Detecção rápida de picornavírus respiratórios nas secreções nasofaríngeas por ensaio de imunofluorescência

Palavras-chave:ImunofluorescênciaPicornavírus respiratóriasVírus respiratóriosEnterovírusRinovírus

RESUMOExperiência: Os picornavírus respiratórios (enterovírus e rinovírus) são comumente citados como causas da auto-limitada infecção do tracto respiratório superior. Contudo, recentemente, tem sido sugerido que eles podem causar doenças respiratórias mais graves. Os ensaios de imunofluorescência (IF) são rápidos e baratos; e são frequentemente utilizados para a detecção de vírus respiratórios.

Objectivos: Procurou-se elaborar um procedimento de IF, utilizando reagentes comercialmente disponíveis, para a detecção de picornavírus respiratórios directamente na secreção nasofaríngea (NPA).

Plano do estudo: De 01 de novembro de 2006 até 31 de outubro de 2007 todos os NPA dos pacientes com infecções respiratórias foram coradas com o reagente Light Diagnostic Pan Enterovirus - "Blend" por IF (IF-ENVPAN).Aquelas amostras cujo o teste foi positivo com a tal mancha, foram ainda testadas (sujeitas à disponibilidade de espécimes congelados) com o método do Painel respiratório viral xTAG (xTAG respiratory viral panel), um múltiplo PCR direccionado contra picornavírus, adenovírus, (ADV), vírus sincicial respiratório (VSR), vírus influenza do tipo A e B (IFA e IFB), vírus parainfluenza (PIV) 1-4, metapneumovírus humano (HMPV) e coronavírus.

Resultados: 241 em 1122 NPA tiveram teste positivo pelo IF-ENVPAN. 143 NPA estavam disponíveis para testes por Painel respiratório viral xTAG. O múltiplo PCR detectou picornavírus respiratórios em 139 NPA, em 126 como sendo o único vírus patogénico.

Conclusões: Os nossos resultados indicam o potencial do IF-ENVPAN para detecção laboratorial de picornavírus respiratórios em espécimes clínicos. Como é conhecido, esta é primeira publicação de tal método.

1. Experiência

Estudos recentes que usam abordagens da biologia molecular sugerem, previamente, para um papel não perigoso por parte dos picornavírus (enterovírus e rhinovírus) na patogénese de infecções graves do tacto respiratório. Respiração ruidosa aguda (bronquiolite e asma aguda) e pneumonia viral em crianças e bebés, irritação de COPD (doença pulmonar obstructiva crónica), asma e fibrose cística, infecções graves e crónicas em pacientes imunologicamente comprometidos e graves infecções no tracto respiratório inferior em pessoas idosas têm sido associados com os picornavírus respiratórios.

O diagnóstico rápido de vírus respiratórios patogénicos é importante para ajudar a prevenção da propagação de uma infecção hospitalar, para minimizar o uso desnecessário de antibióticos e para discernir a necessidade de terapia antiviral. A imunofluorescência é um método largamente usado para a detecção de muitos vírus respiratórios directamente a partir de amostras respiratórias. A imunofluorescência é um método rápido, confiável e economicamente eficiente que fornece uma estimativa da qualidade dos espécimes e permite uma triagem de vários vírus em simultâneo. Contudo, a coloração IF de espécimes para detecção de pircornavírus respiratórios tem sido considerada impossível devo ao grande número de sero-tipos envolvidos. Porém, o uso de anticorpos monoclonais específicos contra enterovírus tem sido descrito para fins de identificação tanto em Shell Vial como em cultura convencional.

Nós conduzimos uma investigação preliminar da adequação do reagente Light Diagnostic Pan Enterovirus - "Blend" IF (IF-ENVPAN) para detecção por imunofluorescência de picornavírus respiratórios directamente da secreção nasofaríngeas (NPA). Embora não concebido para esta aplicação, nós frequentemente observámos um determinado padrão citoplasmático granular fluorescente, que esteve frequentemente associado com o NPA das crianças com respiração ruidosa. Como a reactividade cruzada com a hepatite A e os astrovírus era improvável nas amostras respiratórias, as nossas observações sugeriram uma associação possível entra este padrão fluorescente e a detecção de picornavírus respiratórios.

2. Objectivos

Com o objectivo de avaliar a sustentabilidade do IF-ENVPAN para a detecção de picornavírus respiratórios directamente da NPA, nós, prospectivamente, testámos 1154 espécimes de NPA de pacientes com uma suspeita de infecção viral respiratória com o teste de IF-ENVPAN, testando, além disso, os espécimes disponíveis com resultado positivo de IF-ENVPAN com o Painel respiratório viral xTAG, um múltiplo PCR comercial direccionado contra muitos vírus respiratórios, incluindo picornavírus.

3. Plano de estudo3.1. Amostras

Todas as 1154 secreções nasofaríngeas (NPA) recolhidas durante o período de 1 ano (1 de Novembro de 2006até 31 de Outubro de 2007) de 986 crianças e 5 adultos com suspeita de infecção respiratória foram prospectivamente testados com o reagente Ligth Diagnostic Pan-Enterovirus – “Blend” IF (IF-ENVPAN) e com o nosso habitual painel de triagem de IF para vírus respiratórios (ADV, RSV, IFA, IFB, PIV 1-3 e HMPV). Quando disponível, o excesso de material da amostra foi congelado a -80°C.

Todos os IF-ENVPAN com resultado positivo de NPA, possuindo suficiente material congelado, foram depois testados com o painel respiratório viral xTAG, um múltiplo PCR direccionado contra picornavírus respiratórios, ADV, RSV, IFA, IFB, PIV 1-4, HMPV e coronavírus. O número total de IF-ENVPAN com resultado positivo de NPA testados pelo múltiplo PCR foram 143.

A cada 3 IF com resultado negativo de NPA (tanto pelo painel de triagem como pelo IF-ENVPAN) recolhidos entre 1 de Novembro de 2006 e 14 de Setembro de 2007, possuindo material congelado suficiente, foi também testado o xTAG múltiplo PCR. O número total de espécimes com resultado negativo de IF testados pelo múltiplo PCR foi 100.

3.2. População de pacientes

Grande parte dos NPA foi recolhida de crianças admitidas ao bloco de emergência do Departamento de Pediatria da Universidade de Berna, Suíça. Algumas amostras vieram de crianças admitidas por outros hospitais ou enviadas por práticas de pediatras. Todos os 5 adultos foram admitidos pelo Hospital da Universidade de Berna, Suíça; 3 deles estavam imunocomprometidos.

As idades dos pacientes eram como se segue: 493<1 ano; 331: 1-3 anos; 115:4-9 anos; 47: 10-18 anos e 5 adultos.

3.3. Ensaios de imunofluorescência

As amostras de NPA foram vortexadas e centrifugadas a 700 x g durante 5 minutos. O sedimento celular foi ressuspendido em PBS e centrifugado outra vez a 700 x g durante 5 minutos e foi finalmente ressuspendido em PBS para formar uma suspensão ligeiramente turva. Uma gota desta suspensão celular foi colocada em cada poço da lâmina de multi-poços. Depois de secar a lâmina, foram fixados em acetona durante 10 minutos. Depois de colorir, todos os poços foram examinados com o microscópio de fluorescência de 200-400x. As amostras que contêm menos de 20 células epiteliais ciliadas foram consideradas inadeaquadas.

3.3.1.Painel de triagem de IF para ADV, RSV, IFA, IFB, PIV 1-3 e HMPV

Os poços foram coloridos com Light Diagnostics (Chemicon International, agora parte do Millipore, Temecula, CA) Rspiratoy Viral Screen DFA e a única

fluoresceína-conjugada de anticorpo monoclonal para a detecção de ADV, RSV, IFA, IFB e PIV 1-3 e com o Diagnostic Hybrid DFA Metapneumovirus Identification Kit para a detecção de HMPV de acordo com as instruções do fabricante.

3.3.2.IF-ENVPAN

Todos os espécimes foram também testados com o reagente Light Diagnostics Pan-Enterovirus – “Blend” Cat. Número 3360 que contém uma mistura de dois anticorpos monoclonais 2E11 e 9D5. Lâminas separadas foram usadas para o IF-ENVPAN visto que este foi o único ensaio de imunofluorescência indirecta. Uma gota de anticorpo monoclonal foi colocada em cada poço. Depois da incubação numa câmara húmida a 37° ± 1,5 °C durante 30 minutos. As lâminas foram lavadas em PBS-Tween e uma gota de Anti-Mouse IgG Conjugate (Light Diagnostics Cat. Número 5008) foi adicionada a cada poço. As lâminas foram, depois, incubadas da mesma forma, lavadas, secas e examinadas. Um resultado positivo era indicado pela presença de duas ou mais células intactas, exibindo o padrão específico de fluorescência: o citoplasma das células positivas aparecia envolvido à superfície com um manto de grânulos fluorescentes com uma cor verde-maçã brilhante. As amostras com fluorescência intra-nuclear ou extra-celular foram consideradas negativas.

3.3.3.Ensaio do painel respiratório viral xTAG

O RNA e o DNA foram extraídos com o extractor EasyMAG (bioMérieux), usando o protocolo genérico 1.0.6.. Por cada 200 µL de NPA, 20 µL de uma diluição de 10¯² do fago MS2 da Escherichia Coli (ATCC strain 15597-B1) no Universal Transport Medium (Copan) foi adicionado como um controlo interno. O volume de eluiçã foi estabelecido em 110 µL. Os extractos foram guardados a -80°C.

O ensaio do painel respiratório viral xTAG (Luminex Molecular Diagnostics) compromete os seguintes passos, todos os quais foram executados de acordo com as instruções do fabricante: dirigida a um alvo específico, transcrição reversa PCR; tratamento por exonuclease/fosfatase; dirigida a um alvo específico, extensão de um primer; direccionada a uma alvo específico, a hibridização dos amplicons (produto do PCR) para microesferas de fluorocromo marcadas; detecção dos amplicons no instumento Luminex IS 200. Para uma descrição detalhada do método, ver Merante e al.

A produção de ficheiros de arquivo, que consistem na mediana das intensidades das fluorescências de todos os vírus, sendo que os subtipos foram interpretados usando o TDAS RVP-I 1.10 software (Luminex Molecular Diagnostics).

Tabela 1…

4. Resultados4.1. Resultados da IF

Uns totais de 1122 espécimes de NPA estavam disponíveis para análise; 32 amostras foram rejeitadas por não serem adequadas. Os resultados da IF estão na Tabela 1.

4.1.1. Painel de triagem de IF para ADV, RSV, IFA, IFB, PIV 1-3 e HMPV

271 NPA foram positivos para RSV (24,1%), 36 para o ADV (3,2%), 32 para a IFA (2,8%), 28 para o PIV 1-3 (2,5%) e 10 para HMPV (0,9%). A co-infecção não foi observada.

4.1.2. IF-ENVPAN

241 (21,4%) de NPA de 220 pacientes tiveram resultado positivo. Uma dupla infecção com outro vírus respiratório (9 RSV, 1 ADV, 2 PIV 1-3, e 1 HMPV) foi encontrado em 13 amostras. O resultado foi inconclusivo em 12 espécimes devido a um fundo manchado não específico e a uma falta de aglomerado granular.

4.2. Resultados do painel respiratório viral xTAG

Um total de 243 NPA (143 IF-ENVPAN positivos e 100 negativos através das técnicas de IF-ENVPAN e do painel de triagem de IF) foi testado pelo xTAG PCR múltiplo. O confronto entre os resultados IF-ENVPAN/xTAG PCR múltiplo está na Tabela 2.

4.2.1.IF-ENVPAN positiva em NPA

O PCR múltiplo detectou picornavírus respiratórios em 139 (em 126 como o único vírus patogénico) dos 143 NPA positivos pelo IF-ENVPAN. Somente 4 NPA positivos pelo IF-ENVPAN foram negativos pelo múltiplo PCR. Devido à falta de material congelado, nós fomos incapazes de clarificar estas discrepâncias.

6 NPA com co-infecção (todos com RSV) têm suficiente material congelado e foram testados com xTAG PCR múltiplo. O PCR múltiplo confirmou o resultado de IF em todos os 6 NPA. O xTAG PCR múltiplo detectou uma dupla infecção em mais 7 espécimes (3 RSV, 2 PIV 4 e 2 PIV 3).

4.2.2.IF negativo em NPA

O xTAG PCR múltiplo detectou 41 picornavírus respiratórios, 5 RSV, 5 IFA, 4 coronavírus, 2ADV, 2 PIV4, 2 PIV3 e 2 HMPV em 56 fora dos 100 IF negativos em NPA. Vários vírus patogénicos foram detectados em 6 espécimes (5 amostras com dois e uma com três vírus respiratórios).

4.3. Análises estatísticas

O cálculo da sensibilidade e da especificidade do IF-ENVPAN comparado com o xTAG PCR múltiplo não foi possível por causa da diferenças nas amostragens entre IF-ENVPAN positivos e IF negativos em NPA, como descrito no plano de estudo. Comparado com o xTAG PCR múltiplo, o IF-ENVPAN mostrou um valor preditivo positivo de 97,2% e uma valor preditivo negativo de 59%.

5. Discussão

O nosso estudo avaliou um procedimento de IF para a detecção de picornavírus respiratórios em NPA. Com esta finalidade o IF-ENVPAN foi comparado com o xTAG PCR múltiplo. O PCR múltiplo detectou picornavírus respiratórios e 139 dos 143 IF-ENVPAN positivos em NPA, em 126 como o único vírus patogénico. O reconhecimento do padrão colorido positivo não apresentou qualquer dificuldade em particular para a equipa de laboratório. Somente 4 IF-ENVPAN positivos em NPA eram negativos usando xTAG PCR múltiplo. Infelizmente, os 4 espécimes discrepantes não puderam ser retestados devo à falta de material congelado. Além disso, o xTAG PCR múltiplo confirmou o resultado do IF em todos os 6 testado em NPA com RSV co-infecção. Portanto uma reacção cruzada de IF-ENVPAN com outros vírus respiratórios pareceu ser a mais improvável. Com base nos nossos resultados, nós consideramos o NPA que mostrava o padrão específico citoplasmático granular fluorescente, seguindo a coloração de IF-ENVPAN por ser verdadeiramente positiva para picornavírus respiratórios. O valor predicativo positivo de IF-ENVPAN comparado com o xTAG PCR múltiplo foi 97,2%.

Nem o IF-ENVPAN, nem o xTAG PCR podem distinguir entre enterovírus e rhinovírus. Testar com PCR específico enterovírus e rhinovírus ou a realização de estudos sequenciados seriam necessários para resolver esta incerteza. Contudo, é provável que tanto rhinovírus como enterovírus são parte de um espectro contínuo de vírus relacionados, que causam doenças relacionadas.

De um total de 1122 de NPA testados, 241 foram positivos pelo IF-ENVPAN para picornavírus respiratórios. Quando o IF é usado, os picornavírus respiratórios foram a segunda patogenia viral mais frequentemente detectada em NPA; o primeiro se somente para sujeitos mais velhos do que 1 ano. Os nossos dados de IF apoiam a suspeita de uma grande fequência de picornavírus respiratórios como patogenias virais como o descrito por outros autores.

xTAG PCR múltiplo detectou pelo menos uma patogenia viral (41 picornavírus respiratórios) em 56 dos 100 IF negativos em NPA; e foi, portanto, quando comparado com o IF, mais sensível para a detecção de vírus respiratórios, particularmente para os picornavírus respiratórios. Dada a grande variabilidade genética dos picornavírus respiratórios, é possível que a mistura de anticorpo monoclonal não reaja com todos os serotipos presentes. Por outro lado, o aumento da sensibilidade dos métodos moleculares comparada com o IF, para a detecção de vírus respiratórios não deve ser, somente, considerada como uma vantagem. Os picornavírus respiratórios têm sido detectados, também, por PCR em aproximadamente 20%

dos casos de falta de sintomas respiratórios. Além disso, pelo menos dois relatórios documentaram a recuperação de picornavírus respiratórios por PCR, nas duas a três semanas seguintes a uma doença respiratória aguda. Será que a detecção de ácidos nucleicos de picornavírus respiratórios representa a presença do vírus sem correlação com os sintomas clínicos actuais, a persistência do genoma do vírus, seguindo a infecção anterior ou uma infecção activa? Uma maior vantagem dos métodos de IF é, paradoxalmente, a sua relativa insensibilidade – tem que haver uma quantidade substancial de material viral presente para o resultado ser positivo. Um IF com resultado positivo correlaciona bem com uma infecção activa. Além disso, o IF é muito mais flexível e muito menos caro que os procedimentos moleculares: os resultados estão disponíveis durante muito tempo durante um dia (dentro de 2-4horas) e a preparação de novos espécimes pode começar enquanto os anteriores estão a ser completados. Por todas estas razões, o IF continua a possuir vantagens sobre o PCR, como o teste de primeira linha nos guias clínicos.

Resumindo, os nossos dados apoiam a utilização clínica da coloração através de IF-ENVPAN do NPA, para a detecção de picornavírus respiratórios, particularmente em bebés e crianças. A adição do IF-ENVPAN para triagem IF, segmentação de ADV, RSV, PIV, IFA, IFB e HMPV, proporcionará um diagnóstico mais completo de infecções de vírus respiratórios.