TESTES USADOS EM DIAGNÓSTICO E TITULAÇÃO

VIRAL

Métodos de Detecção Viral

1) Buscar o Vírus

O vírus propriamente

Proteínas Virais

Efeitos virais in vitro

Genoma Viral

1 – Investigação Direta (buscar o vírus)

Microscopia Eletrônica morfologia viral

Detecção do vírus (antígeno) IFA, ELISA, AGLUTINAÇÃO, etc

Detecção do Genoma Viral Hibridização molecular

Amplificação gênica (PCR ou derivados)

Tecidos e/ou matrizes onde se pode buscar o vírus

Aspirato Nasofaringeal Vírus Respiratório sincicialInfluenza A and BParainfluenzaAdenovirus

Fezes RotavirusAdenovirus Astrovirus

Norovirus, etc

Fluidos Herpes SimplesHIV

Esfregaços HPV, HIV

Biópsias HIV, EBV, et

Microscopia Electrônica

106 partículas virais/mL são necessárias para visualização.

Exemplos:

Fezes ……………………Rotavirus, Adenovirus,

Norovírus

Astrovirus, Calicivirus

Mucosas ………………….Papilomavirus (HPV)

Eletromicrografias

Adenovirus

Rotavirus Herpes SimplesRaiva

Astrovírus

HIV

Imuno Microscopia Eletrônica (IME)

A sensibilidade e a especificidade da ME pode ser aumentada por associação a técnicas imunológicas. 

Existem duas variantes: Microscopia Eletrônica Imune Clássica (MEI) - A amostra é tratada com anti-soros específicos antes de ser analisadas no ME.  Partículas virais aglutinadas 

Microscopia Eletrônica de Fase Sólida (MEIFS) - uma “grade” revestida com anticorpos específicos anti-soros é colocada em contato com a amostra. Partículas virais serão absorvidas na “grade” - pelo anticorpo.

Problemas com a Microscopia Eletrônica

Equipamentos e manutenção – custos elevados

Requer bastante experiência do observador

Passiva de falsos negativos/baixa sensibilidade

(depende da origem amostral)

BUSCAR AS PROTEÍNAS VIRAIS

Testes Imunológicos: ELISA, IMUNOHISTOQUÍMICA, IMUNOFLUORESCÊNCIACITOMETRIA DE FLUXORADIOIMUNOENSAIO

ELISA - Ensaio Imunoenzimático

O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.

O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).

A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, é feito através de leitura em fotocolorímetro.

IMUNOHISTOQUÍMICA: detecção de células infectadas em cortes histológicos (EBV, HPV)

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Reagentes secundários:

Anticorpo secundário marcado com fluorocromoproteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs

Célula infectada por Rotavírus Símio

Citometria de Fluxo

(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

RADIOIMUNOENSAIO (RIA): triagem do vírus da hepatite B em doadores de sangue

Investigação Indireta (buscar o efeito do vírus; isolar o vírus; atenuar o vírus)

Cultura celular ou ovos embrionados: Efeito citopático (CPE) ou infecção do embrião

Uso de Animais: Estudo da doença e/ou morte

Como isolar vírus?- a partir dos tecidos infectados

(limitado) - células em cultura- ovos embrionados

CULTURA CELULAR

1. Cultivo celular primário (derivado do tecido)

2. Cultivo em linhagens celulares semi-contínuas (Ex: fibroblastos de rins de macaco)

3. Cultivo em linhagens celulares contínuas (tumorais) - HeLa, Vero, Hep2, A549…

Todos os vírus podem ser cultivados in vitro?

Vírus que podem ser facilmente cultiváveis

Vírus difíceis de cultivar Vírus Fastidiosos

Herpes Simples Varicella-Zoster Norovirus

Vírus das Hepatites

Adenovírus Entéricos

Rotavírus

Citomegalovirus Sarampo

Adenovirus (exceçãos entéricos) Rubeola

Poliovirus Rinovirus

Coxsackie B virus Coxsackie A viruses

Ecovirus

Influenza

Parainfluenza

Caxumba

Virus Respiratório Sincicial

Linhagens Celulares – Visualização de Efeito Citopático

Controle Celular

Controle Viral (PV)Amostra ambiental

Positiva para Enterovírus (7 dias)

Amostra ambiental

Positiva para Enterovírus (4 dias)

Efeitos citopáticos clássicos

ATENUAÇÃO DE VÍRUS PARA PRODUÇÃO DE VACINAS

Ensaio de Formação de Placa de Lise (Contagem em PFU)

1- Diluições Seriadas

2- Infecção Celular

Quantificação Viral em cultura celular

Ensaio de Formação de Placa de Lise (Contagem em PFU)

1- Diluições Seriadas

2- Infecção Celular

Quantificação Viral em cultura celular

Desafios em Cultivos Celulares

Às vezes requerem longos períodos e mais de uma passagem para obter resultados

A matriz de onde provém a fonte viral pode ser um obstáculo (sangue, amostras ambientais, mucosas, fezes…)

Suceptível a contaminações bacterianas e fúngicas Suceptível a substâncias tóxicas presentes na amostra Muitos vírus não são adaptados ao cutivo celular in vitro (hepatites,

diarréias, papilomavírus…)

Cultivo de Vírus em Ovos Embrionados

Isolamento Viral – Inoculações em Ovos Embrionados

Cultivo Celular para Isolamento e Viabilidade Viral - Vírus da Bronquite Aviária

Passagem 1 Passagem 2

Passagem 3

Passagem 4

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Teste rápido, fácil e barato

Pode ser utilizado para detectar anticorpos para o vírus ou inibição da hemaglutinação

Mede quantidade total de vírus (não somente vírus infecciosos)

Testes de Hemaglutinação

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Testes de Hemaglutinação

Alguns vírus, ou antígenos derivados de vírus, se adsorvem às hemácias através de receptores existentes na membrana destas.

Como resultado, as hemácias aglutinam, sendo este fenômeno denominado de hemaglutinação. •Vírus de influenza: aglutina hemácias de galinha, cobaia, carneiro e humanas do grupo O. •Vírus do Sarampo: Aglutinam hemácias de macaco. •Vírus do Dengue: Aglutinam hemácias de ganso

As hemaglutininas de vírus respiratórios são antigênicas e, quando um vírus infecta o organismo humano ou animal, além de anticorpos neutralizantes, há a produção de anticorpos específicos contra as hemaglutininas virais. Esses anticorpos presentes no soro são capazes de se combinar com o vírus in vitro, inibindo assim a hemaglutinação. Este é o princípio da reação de inibição da hemaglutinação, que tem grande utilidade no diagnóstico dessas infecções virais.

TESTES DE INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO

Buscar o genoma viral

Utiliza técnicas que identificam e/ou quantificam o genoma viral

•AMPLIFICAÇÃO GÊNICA•HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES

Métodos Moleculares

Métodos baseados na detecção de genoma viral, conhecido como moleculares, são muito utilizados.

PCR Dot-blot Southern blot

A especificidade depende das condições da reação (otimização)

Mais utilizada!Busca PubMed: 20.163 publicados

(últimos 8 nos) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?termpcrdiagnosisviral (Acesso em 12.03.2012)

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Amplifica a sequência alvo de DNA/cDNA, permitindo detectar o genoma viral

buscado.

É baseada em uma reação enzimática com uso de oligonucleotídeos que flanqueiam a

sequência alvo que será aplificada pela ação da enzima DNA Polimerase.

Graças a Taq Polimerase, enzima termoestável, a reação é possivel em um único MIX

de reagentes;

Ciclos repetidos (usualmente 25 – 40 ciclos) de desnaturação do DNA (94oC),

anelamento dos oligos / primers (50oC – 65°C) e extensão dos primers (72oC)

resultam em uma produção exponencial do fragmento expecífico;

Atualmente a qPCR está sendo amplamente utilizada – Permite

quantificar em cópias genômicas o fragmento detectável.

Esquema de PCR

pcr Vídeo.exe

VÍDEO PCR

Os iniciadores procuram o molde na molécula de DNA, sequências que lhes são complementares

Os iniciadores procuram o molde na molécula de DNA, sequências que lhes são complementares

O pareamento dos iniciadores com a sequência que lhe é complementar já está bem facilitada, pois já existem várias cópias das sequências alvos.

O pareamento dos iniciadores com a sequência que lhe é complementar já está bem facilitada, pois já existem várias cópias das sequências alvos.

A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes - competição dos produtos gerados com os iniciadores

A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes - competição dos produtos gerados com os iniciadores

Cinética da Cinética da PCRPCR

Reação em Cadeia da Polimerase

Vantagens da PCR- Altamente sensível (pequena quantidade de material genético é requerido)

- Rápida

Desvantagens of PCR– Passiva de contaminações

– Alto treinamento do manipulador

– Se PCR qualitativa (Resultado não quantifica)

– Não acessa a infecciosidade viral

– Relativamente custosa (25 Reais/reação)

qPCR

HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES

Detecção de EBV em corte histológico de

linfonodo com doença linfoproliferativa

pós-transplante.

Detecção de EBV em corte histológico de

linfonodo com linfoma de Hodgkin.

Detecção de HPV por FISH (HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTE)

Métodos de Detecção Viral

2) Buscar a resposta ao vírus

Investigação sorológica (buscar a resposta imune ao vírus)

Detecção de de anticorpos presentes no soro 

nas fases aguda (IgM) e/ou convalescente da infecção (IgG ou IgA).

•ELISA•WESTERN BLOT•CITOMETRIA DE FLUXO• IMUNOFLUORESCÊNCIA

Sorologia

Diagnosticando Infecções Primárias:- Pelo aumento de IgG e/ou IgA (dependendo do alvo do vírus) - Presença de IgM no soro indicando infecção primária- Soroconversão

Diagnosticando Reinfecções ou Infecções secundárias

-IgG ou IgA (dependendo do alvo do vírus) no soro e/ou fluidos corpóreos

Perfil Sorológico das Infecções Virais

ELISA – Ex: Teste para HIV

Western Blot

Eletroforese de proteínas.

Identifica antígenos ou anticorpos.

Western Blot

HIV-1 Western Blot Linha 1: Controle Positivo Linha 2: Controle Negativo A: Negativo B: Indeterminado C: Positivo

Utilidade dos Resultados por Sorologia

Resposta específica ao vírus.

Em caso de doenças assintomáticas a detecção sorológica (IgM e IgG) indica doença.

Existem vírus que produzem efeitos clínicos após soroconversão (HIV, RAIVA).

Problemas com Sorologia

Requer longos períodos para diagnosticar a infecção.

Possibilidades de resultados falsos positivos (imunocomprometidos).