MARCOS ANTÔNIO SOARES

TRANSFORMAÇÃO E MUTAGÊNESE

INSERCIONAL EM Penicillium griseoroseum POR REMI

(INTEGRAÇÃO MEDIADA POR ENZIMA DE

RESTRIÇÃO)

Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de “Magister Scientiae”

VIÇOSA MINAS GERAIS – BRASIL

2002

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MARCOS ANTÔNIO SOARES

TRANSFORMAÇÃO E MUTAGÊNESE

INSERCIONAL EM Penicillium griseoroseum POR REMI

(INTEGRAÇÃO MEDIADA POR ENZIMA DE

RESTRIÇÃO)

Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de “Magister Scientiae”

APROVADA: 26 de Março de 2002

Profª. Célia Alencar de Morais Prof. Sérgio Hermínio Brommonschenkel

Profª. Elza Fernades de Araújo (Conselheira)

Prof. Everaldo Gonçalves de Barros (Conselheiro)

Profª. Marisa Vieira de Queiroz

(Orientadora)

A DEUS,

Aos meus pais Marly e Antônio

AGRADECIMENTOS

A DEUS, pela força inestimável que me mantem todos os momentos de

minha vida;

Aos meus queridos pais, Marly e Antônio, que sempre estiveram ao meu

lado e pelo amor, carinho e atenção;

À minha querida avó, “Marinha”, pelo carinho e preocupação com meu

bem-estar;

Aos meus irmãos José Geraldo, Maria Aparecida, Maria Cabral, Maria da

Consolação e Edilene, pela atenção e pelo compartilhamento de afeto;

À Universidade Federal de Viçosa, à Coordenação de Aperfeiçoamento de

Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Departamento de Microbiologia pela

oportunidade de realização deste trabalho;

À professora e amiga Marisa Vieira de Queiroz, pela orientação precisa,

pela atenção, carinho, disposição, humildade que fez deste trabalho um grande

prazer, e pelo estímulo constante em todos os momentos desse curso;

À professora Elza Fernandes de Araújo, pelo exemplo de dinamismo na

condução de sua vida profissional;

À professora Célia Alencar de Moraes, aos professores Sérgio Hermínio

Brommonschenkel e Everaldo Gonçalves de Barros pela participação na banca de

defesa e pelas valiosas sugestões que contribuíram para a finalização deste

trabalho;

Ao professore Lúcio A. de O. Campos e à professora Marisia Cyreti Forte

Pontes, pelos ensinamentos, pelo apoio e incentivo durante o meu curso de

graduação, e pelo exemplo de ética e moral profissional;

À professora Maria Catarina Megumi Kasuya e ao professor Marcos

Rogério Tótola, pela amizade, carinho, e principalmente, pela minha iniciação em

pesquisa e treinamento;

Aos professores do Departamento de Microbiologia que contribuíram para

minha formação profissional;

Aos meus grandes amigos Dyana, William, Cláudio, Aliçandro, Bruno,

Klédna e Maurílio pela convivência diária, pelos cuidados e pelos inúmeros

momentos felizes;

Às minhas queridas amigas de república Francismar, Poliana e Wanessa,

pela convivência sempre divertida e que fizeram da minha estadia em Viçosa

muito aconchegante;

Ao meu amigo Maurício, pelo incentivo constante e grande amizade;

Aos amigos de laboratório de Associações Micorrizas e de Genética

Molecular e de Microrganismos, pela ajuda na condução deste trabalho e pelos

momentos de descontração no trabalho;

Aos meus colegas de curso, pelo convívio agradável e amizade;

Aos meus amigos de João Monlevade, que mesmo afastados pela

distância, transmitiram amizade que tanto ajudou-me em Viçosa;

Aos funcionários do Departamento de Microbiologia, representados pelas

secretárias Laura, Nilcéia e Dona Aparecida, pelo empenho e pela amizade;

A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste

trabalho e para o meu crescimento pessoal e profissional.

BIOGRAFIA

MARCOS ANTÔNIO SOARES, filho de Antônio Soares Cabral e Marly

Soares Cabral, nasceu em São Domingos do Prata, Minas Gerais, no dia 16 de

junho de 1977.

Em outubro de 2000, graduou-se em Ciências Biológicas pela

Universidade Federal de Viçosa – MG.

Em agosto de 2000, iniciou como estudante do programa de mestrado em

Microbiologia Agrícola na Universidade Federal de Viçosa, concluindo em abril

de 2001.

CONTEÚDO

Resumo........................................................................................................................ vii Abstract...................................................................................................................... ix 1. Introdução.............................................................................................................. 01 2. Revisão de literatura.............................................................................................. 03 3. Material e Métodos................................................................................................ 17

3.1 Microrganismos, plasmídeos e meios de cultura....................................... 17 3.2 Extração de DNA plasmidial..................................................................... 17 3.3 Transformação mediada por REMI........................................................... 19 3.4 Isolamento de mutantes.............................................................................. 19 3.5 – Determinação da atividade de poligalacturonase (PG) e pectina liase

(PL) em meio líquido................................................................................................... 20

3.6 - Análise da estabilidade dos mutantes...................................................... 21 3.7 - Análise do padrão de integração.............................................................. 21

4. Resultados e Discussão.......................................................................................... 23 4.1 – Efeito da enzima de restrição Xba I na eficiência de transformação...... 23 4.2 – Caracterização das integrações nos transformantes................................ 26 4.3 – Isolamentos de mutantes morfológicos e com atividade de pectinases

alterada......................................................................................................................... 31

4.3.1) Morfológicos...................................................................................... 31 4.3.2) Mutantes com atividade de pectinases alterada.................................. 34

4.4 – Isolamentos de mutantes niaD- a partir dos transformantes................... 38 5. Conclusões.............................................................................................................. 42 6. Referências Bibliográficas..................................................................................... 43

RESUMO

SOARES, Marcos Antônio, M.S., Universidade Federal de Viçosa, março de

2002. Transformação e mutagênese insercional em Penicillium griseoroseum por REMI (integração mediada por enzima de restrição). Orientadora: Marisa Vieira de Queiroz. Conselheiros: Elza Fernandes de Araújo e Everaldo Gonçalves de Barros.

A aplicação da mutagênese insercional para etiquetagem gênica,

utilizando-se plasmídeos, requer um eficiente sistema de transformação e

ocorrência de integrações únicas no genoma. O presente trabalho demonstrou que

o uso da enzima de restrição XbaI, concomitantemente com o plasmídeo

linearizado, durante a transformação de Penicillium griseoroseum, resultou num

aumento de 6,77 vezes na eficiência de transformação em comparação com o

tratamento com plasmídeo circular. Análises de hibridização mostraram uma forte

tendência para integrações únicas (80% dos transformantes analisados). A

integração foi direcionada para o sítio de restrição, caracterizando eventos REMI.

Integrações REMI e não-REMI foram estáveis. Entre os transformantes, mutantes

morfológicos, bem como mutantes com redução na atividade total de

poligalacturonases, foram isolados. A porcentagem de mutantes foi de 0,95%.

Esse valor poderia ter sido maior considerando que mutantes auxotróficos não

puderam ser recuperados da população de transformantes. A reversão do fenótipo

nos transformantes foram mais freqüentes (até 90%) do que mutações no gene

niaD de P. griseoroseum (aproximadamente 10%). A perda das duas cópias do

vetor em um dos transformantes, que apresentou alteração morfológica, restaurou

o fenótipo original. Uma dessas cópias estava, provavelmente, etiquetando um

gene importante para a determinação da morfologia do tipo selvagem. Esses

resultados demonstram que o uso de REMI na transformação de P. griseoroseum

permite a recuperação de maior número de transformantes quando comparado a

outros métodos. Linhagens com inserções únicas originadas de eventos REMI e

não-REMI podem ser facilmente isoladas, permitindo e facilitando tanto a

etiquetagem quanto a clonagem de genes.

ABSTRACT

SOARES, Marcos Antônio, M.S., Universidade Federal de Viçosa, March, 2002. Transformation and insertional mutagenesis in Penicillium griseoroseum by REMI (restriction enzyme mediated integration). Major advisor: Marisa Vieira de Queiroz. Committee members: Elza Fernandes de Araújo and Everaldo Gonçalves de Barros.

The application of insertional mutagenesis for gene tagging with plasmids

requires an efficient transformation system and the occurrence of single insertions

in the genome. The present work demonstrates that the use of the restriction

enzyme Xba I, concomitantly with plasmid linearization, during transformation of

Penicillium griseoroseum, resulted in 6.77-fold increase in the transformation

efficiency in comparison to the treatment with a circular plasmid. Hybridization

analyses showed a strong trend to single insertions (80% of the transformants).

Integration was directed to the restriction sites of Xba I, characterizing the

occurrence of REMI events. REMI and non-REMI integrations were stable.

Among the transformants, morphological as well as mutants with reduced

polygaturonase total activity were isolated. The percentage of mutants

corresponded to 0.95%. This value might have been actually higher since

auxotrophic mutants could not be recovered from the population of transformants.

Mutations in the Fusarium oxysporum nia D gene, used as an auxotrophy marker,

were obtained at higher frequencies (up to 90%) than those in the P. griseoroseum

nia D (approximately 10%). The loss of the two vector copies by one of the

transformants presenting morphological alterations restored the original

phenotype. One of these copies was probably tagging the gene necessary for the

usual morphology in the wild-type. These results demonstrate that the use of

REMI for the transformation of P. griseoroseum allows the recovery of a higher

number of transformants. Strains with single insertions resulting from REMI and

non-REMI events can be easily isolated, allowing gene tagging and facilitating the

gene cloning.

1 – INTRODUÇÃO

Fungos filamentosos possuem grande importância ecológica e econômica.

Atuam eficientemente na decomposição da matéria orgânica do solo, o que

possibilita a ciclagem de nutrientes; outras espécies especializaram-se no

parasitismo de plantas e animais; e existem aqueles que chamam a atenção por

colonizar e produzir toxinas em alimentos utilizados na dieta animal, resultando

em sérias intoxicações ou no desenvolvimento de doenças; diversas enzimas e

compostos produzidos por determinadas espécies são amplamente utilizados nas

indústrias têxteis e farmacêuticas.

Assim como os organismos superiores, os fungos são eucariotos. Sua

manutenção em laboratório, na maioria das vezes, é fácil, pois não requerem

grande espaço físico, seu ciclo celular é relativamente rápido e seus requerimentos

nutricionais são simples. Todas as características citadas, tornam esse grupo de

organismos excelentes modelos biológicos nas áreas da fisiologia e genética.

Conseqüentemente, a obtenção de mutantes é primordial para que tais estudos

possam ser realizados.

Embora linhagens mutantes possam ser obtidos espontaneamente numa

população, a freqüência de tais mutações é baixa. O número de mutantes pode ser

aumentado utilizando-se agentes mutagênicos físicos, químicos ou biológicos.

Agentes biológicos, como plasmídeos, transposons ou mesmo T-DNA

(Agrobacterium tumefaciens), são utilizados em procedimentos de transformação

para obtenção de mutantes. Quando a molécula de DNA integra no genoma da

célula receptora ocorre uma interrupção na seqüência original de nucleotídeos,

resultando numa mutação dita insercional.

Mutantes obtidos via agentes biológicos possuem certas vantagens em

relação àqueles originados utilizando-se compostos químicos ou agentes físicos. A

capacidade de relacionar o fenótipo mutante com a seqüência interrompida, por

meio de análise de segregação, fornece um indício da função do gene.

Conseqüentemente, a clonagem da seqüência mutada torna-se menos trabalhosa,

considerando que a mesma está etiquetada com a molécula do agente biológico. O

não emprego de reagentes químicos mutagênicos é outra conveniência da

mutagênese insercional; resíduos de tais compostos poderiam poluir o ambiente,

ou mesmo o manipulador, caso não fosse utilizado corretamente.

Em contrapartida aos benefícios citados anteriormente, alguns

requerimentos são necessários para uma eficiente mutagênese insercional. É

preferível a utilização de vetores que não possuam seqüências homologas ao

genoma da célula hospedeira, propiciando-se integrações aleatórias. Eficiência na

transformação é necessária quando esse método é utilizado na mutagênese

insercional e preferencialmente que as integrações dos agentes biológicos sejam

únicas para facilitar analises de segregação e clonagem da seqüência mutada.

A transformação em fungos filamentosos tem o inconveniente de

apresentar uma baixa eficiência, variando de 0 a 10 transformantes/μg de DNA

(Redman et al., 1994). Diversas variáveis interferem nesse valor, e diversos

trabalhos têm relatado mecanismos para otimizar esse processo.

Schiestl e Petes (1991) constataram que a adição de enzima de restrição,

no momento da transformação, ocasionava um aumento de sete vezes na obtenção

de transformantes em Saccharomyces cerevisiae. Ao mesmo tempo, esse

procedimento propiciou integrações únicas do plasmídeo no genoma hospedeiro.

Essa técnica foi denominada REMI (Integração Mediada por Enzima de

Restrição) e vem sendo usada em um número crescente de fungos, onde a maioria

dos trabalhos alcançou resultados muito similares aos obtidos originalmente.

Diversos genes de fungos foram clonados por meio do emprego dessa técnica,

principalmente aqueles relacionados com patogenicidade em espécies

fitopatogênicas.

Penicillium griseoroseum é uma das espécies estuda pelo Departamento de

Microbiologia/UFV. Esse fungo tem se destacado pelo seu potencial na produção

de enzimas pectinolíticas que podem ser aplicadas nas indústrias de alimento e

farmacêutica. Também pode ser utilizado como modelo biológico para estudos de

regulação da expressão gênica, diferenciação celular, dentre outros.

Esse trabalho tem como objetivo verificar se o emprego da técnica REMI

leva a um aumento da eficiência de transformação de Penicillium griseoroseum e

avaliar o potencial mutagênico desta técnica por meio do isolamento de mutantes.

2 – REVISÃO DE LITERATURA

Os fungos constituem um grupo de organismos que se destacam pela sua

importância científica, econômica e ecológica. Esses organismos são utilizados

como modelo de estudo da célula eucariótica e em vários estudos de diferentes

processos celulares, justamente por apresentarem ciclo sexual; possuírem

diferenciação celular resultando em células especializadas; grande flexibilidade de

suas vias metabólicas, além da razoável facilidade de manutenção em laboratório

(Griffin,1994).

Juntamente com importância científica, diferentes ramos industriais têm

utilizado fungos para a fabricação de produtos alimentícios, tais como cogumelos

e produtos lácteos. A capacidade de produção de enzimas, como pectinases para a

produção e clarificação de sucos, é outro ramo bastante lucrativo, assim como a

fabricação de produtos farmacêuticos e compostos químicos como aminoácidos,

aspartame e etanol. Dois exemplos marcantes da aplicação industrial desses

organismos são Penicillium chrysogenum e Acremonium chrysogenum; essas duas

espécies são utilizadas com grande sucesso na indústria farmacêutica para a

produção dos antibióticos penicilina e cefalosporina, respectivamente (Brakhage,

1998).

O fungo Penicillium griseoroseum vem sendo estudado há mais de dez

anos pelo departamento de Microbiologia da UFV (D’Angelo, 1998; Brito, 1998;

Abreu, 2001). Esse organismo é um excelente produtor de pectinases e diferentes

trabalhos foram desenvolvidos com o objetivo de conhecer os genes que

compõem o complexo pectinolítico e isolar linhagens mutantes hiperprodutoras.

Mutação é uma modificação na seqüência de nucleotídeos do material

genético de um organismo. Conseqüentemente, é transferida de uma geração à

outra, ou seja, tem caráter herdável. Nem toda mutação origina alteração no

fenótipo da célula. Dessa forma, pesquisas com mutantes que resultam em

mudanças fenotípicas são mais freqüentes (Singer et al., 1982).

As mudanças numa seqüência de DNA variam em extensão. Podem ser

observadas modificações no número e/ou estrutura dos cromossomos. Como

conseqüência a célula mutante pode conter cromossomos a mais ou a menos; ou

mesmo cromossomos de tamanho diferente por perda/ganho de fragmentos ou

inversão de regiões. Essas alterações são bem mais extensas e, portanto, acabam

afetando diversos genes ao mesmo tempo. Outras alterações são fisicamente

menos evidente na estrutura do cromossomo, pois afetam pequenas seqüências de

nucleotídeos. Dessa forma acabam restringindo-se a um único gene.

A mutação é o fenômeno primário que gera variabilidade genética dentro

de uma população de indivíduos, sobre a qual a seleção natural atua em

conseqüência da pressão ambiental. Por conseguinte, contribuem para a

adaptabilidade dos organismos às mudanças ambientais.

Descobertas e avanços nas áreas de bioquímica, fisiologia e genética só

foram possíveis graças à obtenção, caracterização e análise de mutantes. Eles são

utilizados em mapeamento de genes com cruzamentos entre linhagens contendo

diferentes mutações; na análise de rotas metabólicas; dentre outras aplicações.

Mutantes podem ser obtidos espontaneamente numa população em baixa

freqüência, pois os organismos estão sujeitos a uma taxa de mutação basal. As

modificações na seqüência de nucleotídeos são conseqüências do próprio

metabolismo celular e/ou compostos químicos ou agentes físicos presentes no

ambiente.

O número de mutantes numa população pode aumentar utilizando-se

agentes mutagênicos, que podem ser físicos, químicos ou biológicos. Moléculas

de DNA como transposons, plasmídeos e T-DNA são freqüentemente utilizadas

como agentes biológicos na mutagênese (Casqueiro, et al., 1999; Souza et al.,

2000; Ramachandran et al., 2001). A mutação, resultante da utilização dessas

moléculas, ocorre por inserção das mesmas no genoma, ocasionando a interrupção

da seqüência original de nucleotídeos no DNA. Esse processo é chamado de

mutagênese insercional. Comprovando-se que o fenótipo mutante segrega com a

molécula de DNA utilizada na mutagênese, é demonstrado que o gene mutado

está marcado pelo vetor, processo conhecido como etiquetagem gênica. A

clonagem de genes etiquetados é mais fácil, justamente por eles conterem

seqüências conhecidas do vetor utilizado na mutagênese (Brown et al., 1998;

Souza et al., 2000).

A mutagênese insercional tem auxiliado na elucidação de genes, que até

então tinham função desconhecida. Isso é feito direcionando-se a inserção para a

seqüência de interesse e observando o fenótipo do indivíduo mutante

(Ramachandran et al., 2001; Vidan et al., 2001).

Dentre os agentes biológicos, os plasmídeos são os mais empregados para

a transformação e mutagênese insercional de fungos filamentosos. Essas

moléculas de DNA podem ocorrer naturalmente em fungos e estão

freqüentemente presentes em populações isoladas do ambiente. Os plasmídeos

que ocorrem naturalmente nesses organismos são citoplasmáticos e localizados,

especificamente, nas mitocôndrias.

A utilização dos plasmídeos isolados de fungos filamentosos na biologia

molecular ainda é limitada (Griffiths, 1995). Por isso, os que são empregados na

transformação desses microrganismos são geralmente isolados de bactérias. Para

sua utilização como vetores de transformação, necessitam conter um gene

marcador para seleção das linhagens transformadas em bactérias, e outro

marcador para a utilização em fungos. Normalmente, os plasmídeos utilizados na

transformação não possuem capacidade de replicação no fungo e, portanto, para

que se mantenha na célula transformada de maneira estável, é necessária a sua

integração no genoma.

Apesar da transformação de bactérias ter sido descrita pela primeira vez

em 1928, por Griffith, foi somente em 1973 que Tatum e colaboradores relataram

pela primeira vez a transformação de um fungo filamentoso. O procedimento

desses pesquisadores foi adicionar o DNA de um isolado selvagem de Neurospora

crassa ao meio de cultivo de um mutante, deficiente na síntese de inositol (inos-),

juntamente com cálcio. A partir da cultura do mutante, foram isoladas colônias

capazes de sintetizar inositol. Cultivando os transformantes, observou-se que a

capacidade de síntese do composto foi estável durante o crescimento vegetativo.

Um dos problemas encontrados pelos pesquisadores durante os experimentos de

transformação foi a taxa de reversão espontânea do mutante inos-. O que forneceu

suporte para a hipótese de transformação foi a taxa de reversão ser 30 vezes

superior após o tratamento, em relação ao controle onde não adicionou-se o DNA

da linhagem selvagem. Desde este trabalho até os dias de hoje, diversas espécies

de fungos foram transformadas em condições de laboratório (Fincham, 1989).

Diversos tratamentos têm sido utilizados para transformação de fungos,

como aplicação de um campo elétrico (eletroporação); bombardeamento de

partículas cobertas com o DNA (biobalística); polietilenoglicol (PEG); alta

concentração de LiCl e utilização do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens

(Chakraborty et al., 1991; Fungaro et al.,1995; Queiroz et al., 1998; Chen et al.,

2000).

O processo de biobalística foi proposto por Sanford et al. (1987) com o

objetivo de introduzir material genético no núcleo de células vegetais.

Atualmente, tal processo tem sido aplicado na transformação de diferentes

organismos como protozoários, fungos, animais e plantas (Klein et al., 1992;

Bhairi et al., 1992; Vainstein et al., 1994; Fungaro et al., 1995).

Basicamente, a introdução do DNA na célula se dá por força mecânica.

Portanto, nessa técnica emprega-se microprojéteis encapados com o ácido

nucléico a ser introduzido na célula ou tecido. O aparelho utilizado é capaz de

acelerar os microprojéteis (0,2 a 4 μm de diâmetro) a velocidades superiores a

1500 Km h-1. Essas partículas perfuram a parede e membrana celular distribuindo-

se aleatoriamente no interior da célula. O emprego da biobalística evita o trauma

químico e elétrico sofrido pelas células em outras metodologias de transformação,

pois as partículas de ouro ou de tungstênio, utilizadas para a confecção dos

microprojéteis, possuem alta densidade e baixa reatividade química (Watts et al.,

1990).

Em contrapartida algumas variáveis interferem com a eficiência dessa

técnica. Molnar et al. (1997), otimizando o bombardeamento de Pisum sativum,

verificaram que parâmetros como pressão, tamanho dos microprojéteis e a

distância entre o material a ser transformado e os microprojéteis precisam ser

testados para obtenção de uma maior eficiência na transformação, e

conseqüentemente redução nos danos celulares. Uma vez no interior da célula, o

ácido nucléico pode se dissociar do microprojétil e, eventualmente, integrar-se no

genoma do organismo a ser transformado. O mecanismo de integração do DNA

no genoma hospedeiro é pouco conhecido. Acredita-se que primeiro ocorra um

estágio de pré-integração e, posteriormente, a integração propriamente dita

(Pawlowski et al. citado por Pawlowski, 1998).

A utilização da biobalística é muito vantajosa em organismos para os quais

a obtenção e regeneração de protoplastos não são possíveis ou não estão

otimizados, ou mesmo quando se quer evitar o uso dos mesmos. Diferentes tipos

celulares de fungos podem ser transformados por essa técnica, como micélio e

esporos. Urediniósporos de Uromyces appendiculatus (Bhairi et al., 1992) e

conídios de Aspergillus nidulans (Fungaro et al., 1995) são exemplos de esporos

utilizados na transformação utilizando-se partículas de tungstênio.

A eletroporação é outra técnica de transformação, que se baseia na

aplicação de um pulso elétrico sobre uma suspensão de células na presença de

moléculas de DNA (Watts et al., 1990). O mecanismo de entrada do DNA na

célula ainda não foi completamente elucidado. Alguns autores sugerem que o

pulso aplicado contribui para a ruptura da membrana plasmática, originando

pequenos poros, tornado-a permeável a pequenas moléculas. O DNA difundiria-se

através destes pequenos poros de aproximadamente 5nm de diâmetro

(Zimmermann e Vienken citados por Watts et al., 1990). Outros pesquisadores

propõem que, pela carga residual da membrana plasmática ser negativa, após o

pulso elétrico, ocorreria uma inversão desta carga. Essa inversão de cargas

facilitaria a agregação e transporte de moléculas carregadas negativamente, como

o DNA (Watts et al., 1987, citados por Watts et al., 1990).

Uma forte barreira à entrada do DNA durante a eletroporação é a parede

celular de bactérias, fungos e plantas. Chakraborty et al. (1991) puderam verificar

esse efeito a partir da eletroporação de conídios de N. crassa germinados na

presença de β-glucoronidase. Esse pré-tratamento pode ser de extrema utilidade,

pois enfraquece a parede celular sem comprometer a integridade da célula. A

eficiência de transformação foi 10 vezes superior quando os conídios foram

tratados com β-glucoronidase. A eletroporação necessita de condições

experimentais precisas, como tempo e quantidade do pulso aplicado, para cada

espécie ou isolado a ser transformado. Outros fatores como idade do conídio,

estágio da germinação, natureza da enzima micolítica usada, escolha dos

marcadores e o meio de seleção são críticos para o sucesso de tal metodologia.

Agrobacterium tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias gram- presentes

no solo, capazes de transformar células vegetais, induzindo a proliferação celular

no tecido vegetal.

Esse fenômeno é induzido pelo plasmídeo presente em Agrobacterium

chamado de plasmídeo Ti (“tumour inducing”). Ti é um plasmídeo circular de

aproximadamente 180 Kb. Possui uma região chamada de T-DNA, que é

transferida da bactéria para a célula vegetal durante o processo de infecção e que é

capaz de inserir-se no genoma por recombinação não homóloga. Esse plasmídeo

foi modificado para ser utilizado na biotecnologia com o objetivo de

transformação de vegetais em laboratório.

Em 1995, foi relatada a transformação de S. cerevisiae utilizando A.

tumefaciens(Bundock et al, 1995). As eficiências de transformação relatadas

variaram de 10-6 (Bundock et al., 1995) até 10-3 / receptor recuperado (Piers at al.,

1996). Esses autores concluíram que a indução dos genes vir é necessária para a

transformação de S. cerevisiae, assim como os braços do T-DNA e o

processamento do T-DNA pela proteína VirD1/D2. Desse modo, o mecanismo é,

em parte, similar à transferência observada em plantas. No entanto os genes

necessários para a adsorção da bactéria nas células vegetais não são essenciais

para a transformação de levedura.

A. tumefaciens é capaz de transformar, além de leveduras, os seguintes

fungos filamentosos: Aspergillus awamori, A. niger, Fusarium venenatun,

Trichoderma reesei, Colletotrichum gloeosporioides, N. crassa e Agaricus

bisporus (Groot et al., 1998; Gouka, et al., 1999; Chen et al., 2000). A

transformação é efetiva com conídios, micélio e protoplasto de fungos, além de

fragmentos do basidiocarpo de A. bisporus (Chen et al., 2000).

A integração normalmente ocorre de maneira heteróloga, mas quando o T-

DNA possui homologia com o genoma do fungo transformado a integração

também ocorre nas regiões homólogas (Gouka et al., 1999).

A. tumefaciens também foi capaz de transformar diferentes linhagens de

células humanas (Kunik, et al., 2001), assim como na transformação de células

vegetais, a integração foi heteróloga e genes vir e chv foram essenciais; apesar de

que a indução dos genes vir pela adição de acetoseringona não foi necessária para

a detecção de células transformantes, possivelmente pelo fato do meio de cultura

ou exsudatos das células conterem compostos fenólicos capazes de realizar a

mesma função da acetoseringona.

A obtenção de células, de S. cereviseae, sem parede celular (Hutchison et

al., 1967) possibilitou o aperfeiçoamento da utilização de PEG para a

transformação de fungos. Esses autores submeteram as células de S. cereviseae ao

tratamento com glusulase, uma preparação do suco gástrico de caracol rica em

1,3-glucanase e quitinase. Essa preparação foi capaz de lisar a parede celular da

levedura. Para manter a integridade dos protoplastos, utilizaram-se um

estabilizador osmótico composto de sorbitol 1M. A partir deste trabalho de

obtenção de protoplastos abriu-se a possibilidade de utilização dessa metodologia

no processo de transformação.

Hinnen et al. (1978), utilizando protoplastos preparados a partir de

leveduras deficientes na biosíntese de leucina, leu2-, obtiveram células com o

fenótipo selvagem após o tratamento dos protoplastos com o DNA de células do

tipo selvagem na presença de cloreto de cálcio. Nesse processo de transformação,

os protoplastos, juntamente com o vetor, são tratados com uma solução de PEG e

CaCl2 que auxiliam na transformação.

O mecanismo de entrada do DNA no protoplasto ainda não foi elucidado.

Um dos papéis dos policátions, utilizados na infecção de protoplastos de plantas

com ácido nucléico viral, seria modificar a carga elétrica do ácido nucléico e da

membrana celular para propiciar uma aproximação destes elementos (Motoyoshi

et al., 1974; citados por Watts et al, 1991). Hebert (1963) supôs que o PEG teria

uma função similar, agregando e precipitando o DNA sobre a membrana

plasmática dos protoplastos.

Os fungos Ustilago maydis, Colletotrichum sp, A. bisporus, Botrytis

cinerea, Penicillium chrysogenum, P. griseoroseum e Trichoderma virens são

alguns exemplos de fungos filamentosos cujos protoplastos foram transformados

utilizando PEG (Wang et al., 1988; Redman et al., 1994; van de Rhee et al., 1996;

Baek et al., 1997; Graessle et al., 1997; Levis et al., 1997; Queiroz et al., 1998).

Uma das limitações desta técnica é a necessidade de obtenção e regeneração de

protoplastos da espécie de interesse.

A eficiência de transformação para fungos filamentosos é muito variável,

sendo que algumas espécies apresentam valores baixos, variando de 0 a 10

transformantes/μg de DNA (Redman et al., 1994). Fatores como espécie,

metodologia, adição de inibidores de nucleases ou de enzima de restrição,

quantidade e características do vetor (tamanho, grau de homologia, estado físico,

marca de seleção, presença de seqüências de replicação autônoma, modificações

causadas pela bactéria utilizada na amplificação), influenciam a eficiência e até

mesmo a estabilidade da transformação (Schiestl et al., 1991; Picard et al., 1987,

Diolez et al., 1993; Redman et al., 1994; van de Rhee, et al., 1996; Levis, et al.,

1997; Manczinger et al., 1997).

A integração do plasmídeo no genoma pode ocorrer basicamente por

integração homóloga ou heteróloga. Fatores como grau de homologia entre vetor e

o genoma e os sistemas de recombinação da célula a ser transformada são

determinantes no direcionamento de cada mecanismo de integração (Picard et al.,

1987; Baek et al., 1997; Hogan et al, 1997; Levis et al., 1997; Woods et al., 1998;

Casqueiro at al., 1999; Cormack et al., 1999; Kiechle et al., 2000; Lin et al., 2001;

Perreira et al., 2001).

A integração homóloga, aditiva ou troca gênica, pode ocorrer quando o

vetor possui regiões de homologia com o genoma a ser transformado;

normalmente possuindo algum gene do próprio organismo sendo utilizado como

marca de seleção das células transformadas, ou contendo apenas fragmento de

DNA do organismo. A integração homóloga aditiva é caracterizada por um único

evento de recombinação entre as duas moléculas de DNA, e a troca gênica por

dois eventos de recombinação.

Foram obtidos transformantes numa eficiência de 1,6%, de P.

chrysogenum, deficientes na síntese de lisina por direcionamento da integração do

plasmídeo contendo um fragmento de DNA de 4,9 Kb do gene lys2 desse mesmo

fungo, mas a utilização de vetores com fragmentos menores que o original

resultou na ausência de transformantes, demonstrando que o tamanho da região de

homologia influencia no padrão de integração. Quando esses mesmos autores

utilizaram o gene pyrG como marcador e sua seqüência flanqueada por regiões

homólogas ao gene lys2 de 4,3 e 3 Kb, pode-se recuperar transformantes que

sofreram troca gênica numa eficiência de 0,14%, mas nenhuma troca gênica pôde

ser observada quando seqüências menores do gene lys2 foram utilizadas. Um

hipótese que explica esse evento pode estar relacionada com o próprio locus do

gene lys2 (Casquerio et al. 1999).

Pereira et al. (2001) obtiveram 100 % de integrações homólogas, aditivas

ou troca gênica, quando transformaram P. griseoroseum com o plasmídeo pNPG1

que contém um fragmento de 6,1 Kb que possui o gene nia D desse mesmo fungo.

Em Candida glabrata regiões de homologia de aproximadamente 100 pb

são suficientes para dirigir a integração homóloga (Cormack et al., 1999) e em S.

cerevisiae regiões de 30 pb, de cada lado de um fragmento de DNA não

homólogo, já são suficientes para conseguir uma recombinação eficiente (Hua et

al., 1997).

As diferenças na freqüência de integrações homológas entre diferentes

organismos parecem depender, principalmente, da existência um sistema de

recombinação homólogo eficiente nos organismos. Quando o vetor não apresenta

homologia ou esta é baixa, ele se integra aleatoriamente no genoma hospedeiro

podendo inativar qualquer gene. Esse tipo de integração é chamada de ectópica ou

heteróloga. Mesmo quando um vetor apresenta regiões de homologia com

algumas seqüências do genoma receptor, a integração heteróloga pode ocorrer

devido a um sistema de recombinação homóloga pouco eficiente ou mesmo

ausência desse sistema e/ou por apresentar um sistema de recombinação

heteróloga mais eficiente. Esse sistema de integração é um método eficiente para a

mutagênese insercional, quando o objetivo é obter diferentes tipos de mutantes, já

que sua integração pode ser definida como aleatória.

Na transformação de um mutante deficiente na assimilação de nitrogênio

de B. cinerea com o gene niaD de F. oxysporum, foram obtidos 10

transformantes/μg de DNA, sendo que a eficiência de transformação foi o dobro

quando utilizou-se o gene do próprio B. cinerea (Levis et al., 1997). Penicillium

expansum, quando transformado com o gene nia homólogo, produziu 15-16

transformantes/μg de DNA (Torres, 2001), mas quando transformado com o gene

de F. oxysporum foram obtidos apenas 8 transformantes/μg de DNA (Ribeiro,

1998). A eficiência de transformação com um gene homólogo tende ser maior do

que a obtida com um gene heterólogo.

Estratégias como a utilização de vetores com seqüências teloméricas e/ou

seqüências de replicação autônoma acarretam num aumento acentuado na

eficiência de transformação. Redman et al (1994), ao transformar Colletotrichum

lindemuthianum com o vetor pHA1.3, obtiveram uma eficiência de transformação

de 100 a 10.000 transformantes/μg de DNA. Essa alta eficiência foi

correlacionada com o fato desse vetor possuir seqüências teloméricas de F.

oxysporum e seqüência de replicação autônoma.

Schiestl et al. (1991), transformando S. cerevisiae, propuseram que a

adição de enzima de restrição à mistura de transformação aumentava a eficiência

de transformação em sete vezes. O evento de integração mediado pela enzima de

restrição foi denominado de REMI (Integração Mediada por Enzima de

Restrição). Esses autores sugeriram que a enzima de restrição, utilizada durante a

transformação, induziria quebras duplas no DNA genômico nos seus sítios de

clivagem gerando extremidades coesivas com o vetor linear quando o plasmídeo é

digerido com a mesma enzima.

A clivagem do genoma pela enzima de restrição, durante a transformação,

resulta basicamente em três eventos em relação ao sítio de clivagem da enzima

utilizada: deleções (Figura 1-IA), reparo (Figura 1-IB) e reparo com integração do

vetor (Figura 1-IC). Por meio de sistemas de reparo de quebra dupla, o vetor é

integrado no genoma, podendo regenerar o sítio de clivagem. Dessa forma quando

o DNA total dos transformantes é clivado com a mesma enzima utilizada na

transformação, pode-se detectar um fragmento de DNA de mesmo tamanho que o

vetor. Isso evidência que os dois sítios de clivagem, presentes nas extremidades

do vetor, foram perfeitamente regenerados durante a integração (Figura 1 – IIA).

O sistema de reparo de quebra dupla pode não regenerar um dos sítios de

clivagem, e até mesmo os dois, resultando num evento de mutação não REMI

(Figura 1 – IIB).

Mutantes gerados a partir da transformação utilizando enzimas de restrição

podem ser gerados por outro mecanismo diferente da mutagênese insercional. As

quebras geradas no DNA genômico podem ser corrigidas erroneamente (Figura 1

– IIC), sendo que em alguns casos, deleções e rearranjos já foram observados

(Linnemannstöns et al., 1999).

I

II

Figura 1: Efeito da enzima de restrição utilizada na transformação e integrações do vetor. I- Após a

atuação da enzima no genoma pode haver deleções(A), reparo(B) ou reparo com integração do

vetor no sítio de clivagem da enzima(C). II- Mecanismos de integração do vetor no sitio de

clivagem presente no genoma podem regenerar os dois sítios resultando em evento REMI (A),

regenerar um sítio ou nenhum (B) ou simplesmente regenerar o sítio inicial, mas a integração do

vetor ocorrer em outra região (C).

Quebras de fita dupla podem surgir como conseqüência da ação

de enzimas de restrição, além da ação de topoisomerases, radiações e

agentes químicos. O reparo de quebras duplas no DNA de leveduras

pode ocorrer via um processo reconhecido como reparo por ligação de

terminais não homólogos (Schiestl e Petes, 1991; Moore et al., 1996;

Zhu et al., 1996; Manivasakam et al., 1998; Lewis et al, 1999).

A integração de vetores lineares, sem a presença de enzima, ocorreria por

outro mecanismo de recombinação não homólogo no qual regiões de

microhomologia dos terminais fita simples do vetor atuariam na integração.

Enzimas, como topoisomerase I (Topo I), podem estar envolvidas nesse tipo de

recombinação em S. cerevisiae (Zhu et al., 1996)

Além da diferença no padrão de integrações, existem também diferenças

na estabilidade e no número das mesmas. Integrações homólogas aditivas tendem

a ser mais instáveis por gerar regiões próximas com alta homologia. Essas regiões

podem ser perdidas por um processo de recombinação homóloga. Casqueiro et al.

(1999) observou baixa estabilidade em transformantes que apresentavam esse

padrão de integração.

A presença de cópias únicas e/ou em tandem do plasmídeo podem ocorrer

em qualquer tipo de integração. Provavelmente integrações em tandem surgiriam

a partir de integrações homólogas entre os vetores presentes no núcleo; ocorrendo

antes da integração no genoma, formando concatâmeros ou por meio de ciclos de

recombinação com vetores já integrados no genoma (Fincham, 1989).

Um outro modelo de integração em tandem foi recentemente proposto em

Dictyostelium discoideum (Barth et al., 1998). Os autores do trabalho sugerem que

múltiplas cópias poderiam ser inseridas por meio da replicação circulo rolante a

partir de concatâmeros ou de moléculas simples de plasmídeo, mas

necessariamente circular.

A aplicação da técnica REMI não se limita apenas ao aumento da

eficiência de transformação, podendo ser utilizada na mutagênese insercional,

propiciando um sistema eficiente de etiquetagem gênica, geração de aberrações

cromossômicas e estimulação de recombinação mitótica em sítios específicos

(Schiestl et al., 1991)

Kuspa e Loomis (1992) obtiveram 20 a 60 vezes mais transformantes de

D. discoideum na presença da enzima de restrição utilizada na clivagem do vetor.

A integração do vetor no genoma preservou, em mais de 70% dos transformantes,

o sítio de restrição da enzima utilizada; sugerindo que os terminais compatíveis

entre o vetor e o genoma, gerados pela mesma enzima, são eventualmente

reparados pela maquinaria de reparo da célula. Isso está de acordo com os

resultados obtidos quando a enzima utilizada para a clivagem do vetor foi

diferente da utilizada durante o procedimento de transformação. Enzimas que

geram terminais coesivos, por exemplo, BamH1 e Sau3A1, acarretaram aumento

na transformação, ao contrário do que ocorreu entre BamH1 e EcoR1.

A clonagem do gene Tox1 de Cochliobolus heterostrophus (Lu et al.,

1994) foi realizada utilizando-se o REMI, sendo que de um total de 1310

transformantes, dois eram deficientes na síntese da toxina T e a mutação estava

ligada ao marcador de seleção contido no vetor usado na transformação. Foi

verificado que a forma ativa ou inativa da enzima de restrição adicionada à

suspensão de protoplastos influenciava a eficiência de transformação. A enzima

contida na reação de clivagem foi capaz de aumentar em cerca de 20 vezes a

eficiência de transformação, e a adição posterior de enzima acabou por decrescer

esse valor. Os dois mutantes Tox1- foram gerados pela integração do vetor em

diferentes posições nesse locus, o sítio de restrição da enzima utilizada durante a

transformação foi regenerado, sendo, portanto um evento REMI verdadeiro.

Em Magnaporthe grisea foi relatado um aumento de aproximadamente 10

vezes na eficiência de transformação utilizando-se REMI (Shi et al., 1995). A

eficiência variou com a concentração e a enzima utilizada, onde geralmente

concentrações relativamente altas acabaram por diminuir a eficiência de

transformação. Esse decréscimo não está relacionado com possíveis danos ao

genoma, já que a viabilidade dos protoplastos não foi alterada. A utilização de

enzimas, para linearizar e/ou transformar, que geram terminais abruptos causam

um leve efeito na eficiência de transformação, indicando que terminais coesivos

entre o vetor e o genoma são regenerados com maior eficiência. Após a análise de

600 transformantes foram isolados dois mutantes morfológicos, um auxotrófico e

dois relacionados com a patogenicidade.

Já em U. maydis, não se observou diferença na eficiência de transformação

utilizando enzima de restrição no momento da transformação com o vetor circular

(Bölker, 1995). Após a análise do padrão de integração, pode-se concluir que a

presença da enzima de restrição propiciou, em 90% dos transformantes,

integrações únicas; ao contrário dos transformantes obtidos sem adição de enzima,

onde o vetor apresentou integrações em tandem. Os resultados obtidos por esses

autores demonstram que o REMI é uma técnica eficiente para a etiquetagem

gênica em U. maydis, sendo que de 1000 transformantes analisados, 1 a 2% foram

incapazes de produzir os sintomas de patogenicidade nos testes realizados.

REMI foi aplicado para diversos fungos como Alternaria alternata,

Coprinus cinereus, Mycosphaerella zeae-maydis, Glomerella graminicola, D.

discideum, Colletotrichum magna, Paecilomyces fumosoroseus, A. nidulans, A.

oryzae e A. fumigatus (Akamatsu et al., 1997; Granado et al., 1997; Sánchez, et

al., 1998; Yun et al., 1998; Epstein et al., 1998; Barth et al., 1998; Redman et al.,

1999; Tanaka et al., 1999; Cantone et al., 1999; Yaver et al., 2000; Brookman et

al., 2000; Thon et al., 2000; Zeng et al., 2000; Souza et al., 2000) com os

objetivos de aumentar a eficiência de transformação; isolar mutantes,

principalmente para deficiência na fitopatogenicidade, e etiquetar genes para sua

subseqüente clonagem.

Esses trabalhos corroboram a observação de que REMI é uma técnica

muito eficiente para a etiquetagem de genes porque, em geral, leva a um aumento

da eficiência de transformação, propicia integrações aleatórias no genoma da

espécie a ser transformada e favorece integrações únicas do vetor, diminuindo

integrações em tandem, o que facilita a futura clonagem do gene mutado.

Alguns requerimentos são essenciais para a utilização eficiente do REMI.

É necessário que o vetor possua capacidade de replicação e seleção em E. coli,

para facilitar a recuperação do plasmídeo de um possível mutante de interesse;

para selecionar as células transformantes deve-se utilizar um marcador dominante

ou um marcador que complemente uma mutação auxotrófica, nesse caso, é

preferível que a seqüência do marcador não seja homóloga para propiciar

integrações heterólogas; o vetor precisa ter sítios únicos de restrição; é necessário

padronizar a melhor concentração de enzima que resulte na máxima eficiência.

A partir da aplicação de REMI pode-se obter diferentes mutantes. No

entanto, muitas vezes o mutante pode ser isolado sem a ocorrência de integração

do plasmídeo no gene em estudo. Para comprovar que o gene foi realmente

etiquetado, pode-se utilizar diferentes estratégias, como: análise de segregação

pelo ciclo sexual ou parassexual, transformação da linhagem selvagem com o

plasmídeo recuperado, e pela complementação do mutante com um cosmídeo ou

plasmídeo carregando a região do gene da linhagem selvagem.

3 - MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – Microrganismos, plasmídeos e meios de cultura

O organismo utilizado foi Penicillium griseoroseum (CCT 6421), isolado

de sementes florestais pelo Dr. J. J. Muchovej, do Departamento de Fitopatologia

da Universidade Federal de Viçosa. Os experimentos de transformação foram

realizados com uma linhagem mutante, obtida por Pereira (1999) denominada

PG63. Esse isolado possui conídios verdes e apresenta uma deleção de 211 pb no

gene niaD, tornando-o incapaz de assimilar nitrogênio na forma nítrica. A

linhagem auxotrófica foi cultivada em meio completo (Pontecorvo et al., 1953)

modificado por Azevedo e Costa (1973). Utilizou-se meio mínimo (Pontecorvo et

al., 1953) para a seleção e manutenção dos transformantes a 25°C. Para a seleção

e regeneração dos protoplastos adicionou-se sacarose 0,56 M em ambos os meios.

O plasmídeo pNH24 (Diolez et al., 1993), que possui o gene niaD de F.

oxysporum e sítios únicos de restrição para Xba I e Eco RV, foi utilizado nos

experimentos de transformação. O isolamento de mutantes niaD- foi realizado

segundo UnKles et al. (1989), utilizando meio mínimo contendo clorato de sódio

e glutamina.

3.2 – Extração de DNA plasmidial

O plasmídeo pNH24 foi isolado de E. coli DH5α pelo método de extração

alcalina e purificado por cloreto de lítio, como descrito em Sambrook et al.

(1989). O plasmídeo foi linearizado por digestão de 5 μg do DNA com 15

unidades de Xba I num volume de reação de 30 μL, por 2 horas, segundo

instruções do fabricante. Nos experimentos de transformação foram utilizadas

diferentes quantidades da enzima Xba I (Quadro 1).

Quadro 1: Diferentes tratamentos empregados nos experimentos de

transformação de P. griseoroseum.

TRATAMENTO

CONDIÇÃO DO

VETOR USADO NA

TRANSFORMAÇÃO*

CONDIÇAO DA

ENZIMA

ADICIONADA A

REAÇÃO DE

CLIVAGEM

UNIDADES DE

ENZIMA

ADICIONADAS

DURANTE A

TRANSFORMAÇÃO

T1 Ausência do vetor - 0

T2 circular - 0

T3 Linear inativa

(15min/70°C) 0

T4 Linear Ativa 0

T5 Linear Ativa 1

T6 Linear Ativa 5

T7 Linear Ativa 10

T8 Linear Ativa 15

T9 Linear Ativa 20

* O vetor foi linearizado com a enzima Xba I

3.3 – Transformação mediada por REMI

Uma suspensão de esporos, obtida da linhagem PG63, foi plaqueada sobre

meio completo, coberto com papel celofane e incubada por 20 horas a 25°C. Após

a incubação, aproximadamente 800 mg de micélio foram misturados a 5 mL de

tampão de digestão (KCl 0,8 M, pH 5,8; tampão fosfato 10 mM; 15 mg da enzima

GLUCANEX® - Novo Nordisk). Essa mistura foi mantida a 30°C, 80 rpm por 3

horas. Logo após a protoplastização, a suspensão foi filtrada, e lavada por 3 vezes

em STC (Sorbitol 1M; CaCl2 0,05 M e Tris-HCl 0,1 M) com centrifugação de

3000g por 15 min; ao final obteve-se uma suspensão de protoplastos na

concentração de 108 protoplastos/mL.

A transformação seguiu os procedimentos de Yelton et. al (1984) e

Ballance e Turner (1985) com modificações. Num tubo Eppendorff foram

adicionados: 100 μL da suspensão de protoplastos, 5 μg de DNA plasmidial,

quantidades variáveis da Xba I (Quadro 1) e 50μL de polietilenoglicol 6000 25%.

As misturas foram incubadas em banho de gelo por 30 minutos, seguindo-se a

adição de 500 μL da mesma solução de polietilenoglicol. Após 20 minutos a 25

°C, os protoplastos foram plaqueados em meio mínimo contendo nitrogênio

nítrico como única forma de nitrogênio e sacarose 0,56 M, pelo método “pour

plate”, e mantidos a 250C por 5 dias. A eficiência de transformação foi dada pela

contagem dos transformantes que cresceram no meio seletivo.

O controle negativo da transformação foi realizado nas mesmas condições,

exceto pela ausência do plasmídeo, assim como os controles de regeneração dos

protoplastos.

3.4 - Isolamento de mutantes

Mutantes morfológicos que apresentaram modificações na cor, na

esporulação ou no crescimento foram selecionados pela observação direta das

colônias. Para esses isolados o número de conídios foi estimado por transferência

de discos das colônias para 4 mL de Tween 80 0,1%. A contagem foi feita em

câmara de Neubauer.

A produção diferenciada de pectinases dos transformantes foi estimada

pela medição do halo de degradação de pectina em placa de Petri. Cerca de 500

transformantes purificados foram crescidos em meio mineral tamponado (MMT) a

pH 7,2 (2,0 g de KH2PO4, 7,0 g de K2HPO4, 1,0 g de (NH4)2SO4, 1,0 g de

MgSO4.7H2O, 3,0 g de pectina cítrica, 0,6 g de extrato de levedura, 13 g de ágar –

água q.s.p 1000 mL) por 5 dias a 25°C. Após esse período, discos de 7 mm do

micélio foram transferidos para placas de Petri contendo o meio tamponado Mac

Ilvaine (17,95 g de NaHPO4, 7,74 g de ácido cítrico, 2,5 g de pectina cítrica, 13 g

de agar – água q.s.p. 1000 mL) e incubados por 48 h a 40 °C. Para revelação do

halo de degradação foi utilizada uma solução de iodo/iodeto (5,0 g de KI, 1,0 g de

iodo – água q.s.p. 330 mL). Os transformantes que apresentaram medidas do halo

de degradação menor que o selvagem foram selecionados para posterior dosagem

da atividade enzimática em meio líquido.

3.5 – Determinação da atividade de poligalacturonase (PG) e pectina

liase (PL) em meio líquido

As dosagens enzimáticas foram realizadas no sobrenadante das

culturas crescidas em meio líquido. Para dosagem de poligalacturonase

o meio utilizado foi o meio mineral não tamponado (0,6 g de KH2PO4, 2

g de K2HPO4, 1 g de (NH4)2SO4, 5,5 g de MgSO4.7H2O, 3 g de pectina,

3 g de extrato de levedura, pH 6,3 – água q.s.p. 1000 mL) e para

dosagens de pectina liase utilizou-se o meio mineral tamponado (3,8 g

de KH2PO4, 6,8 g de K2HPO4, 1 g de (NH4)2SO4, 5,5 g de MgSO4.7H2O,

3 g de pectina, 3 g de extrato de levedura – água q.s.p. 1000 mL). Uma

suspensão de esporos foi preparada a partir das linhagens de P.

griseoroseum crescidas por 7 dias em ágar-aveia. Frascos Erlenmeyer

contendo 50 mL de meio foram inoculados com tal suspensão numa

concentração final de 1 x 106 esporos/mL. As culturas foram incubadas

a 25 °C, a 150 rpm por 36 horas para dosagens de PG e por 120 horas

para PL.

A dosagem de poligalacturonase baseou-se no método do açúcar

redutor do DNS (Miller, 1959). A mistura de reação constou de 1 mL

do sobrenadante da cultura e 1 mL de solução do substrato (ácido

poligaraturônico 0,6 %). Imediatamente após a mistura retirou-se uma

alíquota de 0,25 mL a qual foi adicionada a um tubo contendo 1 mL de

DNS e 0,25 mL de água. A mistura de reação foi mantida por 20 min a

40 °C. Após esse período, retirou-se 0,25 mL da mistura e adicionou-se

1 mL de DNS e 0,25 mL de água. Os tubos foram mantidos a 95-100 °C

por 5 min e logo em seguida, 10 mL de água foram adicionados a cada

tudo. A absorbância foi medida a 540 nm.

Para a dosagem de PL 1 mL do substrato (pectina cítrica 2,5 %) e

1,5 mL do sobrenadante da cultura foram misturados. Uma alíquota de

0,5 mL foi retirada e adicionada num tubo de ensaio contendo 4,5 mL

de HCl 10 mM para interromper a reação. Após 30 min, foram

retiradas mais duas alíquotas realizando-se o mesmo procedimento. A

absorbância foi lida a 235 nm, como descrito por Albersheim e Killias

(1962).

3.6 - Análise da estabilidade dos mutantes

Os mutantes selecionados foram transferidos para meio completo e

mantidos por 7 dias, a 25°C. Após esse período foram novamente transferidos

para meio completo, sendo esse processo repetido por 5 vezes. Após essas

transferências testou-se a capacidade de crescimento em meio mínimo com nitrato

na forma nítrica como a única fonte de nitrogênio. Mutantes estáveis foram

capazes de manter sua capacidade de assimilar o nitrogênio do meio mínimo.

3.7 - Análise do padrão de integração

Para extração de DNA, as linhagens transformantes foram crescidas em

meio mínimo coberto com papel celofane. O isolado PG63 foi cultivado em meio

completo.

Realizou-se a maceração do micélio congelado em nitrogênio líquido com

auxílio de almofariz e pistilo. Pequena quantidade do micélio em pó foi

transferida para tubos Eppendorfs e a extração foi realizada segundo metodologia

de Speacht et al. (1982). Cerca de 3 μg de DNA foi clivado num volume 50 μL de

reação de clivagem utilizando Eco RV ou Xba I, de acordo com recomendações

do fabricante. Os fragmentos de DNA da reação de clivagem foram separados por

eletroforese em gel de agarose 0,8 % e transferidos para membrana de nylon

(Stratagene®) de acordo com Sambrook et al. (1989).

O plasmídeo pNH24, empregado como sonda, foi marcado com dUTP –

fluoresceína, utilizando-se flúor-12-dUTP ( Dig hight primer DNA labeling and

detection starter Kit II, Roche) segundo instruções do fabricante, ou com α-32P-

ATP (Sambrook et al., 1998). As condições de hibridização e lavagens da

membrana, quando hibridizadas com sonda marcada por dUTP – fluoresceína,

seguiram as recomendações do fabricante para sondas homólogas, assim como a

detecção da hibridização.

A sonda marcada com α-32P-dATP foi fervida por 10 minutos e mantida

em banho de gelo até sua utilização. A membrana foi incubada por 16 horas a

68°C, sob agitação lenta.

Seguiram-se quatro lavagens, na mesma temperatura de hibridização: uma

vez em SSC 2x, SDS 0,1%; duas vezes em SSC 1X, SDS 0,1%, e uma vez em

SSC 0,1x, SDS 0,1%, cada uma com duração de 20 minutos.

O resultado da hibridização foi detectado após exposição de um filme

radiográfico à membrana por 15 min, quando utilizou-se marcação com dUTP –

fluoresceína, e por 24 horas a –80°C para marcação com α-32P-ATP.

4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 – Efeito da enzima de restrição Xba I na eficiência de

transformação de P. griseoroseum

O vetor linearizado mostrou-se mais eficiente que a forma

circular para a obtenção de transformantes (Figura 2, T2 e T3). As

extremidades do vetor linear podem ser utilizadas de forma

semelhante ao que ocorre em S. cerevisiae, onde os terminais livres de

DNA são usados pelo sistema de integração ilegítima.

De uma forma geral, o estado físico do vetor influenciou a

transformação de diversos outros fungos (Wang et al., 1988; Shi et al.,

1995; van de Rhee et al, 1996; Manivasakam et al., 1998). No entanto,

em determinadas espécies, essa diferença não foi observada (Granado

et al., 1997; Thon et al., 2000). Na maioria dos trabalhos com REMI

citados anteriormente, a linearização do vetor resulta num efeito

positivo na eficiência de transformação.

Em Ustilago maydis a linearização do plasmídeo pHL1 acarretou

um aumento de 20 vezes na eficiência de transformação (Wang et al.,

1988), assim como trabalhos com Agaricus bisporus, Magnaporthe

grisea e S. cerevisiae têm mostrado o mesmo resultado (Shi et al.,

1995; van de Rhee et al, 1996; Manivasakam et al., 1998). No caso de

Cochliobolus heterostrophus, a utilização do plasmídeo pUCATPH

circular inviabilizou a obtenção de transformantes, o que não ocorreu

quando esse plasmídeo foi linearizado, apesar da taxa de

transformação ter sido baixa (Lu et al., 1994)

Espécies como Colletotrichum graminicola (Thon et al., 2000) e

Coprinus cinereus (Granado et al., 1997) não apresentaram diferenças

na eficiência de transformação quando foi utilizada a forma linear ou

circular do plasmídeo.

A diferença entre o tratamento T3 e o tratamento T4 está na presença da

enzima de restrição utilizada na clivagem do plasmídeo, inativa ou ativa,

respectivamente; portanto, Xba I foi capaz de aumentar em 3,24 vezes a eficiência

transformação de P. griseoroseum (Figura 2).

Após o trabalho inicial de Schiestl e Petes (1991), diversos outros têm

demonstrado que enzimas de restrição são capazes de influenciar a transformação

de diversos fungos.

A influência na eficiência de transformação varia entre os tipos e

concentrações das enzimas utilizadas. Asp718, EcoRV, HindIII, SalI, SmaI, HpaI,

MscI e SnaBI não influenciaram na eficiência da transformação de S. cerevisiae

(Manivasakam et al., 1991) e BamHI em Ustilago maydis (Bölker et al., 1995).

Inversamente, HindIII e SalI atuaram positivamente na eficiência de

transformação de A. oryzae (Yaver et al., 2000).

Devido à variação de respostas em relação ao tipo de enzima e ao

organismo estudado, acredita-se que a incapacidade de uma enzima de restrição

em afetar a taxa de transformação não se relaciona com suas propriedades, mas

sim com o ambiente celular, habilidade de entrada na célula e condições de

transformação (Manivasakam et al., 1998).

A quantidade que resulte numa maior eficiência de

transformação precisa ser otimizada empiricamente. A eficiência de

transformação parece ser inversamente proporcional às concentrações

da enzima testada. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que a

adição de 1U é suficiente para a obtenção da maior eficiência de

transformação de P. griseoroseum (Figura 2, T5). Quantidades maiores

resultaram num decréscimo da eficiência, apesar dos números de

transformantes serem superiores ao tratamento no qual a enzima foi

inativada (Figura 2, T3 e T6 a T9).

Granado (1997) verificou que a enzima de restrição não tem

efeito mutagênico que leve a uma menor viabilidade, pelo menos que

seja mensurável, em protoplastos de C. cinereus.

A enzima EcoRI, quando utilizada na transformação de S.

cerevisiae, também não diminuiu a viabilidade das células (Manivasakam

e Schiestl, 1998), mas quando expressa neste organismo resultou em

morte celular provavelmente por induzir inúmeras quebras duplas na

molécula de DNA que não puderam ser corrigidas, eficientemente, pelo

sistema de reparo (Lewis et al., 1999).

Possivelmente as concentrações utilizadas nos procedimentos de

transformação não são nocivas o suficiente para causar inviabilidade

celular. Quantidades maiores da enzima de restrição podem atuar no

sítio de reparo, decrescendo a freqüência de inserção e refletindo uma

menor eficiência de transformação.

Figura 2: Influência do estado físico do plasmídeo e da quantidade de enzima de

restrição na eficiência de transformação de P. griseoroseum. Os tratamentos

correspondem aos mesmos do Quadro 1. Médias seguidas pela mesma letra

não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5 % de probabilidade. T1-

ausência de plasmídeo; T2-plasmídeo circular; T3-plasmídeo linearizado, e

com inativação da enzima utilizada na sua clivagem; T4 a T9-plasmídeo

linearizado, com a enzima ativa utilizada na reação de clivagem, e com adição

de 0, 1, 5, 10, 15 e 20U, respectivamente, de enzima durante a

transformação.

4.2 – Caracterização das integrações dos plasmídeos nos transformantes

Para determinar o padrão de integração do plasmídeo nos transformantes,

o DNA total foi digerido com a enzima Xba I e Eco RV.

O plasmídeo pNH24 possui um único sítio de clivagem para a

enzima Eco RV, conseqüentemente o número de cópias e a

aleatoriedade da integração podem ser inferidos baseados no número

de fragmentos de DNA gerados quando o DNA dos transformantes é

clivado com essa enzima e hibridizado com o plasmídeo.

Se o transformante possuir apenas uma cópia do vetor no seu

genoma, a clivagem do seu DNA produzirá dois fragmentos de DNA.

Isso é resultado da clivagem da enzima uma única vez na seqüência do

plasmídeo, gerando dois fragmentos, sendo que cada um está ligado ao

DNA do fungo. Quando dois transformantes apresentarem diferentes

padrões de bandas, pode-se inferir que a integração ocorreu em

diferentes sítios no genoma. Integrações em tandem são visualizadas

pelo aparecimento de três bandas, sendo uma delas correspondente ao

tamanho do vetor e outras duas de tamanhos variáveis (Figura 3,

canaleta 13). Algumas plasmídeos integrados podem sofrer rearranjos

resultando em pequenas deleções do vetor, nesse caso a hibridização

gera apenas uma banda (Figuras 3, canaleta 10).

A transformação utilizando Xba I favoreceu integrações únicas

em 80 % dos casos analisados, nos casos restantes as integrações

ocorreram em tandem ou foram produzidos rearranjos (Figuras 3 e 4).

Apesar de dois transformantes obtidos com o plasmídeo pNH24 na forma

circular também terem resultado em integrações únicas, pode-se observar que esse

padrão ocorreu em baixa freqüência, como já verificado por Queiroz et al.(1998)

que transformaram pela primeira vez P. griseoroseum utilizando o plasmídeo

pNE24 (Figura 3, canaletas 2 e 3).

Integrações únicas e aleatórias são os principais requerimentos para a

mutagênese insercional, pois facilita a verificação da integração no gene

responsável pelo fenótipo do mutante e a futura clonagem do gene interrompido.

Bölker et al. (1995) apesar de não ter verificado aumento na eficiência de

transformação de U. maydis via REMI, concluíram que essa técnica é eficiente

para a mutagênese insercional, pois favorece justamente esse tipo de integração.

Alguns autores questionam a aleatoriedade fornecida pelo REMI por

isolarem transformantes com o mesmo fenótipo e/ou genes idênticos

interrompidos (Lu et al., 1994). Isso pode estar relacionado com o tamanho do

gene em questão, o número de sítios de clivagem presentes no mesmo para a

enzima utilizada na transformação, ou mesmo o número de genes relacionados

com um determinado fenótipo.

Quando a integração do vetor é direcionada pela enzima de restrição

utilizada durante a transformação, os dois sítios de restrição nos seus terminais

podem ser regenerados. Então, a hibridização gera um fragmento de mesmo

tamanho que o plasmídeo quando o DNA genômico do transformante for clivado

com a mesma enzima.

Três tipos de integração ocorreram entre os transformantes analisados. O

primeiro tipo mostrou um fragmento de tamanho idêntico ao do plasmídeo

pNH24, indicando que nesse transformante os dois sítios foram regenerados

(Figura 4, canaleta 6). Um outro tipo ocorreu quando nenhum dos sítios foi

regenerado ou a regeneração ocorreu em apenas um deles, esse caso é evidenciado

por um fragmento maior que o fragmento do vetor (Figura 4, canaletas 3 e 4). E

por fim, o terceiro tipo surgiu quando o plasmídeo circular integrou mantendo o

sítio de XbaI na sua seqüência, dessa forma fragmentos menores que o do vetor

foram evidenciados pela hibridização (Figura 4 canaleta 2).

A

B

Figura 3 – Análise dos transformantes de P. griseoroseum. (A) Clivagem do DNA total com Eco

RV: M – Marcador de tamanho λ Hind III; P – plasmídeo pNH24, 1 e 17 – P.

griseoroseum PG63; 2 a 16 transformantes niaD+. (B) Auto-radiografia da hibridização

utilizando como sonda o plasmídeo pNH24 marcado com α -32P- ATP.

A B

Figura 4 – Análise dos transformantes com produção de poligalacturonase alterada. (A) Clivagem

do DNA total com Eco RV M – Marcador de tamanho λ Hind III; P – plasmídeo pNH24,

1 – P. griseoroseum PG63; 2 - Tr7 e 3 - Tr8. (B) Auto-radiografia da hibridização

utilizando como sonda o plasmídeo pNH24 marcado com dUTP – fluoresceína.

Transformantes apresentam integrações únicas pela presença de duas bandas.

A B

Figura 5 – Analise dos transformantes de P.griseoroseum. (A) Clivagem do DNA total

com Xba I: M – Marcador de tamanho λ Hind III; P – plasmídeo pNH24, 1 – P.

griseoroseum PG63; 2 – transformantes obtidos com plasmídeo circular; 3 a 6

– transformantes obtidos com plasmídeo linear (B) Auto-radiografia da

hibridização utilizando como sonda o plasmídeo pNH24 marcado com dUTP –

fluoresceína. A seta indica um fragmento de DNA do mesmo tamanho que o

plasmídeo.

4.3 – Isolamentos de mutantes morfológicos e com atividade enzimática de

pectinases alterada

4.3.1 - Mutantes Morfológicos

Diferentes tipos de mutantes podem ser isolados de uma população. O

isolamento restringe-se àqueles que possuem alterações fenotípicas capazes de

serem visualizadas por alguma metodologia. Nessa categoria podemos isolar

indivíduos com alterações morfológicas, auxotróficas, resistentes e/ou sensíveis a

drogas, relacionados com patogenicidade e produção alterada de metabólitos e/ou

enzimas.

Mutantes morfológicos caracterizam-se por apresentar

diferentes fenótipos como alterações na taxa de crescimento linear,

no padrão de ramificação, no grau de esporulação, na pigmentação dos

esporos e na degeneração celular.

De um total de 843 transformantes obtidos foram isolados 6 mutantes

morfológicos (Figura 6). Esses mutantes foram originados somente dos

tratamentos onde houve adição da enzima de restrição. Essa origem deve-se ao

fato de ter sido analisado maior número de transformantes originados desses

tratamentos.

Os mutantes Tr 1, Tr 2 e Tr 3 possuem tonalidade verde mais claro em

relação ao selvagem. Alterações na cor podem ser causadas pela redução na

quantidade de pigmentos, atraso no desenvolvimento dos conídios ou mesmo

redução no número deles. Nesses mutantes esse efeito parece relacionado com a

redução na esporulação, verificado após a contagem de esporos.

O mutante Tr4 apresentou esporos de coloração marron. Esse isolado pode

apresentar um gene da via de produção do pigmento verde mutado ou outro gene

envolvido na deposição do pigmento na parede celular. Em A. nidulans diversos

genes contribuem para os nuances da cor do esporo, mas os dois principais são

wA e yA responsáveis pelas tonalidades branca e amarela, respectivamente. O

produto desses dois genes atuam diretamente na via de formação do pigmento.

Outros genes como chA, fwA, bwA ou dilA e dilB podem alterar a quantidade e a

qualidade do pigmento ou em algum aspecto da parede celular (Adams et al.,

1998).

O mutante Tr5 apresentou redução na esporulação e alterações no padrão

de crescimento. Depois de alguns dias de crescimento, a borda da colônia

começava a sofrer alterações da morfologia, podendo ser resultado de

modificações no padrão de ramificação, o que foi observado por meio de

microscopia.

O mutante Tr6 mostrou áreas do micélio deficientes na esporulação,

provavelmente acarretadas por mutação em um gene envolvido no controle da

esporulação. Fenótipos semelhantes foram obtidos em A. nidulans (Adams et al.,

1998).

Os padrões de integração do vetor nesses mutantes podem ser reunidos em

três grupos: o primeiro apresentando integrações únicas no genoma como os Tr1,

Tr5 e Tr6 (Figura 3, canaletas 12, 8, 11, respectivamente); o segundo

apresentando integrações múltiplas, representado pelos transformantes Tr4 e Tr2

(Figura 3, canaletas 13 e 15, respectivamente), e por fim transformantes que

apresentaram rearranjos no vetor como no Tr3 (Figura 3, canaleta 10).

No mutante Tr4, as integrações ocorreram em tandem e no Tr2

possivelmente houve dois eventos de integração em diferentes regiões do genoma.

Nos transformantes Tr1 e Tr5, os dois sítios de clivagem para Xba I foram

regenerados durante a inserção do vetor (dados não mostrados)

Para os demais mutantes não foi verificado se a mutação responsável pelo

fenótipo dos transformantes ocorreu devido a inserção do plasmídeo ou a outras

mutações causadas pela enzima de restrição utilizada durante a transformação.

Essa estudo poderá ser realizado por meio da análise de segregação entre o

fenótipo e o vetor pelo ciclo parassexual ou mesmo transformando a linhagem

PG63 com o vetor recuperado a partir do mutante.

Figura 6 – Mutantes morfológicos obtidos na transformação do P. griseoroseum. A e B - linhagem

PG63 cultivado em meio mínimo (MM) e meio completo, respectivamente; C – P.

griseoroseum selvagem em MM; D - Tr1, E – Tr2, F – Tr3, G – Tr4, H – Tr5 e I – Tr6

crescidos em MM. Os mutantes foram obtidos nos tratamentos onde houve adição da

enzima XbaI no momento da transformação. Tr1 – reação de clivagem; Tr2 – 01U; Tr3 –

05U; Tr4 – 05U; Tr5 – 20U e Tr6 – 10U.

4.3.2 - Mutantes com atividade de pectinases alterada

Penicillium griseoroseum tem demonstrado ser um eficiente produtor de

enzimas pectinolíticas, tais como pectina liase e poligalacturonase. Nesse fungo já

foram isolados dois genes que codificam para pectina liase (Bazzolli,

comunicação pessoal) e dois genes que codificam endopoligalacturonases

(endoPG) (Ribon, 2001). A obtenção de mutantes para produção dessas enzimas é

importante para o isolamento de novos genes, que ainda não tenham sido

encontrados.

A atividade total de pectinases foi analisada em 500 transformantes pelo

método da medida do halo de degradação em placa de Petri. Esse método não é

muito sensível, mas tem-se prestado para uma triagem inicial quando é necessário

analisar um grande número de isolados.

A maioria dos transformantes apresentou valores muito similares ao

isolado PG63 utilizado como controle. Dessa primeira análise foram selecionados

três transformantes que apresentaram halos de degradação menores que o controle

(Figura 7), sendo que um deles, o Tr5,também apresentou alterações

morfológicas.

Dosagens da atividade enzimática em meio líquido foram realizadas para

confirmação dos resultados obtidos pela medida do halo de degradação em meio

sólido. As dosagens foram realizadas para poligalacturonases e pectina liases para

verificar qual das duas enzimas tinha sido afetada.

Os transformantes Tr7 e Tr8 apresentam menor atividade de

poligalacturonase (PG); não diferindo na atividade de pectina liase (PL) em

relação à linhagem transformada, P. griseoroseum PG63 (Figura 8). O

transformante Tr5 destacou-se pela sua maior atividade de PL.

Esses resultados indicam uma possível mutação em genes relacionados

com a síntese de PG. O sequenciamento das regiões que flanqueiam o vetor

poderá elucidar se o gene mutado corresponde aos genes de endoPG já

caracterizados. Caso a mutação não seja especificamente nos genes de PG, genes

de regulação ou genes com efeitos pleiotrópicos na expressão ou secreção de PG

podem ter sido afetados pela mutação. No caso do transformante Tr5, uma

mutação pode ter ocorrido em algum gene que codifica uma proteína repressora,

ou em outro gene de efeito pleiotrópico.

A obtenção de dois mutantes com redução da atividade de PG e ao mesmo

tempo apresentado alterações morfológicas indica uma possível mutação num

gene de efeito pleiotrópico.

A obtenção de mutantes deficientes na produção de PG, com mutações

especificamente no gene que codifica essa enzima, pode ser dificultada quando

existem diferentes cópias do gene no genoma. Mesmo que se tenha uma cópia

mutada, a segunda cópia funcional poderá mascarar o efeito da mutação

resultando num fenótipo muito discreto e de difícil identificação. Quando se

trabalha com genes representados uma única vez no genoma, a seleção de

mutantes, resultantes de mutagênese insercional, pode ser mais evidente e precisa.

Os três mutantes isolados possuem apenas uma integração do vetor (Figura 3 e 4).

O potencial mutagênico da técnica de REMI foi demonstrado pela

obtenção de 8 mutantes, entre morfológicos e com produção de pectinases

alterada, num total de 843 transformantes. A eficiência de mutação foi de 0,95%

por meio de REMI, e 0,63 % para mutagênese utilizando UV (Brito, 1998).

Mutantes auxotróficos não puderam ser isolados já que a linhagem

transformada, PG63, possui uma marca auxotrófica e a seleção dos transformantes

é realizada em meio mínimo.

A técnica de REMI tem demonstrado ser eficaz pela etiquetagem do gene

que possivelmente está determinando o fenótipo. Outros fatores que determinam

sua eficácia são a aleatoriedade das integrações no genoma e aumento da

eficiência de transformação.

Para a futura clonagem desses genes é necessário verificar se a mutação

resultou da inserção do vetor ou originou-se por outro mecanismo, como a ação da

endonuclease adicionada na transformação.

Figura 7 – Estimativa da atividade de pectinases em meio sólido. I - Transformantes

crescidos em meio mineral tamponado. A: P. griseoroseum PG63, B: Tr 5; C: Tr

7 e D: Tr 8. II – Medidas dos halos de degradação em meio tampão Mac

Ilvaine. A: Tr 5 (2,3 cm) e S (2,9 cm); B: Tr 7 (2,3 cm) e S (2,6 cm); C: Tr 8

(2,4 cm) e S (2,7 cm).

Figura 8 – Dosagem da atividade de pectinases em meio líquido. A – Atividade total de pectina

liase (PL). B – Atividade total de poligalacturonase (PG). Médias seguidas pela mesma

letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5 % de probabilidade.

A

B

4.4 – Isolamento de revertentes niaD- a partir dos transformantes niaD+

A obtenção de mutantes incapazes de assimilar nitrogênio na

forma nítrica pode ser realizada facilmente por obtenção de colônias

resistentes ao clorato.

A enzima nitrato redutase pode converter o clorato em clorito,

que é um composto tóxico à célula, portanto colônias que não assimilam

nitrato são capazes de crescerem no meio contendo clorato. As

mutações podem ocorrer em diferentes genes responsáveis pela

assimilação de nitrogênio nítrico, tais como os genes que codificam

permeases (crn), relacionados com a síntese do cofator (cnxA),

reguladores positivos (nirA e niiA) e finalmente o gene estrutural da

nitrato redutase (niaD).

Após a seleção, é necessário realizar a caracterização da

mutação em diferentes fontes de nitrogênio. Mutantes

especificamente no gene niaD são incapazes de crescer em meio com

NO3-, mas apresentam crescimento em meio contendo NO2

-,

hipoxantina e NH4+.

Os transformantes possuem o gene niaD de F. oxysporum.

Revertentes niaD- obtidos a partir desses transformantes podem

surgir por mutação ou por perda do plasmídeo. Para analisar a

estabilidade dos transformantes obtidos, foram realizadas tentativas

de isolamento de linhagens revertentes, em meio com clorato, de

alguns transformantes, para correlacionar a obtenção de colônias niaD-

com a perda das integrações do plasmídeo pNH24.

Foram utilizadas as linhagens de transformantes que

apresentaram alterações morfológicas e foram observadas freqüências

variações no número de revertentes (Quadro 3). Dos 6 transformantes

testados, 4 apresentaram freqüências maiores que 40%; um

apresentou uma freqüência de 10%, semelhante a obtida por Brito

(1998) para P. griseoroseum e o Tr6 não originou nenhuma colônia nia

D-. Em P. expansum a obtenção de mutantes niaD- por meio da

resistência ao clorato é próxima de 24 % das colônias resistentes ao

clorato (Pio, 2001).

Diversas seqüências levam a rearranjos nos cromossomos em

fungos filamentosos. Seqüências repetidas no genoma são substrato

para a recombinação podendo ocasionar rearranjos e até mesmo

deleções (Fierro et al., 1999). Integrações em tandem foram instáveis

em transformantes de P. chrysogenum (Casqueiro et al., 1998)

justamente por serem regiões homólogas e muito próximas.

Entre os mutantes morfológicos, o Tr2 e o Tr4 apresentaram

integrações múltiplas. O primeiro apresentou integrações em tandem e

o segundo apresentou duas integrações em diferentes locais do genoma

(Figura 3, canaletas 13 e 15, respectivamente). As freqüências de

reversão foram discrepantes entre esses dois isolados.

O Tr4 resultou numa reversão ao fenótipo niaD- de

aproximadamente 90%, correlacionado-se com possível rearranjo ou

deleção na região de integração do plasmídeo. Pelo padrão de

hibridização, de um dos isolados nia D-, é provável que tenha ocorrido

uma recombinação entre as cópias da inserção resultando numa única

cópia com deleção de parte do plasmídeo contendo o gene niaD (Figura

3, canaleta 14). O revertente analisado parece reter uma atividade

alterada da nitrato redutase, pois seu crescimento em meio mínimo

com nitrato, apesar de ser residual, freqüentemente origina regiões de

crescimento compacto e inclusive com esporulação (Figura 10).

A porcentagem de revertentes niaD- do transformante Tr2 foi

relativamente baixa quando comparado aos mutantes Tr1, Tr3, Tr4 e

Tr5 (Tabela 4). Por apresentar duas integrações, seria necessário

mutações ou perdas das duas cópias para resultar em linhagens

resistentes ao clorato, e a recombinação entre essas cópias deve ser

menos freqüente por aparentemente estarem inseridas em diferentes

regiões do genoma. Um fato interessante é que entre os mutantes

niaD- recuperados do mutante Tr2, três mutantes reverteram o

fenótipo (Figura 9). A reversão foi causada por perda das duas cópias

dos vetores, observadas pela falta de sinal de hibridização (Figura 3,

canaleta 16). Isso leva a crer que a inserção de uma das cópias resultou

na mutação.

Os mutantes Tr1, Tr3 e o Tr5, que possuem uma única cópia do

gene niaD de F. oxysporum, apresentaram porcentagens de mutação no

gene niaD- maiores em relação ao gene endógeno. Essa diferença pode

ser conseqüência de integrações em regiões que favoreçam a mutação

nesse gene ou mesmo a perda do vetor. O que pode ser o contrário

para o Tr6, que não apresentou mutantes niaD- quando colocado em

meio seletivo.

Quadro 3: Porcentagem de colônias nia D- resistentes ao clorato

obtidas a partir do plaqueamento de esporos dos transformantes com

alterações morfológicas.

Transformante Revertentes (%)

Tr1 40,62

Tr2 09,68

Tr3 80,00

Tr4 89,75

Tr5 57,14

Tr6 00,00

Figura 9– Mutantes nia D- obtidos a partir do transformante Tr2 isolados em meio seletivo. I e II

são placas replicas contendo meio completo e meio mínimo com nitrato, respectivamente.

A – P. griseoroseum PG63 nia D-; B – transformante Tr2, niaD+, do P. griseoroseum

PG63, que apresenta alteração morfológica; C – três mutantes nia D- obtidos a partir do

Tr2 em meio com clorato e que reverteram ao fenótipo do P. griseoroseum PG63.

Figura 10 – Crescimento do mutante niaD-, em meio mínimo contendo nitrato, obtido a partir do

Tr4. A – plaqueamento de esporos e B – inoculação pontual. Mutantes niaD- possuem

crescimento residual nesse tipo de meio, mas esse mutante apresenta regiões onde o

crescimento é mais vigoroso chegando a esporular (seta).

5 – CONCLUSÕES

A linearização do plasmídeo pNH24 para transformação de Penicillium

griseoroseum resultou num aumento da eficiência de transformação, assim como a

utilização de enzima de restrição XbaI.

A adição de apenas 1U da enzima XbaI, concomitantemente com a

linearização do plasmídeo, foi suficiente para aumentar 6,77 vezes a eficiência de

transformação em relação ao tratamento que utilizou o plasmídeo circular.

Quantidades maiores resultaram num decréscimo da transformação.

A maioria dos transformantes apresentou integrações únicas e aleatórias no

genoma. Nos transformantes obtidos na presença da enzima de restrição, a

integração do vetor restituiu os sítios de clivagem, indicando que a ocorrência de

REMI nesse fungo.

Mutantes com alterações morfológicas, com atividade reduzida de

poligalacturonases (PGs) e atividade aumentada de pectina liase (PL) foram

isolados dos transformantes obtidos nos tratamentos onde utilizou-se a enzima

XbaI.

A freqüência de reversão do fenótipo Nia- nos transformantes foi maior do

que a freqüência de mutação no gene niaD do próprio P. griseoroseum. A

obtenção de uma reversão do fenótipo de um dos mutantes morfológicos, pela

perda do plasmídeo, indicou que o gene está etiquetado por uma das duas cópias

do vetor contida nesse mutante.

A utilização de REMI em P. griseoroseum é indicada para a obtenção de

maiores freqüências de transformação, obtenção de transformantes com

integrações únicas e para a etiquetagem de genes.

6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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