ULTRA-ESTRUTURA DE LEUCÓCITOS, PERFIL HEMATOLÓGICO E

BIOQUÍMICO SÉRICO DE AVESTRUZES (Struthio camelus, Linnaeus

1758) CRIADAS NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

SÉRGIO FERNANDES BONADIMAN

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

MAIO/2008

II

III

ULTRA-ESTRUTURA DE LEUCÓCITOS, PERFIL HEMATOLÓGICO E

BIOQUÍMICO SÉRICO DE AVESTRUZES (Struthio camelus, Linnaeus

1758) CRIADAS NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

SÉRGIO FERNANDES BONADIMAN

“Dissertação apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense ”Darcy Ribeiro”, como parte

das exigências para obtenção do título de

Mestre em Biociências e Biotecnologia”

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

MAIO/2008

IV

ULTRA-ESTRUTURA DE LEUCÓCITOS, PERFIL HEMATOLÓGICO E

BIOQUÍMICO SÉRICO DE AVESTRUZES (Struthio camelus, Linnaeus

1758) CRIADAS NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

SÉRGIO FERNANDES BONADIMAN

“Dissertação apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia da Universidade

Estadual do Norte Fluminense “Darcy Ribeiro”,

como parte das exigências para obtenção do

título de Mestre em Biociências e Biotecnologia

(Biologia Celular)”

Aprovada em 20 de maio de 2008

Comissão Examinadora:

___________________________________________________________________

Profa. Nádia Regina Pereira Almosny (Dra. Medicina Veterinária) - UFF

___________________________________________________________________

Prof. Arthur Giraldi Guimarães (Dr. Biofísica) – UENF

___________________________________________________________________

Prof. Milton Masahiko Kanashiro (Dr. Biociências) – UENF

___________________________________________________________________

Prof. Renato Augusto DaMatta (Dr. Biofísica) – UENF

(Orientador)

V

“Não diga que as estrelas estão mortas

Só porque o céu está nublado.

Não se iluda, o pé que dá fruta é o que mais leva pedra.

A raiz é uma flor, que despreza a fama...”

Wado

VI

Agradecimentos

Ao Prof. Renato DaMatta, não só pela amizade e companheirismo mas pela

orientação, incentivo e troca de idéias.

Ao amigo Luis Fernando Vieira pelo altruísmo na ajuda com as coletas de campo.

Aos meus avós (Honório, Rosa, José e Morcina) e pais (Honory e Rosa) pelos

ensinamentos e exemplos de caráter, honestidade e seriedade.

À minha linda, Roberta, pela ajuda com as diagramações, paciência com a distância

e todo amor dado.

Ao Prof. Clóvis Santos pela amizade, oportunidades de trabalho e revisão desta

dissertação.

Ao Prof. Flávio Miguens pelo auxílio prestado nos experimentos de citoquímica.

Aos Profs. Carlos Veiga, Edilene Silva e Humberto Couto, pelos ensinamentos e

confiança nas colaborações que muito acrescentaram à minha formação.

Aos técnicos do LBCT (Adriana Martins, Artur Rodrigues, Beatriz Ribeiro, Darli

Grativol, Márcia Adriana Dutra, Rosemary Maciel e Sérgio Rangel Braga) pela

prestatividade e ótimo convívio.

Aos Profs. Antônio Albernaz e Francisco de Oliveira, e ao biólogo Josias Machado

pela troca de experiências e auxílio na mensuração da hemoglobina e captura de

imagens.

Ao Dr. José Morgado e ao Msc Daniel Tanaka, INCA/RJ, pela hospitalidade e

disponibilização do microscópio eletrônico em tempos de dificuldade.

VII

As fazendas parceiras, Campos Avestruz e Avestrucenter, nas pessoas do Sr.

Oswaldo e do veterinário Paulo Castro respectivamente, além dos funcionários, pela

disponibilidade e cooperação.

Aos biólogos Carlos Bacelar e Rodrigo Dias e a técnica Layra, do Laboratório Plíno

Bacelar pela disponibilização de seus equipamentos para realização dos ensaios

bioquímicos.

Aos alunos Gustavo Stratievsky, Diego Medina e Nicole Ederly pela ajuda e

aprendizado.

Aos colegas do programa de pós-graduação em biociências e biotecnologia, em

especial ao Guilherme Rabelo, Joseph Evaristo, Emílio Castro, Daniel Zandonadi,

Denise Klein, Cristiane Carvalho, Elaine Roiffé, Luiz Renato Maciel e Jorge André.

Aos meus irmãos (Júnior, Marco Antônio e Marcus César) por toda amizade e apoio

ao longo desses 10 anos em Campos.

Aos grandes amigos que fiz nesse longo período em Campos (República da Mãe

Joana, Bonde da Cirrose e banda Dumêiprufim). Grandes irmãos que deixarão

saudades.

Ao CAPES, CNPq, FAPERJ, TECNORTE e UENF pelo apoio financeiro e logístico.

VIII

Sumário Página

Agradecimentos VI

Sumário VIII

Lista de figuras X

Lista de tabelas XII

Lista de abreviações XIII

Resumo XIV

Abstract XV

Introdução 1

Avestruz 1

Hematologia aviária 3

Heterófilos 5

Eosinófilos 6

Basófilos 6

Linfócitos 7

Monócitos 7

Trombócitos 8

Bioquímica sérica 8

Aspartato aminotransferase 9

Creatina quinase 9

Ácido úrico 10

Glicose 10

Colesterol 10

Proteínas plasmáticas 11

Eletrólitos 11

Considerações finais 12

Objetivos gerais 13

Objetivos específicos 13

Materiais e métodos 14

Animais 14

Coleta de sangue e obtenção dos hemogramas 15

Microscopia óptica 17

IX

Ultra-estrutura 17

Rotina 17

Peroxidase 18

Bioquímica 18

Aspartato aminotransferase 18

Creatina quinase 19

Ácido úrico 19

Glicose 19

Colesterol 20

Proteínas plasmáticas 20

Eletrólitos 20

Resultados 22

Leucócitos 22

Hematologia 29

Bioquímica sérica 31

Discussão 33

Conclusão 43

Referências Bibliográficas 44

X

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1 Ratitas encontradas no mundo de hoje. A: emú. B: ema,

representante sul americana do grupo. C: avestruzes macho

(esquerda) e fêmea (direita). D: cassoar. E: kiwi.

2

Figura 2 Contenção e coleta de sangue em avestruzes. A: contenção

usando capuz preto. B: coleta de sangue de uma avestruz com

acesso à veia ulnar e utilizando sistema de coleta a vácuo.

15

Figura 3 Leucócitos de avestruz, corados com Giemsa, observados em

microscopia óptica de campo claro. A: heterófilo apresentando

núcleo lobulado e grânulos fusiformes; B: eosinófilo; com núcleo

riniforme e citoplasma repleto de grânulos arredondados; e C:

basófilo, notar grânulos grandes e redondos dispostos sobre o

núcleo. D: linfócito; notar alta relação núcleo citoplasma, no qual

este aparece como uma linha tênue ao redor do núcleo e aquele

apresenta grande quantidade de heterocromatina. E: monócito;

notar baixa relação núcleo citoplasma e presença de vesículas

citoplasmáticas. F: agregado de trombócitos, notar núcleo

condensado e citoplasma hialino. Barra = 7 µm

24

Figura 4 Leucócitos granulocíticos de avestruz, preparados para rotina (A

e B) e para detecção da enzima peroxidase (C e D), observados

por microscopia eletrônica de transmissão. A: heterófilo; notar

núcleo lobulado (cabeça de seta) e dois tipos de grânulos: I) em

forma de bastão e menos eletrondensos (seta) e II) menores, de

forma heterogênea e mais elétrondensos (seta larga). Inset

mostrando diferença entre os grânulos. B: eosinófilo; observar

núcleo riniforme e periférico. No citoplasma, destaque para os

três padrões de grânulos, tipo I (cabeça de seta), II (seta) e III

(seta larga). Inset mostrando diferença entre os grânulos. C:

heterófilo apresentando ausência de atividade dessa enzima em

seus grânulos. D: eosinófilo com grânulos eletrondensos

confirmando atividade da enzima em seu interior. Barra = 1,1

µm.

26

XI

Figura 5 Leucócitos agranulocíticos de avestruz preparados para rotina

em microscopia eletrônica de transmissão. A: linfócito

apresentando núcleo repleto de heterocromatina, e citoplasma

escasso e homogêneo. B: monócito com evidentes

mitocôndrias (seta). Notar núcleo sem lobulações e presença de

sulco na face citoplasmática do núcleo (cabeça de seta). C:

trombócito apresentando núcleo repleto de heterocromatina,

vacúolos citoplasmáticos (cabeça de seta) e sistema canalicular

interno (seta). Barra = 1,1 µm.

28

XII

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1 Níveis de garantia contidos na ração utilizada na

alimentação das avestruzes. 14

Tabela 2 Valores para série vermelha, contagem de trombócitos e

leucócitos totais de avestruzes. Sangue de machos (n =

50) e fêmeas (n = 50) foram avaliados pelos métodos

descritos e os resultados apresentados em médias com

desvios padrões.

30

Tabela 3 Contagens diferenciais dos leucócitos de avestruz.

Esfregaços de machos (n = 50) e fêmeas (n = 50) foram

analisados e os resultados apresentados em médias com

seus desvios padrões.

30

Tabela 4 Parâmetros bioquímicos séricos de avestruzes. Soro de

machos (n = 25) e fêmeas (n = 25), foi analisado e os

resultados apresentados em média com seus desvios

padrões.

32

Tabela 5 Valores hematológicos encontrados neste trabalho

comparados aos observados em outros estudos. 39

Tabela 6 Parâmetros bioquímicos encontrados neste trabalho

comparados aos observados em outros estudos. 42

XIII

LISTA DE ABREVIAÇÕES

A:G: albumina/globulina

AST: aspartato aminotransferase

BSA: albumina de soro bovina

CHCM: concentração de hemoglobina corpuscular média

CK: creatina quinase

CO2: dióxido de carbono

Cu+2: íon cúprico

ET: hematimetria

GA: glutaraldeído

H2O2: peróxido de hidrogênio

Hb: hemoglobina

K+: potássio

LG: leucometria

Na+: sódio

OsO4: tetróxido de ósmio

PA: formaldeído recém preparado

PT: proteínas totais

TB: trombócitos

VCM: volume corpuscular médio

VG: volume globular

XIV

RESUMO

Avestruzes foram introduzidas no Brasil no início da década passada. Hoje, o

país possui um rebanho de 250 mil aves criadas majoritariamente na região sudeste.

Entretanto, a falta de dados sobre morfologia de leucócitos, perfis hematológico e

bioquímico cria dificuldades no diagnóstico de patologias. Portanto, o objetivo deste

estudo foi estabelecer tais parâmetros nessas aves. Para isto, sangue foi coletado

da veia ulnar de avestruzes adultas (acima de 72 meses) criadas no Estado do Rio

de Janeiro e submetido a técnicas hematológicas (contagem de trombócitos,

leucócitos, hemácias, diferencial dos leucócitos e mensuração da hemoglobina) e

caracterização ultra-estrutural dos leucócitos. Esfregaços sanguíneos foram corados

com Giemsa e observados em microscopia de campo claro. Leucócitos foram

separados das hemácias, fixados, preparados, para rotina e localização da peroxidase,

e observados no microscópio eletrônico de transmissão. Outra amostra sanguínea foi

coagulada e o soro coletado e conservado a -70 oC para posterior análise por

bioquímica seca. Heterófilos apresentaram núcleo lobulado e dois tipos de grânulos

citoplasmáticos. Um grande, elíptico e menos elétrodenso que o outro, menor de

morfologia heterogênea. Ambos grânulos não apresentaram atividade peroxidásica.

Eosinófilos tinham núcleo riniforme, às vezes lobulado, excêntrico e dois padrões de

grânulo com mesma morfologia, mas de diferente elétrodensidade. Estes grânulos

apresentaram reação positiva para peroxidase. Linfócitos, monócitos e trombócitos

mostraram as mesmas características de outras aves. Parâmetros hematológicos e

bioquímicos não tiveram relação com gênero e foram estabelecidos como padrões de

normalidade para avestruzes criadas no Brasil. Essas informações auxiliarão no

diagnóstico de patologias específicas de avestruzes e servirão como conhecimentos

básicos no estudo de imunologia e patologia comparada nessa espécie.

Palavras-chaves: Struthio camelus, leucócitos, hematologia, bioquímica sérica

XV

ABSTRACT

Ostriches were introduced in Brazil in began of the past decade. Nowadays

the country has 250 thousand animals, most of them raised in the southeastern

region. However, the lack of information about the leukocytes morphology,

hematological e biochemistry profiles creates difficulties to diagnose pathologies.

Thus, the aim of this study was the established these parameters in ostriches. Blood

was collected from the ulnar vein of adults (up to 72 months) ostrich of a farm localized

in Rio de Janeiro State. Blood were collected for the hemogram process (thrombocytes,

erythrocytes, leukocytes, differential leukocyte count and hemoglobin measurement) and

preparation for ultra-structural analysis. Blood smears were stained by the Giemsa

method and were observed by light microscopy. Leukocytes were separated from red

cells, fixed and prepared, for routine and peroxidase localization, and examined in a

transmission electron microscope. Another blood sample were clothed, serum was

collected and stored at -70 oC for posterior dry biochemical analysis. Heterophil

presented lobulated nucleus and two kinds of citoplasmatic granules. One big, rod

shaped and less electrondense than the other, small with heterogenic morphology. Both

granules lacked peroxidase activity. Eosinophils had kidney shaped, sometimes

lobulated, eccentric nucleus and two kinds of granules with the same morphology, but

different electrondensity. These granules showed positive reaction for peroxidase.

Lymphocytes, monocytes and thrombocytes reveled the same characteristics of others

avian species. Hematological and serum biochemical profiles had no gender influence,

and were established as default of normality for ostriches raised in Brazil. These

information will help in diagnoses specific ostriches pathologies and serve as basics

knowledges for studies in immunology and comparative pathology in this specie.

Keywords: Struthio camelus, leukocytes, hematology, serum biochemistry

1

1- Introdução

A estrutiocultura, cirção racional de avestruzes, foi introduzida no Brasil no

início da década de 90. Porém, os primeiros investidores não obtiveram sucesso na

criação, devido a falta de conhecimento sobre as necessidades e características

dessa espécie. Mesmo assim, a partir do século XXI, seu potencial econômico é

verificado pelo crescimento do rebanho brasileiro que progride em escala

geométrica. Principalmente após a Portaria no 36 do Ministério do Meio Ambiente em

2002 e a Instrução Normativa Conjunta no 2 em 2003. Ambas determinando que a

regulamentação das criações passa a ser, a partir de então, de responsabilidade do

Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Mudança que desburocratizou o

processo de implantação da atividade nas propriedades. E o interesse de

profissionais brasileiros que, ao buscar conhecimentos em países onde avestruz é

criada com sucesso, possibilitou a estruturação da estrutiocultura no país.

No Brasil, apesar de hoje termos número considerável de criadores

organizados em associações, existe carência de profissionais habilitados na área.

Ademais, os conhecimentos a respeito da fisiologia básica desta ave são escassos,

incluindo os necessários para o desenvolvimento de técnicas diagnósticas, tais

como morfologia de leucócitos, hemograma e bioquímica sérica.

Portanto, este estudo teve como objetivo a caracterização morfológica dos

leucócitos, determinação do perfil hematológico e bioquímico desta ave no Brasil;

subsidiando conhecimentos para o avanço da medicina diagnóstica aviária.

1.1- Avestruz

Avestruzes, Struthio camelus, emas, Rhea americana, kiwis, Apterix sp.,

cassoares, Dromaius casuarius, Casuarius bennetti e C. unappendiculatus, e emús,

D. novaehollandiae, pertencem a Superordem Paleognathae e formam o grupo das

Ratitas (Figura 1). Mesmo com antecessores voadores, as ratitas são incapazes de

voar. A ausência da quilha do externo e o atrofiamento dos músculos peitorais são

fatores determinantes para tal incapacidade. Em compensação, tanto os cinturões

torácico e pélvico quanto os membros anteriores e posteriores sofreram alterações

que permitiram excelente adaptação à vida terrestre, podendo alcançar velocidade

de 60 km/h em sua corrida (Fowler, 1991).

2

Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Ratites

Figura 1: Ratitas encontradas no mundo de hoje. A: emú. B: ema, representante sul

americana do grupo. C: avestruzes macho (esquerda) e fêmea (direita). D: cassoar. E: kiwi.

3

Originárias de clima semi-árido, a adaptação de avestruzes ao clima brasileiro

ocorreu sem maiores problemas. Estas aves podem atingir uma altura máxima de 3

metros, e peso de cerca de 150 kg. Os machos adultos são pretos e brancos,

enquanto que as fêmeas são castanhas pardas. As fêmeas põem, em média, 60

ovos por ano, gerando até 20 filhotes. Os animais estão prontos para o abate com

18 meses de idade, quando pesam aproximadamente 100 kg e geram 30 kg de

carne limpa, 1,4 m2 de couro, além das plumas. A vida produtiva de uma fêmea é de

30 a 35 anos e a postura inicia aos dois anos de idade. Já o macho inicia a vida

reprodutiva aos 2,5 anos de idade. A expectativa de vida das avestruzes gira em

torno de 65 e 70 anos (ACAB, 2007).

Os principais produtos oriundos da avestruz são as plumas, o couro, os ovos

e a carne. A exploração racional da avestruz no Brasil teve seu início em 1995.

Mesmo com as dificuldades que surgiram decorrente da falta de conhecimento

técnico, a estrutiocultura tornou-se um mercado promissor sendo alvo de grandes

investidores. Entre os principais motivos desta escolha estão o baixo custo de

implantação e a viabilidade em pequenas extensões de terra. Além da alta

reprodutividade, uma fêmea pode gerar 20 pintos por ano, o animal ao ser abatido

possui grande versatilidade de subprodutos (REVISTA BRASILEIRA DE

AGROPECUÁRIA, 1999).

O Brasil conta com um rebanho de aproximadamente 250 mil aves, e o

Estado do Rio de Janeiro tem aproximadamente 40 investidores criando por volta de

3000 avestruzes (ACAB, 2007). A estrutiocultura no Estado cresce à medida que

novos, pequenos e grandes, produtores procuram esta prática, estimulada pela

criação de um abatedouro especializado no município de Quissamã. Hoje, a

associação de criadores do Estado já conta com doze investidores (ACAERJ, 2007).

Seis empresários apostam nessa atividade na região Norte Fluminense onde

compõem um rebanho de, aproximadamente, 300 aves.

1.2- Hematologia aviária

O sangue é um tecido de notória importância na fisiologia dos animais.

Portanto, sua análise, através do hemograma, é uma ferramenta complementar

importante na clínica veterinária. O hemograma fornece acesso a saúde geral do

animal, permite avaliar a capacidade de combate a infecções, além de auxiliar no

diagnóstico, e no progresso ou regresso de doenças (Jain, 1993).

4

A hematologia clínica aviária é relativamente recente. Apenas no início da

década de 60 foi publicado o primeiro trabalho completo sobre as células

sanguíneas de galinhas (Lucas e Jamroz, 1961). Desde então, o estudo dos

leucócitos circulantes ganhou impulso. Sergent et al. (2000) e Bowerman et al.

(2004) utilizaram o hemograma como ferramenta de avaliação do impacto de fatores

estressantes na saúde de pingüins-anões e águias-carecas, respectivamente.

Porém ressaltam a importância de uma boa coleta e de mais estudos visando o

isolamento de variáveis. Manejo, idade e enfermidades são preponderantes na

variação dos índices hematológicos.

Apesar da avestruz possuir importância econômica significativa, a falta de

parâmetros hematológicos traz grandes dificuldades na interpretação de seu

hemograma (Levi et al., 1989). Poucos trabalhos foram realizados, entre os quais,

em Botswana (Mushi et al., 1999a), Israel (Spinu et al., 1999), Turquia (Yüksek et al.,

2002) e no Brasil (Vilar et al., 2003). Ademais, nenhum estudo foi realizado acerca

da morfologia ultra-estrutural de leucócitos desta espécie. Até hoje, a classificação

destes tipos celulares nas avestruzes segue parâmetros descritos para galinhas.

Portanto, se faz importante discutir tais parâmetros.

As avestruzes, assim como todas as aves, possuem peculiaridades nas

células do sangue. Além das hemácias, os trombócitos, homólogos as plaquetas dos

mamíferos, são nucleados. Entre leucócitos, destaque aos heterófilos de galinhas e

gansos que possuem grânulos elípticos e conteúdo enzimático diferente do

encontrado nas células homólogas de mamíferos, os neutrófilos (Rausch e Moore,

1975). As características morfológicas e o perfil enzimático dos grânulos são de

grande valia nos estudos morfo-funcionais dessas células.

Enzimas como a peroxidase, fosfatase ácida e alcalina são importantes na

diferenciação de leucócitos, principalmente quando observados sob microscopia

eletrônica de transmissão. A peroxidase está relacionada com a capacidade

microbicida de neutrófilos humanos, pois possibilita a produção de espécimes

oxidantes (Babior et al., 1973), e modulação dos efeitos vasculares do óxido nítrico

em camundongos (Eiserich, et al., 2002). Essa enzima está ausente nos heterófilos

de diversas aves e roedores, diferente de alguns mamíferos (Jain, 1967; Jain, 1969;

Maxwell, 1984). Brune et al. em 1972 demonstraram que, mesmo com a ausência de

peroxidase no interior de seus grânulos, os heterófilos de galinhas são capazes de

fagocitar e destruir patógenos oportunistas que lesam humanos portadores de falha

5

na atividade desta enzima. Já a atividade oxidativa e microbicida da fosfatase ácida

está presente tanto em eosinófilos de patos (Anas platyrhynchos), gansos (Anser

anser), galinhas d’angola (Numida meleagris), codornas (Coturnix coturnix japonica),

pombos (Columbia lívia) e perus (Meleagris gallopavo) (Maxwell e Siller, 1972) como

nos dos humanos (Ghidoni e Goldberg, 1966). Entretanto, estudos sobre atividade

da fosfatase alcalina em leucócitos são escassos e controversos (Jain, 1969).

1.2.1- Heterófilos

Os heterófilos são os leucócitos circulantes predominantes de avestruzes

(Levi et al., 1989; Mushi et al., 1999a; Spinu et al., 1999; Yüksek et al., 2002; et al.,

2003). Este leucócito está envolvido na resposta inflamatória primária de aves

(Maxwell e Robertson, 1998). Quando sob restrição alimentar ou frio intenso o

número de heterófilos circulantes na galinha pode cair ou aumentar respectivamente

(Maxwell, 1993; Maxwell e Robertson, 1998). Alterações na morfologia desta célula

são encontradas em situações de doença sendo denominadas “tóxicas”. Nesta

situação a célula apresenta vacuolização citoplasmática, degranulação, rompimento

dos grânulos, e degeneração nuclear (Campbell, 2004a). Topp e Carlson (1972)

demonstraram capacidade fagocítica desses leucócitos de perus.

Redondos, os heterófilos são maiores que as hemácias e raramente variam

de tamanho. O citoplasma é transparente e pode estar levemente acidofílico caso

haja degranulação (Campbell, 1995). O núcleo é corado basofilicamente com

regiões mais escuras representando cromatina condensada. Quando maduros

apresentam lobulações nucleares. No citoplasma, estão presentes grânulos

acidofílicos em forma de bastão (Lucas e Jamroz, 1961). Dhingra et al. (1969)

observaram por microscopia eletrônica de transmissão três tipos distintos de

grânulos em heterófilos de galinhas. Um redondo e grande, mais osmiofílico que os

demais, outro elíptico com matriz densa e longitudinal, e o menor menos osmiofílico.

Ericsson e Nair (1973) também descreveram três tipos de grânulos em heterófilos de

galinhas, porém atribuíram ao maior e mais osmiofílico forma elíptica e presença de

matriz densa.

6

1.2.2- Eosinófilos

Os eosinófilos de mamíferos exercem proteção contra infecções helmínticas,

e estão freqüentemente associados a alergias, porém sua função permanece uma

icógnita nas aves (Maxwell, 1995).

Diferente dos heterófilos, os eosinófilos possuem grande variação de

tamanho, porém não de sua forma arredondada. O citoplasma possui coloração azul

claro e o núcleo, riniforme, é basofílico com regiões mais escuras de

heterocromatina (Lucas e Jamroz, 1961). No citoplasma estão contidos grânulos

eosinofílicos redondos (Campbell, 2004a). Maxwell e Siller em 1972, estudando

eosinófilos de diferentes aves, observaram variações nos grânulos de eosinófilos

nas espécies abordadas. Patos e gansos apresentaram em seus grânulos matriz

cristalina como em alguns mamíferos. Eosinófilos de codornas estimulados com soro

eqüino ou albumina bovina apresentam aumento na atividade da fosfatase ácida nos

grânulos, bem como alterações morfológicas destas organelas (Maxwell, 1986).

1.2.3- Basófilos

Os basófilos são normalmente maiores que os heterófilos e eosinófilos.

Embora pertençam a população minoritária de leucócitos circulantes, os basófilo

possuem função importante nos eventos inflamatórios, secreção de aminas

vasoativas, e na hipersensibilidade cutânea (Maxwell e Robertson, 1995). Aves sob

situação de restrição alimentar, calor intenso e medo podem apresentar basofilia,

aumento dos basófilos circulantes (Maxwell, 1993; Maxwell e Robertson, 1995).

O formato dessas células é redondo as quais possuem grande variação de

tamanho entre as espécies de aves. O citoplasma possui coloração basofílica,

porém muitas vezes escondida pela grande quantidade de grânulos citoplasmáticos.

Já o núcleo raramente apresenta lobulações, cora-se basofilicamente e

freqüentemente encontra-se sob os grânulos. Estes grânulos, redondos ou ovais,

são fortemente basofílicos (Campbell, 1995). A ultra-estrutura revela variados graus

de eletrondensidade, mais ou menos fibrilar, entre grânulos de uma mesma célula

(Dhingra et al., 1969).

7

1.2.4- Linfócitos

Os linfócitos possuem as mesmas funções das células homônimas de

mamíferos e representam a população majoritária de leucócitos de algumas aves

(Coke et al., 2004). O número de linfócitos circulantes pode estar elevado ou

reduzido em situações de restrição alimentar e medo, respectivamente (Maxwell,

1993).

Linfócitos podem variar de tamanho, mas são menores do que as hemácias.

O citoplasma é escasso e cora-se em azul vítreo, formando uma linha tênue ao

redor do núcleo, entretanto, pode aumentar de volume em linfócitos maiores.

Projeções citoplasmáticas e pseudópodos podem ser observados com freqüência. O

núcleo é redondo e centralizado, com sulcos raros, e cora-se acidofilicamente

(Lucas e Jamroz, 1961). A cromatina nuclear é, em grande parte, condensada

deixando o núcleo com diversas regiões escuras sob microscopia óptica ou

eletrondensas sob microscopia eletrônica de transmissão. Outra característica

peculiar dessas células é a alta razão núcleo:citoplasma (Campbell, 1995).

1.2.5- Monócitos

Os monócitos das aves são morfologicamente similares aos dos mamíferos.

Precursores de macrófagos, eles são as principais células fagocíticas do sistema

imune das aves. Qualidade anteriormente atribuída aos trombócitos (Chang e

Hamilton, 1979), mas que realizam a fagocitose em baixa intensidade (DaMatta et

al., 1998; Qureshi, 2003).

Normalmente maiores que as hemácias, os monócitos têm formato redondo e

citoplasma azul vítreo com borda hialina, quando observados com coloração tipo

Romanowsky. O núcleo excêntrico é curvo na face membranar, com sulco na face

citoplasmática. As principais características que diferenciam os monócitos dos

linfócitos são a menor quantidade de heterocromatina e menor razão

núcleo:citoplasma (Lucas e Jamroz, 1961). Grânulos azurofílicos podem estar

presentes no citoplasma destas células em algumas espécies de aves e répteis

(Montali, 1988).

8

1.2.6- Trombócitos

Como dito, os trombócitos são equivalentes as plaquetas dos mamíferos. São

caracterizados pela sua forma elíptica ou redonda, tamanho pequeno, presença de

núcleo, sistema canalicular interno e vacúolos citoplasmáticos (Claver, 2005). A

principal função dessas células está na participação dos eventos hemostáticos.

Embora alguns autores (Daimon et al., 1985; Taffarel e Oliveira, 1993) atribuam suas

características citoquímicas a eventos fagocíticos. A presença de proteínas

relacionadas a citotoxidade e da fosfatase ácida em seus vacúolos reforçam esta

tese. Porém, estudos posteriores (DaMatta et al., 1998) revelaram que, comparado

aos macrófagos, sua atividade fagocítica é reduzida quando bacterias interagem

com estas células e não ocorre com os protozoários Toxoplasma gondii e

Trypanosoma cruzi. Portanto, o perfil citoquímico dessas células pode estar

relacionado à remoção de debris celulares e fibrinólise na coagulação.

No esfregaço sanguíneo, os trombócitos são identificados por seu tamanho,

forma e por estarem freqüentemente agregados. Ademais, seu núcleo apresentar

grande quantidade de heterocromatina, quase picnótico, produzindo coloração

intensamente basofílica. O citoplasma é quase translúcido e pode conter grânulos

acidofílicos e vacúolos (Campbell, 1995).

1.3- Bioquímica sérica

O perfil bioquímico sérico é uma abordagem, de avaliação fisiológica,

complementar ao hemograma. Ambos formam o principal pilar do diagnóstico

veterinário (Harr, 2002). O monitoramento das funções renais, hepáticas e

musculares, do metabolismo da glicose e da concentração de íons plasmáticos

possibilita o entendimento do real efeito do manejo e doenças sobre a fisiologia das

aves.

Este dado é de grande importância na avaliação do status nutricional dessas

aves. Por exemplo, avestruzes alimentadas com elevado teor de proteína bruta

apresentam aumento na concentração sérica de ácido úrico (Polat et al., 2003).

A impactação gástrica é uma patologia comum em avestruzes que recebem

manejo nutricional inadequado. O trânsito gastro-intestinal é interrompido e o animal,

se não receber tratamento adequado, vai a óbito. Yüksek et al. (2002) e Komnenou

et al. (2003) encontraram aumento dos valores plasmáticos de enzimas hepáticas,

proteínas totais e ácido úrico em avestruzes com essa patologia.

9

Já em frangos de corte, rações contaminadas com aflatoxinas, ou até mesmo

desbalanceadas, podem alterar a funcionalidade do fígado e rins, e acarretar

mudança das concentrações das proteínas plasmáticas (Quezada et al., 2000;

Oguz, 2002).

1.3.1- Aspartato aminotransferase (AST)

A AST, também chamada de TGO, transaminase glutâmica oxalacética, é

responsável pela transaminação reversível do aspartato e α-cetoglutarato para

glutamato e oxalacetato. Duas isoformas estão presentes nos tecidos de diversos

animais, a mitocondrial e a citosólica, onde aquela é a isoenzima mais abundante

(Kaneko, 1989). Fígado, rins, coração e músculo esquelético são órgãos que

possuem concentração significante dessa enzima (Medway et al., 1973).

Conseqüentemente, em hepatopatias a concentração plasmática da AST pode estar

elevada, porém sem especificidade (Coles, 1984). Entretanto, em degeneração

hepática crônica o nível pode estar baixo indicando perda tecidual importante (Meyer

et al., 1992). Na rotina clínica de aves a AST pode ser utilizada como enzima de

escolha para diagnosticar hepatopatias, melhor ainda quando utilizada com a

creatina quinase para descartar possibilidade de lesão muscular (Dabbert e Powell,

1993 ; Jaensch et al., 2000; Campbell, 2004b).

1.3.2- Creatina quinase (CK)

A creatina quinase, ou fosfocreatina quinase, tem como principais funções

criar reservatório energético e de prótons prontamente disponível; prevenir aumento

do ADP livre intracelular e permitir sinalização para início da glicogenólise no

exercício (Stryer,1995). Três isoformas da CK estão presentes nas aves, todas

envolvidas em metabolismo de alta energia (Kerr, 2003). Essa enzima é encontrada

no citoplasma de células musculares estriadas, lisas e cardíacas (Lassen, 2004). E

por isso é considerada a melhor abordagem na avaliação de danos musculares.

O aumento desta enzima no soro ou plasma pode indicar infarto do miocárdio,

degeneração muscular ou apenas um esforço físico marcante. A CK é uma enzima

muscular específica nas aves (Campbell, 2004b). Portanto, deve ser utilizada para

avaliar danos nesse tecido.

10

1.3.3- Ácido úrico

O ácido úrico é o produto majoritário do catabolismo de proteínas nas aves

(Harr, 2002). Sua síntese ocorre no fígado e quando acumulado acarreta aumento

de sua concentração no plasma. Esta alta concentração pode levar a uma patologia

denominada gota que se caracteriza pela precipitação de cristais de ácido úrico,

principalmente, nas articulações e superfícies de órgãos. Casos crônicos desta

patologia podem culminar na morte do animal (Sturkie, 1965). O aumento de sua

concentração plasmática também pode estar associado a necrose tecidual e jejum

prolongado, com catabolismo de compostos nitrogenados (Campbell, 2004b).

Portanto, o ácido úrico pode ser utilizado como indicador de alterações no

metabolismo renal.

1.3.4- Glicose

A glicose é a molécula de pronta obtenção de energia das células em geral.

Sua concentração no sangue, a glicemia, é influenciada pela ação de hormônios,

tais como glucagon, insulina e corticóides (Sturkie, 1965). Existem grandes

variações nas concentrações plasmáticas entre as espécies de aves granívoras e

carnívoras (Harr, 2002). A hiperglicemia pode ser causada por estresse, diabetes

mellitus e corticóides endógenos ou exógenos, já hipoglicemia está relacionada ao

jejum e insulinomas, neoplasia das células de Langerhans (Kerr, 2003).

1.3.5- Colesterol

O metabolismo do colesterol em aves é idêntico ao de mamíferos (Harr,

2002). Porém, possui participação importante na vitelogênese de algumas espécies

desses ovíparos (Sturkie, 1965).

Aumento no colesterol plasmático pode estar associado à fibrose hepática ou

obstrução dos ductos biliares. Hipotiroidismo, lipemia e dietas com altos níveis de

gordura também podem elevar a concentração de colesterol. Já a diminuição pode

indicar resolução de doença hepática, má-digestão, má-absorção ou jejum

prolongado (Campbell, 2004b).

11

1.3.6- Proteínas plasmáticas

Proteínas plasmáticas podem ser divididas em albumina, globulinas, proteínas

de transporte, enzimas, hormônios e proteínas de coagulação. Exceto pelas

globulinas, produzidas pelas células plasmáticas derivadas dos linfócitos B, essas

moléculas são formadas no fígado. Uma das principais funções dessas moléculas é

a garantia da osmolaridade intra, extra-celular e no interior vascular. Porém existem

as globulinas, fibrinogênio e proteínas de transporte com funções específicas na

imunidade, coagulação e sinalização endócrina, respectivamente (Sturkie, 1965).

Entretanto, apenas a primeira fração, composta pela albumina e imunoglobulinas,

bem como a razão entre as partes (A:G), possui valor de diagnóstico (Campbell,

2004b). Esses parâmetros comumente estão alterados em processos inflamatórios

agudos e crônicos, falência renal, hepatopatias e desidratação (Harr, 2002).

1.3.7- Eletrólitos

Os eletrólitos de maior importância na fisiologia das aves são sódio (Na+) e

potássio (K+), onde este está em menor concentração plasmática do que aquele

(Sturkie, 1965). O Na+ consumido pelas aves é absorvido nos intestinos e excretado

na urina. Sua principal função fisiológica está relacionada ao balanço hídrico.

Avestruzes possuem glândulas de sal, localizadas logo abaixo das órbitas, de onde

derivam ductos até a extremidade do bico. Estas glândulas podem ser responsáveis

por até 80% da excreção de sódio em aves sob alta temperatura (Campbell, 2004b).

Patologias que afetam rins, intestinos e até glândulas de sal conseqüentemente

podem levar a perda excessiva de Na+. Já a hipernatremia pode ser causada por

severa desidratação ou perda de líquido pobre em Na+, como vômito e diarréia (Kerr,

2003).

O K+ é o cátion intracelular predominante (Campbell, 2004b). E compõe, junto

ao Na+, dentre outros exemplos, o sistema de co-transporte celular responsável pela

captação da glicose. Distúrbios na concentração deste elemento acarreta diminuição

da atividade elétrica de células, e normalmente podem estar associados a distúrbios

das glândulas adrenais (Kerr, 2003).

12

1.4- Considerações finais

Com a base de dados gerada a partir desse estudo compreendendo:

morfologia de leucócitos, perfil hematológico e bioquímico das avestruzes, espera-se

contribuir para o aprimoramento do diagnóstico, hematológico e bioquímico, de

patologias que acometem essas aves. Estes dados também servirão como

conhecimentos básicos, e conseqüentemente necessários, para estudos em

patologia comparada e imunobiologia de aves.

13

2- Objetivos

2.1- Objetivo geral

- Caracterizar os leucócitos circulantes de S. camelus, através da citoquímica

sob microscopia óptica e eletrônica de transmissão, e determinar o perfil

hematológico e bioquímico sérico destas aves.

2.2- Objetivos específicos

- Comparar a ultra-estrutura e a presença da atividade da enzima peroxidase

nos leucócitos de S. camelus com de outras aves previamente estudadas.

- Verificar se há diferenças entre machos e fêmeas, quanto aos valores

hematológicos e bioquímicos.

- Determinar os perfis hematológicos e bioquímicos para avestruzes adultas

no Brasil.

14

3- Materiais e métodos

3.1- Animais

As aves examinadas pertencem a fazenda Avestrucenter, localizada no

município de Cabo Frio (S 22° 46’ 31’’; N 42° 01’ 33’’), estado do Rio de Janeiro.

Cem avestruzes, 50 machos e 50 fêmeas, maiores de 30 meses, foram utilizados

para determinar o perfil hematológico. Já para o perfil bioquímico foram 25 aves de

cada sexo do mesmo rebanho. A dieta oferecida era composta de água, gramínea à

vontade e ração específica com níveis de garantia expostos na tabela 1.

Anualmente, entre os períodos de postura, que vai de março a julho, as aves

da propriedade são submetidas a controle parasitológico, com febendazol (30

mg/kg) e ivermectina (0,4 mg/kg). Mesmo assim, as avestruzes passaram por

avaliação clínica, na qual apenas as aparentemente saudáveis e de jejum tiveram o

sangue coletado. A coleta foi realizada entre os meses de maio e junho de 2006 no

período matutino.

Tabela1: Níveis de garantia contidos na ração comercial utilizada na alimentação das avestruzes.

Composto Quantidade (%)

Umidade (máx.) 13

Proteína Bruta (mín.) 12

Extrato Etéreo (mín.) 2

Matéria Fibrosa (máx.) 20

Matéria Mineral (máx.) 20

Cálcio (máx.) 2

Fósforo (mín.) 0,6

Fonte: http://www.guabi.com.br/rc/avestruzes/produtos.asp?marca=9&codigo=197

15

3.2- Coleta de sangue e obtenção dos hemogramas

Depois da contenção física, utilizando gancho e capuz, o sangue das aves foi

coletado através da punção da veia ulnar com tubos a vácuo (Vacutainer BD)

contendo heparina lítica equipados com agulhas 25 x 7 mm (BD) (Figura 2).

Esfregaços sanguíneos foram feitos imediatamente e os frascos, contendo sangue,

acondicionados a 10oC até a chegada ao laboratório.

Figura 2: Contenção e coleta de sangue em avestruzes. A: contenção usando capuz

preto. B: coleta de sangue de uma avestruz com acesso à veia ulnar e utilizando sistema de

coleta a vácuo.

16

Para a série vermelha foram obtidos: i) volume globular (VG) pelo

microhematrócrito; ii) hematimetria (ET) pela contagem direta do número de

hemácias na câmara de Neubauer; e iii) dosagem da concentração de hemoglobina

pelo método colorimétrico.

Para a obtenção do VG pelo microhematócrito, um tubo capilar de vidro foi

preenchido com sangue total e centrifugado a 20000 g por 5 minutos. Passado o

tempo o tubo foi colocado sobre régua específica e o volume de células em relação

ao volume total foi obtido em porcentagem. Para a ET, o sangue foi adicionado ao

diluente de Dacie modificado (1 l de água destilada; 10 ml de formaldeido 40% e

31,3 mg de citrato trissódico) facilitando a visualização e contagem das células na

câmara de Neubauer (Campbell, 2004a). Para contagem, 20 μl de sangue foi

adicionado a 2 ml do diluente acrescido de 20 μl do corante azul cresil brilhante. A

hemoglobina foi mensurada utilizando reação enzimática da cianometemoglobina

(Labtest Ind. Bras.), e posterior leitura por espectrofotometria em 540 nm. A reação

foi realizada adicionando 20 μl de sangue a 5 ml de reagente do kit, seguido de

homogeneização. Após dez minutos, antes da mensuração da hemoglobina, a

solução foi centrifugada a 1600 g por 5 minutos para remover partículas nucleares

das hemácias evitando interferência na leitura.

Com os dados de microhematócrito, hematimetria e concentração de

hemoglobina foram calculados o Volume Corpuscular Médio (VCM) e a

Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM) (Jain, 1993). Onde:

VCM = VG x 10 / hematimetria (hemácias x 106/mm3)

CHCM = hemoglobina / VG x 100

Para série branca, a leucometria (LG) foi obtida através da contagem dos

leucócitos totais na câmara de Neubauer de sangue heparinizado. Como a heparina

causa aglomeração de leucócitos no sangue de avestruzes, especialmente

heterófilos (Green e Blue-McLendon, 2000), a leucometria também foi obtida através

de contagem das células nos esfregaços feitos com sangue livre de anticoagulante.

Os leucócitos foram contabilizados ao longo do esfregaço em paralelo as hemácias.

Quando duas mil hemácias foram registradas, o LG foi calculado integrando o

numero de leucócitos contados no esfregaço com o ET conforme fórmula proposta

por Tavares-Dias e Moraes, 2006:

LG (leucócitos/mm3) = leucócitos contados no esfregaço x ET (hemácias/mm3) /

2000

17

A contagem diferencial foi feita em extensões sanguíneas coradas pelo

método do Panótico rápido. As células foram avaliadas e contadas utilizando

microscópio Ziess Axioplan.

Os trombócitos e hemácias foram contabilizados simultaneamente na câmara

de Neubaer.

3.3- Microscopia óptica

Extensões sanguíneas recém feitas foram fixadas em metanol por 5 minutos e

coradas com Giemsa por 40 minutos. Depois de lavadas e secas, foram observadas,

em campo claro, em microscópio óptico Ziess Axioplan. As células foram

documentadas digitalmente pelo programa AnaliSys acoplado ao microscópio.

3.4- Ultra-estrutura

Um colchão leucocitário foi obtido, segundo Silva et al., (2004). Para obtenção

do colchão, um tubo plástico foi preenchido com sangue total, vedado com duas

esferas metálicas, colocado em um tubo de 15 ml e centrifugado a 700 g por 15

minutos a 10oC. Após a centrifugação, que separa os leucócitos das hemácias, o

tubo foi cortado, sob lupa, com uma lâmina de bisturi na intersecção de leucócitos e

hemácias. Os leucócitos foram aspirados com auxílio de pipeta Pasteur e

preparados de acordo com os tratamentos descritos a seguir. As imagens foram

obtidas no microscópio eletrônico de transmissão Zeiss 900 operado em 80 kv para

rotina e 50 kv para citoquímica.

3.4.1- Rotina

As células foram fixadas com 2% glutaraldeído (GA), 4% formaldeído recém

preparado (PA) em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,2, durante 1 hora. Em seguida as

células foram lavadas com o mesmo tampão por três vezes. A pós-fixação foi com

tetróxido de ósmio (OsO4) a 1 % em tampão cacodilato contendo 0,8% de

ferricianeto de potássio por 1 hora. Depois de lavadas três vezes com tampão

cacodilato, a amostra foi submetida à desidratação em série crescente de acetona,

50 a 100%, com 30 minutos em cada etapa. A inclusão foi feita em resina epóxi

polimerizada por 48 horas a 60oC. Cortes ultra-finos de 80 nm foram feitos no

ultramicrótomo para posterior montagem em grades de cobre de 200 mesh. A

18

contrastação foi feita com acetato de uranila (5%), por vinte minutos, e citrato de

chumbo (2%), por cinco minutos, na ausência de luz.

3.4.2- Peroxidase (Roels et al., 1975)

As células foram fixadas em GA 0,5% em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,2,

por trinta minutos. Em seguida, foram lavadas em tampão cacodilato com 5% de

sacarose. E pré-incubadas com 0,5 mg/ml de diaminobenzidina por 30 minutos em

tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,0 com 5% de sacarose. Após este tempo outra

incubação foi realizada na mesma solução contendo peróxido de hidrogênio (H2O2) a

0,02 %, por mais trinta minutos. As células foram lavadas em tampão cacodilato com

5% de sacarose por 2 vezes. Depois o material foi incluído e cortado como descrito

no item 4.4.1. A contrastação não foi realizada. No controle foi omitido o H2O2.

3.5- Bioquímica

O soro foi obtido através da punção da veia ulnar, com tubos a vácuo

(Vacutainer BD) sem anticoagulante com gel separador. Logo depois da

coagulação, ainda no campo, o tubo foi centrifugado por 5 minutos a 2600g e os

tubos acondicionados a 10 oC. No laboratório o soro foi aliquotado em tubos

plásticos de 1,5 ml e, em seguida, congelados à –70oC. Para análise bioquímica, as

enzimas mensuradas foram AST e CK, além de ácido úrico, glicose, colesterol,

proteínas plasmáticas e eletrólitos. Todos os ensaios enzimáticos foram feitos

utilizando método de bioquímica seca no equipamento Vitros 950 (Johnson &

Johnson’s®) conforme descrito em seguida.

3.5.1- AST

A AST foi mensurada pela taxa de pontos múltiplos, onde 11 μl de soro foi

depositado sobre o reativo seco e difundido para as camadas subjacentes. O reativo

seco é constituído por um elemento analítico seco de múltiplas camadas envolvido

em suporte transparente de poliéster. Neste teste o grupamento amino do L-

aspartato é transferido para α-cetoglutarato, na presença do piridoxal-5-fosfato,

produzindo glutamato e oxaloacetato. Este é convertido em piruvato e dióxido de

carbono (CO2) pela oxaloacetato descarboxilase. Então o piruvato é oxidado a

acetilfosfato e H2O2 pela piruvato oxidase. A última etapa da reação é catalisada

pela peroxidase oxidando um corante branco, produzindo um corante colorido. O

19

índice de oxidação do corante branco é monitorado por espectrofotometria a 37 oC

em 670 nm por 5 minutos. Um filtro de corte de baixo comprimento de onda no

suporte do reativo evita interferências da luz incidente durante a produção do

corante.

3.5.2- CK

A CK foi mensurada pela mesma técnica utilizada para a AST. Onze μl de

soro foi depositado, e difundido, no reativo seco que continha N – acetilcisteína para

ativar a enzima. Assim, a CK catalisa a conversão do fosfato de creatina e ADP em

creatina e ATP. Este possibilita a fosforilação do glicerol, pela glicerol quinase, que

resulta no L- α-glicerofosfato. Em seguida, este é oxidado pela L- α-glicerofosfato

oxidase, gerando fosfato de diidróxiacetona e H2O2. O final desta reação ocorre

assim como no item 4.5.1, onde a transformação do corante branco em colorido é

monitorada em 670 nm a 37 oC por 5 minutos. Para aumentar a precisão no

resultado o soro foi diluído, 1:4, em albumina de soro bovina (BSA) a 7% Vitros.

3.5.3- Ácido úrico

Este metabólito é mensurado pelo teste colorimétrico em reativo seco. Dez μl

de soro foi depositado e uniformemente distribuído pelas camadas do reativo seco.

Então, o ácido úrico, ao migrar para camada do reagente, é oxidado pela uricase

formando alantoína e H2O2. A partir daí a análise ocorre como descrito nos itens

anteriores. O monitoramento da transformação do corante é dado em 670 nm a 37

oC por 5 minutos.

3.5.4- Glicose

A glicose foi mensurada pelo teste colorimétrico. Após difusão de 10 μl de

soro sobre o reagente seco, a glicose foi oxidada pela glicose oxidase para formar

gluconato e H2O2. Este catalisa a oxidação de precursores do corante vermelho

utilizado para leitura da luz refletida. A análise foi realizada em comprimento de onda

de 540 nm a 37 oC por 5 minutos.

3.5.5- Colesterol

O teste colorimétrico também foi escolhido para mensuração do colesterol. Ao

depositar 10 μl de soro, o colesterol, assim como os ésteres de colesterol, foi

20

dissociado de lipoproteínas pela ação do surfactante Triton X-100 ao ser difundido

no reagente seco. Os ésteres de colesterol foram hidrolisados pela éster hidrolase.

Assim, o colesterol livre foi oxidado pela colesterol oxidase para gerar colestenona e

H2O2. Finalmente o H2O2 oxidou o corante branco gerando um corante colorido. A

densidade de corante formado foi proporcional a concentração do colesterol na

amostra. A mensuração foi realizada por espectrofotometria em 540 nm a 37 oC por

5 minutos.

3.5.6- Proteínas plasmáticas

O método de análise das proteínas totais foi baseado na reação do biureto

que produz um complexo violeta após a reação das proteínas com o íon cúprico

(Cu+2) em pH alcalino. Assim, o montante de 10 μl foi depositado e distribuído pelo

reativo. Ao entrarem em contato com o reagente, tartarato de cobre, as proteínas

possibilitam a formação do complexo colorido. A quantidade de proteínas totais foi

dada por espectrofotometria em 540 nm a 37 oC por 5 minutos.

A albumina também foi mensurada pelo método colorimétrico. Ao depositar e

difundir 10 μl de soro sobre o reativo, a albumina reagiu com verde de bromocresol

presente na camada de dispersão. O complexo formado foi medido por

espectrofotometria em 540 nm a 37 oC por 5 minutos.

As globulinas foram obtidas pela diferença entre as proteínas totais e

albumina. Já a relação albumina/globulina (A:G) foi obtida pela divisão entre os

respectivos valores.

3.5.7- Eletrólitos

O Na+ foi mensurado pelo teste potenciométrico. Neste teste, o reativo seco

consistia em dois eletrodos, referência e indicador, de íons seletivos contendo três

camadas cada: i) membrana de íons seletivos com metil monensina, ionóforo para

sódio; ii) camada de referência, com cloreto de sódio e pH 5,6 e iii) outra membrana

de íons seletivos contendo prata e cloreto de prata. Então, 10 μl de soro foram

aplicados sobre o reativo que junto a 10 μl fluido de referência Vitros formaram uma

solução estável. Assim, cada eletrodo produziu um potencial elétrico em resposta à

concentração de sódio aplicada. A diferença de potencial existente entre os

eletrodos foi proporcional à concentração do íon na amostra. O teste durou

aproximadamente 2 minutos a 37 oC.

21

O método potenciométrico também foi utilizado para o K+. Neste, o reativo

seco continha dois eletrodos, referência e indicador, selecionadores de íons

contendo: i) valinomicina, ionóforo para potássio; ii) camada de referência com

cloreto de potássio e iii) prata e cloreto de prata. A partir daí os eventos são os

mesmos descritos para o sódio.

3.6- Análise estatística

Os dados foram tabulados em planilhas do Microsoft Excel e tiveram suas

respectivas médias e desvios padrões calculados. As diferenças entre as médias de

machos e fêmeas foram avaliadas através do teste t de Student.

22

4- Resultados 4.1- Leucócitos

Sob a luz da microscopia óptica os heterófilos (Fig. 3A) apresentaram núcleo

basofílico com até três lóbulos. O citoplasma destas células apresentou coloração

levemente acidofílica, com grânulos em forma de bastão e corados acidofilicamente.

Outra população de granulócitos, os eosinófilos (Fig. 3B), apresentou núcleo

basofílico, excêntrico, riniforme e raramente lobulado. O citoplasma apresentou cor

azulada, semi-translúcido, contendo grânulos eosinofílicos e arredondados em

abundância. Os basófilos (Fig. 3C) apresentaram núcleo basofílico e bastante

lobulado. O citoplasma apresentou coloração basofílica, contendo grânulos grandes

e esféricos, fortemente basofílicos, dispersos sobre e próximo ao núcleo. Os

linfócitos (Fig. 3D) e monócitos (Fig. 3E) apresentaram características tintoriais

semelhantes. Estas células apresentaram núcleo basofílico e sem lobulações. O

citoplasma destas células apresentou coloração levemente azulada e sem grânulos.

Entretanto, foram encontrados eventualmente grânulos citoplasmáticos acidofílicos

em monócitos. A diferença entre essas células foi a relação núcleo:citoplasma, que

foi menor nos monócitos. Ademais o núcleo dos linfócitos apresentou coloração

fortemente heterocromática. Os trombócitos (Fig. 3F) apresentaram forma variada,

desde redondo a elíptico. Normalmente estavam agregados demonstrando núcleo

fortemente basofílico, citoplasma escasso e hialino sem grânulos. Freqüentemente

foram observados vacúolos citoplasmáticos.

Na observação em microscopia eletrônica de transmissão os heterófilos (Fig.

4A) apresentaram núcleo lobulado com heterocromatina distribuída em sua periferia.

Dois tipos de grânulos foram observados. Os fusiformes de diferentes tamanhos

foram chamados de tipo I, e os menores, de forma heterogênea, mais elétrondensos,

foram denominados tipo II. Os eosinófilos (Fig. 4B) apresentaram núcleo excêntrico

com heterocromatina na periferia, e nucléolo. No citoplasma foram observados três

padrões de grânulos com diferença de eletrondensidade. Os grânulos tipo I e II eram

mais comuns e redondos, sendo este mais elétrondenso que aquele. Já o tipo III não

foi observado em todos eosinófilos. Este tipo era redondo como os outros, porém

com material elétrondenso depositado excêntricamente. Infelizmente não foi possível

observar basófilos.

23

Figura 3: Leucócitos de avestruz, corados com Giemsa, observados em

microscopia óptica de campo claro, notar hemácias elípticas e nucleadas. A:

heterófilo apresentando núcleo lobulado e grânulos fusiformes; B: eosinófilo; com

núcleo riniforme e citoplasma repleto de grânulos arredondados; e C: basófilo, notar

grânulos grandes e redondos dispostos sobre o núcleo. D: linfócito; notar alta

relação núcleo citoplasma, no qual este aparece como uma linha tênue ao redor do

núcleo e aquele apresenta grande quantidade de heterocromatina. E: monócito;

notar baixa relação núcleo citoplasma e presença de vesículas citoplasmáticas. F:

agregado de trombócitos, notar núcleo condensado e citoplasma hialino. Barra = 7

µm

24

25

Figura 4: Leucócitos granulocíticos de avestruz, preparados para rotina (A e B) e

para detecção da enzima peroxidase (C e D), observados por microscopia

eletrônica de transmissão. A: heterófilo; notar núcleo lobulado (cabeça de seta) e

dois tipos de grânulos: I) em forma de bastão e menos eletrondenson (seta) e II)

menores, de forma heterogênea e mais eletrondensos (seta larga). Inset mostrando

diferença entre os dois grânulos. B: eosinófilo; observar núcleo riniforme e

periférico. No citoplasma, destaque para os três padrões de grânulos, tipo I (cabeça

de seta), II (seta) e III (seta larga). Inset mostrando os três tipos de grânulos

encontrados. C: heterófilo apresentando ausência de atividade dessa enzima em

seus grânulos. D: eosinófilo com grânulos eletrondensos confirmando atividade da

enzima em seu interior. Barra = 1,1 µm.

26

27

Figura 5: Leucócitos agranulocíticos de avestruz preparados para rotina em

microscopia eletrônica de transmissão. A: linfócito apresentando núcleo repleto de

heterocromatina, e citoplasma escasso e homogêneo. B: monócito com

mitocôndrias evidentes (seta). Notar núcleo sem lobulações e presença de sulco na

face citoplasmática do núcleo (cabeça de seta). C: trombócito apresentando núcleo

repleto de heterocromatina, vacúolos citoplasmáticos (cabeça de seta) e sistema

canalicular interno (seta). Barra = 1,1 µm.

28

29

Enquanto heterófilos (Fig. 4C) e monócitos apresentaram reação positiva

apenas no retículo endoplasmático (não mostrado) para peroxidase. Os eosinófilos

apresentaram reação positiva para esta enzima no interior de seus grânulos (Fig.

4D). Nos controles não houve marcação (não mostrado).

Os linfócitos (Fig. 5A) apresentaram heterocromatina distribuída na periferia

do núcleo, porém em maior quantidade que nos monócitos (Fig. 5B). O citoplasma

apresentou pouco volume e homogeneidade. Os monócitos apresentaram núcleo

excêntrico com heterocromatina distribuída nas bordas, presença de nucléolo e

sulco na face citoplasmática do núcleo. Baixa relação núcleo:citoplasma foi

verificada nestas células, além de mitocôndrias e vacúolos típicos observados com

freqüência. Os trombócitos, freqüentemente agregados, continham núcleo repleto de

heterocromatina, citoplasma com vacúolos e sistema canalicular interno (Fig. 5C).

4.2- Hematologia

Não houve diferenças estatísticas entre os parâmetros hematológicos de

machos e fêmeas. O perfil hematológico das avestruzes avaliadas está exposto nas

tabela 2 e 3. O VG teve a mesma média para ambos sexos, variando entre 39,3 e

46,7 % nos machos de 39,2 a 43,8 % nas fêmeas. A média do ET foi levemente

superior nos machos. Nestes o valor flutuou entre 1,4 e 2,2 x 106/mm3, já nas

fêmeas os valores variaram entre 1,4 e 2 x 106/mm3. A concentração de

hemoglobina apresentou variação entre 10,4 e 12,6 g/dL nos machos e 9,7 e 12,4

g/dL nas fêmeas. O VCM médio das fêmeas foi maior que dos machos. No qual o

das fêmeas variou entre 206,6 e 300,8 fL e dos machos entre 201,6 e 301,4 fL. Já o

CHCM foi maior nos machos, variando entre 24,1 e 29,1 %. Nas fêmeas os valores

variaram entre 22,1 e 29,5 %. A população de trombócitos nos machos variou entre

35,7 e 63.7 x 103/mm3. Esta média foi maior nas fêmeas, a qual variou entre 38,7 e

66,5 x 103/mm3.

A LG apresentou maiores médias em machos, que em fêmeas. As médias

variaram entre 11,4 e 18,2 x 106/mm3 nestas e entre 11,1 e 19,5 naqueles. Ademais

foi confirmada a nocividade da heparina à leucometria verificada por Green e Blue-

McLendon (2000). Já que, com sangue heparinizado, foram obtidas médias de 2,5 e

2,3 x 103/mm3 para machos e fêmeas respectivamente. Portanto houve déficit de

500 % na população de leucócitos ao serem contabilizados com sangue conservado

com heparina lítica.

30

As médias obtidas na contagem diferencial foram bastante próximas entre

machos e fêmeas (tabela 3). Os heterófilos representaram a maior parcela dos

leucócitos circulantes, por volta de 70%, seguido pelos linfócitos. Monócitos,

eosinófilos e basófilos foram visualizados raramente.

Tabela 2: Valores para série vermelha, contagem de trombócitos e leucócitos totais de avestruzes. Sangue de machos (n = 50) e fêmeas (n = 50) foram avaliados pelos métodos descritos e os resultados apresentados em médias com desvios padrões.

Parâmetro

Machos Fêmeas

Média ± DP* Média ± DP

VG (%) 43,0 ± 3,7 43,0 ± 3,8

ET (.106/mm3) 1,8 ± 0,4 1,7 ± 0,3

Hb (g/dL) 11,5 ± 1,1 11,0 ± 1,3

VCM (fL) 251,5 ± 49,9 253,7 ± 47,1

CHCM (%) 26,6 ± 2,5 25,8 ± 3,7

TB (.103/mm3) 49,7 ± 14,0 52,6 ± 13,9

LG (.103/mm3) 15,3 ± 4,2 14,8 ± 3,4

VG: volume globular, ET: hematimetria, Hb: hemoglobina, VCM: volume corpuscular médio, CHCM: concentração de hemoglobina corpuscular média, TB: trombócitos, LG: leucócitos totais.

* Desvio padrão

Tabela 3: Contagens diferenciais dos leucócitos de avestruz. Esfregaços de machos (n = 50) e fêmeas (n = 50) foram analisados e os resultados apresentados em médias com seus desvios padrões.

Leucócito

Machos Fêmeas

Média ± DP*

Média ± DP

Heterófilo (%) 73,5 ± 5,3 73,6 ± 4,5

Heterófilo (.103/mm3) 11,3 ± 3,4 10,7 ± 2,9

Eosinófilo (%) 1,8 ± 1,5 1,8 ± 1,6

Eosinófilo (.103/mm3) 0,3 ± 0,3 0,3 ± 0,2

Basófilo (%) 0 ± 0,1 0,1 ± 0,3

Basófilo (.103/mm3) 0 ± 0 0 ± 0,1

Linfócito (%) 22,1 ± 5,8 22,4 ± 4,3

Linfócito (.103/mm3) 3,3 ± 1,2 3,5 ± 1,0

Monócito (%) 2,6 ± 1,6 2,1 ± 1,5

Monócito (.103/mm3) 0,4 ± 0,3 0,3 ± 0,2 *

Desvio padrão

31

4.3- Bioquímica sérica

Não houve diferença entre as médias de machos e fêmeas nos parâmetros

bioquímicos. As médias da concentração dos elementos avaliados estão exibidas na

tabela 4. A enzima AST apresentou maior média nas fêmeas, que variou entre 304,2

e 481,6 U/l. Já nos machos a atividade desta enzima variou entre 287,1 e 489,2 U/l.

Para CK não foi diferente. A média das fêmeas foi maior que a dos machos. A

variação entre as fêmeas ficou entre 1394,9 e 7644,9 U/l, e nos machos entre

2471,5 e 6307,5 U/l. O ácido úrico obteve a mesma média para os dois sexos. A

glicose apresentou maior concentração nos machos, variando entre 170,2 e 218,2

mg/dl. Já nas fêmeas, variou entre 151,1 e 204,7 mg/dl. O colesterol também foi

maior nos machos que nas fêmeas. Os valores variaram nestas entre 40,1 e 71,5

mg/dl, e entre 44 e 68,8 mg/dl naqueles. Diferença insignificante foi observada para

os valores de PT entre machos e fêmeas. Machos e fêmeas apresentaram mesma

média para albumina. Assim como as proteínas totais (PT), as médias de globulinas

foram bastante próximas entre machos e fêmeas, com variações entre 2,5 e 3,3 g/dl

e 2,4 e 3,6 g/dl respectivamente. Machos apresentaram maior A:G que as fêmeas.

Sódio e potássio tiveram maiores médias nos machos que nas fêmeas. O Na+ variou

nos machos entre 140 e 149,6 mEq/l, e nas fêmeas entre 135,8 e 152 mEq/l. Já o K+

flutuou entre 3,1 e 4,3 mEq/l nos machos e entre 2,9 e 4,1 mEq/l nas fêmeas.

Tabela 4: Parâmetros bioquímicos séricos de avestruzes. Soro de machos (n = 25) e fêmeas (n = 25) foi analisado e os resultados apresentados em média com seus desvios padrões.

AST: aspartato aminotransferase, CK: creatina quinase, PT: proteínas totais, A:G: albumina/globulina.

* Desvio padrão

Parâmetro Machos Fêmeas

Média ± DP*

Média ± DP

AST (U/l) 388,5 ± 101,4 392,9 ± 88,7

CK (U/l) 4389,5 ± 1918 4519,9 ± 3125

Ácido úrico (mg/dl) 4,7 ± 1,2 4,7 ± 1,6

Glicose (mg/dl) 194,2 ± 24,0 177,9 ± 26,8

Colesterol (mg/dl) 56,4 ± 12,4 55,8 ± 15,7

PT (g/dl) 4,6 ± 0,5 4,7 ± 0,8

Albumina (g/dl) 1,7 ± 0,1 1,7 ± 0,2

Globulina (g/dl) 2,9 ± 0,4 3 ± 0,6

A:G 0,6 ± 0,07 0,56 ± 0,04

Na+ (mEq/l) 144,8 ± 4,8 143,9 ± 8,1

K+ (mEq/l) 3,7 ± 0,6 3,5 ± 0,6

32

5- Discussão

A caracterização dos leucócitos de avestruz foi realizada por microscopia

óptica, eletrônica de transmissão e localização ultra-estrutural da atividade da

enzima peroxidase nos granulócitos. Esfregaços sanguíneos, corados com Giemsa e

observados por microscopia óptica de campo claro, mostraram leucócitos com

morfologia similar aos já descritos para outras aves (Campbel, 1995; Canfield, 1998).

Já a ultra-estrutura destas células foi similar as de galinhas (Dhingra et al., 1969)

com algumas considerações feitas a seguir. Ademais, os perfis hematológico e

bioquímico foram estabelecidos para avestruzes criadas no estado do Rio de

Janeiro, formando uma base de dados sólida para auxiliar o diagnostico de

patologias nessa espécie. Como esperado, os valores obtidos diferem dos

estabelecidos em alguns estudos prévios, já que coleta, idade, região, manejo e

metodologia são fatores que influenciam os resultados e serão discutidos neste item.

Os heterófilos de avestruzes apresentaram núcleo lobulado e dois tipos de

grânulos citoplasmáticos. Dhingra et al. (1969) e Damion & Caxton-Martins (1977)

identificaram três tipos de grânulos em heterófilos de galinha. O maior e elíptico foi

descrito como mais eletrodenso dos três, diferindo do observado em S. camelus no

qual este era menos eletrondenso. Outro tipo de grânulo, ausente nas avestruzes,

foi descrito apresentando matriz eletrodensa em seu interior. O terceiro tipo era

menor e menos eletrondenso que os outros dois. Já Topp & Carlson (1972),

estudando leucócitos de perus, observaram apenas um tipo de grânulo nos

heterófilos de forma circular a oval, com variação de afinidade pelo ósmio. Assim

como Santos et al. (2003), que também observaram apenas um tipo de grânulo em

Buteo magnirostris, gavião-carijó, elíptico e bastante eletrodenso. Dhingra et al.,

1969, estudando galinhas, comentam que o grânulo elíptico pode ser encontrado

com matriz elétrodensa em seu interior, dependendo do estagio de maturação do

heterófilo. Durante as observações neste trabalho um heterófilo com estas

características foi encontrado. O ponto comum entre os autores citados e o presente

estudo foi a lobulação característica do núcleo dos heterófilo. A ausência da

atividade da enzima peroxidase no interior dos grânulos dos heterófilos também foi

verificada em outras aves (Rausch & Moore 1975; Damion & Caxton-Martins 1977;

Santos et al., 2003). Desta forma, podemos concluir que os dados apresentados

neste trabalho descrevem de forma clara as características morfológicas dos

heterófilos de avestruz. Também pode-se concluir que não existe um padrão

33

característico de heterófilos de aves. Esta heterogeneidade deve ser levada em

conta em trabalhos que objetivam a caracterização de leucócitos. Para tal se faz

importante a localização da enzima peroxidase como provável não marcadora deste

tipo celular.

Os eosinófilos de avestruz apresentaram núcleo riniforme, às vezes

bilobulado, e dois tipos de grânulos redondos comumente encontrados. Um terceiro

tipo de grânulo, também redondo e com material osmiofílico depositado, foi

observado raramente. Os eosinófilos de galinhas estudados por Dhingra et al.,

(1969) e Damion & Caxton-Martins (1977), apresentaram as mesmas características

de núcleo, porém apenas um tipo de granulo foi encontrado. Este era redondo,

eletrondenso e com conteúdo homogêneo. Maxwell & Siller (1972) estudaram

eosinófilos de cinco espécies de aves diferentes. Patos e gansos demonstraram

grânulos contendo matriz cristalina eletrondensa e retangular, ocupando quase toda

organela, quando contrastados apenas com citrato de chumbo. A principal diferença

encontrada foi que os grânulos do primeiro apresentavam forma alongada,

entretanto, no segundo, a forma variou entre redonda ou oval. Já galinhas d’angola

demonstraram características similares as de galinhas, com dois padrões de

tamanho e eletrondensidades, permitindo classificar dois tipos diferentes de

grânulos. Ou seja, um maior e mais osmiofílico que outro. Codornas também

apresentaram dois padrões distintos de grânulos. Um oval, mais comum, maior e

com periferia mais osmiofílica que o centro. Enquanto o segundo tipo era menor,

mais osmiofílico e de forma variada. Perus apresentaram núcleo sem lobulações, na

maioria das vezes, e grânulos citoplasmáticos escassos e adjacentes ao núcleo que

eram bastante eletrondensos com morfologia irregular. Pombos demonstraram

núcleo lobulado característico, assim como das outras espécies estudadas. Seus

grânulos revelaram três padrões distintos. Um grande, oval ou redondo,

intensamente osmiofílico e homogêneo, outro de morfologia similar, porém menos

eletrondenso e um terceiro tipo, característico de metamielócitos, com forma e

tamanho similares aos demais, porém com aparência granular e espaços vazios no

interior (Maxwell & Siller, 1972). Estas características são similares aos descrito nas

avestruzes neste trabalho. Ademais, os eosinófilos de avestruz apresentaram reação

positiva intensa para peroxidase, assim como em galinhas, patos, codornas e

gaviões-carijós (Damion & Caxton-Martins, 1977; Maxwell, 1986a; Maxwell, 1986b;

34

Santos et al., 2003). Esta característica é um ótimo marcador deste tipo celular

diferindo claramente do heterófilo.

Monócitos e linfócitos observados apresentaram características típicas, entre

as quais diferenças na relação núcleo/citoplasma, quantidade de heterocromatina,

presença marcante de organelas e sulco nuclear na face citoplasmática, como já

descrito anteriormente (DaMatta et al., 1998b; DaMatta et al., 2000). Trombócitos de

avestruzes também foram similares aos observados em anfíbios, répteis e outras

aves, com presença de núcleo, vacúolos citoplasmáticos, sistema canalicular

interno, além da forma variando entre oval ou redonda (Damion et al., 1985; Taffarel

& Oliveira, 1993; DaMatta et al., 1998b; Santos et al. 2003b). Portanto, estes três

tipos celulares são de fácil caracterização morfológica na microscopia eletrônica de

transmissão, e não existe necessidade de localização enzimática para auxiliar sua

diferenciação na microscopia eletrônica de transmissão. Porém, na microscopia

óptica a diferenciação destas requer atenção principalmente às carcterísticas

tintoriais do citoplasma e núcleo.

Embora não houvesse diferença estatística nos parâmetros hematológicos

machos apresentaram médias levemente maiores em ET, CHCM e LG. Enquanto

fêmeas tiveram médias de VCM e TB pouco maiores que dos machos. Dados

similares foram verificados por Levi, et al. (1989). Já que não houve diferenças entre

as médias de machos e fêmeas, elas foram fundidas e estão ao lado das propostas

por outros autores na tabela 5.

O VG obtido foi menor que o encontrado por Palomeque et al. (1991) e igual

ao reportado por Mushi et al. (1999a). Porém foi superior aos encontrados por Levi

et al. (1989), Green (1999), Vilar et al. (2003) e Raukar e Simpraga (2005). Estes

últimos estudando avestruzes de um dia. A ET apresentou médias menores que as

observadas por Palomeque et al. (1991), Mushi et al. (1999a) e Vilar et al. (2003). Já

Levi et al. (1989), Green (1999) e Raukar e Simpraga (2005) obtiveram valores de

ET inferiores que os encontrados no presente estudo. A concentração de

hemoglobina apresentou valor similar ao encontrado por Green (1999). Já Levi et al.

(1989), Palomeque et al. (1991), Mushi et al. (1999a) e Vilar et al. (2003) obtiveram

maiores médias para Hb. Entretanto Raukar e Simpraga (2005), avaliando pintos de

um dia, obtiveram média bastante inferior. Fato explicado pela menor concentração

de hemoglobina em avestruzes mais jovens (Palomeque et al., 1991; Vilar et al.,

2003). Levi et al. (1989), Palomeque et al. (1991), Green (1999), Mushi et al.

35

(1999a), Vilar et al. (2003) e Raukar e Simpraga (2005) observaram menores médias

para VCM. Condição invertida para CHCM, com exceção da apresentada por Raukar

e Simpraga (2005). Mesmo com as diferenças apresentadas, nenhum dos valores

estabelecidos pelos autores revelou grande discrepância em comparação aos

obtidos nesse estudo. Exceto pelo reportado por Raukar e Simpraga (2005), onde

avestruzes mais jovens tendem a apresentar valores menores para parâmetros

eritrocíticos que os adultos. Porém, pode haver controvérsias já que avestruzes

entre quatro e 10 meses podem apresentar ET maior que adultos (Levi et al., 1989;

Green, 1999). Ademais, os maiores valores de hemoglobina encontrados por Mushi

et al. (1999a) e Vilar et al. (2003) podem ser conseqüência da não centrifugação da

amostra, feita após a reação. Esta centrifugação tem a finalidade de remover

partículas nucleares dos eritrócitos que alteram a leitura (Green e Blue-McLendon,

2000; Campbell, 2004a).

A contagem de trombócitos também não apresentou diferenças significativas,

embora tenha sido maior nas fêmeas. Este parâmetro não é amplamente empregado

nos artigos publicados até o momento. É possível que tal fato seja devido a

insegurança existente na identificação destas células na câmara de Neubauer, já

que existe similaridade com linfócitos. Ademais, a contagem automática não é

possível de ser realizada pela mesma razão da manual, ou seja, semelhança com

linfócitos. Mesmo assim, as médias obtidas foram similares as encontradas por Vilar

et al. (2003). Entretanto, média bastante inferior foi proposta por Mushi et al.

(1999a), fruto de um provável equívoco na identificação dos trombócitos. Neste

trabalho, a utilização do diluente de Dacie modificado, com azul cresil brilhante,

proporcionou uma melhor diferenciação entre trombócitos e leucócitos

agranulocíticos. Portanto, para otimizar as contagens de trombócitos e leucócitos na

câmara de Neubauer é fundamental a utilização de uma corante na solução afim de

prevenir erros.

A LG proposta foi similar as encontradas por Palomeque et al. (1991), Green

(1999) e Vilar et al. (2003). Médias muito menores foram observadas por Levi et al.

(1989), Mushi et al. (1999a) e Raukar e Simpraga (2005). Esta discrepância está

provavelmente relacionada ao anticoagulante utilizado. A utilização do EDTA (ácido

etilenodiamino tetra-acético), ou a estimativa do LG através da contagem das células

de esfregaço sanguíneo pela utilização da fórmula proposta por Tavares-Dias e

Moraes, 2006, não influenciou a obtenção deste parâmetro. A comparação dos

36

trabalhos já publicados e do aqui apresentado mostra, claramente, que a LG obtida

diretamente de amostras sanguíneas utilizando a heparina como anticoagulante leva

a um decréscimo na população de linfócitos, (Levi et al., 1989; Mushi et al., 1999a;

Raukar e Simpraga 2005) como já mencionado por Green e Blue-McLendon (2000)

e Campbell (2004a).

As contagens diferenciais dos leucócitos foram similares entre os sexos.

Heterófilos apresentaram maiores médias quando avaliados por Raukar e Simpraga

(2005) em avestruzes de um dia, utilizando citrato de sódio como anticoagulante. Já

Green (1999) e Vilar et al. (2003) observaram médias similares às encontradas pelo

presente estudo. Entretanto, Levi et al. (1989) e Mushi et al. (1999a) propuseram

médias inferiores às demais, provavelmente alteradas pelo uso da heparina como

anticoagulante. Os eosinófilos tiveram médias similares às propostas por todos os

trabalhos consultados, inclusive no realizado em avestruzes de um dia (Levi et al.,

1989; Green, 1999; Mushi et al., 1999a; Vilar et al., 2003; Raukar e Simpraga, 2005).

Entretanto, os basófilos obtiveram média inferior a todos estes artigos, exceto a

apresentada por Levi et al., 1989. Entre os agranulócitos, os linfócitos apresentaram

média inferior à proposta por Mushi et al., (1999a), similar às de Levi et al. (1989) e

Green (1999) e superior às apresentadas por Vilar et al. (2003) e Raukar e Simpraga

(2005). Já a média observada para os monócitos, assim como nos eosinófilos, foi

similar a todos os trabalhos (Levi et al., 1989; Green, 1999; Mushi et al., 1999a; Vilar

et al., 2003; Raukar e Simpraga, 2005). Spinu, et al. (1999) concluíram que

avestruzes domésticas sofrem mais fatores estressantes que as selvagens, já que

aquelas apresentaram eosinofilia, basofilia e menor índice fagocítico quando

comparadas à estas. Em complementação, Kamau et al. (2002) verificaram que

mudanças de ambiente, alimentação e manipulação podem acarretar aumento da

população de heterófilos e diminuição de linfócitos, simulando os efeitos de

corticosteróides. Portanto, o efeito do estresse e a origem das aves são explicações

plausíveis para as diferenças encontradas na contagem diferencial.

Durante as coletas de campo e realização dos primeiros hemogramas em

uma fazenda localizada no município de Campos dos Goytacazes, RJ, foi observada

intensa leucocitose acompanhada de eosinofilia, chegando a 14%, nas amostras

avaliadas. A interpretação clássica desta alteração reportada em mamíferos indica

possível infestação por parasitas do trato gastrointestinal. Portanto, foi realizado

exame coproparasitológico no rebanho desta determinada fazenda. Como resultado

37

obtivemos o diagnóstico e a identificação do parasito do gênero Libyostrongylus sp.

(Bonadiman et al. 2006), acarretando o descarte da propriedade para

estabelecimento de parâmetros hematológico e bioquímicos de avestruzes sadias.

Machos e fêmeas não apresentaram diferenças estatísticas entre seus

parâmetros bioquímicos nesse trabalho, assim como no de Khazraiinia et al., (2006).

Contrário a idade, o sexo exerce pouca influência nos valores bioquímicos,

principalmente devido a produção hormonal, maior nos adultos, e manejo nutricional

dado às diferentes faixas etárias na cadeia produtiva destas aves (Levy et al., 1989;

Palomeque et al., 1991; Okotie-Eboh et al., 1992; Quintavalla et al., 2001).

Entretanto, nem todos os trabalhos evidenciaram esta diferença (Khazraiinia et al.,

2006). Uma única média para machos e fêmeas foi obtida e está apresentada lado a

lado com as estabelecidas por outros estudos (tabela 6).

As médias obtidas para AST e CK foram superiores as apresentadas por Levy

et al. (1989), Palomeque et al. (1991) e Quintavalla et al. (2001), porém foram

similares às reportadas por Verstappen et al. (2002). Okotie-Eboh et al. (1992)

obtiveram médias inferiores para AST, e similares para CK. Este mesmo autor

encontrou maiores médias destas enzimas em fêmeas jovens quando comparadas

às adultas. Já Khazraiinia et al. (2006) observaram média semelhante para AST em

avestruzes no Irã. Os altos valores obtidos para essas enzimas pode ser resultado

do estresse induzido pela captura (Levy et al., 1989; Palomeque et al., 1991;

Verstappen et al., 2002), já que as aves eram maiores de três anos e destinadas à

reprodução. Esta condição aguça o territorialismo e conseqüentemente a

agressividade, resultando em maior estresse durante a coleta de sangue, mesmo

com a utilização do capuz escuro na contenção. Assim, a AST pode ser usada tanto

para avaliação hepática, quanto na avaliação de estresse muscular. A metodologia

empregada também pode explicar diferença entre esses valores, pois os mais

próximos também utilizaram o método da bioquímica seca, ao contrário dos

inferiores que utilizaram kits comercias, onde utilizam os ensaios bioquímicos

clássicos. Outro ponto importante a ser levado em conta é que o presente estudo foi

o único a conservar o soro a – 70 oC, preservando de forma melhor a atividade

enzimática. Ademais, Quintavalla et al. (2001) sugerem que aves criadas em clima

tropical ou sub-tropical apresentam maiores níveis de AST, assim como as

avestruzes alimentadas com maiores níveis de proteínas (Bovera et al., 2007).

38

Tabela 5: Valores hematológicos encontrados neste trabalho comparados aos observados em outros estudos (média ± DP*).

VG: volume globular, ET: hematimetria, Hb: hemoglobina, VCM: volume corpuscular médio, CHCM: concentração de hemoglobina corpuscular média, TB: trombócitos e LG: leucócitos totais.

* Desvio padrão

Este

trabalho Levi et al.,

1989 Palomeque et al., 1991

Green, 1999 Mushi et al.,

1999 Spinu et al., 1999

Vilar et al., 2003

Raukar e Simpraga,

2005

doméstica selvagem

VG (%) 43 ± 3,8 40 ± 4 48 ± 2,4 35 ± 3,6 43,2 ± 1,9 - 40,4 19,85 ± 1,1

ET (.106/mm

3) 1,8 ± 0,4 1,5 ± 0,2 2,42 ± 0,37 1,5 ± 0,2 2,1 ± 0,2 - 2,24 1,62 ± 0,04

Hb (g/dL) 11,5 ± 1,2 13,8 ± 3 15,6 ± 0,9 11,7 ± 1,4 16,6 ± 0,9 - 13,17 8,1 ± 0,4

VCM (fL) 252,6 ± 48,5 193 ± 52 201 ± 25 219 ± 5,3 206 ± 15 - 187,9 122 ± 3,5

CHCM (%) 26,2 ± 3,1 37 ± 4 32,5 ± 3 33 ± 2,6 38,5 ± 2 - 32,76 41,2 ± 0,7

TB (.103/mm

3) 51,2 ± 14 - - - 0,2 - 51,4 -

LG (.103/mm

3) 15 ± 3,8 5,2 ± 1,6 21 ± 8 19,8 ± 6,9 5 ± 1,8 25,9 ± 1,5 26,6 ± 2,6 21,79 7,3 ± 1,2

Heterófilos (%) 73,5 ± 5 63,6 ± 4,7 - 77 ± 3,3 60 ± 2,1 63,3 ± 4,6 67,2 ± 4,9 80,5 85 ± 3,1

Eosinófilos (%) 1,8 ± 1,5 0,1 ± 0,4 - 1 ± 1 1 ± 0,2 2,9 ± 1,6 0,1 ± 0,1 0,4 0,3 ± 0,5

Basófilos (%) 0,3 ± 0,2 0,1 ± 0,3 - 1,5 ± 1 6 ± 1,4 3,3 ± 1,9 1,8 ± 1 0,8 0,9 ± 1,6

Linfócitos (%) 22,2 ± 5 27,1 4,7 - 15,6 ± 3,5 32 ± 2 24,5 ± 2,2 25,3 ± 3,4 9,86 11,2 ± 2,15

Monócitos (%) 2,3 ± 1,5 1,9 ± 1 - 3,5 ± 2 1 ± 0,5 - 3,43 2,6 ± 1,9

39

Avaliando o metabolismo energético, Palomeque et al. (1991) e Okotie-Eboh

et al. (1992) reportam maiores médias para glicose e colesterol. Já Verstappen et al.

(2002) e Khazraiinia et al. (2006) encontraram valores similares aos apresentados

neste estudo. Apesar da tênue diferença, o tempo de espera necessário para

coagulação da amostra pode ter acarretado na queda da concentração sérica de

glicose (Palomeque et al., 1991). Levy et al. (1989) e Palomeque et al. (1991)

observaram maior concentração de glicose em avestruzes jovens, em contraste com

os dados relatados por Okotie-Eboh et al. (1992). Ademais, em outro estudo,

Moniello et al. (2006) justificam a inexistência da diferença na concentração de

glicose entre os gêneros com a heterogeneidade da faixa etária das aves por eles

estudadas. Justificativa que descartamos com este estudo, pois todas as aves

utilizadas pertenciam ao rebanho destinado a reprodução. Já Polat et al. (2003)

evidenciaram aumento da glicemia nas avestruzes alimentadas com níveis de

proteína bruta de 20%, quando comparadas àquelas alimentadas com dieta

contendo 23% de proteína bruta. Quanto ao colesterol, Levy et al. (1989)

observaram queda da concentração à medida que a ave envelhece. Fenômeno

esperado devido a reabsorção total do saco vitelínico, rica fonte de colesterol para

os pintinhos. Talvez esse decréscimo não ocorresse na natureza, pois Norambuena

e Parada (2005), avaliando flamingos, notaram que aves alimentadas com a dieta

natural apresentam maiores concentrações séricas de colesterol quando

comparadas as que receberam dieta industrializada.

Os níveis de ácido úrico das avestruzes deste estudo apresentaram médias

similares as observadas por Quintavalla et al. (2001). Porém, valores mais altos

foram observados nos estudos de Levy et al. (1989), Palomeque et al. (1991),

Okotie-Eboh et al. (1992), Verstappen et al. (2002) e Khazraiinia et al. (2006). Levy

et al. (1989) e Okotie-Eboh et al. (1992) observaram diminuição da concentração

deste metabólito em avestruzes jovens até seis meses, após esta idade a

concentração tende a estabilizar. Como esperado, Polat et al. (2003) e Bovera et al.

(2007) encontraram maior concentração de ácido úrico em avestruzes alimentadas

com dietas contendo maior concentração de proteínas.

A concentração de PT teve pouca variação, às já reportadas (Levy et al.,

1989; Palomeque et al., 1991; Okotie-Eboh et al., 1992; Quintavalla et al., 2001;

Verstappen et al., 2002). Exceto por Khazraiinia et al. (2006) que obtiveram menor

média para este parâmetro. Os demais índices, proteínas plasmáticas, albumina,

40

globulinas e A:G, apresentaram médias semelhantes aos demais estudos (Okotie-

Eboh et al., 1992; Quintavalla et al., 2001; Khazraiinia et al., 2006). Levy et al.

(1989), Palomeque et al. (1991), Okotie-Eboh et al. (1992) e Moniello et al. (2006)

encontraram, em fêmeas adultas, maior concentração de PT, conseqüência do

aumento de globulinas que é resultante do aumento da produção de estrógenos

nessas avestruzes. Norambuena e Parada (2005), no mesmo estudo citado

anteriormente observaram aumento nas concentrações de PT e globulinas nos

flamingo alimentados com dieta industrializada. Já Polat et al. (2003) obtiveram o

mesmo resultado avaliando avestruzes suplementadas com alfafa substituindo a

silagem de milho. Assim, a baixa variação entre os valores de proteínas plasmáticas

de machos e fêmeas está relacionada a mesma fase fisiológica em que se

encontram. Já variação entre os estudos pode estar relacionada a concentração de

proteínas encontrada na alimentação oferecida.

Finalmente, entre os eletrólitos, Levy et al. (1989), Palomeque et al. (1991) e

Verstappen et al. (2002) observaram médias semelhantes para Na+. Entretanto, para

o K+, Palomeque et al. (1991) obtiveram valor bastante superior, enquanto Levy et

al. (1989) encontraram média semelhante. Embora os eletrólitos apresentem pouca

variabilidade em avestruzes independente das condições fisiológicas (Moniello et al.,

2006), Lumeij (1985) e Verstappen et al., (2002) avaliando a influência do binômio

tempo de estocagem/temperatura nas concentrações plasmáticas de K+ em aves,

concluíram que caso a estocagem do sangue total dure mais que duas horas em

temperaturas de 0 oC ou 20 oC, os valores da concentração deste íon podem variar

15% para menos ou para mais, respectivamente. Portanto, ao comparar os

resultados do presente estudo, levando em conta estas considerações, foi

estabelecido que caso o sangue seja centrifugado logo após a coagulação e o soro

congelado a – 70 oC esta amostra não apresentará alterações decorrentes da

armazenagem.

Os parâmetros apresentados para avestruzes estão de acordo com os valores

gerais indicados para a classe das Aves (Campbell, 2004c). Dentro deste contexto, o

perfil bioquímico obtido neste trabalho, bem como o aprofundamento em outros

parâmetros aqui não estudados e o entendimento a respeito dos fatores que

influenciam esses dados serão de grande importância, especialmente para o

diagnóstico de doenças que acometem essas aves, como a impactação gástrica

(Yüksek et al., 2002) e deformidades no cinturão pélvico (Mushi et al., 1999b).

41

Tabela 6: Parâmetros bioquímicos encontrados neste trabalho comparados aos observados em outros estudos (média ± DP*).

Este trabalho Levy et al.,

1989

Okotie-Eboh et al.,

1992

Palomeque et al., 1991

Quintavalla et al., 2001

Verstappen et al., 2002

Khazraiinia et al., 2006

machos fêmeas

AST (U/l) 390,7 ± 95 117 ± 12 280 ± 84 190,5 ± 40 134,8 ± 52 123 ± 36 321 ± 56 322 ± 77

CK (U/l) 4454,7 ± 2521,5 603 ± 146 2470 ± 2059 933 ± 270 - 2667 ± 1041 -

Ácido úrico (mg/dl) 4,7 ± 1,4 6,3 ± 0,6 9,1 ± 4 11,2 ± 2,1 6,47 ± 1,3 7,17 ± 2 8,1 ± 1,5 12,9 ± 4,5

Glicose (mg/dl) 186 ± 25 165,4 ± 32 245 ± 50 207,4 ± 33 - 216,3 ± 20 161 ± 16

Colesterol (mg/dl) 56 ± 14 65,4 ± 19,2 100 ± 38 116,2 ± 27 - - 67 ± 19

PT (g/dl) 4,6 ± 0,7 4,5 ± 0,7 3,8 ± 0,7 3,87 ± 0,6 4,2 ± 2,15 4,9 0,5 4,7 ± 0,5 2,8 ± 1

Albumina (g/dl) 1,7 ± 0,1 - 1,8 ± 0,3 - 2,42 ± 1,2 2,3 ± 0,8 - 1,67 ± 0,15

Globulina (g/dl) 3 ± 0,5 - - - - - -

A:G 0,58 ± 0,05 - - - - 0,53 -

Na+ (mEq/l) 144,3 ± 6,5 151 ± 33 - 161 ± 13 - 152 ± 3,9 -

K+ (mEq/l) 3,6 ± 0,6 2,8 ± 0,5 - 1,68 ± 0,25 - 4,5 ± 0,5 -

AST: aspartato aminotransferase, CK: creatina quinase, PT: proteínas totais, A:G: albumina/globulina. * Desvio padrão

42

6- Conclusões

A morfologia dos leucócitos de S. camelus foi caracterizada. Heterófilos e

eosinófilos apresentaram dois padrões de grânulos característico, cada. As

principais características que os diferencia é a presença da atividade da enzima

peroxidase nos grânulos do eosinófilo e os grandes grânulos elípticos dos

heterófilos.

O perfil hematológico foi estabelecido, sem diferenças significativas entre os

gêneros. A heparina lítica mostrou-se ineficiente para a obtenção dos hemogramas.

Caso seja utilizada, um esfregaço, com sangue livre de anticoagulante, deve ser

feito imediatamente após a coleta evitando alterações no leucograma.

Assim como o perfil hematológico, o bioquímico foi definido mostrando que a

imediata separação do soro e posterior congelamento a – 70 oC minimizam

alterações na amostra, possibilitando o armazenamento prolongado.

43

7- Referências bibliográficas

ACAB (2007): Associação dos Criadores de Avestruz do Brasil. Disponível em:

<http: www.acab.org.br.> acesso em setembro de 2007.

ACAERJ (2007): Associação dos Criadores de Avestruz do Estado do Rio de

Janeiro. Disponível em: <http: www.acaerj.org.br.> acesso em setembro de 2007.

ANGERMULLER, S. e FAHIMI, H. (1984) A new cerium-based method for

cytochemical localization of thiamine pyrophosphatase in the Golgi complex of rat

hepatocytes, comparison with the lead technique. Hystochemistry, 80:107.

BABIOR, B.M.; KIPNES, R.S. e CURNUTTE, J.T. (1973) Biological defense

mechanisms: the production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal

agent. The Journal of Clinical Investigation, 52: 741-744.

BONADIMAN, S.F.; EDERLI, N.B.; SOARES, A.K.P.; MORAES NETO, A.H.A.;

SANTOS, C.P.; DAMATTA, R.A. (2006) Occurrence of Libyostrongylus sp.

(NEMATODA) in ostriches (Struthio camelus Linnaeus, 1758) from the north region

of the state of Rio de Janeiro, Brazil. Veterinary Parasitology, 137: 175-179.

BOWERMAN, W.W.; STICKLE, J.E.; SIKARSKIE, J.G.; GIESY, J.P. (2000)

Hematology and serum chemistries of nestling bald eagles (Haliaeetus

leucocephalus) in the lower peninsula of MI, USA. Chemosphere 41: 1575-1579.

BOVERA, F.; MONIELLO, G.; RIU, N.; MEO, C.; PINNA, W.; NIZZA, A. (2007) Effect

of diet on the metabolic profile of ostriches (Struthio camelus var. domesticus),

Tropical Animal Health and Production, 39: 265-270.

BRASIL. (2003) Instrução Normativa Conjunta no 2. Regulamento Técnico para

Registro, Fiscalização e Controle Sanitário dos Estabelecimentos de Incubação de

Ovos, de Criação e Alojamento de Ratitas. 21 de fevereiro de 2003. MAPA/DAS.

BRASIL. (2002) Portaria no 36 do Ministério do Meio Ambiente em 15 de março de

2002. MMA/IBAMA.

BRUNE, K.; LEFFELL, M. S. e SPITZNAGEL, J. K. (1972) Microbicidal activity of

peroxidaseless chicken heterophile leukocytes. Infection and Immunity, 3: 283-287.

CAMPBELL, T.W. (1995) Avian Hematology and Cytology. Ames: Iowa State

University Press, p. 12-13.

CAMPBELL, T.W. (2004a) Hematology of birds. In: Thrall, M.A. (org.) Veterinary

Hematology and Clinical Chemistry. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, USA,

p. 225 – 258.

44

CAMPBELL, T.W. (2004b) Clinical chemistry of birds. In: Thrall, M.A. (org.)

Veterinary Hematology and Clinical Chemistry. Lippincott Williams & Wilkins,

Philadelphia, USA, p. 479 – 492.

CAMPBELL, T.W. (2004c) Blood biochemistry of lower vertebrates. In: 55th Annual

Meeting of the American College of Veterinary Pathologists (ACVP) & 39th Annual

Meeting of the American Society of Clinical Pathology (ASVCP), 6p.

CANFIELD, P.J. (1998) Comparative cell morphology in the peripheral blood film

from exotic and native animals. Australian Veterinary Journal, 76: 793-800.

CHANG, C. e HAMILTON, P.B. (1979) The thrombocyte as the primary circulating

phagocyte in chickens. Journal of Reticuloendothelial Society, 25: 585-590.

COKE, R.L.; WEST, G.D. e HOOVER, J.P. (2004) Hematology and Plasma

Biochemistry of Captive Puna Ibis (Plegadis ridgewayi). Journal of Wildlife Diseases,

40: 141–144.

COLES, E.H. (1984) Patologia Clínica Veterinária. São Paulo, Brasil. Ed. Marele, 566

p.

DABBERT, C.B. e POWELL, K.C. (1993) Serum enzymes as indicators of capture

myopathy in mallards (Anas platyrhynchos). Journal of Wildlife Diseases, 29: 304-

309.

DAIMON, T. e CAXTON-MARTINS, A. (1977) Electron microscopic and enzyme

cytochemical studies on granules of mature chicken granular leucocytes. Journal of

Anatomy, 123: 553-562.

DAIMON, T.; GOTOH, Y.; KAWAI, K.; UCHIDA, K. (1985) Ultrastructural distribution

of peroxidase in thrombocytes of mammals and submammals. Histochemistry, 82:

345-350.

DAMATTA, R.A., SEABRA, S.H., DE SOUZA, W. (1998a) Further studies on the

phagocytic capacity of thrombocytes. Journal of Submicroscopic Cytology &

Pathology, 30: 271-277.

DAMATTA, R.A., MANHÃS, L.; SEABRA, S.H., DE SOUZA, W. (1998b) Coculture of

chicken thrombocytes and monocytes: morphological changes and lectin binding.

Biocell, 22: 45-52.

DAMATTA, R.A., SEABRA, S.H., MANHÃS, L.; DE SOUZA, W. (2000) Nitric oxide is

not involved in the killing of Trypanosoma cruzi by chicken macrophages.

Parasitology Research, 86: 239-243.

45

DHINGRA, L.D.; PARRISH, W.B.; VENZKE, W.G. (1969) Electron microscopy of

granular leukocytes of chicken (Gallus domesticus). American Journal of Veterinary

Research, 4: 637-642.

EISERICH, J.P.; BALDUS, S.; BRENNAN, M.L.; MA, W.; ZHANG, C.; TOUSSON, A.;

CASTRO, L.; LUSIS, A.J.; NAUSEEF, W.M.; WHITE, C.R.; FREEMAN, B.A. (2002)

Myeloperoxidase, a leukocyte-derived vascular NO oxidase. Science 296: 2391-

2394.

ERICSSON, J.L.E. e NAIR, M.K. (1973) Electron microscopy demonstration of acid

phophatase activity in the development and mature heterophils of the chicken.

Histochemistry 37: 97-105.

FOWLER, M.E. (1991) Comparative clinical anatomy of ratites. Journal of Zoo and

Wildlife Medicine, 22: 204.

GHIDONI, J.J. e GOLDBERG, A.F. (1966) Light and electron microscopic localization

of acid phosphatase activity in human eosinophils. The American Journal of Clinical

Pathology, 4: 402-405.

GREEN, R.A. (1999) Reference range for normal ostriches & rheas. Veterinary

clinical pathology laboratory. Texas A & M University Teaching Hospital, Apud:

GREEN, R.A. e BLUE-MCLENDON, A. (2000) Ratite hematology. In: FELDMAN,

B.V.; ZINKL, J.G.; JAIN, N.C. (eds.), Schalm's veterinary hematology, 5. ed,

Baltimore, Maryland, USA: Lippincott Williams & Wilkins, p. 1201-1206.

GREEN, R.A. e BLUE-MCLENDON, A. (2000) Ratite hematology. In: FELDMAN,

B.V.; ZINKL, J.G.; JAIN, N.C. (eds.), Schalm's veterinary hematology, 5. ed,

Baltimore, Maryland, USA: Lippincott Williams & Wilkins, p. 1201-1206.

HARR, K.E. (2002) Clinical chemistry of companion avian species: A Review.

Veterinary Clinical Pathology, 3: 140-149.

JAIN, N.C. (1967) Peroxidase activity in leukocytes of some animal species. Folia

Haematologica, 88: 297-304.

JAIN, N.C. (1969) A comparative cytochemical study of leukocytes of some animal

species. Folia Haematologica, 94: 49-63.

JAIN, N.C. (1993) Essentials of hematology. Lea & Febiger, Philadelphia, USA.

46

JAENSCH, M.J.; CULLEN, L. e RAIDAL S.R. (2000) Assessment of liver function in

galahs/cockatoos (Eolophus roseicapillus) after partial hepatectomy: a comparison of

plasma enzyme concentrations, serum bile acid levels, and galactose clearance

tests. Journal of Avian Medical Surgery, 14: 164-171. Citado por: HARR, K.E. (2002)

Clinical chemistry of companion avian species: A Review. Veterinary Clinical

Pathology, 3: 140-149.

KANEKO, J. (1989) Clinical biochemistry of Domestic Animals. 4a Ed. New York,

U.S.A. Academic Press, 725 p.

KHAZRAIINIA, P.; SAEI, S.; MOHRI, M.; HADDADZADEH, H.R.; DARVISIHHA, H.R.;

KHAKI, Z. (2006) Serum biochemistry of ostrich (Struthio camelus) in Iran.

Comparative Clinical Pathology, 15: 87-89.

KOMNENOU, A.T.; GEORGIADES, G.K.; SAVVAS, I.; DESSIRIS, A. (2003) Surgical

treatment of gastric impaction in farmed ostriches. Journal of Veterinary Medicine

Association, 50: 474-477.

LEVI, A.; PERELMAN, B.; WANER, T.; VAN GREVENBROEK, M.; VAN CREVELD,

C.; YAGIL, R. (1989) Haematological parameters of the ostrich. Avian Pathology, 18:

321-327.

LEVY, A.; PERELMAN, B.; WANER, T.; VAN GREVENBROEK, M.; VAN CREVELD,

C.; YAGIL, R. (1989) Reference blood chemical values in ostrich (Struthio camelus).

American Journal of Veterinary Research, 50: 1548-1550.

LUCAS, A.M. e JAMROZ, C. (1961) Atlas of avian hematology. Agricultural

Monograph. 25, United States Department of Agriculture, Washington D.C.

LUMEIJ, J.T. (1985) The influence of blood sample treatment on plasma potassium

concentrations in avian blood. Avian Pathology, 14: 257-260.

MAXWELL, M.H. (1984) Histochemical identification of tissue eosinophils in the

inflammatory response of the fowl (Gallus domesticus). Research in Veterinary

Science, 37: 7-11.

MAXWELL, M.H. (1986a) Fine structural and cytochemical studies of eosinophils

from fowls and ducks with eosinophilia. Research in Veterinary Science, 41: 135-148.

MAXWELL, M.H. (1986b) Ultrastructural and cytochemical studies in normal

Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) eosinophils and in those from birds with

experimentally induced eosinophilia. Research in Veterinary Science, 41: 149-161.

MAXWELL, M.H. (1987) The avian eosinophil: a review. World’s Poultry Science

Journal, 3: 190-207.

47

MAXWELL, M.H. e ROBERTSON, G.W. (1995) The avian basophilic leukocyte: a

review. World’s Poultry Science Journal, 3: 307-325.

MAXWELL, M.H. e ROBERTSON, G.W. (1998) The avian heterophil leukocyte: a

review. World’s Poultry Science Journal, 2: 155-178.

MAXWELL, M.H. e SILLER, W.G. (1972) The ultraesturctural characteristics of the

eosinophil granules in six species of domestic bird. Journal of Anatomy, 2: 289-303.

MEDWAY, W.; PRIER, J.E.; WILKINSON, J.S. (1973) Patologia Clínica Veterinária.

Cidade do México, México. Union Tipográfica Editorial Hispano-americana. 532 p.

MEYER, D.J.; COLES, E.H. e RICH, L.J. (1992) Veterinary Laboratory-Medicine

Interpretation and Diagnosis. Philadelphia, U.S.A. W. B. Saunders Company 349 p.

MONTALI, R.J. (1988) Comparative pathology of inflammation in the higher

vertebrates (reptiles, birds and mammals). Journal of Comparative Pathology, 99:1-

26.

MONIELLO, G.; BOVERA, F.; DE RIU, N.; PICCOLO, G.; PINNA, W.; DI MEO, C.

(2006) Gender effect on the metabolic profile of ostriches (Struthio camelus), Italian

Journal of Animal Science, 5: 229-235.

MUSHI, E.Z.; BINTA, M.G.; CHABO, R.G.; ISA J.F.; KAPAATA, R.W. (1999a)

Selected hematologic values of farmed ostriches (Struthio camelus) in Botswana.

Journal of Veteterinary Diagnostic Investigation, 4: 372-374.

MUSHI, E.Z.; BINTA, M.G.; CHABO, R.G.; ISA, J.F.; PHUTI, M.S. (1999b) Limb

deformities of farmed ostrich (Struthio camelus) chicks in Botswana, Tropical Animal

Health and Production, 31: 397-404.

NORAMBUENA, M.C. e PARADA, M. (2005) Serum biochemistry in andean

flamingos (Phoenicoparrus andinus) natural versus artificial diet. Journal of Zoo and

Wildlife Medicine, 36: 434-439.

OGUZ, H.; KURTOGLU, F.; KURTOGLU, V.; BIRDANE, Y.O. (2002) Evaluation of

biochemical characters of broiler chickens during dietary aflatoxin (50 and 100 ppb)

and clinoptilolite exposure. Research in Veterinary Science, 73: 101-103.

OKOTIE-EBOH, G.; BAILEY, C.A.; HICKS, K.D.; KUBENA, L.F. (1992) Reference

serum biochemical values for emus and ostriches. American Journal of Veterinary

Research, 53: 1765-1768.

PALOMEQUE, J.; PINTO, D. e VISCOR, G. (1991) Hematologic and blood chemistry

values of the Masai ostrich (Struthio camelus). Journal of Wildlife Diseases, 27: 34-

40.

48

POLAT, U.; CETIN, M.; TURKYILMAZ, O.; AK, I. (2003) Effects of different dietary

protein levels on the biochemical and production parameters of ostriches (Struthio

camelus). Veterinarski arhiv 73 : 73-80.

QUEZADA, T.; CUÉLLAR, H.; JARAMILLO-JUÁREZ, F.; VALDIVIA, A.G.;.REYES,

J.L. (2000) Effects of aflatoxin B1 on the liver and kidney of broiler chickens during

development. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 125: 265–272.

QUINTAVALLA, F.; BIGLIARDI, E.; BERTONI, P. (2001) Blood biochemical baseline

values in the ostrich (Struthio camelus). Annali della Facoltà di Medicina Veterinária,

Università degli Studi di Parma, 21: 61-71.

QURESHI, M.A. (2003) Avian macrophage and immune response: an overview.

Poultry Science, 82: 691-698.

RAUKAR, J. e SIMPRAGA, M. (2005) Haematological parameters in the blood of

onde day old ostriches. Israel Journal of Veterinary Medicine, 60: 112-114.

RAUSCH, P.G. e MOORE, T.G. (1975) Granule enzymes of polymorphonuclear

neutrophils: a philogenetic comparison. Blood, 46: 913-919.

REVISTA BRASILEIRA DE AGROPECUÁRIA (1999), ano I, no 02.

ROBINSON, J.M. (1985) Proved localization of intracellular sites of phosphatases

using cerium and cell permeabilzation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry,

33: 749.

ROELS, F.; WISSE, E.; DE PREST, B.; VAN DEN MEULEN, J. (1975) Cytochemical

discrimination between catalases and peroxidases using diaminobensidine.

Histochemistry, 41: 281-312.

SANTOS, A.A.; DA SILVA, A.M.; SILVA, M.R.; SEGRETO, H.R.; EGAMI, M.I.

(2003a) Structural, cytochemical, immunocytochemical and ultrastructural

characterization of blood granulocytes of the roadside hawk Buteo magnirostris

(Gmelin, 1788) (Avian, Falconiform). Journal of Submicroscopy Cytology and

Pathology, 35: 351-357.

SANTOS, A.A.; DA SILVA, A.M.; DE CARVALHO, V.A.L.; EGAMI, M.I. (2003b)

Morpho-cytochemical and ultrastructural characterization of peripheral thrombocytes

of roadside hawk Buteo magnirostris (Gmelin, 1788) (avian, falconiform).

International Journal of Morphology, disponivel em:

http://findarticles.com/p/articles/mi_m5EOM/is_4_21/ ai_n18617265.

49

SERGENT, N.; ROGERS, T. E CUNNINGHAM, M. (2004) Influence of biological and

ecological factors on hematological values in wild Little Penguins, Eudyptula minor.

Comparative Biochemistry and Physiology, 138: 333– 339.

SILVA, E.O.; DINIZ, J.P.; ALBERIO, S.; LAINSON, R.; DE SOUZA, W.; DAMATTA,

R.A. (2004) Blood monocyte alteration caused by a hematozoan infection in the lizard

Ameiva ameiva (Reptilia: Teiidae). Parasitology Research, 93: 448-456.

SPINU, M.; SPINU, O. e DEGEN, A.A. (1999) Haematological and immunological

variables in a domesticated and wild subspecies of ostrich (Struthio camelus). British

Poultry Science, 40: 613 – 618.

STRYER, L. (1995) Bioquímica. 4a. Ed. São Paulo, Brasil. Guanabara Koogan.

STURKIE, P.D. (1965) Avian Physiology. 2nd Ed. New York, U.S.A. Cornell University

Press, p. 41-69.

TAVARES-DIAS, M. e MORAES, F.R. (2006) Hematological parameters for the

Brycon orbignyanus Valenciennes, 1850 (Osteichthyes: Characidae) intensively bred.

Hidrobiológica, 16: 271-274.

TOKUMITSU, S.I. e FISHMAN, W.H. (1983) Alkaline phosphatase biosynthesis in the

endoplasmic reticulum and its transport through the Golgi apparatus to the plasma

membrane. Cytochemical evidence. Journal of Histochemistry and Cytochemistry,

31: 647.

TOPP, R.C. e CARLSON, H.C. (1972) Studies on avian heterophils III: phagocytic

proprieties. Avian Diseases, 1: 374-380.

VILAR, T.D.; VOLINO, W.; STELLING, W.; RIBEIRO, I..C.; LEMOS, M.;

NASCIMENTO, M.D. (2003) Determinação dos parâmetros hematológicos em

avestruzes (STRUTHIONIDAE:AVES) Struthio camelus no Estado do Rio de Janeiro,

Brasil. Revista Universidade Rural – Série Ciências da Vida, 1: 301-302.

YUKSEK, N.; AGAOGLU, Z.; KAYA, A.; ASLAN, L.; ERDOGAN, H.M.; AKGUL, Y.

(2002) Stomach impaction in ostriches (Struthio camelus): blood chemistry,

hematology, and treatment. Avian Diseases, 46: 757-760.

VERSTAPPEN, F.A.L.M.; LUMEIJ, J.T.; BRONNEBERG, G.G. (2002) Plasma

chemistry reference values in ostrich. Journal of Wildlife Diseases, 38: 154-159.