transferÊncia de embriÕes fisiologia, Ética e produÇÃo animal- monografia
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UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO
ESPECIALIZAÇÃO latu sensu
PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO EM BOVINOS
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES: FISIOLOGIA, ÉTICA E PRODUÇÃO ANIMAL
Marcelo Mendonça Muzeti
e
Renato Paganelli Jaquetto
Rio de Janeiro, nov. 2007
RENATO PAGANELLI JAQUETTO
E
MARCELO MENDONÇA MUZETI
Alunos do Curso de Especialização latu sensu Produção e Reprodução em
Bovinos
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES: FISIOLOGIA, ÉTICA E PRODUÇÃO ANIMAL
Trabalho monográfico de conclusão do
curso de Especialização latu sensu
Produção e Reprodução em Bovinos
(TCC), apresentado à UCB como requisito
parcial para a obtenção do título de
Especialista em Produção e Reprodução
em Bovinos, sob a orientação do Prof.
Msc. Athos de Assumpção Pastore.
Rio de Janeiro, NOV. 2007
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES: FISIOLOGIA, ÉTICA E PRODUÇÃO ANIMAL
Elaborado por MARCELO MENDONÇA MUZETI
Aluno do Curso de Especialização latu sensu Produção e Reprodução em Bovinos
Foi analisado e aprovado com
grau: ...................................
Rio de Janeiro, ____ de _______________ de ______.
___________________________ Membro
___________________________
Membro
___________________________ Professor Orientador
Presidente
Rio de Janeiro, nov. 2007
Dedicamos este trabalho de Revisão
Bibliográfica a minha família que me deu apoio
durante a realização desta revisão e aos meus
amigos.
“O pior dos defeitos é imaginar-se isento deles”.
Bottach
Sumário
1 – Introdução.....................................................................................................................01
2 – Histórico .......................................................................................................................04
3 – Programa de transferência de embrião, seleção de doadoras e receptoras ...................07
3.1 – Programa de transferência de embriões...............................................................07
3.2 – Seleção de Doadoras e Receptoras ......................................................................08
4 – Ciclo Estral ...................................................................................................................09
5 – Sincronização ...............................................................................................................11
6 – Superovulação ..............................................................................................................13
7 – Coleta............................................................................................................................15
8 – Fecundação in vitro ......................................................................................................17
8.1 – Capacitação de espermatozóide...........................................................................17
8.2 – Fertilização de oócitos .........................................................................................18
8.3 – Critérios para a FIV .............................................................................................19
8.4 – Criopreservação...................................................................................................19
8.5 – Maturação com água de coco ..............................................................................19
9 – Inovulação ....................................................................................................................21
9.1 – Cirúrgica pelo flanco ...........................................................................................21
9.2 – Fundo de saco vaginal .........................................................................................21
10 – Eficiência da técnica...................................................................................................23
11 – Agentes infecciosos na reprodução voltados a inovulações (T.E.) ............................24
11.1 – L.E.B. – Leucose Enzoótica Bovina..................................................................24
11.2 – I.B.R. – Rinotraqueíte infecciosa bovina...........................................................24
11.3 – Diarréia bovina vírus .........................................................................................25
11.4 – Língua Azul (bluetongue)..................................................................................25
11.5 – Brucelose ...........................................................................................................26
11.6 – Leptospirose ......................................................................................................26
12 – Condições sanitárias internacionais básicas para comercialização de embriões........28
12.1 – Normas recomendadas por O.I.E., F.A.O., e O.M.S. (Código, 1982)...............28
13 – Aspectos éticos da biotécnica de reprodução .............................................................30
14 – Planos futuros da reprodução .....................................................................................32
15 – Conclusão ...................................................................................................................34
16 – Referências Bibliográficas..........................................................................................35
.
1 - Introdução
Segundo Silva (2000), sob a ótica
biológica todo ser vivo nasce, cresce, reproduz e
morre. Neste aspecto, a reprodução representa a
continuidade das espécies e seus domínios sobre
alguma coisa, seja um território, o alimento,
conquista passadas, evolução e desenvolvimento.
Sem a capacidade para se reproduzir,
dificilmente estas metas seriam alcançadas e
transmitidas ás gerações futuras. Esta linha de
raciocínio vale para todas as espécies existentes
neste planeta Terra, planeta em constante
evolução, cujo ser dominante, o homem, busca o
seu bem estar como para sua própria
sobrevivência. Ciente do que e importante para
si, o homem aproveita-se da natureza e dos
conhecimentos acumulados durante gerações
para desenvolver ciência, capazes de lhe garantir
o domínio completo sobre determinados
fenômenos evolutivos que ele via acontecer e
que, em muitos casos, tardou a compreender. A
partir da compreensão dos fatos é que se pode
partir ao conhecimento e, principalmente, buscar
metodologias que possam acelerar certos
fenômenos, que pela evolução natural tardariam
milhares de anos para se tornar realidade. Assim
aconteceu com os conhecimentos sobre a
reprodução, um dos pilares da existência dos
seres vivos sobre a Terra. Ate compreender que
da união de dois gametas (masculino e feminino)
surgiria um zigoto e a partir das sucessivas
divisões celulares este se diferenciava e se
tornava um ser vivo completo, igual ao de sua
espécie e com características de seus pais, muito
tempo se passou. São muitas as razões pelas
quais este homem tardou tanto a compreender
um fenômeno tão simples. Entre elas, o medo do
desconhecido, motivos religiosos ou mesmo a
falta de visão do futuro de certos homens que
fazem ciência.
A partir do momento em que o homem venceu em partes estas barreiras e
vieram a luz do conhecimento fatos e fenômenos que tornam hoje a vida mais fácil, é que
podemos explicar melhor o mecanismo de nossa existência. Ao desvendarem a estrutura dos
ácidos nucléicos e possibilitar o entendimento do código genético, Watson & Crick em 1953
davam impulso para o desenvolvimento de muitas ciências relacionadas com vida, entre elas a
reprodução, iniciado em 1856 por Mendel, pai da genética e autor das leis da hereditariedade.
Assim constantemente evoluindo e diante de tantos fatos novos que estão acontecendo e
desencadeados pelos avanços biotecnológicos, nos perguntamos: quais serão os desafios
atuais da reprodução como ciência e como eles podem ser utilizados como instrumento de
maximização da produção animal?
Como observado por Esper (1998), a necessidade de pesquisa para aumentar a
eficiência na produção de bovinos tem sido sentida em todo o mundo e, em alguns paises,
adquirida certa prioridade.A atual população mundial excede 5,3 bilhões e cresce 90 milhões
por ano (1.8%). Este crescimento exerce profundo efeito sobre a necessidade de produtos de
origem animal.
Recentemente novas tecnologias tem sido incorporadas objetivando a
exploração de animais domésticos.A produção in vitro de embriões bovinos em numero
substancial e a baixo custo já é uma realidade.
O desenvolvimento efetivo de métodos não cirúrgicos para o recolhimento e
transferência de embriões em bovinos constituiu-se num importante estagio na exploração
comercial da tecnologia da transferência de embriões.
O Brasil inicia o novo milênio como o país com maior potencial de
crescimento de carne bovina do mundo. Produzindo ecologicamente carne magra com
qualidade a baixo custo, torna-se um vendedor potencial para os países de primeiro mundo, os
quais veêm passando por sérios problemas no setor pecuário (vaca louca e aftosa na europa)
(LOBO et al., 2001).
A biotecnologia, dentro do contexto das tecnologias de processo ou de produto,
utiliza técnicas de biologia molecular e ou celular visando a geração de processos, como os
agroindustriais com o fim de obter índices elevados de produtividade de bens e serviços
(RODRIGUES & RODRIGUES, 1999).
A técnica de transferência de embriões em bovinos ganha, a cada dia, mais espaço dentro da pecuária nacional. Neste contexto, salienta-se o aspecto de que uma fêmea de elevado padrão zootécnico pode ser utilizada de forma mais racional, fornecendo grande
número de descendentes em um curto espaço de tempo (COSTA et al., 1999). De acordo com Fernandes (1999), a técnica de transferência de embriões (T.E.)
em bovinos vem se desenvolvendo rapidamente e com ela surgem novas perspectivas para
reprodução e do melhoramento animal.
2 - Histórico
De acordo com Rodrigues (2001), o primeiro experimento de coleta e
transferência de embriões mamíferos (coelhos) foi por Walter Heaper (1855-1929), em
Cambridge (UK), quando em 1890 coletou embriões do útero de doadora e os transferiu com
sucesso para o útero de uma receptora.O objetivo do seu experimento era examinar, ate que
ponto, o ambiente uterino da receptora poderia influenciar ou alterar o fenótipo dos embriões.
Anteriormente, a invenção do microscópio pelo holandês Antoni vam Leewenhoek (1632-
1730), propiciou durante os séculos dezessete e dezoito a discussão, nos círculos acadêmicos,
sobre a geração dos animais, que tem no livro Exercitationes de geratione animalium de
autoria do medico inglês Willian Harvey (1578-1657), o postulado que pode ser considerado a
fronteira de uma nova época de idéias: “Tudo que é vivo provem do ovo”. A publicação em
1672 de Reinier de Graaf (1641-1673), DE mulierum organis generationi inserventibus, onde
são descritos no ovário, os folículos (que hoje levam seu nome), seguida pela observação e a
descrição dos espermatozóides por Leewenhock em 1679, permitiram o florescimento de uma
acirrada discussão a cerca da geração dos animais, com a teoria da pré–formação tendo de um
lado os ovistas e de outro os espermistas. De acordo com os pré-formistas o indivíduo já
existia na sua forma adulta, necessitando para o seu crescimento intra-uterino que a sua forma
definitiva fosse sendo aberta ou desdobrada. A localização destes indivíduos pré-formados,
transmitidos de geração a geração, se no ovário ou no testículo, foi o moto para acaloradas
discussões acadêmicas durante quase dois séculos. A epigenia tal qual a conhecemos hoje,
onde a geração de um novo é o produto da fecundação do óvulo pelo espermatozóide, com o
posterior crescimento e diferenciação no útero materno é o fruto desta polêmica cientifica.
Em 1949 a organização da Unidade de Reprodução Animal no Instituto de
Pesquisa Agrícola em Cambridge, com o objetivo de estudar as possibilidades do emprego da
transferência de embriões nos programas de seleção animal, permitiu um grande impulso ao
desenvolvimento da área. Em 1951 foi reportado nos USA por Willet e colaboradores o
nascimento do primeiro bezerro produto da transferência de embriões. Neste período as
grandes barreiras eram a ausência de procedimentos adequados de estimulação ovariana, de
técnicas eficientes para a coleta, a transferência e a manutenção dos embriões fora do
ambiente uterino. Durante as décadas de 60 e 70 o grupo de Cambridge, liderado por E.J.C.
Polge e L.E.A Rowson realizaram os experimento que tornaram os procedimentos com
embriões bovinos passiveis de serem realizados nas propriedades rurais.
Na metade dos anos 70 teve início no Canadá e nos USA o emprego comercial
desta biotécnica de reprodução (Tab.1), sendo a Alberta Liverstock Transplant a primeira
companhia a oferecer serviços de transferência de embriões. Neste período, em 1974, foi
fundada em Denver, no Colorado, a Sociedade Internacional de Transferência de Embriões
(IETS), que hoje conta com cerca de 900 associados, representando mais de 40 diferentes
países.
Tab. 1. Histórico da Transferência de Embriões.
Ano Número de prenhezes Causa
1970 0 Somente experimental
1975 4000 Introdução de raças exóticas
1980 20000 Sincronização do ciclo estral
1985 50000 a 100000 Transferência via cervical; Congelação de embriões
Fonte: (Rodrigues, J. L.)
A reunião anual da IETS constituiu-se no fórum das discussões técnicas sobre
os mais diferentes aspectos das biotécnicas da reprodução, permitindo a troca de experiências
da comunidade acadêmica com os colegas que exercem atividade profissional nas
propriedades.
No Brasil, os primeiros experimentos com embriões bovinos foram realizados
pelo Dr. João Carlos Giudice em 1973 na Cabanha Azul, no município de Quarai, no Rio
Grande do Sul. Ao retornar de uma viagem científica à Europa, o Dr. Giudice organizou um
programa de coletas cirúrgicas de embriões, onde foram realizadas tentativas de obtenção de
embriões viáveis, mas em virtude das dificuldades técnicas encontradas, este objetivo não
pôde ser alcançado. Passados 5 anos, o desenvolvimento da técnica permitiu ao Dr. Jorge
Nicolau realizar na fazenda experimental São Pedro, em Sorocaba, São Paulo, a primeira
coleta cervical e transferência por laparotomia, resultando no nascimento do primeiro bezerro
T.E. brasileiro, que recebeu o nome de Eureka. A partir desse momento, multiplicaram-se as
equipes envolvidas com a tecnologia de embriões, colocando o Brasil como o primeiro país,
fora do eixo Europa/América do Norte em números absolutos de embriões transferidos
anualmente, sendo que em 1999 foram transferidos 78 mil embriões. O maior número é
realizado nos estados da Região Sudeste com bovinos da raça Limousin, Simental e Holandês.
Seguindo-se os estados do Paraná, Mato Grosso do Sul e Goiás, onde estão localizados o
maior número de centros e equipes que desenvolvem e aplicam a tecnologia. Atualmente a
raça Limousin é a que mais cresce no número de embriões transferidos, tendo localizado
durante o ano de 1999 a transferência de 14000 embriões.
Em 1986 fundou-se a Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões, hoje
contando com cerca de 450 associados, que de maneira similar à congênere internacional,
proporciona o ambiente para as discussões sobre os avanços da área de conhecimento e as
possibilidades do emprego das biotécnicas de reprodução no Brasil.
3 – Programa de Transferência de Embriões, Seleção de Doadoras e Receptoras
3.1 – Programa de Transferência de Embriões
Segundo Rodrigues (2001), em termos gerais, podemos considerar os seguintes
aspectos para a organização de um programa de transferência de embriões:
a) Recursos Humanos:
- Equipe com experiência em transferência de embriões;
- Pessoal da propriedade treinada.
b) Recursos Materiais:
- Equipamento;
- Material permanente;
- Material de consumo.
c) Propriedade:
- Alimentação;
- Manejo;
- Sanidade;
- Programa de seleção;
- Qualidade da receptora.
d) Animais:
- Doadoras;
- Sêmen ou reprodutores;
- Receptoras.
3.2 – Seleção de Doadoras e Receptoras
De acordo com Rodrigues (2001), é de
fundamental importância a escolha adequada das
doadoras e receptoras para o programa.
Na seleção das doadoras podemos avaliar as seguintes características:
Genótipo: usualmente, realiza-se a cariotipia da doadora, excluindo-se
do programa aquelas fêmeas que apresentarem qualquer tipo de anomalia
cromossômica. Dentro das possibilidades, faz-se uma análise dos ascendentes e
descendentes, quanto à ocorrência de defeitos com origem hereditária.
Fenótipo: a doadora deve possuir um fenótipo considerado superior
dentro da raça, levando-se também em consideração a sua habilidade em transmitir estas
características aos seus descendentes.
Saúde Geral: a constatação à inspeção e ao exame clínico geral de um
animal sadio é indispensável para a obtenção dos resultados esperados.
Saúde Genital: órgãos genitais sadios que executem as funções
fisiológicas do ciclo estral dentro dos padrões normais são exigências que o Médico
Veterinário deve examinar com rigor a fim de poder selecionar doadoras com potencial
de produção de embriões viáveis compatíveis com o número médio (5/colheitas)
descrito para a espécie bovina.
Na avaliação das receptoras, os itens saúde geral e saúde genital descritos
acima são determinantes do percentual de prenhez a ser obtido no trabalho. Propriedades bem
organizadas e com bom manejo dos animais, normalmente obtêm índices de prenhez
semelhantes aos observados em propriedades dos países desenvolvidos.
4 – Ciclo Estral
De acordo com Hafez (1995) e Rodrigues (2001), o emprego da transferência
de embriões exige o domínio do ciclo estral, da função ovariana e da folículogênese. O ciclo
estral bovino é definido como o período compreendido entre dois estros, tem duração média
de 21 dias, considerando-se fisiológica variações entre os 18 e 24 dias. As diferentes fases em
que o ciclo estral pode ser caracterizado são:
Estro: é a fase em que a fêmea aceita ser copulada pelo macho, dura em média
18 horas. O endométrio encontra-se em proliferação, sendo sinais característicos a fêmea
deixar-se montar, o edema da vulva e o corrimento vaginal mucoso. No aspecto
endocrinológico, existe uma dominância da ação dos estrógenos, produzidos pela teca interna
do folículo, que estimulando o centro sexual no hipotálamo, são os receptores pelas
manifestações clínicas do estro. No início desta fase ocorre o pico de LH, que é responsável
pelo final da maturação do ovócito e pela ocorrência da ovulação.
Metaestro: é a fase compreendida entre o final do estro e o diestro, dura em
média 5 dias nos bovinos. A ovulação, a fecundação e o desenvolvimento embrionário até o
estágio de mórula não compacta são eventos que ocorrem no metaestro. A luteinização das
células da fossa ovulatória dá origem ao corpo lúteo, responsável pela produção de
progesterona, que aumentando progressivamente os seus níveis séricos, alcança um platô a
partir do 6º dia pós-ovulação. Os níveis circulantes de estrógenos decrescem após a ovulação
e sob a influência da progesterona, o endométrio passa da fase de proliferação para a fase de
secreção, preparando-se para receber o embrião em desenvolvimento.
Diestro: é a fase mais longa no ciclo estral, dura em média 10 a 20 dias e
caracteriza-se pela ação da progesterona. O útero apresenta-se relaxado e em um dos ovários
está presente o corpo lúteo. Ao redor do 16º dia do ciclo estral ocorre a liberação de
prostaglandina pelo endométrio que, chegando ao ovário através da anastomose da veia
uterina com a artéria ovárica, promove a luteólise, o que caracteriza o final do diestro.
Próestro: tem início a partir da luteólise, ocorrendo entre o 17º e o 20º dia do
ciclo estral, onde acontece os eventos que permitirão que o folículo dominante siga
desenvolvendo-se e produzindo estrógeno, fazendo com que a fase de secreção do
endométrio, presente no diestro, assuma as características de proliferação. O próestro
constitui-se em uma preparação dos órgãos genitais para o estro, observando-se gradualmente
o aparecimento dos sinais clínicos que nos permitem identificá-lo. O limite entre o próestro e
o estro é o momento em que a fêmea passa a aceitar a monta.
A função ovariana nos bovinos tem início ainda no período fetal e estende-se,
após a puberdade, até idades que podem atingir aos 15 anos. Durante o desenvolvimento fetal
sob a influência dos hormônios maternos, os ovários do feto apresentam crescimento e atresia
folicular. Do nascimento à puberdade, na ausência de função do hipotálamo e da hipófise, as
gônadas femininas permanecem em repouso. Após a puberdade, quando o sistema nervoso
central e a hipófise iniciam a liberação do GnRH e das gonadotrofinas (FSH e LH),
respectivamente, os ovários passam a funcionar, realizando um conjunto de atividades, as
quais denominamos ciclo ovariano. Nas diferentes fases do ciclo estral existem nos ovários
um número de folículos entre 200 e 400 que se encontram em fase de crescimento, destes 25 a
50 são folículos terciários, dos quais um será selecionado como folículo dominante,
adquirindo as características para realizar a maturação e a ovulação.
5 – Sincronização
Segundo Rodrigues (2001), a necessidade da sincronização dos ciclos de
diferentes doadoras faz com que um período de tempo maior seja necessário para que as
atividades possam ser realizadas de forma adequada. Usualmente as doadoras recebem uma
primeira dose de prostaglandina e onze dias após uma segunda, o que proporciona à indução
simultânea dos estros na totalidade dos animais envolvidos no programa.
O tipo de hormônio vai determinar a forma e a dose de administração, por
exemplo o eCG por tratar-se de uma proteína de alto peso molecular, tem uma meia vida
longa, o que facilita sua utilização, pois todo tratamento resume-se a uma única aplicação
intramuscular da dose total estipulada. Ao contrario os hormônios obtidos.
Atualmente a utilização de progestágenos na forma de implantes auriculares ou
espirais intravaginais permitem uma sincronização com maior controle do ciclo estral das
doadoras, o que proporciona um trabalho mais confortável ao medico veterinário, no que diz
respeito a escolha do calendário de datas para realizar as atividades de colheita e transferência
de embriões.
De acordo com Hafez (1995), para uma transferência de embriões bem
sucedida, é necessário a sincronização entre o estágio do ovo e trato reprodutivo da receptora.
Isto é realizado usualmente pela seleção de receptoras que estiverem em cio ao mesmo tempo
que a doadora, seja naturalmente ou em conseqüência de sincronização do cio. Para resultados
ótimos, a receptora deve estar em cio com um limite de 12 horas em ralação à doadora. A taxa
de gestação cai drasticamente se a diferença for de 24 horas em vacas. As receptoras de
embriões congelados ou armazenados em baixa temperatura devem ser selecionadas para
estarem em sincronia fisiológica com o estágio de desenvolvimento do embrião. Assim, se
embriões estiverem congelados por 2 dias, eles deverão ser transferidos para receptoras que
estiverem no cio 2 dias após a doadora. As perdas de gestação por transferência não
sincronizadas são provavelmente devido à colocação dos embriões em ambiente adversos, ou
à inabilidade de embriões não sincronizados para exercer uma ação luteotrófica sobre o corpo
lúteo da receptora.
Segundo Costa et al. (2000), as melhores taxas de sincronização de cio em
raças zebuínas são obtidas quando são considerados algumas particularidades da fisiologia
destes animais, como por exemplo a menor duração do cio e a menor intensidade de
manifestações dos sinais do cio, os animais ovulam em menor tempo após o início do cio, o
padrão do crescimento folicular e a secreção e metabolismo de estrógeno são diferentes dos
observados em espécies européias e o pico de LH após a sincronização de cio é menor do que
aquele observado em animais Bos taurus. Etiproston é um análogo sintético de prostaglandina
F2α que possui dois átomos de oxigênio no C15. Sua molécula é muito estável, possuindo
meia vida maior que a PGF2α natural. Além do efeito luteolítico, este análogo tem uma forte
ação sobre a contração uterina, o que o destaca dos demais.
6 - Superovulação
Rodrigues (2001), descreve que são utilizados 3 preparos hormonais para a
indução da ovulação múltipla na fêmea bovina:
a) FSH: hormônio folículo estimulante obtido de extrato de hipófise suína ou ovina.
b) ECG: gonadotrofina coriônica eqüina, obtida a partir do soro de éguas prenhes
entre os 70 e os 120 dias de gestação.
c) HMG: gonadotrofina da menopausa humana, extraída da urina da mulher em
menopausa.
Como objetivo de avaliar a resposta a superovulação vacas da raça Nelore
foram tratadas com 25 mg de FSH-P, em oito sub-doses decrescentes com intervalos de 12
horas. Em dois animais não foi possível recuperar estruturas, o que resultou em 90% de índice
de recuperação. As colheitas entre 6.5 e 7.5 dias após o estro das doadoras, sendo recuperadas
162 estruturas (media de 8.1 por doadora), com 31 não fertilizadas (media de 1.55 por
doadora). Os embriões foram classificados como excelentes (64), bons (24), regulares (15) e
degenerados (23). Nas condições deste experimento, os resultados permitem concluir que a
dose de 25mg de FSH-P é eficaz para induzir superovulação em vacas Nelore embora a falta
de padronização nas respostas ao tratamento superovulatórias ainda é um obstáculo a ser
vencido para melhor eficiência do processo (Molina & Saturnino, 1993).
De acordo com Hafez (1995), os processos atuais, a superovulação aumenta a
produção de embriões normais em aproximadamente 5 vezes na vaca, porém levemente em
porcas e éguas. Em todas as espécies existem extremas variações individuais nas respostas.
Muitas doadoras não produzem nenhum embrião normal, enquanto que porcas produzem
grandes números. Por exemplo, aproximadamente metade dos embriões recuperados de um
grande grupo de doadoras superovuladas são tipicamente produzidos por um quarto das
doadoras. Infelizmente não é possível predizer como irá responder uma determinada doadora;
este é o maior obstáculo para uma aplicação mais satisfatória.
7 – Colheita de embriões.
De acordo com Frare (1997), desde que se iniciou a transferência de embriões,
busca se a praticidade e economia da técnica, além da intenção de maximizar o uso de
doadoras e receptoras envolvidas no processo da T.E., pois estes animais ficam na maioria das
vezes ociosos por muito tempo a espera dos trabalhos de coleta e transferência dos embriões.
Rotineiramente, as coletas de uma mesma doadora ocorrem a intervalos de 60-90 dias como
indicados por vários autores e técnicos, espaço ate então raramente reduzido. Em testes
coletados até 8 vezes seguidas com intervalo de 33 a 42 dias, de acordo com o programa
estabelecido para a propriedade. “Há casos em que optamos não por 35 mas por 42 dias, de
intervalo entre as coletas o que serve para aproveitar a re-sincronia das receptoras (o segundo
cio natural após a transferência) que não contraíram gestação na transferência anterior”.
Os resultados obtidos não são, ao seu modo de ver estatisticamente diferente
entre os dois sistemas (intervalo 60-90 e 33-42). As dificuldades em emprenhar os animais
após uma série grande de coletas seguidas a intervalos de 35 dias, tem-se mostrado até o
presente momento similares as dificuldades apresentadas no esquema 60-90 dias. Também até
o presente momento não se observou alterações hormonais perceptíveis externamente nas
doadoras envolvidas, nem alterações de comportamento reprodutivo.
Efeitos negativos para a técnica poderão surgir com decorrer do tempo, todos
os proprietários dos animais envolvidos optaram por continuar os programas no mesmo ritmo,
pois a compensação em ganho de tempo tanto para as doadoras como para as receptoras é
muito grande e o resultado econômico dos programas realizados também se demonstram
altamente favoráveis a continuidade da técnica.
8 – Fecundação in vitro
Hafez (1995), afirma que os primeiros estudos sistemáticos de fertilização de
ovos de coelha in vitro por espermatozóides recuperados do trato feminino foram
comunicados pela primeira vez em 1954. O desenvolvimento e aplicação da FIV em animais
domésticos foram revistos intensivamente em 1981. A FIV é significado prático para obter
grande número de embriões para investigações científicas ou para transferência subseqüente a
receptoras apropriadas.
8.1 – Capacitação de espermatozóide
Os espermatozóides não atingem sua capacidade total de fertilização até depois
de serem transportados no trato reprodutivo feminino. Os espermatozóides devem passar por
novas modificações fisiológicas antes de poderem penetrar na zona pelúcida e fundirem-se
com o vitelo dos ovos. O desenvolvimento de condições definidas em que a fertilização pode
tomar lugar fora do organismo aumento rapidamente a profundidade de compreensão da
capacitação espermática e a da reação do acrossomo dos espermatozóides a maior parte dos
experimentos iniciais com FIV não foram bem sucedida, porque os espermatozóides não
estavam capacitados, termo que se refere a modificações dos espermatozóides ejaculados no
trato reprodutivo feminino, tornando-os capazes de fertilizar os oócitos, o mecanismo
molecular de capacitação é desconhecido. Uma teoria é que as membranas da célula
espermática não capacitada são especificamente estabilizadas para proteger contra danos no
trato reprodutivo feminino e que a capacitação é o inverso desta estabilização. Uma outra é
que a capacitação consiste na remoção de inibidores das enzimas acrossômicas. Em cada
espécie, a capacitação é completada pelo maior tempo que os espermatozóides entram em
contato com os oócitos. Uma provável explicação da capacitação invoca o fator de captação, o
qual julga-se seja produzido nos epidídimos ou glândulas sexuais acessórias do macho e
juntado aos espermatozóides.
8.2 – Fertilização de oócitos
Oócitos para FIV são obtidos usualmente das trompas logo após a ovulação,
porém podem também ser conseguidos de folículos ou da superfície do ovário. Enquanto que
os espermatozóides podem penetrar os oócitos com idade variável do estágio primário
imaturo antes do rompimento da membrana nuclear até oócitos envelhecidos recuperados a
mais de um dia após a ovulação, o desenvolvimento embrionário normal não resulta da
fertilização de oócitos em qualquer extremo. Vários tipos de placas de cultura tem sido
utilizada para a FIV (HAFEZ, 1995).
Segundo Rodrigues & Rodrigues (2000), os experimentos realizados a partir de
1980 na Georgia (USA) pelo grupo liderado pelo professor Brakett, proporcionaram avanços
consideráveis às técnicas de produção de embriões bovinos no laboratório, permitindo sua
utilização em associações aos programas de ovulação múltipla e de transferência de embriões
(MOET) com o objetivo de subsidiar programas de seleção animal. As diferentes
considerações e propostas sobre o emprego do MOET permitiram o desenvolvimento de
novas idéias no âmbito dos testes de progênie e dos programas de seleção animal, que tem
como base famílias formadas por irmãos inteiros e meio irmãos. Além dos aspectos
envolvendo os programas de seleção animal, a produção in vitro de embriões proporcionou
meios para o desenvolvimento de experimentos na área da micromanipulação envolvendo as
particularidades ligadas à sexagem, a clonagem e a produção de animais transgênicos.
De acordo com Esper (1998), várias características e mudanças que ocorrem no
embrião tem sido exploradas com intuito de se obter metodologia que possibilite uma
variação segura do "status" do embrião a ser transferido como: número de células, corantes
florescentes, testes bioquímicos, cronologia pelo estágio, critério morfológico e análise
estrutural.
8.3 – Critérios para a FIV
Conforme Hafez (1995), existem vários requisitos para a fertilização in vitro
tais como:
1. Maturação nuclear e citoplasmático de gametas nas gônadas
2. Desenvolvimento da fertilidade de gametas nos tratos reprodutivos
masculino e feminino
3. Um número ótimo de espermatozóides fertilizáveis com motilidade
rigorosa
4. Um óvulo fertilizável com um primeiro corpúsculo polar
8.4 – Criopreservação
A principal vantagem da criopreservação de embriões ao invés dos
espermatozóides ou oócitos é que o embrião possui o genoma completo, que pode ser
transferido para uma mãe adotiva de fundo genético conhecido ou não, sem o risco de
modificação genética. A criopreservação de embriões facilita os centros de criação animal de
possuir maior variação de estoques, inclusive para o uso não imediato, salvando deste modo
espaço e dinheiro, assim como oferecendo proteção contra perdas por fogo, doenças e outros
riscos. Linhagens consangüíneas, mutações e combinações genéticas especiais podem ser
preservadas; este é um recurso valioso para a pesquisa avançada em genética animal. Além
disso, padrões de pedigree genéticos podem ser estabelecidos e testados para uma direção
genética em gerações subseqüentes.
8.5 – Maturação com água de coco
Segundo Blume, et al. (1997), a água de coco mostrou-se eficiente como meio
de cultivo de embriões murídeos frescos e congelados em diferentes estágios de
desenvolvimento por um período de até 48 horas (Blume & Marques Jr., 1994). O presente
trabalho foi o de avaliar a água de coco in natura e enriquecida na maturação de ovócitos
bovinos, classificados quanto ao tipo de envoltório nuclear, levando-os a FIV e analisando os
resultados da clivagem. As taxas de maturação e o percentual de clivagem na FIV, mostram
que a água de coco pode ser usada como meio de maturação in vitro de ovócitos bovinos.
9 - Inovulação
É o ato de deposição dos embriões no trato reprodutivo da fêmea receptora.
Duas técnicas são utilizadas:
9.1 – Cirúrgica pelo flanco
A técnica cirúrgica pelo flanco é a mais utilizada
e é ainda empregada por grupos em atividade por
apresentar as seguintes:
- Melhor controle sobre a inovulação
- Deposição do embrião no local apropriado.
- Maior índice de prenhez
Para utilização na propriedade rural esta técnica apresenta algumas limitações:
-necessidade de laparotomia
-maior custo por embrião transferido
-maiores recursos humanos
As equipes que utilizam a cirurgia no flanco têm como argumento a maior
eficiência e constância nos resultados obtidos.
9.2 – Fundo de saco vaginal
A cirurgia no fundo de saco vaginal, que era realizada pelo grupo de trabalho da
STRACTA em Brasília, consiste numa incisão no fundo do saco vaginal, com a
exteriorização do corno uterino através da vagina. Os resultados obtidos são semelhantes
aos descritos com a cirurgia no flanco, porém não se aconselha o uso desta técnica com
novilhas pela dificuldade de exposição dos cornos uterinos. A sincronização dos ciclos
estrais da doadora com a receptora é fundamental para a obtenção de bons resultados
(Rodrigues, 2001).
Hafez (1995), afirma que os resultados de transferência de embriões não
cirúrgica foram resumidos por Foote e Onuma (1970). Com a técnica desenvolvida Sugie
(1965), a cérvix não é ultrapassada. Corretamente o método mais comum é depositar os ovos
no útero através da cérvix com uma palheta de inseminação artificial, 6 a 12 dias após o cio
(SREENAN, 1978; TROUNSON et al., 1978a).
10 – Eficiência da Técnica
O trabalho de rotina mostra a necessidade de um
período entre 6 e 12 meses para a organização da
infra-estrutura, tanto material como humana para
o desenvolvimento de um programa de
transferência de embriões na propriedade rural.
Depois da solução dos problemas básicos, é
também importante o estabelecimento de padrões
para estimar a relação custo benefício. Nos
programas de iniciativa particular e individual,
que são a maioria absoluta dos existentes no
Brasil, podemos sugerir 3 critérios:
a) Coletas/Doadora/Ano: pode-se realizar de 5 a 6 coletas de embriões por doadora
por ano. Atualmente existem técnicas de aspiração folicular, que já permitem a
utilização com a maior freqüência de fêmeas doadoras.
b) Embriões viáveis/Coleta: a espécie bovina por proporcionar uma média de 5
embriões viáveis por coleta, esta pode variar com programas de superovulação
onde são selecionadas doadoras com grande número de ovulações. Médias abaixo
de 3 embriões viáveis por coleta inviabilizam o processo.
c) Prenhez/Coleta: é a relação que mostra com maior objetividade a eficiência do
método como um todo. Os grupos de trabalho com excelente qualidade de rotina
consegue em média 2,6 bezerros por coleta. Nas condições de trabalho na
propriedade encontrados no Brasil, resultados médios de 1,8 a 2,3 bezerros por
coleta são considerados suficientes para tornar o emprego do método econômico
(RODRIGUES, 2001).
11 – Agentes infecciosos na reprodução voltado a inovulações
11.1 – L.E.B. – Leucose Enzoótica Bovina
O vírus da LEB é transmitido horizontalmente,
da mesma forma que muitos outros agentes. A
resposta sorológica e o transporte de leucócitos
com o vírus perduram ao longo da vida dos
animais infectados. Dessa forma, os fluídos
uterinos podem estar infectados por causa da
contaminação sanguínea. Entretanto, não há
evidência de que a T.E., a partir de doadoras
infectadas cause infecção das receptoras ou
resulte no nascimento de bezerros infectados.
Assim, as pesquisas conduzidas por
BOUILLANT et al. (1981) e HARE et al.
(1985), indicaram que embriões colhidos de
doadoras infectadas ou expostos in vitro ao vírus
da LEB não causaram infecções em receptoras e
em suas crias (VIANA, 1990).
11.2 – I.B.R. – Rinotraqueíte Infecciosa Bovina
O vírus da IBR causa problemas respiratórios e reprodutivos em bovinos. O
animal infectado pode manter o estado de portador especialmente quando submetido ao
estresse ou quando tratado experimentalmente com corticóides. Há descrição do isolamento
do vírus a partir do corpo lúteo, do tecido ovariano do oviduto e do infundíbulo. Alguns
estudos demonstram a capacidade do vírus de aderir à zona pelúcida. Nesse caso há
necessidade de tratamento do embrião com tripsina e ou antisoro específico para assegurar a
não infecção do mesmo. Nesse sentido, SINGH et al. (1982b), expuseram embriões bovinos
ao vírus da IBR (106-8 TCID 50/ml*) e mesmo com 10 lavagens não conseguiram eliminar os
vírus aderidos na zona pelúcida. Entretanto nos 23 embriões tratados com antisoro por uma
hora e nos 32 tratados com tripsina (0,25%), por um a dois minutos, não foi isolado este
agente. Em outros experimentos, estes autores escolheram 63 embriões de 22 doadoras
infectadas experimentalmente com o vírus de IBR. Após o tratamento com tripsina os
embriões foram transferidos para 45 receptoras, resultando em 21 gestações. Todas as
receptoras e as crias nascidas foram negativas para o vírus (SINGH et al., 1983).
11.3 – Diarréia Bovina Vírus
A diarréia a vírus pode apresentar-se clinicamente como uma doença aguda
com diarréia e baixa mortalidade ou como uma doença grave onde predominam lesões das
mucosas do trato digestivo, com alta mortalidade. Há casos de animais infectados de forma
persistente que não apresentam respostas sorológicas detectáveis. Procura-se então fazer o
isolamento do vírus nos líquidos uterinos. ARCHBALD et al. (1979), publicaram polêmico
trabalho envolvendo a inoculação de vírus da diarréia bovina no lúmen do corno direito de 5
vacas. Após uma semana recolheram 22 embriões, 12 dos quais procedentes do corno uterino
infectado. Destes, 8 possuíam zona pelúcida e apresentavam início de degeneração. Ao
microscópio eletrônico foi identificada uma estrutura morfologicamente ao vírus. Os autores
concluíram que o vírus poderia apresentar efeitos adversos nos estágios iniciais da gestação,
resultando em infertilidade. Entre tanto SINGH et al. (1982a), expuseram 96 embriões de
vacas a concentração de vírus entre 104 e 105 50ml TCID e não encontraram o agente após
processo de lavagem do embrião. Estes autores discordam da conclusão ARCHBALD et al.
(1979), e postulam que a degeneração do embrião não significa necessariamente infecção e o
achado de partícula semelhante ao vírus não pode ser correlacionado com a infecção.
POTTER et al. (1984), verificaram significativa redução na concentração deste vírus após
incubação em solução salina com 5% de soro de cabra por 24 horas a 37ºC.
11.4 – Língua Azul (Bluetongue)
A doença tem sido relacionada com morte embrionária (30 - 40 dias), aborto e
efeitos teratogênicos no feto, entretanto na opinião de VAN DER MAATEN (1985), tem uma
grande controvérsia sobre a patogenicidade do agente, sensibilidade e validade dos vários
testes sorológicos e virológicos. A combinação de várias técnicas diagnósticas, incluindo a
inoculação em animais sensíveis, contribui para onerar sobre maneira o custo do embrião.
A inseminação de vacas doadoras com sêmen infectado pelo vírus da
"bluetongue" ou a inoculação do vírus em vacas doadoras tem resultado na identificação do
vírus nos fluídos uterinos, mas a transferência de embriões colhidos desses animais não
resulta na infecção de receptoras negativas. SINGH et al. (1982a), submeteram 116 embriões
a diversas concentrações do vírus de "bluetongue" (102 a 107 p.f.u./ml)* entre 1 e 24 horas
sem que fosse evidenciada a infecção dos embriões. BOWEN et al. (1982), demonstraram que
os embriões bovinos sem zona pelúcida se infectam e degeneram por ação do vírus, o mesmo
não ocorrendo com embriões que a possui. SINGH et al. (1983), obtiveram 28 embriões de 10
vacas doadoras que foram transferidos sem causar infecção ou soroconversão nas receptoras e
nas crias. THOMAS et al. (1983), transferiram 28 embriões de 10 vacas infectadas
experimentalmente com o vírus de "bluetongue" e obtiveram 14 gestações sem evidência de
infecção ou soroconversão das receptoras e suas crias. THOMAS et al. (1985), transferiram
20 embriões de 4 vacas inseminadas com sêmen infectado experimentalmente com vírus de
"bluetongue", sem que encontrasse infecção ou soroconversão nas receptoras e suas crias.
11.5 – Brucelose
Em relação a Brucella abortus a pesquisa demonstrou que a lavagem dos
embriões é eficaz para eliminá-las. Até 1982 não existia segurança para afirmar se este agente
poderia ser transmitido ou não pela transferência de embriões. STRINGFELLOW &
WRIGHT (1989), analisaram os principais aspectos epidemiológicos relacionados ao uso de
doadoras brucélicas e concluíram que as diversas pesquisas são suficientes para garantir que
não há transmissão deste agente através da T.E. e que os regulamentos sanitários devem
dedicar mais atenção à manipulação apropriada dos embriões e menos ênfase ao teste da
doadora para prevenir a transmissão da brucelose.
11.6 – Leptospirose
No Brasil os resultados sorológicos de bovinos obtidos por vários autores
(ÁVILA et al., 1978; MOREIRA et al., 1979; GIORGI et al., 1981; RIBEIRO et al., 1978;
GIRIO & MATHIAS, 1989; BROD et al., 1995), também mostraram que a infecção está
bastante difundida. Atualmente o sorotipo hardjo tem sido o mais freqüentemente detectado e
é o que causa maior impacto econômico na eficiência reprodutiva de rebanhos de bovinos de
diversas partes do mundo (MILLER et al., 1991; MOREIRA et al., 1993; MOREIRA et al.,
1994; BROD et al., 1995; LILENBAUM et al., 1995; RICHARDSON, 1995). Nessa espécie
os primeiros sinais da leptospirose são os ligados à esfera reprodutiva, como aborto,
natimortos, reabsorção fetal, nascimento de animais debilitados e infertilidade, podendo a
fêmea necessitar de 3 - 6 coberturas para conceber (FAINE, 1982; ELLIS, 1994; ELLIS et al.,
1985).
12 – Condições sanitárias internacionais básicas para comercialização de
embriões.
A OIE (Office International des Epizooties) é um
organismo internacional de referencia em caso
de importação/exportação de animais e seus
subproduto. Isto não significa que um pais ou
grupo de paises não possa fixar
acordos/regulamentos próprios. Serão registrados
neste capitulo as recomendações mais
importantes em relação ao outro (VIANA, 1990).
12.1 – Normas recomendadas por OIE, FAO, OMS (código, 1982)
Para a importação de embriões de ruminantes
deve constar do certificado zoosanitário
internacional que:
1. As fêmeas doadoras e os animais do rebanho de origem não apresentaram
sinal clinico de febre aftosa, peste bovina, IBR, LEB, língua azul, brucelose , 24 horas antes
do embarque para o local credenciado de colheita e que nenhum caso de febre aftosa , peste
bovina e IBR foi oficialmente constatado no rebanho de origem durante 30 dias seguintes ao
do embarque.
2. As doadoras permaneceram no mesmo rebanho de durante 30 dias,
precedentes a seu embarque para o local credenciado da colheita e que foram submetidas
nesse período, com resultados negativos, provas de diagnostico.
3. As fêmeas doadoras foram vacinadas ou não contra febre aftosa, peste
bovina, IBR e "bluetongue", especificando o tipo da vacina.
4. As fêmeas doadoras foram fecundadas com sêmen que satisfaz as
condições da OIE.
5. As fêmeas doadoras foram transportada desde o local credenciado de
colheita sem atravessar uma zona infectada de febre aftosa, peste bovina, "bluetongue", e que
o local de colheita permaneceu livre destas doenças durante os 30 dias seguintes á data da
colheita.
6. No caso da LEB, da brucelose e da tuberculose deve ser atestado que as
fêmeas doadoras procedem de rebanhos livres e que nos 30 dias anteriores ao do embarque
apresentaram resultados negativo ás provas diagnosticas especificas pela OIE/FAO.
.
14 – Perspectivas futuras da reprodução
Segundo Silva (2000), seguindo o
desenvolvimento tecnológico ligado a
reprodução estão disponíveis hoje, além da
inseminação artificial, técnicas como
criopreservação, sexagem, T.E, FIV, clonagem
de seres vivos e a produção de animais
transgênicos. Todas estas metodologias são
formas que possibilitam aumentar a produção
animal, alem de viabilizar programas,
preservação e multiplicação da biodiversidade,
em especial daquelas espécies que se encontram
em perigo de extinção.
Na reprodução de animais domésticos a clonagem (a partir de um clone se
permite a produção de crias idênticas em larga escala) possui particular valor para
identificação e uso de genótipos superiores. Estes, então, poderiam ser selecionados através de
cruzamento direcionados e difundidos, aumentando de forma rápida as taxas de
melhoramento genéticos.
Experimentos anteriores de clonagem de animais não tiveram as repercussões
que alcançou o trabalho de Wilmut e sua equipe ao anunciarem ao mundo, em 1997, o
nascimento de um ser vivo (Dolly), a partir da transferência de um núcleo de uma célula de
glândula mamaria, de uma ovelha adulta, para um oócito enucleado de uma ovelha receptora.
Ficou provado que núcleos de uma grande variedade de células podem se revelar totipotentes
com capacidade de formar células germinativas ou diferenciar-se em um individuo. Abriu-se,
assim, amplas possibilidades de clonar animais com traços genéticos desejáveis através da
transferência nuclear a partir de população celulares modificados, oferecendo novas
perspectivas biotecnológicas. O nascimento da ovelha Dolly, trouxe um novo despertar sobre
os avanços da reprodução, assim como sobre os aspectos éticos que cercam a clonagem de
seres vivos.
A produção de animais transgênicos, através da integração de determinados
genes dentro do DNA do receptor, fazendo com que este DNA recombinante possa replicar e
transmitir a característica desejada, representa um grande potencial para a industria
farmacêutico e de alimentos. Serve, também, como modelo para compreensão genética de
varias doenças hereditárias. As dificuldades de produção de animais domésticos transgênicos
varia de espécie para espécie, sendo mais difícil de promover a integração genética em
bovinos; a interação dos genes esta em torno de 35% na maioria das espécies, em bovinos é
da ordem de 6%. Em ovelhas, cabras e suínos existem relatos da interação dos genes na
linhagem de células germinativas e a sua expressão transgênica nas crias dos animais
transplantados. Em bovinos existe apenas o relato de um embrião transplantado que gerou um
bezerro que manifestou a expressão transgênica, entretanto, não existem relatos que esta
expressão tenha sido transmitida a seus descendentes.
15 – Conclusão
Nos países desenvolvidos, as biotécnicas de reprodução além do emprego pela livre iniciativa já estão sendo também utilizadas programas de seleção e melhoramento animal parece-nos ser de fundamental importância antes de pensarmos em utilizar a biotecnologia para multiplicar o potencial de alguns considerados excepcionais, estabelecendo parâmetros de seleção e melhoramento animal, que de maneira objetiva suportem emprego destas
tecnologias. A transferência de embriões com toda sua potencialidade é objetivo de grandes
avanços e sucessos, a necessidade de produção são crescentes, abrangendo vários e diferentes
aspectos. As biotécnicas de reprodução vem sendo utilizadas em programas de seleção e
melhoramento animal e para isso preciso uma equipe com experiência em transferência de
embriões, pessoal treinado sanidade manejo, equipamento e o mais importante aos animais.
A maior responsabilidade dos pesquisadores talvez não seja a pura e simples
condução da rotina científica, mas bem informar a opinião pública sobre os mais diferentes
aspectos do conhecimento, permitindo à sociedade a opção da escolha dos caminhos a serem
por ela seguidos.
Desta maneira é de fundamental importância que as associações de criadores junto com os organismos oficiais empreendam esforços para a organização de programas de seleção animal, respeitando as particularidades de cada raça, visando o bem
16 – Referências Bibliográficas
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