Pontifícia Universidade Católica de GoiásBioquímica e Biofísica I – Prática CBB1081 - Turma A01.4Prof. Msc. Roberpaulo Anacleto Neves

PIPETAS

As pipetas são instrumentos ou equipamentos largamente utilizados no laboratório com a finalidade de medir e transferir líquidos.

Uma pipeta deve apresentar precisão (reprodutividade) e exatidão (relacionada com o valor absoluto). A maioria das pipetas apresenta precisão, mas a exatidão é também fundamental.

Problemas de pipetagem são fontes comuns de erros em diagnósticos laboratoriais. Esses problemas podem ser causados por falha na técnica de pipetagem, erro na escolha da pipeta, problemas de ajuste do equipamento ou falta de cuidados de conservação.

TIPOS DE PIPETAS

As pipetas mais utilizadas são as sorológicas ou graduadas, as pipetas de volume fixo ou ajustável e também as pipetas multicanal. São usadas ainda as pipetas de Pasteur, somente para transferir líquidos. Para líquidos densos, viscosos ou voláteis são indicadas as pipetas de deslocamento positivo, sendo muito utilizadas em técnicas de biologia molecular, uma vez que são desenvolvidas para que não haja contato da substância pipetada com o corpo da pipeta, prevenindo a contaminação de uma amostra para outra.

I. PIPETAS SOROLÓGICAS (GRADUADAS) E PIPETAS VOLUMÉTRICAS

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São instrumentos de vidro ou plástico utilizadas para medir volumes entre 1 e 10 ml. Devem ser usadas com muito critério e precisão, devem apresentar um limiar de tolerância que devem ser expressos em percentagem sendo menor para as pipetas de menor volume e maior para as pipetas de maior volume.

1) As pipetas graduadas (mais finas) permitem medir volumes variáveis de líquidos.

2) As pipetas volumétricas( com bulbos), não são graduadas e só permitem medir um volume único de líquido.

1. Cuidados e precauções nas pipetagens:

a) Usar uma pipeta para cada reagente, a fim de evitar contaminação entre um líquido e outro;b) Antes de introduzir as pipetas nas soluções, verificar se estão realmente limpas a se as extremidades superior e inferior não estão quebradas;c) Utilize equipamento auxiliar de pipetagem. Nunca pipete com a boca.d) Evitar a troca de rolhas entre os reagentes;e) Nunca devolver a solução pipetada para o frasco estoque, pois esta pode estar contaminada;f) As pipetas vem calibradas com H2O destiladas em dadas temperaturas, conforme vem registrado (15, 20, 25ºC);g) Para pipetar volumes entre 0 e 1 ml, usar pipetas de 1 ml graduadas ao centésimo; entre 1 e 2 ml, usar pipetas de 2 ml graduadas ao centésimo; entre 2 e 5, usar de 5 ml graduadas ao décimo; entre 5 e 10 ml, usar pipetas de 10 ml graduadas ao décimo;h) O líquido no interior da pipeta forma um menisco. A leitura é feita utilizando a parte inferior do menisco se a substância for incolor e a parte superior do menisco se for colorida, sempre colocando a pipeta na altura da linha dos olhos;i) Para pipetar substâncias corrosivas ou tóxicas, obturar a extremidade superior da pipeta com algodão ou utilizar pipetas semi-automáticas;j) Quando pipetar sangue, ácido concentrado ou álcalis concentrados, lavar imediatamente as pipetas em H2O corrente;k) Após o uso deixe as pipetas totalmente submersas, por 24h, em solução de hipoclorito de sódio a 2% para garantir sua desinfecção e também para evitar que os resíduos sequem no seu interior;l) As pipetas que precisam ser sopradas apresentam dois anéis ou um halo fosco na extremidade superior;

2. Procedimento para pipetagem:

a) Aspirar a solução até acima da marca de calibração e manter a coluna líquida neste ponto;b) Encostar o bico da pipeta numa superfície (vidro de solução), colocar a pipeta em posição vertical e levar o menisco até a marca zero;c) Limpar a parte externa do bico da pipeta;

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d) Levar o bico da pipeta no recipiente adequado e deixar o líquido escoar livremente, encostando o bico na parede do recipiente, até o volume desejado. Se a pipeta apresentar dois anéis na extremidade ela deverá ser sopradae) Ao usarmos apenas uma fração da pipeta sorológica devemos contê-la entre duas marcas e não utilizar a parte inferior da pipeta, pois ocorrem muitos erros de calibração junto a ponta.

II. PIPETAS SEMI-AUTOMÁTICAS

Destina-se a pipetagem de líquidos em geral podendo apresentar em modelo de volume fixo ou ajustável e pode ou não apresentar ejetor/dispersor de ponteiras, evitando contaminações.As pipetas automáticas tem como vantagem a rapidez de uso. Cuidados especiais, porém, devem ser considerados. Toda pipeta automática tem dois estágios no seu êmbolo. No momento de sugar o líquido, o êmbolo deve ser colocado no primeiro estágio. Para expulsar o líquido das ponteiras, o êmbolo tem que ser levado ao segundo estágio. Existem pipetas de volume fixo, volume ajustável e as pipetas multicanal. São necessários ponteiras e o suporte para manter a pipeta na posição vertical.

1. Vários pontos devem ser cuidadosamente verificados:

a) Nunca sugar um líquido ou solução colocando o êmbolo no segundo estágio. Se for assim, o volume pipetado seria maior do que o valor nominalb) Quando selecionar o volume, verificar que o volume escolhido esteja dentro da faixa de volumes da pipeta automática a ser utilizada. Ou seja, se por exemplo uma pipeta tem uma faixa de volumes que vai de 200 a 1000 µl, sob nenhuma circunstância deve ser pipetado um volume de “por exemplo” 1100 µl. Na verdade, a eleição da pipeta adequada depende do volume que se deseja pipetar e da faixa de volumes na qual cada pipeta trabalha. Ex: num laboratório tem 2 pipetas automáticas. A pipeta A, tem uma faixa de volumes de 10 a 40 µl e a pipeta B tem uma faixa de volumes de 20 a 100 µl (figura 1a). Se fosse necessário pipetar 40 µl, a escolha certa seria a pipeta B, devido a que o volume desejado não fica num dos extremos da faixa de trabalho da pipeta.c) Especiais cuidados devem ser levados em consideração quando a solução que de quer pipetar é cáustica (um ácido ou uma base forte, por exemplo). Neste caso qualquer gota do líquido (ou ainda o vapor do composto) que fique dentro da pipeta pode danificar seriamente o instrumental. Uma solução muito simples é colocar um pedaço de algodão dentro da ponteira, verificando que não seja atingida pelo líquido no momento de sugar. O algodão absorverá qualquer respingo que houver, impedindo que o líquido fique no interior da pipeta (figura 1b).

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d) Escolha as ponteiras adequadas às pipetas, que não seja de material reciclado para evitar contaminações e devem ter as pontas polidas. Não reutilize ponteiras. Estes materiais são de baixo custo e além disso, os procedimentos adotados para lavagem não garantem a completa remoção de resíduos, constituindo-se em fonte de contaminação das reações e não esqueça que estas devem ser autoclavadas antes de serem descartadas.e) Mantenha sempre as pipetas em suporte apropriado na posição vertical, para evitar agregação de partículas em seu interior.

Suporte para pipetas

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Cuidados a serem observados na pipetagem

a) Selecionar o volume desejado;b) Verificar se a ponteira está corretamente acoplada à pipeta;c) Faça a pipetagem com a pipeta na posição vertical;d) Aspire e dispense o líquido mantendo velocidade lenta e constante;e) Mergulhe a ponteira aproximadamente 5 mm abaixo da superfície do líquido;f) Retire o excesso de líquido que se acumula no exterior da pipeta evitando erros de volume. Passe a ponteira na borda do frasco para que o excesso de líquido seja retirado;g) Algumas seções exigem que a ponteira seja limpa pelo lado de fora com papel absorvente. Neste caso não passe o papel no orifício da ponteira;h) Ao manusear pipetas multicanal utilizar sempre ponteiras iguais, acoplar bem as ponteiras e após aspirar o líquido verificar se este se encontra no mesmo nível em todos os canais.

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