testes utilizados em imunologia clínica – reagentes não marcados profa alessandra xavier pardini...
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Testes utilizados em Imunologia Clínica –
Reagentes não Marcados
Profa Alessandra Xavier Pardini
Disciplina Imunologia Clínica
Resposta Imunológica Específica
- é mais elaboradareconhecimento - clonagem (multiplicação de células defesa) - ativação celular - processo complexo
- células: ly T e B atacam especificamente o antígeno- resposta imunológica
de memória
Anticorpos
Molécula de Ac Sítio de ligação do Ag símbolo
Sítio de ligação do AgSítio de ligação do Ag
antígeno Determinante antigênico (epítopo)
Cadeia leve
Cadeia pesada
Fab
Fc Região de dobradiça
Tempo (dias)
Primeira exposição ao
Ag
Segunda exposição ao
Ag
Resposta secundária
Resposta primária
Títu
lo d
e A
c no
sor
o
( u
nida
des)
Dinâmica de produção de Anticorpos durante a infecçãoDurante a infecção realiza-se pesquisa de IgM e IgG para diferenciar a fase em que se encontra a doença
Determinação de limiar de reatividade
A – Limiar de máxima sensibilidade - triagemB – Limiar com máximas sensibilidade e especificidade – estudos epidemiológicosC – Limiar de máxima especificidade – diagnóstico
Introdução- Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas para a
detecção de antígenos, anticorpos ou substâncias que desempenhem papel de antígenos - drogas, hormônios, ácidos nucléicos
- Utilizam reagentes não marcados (precipitação aglutinação, floculação e complemento) ou reagentes marcados (fluorescência, radioimunoensaio, imunoenzimáticos)
- Cada técnica apresenta vantagens, desvantagens, aplicação específica
- Podem ser manuais ou semi ou totalmente automatizadas
- Anticorpos monoclonais e Antígenos recombinantes = maior desenvolvimento
(a) Ac monoclonais: produção, homogêneos, caracterizáveis(b) Ag recombinantes: caracterizáveis, produção em larga escala,
especificidade
Métodos:- aperfeiçoamento, consolidação do que já existe, tecnologias
emergentes, melhora da sensibilidade, confiabilidade no resultado, execução mais simples e adaptáveis a automação
- métodos multiparamétricos: desafio de detecção de substâncias diferentes simunltâneamente
- Os testes sorológicos têm se tornado cada vez mais refinados e de execução simples, porém, para se garantir a qualidade dos resultados é necessário controle rigoroso
- Técnicas cuidadosamente padronizadas (estudo de população, limiar de reatividade) = temperatura, pH, tempo de incubação, títulos, conjugados
- As metas para o laboratório clínico devem melhorar a disponibilidade, exatidão e precisão dos testes clínicos, garantir a interpretação correta dos resultados
Imunodiagnóstico
Designa o diagnóstico por técnicas imunológicas que revelam a presença de determinado antígeno (Ag) ou anticorpo (Ac) no organismo
•Ensaios ou Testes de Precipitação
•Fixação do Complemento
•Neutralização ou Imunoensaios
•Imunofluorescência
•Radioimunoensaio
•Imunoenzimáticos
•Imunofluorimétricos
•Quimiluminescência
Métodos de Imunoensaios
Reagentes não-marcados• Precipitação• Aglutinação• Ensaios Líticos
Reagentes marcados• Radioativos• Enzimáticos• Fluorescentes• Quimioluminescentes
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS:REAGENTES NÃO MARCADOS
Técnicas rápidas
Sistema homogêneo
Sensibilidade reduzida
Boa especificidade
Direta – detecção de Ag
Indireta – detecção de Ac
Baixo custo
Dificultam automação
Problemas com reprodutibilidade
Não permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag – de uma só vez
Precipitação
- quantificação de complexo Ag-Ac
- depende de [ ] relativas de Ag e Ac
- excesso - dissolução do precipitado
- zona de equilíbrio - precipitação máxima
Concentração de Ag
Excesso de Ag
Excesso de Ac
Equivalência
Imun
opre
cipi
taçã
o
Imunodifusão
- difusão de Ag e Ac solúveis em meio fluido ou semi sólido - complexo Ag-Ac
- simples: fixa-se um dos reagentes no suporte e difunde-se o outro - complexo
- dupla: ambos movem-se = encontro – complexo
pode ser linear ou radial
Imunodifusão Radial Simples (Mancini)
- utiliza placa de vidro - mistura de ágar com solução de anticorpos específicos
- perfurações em locais apropriados do gel - as amostras + 3 concentrações conhecidas do Ag
- quantificação de [ ] em soro ou líquor
- sensibilidade de 1 a 3ug/mL de antígeno
uso: Ig séricas, proteína C reativa (PRC) e proteínas do sistema complemento (C3, C4)
- diâmetro do halo de precipitação formado relaciona-se com a concentração do antígeno
- construção de curva padrão permite determinar a conentração do antígeno
Imunodifusão dupla (Ouchterlony)
- precipitação Ag-Ac - linhas ou arcos - ausência de linhas indica ausência de Ag ou Ac
- depende de [ ] e tamanho da molécula, tamanho dos poros do gel, temperatura, [ ] e pureza do ágar
- camada de ágar sobre lâmina de vidro - perfuração – aplicação da amostra
- desvantagens: lenta e baixa sensibilidade
Uso: vários sistemas antigênicos (artrite reumatóide, lupus, esclerose sistêmica, caxumba)
Nefelometria
- muito usada em laboratórios de análises clínicas
- Ag+Ac em suspensão – dispersão de luz
- Vantagens: automatizada, fácil, rápida, precisa, com sensibilidade adequada e pequenos volumes de amostra, não necessita separação de fases
- Desvantagens: alto custo do anti-soro, reações inespecíficas, múltiplas diluições de antígenos muito concentrados
- Sensibilidade - 1ug/mL
Uso: Ig, componentes do complemento, fator reumatóide, proteína c-reativa, fatores de coagulação, imunocomplexos e hormônios
Princípio
partículas em suspensão – desvio de luz incidida
dispersão de luz incidente quantificada por um detectorFonte de luz
Suspensão de Ac e Ag diluídos
Raios de luz focados
Raios de luz desviados e refletidos
Detector
Fonte de luz – lâmpadas de tungstênio, mercúrio, xenônio, hélio-neônio ou laser
concentração - curva padrão
Nefelômetro acoplado a computador
TurbidimetriaAg+Ac em suspensão – luz transmitidaDetector - espectrofotômetroVantagens: não necessita separação de fases, rápida, precisa, econômica e
automatizadaDesvantagens: não pode ser usada em amostras muit turvasUso: Ag, Ac, lipoproteínas, proteína C-reativa, albumina
Fonte de luz branca
Espectrofotômetro de fibra óptica Absorção e espectro de
luz desviada e refletida
Técnicas de Aglutinação
Aglutinação
- complexo Ag-Ac - agregados visíveis
- semi-quantitativa – 500x mais sensível que precipitação
- sensibilização de suporte – látex, hemácias
- vantagens: < custo, facilidade e rapidez
- desvantagens: reprodutibilidade, estabilidade do complexo formado e acessibilidade
- vários tipos de sistemas
Fatores interferentes
- classe de Ac - IgM 750 vezes mais eficiente que IgG
- eletrólitos
- pH ( ideal entre 6,0 e 8,0)
- tempo
- temperatura
- estabilidade da ligação ao suporte (adsorção)
- concentração de Ag ou Ac (falso -)
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃOREAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
Tipos de reaçõesTipos de reações
Aglutinação Direta
Inibição da aglutinação direta / hemaglutinação
Aglutinação Indireta ou Passiva
Hemaglutinação passiva
Inibição da aglutinação passiva / hemaglutinação
Reação de microflocução
Ag ou Ac adsorvido a partícula/célula
Facilita a visualização do imunocomplexo Ag-Ac
Aglutinação direta
- partículas antigênicas insolúveis íntegras ou fragmentadas
- Ag presente na partícula / célula – hemácias, bactérias, protozoários e fungos
- realizado em tubo ou lâmina
- Uso: identificação de grupo sanguíneo, diagnóstico de mononucleose infecciosa, toxoplasmose, brucelose, salmonelose, leptospirose
- para a identificação de ANTÍGENOS (teste DIRETO)
AGLUTINAÇÃO DIRETAAGLUTINAÇÃO DIRETA
Ac do soro
Ag íntegro ou fragmentado
aglutinação
Resultado positivo
Resultado positivo
Ag eritrocitário
Ac Anti-eritrócito
Reagente de Coombs
A B AB O
Tipagem de Sangue – direto (pesquisa de antígeno)
Aglutinação indireta ou passiva
- Ag solúveis adsorvidos na superfície da partículas inertes
- hemácias – hemaglutinação - um dos melhores suportes
- outros suportes: látex, carvão, gelatina e sepharose
- detecta IgG e IgM / tratamento com 2-ME
- lâmina ou microplaca em “V” ou “U”
Uso: diagnóstico da toxoplasmose, doença de Chagas, fator reumatóide (FR), proteína C reativa (PRC), ASLO
Esquema de realização de testes de aglutinação em placa –
teste de Látex (testes rápidos)
Aglutinação indireta (passiva)
AGLUTINAÇÃO INDIRETA OU PASSIVAAGLUTINAÇÃO INDIRETA OU PASSIVAAc do soro
Ag solúvel adsorvido ao suporte
aglutinação
Aglutinação Indireta
HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVAHEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA
Ac do soro
Ag solúvel adsorvido ao suporte (hemácia)
aglutinação
Hemaglutinação passiva
Ac do soro
Ag solúvel adsorvido ao suporte (hemácia)
Aglutinação
Reação de microfloculação
- VDRL (Veneral Disease Research Laboratory)
- RPR (Rapid Plasm Reagin)
- suporte: cristais de colesterol
- Ag: cardiolipina
- placas escavadas
- Uso: pesquisa de reaginas
REAÇÃO DE MICROFLOCULAÇÃO
Ac da Amostra
Suspensão antigênica: cardiolipina, colesterol e lecitina
aglutinação
Reação Positiva=
Reação negativaReação negativa Reação positivaReação positiva
Resultado VDRL
Microscópio óptico 100x
Reação de fixação de complemento (RFC)
- 1901 – Boret e Gengou - qualitativo: sistema homogêneo de duas etapas
- 1948 – Mayer e cols. – quantitativo
- 1961 – Wassermanmn e Levine – micrométodo quantitativo
- 1a etapa: interação Ag-Ac na presença de complemento
- 2a etapa: adição do sistema indicador (Hc+hemolisina)
difícil execução: reagentes padronizados
- uso: doença de Chagas, sífilis, neurocisticercose
Soro com Ac
Soro sem Ac
Ag liga-se ao Ac
Ag não ligado
Complemento liga-se ao
complexo Ag-Ac
Complemento não ligado
Indicador - Hemácias
sensibilizadas com hemolisinas
Indicador - Hemácias
sensibilizadas com
hemolisinas
Hemácias íntegras no pellet
Não houve lise
Hemácias lisadas pelo complemento não ligado
Hemólise
Reativo Não reativo
REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO
Ag
Ac do soro
complemento
sistema indicador sem hemólise+
+
Agradecimentos
Profa Adriana de BritoProfa Paula KnoxPelo material gentilmente cedido
Referências BibiolgráficasFERREIRA, AW & ÁVILA, SL Diagnóstico Laboratorial das
Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes, 2001.
Obrigada, Profa Alessandra