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Dissertação TERAPIA GÊNICA PARA ANGIOGÊNESE NA ANGINA REFRATÁRIA: ENSAIO CLÍNICO CONTROLADO FASE I/II Imarilde Inês Giusti

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Dissertação

TERAPIA GÊNICA PARA ANGIOGÊNESE NA ANGINA REFRATÁRIA:

ENSAIO CLÍNICO CONTROLADO FASE I/II

Imarilde Inês Giusti

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INSTITTUTO DE CARDIOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL

FUNDAÇÃO UNIVERSITÁRIA DE CARDIOLOGIA

Programa de Pós-Graduação em Medicina:

Área de Concentração: Cardiologia e

Ciências Cardiovasculares

TERAPIA GÊNICA PARA ANGIOGÊNESE NA ANGINA REFRATÁRIA:

ENSAIO CLÍNICO CONTROLADO FASE I/II

Autor: Imarilde Inês Giusti

Orientador: Dr. Renato Abdala Karam Kalil

Dissertação submetida como requisito para

obtenção do grau de mestre ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Área

de concentração: Cardiologia e Ciências

Cardiovasculares, da Fundação Universitária

de Cardiologia / Instituto de Cardiologia do

Rio Grande do Sul.

Porto Alegre, 2011

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pela vida.

À minha família, meus filhos e meu marido pelo apoio, carinho e compreensão.

Ao meu orientador, Dr. Renato Abdala Karam Kalil, sem ele, este trabalho não

aconteceria, agradeço pela orientação, pela amizade e pelo exemplo a ser seguido.

Aos colaboradores do trabalho, aos diferentes setores do Instituto de Cardiologia, que de

alguma forma contribuíram para a realização do mesmo.

À equipe da terapia gênica, Clarissa Garcia Rodrigues, Felipe Borsu de Salles, Roberto

Sant’Ana, Nance Beyer Nardi, Melissa Medeiros Markoski, Andrés Delgado Cañedo e Bruna

Eibel.

Aos pacientes, pela paciência com o estudo e por confiarem na equipe da terapia gênica.

Ao Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul/Fundação Universitária de Cardiologia

pela oportunidade na realização deste trabalho.

Às pessoas que direta ou indiretamente auxiliaram no desenvolvimento e conclusão deste

trabalho.

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SUMÁRIO

BASE TEÓRICA

1. Introdução................................................................................................... 7

2. Cardiopatia Isquêmica .............................................................................. 9

2.1. Tratamento da Cardiopatia Isquêmica.......................................................... 11

3. Terapia Gênica para Cardiopatia Isquêmica.......................................... 12

3.1. Bases Moleculares da Angiogênese............................................................. 12

3.2. Papel do Endotélio....................................................................................... 16

4. Terapia Gênica com VEGF165............................................................... 19

4.1. Vetor Plasmidial........................................................................................... 28

4.2. Vias de Administração................................................................................. 30

4.3. População, Segurança, Benefícios e Potenciais Riscos do Uso da Terapia

Gênica...........................................................................................................

31

5. Ensaios Clínicos Controlados de Terapia Gênica................................... 32

6. Nossa Experiência com Terapia Gênica................................................... 38

7. Justificativa................................................................................................. 44

8. Hipótese de Pesquisa.................................................................................. 45

9. Objetivos..................................................................................................... 46

9.1. Objetivo Geral.............................................................................................. 46

9.2. Objetivos Específicos................................................................................... 46

10. Referências.................................................................................................. 47

ARTIGO

Resumo........................................................................................................ 57

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Introdução..................................................................................................

Métodos.......................................................................................................

Análise Estatística......................................................................................

Resultados...................................................................................................

Discussão.....................................................................................................

Referências..................................................................................................

Tabela 1........................................................................................................

Figura 1........................................................................................................

Figura 2........................................................................................................

Figura 3................................................................................................... .....

Figura 4........................................................................................................

Figura 5........................................................................................................

Figura 6........................................................................................................

59

60

64

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1. INTRODUÇÃO

A demonstração de que alguns fatores de crescimento vascular têm o potencial de induzir

angiogênese no tecido isquêmico1-3

tem estimulado a investigação de novas técnicas de

tratamento para pacientes com doença arterial coronariana (DAC). Isso se deve à possibilidade de

induzir angiogênese miocárdica e estabelecer circulação colateral, especialmente nos casos de

angina refratária à terapêutica convencional e inviáveis para as técnicas de revascularização

miocárdica tradicionais, percutânea e cirúrgica.

A complexa cascata de eventos que ocorre durante a neovascularização em resposta à

isquemia envolve diversos fatores de crescimento e receptores4. O fator de crescimento endotelial

vascular (vascular endothelial growth factor - VEGF) tem sido foco de diversos estudos5, 6

e seus

efeitos vêm sendo testados em pacientes com DAC grave7-20

. Nos últimos anos, foram realizados

estudos que utilizaram diferentes doses, vetores e vias de administração do VEGF. Ensaios

clínicos trazem resultados controversos, muitos demonstrando melhora clínica e evidência de

angiogênese8-19

e outros não apresentando diferenças na perfusão miocárdica quando comparados

aos seus controles7-20

. Dessa forma, apesar de promissores, os efeitos clínicos e sobre a

vascularização do miocárdio proporcionados pela terapia gênica com VEGF permanecem não

esclarecidos totalmente.

A terapia gênica com o VEGF representa uma potencial alternativa de tratamento para

angina refratária, pela possibilidade do desenvolvimento de circulação colateral e melhora da

perfusão miocárdica. O VEGF funciona tanto como um importante marcador de dano endotelial

quanto como mediador de reparo. Em casos de injúria como isquemia, inflamação e infarto tem

sua expressão aumentada e estimula a manutenção, mobilização e recrutamento das células

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progenitoras endoteliais (CPE) da medula óssea21

. Seu potencial angiogênico estimula a produção

endotelial de óxido nítrico (NO).

Estas observações salientam a importância do estudo da segurança, viabilidade e os

efeitos iniciais (ensaio clínico fase I/II), clínicos e sobre a perfusão do miocárdio do gene que

codifica a proteína VEGF em pacientes com DAC avançada e angina refratária, não passíveis de

revascularização percutânea e cirúrgica, visando a possível formação de novos vasos colaterais.

No presente estudo, a administração transtorácica de VEGF165 plasmidial representa o primeiro

ensaio clínico com terapia gênica no Brasil.

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2. CARDIOPATIA ISQUÊMICA

As doenças cardiovasculares (DCV) são a primeira causa de morte no Brasil,

especialmente entre os idosos. As doenças cerebrovasculares (DCBV) e as doenças isquêmicas

do coração (DIC) totalizam mais de 60% dos óbitos por DCV. Em 2002, a mortalidade

proporcional por DIC, no Brasil, foi de 30,5% das mortes por DCV, sendo que, na faixa etária

acima de 60 anos, foi de 27,4% para o sexo feminino, e para o sexo masculino foi de 32,0% dos

óbitos por DCV22

.

Na fisiopatologia da cardiopatia isquêmica dois processos estão implicados: a oferta e a

demanda de oxigênio pelo miocárdio. A isquemia miocárdica ocorre quando há desequilíbrio na

oferta e na demanda de oxigênio. Por outro lado, duas situações alteram a oferta de oxigênio para

o miocárdio: a isquemia e a hipoxemia. Em algumas condições, o comprometimento da oferta de

oxigênio é secundário à diminuição do fluxo sanguíneo, sendo essa a fisiopatologia da maioria

dos casos de infarto agudo do miocárdio (IAM) e dos episódios de angina instável. Em outras

situações, como a hipertrofia ventricular, o aumento na demanda de oxigênio é o principal

responsável pela isquemia miocárdica23

.

Além disso, o sinergismo desses dois mecanismos é o principal fator na determinação de

isquemia nos casos de angina crônica estável. Esforço físico, estresse emocional, taquicardia ou

hipertensão arterial associados à obstrução coronária alteram não só a demanda como a oferta de

oxigênio, desencadeando isquemia miocárdica. A hipoxemia, por sua vez, caracteriza-se pela

redução da oferta de oxigênio, mas com perfusão sanguínea adequada. Alguns exemplos desse

quadro são as cardiopatias congênitas cianóticas, asfixia, a insuficiência respiratória e a

intoxicação por monóxido de carbono24

. Fatores que alteram a demanda e a oferta de oxigênio,

portanto, são os responsáveis pela evolução do paciente para síndrome coronária aguda e angina

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crônica estável. De acordo com estatísticas do American Heart Association, 201025

, a prevalência

de angina na população americana é de 4,6%, afetando 58% dos pacientes com DAC25

e

crescendo rapidamente com o aumento da idade.

As opções não convencionais de tratamento para angina refratária são limitadas e incluem

terapia gênica, terapia celular com células tronco e revascularização transmiocárdica com laser.

Alguns pacientes são extensivamente revisados e acabam fazendo algum tipo de

revascularização, mesmo que parcial, com o objetivo de aliviar os sintomas. Entretanto, a longo

prazo, os riscos de eventos adversos são bastante altos26

.

O grau de obstrução da artéria responsável pelo episódio agudo, a ocorrência de lesões em

outros vasos e o grau de circulação colateral são os determinantes mais importantes da

diminuição da oferta de oxigênio; a pressão arterial sistêmica, a freqüência cardíaca e a

hipertrofia e contratilidade ventricular são as variáveis mais importantes na determinação da

demanda de oxigênio. Apesar da contribuição de todos esses fatores na determinação da isquemia

miocárdica, a doença aterosclerótica coronária é o substrato anatômico mais importante na

fisiopatogenia da cardiopatia isquêmica24

.

A partir de estudos destacados da literatura27-30

, sabemos hoje da importância do processo

aterotrombótico não só no desencadeamento da isquemia aguda como também na progressão da

doença aterosclerótica com relação à gravidade da obstrução da luz vascular31, 32

.

Dentre os principais fatores de risco, destacam-se o tabagismo, a hipertensão arterial

sistêmica, a dislipidemia, diabetes melito, intolerância à glicose, resistência à insulina,

insuficiência renal crônica, obesidade, sedentarismo e deficiência de estrógeno. Surgem a cada

ano novos fatores de risco para a DAC, onde várias substâncias dosadas no sangue têm

demonstrado relação com risco coronário maior. Entre essas, as mais estudadas são os valores

totais de homocisteína, lipoproteína, marcadores da função fibrinolítica (PAI-1, t-PA e d-dímero),

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fibrinogênio e marcadores inflamatórios (proteína C reativa, interleucina 6, fatores de adesão

celular – ICAM-1 e fator de necrose tumoral – TNFα)33, 34

.

A progressão da DAC causa seqüelas como necrose por infarto do miocárdio e fibrose por

isquemia crônica severa, levando à perda progressiva da função contrátil e do relaxamento, à

miocardiopatia isquêmica, com sintomas de insuficiência cardíaca, arritmias e morte35

. O

miocárdio tem capacidade de regeneração limitada, pois embora tenham sido demonstradas

células-tronco cardíacas, estas não são suficientes para compensar grandes perdas de tecido,

como ocorre em infartos do miocárdio, mesmo clinicamente pequenos. Como resultado disso,

isquemia irreversível (infarto) resulta em progressiva substituição das células miocárdicas mortas

por fibrose (cicatriz) com redução da função sistólica e diastólica do coração e iniciando a

síndrome clínica da insuficiência cardíaca com início de toda a ativação neuro-hormonal própria

da doença.

2.1. Tratamento da Cardiopatia Isquêmica

O objetivo do tratamento da angina em pacientes crônicos é aliviar os sintomas, reduzir a

progressão do processo de aterosclerose, diminuir o risco de infarto do miocárdio e morte.

Tradicionalmente é realizado com nitratos, beta-bloqueadores, estatinas, bloqueadores do cálcio e

anti-agregantes plaquetários. Anti-anginosos menos usais como trimetazidina36-38

, ranolazina39,40

,

ivabradina41,42

e nicorandil43-45

eventualmente são associados em situações especiais.

Ainda, entre as opções de tratamento da cardiopatia isquêmica estão a revascularização

percutânea por cateter e a cirurgia de revascularização do miocárdio46

. Com os avanços

tecnológicos e das técnicas cirúrgicas, a cirurgia de revascularização miocárdica é considerada a

melhor opção para o alívio dos sintomas e para a melhora da qualidade de vida dos portadores de

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DAC46

. Outra opção é a angioplastia coronária transluminal percutânea (ACTP), a qual visa

desobstruir as artérias comprometidas e permitir que o sangue volte a circular livremente47

.

3. TERAPIA GÊNICA PARA CARDIOPATIA ISQUÊMICA

3.1. Bases Moleculares da Angiogênese

Recursos de biologia molecular e terapia gênica têm sido desenvolvidos para aplicação na

terapêutica cardiovascular, em situações nas quais não há opções, ou quando estas apresentam

limitações, pelos métodos convencionais. A principal área de desenvolvimento de terapia gênica

em cardiologia é na indução de angiogênese miocárdica, com potenciais benefícios na cardiopatia

isquêmica em fase terminal, após esgotados os recursos farmacológicos, intervencionistas por

cateter e cirúrgicos, ou seja, naqueles casos refratários a todas as formas de tratamento, onde

restaria apenas o recurso do transplante cardíaco48

.

Angiogênese, a formação de novos vasos a partir do endotélio de vasos já existentes, possui

papel essencial no desenvolvimento embrionário, reparo tissular e progressão de uma variedade

de processos patológicos1, 2

. A angiogênese induzida pela administração do gene que codifica a

proteína VEGF destina-se a promover a formação de novos vasos, capilares e arteríolas.

A idéia de que fatores angiogênicos possam promover revascularização de tecidos

isquêmicos, uma estratégia chamada angiogênese terapêutica49

, foi investigada primeiramente em

indivíduos com doença arterial periférica, especificamente, isquemia crítica de membros. A

transferência de VEGF plasmidial trouxe alguns benefícios clínicos, como a abolição da dor em

repouso e cicatrização das úlceras isquêmicas, salvando membros inferiores. Esses benefícios

foram associados com evidência angiográfica de novos vasos colaterais e do aumento do fluxo

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sanguíneo para a perna50

. O conceito de angiogênese terapêutica em humanos, através de ensaios

clínicos fase I, levou adiante a idéia de testar esta estratégia em cardiopatas isquêmicos. Portanto,

a angiogênese terapêutica é uma estratégia desenvolvida para amplificar o processo natural da

angiogênese e reperfundir tecidos isquêmicos, podendo representar um novo processo de

revascularização nesses pacientes de alto risco51

.

O mecanismo da angiogênese pode ser iniciado por alguns fatores de natureza mecânica,

por processos inflamatórios ou por hipóxia (desbalanço energético). O processo de angiogênese

ocorre por estágios (Figura 1) que compreendem: dilatação do vaso, ativação de células

endoteliais, ativação de plaquetas, secreção de ativadores do plasminogênio e enzimas

proteolíticas, desgranulação de mastócitos, ativação de macrófagos, ruptura da membrana basal e

aumento de permeabilidade com saída de fibrina e outras proteínas (estágio 1). A seguir, ocorre

formação de pseudópodos, degradação da matriz extracelular, migração de células endoteliais

para o espaço extravascular com proliferação das mesmas e formação de brotos de tecido

vascular (estágio 2). Por fim, forma-se nova membrana basal e maturação da nova parede

vascular para estabelecimento do fluxo sangüíneo, formação de tubos e conexões, estabelecendo-

se os novos vasos (estágio 3)52

.

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Figura 1 - Seqüência de eventos no processo da angiogênese.

O processo pelo qual a hipóxia e a inflamação induzem à angiogênese vem sendo

intensamente estudado53, 54

. A inflamação aumenta a produção do peptídeo derivado de

macrófagos PR-39, este inibe a degradação do hypoxia-inducible factor 1-alfa (HIF 1-alfa)

levando ao aumento da expressão do VEGF e seus receptores55

. Por outro lado, o PR-39 aumenta

a produção de fatores de crescimento dos fibroblastos (FGF), os quais têm poder angiogênico.

Ainda por outro caminho, a inflamação induz a produção de citoquinas promotoras de

angiogênese56

. Fatores mecânicos podem atuar ativando o mesmo mecanismo e resultando em

angiogênese57

(Figura 2).

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Figura 2 - Mediadores bioquímicos envolvidos no processo pelo qual a hipóxia e a inflamação

levam à angiogênese. HIF: hypoxia-inducible factor 1; VEGF: vascular endothelial growth

factor; TGF: transforming growth factor; TNF: tumor necrosis factor; FGF: fibroblast growth

factor; IL: interleucina57

.

As duas famílias de fatores identificados e isolados que participam do processo acima

descrito, são do VEGF e do FGF. O membro melhor identificado da família do VEGF é VEGF-

A, que consiste de 5 isoformas, resultantes de divisões alternativas de um gen único, ou sejam:

VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 e VEGF206. A família FGF compreende pelo menos 9

polipeptídeos, incluindo FGF básico e FGF ácido. Diferentemente do VEGF, FGF atua na

mitogênese de células endoteliais, de fibroblastos e de células musculares lisas56

. Ainda, o fator

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de crescimento do hepatócito (HGF) é um potente mitógeno para uma grande variedade de

células, sendo angiogênico, antiapoptótico e possuindo propriedades antifibróticas58, 59

.

A disponibilidade maior de FGF fez com que o emprego desse gene tenha sido mais

estudado. Entre os estudos experimentais, cabe destacar o relatado por Kawasuji e colaboradores

em um modelo de infarto agudo do miocárdio, onde se demonstrou a eficácia do bFGF em

aumentar o número de vasos capilares na zona limítrofe e no epicárdio da área infartada, no

aumento do fluxo sangüíneo nessas áreas e na melhora da fração de ejeção do ventrículo

esquerdo, 7 dias após o infarto60

. Estudo de longo prazo, de tratamento com FGF-1 ácido como

adjunto de revascularização cirúrgica do miocárdio, em injeção intramiocárdica, por controles

cinecoronariográficos, demonstrou maior densidade de contraste no miocárdio das regiões

tratadas desde o primeiro exame, após 3 meses, mantendo-se de forma semelhante após 3 anos. A

fração de ejeção ventricular esquerda melhorou significativamente no grupo tratado, em relação

ao controle. O mesmo ocorreu na melhora da função segmentar da parede ventricular esquerda da

região apical, tratada com FGF61

.

3.2. Papel do Endotélio

O endotélio sintetiza importantes substâncias desempenhando papel fundamental sobre o

controle vascular, tanto em situações fisiológicas quanto em processos patológicos como as

síndromes coronarianas. Sabe-se que a monocamada de células endoteliais atua como uma

superfície não aderente para plaquetas e leucócitos produzindo uma variedade de importantes

fatores regulatórios como o NO62

. Dessa forma, influencia não somente o tono vascular, mas

também o seu remodelamento, por meio da produção de substâncias promotoras e inibidoras do

seu crescimento63

.

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A disfunção nas células endoteliais leva a uma perda das propriedades antitrombóticas da

parede vascular e corresponde ao início do processo aterosclerótico62

. Pacientes com doença

coronariana têm importante disfunção endotelial e diminuição da disponibilidade de NO,

particularmente quando a DAC é severa e difusa64,65

.

A reconstrução endotelial ocorre pela migração e proliferação de células endoteliais

maduras circulantes. Entretanto, essas células têm baixo potencial proliferativo e sua capacidade

de reparo é limitada. Evidências indicam que a circulação periférica contém subtipos celulares da

medula óssea com propriedades similares aos angioblastos embrionários. As CPE possuem

capacidade proliferativa e de diferenciação em células endoteliais maduras, podendo ser

induzidas por diferentes citocinas ou fatores de crescimento, como por exemplo, VEGF,

adquirindo diferentes fenótipos62

.

As CPE caracterizam-se pela expressão de diversos marcadores, como CD133, CD34 e

KDR, entre outros. Durante a diferenciação, diminuem os níveis de CD133 e aumenta a

expressão de CD31, CD34, KDR, fator de Von Willebrand, entre outros. As CPE possuem a

habilidade de homing em sítios de lesão vascular e contribuem para a neoangiogênese66

. CPE são

consideradas poderosos marcadores biológicos para a função vascular. Os mecanismos que

estimulam a proliferação e migração dessas células ainda são parcialmente conhecidos62

.

A aplicação de genes recombinantes ou fatores de crescimento sob forma de proteína

recombinante é eficaz tanto pela injeção intramiocárdica como pela via intracoronariana. A

primeira, ainda que implique em toracotomia, tem como vantagem a entrega localizada e com

menor extravasamento sistêmico. O principal alvo do VEGF é a célula endotelial. O receptor

comum para o VEGF-1 e VEGF-2 é o KDR67

, que faz a transdução do sinal angiogênico. O papel

do receptor do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGFR-1) (Flt-1) na angiogênese é

controverso. Hipóxia aumenta a expressão de KDR e a produção de VEGF pelas células

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endoteliais; este mecanismo com o loop autócrino, juntamente com a proliferação de células

endoteliais após estímulo, pode amplificar e prolongar a resposta ao VEGF administrado. Um

importante papel adicional do VEGF é que ele aumenta o número de células endoteliais

progenitoras circulantes, um efeito que foi documentado em camundongos e seres humanos66,68

.

Estudos experimentais recentes em mamíferos de médio porte como modelo de isquemia

miocárdica investigaram o efeito do VEGF165 intramiocárdico na proliferação de vasos com

musculatura lisa - arteriogênese, visto que a perfusão tecidual depende principalmente da árvore

arteriolar. Além disso, foi avaliado o efeito do tratamento no crescimento capilar, perfusão

miocárdica e função miocárdica. Cinco semanas após o tratamento, o grupo tratado com VEGF165

mostrou alta densidade de pequenos vasos com musculatura lisa, alta densidade de capilares e

melhora na função miocárdica, com diferença significativa em relação ao grupo controle. Esse

estudo mostra um efeito arteriogênico do VEGF165 em um modelo de mamífero com cardiopatia

isquêmica, encorajando seu uso como promotor de crescimento arteriolar em pacientes com

doença coronariana grave69

. Não está claro o método mais adequado para avaliar os efeitos na

perfusão tecidual. A angiografia simples não é capaz de detectar mudanças em nível

microvascular, mas a ecocardiografia miocárdica contrastada, em conjunto com microesferas

radiomarcadas, foi utilizada com sucesso para avaliar os benefícios da terapia com VEGF12170

.

Para a proteção de miocárdio isquêmico, é conhecida a função angiogênica através de

fatores pró-angiogênicos como VEGF, FGF e HGF, os quais podem ser usados para o tratamento

da isquemia71

. Atualmente salienta-se também o uso de enzimas antioxidantes que inibem a

ativação de células endoteliais tanto para tratamento de infarto agudo do miocárdio como para

imunossupressão no transplante cardíaco, além de transferência de genes anticoagulantes visando

à estabilização da placa de ateroma. Esses tratamentos são apresentados como forma de

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prevenção de eventos agudos, visto que seu tempo de ação ultrapassa o tempo previsto para a

intervenção durante o evento clínico.

Em um estudo piloto de terapia gênica em pacientes com DAC, Yang et al.72

relataram a

crescente evidência dos efeitos benéficos do HGF no infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca

e doença arterial obstrutiva periférica. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da

administração intracoronariana de um vetor de adenovirus que codifica o gene HGF humano (Ad-

HGF) sobre os níveis séricos de citocinas e mobilização de células CD34 (+) e CD117 (+) em

pacientes com doença cardíaca. Diante dos achados, concluiu-se que a terapia gênica com HGF

pode desempenhar um papel importante na regulação das citocinas inflamatórias e indução da

mobilização de CPE em pacientes com DAC.

Por outro lado, na terapia gênica de resgate do miocárdio, a manipulação de proteínas

reguladoras do cálcio e de receptores beta-adrenérgicos sinalizam melhora na contratilidade

miocárdica73

.

Atualmente, estuda-se a associação de terapia gênica e terapia celular frente a diferentes

patologias cardíacas. Um exemplo recente é o estudo de Matsumoto et al.74

, que avaliaram a

expressão de VEGF após transplante de células tronco mesenquimais (MSC) e verificaram o

possível aumento de efeitos cardioprotetores destas células seguido da angiogênese, na

recuperação do miocárdio isquêmico. Diante disso, demonstra-se a possibilidade da análise cada

vez mais apurada da expressão de biomarcadores diante de tais terapias75

.

4. TERAPIA GÊNICA COM VEGF165

Com o intuito de induzir a angiogênese miocárdica, a terapia gênica utilizando o VEGF

poderia representar uma nova modalidade de tratamento para a DAC. Isso se deve à possibilidade

de desenvolver novos vasos arteriais ou promover a reformação dos vasos existentes76

.

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O VEGF165 contém 165 aminoácidos e funciona interagindo com receptores específicos

das células endoteliais, iniciando a cascata de eventos que culmina com a migração de células

endoteliais, proliferação e agregação em microtúbulos que acabarão por formar uma rede de

sistemas arteriais e venosos. Transferência de genes representa uma maneira de transportá-los

para o coração, onde o DNA codificador de VEGF é liberado na célula miocárdica, a qual

começa secretar VEGF. Nos ensaios realizados até o momento, não existem dados concretos

sobre a dose adequada e segura de fator angiogênico a ser administrada. Na maior parte dos

estudos com VEGF165, a dose variou entre 125 - 500 μg.

A disponibilidade de vetores com tropismo pelo miocárdio, capazes de uma expressão

protéica longa e estável, e o isolamento de células progenitoras com potencial angiogênico e

regenerativo oferece possibilidades de desenvolvimento de terapia baseada em proteção e

regeneração do miocárdio isquêmico e insuficiente. A terapia gênica em doenças

cardiovasculares não visa a substituir um gene anormal, mas supra-regular a expressão de uma

proteína útil aumentando o conteúdo de DNA. Sua efetividade depende do gene, do vetor e da

forma de administração utilizados77

.

Vetores genéticos são todas as moléculas de DNA com potencial de replicação

autonômica dentro da célula hospedeira, na qual seqüências de DNA podem ser inseridas e

ampliadas. A origem do vetor permite classificar em plasmidiais, bacteriófagos ou virais78

. Eles

são utilizados para transportar genes para células receptoras. Possuem não apenas marcadores

para facilitar seu reconhecimento, como também seqüências replicadoras. Em modelos animais, o

uso de plasmídeos demonstrou uma expressão duradoura após vários meses, apesar de baixa taxa

de transfecção efetiva79

. A aplicação de adenovírus apresenta taxas de transfecção, durando de

dias a semanas, com contraditória curta expressão gênica. Ademais, anticorpos circulantes,

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21

freqüentemente encontrados na população adulta, podem reduzir a taxa de transfecção efetiva de

0,04% até 5,0% de células positivas em análise histológica80

.

Além disso, o uso de vetores virais requerem cuidados de biossegurança, medidas

desnecessárias com vetores não-virais. Estudos apontam eventos temporários relacionados com

utilização de adenovírus, tais como febre, ou elevação sérica de proteína C reativa, das enzimas

hepáticas e da titulação de anticorpos81

. Hao et al.82

, publicaram em 2007 um estudo

experimental sobre angiogênese miocárdica por VEGF165 comparando vetores adenovirais com

plasmidiais. Estes autores demonstraram benefícios equivalentes em termos de função ventricular

(p<0,05) para plasmídeos e adenovírus após quatro semanas, entretanto, neste trabalho a técnica

TUNEL, que detecta quebras do DNA que ocorrem durante o processo de apoptose, demonstrou

um aumento da freqüência de apoptose de cardiomiócitos no grupo adenovírus (p<0,02).

A terapia gênica sofreu um revés importante quando da ocorrência de um óbito em sujeito

de pesquisa, provavelmente devido à alta carga viral administrada, tendo havido cancelamento de

vários projetos clínicos e retorno à pesquisa laboratorial. Desde 2000, poucos projetos de

aplicação clínica foram desenvolvidos. Entretanto, nenhuma complicação de gravidade notável

foi observada nos projetos que não utilizaram vetores virais. As formas de administração por

lipossomas ou por DNA plasmidial desnudo não estão relacionadas à morbidade nos relatos

disponíveis na literatura82

.

A formação de novos vasos responde ao estímulo de fatores angiogênicos, os quais

regulam a migração endotelial, proliferação, sobrevida e atividade proteolítica. Entre os fatores

descritos na literatura, o VEGF e as angiopoietinas (Ang) têm emergido como reguladores

críticos do processo pró-angiogênico3,7,83

. Essas moléculas promovem a formação de novos vasos

e sua morfogênese, por meio de um complexo processo de eventos angiorregulatórios8,81

.

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22

VEGF, membro da família do VEGF A, é um fator de crescimento específico do

endotélio9,10

. Ele age, principalmente, ativando dois receptores do tipo tirosina quinase Flt-1

(fms-like tyrosine kinase-1, VEGF receptor-1)11

e KDR (kinase-insert domain-containing

receptor, VEGF receptor-2)12

, mas também pode ativar outros receptores como neuropilin-1 e 281

.

VEGF165 tem sido intensamente pesquisado. Inicialmente administrado por injeção intramuscular

direta do DNA plasmidial, em doença arterial periférica de membros inferiores, demonstrou

produzir melhora da circulação colateral e da perfusão das extremidades84

. Mais recentemente foi

conduzido um estudo clínico para avaliar a segurança e a bioatividade da transfecção

intramiocárdica de DNA plasmidial em pacientes considerados “inoperáveis” por cardiopatia

isquêmica avançada. O gene foi injetado diretamente no miocárdio, por minitoracotomia

esquerda, em 20 pacientes, como única terapêutica. Não ocorreram complicações. Todos os 16

pacientes acompanhados até 90 dias apresentaram redução significativa da angina e 100% dos

que completaram 6 meses estavam livres de angina. A cintilografia miocárdica mostrou redução

dos defeitos isquêmicos em 13 de 17 pacientes aos 60 dias16,17,85

.

Em 1998, Losordo et al.18

conduziram o primeiro ensaio clínico testando terapia gênica

com VEGF165 em pacientes com angina refratária. Este estudo demonstrou as primeiras

evidências de segurança e dados observacionais sobre sintomas e perfusão miocárdica.

Em estudo subseqüente, Laitinen et al.86

, demonstraram um método menos invasivo de

administração VEGF165 plasmidial, via infusão intra-coronariana, sendo este método, seguro e

executável.

O estudo KAT81

(Kuopio Angiogenesis Trial), teve como objetivo avaliar a segurança da

terapia gênica com VEGF165 intracoronária, quando administrada ao tempo da angioplastia

coronariana com stent, avaliando o quanto a terapêutica com VEGF165 pode prevenir a reestenose

e melhorar a perfusão miocárdica. Foram randomizados 103 pacientes sintomáticos que iriam

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23

realizar angioplastia coronariana para receber infusões intracoronárias de VEGF165 adenoviral,

VEGF165 plasmidial ou placebo, no momento da angioplastia. Concluíram que a terapia com

VEGF165 durante angioplastia parece segura, mas os investigadores não encontraram diferenças

na taxa de reestenose 6 meses após o tratamento. Em relação à perfusão miocárdica, entretanto,

houve aumento em 6 meses de acompanhamento nos pacientes submetidos a administração de

VEGF165 adenoviral81

.

O Euroinject One Trial7 foi um estudo randomizado, duplo-cego, placebo-controlado em

pacientes com DAC sintomática, que não eram candidatos a revascularização cirúrgica. Oitenta

pacientes foram eleitos para receber injeção de VEGF165 plasmidial ou plasmídeo placebo na área

miocárdica isquêmica identificada por mapeamento eletromecânico (MEM) e SPECT. O

plasmídeo foi administrado por injeção via endocárdica utilizando-se o sistema NOGA. Após 3

meses de acompanhamento, a perfusão miocárdica avaliada em estresse e a classe de angina

(CCS) não foram diferentes entre os dois grupos, mas escores de movimentação regional da

parede miocárdica e a função ventricular esquerda melhoraram no grupo tratado com VEGF1657.

Ao final do estudo, uma análise utilizando um método alternativo de interpretação do escore de

movimentação regional da parede miocárdica e da perfusão miocárdica revelou alguma evidência

de melhora nos pacientes tratados com VEGF16587

.

Ripa et al.83

realizaram um estudo piloto com o uso combinado de terapia gênica com

VEGF165 e mobilização de células tronco em pacientes com DAC, sendo estes, sintomáticos e

não candidatos à revascularização. Dezesseis pacientes receberam injeções intramiocárdica de

VEGF165 plasmidial seguido da administração, uma semana após, do fator de estimulação de

colônias de granulócitos (G-CSF) visando à mobilização de células progenitoras da medula óssea

no grupo tratado. O grupo controle foram os 16 pacientes tratados com VEGF165 e os 16 tratados

com plasmídeo placebo do estudo Euroinject One Trial. O número de células progenitoras

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(identificadas via CD34) aumentou consideravelmente após o tratamento com G-CSF, mas não

houve melhora nos desfechos primários de mudança na perfusão miocárdica de estresse83

.

Recentemente, relato de Reilly apresentou resultados de terapia gênica com VEGF em

pacientes sem outras opções terapêuticas. Foram 30 pacientes com angina classe III ou IV que

receberam injeção intramiocárdica via toracotomia de VEGF2. Esses pacientes foram seguidos

para eventos clínicos depois de um ano por registros hospitalares, visitas ou contato telefônico.

Um paciente teve óbito perioperatório. A média de seguimento foi de 751±102,5 dias. Houve 4

óbitos (13,8%), 5 infartos do miocárdio (17,2%) e 7 procedimentos de revascularização (24,1%).

Também houve 15 hospitalizações em 12 pacientes. No fim do seguimento nenhum paciente se

encontrava em classe IV de angina, 3 pacientes (11,5%) estavam em classe III e 23 pacientes

(88,5%) estavam em classe I ou II. Esse estudo permitiu associar a terapia gênica com VEGF2

com a melhora dos sintomas de angina na maioria dos pacientes após o primeiro ano de

tratamento. Eventos clínicos maiores como óbito, infarto do miocárdio e novos procedimentos de

revascularização foram incomuns durante o primeiro ano, mas tornaram-se mais frequentes após

esse período. A maioria desses eventos em longo prazo seriam resultado da progressão da doença

de base em áreas cardíacas afastadas dos locais de infusão de terapia gênica88

.

Em abril de 2008, Marc Ruel publicou um estudo realizado na Universidade de Otawa, no

Canadá, onde investigou a associação entre VEGF165 e L-arginina. Participaram do estudo 19

pacientes cardiopatas isquêmicos graves que foram randomizados da seguinte forma: grupo 1:

Placebo para injeção intramiocárdica de VEGF165 + placebo para suplementação pós-operatória

de L-arginina; grupo 2: Injeção intramiocárdica de VEGF165 + placebo para suplementação pós-

operatória de L-arginina; grupo 3: Placebo para injeção intramiocárdica de VEGF165 +

suplementação pós-operatória de L-arginina e grupo 4: Injeção intramiocárdica de VEGF165 +

suplementação pós-operatória de L-arginina. A suplementação com L-arginina foi realizada via

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25

oral por três meses. Foram avaliadas mudanças na perfusão e contratilidade miocárdica anterior

através de tomografia por emissão de pósitrons (PET scan) e ecocardiografia. Pacientes que

receberam a combinação de VEGF e L-arginina demonstraram melhora na perfusão da parede

anterior observada no PET scan (p=0,02) e melhora da contratilidade da parede anterior (p=0,02)

em três meses quando comparados ao começo do estudo. Os resultados sugerem segurança e

eficácia na intervenção. De fato, foi demonstrado que a L-arginina é clinicamente segura e tem

efeitos benéficos sobre o NO19

.

Em estudo multicêntrico recente (Northern Trial), Stewart e cols (2009)20

, realizaram um

estudo duplo-cego, controlado por placebo. Este envolveu sete centros do Canadá e um total de

93 pacientes com CCS 3 ou 4, os quais foram randomizados para receber 2.000 g de VEGF165

plasmidial ou placebo por via endocárdica sob orientação do cateter eletroanatômico NOGA. Não

houve diferença entre o grupo tratado com VEGF e placebo em relação à perfusão miocárdica no

período basal, 3 e 6 meses, avaliados por SPECT. Observou-se redução significativa da área

isquêmica observada em ambos os grupos. Melhoras no tempo do teste ergométrico e sintomas

anginosos foram observados em ambos os grupos em 3 e 6 meses, não havendo diferença entre os

grupos20

.

A eficácia da angiogênese terapêutica por injeção intramiocárdica de pCK-VEGF165 em

modelo suíno de infarto agudo do miocárdio foi relatada por Choi e colaboradores em 200689

.

Aos 30 dias após o infarto e injeção de pCK-VEGF165 na sua zona de transição, não houve

diferença nos parâmetros de perfusão segmentar, espessamento parietal e contratilidade entre os

grupos controle e tratado. Aos 60 dias, entretanto, o grupo tratado mostrou melhora significativa,

tanto em relação ao 30º dia (p<0,05) nos parâmetros citados, como em relação ao grupo controle

para perfusão segmentar (p=0,018), contratilidade (p=0,004) e espessura (p=0,068). A análise

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26

histológica mostrou aumento significativo na microvasculatura do grupo tratado em relação ao

controle (p<0,001)89

.

Evidencia-se desse modo a aplicabilidade clínica do VEGF165 em humanos, visto que

estudos experimentais mostram resultados favoráveis e estudos iniciais em humanos não relatam

efeitos adversos relacionados. Ensaios atuais relatam que o uso de altas doses de rhVEGF,

quando comparado com baixas doses e com placebo, melhora a perfusão miocárdica em

pacientes com angina estável severa e fornece evidências de um efeito positivo dose-

dependente90, 91

. Também como alternativa a pacientes sem outras possibilidades terapêuticas foi

desenvolvido o estudo The VIVA Trial, designado a avaliar a segurança e eficácia da infusão

intracoronariana e intravenosa de rhVEGF (recombinante humano de fator de crescimento

endotelial vascular). Assim, 178 pacientes foram randomizados para receberem placebo, baixa

dose de rhVEGF ou alta dose de rhVEGF por infusão intracoronariana no dia 0, seguido por

infusão intravenosa nos dias 3, 6 e 9. Teste ergométrico em esteira e avaliações da classe de

angina e da qualidade de vida foram realizados no início dos procedimentos, dia 60 e dia 120.

Imagens de perfusão miocárdica foram obtidas no início dos procedimentos e no dia 60. Esse

estudo mostrou que rhVEGF é seguro e bem tolerado. Nas mensurações feitas no dia 60, rhVEGF

não ofereceu melhora além do placebo em nenhum dos testes. Porém no dia 120, altas doses de

rhVEGF resultaram em significativa melhora na angina dos pacientes e tendência favorável no

tempo de teste de esteira ergométrica e na freqüência de episódios de angina90

.

Quanto à via de injeção do VEGF, não se pode ainda estabelecer qual o método mais

adequado. Foi demonstrada segurança e melhora na perfusão miocárdica em pacientes tratados

com VEGF – adenovírus injetado por cateter durante ACTP após 6 meses de seguimento81

. Por

outro lado, a injeção intramiocárdica apresentou melhora na contratilidade da parede ventricular

tanto na avaliação pelo método NOGA, quanto pela ventriculografia – podendo indicar um

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provável efeito anti-isquemia, mesmo sem apresentar evidência de melhora na perfusão

miocárdica induzida por estresse7.

Na pesquisa experimental há sugestões de outros papéis para o VEGF. Foi descoberto

efeito mitogênico em cardiomiócitos adultos, induzido por terapia gênica com VEGF. Estudo

posterior pesquisou hiperplasia de cardiomiócitos induzida pelo VEGF através de citocinese de

cardiomiócitos. Cinco semanas após indução de isquemia e injeção intramiocárdica de VEGF, o

grupo tratado apresentou 22% mais cardiomiócitos por unidade de volume além de um número

significativamente maior de cardiomiócitos oligonucleados (1 ou 2 núcleos) quando comparado

com o grupo controle. Desse modo, a transferência gênica de VEGF induziu citocinese de

cardiomiócitos em porcos com miocardiopatia isquêmica crônica, como revelado pela hiperplasia

de cardiomiócitos. Esse estudo confirma o já reportado efeito mitogênico de VEGF em

cardiomiócitos adultos e dá suporte à hipótese que o VEGF pode ter um papel terapêutico em

doenças caracterizadas por perda de células miocárdicas92

.

Quanto à angiogênese por terapia celular, estudo experimental de Huang et al.93

investigou a ação das célula-tronco mesenquimais (MSCs) do miométrio e a contribuição da

progesterona sobre a indução à angiogênese e a melhora da perfusão em miocárdio isquêmico.

Constatou-se a significativa capacidade de indução de angiogênese, principalmente nos vasos

arteriolares e melhora da função cardíaca após tratamento.

É de suma importância relatar as limitações dos modelos pré-clínicos e as diferenças entre

os modelos animais e os pacientes incluídos em ensaios clínicos de terapêutica cardiovascular. Os

animais utilizados em estudos pré-clínicos são geralmente jovens e saudáveis, enquanto os

pacientes são tipicamente idosos com múltiplas comorbidades. Estudos clínicos e

epidemiológicos indicam que a idade é um forte preditor de doença avançada94, 95

da mesma

forma, animais com idade têm menos probabilidade de se recuperar de doenças vasculares e

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28

isquêmicas96

. Esse comprometimento parece evoluir, pelo menos em parte, quanto as deficiências

no recrutamento de células angiogênicas e quanto à expressão do fator de crescimento97, 98

.

A eficácia da terapia gênica pode ser prejudicada pela espécie, idade e em relação as

diferentes condições de saúde entre os modelos animais e populações clínicas, mas também por

diferenças biológicas na expressão genética. Além disso, a incapacidade para quantificar

precisamente a expressão do gene prejudica o projeto experimental48

.

Os estudos realizados até o momento não apresentavam o número de pacientes necessário

para quantificar o potencial benefício da terapia gênica, com parâmetros inequívocos como a

mortalidade ou o salvamento do membro, no caso de isquemia periférica. Em vez disso, os

pesquisadores têm procurado identificar outros parâmetros e desfechos que podem fornecer

evidências objetivas da bioatividade e melhora clínica48

.

4.1. Vetor Plasmidial

Transferência gênica para o miocárdio tem sido utilizada como estratégia alternativa para

se obter uma expressão local sustentada das proteínas angiogênicas99

.

Vetores comuns para transporte incluem plasmídeos carreadores de cDNA “nu” e vetores

virais como adenovírus, lentivírus e retrovírus. Vantagens e desvantagens em relação ao vetor

empregado incluem o tamanho do gene inserido, o sítio de incorporação no núcleo, a duração da

expressão, a eficiência da transferência e o grau de resposta imune do organismo100

. O vetor

plasmidial é expresso por apenas alguns dias após administração e o vetor viral apresenta

expressão do gene por algumas semanas101

. Assim, os estudos clínicos que tentam tratar a fase

final da doença isquêmica através da terapia gênica podem ser limitados por duração inadequada

da exposição ao agente angiogênico48

.

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29

O vetor ideal seria aquele que combinaria baixa imunogenicidade e um perfil de

segurança satisfatório, com alta eficiência de transfecção e expressão do transgene para períodos

de tempo específicos48

.

Vetores plasmidiais não têm limite de tamanho de gene a ser inserido e induzem mínima

resposta imune, o que resulta em expressão transgênica sustentada. A desvantagem é a baixa taxa

de transferência do gene codificador do fator angiogênico. Em contraste, vetores virais têm alta

eficiência na transferência dos genes de fator angiogênico para as células alvo, mas podem

induzir significativa resposta imune do organismo hospedeiro, o qual limita a expressão

transgênica sustentada102

.

A transferência de VEGF165 plasmidial tem se mostrado segura, segundo a literatura. Em

séries de terapia gênica, como já citado anteriormente, a única morte acontecida foi reportada

num paciente de 18 anos em setembro de 1999. Neste caso, o óbito foi devido a um processo

inflamatório contra o vetor usado (vetor viral baseado em adenovírus, em doses altas). O paciente

era portador de um distúrbio metabólico, de origem genética, denominada deficiência de ornitina

transcarbamilase (OTC), que tem como principal conseqüência a não eliminação de amônia e foi

convidado pelo seu pediatra para participar de um projeto de pesquisa fase I, envolvendo terapia

gênica para este distúrbio, no Institute for Human Gene Therapy (IHGT) da Universidade da

Pennsylvania/EUA, em conjunto com a empresa Genovo. Foi administrada uma infusão, na

artéria hepática, do gene de correção da OTC, utilizando vetor adenoviral. Ele teve uma séria

reação imunológica atribuída ao vetor e faleceu quatro dias após, quando foi constatada sua morte

encefálica, sendo o primeiro paciente a morrer em um ensaio clínico de terapia gênica103

.

Já outra paciente tratada com uma dose similar (a dose mais alta do tratamento) não

apresentou efeitos colaterais. Uma das explicações desta resposta imunológica foi que,

provavelmente, o paciente tinha sido infectado anteriormente com um adenovírus do mesmo

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sorotipo ou algum outro que apresentou reação cruzada. Casos de leucemia desenvolvida em 2 de

10 pacientes com a doença SCID-XI na França, também aconteceram em procedimentos de

terapia gênica com vetores virais.

O plasmídeo pode ser aplicado na sua forma mais pura, diluído em solução fisiológica e,

por este motivo, a metodologia é conhecida como DNA desnudo, já que ele não está coberto por

nenhum material, sejam estes materiais compostos catiônicos ou as estruturas virais dos vetores

virais104

. Por outro lado, este plasmídeo atua na forma epissomal, ou seja, ele não se integra no

genoma. Este é um ponto importante, pois os problemas relacionados com a ativação de proto-

oncogenes durante a integração são mínimos. Ao mesmo tempo, a sua não-integração permite

que a expressão do transgene (proteína VEGF165) seja transitória devido a sua degradação e/ou

diluição ao longo do tempo. Vários estudos utilizando plasmídeos epissomais mostraram que a

expressão do transgene é mantida entre 1 e 2 meses, o que representa uma vantagem deste

sistema no tratamento com VEGF78

.

4.2. Vias de Administração

A efetividade da terapia gênica depende dos genes, dos vetores e da forma de

administração. Na terapêutica cardiovascular, as formas possíveis são: injeção por cateter

intraventricular, injeção pericárdica, via epicárdica, injeção intramiocárdica, intra-arterial

coronariana associada ou não a angioplastia e adventicial em vasos ou enxertos de veia safena.

Na indução de angiogênese miocárdica, as vias mais utilizadas têm sido a epicárdica por

lipossomas e a intramiocárdica78

. Há precauções em relação à injeção intra-arterial, pela

possibilidade de difusão dos vetores na corrente sangüínea, embora haja estudos, tanto isolados

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como multicêntricos, com administração intracoronária e intravenosa de FGF e VEGF, utilizando

proteína recombinante e vetores adenovirais.

Estudos anteriores sobre terapia gênica sugerem que a administração intracoronária e

periférica entregam de forma inadequada quantidades do vetor para o sítio de destino105, 106

. Já a

injeção intramuscular oferece a possibilidade de uma oferta mais eficiente em áreas focais de

músculo isquêmico48

.

4.3. População, Segurança, Benefícios e Potenciais Riscos do Uso da Terapia Gênica

Quase todos os ensaios clínicos de terapia gênica têm como população de estudo

pacientes em fase terminal da doença isquêmica, cujas opções terapêuticas convencionais já se

esgotaram, uma vez que o possível maior risco em relação ao benefício associado aos novos

tratamentos são mais aceitáveis. Entretanto, os pacientes com doença cardiovascular avançada,

muitas vezes têm sofrido décadas de deterioração sistêmica, onde a terapia pode não conduzir a

uma melhoria mensurável, mesmo quando o tratamento é benéfico48, 107

.

Mais de 1.000 pacientes foram incluídos em ensaios clínicos controlados de terapia

gênica, abrangendo mais de uma década e até agora, com exceção dos casos relatados

anteriormente e que tem explicações específicas, nenhum sinal de segurança adversa foi

detectado. Relatórios de retinopatia, câncer, ou outras doenças que podem ser impulsionadas pelo

crescimento vascular foram percebidos como igualmente distribuídos em grupos tratado e

placebo. Conclusões mais definitivas sobre riscos e complicações exigirão maiores tempo de

acompanhamento e número de pacientes submetidos à terapia48

.

Quinze anos se passaram desde os primeiros relatos de terapia gênica em humanos. O

amplo número de estudos pré-clínicos demonstram a bioatividade dos genes transplantados e

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vários ensaios clínicos indicam que a terapia é segura, viável, e potencialmente eficaz, embora

não tenham produzido evidências conclusivas de benefício. Assim, para continuar a desenvolver

esta abordagem terapêutica promissora, devemos avaliar criticamente os resultados experimentais

e os protocolos para identificar fatores que podem ter prejudicado a eficácia da terapia ou dados

confundidores de interpretação48

.

A terapia gênica pode resultar na desregulação da expressão da proteína inoculada e a

expressão contínua do VEGF tem sido associada com a formação de tumores vasculares

intramurais e na diminuição da sobrevida em modelos animais108

. Com o avanço da engenharia

genética e o maior conhecimento das técnicas de purificação, espera-se que tais complicações

sejam controladas108

. Existem questionamentos em relação à segurança da transferência de

fatores angiogênicos, e também em relação ao tempo de expressão109

, onde se sabe que os

plasmídeos carreadores de proteínas de fatores angiogênicos, por terem expressão mais curta e

não se incorporarem ao DNA da célula à qual vão se ligar, têm menor risco deste efeito adverso.

A gênese, crescimento e manutenção da neovascularização ocorrem através de interações

complexas e entre mecanismos envolvidos na vasculogênese, angiogênese e arteriogenêse110,111

.

As direções futuras da terapia gênica apontam prováveis combinações de fatores angiogênicos,

ou fatores individuais (HIF-1α) que ativam diversas vias de neovascularização. As combinações

de terapia celular e de fatores angiogênicos, bem como o uso de biomateriais para melhorar o

microambiente são outras estratégias promissoras para o reparo isquêmico tecidual48

.

5. ENSAIOS CLÍNICOS CONTROLADOS DE TERAPIA GÊNICA

Na tabela abaixo, procuramos sintetizar a experiência existente, nesta relação de ensaios

clínicos controlados envolvendo terapia gênica visando à terapêutica cardiovascular.

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33

Autor Tratamento Administração Grupo ativo

(n)/

Placebo (n)

Características

pacientes

Acompa-

nhamento

Desfechos Resultados

Phase I/II

VEGF

Losordo

et al10

Ensaio Clínico

Controlado

VEGF2

plasmidial

Intramiocárdica

percutânea via

mapeamento

eletromecânico

12/7 Doença arterial

coronariana, não

passíveis de

revascularização,

angina refratária, CCS

(3/4)

12 semanas Mudança da CCS

e tolerância ao

exercício

Melhora da

CCS - grupo

VEGF2 versus

placebo (-1.3

versus -0.1,

P=0.04);

tolerância ao

exercício (91.8

versus 3.9

segundos)

Mäkinen

et al84

Ensaio Clínico

Controlado

VEGF165

adenoviral e

plasmidial

Percutânea intra-

arterial seguida de

angioplastia

VEGF-ad (18)

VEGF- P (17)

Placebo (19)

Doença arterial

periférica adequada

para angioplastia

3 meses Angiografia

digital

Angiografia

digital revelou

aumento da

vascularização

distalmente do

local de

tranferência de

genes no

grupo VEGF-

P e na região

isquêmica no

grupo VEGF-

ad (VEGF-ad

P=0.03;

VEGF-P

P=0.02)

RAVE

Rajagopalan

et al112

Ensaio Clínico

Controlado

VEGF121

adenoviral

Intramuscular Alta dose (40)

Baixa Dose (32)

Placebo (33)

Doença arterial

periférica, limitação ao

exercício, claudicação

12 semanas Mudança do pico

e do tempo de

andar em relação

à linha de base

A mudança do

pico e do

tempo de

andar não

diferiram entre

os grupos alta

dose (1.5+/-

3.1 minutos),

baixa dose

(1.6+/-1.9

minutos) e

placebo

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34

(1.8+/-3.2

minutos)

KAT

Hedman

et al81

Ensaio Clínico

Controlado

VEGF165

adenoviral e

plasmidial

Intracoronária após

intervenção

coronária

percutânea

VEGF-ad (37)

VEGF-P (28)

Placebo (38)

Doença arterial

coronariana, CCS (2/3),

intervenção coronária

percutânea

6 meses % de estenose do

diâmetro luminal

mínimo pela

angiografia

coronária

Taxa de

reestenose

clínica: 6%;

diâmetro

mínimo e o

percentual de

estenose não

diferiram entre

os grupos;

perfusão

miocárdica

mostrou uma

melhora

significativa

no grupo

VEGF-ad

Euroinject

One

Kastrup

et al7

Ensaio Clínico

Controlado

VEGF165

plasmidial

Intramiocárdica

percutânea via

mapeamento

eletromecânico

40 / 40 Doença arterial

coronariana, não

passíveis de

revascularização,

angina refratária, CCS

(3/4)

3 meses Perfusão

miocárdica,

mapeamento do

movimento da

parede por

NOGA,

ventriculografia

esquerda e CCS

Perfusão

miocárdica

não diferiu

entre o grupo

VEGF 165 e

placebo (38

+/- 3%; 44 +/-

2%); movi-

mento da

parede por

NOGA

(P=0.04) e

ventriculogra-

fia esquerda

(P=0.03)

melhoraram

em relação ao

placebo;

melhora da

CCS, mas sem

diferença entre

os grupos

REVASC VEGF121 Intramiocárdica 32 / 35 Doença arterial 26 semanas Tempo no teste Tempo no

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35

Stewart

et al13

Ensaio Clínico

Controlado

adenoviral via mini-

toracotomia

coronariana, não

passíveis de

revascularização,

angina refratária, CCS

(2/4)

ergométrico e

depressão do

segmento S-T em

1mm de diâmetro

teste

ergométrico e

depressão do

segmento S-T

em 1mm de

diâmetrofoi

significativa-

mente maior

no grupo

VEGF 121-ad

(P=0.026);

CCS melhorou

no grupo

VEGF 121-ad

(P<ou =0.001)

Ripa et al83

Ensaio Clínico

Controlado

VEGF165

plasmidial e

G-CSF

Intramiocárdica

percutânea de

VEGF165 usando

mapeamento

eletromecânico e

injeção subcutânea

de

G-CSF

VEGF165+G-

CSF (16)

VEGF165 (16)

Placebo (16)

Doença arterial

coronariana, não

passíveis de

revascularização,

angina refratária, CCS

(3/4)

3 meses Mudança dos

defeitos de

perfusão, avaliado

por SPECT

Não houve

melhora da

perfusão

miocárdica em

ambos os

grupos

tratados e

sintomas

clínicos não

foram

alterados

Kusumanto

et al113

Ensaio Clínico

Controlado

VEGF165

plasmidial

Intramuscular 27 / 27 Doença arterial

periférica, diabetes

mellitus, isquemia

crítica do membro, não

passíveis de

revascularização

100 dias Amputações 6 amputações

grupo placebo

versus 3

amputações

grupo VEGF

165 plasmidial,

melhora

hemodinâmi-

ca, das úlceras

e diminuição

da dor foram

maiores no

grupo VEGF

165 plasmidial

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36

FGF

AGENT

Grines

et al114

Ensaio Clínico

Controlado

Ad5-FGF4 Intracoronária 60 / 19 Doença arterial

coronariana, CCS (2/3)

12 semanas Segurança e

tempo do teste

ergométrico

Administração

única de Ad5-

FGF4

mostrou-se

segura e bem

tolerada;

grupo Ad5-

FGF4

apresentou

melhora no

tempo do teste

ergométrico

em análise de

subgrupo (1.6

versus 0.6

minutos,

P=0.01, n=50)

AGENT-2

Grines

et al115

Ensaio Clínico

Controlado

Ad5-FGF4 Intracoronária 35 / 17 Doença arterial

coronariana, não

passíveis de

revascularização,

angina refratária, CCS

(2/4)

12 meses Mudança dos

defeitos de

perfusão, avaliado

por SPECT

adenosina em 8

semanas

Ad5-FGF4

resultou em

uma

significativa

redução da

isquemia

(4,2%

absoluta, 21%

relativa;

P < 0,001),

enquanto

placebo não

apresentou

melhora (P =

0,32).

Talisman

201

Nikol et al116

Ensaio Clínico

Controlado

FGF-1

plasmidial

Intramuscular 51 / 56 Doença arterial

periférica, isquemia

crítica do membro, não

passíveis de

revascularização

1 ano Cicatrização da

úlcera isquêmica

Melhorias na

cicatrização da

úlcera foram

semelhantes

para uso de

FGF-1

plasmidial

(19,6%) e

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37

placebo

(14,3%, P =

0,514); o

grupo FGF-1

obteve

redução do

risco de

amputação

(HR= 0,498; P

= 0,015) e

amputações

maiores (HR=

0,371; P =

0,015)

HIF

Rajagopalan

et al54

Ensaio Clínico

Controlado

Ad2/HIF-

1α/VP16

Intramuscular 34 / 7 Doença arterial

periférica, isquemia

crítica do membro, não

passíveis de

revascularização

1 ano Segurança Os pacientes

HIF-1α

apresentaram

resolução

completa da

dor em

repouso nos

membros (14

de 32) e

cicatrização da

úlcera (5 de

18)

Del-1

DELTA-1

Grossman

et al117

Ensaio Clínico

Controlado

Del-1

plasmidial

Intramuscular 52 / 53 Doença arterial

periférica, pico do

tempo de caminhada de

1–10 em teste

ergométrico

180 dias Pico do tempo de

caminhada em 90

dias

Aumento do

tempo de

início da

claudicação na

caminhada em

30, 90 e 180

dias em ambos

os grupos, sem

diferença

significativa

HGF

HGF-Stat

Powell

et al118

HGF

plasmidial

Intramuscular Alta dose (27)

Média dose (25)

Baixa dose (26)

Placebo (26)

Doença arterial

periférica, isquemia

crítica do membro, não

passíveis de

revascularização e

12 meses Mudança na

TcPo2 em 6 meses

TcPo2

aumentou em

6 meses no

grupo alta

dose (24.0+/-

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38

Ensaio Clínico

Controlado

tensão de oxigênio

transcutâneo (TcPO2) <

40 mm Hg

ou pressão do dedo do

pé < 50 mm Hg ou

pressão do tornozelo

< 70 mm Hg

4.2 mmHg)

comparando

ao placebo

(9.4+/-4.2

mmHg), ao

grupo baixa

dose (11.1+/-

3.7 mmHg) e

ao grupo

média dose

(7.3+/-4.8

mmHg)

Phase III

FGF

AGENT-3

AGENT-4

Henry

et al119

Ensaio Clínico

Controlado

Ad5-FGF4 Intracoronária Alta dose (175)

Baixa dose

(180)

Placebo (177)

Doença arterial

coronariana, angina

refratária, CCS (2/4)

AGENT 3: sem

necessidade imediata de

revascularização

AGENT 4: não

passíveis de

revascularização

12 meses Mudança no

tempo do teste

ergométrico em

12 semanas

Significativo

efeito benéfico

do gênero, as

mulheres

apresentaram

melhora no

tempo do teste

ergométrico e

melhora

quanto à CCS

6. NOSSA EXPERIÊNCIA COM TERAPIA GÊNICA

Em nosso centro (Instituto de Cardiologia do RS/FUC) desenvolvemos experimentos em

modelo canino de infarto do miocárdio nas fases aguda e crônica, na tentativa de acompanhar os

processos de terapia gênica. Primeiramente testamos a transfecção do gene responsável pela

produção da proteína verde fluorescente (GFP) em um modelo canino, demonstrando a efetiva

produção da proteína verde fluorescente na área tratada e, portanto, a eficácia do processo de

transfecção gênica desse modelo120

.

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39

Posteriormente, utilizando um modelo canino de cardiopatia isquêmica com controle

cintilográfico121

, verificamos a indução de angiogênese miocárdica pela injeção transmural de

plasmídeo VEGF165 (Genentech/ USA) em zonas do infarto agudo do miocárdio (IAM). Nesse

modelo, IAM era provocado por ligadura coronariana, seguido da injeção imediata

intramiocárdica de plasmídeo contendo VEGF165 no grupo tratado e de solução salina no grupo

controle. Cintilograficamente, não foram percebidas diferenças da perfusão miocárdica entre os

grupos controle e tratado, tanto no estudo imediato como no de 15 dias após IAM, sendo que os

dois grupos mostraram uma recuperação de 70 a 90 % da hipoperfusão demonstrada no primeiro

exame. No experimento com infarto do miocárdio em fase aguda, a injeção de VEGF165 resultou

em importante aumento no número total de vasos nos cães tratados. Este aumento se deveu quase

exclusivamente à formação de capilares e, em menor escala, de arteríolas. Quando examinadas as

diversas zonas do coração, foi encontrada maior proliferação de capilares nas zonas de transição

entre o infarto e o miocárdio normal. Por outro lado, foi interessante notar que, nestas mesmas

zonas de transição, o número de arteríolas foi menor do que nas zonas de miocárdio normal, não

tratado pela injeção de VEGF165 (Figuras 3 e 4)121

. Técnica semelhante foi utilizada por Kawasuji

e cols, porém com injeção intramiocárdica do fator básico de crescimento de fibroblastos

(bFGF)60

.

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40

Figura 3 - Número de vasos por cm2: comparação entre o grupo controle e tratado, no infarto

agudo do miocárdio.

Figura 4 - Número de vasos por cm2: comparação entre a área de transição do infarto agudo do

miocárdio e de área normal da parede ventricular posterior do grupo tratado.

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41

Em estudo seguinte, aplicamos a mesma técnica deste modelo experimental, porém em

fase crônica do infarto do miocárdio, quando foi feita injeção intramiocárdica de plasmídeo

contendo VEGF165 no sétimo dia após a indução de infarto. Esse grupo foi comparado com um

controle, no qual foi injetada solução salina. A função ventricular esquerda foi avaliada por

ecocardiogramas pré e pós-tratamento e foi realizada análise histológica para contagem de vasos.

Encontramos aumento significativo do número de capilares no grupo tratado, além de

estabilização da fração de ejeção ventricular do grupo tratado 14 dias após o tratamento com

VEGF165, em contraste com o grupo controle, no qual ocorreu diminuição significativa da fração

de ejeção ventricular esquerda (Figuras 5, 6, 7, 8)122

.

Figura 5 - Medida eletrônica de vasos em corte histológico

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42

Figura 6 - FE pré e 14 dias após injeção de plasmídeo (grupo tratado) e de solução salina (grupo

controle). FE: fração de ejeção do ventrículo esquerdo.

Figura 7 - Número de capilares por cm2 de área analisada em ambos os grupos de infarto do

miocárdio em fase crônica.

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43

Figura 8 - Número de arteríolas por cm2 de área analisada em ambos os grupos de infarto do

miocárdio em fase crônica.

Em continuidade a esta linha de pesquisa, foi realizado o ensaio clínico para testar o uso

exclusivo de terapia gênica em pacientes com angina refratária. O estudo proposto neste projeto

trata-se do primeiro ensaio clínico fase I/II realizado no Brasil investigando a terapia gênica com

VEGF165 para revascularização miocárdica, em relação à segurança e viabilidade da mesma em

pacientes cardiopatas isquêmicos inoperáveis pelos métodos convencionais.

Adicionalmente, este estudo proposto se caracteriza por utilizar um plasmídeo produzido

inteiramente em nosso país, desenvolvido em universidade brasileira e produzido por empresa de

biotecnologia essencialmente nacional, como está descrito em mais detalhes abaixo.

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44

7. JUSTIFICATIVA

Apesar de mais de uma década da realização do primeiro ensaio clínico sobre terapia

gênica, os reais benefícios clínicos dessa terapêutica permanecem não totalmente esclarecidos.

Princípios e experiências anteriormente citados podem ser aplicadas à revascularização

miocárdica em pacientes sem opção por método convencional. Alguns fatores justificam a

utilização da angiogênese em doenças vasculares oclusivas. Apesar da isquemia advinda da

oclusão vascular aumentar a expressão de fatores de crescimento angiogênicos, o fato dos

pacientes se apresentarem com angina incapacitante indica que o processo natural compensatório

nem sempre é suficiente, indicando que a produção de citocinas é inadequada e/ou a resposta a

elas está diminuída.

Parece estar demonstrada experimentalmente a eficácia da terapia gênica com VEGF para

produção de angiogênese, melhora da perfusão miocárdica e preservação da função ventricular

esquerda. Por outro lado, as experiências clínicas em pequenas séries de casos e estudos

randomizados demonstram ser um método seguro, com baixa morbidade quando se utilizam

vetores plasmidiais. A eficácia clínica foi demonstrada em maior ou menor grau, nos diferentes

relatos, de acordo com o agente utilizado, as doses e as vias de administração. Há carência de

estudos randomizados controlados para verificar o efeito da terapia gênica nas diversas situações

clínicas decorrentes de cardiopatia isquêmica. Por esses motivos, justifica-se testar a segurança e

a eficácia de um método de indução de angiogênese terapêutica por DNA plasmidial desnudo

(VEGF165) através de injeção intramiocárdica, em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica

avançada que demonstrem refratariedade ao tratamento clínico e inviabilidade às técnicas

disponíveis de revascularização, percutâneas e cirúrgicas.

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45

8. HIPÓTESE DE PESQUISA

A administração intramiocárdica, transtorácica de VEGF165 plasmidial em pacientes com

DAC avançada e angina refratária, não passíveis de revascularização percutânea e cirúrgica,

proporciona a formação de novos vasos, melhora a perfusão miocárdica em áreas isquêmicas, a

capacidade funcional e as classes de angina e de insuficiência cardíaca, refletindo na melhora da

qualidade de vida dos pacientes.

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46

9. OBJETIVOS

9.1. Objetivo Geral

Avaliar os efeitos clínicos e sobre a perfusão miocárdica da administração

intramiocárdica, transtorácica de VEGF165 plasmidial em pacientes com DAC avançada e angina

refratária, não passíveis de revascularização percutânea e cirúrgica.

9.2. Objetivos Específicos

Nos pacientes descritos acima, avaliar os efeitos:

1. Sobre a perfusão miocárdica por meio de cintilografia.

2. Sobre a capacidade funcional por meio de teste ergométrico.

3. Clínicos por meio da análise da classe angina e insuficiência cardíaca e do questionário

de qualidade de vida de Minnesota.

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47

10. REFERÊNCIAS

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High doses of VEGF165 as sole gene therapy for patients with inoperable coronary artery

disease and refractory angina: 1-year follow-up from a phase I/II clinical trial

Imarilde I. Giusti – Cardiologist - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação

Universitária de Cardiologia – Brazil

Short title: VEGF 165 Sole Gene Therapy for Refractory Angina

Clarissa G. Rodrigues – Spec RN - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação

Universitária de Cardiologia – Brazil and Research on Research Group, Duke University, USA.

Felipe B. Salles – MD- Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação Universitária

de Cardiologia – Brazil.

Roberto T. Sant’Anna –MD; Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação

Universitária de Cardiologia – Brazil.

Bruna Eibel – Physiotherapist - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação

Universitária de Cardiologia – Brazil.

Sang W. Han – PhD – Universidade Federal de São Paulo.

Eduardo Ludwig – MD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação Universitária

de Cardiologia – Brazil.

Gabriel Grossman – MD, PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação

Universitária de Cardiologia – Brazil.

Paulo Roberto L. Prates – MD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação

Universitária de Cardiologia – Brazil.

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João Ricardo M. Sant’Anna – MD, PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul /

Fundação Universitária de Cardiologia – Brazil.

Guaracy F. Teixeira Filho – MD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação

Universitária de Cardiologia – Brazil.

Melissa Medeiros Markoski – PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação

Universitária de Cardiologia – Brazil.

Ivo A. Nesralla – MD, PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação

Universitária de Cardiologia – Brazil.

Nance B. Nardi – PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação Universitária

de Cardiologia – Brazil.

Renato A. K. Kalil – MD, PhD - Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação

Universitária de Cardiologia – Brazil and Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto

Alegre – Brazil.

Corresponding Author:

Renato A. K. Kalil

Research Unit of Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação Universitária de

Cardiologia – Brazil. Av. Princesa Isabel, 370 Porto Alegre, RS. Zip code: 90620-001.

[email protected], [email protected]

Telephone: +55 (51) 3230-3600 Fax: +55 (51) 3217-2035

Total word count: 5.050 words.

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57

Abstract

Background - Gene therapy has the potential to aid development of angiogenesis and collateral

circulation in the ischemic tissue. The aim of this study was to assess the safety and feasibility

and to evaluate the initial results, both clinical and on myocardial perfusion, of gene therapy with

2000 µg of VEGF165 in patients with ischemic heart disease and refractory angina.

Methods and Results – This was a Phase I/II, prospective, temporal-controlled series, clinical

trial. Thirteen patients were maintained for a minimum of 6 months under optimized clinical

management, then received transthoracic intramyocardial injections of 2000 µg plasmid

VEGF165 and were followed by single photon emission computed tomography (SPECT) scans,

treadmill tests, Minnesotta Quality of Life Questionnaire (QOL) and New York Heart

Association (NYHA) and Canadian Cardiovascular Society (CCS) angina classifications. There

were no deaths, early or late. During the optimized clinical treatment, it was observed worsening

of rest ischemia scores on SPECT (P<0.05). After treatment, there was a transitory increase in

myocardial perfusion at 3rd

month SPECT under stress (pre-op 18.38±7.51 vs. 3 months

15.31±7.30; P<0.01) and at 6th month under rest (pre-op 13.23±7.98 vs. 6 months: 16.92±7.27;

P<0.01). One year after, there were improvements in treadmill test steps (pre-op 2.46±2.07 vs.12

months 4.15±2.23; P<0.01) and oxygen consumption (pre-op 7.66±4.47 vs.12 months

10.89±4.65; P<0.05), QOL (pre-op 48.23±18.35 vs.12 months 28.31±18.14; P<0.01) scores and

CCS (pre-op 3(3-3.5) vs.12 months 2(1-2.5); P<0.01) and NYHA (pre-op 3(3-3) vs. 2(2-2) vs. 12

months 2(1-2); P<0.01) classes.

Conclusions – Gene therapy demonstrated to be feasible and safe in this advanced ischemic

cardiomyopathy patient sample. There were improvements in clinical evaluation parameters and

a transitory increase in myocardial perfusion detectable by SPECT scintigraphy.

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Clinical Trial Registration: NCT00744315

http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00744315?term=Induced+Angiogenesis+by+Genic+Thera

py+in+Advanced+Ischemic+Cardiomyopathy+(THEANGIOGEN)&rank=1

Key Words: gene therapy, angiogenesis, myocardial perfusion, angina.

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It is estimated that about 900,000 individuals in the United States have refractory angina.

This syndrome is defined as severe symptomatic coronary artery disease (CAD), not manageable

by conventional treatment, including coronary artery bypass grafting (CABG), percutaneous

coronary intervention (PCI) and optimized clinical treatment1,2

. Moreover, there are about 25,000

to 75,000 new cases diagnosed each year1,2

. In Europe, about 15% of the total cases of angina can

be characterized as refractory angina2. With increasing population age and CAD mortality

reduction, it is believed that the incidence of refractory angina will increase.

In order to improve quality of life for these patients, alternative revascularization

strategies have been evaluated. In this context, given its potential for aiding the development

myocardial angiogenesis and formation of collateral circulation in the ischemic myocardium3,

gene therapy using the vascular endothelial growth factor (VEGF) could represent a new

therapeutic option3,4

. In 1998, Losordo et al5 conducted the first clinical trial using gene therapy

with VEGF165 for patients with refractory angina. Over a decade later, however, the real benefits

of the therapy as well as the most appropriate and effective dose are still controversial.

Clinical trials of gene therapy with VEGF165 as the sole therapy for patients with

refractory angina have used low gene vector doses (125-400 µg)5-7

. Higher doses have been used

in some studies, although in combination with well-established techniques of myocardial

revascularization, such as CABG and PCI8-13

. Additionally, such trials have demonstrated the

safety and feasibility of this type of therapy, evidencing myocardial angiogenesis and improved

functional capacity. However, the effect of high doses in patients with refractory angina remains

unclear.

The aim of this study was to assess the safety and feasibility and to evaluate the initial

results, both clinical and over the myocardial perfusion, of gene therapy with 2000 µg of plasmid

VEGF165 in patients with advanced ischemic heart disease and refractory angina.

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METHODS

Clinical Study Design and Patients Selection

This trial was designed as a prospective temporal-controlled clinical series study and

enrolled 13 patients (Table 1) with refractory angina selected from 134 candidates screened in a

dedicated outpatient clinic during a 2-year period. All 13 patients had advanced ischemic heart

disease, inoperable by CABG or PCI, as assessed by independent cardiovascular surgeons and

interventionist cardiologists. The inclusion criteria were: signs and symptoms of angina and/or

heart failure despite maximum medical treatment, myocardial ischemic area of at least 5% as

assessed by single photon emission computed tomography (SPECT) scans and diffuse coronary

artery disease with vessels unfeasible for CABG or PCI. The exclusion criteria were: age over 65

years, left ventricular ejection fraction less than 25% and diagnosed neoplasms. After selection,

the patients had their medical treatment optimized following current clinical guidelines and were

followed for a minimum of 6 months (259.6±167.3 days) in a dedicated outpatient clinic, under

the research group supervision. During this period, the plasmid VEGF solution was prepared by

the supplier. Immediately before intervention, the patients underwent a preoperative evaluation

that included all of the described parameters, with emphasis on a new SPECT scan. Patients who

responded well to medical treatment or who showed improvements in myocardial SPECT scan

perfusion were discarded from the study and not submitted to gene therapy.

Study Registrations and Approvals

This study was registered at ClinicalTrials.gov under the registration number NCT

00744315 and was carried out in a reference cardiology hospital in southern Brazil. This is the

first clinical trial using gene therapy in Brazil for the treatment of refractory angina patients and

the first one to use a vector entirely developed in this country, by Excellion, Petropolis, RJ,

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61

Brazil. The project was designed according to the Guidelines and Norms Regulating Research

Involving Human Subjects (Declaration of Helsinki World Medical Association, 1964). It was

approved by the National and Local Ethics Committee under number 3849/06, as well as by the

National Technical Commission on Biosafety (CTNBio) for the surgical center and the supplier

of the plasmid vector. All the patients signed informed consents. Figure 1 demonstrates the study

phases flow diagram.

Intervention

The patients were submitted to surgical intervention under general anesthesia at a

reference cardiovascular surgery center. The ischemic area of the myocardium previously

identified by a SPECT scan was approached through a small anterolateral thoracotomy with an

incision of approximately 5 cm in the 4th or 5th left intercostal space, according to the area to be

treated, followed by a corresponding T-shaped pericardiotomy. This area received injections of

the plasmid vector solution under direct vision, distributed over ten points of the ischemic

myocardium, with a total of 2000 µg of plasmid VEGF165, diluted in 5 mL saline solution, using

a 5 mL syringe and a 25 F Butterfly injection needle. Prior to thoracic closure, a thoracic tube

was put in place and maintained for 12 h. Postoperative pain was treated with intercostal neural

block with local marcaine solution and postoperatively with injectable analgesics.

Plasmidial Vector

The plasmid backbone used was developed by one of the authors (SWH) at the Federal

University of São Paulo and produced commercially by Excellion Serviços Biomédicos in

Petropolis, RJ, Brazil. The PEX-HV5 plasmid backbone is composed of cytomegalovirus (CMV)

intron 1 with its promoter and splicing signals. The human VEGF165 cDNA was inserted

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62

between the CMV promoter and the bovine polyA sequence. This vector also contains a pUC

origin of replication and kanamycin resistance sequences for propagation in bacteria. The

solution is considered stable if kept under refrigeration for 6 months; it must be discarded after

this period.

Hypersensibility Test

All patients were tested for hypersensitivity to the VEGF165 plasmid vector solution.

The test consisted of a 0.5 mL subcutaneous injection containing a 500 ng dose of vector PEX-

HV5 (containing the human gene VEGF165) in 0.5 mL of sodium chloride 0.9% in the left

forearm at least 2 weeks before the intervention. The application was performed in the outpatient

clinic, where the patients remained and were reassessed 6 hours after the injection. Thereafter, the

patients received instructions to return to the hospital in case of adverse events. No type of

adverse event was observed in any of the patients studied.

Myocardial Perfusion

All patients underwent ECG-gated myocardial perfusion studies. The protocol involved a

2 day (rest/stress) technetium 99m sestamibi imaging approach(SPECT). All patients were

submitted to pharmacological stress using dipyridamole (0.56 mg/Kg in 4 minutes). A stress

injection of Tc-99m sestamibi was administered at the seventh minute of the beginning of

dipyridamole infusion. The images were acquired with a low-energy high-resolution collimator

using a 180º non-circular orbit from 45º right anterior oblique to left posterior oblique, with a 64

× 64 matrix. The rest and stress studies were reconstructed using a Butterworth filter with a

critical frequency of 0.5 Nyquist, with an order of 5.

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63

An Emory Cardiac Toolbox (ECTb) was used to identify left ventricular landmarks from

short axis slices which were then verified by an operator. The ejection fraction and left

ventricular volume values were calculated using the ECTb and the extent and severity of the

ischemic area were obtained using Cedars-Sinai QPS software. In this software, the left ventricle

is divided into segments and each receives scores between 0 and 4 (0 = normal perfusion and 4 =

absence of perfusion). The severity scores obtained were: summed stress score (SSS), summed

rest score (SRS) and summed difference score (SDS). The extent of ischemia was calculated by

comparing the perfusion of the patient with a database of normal patients. The final examination

result was defined via a consensus between two experts.

Functional Capacity

A treadmill test with the Naughton protocol was used, which provides an estimated

oxygen consumption of 1 MET per stage. This protocol is often used in post-myocardial

infarction exercise testing to classify patients into high-risk or low-risk categories and to

determine optimal treatment strategies. The protocol begins with a belt speed of 1.0 mph with

zero elevation, followed by an increase to 2.0 mph, keeping the elevation zero. From this stage,

the rate is fixed at 2 mph and the elevation of the ramp increases in 3.5% increments every 3

minutes.

Quality of Life

The Minnesota quality of life (QOL) questionnaire is comprised of 21 questions related to

limitations that are often associated with how much heart failure (HF) prevents patients from

living as they would like to, considering questions related to the previous months. The responses

to each question range from 0 (no) to 5 (yes), where 0 represents no limitation and 5 maximal

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64

limitation. This questionnaire was specifically developed for heart failure, making it closer to

reality for this class of patient.

Heart Failure (NYHA) and Angina (CCS) Functional Classification

Scores of angina according to the Canadian Cardiovascular Society (CCS), and heart

failure according to the New York Heart Association (NYHA), were assigned at each interval

evaluation.

Outcomes

For the above described parameters, the patients were evaluated at the study inclusion,

after at least 6 months of optimized clinical treatment (pre-intervention period), and at 1, 3, 6 and

12 months after intervention, observing the following outcomes;

Primary outcome: ischemia extension evaluated by serial SPECT scans

Secondary outcomes: angina class by CCS classification, heart failure class by NYHA

classification, quality of life by the Minnesota questionnaire, functional capacity and estimated

oxygen consumption by treadmill tests.

Statistical Analysis

Continuous variables are expressed as means and standard deviation and categorical

variables as absolute and relative frequencies. Friedman´s nonparametric test and ANOVA were

used to compare the same variables at different times in relation to the same group. Analyses

were performed using the SPSS 18.0 statistical package.

RESULTS

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65

Safety and Feasibility

There were no deaths or surgical re-interventions during the study period. There was

a case of prolonged postoperative hospitalization due to decompensated diabetes. One patient

had premature ventricular contractions in the immediate postoperative period. It is noteworthy

that this same patient had already presented the same arrhythmia in a previous treadmill test, with

spontaneous reversion. Another patient developed bacteremia associated with pneumonia within

12 hours post-op. Microbiological analysis of the plasmid solution used in this patient was

negative for bacterial or fungal growth until the fifth day of observation. This same patient

required assistance in the emergency unit in the fourth month after the intervention due to stress

caused by family illness, but no cardiovascular abnormalities were observed. At the tenth month,

this patient presented with thoracic discomfort, was submitted to a new coronary artery

cineangiogram that identified a new lesion, and was treated with PCI with good results. Another

patient required hospitalization for signs of heart failure and was managed clinically.

Myocardial Perfusion

During the previous optimal drug treatment period, there was no difference in stress and

differential ischemia SPECT scores. However, an increase in the rest ischemia SPECT score

(baseline 10.23±7.06 vs. pre-op 13.23±7.98; P<0.05) was observed. Three months after

VEGF165 gene therapy, analyses of ischemia SPECT scores showed a reduction in the number

of ischemic segments under stress (pre-op 18.38±7.51 vs. 3 months 15.31±7.30; P<0.01) and at

rest (pre-op 13.23±7.98 vs. 3 months 8.77±6.82; P<0.01). There was no difference in the

differential score in the same time period. Six months after intervention, there was a significant

difference only in the rest ischemia score (6 months: 16.92±7.27; P<0.01).

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66

One year after gene therapy, the ischemia scores were similar to the preoperative values.

Figure 2 demonstrates the ischemia scores throughout follow-up and Figure 3 presents the

variation in myocardial perfusion as assessed by SPECT scans for one of the patients included

this study.

Functional Capacity

One month after VEGF165 gene therapy, there was improvement in the number of steps

taken in the treadmill test (pre-op 2.46±2.07 vs. 1 month 3.31±1.75, P<0.05), which was

maintained at 1 year after intervention (3 months 3.77±2.13, P<0.05; 6 months 3.92±2.14, P<0.05

and 12 months 4.15±2.23, P<0.01). Oxygen consumption in the patients was improved three

months after intervention (pre-op 7.66±4.47 vs. 3 months 10.30 ±4.36, P<0.05), and this effect

remained at 1 year after gene therapy (12 months 10.89±4.65; P<0.05). During the optimal drug

treatment period, there was no difference in the number of steps (baseline 2.00±2.27 vs. pre-op

2.46±2.07; P=NS) or in oxygen consumption (baseline 6.70±4.54 vs. pre-op 7.67±4.47; P=NS) in

the treadmill tests. These results are presented in Figure 4.

Quality of Life

During the optimal drug treatment, there was no difference in quality of life (baseline

49.77±20.85 vs. pre-op 48.23±18.35; P=NS). One month after VEGF165 gene therapy, a

decrease in these scores was observed, showing an improvement in quality of life (1 month

31.00±15.71; P<0.01). The same decrease was observed 3 (3 months 30.15±20.13; P<0.01), 6 (6

months 27.62±18.47; P<0.01) and 12 months (12 months 28.31±18.14; P<0.01) after gene

therapy, indicating an improvement in the quality of life throughout follow-up (Figure 5).

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67

Angina (CCS) and Heart Failure (NYHA) Classification

One month after VEGF165 gene therapy, the patients showed an improvement in angina

classification (pre-op 3(3-3.5) vs. 1 month 2(2-2)), which remained constant until one year after

intervention (12 months 2(1-2.5); P<0.01). The same results were observed for heart failure

classification (pre-op 3(3-3) vs. 2(2-2) and 12 months 2(1-2); P<0.01). During the optimal drug

treatment period there was no change in either angina (baseline 2.69±0.63 vs. pre-op 3.08±0.64)

or heart failure classification (baseline 3(2-3) vs. pre-op 3(3-3)) (Figure 6).

Individual patients clinical assessments showed improvements in angina symptoms

evaluated by CCS classification in 10 patients, whereas no improvements were noticed in three

patients. There was no case of clinical worsening after gene therapy. During the previous optimal

drug treatment period, five patients reported worsening of angina symptoms and eight reported

no difference. One year after gene therapy, 11 patients showed improvements in NYHA heart

failure classes, whereas 2 patients reported no changes. Similar to the angina symptoms, no

worsening after intervention was observed. During the previous optimized clinical treatment

period, there were five cases of worsening and eight patients reported no difference in relation to

NYHA heart failure classes.

DISCUSSION

In this trial, we assessed the effect of high doses of VEGF165 as sole gene therapy for

patients with severe coronary artery disease and refractory angina. The best or more adequate

clinical dose is not yet known. We chose this high dose based on experimental studies in which

injection of 200 mcg plasmidial solution in dogs of 7-10 Kg provided significant increase in

capillary density of treated areas14

. The intervention was shown to be safe and feasible. There

were objective and subjective significant changes related to the intervention. A transitory

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68

improvement in ischemic SPECT scores and an increase in the number of steps taken and oxygen

consumption in the treadmill test, an improvement in quality of life and angina and heart failure

classifications were observed in the patients immediately after treatment.

Only minor complications were observed during the follow-up period of 1 year. Six

months after the study began, there were two cases of hospitalization, but only non-invasive

management, such as clinical treatment, were necessary to control the situation. There was one

case of angina 10 months after gene therapy, which demanded PCI in a new developed coronary

lesion. Previous studies have demonstrated the safety and feasibility of high-dose gene therapy in

combination with other revascularization techniques13

. Studies with lone gene therapy employed

usually low doses5-7

.

When the SPECT images were evaluated, we observed an improvement in the perfusion

scores in the treated area at 3 and 6 months after the injections of plasmid VEGF165, whereas

after 1 month an improvement was not yet evident. While the scores of segmental ischemia under

stress and at rest, SSS and SRS, respectively, which assess both the extent and intensity of

myocardial ischemia, showed myocardial perfusion improvements, the differential scores (SDS)

for individual observations did not change in this period. The proposed treatment aims to

improve perfusion scores in regions with a viable myocardium rather than recover inactive areas.

Thus, an improvement in the scores reflects a real decrease in ischemia severity in the treated

areas.

The improvement in the scores of ischemia at rest in this series of patients suggests that

myocardial perfusion was also improved, but not enough to provide normal perfusion, so that

evidence of stress-induced ischemia remained during stress. Nevertheless, these results show a

clear angiogenic effect of gene therapy in these myocardial areas. One year after gene therapy,

the SPECT scores were similar to baseline parameters, showing a transient effect of the

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69

treatment. However, no cases of worsening perfusion scores were observed; therefore,

considering the severity of the coronary artery disease in this class of patients, one year without

worsening of the clinical picture may be seen as a favorable result.

Two previous studies5-7

similar to ours showed different results, with improvements in

myocardial perfusion and angina in one and only an improvement in angina in the other.

However, the number of patients in these studies was also small and, in addition, different doses

of VEGF165 were used. A recent randomized clinical trial using gene therapy combined with

CABG surgery and supplemental oral L-arginine treatment showed promising results for the

association of different treatments, also suggesting that endothelial dysfunction may be

associated with the pathophysiology of these patients8.

Two larger studies, using a similar patient profile, compared injection of plasmid VEGF-

165 with placebo using NOGA technique9,15

. Kastrup et al used 500 mcg of plasmid solution.

Three months after procedure, myocardial stress perfusion defects (primary endpoint) and angina

classs did not differ significantly between the VEGF gene transfer and

placebo groups

15. VEGF

gene transfer improved the local wall motion disturbances, assessed both by

NOGA and contrast

ventriculography. No VEGF related adverse events were observed; however, NOGA procedure-

related adverse events occurred in five patients and one patient died during diagnostic NOGA

before randomization. Stewart et al9, randomized 93 patients with CCS class 3 ou 4 angina, to

2,000 mcg of VEGF plasmid DNA or placebo (buffered saline) delivered via the endocardial

route using a percutaneous electroanatomical NOGA guidance catheter. Despite the

intramyocardial administration of a “high dose" of plasmid DNA, there was no benefit of VEGF

gene therapy at 3 or 6 months for the studied end points.

Evaluation of the exercise test results in this series of patients showed improved oxygen

consumption at three months and up to one year after the intervention. For some of the patients

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the exercise test had to be interrupted due to claudication and fatigue, which represent a

limitation of the test. In a clinical trial using a VEGF-2 plasmid, Losordo et al16

observed an

increase in the average duration of physical activity in the treated group compared to the placebo

group. A similar study17

with intramyocardial administration of a VEGF121 adenonoviral vector

showed improvements in exercise time at week 26 after gene therapy in the treated patients, but

not in the control patients treated with maximum medical therapy. In this series of patients,

quality of life was improved from one month up to one year after gene therapy with VEGF165,

but not in the patients receiving maximum medical treatment. A previous study16

that included

patients with angina classes III and IV showed a significant reduction in these classes after 12

weeks of treatment with phVEGF2, which did not occur in the control group. Most of larger

therapeutic angiogenesis trials showed non-substantial benefit for cardiovascular disease and the

early promising results of preclinical studies are yet to be translated to the clinic18,19

.

A possible interference of the placebo effect in this series of patients may change their

perception of the symptoms of the disease, representing a confounding variable. However, the

improvements observed in both SPECT scans and exercise treadmill tests were objective

indications of the relevance of the findings on quality of life and of CCS and NYHA

classification. It should also be noted that no improvements were observed in the previous period

of optimal medical treatment, which supports the hypothesis that angiogenesis and improved

myocardial perfusion were gene therapy-induced.

Study limitations: It is recognized that the method of a clinical series with prospective

temporal control model, instead of a parallel control group, might be a limitation of this study.

We chose the temporal control series model, where the patient is his/her own control in the period

prior to treatment, given the heterogeneity and variability of coronary artery disease and

considering the small sample size. In this case, the method could be appropriate for analysis of

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71

the effects of gene therapy. All patients remained under optimal medical treatment for at least 6

months before the intervention, which would be a conventional treatment option for patients who

were not undergoing gene therapy. Improvement in symptoms or ischemia parameters such as

SPECT during that period were criteria for excluding patients from treatment. It was therefore

possible to compare the results obtained with the optimal medical treatment and those after

treatment with VEGF165 by considering each patient as his/her own control. It should be

recognized, however, that ischemic heart disease has its own natural history and this could

influence the outcomes, irrespective of the treatment options.

We used a more conventional surgical approach instead of the less invasive NOGA

technique. There are no randomized studies comparing these two approaches in terms of safety

and results. NOGA is attractive since it allows electromechanical mapping of the left ventricle,

facilitating injection in appropriate areas. But there is a risk of perforation, which is not negligible

as demonstrated by the occurrence of cases of pericardial tamponade requiring cardiac surgery17

.

It is, also, difficult to be certain that the DNA product was indeed injected into the myocardium.

A surgical approach is more traumatic, requiring a 5 cm incision, but allows direct injection and

the presence of a thoracic tube reduces the risk of tamponade. With proper SPECT scan analysis

and surgical planning, all areas of the left ventricular free wall can be approached through this

small incision in the 4th or 5

th intercostals spaces. Limitations in this approach are related to the

ventricular septum. With modern anesthetic techniques and meticulous patient care, this approach

has demonstrated to be safe even in high risk patients. However, it renders impossible to perform

blind, placebo-controlled studies.

Gene therapy with the VEGF165 plasmid was shown to be safe and feasible in this patient

group. Three months after gene therapy, the clinical results demonstrated an improvement in the

intensity of myocardial ischemia in the treated areas. One year after treatment, the ischemia

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72

scores were similar to the preoperative levels, but no patient showed worsening of ischemia

during this period. Improvements in quality of life and classes of angina and heart failure were

observed in the same one-month period after gene therapy and were maintained for one year after

treatment.

ACKNOWLEDGMENTS

We would like to acknowledge the staff of the Surgical Unit, Postoperative Unit and

Outpatient Department of Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul/Fundação Universitária

de Cardiologia, where this study took place, for their help in assisting with the patients.

Additionally, we would also like to thank the Research Unit at the same Institution for their

efficient assistance throughout this study.

FUNDING SOURCES

FAPERGS – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul(State of Rio

Grande do Sul Research Foundation).

CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(National Council for

Scientific and Technological Development).

DISCLOSURES

The authors had no relations whatsoever with any laboratory, industry or company with interests

in the subject of this study. The trial was designed and conducted independently by the authors,

with financial support from the government agencies cited above (FAPERGS and CNPq).

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77

FIGURE LEGENDS

Figure 1: CAD: coronary artery disease, CAGB: coronary artery bypass grafting, PCI:

percutaneous coronary disease, SPECT: single photon emission computed tomography, QOL:

quality of life, NYHA classification: New York Heart Association classification, CCS

classification: Canadian Cardiovascular Society classification, VEGF165: vascular endothelial

growth factor 165.

Figure 2: SSS: summed stress score. SRS: summed rest score. Pre-op: pre-operative.

Figure 3: -

Figure 4: Pre-op: pre-operative.

Figure 5: Pre-op: pre-operative.

Figure 6: NYHA: New York Heart Association classification. CCS: Canadian Cardiovascular

Society Angina classification. Pre-op: pre-operative.

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TABLES

Table 1: Sample characteristics.

Characteristics Patients (n=13)

Age (years) * 58.7±5.9

Male † 12 (92.3%)

Hypertension † 12 (92.3%)

Diabetes † 6 (46.2%)

Previous myocardial infarction † 13 (100%)

Previous stroke † 2 (15.4%)

Peripheral vascular disease † 2 (15.4%)

Previous CABG † 11 (84.6%)

Previous ICP † 12 (92.3%)

Left ventricular ejection fraction * 56.0±14.5

CCS Angina classification †

I 0 (0%)

II 2 (15.4%)

III 8 (61.5%)

IV 3 (23.1%)

NYHA Heart failure classification †

I 0 (0%)

II 0 (0%)

III 11 (84.6%)

IV 2 (15.4%)

* Mean and standard deviation. † Absolute and relative frequencies. CABG: coronary artery bypass graft. ICP:

intervention coronary percutaneous. CCS: Canadian Cardiovascular Society. NYHA: New York Heart Association

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FIGURES

Figure 1: Study phases diagram.

L

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Figure 2: Ischemia scores in the SPECT.

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Figure 3: Variation in myocardial perfusion as assessed by the SPECT scans of one patient

included in this study.

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Figure 4: Steps taken and oxygen consumption (METs) in treadmill tests.

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Figure 5: Scores obtained in Minnesota questionnaire.

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Figure 6: Angina (CCS) and heart failure (NYHA) classification.