmente à unidade endoperoxídica, demonstrando uma fraca inibição da

falcipaína-2 e/ou um acesso limitado ao vacúolo alimentar.

Em conclusão, estes híbridos C10-oxa contendo as unidades ácido artelínico e

dipeptidilvinilsulfona covalentemente ligadas têm uma óptima actividade antimalárica,


78

com valores de IC50 entre 2-5 nM. Apesar de incorporarem a sequência de aminoácidos

essencial para o reconhecimento enzimático (Leu-hPhe) na unidade

dipeptidilvinilsulfona, requerida para a inibição da falcipaína, apenas inibem a

falcipaína-2 na ordem dos µM.

A babesiose ou vulgarmente denominada febre da carraça, é uma doença

parasitária, onde a carraça é o agente transmissor da espécie Babesia, que parasita e

destrói as células sanguíneas do animal causando anemia e podendo inclusive levá-lo à

morte. Existem inúmeras espécies que parasitam os mais diversos animais (gado bovino

e caprino, cães, gatos…), mas felizmente são poucas as que infectam o homem. A

babesiose é uma doença com impacto razoável tanto a nível económico como

veterinário, causada por este parasita protozoário, que apresenta semelhanças ao

Plasmodium e ao seu ciclo de vida. Ainda existem algumas limitações em relação à

vacinação e no tratamento quimioterápico geralmente recorre-se à clindamicina, em

associação com outros fármacos e ao dipropionato de imidocarb (Imizol

) 264-266

.

Sabe-se que inibidores das proteases de cisteína, como o E64, diminuem a invasão dos

eritrócitos in vitro, bem como o crescimento da Babesia bovis, responsável pela

infecção no gado bovino 267

. À semelhança do que acontece na malária, a procura de

novos alvos para o tratamento da babesiose, levou à descoberta recente de uma protease

de cisteína, com um papel importante do desenvolvimento deste parasita, a babesipaína-

1 268

.

Com base nestes factos, os derivados 2.12a-d foram testados relativamente à

inibição da protease de cisteina, babesipaína-1 (na estirpe Babesia bigemina), pelo

mesmo grupo que efectuou os estudos anteriores de inibição da chabaupaína-1. A

actividade da babesipaína-1 foi determinada por fluorescência e o procedimento

experimental foi semelhante ao efectuado anteriormente para a inibição da chabaupaína-

1. Os inibidores foram dissolvidos em DMSO e o controlo foi efectuado com a enzima

isolada, o substracto isolado e a enzima em DMSO 268

.

Na Tabela 2.8 apresentam-se os resultados obtidos referentes à inibição da

babesipaína-1.


79

Tabela 2.8 - Inibição da babesipaína-1 (IC50/µM) obtida para alguns híbridos C10-oxa.

Composto IC50 / µM

babesipaína-1

2.12a 30,3

2.12b 26,9

2.12c 0,700

2.12d 0,349

Os resultados apresentados para os híbridos testados, são consistentes com os

obtidos para a inibição da falcipaína-2 (Tabela 2.7), onde se verifica que os compostos

com o aminoácido homo-fenilalanina em R2

(2.12c e 2.12d), têm maior capacidade de

inibição nestas proteases de cisteína, em comparação com a fenilalanina em R2

(2.12a e

2.12b). Pode-se confirmar que apesar da pequena variação entre estes dois aminoácidos,

a homo-fenilalanina é o aminoácido requerido para o reconhecimento enzimático. A

inibição da babesipaína-1, para 2.12a e 2.12b (R2 = Phe e R

3 = Ph) e 2.12c e 2.12d

(R2 = hPhe e R

3 = Ph) relativamente à inibição das duas proteases de cisteína anteriores

(FP-2 e CP-1), apresenta resultados diferentes. Os híbridos com a Gly, 2.12a, e com a

Leu, 2.12c, em R1, originam uma melhor inibição da FP-2 (IC50 = 16,5 µM e 4,95 µM,

respectivamente), porém relativamente à CP-1 e babesipaína-1, não se verificou este

comportamento. Na inibição da CP-1 e da babesipaína-1 foi obtida uma melhor inibição

para os híbridos 2.12b e 2.12d, ambos com o aminoácido Phe em R1. Esta variação na

inibição destas proteases, parece indicar a existência de diferenças estruturais nestas três

proteases de cisteína.

2.1.7 - Avaliação da estabilidade

A estabilidade dos híbridos C10-oxa em tampão fosfato isotónico pH 7,4 e

plasma humano foi estudada por HPLC com detector de UV. A metodologia utilizada

está descrita no capítulo da Parte Experimental.

Foi utilizada a mistura de solventes água/acetonitrilo para o eluente de HPLC-

UV, sendo este o sistema mais referido na literatura, utilizado quer em sistema

isocrático ou em gradiente, para este tipo de compostos 269- 273

. Devido à artemisinina

não ter funções ionizáveis, o pH da fase móvel não afecta o comportamento em relação


80

ao tempo de retenção, o mesmo ocorrendo nos híbridos finais. Na Tabela 2.9 é possível

verificar os sistemas de eluentes utilizados para estes híbridos C10-oxa do ácido

artelínico e os respectivos tempos de retenção (tr). O comprimento de onda escolhido

(λ=220 nm) para estes estudos de HPLC-UV foi obtido com base no espectro de UV

traçado para os compostos.

Tabela 2.9 - Tempos de retenção obtidos para os híbridos C10-oxa, em função do eluente

utilizado (λ= 220 nm, fluxo 1ml/min, coluna RP18 250×4 mm, 5µm).

Híbrido

Eluente

tr /min % H2O % ACN

2.12a 25a/30

b 75a/70

b 5,55a/6,48

b

2.12b 25a,b 75

a,b 7,44 a,b

2.12c 25 a,b 75

a,b 8,26 a,b

2.12d 25 a,b 75

a,b 8,06 a,b

2.12e 25 a,b 75

a,b 6,18 a,b

2.12f 25 a/30

b 75a/70

b 6,46a/7,81

b

ª - eluente utilizado nos ensaios em PBS

b - eluente utilizado nos ensaios em plasma humano

O estudo da estabilidade dos compostos em tampão fosfato isotónico, pH 7,4 e

em plasma humano, a 37ºC, pretende avaliar a susceptibilidade química e enzimática

destes híbridos em condições fisiológicas. Da análise dos cromatogramas, conseguiu-se

visualizar o desaparecimento do pico referente ao híbrido em questão, mas nunca se

conseguiu identificar o aparecimento de outro pico, como resultado de uma possível

reacção química ou enzimática nos estudos em PBS ou plasma, respectivamente. O pico

referente à unidade da artemisinina, por esta não conter qualquer cromóforo

identificável no UV, não foi visualizado, porém a unidade dipeptidilvinilsulfona, apesar

de conter sistemas aromáticos, também não foi visualizada no HPLC, possivelmente por

sair na frente do eluente. As constantes de velocidade (kobs) para a hidrólise destes

híbridos foram calculadas a partir da diminuição da área do pico correspondente ao

substrato ao longo do tempo em tampão fosfato e em plasma. Na Tabela 2.10

apresentam-se os valores de kobs e tempo de semi-vida (t½) para os híbridos C10-oxa

derivados do ácido artelínico.


81

Tabela 2.10 - Valores de kobs e t½ obtidos para os compostos em tampão fosfato isotónico pH

7,4 e plasma humano, a 37ºC e respectivos valores de log P.

Híbrido

kobs/ h-1 t½ / h

log Pa PBS Plasma

Humano

PBS Plasma

Humano

2.12a Estável 2,4×10-2 > 300 29 4,94

2.12b Estável 1,8×10-2 > 300 39 5,96

2.12c Estável 1,1×10-2 > 300 54 6,08

2.12d Estável 1,4×10-2 > 300 48 6,26

2.12e Estável 8,4×10-3 > 300 83 5,34

2.12f Estável 1,9×10-2 > 300 36 5,55

a - log P calculado através do programa ALOGPS 2.1

251

Para o híbrido 2.12c foi calculado o valor de kobs em plasma, obtido por HPLC-MS,

como resultado da detecção da massa molecular do composto e o valor obtido de

1,3×10-2

h-1

é semelhante ao obtido por HPLC com o detector de UV

(kobs = 1,1×10-2

h-1

). O mesmo estudo foi efectuado em água para este híbrido e

analisado por HPLC-MS e verificou-se não existir hidrólise significativa, como

determinado anteriormente em PBS por HPLC-UV. A reacção de hidrólise em PBS foi

seguida durante cerca de 15 dias e não havendo alteração significativa nas áreas

referentes ao pico do composto, concluiu-se que os compostos eram estáveis, não

havendo qualquer distinção entre os híbridos. Em relação ao estudo em plasma, pode-se

verificar que os híbridos apresentam um tempo de semi-vida menor comparativamente

ao PBS, o que sugere uma possível hidrólise enzimática. Foi também efectuado o estudo

por HPLC-MS, para a identificação dos possíveis metabolitos resultantes da hidrólise

enzimática em plasma para o híbrido 2.12c. Apesar das várias condições utilizadas,

entre as quais se efectuaram variações no eluente e nos potenciais e modo de ionização,

conseguiu-se verificar o desaparecimento do pico referente ao híbrido 2.12c, mas não se

conseguiram identificar as massas moleculares relativas os metabolitos prováveis. É de

referir que o estudo por HPLC-MS na tentativa de identificar os possíveis metabolitos

resultantes da estabilidade do híbrido 2.12c em plasma contínua em desenvolvimento.

Foi estudada a correlação entre os valores das constantes de velocidade obtidas

experimentalmente e a lipofilia para os híbridos e não existe correlação linear entre os

dois parâmetros (Gráfico 2.2). Verificou-se deste modo que a velocidade de hidrólise


82

enzimática destes compostos é independente da lipofilia dos compostos. Pode-se apenas

afirmar que o híbrido 2.12a, sendo o menos lipofílico (log P = 4,94), é o que apresenta

maior constante de velocidade e consequentemente menor tempo de semi-vida.

Gráfico 2.2 - Gráfico que correlaciona o log kobs em função de log P para os híbridos C10-oxa

derivados do ácido artelínico.

2.2 - Híbridos baseados no ácido artesúnico

2.2.1 - Síntese dos híbridos de ácido artesúnico e dipeptidilvinilsulfonas

Muitos derivados foram sintetizados a partir da dihidroartemisinina,

principalmente devido às suas propriedades físico-químicas. A necessidade de

compostos mais solúveis em água e as vantagens inerentes à sua administração

intravenosa, levou ao desenvolvimento do hemisuccinato da dihidroartemisinina, o

artesunato de sódio, 1.7, que na sua forma ácida se apresenta como o ácido artesúnico,

2.15 24

.

O

O

O

O

CH3

CH3

CH3

O

O

OH

O

Linker

2.15

-2,5

-2

-1,5

4,5 5 5,5 6 6,5

log

kob

s

log P

2.12a

2.12e

2.12f 2.12b

2.12c

2.12d


83

O ácido artesúnico, ou o sal sódico, artesunato de sódio, é mais activo do que a

própria artemisinina e é actualmente um dos fármacos mais utilizado na terapia

combinada. Este fármaco exibe elevada eficácia quando administrado por via sistémica,

porém a sua actividade diminui quando administrado por via oral. Devido a este facto

têm sido sintetizados vários derivados ésteres da dihidroartemisinina, mais lipofílicos e

incorporando estruturas químicas farmacologicamente vantajosas, como o adamantano,

fluoreno ou bifenilo, com elevada actividade antimalárica 274

.

Este facto levou-nos ao design e síntese de compostos híbridos contendo a

unidade do ácido artesúnico covalentemente ligada à unidade dipeptidilvinilsulfona e

com um linker diferente, relativamente aos híbridos do ácido artelínico. Estes

compostos contendo a função química éster conjugada com o acetal, permitem estudar

diferenças na estabilidade química e enzimática, comparativamente aos compostos

híbridos C10-oxa sintetizados anteriormente.

Relativamente ao método de síntese, após obtenção do derivado com a função

ácido carboxílico, o procedimento é igual ao descrito para o ácido artelínico, ou seja, o

acoplamento da unidade dipeptidilvinilsulfona. No Esquema 2.6 está indicada a síntese

para o ácido artesúnico, resultante da reacção da dihidroartemisinina com o anidrido

succínico na presença do catalisador 4-dimetilaminopiridina (DMAP).

O

O

O

O

O

O

OH

OO

O

O

O

CH3

OH

i)

Esquema 2.6 - Reacção efectuada para obtenção do ácido artesúnico. Reagentes e condições:

i) anidrido succínico, DMAP, DCM, t.a..

Além desta reacção, ainda se efectuaram outras reacções entre a

dihidroartemisinina e o anidrido glutárico, anidrido ftálico e o 2,2-dimetil anidrido

succínico, de modo a obter os compostos 2.16, 2.17 e 2.18, respectivamente.

1.4 2.15


84

O

O

O

O

O

O O

OH

O

O

O

O

O

O

COOH

O

O

O

O

O

O

OH

O

2.16 2.17 2.18

Porém, devido à instabilidade química dos derivados 2.17 e 2.18, sendo

facilmente decompostos e originando o composto de partida, dihidroartemisinina,

apenas se conseguiu sintetizar o derivado resultante da síntese com o anidrido glutárico,

2.16. Assim, têm-se dois derivados com a função ácida, para o acoplamento à

dipeptidilvinilsulfona, originando os compostos híbridos finais, 2.19 e 2.20. De acordo

com a literatura e com os resultados anteriores, a sequência ideal de aminoácidos é a

que contém a Leu-hPh ligada à unidade vinilsulfona, pelo que estes derivados foram

sintetizados contendo esta unidade dipeptídica.

NH

O

NH

SO

OO

O

O

O

O

O

On

2.19, n = 2

2.20, n = 3

2.2.2 - Caracterização estrutural


Em relação à unidade da dipeptidilvinilsulfona, os aspectos mais relevantes já

foram discutidos anteriormente. Na síntese destes compostos híbridos derivados do

ácido artesúnico é de salientar a existência de estereoquímica α em C10.

Aquando da formação do ácido artelínico com a presença do catalisador

BF3.Et2O, formava-se o ião oxónio, que ao sofrer ataque do álcool do reagente ácido


85

4-hidroximetil-benzóico, originava o composto com uma conformação 10-β. Na síntese

do ácido artesúnico, temos uma química diferente e esteroquímica diferente, com

obtenção da conformação 10-α. A estereoquímica deste composto tem sido tema de

vasta discussão. Antes de 2000, o Chemical Abstracts designava o artesunato como

isómero 10-β, mas a partir deste ano foram atribuídas as estereoquímicas 10-β ou 10-α

ou então como indefinida. Presentemente, sabe-se que a acilação da dihidroartemisinina

com anidridos na presença de base, como a piridina, origina ésteres com uma

estereoquímica 10-α. Mas qual a razão da formação de apenas o epímero α? A

dihidroartemisinina existe como uma mistura 1:1 dos dois epímeros α e β, porém esta

proporção pode ser alterada em função do solvente, onde em metanol e acetona a razão

é de 2:1 (α/β) e em dimetilsufóxido de 3:1 (α/β). Verificou-se também que a adição de

um equivalente de DMAP ou trietilamina causa uma alteração no equilíbrio de cerca de

1,5:1 a favor da estereoquímica α. Haynes et al efectuaram estudos computacionais

adicionais e obtiveram as seguintes conclusões: a) a formação exclusiva do 10-α

artesunato não pode ser atribuída a factores termodinâmicos, mas sim a fenómenos

cinéticos; b) a presença da base não tem qualquer efeito na estereoquímica adoptada

durante a acilação; c) são obtidos α-ésteres quando o grupo hidroxilo da

dihidroartemisinina actua como nucleófilo e β-ésteres quando é activado por

substituição; d) a formação de éteres catalisada por ácidos de Lewis origina

maioritariamente o epímero β 237

.

A atribuição da estereoquímica C10-α para os compostos sintetizados foi

verificada por ressonância magnética nuclear. Na Figura 2.15 pode-se ver parte do

espectro de 1H-RMN do ácido artesúnico, referente ao sinal do protão H10, com um

desvio químico de 5,82 ppm e uma constante de acoplamento de 10,0 Hz com o protão

H9, que corresponde a um arranjo trans-diaxial destes protões.


86

Figura 2.15 - Parte do espectro de 1H-RMN do ácido artesúnico, referente ao sinal de H10 e

respectiva constante de acoplamento (espectro efectuado em CDCl3).

Na Figura 2.16 é possível ver parte da estrutura do α-artesunato e β-artesunato e

as relações trans-diaxiais e cis-equatorial-axial, entre H10 e H9, respectivamente. Este

raciocínio baseado na constante de acoplamento foi utilizado na atribuição da

estereoquímica do ácido artelínico e dos demais compostos sintetizados, quando

necessário.

H10

H9

OO

OCH3

O

O

O

H9

OO

OCH3

H10

O

α-ácido artesúnico β-ácido artesúnico

Figura 2.16 - Parte da estrutura do ácido artesúnico, onde se podem ver as interacções entre

H9 e H10: trans-diaxiais (α-ácido artesúnico) e cis-equatorial-axial (β-ácido artesúnico).

2.2.3 - Avaliação antimalárica in vitro

A actividade antimalárica destes dois híbridos C10-oxa derivados do ácido

artesúnico foi avaliada in vitro em várias estirpes de P. falciparum e foi também

determinada a sua capacidade inibitória para a falcipaína-2. Os resultados obtidos

encontram-se na Tabela 2.11.

C12-H

C10-H(β)

J= 10,0 Hz


87

Tabela 2.11 - Actividade antimalárica em várias estirpes de P. falciparum e inibitória para

FP-2 dos híbridos C10-oxa derivados do ácido artesúnico.

Composto IC50 ± SD/ nM

W2 FCR3 3D7 V1/S D6 FP-2 FP-3

2.19 3,97±0,2 1,40±0,3 2,50±0,60 1,30±0,10 4,30±0,10 1965± 895 ND

2.20 5,34±0,1 ND ND ND ND 898,0± 242 130±13

ART 10,6±0,9 5,40±0,5 9,70±4,2 4,20±0,50 14,5±1,2 -- --

DHART 1,90±0,1 0,800±0,0 2,10±0,30 0,800±0,10 2,10±0,10 -- --

ARTM 6,77±0,4 2,40±0,2 4,80±0,20 1,90±0,20 6,70±0,40 -- --

CQ

51,7±0,6 51,1±0,1 11,6±1,1 65,0±4,1 16,9±2,1 -- --

E64 -- -- -- -- -- 64,50±9,90 120

SD - Desvio Padrão; ND - Não Determinado; ART - artemisinina; DHART - dihidroartemisinina;

ARTM - arteméter; CQ - cloroquina;

O híbrido 2.19 exibe melhor actividade antimalárica em várias estirpes de

P. falciparum, relativamente aos fármacos utilizados em terapia, ou seja, a artemisinina,

o arteméter e a cloroquina. Para o híbrido 2.20, o valor de IC50 apesar de ser

ligeiramente superior ao de 2.19, não é superior ao obtido para a artemisinina. A

semelhança de IC50 destes dois híbridos parece indicar que a diferença estrutural de um

grupo CH2 entre eles, não representa uma diferença significativa na actividade

antimalárica destes híbridos.

Na inibição da falcipaína-2, estes híbridos apesar de conterem a sequência

dipeptídica ideal, exibem valores de IC50 superiores ao do obtido para o inibidor E64.

No híbrido 2.12c (IC50 = 4,95 µM) que contém a mesma sequência dipeptídica e a

mesma fenilvinilsulfona, o valor de IC50 para a inibição da FP-2 é superior ao obtido

para os híbridos 2.19 (IC50 = 1,97 µM) e 2.20 (IC50 = 0,89 µM), o que pode indicar que

estes últimos derivados pelo facto de serem quimicamente mais instáveis, libertam mais

facilmente a unidade dipeptidilvinilsulfona, de modo a esta poder actuar no local alvo.


88


A estabilidade em plasma humano e em tampão fosfato a 37ºC foi estudada para

estes dois híbridos e as constantes de velocidade e os tempos de semi-vida obtidos estão

apresentados na Tabela 2.12.

Tabela 2.12 - Valores de kobs e t½ obtidos para os compostos em tampão fosfato isotónico pH

7,4 e plasma humano a 37ºC, e os respectivos valores de log P.

Híbrido

kobs / h-1 t½ / h

log Pa PBS Plasma

Humano PBS Plasma

Humano

2.19 6,7×10-4 1,8 > 1000 0,40 5,15

2.20 1,4×10-2 2,7×10

-1 51 2,6 5,34

a - calculado através do programa ALOGPS 2.1

251

Existem apenas dois compostos estudados neste tipo de híbridos, razão pela qual

não se efectuou qualquer correlação linear. Dos resultados obtidos pode-se afirmar que

o composto menos lipofílico, 2.19, apresenta maior constante de velocidade e menor

tempo de semi-vida em plasma humano, à semelhança do que acontecia nos híbridos

C10-oxa derivados do ácido artelínico, apesar de não haver uma diferença significativa

no valor de log P comparativamente a 2.20. Comparando estes compostos com os

híbridos C10-oxa anteriores, seria de esperar que fossem menos estáveis, o que se veio a

verificar de acordo com os valores de kobs obtidos. A razão reside no facto de estes

derivados do ácido artesúnico, conterem uma função éster, mais facilmente hidrolisável

pelas esterases do plasma, comparativamente aos derivados do ácido artelínico,

caracterizados pela ausência deste grupo funcional. O composto 2.19 apresenta um

valor de kobs maior do que 2.20 em plasma, apesar de ambos conterem as mesmas

funções químicas, porém o composto 2.19 apresenta menos um grupo metilénico, o que

parece indicar alguma selectividade das enzimas plasmáticas para a hidrólise.

Em relação aos valores obtidos em PBS, pode-se verificar que o derivado 2.20 é

menos estável nestas condições do que 2.19, o que indica uma maior hidrólise química.

O facto deste composto 2.20 apresentar maior constante de velocidade em PBS e menor

constante de velocidade em plasma, parece indicar que existe uma diferença

relativamente à hidrólise química e enzimática.


89

Para confirmar a facilidade de hidrólise destes híbridos, devido à presença do

grupo éster, comparativamente aos híbridos derivados do ácido artelínico, os compostos

2.19 e 2.12f foram colocados em PBS e depois foi adicionado igual volume de NaOH

0,1M. Verificou-se por HPLC, que no t0, ou seja, logo após a adição de hidróxido de

sódio, o pico referente ao composto 2.19 desapareceu, enquanto para 2.12f ainda

continuou a existir por mais tempo, indicando maior dificuldade de hidrólise em meio

básico. Apesar do desaparecimento do pico em 2.19, não foi visualizado o aparecimento

de outro pico.


90

CAPÍTULO III

Híbridos de derivados C10-carba da artemisinina


92


93

3.1 - Híbridos C10-carba da artemisinina

3.1.1 - Análise retrossintética

Os derivados arteméter, 1.5, e arteéter, 1.6, apesar de serem antimaláricos

potentes, exibem fraca biodisponibilidade e rápida eliminação, tanto em modelos animais

como no homem. Este fenómeno está associado à instabilidade química e metabólica

inerente à função acetal, existente nestes derivados. Uma das muitas vias metabólicas do

arteméter através do complexo enzimático P450, origina a dihidroartemisinina. De modo

a aumentar a estabilidade, foram criados análogos não-acetais, de entre os quais os

derivados C10-deoxoartemisininas que mostraram ser 15 a 22 vezes mais estáveis do que

os análogos acetais em condições acídicas semelhantes à do estômago 275

. A presença da

ligação C-C faz com que estes compostos tenham uma maior estabilidade metabólica, do

que os derivados de primeira geração arteéter e arteméter, o que levou vários grupos a

desenvolverem vias sintéticas para a síntese destes derivados C10-deoxoartemisininas.

Os híbridos C10-carba da artemisinina foram sintetizados de acordo com a análise

retrossintética do Esquema 3.1. A síntese da unidade dipeptidilvinilsulfona é efectuada de

acordo com o procedimento experimental utilizado no capítulo anterior, e a principal

diferença nestes híbridos é a existência do átomo de carbono em vez do átomo de

oxigénio, na ligação ao C10 da artemisinina.


94

NH

SO2

NH

O

O

O

O

O

O

NH

SO2

NH2

O

O

O

O

O

O

OH

BocNH CO2H

BocNH CHO

BocNH SO2

P

O

SO2

EtO

EtO

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

Ph

R2

R3

R1

R2

R3

R1+

R1

R2

R2

R3

R3

+

+3.1

Esquema 3.1 - Análise retrossintética dos derivados híbridos C10-carba da artemisinina-

dipeptidilvinilsulfona.

De acordo com a análise retrossintética, estes híbridos vão ser sintetizados a partir

do derivado benzoato 3.1. Numa primeira abordagem, tentaram-se sintetizar estes

compostos a partir do derivado acetato 3.2, que foi obtido a partir da dihidroartemisinina

na presença de anidrido acético, piridina e DMAP (Esquema 3.2) 276, 277

. Verificou-se que

este composto tinha a desvantagem de ser bastante instável, originando o reagente

dihidroartemisinina e que a posterior formação do aldeído 3.3 nunca foi obtida apesar da

variação de catalisadores utilizados (TiCl4, BF3.Et2O e ZrCl4) e condições reaccionais

(Esquema 3.2).


95

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

H

i) ii)

Esquema 3.2 - Proposta de síntese do composto C10-carba 3.3 a partir do derivado acetato da

dihidroartemisinina 3.2. Reagentes e condições: i) Ac2O, piridina, DMAP, DCM, t.a.; ii)

viniloxitrimetilsilano, tetracloreto de titânio, THF, -40ºC.

Este facto levou então a um método alternativo de síntese, recorrendo ao benzoato

da dihidroartemisinina, 3.1, mais estável à hidrólise comparativamente ao derivado

acetato 3.2.

3.1.2 - Híbridos C10-carba dipeptidilvinilsulfona

Para a síntese destes compostos, começou-se por sintetizar o derivado benzoato da

dihidroartemisinina, 3.1 238,

278

. A dihidroartemisinina, 1.4, na presença de cloreto de

benzoílo e de uma base, neste caso a piridina, originou o derivado benzoato 3.1, com uma

configuração α em C10, facto que será posteriormente discutido na Caracterização

estrutural. O próximo passo foi sintetizar o derivado com a dupla ligação terminal

(10β-alil-10-desoxi-dihidroartemisinina), 3.4, que se denominará simplesmente derivado

alilo. Este derivado alilo, foi obtido através da reacção do benzoato 3.1 com o composto

aliltrimetilsilano, utilizando cloreto de zinco anidro na presença de peneiros moleculares

de 4Å e dicloroetano seco como solvente (Esquema 3.3). Inicialmente, O´Neill e

colaboradores 238, 275,

278, 252

, testaram vários catalisadores para sintetizar este derivado

alilo e verificaram que ácidos de Lewis fortes, como por exemplo BF3.Et2O originavam

rearranjos com formação de produtos secundários indesejados. Com base nestas

observações, o cloreto de zinco, sendo um ácido de Lewis mais fraco, foi o reagente

escolhido para a reacção com o C10α- benzoato, originando o produto desejado com bom

rendimento.

1.2 3.2 3.3


96

O

O

O

O

OH

O

O

O

O

O

O

Ph

O

O

O

Oi) ii)

Esquema 3.3 - Síntese dos derivados benzoato, 3.1, e alilo, 3.4, a partir da dihidroartemisinina,

1.4. Reagentes e condições: i) BzCl, DCM, t.a.; ii) aliltrimetilsilano, ZnCl2, DCE anidro, peneiros

moleculares, -10º C.

Pensa-se que o mecanismo para a formação do derivado alilo envolva a saída do

grupo benzoato, catalisada pelo ácido de Lewis (Figura 3.1), originando a formação de

um catião oxónio intermédio, 2.2, com subsequente ataque nucleofílico axial do reagente

aliltrimetilsilano. O átomo de silício participa na estabilização do carbocatião em β, e no

passo final forma-se o alceno devido ao ataque nucleofílico do ião haleto (Figura 3.1) 240

.

O

O

O

O

O

O

Ph

Me3Si

O

O

O

O

O

O

Ph

Cl2Zn

O

O

O

O

O

O

Ph

Cl2Zn

O

O

O

O

O

O

O

O

SiMe3

O

O

O

O

ZnCl2

- + -

+

+

+

- Cl2ZnOCOPh

Cl-

- ClSiMe3

2.2 3.4

3.1

Figura 3.1 - Provável mecanismo catalisado pelo ácido de Lewis, ZnCl2, para a síntese do

derivado alilo 3.4.

Na purificação do derivado 3.4 por coluna de cromatografia com sílica-gel, verificou-se

sempre a existência de um produto secundário, com um Rf muito próximo que dificultava

a purificação, com um rendimento de cerca de 40%. Este contaminante foi isolado e

1.4 3.1 3.4


97

caracterizado por RMN (ver discussão em Caracterização Estrutural), e é resultante da

desidratação da dihidroartemisinina, originando a anidroartemisinina, 3.5 275

.

O

O

O

O

HO

O

O

O

+

2.2 3.5

O derivado C10-carba da artemisinina contendo a função ácido carboxílico, 3.6, é

obtido a partir da oxidação do derivado alilo 3.4, com permanganato de potássio e

metaperiodato de sódio, de acordo com o Esquema 3.4.

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

i)

3.4 3.6

Esquema 3.4 - Síntese do derivado ácido C10-carba da artemisinina, 3.6. Reagentes e condições:

KMnO4, NaIO4, 50% H2O/acetona, t.a..

O mecanismo possível para a síntese do derivado ácido está apresentado na Figura

3.2. Primeiramente ocorre a oxidação da dupla ligação pelo permanganato de potássio

originando o respectivo diol, que posteriormente por acção do metaperiodato de sódio em

excesso é oxidado a ácido carboxílico 240, 280

.

É de referir que os derivados benzoato e alilo da artemisinina foram purificados

por métodos cromatográficos, mas o derivado ácido apresentava-se suficientemente puro

para ser utilizado sem qualquer purificação adicional.


98

O

O

O

O

Mn

O O

OO Mn

O O

OO

O

O

O

O

OH

OH

O

O

O

O

I

O O

OO

O

O

O

O

OH

H

O

O

O

O

O

OH

O

O

O

O

O

H2O

K+

K+

- MnO2

NaIO4

- HCHO excesso

NaIO4

Figura 3.2 - Mecanismo para a síntese do derivado ácido da artemisinina, 3.6, obtido através da

oxidação do derivado 3.4 com KMnO4 e NaIO4.

Após a síntese de 3.6 fez-se o acoplamento da unidade dipeptidilvinilsulfona, com

TBTU e TEA em DCM à temperatura ambiente. Uma vez que a sequência ideal de

aminoácidos é Leu-hPh, os compostos finais sintetizados nesta série de híbridos

C10-carba, mantêm esta sequência de aminoácidos, mas sofreram alterações no

substituinte da unidade vinilsulfona. Foram sintetizados os híbridos C10-carba de 3.7 a

3.10, com dois grupos vinilsulfona (fenil vinilsulfona, 3.7, e metil vinilsulfona, 3.8), um

éster vinilsulfonato, 3.9, e uma vinilsulfonamida, 3.10.

NH

SNH

O

O

O

O

O

O

O

O

NH

SNH

O

O

O

O

O

O

O

O CH3

3.7 3.8


99

NH

SNH

O

O

O

O

O

O

O

O OEt

NH

SNH

O

O

O

O

O

O

O

O N

CH3

3.9 3.10

3.1.3 - Híbridos C10-carba dipeptidilvinilsulfonato e vinilsulfonamida

Sabe-se que as vinilsulfonamidas e os ésteres vinilsulfonatos, tal como as

vinilsulfonas são excelentes aceitadores de Michael, razão pela qual exibem actividade

como inibidores das proteases de cisteína. Tentaram-se sintetizar ésteres vinilsulfonatos e

vinilsulfonamidas de acordo com o Esquema 3.5, a partir do cloreto de

vinilsulfonilo, 3.11 78

.

BocHNH

ONH

S

O

O

OEt

O

BocNHBocHN S

O

O

OEt

NH

S

O

O

Cl

O

BocNHNH

S

O

O

NHPh

O

BocNH

NH

S

O

O

OPh

O

BocNH

i) ii)

iii)iv)

v)

vi)

vii)

3.11

Esquema 3.5 - Esquema reaccional proposto para a síntese de ésteres vinilsulfonatos e

vinilsulfonamidas. Reagentes e condições: i) trietilfosfonometanossulfonato, BuLi, THF; ii)TFA,

DCM; iii) Boc-Leu-OH, TBTU, TEA, DMF; iv) n-Bu4NI, acetona, refluxo; v) PH3P, SOCl2, t.a. vi)

PhNH2; vii) PhOH.


100

Para tal foi necessário sintetizar o composto etilmetanossulfonato, 3.12, o qual na

presença da base n-butil-lítio (n-BuLi) dá origem a um nucleófilo, que reagindo com o

dietilclorofosfato origina o etil (dietoxifosforil)metanossulfonato, 3.13

(Esquema 3.6) 224, 281

.

P

O

SO O

OEt(OEt)2S

O O

CH3 OEtS

O O

CH3 Cli) ii)

Esquema 3.6 - Esquema reaccional para a síntese do trietilfosfonometanossulfonato. Reagentes e

condições: i) EtOH anidro, refluxo; ii) dietilclorofosfato, n-BuLi, THF anidro, -78º C.

O acoplamento de 3.13 ao aldeído Boc-hPhe, segue a química de Horner-

Wadsworth-Emmons, e origina o derivado vinilsulfonato, 3.14, que após desprotecção do

grupo Boc dá origem ao derivado 3.15. Posteriormente adiciona-se o aminoácido

Boc-Leu-OH, originando 3.16. O próximo passo seria a formação do cloreto de

vinilsulfonilo, porém, a formação do sal tetrabutilamónio 3.17 (Esquema 3.7) não foi

obtida, apesar de para os compostos indicados na literatura ser mencionada a sua síntese

com um rendimento de 84% 78

. O iodeto de tetrabutilamónio utilizado como reagente na

tentativa de síntese de 3.17, foi obtido a partir da reacção do brometo de tetrabutilamónio

com iodeto de sódio e sua precipitação em acetona. A maior nucleofília do iodeto

comparativamente ao brometo e o facto deste sal de tetrabutilamónio aumentar a

solubilidade dos compostos em solventes orgânicos, levou ao uso deste reagente para a

síntese de 3.17, porém sem sucesso.

S

O

OOEt

NH

O

BocNHS

O

OO

NH

O

BocNH

NBu4

i

+

3.12

Esquema 3.7 - Formação do sal tetrabutilamónio sulfonato 3.17. Reagentes e condições:

i) n-Bu4NI, acetona, refluxo; ii) PH3P, SOCl2, t.a..

3.11

3.12 3.13

3.16 3.17


101

Na tentativa de síntese do sal 3.17, verificou-se o desaparecimento dos picos

característicos dos protões vinílicos, sugerindo uma reacção na dupla ligação, o que

parece indicar um possível ataque do iodeto à dupla ligação. Estes resultados levaram a

desistir do objectivo de sintetizar os ésteres vinilsulfonatos, através deste método de

síntese.

O derivado éster vinilsulfonato 3.16, após desprotecção do grupo Boc, origina o

sal trifluoroacetato 3.18, que ao reagir com o derivado ácido, 3.6, dá origem ao híbrido

C10-carba final 3.9. Este raciocínio levou a sintetizar os futuros compostos

fosfonometanossulfonato com as substituições pretendidas, para acoplar ao aldeído e

formar a ligação vinílica. Porém, na síntese do composto 3.19, verificou-se que o grupo

fenóxido sendo um bom grupo abandonante, impossibilitou a obtenção do composto

pretendido (Esquema 3.8).

Tendo em conta estes factores, apenas foi sintetizado o híbrido 3.9 contendo a

artemisinina C10-carba covalentemente ligada a um éster dipeptidilvinilsulfonato.

P

O

SO O

O(OEt)2O

SO O

CH3

i)

Esquema 3.8 - Esquema reaccional para a síntese do éster fenil fosfonometanossulfonato.

Reagentes e condições: i) dietilclorofosfato, n-BuLi, THF anidro, -78º C.

Em relação à síntese da vinilsulfonamida, este derivado foi sintetizado de modo

análogo ao do híbrido 3.9. Sintetizou-se primeiro a sulfonamida 3.20 para reagir com o

dietilclorofosfato, originando a N-fenil-N-metilfosfonometanossulfonamida 3.21

(Esquema 3.9)

NH

CH3

P

O

S

O O

N

CH3

(EtO)2SO O

CH3 N

CH3

ii)i)

Esquema 3.9 - Síntese de N-fenil-N-metil fosfonometanossulfonamida 3.21. Reagentes e

condições: i) cloreto de metanosulfonilo, NaOH 10%; ii) dietilclorofosfonato, n-BuLi, THF

anidro, -78º C.

3.20 3.21

3.19


102

A N-fenil-N-metil metanossulfonamida 3.20 foi sintetizada pela reacção Shotten-

Baumann com trietilamina em THF 282

ou com hidróxido de sódio a 10% 283

, tendo-se

obtido melhor rendimento neste último procedimento experimental (25% vs 18%). Para a

obtenção deste híbrido final 3.10, foram sintetizados os derivados intermédios de 3.22 a

3.25 descritos no capítulo do Procedimento Experimental.

Através deste método de síntese, obtiveram-se quatro híbridos C10-carba e na

Tabela 3.1 são apresentados os rendimentos do último passo reaccional.

Tabela 3.1 - Híbridos C10-carba sintetizado e rendimentos do último passo reaccional..

Híbrido ηηηη / %

3.7 58

3.8 59

3.9 35

3.10 38

Os rendimentos do último passo para os híbridos C10-carba dipeptidilvinilsulfona 3.7 e

3.8 foram 58 e 59%, respectivamente.


A análise por espectrometria de massa foi efectuada nestes híbridos C10-carba e à

semelhança dos híbridos C10-oxa verificou-se a existência do pico com massa m/z 163.

Porém, observa-se a ausência dos picos de m/z 221 e 167, o que parece indicar um

mecanismo de fragmentação diferente, pela presença do átomo de carbono ligado a C10,

em vez do átomo de oxigénio. O pico referente à massa molecular dos híbridos foi sempre

detectado, com ou sem o átomo de sódio, tal como alguns picos resultantes de

fragmentações esperadas.

A síntese dos derivados acetato 3.2 e benzoato 3.1 foi comprovada por

espectroscopia de IV, pela presença de uma banda a 1750 cm-1

e 1730 cm-1

,

respectivamente, característica da ligação carbonilo (νC=O). Foi possível também

visualizar as bandas características do sistema aromático do benzoato (νC=C = 1597, 1451,

1381 cm-1

, νC=H = 2928 cm-1

e νC-H = 1019, 917, 872, 712 cm-1

), assim como as bandas a

1640 cm-1

e a 1639 cm-1

, da dupla ligação não conjugada (νC=C) do derivado alilo, 3.4 e


103

do produto secundário anidroartemisinina 3.5, respectivamente. Relativamente ao

derivado ácido 3.6, foram identificadas as bandas a 3000 e 1634 cm-1

, que correspondem

às vibrações νO-H e νC=O, respectivamente. Além destas são de salientar as bandas

características da artemisinina e da unidade dipeptidilvinilsulfona nos híbridos C10-carba

finais. Na unidade artemisinina é de salientar a banda relativa à ponte peroxídica (νO-O) a

cerca de 970 cm-1

. Relativamente à unidade dipeptidilvinilsulfona, foram identificadas as

bandas do grupo N-H e do carbonilo, na ligação peptídica, a 3441 e 1643 cm-1

,

respectivamente, assim como as bandas características da sulfona a 1319 e 1146 cm-1

.


Na identificação estrutural destes híbridos são de referir alguns aspectos

importantes:

a) Configuração αααα-C10 vs β-C10

Tal como efectuado para o ácido artelínico, calculou-se o valor experimental de

163º para o ângulo diedro entre C9-H e C10-H no derivado acetato 3.2 utilizando o

programa MOE (Figura 3.3). Este valor é aproximado ao ângulo diedro de 180º indicado

na literatura 275

para a configuração α.

Para o derivado 3.1 (α-C10-benzoato) e 3.2 (α-C10-acetato), os estudos de RMN

comprovaram a estereoquímica α no carbono C10, devido à existência de um dupleto no

espectro de 1H-RMN para o H10, com J = 10 Hz, devido ao acoplamento com C9-H

(Figura 3.4 A) e B)). A atribuição destes hidrogénios C10-H e C9-H foi confirmada pelos

espectros COSY e HETCOR (HMBC e HMQC).


104

Figura 3.3 - Conformação para o derivado α-C10-acetato, 3.2, e ângulo diedro entre C9-H e

C10-H.

A correlação heteronuclear efectuada para 3.1, além de elucidar a estereoquímica

em C10, permitiu identificar no espectro de 13

C-RMN, o carbono carbonílico a 165,3 ppm,

o sistema aromático entre 128 e 133 ppm, bem como o C10 e o C9, a 92,5 e 32 ppm,

respectivamente.

A) B) α-C10-Acetato α-C10-Benzoato

163º

C10-H C9-H

O

O

O

O

O

O

Ph

O

O

O

O

O

O

CH3

H10

H12

H10

H12


105

Figura 3.4 - Espectro de 1H-RMN e atribuição dos sinais C12-H e C10-H nos derivados acetato,

benzoato e alilo da dihidroartemisinina (espectro efectuado em CDCl3).

É interessante verificar que aquando da síntese do derivado alilo a partir do

benzoato, existe uma alteração da estereoquímica, que passa de α-C10 para β-C10. Esta

alteração deve-se à presença da dupla ligação no catião oxónio 2.2 e a um ataque

nucleofílico axial do reagente aliltrimetilsilano (Figura 3.5).

O

OCH3

H

OO

SiMe3

O

O

O

O

+

Ataque

Axial

Oxónio 2.2 intermédio

Figura 3.5 - Adição de aliltrimetilsilano ao ião oxónio 2.2, com a correspondente consequência

estereoquímica.

Este ataque axial é o mesmo que ocorre aquando da formação do ácido artelínico 2.1,

razão pela qual ambos apresentam a mesma estereoquímica β-C10.

Na Figura 3.4 C) pode-se ver o sinal referente a H10 do derivado alilo, com desvio

químico e multiplicidade diferente de H10 do acetato (Figura 3.4 A) e benzoato (Figura 3.4

B), tal como descrito anteriormente por vários autores 237, 275, 277, 284

. O padrão de

desdobramento (ddd) deste hidrogénio H10 está apresentado na Figura 3.6, onde é possível

C)

O

O

O

O

H10

Hc1 Hc2

Ha1

Ha2

Hb

β-C10-Alilo

H10

H12


106

ver o acoplamento com H9 (J = 3,9 Hz) e com os dois átomos de hidrogénio Ha (J = 10 e

6 Hz).

J10,a= 10 Hz

H10

J10,a= 6 Hz

J10,9= 3,9 Hz

Figura 3.6 - Desdobramento obtido para o protão H10 do derivado alilo 3.4.

b) Atribuição dos sinais e padrão de desdobramento para os protões do grupo alilo

Na Figura 3.7 vê-se parte do espectro de protão de derivado alilo 3.4 e os sinais

referentes aos protões alílicos, vinílicos e aos protões H9, H10 e H12 da artemisinina.

Devido ao carbono C10 quiral, os protões Ha1 e Ha2 são diastereotópicos e com um

desdobramento complexo, como se pode ver pelo multipleto apresentado. Os protões Hc1

e Hc2 apresentam-se como um duplo dupleto, devido ao acoplamento geminal entre eles

(J =1,6 Hz) e vicinal com Hb (J = 17,2 Hz (trans) e J = 10,0 Hz (cis)).

Figura 3.7 - Parte do espectro de 1H-RMN do derivado alilo 3.4, e a atribuição dos respectivos

protões (espectro efectuado em CDCl3).

H10

O

O

O

O

Hc1 Hc2

Ha1

Ha2

Hb

H10

H12

Hb

Hc1 + Hc2

H9

Ha1 + Ha2


107

Para o protão Hb foi efectuado o padrão de desdobramento, consistente com uma

multiplicidade ddt, como se pode ver na Figura 3.8. Existe acoplamento deste protão Hb

com os protões Ha com uma constante de acoplamento de cerca de 7 Hz, além de um

acoplamento trans com o protão Hc1 (J = 17,2 Hz) e outro acoplamento cis com Hc2

(J = 10,0 Hz).

Através dos espectros de 13

C-RMN, HMQC e HMBC foi possível identificar os

carbonos do grupo alilo, nomeadamente Ca, Cb e Cc, a 34,5, 136,5 e 116,1 ppm,

respectivamente.

Jb,c1= 17,2 Hz

Hb

Jb,c2= 10 Hz

Jb,a= 7 Hz

Figura 3.8 - Desdobramento obtido para o protão Hb do derivado alilo 3.4.

O produto secundário 3.5 formado durante a síntese do derivado alilo 3.4 após

desidratação, foi igualmente identificado e caracterizado. Pelo espectro de 1H-RMN

obtido é possível visualizar o sinal de C10-H, característico de um grupo vinílico e a

desvio químico de 6,19 ppm. A multiplicidade deste sinal (quarteto largo) sugere o

acoplamento com o grupo metilo em C9, com uma constante de acoplamento entre

0-3 Hz, que se reflecte também pela existência de um dupleto para este grupo metilo

(Figura 3.9). Como esperado, o sinal de H9 para este composto, não foi identificado no

espectro de 1H-RMN, o que reforça a presença da dupla ligação, ao contrário do que

acontecia anteriormente para os outros compostos a cerca de 2,6-2,7 ppm. No espectro de

13C-RMN, os sinais destes dois carbonos da dupla ligação, C10 e C9, foram também

identificados a 135,1 e 108,3 ppm, respectivamente.

Hb


108

Figura 3.9 - Derivado anidroartemisinina 3.5, e sinal apresentado pelo grupo metilo em C9 e

pelo protão em C10-H no espectro de 1H-RMN.

c) Configuração β-C10 para o derivado ácido

Este derivado foi obtido por oxidação do derivado alilo 3.4, e como tal, é de

esperar a mesma configuração β-C10, o que se veio a confirmar com base no espectro de

1H-RMN e na constante de acoplamento (J = 3,6Hz) calculada para o sinal de C10-H,

resultante da interacção axial-equatorial com o C9-H. No espectro bidimensional COSY

foi também verificado o acoplamento de C10-H com os dois hidrogénios diastereotópicos

do grupo CH2, que aparecem entre 2,76-2,49 ppm. A oxidação foi também comprovada

por 13

C-RMN, através da presença do sinal do carbono carbonílico a 175,6 ppm,

característico de um grupo ácido carboxílico e pelo desaparecimento dos protões alílicos

no espectro de 1H-RMN.

C10-H

C9-CH3

O

O

O

O

HC10

C9


109

Figura 3.10 - Espectro de 1H-RMN do derivado ácido C10-carba da artemisinina (espectro


d) Identificação do híbrido

Para todos os híbridos foram efectuados os espectros de 1H-RMN e

13C-RMN,

bem como as correlações bidimensionais COSY, HMQC e HMBC. Na Figura 3.11 está

apresentado o espectro de 1H-RMN para 3.10 e algumas identificações. Apesar de entre

2,7 e 0,8 ppm existirem zonas de complexa interpretação, todas as identificações foram

efectuadas com base nas correlações bidimensionais e na literatura.

A desvio químico mais elevado foram visualizados os sinais dos protões dos dois

sistemas aromáticos, assim como dos protões das aminas e da dupla ligação da unidade

vinilsulfona, tendo estes dois protões vinílicos sido identificados a 6,56 e 6,28 ppm. Na

unidade da artemisinina, os protões mais característicos, nomeadamente C12-H e C10-H,

foram igualmente identificados, como um singuleto e um multipleto, a 5,37 e 4,86 ppm,

respectivamente. Identificaram-se também os multipletos relativos aos protões do grupo

CH dos aminoácidos homofenilalanina e leucina, a 4,52 e 4,39 ppm, respectivamente,

assim como o singuleto do grupo metilo da sulfonamida a 3,22 ppm. Finalmente é de

salientar que os protões diastereotópicos do carbono metilénico, existente no linker destes

híbridos C10-carba, foram identificados como dois multipletos distintos entre 2,69 e

2,26 ppm. Este carbono metilénico foi também identificado no espectro de 13

C-RMN e

apresenta um desvio químico de 37,5 ppm. A menor desvio químico foi possível

C10-H

O

O

O

O

O

OH

C10-H


110

visualizar os protões dos grupos metilo da artemisinina e do aminoácido leucina, assim

como os sinais dos restantes protões alifálicos da molécula.

Figura 3.11 - Espectro de 1H-RMN do híbrido final 3.8 (espectro efectuado em CDCl3).

3.1.5 - Actividade antimalárica in vitro

Foi determinada a actividade antiplasmódica in vitro destes híbridos C10-carba na

estirpe W2 do Plasmodium falciparum, assim como a actividade inibitória da FP-2 e FP-3

(Tabela 3.2). São também apresentados os valores de log P teóricos calculados para estes

compostos.

Relativamente aos híbridos C10-carba 3.7 e 3.8 com a unidade

dipeptidilvinilsulfona, os resultados obtidos demonstram que à semelhança dos híbridos

C10-oxa apresentam melhor actividade antimalárica na estirpe W2, na ordem dos nM,

comparativamente à artemisinina. Os valores de IC50 para estes híbridos são semelhantes

aos obtidos para os compostos C10-oxa, parecendo indicar que apesar de terem linkers

com diferentes grupos funcionais, não se verifica diferença significativa entre os dois

tipos de híbridos relativamente à sua actividade antimalárica in vitro. Estes resultados

parecem indicar que a unidade artemisinina exerce a sua função, tanto nos híbridos

C10-oxa e C10-carba e que não está dependente do tipo de linker existente. Verificou-se

que o híbrido 3.7 contendo o grupo fenilo ligado à unidade sulfona exibe pior actividade

do que 3.8 que contém a metilsulfona. Este resultado não é consistente com o verificado

anteriormente para os derivados C10-oxa, em que menor actividade antimalárica era

NH

SNH

O

O

O

O

O

O

O

O N

CH3

1

3

7

6

9

4

2

8

5

10


111

obtida para os derivados contendo a unidade metilsulfona. Estes dados reforçam a ideia

de que não existe qualquer relação entre o substituinte da unidade vinilsulfona e os

valores de IC50 para a estirpe W2.

Tabela 3.2 - Actividade antimalárica in vitro para os híbridos C10-carba da artemisinina.

Composto

R

IC50 ± SD

log Pa W2 /

nM

FP-2 /

µM

FP-3 /

µM

3.7 Ph 5,54 ± 0,020 1,16 ± 0,10 0,810 ± 0,29 5,20

3.8 Me 3,09 ± 0,38 2,84 ± 0,49 1,26 ± 0,070 4,29

3.9 OEt 15,3 ± 0,57 ND ND 4,21

3.10 N(Me)Ph 3,82 ± 0,13 ND ND 5,39

ART -- 8,95 ± 1,6 -- --

CQ -- 42,6 ± 3,3 -- --

E64 -- 1943,5 ± 3,5 0,110 ± 0,03 0,170

SD - Desvio Padrão; ND - Não Determinado; ART - Artemisinina; CQ - Cloroquina; a - valores calculados

com base no programa ALOGPS 2.1 227

Nos híbridos 3.9 e 3.10 contendo a unidade vinilsulfonato e vinilsulfonamida,

respectivamente, verificou-se que o último apresenta melhor actividade antimalárica do

que o vinilsulfonato em relação à estirpe W2, possivelmente como consequência da maior

lipofília, de acordo com os valores de log P, à semelhança do que ocorria para os híbridos

C10-oxa do ácido artelínico.

Comparativamente aos derivados C10-carba sintetizados, pode-se afirmar que o

híbrido 3.9 com a unidade vinilsulfonato foi o que apresentou menor actividade

antimalárica, sendo de todos, o composto menos lipofílico, com base no valor de log P

obtido. No Gráfico 3.1 podem-se ver os valores de IC50 em função do log P dos híbridos,

não se verificando qualquer correlação entre eles.


112

Gráfico 3.1 - Correlação entre o log P e o valor de IC50 para os híbridos C10-carba.

Relativamente à inibição de FP-2 e FP-3, verifica-se pelo valor de IC50 na ordem

dos µM, que estes compostos não são tão bons inibidores como o E64, apesar de

conterem a sequência ideal Leu-hPhe para o reconhecimento enzimático. Analisando os

dados obtidos para 3.7 e 3.8, pode-se afirmar que parece não haver ligação entre a

actividade inibitória da falcipaína e o grupo substituinte da unidade vinilsulfona, uma vez

que nos híbridos C10-oxa a melhor inibição da FP-2 foi obtida para o derivado com o

grupo metilo ligado à unidade sulfona, não se verificando o mesmo nestes híbridos.


Estudou-se a estabilidade química e enzimática dos compostos em PBS e em

plasma humano, a 37ºC. Esta avaliação da estabilidade foi efectuada por HPLC-UV e a

metodologia utilizada está descrita no capítulo da Parte Experimental.

Utilizou-se como eluente uma mistura de água e acetonitrilo e o comprimento de

onda escolhido para estes estudos de HPLC-UV foi dependente do híbrido em causa. Da

análise dos cromatogramas, conseguiu-se visualizar o desaparecimento do pico referente

ao híbrido em questão, mas não foi possível identificar o aparecimento de outro pico. Na

Figura 3.12 são apresentados dois cromatogramas elucidativos (t0 e t14) do estudo em

plasma para o híbrido 3.10 (tr ∼ 9,58 min), assim como o gráfico que representa o

desaparecimento deste substrato.

0

4

8

12

16

20

4 4,5 5 5,5

IC50

/ n

M

log P

3.7

3.8 3.10

3.9

Figura 3.12 - Representação gráfica que demonstra o desaparecimento de

função do tempo (estudos em plasma, 37ºC).

Os valores de kobs obtidos

apresentados na Tabela 3.3

Tabela 3.3 - Valores de kobs

pH 7,4 e plasma humano, a 37ºC.

Híbrido

R

3.7 a Ph

3.8 b

Me

3.9 a OEt

3.10 a N(Me)Ph

a - λ= 230 nm

Estes híbridos C10

artelínico, apresentaram-se

apresentar tempos de semi

9,5

10,5

11,5

12,5

Ln

Áre

a

t0


Representação gráfica que demonstra o desaparecimento de 3.10

função do tempo (estudos em plasma, 37ºC).

obtidos para a estabilidade destes híbridos e os respectivos t

3.

NH

SNH

O

O

O

O

O

O

O

O R

e t½ obtidos para os híbridos C10-carba em tampão fosfato isotónico

a 37ºC.

Eluente kobs/ h-1

%

H2O

%

ACN

PBS Plasma

Humano

PBS

25 75 estável 3,38 × 10-1 >500

25 75 estável 4,17 × 10-2 >500

30 70 2,16 × 10-2 5,22 × 10

-1 32

30 70 estável 2,44 × 10-2 >500

= 230 nm; b - λ= 223 nm

-carba, à semelhança dos híbridos C10-oxa derivados do ácido

se estáveis em PBS, com os compostos

tempos de semi-vida superiores a 500 horas. Porém, o híbrido

R² = 0,97

9,5

10,5

11,5

12,5

0 20 40 60 80

Tempo/h

carba da artemisinina

113

3.10 (tr=9,59 min) em

e os respectivos t½ estão

em tampão fosfato isotónico

t½ / h

PBS Plasma

Humano

500 2,10

500 16,6

32 1,30

500 28,4

derivados do ácido

compostos 3.7, 3.8 e 3.10 a

Porém, o híbrido 3.9, com a

t14


114

unidade vinilsulfonato apresentou uma constante de velocidade de 2,16×10-2

h-1

,

correspondente a um tempo de semi-vida de 32 horas, bastante mais rápido do que os

outros derivados C10-carba.

Relativamente à estabilidade em plasma, analisando os derivados com a unidade

vinilsulfona, ou seja, 3.7 e 3.8, e comparando-os com os respectivos análogos C10-oxa,

2.12c e 2.12e, verifica-se que em ambos os híbridos, a constante de velocidade é superior

nos derivados contendo a unidade fenilvinilsulfona do que na presença da

metilvinilsulfona. Os híbridos C10-carba apresentam menor estabilidade em plasma do

que os híbridos C10-oxa do ácido artelínico. Apesar destes últimos compostos conterem

uma função acetal, mais susceptível de hidrólise, e um sistema aromático ligado ao

carbonilo da amida, tornando-o mais reactivo, verificou-se que em plasma humano estes

híbridos são mais estáveis. Existem algumas razões que podem justificar este facto, como

por exemplo, o mecanismo de degradação destes derivados não ocorrer na zona do linker

ou a possibilidade de os híbridos C10-carba por algum motivo ficarem ligados às proteínas

do plasma, o que faz diminuir a sua detecção no HPLC-UV. Tentaram-se correlacionar os

resultados obtidos de estabilidade com a lipofilia (Gráfico 3.2), porém não se verifica

qualquer correlação entre os valores de log kobs e o log P. Verificou-se, tal como nos

híbridos anteriores, que o composto menos lipofílico, 3.9, é aquele que apresenta maior

constante de velocidade.

Gráfico 3.2 - Correlação entre o log P e o valor de log kobs para os híbridos C10-carba.

Em conclusão, foi desenvolvido um método de síntese para compostos híbridos da

artemisinina e vinilsulfonas dipeptídicas. Estes compostos demonstraram ser potentes

agentes antiplasmódicos e bons inibidores das falcipaínas-2 e -3, além de serem

quimicamente e metabolicamente estáveis.

-2

-1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0

4 4,5 5 5,5

log

kob

s

log P

3.7

3.8

3.9

3.10

CAPÍTULO IV

Híbridos de artemisinina e primaquina


116


117

4.1 - Síntese de híbridos de artemisinina e primaquina

Uma vez que a artemisinina actua apenas na fase sanguínea do Plasmodium e

sendo a primaquina o único fármaco aprovado que actua na fase hepática do Plasmodium

vivax, incluindo os hipnozoítos, a incorporação destas duas unidades numa só entidade,

pode originar novos híbridos que podem contribuir para a erradicação da malária. Foram

sintetizados híbridos C10-oxa e C10-carba da artemisinina ligada covalentemente à

primaquina através de um linker com função amida ou amina.

NH

O

O

O

O

O

O

NH

N

MeO

NH

O

O

O

O

O

NH

N

MeO

4.1 4.2

NH NH

N

MeO

O

O

O

O

O

NH NH

N

MeO

O

O

O

O

4.3 4.4

Os compostos com a ligação amida, 4.1 e 4.3 são obtidos a partir do acoplamento

do grupo amina terminal da primaquina com o correspondente derivado C10-oxa, 2.1, ou

C10-carba, 3.6, ambos na forma de ácido carboxílico. A reacção de acoplamento é

efectuada através de uma activação prévia com o agente TBTU.

Na síntese dos híbridos com a ligação amina, 4.2 e 4.4, o processo escolhido de

aminação redutiva, requer a presença de um grupo funcional aldeído para reacção com a

amina. Como descrito anteriormente no sub-capítulo 2.1.3 para os compostos 2.7, os

derivados com o grupo funcional aldeído vão ser sintetizados via a amida de Weinreb, a

partir do respectivo derivado ácido carboxílico.


118

4.1.1 - Híbridos C10-oxa de artemisinina e primaquina

Estes híbridos C10-oxa são derivados do ácido artelínico, 2.1, em que a ligação da

primaquina 1.44 será efectuada via ligação amida, 4.1, ou amina, 4.2. No caso da síntese

do híbrido 4.1, a reacção baseia-se no acoplamento entre o ácido artelínico e a primaquina

na forma de sal difosfato, na presença de TBTU e TEA (Esquema 4.1), tendo-se obtido um

rendimento máximo de 72% no último passo reaccional.

NH NH

N

OMe

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OH

NH2 NH

N

OMe

i)

2 H3PO4 .

+

Esquema 4.1 – Reacção de acoplamento entre o ácido artelínico e a primaquina difosfato para

obtenção de 4.1. Reagentes e condições: i) TBTU, TEA, DMF, t.a..

Para a síntese do híbrido 4.2, com a ligação amina entre os dois farmacóforos, a

química efectuada foi mais complexa.

Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a obtenção de aminas, tais como o

rearranjo de Curtius ou Hofmann, a redução de amidas e de grupos nitro e a aminação

redutiva, entre outros 240

. A aminação redutiva de compostos carbonílicos é um dos

métodos mais eficazes em química orgânica para obter diversas aminas. A reacção de um

aldeído com uma amina primária ou secundária na presença de um agente redutor, através

da formação de uma imina ou sal de imínio intermédio, origina a formação da amina in

situ. Esta reacção permite a conversão da função carbonilo numa amina, através do

tratamento directo da mistura reaccional contendo o composto carbonílico e a amina com

o agente redutor, num único passo, sem isolar o intermédio imina ou sal de íminio. Vários

hidretos metálicos têm sido utilizados na literatura para efectuar esta reacção. O

cianoboro hidreto de sódio (NaBH3CN) na redução de Borch 285-287

, o borohidreto de

sódio (NaBH4) 288-290

e o triacetoxiboro hidreto de sódio (NaBH(OAc)3) 164, 288, 291

são os

hidretos mais vulgarmente utilizados na aminação redutiva. Estes agentes redutores

apesar de serem largamente utilizados têm algumas desvantagens: a) o NaBH3CN é pouco

eficaz quando a imina é difícil de se formar, além de libertar o ião cianeto tóxico; b) a

eficácia do NaBH(OAc)3 é limitada na presença de compostos carbonílicos aromáticos;

2.1 1.44 4.1


119

c) o NaBH4 apesar de ser económico, é mais reactivo do que os agentes anteriores, e pelo

facto de reduzir aldeídos e cetonas a alcoóis, é importante garantir que a formação da

imina está completa antes da sua adição 292-293

.

Na aminação redutiva de aldeídos e cetonas, embora o pH ideal seja entre 6-8,

foram executadas com sucesso reacções a valores de pH baixo (pH=4) e alto (pH=10). O

único requisito parece ser a presença de um meio rico em protões e de um agente secante,

como peneiros moleculares, para absorver a água formada durante a reacção. De acordo

com a literatura, o meio geralmente é acidificado com ácido acético glacial ou então com

uma mistura contendo ácido clorídrico gasoso em metanol 285, 289

.

A função ácido carboxílico do ácido artelínico 2.1 foi transformada no respectivo

aldeído, originando o composto 4.5, obtido através da amida de Weinreb intermédia 4.6

(Esquema 4.2).

O

O

O

O

O

H

O

OH

i)O

O

O

O

O

H

O

NMe

OMe

O

O

O

O

O

H

O

Hii) b)

ii) a)

Esquema 4.2 - Síntese do derivado aldeído 4.5. Reagentes e condições: i) TBTU, TEA, DCM,

N,O-dimetilhidroxilamina.HCl, t.a., ii) a)LiAlH4, THF seco, 0ºC, b) KHSO4 (solução aquosa).

Testaram-se várias condições experimentais para a reacção de aminação redutiva,

de modo a obter um melhor rendimento para a síntese do híbrido 4.2. (Tabela 4.1). A

ordem de adição dos reagentes foi sempre a mesma, ou seja, ao aldeído dissolvido

adicionou-se a primaquina e posteriormente adicionou-se o agente redutor.

2.1 4.6 4.5


120

Tabela 4.1 - Condições reaccionais para a reacção de aminação redutiva.

Nº Eq.a Agente

Redutor

Solvente Agente

Secante

Eq.

HA b

ηηηη / %

1 1+1+2 NaBH3CN MeOH MgSO4 anidro - 26

2 1+1+3,5 NaBH3CN DCM MgSO4 anidro - 14

3 1+1+2 NaBH3CN DCM + MeOH Peneiros

moleculares

- 12

4 1+1,1+1,1 NaBH3CN MeOH Peneiros

moleculares

1 39

5 1+1,1+1,1 NaBH(OAc)3 MeOH Peneiros

moleculares

1 30

6 1+1,1+1,65 NaBH(OAc)3 MeOH Peneiros

moleculares

1 39

a - Equivalentes de cada reagente por ordem de adição;

b - Equivalentes de ácido acético glacial;

O rendimento máximo da reacção (Esquema 4.3) foi de 39% no último passo, com ambos

os agentes redutores, NaBH3CN e NaBH(OAc)3, após purificação por cromatografia em

placas preparativas de sílica-gel.

NH NH

N

OMe

O

O

O

O

O

H

O

O

O

O

O

H

O

H

NH2 NH

N

OMe

i)+

Esquema 4.3 - Síntese do híbrido 4.2, através da reacção de aminação redutiva entre o aldeído

4.5 e a primaquina neutra 1.44. Reagentes e condições: i) NaBH(OAc)3, CH3COOH, peneiros

moleculares, MeO, t.a..

Outro método alternativo para a síntese de aminas descrito na literatura é a

redução de amidas com hidreto de alumínio e lítio (LiAlH4) 294-298

. Com o objectivo de se

conseguir sintetizar o derivado 4.2 com maior rendimento, efectuaram-se várias tentativas

de redução da amida no híbrido 4.1 com LiAlH4 em tetrahidrofurano (THF) seco, mas

nunca se conseguiu obter o derivado pretendido.

4.5 1.44 4.2


121

4.1.2 - Híbridos C10-carba de artemisinina e primaquina

Na síntese do híbrido 4.3, partiu-se do derivado C10-carba com o ácido carboxílico

sintetizado anteriormente, 3.6, e efectuou-se o acoplamento com a primaquina na forma

de sal, como indicado no Esquema 4.4, tendo-se obtido um rendimento máximo de 66%.

NH NH

N

OMe

O

O

O

O

H

O

NH2 NH

N

OMe

i)O

O

O

O

CH3

CH3

O

OH

2 H3PO4 .

+

Esquema 4.4 - Síntese do híbrido 4.3, através da reacção de acoplamento entre o derivado ácido

C10-carba 3.6 e o difosfato de primaquina. Reagentes e condições: i) TBTU, TEA, DMF, t.a..

Para o híbrido 4.4, efectuou-se a aminação redutiva entre o derivado C10-carba

aldeído 4.7 e a primaquina neutra (Esquema 4.5).

NH NH

N

OMe

O

O

O

O

H

NH2NH

N

OMe

i)O

O

O

O

CH3

CH3

O

H+

Esquema 4.5 - Síntese do híbrido 4.4, através da reacção de aminação redutiva entre o aldeído

4.7 e a primaquina neutra 1.44. Reagentes e condições: i) NaBH3CN, CH3COOH, peneiros

moleculares, MeOH, t.a.

Várias condições experimentais foram testadas na reacção de aminação redutiva, para

obter o melhor rendimento para a síntese do híbrido 4.4 (Tabela 4.2). A ordem de adição

dos reagentes é a mesma utilizada anteriormente, ou seja, a primaquina foi adicionada ao

aldeído e posteriormente adicionou-se o agente redutor.

3.6 1.44 4.3

4.7 1.44 4.4


122

Tabela 4.2 - Condições reaccionais para a reacção de aminação redutiva.

Nº Eq.a Agente

Redutor

Solvente Agente

Secante

Eq.

HA b

ηηηη \ %

1 1+1,1+1,1 NaBH3CN MeOH Peneiros moleculares 1 34

2 1+1+2 NaBH3CN DCM + MeOH MgSO4 anidro 2 15

3 1+1,1+2,5 NaBH(OAc)3 DCM - 2,5 63

a - Equivalentes de cada reagente por ordem de adição;

b - Equivalentes de ácido acético glacial;

Para esta reacção obteve-se um rendimento máximo de 63% com o agente redutor

NaBH(OAc)3.

O composto 4.7 foi sintetizado pela via amida de Weinreb, 4.8, como se pode ver

no Esquema 4.6.

OH

O

O

O

O

H

O

H

O

O

O

O

H

O

N

O

O

O

O

H

OCH3

OMe

i) ii)

Esquema 4.6 - Síntese do derivado aldeído 4.7. Reagentes e condições: i) TBTU, TEA, DCM,

N,O-dimetilhidroxilamina.HCl, t.a., ii) a)LiAlH4, THF seco, 0ºC, b) KHSO4 (solução aquosa).

Na obtenção do derivado 4.7, a partir da dihidroartemisinina, têm de ser

efectuados cinco passos reaccionais. Para reduzir o número de etapas reaccionais,

aumentar o rendimento global e diminuir o tempo necessário para a sua síntese, foi

utilizado outro método de síntese alternativo. No Esquema 4.7 encontra-se este método

alternativo no qual se efectua uma reacção de ozonólise 175, 299-301

.

H

O

O

O

O

H

O

O

O

O

O

H

i)

Esquema 4.7 - Reacção de ozonólise. Reagentes e condições. i) O3, PPh3, DCM, -78ºC.

3.6 4.8 4.7

3.4 4.7


123

A reacção de ozonólise foi efectuada no Instituto Superior Técnico, no grupo do

Professor Carlos Afonso, que cedeu as condições necessárias para a sua execução. Esta

reacção foi efectuada, fazendo borbulhar ozono (O3) no meio reaccional contendo o

derivado alilo. O ozono, um dos oxidantes mais fortes conhecidos, foi obtido por descarga

eléctrica em ambiente de oxigénio, num aparelho denominado ozonizador. A

trifenilfosfina (PPh3) foi usada como agente redutor, para transformar o ozonido instável

no aldeído desejável. O rendimento obtido para o composto aldeído 4.7 a partir do

derivado alilo 3.4, através da ozonólise foi de 87%, enquanto a síntese pelo primeiro

método originou um rendimento global de 32%.


Os compostos sintetizados foram caracterizados com recurso a várias técnicas

espectroscópicas, nomeadamente RMN, espectrometria de massa de alta resolução,

análise elementar e IV. Relativamente à espectroscopia de IV, verificou-se a presença das

seguintes bandas:

a) a cerca de 937 cm-1

e atribuída à ligação O-O da ponte peroxídica na unidade

artemisinina,

b) a 1702 e 1722 cm-1

, atribuídas ao carbonilo do aldeído no derivado C10-oxa,

4.5, e no derivado C10-carba, 4.7, respectivamente,

c) a cerca de 1252 e 1188 cm-1

e atribuídas às ligações C-N e C-O,

respectivamente, na amida de Weinreb C10-carba, 4.8,

d) a 1639, 1610, 1578 e 1519 cm-1

, atribuídas às ligações C=C e C=N, originando

o quarteto característico do sistema quinolínico,

e) a 1636 e 1667 cm-1

, relativa ao grupo carbonilo da função amida nos híbridos

4.1 e 4.3, respectivamente. Verificou-se a ausência desta banda nos híbridos 4.2 e 4.4,

com a função amina,

f) a 3500-3300 cm-1

, atribuída a νN-H da amida ou da amina, nos híbridos finais.


Na síntese dos híbridos C10-oxa artemisinina-primaquina existem alguns aspectos

espectroscópicos de RMN merecedores de discussão. São eles:


124

a) Protões quinolínicos

A reactividade não usual nos protões quinolínicos, levou alguns grupos a estudar

este sistema e para tal foram desenvolvidos estudos espectroscópicos de RMN. Verificou-

se que estes protões, principalmente em C5 e C7, exibiam diferenças no espectro de RMN,

dependentes do solvente e do pH, e que estavam relacionadas com a velocidade de troca

com o átomo de deutério 302-305

. O espectro de 1H-RMN apresentado na Figura 4.1

corresponde à primaquina neutra em acetonitrilo deuterado (CD3CN), mas foi igualmente

realizado o espectro do difosfato de primaquina em dimetilsufóxido (d6-DMSO), e todos

os protões quinolínicos apresentaram o mesmo desvio químico e desdobramento, apesar

da diferença de solvente. O protão quinolínico H2 é o mais desblindado, com um desvio

químico de 8,54 ppm, pela sua proximidade ao átomo de azoto electronegativo. Em

relação à multiplicidade, H2 apresenta-se como um duplo dupleto (J = 1,6 e 4,0 Hz),

devido ao acoplamento com os protões em C3 e C4. Os protões H5 e H7 por estarem na

vizinhança do grupo metoxilo, são por sua vez os que se encontram menos desblindados,

a 6,47 e 6,31 ppm, respectivamente, e originam um dupleto com J = 2,4 Hz, em

consequência do acoplamento entre ambos. Os valores obtidos das constantes de

acoplamento encontram-se de acordo com a literatura 239

(Jorto = 6-10 Hz e Jmeta = 1-3 Hz),

com excepção do valor de J obtido para o acoplamento entre H2 e H3 inferior ao esperado,

devido ao facto de H2 estar adjacente ao átomo de azoto, que pela sua electronegatividade

altera o comportamento magnético. É de salientar que no espectro de 1H-RMN

apresentado, além do sistema quinolínico, consegue-se também visualizar o singuleto

largo referente ao NH da amina secundária.

Através da realização dos espectros de HMQC e HMBC foi possível identificar os

carbonos do sistema quinolínico, sendo C6 o carbono com maior valor de desvio químico

(159,5 ppm), pela sua ligação ao grupo metoxilo.

Figura 4.1 - Espectro parcial de

efectuado em CD3CN).

É interessante verificar que no espectro de

referente aos protões H4

anteriormente (Figura 4.2

aromáticos H4 e H5, apesar de tal acoplamento não ter sido verificado no espectro de

COSY. Este comportamento

observado para os outros derivados

Figura 4.2 – Padrão de desdobramento obtido para os protões quinolínicos H

4.3 (espectro efectuado em CDCl

H4 H2

H4

H2

J2,3= 4,0 HzJ2,4=1,6 Hz

H4

J4,3

J4,2


Espectro parcial de 1H-RMN da primaquina (protões quinolínicos)

É interessante verificar que no espectro de 1H-RMN do híbrido

4 e H5 apresenta um desdobramento diferente dos referidos

2). O sinal obtido parece indicar acoplamento entre os protões

pesar de tal acoplamento não ter sido verificado no espectro de

Este comportamento foi também observado para 4.4 mas

para os outros derivados, durante as várias sínteses efectuadas.

Padrão de desdobramento obtido para os protões quinolínicos H

espectro efectuado em CDCl3).

H3

H

NH NH

N

MeO

O

O

O

O

O

45

3

2

NH

N

MeO

NH2

2

3

45

7

H4

4,3= 8,2 Hz

4,2=1,6 Hz

H3

J3,4= 8,2 HzJ3,2=4,0 Hz

H


125

rimaquina (protões quinolínicos) (espectro

RMN do híbrido 4.3, o sinal

apresenta um desdobramento diferente dos referidos

. O sinal obtido parece indicar acoplamento entre os protões

pesar de tal acoplamento não ter sido verificado no espectro de

mas nem sempre foi

, durante as várias sínteses efectuadas.

Padrão de desdobramento obtido para os protões quinolínicos H4 e H5, no híbrido

H5 H7

H5

NH

H5 e H7

J5,7= J7,5=2,4 Hz


126

b) Quiralidade e protões diastereotópicos

A primaquina possui um carbono quiral em C1´ e a sua utilização como mistura

racémica, na presença dos carbonos quirais de estereoquímica fixa da artemisinina, pode

originar uma mistura de diastereoisómeros dos compostos híbridos sintetizados. Na

purificação dos híbridos, foi observada a existência de duas manchas quase sobrepostas e

quando isoladas por cromatografia em placa preparativa, verificou tratar-se do híbrido

final em ambas, com base nos espectros de RMN obtidos. Na Figura 4.3 apresenta-se o

espectro do híbrido 4.3 e além do multipleto atribuído ao protão do carbono quiral C1´ da

primaquina a 3,65 ppm, é possível ver a atribuição dos protões diastereotópicos. Os

protões metilénicos em C2´ adjacentes ao carbono quiral da primaquina são

diastereotópicos e magneticamente diferentes. O sinal destes dois protões aparece

sobreposto ao sinal dos protões metilénicos em C3´, aparecendo como um multipleto.

Apesar de estarem afastados do carbono quiral C1´, os protões metilénicos em C4´ também

são magneticamente não equivalentes, originando dois multipletos a desvios químicos

diferentes. Porém, é interesssante verificar que na primaquina neutra, o sinal destes

protões em C4´ aparece como um tripleto a 2,63 ppm e com uma constante de

acoplamento de J = 6,8Hz.

Figura 4.3 - Parte do espectro de 1H-RMN do híbrido 4.3, e atribuição dos protões

diastereotópicos (espectro efectuado em CDCl3).

NH NH

N

MeO

O

O

O

O

O

1´2´

3´

4´5´

H1´ H4´ H4´

H5´

H5´

H3´

H2´


127

É de referir que os sinais não identificados na Figura 4.3, pertencem à estrutura da

artemisinina e estão atribuídos no capítulo do Procedimento Experimental.

c) Linker amida e amina

Por espectroscopia de RMN confirmaram-se os grupos amida e amina do linker,

utilizado na ligação covalente entre as unidades primaquina e artemisinina dos diferentes

híbridos. Apresentam-se na Figura 4.4 a) e b) os espectros de 1H-RMN dos híbridos 4.1 e

4.2, onde é possível verificar as principais diferenças existentes. Em ambos os espectros

foi possível identificar os protões quinolínicos e os protões característicos da

artemisinina, nomeadamente H9, H10, H12 e os grupos metilo. O protão H1´ do carbono

quiral da primaquina foi também identificado nos dois espectros a cerca de 3,7 ppm como

um multipleto, verificando-se o seu acoplamento com o grupo metilo e com a amina

secundária directamente ligada, através dos espectros de COSY. Nos espectros

apresentados, estão evidenciadas a sombreado as três principais diferenças existentes

entre os dois híbridos. Primeiro, pode-se ver o desaparecimento do sinal característico dos

protões aromáticos do sistema AA´BB´ de 4.1 para 4.2, devido à introdução do grupo

metilénico. Este grupo CH2 do linker provoca menor alteração no ambiente magnético

dos protões aromáticos, relativamente ao grupo carbonilo existente anteriormente. Em

segundo lugar, é possível visualizar os protões metilénicos da nova ligação CH2 formada

em 4.2, que aparecem como um singuleto a 3,8 ppm, sinal não existente em 4.1. A

atribuição deste sinal foi possível através dos espectros de HMBC e HMQC, verificando-

se o acoplamento destes protões com o carbono C4´ da primaquina (49,0 ppm), com os

carbonos aromáticos (128,3 e 137,4) e com o carbono metilénico (53,3 ppm). No espectro

de 13

C-RMN do híbrido 4.2 foi igualmente possível verificar o desaparecimento do sinal

do carbono carbonílico a 167,3 ppm. Finalmente, em relação aos protões diastereotópicos

da primaquina, detectou-se também alteração no desvio químico dos protões H4´, que pelo

facto de estarem ligados a uma amina em 4.2, aparecem mais blindados (2,74-2,64 ppm).

No híbrido 4.1, estes protões diastereotópicos aparecem como um multipleto entre 3,60-

3,43 ppm.


128

Figura 4.4 - Espectros de 1H-RMN dos híbridos 4.1 e 4.2, onde são evidenciadas nas zonas a

sombreado, as principais diferenças entre os dois compostos (espectro efectuado em CDCl3).

NH

O

O

O

O

O

NH

N

MeO

4.2

b)

NH

O

O

O

O

O

O

NH

N

MeO

a)

4.1


129

4.1.4 - Actividade antimalárica para a fase sanguínea

4.1.4.1 - Estudos in vitro

A actividade antiplasmódica destes derivados foi testada in vitro na estirpe W2 do

Plasmodium falciparum, resistente à cloroquina, e expressa em IC50. Estes estudos foram

desenvolvidos no grupo do Professor Phillip Rosenthal (Department of Medicine, San

Francisco General Hospital, University of California, San Francisco, USA). Na Tabela 4.3

podem-se ver os resultados obtidos da actividade antimalárica in vitro e os valores de log

P, para os híbridos artemisinina-primaquina sintetizados.

Tabela 4.3 - Actividade antimalárica (PfW2) para os híbridos artemisinina-primaquina.

Híbridos da artemisinina-primaquina

PfW2

log Pb IC50 ± SD/ nM

NH

O

O

O

O

O

O

NH

N

MeO

4.1

5,10 ± 0,40

5,75

NH

O

O

O

O

O

NH

N

MeO

4.2

12,5 ± 1,1

5,88

NH NH

N

MeO

O

O

O

O

O

4.3

9,10 ± 0,60

5,25

NH NH

N

MeO

O

O

O

O

4.4

9,30 ± 0,30

5,34

ART 8,20 ± 0,90 2,90

PQ 3300 ± 55 2,76

SD - Desvio Padrão; b

- calculado através do programa ALOGPS 2.1 227

; ART - artemisinina;

PQ - primaquina


130

Analisando os resultados obtidos para a actividade in vitro para a fase sanguínea

do Plasmodium falciparum, podemos afirmar que os híbridos com a função amida

apresentam melhor actividade comparativamente aos que contêm a função amina entre os

dois farmacóforos, sendo esta diferença bastante mais acentuada nos híbridos C10-oxa do

que nos C10-carba. De uma maneira geral, os híbridos mantêm a actividade da

artemisinina para a fase sanguínea, sendo que o híbrido 4.1 se mostrou cerca de duas

vezes mais activo. É de referir a fraca actividade da primaquina nestes estudos in vitro na

fase sanguínea, o que seria de esperar, uma vez que este fármaco não é activo contra os

parasitas nesta fase.

A terapia combinada destes dois fármacos, artemisinina e primaquina, apresentou

uma redução substancial da infecção por P. falciparum em doentes na Tailândia.

Verificou-se também que existe um aumento da potência da artemisinina, quando esta é

administrada em ratinhos infectados, conjuntamente com compostos que actuam a nível

da mitocôndria, como a primaquina, tetraciclinas e clindamicinas 108, 306

.

Os compostos híbridos apresentam uma maior lipofilia do que a artemisinina e a

primaquina. Como seria de esperar, os híbridos C10-oxa 4.1 e 4.2, derivados do ácido

artelínico, apresentam maior lipofilia do que os derivados C10-carba 4.3 e 4.4,

verificando-se também que os que contêm a função amida são menos lipofílicos do que os

que têm o grupo funcional amina. A diferença de lipofilia não é suficientemente

significativa para se poder retirar qualquer tipo de conclusão entre a actividade

antimalárica e a lipofilia.

4.1.4.2 - Estudos in vivo

O estudo in vivo destes híbridos foi efectuado no IMM (Instituto de Medicina

Molecular), Faculdade de Medicina de Lisboa, sob a orientação do Doutor Miguel

Prudêncio e da Doutora Maria Mota. Até ao momento, apenas os derivados 4.2 e 4.3

foram completamente estudados in vivo, estando os restantes híbridos ainda em fase de

estudo. É de referir que apesar de na literatura existirem híbridos da primaquina com

outros farmacóforos 307, 308

, até ao momento estes nunca foram estudados in vivo e in vitro

nas fases sanguínea e hepática do Plasmodium. Para este estudo foram utilizados ratinhos

C57BL/6 e a actividade dos compostos híbridos foi comparada com a primaquina e a

artemisinina administradas isoladamente ou em mistura equitativa 309

. Os valores de IC50

obtidos para a inibição do crescimento do parasita foram determinados utilizando o


131

software GraphPad Prism, através dos valores da percentagem de parasitémia em função

da concentração de inibidor, relativamente a controlos efectuados com DMSO. Nos

ensaios in vivo foi igualmente comparada a actividade dos híbridos por administração

oral, subcutânea ou intraperitoneal.

Administração subcutânea

Os ratinhos foram infectados por via intraperitoneal com células eritrocíticas

contaminadas com esporozoítos de Plasmodium berghei. Estes esporozoítos foram

obtidos a partir de mosquitos fêmea Anopheles stephensi e expressam a GFP (Green

Fluorescent Protein). Esta proteína exibe várias propriedades favoráveis, nomeadamente,

a emissão de fluorescência na zona verde do espectro visível, podendo ser facilmente

monitorizada e quantificada in vivo, elevada versatilidade em diversos estudos e baixa

toxidade. O gene que codifica esta proteína, pode ser introduzido em diversos

organismos, como o caso do Plasmodium 310, 311

. Além da técnica de fluorescência,

também foi utilizada a citometria de fluxo para medir a GFP expressa pelo P. berghei. A

citometria de fluxo permite a contagem, análise e classificação de partículas

microscópicas suspensas em meio líquido através da detecção óptica e electrónica de

espécies fluorescentes. Após infecção, a parasitémia nos ratinhos foi monitorizada

diariamente até se atingir 2 a 3% de eritrócitos infectados, altura a partir da qual foram

tratados diariamente, durante 4 dias, com os híbridos 4.2, 4.3 e com a artemisinina. A

dose de 4.2 e 4.3 injectada nos ratinhos por via subcutânea foi de 31,8 µmol/kg

(equivalente a 9 mg/ kg de artemisinina), sendo esta a dose correspondente ao valor de

ED90, descrita para a artemisinina com este tipo de administração309

. Em relação ao

ensaio controlo, os ratinhos foram administrados com igual quantidade de solvente

(DMSO). Após monitorização diária, verificou-se o aumento da parasitémia e a morte dos

ratinhos controlo, entre 7 a 8 dias após a infecção, enquanto os ratinhos tratados com os

três compostos administrados exibiram uma diminuição da parasitémia. A parasitémia

desceu para valores perto de zero para todos os ratinhos, a cerca de 9 dias após a infecção,

porém o seu reaparecimento foi verificado 12 a 13 dias após a infecção, para os ratinhos

tratados com a artemisinina e o híbrido 4.2, respectivamente, acabando por morrer

(Figura 4.5 a)). A morte provavelmente terá sido consequência de hiperparasitémia, uma

vez que não foram detectados sintomas de malária cerebral. No tratamento com o híbrido


132

4.3, não se verificou o reaparecimento da infecção e os ratinhos tiveram uma taxa de

sobrevivência de 100% (Figura 4.5 b)).


intraperitoneal de eritrócitos infectados com esporozoítos (106) que expressam a GFP. O

tratamento por administração subcutânea dos compostos nos ratinhos, foi iniciado quando a

parasitémia no sangue atingiu 2-3% e foi continuado diariamente durante 4 dias. a) Percentagem

de ratinhos livres de parasitémia sanguínea, monitorizada por citometria de fluxo; b)

Percentagem de ratinhos vivos durante o estudo, desde o início do tratamento até ao fim da

experiência.

Administração oral

A eficácia destes híbridos foi também determinada por administração oral. Os

ratinhos C57BL/6 (N=5) foram infectados por administração i.v. com esporozoítos de

P. berghei que expressam GFP e o tratamento foi iniciado quando o nível de parasitémia

atingiu 2 a 3%. Os híbridos 4.2, 4.3 e uma mistura equitativa de artemisinina e

primaquina (31,8 µmol/kg) foram administrados aos ratinhos, diariamente e oralmente

durante 10 dias. Após monitorização diária da parasitémia, sintomas e sobrevivência dos

a)

b)


133

ratinhos, o híbrido 4.3 exibiu melhores resultados comparativamente aos obtidos para a

mistura artemisinina e primaquina. Na Figura 4.6 pode-se ver a evolução do tratamento in

vivo, após administração oral dos dois híbridos em ratinhos com infecção sanguínea por

P. berghei. Estes resultados estão de acordo com os obtidos por administração subcutânea

e demonstram que estes híbridos podem ser administrados oralmente no tratamento da

doença. É de salientar que todos os ratinhos utilizados no ensaio controlo acabaram por

morrer de sintomas relacionados com a malária cerebral, entre 7 a 8 dias após a infecção.

Os dois híbridos, especialmente 4.3, podem ser utilizados para controlar a infecção

na fase sanguínea, com maior eficácia do que a artemisinina isolada ou numa mistura 1:1

com a primaquina.


intravenosa de esporozoítos (105) que expressam a GFP. O tratamento por administração oral

dos compostos nos ratinhos, foi iniciado quando a parasitémia no sangue atingiu 2-3% e foi

continuado diariamente durante 10 dias. a) Evolução dos parasitas na fase sanguínea,

monitorizada por citometria de fluxo; b) Curva de sobrevivência, exibindo a percentagem de

ratinhos vivos durante a experiência.

a)

b)


134

Assim, relativamente à actividade na fase sanguínea destes dois híbridos,

verificou-se que o híbrido 4.3 exibe um valor de IC50 in vitro inferior ao do híbrido 4.2,

sendo também mais eficaz in vivo na fase sanguínea, por administração subcutânea e oral,

indicando a existência de uma estabilidade e de propriedades farmacocinéticas mais

favoráveis.

4.1.5 - Actividade para a fase hepática

4.1.5.1 - Estudos in vitro

As células hepáticas Huh7 humanas utilizadas neste estudo foram obtidas de uma

cultura em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino, 1% de aminoácidos não essenciais,

1% de penicilina-estreptomicina, 1% glutamina e 10mM HEPES (pH 7) e mantidas a

37ºC sob 5% de CO2. Quando estas células atingiram cerca de 60% de confluência, foram

incubadas com os compostos a estudar durante 1 hora, tempo após o qual se efectuou a

sua infecção através de adição directa de esporozoítos P. berghei obtidos das glândulas

salivares dos mosquitos, ao meio de cultura. Os esporozoítos adicionados expressam a

proteína GFP ou a enzima luciferase. Esta enzima catalisa várias reacções biológicas na

presença do substracto luciferina, transformando a energia química em energia luminosa e

através da medição da luminescência, permite a análise de vários eventos intracelulares,

sem destruição celular. O meio existente foi substituído 24 horas após infecção por novo

meio contendo os compostos a estudar.

Nos ensaios com esporozoítos que expressam a luciferase, após a sua adição às

células Huh7 incubadas com igual quantidade de cada híbrido ou da mistura equitativa

primaquina-artemisinina, a quantificação da infecção após 48 horas foi efectuada através

da medição da luminescência, após lise celular. Os efeitos na proliferação celular foram

determinados por medição da fluorescência após 1,5 horas de incubação com alamarBlue.

Os resultados obtidos demonstraram que os compostos 4.2 (IC50 = 155 nM) e 4.3

(IC50 = 523 nM) têm efeitos inibitórios potentes, exibindo valores de IC50 cerca de 66 e

18 vezes, respectivamente, inferiores aos obtidos para a mistura primaquina-artemisinina

(IC50 = 9714 nM) (Figura 4.7, d)). O tratamento com a artemisinina não demonstrou

qualquer efeito inibitório na infecção, a nível da fase hepática, como seria de esperar. É

importante salientar, que nas concentrações testadas, nenhum dos híbridos demonstrou

qualquer efeito na proliferação das células Huh7, com base nas medições de fluorescência

com alamarBlue, o que demonstra que não apresentam efeitos tóxicos sobre as células

utilizadas (Figura 4.7, a), b)


híbridos 4.2 e 4.3. Os híbridos foram adicionados às células Huh7, 1 hora antes da infecção

esporozoítos que expressam a luciferase. O

DMSO equivalente à concentração superior de híbrido utilizada.

(linhas vermelhas nos gráficos

esporozoítos P. berghei e a taxa de infecção foi medida

actividade da luciferase por luminescência

a) híbrido 4.2; b) híbrido 4.3

obtidos para os híbridos 4.2

Em relação aos estudos efectuados com esporozoítos que expressam a GFP, a

citometria de fluxo efectuada determinou que os compostos

primaquina-artemisinina causam uma diminuição do desenvolvimento do parasita,

dependente da dose, com base nos valores obtidos para as intensidades

da GFP nas células infectadas

0

50

100

150

0 0,05 0,1 0,15 0,25

Infe

cçã

o(%

de

co

ntr

olo

)

Concentração (µM)

Híbrido 4.2

0

50

100

150

0 0,5 1 2,5 5 10Infe

cçã

o(%

de

co

ntr

olo

)


Primaquina +

a)

c)


, o que demonstra que não apresentam efeitos tóxicos sobre as células

b), c)).

Resultados da inibição in vitro após infecção hepática por P. berghei, para os

Os híbridos foram adicionados às células Huh7, 1 hora antes da infecção

esporozoítos que expressam a luciferase. O ensaio controlo foi efectuado com um volume de

concentração superior de híbrido utilizada. A confluência das células

(linhas vermelhas nos gráficos a), b) e c)) foi determinada 48 horas após a adição de

esporozoítos P. berghei e a taxa de infecção foi medida de seguida através da quantificação da

actividade da luciferase por luminescência, após lise celular e adição do substracto luciferina

4.3; c) mistura 1:1 de primaquina-artemisinina;

e 4.3 e para a mistura 1:1 de primaquina-artemisinina.


de fluxo efectuada determinou que os compostos 4.2,

artemisinina causam uma diminuição do desenvolvimento do parasita,

dependente da dose, com base nos valores obtidos para as intensidades

ectadas (Figura 4.8, a), b), c)).

0

25

50

75

100

125

0,25 0,5 1

Co

nfl

uê

nci

a(%

de

co

ntr

olo

)

(µM)

4.2

0

50

100

150

0 0,1 0,25 0,5 1 2,5Infe

cçã

o(%

de

co

ntr

olo

)


Híbrido 4.3

0

25

50

75

100

125

10 20 30

Co

nfl

uê

nci

a(%

de

co

ntr

olo

)

(µM)

+ Artemisinina

0

50

100

0 2

Infe

cçã

o(%

de

co

ntr

olo

)

Concentração

4.2; IC50

4.3; IC50

PQ+ART; IC

b)

d)


135

, o que demonstra que não apresentam efeitos tóxicos sobre as células


Os híbridos foram adicionados às células Huh7, 1 hora antes da infecção com

trolo foi efectuado com um volume de

A confluência das células

) foi determinada 48 horas após a adição de

através da quantificação da

, após lise celular e adição do substracto luciferina.

artemisinina; d) valores de IC50

artemisinina.


, 4.3 e a mistura

artemisinina causam uma diminuição do desenvolvimento do parasita,

dependente da dose, com base nos valores obtidos para as intensidades de fluorescência

0

25

50

75

100

125

2,5 5 10

Co

nfl

uê

nci

a(%

de

co

ntr

olo

)

(µM)

4.3

4 6

Concentração (nM)

50 = 155 nM

50 = 523 nM

PQ+ART; IC50 = 9714 nM


136

Deste modo, estes híbridos actuam através da inibição da replicação intracelular

dos parasitas, tal como verificado anteriormente para a primaquina. O composto

exibiu também uma modesta inibição da invasão celular pelos parasitas, como verificado

pela medição da taxa de infecção 4 horas após a adição dos parasitas às células hepáticas

(Figura 4.8, b)). Apesar dos valores de IC

serem cerca de 1,5 a 2,5 vezes superiores aos determinados por luminescência, ambos têm

a mesma eficácia relativa e indicam que o híbrido

efeito inibitório bastante mais acentuado do que a mistura

(IC50 = 14676 nM) .

Figura 4.8 - Resultados da inibição in vitro após infecção

híbridos 4.2 e 4.3. Os híbridos foram adicionados às células Huh7, 1 hora antes da infecção com

esporozoítos que expressam a GFP

da GFP no P. berghei por citometria

esporozoítos P. berghei e a taxa de infecção foi medida

luminescência. a) híbrido 4.2;

valores de IC50 obtidos para os híbridos

artemisinina.

0

50

100

150

0 0,2 0,6 1,5

GF

P. 4

8 h

ora

sa

pó

sin

fecç

ão

(% d

e c

on

tro

lo)


Híbrido 4.2

0

50

100

150

0 5 10 20

GF

P, 4

8 h

ora

sa

pó

sin

fecç

ão

(% d

e c

on

tro

lo)


Primaquina + Artemisinina

a)

c)



, tal como verificado anteriormente para a primaquina. O composto



. Apesar dos valores de IC50 determinados ((Figura 4.8, d)) po


e indicam que o híbrido 4.2 (IC50 = 415 nM)

efeito inibitório bastante mais acentuado do que a mistura primaquina


. Os híbridos foram adicionados às células Huh7, 1 hora antes da infecção com

GFP. O ensaio controlo foi efectuado com DMSO.

da GFP no P. berghei por citometria de fluxo foi determinada 48 horas após a adição de

esporozoítos P. berghei e a taxa de infecção foi medida 4 horas após a infecção,

; b) híbrido 4.3; c) mistura 1:1 de primaquina-

obtidos para os híbridos 4.2 e 4.3 e para a mistura 1:1 de primaquina

0

25

50

75

100

125

1,5

Ta

xad

e i

nfe

cçã

o,

4 h

ora

sa

pó

s

infe

cçã

o(%

de

co

ntr

olo

)

0

50

100

150

0 1 5 10

GF

P, 4

8 h

ora

sa

pó

sin

fecç

ão

(% d

e c

on

tro

lo)


Híbrido 4.3

0

25

50

75

100

125

20

Ta

xad

e i

nfe

cçã

o,

4 h

ora

sa

pó

s

infe

cçã

o,

(% d

e c

on

tro

lo)

Artemisinina

0

50

100

0 2 4Cre

scim

en

to(%

de

co

ntr

olo

)

Concentração (nM

0.1 10

4.2; IC50 = 415 nM

4.3; IC50 = 1334 nM

PQ + ART; IC50

b)

d)


, tal como verificado anteriormente para a primaquina. O composto 4.3



por este método


= 415 nM) apresenta um

primaquina-artemisinina

hepática por P. berghei, para os

. Os híbridos foram adicionados às células Huh7, 1 hora antes da infecção com

. A determinação

oi determinada 48 horas após a adição de

4 horas após a infecção, por

-artemisinina; d)

e para a mistura 1:1 de primaquina-

0

25

50

75

100

125

Ta

xad

e i

nfe

cçã

o,

4 h

ora

sa

pó

s

infe

cçã

o,

(% d

e c

on

tro

lo)

6

nM)

1000

= 415 nM

= 1334 nM

= 14676 nM


137

Os híbridos 4.1 e 4.4 foram também testados in vitro em células Huh7, de modo

semelhante ao descrito anteriormente. Os compostos foram adicionados 1 hora antes da

infecção às células hepáticas, que posteriormente foram infectadas com 105 esporozoítos

de P. berghei que expressam a GFP. A confluência das células e a percentagem de

infecção foi medida por fluorescência 46 horas após a infecção. Estes estudos

preliminares indicam que os híbridos 4.1 e 4.4, nas duas concentrações mais altas testadas

(5 µM e 10µM), exibem maior actividade de inibição da infecção do que a primaquina em

igual quantidade, chegando-se a atingir uma percentagem de células infectadas

praticamente nula. Contudo, o nível de confluência celular para estas concentrações é

significativamente menor para estes híbridos, o que revela alguma toxicidade por parte

dos mesmos (Figura 4.9).

Todos os híbridos sintetizados e testados in vitro na fase hepática demonstram

elevada actividade como esquizonticidas tecidulares, actuando sobre as células

parasitárias na fase hepática da infecção.


híbridos 4.1 e 4.4. Os híbridos foram adicionados às células Huh7, 1 hora antes da infecção com

esporozoítos que expressam a GFP. O ensaio controlo foi efectuado com DMSO. A confluência

das células está representada nos gráficos através de pontos vermelhos. A percentagem de

infecção foi determinada através da medição da fluorescência.

DMSO PQ 10µM 4.1 10µM 4.4 10µM

DMSO 4.4 4.4 4.4 4.1 4.1 4.1 PQ

0,1µM 1µM 5µM 0,1µM 1µM 5µM 10µM


138

4.1.5.2 - Estudos in vivo

Administração intraperitoneal

No estudo da actividade in vivo sobre a fase hepática, os híbridos 4.2 e 4.3 foram

administrados por via intraperitoneal na dose de 26,5 µmol/kg (equivalente a 12 mg/kg de

primaquina), 3 horas após a infecção. A infecção foi efectuada por injecção intravenosa

com 104 esporozoítos de P. berghei que expressam a luciferase em ratinhos C57BL/6

(N=6). A carga parasitária no fígado foi determinada nas 42 horas seguintes à infecção,

através da medição da actividade da luciferase. Para esta determinação, os ratinhos foram

injectados subcutaneamente com D-luciferina dissolvida em PBS e cinco minutos depois

foram anestesiados com injecção intraperitoneal de xilazina (20 mg/kg) e cetamina

(120 mg/kg) dissolvidas em PBS. As medições da bioluminescência (fotões/segundo) nos

fígados dos ratinhos foram efectuadas 10 minutos após a injecção da D-luciferina e os

resultados foram expressos em percentagem em relação ao ensaio controlo efectuado com

DMSO. Com este estudo verificou-se uma diminuição substancial da carga parasitária no

fígado dos ratinhos tratados com os híbridos 4.2 e 4.3, embora este efeito não seja tão

acentuado como o obtido para a primaquina (Figura 4.10, a)).

0

50

100

150

PQ RC40 RC44 DMSO

Pa

rasi

tém

iaH

ep

áti

ca(%

de

con

tro

lo)

a)

PQ 4.3 4.2 DMSO PQ 4.3 4.2 DMSO

Figura 4.10 - Resultados da

hepática por P. berghei, para os híbridos

intraperitoneal aos ratinhos, 3 horas após a infecção

luciferase. O ensaio controlo foi efectuado com DMSO

pela medição da bioluminescência

médio; amarelo-alto; vermelho

híbridos 4.2, 4.3 e para a primaquina

b) O aparecimento de parasitas no sangue foi monitorizado diariamente, a partir do segundo dia

de infecção.

Os híbridos foram também administrados durante a fase hepática, de modo a

verificar o seu efeito na parasitémia

esporozoítos P. berghei que expressam a GFP e 3 horas mais tarde os híbridos e a

primaquina foram injectados por via intraperitoneal (26,5 µg/kg).

aparecimento de sintomas

híbrido 4.3 não teve qualquer efeito na infecção, a administração de

hepática provocou a demora ou prevenção no aparecimento dos parasitas

sanguínea, de um modo similar ao obtido para a primaquina (

resultados são consistentes com as eficácias relativas

estes híbridos contra a infecção hepática

Ra

tin

ho

s n

eg

ati

vo

s (%

)

b)


Resultados da carga parasitémia in vivo no fígado dos ratinhos após

hepática por P. berghei, para os híbridos 4.2 e 4.3. Os híbridos foram administrados

intraperitoneal aos ratinhos, 3 horas após a infecção com esporozoítos que expressam a

controlo foi efectuado com DMSO e a actividade da luciferase foi efectuada

pela medição da bioluminescência. a) Níveis de luminescência nos ratinhos:

alto; vermelho-muito alto. Percentagem de parasitémia hepática obtida para os

e para a primaquina e controlo. As barras de erro representam

O aparecimento de parasitas no sangue foi monitorizado diariamente, a partir do segundo dia

s híbridos foram também administrados durante a fase hepática, de modo a

verificar o seu efeito na parasitémia. Para tal, os ratinhos foram infectados com

que expressam a GFP e 3 horas mais tarde os híbridos e a

ectados por via intraperitoneal (26,5 µg/kg). A parasitémia e o

aparecimento de sintomas foram monitorizados diariamente. Verificou

não teve qualquer efeito na infecção, a administração de

a demora ou prevenção no aparecimento dos parasitas

, de um modo similar ao obtido para a primaquina (Figura

resultados são consistentes com as eficácias relativas in vitro obtidas anteriormente para

tra a infecção hepática (Figura 4.7)).

0

25

50

75

100

2 6 10 14

Ra

tin

ho

s n

eg

ati

vo

s (%

)

Dias após infecção e tratamento


139

carga parasitémia in vivo no fígado dos ratinhos após infecção

administrados por via

com esporozoítos que expressam a

da luciferase foi efectuada

Níveis de luminescência nos ratinhos: azul-fraco; verde-

de parasitémia hepática obtida para os

As barras de erro representam o desvio padrão;

O aparecimento de parasitas no sangue foi monitorizado diariamente, a partir do segundo dia

s híbridos foram também administrados durante a fase hepática, de modo a

. Para tal, os ratinhos foram infectados com

que expressam a GFP e 3 horas mais tarde os híbridos e a

A parasitémia e o

Verificou-se que enquanto o

não teve qualquer efeito na infecção, a administração de 4.2 durante a fase

a demora ou prevenção no aparecimento dos parasitas na corrente

Figura 4.10, b)). Estes

obtidas anteriormente para


140

Administração oral

Além da eficácia do híbrido 4.2 por administração intraperitoneal, a actividade dos

compostos in vivo, foi também testada por administração oral, em comparação com uma

mistura equimolar de primaquina-artemisinina. Foram administradas 4 doses orais de

65,9 µmol/kg (equivalentes a 30 mg/kg de primaquina) de cada híbrido, 30 minutos,

15 horas, 23 horas e 39 horas após a infecção dos ratinhos com esporozoítos P. berghei

que expressam a GFP. A carga parasitária foi determinada 44 horas após a infecção por

PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitativo em tempo real (Figura 4.11, a)) e os

resultados obtidos estão concordantes com os obtidos por administração intraperitoneal,

com o híbrido 4.2 a eliminar quase por completo a infecção hepática. Finalmente, os

ratinhos foram infectados com esporozoítos P. berghei que expressam a GFP e tratados

após 4 horas com uma dose oral única de 65,9 µmol/kg dos híbridos, seguindo-se a

monitorização diária da parasitémia no sangue. Não foi detectada qualquer parasitémia

nos ratinhos tratados com a mistura primaquina-artemisinina (Figura 4.11, b)),

provavelmente devido à actividade antimalárica da primaquina na fase hepática. No final

da experiência verificou-se que quatro dos seis ratinhos tratados com o híbrido 4.2

apresentaram também a inexistência de parasitémia no sangue, sendo de realçar que deste

grupo de ratinhos, três deles apresentavam parasitas no sangue no dia 5 após a infecção,

mas que foram totalmente eliminados, sugerindo que o híbrido permanece na circulação

sanguínea o tempo suficiente para eliminar os parasitas ou que pode existir algum tipo de

resposta imunitária.

0,25

0,5

0,75

1

1,25

0

0,005

0,01

DMSO PQ-AS PQ RC40 RC44

a)

Car

ga p

aras

itária

hep

átic

a (%

de

cont

rolo

)

DMSO PQ+ART PQ 4.3 4.2

125

100

75

50

25 1

0.5

0


141

Figura 4.11 - Resultados da inibição da infecção in vivo na fase hepática por P. berghei, através

da administração oral dos híbridos 4.2 e 4.3. Os ratinhos C57BL/6 (N=6) foram infectados por

injecção intravenosa de esporozoítos (105) que expressam a GFP. a) Os ratinhos foram tratados

por administração oral dos híbridos, na quantidade e nos tempos mencionados no texto. A carga

parasitária hepática foi determinada por PCR quantitativo em tempo real, 44 horas após a

infecção; b) Os ratinhos foram tratados com administração oral única dos híbridos, na

quantidade e nos tempos mencionados no texto e o aparecimento dos parasitas no sangue foi

monitorizado diariamente. Percentagem de ratinhos com parasitémia após o início do

tratamento.

Os híbridos artemisinina-primaquina estudados exibem uma potente acção

antiplasmódica durante a fase hepática da infecção, em particular o híbrido 4.2, tanto in

vitro como in vivo. O facto da artemisinina não exibir qualquer acção na fase hepática,

sugere que estas moléculas híbridas constituem uma modificação na primaquina que

potencia o seu efeito, tornando-a mais eficaz, com base nos resultados obtidos da inibição

da infecção na fase hepática.


Devido à existência de inúmeros metabolitos da primaquina, a maior parte

formados a nível hepático, efectuou-se o estudo da estabilidade destes híbridos da

artemisinina-primaquina em microssomas de fígado de rato, de modo a prever a

degradação destes compostos. Os microssomas utilizados (BD Gentest™) foram

extraídos de ratos machos Sprague-Dawley e por conterem enzimas do citocromo P450 e

outras enzimas dependentes de NADPH, foi necessário adicionar um sistema gerador de

b)


142

NADPH. A certificação da actividade enzimática dos microssomas indicada pelo

fabricante, foi determinada através da medição da actividade da enzima CYP2E1. A

quantificação da enzima CYP2E1 foi realizada através de ensaios espectrofotométricos,

que determinaram a quantidade de enzima hidroxilase presente nos microssomas,

responsável pela hidroxilação do p-nitrofenol a p-nitrocatecol (Esquema 4.8) 312, 313

.

OH

NO2

OH

NO2

OHCYP2E1

p-nitrofenol hidroxilase

Esquema 4.8 - Transformação enzimática de p-nitrofenol a p-nitrocatecol, através de

CYP2E1.

Foi obtida para a enzima CYP2E1 uma actividade experimental de 1040

pmol/(mg×min), valor de acordo com as especificações indicadas para os microssomas

pelo fornecedor (880 pmol/(mg×min)). Os detalhes deste procedimento encontram-se no

capítulo da Parte Experimental.

Para o estudo da estabilidade, colocou-se determinada concentração de cada

híbrido na presença dos microssomas de fígado de rato e de sistema gerador de NADPH

em PBS, a 37 ºC. A determinação da degradação dos híbridos foi analisada por HPLC-

UV em ensaios triplicados e a média das constantes de velocidade obtidas, tempos de

semi-vida e eluentes utilizados encontram-se na Tabela 4.4. Nos compostos com o grupo

funcional amina, 4.2 e 4.4, foi necessário utilizar um eluente cuja fase aquosa era

constituída por tampão fosfato, pH=3,11. O procedimento experimental detalhado para

estes estudos de estabilidade encontra-se descrito no capítulo da Parte Experimental.

Tabela 4.4 - Valores de kobs e t½ obtidos, assim como o eluente utilizado, para os híbridos

artemisinina-primaquina.

Derivado Eluente

kobs / h-1

t½ / h F. Aquosa / % F. Orgânica / %

4.1ª H2O / 30 ACN/ 70 7,40×10-3

94

4.2b Tampão Fosfato / 50 ACN/ 50 8,07×10

-3 86

4.3ª H2O / 30 ACN/ 70 1,30×10-2

53

4.4c Tampão Fosfato/ 50 ACN/ 50 1,60×10

-2 42

a - λ= 264 nm;

b - λ= 230 nm;

c - λ= 270 nm


143

Os resultados obtidos demonstram que estes híbridos da artemisinina-primaquina

se degradam na presença de microssomas de fígado de rato, com base no desaparecimento

gradual do pico relativo ao híbrido. Porém, não foi visualizado o aparecimento de

qualquer outro tipo de pico no decorrer destes estudos. Observou-se também que os

híbridos C10-oxa, 4.1 e 4.2, são mais estáveis do que os híbridos C10-carba, 4.3 e 4.4, em

microssomas de fígado de rato e que em cada um destes tipos, os híbridos com o linker

amina, 4.2 e 4.4, são menos estáveis do que os que têm o linker amida, 4.1 e 4.3. As

enzimas microssomais dependentes de NADPH catalizam reacções de Fase I em amidas e

aminas. A N-oxigenação e a N-desalquilação ocorrem em amidas e aminas, e a

N-hidroxilação e a desaminação oxidativa ocorre exclusivamente em aminas, sendo estas

últimas mais susceptíveis à metabolização microssomal Em compostos contendo

heteroátomos, a oxidação ocorre preferencialmente nos carbonos adjacentes, geralmente

com formação de um intermediário instável e originando a desalquilação do composto de

partida. Na ausência de hidrogénios no carbono adjacente ao heteroátomo, pode ocorrer

oxigenação directa do heteroátomo, com formação de N-hidroxilaminas nas aminas

primárias e secundárias ou N-óxidos nas aminas terciárias 151

. Este comportamento está

de acordo com os resultados de estabilidade obtidos, pois os híbridos 4.2 e 4.4, devido à

presença da amina secundária em vez do grupo amida em 4.1 e 4.3, são metabolizados

mais rapidamente, justificando o valor superior de kobs.

Relativamente aos híbridos artemisinina-primaquina e com base nos diversos

estudos efectuados, obtiveram-se os seguintes resultados:

a) o híbrido 4.1 foi o único que exibiu um valor de IC50 in vitro inferior ao da

artemisinina na fase sanguínea,

b) todos os híbridos sintetizados e estudados in vitro na fase hepática, exibiram maior

actividade antimalárica do que a primaquina, sugerindo que a eficácia da primaquina é

aumentada pela introdução do farmacóforo artemisinina,

c) os híbridos 4.2 e 4.3 reduzem significativamente in vitro a carga parasitária a nível

hepático, após injecção intravenosa de esporozoítos, embora este efeito seja inferior ao

obtido para a primaquina,

d) redução significativa da parasitémia in vivo e in vitro, na fase hepática, principalmente

pelo híbrido 4.2,


144

e) quando administrado oralmente, verificou-se que o híbrido 4.2 era eficaz na fase

sanguínea in vivo, apesar de não ser tão potente como a mistura artemisinina-primaquina

1:1, possivelmente devido a uma biodisponibilidade reduzida, que é compensada pela

eficácia pronunciada na fase hepática e sanguínea.

f) os híbridos sofrem degradação pelas enzimas presentes nos microssomas de fígado de

rato, sendo os híbridos com linker amida mais estáveis do que os que têm o linker amina.

A ligação covalente entre a unidade da artemisinina e da primaquina originou

estes híbridos com elevada eficácia no tratamento da infecção na fase hepática

(principalmente 4.2) e na fase sanguínea (principalmente 4.3). Para a relação

estrutura-actividade ficar completa falta estudar e comparar todos os híbridos sintetizados

na fase sanguínea e hepática in vitro e in vivo. Estes estudos estão em progresso e espera-

se que com estes resultados se possam obter híbridos com actividade nas fases hepáticas e

sanguínea do ciclo do parasita, superiores aos fármacos mãe.

CAPÍTULO V

Conclusões

Conclusões

146

Conclusões

147

5 - Conclusões

Todos os derivados foram sintetizados com rendimentos satisfatórios e a

estereoquímica atribuída aos derivados 10-α e 10-β foi obtida com base nos valores das

constantes de acoplamento obtidas nos espectros de 1H-RMN e encontra-se de acordo

com o descrito na literatura.

Dos derivados aminoacilo sintetizados, alguns foram testados na estirpe W2 de

Plasmodium falciparum. O derivado 2.3c exibiu melhor actividade antimalárica do que a

artemisinina e o ácido artelínico, tendo-se verificado uma relação entre a actividade

antimalárica e o aumento da lipofilia.

Todos os híbridos C10-oxa testados, tanto os derivados do ácido artelínico como

do ácido artesúnico exibiram actividade antimalárica na ordem de grandeza de nM (2,08 -

5,34 nM), sendo mais activos do que a própria artemisinina, 1.1, (12,0 nM) e equipotentes

ao ácido artelínico, 2.1, (5,66 nM) e ao arteméter, 1.5, (6,77 nM) para a estirpe W2.

Alguns destes híbridos C10-oxa foram também testados em outras estirpes de Plasmodium

falciparum, tendo igualmente demonstrado melhor actividade comparativamente à

artemisinina. O mesmo resultado se obteve para os híbridos C10-carba, onde os valores de

IC50 obtidos (3,09 - 5,54 nM) foram inferiores aos obtidos para a artemisinina (8,95 nM),

com excepção do composto híbrido dipeptidilvinilsulfonato de etilo, 3.9, que demonstrou

um valor de IC50 de 15,34 nM. De um modo geral, verificou-se que existe para estes

híbridos C10-oxa e C10-carba uma relação directa entre a actividade antimalárica e a

lipofilia.

Relativamente à inibição da protease de cisteína, falcipaína-2, os valores de IC50

para estes derivados C10-oxa e C10-carba foram na ordem dos µM (0,35-22,4 µM), tendo-

se obtido melhor inibição desta enzima para o derivado do ácido artelínico com a

dipeptidilvinilsulfona Leu-hPhe-VSMe, 2.12e (IC50=0,35 µM) e do ácido artesúnico com

Leu-hPhe-VSPh, 2.18 (IC50=0,9 µM). Comparando os valores obtidos para os híbridos

C10-oxa e C10-carba relativamente à inibição da FP-2, verificou-se melhor inibição para o

derivado C10-oxa 2.12e com a dipeptidilvinilsulfona Leu-hPhe-VSMe, enquanto nos

derivados C10-carba o melhor resultado de inibição foi obtido para o híbrido 3.7 com a

dipeptidilvinilsulfona Leu-hPhe-VSPh. Estes resultados parecem indicar não haver

qualquer tipo de relacionamento entre o substituinte da unidade vinilsulfona e a inibição

da protease falcipaína-2. Apesar destes híbridos conterem a sequência dipeptídica ideal

Conclusões

148

para o reconhecimento molecular desta protease de cisteína, os valores na ordem dos µM,

sugerem a necessidade de um maior estudo de SAR, de modo a entender o funcionamento

das unidades artemisinina e dipeptidilvinilsulfona covalentemente ligadas através destes

tipos de linker. Verificou-se igualmente que os híbridos mais lipofílicos exibem maior

actividade de inibição desta protease.

Relativamente aos híbridos artemisinina-primaquina sintetizados, o composto 4.1

foi o único que exibiu um valor de IC50 in vitro inferior ao da artemisinina na fase

sanguínea. Os híbridos 4.2 e 4.3 foram estudados in vitro na fase hepática e exibiram

acentuada actividade antimalárica com valores de IC50 inferiores ao obtido para a

primaquina, sugerindo que a eficácia da primaquina é aumentada pela introdução do

farmacóforo artemisinina. Notou-se também que estes híbridos reduzem

significativamente a parasitémia a nível hepático nos ratinhos após injecção intravenosa

de esporozoítos, embora este efeito não seja tão pronunciado como na primaquina. Na

análise in vivo dos híbridos estudados, é de salientar uma diminuição na eficácia,

comparativamente aos resultados in vitro, devido a factores inerentes aos ensaios in vivo,

como biodisponibilidade e estabilidade metabólica, entre outros. A actividade pode ser

limitada pelo facto de os compostos necessitarem de atravessar várias barreiras antes de

atingir o vacúolo do parasita, dentro dos hepatócitos. Dos dois híbridos estudados, 4.3

demonstrou in vitro e in vivo, com administração oral e intraperitoneal, ser o mais eficaz a

controlar a parasitémia. Quando administrado oralmente verificou-se que este híbrido não

era tão potente como a mistura artemisinina-primaquina 1:1, possivelmente devido a uma

biodisponibilidade reduzida, que é compensada pela eficácia pronunciada na fase hepática

e sanguínea. Por estas razões, este híbrido é um composto promissor no tratamento da

malária por P. vivax. A ligação covalente entre a unidade da artemisinina e da primaquina

originou estes dois híbridos com elevada eficácia no tratamento da infecção na fase

hepática (principalmente 4.2) e na fase sanguínea (principalmente 4.3). Apesar dos

valores in vitro obtidos para a estirpe W2 do Plasmodium falciparum serem semelhantes,

não é evidente a diferença de actividade existente nestes dois híbridos relativamente às

fases em que actuam. As explicações para este facto podem estar relacionadas com

diferenças na estabilidade entre os híbridos e na sua afinidade para as células eritrocíticas

e hepáticas. Estas duas moléculas são assim possíveis híbridos com inibição nas fases

hepáticas e sanguínea.

Assim, foram sintetizados quatro híbridos, dois deles com uma ligação C10-oxa

(amida, 4.1, e amina, 4.2) e outros dois com uma ligação C10-carba (amida, 4.3, e amina,

Conclusões

149

4.4). Os híbridos 4.2 e 4.3 foram estudados in vitro e in vivo na fase sanguínea e hepática,

mas para a relação estrutura-actividade ficar completa falta estudar todos os derivados

sintetizados tanto in vivo como in vitro na fase hepática e sanguínea. Estes estudos estão

em progresso e espera-se que com estes resultados se possam obter híbridos com

actividade nas duas fases do ciclo do parasita, superiores aos fármacos mãe.

Em relação aos estudos de estabilidade por HPLC-UV verificou-se que em

plasma, os híbridos C10-oxa e C10-carba dipeptidilvinilsulfona mais lipofílicos apresentam

menor velocidade de reacção e maior tempo de semi-vida. Estes híbridos são estáveis em

PBS com excepção do derivado C10-oxa do ácido artesúnico 2.18 e do derivado C10-carba

artemisinina-dipeptidilvinilsulfonato 3.9, que apresentam t1/2 de 51 e 32 horas,

respectivamente. Relativamente aos híbridos artemisinina-primaquina, verificou-se que

sofrem degradação pelas enzimas presentes nos microssomas de fígado de rato e os

resultados obtidos da estabilidade demonstraram que os híbridos C10-oxa são mais

estáveis (t½ = 86 e 94 h) comparativamente aos híbridos C10-carba (t½ = 53 e 42 h).

Verificou-se também que os híbridos com o linker amida (4.1 e 4.3) mais estáveis do que

os que têm o linker amina (4.2 e 4.4).

Face aos resultados obtidos para todos os derivados estudados, pode-se concluir

que foram sintetizados híbridos com actividade antimalárica superior à artemisinina, com

acção inibitória nas proteases de cisteína estudadas e com actividade na fase sanguínea e

hepática, esta última para os híbridos com a primaquina.

Conclusões

150

CAPÍTULO VI

Parte Experimental

Parte Experimental

152

Parte Experimental

153

6.1 - Equipamento

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de protão e de carbono foram

traçados num espectrómetro Bruker 400 Ultra-Shield, no Departamento de Química e

Bioquímica da Faculdade de Ciências de Lisboa, usando clorofórmio e acetonitrilo

deuterados como solventes. Os dados referentes a cada espectro encontram-se de acordo

com a seguinte norma: desvio químico (δ em ppm, partes por milhão), número de protões,

multiplicidade do sinal (sendo s (singuleto), sl (singuleto largo), d (dupleto), dl (dupleto

largo), dd (duplo dupleto), ddd (duplo duplo dupleto), dtd (dupleto de triplo dupleto), dt

(dupleto de tripletos), td (tripleto de dupletos), t (tripleto), q (quarteto), qd (quarteto de

dupletos) ou m (multipleto)) e constante de acoplamento (J em Hz). No espectro da

dihidroartemisinina as letras α e β entre parêntesis correspondem aos respectivos

isómeros.

Os espectros de massa de alta resolução foram efectuados na Universidade de

Santiago de Compustela, Espanha, num espectrómetro de massa quadrupolar Hewlett-

Packard, modelo HP5988A, através de impacto electrónico. Os espectros HPLC-MS e

MS-MS de baixa resolução foram executados na Faculdade de Farmácia de Lisboa, num

espectrómetro de massa Micromass Quattro Micro API, com fonte de ionização por

electrospray e software Masslynx V4.1.

As análises elementares foram realizadas em Santiago de Compustela, Espanha,

recorrendo ao analisador automático CE Instruments EA 1110.

Os espectros no infravermelho (IV) foram executados em espectrofotómetros

Nicolet Impact 400 FTIR e Shimadzu IRAffinity FTIR, sob a forma de filme em células

de cloreto de sódio ou sob a forma de pastilhas com brometo de potássio como suporte.

As bandas de absorção indicadas para cada compostos são as mais significativas.

Os espectros de ultravioleta (UV) foram efectuados num espectrofotómetro de

UV-Visível de feixe duplo Shimadzu UV-2100PC.

Os estudos de estabilidade foram realizados num sistema de Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (HPLC), utilizando um detector espectrofotométrico UV-VIS

Shimadzu SPD-6AV, de comprimento de onda variável, acoplado a uma bomba Lachrom

Merck-Hitachi L-7100, com um injector Rheodyne de 20 µl, um registador Chromato-

Integrator Merck-Hitachi D2500A e coluna Merck Lichrocart

RP-18, 250×4 mm com

partículas de 5 µm, com pré-coluna RP-18 da Merck. O aparelho utilizado para as leituras

Parte Experimental

154

de pH foi um potenciómetro micro pH 2002 Crison. Os pontos de fusão foram

determinados numa placa Kofler Bock Monoscop M e são apresentados sem correcção.

Cromatografia

Na separação cromatográfica em coluna utilizou-se sílica-gel 60 M de

granulometria 0,040-0,063 mm (Merck) e para a cromatografia em camada fina (TLC)

usaram-se placas de sílica-gel Merck Kieselgel F254 de espessura 0,25 mm. As placas de

TLC foram reveladas usando uma câmara CAMAG de UV (λ= 254 nm), câmara de iodo

ou uma mistura H2SO4:MeOH (1:1). Na cromatografia em placas preparativas, estas

foram preparadas no laboratório com sílica gel GF254 (Merck).

6.2 - Reagentes e Solventes

6.2.1 - Solventes

Foram utilizados solventes puros nas sínteses realizadas, bem como para a

purificações por cromatografia e recristalizações.

O tetrahidrofurano da Panreac foi purificado por refluxo de fio de sódio e

benzofenona (Merck), destilado e utilizado seguidamente na reacção. De igual modo os

solventes diclorometano, dicloroetano e metanol foram destilados de hidreto de cálcio e o

etanol com limalha de magnésio metálico e cristais de iodo.

Nos estudos de estabilidade por HPLC-UV, o acetonitrilo utilizado era

Lichrosolv

da Merck ou Panreac e a água desionizada obtida através da passagem de

água bidestilada numa resina de troca iónica Millipore, sendo recolhida com uma

resistividade de 18 mΩ cm-1

.

Os solventes deuterados utilizados (CDCl3 e ACN) eram da Cambridge Isotope

Laboratories, Inc., com um grau de pureza de 99,8%.

Parte Experimental

155

6.2.2 - Reagentes

A artemisinina utilizada no processo de síntese foi obtida através da empresa

Fraken Company, China, e apresenta um grau de pureza superior a 99%. Os restantes

reagentes utilizados de grau de pureza superior a 97% são da Merck, Alfa-Aesar ou

Sigma-Aldrich. A trietilamina foi destilada de hidróxido de potássio em lentilhas e

armazenada a 5ºC. O tampão fosfato, pH 7,4, foi preparado a partir de pastilhas

phosphate buffer saline (PBS) da Sigma.

6.3 - Síntese de híbridos C10-oxa de artemisinina e dipeptidilvinilsulfona

Foram sintetizados dois tipos de híbridos contendo a unidade

dipeptidilvinilsulfona covalentemente ligada ao ácido artelínico e ao ácido artesúnico

através de uma ligação C10-oxa.

6.3.1 - Síntese de híbridos C10-oxa do ácido artelínico

A síntese do ácido artelínico, 2.1, faz-se a partir da dihidroartemisinina, 1.4, obtida

por redução da artemisinina, 1.1.

Foi efectuada a identificação estrutural da artemisinina por diversas técnicas

espectrocópicas, com o objectivo de facilitar a interpretação dos espectros dos derivados

posteriormente sintetizados.

Artemisinina, 1.1

p.f.= 151-154 ºC

IV, νmáx/cm-1

2997, 2956, 1736, 1464, 1389, 1198, 1109, 990

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 5,86 (1H, s, H12), 3,45-3,34 (1H, m, H9), 2,49-2,37 (1H, m,

H4α), 2,10-1,95 (2H, m, H4β, H5α), 1,93-1,84 (1H, m, H8α), 1,82-1,72 (2H, m, H7β, H8a),

1,53-1,46 (1H, m, H5β), 1,44 (3H, s, C3-CH3), 1,43-1,31 (2H, m, H5a, H6β), 1,20 (3H, d,

J = 7,2 Hz, C9-CH3), 1,15-1,03 (2H, m, H7α, H8β), 0,99 (3H, d, J = 5,6 Hz, C6-CH3)

Parte Experimental

156

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 172,1 (C10), 105,4 (C3), 93,7 (C12), 79,5 (C12a), 50,1

(C5a), 44,9 (C8a), 37,5 (C6), 35,9 (C4), 33,6 (C7), 32,9 (C9), 25,2 (C3-CH3), 24,9 (C5), 23,4

(C8), 19,9 (C6-CH3), 12,6 (C9-CH3)

Dihidroartemisinina, 1.4

Colocou-se a artemisinina (1,77 mmol, 500 mg) em 25 ml de MeOH a 0-5ºC e

adicionou-se lentamente NaBH4 (13,2 mmol, 500 mg) durante 1,75 h. Após 1,25 h de

agitação adicional, neutralizou-se com ácido acético (780 µl) e evaporou-se parte do

MeOH sob vácuo. Diluiu-se com água fria (15 ml), agitou-se durante 15 min à

temperatura ambiente, e filtrou-se o sólido formado, tendo-se lavado os cristais com

H2O:MeOH (2:1) a 0-5ºC. Posteriormente dissolveram-se os cristais formados em DCM,

secou-se a fase orgânica com sulfato de sódio anidro e evaporou-se o solvente.

Sólido branco

η= 82%

p.f.= 152-155 ºC

IV, νmáx/cm-1

3368, 2942, 2860, 1450, 1375, 1191, 1020, 986

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 5,63 (1H, s, H12, (β)), 5,41 (1H, s, H12, (α)), 5,33 (1H, d,

J = 2,8 Hz, H10β), 4,77 (1H, d, J = 8,8 Hz, H10α), 3,20 (1H, sl, OH), 2,96 (1H, sl, OH),

2,69-2,58 (1H, m, H9, (β)), 2,47-2,29 (3H, m, H9, (α), H4α, (α/β)), 2,11-2,01 (2 H, m),

1,97-1,47 (12H, m), 1,46 (3H, s, C3-CH3), 1,45 (3H, s, C3-CH3), 1,41-1,22 (4H, m), 1,01-

0,95 (12H, m, C6-CH3, (α/β), C9-CH3, (α/β)), 1,08-0,85 (2H, m)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 104,4/104,1 (C3 (α/β)), 96,4/94,7 (C10 (α/β)), 91,2/87,8

(C12 (α/β)), 81,2/80,4 (C12a (α/β)), 52,5/51,5 (C7 (α/β)), 45,4/44,3 (C8a (α/β)), 37,5/37,4

(C6 (α/β)), 36,4/36,3 (C4 (α/β)), 34,8 (C9 (β)), 34,7/34,2 (C5a (α/β)), 30,8 (C9 (β)),

26,1/26,0 (C3-CH3 (α/β)), 24,8/24,7 (C5 (α/β)), 24,6/22,1 (C8 (α/β)), 20,4/20,3 (C6-CH3

(α/β)), 13,2/12,8 (C9-CH3 (α/β))

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 307,22

Parte Experimental

157

Ácido 10β-artelínico, 2.1

Colocou-se a dihidroartemisinina, 1.4, (0,885 mmol, 251 mg) em 35 ml de éter

etílico anidro à temperatura ambiente, sob atmosfera de azoto e adicionou-se BF3.Et2O

(1,015 mmol, 125 µl), seguida da adição do ácido 4-(hidroximetil)benzóico (1,33 mmol,

201 mg). A reacção foi seguida por TLC e após estar finalizada adicionou-se água

destilada (35 ml). Separaram-se as duas fases e a fase orgânica foi extraída três vezes com

30 ml de uma solução aquosa de Na2SO4 (30% m/v). Secou-se a fase orgânica resultante

com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente até à secura. A

purificação foi efectuada em coluna de cromatografia (AcOEt:n-hexano, 3:7).

Sólido branco

η= 69%

p.f.= 110-115 ºC

IV, νmáx/cm-1

3396, 3151, 2920, 1702, 1409, 1280, 1230, 1012, 871

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 8,12 (2H, d, J = 8,4 Hz, C6H4COOH), 7,44 (2H, d,

J = 8,4 Hz, OCH2C6H4), 5,48 (1H, s, H12), 5,01 (1H, d, J = 13,4 Hz, OCH2), 4,96 (1H, d,

J = 3,6 Hz, H10), 4,63 (1H, d, J = 13,4 Hz, OCH2), 2,79-2,76 (1H, m, H9), 2,47-2,34 (1H,

m, H4α), 2,12-2,02 (1H, m, H4β), 1,98-1,81 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,71-1,62 (1H, m, H7),

1,59-1,45 (2H, m, H5, H8a), 1,49 (3H, s, C3-CH3), 1,43-1,21 (2H, m, H5a, H6), 1,01 (3H,

d, J = 7,2 Hz, C9-CH3), 0,97 (3H, d, J = 6,4 Hz, C6-CH3), 0,95-0,87 (1H, m, H7)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 171,4 (C=O), 144,7 (CArCOOH), 130,2 (CAr), 128,3

(CH2CAr), 126,9 (CAr), 104,2 (C3), 101,7 (C10), 88,1 (C12), 81,1 (C12a), 69,2 (CH2C6H4),

52,5 (C5a), 44,3 (C8a), 37,4 (C6), 36,4 (C4), 34,6 (C7), 30,9 (C9), 26,2 (C3-CH3), 24,7 (C5),

24,6 (C8), 20,4 (C6-CH3), 13,1 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 441,29

6.3.2 - Síntese de derivados aminoacilo do ácido artelínico

Dissolveu-se o ácido artelínico, 2.1, (0,5 mmol) em DCM (4 ml) a 0-5ºC e

adicionou-se DCC (0,55 mmol). Após 20 minutos adicionou-se a mistura reaccional

contendo o éster do aminoácido pretendido (0,5 mmol) em DCM (3 ml) e TEA (0,5

mmol) e deixou-se a reacção à temperatura ambiente. Seguiu-se a reacção por TLC e após

Parte Experimental

158

estar completa, filtrou-se a ureia formada, evaporou-se o solvente e purificou-se por

coluna de cromatografia (AcOEt:éter de petróleo).

Ácido 10β-artelínico-PheOEt, 2.3a

Sólido branco

η= 84 %

p.f.= 67-70 ºC

IV, νmáx/cm-1

3310, 2930, 2855, 1744, 1639, 1450, 1375, 1277, 1157, 1099, 1030, 1011,

957, 939, 876, 826

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,73 (2H, d, J = 8,0 Hz, C6H4CO), 7,39 (2H, d, J = 8,0 Hz,

OCH2C6H4), 7,36-7,12 (5H, m, CAr-H), 6,60 (1H, d, J = 8,0 Hz, NH), 5,47 (1H, s, H12),

5,12-5,07 (1H, m, CH), 4,97 (1H, d, J = 12,0 Hz, OCH2), 4,94 (1H, d, J = 4,0 Hz, H10),

4,59 (1H, d, J = 12,0 Hz, OCH2), 4,24 (2H, q, J = 8,0 Hz, OCH2CH3), 3,35-3,22 (2H, m,

CH2C6H5), 2,76-2,66 (1H, m, H9), 2,46-2,33 (1H, m, H4α), 2,12-2,02 (1H, m, H4β), 1,96-

1,77 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,70-1,50 (3H, m, H7, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,39-

1,22 (2H, m, H5a, H6), 1,30 (3H, t, J = 8,0 Hz, OCH2CH3), 0,99 (3H, d, J = 7,2 Hz,

C9-CH3), 0,97 (3H, d, J = 6,4 Hz, C6-CH3), 0,95-0,87 (1H, m, H7)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 170,6 (C=O), 166,5 (C=O), 142,5 (CAr), 137,7 (CAr),

132,9 (CAr), 129,4 (CAr), 128,6 (CAr), 127,2 (CAr), 127,1 (CAr), 127,0 (CAr), 104,2 (C3),

101,6 (C10), 88,0 (C12), 81,1 (C12a), 69,2 (CH2C6H4), 61,7 (OCH2CH3), 53,5 (CH), 52,5

(C5a), 44,3 (C8a), 38,0 (CH2C6H5), 37,4 (C6), 36,4 (C4), 34,6 (C7), 30,9 (C9), 26,2

(C3-CH3), 24,7 (C5), 24,5 (C8), 20,3 (C6-CH3), 14,2 (OCH2CH3), 13,1 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 616,29

Ácido 10β-artelínico-GlyOEt, 2.3b

Óleo incolor

η= 68 %

IV, νmáx/cm-1

3354, 2924, 2874, 1749, 1651, 1502, 1375, 1202, 1159, 1101, 1030, 939,

876, 826


OCH2C6H4), 6,68 (1H, t, J = 4,8 Hz, NH), 5,47 (1H, s, H12), 4,97 (1H, d, J = 12,8 Hz,

Parte Experimental

159

OCH2), 4,94 (1H, d, J = 3,6 Hz, H10), 4,59 (1H, d, J = 12,8 Hz, OCH2), 4,29 (2H, q,

J = 7,2 Hz, OCH2CH3), 4,26 (2H, d, J = 4,8 Hz, NHCH2CO), 2,76-2,67 (1H, m, H9), 2,46-

2,34 (1H, m, H4α), 2,12-2,02 (1H, m, H4β), 1,96-1,79 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,70-1,50

(3H, m, H7, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,34 (3H, t, J = 7,2 Hz, OCH2CH3), 1,31-1,23

(2H, m, H5a, H6), 0,98 (3H, d, J = 7,2 Hz, C9-CH3), 0,97 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3),

0,95-0,88 (1H, m, H7)


127,2 (CAr), 127,1 (CAr), 104,2 (C3), 101,6 (C10), 88,1 (C12), 81,1 (C12a), 69,2 (CH2C6H4),

61,7 (OCH2CH3), 52,5 (C5a), 44,3 (C8a), 41,9 (HNCH2), 37,4 (C6), 36,4 (C4), 34,6 (C7),

30,9 (C9), 26,2 (C3-CH3), 24,7 (C5), 24,5 (C8), 20,4 (C6-CH3), 14,2 (OCH2CH3), 13,1

(C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 526,24

Ácido 10β-artelínico-ProOMe, 2.3c

Óleo incolor

η= 77 %

IV, νmáx/cm-1

3447, 2953, 2876, 1746, 1632, 1512, 1279, 1200, 1099, 1013, 939, 876, 826


OCH2C6H4), 5,45 (1H, s, H12), 4,92 (1H, d, J = 12,2 Hz, OCH2), 4,91 (1H, d, J = 4,0 Hz,

H10), 4,69-4,65 (1H, m, COCH), 4,56 (1H, d, J = 12,2 Hz, OCH2), 3,78 (3H, s, CH3),

3,72-3,50 (2H, m, NCH2), 2,75-2,65 (1H, m, H9), 2,45-2,25 (2H, m, H4α, COCHCHH),

2,10-1,98 (3H, m, H4β, COCHCHH, COCHCH2CHH), 1,95-1,75 (4H, m, H5, H8α, H8β,

COCHCH2CHH), 1,70-1,48 (3H, m, H7, H5, H8a), 1,46 (3H, s, C3-CH3), 1,40-1,20 (2H,

m, H5a, H6), 0,96 (3H, d, J = 7,6 Hz, C9-CH3), 0,95 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,92-0,87

(1H, m, H7)


127,5 (CH2CAr), 126,9 (CAr), 104,2 (C3), 101,5 (C10), 88,0 (C12), 81,1 (C12a), 69,3

(CH2C6H4), 59,2 (COCH), 52,5 (C5a), 52,3 (CH3), 50,0 (NCH2), 44,4 (C8a), 37,4 (C6),

36,4 (C4), 34,6 (C7), 30,9 (C9), 29,4 (COCHCH2) 26,2 (C3-CH3), 25,4 (NCH2CH2), 24,7

(C5), 24,5 (C8), 20,3 (C6-CH3), 13,1 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 536,26

Parte Experimental

160

Por hidrólise do grupo éster obtiveram-se os respectivos derivados ácidos. Para tal

dissolveram-se os derivados 2.3a e 2.3b em THF (5 ml/mmol) e adicionou-se NaOH 1N

(1,25 ml/mmol). A reacção foi seguida por TLC e, no final evaporou-se o solvente e

adicionou-se 15 ml de H2O e 15 ml de éter etílico. Separou-se a fase aquosa e

acidificou-se com HCl 1N até pH 2-3. Extraiu-se a fase aquosa com AcOEt, secou-se a

fase orgânica com agente secante, filtrou-se e evaporou-se o solvente.

Ácido 10β-artelínico-Phe, 2.3d

Sólido branco

η= 79 %

p.f.= 90-94 ºC

IV, νmáx/cm-1

3566, 3310, 2928, 2872, 1730, 1688, 1450, 1375, 1227, 1194, 1099, 1030,

1011, 939, 875, 825


OCH2C6H4), 7,36-7,22 (5H, m, CAr-H), 6,56 (1H, d, J = 7,2 Hz, NH), 5,47 (1H, s, H12),

5,13-5,08 (1H, m, CH), 4,96 (1H, d, J = 13,2 Hz, OCH2), 4,94 (1H, d, J = 3,6 Hz, H10),

4,58 (1H, d, J = 13,2 Hz, OCH2), 3,45-3,22 (2H, m, CH2C6H5), 2,77-2,64 (1H, m, H9),

2,47-2,35 (1H, m, H4α), 2,12-2,02 (1H, m, H4β), 1,98-1,77 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,70-

1,43 (3H, m, H7, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,38-1,23 (2H, m, H5a, H6), 0,98 (3H, d,

J = 7,2 Hz, C9-CH3), 0,97 (3H, d, J = 5,2 Hz, C6-CH3), 0,92-0,85 (1H, m, H7)



101,6 (C10), 88,1 (C12), 81,1 (C12a), 69,1 (CH2C6H4), 53,6 (CH), 52,5 (C5a), 44,3 (C8a),

37,4 (C6), 37,2 (CH2C6H5), 36,4 (C4), 34,6 (C7), 30,9 (C9), 26,2 (C3-CH3), 24,7 (C5), 24,5

(C8), 20,3 (C6-CH3), 13,1 (C9-CH3)

ESI-MS (-) m/z: [M-H]-: 564,39

Análise Elementar (%) para C32H39NO8; 565,27 gmol-1

; Calculada: C 67,95; H 6,95;

N 2,48. Experimental: C 67,53; H 6,49; N 2,73

Parte Experimental

161

Ácido 10β-artelínico-Gly, 2.3e

Óleo incolor

η= 64 %

IV, νmáx/cm-1

3524, 3445, 2924, 2874, 1724, 1639, 1545, 1238, 1099, 1030, 1011, 937,

876

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,82 (2H, d, J = 8,0 Hz, C6H4COOH), 7,42 (2H, d,

J = 8,4 Hz, OCH2C6H4), 6,80 (1H, t, J = 5,0 Hz, NH), 5,48 (1H, s, H12), 4,97 (1H, d,

J = 13,2 Hz, OCH2), 4,94 (1H, d, J = 3,2 Hz, H10), 4,60 (1H, d, J = 13,2 Hz, OCH2), 4,32

(2H, d, J = 4,8 Hz, NHCH2CO), 2,76-2,66 (1H, m, H9), 2,46-2,34 (1H, m, H4α), 2,12-2,02

(1H, m, H4β), 1,97-1,79 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,70-1,50 (3H, m, H7, H5, H8a), 1,48 (3H,

s, C3-CH3), 1,41-1,23 (2H, m, H5a, H6), 0,98 (3H, d, J = 7,2 Hz, C9-CH3), 0,97 (3H, d,

J = 5,2 Hz, C6-CH3), 0,95-0,89 (1H, m, H7)



52,5 (C5a), 44,3 (C8a), 41,9 (HNCH2), 37,4 (C6), 36,4 (C4), 34,6 (C7), 30,9 (C9), 26,2

(C3-CH3), 24,7 (C5), 24,5 (C8), 20,3 (C6-CH3), 13,1 (C9-CH3)

ESI-MS (-) m/z: [M-H]-: 474,34

Análise Elementar (%) para C25H33NO8; 475,22 gmol-1

; Calculada: C 63,14; H 6,99;


6.3.3 - Síntese da unidade dipeptidilvinilsulfona

6.3.3.1 - Síntese da sulfona

Colocou-se o fosfonato, 2.8, (dietil(feniltiometil)- ou (dietil(metiltiometil)-

fosfonato), (7,7 mmol) em 2 ml de ácido acético glacial e aqueceu-se até 50ºC.

Adicionou-se lentamente 600 µl de H2O2 (solução 30%), mantendo a temperatura abaixo

dos 80ºC. Após adição, manteve-se à temperatura de 85ºC e agitou-se durante cerca de 2h

30m. Arrefeceu-se até à temperatura ambiente, diluiu-se com H2O fria (7,5 ml) e

adicionou-se NaOH 10 M até pH 8-9. Extraiu-se a fase aquosa com DCM e a fase

orgânica foi lavada com hidrogenossulfito de sódio até deixar de haver agente oxidante.

Secou-se com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente.

Parte Experimental

162

Dietil(fenilsulfonil)metilfosfonato, 2.9a

Óleo amarelo

η=85%

IV, νmáx/cm-1

1319, 1255, 1160, 1026

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 8,03-7,93 (2H, m, CAr-H), 7,71-7,65 (1H, m, CAr-H),

7,62-7,55 (2H, m, CAr-H), 4,16 (4H, qd, J = 7,6, 7,3 Hz, P(OCH2CH3)2), 3,78 (2H, d,

J = 16,8 Hz, SO2CH2), 1,30 (6H, t, J = 7,3 Hz, P(OCH2CH3)2)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 140,0 (CAr), 134,1 (CAr), 129,2 (CAr), 128,3 (CAr),

63,5/63,4 (P(OCH2CH3)2), 54,5/53,1 (PCH2), 16,3/16,2 (P(OCH2CH3)2)

Dietil(metilsulfonil)metilfosfonato, 2.9b

Goma branca

η=47%

1H-NMR, (400 MHz, CDCl3) 4,26 (4H, qd, J = 7,7, 7,4 Hz, P(OCH2CH3)2), 3,61 (2H, d,

J = 16,4 Hz, SO2CH2), 3,23 (3H, s, CH3SO2), 1,40 (6H, t, J = 7,4 Hz, P(OCH2CH3)2)

6.3.3.2 - Síntese da amida de Weinreb

Dissolveu-se o aminoácido protegido a utilizar, 2.4, (N-Boc-Phe-OH, N-Boc-

homoPhe-OH) (3 mmol) em 10 ml de DCM e adicionou-se TBTU (3 mmol) e TEA (3

mmol) à temperatura ambiente. Após dissolução da mistura reaccional, adicionou-se o

hidrocloreto da O,N-dimetilhidroxilamina (3,3 mmol) e TEA (3,3 mmol) em 3 ml de

DCM. A reacção foi seguida por TLC e quando completa diluiu-se com DCM (50 ml) e

lavou-se com HCl 3M (30 ml), solução saturada de NaHCO3 (2×15 ml) e brine

(2×15 ml). Secou-se a fase orgânica com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se

o solvente sob vácuo. A purificação foi efectuada em coluna de cromatografia

(AcOEt:n-hexano, 1:1)

Parte Experimental

163

Boc-Phe-N(Me)OMe, 2.5a

Óleo amarelo

η= 88%

IV, νmáx/cm-1

3331, 1702, 1657, 1498, 1389, 1367, 1248, 1172, 852, 737, 689

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,34-7,15 (5H, m, CAr-H), 5,18 (1H, dl, J = 7,6 Hz, NH),

5,03-4,91 (1H, m, CH), 3,68 (3H, s, OCH3), 3,19 (3H, s, NCH3), 3,12-3,02 (1H, m,

CHHC6H5), 2,95-2,83 (1H, m, CHHC6H5), 1,41 (9H, s, Boc)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 172,3 (C=O), 155,2 (C=OBoc), 136,6 (CAr), 129,5

(CAr-H), 128,4 (CAr-H), 126,8 (CAr-H), 79,6 ((CH3)3C), 61,6 (OCH3), 51,5 (CH), 38,9

(CH2C6H5), 32,1 (NCH3), 28,3 ((CH3)3C)

Boc-hPhe-N(Me)OMe, 2.5b

Óleo amarelo

η= 98%

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,35-7,15 (5H, m, CAr-H), 5,26 (1H, dl, J = 9,2 Hz, NH),

4,77-4,63 (1H, m, CH), 3,64 (3H, s, OCH3), 3,18 (3H, s, NCH3), 2,82-2,61 (2H, m,

CH2C6H5), 2,10-1,98 (1H, m, CHHCH2C6H5), 1,91-1,79 (1H, m, CHHCH2C6H5), 1,47

(9H, s, Boc)


(CAr-H), 128,4 (CAr-H), 126,0 (CAr-H), 79,6 ((CH3)3C), 61,5 (OCH3), 50,1 (CH), 34,6

(CH2CH2C6H5), 32,1 (NCH3), 31,7 (CH2CH2C6H5), 28,4 ((CH3)3C)

6.3.3.3 - Síntese do aldeído

A uma solução de 2.5a-b (0,8 mmol) em THF destilado (8 ml) a 0ºC adicionou-se

LiAlH4 (1 mmol). Após verificar que a reacção estava completa por TLC, adicionou-se

uma solução de hidrogenossulfato de potássio (1,4 mmol) em 2 ml de H2O. Diluiu-se com

H2O (40 ml) e extraiu-se com éter etílico. Lavou-se a fase orgânica com HCl 3M (30 ml),

solução saturada de NaHCO3 (30 ml) e brine (30 ml) e a mesma foi seca com sulfato de

sódio anidro, filtrada e evaporada.

Parte Experimental

164

Boc-Phe-H, 2.7a

Sólido branco

η= 93%

p.f. = 80-84 ºC

IV, νmáx/cm-1

3357, 2816, 2722, 1724, 1688, 1517, 1453, 1377, 1262, 1172

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 9,66 (1H, s, CHO), 7,36-7,25 (3H, m, CAr-H), 7,20 (2H, d,

J = 8,0 Hz, CAr-H), 5,06 (1H, sl, NH), 4,51-4,40 (1H, m, CH), 3,14 (2H, dl, J = 6,4 Hz,

CH2C6H5), 1,46 (9H, s, Boc)


(CAr-H), 128,8 (CAr-H), 127,1 (CAr-H), 80,2 ((CH3)3C), 60,8 (CH), 35,5 (CH2C6H5), 28,3

((CH3)3C)

Boc-hPhe-H, 2.7b

Óleo incolor

η= 87%

IV: νmáx/cm-1

3327, 2970, 1696, 1505, 1450, 1368, 1252, 1170

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 9,57 (1H, s, CHO), 7,36-7,18 (5H, m, CAr-H), 5,11 (1H, dl,

J = 5,6 Hz, NH), 4,33-4,22 (1H, m, CH), 2,80-2,65 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,35-2,18 (1H,

m, CHHCH2C6H5), 2,0-1,82 (1H, m, CHHCH2C6H5), 1,49 (9H, s, Boc)


(CAr-H), 128,4 (CAr-H), 126,4 (CAr-H), 73,4 ((CH3)3C), 59,6 (CH), 31,4 (CH2CH2C6H5),

30,9 (CH2CH2C6H5), 28,3 ((CH3)3C)

6.3.3.4 - Síntese da vinilsulfona

A uma solução de 2.9a-b (0,4 mmol) em THF destilado (3 ml) a -10ºC

adicionou-se NaH lentamente (0,43 mmol). Após cerca de dez minutos, adicionou-se uma

solução de 2.7a-b (0,34 mmol) em 2 ml de THF e igualmente à temperatura de -10ºC. A

mistura reaccional foi agitada durante cerca de 2 h à temperatura ambiente, seguindo-se a

reacção por TLC. No fim, a mistura reaccional foi diluída com éter etílico (10 ml) e

lavou-se a fase orgânica com brine (3×5 ml). Após separação, secou-se a fase orgânica

Parte Experimental

165

com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente. O composto foi

purificado por cromatografia em coluna (AcOEt:n-hexano, 4:6)

Boc-Phe-VSPh, 2.10a

Sólido branco

η= 67%

p.f.= 131-135 ºC

IV, νmáx/cm-1

3357, 3060, 1689, 1523, 1453, 1319, 1153, 1026, 971

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,84 (2H, d, J = 7,2 Hz, CAr-H), 7,64 (1H, t, J = 7,4 Hz,

CAr-H), 7,55 (2H, t, J = 7,6 Hz, CAr-H), 7,33-7,21 (3H, m, CAr-H), 7,13 (2H, d, J = 6,4 Hz,

CAr-H), 6,96 (1H, dd, J = 15,2, 4,8 Hz, HC=CHSO2), 6,34 (1H, dd, J = 15,2, 1,8 Hz,

HC=CHSO2), 4,78-4,62 (1H, m, CH), 4,52 (1H, sl, NH), 2,93 (2H, d, J = 6,0 Hz,

CH2C6H5), 1,37 (9H, s, Boc)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 156,1 (C=OBoc), 145,8 (HC=CHSO2), 140,1 (CAr),

135,6 (CAr), 133,4 (CAr), 130,8 (HC=CHSO2), 129,4 (CAr), 129,3 (CAr), 128,7 (CAr), 127,7

(CAr), 127,1 (CAr), 80,2 ((CH3)3C), 51,9 (CH), 40,5 (CH2C6H5), 28,2 ((CH3)3C)

Boc-hPhe-VSPh, 2.10b

Sólido branco

η= 68%

p.f.= 79-82 ºC

IV, νmáx/cm-1

3325, 2988, 1679, 1521, 1364, 1168, 1006, 963


CAr-H), 7,60-7,51 (2H, m, CAr-H), 7,35-7,20 (3H, m, CAr-H), 7,16 (2H, d, J = 6,8 Hz,

CAr-H), 6,92 (1H, dd, J = 14,8, 4,4 Hz, HC=CHSO2), 6,45 (1H, d, J = 14,8 Hz,

HC=CHSO2), 4,60-4,48 (1H, m, NH), 4,45-4,30 (1H, m, CH), 2,80-2,62 (2H, m,

CH2CH2C6H5), 2,30-1,78 (2H, m, CH2CH2C6H5), 1,42 (9H, s, Boc)

Parte Experimental

166

Boc-hPhe-VSMe, 2.10c

Sólido branco

η=48%

p.f.= 110-115 ºC

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,36-7,15 (5H, m, CAr-H), 6,86 (1H, dd, J = 15,0, 4,8 Hz,

HC=CHSO2), 6,50 (1H, dd, J = 15,0, 1,5 Hz, HC=CHSO2), 4,56 (1H, sl, NH), 4,48-4,31

(1H, m, CH), 2,95 (3H, s, SO2CH3), 2,83-2,63 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,05-1,79 (2H, m,

CH2CH2C6H5), 1,48 (9H, s, Boc)

6.3.3.5 - Síntese da dipeptidilvinilsulfona

Antes de fazer o acoplamento do segundo aminoácido, tem que se efectuar a

desprotecção do grupo amina, e para tal, a 2.9a-c (0,92 mmol) em 2 ml de DCM

adicionou-se uma mistura 1:1 de TFA/DCM (2 ml). A reacção foi deixada em agitação, à

temperatura ambiente e seguida por TLC. Após 1h evaporou-se o solvente directamente

na bomba de vácuo. O composto foi utilizado sem qualquer purificação adicional.

CF3CO2H . Phe-VSPh, 2.11a

Óleo castanho

η=100%

IV, νmáx/cm-1

3034, 2907, 1667, 1523, 1306, 1143, 964, 823

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,75-7,63 (3H, m, CAr-H), 7,53 (2H, t, J = 7,8 Hz, CAr-H),

7,20-7,13 (3H, m, CAr-H), 7,10-6,97 (3H, m, CAr-H, HC=CHSO2), 6,52 (1H, d,

J = 15,2 Hz, HC=CHSO2), 5,85 (3H, sl, NH3+), 4,40-4,25 (1H, m, CH), 3,35-3,22 (1H, m,

CHHC6H5), 3,10-2,97 (1H, m, CHHC6H5)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 139,2 (HC=CHSO2), 138,3 (CAr), 134,8 (CAr), 134,1

(CAr), 133,6 (HC=CHSO2), 129,5 (CAr), 129,3 (CAr), 128,9 (CAr), 127,7 (CAr),127,6 (CAr),

53,3 (CH), 38,5 (CH2C6H5)

Parte Experimental

167

CF3CO2H . hPhe-VSPh, 2.11b

Óleo castanho

η=100%


CAr-H), 7,57 (2H, t, J = 7,6 Hz, CAr-H), 7,28-7,15 (3H, m, CAr-H), 7,05-6,94 (3H, m,

CAr-H, HC=CHSO2), 6,70 (1H, d, J = 15,2 Hz, HC=CHSO2), 5,97 (3H, sl, NH3+), 4,08-

3,93 (1H, m, CH), 2,72-2,49 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,33-2,19 (1H, m, CHHCH2C6H5),

2,17-2,02 (1H, m, CHHCH2C6H5)

CF3CO2H . hPhe-VSMe, 2.11c

Óleo castanho

η=100%

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,40-7,07 (5H, m, CAr-H), 6,95-6,65 (2H, m, HC=CHSO2,

HC=CHSO2), 4,63 (3H, sl, NH3+), 4,10-3,95 (1H, m, CH), 2,94 (3H, s, SO2CH3), 2,82-

2,64 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,34-2,04 (2H, m, CH2CH2C6H5)

Colocou-se o aminoácido protegido 2.4 (0,92 mmol) em 4 ml de DMF anidra a

0ºC, e adicionou-se HOBt (0,95 mmol), TBTU (0,96 mmol) e TEA (0,93 mmol). Após 30

minutos de agitação, adicionou-se lentamente 2.11a-c à temperatura ambiente, dissolvido

em 4 ml de DMF e com TEA (0,915 mmmol). A reacção ficou em agitação à temperatura

ambiente e foi seguida por TLC. Quando terminada, adicionou-se 25 ml de AcOEt e

25 ml de solução saturada de NaHCO3 e separaram-se as fases. A fase aquosa foi extraída

com AcOEt e as fases orgânicas resultantes foram adicionadas e lavadas com solução

saturada de NaHCO3 (2×30 ml), HCl 1M (2×30 ml) e brine (2×30 ml). Secou-se com

sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente a pressão reduzida. A

purificação foi efectuada por cromatografia em coluna de sílica-gel

(AcOEt:n-hexano, 1:1).

Parte Experimental

168

Boc-Phe-hPhe-VSPh, 2.13a

Sólido branco

η=76%

p.f.= 147-150 ºC

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,86 (2H, d, J = 8,0 Hz, CAr-H), 7,69-7,62 (1H, m, CAr-H),

7,61-7,53 (2H, m, CAr-H), 7,32-7,22 (6H, m, CAr-H), 7,19-7,14 (2H, m, CAr-H), 7,10 (2H,

d, J = 7,2 Hz, CAr-H), 6,81 (1H, dd, J = 15,2, 4,4 Hz, CH=CHSO2), 6,05 (1H, d,

J = 15,2 Hz, HC=CHSO2), 5,88 (1H, dl, J = 8,4 Hz, NH), 4,90 (1H, sl, NH), 4,75-4,64

(1H, m, CH), 4,29-4,19 (1H, m, CH), 3,02 (2H, d, J = 7,2 Hz, CH2C6H5), 2,71-2,53 (2H,

m, CH2CH2C6H5), 2,00-1,72 (2H, m, CH2CH2C6H5), 1,42 (9H, s, Boc)

Boc-Leu-hPhe-VSPh, 2.13b

Sólido branco

η=67%

p.f.= 152-155 ºC


CAr-H), 7,55 (2H, t, J = 7,6 Hz, CAr-H), 7,35-7,19 (3H, m, CAr-H), 7,15 (2H, d,

J = 7,2 Hz, CAr-H), 6,93 (1H, dd, J = 15,0, 4,8 Hz, CH=CHSO2), 6,45 (1H, d,

J = 15,0 Hz, HC=CHSO2), 6,33 (1H, dl, J = 6,7 Hz, NH), 4,80-4,62 (2H, m, CH, NH),

4,08-3,40 (1H, m, CH), 2,77-2,60 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,10-1,83 (2H, m,

CH2CH2C6H5), 1,71-1,54 (3H, m, CH(CH3)2, CH2Leu), 1,44 (9H, s, Boc), 0,94 (3H, d,

J = 6,4 Hz, (CH3)CH(CH3)), 0,90 (3H, d, J = 6,4 Hz, (CH3)CH(CH3))

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 171,9 (C=O), 154,0 (C=OBoc), 145,7 (HC=CHSO2),

140,6 (CAr), 137,7 (CAr), 136,7 (CAr), 131,9 (CAr), 130,8 (HC=CHSO2), 129,4 (CAr), 128,7

(CAr), 128,4 (CAr), 127,7 (CAr), 73,2 ((CH3)3C), 58,5 (CHLeu), 55,0 (CHhPhe), 45,3

(CH2Leu), 39,5 (CH2CH2C6H5), 31,0 (CH2CH2C6H5), 28,3 (Boc-CH3), 24,7 (CH(CH3)2),

24,6 (CH(CH3)2)

Parte Experimental

169

Boc-Leu-hPhe-VSMe, 2.13c

Sólido branco

η=60 %

p.f.= 154-155 ºC


HC=CHSO2), 6,51 (1H, d, J = 15,0 Hz, HC=CHSO2), 6,39 (1H, dl, J = 6,8 Hz, NH), 4,78-

4,62 (2H, m, CH, NH), 4,11-4,01 (1H, m, CH), 2,94 (3H, s, SO2CH3), 2,80-2,64 (2H, m,

CH2CH2C6H5), 2,09-1,87 (2H, m, CH2CH2C6H5), 1,76-1,65 (3H, m, CH(CH3)2, CH2Leu),

1,47 (9H, s, Boc), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz, (CH3)CH(CH3)), 0,96 (3H, d, J = 6,0 Hz,

(CH3)CH(CH3))

Boc-Phe-hPhe-VSMe, 2.13d

Sólido branco

η=62 %

p.f.= 194-196 ºC


HC=CHSO2), 6,13-5,98 (2H, m, HC=CHSO2, NH), 4,93 (1H, sl, NH), 4,73-4,61 (1H, m,

CH), 4,38-4,24 (1H, m, CH), 3,10-3,03 (2H, m, CH2C6H5), 2,87 (3H, s, SO2CH3), 2,73-

2,55 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,0-1,74 (2H, m, CH2CH2C6H5), 1,44 (9H, s, Boc)

6.3.3.6 - Síntese de híbridos C10-oxa do ácido artelínico e

dipeptidilvinilsulfona

Antes de efectuar o acoplamento da dipeptidilvinilsulfona ao ácido artelínico, o

grupo amina tem de ser desprotegido. Assim, a 2.13a-d (0,92 mmol) em 2 ml de DCM

adicionou-se uma mistura 1:1 de TFA/DCM (2 ml). A reacção foi deixada em agitação, à

temperatura ambiente e seguida por TLC. Após verificar que a reacção estava completa

evaporou-se o solvente na bomba de vácuo. O composto foi utilizado sem qualquer

purificação adicional.

Parte Experimental

170

CF3CO2H . Phe-hPhe-VSPhe, 2.14a

Óleo castanho

η=100%


7,31-7,23 (6H, m, CAr-H), 7,19-7,15 (2H, m, CAr-H), 7,09 (2H, d, J = 7,0 Hz, CAr-H), 6,82

(1H, dd, J = 15,2, 4,4 Hz, CH=CHSO2), 6,10 (1H, d, J = 15,2 Hz, HC=CHSO2), 5,10 (4H,

sl, NH3+, NH), 4,73-4,63 (1H, m, CH), 4,23-4,28 (1H, m, CH), 3,08-2,98 (2H, m,

CH2C6H5), 2,70-2,52 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,00-1,73 (2H, m, CH2CH2C6H5)

CF3CO2H . Leu-hPhe-VSPhe, 2.14b

Óleo castanho

η=100%


7,55 (2H, t, J = 7,8 Hz, CAr-H), 7,28-7,16 (3H, m, CAr-H), 7,05 (2H, d, J = 6,8 Hz, CAr-H),

6,86 (1H, dd, J = 15,1, 6,0 Hz, CH=CHSO2), 6,48 (1H, d, J = 15,1 Hz, HC=CHSO2), 5,69

(4H, sl, NH3+, NH), 4,53-4,41 (1H, m, CH), 4,21-4,08 (1H, m, CH), 2,67-2,50 (2H, m,


0,91 (3H, d, J = 5,6 Hz, (CH3)CH(CH3)), 0,88 (3H, d, J = 5,6 Hz, (CH3)CH(CH3))

CF3CO2H . Leu-hPhe-VSMe, 2.14c

Óleo castanho

η=100%


CH=CHSO2), 6,58 (1H, d, J = 16,0 Hz, HC=CHSO2), 5,09 (4H, sl, NH3+, NH), 4,54-4,41

(1H, m, CH), 4,20-4,05 (1H, m, CH), 2,93 (3H, s, SO2CH3), 2,79-2,57 (2H, m,


1,05-0,89 (6H, m, CH(CH3)2)

CF3CO2H . Phe-hPhe-VSMe, 2.14d

Óleo castanho

η=100%

Parte Experimental

171


HC=CHSO2), 6,14 (1H, d, J = 15,0 Hz, HC=CHSO2), 4,46-4-30 (2H, m, CH, CH), 4,14

(4H, sl, NH3+, NH), 3,30-3,04 (2H, m, CH2C6H5), 2,85 (3H, s, SO2CH3), 2,63-2,41 (2H,

m, CH2CH2C6H5), 1,90-1,77 (2H, m, CH2CH2C6H5)

De acordo com a análise retrossintética apresentada no Esquema 2.1, a síntese dos

compostos finais 2.12 pode ser efectuada pelo método a, b ou c. Nesta tese foram

desenvolvidos os métodos a e b, para os quais se descreve o procedimento experimental

geral.

Método a

Colocou-se o composto 2.3e (0,30 mmol, 142 mg) em 1 ml de THF, e

adicionou-se 1 equivalente de TEA (0,042 ml) e de TBTU (96 mg), tendo-se submetido a

mistura reaccional a agitação à temperatura ambiente sob atmosfera de azoto durante 30

min. De seguida adicionou-se 1 equivalente de 2.11a (120 mg) e 1 equivalente de TEA

(0,042 ml) em 1 ml de THF. A reacção ficou em agitação durante a noite, foi seguida por

TLC e após estar completa juntou-se 20 ml de H2O e 20 ml de DCM e separaram-se as

duas fases. A fase aquosa foi extraída com DCM (3×20 ml) e todas as fases orgânicas

foram recolhidas. A fase orgânica resultante foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada

e evaporada. A purificação do composto foi efectuada em coluna de cromatografia de

sílica-gel (DCM:MeOH, 9:1).

Ácido-10β-artelínico-Gly-Phe-VSPh, 2.12a

Sólido branco

η=66%

p.f.= 95-97 ºC

IV, νmáx/cm-1

3441, 2955, 2876, 2100, 1634, 1447, 1308, 1146, 1099, 1011, 957, 874

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,80 (2H, d, J = 7,6 Hz, CAr-H), 7,76 (2H, d, J = 8,2 Hz,

C6H4CO), 7,62 (1H, t, J = 7,4 Hz, CAr-H), 7,52 (2H, t, J = 7,8 Hz, CAr-H), 7,41 (2H, d,

J = 8,2 Hz, OCH2C6H4), 7,21-7,14 (3H, m, CAr-H), 7,13-7,07 (2H, m, CAr-H), 7,02 (1H,

sl, NH), 6,99 (1H, dd, J = 15,2, 4,8 Hz, HC=CHSO2), 6,93 (1H, d, J = 8,4 Hz, NH), 6,44

Parte Experimental

172

(1H, d, J = 15,2 Hz, HC=CHSO2), 5,48 (1H, s, H12), 5,06-4,97 (1H, m, CH), 4,98 (1H, d,

J = 13,0 Hz, OCH2), 4,94 (1H, d, J = 3,2 Hz, H10), 4,61 (1H, d, J = 13,0 Hz, OCH2), 4,09-

3,99 (2H, m, NHCH2), 3,03-2,89 (2H, m, CH2C6H5), 2,78-2,65 (1H, m, H9), 2,48-2,34

(1H, m, H4α), 2,12-2,02 (1H, m, H4β), 1,96-1,79 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,67-1,44 (3H, m,

H7, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,39-1,23 (2H, m, H5a, H6), 0,99 (3H, d, J = 7,2 Hz,

C9-CH3), 0,96 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,93-0,84 (1H, m, H7)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 175,3 (C=O), 164,2 (C=O), 144,4 (HC=CHSO2), 141,5

(CAr), 135,2 (CAr), 133,5 (CAr), 131,9 (CAr), 131,6 (CAr), 131,4 (CAr), 130,1 (HC=CHSO2),


101,6 (C10), 88,3 (C12), 81,1 (C12a), 69,1 (CH2C6H4), 52,6 (C5a), 50,6 (CHPhe), 47,8

(CH2Gly), 44,3 (C8a), 40,3 (CH2C6H5), 37,5 (C6), 36,4 (C4), 34,6 (C7), 30,9 (C9), 26,2 (C3-

CH3), 25,5 (C5), 24,5 (C8), 20,3 (C6-CH3), 13,2 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 767,27

Análise Elementar (%) para C41H48N2O9S; 744,31 gmol-1

; Calculada: C 66,11; H 6,50;


Método b

Dissolveu-se o ácido artelínico 2.1 (0,92 mmol) em 6 ml de DMF e adicionou-se

TEA (0,925 mmol) e TBTU (0,96 mmol), à temperatura de 0ºC. Agitou-se durante cerca

de 30 min. e após este tempo adicionou-se o sal trifluoroacetato da dipeptidilvinilsulfona,

2.14a-d, (0,91 mmol) dissolvido em 6 ml de DMF, juntamente com TEA (0,92 mmol) à

temperatura ambiente.

A mistura reaccional ficou em agitação à temperatura ambiente durante a noite. A

reacção foi seguida por TLC e quando completa, adicionou-se 25 ml de AcOEt e 25 ml de

solução saturada de NaHCO3 e separaram-se as fases. Extraiu-se a fase aquosa com

AcOEt (2×15 ml) e a fase orgânica resultante juntou-se à anterior fase orgânica, tratando-

se de seguida com solução saturada de NaHCO3 (2×30 ml), HCl 1M (2×30 ml) e brine

(2×30 ml). A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada. A

purificação foi efectuada por cromatografia em coluna de sílica-gel (AcOEt:n-hexano).

Parte Experimental

173

Ácido-10β-artelínico-Phe-Phe-VSPh, 2.12b

Sólido branco

η=62 %

p.f.= 162-163ºC

IV, νmáx/cm-1

3287, 2922, 2872, 1633, 1447, 1319, 1194, 1099, 1029, 957, 876


7,57 (2H, t, J = 7,6 Hz, CAr-H), 7,40 (2H, d, J = 8,0 Hz, CAr-H), 7,27-7,08 (8H, m, CAr-H),

7,05-6,96 (2H, m, CAr-H), 6,85 (1H, dd, J = 15,1, 4,6 Hz, HC=CHSO2), 6,59 (1H, d,

J = 7,6 Hz, NH), 6,09 (1H, d, J = 8,8 Hz, NH), 5,96 (1H, d, J = 15,1, 1,6 Hz,

HC=CHSO2), 5,48 (1H, s, H12), 5,00-4,91 (1H, m, CH), 4,97 (1H, d, J = 13,2 Hz, OCH2),

4,94 (1H, d, J = 3,6 Hz, H10), 4,80-4,69 (1H, m, CH), 4,60 (1H, d, J = 13,2 Hz, OCH2),

3,23-2,98 (2H, m, CH2C6H5), 2,92-2,66 (3H, m, H9, CH2C6H5), 2,47-2,35 (1H, m, H4α),

2,12-2,02 (1H, m, H4β), 1,96-1,79 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,70-1,43 (3H, m, H7, H5, H8a),

1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,39-1,22 (2H, m, H5a, H6), 0,99 (3H, d, J = 7,2 Hz, C9-CH3), 0,97

(3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,94-0,84 (1H, m, H7)


(CAr), 140,0 (CAr), 136,2 (CAr), 135,4 (CAr), 133,5 (CAr), 132,3 (CAr), 130,9 (HC=CHSO2),

129,3 (CAr), 129,2 (CAr), 129,1 (CAr), 128,9 (CAr), 128,6 (CAr), 127,7 (CAr), 127,3 (CAr),

127,2 (CAr), 127,1 (CAr), 127,0 (CAr), 104,2 (C3), 101,6 (C10), 88,1 (C12), 81,1 (C12a), 69,1

(CH2C6H4), 55,0 (CH), 52,5 (C5a), 50,4 (CH), 44,3 (C8a), 40,2 (CH2C6H5), 38,2

(CH2C6H5), 37,4 (C6), 36,4 (C4), 34,6 (C7), 30,9 (C9), 26,2 (C3-CH3), 24,7 (C5), 24,6 (C8),

20,3 (C6-CH3), 13,1 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 857,32


; Calculada: C 69,04; H 6,52;


Ácido-10β-artelínico-Leu-hPhe-VSPh, 2.12c

Sólido branco

η=53%

p.f.= 102-104 ºC

IV, νmáx/cm-1

3275, 2953, 2872, 1634, 1447, 1321, 1148, 1101, 1032, 939, 876, 826

Parte Experimental

174


CAr-H), 7,69-7,61 (1H, m, CAr-H), 7,56 (2H, t, J = 7,6 Hz, CAr-H), 7,40 (2H, d, J = 8,4 Hz,

CAr-H), 7,25-7,12 (3H, m, CAr-H), 7,06-7,00 (2H, m, CAr-H), 6,93 (1H, dd, J = 15,2, 5,2

Hz, HC=CHSO2), 6,70 (1H, dl, J = 8,4 Hz, NH), 6,48 (1H, dd, J = 15,2, 1,6 Hz,

HC=CHSO2), 6,44 (1H, d, J = 8,0 Hz, NH), 5,47 (1H, s, H12), 4,96 (1H, d, J = 13,2 Hz,

OCH2), 4,93 (1H, d, J = 3,6 Hz, H10), 4,74-4,65 (1H, m, CH), 4,64-4,55 (1H, m, CH), 4,58

(1H, d, J = 13,2 Hz, OCH2), 2,77-2,67 (1H, m, H9), 2,65-2,51 (2H, m, CH2CH2C6H5),

2,46-2,35 (1H, m, H4α), 2,12-2,02 (1H, m, H4β), 2,01-1,73 (5H, m, H5, H8α, H8β,

CH2CH2C6H5), 1,70-1,60 (4H, m, H7, CH, CH2), 1,57-1,44 (2H, m, H5, H8a), 1,48 (3H, s,

C3-CH3), 1,38-1,25 (2H, m, H5a, H6), 1,02-0,9 (12H, m, C9-CH3, C6α-CH3, (CH3)2Leu),

0,90-0,83 (1H, m, H7)


(CAr), 140,3 (CAr), 140,1 (CAr), 133,6 (CAr), 132,3 (CAr), 130,9 (HC=CHSO2), 129,4 (CAr),


101,6 (C10), 88,1 (C12), 81,1 (C12a), 69,1 (CH2C6H4), 52,5 (CH), 52,2 (C5a), 49,2 (CH),

44,3 (C8a), 40,2 (CH2Leu), 37,4 (C6), 36,4 (C4), 35,6 (CH2CH2C6H5), 34,6 (C7), 31,8

(CH2CH2C6H5), 30,9 (C9), 26,2 (C3-CH3), 25,0 (CH(CH3)2), 24,7 (C5), 24,5 (C8), 22,9

(CH(CH3)2), 20,3 (C6-CH3), 13,1 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 837,31


; Calculada: C 67,73; H 7,12;


Ácido-10β-artelínico-Phe-hPhe-VSPh, 2.11d

Sólido branco

η= 77%

p.f.= 114-118 ºC

IV, νmáx/cm-1

3385, 2922, 2872, 1632, 1447, 1319, 1194, 1146, 1099, 1030, 957, 876


7,59 (2H, t, J = 7,6 Hz, CAr-H), 7,39 (2H, d, J = 8,0 Hz, CAr-H), 7,28-7,13 (8H, m, CAr-H),

7,02 (2H, d, J = 6,8 Hz, CAr-H), 6,79 (1H, dd, J = 15,1, 5,0 Hz, HC=CHSO2), 6,71 (1H, d,

J = 7,6 Hz, NH), 6,11 (1H, d, J = 8,0 Hz, NH), 6,06 (1H, dd, J = 15,1, 1,6 Hz,

HC=CHSO2), 5,47 (1H, s, H12), 4,96 (1H, d, J = 13,0 Hz, OCH2), 4,93 (1H, d, J = 3,6 Hz,

Parte Experimental

175

H10), 4,80-4,72 (1H, m, CH), 4,71-4,62 (1H, m, CH), 4,58 (1H, d, J = 13,0 Hz, OCH2),

3,24-3,06 (2H, m, CH2C6H5), 2,76-2,66 (1H, m, H9), 2,64-2,49 (2H, m, CH2CH2C6H5),

2,46-2,35 (1H, m, H4α), 2,11-2,02 (1H, m, H4β), 1,97-1,71 (5H, m, H5, H8α, H8β,

CH2CH2C6H5), 1,58-1,44 (3H, m, H7, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,41-1,23 (2H, m,

H5a, H6), 0,98 (3H, d, J = 7,2 Hz, C9-CH3), 0,96 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,93-0,84

(1H, m, H7)


(CAr), 140, 9 (CAr), 140,2 (CAr), 140,1 (CAr), 136,2 (CAr), 133,6 (CAr), 130,7

(HC=CHSO2), 129,3 (CAr), 129,2 (CAr), 128,9 (CAr), 128,6 (CAr), 128,3 (CAr), 127,7 (CAr),

127,5 (CAr) 127,3 (CAr), 127,1 (CAr), 126,3 (CAr), 104,3 (C3), 101,6 (C10), 88,0 (C12), 81,1

(C12a), 69,1 (CH2C6H4), 55,3 (CH), 52,6 (C5a), 49,2 (CH), 44,3 (C8a), 38,1 (CH2C6H5),

37,5 (C6), 36,4 (C4), 35,6 (CH2CH2C6H5), 34,5 (C7), 31,8 (CH2CH2C6H5), 30,9 (C9), 26,2

(C3-CH3), 24,7 (C5), 24,6 (C8), 20,3 (C6-CH3), 13,2 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 871,28


; Calculada: C 69,32; H 6,65;


Ácido-10β-artelínico-Leu-hPhe-VSMe, 2.11e

Sólido branco

η=65%

p.f.= 86-88 ºC

IV, νmáx/cm-1

3291, 2924, 2870, 1636, 1450, 1310, 1136, 1101, 1032, 1011, 959


CAr-H), 7,26-7,15 (3H, m, CAr-H), 7,07 (2H, d, J = 6,8 Hz, CAr-H), 6,87 (1H, dd,

J = 15,0, 5,0 Hz, HC=CHSO2), 6,83 (1H, d, J = 8,0 Hz, NH), 6,53 (1H, dd,

J = 15,0, 1,4 Hz, HC=CHSO2), 6,48 (1H, dl, J = 7,6 Hz, NH), 5,47 (1H, s, H12), 4,97 (1H,

d, J = 13,0 Hz, OCH2), 4,93 (1H, d, J = 3,2 Hz, H10), 4,74-4,62 (2H, m, CH, CH), 4,59

(1H, d, J = 13,0 Hz, OCH2), 2,96 (3H, s, SO2CH3), 2,77-2,56 (3H, m, H9, CH2CH2C6H5),

2,46-2,34 (1H, m, H4α), 2,12-1,61 (10H, m, H4β, H5, H8α, H8β, CH2CH2C6H5, H7, CH,

CH2Leu), 1,57-1,49 (2H, m, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,38-1,26 (2H, m, H5a, H6),

1,04-0,94 (12H, m, C9-CH3, C6-CH3, (CH3)2Leu), 0,93-0,84 (1H, m, H7)

Parte Experimental

176


(CAr), 140,2 (CAr), 131,0 (CAr), 129,9 (HC=CHSO2), 128,6 (CAr), 128,4 (CAr), 127,3 (CAr),


52,6 (C5a), 52,3 (CH), 49,4 (CH), 44,3 (C8a), 42,8 (SO2CH3), 40,2 (CH2Leu), 37,4 (C6),

36,4 (C4), 35,4 (CH2CH2C6H5), 34,6 (C7), 31,8 (CH2CH2C6H5), 30,9 (C9), 26,2 (C3-CH3),

25,1 (CH(CH3)2), 24,7 (C5), 24,6 (C8), 23,1 (CH(CH3)2), 20,4 (C6-CH3), 13,1 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 775,32


; Calculada: C 65,40; H 7,50;


Ácido-10β-artelínico-Phe-hPhe-VSMe, 2.11f

Sólido branco

η=59 %

p.f.= 155-158 ºC

IV, νmáx/cm-1

3277, 2924, 2853, 1630, 1533, 1375, 1308, 1136, 1099, 1032, 1011, 957,

876

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,71 (2H, d, J = 6,2 Hz, CAr-H), 7,44-7,12 (10 H, m, CAr-H),

7,06 (2H, d, J = 6,0 Hz, CAr-H), 6,76 (1H, d, J = 7,2 Hz, NH), 6,71 (1H, dd,

J = 15,0, 4,4 Hz, HC=CHSO2), 6,28 (1H, d, J = 7,2 Hz, NH), 6,06 (1H, d, J = 15,0 Hz,

HC=CHSO2), 5,47 (1H, s, H12), 4,96 (1H, d, J = 13,4 Hz, OCH2), 4,93 (1H, d, J = 3,2 Hz,

H10), 4,89-4,78 (1H, m, CH), 4,71-4,53 (1H, m, CH), 4,58 (1H, d, J = 13,4 Hz, OCH2),

3,31-3,12 (2H, m, CH2C6H5), 2,89 (3H, s, SO2CH3), 2,77-2,66 (1H, m, H9), 2,65-2,51

(2H, m, CH2CH2C6H5), 2,48-2,32 (1H, m, H4α), 2,12-2,0 (1H, m, H4β), 1,98-1,75 (5H, m,

H5, H8α, H8β, CH2CH2C6H5), 1,57-1,44 (3H, m, H7, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,37-

1,21 (2H, m, H5a, H6), 1,05-0,93 (6H, m, C9-CH3, C6-CH3), 0,92-0,8 (1H, m, H7)


(CAr), 140,1 (CAr), 136,3 (CAr), 132,2 (CAr), 129,7 (HC=CHSO2), 129,3 (CAr), 129,1 (CAr),

128,6 (CAr), 128,3 (CAr), 127,5 (CAr) 127,3 (CAr), 127,2 (CAr), 126,4 (CAr), 104,2 (C3),

101,6 (C10), 88,1 (C12), 81,1 (C12a), 69,1 (CH2C6H4), 55,2 (CH), 52,5 (C5a), 49,4 (CH),

44,3 (C8a), 42,8 (SO2CH3), 38,0 (CH2C6H5), 37,5 (C6), 36,4 (C4), 35,2 (CH2CH2C6H5),

34,6 (C7), 31,7 (CH2CH2C6H5), 30,9 (C9), 26,2 (C3-CH3), 24,7 (C5), 24,6 (C8), 20,4 (C6-

CH3), 13,2 (C9-CH3)

Parte Experimental

177

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 809,34

Análise Elementar (%) para C44H54N2O9S: 786,36 gmol-1

; Calculada: C 67,15; H 6,92;


6.3.4 - Síntese de híbridos C10-oxa do ácido artesúnico

Para a síntese destes derivados fez-se reagir a dihidroartemisinina, 1.4, (1 eq.) com

o respectivo anidrido (succínico para 2.15 (0,352 mmol) e glutárico para 2.16

(1,76 mmol)) em DCM e na presença de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (1 eq.). Na

síntese de 2.16, foi necessário adicionar mais 0,5 equivalentes de anidrido glutárico e

DMAP. A reacção foi seguida por TLC e após estar completa, juntou-se 5 ml de HCl 10%

à mistura reaccional e efectuou-se a sua extracção. Secou-se a fase orgânica com sulfato

de sódio anidro, e após filtração evaporou-se o solvente a pressão reduzida. A purificação

foi efectuada por recristalização com mistura de solventes, utilizando DCM e n-hexano.

Ácido 10α-artesúnico, 2.15

1,57-1,44 (3H, m, H7, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,37-1,21 (2H, m, H5a, H6), 1,05-

0,93 (6H, m, C9-CH3, C6-CH3), 0,92-0,8 (1H, m, H7)

Sólido branco

η= 71%

p.f. = 135-138ºC

IV, νmáx/cm-1

3439, 2928, 2876, 2361, 1746, 1715, 1452, 1377, 1163, 1132, 1099, 1016,

926, 876

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 5,82 (1H, d, J = 10,0 Hz, H10), 5,46 (1H, s, H12), 2,77-2,65

(4H, m, CH2CH2), 2,63-2,54 (1H, m, H9), 2,45-2,35 (1H, m, H4α), 2,10-2,01 (1H, m, H4β),

1,96-1,71 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,69-1,25 (5H, m, H5, H7, H8a, H5a, H6), 1,46 (3H, s,

C3-CH3), 1,10-1,01 (1H, m, H7) 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,87 (3H, d, J = 7,2 Hz,

C9-CH3)

Parte Experimental

178

Ácido 10α-dihidroartemisinina-glutárico, 2.16

Sólido branco

η= 64 %

p.f. = 40-43ºC

IV, νmáx/cm-1

3445, 2928, 2874, 2361, 1744, 1709, 1377, 1132, 1099, 1018, 926, 847


(1H, m, H9), 2,52 (2H, td, J = 7,3, 2,3 Hz, COCH2), 2,47 (2H, t, J = 7,4 Hz, CH2COOH),

2,44-2,34 (1H, m, H4α), 2,10-2,05 (1H, m, H4β), 2,03-1,97 (2H, m, COCH2CH2), 1,95-

1,71 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,68-1,26 (5H, m, H5, H7, H8a, H5a, H6), 1,45 (3H, s,

C3-CH3), 1,09-1,01 (1H, m, H7) 0,98 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,87 (3H, d, J = 7,2 Hz,

C9-CH3)

Na síntese dos híbridos 2.19 e 2.20, o procedimento experimental geral foi o

mesmo que efectuado no método b, para a síntese dos derivados 2.12b-f.

Dissolveu-se o derivado 2.15 ou 2.16 (0,414 mmol) em 6 ml de DMF e

adicionou-se TBTU (0,432 mmol, 139 mg), à temperatura de 0ºC. Agitou-se durante

cerca de 30 min. e após este tempo adicionou-se o sal trifluoroacetato da

dipeptidilvinilsulfona, 2.14b, (0,410 mmol, 216 mg) dissolvido em 6 ml de DMF,

juntamente com TEA (0,410 mmol, 0,057 ml) à temperatura ambiente.

A mistura reaccional ficou em agitação à temperatura ambiente durante a noite. A

reacção foi seguida por TLC e quando completa, adicionou-se 25 ml de AcOEt e 25 ml de

solução saturada de NaHCO3 e separaram-se as fases. Extraiu-se a fase aquosa com

AcOEt e a esta fase orgânica resultante juntou-se à anterior fase orgânica, lavando-se com

solução saturada de NaHCO3 (2×20 ml), HCl 1M (2×20 ml) e brine (2×20 ml). A fase

orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada. A purificação foi

efectuada por cromatografia em coluna de sílica-gel (eluente AcOEt:n-hexano, 5:5).

10α-artesunato-Leu-hPhe-VSPh, 2.19

Sólido branco

η=44 %

p.f. = 95-97ºC

Parte Experimental

179

IV, νmáx/cm-1

3443, 1638, 1630, 1364, 1146, 1086, 1018


7,34-7,16 (5H, m, CAr-H), 6,92 (1H, dd, J = 15,0, 4,6 Hz, HC=CHSO2), 6,83 (1H, d,

J = 8,4 Hz, NH), 6,49 (1H, dd, J = 15,0, 1,3 Hz, HC=CHSO2), 5,80 (1H, d, J = 7,6 Hz,

NH), 5,67 (1H, d, J = 10,0 Hz, H10), 5,24 (1H, s, H12), 4,78-4,66 (1H, m, CH), 4,41-4,30

(1H, m, CH), 2,68 (2H, t, J = 7,0 Hz, CH2CH2), 2,61 (2H, t, J = 7,0 Hz, CH2CH2), 2,58-

2,51 (1H, m, H9), 2,49-2,38 (1H, m, H4α), 2,37-2,28 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,09-1,74

(6H, m, H4β, H5, H8α, H8β, CH2CH2C6H5), 1,72-1,47 (6H, m, H7, CH, CH2Leu, H5, H8a),

1,44 (3H, s, C3-CH3), 1,42-1,31 (2H, m, H5a, H6), 1,03-0,97 (1H, m, H7), 0,94 (6H, d,

J = 6,4 Hz (CH3)2Leu), 0,89 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,83 (3H, d, J = 7,2 Hz, C9-CH3)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 172,6 (C=O), 171,9 (C=O), 171,5 (C=O), 145,4

(HC=CHSO2), 141,1 (CAr), 140,2 (CAr), 133,3 (CAr), 130,6 (HC=CHSO2), 129,4 (CAr),

128,6 (CAr), 128,5 (CAr), 127,9 (CAr), 126,2 (CAr), 104,5 (C3), 92,7 (C10), 91,4 (C12), 80,0

(C12a), 52,4 (CH), 51,4 (C5a), 49,5 (CH), 45,1 (C8a), 39,9 (CH2Leu), 36,8 (C6), 36,3 (C4),

35,4 (CH2CH2C6H5), 34,0 (C7), 32,3 (CH2CH2), 31,8 (CH2CH2C6H5), 31,0 (C9), 29,5

(CH2CH2), 25,9 (C3-CH3), 24,9 (CH(CH3)2), 24,5 (C5), 23,1 (C8), 21,7 (CH(CH3)2), 20,2

(C6-CH3), 12,2 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 803,21


, Calculada: C 64,59; H 7,23;

N 3,59; Experimental: C 64,15; H 7,28; N 3,28

10α-dihidroartemisinina-glutarato-Leu-hPhe-VSPh, 2.20

Sólido branco

η=50 %

p.f. = 90-94ºC

IV, νmáx/cm-1

3267, 2946, 1746, 1638, 1542, 1447, 1383, 1320, 1140, 1012, 926, 878


7,30-7,04 (6H, m, CAr-H, NH), 6,91 (1H, dd, J = 15,0, 5,2 Hz, HC=CHSO2), 6,46 (1H, dd,

J = 15,0 Hz, HC=CHSO2), 6,42 (1H, d, J = 8,0 Hz, NH), 5,75 (1H, d, J = 10,0 Hz, H10),

5,42 (1H, s, H12), 4,69-4,58 (1H, m, CH), 4,50-4,38 (1H, m, CH), 2,65-2,49 (3H, m, CH2,

H9), 2,43-2,18 (6H, m), 2,03-1,8 (6H, m), 1,78-1,43 (7H, m) 1,40 (3H, s, C3-CH3), 1,38-

1,25 (2H, m, H5a, H6), 1,07-1,01 (1H, m, H7), 0,96 (3H, d, J = 5,6 Hz, (CH3)2Leu), 0,88

Parte Experimental

180

(3H, d, J = 6,0 Hz, (CH3)2Leu), 0,84 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,81 (3H, d, J = 7,2 Hz,

C9-CH3)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 172,8 (C=O), 172,0 (C=O), 171,8 (C=O), 145,7

(HC=CHSO2), 140,5 (CAr), 140,1 (CAr), 133,5 (CAr), 130,7 (HC=CHSO2), 129,4 (CAr),

128,6 (CAr), 128,4 (CAr), 127,6 (CAr), 126,3 (CAr), 104,5 (C3), 92,1 (C10), 91,4 (C12), 80,2

(C12a), 52,0 (CH), 51,5 (C5a), 49,1 (CH), 45,1 (C8a), 40,4 (CH2Leu), 37,2 (C6), 36,2 (C4),

35,6 (CH2CH2C6H5), 34,7 (CH2), 34,1 (C7), 32,9 (CH2), 31,9 (CH2CH2C6H5), 31,6 (C9),

25,9 (C3-CH3), 24,8 (CH(CH3)2), 24,6 (C5), 22,7 (C8), 21,9 (CH(CH3)2), 20,7 (CH2), 20,2

(C6-CH3), 12,3 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 817,3700


; Calculada: C 64,96; H 7,35;

N 3,52; Experimental: C 65,24; H 7,30; N 3,42

6.4 - Síntese de híbridos C10-carba da artemisinina

6.4.1 - Síntese do derivado ácido C10-carba da artemisinina

Tentaram-se sintetizar estes derivados a partir do 10α-acetato da

dihidroartemisinina, 3.2, mas devido à sua instabilidade química tiveram de ser

sintetizados a partir do 10α-benzoato da dihidroartemisinina, 3.1.

10α-Acetato de dihidroartemisinina, 3.2

À dihidroartemisinina, 1.4, (2,41 mmol, 684 mg) dissolvida em 33 ml de DCM

seco adicionou-se piridina destilada (3,73 mmol, 0,3 ml), anidrido acético (4,24 mmol,

0,4 ml) e DMAP (0,241 mmol, 29,4 mg) à temperatura ambiente e a reacção foi seguida

por TLC. Quando completa, lavou-se a fase orgânica com HCl 1M (3×15 ml) e brine

(3×15 ml). Secou-se com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente a

pressão reduzida. A purificação foi efectuada por cromatografia em coluna (eluente

AcOEt:n-hexano, 2:6).

Parte Experimental

181

Sólido branco

η=81%

p.f.= 92-95 ºC

IV, νmáx/cm-1

2928, 2880, 1750, 1443, 1368, 1225, 1109, 1027, 837


(1H, m, H9), 2,46-2,34 (1H, m, H4α), 2,15 (3H, s, COCH3), 2,09-2,01 (1H, m, H4β), 1,96-

1,71 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,69-1,48 (3H, m, H7, H5, H8a), 1,46 (3H, s, C3-CH3), 1,42-

1,25 (2H, m, H5a, H6), 1,10-1,01 (1H, m, H7), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,87 (3H,

d, J = 6,8 Hz, C9-CH3)

10α-Benzoato de dihidroartemisinina, 3.1

Dissolveu-se a dihidroartemisinina, 1.4, (1,76 mmol, 500 mg) em 5,4 ml de DCM

seco e adicionou-se piridina destilada (11,2 mmol, 0,9 ml) a 0ºC e sob azoto. Adicionou-

se lentamente o cloreto de benzoilo (2,73 mmol, 0,32 ml), deixando-se a reacção à

temperatura ambiente e sob azoto. A reacção foi seguida por TLC e após estar completa,

adicionou-se 20 ml de AcOEt e lavou-se a fase orgânica sucessivamente com HCl 0,01M

(pH=2) (3×5 ml), solução de NaHCO3 saturada (3×5 ml) e H2O (3×5 ml). Secou-se com

sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente a vácuo. A purificação foi

efectuada por cromatografia em coluna de sílica-gel (AcOEt:n-hexano, 1:9) ou por

recristalização por gradiente térmico de n-hexano.

Sólido branco

η=84%

p.f.= 135-137 ºC

IV, νmáx/cm-1

2928, 2876, 1730, 1451, 1381, 1267, 1019, 917, 824


CAr-H), 7,47 (2H, t, J = 7,8 Hz, CAr-H), 6,04 (1H, d, J = 10,0 Hz, H10), 5,55 (1H, s, H12),

2,84-2,73 (1H, m, H9), 2,47-2,35 (1H, m, H4α), 2,12-2,02 (1H, m, H4β), 1,98-1,47 (6H, m,

H5, H8α, H8β, H5, H7, H8a), 1,45 (3H, s, C3-CH3), 1,43-1,26 (2H, m, H5a, H6), 1,13-1,03

(1H, m, H7), 1,01 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,95 (3H, d, J = 6,8 Hz, C9-CH3)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 165,3 (C=O), 133,3 (CAr), 130,2 (CAr), 129,6 (CAr),

128,3 (CAr), 104,5 (C3), 92,5 (C10), 91,6 (C12), 80,2 (C12a), 51,7 (C5a), 45,4 (C8a), 37,3

Parte Experimental

182

(C6), 36,3 (C4), 34,1 (C7), 32,0 (C9), 26,0 (C3-CH3), 24,6 (C5), 22,1 (C8), 20,3 (C6-CH3),

12,3 (C9-CH3)

10β-Alil-10-desoxi-dihidroartemisinina, 3.4

A uma solução de aliltrimetilsilano (2,4 mmol, 0,380 ml) em 1,2-dicloroetano

seco (2,5 ml) contendo peneiros moleculares, a 0ºC e sob atmosfera de azoto,

adicionou-se ZnCl2 (0,6 mmol, 82 mg). Após dez minutos em agitação, o composto 3.1

(0,5 mmol, 200 mg) dissolvido em 1,2-dicloroetano igualmente seco, foi adicionado com

uma seringa. A mistura reaccional foi agitada a 0ºC e depois à temperatura ambiente,

tendo-se seguido a reacção por TLC. Quando completa juntou-se AcOEt (10 ml) e lavou-

se a fase orgânica com HCl 0,01M (2×10 ml), solução saturada de NaHCO3 (2×10 ml) e

brine (2×10 ml). A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e o

solvente evaporado sob vácuo. O composto foi purificado por cromatografia em coluna

de sílica-gel (AcOEt:n-hexano, 1:9).

Sólido branco

η=62%

p.f. = 62-65 ºC

IV, νmáx/cm-1

2957, 2862, 1640, 1377, 1105, 1059, 1042, 1001, 879

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 5,94 (1H, dtd, J = 17,2, 10,0, 7,0 Hz, CH=CH2), 5,35 (1H,

s, H12), 5,14 (1H, dd, J = 17,2, 1,6 Hz, CH=CH), 5,08 (1H, dd, J = 10,0, 1,6 Hz, CH=CH),

4,31 (1H, ddd, J = 10,0, 6,0, 3,9 Hz, H10), 2,76-2,65 (1H, m, H9), 2,48-2,40 (1H, m, CH2),

2,39-2,29 (1H, m, H4α), 2,27-2,19 (1H, m, CH2), 2,10-2,0 (1H, m, H4β), 1,97-1,46 (6H, m,

H5, H8α, H8β, H5, H7, H8a), 1,44 (3H, s, C3-CH3), 1,41-1,22 (2H, m, H5a, H6), 1,03-0,94

(1H, m, H7), 0,98 (3H, d, J = 5,6 Hz, C6-CH3), 0,91 (3H, d, J = 7,2 Hz, C9-CH3)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 136,5 (CH=CH2), 116,1 (CH=CH2), 103,2 (C3), 89,1

(C12), 81,1 (C12a), 74,8 (C10), 52,4 (C5a), 44,3 (C8a), 37,5 (C6), 36,6 (C4), 34,5 (C10CH2),

34,2 (C7), 30,21 (C9), 26,1 (C3-CH3), 24,9 (C8), 24,7(C5), 20,2 (C6-CH3), 13,0 (C9-CH3)

Parte Experimental

183

Anidroartemisinina, 3.5

Sólido branco

η= 40%

p.f. = 87-91 ºC

IV, νmáx/cm-1

2922, 2849, 1639, 1373, 1198, 1113, 1078, 991, 880

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 6,21-6,17 (1H, m, H10), 5,54 (1H, s, H12), 2,46-2,34 (1H, m,

H4α), 2,12-1,99 (2H, m), 1,96-1,86 (1H, m), 1,74-1,39 (5H, m), 1,58 (3H, d, J = 1,2 Hz,

C9-CH3), 1,42 (3H, s, C3-CH3), 1,22-1,03 (2H, m), 0,98 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 135,1 (C10), 108,3 (C9), 104,7 (C3), 89,8 (C12), 79,1

(C12a), 51,5 (C5a), 44,5 (C8a), 37,1 (C6), 36,4 (C4), 34,2 (C7), 30,1 (C8), 26,0 (C3-CH3),

24,5 (C5), 20,4 (C6-CH3), 16,3 (C9-CH3)

10β-Carboximetil-10-desoxi-dihidroartemisinina, 3.6

Numa mistura de acetona (30 ml) e H2O (30ml) à temperatura ambiente dissolveu-

se o derivado 3.4 (0,47 mmol, 143 mg) e posteriormente adicionou-se NaIO4 (1,9 mmol,

407 mg) e KMnO4 (0,29 mmol, 46 mg). A reacção foi seguida por TLC e após estar

completa, filtrou-se a mistura reaccional, basificou-se com NaOH 10M, adicionou-se 25

ml de éter etílico e separou-se a fase orgânica. A fase aquosa foi acidificada com HCl

37% até pH 1 e extraída com éter etílico (3×20 ml). Adicionaram-se as fases orgânicas

resultantes da extracção, secou-se com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o

solvente. O composto foi utilizado sem qualquer tipo de purificação adicional.

Óleo Amarelo

η=92%

IV, νmáx/cm-1

3436, 1634, 1523, 1430, 1375, 1086, 1031, 962

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 5,39 (1H, s, H12), 4,93-4,83 (1H, ddd, J = 10,4, 6,4, 3,6 Hz,

H10), 2,77-2,63 (2H, m, H9, CHHCOOH), 2,57-2,48 (1H, m, CHHCOOH), 2,40-2,29 (1H,

m, H4α), 2,10-1,90 (2H, m, H4β, H5), 1,87-1,66 (3H, m, H8α, H7, H8β), 1,48-1,20 (4H, m,

H5, H5a, H6, H8a), 1,43 (3H, s, C3-CH3), 1,04-0,94 (1H, m, H7), 0,99 (3H, d, J = 5,6 Hz,

C6-CH3), 0,90 (3H, d, J = 7,6 Hz, C9-CH3)

Parte Experimental

184

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 175,6 (C=O), 103,3 (C3), 89,4 (C12), 80,9 (C12a), 70,9

(C10), 52,1 (C5a), 43,8 (C8a), 37,5 (C6), 36,4 (C4), 35,8 (CH2COOH), 34,3 (C7), 29,8 (C9),

25,8 (C3-CH3), 24,7 (C8), 24,6(C5), 20,1 (C6-CH3), 12,70 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+H]+: 327,13

6.4.2 - Síntese de híbridos da artemisinina e dipeptidilvinilsulfona

Dissolveu-se o ácido C10-carba da artemisinina, 3.6, (0,92 mmol) em 6 ml de

DMF e adicionou-se TEA (0,925 mmol) e TBTU (0,96 mmol), a 0ºC. Adicionou-se o sal

trifluoroacetato da dipeptidilvinilsulfona, 2.14b e 2.14c, (0,91 mmol) dissolvido em 6 ml

de DMF, juntamente com TEA (0,92 mmol) à temperatura ambiente.

A mistura reaccional ficou em agitação à temperatura ambiente durante a noite. A reacção

foi seguida por TLC e quando completa, adicionou-se 25 ml de AcOEt e 25 ml de solução

saturada de NaHCO3 e separaram-se as fases. Extraiu-se a fase aquosa com AcOEt

(2×15 ml) e a esta fase orgânica resultante juntou-se a anterior e lavou-se com solução

saturada de NaHCO3 (2×15 ml), HCl 1M (2×15 ml) e brine (2×15 ml). A fase orgânica foi

seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada. A purificação foi efectuada por

cromatografia em coluna (AcOEt:n-hexano, 6:4).

10β-Carboximetil-10-desoxi-dihidroartemisinina-Leu-hPhe-VSPh, 3.7

Sólido branco

η=58%

p.f.= 50-54 ºC

IV, νmáx/cm-1

3292, 2926, 2872, 1643, 1447, 1379, 1319, 1146, 1086, 1055, 1011, 878


CAr-H), 7,55 (2H, t, J = 7,4 Hz, CAr-H), 7,34-7,18 (4H, m, CAr-H, NH), 7,14 (2H, d,

J = 6,8 Hz, CAr-H), 6,93 (1H, d, J = 7,6 Hz, NH), 6,92 (1H,dd, J = 15,2, 4,8 Hz,

HC=CHSO2), 6,47 (1H, dd, J = 15,2, 1,6 Hz, HC=CHSO2), 5,36 (1H, s, H12), 4,87-4,78

(1H, m, H10), 4,68-4,59 (1H, m, CH), 4,42-4,32 (1H, m, CH), 2,69-2,43 (3H, m, H9,

CHHCO, CHHCO), 2,41-2,17 (3H, m, H4α, CH2CH2C6H5), 2,11-1,53 (12H, m, H4β, H5,

H8α, H8β, H7, H5, H8a, CH2CH2C6H5, CH, CH2Leu), 1,41 (3H, s, C3-CH3), 1,37-1,16 (2H,

m, H5a, H6), 1,01-0,81 (13H, m, H7, C9-CH3, C6-CH3, (CH3)2Leu)

Parte Experimental

185


(CAr), 140,2 (CAr), 133,4 (CAr), 130,6 (HC=CHSO2), 129,3 (CAr), 128,6 (CAr), 128,4 (CAr),

127,7 (CAr), 126,2 (CAr), 103,0 (C3), 90,5 (C12), 80,7 (C12a), 68,6 (C10), 51,9 (CH), 51,6

(C5a), 49,0 (CH), 43,1 (C8a), 38,5 (CH2), 37,5 (C6), 37,4 (CH2CO), 36,6 (C4), 35,6

(CH2CH2C6H5), 34,2 (C7), 31,9 (CH2CH2C6H5), 30,3 (C9), 25,8 (C3-CH3), 24,8 (C8), 24,7

(CH(CH3)2), 23,0 (CH(CH3)2), 21,9 (C5), 19,9 (C6-CH3), 11,9 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 745,41


. Calculada: C 66,46; H 7,53;


10β-Carboximetil-10-desoxi-dihidroartemisinina-Leu-hPhe-VSMe, 3.8

Sólido branco

η=59%

p.f.= 83-86 ºC

IV, νmáx/cm-1

3441, 2955, 2874, 1643, 1452, 1377, 1308, 1132, 1092, 1042, 966, 876

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,35-7,14 (6H, m, CAr-H, NH), 6,99 (1H, d, J = 8,0 Hz,

NH), 6,85 (1H, dd, J = 15,0, 4,8 Hz, HC=CHSO2), 6,52 (1H, dd, J = 15,0, 1,6 Hz,

HC=CHSO2), 5,38 (1H, s, H12), 4,91-4,81 (1H, m, H10), 4,68-4,57 (1H, m, CH), 4,46-4,37

(1H, m, CH), 2,94 (3H, s, SO2CH3), 2,73-2,46 (3H, m, H9, CHHCO, CHHCO), 2,44-2,22

(3H, m, H4α, CH2CH2C6H5), 2,12-1,61 (12H, m, H4β, H5, H8α, H8β, H7, H5, H8a,

CH2CH2C6H5, CH, CH2Leu), 1,43 (3H, s, C3-CH3), 1,40-1,14 (2H, m, H5a, H6), 1,05-0,97

(7H, m, H7, CH(CH3)2), 0,94 (3H, d, J = 6,4 Hz, C6-CH3), 0,87 (3H, d, J = 6,4 Hz,

C9-CH3)


(CAr), 129,7 (HC=CHSO2), 128,6 (CAr), 128,4 (CAr), 126,3 (CAr), 103,0 (C3), 90,6 (C12),

80,8 (C12a), 68,7 (C10), 52,0 (CH), 51,6 (C5a), 49,2 (CH), 43,1 (C8a), 42,9 (SO2CH3), 38,6

(CH2Leu), 37,6 (CH2CO), 37,5 (C6), 36,5 (C4), 35,4 (CH2CH2C6H5), 34,2 (C7), 31,9

(CH2CH2C6H5), 30,3 (C9), 25,8 (C3-CH3), 24,8 (C8), 24,7 (CH(CH3)2), 23,2 (CH(CH3)2),

21,7 (C5), 19,9 (C6-CH3), 11,9 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+H]+: 661,3510


. Calculada: C 63,61; H 7,93;


Parte Experimental

186

6.4.3 - Síntese do híbrido da artemisinina e dipeptidilvinilsulfonato

6.4.3.1 - Síntese do dipeptidilvinilsulfonato

Etilmetanossulfonato, 3.12

Dissolveu-se cloreto de metanosulfonilo (0,032 mol, 2,5 ml) em etanol absoluto

seco (2 ml) e colocou-se sob refluxo durante três horas. Ao fim desse tempo evaporou-se

o solvente, adicionou-se diclorometano e lavou-se com uma solução saturada de NaHCO3

até deixar de fazer efervescência. Secou-se com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e

evaporou-se o solvente a pressão reduzida.

Óleo amarelo

η=12%

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 4,29 (2H, qd, J = 7,1 Hz, OCH2CH3), 3,00 (1H, s, CH3),

1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz, OCH2CH3)

etil (dietoxifosforil)metanossulfonato, 3.13

Dissolveu-se o etilmetanossulfonato 3.12 (4 mmol, 493 mg) em THF seco (10 ml),

colocou-se sob azoto a -78ºC, adicionou-se n-BuLi (4,4 mmol, 2,2 ml) e posteriormente

adicionou-se o etilclorofosfato (2,2 mmol, 0,318 ml). A mistura reaccional ficou em

agitação durante 30 minutos a -78ºC e uma hora a -50ºC. De seguida adicionou-se NH4Cl

(4,4 mmol, 235 mg em 1 ml de água), tendo ficado a mistura reaccional em agitação até

atingir a temperatura ambiente. Evaporou-se o solvente a pressão reduzida, adicionou-se

15 ml de água e extraiu-se com diclorometano (3×20 ml). Secou-se com sulfato de sódio

anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente a pressão reduzida. O composto foi purificado

por cromatografia em coluna de sílica-gel (CH2Cl2:éter etílico, 1:1).

Óleo amarelo

η=75%

IV, νmáx/cm-1

2983, 2914, 1477, 1443, 1361, 1259, 1177, 1020, 918, 808

Parte Experimental

187

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 4,42 (2H, q, J = 7,1 Hz, SOCH2CH3), 4,25 (4H, qd,

J = 7,1 Hz, P(OCH2CH3)2), 3,73 (2H, d, J = 17,2 Hz, PCH2S), 1,44 (3H, t, J = 7,1 Hz,

SOCH2CH3), 1,38 (6H, dt, J = 7,1 Hz, P(OCH2CH3)2)

Boc-hPhe-VSOEt, 3.14

A uma solução de 3.13 (0,65 mmol, 169 mg) em 4 ml de THF recém destilado a

-78ºC sob atmosfera de azoto, adicionou-se n-BuLi lentamente (0,65 mmol, 0,325 ml).

Posteriormente adicionou-se o aldeído Boc-hPhe-H, 2.7b (0,637 mmol, 167 mg), em 2,5

ml de THF recém destilado. Retirou-se a mistura reaccional do frio e ficou em agitação à

temperatura ambiente durante a noite. Adicionou-se 20 ml de tampão fosfato, pH 7,4 e

extraiu-se com diclorometano (3×30 ml). Após separação, secou-se a fase orgânica com

sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente a pressão reduzida. O

composto Boc-hPhevinilsulfonato foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-

gel (éter etílico:n-hexano, 6:4)

Sólido branco

η= 63%

p.f.= 65-68 ºC

IV, νmáx/cm-1

3325, 2987, 2931, 1679, 1522, 1364, 1168, 1006, 963, 916


HC=CHSO2), 6,33 (1H, dd, J = 15,2, 1,6 Hz, HC=CHSO2), 4,60 (1H, dl, J = 7,6 Hz, NH),

4,43-4,30 (1H, m, CH), 4,18 (2H, q, J = 7,1 Hz, SOCH2CH3), 2,81-2,66 (2H, m,

CH2CH2C6H5), 2,05-1,80 (2H, m, CH2CH2C6H5), 1,47 (9H, s, Boc), 1,39 (3H, t,

J = 7,1 Hz, SOCH2CH3)

CF3CO2H . hPhe-VSOEt, 3.15

A desprotecção do grupo Boc, foi efectuada de acordo com o procedimento

experimental descrito em 6.3.3.5 para a síntese dos derivados 2.11.

Óleo amarelo

η= 100%

Parte Experimental

188

IV, νmáx/cm-1

3410, 1659, 1430, 1356, 1178, 1141, 915


HC=CHSO2), 6,59 (1H, d, J = 15,2 Hz, HC=CHSO2), 4,90 (3H, sl, NH3+), 4,20 (2H, q,

J = 7,1 Hz, SOCH2CH3), 4,06-3,95 (1H, m, CH), 2,84-2,60 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,34-

2,03 (2H, m, CH2CH2C6H5), 1,38 (3H, t, J = 7,1 Hz, SOCH2CH3)

Boc-Leu-hPhe-VSOEt, 3.16

Para a síntese do dipeptidilvinilsulfonato 3.16, vai-se acoplar o aminoácido

Boc-Leu-OH ao ácido trifluoroacetato 3.15. O procedimento experimental foi efectuado

de acordo com o descrito anteriormente em 6.3.3.5 para a síntese dos derivados 2.13.

Sólido branco

η= 67%

p.f.= 100-103 ºC

IV, νmáx/cm-1

3292, 2967, 1689, 1659, 1541, 1459, 1393, 1170, 1044, 919

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,33 (2H, t, J = 7,2 Hz, CAr-H), 7,25 (1H, t, J = 7,2 Hz,

CAr-H), 7,18 (2H, d, J = 7,2 Hz, CAr-H), 6,83 (1H, dd, J = 15,4, 4,8 Hz, HC=CHSO2),

6,39 (1H, dl, J = 5,2 Hz, NH), 6,33 (1H, d, J = 15,4 Hz, HC=CHSO2), 4,74-4,64 (2H, m,

CH, NH), 4,22-4,13 (2H, m, SOCH2CH3), 4,09-4,01 (1H, m, CH), 2,80-2,64 (2H, m,

CH2CH2C6H5), 2,08-1,85 (2H, m, CH2CH2C6H5), 1,75-1,65 (3H, m, (CH3)2CH, CH2Leu),

1,47 (9H, s, Boc), 1,39 (3H, t, J = 7,0 Hz, SOCH2CH3), 0,99 (3H, d, J = 6,2 Hz,

(CH3)2CH), 0,96 (3H, d, J = 6,2 Hz, (CH3)2CH)

A desprotecção do grupo Boc, foi efectuada de acordo com o procedimento experimental

descrito em 6.3.3.5 para a síntese dos derivados 2.14.

CF3CO2H . Leu-hPhe-VSOEt, 3.18

Óleo amarelo

η= 100%

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,89 (1H, sl, NH), 7,37-7,30 (2H, m, CAr-H), 7,25-7,12 (3H,

m, CAr-H), 6,78 (1H, d, J = 15,0 Hz, HC=CHSO2), 6,40 (1H, d, J = 15,0 Hz,

Parte Experimental

189

HC=CHSO2), 4,60-4,46 (1H, m, CH), 4,20-4,09 (2H, q, J = 6,7 Hz,, SOCH2CH3), 4,07-

3,98 (1H, m, CH), 3,0 (3H, sl, NH3+), 2,77-2,52 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,08-1,86 (2H, m,

CH2CH2C6H5), 1,76-1,58 (3H, m, (CH3)2CH, CH2Leu), 1,33 (3H, t, J = 6,7 Hz,

SOCH2CH3), 0,99-0,85 (6H, m, (CH3)2CH)

6.4.3.2 - Síntese do híbrido da artemisinina e dipeptidilvinilsulfonato

Dissolveu-se o ácido C10-carba da artemisinina, 3.6, (0,168 mmol, 55 mg) em 1 ml

de DMF e adicionou-se TEA (0,168 mmol, 0,024 ml) e TBTU (0,175 mmol, 56 mg), a

0ºC. Adicionou-se o sal trifluoroacetato do dipeptidilvinilsulfonato, 3.18, (0,166 mmol,

82 mg) dissolvido em 1 ml de DMF, juntamente com TEA (0,168 mmol, 0,024 ml) à

temperatura ambiente. A mistura reaccional ficou em agitação à temperatura ambiente

durante a noite. A reacção foi seguida por TLC e quando completa, adicionou-se 25 ml de

AcOEt e 25 ml de solução saturada de NaHCO3. Após separação das fases, a fase aquosa

foi extraída com AcOEt (2×15 ml) e a esta fase orgânica resultante juntou-se a fase

orgânica anterior, tendo sido lavadas com solução saturada de NaHCO3 (2×15 ml),

HCl 1M (2×15 ml) e brine (2×15 ml). A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio

anidro, filtrada e evaporada. A purificação foi efectuada por cromatografia em coluna de

sílica-gel (AcOEt:n-hexano, 4:6)

10β-Carboximetil-10-desoxi-dihidroartemisinina-Leu-hPhe-VSOEt, 3.9

Sólido branco

η=35%

p.f.= 56-62 ºC

IV, νmáx/cm-1

3293, 2920, 1676, 1645, 1530, 1460, 1357, 1166, 1128, 1089, 1051, 1000,

916, 872

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,27-7,20 (2H, m, CAr-H), 7,18-7,10 (2H, m, CAr-H, NH),

7,09-7,05 (2H, m, CAr-H), 6,94 (1H, d, J = 8,0 Hz, NH), 6,74 (1H, dd, J = 15,2, 5,1 Hz,

HC=CHSO2), 6,25 (1H, dd, J = 15,2, 1,5 Hz, HC=CHSO2), 5,29 (1H, s, H12), 4,81-4,72

(1H, m, H10), 4,56-4,45 (1H, m, CH), 4,37-4,27 (1H, m, CH), 4,08 (2H, q, J = 7,1 Hz,

SOCH2CH3), 2,66-2,18 (6H, m, H9, H4α, CH2CO, CH2CH2C6H5), 2,03-1,47 (12H, m,

H4β, H5, H8α, H8β, H7, H5, H8a, CH2CH2C6H5, (CH3)2CH, CH2Leu), 1,34 (3H, s, C3-CH3),

Parte Experimental

190

1,29 (3H, t, J = 7,1 Hz, SOCH2CH3), 1,23-1,02 (2H, m, H5a, H6), 0,90 (6H, d, J = 6,4 Hz,

(CH3)2CH), 0,85 (3H, d, J = 6,4 Hz, C6-CH3), 0,87-0,80 (1H, m, H7), 0,78 (3H, d,

J = 7,6 Hz, C9-CH3)


(CAr), 128,7 (CAr), 128,4 (CAr), 126,3 (CAr), 124,8 (HC=CHSO2), 103,0 (C3), 90,6 (C12),

80,8 (C12a), 68,6 (C10), 67,1 (SOCH2CH3), 51,9 (CH), 51,6 (C5a), 49,2 (CH), 43,1 (C8a),

38,5 (CH2Leu), 37,5 (CH2CO), 36,5 (C4), 35,4 (CH2CH2C6H5), 34,1 (C7), 31,9

(CH2CH2C6H5), 30,3 (C9), 29,7 (C6), 25,8 (C3-CH3), 24,8 (C8), 24,7 ((CH3)2CH), 23,1

((CH3)2CH), 21,8 (C5), 19,9 (C6-CH3), 14,9 (SOCH2CH3), 11,9 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+Na]+: 713,49


. Calculada: C 62,58; H 7,88;


6.4.4 - Síntese do híbrido da artemisinina e dipeptidilvinilsulfonamida

Na síntese deste híbrido, foi necessário sintetizar primeiro a unidade

dipeptidilvinilsulfonamida, para posteriormente acoplar ao derivado ácido C10-carba da

artemisinina, 3.6.

6.4.4.1 - Síntese da dipeptidilvinilsulfonamida

N-fenil-N-metilmetanosulfonamida, 3.20

A uma solução aquosa de hidróxido de sódio 10% (50 ml) adicionou-se a

N-metilbenzenamina (56 mmol, 6,06 ml). Colocou-se a mistura reaccional em gelo e

lentamente adicionou-se cloreto de metanossulfonilo (60 mmol, 4,64 ml). Agitou-se

vigorosamente durante trinta minutos, ao fim dos quais se efectuou a separação das duas

fases. A fase aquosa foi extraída com diclorometano. Juntaram-se as duas fases orgânicas,

secou-se com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente a pressão

reduzida. Recristalizou-se de metanol e n-hexano.

Parte Experimental

191

Sólido branco

η=25%

p.f.= 77-78 ºC

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,46-7,26 (5H, m, CAr-H), 3,36 (3H, s, CH3SO2), 2,87 (3H,

s, NCH3)

N-fenil-N-metildietilfosforilmetanosulfonamida, 3.21

Dissolveu-se a sulfonamida 3.20 (3,25 mmol, 602 mg) em THF seco (10 ml),

colocou-se sob azoto a -78ºC e adicionou-se n-BuLi (3,58 mmol, 1,8 ml). Posteriormente

adicionou-se o etilclorofosfato (1,81 mmol, 0,270 ml). Ficou em agitação durante 30

minutos a -78ºC e uma hora a -50ºC, tempo após o qual se adicionou NH4Cl (3,58 mmol,

191 mg em 0,8 ml de água), tendo ficado a mistura reaccional em agitação até atingir a

temperatura ambiente. Evaporou-se o solvente a pressão reduzida, adicionou-se 25 ml de

água e extraiu-se com diclorometano (3×25 ml). Secou-se a fase orgânica com sulfato de

sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente a pressão reduzida. O composto foi

purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (AcOEt:n-hexano, 4:6).

Óleo incolor

η=68%

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,54-7,30 (5H, m, CAr-H), 4,24 (4H, qd, J = 7,3 Hz,

P(OCH2CH3)2), 3,56 (2H, d, J = 17,2 Hz, PCH2S), 3,45 (3H, s, NCH3), 1,37 (6H, t,

J = 7,2 Hz, P(OCH2CH3)2)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 140,8 (CAr), 129,5 (CAr), 127,8 (CAr), 126,9 (CAr),

63,6/63,5 (P(OCH2CH3)2), 46,8/45,4 (PCH2S), 39,3 (NCH3), 16,4/16,3 (P(OCH2CH3)2)

Boc-hPhe-VSN(Me)Ph, 3.22

Colocou-se 3.21 (0,67 mmol, 215 mg) em 5 ml de THF recém destilado a 0ºC sob

azoto e adicionou-se NaH lentamente (0,72 mmol, 29 mg). Posteriormente adicionou-se o

aldeído Boc-hPhe-H 2.7b (0,57 mmol, 151 mg) em 4 ml de THF recém destilado.

Retirou-se a mistura reaccional do frio e ficou em agitação à temperatura ambiente

durante a noite. Adicionou-se 20 ml de éter etílico e extraiu-se com brine (3×10 ml).

Parte Experimental

192

Após separação, secou-se a fase orgânica com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e

evaporou-se o solvente a pressão reduzida. O composto foi purificado por cromatografia

em coluna de sílica-gel (AcOEt:n-hexano, 6:4)

Sólido branco

η= 81%

p.f.= 106-108 ºC


HC=CHSO2), 6,27 (1H, dd, J = 15,1, 1,2 Hz, HC=CHSO2), 4,56 (1H, dl, J = 7,2 Hz, NH),

4,35-4,24 (1H, m, CH), 3,22 (3H, s, NCH3), 2,76-2,61 (2H, m, CH2CH2C6H5), 1,97-1,80

(2H, m, CH2CH2C6H5), 1,49 (9H, s, Boc)

CF3CO2H . hPhe-VSN(Me)Ph, 3.23

A desprotecção do grupo Boc, foi efectuada de acordo com o procedimento

experimental anterior para obter os derivados 2.11.

Óleo amarelo

η= 100%

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,41-7,21 (8H, m, CAr-H), 7,13-7,07 (2H, m, CAr-H), 6,64-

6,59 (2H, m, HC=CHSO2), 3,97-3,85 (1H, m, CH), 3,46 (3H, sl, NH3+), 3,24 (3H, s,

NCH3), 2,64-2,45 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,20-1,90 (2H, m, CH2CH2C6H5)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 140,4 (CAr), 139,7 (HC=CHSO2), 138,8 (CAr), 129,4

(CAr), 129,3 (CAr), 128,9 (HC=CHSO2), 128,2 (CAr) 128,1 (CAr) 127,0 (CAr) 126,8 (CAr),

51,5 (CH), 38,2 (NCH3), 34,0 (CH2CH2C6H5), 31,0 (CH2CH2C6H5)

Boc-Leu-hPhe- VSN(Me)Ph, 3.24

Para a síntese da dipeptidilvinilsulfonamida, ao sal trifluoroacetato 3.23 vai-se

acoplar o aminoácido Boc-Leu-OH. O procedimento experimental efectuado é o descrito

anteriormente para a síntese dos derivados 2.13.

Parte Experimental

193

Sólido branco

η= 69%

p.f.= 35-37 ºC

IV, νmáx/cm-1

3291, 2928, 2870, 1775, 1651, 1597, 1495, 1350, 1248, 1169, 1144, 1026,

968, 872

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,40-7,21 (8H, m, CAr-H), 7,16 (2H, d, J = 7,2 Hz, CAr-H),

6,57 (1H, dd, J = 15,2, 4,8 Hz, HC=CHSO2), 6,35-6,24 (2H, m, HC=CHSO2, NH), 4,68

(1H, sl, NH), 4,65-4,56 (1H, m, CH), 4,08-3,98 (1H, m, CH), 3,22 (3H, s, NCH3), 2,76-

2,58 (2H, m, CH2CH2C6H5), 2,03-1,83 (2H, m, CH2CH2C6H5), 1,73-1,62 (3H, m,

(CH3)2CH, CH2Leu), 1,44 (9H, s, Boc), 0,97 (3H, d, J = 6,6 Hz, (CH3)CH(CH3)), 0,95 (3H,

d, J = 6,6 Hz, (CH3)CH(CH3))

A desprotecção do grupo Boc, foi efectuada de acordo com o procedimento experimental

anterior para obter os derivados 2.14.

CF3CO2H . Leu-hPhe-VSN(Me)Ph, 3.25

Óleo amarelo

η= 100%

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,75 (1H, d, J = 6,8 Hz, NH), 7,38-7,18 (8H, m, CAr-H),

7,11 (2H, d, J = 7,2 Hz, CAr-H), 6,53 (1H, dd, J = 15,2, 6,0 Hz, HC=CHSO2), 6,29 (1H, d,

J = 15,2 Hz, HC=CHSO2), 4,52-4,40 (1H, m, CH), 4,09-3,97 (1H, m, CH), 3,20 (3H, s,

NCH3), 2,81-2,45 (5H, m, NH3+, CH2CH2C6H5), 1,96-1,78 (2H, m, CH2CH2C6H5), 1,69-

1,54 (3H, m, (CH3)2CH, CH2Leu), 0,89 (3H, d, J = 5,6 Hz, (CH3)CH(CH3)), 0,86 (3H, d,

J = 5,2 Hz, (CH3)CH(CH3))

6.4.4.2 Síntese do híbrido da artemisinina e dipeptidilvinilsulfonamida

Dissolveu-se o ácido C10-carba da artemisinina, 3.6, (0,276 mmol, 90 mg) em 2 ml

de DMF e adicionou-se TEA (0,278 mmol, 0,039 ml) e TBTU (0,288 mmol, 95 mg), a

0ºC. Adicionou-se o sal trifluoroacetato da dipeptidilvinilsulfonamida 3.25 (0,273 mmol,

0,152 mg) dissolvido em 2 ml de DMF, juntamente com TEA (0,276 mmol, 0,038 ml) à

temperatura ambiente. A mistura reaccional ficou em agitação durante a noite á

Parte Experimental

194

temperatura ambiente. A reacção foi seguida por TLC e quando completa, adicionou-se

20 ml de AcOEt e 20 ml de solução saturada de NaHCO3. Após separação, a fase aquosa

foi extraída com AcOEt (3×30 ml) e a esta fase orgânica resultante juntou-se a fase

orgânica anterior, tendo sido lavada com brine (3×30 ml). A fase orgânica foi seca com

sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada a pressão reduzida. A purificação foi

efectuada por cromatografia em coluna de sílica-gel (AcOEt:n-hexano, 6:4)

10β-Carboximetil-10-desoxi-dihidroartemisinina-Leu-hPhe-VSN(Me)Ph, 3.10

Sólido amarelo

η=38%

p.f.= 66-71 ºC

IV, νmáx/cm-1

3368, 2953, 2872, 1641, 1493, 1352, 1169, 1142, 1057, 1011, 875

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 7,40-7,26 (7H, m, CAr-H), 7,24-7,18 (2H, m, CAr-H, NH),

7,14 (2H, d, J = 7,2 Hz, CAr-H), 6,93 (1H, d, J = 7,6 Hz, NH), 6,56 (1H, dd, J = 15,1, 5,4

Hz, HC=CHSO2), 6,28 (1H, dd, J = 15,1, 1,2 Hz, HC=CHSO2), 5,37 (1H, s, H12), 4,90-

4,81 (1H, m, H10), 4,57-4,46 (1H, m, CH), 4,43-4,33 (1H, m, CH), 3,22 (3H, s, NCH3),

2,69-2,26 (6H, m, H9, H4α, CH2CO, CH2CH2C6H5), 2,12-1,58 (12H, m, H4β, H5, H8α,

H8β, H7, H5, H8a, CH2CH2C6H5, (CH3)2CH, CH2Leu), 1,41 (3H, s, C3-CH3), 1,38-1,14 (2H,

m, H5a, H6), 0,99 (6H, d, J = 6,4 Hz, (CH3)2CH), 0,95 (3H, d, J = 6,4 Hz, C6-CH3), 0,97-

0,89 (1H, m, H7), 0,86 (3H, d, J = 7,6 Hz, C9-CH3)


(CAr), 140,5 (CAr), 129,1 (CAr), 128,6 (CAr), 128,4 (CAr), 127,5 (CAr), 127,1 (CAr), 126,3

(CAr), 124,4 (HC=CHSO2), 103,0 (C3), 90,5 (C12), 80,8 (C12a), 68,7 (C10), 51,9 (CH), 51,6

(C5a), 49,5 (CH), 43,1 (C8a), 38,7 (CH2Leu), 38,2 (NCH3), 37,5 (CH2CO), 36,5 (C4), 35,4

(CH2CH2C6H5), 34,1 (C7), 31,9 (CH2CH2C6H5), 30,3 (C9), 29,7 (C6), 25,8 (C3-CH3), 24,8

(C8), 24,7 ((CH3)2CH), 23,2 ((CH3)2CH), 21,8 (C5), 19,9 (C6-CH3), 11,9 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+H]+: 752,3922


. Calculada: C 65,49; H 7,64;


Parte Experimental

195

6.5 - Derivados híbridos da artemisinina e primaquina

6.5.1 - Derivados híbridos C10-oxa da artemisinina e primaquina

6.5.1.1 - Híbrido com ligação amida

Na síntese do derivado 4.1 realizou-se o acoplamento entre o ácido artelínico 2.1 e

a primaquina, 1.44. Para tal dissolveu-se 2.1 (0,250 mmol, 105 mg) em 2 ml de DMF e

adicionou-se TEA (0,251 mmol, 0,035 ml) e TBTU (0,261 mmol, 84 mg) a 0ºC.

Posteriormente adicionou-se 1.44 na forma de sal difosfato (0,247 mmol, 113 mg)

dissolvida em 2 ml de DMF com TEA (0,495 mmol, 0,069 ml). Após adição ficou em

agitação à temperatura ambiente durante a noite. A reacção foi seguida por TLC e quando

completa, adicionou-se 10 ml de AcOEt e 10 ml de solução de NaHCO3 saturada e após

separação das fases, a fase aquosa foi extraída com AcOEt (2×15 ml). Juntaram-se as

fases orgânicas e foram lavadas com uma solução de NaHCO3 saturada (2×20 ml) e brine

(2×20 ml). A fase orgânica secou-se com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se

o solvente a pressão reduzida. A purificação foi efectuada por cromatografia em coluna

de sílica-gel (AcOEt:n-hexano, 1:1)

Híbrido artemisinina-primaquina, 4.1

Sólido amarelo

η=72 %

p.f.= 84-88 ºC

IV, νmáx/cm-1

3389, 2920, 1636, 1614, 1520, 1385, 1099, 1028, 1011, 874, 824

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 8,55 (1H, dd, J = 4,0, 1,4 CAr-H2), 7,95 (1H, dd, J = 8,2,

1,4 Hz, CAr-H4), 7,70 (2H, d, J = 8,2 Hz, OCH2C6H4), 7,37-7,31 (1H, m, CAr-H3), 7,35

(2H, d, J = 8,2 Hz, OCH2C6H4), 6,37 (1H, d, J = 2,4 Hz, CAr-H5), 6,32 (1H, d, J = 2,4 Hz,

CAr-H7), 6,22 (1H, t, J = 5,6 Hz, CONH), 6,04 (1H, d, J = 8,4 Hz, HCNH), 5,47 (1H, s,

H12), 4,94 (1H, d, J = 12,8 Hz, OCH2C6H4), 4,92 (1H, d, J = 2,8 Hz, H10), 4,57 (1H, d,

J = 12,8 Hz, OCH2C6H4), 3,90 (3H, s, CH3O), 3,75-3,64 (1H, m, CHCH3), 3,60-3,43 (2H,

m, HNCH2), 2,76-2,64 (1H, m, H9), 2,46-2,34 (1H, m, H4α), 2,11-2,02 (1H, m, H4β), 1,97-

1,76 (7H, m, H5, H8α, H8β, HNCH2CH2, HNCH2CH2CH2), 1,68-1,60 (1H, m, H7), 1,58-

Parte Experimental

196

1,46 (2H, m, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,34 (3H, d, J = 6,4 Hz, HCCH3), 1,37-1,25

(2H, m, H5a, H6), 0,97 (3H, d, J = 7,2 Hz, C6-CH3), 0,96 (3H, d, J = 6,0 Hz, C9-CH3),

0,94-0,88 (1H, m, H7)


141,8 (CAr), 135,3 (CAr), 134,8 (CAr), 133,7 (CAr), 129,9 (CAr), 127,1 (CAr), 126,9 (CAr),

121,9 (CAr), 104,2 (C3), 101,5 (C10), 96,9 (CAr), 91,8 (CAr), 88,0 (C12), 81,1 (C12a), 69,2

(CH2C6H4), 55,2 (CH3O), 52,5 (C5a), 47,9 (CH), 44,3 (C8a), 39,9 (HNCH2), 37,4 (C6),

36,4 (C4), 34,6 (C7), 33,9 (CHCH2), 30,9 (C9), 26,4 (CH2CH2CH2), 26,2 (C3-CH3), 24,7

(C5), 24,5 (C8), 20,7 (C6-CH3), 20,4 (HCCH3), 13,1 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+H]+: 660,3631

Análise Elementar (%) para C38H49N3O7; 659,36 gmol-1

. Calculada: C 69,17; H 7,49;


6.5.1.2 - Híbrido com ligação amina

Amida de Weinreb do ácido artelínico, 4.6

A uma solução de 2.1 (0,842 mmol, 352 mg) em 3 ml de DCM adicionou-se

TBTU (0,842 mmol, 270 mg) e TEA (0,842 mmol, 0,118 ml) à temperatura ambiente.

Após dissolução da mistura reaccional, adicionou-se o hidrocloreto da

O,N-dimetilhidroxilamina (0,926 mmol, 90 mg) e TEA (0,926 mmol, 0,129 ml) em 1 ml

de DCM. A reacção foi seguida por TLC e quando completa diluiu-se com DCM (20 ml)

e lavou-se com solução saturada de NaHCO3 e brine (2×20 ml). Secou-se a fase orgânica

com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente sob vácuo. A purificação

foi efectuada em coluna de cromatografia de sílica-gel (AcOEt:n-hexano, 1:1).

Óleo amarelo

η= 75%


CAr-H), 5,48 (1H, s, H12), 4,96 (1H, d, J = 12,8 Hz, OCHHC6H4), 4,94 (1H, d, J = 2,4 Hz,

H10), 4,59 (1H, d, J = 12,8 Hz, OCHHC6H4), 3,58 (3H, s, OCH3), 3,39 (3H, s, NCH3),

2,77-2,65 (1H, m, H9), 2,47-2,36 (1H, m, H4α), 2,11-2,02 (1H, m, H4β), 1,95-1,80 (3H, m,

H5, H8α, H8β), 1,71-1,65 (1H, m, H7), 1,58-1,45 (2H, m, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3),

Parte Experimental

197

1,40-1,23 (2H, m, H5a, H6,), 0,98 (3H, d, J = 6,4 Hz, C9-CH3), 0,97 (3H, d, J = 5,2 Hz,

C6-CH3), 0,95-0,88 (1H, m, H7)

Aldeído do ácido artelínico, 4.5

A uma solução de 4.6 (0,709 mmol, 327 mg) em 8 ml de THF seco, a 0°C,

adicionou-se lentamente LiAlH4 (0,886 mmol, 34 mg). Após uma hora em agitação,

parou-se a reacção, adicionando-se uma solução de KHSO4 (1,24 mmol, 169 mg) em 2 ml

de água. De seguida diluiu-se com água destilada (40 ml) e extraiu-se com éter etílico

(3×30 ml), tendo-se lavado a fase orgânica resultante com uma solução saturada de

NaHCO3 (3×30 ml) e brine (3×30 ml). Secou-se a fase orgânica com sulfato de sódio

anidro, filtrou-se e removeu-se o solvente a pressão reduzida.

Óleo incolor

η=78%

IV, νmáx/cm-1

2928, 1702, 1607, 1457, 1375, 1211, 1102, 870

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 10,02 (1H, s, CHO), 7,88 (2H, d, J = 8,0 Hz, CAr-H), 7,49

(2H, d, J = 8,0 Hz, CAr-H), 5,47 (1H, s, H12), 5,00 (1H, d, J = 13,6 Hz, OCHHC6H4), 4,94

(1H, d, J = 3,6 Hz, H10), 4,62 (1H, d, J = 13,6 Hz, OCHHC6H4), 2,78-2,66 (1H, m, H9),

2,44-2,34 (1H, m, H4α), 2,11-2,03 (1H, m, H4β), 1,94-1,80 (3H, m, H5, H8α, H8β), 1,70-

1,62 (1H, m, H7), 1,56-1,48 (2H, m, H5, H8a), 1,47 (3H, s, C3-CH3), 1,39-1,25 (2H, m,

H5a, H6), 0,99 (3H, d, J = 7,2 Hz, C9-CH3), 0,96 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,94-0,87

(1H, m, H7)

Primaquina neutra 1.44

Na reacção de aminação redutiva utilizou-se a primaquina na forma neutra. Para

tal dissolveu-se a primaquina difosfato (2,19 mmol, 1 g) em 40 ml de água e adicionou-se

uma solução de hidróxido de sódio 10M até pH 10. Efectuou-se a extracção com AcOEt

(3× 80 ml), verificando-se o pH entre cada extracção. Secou-se a fase orgânica resultante

com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente a pressão reduzida.

Parte Experimental

198

Óleo castanho

η=99 %

1H-RMN, (400 MHz, CD3CN) 8,54 (1H, dd, J = 4,0, 1,6 Hz, CAr-H2), 8,03 (1H, dd,

J = 8,2, 1,6 Hz, CAr-H4), 7,39 (1H, dd, J = 8,2, 4,0 Hz, CAr-H3), 6,47 (1H, d, J = 2,4 Hz,

CAr-H5), 6,31 (1H, d, J = 2,4 Hz, CAr-H7), 6,06 (1H, sl, NH), 3,88 (3H, s, CH3O), 3,72-

3,62 (1H, m, CHCH3), 2,63 (2H, t, J = 6,8 Hz, NCH2), 2,02-1,91 (2H, m, NH2) 1,77-1,46

(4H, m, CH2CH2CH), 1,28 (3H, d, J = 6,4 Hz, HCCH3)

13C-RMN, (100,61 MHz, CD3CN) 159,5 (C6), 145,1 (C8), 144,3 (C2), 135,4 (CAr), 134,8

(C4), 129,9 (CAr), 121,8 (C3), 96,7 (C7), 91,6 (C5), 55,2 (CH3O), 48,0 (HCCH3), 42,1

(HNCH2CH2), 34,1 (H2CCH), 30,1 (CH2CH2CH2), 20,6 (HCCH3)


A uma solução em agitação do aldeído 4.5 (0,376 mmol, 151 mg) em 5 ml de

metanol seco a 0°C adicionou-se a primaquina neutra (0,414 mmol, 107 mg) e o ácido

acético glacial (0,376 mmol, 0,022 ml). Posteriormente adicionou-se lentamente

NaBH(OAc)3 (4,14 mmol, 88 mg). A reacção ficou em agitação até atingir a temperatura

ambiente e foi seguida por TLC, tendo sido necessário fazer um reforço de hidreto

(2,07 mmol, 44 mg). Quando a reacção ficou completa diluiu-se com água destilada (20

ml) e adicionou-se uma solução saturada de NaHCO3 até pH 9. Efectuaram-se extracções

com éter etílico (3×40 ml) e a fase orgânica resultante foi seca com sulfato de sódio

anidro, filtrada e evaporada a pressão reduzida. O composto foi purificado por

cromatografia preparativa em placas com sílica gel (eluente, AcOEt:MeOH, 9:1).

Óleo amarelo

η= 39%

IV, νmáx/cm-1

3370, 2933, 2856, 1619, 1523, 1460, 1389, 1166, 1102, 1013, 824

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 8,54 (1H, dd, J = 4,1, 1,4 Hz, CAr-H2), 7,94 (1H, dd, J = 8,0,

1,4 Hz, CAr-H4), 7,32 (1H, dd, J = 8,0, 4,1 Hz, CAr-H3), 7,30-7,23 (4H, m, C6H4), 6,36

(1H, d, J = 2,4 Hz, CAr-H5), 6,30 (1H, d, J = 2,4 Hz, CAr-H7), 6,04 (1H, sl, HCNH), 5,48

(1H, s, H12), 4,92 (1H, d, J = 3,6 Hz, H10), 4,90 (1H, d, J = 12,4 Hz, OCHHC6H4), 4,50

(1H, d, J = 12,4 Hz, OCHHC6H4), 3,91 (3H, s, CH3O), 3,81 (2H, s, C6H4CH2N), 3,67-

3,58 (1H, m, CHCH3), 2,74-2,64 (3H, m, H9α, HNCH2), 2,46-2,33 (1H, m, H4α), 2,11-

Parte Experimental

199

2,02 (2H, m, H4β, H5), 1,95-1,57 (8 H, m, H8α, H8β, H7, CH2CH2CH, CH2NH), 1,55-1,45

(2H, m, H5, H8a), 1,48 (3H, s, C3-CH3), 1,38-1,20 (2H, m, H5a, H6), 1,31 (3H, d,

J = 6,4 Hz, HCCH3), 0,95 (3H, d, J = 6,0 Hz, C9-CH3), 0,96 (3H, d, J = 6,4 Hz, C6-CH3),

0,93-0,86 (1H, m, H7)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 159,4 (CAr), 144,9 (CAr), 144,3 (CAr), 137,4 (CAr), 135,4

(CAr), 134,8 (CAr), 134,7 (CAr), 129,9(CAr), 128,3 (CAr), 127,4 (CAr), 121,8 (CAr), 104,1

(C3), 101,4 (C10), 96,9 (CAr), 91,7 (CAr), 88,0 (C12), 81,2 (C12a), 69,6 (OCH2C6H4), 55,2

(CH3O), 53,3 (C6H4CH2N), 52,6 (C5a), 49,0 (HNCH2CH2), 48,0 (CHCH3), 44,4 (C8a),

37,4 (C6), 36,4 (C4), 34,7 (HCCH2), 34,6 (C7), 34,4 (CH2CH2CH2), 30,9 (C9), 26,2 (C3-

CH3), 24,7 (C5), 24,5 (C8), 20,7 (C6-CH3), 20,4 (HCCH3), 13,1 (C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+H]+: 646,38

6.5.2 - Derivados híbridos C10-carba da artemisinina e primaquina

6.5.2.1 - Híbrido com ligação amida

Dissolveu-se o ácido C10-carba da artemisinina, 3.6, (0,652 mmol, 213 mg) em

5 ml de DMF e adicionou-se TEA (0,655 mmol, 0,092 ml) e TBTU (0,680 mmol,

218 mg) a 0ºC. Posteriormente adicionou-se a primaquina, 1.44, na forma de sal difosfato

(0,645 mmol, 294 mg) dissolvida em 5 ml de DMF com TEA (1,32 mmol, 0,185 ml). A

mistura reaccional ficou em agitação à temperatura ambiente durante a noite.

Adicionou-se 25 ml de AcOEt e 25 ml de solução saturada de NaHCO3 e após separação

das fases, a fase aquosa foi extraída com AcOEt (3×25 ml). Juntaram-se as fases

orgânicas e foram lavadas com NaHCO3 e brine (3×35 ml). Secou-se com sulfato de

sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente a pressão reduzida. A purificação foi

efectuada por cromatografia em coluna de sílica-gel (AcOEt:n-hexano, 3:7).


Sólido amarelo

η= 66 %

p.f.= 127-129° C

Parte Experimental

200

IV, νmáx/cm-1

3366, 3130, 2922, 1667, 1615, 1578, 1519, 1400, 1215, 1170, 1052, 879,

820

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 8,54 (1H, dd, J = 4,0, 1,6 CAr-H2), 7,94 (1H, dd, J = 8,0,

1,6 Hz, CAr-H4), 7,32 (1H, J = 8,0, 4,0 Hz, CAr-H3), 7,13-6,98 (1H, m, CONH), 6,34 (1H,

d, J = 2,4 Hz, CAr-H5), 6,29 (1H, d, J = 2,4 Hz, CAr-H7), 6,03 (1H, d, J = 8,0 Hz, HCNH),

5,35 (1H, s, H12), 4,80-4,71 (1H, m, H10), 3,91 (3H, s, CH3O), 3,70-3,58 (1H, m, HCCH3),

3,51-3,38 (1H, m, HNCHH), 3,24-3,11 (1H, m, HNCHH), 2,62-2,48 (2H, m, H9α,

CHHCO), 2,37-2,23 (2H, m, H4α, CHHCO), 2,03-1,90 (2H, m, H4β, H5), 1,82-1,62 (6H,

m, H8α, H8β, HNCH2CH2CH2), 1,31 (3H, s, C3-CH3), 1,32 (3H, d, J = 6,4 Hz, HCCH3),

1,30-1,10 (5H, m, H5, H5a, H6, H7, H8a), 0,98 (3H, d, J = 5,6 Hz, C6-CH3), 0,96-0,90 (1H,

m, H7), 0,87 (3H, d, J = 7,6 Hz, C9-CH3)


134,8 (CAr), 132,8 (CAr), 129,9(CAr), 121,8 (CAr), 102,8 (C3), 96,7 (CAr), 91,6 (CAr), 90,0

(C12), 80,8 (C12a), 69,7 (C10), 55,2 (CH3O), 51,7 (C5a), 47,7 (CH), 43,4 (C8a), 39,4

(HNCH2), 37,4 (CH2CO), 37,3 (C6), 36,4 (C4), 34,2 (C7), 34,1 (CH2CH), 30,4 (C9), 26,1

(CH2CH2CH2), 25,7 (C3-CH3), 24,8 (C8), 24,7 (C5), 20,5 (C6-CH3), 20,0 (HCCH3), 12,1

(C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+H]+: 567,33

Análise Elementar (%) para C32H45N3O6 + AcOEt; 655,38 gmol-1

. Calculada: C 65,93; H

8,15; N 6,41. Experimental: C 65,21; H 7,72; N 6,73

6.5.2.2 - Híbrido com ligação amina

Amida de Weinreb do ácido C10-carba, 4.8

Dissolveu-se o ácido C10-carba da artemisinina, 3.6, (0,944 mmol, 308 mg) em

4 ml de DCM e adicionou-se TBTU (0,944 mmol, 303 mg) e TEA (0,944 mmol,

0,132 ml) à temperatura ambiente. Após dissolução da mistura reaccional, adicionou-se o

hidrocloreto da O,N-dimetilhidroxilamina (1,038 mmol, 101 mg) e TEA (1,038 mmol,

0,145 ml) em 2 ml de DCM. A reacção foi seguida por TLC e quando completa diluiu-se

com DCM (20 ml) e lavou-se com solução saturada de NaHCO3 e brine (2×20 ml).

Secou-se a fase orgânica com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e evaporou-se o solvente

Parte Experimental

201

sob vácuo. A purificação foi efectuada em coluna de cromatografia de sílica-gel

(AcOEt:n-hexano, 1:1).

Óleo amarelo

η= 56%

IV, νmáx/cm-1

2940, 2874, 1709, 1377, 1252, 1188, 1055, 1013, 941, 878

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 5,38 (1H, s, H12), 4,91-4,83 (1H, m, H10), 3,74 (3H, s,

OCH3), 3,23 (3H, s, NCH3), 2,97-2,88 (1H, m, CHHCO), 2,86-2,79 (1H, m, H9), 2,53-

2,44 (1H, m, CHHCO), 2,41-2,30 (1H, m, H4α), 2,08-2,0 (1H, m, H4β), 1,97-1,59 (3H, m,

H5, H8a, H8), 1,44 (3H, s, C3-CH3), 1,53-1,24 (5H, m, H7 H5, H8 H5a, H6), 0,99 (3H, d,

J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,97-0,93 (1H, m, H7), 0,91 (3H, d, J = 7,2 Hz, C9-CH3)

Aldeído do ácido C10-carba, 4.7

Método a

A uma solução contendo a amida de Weinreb do ácido C10-carba, 4.8,

(0,523 mmol, 193 mg) em 7 ml de THF seco, adicionou-se LiAlH4 lentamente

(0,654 mmol, 25 mg), a 0°C. Após uma hora em agitação, a reacção foi terminada

adicionando-se uma solução de KHSO4 (0,916 mmol, 125 mg) em 2 ml de água. De

seguida diluiu-se com água destilada (15 ml) e extraiu-se com éter etílico (3×10 ml),

tendo-se lavado a fase orgânica resultante com uma solução saturada de NaHCO3

(2×15 ml) e brine (2×15 ml). A fase orgânica secou-se com sulfato de sódio anidro,

filtrou-se e removeu-se o solvente a pressão reduzida.

Óleo incolor

η=85%

Método b

Dissolveu-se o derivado 10β-alil-10-desoxi-dihidroartemisinina, 3.4 (0,162 mmol,

50 mg) em 20 ml de DCM e colocou-se a -78ºC. Fez-se borbulhar O3 durante cerca de

uma hora, seguindo-se a reacção por TLC. Após este tempo fez-se passar uma corrente de

Parte Experimental

202

argón durante dez minutos e adicionou-se trifenilfosfina (0,32 mmol, 84 mg). A agitação

continuou cerca de uma hora a -78ºC e durante a noite à temperatura ambiente, tempo

após o qual se parou a reacção e evaporou-se o solvente. Foi efectuada a purificação da

mistura reaccional por cromatografia em coluna de sílica-gel (AcOEt:n-hexano, 6:4).

Óleo incolor

η=87%

IV, νmáx/cm-1

2926, 2872, 1722, 1377, 1227, 1130, 1057, 1043, 880

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 9,83-9,79 (1H, m, CHO), 5,34 (1H, s, H12), 5,01-4,93 (1H,

m, H10), 2,83-2,65 (2H, m, H9, CHHCO), 2,51-2,43 (1H, m, CHHCO), 2,41-2,30 (1H, m,

H4α), 2,10-2,02 (1H, m, H4β), 1,99-1,66 (3H, m, H5, H8a, H8), 1,43 (3H, s, C3-CH3), 1,50-

1,22 (5H, m, H7 H5, H8 H5a, H6), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz, C6-CH3), 0,97-0,92 (1H, m, H7),

0,89 (3H, d, J = 7,6 Hz, C9-CH3)


A uma solução do aldeído 4.7 (1,74 mmol, 540 mg) em 15 ml de DCM seco, sob

atmosfera de azoto e à temperatura ambiente em agitação, adicionou-se a primaquina

neutra (1,91 mmol, 496 mg). Após cerca de uma hora adicionou-se ácido acético glacial

(2,61 mmol, 0,157 ml) e NaBH(OAc)3 (2,61 mmol, 553 mg) de forma gradual. A reacção

foi seguida por TLC e ficou em agitação durante a noite, tendo-se efectuado uma recarga

de hidreto (1,7 mmol, 369 mg) e ácido acético (1,7 mmol, 0,105 ml ), após cerca de

12 horas. Quando completa adicionou-se uma solução saturada de NaHCO3 até pH 9-10.

Efectuaram-se extracções com éter etílico (2×20 ml) e AcOEt (1×20 ml) e a fase orgânica

resultante foi lavada com brine (1×20 ml), seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e

evaporada a pressão reduzida. O composto foi purificado por cromatografia em coluna de

sílica-gel (AcOEt:MeOH:TEA, 8,9:1:0,1).

Óleo amarelo

η= 63%

IV, νmáx/cm-1

3387, 2926, 2874, 1614, 1574, 1520, 1454, 1385, 1217, 1161, 1051, 878,

824

Parte Experimental

203

1H-RMN, (400 MHz, CDCl3) 8,54 (1H, dd, J = 4,2, 1,6 Hz, CAr-H2), 7,94 (1H, dl,

J = 8,2 Hz, CAr-H4), 7,32 (1H, dd, J = 8,2, 4,2 Hz, CAr-H3), 6,35 (1H, d, J = 2,4 Hz,

CAr-H5), 6,29 (1H, d, J = 2,4 Hz, CAr-H7), 6,03 (1H, sl, HCNH), 5,36 (1H, s, H12), 4,35-

4,24 (1H, m, H10), 3,91 (3H, s, CH3O), 3,72-3,55 (1H, m, CHCH3), 3,06-2,82 (3H, m,

C10CH2CHH, C10CH2CHH, HNCHH), 2,80-2,57 (2H, m, HNCHH, H9), 2,37-2,20 (1H,

m, H4α), 2,09-1,56 (12H, m, H4β, H5, H8α, H8β, H7, C10CH2, CH2CH2CH, CH2NH), 1,44-

1,17 (4H, m, H5, H8a, H5a, H6), 1,36 (3H, s, C3-CH3), 1,32 (3H, d, J = 6,4 Hz, CHCH3),

0,99-0,82 (7H, m, H7, C9-CH3, C6-CH3)

13C-RMN, (100,61 MHz, CDCl3) 159,9 (CAr), 145,1 (CAr), 144,7 (CAr), 135,5 (CAr), 132,8

(CAr), 130,5 (CAr), 122,3 (CAr), 103,5 (C3), 97,9 (CAr), 92,6 (CAr), 90,3 (C12), 81,3 (C12a),

75,4 (C10), 55,7 (CH3O), 52,2 (C5a), 48,8 (NCH2), 48,0 (C10CH2CH2), 47,8 (C10CH2CH2),

47,6 (CH), 43,8 (C8a), 37,6 (C6), 36,8 (C4), 34,6 (C7), 33,7 (CH2CH), 32,3 (CH2CH2CH2),

30,8 (C9), 26,3 (C3-CH3), 25,0 (C8), 23,6 (C5), 20,8 (C6-CH3), 20,4 (HCCH3), 12,7

(C9-CH3)

ESI-MS (+) m/z: [M+H]+: 554,3563

Análise Elementar (%) para C32H47N3O5: 553,35 gmol-1

. Calculada: C 69,41; H 8,56;


6.6 - Estabilidade dos híbridos da artemisinina

6.6.1 - Estabilidade em tampão fosfato

O estudo da estabilidade dos compostos híbridos foi efectuado recorrendo a um

método descontínuo em que várias alíquotas da mistura reaccional foram analisadas ao

longo do tempo por HPLC-UV. O tampão fosfato isotónico pH 7,4 (5 ml) foi colocado

num frasco de reacção, num banho de água previamente termostatizado a 37ºC. Após

estabilização da temperatura, adicionou-se 5 µl da solução stock 10-2

mol dm-3

do

substrato em metanol ou acetonitrilo, obtendo-se assim uma concentração final de

10-5

mol dm-3

. As alíquotas foram retiradas ao longo do tempo e injectadas no

cromatógrafo através de um injector de 20 µl. Dependendo do composto injectado, o

eluente variava de proporções entre a fase aquosa e a fase orgânica. Os ensaios foram

realizados em duplicado. O comprimento de onda utilizado variou no intervalo entre 220

Parte Experimental

204

e 270 nm, conforme o composto em estudo, e foi escolhido pela determinação da

absorvância máxima por espectroscopia de UV-Visível.

6.6.2 - Estabilidade em plasma humano

O sangue para estes estudos foi obtido de vários dadores saudáveis no laboratório

de análises clínicas da Faculdade de Farmácia de Lisboa e recolhido em tubos com

heparinato de sódio. Depois de centrifugado, todo o plasma sobrenadante foi dividido por

vários frascos de vidro (2 ml) e armazenado a -20ºC. Aquando da sua utilização, o plasma

foi descongelado gradualmente de modo a evitar a desnaturação das proteínas.

O estudo foi realizado em plasma humano diluído a 80% com tampão fosfato

isotónico 0,01 moldm-3

pH 7,4, ou seja, 2 ml de plasma com 0,5 ml de tampão fosfato. O

plasma diluído foi colocado num banho termostatizado a 37ºC até estabilização da

temperatura e posteriormente adicionou-se uma alíquota (12,5 µl) da solução stock do

substrato a 10-2

mol dm-3

. Em determinados tempos, começando no tempo zero,

retiravam-se 200 µl da mistura reaccional e colocavam-se num eppendorf contendo

400 µl de acetonitrilo, para precipitação das proteínas do plasma. A mistura foi

centrifugada durante 5 minutos, retirando-se cuidadosamente o sobrenadante e

injectando-o no cromatógrafo. O estudo foi realizado em triplicado.

6.6.3 - Estabilidade em microssomas de fígado de rato

Os microssomas (20 mg/ml de conteúdo proteico) utilizados extraídos de ratos

machos Sprague-Dawley são da marca BD Gentest™, tal como as soluções A

(31 mM NADP+, 66 mM glucose-6-fosfato e 66 mM MgCl2) e B (40 U/ml glucose-6-

fosfato desidrogenase em 5 mM citrato de sódio) regeneradoras de sistema NADPH. A

certificação da actividade enzimática dos microssomas indicada pelo fabricante foi

determinada através da medição da actividade da enzima CYP2E1. Foram efectuados

para tal estudos espectrofotométricos que permitiram quantificar a enzima hidroxilase

responsável pela transformação do p-nitrofenol a p-nitrocatecol 282, 283

.

Incubaram-se 1320 µl de 50 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,4 com 30 µl

de uma solução 5 mM de p-nitrofenol, 75 µl da solução A, 15 µl da solução B e 60 µl de

microssomas (100 µg de proteína), a 37ºC durante 30 minutos. Após este tempo

Parte Experimental

205

adicionaram-se 300 µl de ácido tricloroacético a 20% (v/v) para parar a reacção

enzimática e colocou-se no gelo. Centrifugou-se a cerca de 10.000 g durante 5 minutos.

Transferiu-se 1,5 ml do sobrenadante para um eppendorf contendo 0,750 ml de NaOH

2M e levou-se ao vórtex. Mediu-se a absorvância a 535 nm, utilizando um branco igual à

mistura incubada, em que o volume de microssomas foi substituído por tampão.

A quantificação do produto formado foi efectuada através de uma curva de

calibração do padrão p-nitrocatecol com concentrações de 1, 2, 5, 10 e 20 nmol

(Gráfico 6.1). A actividade da enzima p-nitrofenol hidroxilase, expressa em

pmol/(mg×min) foi determinada pela quantificação da hidroxilação do p-nitrofenol. O

valor experimental de actividade obtido (1040 pmol/(mg×min)) para esta enzima está de

acordo com as especificações do fabricante (880 pmol/(mg×min)).

Para o estudo da estabilidade utilizaram-se os microssomas de fígado de rato aos

quais se adicionaram as soluções A e B. Estas soluções e os microssomas foram

armazenados a -20ºC e -80ºC, respectivamente. Assim, num eppendorf com 920 µl de

PBS, colocou-se 10 µl de microssomas, juntamente com 50 µl da solução A e 10 µl da

solução B e deixou-se estabilizar a temperatura até 37ºC. Adicionaram-se 10 µl do

substrato 10-2

mol dm-3

, de modo a obter uma concentração final de 10-4

mol dm-3

. Foram

retiradas alíquotas a determinados tempos, sendo a reacção terminada por adição de

100 µl da amostra a 900 µl de acetonitrilo, para precipitar as proteínas. A mistura

resultante foi homogeneizada em vórtex e posteriormente centrifugada a 10.000 g. O

sobrenadante foi injectado no cromatógrafo, contendo uma concentração de 10-5

mol dm-3

de substrato, para proceder à sua análise por HPLC.

Gráfico 6.1- Gráfico que correlaciona a absorvância em função da concentração de p-

nitrocatecol em mol/l.

y = 0,1219x + 0,009

R² = 0,9995

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 1 2 3

Ab

s.

[ ] ×××× 10-5 mol/l

Parte Experimental

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Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 (2009) 3229–3232

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Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters

journal homepage: www.elsevier .com/ locate/bmcl

Artemisinin-dipeptidyl vinyl sulfone hybrid molecules: Design, synthesisand preliminary SAR for antiplasmodial activity and falcipain-2 inhibition

Rita Capela a, Rudi Oliveira a, Lídia M. Gonçalves a, Ana Domingos b, Jiri Gut c, Philip J. Rosenthal c,Francisca Lopes a,*, Rui Moreira a

a iMed.UL, Faculty of Pharmacy, University of Lisbon, Av Prof. Gama Pinto, 1649-003, Portugalb CMDT, IHMT, Universidade Nova de Lisboa, R. Junqueira 96, 1349-008 Lisboa, Portugalc Department of Medicine, San Francisco General Hospital, University of California, San Francisco, Box 0811, San Francisco, CA 94143, USA

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history:Received 3 April 2009Revised 21 April 2009Accepted 21 April 2009Available online 3 May 2009

Keywords:AntimalarialArtemisininFP-2Vinylsulfone

0960-894X/$ - see front matter 2009 Elsevier Ltd. Adoi:10.1016/j.bmcl.2009.04.100

* Corresponding author. Tel.: +351 217946476; faxE-mail address: [email protected] (F. Lopes).

A series of artemisinin–vinyl sulfone hybrid molecules with the potential to act in the parasite food vac-uole via endoperoxide activation and falcipain inhibition was synthesized and screened for antiplasmo-dial activity and falcipain-2 inhibition. All conjugates were active against the Plasmodium falciparum W2strain in the low nanomolar range and those containing the Leu-hPhe core inhibited falcipain-2 in lowmicromolar range.

2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

OO

OO

R

H

1, R = =O2, R = β-Me3, R = β-Et

H1

23

4 5 6

7

8

9

10

12 8a

5

HN

O

SPh

OOO

NH

N

P3

P1

P1'

P2

Ph

O

Artemisinin, 1, a sesquiterpene lactone isolated from the Artemi-sia annua Chinese herb, and its analogues (e.g., artemether, 2, artee-ther, 3, and artesunate, 4; Fig. 1) were a major breakthrough inmalaria chemotherapy because they produce a very rapid therapeu-tic response, particularly against multidrug-resistant Plasmodiumfalciparum malaria.1,2 Despite the rapid clearance of parasites, theshort half-lives of these compounds lead to many late recrudes-cences after monotherapy.3 Thus, artemisinin-based combinationtherapy (ACT) has now been recommended by the World HealthOrganisation as standard therapy for falciparum malaria.4

Cysteine proteases from malaria parasites are of particularinterest as therapeutic targets due to their role in parasite develop-ment.5 P. falciparum expresses four cysteine proteases from the pa-pain family known as falcipains, of which falcipain-2 (FP-2)6,7 andfalcipain-3 (FP-3)7,8 are the most relevant as therapeutic targets.Peptidyl vinyl sulfones, for example, 5, are potent irreversibleinhibitors of falcipains, acting as Michael acceptors of the catalyticcysteine residue.9 Falcipain inhibitors have been shown to inhibitthe development of cultured erythrocytic parasites by blockingthe hydrolysis of host hemoglobin and to cure mice infected withlethal malaria infections.10

A concern regarding the use of protease inhibitors as antimala-rials is that selection of drug-resistant mutants will eventually

ll rights reserved.

: +351 217946470.

occur. Indeed, parasites resistant to a dipeptidyl vinyl sulfone havebeen selected in the laboratory, although this resistance was some-what unstable.11 Thus, dipeptidyl vinyl sulfones are obvious candi-dates for combination antimalarial therapy as a strategy to retardthe development of resistance. This information prompted us todesign artemisinin–vinyl sulfone hybrid molecules with thepotential to help prevent multi-drug resistance in P. falciparummalaria. It has recently been shown that hybrid molecules in whichthe two antimalarials are combined via a linker can offer aneffective means of delivering these agents to the parasite site ofaction.12–14

4, R = α-CO(CH2)2CO2Na

Figure 1. Structures of artemisinin 1, artemether, 2, arteether, 3, sodium artesu-nate, 4, and a dipeptidyl vinyl sulfone, Mu-Leu-hPhe-VSPh, 5.

mailto:[email protected]

http://www.sciencedirect.com/science/journal/0960894X

http://www.elsevier.com/locate/bmcl

R =1 CH2CH2Ph, CH2PhR =2 CH2CHMe2, CH2Ph, HR =3 Ph, Me

OO

OO

O

H

HN

O

SR

OOR 2

3

R1

NH

O

6

3230 R. Capela et al. / Bioorg. Med. Chem. Lett. 19 (2009) 3229–3232

Structure–activity relationship (SAR) data for the inhibition of FP-2reveals that peptidyl vinyl sulfones containing a Leu residue at theP2 position and a hPhe (homophenylalanine) at the P1 position, forexample, 5, are the most active, with IC50 values in the low-nMrange.6,8,15,16 With this information in hand we designed hybridmolecules 6, in which the vinyl sulfone component is linked tothe endoperoxide moiety via the N-terminus, using a 4-hydroxym-ethylbenzoic acid linker. In addition to the Leu-hPhe sequence,compounds 6 containing the Phe-hPhe and Phe-Phe moieties werealso prepared based on the SAR against falcipains16 and cruzain,17

a related cysteine protease from Trypanosoma cruzi. The substituentat the P01 position was a methyl or phenyl group.

The synthesis of compounds 6 involved the preparation of alde-hydes 9 containing the P1 residue, using Weinreb chemistry andthe appropriate Na-Boc-protected amino acids 7 (Scheme 1).18,19

The Horner–Wadsworth–Emmons reaction of 9 with the appropri-ate sulfones 10, prepared by oxidation of the corresponding sulfidewith H2O2 in AcOH,18 afforded the amino acyl vinyl sulfones, 11.The Boc group was removed with trifluoroacetic acid (TFA) and the

BocHN CO2H

R1

BocHN

R1

O

NMe

OMe Boc

NH

R1

SR3

O O

OBocHN

R2

8a, R1 = CH2Ph, 99%8b, R1 = CH2CH2Ph, 98%

(i) (ii)

(iv) (v)

14

OO

OO

O

H

CO2H

15, 69%

(vi) (vii)OO

OO

OH

H

7a, R1 = CH2Ph7b, R1 = CH2CH2Ph

9a, R1

9b, R

12a-f , 61-76%

CF3CO2H .

Scheme 1. Reagents and conditions: (i) TBTU, TEA, HN(Me)OMe, DCM; (ii) LiAlH4, THF; (iTFA, DCM; (vi) BF3OEt2, HOCH2C6H4CO2H; (vii) 13a–f, TBTU, TEA, DMF, rt.

resulting trifluoroacetates were then reacted with the second Na-Boc-protected amino acid and TBTU, to yield the Na-Boc-protecteddipeptidyl vinyl sulfones 12a–f. These were quantitatively deprotec-ted to 13a–f with TFA. Finally, compounds 13 were converted in rea-sonable to good yields into the target compounds, 6a–f, by reactionwith 15 (artelinic acid, synthesized from dihydroartemisinin, 1420)and TBTU.21 The hybrid molecules 6a–f were isolated as single iso-mers as shown by the 1H NMR spectra,21 which presented (i) onlyone singlet at d ca. 5.4 ppm, corresponding to the H-12 signal and(ii) a small coupling constant for the H-10 signal at d 4.9 ppm, J ca4 Hz, indicative of a vicinal equatorial–axial coupling with H-9. Thisresult, which is similar to that for precursor 15 (J = 3.7 Hz for the H-10 signal), is consistent with the b-isomer at C-10.

The semi-synthetic artemisinin derivatives 6a–f were screenedfor FP-2 inhibition and compared to dipeptidyl vinyl sulfones andE64 (Table 1). Selectivity assays were also carried out by testingcompounds 6a–d against chabaupain-1 (CP-1), a cysteine proteasefrom the murine parasite P. chabaudi.22 inspection of the data inTable 1, shows that the Leu-hPhe sequence leads to a higher levelof FP-2 inhibition than the Phe-hPhe (6d vs 6c and 6f vs 6e) or Phe-Phe counterparts (6c vs 6b), in line with the SAR for dipeptidyl vi-nyl sulfones.15,16 In contrast, a Phe residue at the P2 position is pre-ferred for CP-1 inhibition (e.g., 6b and 6c), implying that thisenzyme presents a different structural requirement for molecularrecognition at this position. The presence of the endoperoxide moi-ety at the amino (P3) terminus of the dipeptide sequence decreasessignificantly the inhibitory potency. The IC50 ratio for compounds6d, 12d and 5 is 1650:70:1, which suggests that voluminousgroups at position P3 in dipeptidyl vinyl sulfones are deleteriousfor FP-2 inhibition. Finally, the effect of substituents at the P01 posi-tion seems to be dependent on the dipeptide core. Interestingly,the reduction in activity observed when the phenyl group is ex-changed for a methyl at P01 in compounds with the Phe-hPhe moi-ety (6c vs 6e) is in line with that reported for Mu-Phe-hPhe vinylsulfones.16

The antiplasmodial activity of compounds 6a–f was screenedagainst the chloroquine-resistant W2 strain of P. falciparum (Table

HN

R1

O

H

OP SO2R3EtO

EtO

BocHN

R1

SR3

O O

10a, R3 = Ph10b, R3 = Me

(iii)

= CH2Ph, 93%1 = CH2CH2Ph, 87%

11a, R1 = CH2Ph, R3 = Ph, 67%11b, R1 = CH2CH2Ph, R3 = Ph, 68%11c, R1 = CH2CH2Ph, R3 = Me, 48%

NH

R1

SR3

O O

OH2N

R2

6a, R1 = CH2Ph, R2 = H, R3 = Ph, 66%6b, R1 = CH2Ph, R2 = CH2Ph, R3 = Ph, 62%6c, R1 = CH2CH2Ph, R2 = CH2Ph, R3 = Ph, 77%6d, R1 = CH2CH2Ph, R2 = CH2CHMe2, R3 = Ph, 53%6e, R1 = CH2CH2Ph, R2 = CH2Ph, R3 = Me, 59%6f , R1 = CH2CH2Ph, R2 = CH2CHMe2, R3 = Me, 65%

13a-f , 100%

ii) 10a or 10b, NaH, THF; (iv) (a) TFA, DCM; (b) BocAAOH, TBTU, HOBt, TEA, DMF; (v)

Table 1Effect of hybrid compounds 6, artemisinin (1), artelinic acid (15), dipeptidyl vinyl sulfones 5 and 12d and E64 on the inhibition of falcipain-2, chabaupain-1, and growth of P.falciparum W2 strain

Compound R1 R2 R3 IC50/lM IC50/nM

FP-2a CP-1b W2 P. falciparuma

Artemisinin — — — ND ND 12.0 ± 1.9715 — — — ND ND 5.66 ± 0.586a CH2Ph H Ph 16.5 56.8 4.09 ± 0.136b CH2Ph CH2Ph Ph 22.4 0.40 2.27 ± 0.736c CH2CH2Ph CH2Ph Ph 9.22 0.538 3.94 ± 0.286d CH2CH2Ph CH2CHMe2 Ph 4.95 2.29 2.08 ± 0.896e CH2CH2Ph CH2Ph Me 21.6 ND 4.81 ± 0.126f CH2CH2Ph CH2CHMe2 Me 0.35 ND 4.21 ± 0.5612d CH2CH2Ph CH2CHMe2 Ph 0.21 ND >10,0005 CH2CH2Ph CH2CHMe2 Ph 0.003c ND 22.0d

E64 — — — 0.084 0.009 1955 ± 121

ND, not determined.a Assays of falcipain inhibition and parasite development were determined as described earlier.15

b Assay of chabaupain inhibition was performed as described previously.22

c Non-recombinant falcipain.16

d Itg2 strain.16

Table 2IC50 values of compounds 6a, 6e and 6f, chloroquine and artemisinin against the W2, FCR3, 3D7, VI/S and D6 P. falciparum strains

Compound IC50/nM

W2 FCR3 3D7 VI/S D6

Chloroquine 78.1 ± 6.91 51.1 ± 0.1 11.6 ± 1.1 65.0 ± 4.1 16.9 ± 2.1Artemisinin 12.0 ± 1.97 5.38 ± 0.54 9.71 ± 4.18 4.24 ± 0.54 14.5 ± 1.26a 4.09 ± 0.13 1.75 ± 0.32 3.11 ± 0.72 1.59 ± 0.11 4.71 ± 0.126e 4.81 ± 0.12 2.00 ± 0.02 2.50 ± 1.51 2.25 ± 0.24 4.75 ± 0.376f 4.21 ± 0.56 1.89 ± 0.10 2.48 ± 0.41 1.65 ± 0.11 4.96 ± 0.66

R. Capela et al. / Bioorg. Med. Chem. Lett. 19 (2009) 3229–3232 3231

1). All hybrids 6 displayed activity in the nM range, being moreactive than artemisinin and equipotent to artelinic acid, 15. Thisresult strongly suggests that the endoperoxide pharmacophoreis the major contributor to the antiplasmodial activity exertedby compounds 6. This hypothesis is further supported by the ab-sence of swollen food vacuoles in trophozoites incubated with 6.We have previously shown that this specific abnormality, ob-served when parasites are incubated with dipeptidyl vinyl sulf-ones and E64, is indicative of a block in hemoglobinhydrolysis.23 The lack of a food vacuole abnormality for deriva-tives 6 can be explained by the relatively poor activity of hybridsagainst FP-2 and/or limited access to the food vacuole. Com-pounds 6a, 6e and 6f were also screened against 4 additional Pfalciparum strains with different phenotypes: FCR3 (atovaquoneresistant), 3D7 (chloroquine-sensitive), V1/S (chloroquine andpyrimethamine resistant) and D6 (chloroquine sensitive, meflo-quine resistant) (Table 2). The IC50 values show the superioractivity of compounds 6a, 6e and 6f when compared to chloro-quine and artemisinin against all strains.

In summary, a new class of hybrid molecules, 6, based on dipep-tidyl vinyl sulfone and artemisinin cores has been synthesized andshown to display potent antiplasmodial activity against a panel ofP. falciparum chloroquine-sensitive and multidrug-resistantstrains, with IC50 values ranging from 2 to 5 nM. Despite the factthat these hybrids incorporate the structural elements requiredfor falcipain inhibition (e.g., Leu residue at P2), they inhibited FP-2 only in the lM range. These results indicate that, although theartemisinin core or the linker may not be suitable for optimal en-zyme binding, there is space to improve the bi-functional mole-cules as the SAR for both activities is better understood. Thesynthesis of novel hybrid molecules incorporating vinyl sulfoneand artemisinin cores is underway.

Acknowledgements

This work was supported by FCT (Portugal) and the NationalInstitutes of Health; R.C. acknowledges FCT for the PhD grantSFRH/BD/30418/2006. PJR is a Doris Duke Charitable FoundationDistinguished Clinical Scientist.

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21. Compound 6d. To a solution of 15 (103.7 mg, 0.248 mmol) in DMF (2 ml) stirredat 0 C were added TBTU (86.3 mg, 0.258 mmol), Et3N (35 ll, 0.249 mmol) anda solution of 13d (129.6 mg, 0.245 mmol) and Et3N (35 ll, 0.249 mmol) in DMF(2 ml). The reaction was allowed to warm slowly to room temperature andmonitored by TLC. After completion, the reaction mixture was diluted withAcOEt (25 ml) and then poured into saturated NaHCO3 (25 ml). The layers wereseparated and the aqueous layer was extracted twice with AcOEt (15 ml). Thecombined organic layers were treated with saturated NaHCO3, HCl 1 N andbrine and then dried over Na2SO4.The solvent was removed and the crudeproduct was purified by column chromatography using AcOEt/hexane (1:1), togive 6d, 53% (106.7 mg) yield, as a white solid, mp 102–104 C. 1H NMR(400 MHz, CDCl3) dH (ppm) 7.89 (2H, m), 7.74 (2H, d, 8.4 Hz), 7.65 (1H, m), 7.56

(2H, t, 7.6 Hz), 7.40 (2H, d, 8.4 Hz), 7.20 (3H, m), 7.03 (2H, m), 6.93 (1 H, dd,15.2, 5.2 Hz), 6.70 (1H, d, 8.4 Hz), 6.48 (1H, dd, 15.2, 1.6 Hz), 6.44 (1H, d,8.0 Hz), 5.47 (1H, s), 4.96 (1H, d, 13.2 Hz), 4.93 (1H, d, 3.6 Hz), 4.74–4.65 (1H,m), 4.64–4.55 (1H, m), 4.58 (1H, d, 13.2 Hz), 2.71 (1H, m), 2.59 (2H, m), 2.40(1H, m), 2.07 (1H, m), 2.02–1.73 (5H, m), 1.70–1.60 (5H, m), 1.57–1.25 (7H, m),1.02–0.90 (12H, m). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) dC (ppm) 171.5, 167.7, 145.4,142,9, 140.3, 140.1, 133.6, 132.3, 130.9, 129.4, 128.6, 128.4, 127.7, 127.3, 127.1,126.3, 104.2, 101.6, 88.1, 81.1, 69.1, 52.5, 52.2, 49.2, 44.3, 40.2, 37.4, 36.4, 35.6,34.6, 31,8, 30.9, 26.2, 25.0, 24.7, 24.5, 22.9, 22.2, 20.3, 13.1. Anal. (C, H, N) Calcdfor C46H58N2O9S: C, 67.73; H, 7.12; N, 3.44; Found: C, 67.58; H, 7.20; N, 3.35.ESI/MS (m/z): Calcd for C46H58N2O9SNa+: 838.04. Found: 838.24.

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Design and Evaluation of Primaquine-Artemisinin Hybrids as aMultistage Antimalarial Strategy†

Rita Capela,1‡ Ghislain G. Cabal,2‡ Philip J. Rosenthal,3 Jiri Gut,3 Maria M. Mota,2Rui Moreira,1 Francisca Lopes,1* and Miguel Prudencio2*

iMed.UL—Faculdade de Farmacia, Universidade de Lisboa, Av. Prof. Gama Pinto, 1649-003 Lisbon,1 and Unidade deMalaria, Instituto de Medicina Molecular, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, Av. Prof. Egas Moniz,

1649-028 Lisbon,2 Portugal, and Department of Medicine, San Francisco General Hospital, University ofCalifornia, San Francisco, Box 0811, San Francisco, California 941433

Received 21 June 2011/Returned for modification 18 July 2011/Accepted 26 July 2011

It is widely accepted that the struggle against malaria depends on the development of new strategies to fightinfection. The “magic bullet” thought to be necessary to reach eradication should not only provide treatmentfor all Plasmodium spp. that infect human red blood cells but should also eliminate the replicative and dormantliver forms of the parasite. Moreover, these goals should ideally be achieved by using different mechanisms ofaction so as to avoid the development of resistance. To that end, two hybrid molecules with covalently linkedprimaquine and artemisinin moieties were synthesized, and their effectiveness against the liver and bloodstages of infection was compared in vitro and in vivo with those of the parent compounds. Both hybridsdisplayed enhanced in vitro activities, relative to those of the parent compounds, against Plasmodium bergheiliver stages. Both compounds were about as potent as artemisinin against cultured Plasmodium falciparum(50% inhibitory concentration [IC50], 10 nM). When used to treat a murine P. berghei infection, one of themolecules displayed better efficacy than an equimolar mixture of the parent pharmacophores, leading toimproved cure and survival rates. These results reveal a novel approach to the design and evaluation ofantimalarials based on the covalent combination of molecules acting on different stages of the parasite lifecycle.

The combination of pharmacological agents may enable syn-ergistic interactions, where the efficacy of a single agent isenhanced by the addition of a second compound. Hybrid (orbifunctional ligand) compounds, where two pharmacophoresare combined in a single molecule, can be considered an ex-tension of the concept of drug combinations in which thechallenges of ensuring compliance with complex regimens orcoformulating different compounds into a single tablet can beavoided. Hybrid molecules have been designed for use in var-ious therapeutic areas, such as inflammation (6, 16), allergy(2), and depression (20). Typically, two pharmacophores areconjugated through a linker unit, creating a single chemicalentity that is able to modulate multiple targets. This covalentlinkage may present advantages over combinations of the twoconstituent drugs. These include enhanced uptake of a com-ponent due to the physicochemical properties of the other

component, stronger synergism between the two componentsdue to their proximity, or improvement of individual pharma-cokinetic, stability, or side effect profiles (35).

Malaria remains the most important vector-borne disease inthe world, threatening 40% of the human population andcausing hundreds of millions of infections and about 1 milliondeaths each year (39). Malaria is caused by protozoan Plasmo-dium parasites that infect their mammalian hosts in two con-secutive stages. The hepatic (liver) stage is initiated whensporozoites injected through the bite of an Anopheles mosquitotravel to the liver and infect hepatocytes, where a clinicallysilent asexual multiplication phase takes place, generatingthousands of merozoites. The release of merozoites into thebloodstream marks the beginning of the erythrocytic (blood)stage of infection, during which parasites infect red blood cells(RBCs), undergo repeated asexual replication cycles, and giverise to clinical illness (28).

Plasmodium falciparum is responsible for most malaria-as-sociated mortality worldwide, and it is by far the predominantspecies in Africa. The other Plasmodium species that infecthumans are P. vivax, P. ovale, P. malariae, and P. knowlesi. Theasexual blood stages of malaria parasites, which are solelyresponsible for illness, are the targets of most available drugs.Among these, artemisinin (ART) and its derivatives are highlyeffective, fast-acting antimalarials and are particularly usefulagainst strains of P. falciparum resistant to other agents. Theyhave proven effective against all species capable of causinghuman malaria and are generally advocated for the treatmentof uncomplicated P. falciparum malaria as components ofART-based combination therapies (ACTs) in which the ART

* Corresponding authors. Mailing address for Francisca Lopes:iMed.UL—Faculdade de Farmacia, Universidade de Lisboa, Av. Prof.Gama Pinto, 1649-003 Lisbon, Portugal. Phone: 351 217946476. Fax:351 217946470. E-mail: [email protected]. Mailing address for MiguelPrudencio: Unidade de Malaria, Instituto de Medicina Molecular,Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, Av. Prof. EgasMoniz, 1649-028 Lisbon, Portugal. Phone: 351 217999509. Fax: 351217999504. E-mail: [email protected].

† Supplemental material for this article may be found at http://aac.asm.org/.

‡ R.C. and G.G.C. contributed equally to this work. Published ahead of print on 1 August 2011.

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component is partnered with a second, longer-acting agent(37).

P. vivax, which is about as prevalent as P. falciparum, and P.ovale uniquely produce chronic liver forms called hypnozoites,which can remain dormant for extended periods before initi-ating a blood-stage infection (relapse) (25). Primaquine (PQ)is the only approved drug against hepatic stages of malariaparasites, including parasites acutely infecting the liver andhypnozoites. No other available drugs reliably clear hypnozo-ites. PQ also acts against sexual stages, known as gametocytes;this activity disrupts the transmission of infection to mosqui-toes (21). Thus, PQ is provided in combination with an agentthat clears blood-stage parasites to achieve a radical cure ofinfections with P. vivax or P. ovale and thereby prevent relapsesdue to the development of subsequent blood-stage infectionsfrom hypnozoites (3).

In this work, we describe the synthesis of hybrid moleculescontaining PQ and ART pharmacophoric units. We report ontheir efficacies against Plasmodium liver and blood stages, bothin vitro and in animal models of malaria, and demonstrate theirpotential as lead compounds for the development of novelantimalarial drugs.

MATERIALS AND METHODS

Chemical synthesis. (i) General description. Melting points were determinedusing a Kofler camera Bock monoscope M and are uncorrected. Nuclear mag-netic resonance (NMR) spectra were recorded on a Bruker 400 Ultra-Shieldspectrometer. Chemical shifts are reported in ppm using either tetramethylsilaneor the solvent peak as an internal standard. Data are reported as follows:chemical shift, integration, multiplicity (s, singlet; brs, broad singlet; d, doublet;t, triplet; dd, double doublet; brd, broad doublet; m, multiplet), and couplingconstant (J), reported in hertz. High-resolution mass spectra were recorded byelectron impact using a Hewlett-Packard HP5988A system (University of Santi-ago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain). Low-resolution mass spec-tra were recorded using a Micromass Quattro micro API mass spectrometer.Elemental analyses were performed using a CE Instruments EA 1110 automaticanalyzer (University of Santiago de Compostela). Column chromatography wasperformed with a silica gel (230/400 mesh ASTM; Merck), and preparativethin-layer chromatography (TLC) was performed on silica gel GF254 (Merck).Analytical TLC was performed on precoated silica gel F254 (Merck). Artemisininwas purchased from Fraken Company, China, and was 99% pure. Dihydroarte-misinin and artelinic acid were synthesized from artemisinin according to refer-ence 5. 10-Allyldeoxoartemisinin was prepared according to reference 14. Allthe other reagent-grade chemicals were bought from Sigma-Aldrich (Spain),Merck (Spain), or Alfa Aesar (Spain). Tetrahydrofuran (THF) was dried bydistillation from sodium benzophenone.

(ii) Synthesis of hybrid compound 7. A suspension of O,N-dimethylhydroxy-lamine hydrochloride (90.4 mg; 0.93 mmol) in dichloromethane (1 ml) andtriethylamine (129 l; 0.93 mmol) was added to a solution of artelinic acid,compound 4 (352 mg; 0.84 mmol) in dichloromethane (3 ml), O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N,N-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) (270 mg; 0.84mmol), and triethylamine (118 l; 0.84 mmol). After stirring for 7 h, the reactionmixture was diluted with dichloromethane (20 ml), and the organic phase waswashed with saturated NaHCO3, treated with brine, and dried with anhydrousNa2SO4. Removal of the solvent under reduced pressure gave the hydroxamatecompound 5 as a yellow oil (yield, 91%). 1H NMR (CDCl3) 7.68 (2H, d, J 8.0), 7.37 (2H, d, J 8.0), 5.48 (1H, s), 5.02 to 4.90 (2H, m), 4.58 (1H, d, J 12.8), 3.58 (3H, s), 3.39 (3H, s), 2.71 (1H, m), 2.40 (1H, m), 2.07 (1H, m), 1.93to 1.82 (3H, m), 1.66 (1H, m), 1.57 to 1.43 (2H, m), 1.48 (3H, s), 1.37 to 1.23 (3H,m), 0.98 (3H, d, J 6.4), 0.97 (3H, d, J 5.6). Lithium aluminum hydride (33.6mg; 0.89 mmol) was added to a solution of the hydroxamate compound 5 (327mg; 0.71 mmol) in dry tetrahydrofuran (8 ml) at 0°C. The reaction mixture wasstirred for 1 h at 0°C, after which it was quenched using a solution of KHSO4 (191mg; 1.4 mmol) in water (2 ml), diluted with water (40 ml), and extracted threetimes with ethyl ether (30 ml). The combined organic extracts were washed withsaturated NaHCO3 and brine, dried (with anhydrous NaSO4), and evaporatedunder reduced pressure to give the aldehyde compound 6 as a colorless oil

sufficiently pure to be used in the next step (yield, 78%). 1H NMR (CDCl3) 10.02 (1H, s), 7.88 (2H, d, J 8.0), 7.49 (2H, d, J 8.0), 5.47 (1H, s), 5.00 (1H,d, J 13.6), 4.94 (1H, d, J 3.6), 4.62 (1H, d, J 13.6), 2.72 (1H, m), 2.39 (1H,m), 2.07 (1H, m), 1.94 to 1.80 (3H, m), 1.65 (1H, m), 1.56 to 1.48 (2H, m), 1.47(3H, s), 1.39 to 1.25 (3H, m), 0.99 (3H, d, J 7.2), 0.96 (3H, d, J 6.0). To asolution of the aldehyde compound 6 (64.0 mg; 0.16 mmol) in methanol (MeOH)(2 ml) and glacial acetic acid (9.15 l; 0.16 mmol) at 0°C were sequentially addedprimaquine, compound 1 as a free base (46 mg; 0.176 mmol), and NaBH3CN (11mg; 0.176 mmol). The reaction mixture was allowed to warm up to room tem-perature. After the completion of TLC, the reaction mixture was diluted withwater (10 ml) and acidified to pH 2 to 3 with a 10% (wt/vol) aqueous hydro-chloric acid solution. This solution was washed with ethyl ether, neutralized witha 30% (wt/vol) sodium hydroxide solution, and extracted three times with ethylether (10 ml). The combined ether extracts were dried over Na2SO4; the solventwas removed under reduced pressure; and the residue was purified by prepara-tive chromatography using ethyl acetate (AcOEt) as an eluent to give the finalcompound 7 as a yellow syrup (yield, 39%). 1H NMR (CDCl3) 8.54 (1H, dd, J 1.5, 4.2), 7.94 (1H, dd, J 1.5, 8.2), 7.32 (1H, dd, J 4.2, 8.2), 7.28 (4H, m), 6.35(1H, d, J 2.4), 6.29 (1H, d, J 2.4), 6.03 (1H, brs), 5.48 (1H, s), 4.92 (1H, d,J 4.0), 4.90 (1H, d, J 12.4), 4.52 (1H, d, J 12.4), 3.91 (3H, s), 3.81 (2H, brs),3.62 (1H, m), 3.03 (1H, brs), 2.74 to 2.63 (3H, m), 2.40 (1H, m), 2.11 to 2.01 (2H,m), 1.95 to 1.56 (7H, m), 1.55 to 1.20 (5H, m), 1.48 (3H, s), 1.31 (3H, d, J 6.4),0.95 (6H, brd); m/z 646.38.

(iii) Synthesis of hybrid compound 10. Sodium periodate (278 mg; 1.3 mmol)and potassium permanganate (31 mg; 0.2 mmol) were added to a stirred solutionof 10-allyldeoxoartemisinin, compound 8 (99 mg; 0.32 mmol) in 20 ml acetone,and 20 ml water at room temperature. On completion of the reaction, thereaction mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reducedpressure, treated with 10 M NaOH until basic, and washed with ethyl ether. Theaqueous phase was then acidified to pH 1 with concentrated HCl. The aqueousphase was extracted three times with ethyl ether (20 ml). The combined organicextracts were dried over Na2SO4 and were concentrated to give the carboxylicacid derivative, compound 9, as a yellow oil (yield, 67%). 1H NMR (CDCl3) 5.39 (1H, s), 4.88 (1H, m), 2.77 to 2.63 (2H, m), 2.52 (1H, m), 2.35 (1H, m), 2.1to 1.92 (2H, m), 1.82 (1H, m), 1.77 to 1.66 (2H, m), 1.48 to 1.2 (5H, m), 1.43 (3H,s), 0.99 (3H, d, J 5.6), 0.90 (3H, d, J 7.6). To a solution of compound 9 (133mg; 0.407 mmol) in dimethylformamide (3 ml) stirred at 0°C were added TBTU(142 mg; 0.425 mmol), triethylamine (57 l; 0.409 mmol), and a solution ofprimaquine diphosphate salt, compound 1 (183 mg; 0.403 mmol), and triethyl-amine (115 l; 0.826 mmol) in dimethylformamide (3 ml). The reaction mixturewas allowed to warm up to room temperature, and the reaction was monitoredby TLC. After completion, the reaction mixture was diluted with ethyl acetate(25 ml) and was then poured into saturated NaHCO3 (25 ml). The layers wereseparated, and the aqueous layer was extracted twice with ethyl acetate (25 ml).The combined organic layers were treated with saturated NaHCO3 and brine andwere then dried over Na2SO4. The solvent was removed, and the crude productwas purified by column chromatography using ethyl acetate–hexane (1:1) to givecompound 10 as a yellow solid (yield, 43%), with a melting point (mp) of 127 to129°C. 1H NMR (CDCl3) 8.54 (1H, dd, J 1.6, 4.0), 7.94 (1H, dd, J 1.6, 8.0),7.32 (1H, dd, J 4.0, 8.0), 7.07 (1H, m), 6.34 (1H, d, J 2.4), 6.29 (1H, d, J 2.4), 6.03 (1H, d, J 8.0), 5.35 (1H, s), 4.75 (1H, m), 3.91 (3H, s), 3.65 (1H, m),3.44 (1H, m), 3.18 (1H, m), 2.62 to 2.48 (2H, m), 2.37 to 2.23 (2H, m), 2.03 to 1.90(2H, m), 1.82 to 1.65 (7H, m), 1.30 to 1.10 (5H, m), 1.32 (3H, d, J 6.4), 1.32(3H, s), 0.98 (3H, d, J 5.6), 0.87 (3H, d, J 7.6). Analysis (C, H, N) calculatedfor C32H45N3O6 AcOEt: C, 65.93; H, 8.15; N, 6.41. Found: C, 65.21; H, 7.72; N,6.73; m/z 567.33.

Parasites, cells, and mice. In vitro blood schizonticidal activity assays wereperformed as reported elsewhere (8). Briefly, synchronized ring-stage P. falcip-arum strain W2 parasites were cultured with multiple concentrations of testcompounds (added from 1,000 stocks in dimethyl sulfoxide [DMSO]) in RPMI1640 medium with 10% human serum. After 48 h of incubation, when controlcultures contained new rings, parasites were fixed with 1% formaldehyde inphosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4, for 48 h at room temperature; thenthey were labeled with YOYO-1 (1 nM; Molecular Probes) in 0.1% Triton X-100in PBS. Parasitemia was determined from dot plots (forward scatter versusfluorescence) acquired on a FACSort flow cytometer using CellQuest software(Becton Dickinson). Fifty percent inhibitory concentrations (IC50s) for growthinhibition were determined with GraphPad Prism software from plots of thepercentage of parasitemia of the control relative to the inhibitor concentration.In each case, the goodness of the curve fit was documented by R2 values of 0.95.

Plasmodium berghei ANKA sporozoites expressing luciferase or green fluores-cent protein (GFP) (parasite lines 676m1cl1 and 259cL2, respectively), wereobtained from 21- to 28-day infected female Anopheles stephensi mosquitoes (22,

VOL. 55, 2011 MULTISTAGE ANTIMALARIAL HYBRIDS 4699

26). Mosquitoes bred at the Insectary of the Instituto de Medicina Molecular,Lisbon, Portugal, were previously infected by feeding on infected mice usingstandard methods. When required, the salivary glands of the mosquitoes werecollected by hand dissection in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM;GIBCO), homogenized with a plastic pestle, and filtered on a cell strainer(70-m-pore-size nylon; BD Falcon). The free sporozoites were counted in aNeubauer counting chamber using phase-contrast microscopy. For infections bymosquito bite, infected mosquitoes were starved overnight and were then al-lowed to feed on anesthetized mice for 30 min, at a proportion of 10 mosquitoesper mouse.

Cells of the Huh7 human hepatoma cell line were cultured in RPMI medium(Gibco/Invitrogen) supplemented with 10% fetal calf serum, 1% nonessentialamino acids, 1% penicillin-streptomycin, 1% glutamine, and 10 mM HEPES (pH7) (all from Gibco/Invitrogen) and were maintained at 37°C under 5% CO2. Forinfection, P. berghei sporozoites obtained from freshly dissected mosquito sali-vary glands were added directly to the culture medium, and cell culture plateswere centrifuged for 5 min at 1,800 g to promote contact of the parasites withthe Huh7 cell monolayer.

C57BL/6 mice were bred and housed in the pathogen-free facility of theInstituto de Medicina Molecular, Lisbon, Portugal. All protocols were approvedby the Animal Care Committee of the Instituto de Medicina Molecular.

Luciferase assay for liver-stage infection in vitro. Huh7 cells at about 50 to60% confluence were incubated with the test compounds for 1 h and were theninfected in 96-well plates at a multiplicity of infection of 0.4 with luciferase-expressing P. berghei sporozoites obtained from freshly dissected mosquito sali-vary glands. The medium was replaced 24 h after infection by new mediumcontaining freshly diluted drugs. At 46 h after infection, cell confluence wasassessed by the alamarBlue (Biosource/Invitrogen) assay. Briefly, this assay isbased on an oxidation-reduction indicator that both fluoresces and changes colorin response to chemical reduction of the culture medium resulting from cellgrowth. Cells were incubated for 1.5 h with fresh medium containing 5%alamarBlue, and fluorescence was measured (excitation wavelength, 530 nm;emission wavelength, 590 nm) with a Tecan Infinite M200 microplate reader.Following alamarBlue measurement, cells were washed once with PBS and werelysed with 75 l of cell culture lysis reagent obtained from the Promega luciferaseassay system kit. Samples in lysis buffer were either stored at 20°C or processedimmediately to measure luminescence intensity. In the latter case, 35 l of thecell lysate was transferred to white 96-well plates (Nunc) and was mixed with 50l of luciferase assay substrate, freshly reconstituted with luciferase assay buffer(Promega luciferase assay system kit). Luminescence was measured over 100 mswith a Tecan Infinite M200 microplate reader within the 3 min following theaddition of the luciferase assay substrate.

FACS analysis of in vitro liver-stage infection. Huh7 cells at about 60%confluence were treated in 24-well plates with the different compounds and wereinfected 1 h later with GFP-expressing P. berghei sporozoites obtained fromfreshly dissected mosquito salivary glands at a multiplicity of infection of 0.3.Fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis at 4 h and 48 h after infec-tion was performed as previously described (26, 29).

In vivo analysis of liver-stage development by luminescence. Luciferase activityin animals was visualized at 44 h after infection with luciferase-expressing P.berghei sporozoites, as previously described (22). Briefly, D-luciferin (Caliper LifeSciences) dissolved in PBS (100 mg/kg of body weight) was injected subcutane-ously in the necks of the animals. Five minutes later, mice were anesthetized byintraperitoneal (i.p.) injection of xylazine (20 mg/kg) and ketamine (120 mg/kg)dissolved in PBS. Bioluminescence measurements were performed in an IVISLumina imaging system (Caliper Life Sciences) 10 min after D-luciferin injection.

Assessment of liver parasite loads by qRT-PCR. Determination of liver par-asite loads in vivo was carried out as previously described (27). Briefly, total RNAwas isolated from livers by using Qiagen’s RNeasy Mini kit according to themanufacturer’s instructions. Livers were collected and homogenized in a dena-turing solution (4 M guanidine thiocyanate; 25 mM sodium citrate [pH 7], 0.5%sarcosyl, and 0.7% -mercaptoethanol in diethyl pyrocarbonate-treated water)40 h after sporozoite injection. Total RNA was extracted using the QiagenRNeasy Mini kit according to the manufacturer’s instructions. RNA for infectionmeasurements was converted into cDNA by using the Roche Transcriptor first-strand cDNA synthesis kit according to the manufacturer’s protocol. The quan-titative real-time PCRs (qRT-PCRs) used the Applied Biosystems Power SYBRgreen PCR master mix and were performed according to the manufacturer’sinstructions on an ABI Prism 7500 Fast system (Applied Biosystems). Amplifi-cation reactions were carried out in a total reaction volume of 25 l, containing0.8 pmol/ml or 0.16 pmol/ml of the P. berghei ANKA 18S rRNA gene- orhousekeeping gene-specific primers, respectively. Relative amounts of P. bergheiANKA mRNA were calculated against the amount of the hypoxanthine guanine

phosphoribosyltransferase (HGPRT) housekeeping gene. Primer sequences spe-cific to each gene were as follows: for the P. berghei ANKA 18S rRNA gene,5-AAG CAT TAA ATA AAG CGA ATA CAT CCT TAC-3 and 5-GGAGAT TGG TTT TGA CGT TTA TGT G-3; for the mouse HGPRT gene,5-TGC TCG AGA TGT GAT GAA GG-3 and 5-TCC CCT GTT GAC TGGTCA TT-3; and for the human HGPRT gene, 5-TGC TCG AGA TGT GATGAA GG-3 and 5-TCC CCT GTT GAC TGG TCA TT-3.

Assessment of parasitemia. Giemsa staining followed by microscopic analysiswas performed daily to assess the presence or absence of parasites in the blood,and parasitemia was quantified by flow cytometry as previously described (26).

RESULTS

Design and synthesis of primaquine-artemisinin hybrids.Hybrid compound 7 was synthesized by starting from artelinicacid (Fig. 1), a derivative of ART previously used in our lab-oratory to prepare hybrid molecules, including vinyl sulfoneinhibitors of falcipain-2 (5). Artelinic acid has been shown tobe the most metabolically stable of the derivatives of ART(17). It was converted to the corresponding hydroxamate, com-pound 5, by reaction with N,O-dimethylhydroxylamine, whichwas then reduced to the aldehyde compound 6. Reductiveamination of compound 6 using PQ in methanol gave thedesired hybrid compound 7, with an overall yield of 28%.Hybrid compound 10 was designed to replace the oxygen at theC-10 position with a carbon, a modification expected to pro-duce a compound with greater hydrolytic stability, a longerhalf-life, and potentially lower toxicity (23). Hybrid compound10 was synthesized from 10-allyldeoxoartemisinin, compound8, in two steps, involving oxidation of the allyl moiety andcoupling of the resulting acid with PQ, with an overall yield of29% (Fig. 1). The structural identification of the hybridcompounds was performed using mass spectrometry and nu-clear magnetic resonance spectrometry (correlation spectros-copy [COSY] and heteronuclear correlation spectroscopy[HETCOR] experiments).

Inhibition of hepatic P. berghei infection by primaquine-artemisinin hybrids. To evaluate the abilities of compounds 7and compound 10 to inhibit Plasmodium infection of liver cells,we tested them on an established in vitro infection system thatemploys a human hepatoma cell line (Huh7) and the rodentparasite P. berghei. Huh7 cells were incubated with variousamounts of each compound or compound mixture prior to theaddition of transgenic, luciferase-expressing P. berghei sporo-zoites, and total infection loads were quantified 48 h later byluminescence measurements of cell lysates (22). Effects on cellproliferation and survival were assessed by fluorescence mea-surements following 1.5 h of incubation with alamarBlue.Compounds 7 and 10 had potent parasite-inhibitory effects,displaying IC50 values 66 and 18 times lower, respectively,than that of a 1:1 PQ-ART mixture (Fig. 2). Treatment withART had no detectable effect on P. berghei liver-stage infec-tion. Importantly, at the concentrations used in this experi-ment, none of the hybrid compounds showed any effect onHuh7 cell proliferation, as measured by alamarBlue fluores-cence (Fig. 2). Flow cytometry-based analysis of GFP-express-ing P. berghei 48 h after the addition of P. berghei to Huh7 cellsshowed that compounds 7 and 10 and a PQ-ART mixturecaused dose-dependent decreases in parasite development, asassessed by the geometrical means of the GFP intensities ofinfected cells (26) (see Fig. S1 in the supplemental material).Thus, the hybrid molecules acted by preventing intracellular

4700 CAPELA ET AL. ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER.

parasite replication, in accordance with our previous data forthe parent compound PQ (34). Compound 10 also showedmodest inhibition of cell invasion by the parasites, as shown bythe infection rate measured 4 h after the addition of parasitesto the cells (see Fig. S1A in the supplemental material). Al-though the IC50s determined by this method were 1.5- to2.5-fold higher than those determined by luminescence, theyindicated similar relative efficacies for the three sets of com-pounds and confirmed that compound 7 displayed a muchstronger inhibitory effect than the PQ-ART mixture.

We next tested the abilities of the hybrid compounds toinhibit P. berghei liver infection in mice. Mice were infected byintravenous (i.v.) injection of 10,000 luciferase-expressing P.berghei sporozoites, and liver parasite loads were assessed 42 hlater following the injection of luciferin (22). We observedsignificant decreases in parasite loads in the livers of micetreated with a single intraperitoneal (i.p.) injection of 26.5mol/kg (equivalent to 12 mg/kg of PQ) of compound 7 or 10,delivered 3 h after infection, although this effect was lessmarked than that observed in mice similarly treated with PQ(see Fig. S2A in the supplemental material). We then investi-

gated whether administration of the compounds during theliver stage would affect the subsequent appearance of para-sitemia. Mice infected with GFP-expressing P. berghei sporo-zoites and treated 3 h later by i.p. injection of 26.5 mol/kg ofcompound 7, compound 10, or PQ were monitored daily forthe appearance of parasitemia (see Fig. S2B in the supplemen-tal material) and disease symptoms. Remarkably, while com-pound 10 had no effect on infection, administration of com-pound 7 during the liver stage delayed or prevented theappearance of parasites to an extent similar to that of PQ (seeFig. S2B). Importantly, these results are consistent with therelative in vitro efficacies of compounds 7 and 10 against he-patic infection (Fig. 2).

Having established the efficacy of i.p. administration of com-pound 7 during liver infection, we then assessed efficacy whenthe compounds were administered orally. We compared theactivities of the hybrid molecules with that of an equimolarmixture of PQ and ART. Four 65.9-mol/kg (equivalent to 30mg/kg of PQ) doses of the compounds were administered byoral gavage 30 min, 15 h, 23 h, and 39 h after infection of micewith GFP-expressing P. berghei sporozoites. Parasite loads in

FIG. 1. Syntheses. Shown are the chemical structures of primaquine (compound 1), artemisinin (compound 2), dihydroartemisinin (compound3), and artelinic acid (compound 4) and synthetic schemes for hybrid compounds 7 and 10.


livers collected 44 h postinfection were then determined byquantitative real-time PCR (Fig. 3A). The results were inagreement with those obtained following i.p. treatment (seeFig. S2A in the supplemental material), with oral administra-tion of compound 7 resulting in near-abrogation of liver infec-tion. Finally, in a parallel experiment, mice were infected withGFP-expressing P. berghei sporozoites and were treated 4 hlater with a single 65.9-mol/kg oral dose of the compounds,followed by daily monitoring of blood for parasitemia. As ex-pected, no parasitemia was detected in mice treated with thePQ-ART mixture (Fig. 3B), presumably due to parasite clear-ance in the liver by PQ. Four out of 6 mice treated withcompound 7 were also blood-stage negative at the end of theexperiment. Importantly, parasites were detected in the bloodof three mice in this group up to day 5 postinfection but werethen cleared, suggesting that the hybrid may remain in thecirculation for a considerable time or that an immune responsecontributed to parasite clearance.

Overall, these results indicate that the PQ-ART hybrid mol-ecules display strong antiplasmodial effects during the liverstage of infection. In particular, compound 7 displayed strongin vivo efficacy as a liver-stage antimalarial. Since our in vitroresults showed that ART alone does not possess significantactivity against Plasmodium liver stages, these data suggest thatthe hybrid molecule constitutes a modification of PQ thatpotentiates its effect, rendering it more effective at lower molaramounts.

Treatment of Plasmodium parasitemia with primaquine-ar-temisinin hybrids. As P. falciparum resistance to chloroquinebecame increasingly widespread, artemisinin-based therapies

became the standard means of treating malaria in nearly allcountries where the disease was endemic (18). Thus, we as-sessed the in vitro activities of compounds 7 and 10 against theerythrocytic stage of P. falciparum and compared these activi-ties with those of PQ and ART. While PQ showed only modestactivity in these assays, as expected, compounds 7 and 10 andART all yielded potent inhibitory effects, with IC50s in thenanomolar range (Table 1).

We then compared the in vivo therapeutic efficiencies of thehybrid compounds and ART in the treatment of an establishedmurine blood infection. C57BL/6 mice were infected by i.p.injection of 106 P. berghei-infected RBCs (iRBCs), and theirparasitemia was monitored daily until their percentages ofiRBCs reached 2 to 3%. At this point, mice were treated daily,for 4 days, by subcutaneous injection of 31.8 mol/kg (equiv-alent to 9 mg/kg of ART) of compound 7, compound 10, orART, an amount corresponding to the reported 90% effectivedose (ED90) for ART administered by this route (24), whilecontrol mice were treated with equivalent amounts of a sol-vent. Mice were then monitored daily for parasitemia anddisease symptoms (see Fig. S3 in the supplemental material).As expected, the parasitemia of solvent-treated control miceincreased steadily until they perished with symptoms of exper-imental cerebral malaria (19) between days 7 and 8 postinfec-tion. Conversely, the parasitemia of compound-treated micedecreased soon after the initiation of treatment, approachingzero for all mice around day 9 postinfection. However, para-sitemia recurred at days 12 to 13 postinfection in mice treatedwith ART or compound 7 (see Fig. S3A and B in the supple-mental material), and all mice in these two groups eventually

FIG. 2. In vitro inhibition of hepatic Plasmodium berghei infection by compounds 7 and 10. (A to C) Compounds were added to Huh7 hepatomacells 1 h before infection with luciferase-expressing sporozoites. An amount of DMSO equivalent to that in the highest compound concentrationtested was used as a control. Forty-eight hours after the addition of P. berghei sporozoites, cell confluence (red lines on bar plots) was assessed byalamarBlue fluorescence, and the infection rate (bars) was measured by quantifying the luciferase activity by luminescence. The effects of differentconcentrations of compound 7 (A), compound 10 (B), and a 1:1 mixture of primaquine and artemisinin (C) are shown. Results are expressed asmeans standard deviations. (D) For each compound, the IC50 was calculated by sigmoidal fitting. Red, compound 7; orange, compound 10;green, primaquine plus artemisinin.


succumbed on days 15 to 16 and 16 to 17 postinfection, respec-tively. These outcomes were presumably due to hyperpara-sitemia, since the mice did not display symptoms of experimen-tal cerebral malaria (see Fig. S3C in the supplementalmaterial). Importantly, mice treated with compound 10 did notexperience recurrent parasitemia after initial clearance of in-fections. Instead, they remained blood-stage negative through-out the duration of the experiment (see Fig. S3A and B) andhad a 100% survival rate (see Fig. S3C).

In view of these results, we investigated the efficacy of oraladministration of the hybrid molecules in the treatment of apatent blood infection. In this experiment, mice were infectedby i.v. injection of 10,000 GFP-expressing P. berghei sporozo-ites, and treatment was initiated when the level of parasitemiareached 2 to 3%. Both hybrid molecules and an equimolarmixture of PQ and ART were administered daily by oral ga-vage for 10 days, at 31.8 mol/kg per dose. We selected adosage expected to be suboptimal for orally administered ar-temisinin (24) in order to facilitate comparison of the efficaciesof the different treatments. Mice were monitored daily forparasitemia, disease symptoms, and survival (Fig. 4). As ex-pected, all control mice died with symptoms of experimentalcerebral malaria between days 7 and 8 after infection. Mostnoticeably, parasitemia and survival rates were remarkably in-creased in mice treated with compound 10 over those for thePQ-ART mixture (Fig. 4). These results are in agreement withthose obtained after i.p. dosing (see Fig. S3 in the supplemen-tal material) and demonstrate that the hybrid molecules can beadministered orally to treat malaria.

Overall, our results show that both hybrid molecules, andparticularly compound 10, can be used to control an ongoingblood-stage infection with greater efficacy than that of the

FIG. 3. In vivo inhibition of Plasmodium berghei liver-stage infection and blood patency by oral administration of compounds 7 and 10. C57BL/6mice (n 6) were infected by intravenous injection of 10,000 GFP-expressing P. berghei sporozoites. (A) Mice were treated by oral administrationof the different compounds in the amounts and at the times noted in the text. Parasite liver loads (P. berghei ANKA 18S rRNA; relative quantitynormalized against that of the host HGPRT gene) were assessed by quantitative real-time PCR 44 h after infection. (B) Mice were treated by asingle administration of the compounds in the amounts and at the time noted in the text, and the appearance of parasites in the blood wasmonitored daily. The percentage of mice with parasitemia under the detection limit (parasite-free mice) is shown.

TABLE 1. In vitro blood schizonticidal activity, molecular weight,and ClogP for primaquine, artemisinin, and

hybrid compounds 7 and 10

Compound IC50 (nM)a Mol wt ClogPb

Primaquine 3,300 55 259 2.76Artemisinin 8.2 0.9 282 2.90Compound 7 12.5 1.1 646 5.88Compound 10 9.1 0.6 568 5.25

a Determined against the chloroquine-resistant P. falciparum strain W2.b ClogP is an estimate of the value of the logarithm of the partition coefficient

between 1-octanol and water, calculated using ALOGPS software (http://www.vcclab.org/lab/alogps/). The logP values measure a compound’s lipophilicity(higher values mean higher lipophilicity).


parent compound ART or ART-PQ. Interestingly, althoughcompound 10 had a lower IC50 than compound 7 in vitro, it wasmore active in vivo, suggesting enhanced pharmacokineticproperties or stability. Indeed, compound 10 was designed toreplace the oxygen at the C-10 position with a carbon, a mod-ification expected to produce a compound that was both lesstoxic and more stable (23).

DISCUSSION

Treatment of malaria relies on agents that eliminate blood-stage infection, notably ART derivatives, and, in the case of P.vivax and P. ovale infections, PQ to eradicate dormant liver-stage parasites (7, 11). Optimal therapy might incorporateagents active against both blood- and liver-stage parasites inthe same molecule. To this end, we have synthesized two hy-brid molecules, compounds 7 and 10, that covalently combine

the PQ and ART pharmacophores. We found that these com-pounds displayed antimalarial efficacies that in some instanceswere superior to those of the parent compounds.

There is consensus that efforts to eradicate malaria shouldbe multifaceted and that new and effective antimalarial drugswill constitute essential tools in this struggle (1, 37). PQ is thecompound of reference against the liver stage of mammalianinfection by Plasmodium, while ART derivatives, such as arte-sunate and artemether, are the compounds of referenceagainst blood-stage parasites. PQ is usually employed in com-bination with blood schizonticides, in particular chloroquine(12) or ART derivatives (9, 32, 33), to prevent relapses in P.vivax infections and to reduce malaria transmission followingtreatment (31, 33). Two studies on chimeric PQ-containingmolecules, in which PQ was linked to statin-based inhibitors ofplasmepsins, have been reported (10, 30). Although these dou-

FIG. 4. In vivo treatment of Plasmodium berghei blood infection by oral administration of compounds 7 and 10. C57BL/6 mice (n 5) wereinfected by intravenous injection of 105 GFP-expressing sporozoites. Oral administration of the compounds was initiated when parasitemia reached2 to 3% and was carried out daily for 10 days. (A) Blood parasite patency, monitored daily by flow cytometry. The percentages of mice withparasitemia under the detection limit are shown. (B) Survival plot showing the percentages of live mice throughout the duration of the experiment.


ble drugs displayed improved in vitro blood schizonticidal ac-tivities relative to those of the single compounds, no data wereprovided on their in vitro effects against Plasmodium liverstages or on their in vivo activities against liver and bloodstages. Both hybrids described in the present study displayedmarked antiplasmodial activity in vitro against liver stages, withIC50s lower than those reported for PQ (22) (Fig. 2). Our invitro results suggest that the efficacy of PQ is increased by theintroduction of the ART pharmacophoric unit into the hybridmolecules. Additionally, both hybrid molecules significantlyreduced parasite loads in the livers of mice following intrave-nous injection of sporozoites, although this effect was lowerthan that of PQ (Fig. 3A; see also Fig. S2A in the supplementalmaterial). Taken together, our data suggest that the greater invitro efficacy of the compounds was, to some extent, counter-balanced by a decrease in their bioavailability, metabolic sta-bility, or other factors necessary for in vivo activity. Activitymay be limited by the fact that the drug needs to cross severalbarriers before reaching the intrahepatic parasite, which re-sides inside a parasitophorous vacuole. Nevertheless, whensporozoites were delivered by mosquito bite and infection wasallowed to proceed to the blood stage, compound 7 displayedsignificant in vivo efficacy in controlling parasitemia (see Fig.S2B in the supplemental material). Further, compound 7 wasalso efficacious when administered orally following i.v. injec-tion of sporozoites, although in this case its effect was not aspotent as that of the PQ-ART mixture (Fig. 3B). We thereforespeculate that the reduced bioavailability of compound 7 iscompensated for by its strong efficacy against the liver stage,which, combined with its blood schizonticidal activity (see be-low), renders it a promising compound for the treatment of P.vivax malaria.

Antimalarial therapy increasingly involves the use of drugcombinations as a means of improving treatment efficacy andreducing the development of resistance (4, 38). The emphasison fixed-dose antimalarial drug combinations has led logicallyto the development of hybrid molecules that covalently jointwo distinct antimalarial moieties. Most antimalarial hybridmolecules have been designed to act solely on the asexualblood stages of the parasite (reviewed in reference 35). Onlytwo of these designs included ART as one of the units in thechimeric molecule, coupled with either mefloquine (13) orquinine (36). The ART-mefloquine hybrids were more effec-tive at controlling parasitemia in P. berghei-infected mice thanartemether (13). The ART-quinine chimera was tested only invitro, where it showed anti-P. falciparum activity superior tothat of ART alone, quinine alone, or a 1:1 mixture of ART andquinine (36). The data obtained with our hybrid compoundsindicate that the covalent linkage of the PQ and ART unitsleads to enhanced efficacy in the treatment of a patent blood-stage infection over that of the parent compounds, particularlyin the case of compound 10 (Fig. 4). It is not clear why a similareffect was not observed for compound 7, despite the similarityof the in vitro activities of compounds 7 and 10 (Table 1).Differences in activity might be explained by differences incompound stability. Another possibility is that the differentialactivities shown by compounds 7 and 10 against blood and liverstages may result from different preferences of the two com-pounds for RBCs and hepatocytes.

The design of compounds with a predefined multitarget pro-

file presents several important challenges to medicinal chem-ists, not the least of which is achieving a design that confers“drug-like” properties on the resulting molecule (15). In thiswork we describe, for the first time, the ability of hybrid PQ-ART molecules to inhibit the liver and blood stages of mam-malian Plasmodium infection. Our data constitute a proof ofprinciple that paves the way for the exploitation of a multistagehybrid approach in drug-based strategies for malaria controland eradication.

ACKNOWLEDGMENTS

Ines Albuquerque is gratefully acknowledged for help with the as-sessment of parasite patency in Giemsa-stained blood smears.

M.P. holds a Ciencia 2007 position from the Portuguese Ministry ofScience and Technology. R.C. acknowledges FCT for Ph.D. grantSFRH/BD/30418/2006, and G.G.C. acknowledges the FP7 of the Eu-ropean Commission for Marie Curie fellowship FP7-PEOPLE-IEF-2008-235864. This work was supported by Portuguese Foundation forScience and Technology grant PTDC/SAUMII/099118/2008 toM.P. P.J.R. is a Distinguished Clinical Scientist of the Doris DukeCharitable Foundation.

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SHORT COMMUNICATION

Effect of Synthesized Inhibitors on Babesipain-1,a New Cysteine Protease from the Bovine PiroplasmBabesia BigeminaT. M. Martins1,2, L. M. D. Goncalves3, R. Capela3, R. Moreira3, V. E. do Rosario2 and A. Domingos1,2

1 Unidade de Tecnologias de Proteınas e Anticorpos Monoclonais, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Lisboa, Portugal2 Centro de Malaria e Doencas Tropicais, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Lisboa, Portugal3 iMed.UL, Faculty of Pharmacy, University of Lisbon, Lisbon, Portugal

Introduction

The tick-transmitted pathogen Babesia is an intracellular

haemoprotozoan parasite of the phylum Apicomplexa

causing a malaria-like disease, called babesiosis, responsi-

ble for a considerable worldwide economic, medical and

veterinary impact. Live-attenuated vaccines are used for

the control of cattle babesiosis but outbreaks are common

as the vaccines are strain-specific. The identification of

new drug targets for chemotherapy is a pressing priority

for the control of babesiosis.

Cysteine proteases (CP) from parasites are of particular

interest as therapeutic targets because of their role in

parasite development. Cysteine protease inhibitors

reduced in vitro the invasion of erythrocytes as well as the

growth of B. bovis (Okubo et al., 2007). In this work, one

gene belonging to the Family C1 of CP from B. bigemina,

called babesipain-1, was expressed in an Escherichia coli

system and tested against inhibitors designed for

falcipains, similar enzymes from the malaria parasite

Plasmodium falciparum.

Material and Methods

The full-length babesipain-1 gene was amplified from

B. bigemina genomic DNA by polymerase chain reaction,

and cloned in the pGEX-6P-1 expression vector (GE

Healthcare, Buckinghamshire, UK). Constructs were trans-

formed into E. coli BL21 cells (GE Healthcare). Insoluble

inclusion bodies were washed with a urea buffer and the

resulting denatured and reduced glutathione S-transferase-

babesipain-1 protein was refolded and later acidified to

promote auto activation to an active form.

Babesipain-1 activity was assayed by a fluorimetric

assay as previously described (Caldeira et al., 2009).

Inhibitors stock solutions were prepared in dimethyl sulf-

oxide (DMSO), and serial dilutions were made in DMSO.

Controls were performed using enzyme alone, substrate

Keywords:

Babesia; cysteine proteases; babesipain-1;

recombinant expression; inhibition studies

Correspondence:

A. Domingos, Unidade de Tecnologias de

Proteınas e Anticorpos Monoclonais, Instituto

de Higiene e Medicina Tropical, Estrada do

Paco do Lumiar 22, 1649-038 Lisboa,

Portugal. Tel.: +351210924712; Fax:

+351217163636; E-mail:

[email protected]

Received for publication January 26, 2010

doi:10.1111/j.1865-1682.2010.01102.x

Summary

Papain-like cysteine proteases (CP) have been shown to have essential roles in

parasitic protozoa and are under study as promising drug targets. One gene

was identified by sequence similarity search to be homologous to the CP family

in the ongoing Babesia bigemina genome sequencing project database. The

newly identified CP gene, called babesipain-1, was cloned and expressed as a

fusion protein, and the effect of different inhibitors on proteolytic activity was

tested. A series of new artemisinin-vinyl sulfone hybrid molecules were tested

as inhibitors being effective on the range of 0.3–30 lm, depending on the core-

containing molecule.

Transboundary and Emerging Diseases

68 ª 2010 Blackwell Verlag GmbH • Transboundary and Emerging Diseases. 57 (2010) 68–69

alone and enzyme with DMSO. Inhibition concentration

50 (IC50) values were determined by nonlinear regression

analysis.

Results

The putative gene, named babesipain-1 (GenBank acces-

sion no. FJ859910), with high homology to the query

sequences of members of the C1 family of CP from

Theileria annulata, was found by tblastn in the unfinished

B. bigemina genome database. Babesipain-1is an intronless

gene and has an expected ORF size of 1377 bp. The

deduced amino acid sequence presents features character-

istic of CP, including the critical cysteine residue and

members of the catalytic triad.

New artemisinin-vinyl sulfone hybrid molecules have

showed potential to help prevent multi-drug resistance in

P. falciparum malaria (Capela et al., 2009). The potential

of these new compounds as inhibitors of the babesipain-1

was evaluated and the results of IC50 are presented on

Table 1.

Discussion

In previous studies, genome alignments showed that in

the Babesia species studied there is only one babesipain-1

gene while T. annulata and T. parva genome show seven

and six ortholog genes respectively. The recombinant

active babesipain-1 which shows typical properties of a

papain-family CP was tested against inhibitors designed

based on falcipains structure. The semi-synthetic artemisi-

nin derivatives 6a–d were screened for falcipain-2 and

chabaupain-1 inhibition presenting good inhibition

results on the range of lm while the inhibition of growth

of resistant P. falciparum strains was on the nm range

(Capela et al., 2009). In this study, we have also tested

the same family of newly synthesized compounds against

babesipain-1, a CP from B. bigemina. The data in Table 1,

show that a small change in the R1 group leads to a dif-

ferent level of babesipain-1 inhibition (6c versus 6b).

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Table 1. Effect of hybrid compounds 6 on the inhibition of babepsin-

1 activity

Compounda R1 R2 R3

Inhibition

concentration 50 (lm)

6a CH2Ph H Ph 30.3

6b CH2Ph CH2Ph Ph 26.9

6c CH2CH2Ph CH2Ph Ph 0.349

6d CH2CH2Ph CH2CHMe2 Ph 0.700

aCompounds are Artemisinin-dipeptidyl vinyl sulfone hybrid molecules

described on Capela et al., 2009.

T. M. Martins et al. Effect of Synthesized Inhibitors on Babesipain-1

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