CENTRO FEDERAL DE EDUCAO TECNOLGICA DE MINAS GERAIS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MATERIAIS

CURSO DE ENGENHARIA DE MATERIAIS

ERIKA ALCNTARA

LUCAS MEDEIROS

MATHEUS MARTINS

COLGENO ADSORVIDO EM SUPERFCIE DE TITNIO

BELO HORIZONTE

2015

1 Introduo

As propriedades do titnio para aplicaes em biomateriais so bastante

conhecidas e estudadas. O uso do titnio em aplicaes ortopdicas e dentais deve-se as

propriedades de boa interface entre osso e material, alm da j conhecida

osteointegrao promovida pelo mesmo. No entanto, o uso de tcnicas de modificao

de superfcie no titnio uma rea que ainda demanda estudos e um campo que tem

ainda muito que ser explorado. Com a modificao da superfcie do titnio torna-se

possvel uma acelerao do processo de regenerao ssea, podendo diminuir a

morbidez do paciente e prejuzos financeiros (MORRA, 2003)

Atualmente tm-se trs tipos de modificaes nas superfcies de biomateriais de

titnio, sendo eles: fsico-mecnico, bioqumico e morfolgico, sendo o ltimo o mais

amplamente utilizado. O mtodo bioqumico tem se mostrando uma alternativa

interessante, baseado na liberao de protenas ou enzimas que induziriam uma resposta

das clulas e tecidos. Dentro desse contexto o colgeno se mostra como uma molcula

de extrema importncia, uma vez que est associada a uma mais rpida regenerao

ssea (MORRA, 2003)

Biomateriais de Titnio com colgeno na superfcie foram estudados e

comprovou-se que os mesmos propiciam uma maior distribuio de osteoblastos e mais

rpida adeso de clulas do que o material sem revestimento (MORRA, 2003)

2 Metodologia

2.1 Produtos Qumicos

Folhas de titnio (0,125 mm de espessura, 99,7%), cido acrlico, propileno, N-

(3 dimetilaminopropil) N-etilcarbodiimida hidrocloridrato (EDC), N-

hidroxissuccinimida (NHS) foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich. Para as

experincias de ATR-IR, foram usadas pelculas muito finas de Ti (99,98%, 0,025 mm

de espessura, Sigma Aldrich), para melhorar o contato com o cristal ATR devido

flexibilidade da amostra.

O colgeno (KNC Semed S p de colgeno) foi fornecido a partir de Kensey

Nash (Lot. No. 24903). Este basicamente colgeno do tipo I bovino.

2.2 A modificao da superfcie

2.2.1 Deposio de plasma

A deposio de plasma foi realizada num reator de placas paralelas acopladas

capacitivamente colocadas dentro de uma sala limpa de uma classe 10.000. As amostras

foram localizadas no eletrodo aterrado watercooled. Tanto o reator e os eletrodos so

feitos de ao inoxidvel. O volume do reator de cerca de 3 dm3 e a distncia entre os

eletrodos de 5 cm. Foram utilizados os seguintes tratamentos: 1 min plasma de ar, 50

W, taxa de fluxo de 20 sccm (passo de limpeza), seguido de deposio de plasma

propileno por 5 min, 50 W, taxa de fluxo de 100 sccm (taxa de fluxo controlada por

um controlador de fluxo de massa MKS) (etapa de deposio).

Algumas amostras foram utilizadas para a avaliao da espessura da camada

enxertada de cido acrlico. Para esse efeito, aps a deposio de plasma, uma mscara

feita por uma folha de ao inoxidvel com furos redondos de 40 mm de dimetro foi

suavemente pressionada sobre a amostra de titnio. A amostra mascarada foi colocada

no reator de plasma e um tratamento de condicionamento foi realizado para remover a

camada de depsito de plasma a partir das reas expostas (plasma de ar, 10 min 100 W).

2.2.2 Enxerto de cido acrlico

Aps a deposio, as amostras tratadas foram submetidas enxertia de cido

acrlico. Em particular, o enxerto foi executado a partir de uma soluo a 40% de cido

acrlico aquoso. A soluo foi misturada suavemente utilizando uma barra de agitao

durante 2 min. Neste ponto, de argnio(Ar) foi suavemente borbulhado na soluo

durante 10 min, e depois 3% de uma soluo cida de nitrato de crio amnio foi

adicionado, sem interromper o Ar. A soluo foi misturada enquanto se borbulhava

durante mais 2 minutos, e em seguida foi cuidadosamente vertida em tubos de ensaio,

contendo as amostras de plasma depositado. A enxertia foi realizada durante 45 min,

temperatura ambiente. No final a reao de enxerto, as amostras foram enxaguadas em

gua durante a noite. Plasma depositado, amostras de cido acrlico enxertado sero

codificadas por AATi.

2.2.3 Acoplamento de Colgeno

As amostras AATi foram ainda submetidos a acoplamento de colgeno. O

acoplamento foi realizado como se segue: amostras AATI foram imersas num colgeno

a 0,5%, soluo aquosa de cido actico a 1%. Depois de 2 h, as amostras foram

removidas da soluo e lavadas vrias vezes em 1% de cido actico aquoso, para

remover o excesso de colgeno adsorvido. Aps lavagem, as amostras foram imersas

em gua contendo 0,25% de EDC e 0,25% NHS, ambos da Sigma, e mantidas durante a

noite em soluo deste acoplamento. Aps o acoplamento, todas as amostras foram

cuidadosamente lavadas com 1% de cido actico aquoso e gua, depois secadas sob um

exaustor. As amostras de colgeno acopladas sero codificada por ColTi.

2.2.4 Caracterizao superfcial

Anlise XPS foi realizada com um sistema de Perkin Elmer PHI ESCA 5500. O

instrumento est equipado com uma fonte de raios-X monocromticos (nodo Al Ka)

operando a 14 kV e 250 W. O dimetro do ponto analisado de aproximadamente 400

m, a presso de base 10-8

Pa. O ngulo entre o analisador de eltrons e a superfcie da

amostra foi de 45. Quantificaes dos elementos foram realizadas utilizando o software

e de fatores de sensibilidade fornecidos pelo fabricante.

2.2.5 ATR-IR

Espectros ATR-IR foram obtidas utilizando um Mattson Research Series

Spectrometer. Os espectros foram obtidos usando uma resoluo 4 cm-1

e um 45

Cristal Ge. Usando este arranjo, a profundidade de amostragem analtica na regio do

espectro da carbonila de cerca de 300 nm. As amostras foram prensadas contra o

cristal usando MiniGrip (Thermo Spectra-Tech). Os dados apresentados so calculados

a partir de 256 espectros.

2.2.6 Anlise AFM

A anlise AFM foi realizada utilizando um AFM Nanoscope III pela Digital. As

medies foram realizadas tanto em ar e em solues aquosas. Uma ponta de nitreto de

silcio convencional foi utilizada nestas experincias. A da ponta da mola constante,

conforme avaliado pelo produtor, de 0,06 N / m. As imagens foram obtidas no modo

de contato. O modo de tipo Altura de foi usado, que so dados correspondentes

variao na altura piezo necessria para manter o arco de deflexo constante. A fim de

reduzir os danos da superfcie das amostras pelo arco da ponta, a fora foi

constantemente monitorizada e minimizada usando o software de controle de

instrumento. As imagens foram constantemente monitoradas para detectar efeitos

devido ao arco da ponta ''arar'' a superfcie da amostra. Em nenhum dos casos foram

observados tais efeitos.

Dados de rugosidade foram calculados a partir das imagens usando o software

do aparelho. T-testes Student foram realizadas para determinar as eventuais diferenas

entre os dados, conforme relatado na seo relevante.

Curvas fora-distncia em soluo aquosa foram obtidas utilizando o fluido

celular fornecido pela Digital. Na medio da fora a amostra movido continuamente

para cima e para baixo. Deformao da posio do arco e altura da amostra so

gravadas. A fora obtida multiplicando a deflexo do cantilever vezes o seu constante

da mola. Neste caso, a constante pela multiplicao dos tempos da deflexo do arco sua

constante da mola. Neste caso, a constante de mola no foi medida e foi utilizado o

valor sugerido pelo produtor, mas isto no afeta o significado dos dados.

As medidas foram repetidas usando o mesmo arco para todo o conjunto de

amostras, e repetido para confirmar que os valores obtidos no foram afetados pelo

desgaste ou outros efeitos inesperados sobre a ponta. As diferenas entre os dados

obtidos com a mesma amostra em diferentes momentos no foram significativas, e a

mesma tendncia geral entre diferentes amostras foi detectado.

Para obter curvas de fora versus distncia, a deflexo do arco deve ser subtrada

posio do scanner piezo. O ponto de distncia zero foi determinado a partir da parte

linear da linha de contato. Curvas de fora versus posio de varredura foram

registradas continuamente com uma frequncia tpica de cerca de 1 Hz, o comprimento

de varredura foi de 200 nm. Foram registradas um mnimo de 20 curvas em cinco

regies diferentes da cada amostra.

2.3 Testes biolgicos

2.3.1 Materiais

As amostras utilizadas para estudos in vitro e implantes intramusculares so

mostrados na Fig. 1. Eles foram obtidas a partir de 2 milmetros de espessura de placas

Ti (99,7%, Aldrich). O tamanho das amostras de 10 x 3 x 2 mm. A fotografia foi

tirada aps colorao com azul de toluidina das amostras. O controle de Ti (Ti

codificados nos seguintes), esquerda, no levou o corante, enquanto o revestido de

colgeno Ti (ColTi na seguinte) sim, e parece mais escura na fotografia. Antes de azul

de toluidina, as amostras so indistinguveis. Amostras foram homogeneamente

revestido de todos os lados.

Parafusos para estudos de implantes sseo foram obtidos a partir cpTi, grau 2.

Eles so mostrados na Fig. 2, tambm neste caso aps colorao com azul de toluidina,

para mostrar a homogeneidade do revestimento (ColTi est direita). O dimetro dos

parafusos s de 2 mm. Nenhum pr-tratamentos que visam a modificao da topografia

da superfcie dos parafusos foi realizada. Ou seja, a partir de um ponto de vista

morfolgico, as superfcies investigados pertencem classe maquinado.

Fig. 1 - Fotografia das amostras utilizadas para estudo dos implantes musculares e celular. As

amostras so coradas com azul de Toluidina para mostrar o homogeneidade do revestimento em

ColTi ( direita).

Fig. 2 - Fotografia dos parafusos usados para implantes sseos. As amostras so coradas com azul

de Toluidina para mostrar o homogeneidade do revestimento na ColTi ( esquerda).

2.3.2 Testes de citotoxicidade

A citotoxicidade foi avaliada pelo mtodo de contato direto, utilizando a linha

celular de fibroblastos contnuos de ratos L-929. Meio de cultura celular experimental

(Sigma, Milo) foi Minimum Essential Eagles Medium sem l-glutamina, 10% de soro

fetal de bovino, estreptomicina (100 mg / l), penicilina (10 U / ml), 2 mmol / l de L-

glutamina em frasco plstico de cultura de 250 ml (Falcont). As clulas so cultivadas a

37 C numa incubadora umidificada equilibrada com 5% de CO2. Os fibroblastos foram

colhidos antes da confluncia por meio de uma soluo estril de tripsina-EDTA

(tripsina a 0,05, 0.02 de EDTA em soluo salina tamponada com fosfato normal, pH

7,4) a partir dos frascos de cultura, ressuspendidas em meio de cultura celular

experimental, e diludas para 1x105 clulas / ml, 3,5 ml de suspenso de clulas

semeadas em 6 culturas em placas de tecidos de poliestireno (9,6 cm2 de rea de

crescimento; Falcont), contendo as amostras. Aps 3 dias de crescimento a 37 C, 5%

de CO2 num incubador humidificado, a sequncia de avaliaes peridicas foram

realizadas:

(1) morte celular e morfologia das clulas. A monocamada de clulas em torno das

amostras foi observada por em microscpio invertido (DM IL, Leica). A fronteira entre

as amostras e as monocamadas de clulas foi cuidadosamente controlada, para verificar

se a liberao das amostras resultou na morte celular ou a reduo em nmero. Assim, a

morfologia das clulas foi cuidadosamente controlada e comparada com resultados

obtidos com o controle negativo (isto , as clulas cultivadas em tecido de poliestireno

com um lingote de ouro dentro, mesmo tamanho das amostras experimentais). O

controlo positivo foi obtido a partir do lingote a uma liga Ni-Cu-Al, o mesmo tamanho

que a amostra experimental.

(2) atividade biossinttica. O ensaio MTT foi utilizado para avaliar clulas sadias por

meio da sua atividade biossinttica. Este teste mede a atividade succinato desidrogenase

(SDH) de clulas aps 72 horas de contato com as amostras. SDH uma enzima chave

do ciclo de Krebs (ou seja, o ciclo de cido ctrico), e a sua avaliao por meios

bioqumicos comumente usado para verificar as clulas sade.

Resumidamente, no final de 72 h de contato, as clulas foram lavadas com PBS

estril e em seguida o PBS foi substitudo com 2 ml / poo de soluo de MTT (brometo

de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil brometo de tetrazlio) succinato de sdio. A

soluo de MTT e clulas foram incubadas a 37C durante 3 h na incubadora. Durante

este tempo, a soluo de MTT amarela transformado por desidrogenase das clulas

mitocondriais em azul de formazano insolvel. Ao medir a quantidade de formazano

produzido, possvel medir a atividade mitocondrial, e, como consequncia, a

viabilidade celular. No final do perodo de incubao, a soluo de MTT foi removida e

substituda com 2 ml / poo de uma 6,25% v/v 0,1 mol/L NaOH em dimetilsulfxido, a

fim de dissolver o formazano. Os poos rodaram por 5 minutos at que a cor roxa

ficasse uniforme e a absorvncia foi avaliada a 560 nm. Os valores de absorvncia

obtidos foram em mdia, e a mdia foi expressa como a percentagem do controle

negativo (que, por definio, 100%).

2.3.3 O crescimento de clulas semelhantes a osteoblastos e atividade de fosfatase

alcalina

Osteoblastos como as clulas SaOS-2 foram utilizados nas experincias de

crescimento celular. O meio experimental de cultura de clulas (Biochrom KG, Berlim)

consistiu de Minimum Eagles Medium sem L-glutamina, 10% de soro fetal de bovino,

estreptomicina (100 mg / l), penicilina (100 U / ml), e 2 mmol / l de l-glutamina em

frasco de cultura de plstico de 250 ml (Corningt). As clulas foram cultivadas a 37C

numa incubadora umidificada equilibrada com 5% de CO2. As clulas foram colhidas

antes da confluncia por meio de uma soluo estril de tripsina-EDTA (tripsina 0,5 g /

L, 0,2 g / L de EDTA em soluo salina tamponada com fosfato normal, pH 7,4),

ressuspendidas em meio de cultura celular experimental, e diludas a 1x105 clulas / ml.

Para experincias, 5 ml da suspenso de clulas foram semeadas em placas de 6 poos

de cultura de tecidos de poliestireno (9,6 cm2 de rea de crescimento; Falcont),

contendo as amostras. Experimentos foram realizados lobisomem triplicado.

Em intervalos de tempo selecionados (1 dia, 4 dias e 10 dias), o nmero de

clulas na amostra foi avaliado. Resumidamente, as amostras foram removidas dos

recipientes, enxaguadas com PBS e colocados em uma outra placa de multi-poos.

Clulas foram colhidas a partir da superfcie das amostras de superfcie por tripsina e

contadas num hemocitmetro.

A medio da atividade da fosfatase alcalina foi realizada aps 10 dias de

crescimento como se segue: amostras foram enxaguadas com PBS e transferidas para

uma nova placa de multi-recipientes. Um ml de soluo de lise (0,2% de Triton X-100,

Sigma)foi adicionado a cada amostra. Depois disso, os lisados foram incubados durante

2 h a 37 C com 1 ml da soluo de mistura de substratos de enzima, contendo 1 mM

MgCl2 x 6H2O, 1.5 mM 2-amino-2-metil-1-propanol e 20 Mm, p-nitrofenilfosfato. A

reao parou com 1 ml de 1N NaOH. A atividade enzimtica foi medida pela leitura

das amostras a um comprimento de onda de 405 nm usando um leitor de microplacas

Tecan Genios. As leituras obtidas posteriormente foram comparadas com os valores

medidos em uma curva padro, obtida pelas medies de soluo-padro de p-

nitrofenol.

A atividade especfica da fosfatase alcalina foi obtida por ratioing dos dados

anteriores para a concentrao total de protena, obtida pelo mtodo de Bradford e

usando uma curva de calibrao baseada em solues-padro de albumina de soro

bovino (Sigma). Amostras foram lidas a 595 nm, utilizando o mesmo leitor micro placa,

conforme descrito acima.

2.3.4 Estudos in vivo

Todo o estudo in vivo foi realizada seguindo a lei europeia e italiana em

experimentos com animais e de acordo a Garantia do Bem-Estar Animal No. # A5424-

01 pelo Instituto Nacional de Sade (NIHRockville, MD, EUA). O protocolo

experimental foi enviado ao Ministrio da Sade italiano.

Onze coelhos adultos, do sexo masculino, pesando 3.250 0.350 foram usados

(Charles River, Calco, Lecco, Itlia). Coelhos foram aclimatados por 10 dias e se

mostraram saudveis e livres de imperfeio antes da admisso no estudo. Os animais

foram mantidos em gaiolas individuais em um T de 20 0,5 C, a taxa de umidade de

55 10% e gua e comida espontaneamente (Mucedola, Settimo Milanese, Milano,

Italia).

Os implantes foram colocados em estril aps barbear e desinfeco com

soluo de betadine. A anestesia geral foi induzida com injeco de 44 mg / kg de

cetamina (100 Ketavet, Farmaceutici SpA Gellini, Aprilia Lt, Itlia) e 3 mg / kg de

xilazina (Rompun, Bayer AG, Leverkusen, Alemanha), e ventilao assistida (O2: 1 l /

min; N2O: 0,4 l / min; isofluorano: 2,5-3%). No ps-operatrio os animais foram

verificados diariamente, isolando as feridas at a retirada de pontos. A terapia com

antibiticos (cefazolin, 100 mg / kg) foi administrada no pr-operatrio, que,

imediatamente aps a cirurgia e aps 24 h. Analgsicos (cloreto de metamizole, 50 mg /

kg) foram prescrito no ps-operatrio imediato. A sade dos animais foi avaliada

durante todo o estudo por um veterinrio. No final dos protocolos experimentais os

animais foram sacrificados por eutansia sob anestesia geral com administrao

intravenosa farmacolgica de Tanax (Hoechst, Frankfurt am Main, Alemanha).

2.3.5 Implantes intramusculares

Cinco coelhos foram utilizados para o implante intramuscular de 10 placas de Ti

e ColTi. Duas espcimes foram inseridas de cada lado do animal cirurgicamente com o

longo eixo paralelo s fibras musculares e em mais de 25 mm a partir da linha mdia e

para alm de um ao outro como sugerido pela International Standard Organization. As

placas de controle (Ti sem revestimento) foram implantadas no lado esquerdo, enquanto

placas experimentais (ColTi) no lado direito. Uma inciso longitudinal foi feita atravs

da pele na regio dorso-lombar. A pele se separou da fscia. Subsequentemente, a

fscia1 foi dissecada e uma pequena inciso foi feita na a barriga do msculo. Locais de

implantao foram criados para mais separaes das fibras musculares, com dissecao

com tesouras arredondadas. Aps a insero dos implantes, a inciso do msculo no

foi suturada para evitar efeitos secundrios material de sutura. A pele foi suturada com

pontos no-absorvveis. Aps 12 semanas os animais foram sacrificados e o implante

com um suficiente tecido circundante (cerca de 2 cm) no afetado foi removido para

avaliar a resposta biolgica local.

1 uma bainha fina de tecido fibroso, que encerram um msculo ou outro rgo.

2.3.6 Implante sseo

Seis coelhos foram utilizados para implantao ssea. O fmur middiaphyses foi

exposto e dois defeitos com um dimetro de 1,9 mm foram perfurados em baixa

velocidade e sob irrigao salina contnua no osso cortical do fmur direito e esquerdo.

Parafusos controle de Ti no revestidos foram transversalmente implantados nos

fmures esquerdos de todos os coelhos, enquanto parafusos ColTi foram posicionado

nos fmures direitos, at um total de 12 implantes corticais para cada material.

Finalmente, a pele foi suturada em duas camadas. Quatro semanas aps a cirurgia, os

animais foram sacrificados. Os fmures foram retirados, limpos dos tecidos moles e

preparados para histomorfometria.

2.3.7 Histologia e histomorfometria

Bipsias dos tecidos moles e duros foram fixadas em 4% paraformaldeido

tamponado durante 7 dias para o processo de descalcificao ssea. Em seguida, as

amostras foram desidratadas em sries graduais de lcoois at a absoluta (50%, 75%,

95% e 100% durante 24 horas para cada concentrao). Finalmente elas foram

incorporadas em metacrilato de metila. Blocos foram seccionados ao longo de um plano

paralelo ao eixo longo dos implantes e uma srie de seco de cerca de 1020

milmetros, espaadas por 200 m de distncia, foi btida com um diamante Leica 1600

micrtomo de vista (Leica 1600 Leica SpA, Milano, Italia). Eles foram diludos para

cerca de 10 2 m e 30 2 m (msculos e ossos, respectivamente) por um polidor

Exact (Bioptica, Milano, Itlia). Para cada amostra, trs fatias foram examinados, aps

colorao de hematoxilina eosina (implantes musculares) e Fast Green-cido Fucsina

(implantes sseos). A histomorfometria foi realizada por Axioscop (Carl Zeiss GmbH,

Jena, Alemanha), conectado por uma cmera de vdeo atravs de um computador

pessoal equipado com o software Kontron KS 300 (Kontron eletrnicos, GmbH, em

Eiching Munchen, Alemanha). Como a medida do implante muscular est em causa, a

avaliao envolveu a presena e a espessura da cpsula fibrosa, inflamao,

degenerao, necrose e a natureza das clulas na interface implante-tecido. Por

histomorfometria, os seguintes parmetros foram medidos: presena da cpsula fibrosa

em torno do implante (comprimento do permetro ocupado por cpsula / permetro total

da amostra x 100) e a espessura da cpsula. O ltimo foi medido em 16 locais diferentes

ao longo do permetro da amostra (cinco locais ao longo do lado mais comprido, trs ao

longo do lado curto da amostra).

Para avaliar a interface osso-biomaterial e osteointegrao, as seguintes medidas

histomorfomtricas foram realizadas:

Contato osso-implante: fracional, extenso linear de osso aposto superfcie do

implante dividido pelo permetro da superfcie total do implante x 100;

Crescimento sseo (BI): quantidade de osso na rea delimitada pela superfcie

roscada e uma linha ligando a parte superior dos roscas, dividida pela rea total

do segmento x 100. Este valor foi calculado para todos as roscas de cada

implante e foi ento comparada com a sua imagem no espelho (rea de espelho)

(MA).

Cada medida foi tomada semi-automaticamente a um aumento original de x 40

por um investigador cego experiente.

Os dados so apresentados como mdia desvio padro.

2.3.8 Anlise estatstica

A anlise estatstica foi realizada atravs do software SPSS V.10.1 (SPSS / PC

Inc., Chicago, IL). Os dados so apresentados como mdia SD em um nvel de

significncia de p < 0.05. Depois de verificar a distribuio normal e homogeneidade

das varincias, os testes t de Student emparelhados foram utilizados para comparao de

dados entre os parafusos de Ti e ColTi.

3 Resultados

3.1 Anlise XPS

O mtodo de XPS (Espectroscopia Fotoeltrica de Raios-X) foi usado para

determinar a composio da camada superficial das amostras. A superfcie de titnio

coberta por uma fina camada de xido (com espessura aproximada de 4nm). A mxima

concentrao de titnio puro no material de 33%. O restante costuma ser de xido

(sendo o xido de titnio - TiO2 - o mais estvel deles). Contaminaes com

hidrocarbonetos do meio juntamente com impurezas derivadas dos processos realizados

anteriormente no maquinrio aumentam significativamente a presena de carbono.

Diversas literaturas consideram que a presena de 15% de titnio puro indica uma

superfcie limpa.

Tabela 1 - Composio das superfcies de diferentes amostras.

Observaes:

AATi (enxerto com cido acrlico): presena de grupos

carboxlicos com cido acrlico.

ColTi (Ti ligado ao colgeno): no h sinal da subcamada de

titnio e ocorreu a homogeneizao da cobertura do substrato

3.2 ATR-IR

Vale ressaltar que a qualidade do espectro gerado pelo ensaio ATR-IR

(Espectroscopia no Infravermelho de Refletncia Total Atenuada) no muito boa,

devido dificuldade de obter o espectro confiante, para uma camada to fina de metal

opaco, como o caso estudado.

Os ensaios foram feitos com dois ph diferentes: 3 e 7.

Fig.3 Espectro de ATR-IR de amostras do tipo AATi.

Observaes na figura: cido acrlico protonado e ionizado.

Apesar da imobilizao induzida pela superfcie enxertada, a camada de cido

poliacrlico mantm sua atividade cida-bsica. Aps o acoplamento de colgeno,

bandas feitas de grupos carboxlicos so substitudas por bandas tpicas de amida, como

esperado.

3.3 AFM

A primeira informao buscada a partir da anlise de AFM a avaliao da

espessura da camada enxertada.

A efetividade do processo foi confirmada pelo tingimento por toluidina. Tal

substncia azulada somente se adere regio recoberta. Desta maneira, as partes sem o

recobrimento permanecem com sua colorao original.

Alguns detritos podem ser encontrados dentro do buraco analisado na figura que

se segue, ou na regio prxima a ele, que podem ser devido a pequenas pores de cido

acrlido homopolimerizado, que no foram completamente removidos pela limpeza

rotineira. A rea distante e fora do buraco muito mais plana e homognea.

A figura 4 apresenta a anlise da seo atravs de um dos buracos obtidos. Ela

apresenta tambm o perfil da altura ao longo da linha preta desenhada sobre a imagem.

As setas so uma referncia para as medidas, que representam a avaliao da espessura

da camada enxertada, que justamente a distncia vertical entre as duas setas, de

aproximadamente 117nm.

Fig. 4 Anlise da seo da amostra de AATi

Em relao Figura 5, verificou-se que em 5a no houve modificao

significativa na morfologia da superfcie. Em 5b, verificou-se uma superfcie tpica

enxertada com hidrogel. J em 5c, percebeu-se significativa mudana morfolgica. Em

suma, vale ressaltar que o AFM pode detectar, claramente, diferenas entre a

morfologia superficial das amostras.

Fig. 5 Imagens de AFM mostrando a morfologia superficial

A Tabela 2 mostra o efeito do meio ambiente na rugosidade superficial,

calculado por meio de software.

Tabela 2 Valores de rugosidade no ar

3.4 Testes de citotocidade

O contato direto entre clulas L-929 e amostras de Ti e ColTi no provocou

nenhum efeito de averso a nvel de microscopia tica.

A Tabela 3 apresenta os resultados de testes por MTT, expressos em porcentagem de

controle negativo. Ti e ColTi no apresentaram diferenas significativas.

Tabela 3 Resultados de testes de MTT

Fig. 6 Fotografia de microscpio tico mostrando resultados de ensaio de

citotoxicidade

3.5 Crescimento de clulas SAOS-2 e atividade de fosfatase alcalina

O nmero de clulas na superfcie das amostras em funo do tempo mostrado

na Grfico 1. No primeiro dia, no h diferena significativa, mas aps um tempo

maior, percebe-se grandes diferenas, explicadas pela variao da estrutura superficial

entre as amostras analisadas. Os resultados relacionados fosfatase alcalina remetem,

obviamente, ao grande nmero de clulas na amostra de Ti.

Grfico 1 Resultados de experimentos com crescimento de clulas de SaOS-2.

3.6 Experimentos in vivo

Todos os animais toleraram bem as cirurgias e sobreviveram sem nenhuma

complicao clnica at o final do tempo de experimentos. Radiografias confirmaram as

boas localizaes dos implantes. A nveis macroscpicos, durante a autpsia dos

animais, no houve sinal de inflamao, infeco grosseira, nem danos aos tecidos,

observao feita ao redor dos implantes, tanto em tecidos macios quanto rgidos.

3.7 Implantes no msculo

Aps 12 semanas do implante, a observao histolgica no revelou nenhuma

inflamao remanescente ou detritos de material proveniente do implante. Ambos os

materiais induziram o crescimento de cpsula fibrosa de espessura varivel, com as

fibras orientadas paralelamente interface do implante. No se verificou nenhuma

diferena significativa entre os parmetros das duas amostras analisadas.

Fig.7 Resultados dos experimentos de implante intramuscular

3.8 Implantes sseos

O parafuso de ColTi mostrou maior percentual de contato com o osso

circundante, quando comparado ao Ti no revestido. A semelhana entre os valores da

rea espelhada indicam a homogeneidade do implante no osso. Os valores da Tabela 4

mostram o benefcio do revestimento de colgeno na matriz de titnio.

Fig.8 Resultados de experimentos de implante no osso

Tabela 4 Resultados de experimentos histomorfomtricos

4 Discusso

Dentro das avaliaes biolgicas o teste de citotoxicidade, resultou na no

presena de efeitos adversos bem como no houve liberao de produtos no esperados;

tambm dentro das avaliaes biolgicas no se constatou clulas inflamatrias e

tecidos necrosados em 12 semanas, com teste de implante muscular. Houve formao de

cpsula fibrosa, no diferente da amostra teste. Divergindo de outros estudos que no

houve formao de cpsula fibrosa (MORRA, 2003)

Estudos in vitro tambm mostraram uma reduo no crescimento de clulas

osteoblastas do ColTi comparado ao Titnio, diferente do que foi mostrado em outros

estudos. Tal diferenciao pode ser pelo modelo que se conta as clulas osteoblastas. J

nos estudos in vivo constatou-se resultados positivos, com maior interao entre osso-

implante e maior crescimento sseo do que o implante de Titnio (MORRA, 2003)

Algumas hipteses para o aumento da taxa de reconstituio ssea so:

I. O notrio papel do colgeno na diferenciao de clulas sseas,

mineralizao ssea e reconstituio ssea;

II. Ativao plaquetria do colgeno e liberao de fatores de crescimento das

plaquetas ativadas (MORRA, 2003)

5 Concluso

O titnio foi substitudo por um material com superfcie homognea de

colgeno. O mais importante que o teste in vivo traz uma perspectiva interessante para

essa nova classe de material, uma vez que demonstrou maior interao osso-implante e

maior crescimento sseo, sendo, portanto uma alternativa a uma recuperao mais

rpida.

Referncias bibliogrficas

MORRA, M. et. al. Surface engineering of titanium by collagen immobilization.

Surface characterization and in vitro and in vivo studies. In Biomaterials 24, 2003,

p. 46394654.