1.3- QUÍMICA E BIOQUÍMICA

MICROBIANAMICROBIANA

1

I.3- Química e Bioquímica Microbiana

I.3.1- Introdução

� Organismos vivos (microrg.) classificados:

� “máquinas químicas” são feitos de compostos

químicos e vivem por meio de reações químicas

ocorrem sob a ação de uma enzima específica.

2

a capacidade de desenvolverem uma infinidade de enzimas

capazes de se adaptar às mudanças necessárias que a célula

microbiana solicita à medida que o ambiente sofre variações.

3

� Como toda a matéria:

� organismos vivos contêm átomos e moléculas como suas

unidades estruturais básicas.

� A forma como estes átomos e moléculas interagem:� A forma como estes átomos e moléculas interagem:

� determinam as qualidades fundamentais dos compostos

(solubilidade e acidez).

4

� Os compostos orgânicas biologicamente importantes nos

organismos vivos são :

� carboidratos;

� lípideos;

� proteínas;� proteínas;

� ácidos nucleicos.

5

1) Carboidratos:

� açúcares e amido são fontes primárias de energia nas

células.

� alguns carboidratos também são encontrados nas paredes

celulares microbianas, enquanto outros servem como fonte

de reserva nutritiva e atuam como precursores dede reserva nutritiva e atuam como precursores de

proteínas, lípideos e ácidos nucléicos.

� Fórmula geral: (CH2O)n

Estruturas simples

(monossacarídeos= açúcares simples/ 6 carbonos –hexoses= glicose, glactose e frutose)

Estruturas complexa (grande número de moléculas)/ligação de 2 ou mais monossacarídeos/ lactose (2monossac= galactose +glicose) e sacarose(glicose+frutose) 6

� Polissacarídeos (grande número de monossacarídeo)- não

são solúveis em água:

• são importantes na estrutura das células e no

armazenamento de energia.

• Ex: dextrana, sintetizada por bactérias e utilizada em• Ex: dextrana, sintetizada por bactérias e utilizada em

substituição do plasma sanguíneo e celulose encontrada

nas paredes celulares de plantas e da maioria de algas.

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2) Lípideos:

� solúveis em solventes apolares (acetona, clorofórmio, éter

ou benzeno/insolúvel em água;

� Classes: triglicerídeos, fosfolípídeos e esteróis;

a) Triglicerídeos: as gorduras são lípideos simplesa) Triglicerídeos: as gorduras são lípideos simples

constituído de 2 grupamentos: glicerol (C3H8O3) e ácidos

graxos (CH3(CH2)n-COOH).

• Os grupamentos hidroxila (-OH), que são polares, tornam o

glicerol solúvel em água.

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b) Fosfolípideos: os lipídeos complexos são componentes

importantes de membranas celulares.

Ex: uma única célula da bactéria Escherichia coli contém

22.000.000 de moléculas de fosfolipídeo em sua

membrana.

• Os fosfolipídeos diferem dos triglicerídeos em dois• Os fosfolipídeos diferem dos triglicerídeos em dois

aspectos:

� somente duas moléculas de ácidos graxos estão ligados a

molécula de glicerol;

� e um grupo fosfato está ligado ao glicerol.

9

10

c) Esteróis:

� É altamente apolar e consiste principalmente de vários

anéis constituídos de átomos de carbono ligados entre si.

� O composto colesterol é um componente normal de

algumas membranas.

11

�Certas drogas antifúngicas combinam

com os esteróides nas membranas dos

fungos e eventualmente matam as células.

3) Proteínas:

� em termos de peso, as proteínas ultrapassam os lipídeos e

carboidratos na célula;

� em termos de função apresentam múltiplas tarefas;

� algumas podem ser enzimas, os agentes catalíticos que

12

� algumas podem ser enzimas, os agentes catalíticos que

controlam todos os processos bioquímicos;

� outras podem fazer parte da estrutura da célula, como o

flagelo;

� podem controlar o transporte de nutrientes através da

membrana;

� as toxinas liberadas pelas células bacterianas são

proteínas;

� são compostas de muitas moléculas de aminoácidos

13

ligadas entre si formando a cadeia;

� todas as proteínas, independentemente de sua função ou

espécie de origem, são construídas a partir de um conjunto

básico de vinte aminoácidos, arranjados em várias

seqüências específicas.

� exercem funções diversas, como:

- Catalisadores;

- Elementos estruturais (colágeno) e sistemas contráteis;

- Armazenamento (ferritina);

- Veículos de transporte (hemoglobina);

- Hormônios;

14

- Anti-infecciosas (imunoglobulina);

- Enzimáticas (lipases);

- Nutricional (caseína);

- Agentes protetores.

4) Ácidos Nucléicos:

� a descoberta das substâncias químicas que carregam a

informação genética nas células foi um marco:

microbiologistas americanos- Oswald Avery, Colin Macleod

e Maclyn McCarty identificaram os ácidos

desoxirribonucléico (DNA);

15

desoxirribonucléico (DNA);

� DNA substância responsável pelas características

hereditárias dos organismos vivos.

� Os trabalhos de James Watson, Francis Crick, Rosalind

Franklin e Maurice Wilkins resultaram na compreensão da

aparência física do DNA, bem como seu funcionamento.

� O DNA e uma outra substância, inicialmente encontrada

16

nos núcleos das células, o ácido ribonucléico (RNA), são

denominados de ácidos nucléicos.

1.3.2- Fonte de carbono:

� O carbono é um elemento essencial necessário ao

crescimento microbiano.

� Todos os organismos requerem carbono de alguma forma;

� Os compostos orgânicos são aqueles que contem carbono,� Os compostos orgânicos são aqueles que contem carbono,

enquanto os compostos inorgânicos são os que não contém

(exceção CO2 inorgânico);

17

� O carbono forma o esqueleto das três maiores classes de

nutrientes: carboidratos, lipídeos e proteínas;

� Tais compostos fornecem energia para o crescimento das

células e servem como unidade básica do material celular.

� Entre os microrganismos há duas categorias de acordo com� Entre os microrganismos há duas categorias de acordo com

as suas necessidades nutricionais:

- autotróficos;

- heterotróficos.

18

� autotróficos:

- usam carbono inorgânico na forma de dióxido de carbono

(CO2) como única ou principal fonte de carbono.

� Estes microrganismos podem ser cultivados num meio de

cultura só com compostos inorgânicos, pois não necessitam decultura só com compostos inorgânicos, pois não necessitam de

compostos orgânicos e podem ser inibidos por eles.

Ex: Cianobactérias

19

� heterotróficos: usam compostos orgânicos como principal

fonte de carbono.

� Estes microrganismos não podem ser cultivados num meio

só com compostos inorgânicos, pois eles necessitam de

nutrientes orgânicos, principalmente glicose.nutrientes orgânicos, principalmente glicose.

20

1.3.3- Fonte de nitrogênio:

� Todos os organismos também necessitam de nitrogênio em

alguma forma.

� O elemento é parte essencial dos aminoácidos que juntos

formam as proteínas.

21

� As bactérias são particularmente versáteis na utilização de

nitrogênio.

� Algumas bactérias podem utilizar nitrogênio gasoso ou

atmosférico para a síntese celular por meio do processo

fixação de nitrogênio.

� Podem utilizar compostos nitrogenados inorgânicos como:

• nitratos;

• nitritos;

22

• nitritos;

• sais de amônia

� Fontes orgânicas como:

• aminoácidos

• peptídeos.

1.3.4- Hidrogênio, Oxigênio, Enxofre e Fósforo:

� O H2 e o O2 fazem parte de muitos compostos orgânicos.

� O enxofre é necessário para a biossíntese dos aminoácidos

cisteína, cistina e metionina.

� O fósforo é essencial para a síntese de ácidos nucléicos e

23

� O fósforo é essencial para a síntese de ácidos nucléicos e

adenosina trifosfato (ATP), importante para o armazenamento

e a transferência de energia.

� Sulfatos e fosfatos podem suprir os principais elementos

necessários.

1.3.5- Outros elementos:

� Outros elementos são importantes embora em menores

quantidades são eles:

• Na+;

• Fe+2 – requerido como cofator para enzimas (catalases);

• Zn+2-;

24

• Zn+2-;

• Cu+2;

•Mn+2; Ativadores de enzimas

• Mo+2 (nitrogenase);

•Co+2.

1.3.6- Fonte de Energia:

� Os organismos que utilizam compostos químicos para obter

energia são chamados quimiotróficos.

� Os que dependem primariamente da energia radiante (luz)

são chamados fototróficos.

25

� Pela combinação destes termos com aqueles relacionados às

principais fontes de carbono, os seguintes grupos emergem:

� Quimioautotróficos: organismos que utilizam subst. químicas

(inorgânicas) como fontes de energia e dióxido de carbono

como principal fonte de carbono.

� Quimioheterotróficos: organismos que utilizam subst.

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químicas (orgânicas) como fontes de energia e os compostos

orgânicos como principal fonte de carbono.

� Fotoautotróficos: utilizam a luz como fonte de energia e

dióxido de carbono como fonte principal de carbono.

� Fotoheterotrófico: utilizam a luz como fonte de energia e

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compostos orgânicos como fonte principal de carbono.

Grupo Nutricional Fonte de Carbono Fonte de energia

Quimioautotrófico Dióxido de Carbono Compostos Inorgânicos

Quimioheterotróficos Compostos Orgânicos Compostos Orgânicos

Fotoautotróficos Dióxido de Carbono Luz

Classificação nutricional dos microrganismos:

Fotoautotróficos Dióxido de Carbono Luz

Fotoheterotróficos Compostos Orgânicos Luz

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1.3.7- Reações Químicas: Enzimas

� As enzimas são sintetizadas através de informação genética.

� Quimicamente as enzimas são:

• proteínas (com uma estrutura química especial);

• contendo um centro ativo (apoenzima);

• necessita de coenzimas ou cofatores.• necessita de coenzimas ou cofatores.

29

1.3.7.1- Co-enzimas e cofatores

(caderno)

30

31

1.3.7.2-Classificação das Enzimas

� As enzimas podem ser classificadas em 6 classes:

� Oxidorredutases;

� Transferases;

� Hidrolases;� Hidrolases;

� Liases;

� Isomerases;

� Ligases.

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� Oxidorredutases: São enzimas que catalisam reações de

transferência de elétrons, ou seja: reações de oxi-redução.

• São as desidrogenases e as oxidases.

• Se uma molécula se reduz, tem que haver outra que se oxide.

� Transferases: Enzimas que catalisam reações de

transferência de grupamentos funcionais como grupos amina,

fosfato, acil, carboxil, etc.

• Como exemplo: Quinases e as Transaminases.

33

� Hidrolases: Catalisam reações de hidrólise de ligação

covalente.

• Ex: As peptidades.

� Liases: Catalisam a quebra de ligações covalentes e a

remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico.

• Dehidratases e as descarboxilases são bons exemplos.

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� Isomerases: Catalisam reações de inter-conversão entre

isômeros ópticos ou geométricos.

• As epimerases são exemplos.

� Ligases: Catalisam reações de formação e novas moléculas

a partir da ligação entre duas já existentes, sempre às custas de

energia (ATP).

• São as sintetases.

35

1.3.8- Complexo Enzima/Substrato:

� Em uma reação química, o composto-alvo da enzima é o

substrato (especificidade), que será convertido em produto.

� Enzima + Substrato= Complexo enzima-substrato.

�Especificidade= único substrato ou com grupos de subst.�Especificidade= único substrato ou com grupos de subst.

Itimamente relacionados.

� Existe alguns modelos de ligação:

36

� Modelo Chave/Fechadura: que prevê um encaixe perfeito do

substrato no sítio de ligação, que seria rígido como uma

fechadura.

� Modelo do Ajuste Induzido:

que prevê um sítio de ligação não totalmente pré-formado, masque prevê um sítio de ligação não totalmente pré-formado, mas

sim moldável à molécula do substrato; a enzima se ajustaria à

molécula do substrato na sua presença.

37

� Terceiro modelo que combina o ajuste induzido a uma

"torção" da molécula do substrato, que o "ativaria" e o prepararia

para a sua transformação em produto.

38

1.3.8.1- Inibição Enzimática:

� Inibidor – composto que se liga à enzima e que afeta

negativamente a sua atividade. Pode ser:

� natural – utilizado pelas células para regularem o seu

metabolismo.

� artificial – usado para combater doenças, eliminar pestes,

estudar laboratorialmente as enzimas, indústria alimentar...

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� Outras formas de inibição:

• Inibição competitiva: competição entre duas moléculas

diferentes pelo mesmo sítio ativo.

• Inibição não-competitiva: o inibidor não compete com o

substrato pelo sítio ativo. O inibidor liga-se a um outrosubstrato pelo sítio ativo. O inibidor liga-se a um outro

componente da enzima.

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1.3.9- Aplicações Industriais das Enzimas:

a) Uso Das Enzimas Nas Indústrias Alimentícias:- Redução da viscosidade.- Melhoria da filtrabilidade.- Clarificação e estabilização dos líquidos devido à suaconservação.- Insolubilização das macromoléculas para formação de coágulo.- Melhoria da digestibilidade.- Melhoria da fermentabilidade.- Melhoria da fermentabilidade.- Melhoria da textura.- Melhoria da característica organolépticas.- Aumento do poder adoçante.- Melhoria da estabilidade bacteriológica.- Redução da dificuldade para cristalização.- Correção das deficiências enzimáticas de origem natural.

41

Ex:

1) Alfa-amilase bacteriana (Alfa-1,4 Glucanes 4-

glucanoidrolase; EC 3.2.1.1) /// Bacillus

amyloliquefaciens hidroliza amilose e

amilopectina solubiliza o amido ↓ viscosidade

42

1.4- CARACTERÍSTICAS DOS MEIOS

DE CULTIVO

43

I.4- Características do Meio de Cultivo

� Os meios de cultivo preparados podem ser:

� aplicados diretamente no processo (obtenção de

produtos);

� manutenção das culturas.� manutenção das culturas.

44

Concentração não inibitória dos nutrientes

Condições de Assepsia

pH

Fatores

EsterilizaçãoNutrientes necessários

45

� Meios de cultura: associação quali e quantitativamente

equilibrada, de substâncias que, por natureza, permitem o

cultivo dos microorganismos fora de seu “habitat”.

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� Em termos de características estes devem:

� Ser o mais barato possível;

� Atender às necessidades nutricionais dos microrganismos;

� Auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser

ligeiramente tamponado, o que evita variações drásticas do pH

ou evitar excessiva formação de espuma;

47

� Não provocar problemas na recuperação do

produto;

� Os componentes devem permitir algum tempo de

armazenamento, a fim de estarem disponíveis todo o

tempo;

� Ter composição razoavelmente fixa;

48

� Não causar dificuldades no tratamento final de

efluente;

� Sem substâncias tóxicas.� Sem substâncias tóxicas.

49

I.4.1- Classificação dos Meios de Cultura:

� Quanto a apresentação: podem ser líquidos ou

sólidos.

• Os líquidos são usados quando se deseja um

grande número de células;

• Os sólidos são usados para isolamento de espécies

e conservação de cultura.

50

� Os meios sólidos têm aspecto gelatinoso, devido à

presença de ágar (polissacarídeo extraído de algas)

ou de gelatina.

� O ágar não é atacado pela grande maioria dos

microrganismos e não é liquefeito em temperaturasmicrorganismos e não é liquefeito em temperaturas

normalmente usadas para o crescimento (em torno

de 30 - 35°C).

51

52

� Quanto à origem dos constituintes:

� naturais (caldo de cana, melaço,

sangue...);

� sintéticos (meio ágar nutriente, meio� sintéticos (meio ágar nutriente, meio

sabourand...).

53

� Quanto à natureza dos constituintes: meios

minerais, meios orgânicos, meios mistos (fontes

de carbono orgânico e demais componentes

minerais) e meios complexos (têm-se vitaminas

como “fatores de crescimento”).como “fatores de crescimento”).

� Quanto à finalidade: meios de cultivo, meios de

enriquecimento, meios de identificação, meios

diferenciais e meios para conservação.

54

� Meio de cultura depende:

� Tipo de microrganismo;

� Produto pretendido;

� Escala do processo.� Escala do processo.

55

� Caldo Nutriente (Simples) – Para cultivo e contagem emplaca de bactérias aeróbias totais.

� Meio YMA – Também para o cultivo e a contagem em placade bactérias aeróbias totais.

� MEIOS DE CULTURA

Tipos de Meios de Cultura

de bactérias aeróbias totais.

� Gelose Sabourand–dextrose - Para cultivo e contagem emplaca de leveduras e fungos não filamentosos.

� Gelose Czapeck - Para cultivo e contagem em placa defungos filamentosos.

56

� Exemplo:

� Os meios de cultura utilizados e suas respectivas

fórmulas são:

� Meio YMA- Para cultivo e contagem em placa de

bactérias aeróbias totais.bactérias aeróbias totais.

Componentes: 10g de glicose; 3 g de extrato de

levedura, 5,0 g de peptona, 18 g de agar-agar; 1L de

água destilada.

57

� Gelose Sabourand-dextrose: Para cultivo e

contagem em placa de leveduras e fungos não

filamentosos.

Componentes: 10g de peptona; 40 g de dextrose; 20Componentes: 10g de peptona; 40 g de dextrose; 20

g de agar-agar; 1L de água destilada.

58

� Fontes mais empregadas:

1- Glicose

59

2- Fontes de azoto ou N2

60

� Preparação dos meios:

� Na preparação dos meios e na manutenção das culturas de

microrganismos é importante observar as necessárias

condições de assepsia, de modo a se evitarem contaminações

com outros microrganismos.com outros microrganismos.

61

�Sistema de Assepsia:

1- Autoclaves: Vertical e Horizontal (calor úmido)

62

63

1- Autoclave Vertical

� Formado por um cilindro metálico resistente vertical

com uma tampa que permite fechar hermeticamente

o autoclave.

� Essa tampa apresenta parafusos de orelhas e uma

anilha de amianto que impedem a existência de fugas

de pressão.

64

� Tem geralmente um manômetro, uma válvula de segurança e

uma torneira para descarga.

� Na preparação dos meios e na manutenção das culturas de

microrganismos é importante observar as necessárias

condições de assepsia, de modo a se evitarem contaminaçõescondições de assepsia, de modo a se evitarem contaminações

com outros microrganismos.

65

� As autoclaves não necessitam de termômetro para

indicar a que temperatura se encontra o vapor de

água no seu interior visto que existe uma relação

direta entre a pressão do vapor de água saturado e a

temperatura desse mesmo vapor.

66

2- Fluxo Laminar Bacteriológico

67

Calor Seco

� Repique é a operação que consiste no

transporte de uma certa porção de uma cultura

(inoculum ou semente) para um meio

esterilizado.

68

� Os repiques devem ser feito com muita assepsia,

para que não ocorra contaminações, ou seja, todo

material deve ser esterilizado e deve-se ter perfeita

observância das normas da prática asséptica;observância das normas da prática asséptica;

69

� Há 2 casos de repique:

� da placa ao tubo;

� de um tubo ao outro (que será utilizado no nosso

procedimento experimental);

� Em geloses inclinadas, as culturas resistem por mais tempo

do que em meio líquido, pois os microorganismos tem

acesso mais lento ao material nutritivo, esgotando-o

lentamente.

� No entanto, eles ressecam rapidamente.

70

� tempo de incubação após repique

� Os tubos com as novas culturas colocados na

estufa, a uma temperatura de 30oC -35oC por 48 horas

para bactérias e 120 horas para fungos.

71

Escala Industrial (Scaling-up)

72

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Condições de Fermentação

• pH

• Temperatura

• Velocidade de Agitação

• Oxigênio Dissolvido

• Densidade Celular

• Podem influenciar:

- Produtividade do processo;

- Morfologia das células;

- Diretamente a atividade • Densidade Celular

• Etc.Microbiana;

- As condições seletivas

para ↓ contaminações.

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