Universidade Federal do Triangulo Mineiro

Pós Graduação em Patologia Humana

Ariana de Melo Borges

Papel do polimorfismo de genes envolvidos no contro le da

resposta imune na susceptibilidade à Doença de Chag as.

Orientador: Prof. Dr. Virmondes Rodrigues Júnior

Co-Orientadora: Profa. Dra. Cristina Wide Pissetti

Uberaba

Outubro 2013

Ariana de Melo Borges

Papel do polimorfismo de genes envolvidos no contro le da

resposta imune na susceptibilidade à Doença de Chag as.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Patologia Humana.

Orientador: Prof. Dr. Virmondes Rodrigues Júnior

Co-Orientadora: Profa. Dra. Cristina Wide Pissetti

Uberaba

Outubro 2013

Dedico este trabalho aos meus pais,

que com muito amor, confiança e sabedoria de vida me conduziram

até aqui.

AGRADECIMENTOS

A realização deste trabalho foi possível graças ao empenho de muitas pessoas, mas, antes de agradecê-las, agradeço a Deus por me permitir chegar até aqui.

Ao meu orientador Prof. Dr. Virmondes Rodrigues Júnior, pelo voto de confiança, em ter estendido a mão no momento em que mais precisei. Agradeço por ser o grande responsável por este trabalho, por todo o apoio e, acima de tudo, pela confiança. Obrigada pelo exemplo de profissionalismo.

A minha co-orientada Cristina Wide Pissetti, agradeço pela disponibilidade em ajudar e pelas valiosas idéias que contribuíram para a boa condução deste trabalho.

Ao Rafael Faria de Oliveira, agradeço por toda ajuda, muitas vezes de longe, a cada e-mail respondido e por toda atenção que teve desde o início do meu trabalho.

As amigas Betânea Maria Ribeiro e Mônica Miguel Sawan Mendonça pela amizade e pelo apoio.

Ao colega Maurício Llaguno pela horas de paciência revisando os prontuários e ajudando a classificar os pacientes em relação a forma clinica.

Aos amigos do laboratório de Imunologia, Parasitologia e Biologia Molecular que sempre tinham uma palavra amiga e motivadora: Paula Degani, Marcus Vinícius, Beatriz, Patricia Lins, Ana Claudia Correa, Luciano, Keila Adriana, Lucilia agradeço pela boa convivência e pelos laços de amizade construídos.

Aos amigos, agradeço pelos momentos de descontração e pelo incentivo que sempre me ajudou a crescer:

À minha família, agradeço por estar sempre ao meu lado vibrando a cada vitória! E dando colo e apoio nos momentos que cheguei a achar que não conseguiria. Aos meus pais dedico esta conquista que foi possível graças ao amor, coragem, dedicação, zelo e oração de vocês!

Aos amigos do Laboratório de Patologia Clinica, pelo apoio e torcida e para os simplesmente colegas obrigada pelos obstáculos pois me tornei mais forte e mais merecedora. Aos professores que tive em toda minha vida acadêmica, todos de alguma forma contribuíram com a profissional que sou A Ana Carla, Valéria.

A todos que direta ou indiratamente contribuíram para a realização deste trabalho, meu sincero agradecimento. Aos pacientes,

Muito obrigada!

Resumo

A doença de Chagas é causada por um protozoário flagelado, o Trypanosoma cruzi, e foi

descrita por Carlos Chagas em 1909, sendo uma importante doença parasitária crônica. Estima-se

que 7 a 8 milhões de pessoas no mundo, principalmente na América Latina, estejam infectadas por T.

cruzi. Manifesta-se influenciada por muitos fatores ainda não totalmente esclarecidos, e geralmente é

acompanhada de uma fase aguda assintomática ou sintomática que evolui para a fase crônica. Várias

citocinas são detectadas em pacientes chagásicos nas diversas formas da doença. Algumas têm

efeito protetor e outras estão relacionadas com gravidade da lesão. O objetivo deste trabalho foi

investigar a importância de polimorfismos genéticos (SNP) nos genes da IL- 4, IL-10, IL-12, TNF-α,

FcγRIIa e iNOS no desenvolvimento das formas clínicas da Doença de Chagas. Dessa forma,

avaliamos a presença de polimorfismos genéticos SNP para IL-4 (33 C/T); IL-10 (-819 C/T e -1082

A/G); IL-12B (1188 C/A), FcγIIa (A/G), iNOS (-1173 C/T) e do TNF-α (-308 A/G) por PCR em tempo

Real e associamos o genótipo do polimorfismo com a infecção por T. cruzi. O estudo foi realizado em

656 indivíduos atendidos no ambulatório Maria da Glória (HC/UFTM), sendo 243 (37%) com sorologia

negativa (grupo controle) e 413 (63%) com sorologia positiva, classificados de acordo com a forma

clínica: indeterminada (n= 130), cardíaca (n = 238) e mista (45). Avaliando o polimorfismo das

citocinas IL-4, IL-12B, FcγIIa não houve diferença significativa ao compararmos a frequência dos

genótipos e dos alelos em relação a sorologia e com as formas clínicas. Para IL-10 (-1082 A/G)

houve uma associação significativa entre o genótipo AG e a soropositividade ao T. cruzi (p< 0,05 e

OR= 1,642). Da mesma forma para o TNF-α (-308 A/G) observou-se significante associação entre a

frequência do alelo A e dos genótipos AA+AG com a soropositividade. Já o polimorfismo do gene da

iNOS mostrou importância quanto a forma clínica, sugerindo que a maior frequência do alelo C está

associado à forma cardíaca. Este estudo colocou em evidência que o polimorfismos dos genes da IL-

10, TNF-α e iNOS podem influenciar na suscetibilidade à Doença de Chagas.

Palavras-chaves: Doença de Chagas, suscetibilidade genética, polimorfismos, T. cruzi

Abstract

Chagas disease is an important chronic parasitic disease caused by a flagellated protozoan,

Trypanosoma cruzi, and described by Carlos Chagas in 1909. It is estimated that 7 to 8 million people

worldwide, mostly in Latin America, are infected by T. cruzi. Its manifestations are influenced by many

factors not fully understood yet that develop a variety of clinical conditions, presenting generally an

asymptomatic or symptomatic-acute phase that progresses to the chronic phase. On chagasic

patients, several cytokines are detected in the various forms of the disease. Many of these have a

protective effect and others are related to injury severity. Thus, the objective of this work was evaluate

the presence of IL-10 (Interleukin-10), IL-4 (Interleukin-4), IL-12 (Interleukin-12), TNF-α, FcγRIIa and

iNOS genetic polymorphisms (SNPs), and associate the polymorphic genotype with T. cruzi infection

as well. The study consisted of 656 patients seen at the outpatient clinic Maria da Glória (HC/UFTM),

243 seronegative (control group) and 413 seropositive, classified according to the clinical form:

indeterminate (n = 130), cardiac (n = 238) and mixed (45). By assessing IL-4, IL-12B and FcγIIa

polymorphisms, we haven’t found statistic difference when comparing genotype and allelic frequency

according to serology and clinical forms. IL-10 (-1082 A/G) polymorphism showed a significative

association among patients with AG genotype and positivity for T. cruzi (p<0,05 and OR= 1,642). For

TNF-α (-308 A/G) we found significative association among soropositivity, allelic A frequency and

AA+AG genotypes. iNOS gene polimorphism is important for clinical forms, suggesting that presence

of C is associated with cardiac form. Thus, we conclude that IL-10, TNF-α and iNOS polimorphisms

can influence at Chagas disease pathogenesis.

Keywords: Chagas disease, Trypanosoma cruzi, polimorphism, genetic susceptibility.

Introdução

1.1 Doença de Chagas

A Doença de Chagas (tripanossomíase americana) é uma infecção causada pelo protozoário

flagelado Trypanosoma cruzi, descoberta e descrita por Carlos Chagas em 1909 (CHAGAS, 1909). É

um dos mais importantes problemas de saúde pública em vários países Latino-Americanos. Tem

caráter endêmico, acometendo largas extensões territoriais do continente (ABEL et al., 2001).

Acredita-se que a doença de Chagas tenha surgido há milhões de anos entre os animais

selvagens (doença enzoótica). O homem ao iniciar uma ação predatória, devastando matas e

florestas, com o intuito de ocupar o espaço físico para criar gados e desenvolver a agricultura,

acentuou-se o desmatamento nos últimos dois a três séculos e os triatomíneos tiveram que se

adaptar, passando a alimentar-se de sangue de humanos e animais domésticos. (ARAGÃO, 1983). A

adaptação de triatomíneos para habitações humanas e a circulação de T. cruzi entre os homens, os

animais selvagens e domésticos foram determinantes para o estabelecimento da infecção humana

(FORATTINI, 1980).

No século XX estimava-se que em uma população de cerca de 360 milhões de habitantes de

países endêmicos pelo menos 90 milhões de pessoas (25%) estavam sob risco de infecção e cerca de

16 a 18 milhões estariam infectados (WHO, 1991; ABEL et al., 2001). No território brasileiro haviam

cerca de 5 milhões de infectados, cuja metade seriam apenas portadores, sem manifestação clínica e

a outra metade chegaria à óbito por consequência direta ou indireta da infecção (SOUZA, 2000;

MANOEL-CAETANO; SILVA, 2007).

Após o início dos programas de controle vetorial em vários países endêmicos, houve redução

na transmissão, o que proporcionou decréscimo substancial na incidência da doença (MONCAYO,

2003; WHO, 2002). Em junho de 2006, o Brasil recebeu da Organização Mundial de Saúde (OMS) uma

certificação relativa à eliminação da transmissão da doença de Chagas pelo principal vetor (Triatoma

infestans) e pela via transfusional (DIAS, 2006).

Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (WHO, 2013), o Trypanosoma cruzi infecta

hoje em torno de 7 milhões de pessoas na América Latina, sendo responsável pela alta prevalência,

morbidade e letalidade. No Brasil, esta parasitose constitui um dos mais graves problemas de saúde

pública devido a sua alta prevalência e expressiva morbidade.

A transmissão ocorre quando o T. cruzi atinge a circulação sanguínea do indivíduo. De acordo

com a sua forma de transmissão a Doença de Chagas pode ser adquirida ou congênita sendo a

primeira a mais frequente. Dentre os principais mecanismos de transmissão estão: a transmissão

vetorial por triatomíneo (transmissão natural), oral, transfusional, congênita, acidental e por

transplante de órgão (SILVEIRA; VINHARES, 1998).

A transmissão da doença de Chagas por vetores é realizada por um hematófago, um

Hemiptera, da família Reduvidae, subfamília Triatominae. São conhecidas mais de 130 espécies de

triatomíneos potenciais vetores do T. cruzi, a grande maioria vivendo em associação com aves e

mamíferos silvestres, utilizados como fonte alimentar, e no caso dos mamíferos, também para

manutenção do ciclo do parasito na natureza. Destacam-se como de importância em saúde pública

pela sua capacidade de domiciliação e antropofília as seguintes espécies: T. infestans, R. prolixus, T.

dimidiata, P. megistus, T. brasiliensis, T. pseudomaculata, T. sórdida, T. maculata, T. phylosoma e R.

Palescens. (LENT, 1979). Sendo os de maior destaque o Triatoma infestans e Rhodnius prolixus

(KOLLIEN; SCHAUB, 2000).

A infectividade natural do vetor é variável, dependendo de alguns fatores como

susceptibilidade do triatomíneo de se infectar a partir de um hospedeiro infectado no momento do

repasto sanguíneo e a capacidade da cepa de se desenvolver no vetor. (GARCIA; DVORAK, 1982;

PERLOWAGORA-SZUMLEWICZ; MOREIRA, 1994).

O ciclo de vida do T. cruzi é complexo e inclui duas formas extracelulares e intracelulares nos

hospedeiros vertebrados. A forma extracelular é tripomastigota, que não se divide, está presente na

corrente sanguínea. Essas formas são ingeridas pelo inseto vetor após o repasto sangüíneo. No

intestino médio do inseto, tripomastigotas se diferenciam em epimastigotas que se multiplicam e

migram para o intestino posterior, onde se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos. Esta é a

forma infectante que é excretada com as fezes e infecta hospedeiros vertebrados, passando através

de mucosas ou lesões na pele. Eles, então, invadem células vizinhas, diferenciando-se em

amastigotas. Multiplicam-se no citoplasma celular, amastigotas transformam-se em tripomastigotas.

Após a ruptura das células as formas tripomastigota ganham a corrente circulatória e tecidos

adjacentes. Assim, formas tripomastigotas se espalham e podem invadir diferentes tipos celulares,

formando ninhos de amastigotas, incluindo células musculares cardíacas e esqueléticas, onde fazem

novos ciclos intracelulares, neles podendo causar lesões de intensidade variável (DaROCHA et al.,

2002).

Depois de adquirida, a doença de Chagas pode se dividir em duas fases: a aguda e a crônica,

com ou sem sintomatologia. (DIAS; COURA, 1997). A fase aguda caracteriza-se por alta parasitemia,

intensidade do processo inflamatório, podendo ser assintomática (mais comum) ou sintomática.

Quando apresenta sintomas são: febre, mal estar, edemas, hepatoesplenomegalia, conjuntivite

unilateral (sinal de Romaña), miocardite, infartamento ganglionar generalizado, taquicardia,

elementos diretamente relacionados com a defesa celular e meningoencefalite. (TORRES, 1917;

ANDRADE, 1958). Ocorre aumento da parasitemia devido à multiplicação exponencial do parasita.

A fase aguda dura entre 10 a 60 dias, após esse período há diminuição dos parasitas na

circulação, sendo pouco encontrado normalmente na fase crônica. O início da infecção pode ser

acompanhado de sintomas e sinais locais, decorrentes da penetração do parasita e representado

pelo sinal de Romaña ou pelo chagoma de inoculação, com formação de uma lesão exsudativa

proliferativa, acompanhada de reação ganglionar satélite (DIAS et al., 1956; ANDRADE, 1958). Essa

fase apresenta um curso clínico curto e reações inflamatórias nos tecidos parasitados (DIAS, 1984). O

principal tecido acometido é o cardíaco, cuja manifestação é a miocardite grave, relacionada com a

presença de parasitas intracelulares (ANDRADE, 1982; PRATA; MACÊDO, 1984; PRATA, 2001). Os

sintomas e sinais da infecção inicial são, em regra, transitórios, regredindo parcial ou totalmente

após os primeiros meses de doença (geralmente, após dois a quatro meses). Alguns doentes morrem

durante essa fase, com manifestações de meningo-encefalite ou de insuficiência cardíaca ou, de

ambas. Sem tratamento, a mortalidade decorrente dessas causas é de cerca de 5 a 10% (PRATA,

2001). Na maioria, porém, a doença se desenvolve de maneira favorável, passando a uma fase de

cronicidade assintomática ou com sintomas de variável intensidade (DIAS et al., 1956).

Na doença humana, durante a primeira semana, formas de tripomastigotas podem ser

detectadas por exame microscópico em sangue fresco. No final de dois meses de infecção,

tripomastigotas diminuem na circulação controlada pela resposta imune adaptativa, podendo apenas

ser detectados por meio de métodos parasitológicos de xenodiagnóstico e hemocultura (BRENER,

1987). Baixos níveis de parasitismos intracelulares teciduais persistem durante a vida do hospedeiro,

que podem ser observados através de técnicas como imunohistoquímica, Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR) in situ ou PCR convencional (TARLETON; ZHANG, 1999). Pode-se detectar presença

de anticorpos séricos da classe IgG, sendo importantes para o diagnóstico sorológico (HOFT et al,

2000). Depois de dois a quatro meses, as manifestações clínicas agudas desaparecem e os parasitas

são raramente detectados no sangue periférico. O parasitismo tissular é escasso.

A doença entra na fase crônica, geralmente começando com um longo período

assintomático, chamado de forma indeterminada, que acomete a maioria dos doentes (50 a 60%)

podendo persistir de dez a trinta anos ou por toda a vida. Cerca de 20 a 30% desenvolvem, após 10 a

20 anos de infecção, miocardiopatia de gravidade variável; 8 a 10% apresentam a forma digestiva,

caracterizada por dilatações do esôfago e/ou cólon (megaesôfago e megacólon). Os demais

pacientes apresentam associação das manifestações cardíaca e digestiva, conhecida como forma

mista (BRENER, 1987; DIAS, 1989).

A fase crônica é caracterizada pela baixa parasitemia e elevado número de anticorpos

circulantes. Esse comprometimento do sistema imune pode atingir os gânglios e causar uma

miocardite focal discreta, progressiva e fibrosante com exsudação de células mononucleadas, ou

formando nódulos que se assemelham a granulomas. Não há fibrose, mas visualizam-se focos de

cicatrização (LOPES et al., 1981), podendo ou não haver hipertrofia do coração (FERRAZ et al, 2007).

A maioria dos casos agudos não tratados evolui para a forma crônica indeterminada.

Caracterizada por positividade de exames sorológicos e/ou parasitológicos, ausência de sintomas

e/ou sinais da doença, eletrocardiograma convencional normal e coração, esôfago e cólons

radiologicamente normais. Esses critérios estão de acordo com a Validade do Conceito de Forma

Indeterminada da Doença de Chagas, apresentado em 1985. (MACEDO, 1997)

A evolução clínica de pacientes com a forma indeterminada é geralmente lenta e benigna.

Em longo prazo, a evolução desses pacientes é favorável, e eles, geralmente, morrem de outras

causas (DIAS, 1989).

A forma digestiva pode acometer o esôfago, que na fase precoce é caracterizada pela

incoordenação dos movimentos peristálticos do esôfago e colón devido a destruição dos plexos

mesentéricos e mais tarde são seguidos por dilatação, disfagia e sintomas relacionados. Constipação

prolongada é o principal sintoma do megacólon, que apresenta diferentes graus de dilatação

(BRENER, 1987).

No megaesôfago e megacólon há sempre algum grau de destruição do sistema nervoso

autônomo, que precede as alterações de motilidade. Existem lesões nas camadas musculares, mas

não se sabe se são primárias ou secundárias (KÖEBERLE, 1957; PRATA, 2001).

Em algumas circunstâncias, principalmente quando o quadro cardíaco é muito intenso na

fase aguda, há uma evolução direta para a forma crônica sintomática. Do ponto de vista

epidemiológico, as formas crônicas sintomáticas da doença de Chagas humana são as que causam

maiores impactos médico-sociais, principalmente a cardiopatia crônica, que é a principal

manifestação mórbida da doença. (PRATA, 2001). Incidindo em chagásicos de todas as áreas

endêmicas, em torno de 10 a 40% dos chagásicos crônicos.

Nos estágios iniciais da forma cardíaca, o paciente pode ser assintomático ou apresentar

sintomas relacionados a distúrbio de ritmo e condução cardíaca (PRATA ,1984). As manifestações

clínicas persistem ou se intensificam, podendo surgir grave insuficiência cardíaca congestiva (ICC)

com fenômenos tromboembólicos e arritmias graves. Os distúrbios do ritmo na presença ou não de

disfunção sistólica podem manifestar-se com quadros de palpitações e alguns casos com sinais de

baixo débito transitório como lipotimia e síncope. As embolias pulmonares e sistêmicas originadas de

tromboses murais em câmaras cardíacas são relativamente frequentes no curso clínico da

cardiopatia chagásica e em alguns casos se constituem na primeira manifestação da doença. (SIMÕES

et al., 2000). Pacientes portadores dessa forma clínica apresentam miocardite usualmente intensa e

difusa, sendo acompanhada de cardiomegalia, lesões vasculares e fibrose (REZENDE; RASSI, 1983;

MARIN-NETO et al., 1980).

Aspectos morfológicos

Aproximadamente 90% dos pacientes sobrevivem à fase aguda e a classificação anátomo-

clínica da doença é dada pela intensidade da parasitemia e da resposta inflamatória (ABEL; KALIL;

CUNHA-NETO, 1997; MANOEL-CAETANO; SILVA, 2007).

Pacientes acometidos pela Doença de Chagas apresentando miocardite apresentam

macroscopicamente aumento da área cardíaca. Com uma distensão e congestão do saco pericárdico

com maior quantidade de líquido resultando da intensa inflamação que acometem os três folhetos

cardíacos, principalmente o miocárdio. O epicárdio pode apresentar espessamento brancacento,

nodular ao longo dos ramos coronarianos, caracterizando uma pericardite produtiva. Esta

pericardite é mais comum na fase crônica, podendo acontecer na fase aguda. Geralmente o

endocárdio tem aspecto normal e, raramente, pode ocorrer trombose intracavitária. (AÑEZ, et al.,

1999; ANDRADE, et al., 2006; BENVENUTI; GUTIERREZ, 2007).

Na microscopia a lesão inflamatória acomete os três folhetos cardíacos simultaneamente,

com uma verdadeira pancardite. Além de congestão e edema verifica-se predomínio de intenso

infiltrado de mononucleares (macrófagos, linfócitos, linfobrastos e plasmócitos) e quantidade

variável de mastócitos e granulócitos, inclusive eosinófilos. O infiltrado penetra no endomíssio,

sobrepondo ao longo dele ou formando acúmulos, mascarando as fibrocélulas, dissociando-as e

separando-as dos capilares, estendendo-se o perimísio e à adventícia dos vasos. Na fase aguda há um

parasitismo intenso principalmente nas células musculares, visualizando os ninhos de amastigotas.

Mas podendo parasitar outras células como macrófagos subepicárdicos e intramusculares, as células

de Schwann dos gânglios e outras, porém não se encontram ninhos típicos, visualizando no máximo

alguns parasitas (AÑEZ et al., 1999; BILATE; CUNHA-NETO, 2008).

Principalmente nas células musculares cardíacas é que se cumpre o ciclo do parasita, onde se

inicia a inflamação caracteristicamente intrafascicular. Aparecendo a reação inflamatória somente

em torno das fibras parasitadas rotas. As miocélulas parasitadas em geral não degeneram, sendo

destruída somente uma parte, ao se romper as formas amastigotas e os demais elementos caem no

interstício, desencadeando o processo inflamatório (ANDRADE, 1999).

As fibras musculares não parasitadas mostram várias lesões, desorganização e destruição dos

sarcômeros, lise ou dissociação das microfibrilas. Ocorre ainda hipotrofia e necrose com esfacelo de

grande número de fibras. Apesar da gravidade do processo inflamatório e dos fenômenos destrutivos

que o acompanham, a fibrose não existe ou é discreta durante a fase aguda (AÑEZ, et al., 1999;

ANDRADE, et al., 2000).

Pode ser observada uma epicardite aguda variável, ora focal, ora difusa, atingindo

especialmente o tecido gorduroso e as estruturas nervosas podendo acarretar ganglionite,

periganglionite e neurite agudas. Também o endocárdio parietal mostra discreta inflamação aguda,

focal ou difusa. Os linfonodos intrapericárdicos, situados entre a aorta e o tronco pulmonar mostram

quadro de depleção linfocítica, porém não há relatos de parasitismo (AÑEZ, et al.,1999).

A cardiopatia chagásica crônica, cujo substrato morfológico é uma inflamação crônica

progressiva e fibrosante, que pode ser assintomática ou apresentar-se como uma síndrome

congestiva e/ou alterações do ritmo cardíaco e da condução do estímulo elétrico.

Macroscopicamente o epicárdio quase sempre apresenta espessamentos brancacentos, sob

a forma de placas, faixas ou estrias, apresentando pequenos nódulos disseminados na superfície

atrioventricular ou ao longo dos ramos coronários. Microscopicamente o quadro histológico geral é

uma inflamação crônica fibrosante do tecido gorduroso subepicárdico. Além dos espessamentos

pode apresentar epicardite fibrinosa. Uma miocardite crônica fibrosante que se mantém em

atividade pela eclosão de repetidos focos inflamatórios, os quais confluem, conferindo à lesão um

aspecto zonal ou difuso. Os focos inflamatórios predominando intrafasciculares ou endomissiais

estendem-se geralmente ao conjuntivo interfascicular ou à adventícia dos vasos de pequeno e médio

calibre (ANDRADE, 1999; ANDRADE et al.,2006; MANOEL-CAETANO; SILVA, 2007; BILATE; CUNHA-

NETO, 2008).

Os processos degenerativos variam de intensidade nas diversas áreas miocárdicas. Atingem

fibras contidas nos focos inflamatórios ou encerradas nas áreas de fibrose. Em fases mais avançadas

do processo, grupos de miofibrilas desaparecem em meio ao infiltrado celular, e restos celulares são

observados no interior dos macrófagos. Em outras áreas, focos inflamatórios são menos destrutivos,

o infiltrado diminui ou desaparece, permanecendo íntegra a estrutura do sarcolema e do endomísio

(ANDRADE, 1999).

Com a diminuição ou desaparecimento do infiltrado surge neoformação conjuntiva a partir

do endomísio, a qual substitui as fibras cardíacas destruídas e associado a esta ocorre colapso da

trama reticular miocárdica. O colágeno neoformado afasta e circunda as demais fibrocélulas que se

atrofiam e desaparecem. Nas zonas de fibrose, o colágeno é dos tipos I e III. A fibrose pode atingir e

envolver o perimísio e unir-se a fibras de outros fascículos adjacentes, que se tornam não só

interrompidos, mas também fixados uns aos outros pelo conjuntivo esclerótico neoformado

(ANDRADE, 1999; LOPES, et al, 2006).

Patogenia

Quando se refere a patogenia da Doença de Chagas, entendem-se todos os mecanismos

envolvidos na produção de lesão pelo T. cruzi. Esses mecanismos se correlacionam com fatores que

podem atuar direta ou indiretamente, qualitativa e quantitativamente na determinação e evolução

da infecção. Podendo ser divididos em: 1) Fatores dependentes do parasita (polimorfismo, tropismo,

virulência, constituição antigênica, número de T. cruzi, tipo de cepa e outros) e 2) Fatores inerentes

ao hospedeiro (constituição genética, sexo, idade, espécie, resposta imunológica, infecção, fatores

nutricionais e outros). (TAFURI, 1987).

Embora haja uma literatura rica sobre o assunto, não há respostas concretas à maioria

dos mecanismos que regulam a mudança da reatividade local e geral do organismo na

evolução da doença da fase aguda para a crônica durante a infecção chagásica. Acredita-se

que o parasita apresenta um papel fundamental durante as fases aguda e crônica da doença,

provavelmente dependente do tipo de cepa presente na infecção.

O mecanismo de patogênese na doença de Chagas está baseado em duas hipóteses: a

primeira seria que a persistência do T. cruzi em locais específicos nos hospedeiros infectados

resultaria em uma reatividade inflamatória crônica; a segunda hipótese seria que a infecção pelo T.

cruzi induziria a uma resposta imune na qual os próprios tecidos são alvos, independente da

persistência do parasita (TARLETON, 2001).

Outra hipótese que foi proposta é que a auto-imunidade poderia facilitar a compreensão da

patogênese da doença. (KALIL; CUNHA-NETO, 1996). Embora não visualize a presença de T. cruzi nos

tecidos e sangue na fase crônica da doença, encontram-se focos de infiltrado de células

mononucleares no coração de pacientes infectados pelo T. cruzi nessa fase. Ocorrendo um

predomínio de células TCD8+ e alguns macrófagos, (REIS et al., 1993) e as fibras cardíacas destruídas,

infectadas ou não, encontram-se associadas com linfócitos T CD4+ ou CD8+ (TOSTES JUNIOR et al.,

1994). A parasitemia baixa e lesão tecidual, aliada a presença de fibras destruídas, mesmo sem a

detecção do parasita no local, tem servido de base à hipótese da existência de auto-imunidade

contra o tecido cardíaco.

No contexto de autoimunidade, diversos antígenos tissulares foram descritos nas duas

últimas décadas como elementos alvo dos linfócitos T e B autorreativos, e diversos

mecanismos foram propostos como responsáveis pela indução de autorreatividade (LEVITUS

et al., 1991). A hipótese de autoagressão foi considerada durante algumas décadas como a

mais provável para explicar a patologia chagásica (RIBEIRO-DOS SANTOS; ROSSI, 1985).

No momento discute-se muito a teoria imunitária, ou seja, a autoimunidade como fator

principal da patogenia da doença, embora existam grandes dúvidas quanto aos mecanismos

autoimunitários, vários anticorpos têm sido detectados em pacientes naturalmente infectados

ou em animais de experimentação.

Muitos autores têm proposto que o padrão de resistência ou susceptibilidade à infecção

pelo T. cruzi está relacionado ao tipo de citocinas produzidas, com participação destacada das

citocinas Th1, responsáveis por promover a resistência (SILVA et al., 1992; HOFT et al.,

1993; MINOPRIO et al., 1993; REED et al., 1994). Assim, a resistência ao parasita

dependeria de citocinas tais como o IFN-γ, TNF-α e IL-12, enquanto IL-10, IL-4 e TGF-β

promoveriam a susceptibilidade (SAVINO et al., 2007).

1.2 Resposta Imune na Doença de Chagas

Grande parte das manifestações clínicas da doença de Chagas no homem acredita-se ser

consequência da resposta imune dirigida ao parasita. A infecção por T. cruzi sensibiliza diferentes

mecanismos do sistema imune, ocasionando o aparecimento de respostas humorais (TAKEHARA et

al., 1981; KRETTLI; BRENER, 1982; TAKEHARA et al., 1989) e celulares (ROBERSON; HANSON, 1973;

TARLETON, 1990; NICKELL, KEANE; SO, 1993) contra o parasita.

No início da infecção, o parasitismo é eventualmente controlado por vários mecanismos

imunes: citocinas ativadoras de macrófagos, opsonização através de anticorpos e citotoxicidade

medida por células T. A resposta imune controla o parasitismo, mas falha ao tentar eliminar

completamente o parasita; por isso, os pacientes permanecem infectados por toda vida (HUDSON;

BRITTEN, 1985). Várias evidências apoiam a hipótese de que a persistência do T. cruzi nos tecidos

seria o estímulo para a resposta inflamatória crônica, que resulta em destruição tecidual (TARLETON;

ZHANG, 1999; TARLETON, 2001).

A inflamação é o processo patológico básico da doença de Chagas. A resposta inflamatória

que segue à infecção pelo T. cruzi é essencial à resistência do hospedeiro, mas também é responsável

pela patologia observada na doença de Chagas (TEIXEIRA et al., 2002). A inflamação focal pode ser

destrutiva não só para as células parasitadas, mas também para as células não parasitadas. Ela se faz

inicialmente à custa de linfócitos e logo depois, de neutrófilos e eosinófilos (BRENER; ANDRADE;

BARRA-NETO, 2000).

Estudos relacionam a imunidade celular como sendo um importante mecanismo para a

proteção à infecção experimental por T. cruzi, visto que camundongos geneticamente desprovidos de

timo (KIERZENBAUM; HOWARD, 1976) ou timectomizados logo após o nascimento (SCHMUNIS et al.,

1971) apresentam um aumento da susceptibilidade ao T. cruzi., sugerindo que linfócitos T favorecem

a resistência à infecção. A diminuição ou mesmo destruição de células T CD4+ (RUSSO et al., 1988)

aumenta a susceptibilidade de animais à infecção, induzindo maiores níveis de parasitemia e

mortalidade. As células T CD8+ possuem um papel no controle da resposta imune da infecção,

demonstrado através de um trabalho de Tarleton (1990), onde animais foram infectados com uma

cepa virulenta de T. cruzi e foram tratados com anticorpo anti-CD8+, e ainda, a ausência de células

CD8+ em camundongos mutantes para o gene da ß2-microglobulina resultam no aumento da

susceptibilidade à infecção (TARLETON et al., 1992).

Está bem documentada a ação do sistema imune na resistência à infecção, não havendo,

entretanto, consenso sobre a contribuição específica de cada componente. Muitas evidências

mostram a participação das células B, células T (CD4+ e CD8+), células Natural Killer (NK) e macrófagos

no controle da infecção (LAUCELLA; ROTTENBERG; TITTO, 1996).

Na tentativa de controlar a infecção pela resposta imune na Doença de Chagas, ocorre

detecção e destruição dos parasitos diretamente, em especial por células dendríticas e macrófagos,

com a ativação dessas células no intuito de potencializar suas funções como apresentadores de

antígenos, e consequentemente, direcionar uma resposta imune adaptativa eficiente; e pelo

monitorando da infecção de células não-fagocíticas, que são o alvo primário da infecção por T.cruzi.

A presença de T. cruzi estimula uma linha de defesa, composta por macrófagos e células NK.

(NOGUEIRA; COHN, 1978). Em hospedeiros infectados, tem sido observado o aumento da atividade

lítica das células do hospedeiro e pelo aumento de populações linfocitárias com marcadores

característicos das células NK (CD69 no homem). Estas liberam o IFN-γ que atua ativando macrófagos

(GAZZINELLI et al., 1992). Estes por sua vez, produzem TNF-α e IFN-γ e induz a produção de óxido

nítrico que é tóxico e eliminam os parasitas. (VESPA; CUNHA; SILVA, 1994; MARTINS et al., 1998).

Além do TNF-α, várias outras citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6 e IL-12 e quimiocinas como

IP-10, MCP-1, MIG e RANTES são produzidas pelos macrófagos ativados e, por sua vez, recrutarão

várias células do sistema imunológico.

O exsudado inflamatório na miocardite chagásica é constituído principalmente por linfócitos

e macrófagos. (ALMEIDA, 1986). A miocardite pode evoluir de vários modos, agravando-se devido à

intensidade e à qualidade do exsudato inflamatório e alterações vasculares (TAFURI et al., 1971;

HIGUCHI et al., 1987).

Na população de linfócitos T, além da expressão da proteína CD3, são expressas

moléculas acessórias, CD4 e CD8. A molécula de CD4 é expressa em aproximadamente 60%

das células T maduras CD3+, enquanto CD8 é expressa em cerca de 30% das células T

(ABBAS; LICHTMAN, POBER, 2005). As células T CD4+ são extremamente importantes

na proteção contra a infecção pelo T. cruzi, visto que são necessárias para a produção de

citocinas Th1, como a IL-12 e IFN-γ, que auxiliam na ativação de macrófagos e na destruição

de formas intracelulares do parasito em células infectadas (ALIBERTI et al., 1996;

TARLETON et al., 1996; BRENER; GAZZINELLI, 1997). Estas células contribuem também

estimulando os linfócitos B e produção de anticorpos líticos (BRENER; GAZZINELLI, 1997)

Estudos apontam as células T CD8 + envolvidas nos mecanismos imunopatológicos.

(CUÑA; CUÑA, 1995). Essas células dominam o foco inflamatório nos tecidos parasitados e

sua ausência leva à replicação descontrolada do parasita e subsequente morte do hospedeiro

infectado. Trabalho de Reis e colaboradores (1993) realizou imunoistoquímica em tecidos

cardíacos, originado de pacientes com cardiomiopatia chagásica grave, mostrando que os

processos inflamatórios são caracterizados principalmente por linfócitos T CD8+, nos quais

muitos expressam granzima A. Células T CD8+ além de serem importantes produtoras de

IFN-γ na infecção chagásica, apresentam citotoxidade in vitro em resposta a antígenos

expressos por T. cruzi. (GARG et al., 1997; WIZEL; NUNES; TARLETON, 1997; GARG;

TARLETON, 2002). Autores sugerem que estas células são as principais efetoras da

patogênese, contribuindo para o desenvolvimento de citólise e fibrose em resposta a

citopatologia (BRENER. GAZZINELLI, 1997)

No que diz respeito à ativação de célula T em paciente chagásico crônico, mostrou-se que

indivíduos com a forma indeterminada ou severa da doença de Chagas apresentam uma alta

freqüência de circulação de células T CD4+ e CD8+ com ausência de molécula CD28 de superfície

(DUTRA et al., 1996). As células T ativadas, particularmente a subpopulação de célula T CD8+, foram

também encontradas no infiltrado inflamatório das lesões (REIS et al., 1993).

CARDONI; ANTÚNEZ; ABRAMI ,(1999) avaliaram a cinética das células NK e a produção de IL-

12 e IFN-γ pelas células do baço de camundongos, infectados experimentalmente com cepas de T.

cruzi e afirmaram que o efeito central do IFN-γ in vivo seria a geração do óxido nítrico, para

destruição intracelular dos parasitas. Ainda observaram que durante toda a fase aguda houve um

aumento na produção de IL-12 e IFN-γ pelas células esplênicas, devido ao aumento da atividade das

células NK. Concluíram que a resposta global na fase aguda foi, predominantemente, do tipo Th1 nas

diferentes cepas de camundongos e que os fatores que controlam essa resposta protetora são de

importância primária para determinar a resistência à infecção ou o dano tissular. Mantovani,

Allavena e Sica (2004), chegaram às mesmas conclusões que o perfil Th1 representado

principalmente pelas citocinas inflamatórias IFN-ү e TNF-α ativam macrófagos, assim como o próprio

parasito pode ativar resultando em um padrão caracterizado pela produção elevada de agentes

antimicrobicidas como o óxido nítrico (NO) e as espécies reativas do oxigênio. Desse modo, parece

claro que a ativação clássica dos macrófagos por citocinas pro-inflamatórias exercem um papel

fundamental no controle da parasitemia e mortalidade na fase aguda da infecção por T. cruzi.

O estudo de Reis e colaboradores (1993), no qual usaram um painel de anticorpos

monoclonais e policlonais, caracterizou imunohistoquimicamente as células inflamatórias em

corações de pacientes com cardiopatia chagásica crônica; demonstrou que o tipo de célula

dominante nas lesões inflamatórias era linfócito T CD8 muitos dos quais expressavam granzima A, as

células B e macrófagos. Granzima A é um mediador solúvel presente nos lisossomos dos linfócitos T

citotóxicos e penetram nos poros da membrana das células, degradando substâncias no interior

dessas e ativando o processo de apoptose. Encontraram ainda poucos macrófagos que expressavam

TNF-α e poucas células NK e linfócitos B nas lesões. Concluíram que a demonstração de linfócitos

granzima A+ nas lesões cardíacas dos chagásicos cardiopatas gerava fortes evidências para o

envolvimento de eventos citotóxicos na destruição dos tecidos miocárdicos, enfatizando a grande

participação das células T CD8+ na doença de Chagas humana.

Os processos inflamatórios estão associados com as lesões ocorridas pela presença do T.

cruzi e, por sua vez, com a produção de citocinas e quimiocinas que recrutam e ativam células

inflamatórias. (HODGE-DUFOUR et al., 1998). Citocinas do tipo Th1, como o IFN-γ, na fase aguda da

infecção chagásica, age eliminando o parasita. (MICHAILOWSKH et al., 1998). Entretanto, durante a

fase crônica da infecção, uma exacerbação da resposta imunológica da produção exagerada de IFN-γ

pode promover a destruição do miocárdio (REIS et al., 1997; BAHIA-OLIVEIRA et al.,2000)

As citocinas mostram um papel fundamental na infecção pelo T. cruzi e suas atuações

determinam o início, a duração e a composição da resposta imune. O IFN-γ é considerado uma

citocina de defesa estando relacionada com a resistência à infecção, devido a sua capacidade de

ativar os macrófagos que, por sua vez, apresentam atividade tripanocida. Macrófagos infectados

liberam IL-12, que estimulam as células NK a produzir IFN- γ. O IFN-γ em associação com TNF-α,

induzem a expressão da enzima óxido nítrico sintetase (iNOS) através dos macrófagos e,

consequentemente, a produção de óxido nítrico, que apresenta atividade microbicida sobre o T.

cruzi.

As interleucinas IL-4 e IL-10 e o Fator Transformador de Crescimento Beta (TGF-β) suprimem

a ativação dos macrófagos induzida por IFN-γ desativando a capacidade tripanocida dos macrófagos

e inibindo a liberação de óxido nítrico e também a diferenciação de células Th1. (GAZZINELLI et al.,

1992). O estudo de Silva et al., 1991 mostrou que o TNF-α é um potente inibidor dos efeitos de

ativação de citocinas por macrófagos in vivo e in vitro, tendo papel na regulação da infecção (SILVA;

TWARDZIK; REED, 1991).

A IL-6 e a IL-1 estão associadas com as alterações na função das células endoteliais, podendo

estar envolvidas nas alterações microvasculares observadas na miocardite chagásica. As citocinas

IFN-γ, o TNF-α, a IL-6 e IL-1 modulam a expresão de moléculas de adesão, importantes no

recrutamento de linfócitos para os focos inflamatórios. Por isso, qualquer alteração nos níveis ou no

equilíbrio entre as citocinas pode estar associado com a resistência e o desenvolvimento das lesões

vistas na fase crônica da Doença de Chagas. (LAUCELLA; ROTTEMBERG; TITTO, 1996)

Foi sugerido que indivíduo com doença na forma severa tenha uma tendência a produzir

mais IFN-γ comparado com os pacientes indeterminados sob estimulação com antígenos do parasita

(GOMES et al., 2003) e que clones de células T derivadas dos corações de pacientes cardíacos

produza predominante IFN-γ (ABEL et al., 2001). Uma correlação entre níveis de TNF-α e a ocorrência

das formas graves da doença tem sido também estabelecida (TALVANI et al., 2004).

Logo após este controle inicial da parasitemia e do parasitismo tecidual, a miocardite, bem

como a ativação policlonal de linfócitos, são atenuados durante a fase crônica da doença.

Mecanismos imunorreguladores entram em cena, controlando atividade do sistema imune, fator

necessário para prevenção dos aspectos deletérios da estimulação imunológica excessiva. A

diminuição da proliferação das células T está correlacionada com ativação de macrófagos, produção

de NO e produção ineficiente de IL-12 (ABRAHAMSOHN; COFFMAN, 1995)

Nessa fase de regular o sistema imune, as prostaglandinas e o óxido nítrico são cruciais, uma

vez que a interferência em seus níveis, diminuindo-os, está correlacionada com a restauração da

resposta proliferativa dos linfócitos contra antígenos parasitários e uma aumentada produção de

moléculas pró-inflamatórias (PINGE-FILHO et al., 1999). Outro importante aspecto imunorregulador

na resposta anti-T.cruzi é a indução de apoptose de células B e T (LOPES; REIS 1995; FREIRE-DE-LIMA

et al., 2000).

Citocinas imunoregulatórias, como TGF-β, IL-4 e IL-10, também têm destaque no controle da

resposta imune durante a infecção com T.cruzi e modelos experimentais reforçam a importância

destas citocinas. Por exemplo, camundongos deficientes de IL-10 exibem uma forte resposta

inflamatória e embora controlem bem o parasitismo, sucumbem perante uma resposta inflamatória

exacerbada. A depleção de IL-12 tem um efeito retardante na morte destes animais (HUNTER et al.,

1997), reforçando o papel deletério da resposta inflamatória exagerada. No caso da IL-4, animais que

são deficientes nesta citocina mostram uma clara polarização Th1, cursando desta forma com um

parasitismo reduzido e também com intensa miocardite, porém, a IL-4 demonstra ter um papel

menor na regulação da resposta imune na doença de Chagas (HOLSCHER et al., 2000; SOARES et al.,

2001). Outro aspecto importante no que diz respeito às citocinas que imunorregulam a resposta anti-

T.cruzi é a demonstração de que mRNA de IL-4 e IL-10 já são observados 15 dias após a infecção,

sugerindo sua participação desde os eventos iniciais da doença (GOLGHER ;GAZZINELLI, 2004).

Um importante aspecto a ser considerado neste cenário de imunorregulação da resposta

imune na doença de Chagas é a possibilidade de utilização destas vias, por parte do parasito, a fim de

escapar dos mecanismos imunes efetores, promovendo assim sua sobrevivência e estabelecimento

de uma infecção crônica (GOLGHER; GAZZINELLI, 2004). De fato, os efeitos, principalmente de IL-10 e

TGF-β tem repercussões diretas na capacidade microbicida dos macrófagos (SILVA; TWARDZIK; REED,

1991; SILVA et al., 1992). Outro aspecto importante que pode estar relacionado com esta

imunoregulação é a participação das células T reguladoras CD4+CD25+ na doença de Chagas; embora

os estudos relacionados a esta população celular estejam cada vez mais comuns, sua participação

exata na doença de Chagas ainda necessita ser determinada (GOLGHER; GAZZINELLI, 2004).

Este período de dita “latência” da infecção pode perdurar por toda a vida do hospedeiro.

Porém, em uma parcela dos indivíduos este equilíbrio é quebrado e as manifestações clínicas da

doença se manifestam. Ainda há muito a ser esclarecido sobre a exata relação parasito-hospedeiro

envolvida neste desequilíbrio, com as teorias fundamentadas principalmente em três hipóteses: a

patologia sendo derivada da presença contínua do parasito no indivíduo; a patologia sendo gerada a

partir da indução de resposta autoimune exacerbada; e ultimamente, uma tentativa de conciliação

destas duas teorias, onde a interação dos genomas do parasito e do hospedeiro tem um papel

crucial.

As primeiras teorias acerca da patogênese da doença de Chagas vieram a partir da

identificação direta do parasito nos tecidos. Desta forma, a patologia seria devido a uma ruptura da

célula parasitada e liberação dos antígenos do parasito, afetando o tecido e direcionando uma

inflamação crônica. Contudo, esta teoria esbarrava na ausência de demonstração de parasitos nos

tecidos de cerca de 80% dos indivíduos já com a patologia desenvolvida (TEIXEIRA et al., 2006B). Esta

dificuldade foi resolvida com o advento de testes imunológicos e, em especial moleculares, que

demonstraram a presença de kDNA de T. cruzi nos tecidos de indivíduos chagásicos (ZHANG;

TARLETON, 1999). No entanto, somente a detecção de DNA nuclear, ou seja, nDNA é indicativo de

uma infecção ativa com T.cruzi (BRAGA et al., 2000; LAURIA-PIRES et al., 2000). De fato, as

manifestações crônicas da doença de Chagas não estão relacionadas com severa parasitemia, pelo

contrário, esta é praticamente ausente na fase crônica da doença (TEIXEIRA et al., 2006B).

Nas últimas décadas a autoimunidade tem sido considerada um importante aspecto na

patogenia da doença de Chagas, recebendo atenção e suporte substanciais (GIRONES; FRESNO, 2003,

LEON; ENGMAN, 2003). Dados experimentais têm demonstrado que a autoimunidade é um

importante componente da patogênese da Doença de Chagas. Sendo assim os fenômenos

autoimunes relacionados seriam: a presença dos anticorpos e de células autorreativas (LEVITUS et al.,

1991); mimetismo molecular entre os componentes do hospedeiro e do parasita (ABEL; KALIL;

CUNHA NETO, 1997); e a observação de que células mononucleares de pacientes chagásicos podem

responder a antígenos autólogos in vitro (DUTRA et al., 2000); e a ocorrência de populações de

células circulando relacionadas a auto-imunidade, tal como células B CD5+, nos pacientes chagásicos

(DUTRA ; ROCHA; TEIXEIRA, 2005). É atualmente aceito que resposta antiparasitas e autorreativas

não são mutuamente exclusivas na doença de Chagas e que as combinações destes tipos de resposta

imune podem estar envolvidas no estabelecimento da patologia. (DUTRA ; ROCHA; TEIXEIRA, 2005).

Há uma evidência demonstrando que além da auto-imunidade fatores genéticos do parasita e

hospedeiro também podem influenciar o resultado da infecção (KIERSZENBAUM, 2003).

Girones e Fresno (2003), postularam que essa persistência do T. cruzi, junto com a resposta

imune específica induzida por antígenos miocárdicos múltiplos pode causar danos cardíacos. Estes

mesmos autores encontraram que a auto-reatividade encontrada na fase crônica da infecção por T.

cruzi está ligada à parasitemia; os anticorpos e células T reativas contra o auto-antígeno que mostrou

ser significativamente mais baixa em camundongos C57BL/6 do que nos BALB/c . A este respeito, a

eliminação do parasita na fase aguda poderia revogar potencialmente a indução da auto-imunidade

(KIERSZENBAUM, 2003 ).

Para MORRIS e colaboradores (1990), a destruição do tecido que é característica das formas

clínicas mais severas da doença de Chagas é causada por uma reação inflamatória progressiva

multifocal. Propôs que a miosite e linfócitos T que se infiltram no tecido do coração são envolvidos no

dano cardíaco. Chagásicos com doença cardíaca evidente produziram altos níveis de IFN-γ, mas

diminuída produção de IL-4 após estimulação in vitro, sugerindo que dano do coração poderia ser

resultado das citocinas inflamatórias. A persistência da inflamação pode ser relacionada à citocinas

produzidas pelas células T CD4+ específicas.

Dutra, Rocha e Teixeira (2005) sugerem uma provável combinação de composição genética do

hospedeiro e do parasita, além do que o sistema imune do hospedeiro e o ambiente, contribuem

para a determinação do resultado clínico da doença.

Atualmente quatro mecanismos principais são definidos como responsáveis pelo

desenvolvimento das formas clínicas da Doença de Chagas, sendo eles: Agressão dependente do

parasito, alterações do sistema nervoso autônomo, agressão imunomediada com processos

inflamatórios nos tecidos e aparente ausência de parasitos e alterações microvasculares (MARIN-

NETO et al., 2007).

Camundongos Knouck-out (KO) para o gene da IL-10 (IL-10 KO) infectados com a cepa Y de T.

cruzi apresentaram menor número de parasitas no sangue e tecidos e maior produção de IFN-γ e

óxido nítrico pelas células do baço do que o tipo selvagem. O tratamento de camundongos IL-10 KO e

selvagens com IL-10 recombinante resultou em aumento da parasitemia. Camundongos Knouck-out

para os genes da recombinase ativa (RAG/KO), que não possuem células B e T, fornecem um modelo

para determinar a importância da imunidade inata na resistência. Camundongos RAG/KO e selvagens

tiveram níveis de parasitemia semelhantes até o 13° dia da infecção, sugerindo o controle efetivo do

parasitismo pelo sistema imune inato durante a fase inicial da infecção, a partir de então, foi maior

em RAG/KO. O tratamento de camundongos RAG/KO, IL-10 KO e selvagens com anticorpos

neutralizantes anti-IFN-γ, anti-TNF ou anti-IL-12 aumentou os níveis de parasitemia, mostrando a

importância da produção endógena dessas citocinas no controle do parasitismo pelas respostas inata

e adaptativa. Células do baço de camundongos selvagens tratadas com anti-IL-12 apresentaram

produção diminuída de IFN-γ e óxido nítrico, sugerindo que a produção de IFN-γ é dependente do

estímulo de IL-12 (ABRAHAMSOHN; COFFMAN, 1996).

Devido às propriedades imunossupressoras da IL-10 sobre a resposta Th1, impedindo a ação

de respostas inflamatórias deve-se inferir que esta citocina tem um papel fundamental na doença de

Chagas.

A IL-10 é produzida por polimorfos nucleares de indivíduos chagásicos na forma

indeterminada e cardíaca (DUTRA et al., 1997). Trabalhos mostram que aumento da produção da IL-

10 por células T e monócitos de pacientes na forma indeterminada em relação a indivíduos cardíacos

(GOMES et al., 2003; BARROS-MAZON et al., 2004; SOUZA et al., 2004).

Entretanto, em modelos experimentais, foi demonstrado que a IL-10 também está associada

à susceptibilidade à infecção por T. cruzi. Células do baço de camundongos susceptíveis produzem

significativamente mais IL-10 que camundongos resistentes (SILVA et al., 1992). Além disso,

tratamento com baixas doses de anticorpos neutralizantes para IL-10 protege camundongos da

infecção fatal, enquanto que altas doses não promovem resistência (REED et al., 1994). Estes

trabalhos sugerem que a IL-10, semelhante ao IFN-γ, também apresenta um papel duplo na

patogênese da doença de Chagas, sendo que uma produção excessiva de IL-10 impede a eficácia da

resposta anti-parasitária e uma produção diminuída pode contribuir para uma resposta Th1

exagerada.

Höhler e colaboradores (1998) puderam demonstrar a importância do IFN-γ, quando

utilizaram camundongos deficientes em IFN-γ e inibidores da NO sintase (iNOs),

conseguiram demonstrar que ambos animais apresentavam susceptibilidade à infecção pelo T.

cruzi. Este resultado levou os pesquisadores a concluírem o quanto o IFN-γ e NO mediado

pela iNOs, são cruciais para a atividade tripanomicida dos macrófagos e sobrevivência dos

camundongos na fase aguda da infecção chagásica.

Esplenócitos obtidos durante a fase aguda da infecção produziram quantidades elevadas de

NO que foram correlacionadas com a resistência ou susceptibilidade dos animais. Níveis de nitrito e

nitrato no plasma durante estágios avançados da infecção foram maiores em camundongos C57BL/6

do que em BALBL/c. O tratamento de camundongos C57BL/6 com inibidores da NO sintase

aumentou a parasitemia e a mortalidade. Finalmente, foi encontrada uma droga doadora de NO

capaz de matar tripomastigotas in vitro, na ausência de quaisquer outras células, sugerindo a morte

de T. cruzi mediada diretamente por NO (VESPA; CUNHA; SILVA, 1994; COSTA et al., 2006).

Foi demonstrado que camundongos infectados por T. cruzi e deficientes no receptor de IFN-γ

ou deficientes iNOs foram altamente suscetíveis à infecção, tiveram parasitemias elevadas e

histopatologia grave. Ambas as linhagens de camundongos foram incapazes de responder a infecção

devido à atividade tripanocida prejudicada de macrófagos, causada pela deficiência na produção de

óxido nítrico. Esse estudo demonstrou uma via de indução de iNOs dependente de IFN-γ crucial para

a eficiente produção de óxido nítrico na resistência à infecção aguda por T. cruzi (HÖLHER et

al.,1998).

O tratamento de camundongos infectados com L-NMMA (inibidor da L-argnina), e anticorpos

monoclonais anti-TNF-α ou anti-IFN-γ causou redução na produção de NO e na quantidade de células

apoptóticas, sugerindo que NO, produzido por macrófagos ativados por TNF-α e IFN-γ, tem papel

direto na indução da apoptose in vivo (MARTINS et al., 1998).Foi demonstrado que formas

epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi estimulam a produção de TNF-α por células do baço

(TARLETON, 1988).

Verificou-se que TNF-α teve efeito protetor contra a multiplicação de parasitas na fase inicial

da doença, agindo na indução de células inflamatórias para alvos teciduais (miocárdio),

provavelmente diminuindo a carga parasitária (LIMA et al., 1997). No entanto, em outro estudo, TNF-

α foi encontrado no citoplasma de macrófagos e dentro de áreas necróticas do baço de

camundongos Swiss, C3H/He e DBA. Esse resultado sugere que TNF-α tem papel importante nas

alterações necróticas do baço associadas com a gravidade da infecção experimental por T. cruzi

(LIMA; ANDRADE; ANDRADE, 2001).

Souza e colaboradores (2004) mostraram que a infecção por T. cruzi leva a uma expressão

aumentada de TNF-α por monócitos de indivíduos cardiopatas em relação ao de forma

indeterminada. O contrario foi observado na expressão de IL-10 que foi maior entre os indivíduos

com forma indeterminada. Os autores sugerem ainda que a produção aumentada de IL-10 entre os

indivíduos com forma indeterminada é responsável pela diminuição de MHC-II observada entre estes

indivíduos. Corroborando com eles, Bahia-Oliveira e colaboradores (1998) mostraram que células

mononucleares de pacientes com cardiopatia chagásica, estimuladas com antígenos parasitários,

apresentam maior produção de IFN-γ em relação a indivíduos com forma indeterminada. O contrário

foi observado novamente para a IL-10.

Apesar do papel protetor claro da resposta inata inicial, tripomastigotas infectantes vivos

podem desencadear a resposta por macrófagos que pode ser protetora para o hospedeiro (IL-12) ou

para o parasita (IL-10), e na ausência de linfócitos. A extensão da infecção parece ser função do

balanço entre efeitos antagonistas exercidos sobre os macrófagos (REIS, 1993).

É interessante observar que T. cruzi é um estímulo poderoso para resposta imune inata

montada por macrófagos e células NK. Com o estímulo persistindo ao longo da infecção, seria

importante avaliar a contribuição da resposta inata para imunopatologia na fase crônica (REIS, 1993).

Os resultados obtidos em experimentos com camundongos infectados por T. cruzi

estabelecem que citocinas Th1, que estão envolvidas na hipersensibilidade tardia, são induzidas

durante a infecção aguda e parecem ter papel obrigatório na eliminação do parasita (CUNHA-NETO

et al., 1995).

Os níveis séricos de IL-2, IFN-γ e TNF-α foram estudados em pacientes com doença de Chagas

crônica (forma indeterminada, cardiopatia insipiente, cardiopatia bem estabelecida, forma digestiva

e forma mista). Os níveis séricos de TNF foram indetectáveis e de IFN-γ não diferiram nas diferentes

formas clínicas ou com a gravidade da doença. No entanto, foram encontrados níveis mais elevados

de IL-2 em pacientes com cardiopatia descompensada, sugerindo que a dosagem dessa citocina

possa servir como indicadora da necessidade de terapêuticas mais agressivas nesses pacientes

(WARD et al., 1999).

A demonstração clara da participação da imunidade humoral na resistência à infecção

experimental por T. cruzi foi evidenciada em um estudo de transferência passiva de anticorpos. Os

resultados sugerem que a imunidade humoral participa da resposta imune protetora contra o T. cruzi

(KRETTLI; BRENER, 1982).

Em todas as formas clínicas da doença de Chagas crônica, o envolvimento da imunidade

mediada por células é de fundamental importância. Nesse contexto, alguns estudos relataram o

papel de mecanismos citotóxicos no desenvolvimento das manifestações clínicas mais graves (REIS et

al., 1993).

Relata-se na literatura a importância do NO como microbicida na doença de Chagas. Em

contrapartida durante a infecção experimental, tem sido demonstrado que o NO também induz

imunossupressão (ABRAHAMSOHN; COFFMANN, 1996).

Na doença de Chagas, os mecanismos pelos quais o NO exerce função imunossupressora ainda

não foram totalmente esclarecidos, entretanto, foi demonstrado que o NO pode inibir a

apresentação de antígenos por macrófagos regulando negativamente a expressão de moléculas MHC

(SICHER; VASQUEZ; LU, 1994). Outros estudos revelam que o NO pode alterar o funcionamento de

complexos enzimáticos no metabolismo celular, inibir a duplicação de DNA ou causar danos diretos

no DNA sugerindo que o NO não só pode inibir a replicação, mas também pode induzir a morte

celular (GRANGER; LEHNINGER, 1982).

Para confirmar o papel do IFN-γ e NO na imunossupressão, Goni. Alcaide e Fresno (2002),

utilizaram camundongos knock-out em IFN-γR ou iNOs. Verificando que as células esplênicas (SC) de

camundongos não infectados, também KO, proliferaram exatamente como as células dos controles,

que eram das linhagens Sv129 e C57BL/6 respectivamente, em resposta a Concavalina A (Con-A).

Entretanto, a resposta de SC dos animais KO infectados a Con-A foi minimamente depreciada (cerca

de 20 a 30% de inibição) quando comparada aos controles. A produção de NO foi grandemente

diminuída em SC ativados com Con-A nos animais KO iNOs. Em concordância à carência de produção

significativa de NO, L-NMMA não afetou a proliferação pelas SC nestes animais infectados. Chegaram

à conclusão de que os animais KO apresentaram uma alta parasitemia, porém muito pouca

imunossupressão, afirmando que neste caso, a imunossupressão não foi necessária para o

desenvolvimento do parasita, pois o mesmo pôde crescer melhor devido à facilidade pelos animais

serem KO, sendo assim a imunossupressão não seria necessária pelo parasita e sim uma resposta

excessiva do sistema imune, levando aos danos.

Existem muitas dúvidas relacionadas ao fato de que alguns indivíduos infectados

desenvolvem uma forma severa da doença de Chagas e outros não; também há dúvidas em relação

às manifestações clínicas, que se apresentam de forma heterogênea. Na forma cardiodigestiva,

CARDOSO et al. (2006) encontraram um perfil de citocinas distinto quando comparado a outras

formas clínicas da doença de Chagas; sugerindo que os eosinófilos são as maiores fontes de citocinas

nessa entidade clínica. Os pacientes com a forma indeterminada da doença apresentam células T

capazes de controlar a atividade citotóxica deletéria através da inibição da ativação do HLADR das

células T CD8+. Acredita-se que a falta de uma população reguladora nas formas cardíaca ou

digestiva acarretaria em prejuízo da resposta imune, que culminaria numa forte atividade citotóxica

e destruição dos tecidos (VITELLI-AVELAR et al., 2005).

A heterogeneidade sugere que variações genéticas do hospedeiro, parasita ou ambos, são

importantes no estabelecimento da forma clínica da doença. Em humanos essa suspeita foi

confirmada através de estudos com técnicas de PCR em material de biópsia e/ou necropsia; Vago e

outros (2000), demonstraram variabilidade genética do parasita como sendo um dos fatores

determinantes da forma digestiva ou cardíaca da doença de Chagas.

Com objetivo de caracterizar o perfil genético de cepas de T. cruzi obtidas de pacientes

chagásicos, com e sem sintomas, oriundos de nosso país, FREITAS et al. (2005) e, em nossa região

LAGES-SILVA et al. (2006), confirmaram que o T. cruzi II é o agente causador das lesões da doença de

Chagas no Brasil. Entretanto, LAGES-SILVA et al. (2006) encontraram um alto grau de variabilidade

dentro das cepas de T. cruzi II, demonstrado pelo intenso polimorfismo do kDNA, entre todas as

formas clínicas e também dentro das mesmas. Segundo MACEDO et al. (2004) o intenso

polimorfismo poderia ser explicado devido ao fato de muitas populações de T. cruzi serem policlonais

e o elevado grau de diversidade do parasita poderia estar associado à sua necessidade de adaptação

e sobrevivência em diferentes hospedeiros.

A severidade e prevalência da doença de Chagas pode variar geograficamente, o que muitas

vezes dificulta o esclarecimento clínico e epidemiológico. Dados têm demonstrado que uma

alteração pode ser devido à variação genética constitucional do hospedeiro, relacionada com os

mecanismos de defesa que estão envolvidos no controle do parasitismo e da lesão tecidual. (DUTRA;

ROCHA; TEIXEIRA; 2005; DUTRA; GOLLOB, 2008).

A interação entre o parasito e mediadores do sistema imune seria talvez o principal

fator responsável pelos danos tissulares nas células infectadas, favorecendo a persistência da

inflamação cardíaca e da fibrose reparativa subsequente, levando a uma perda funcional

importante do órgão ao longo dos anos. Diferentes modelos genéticos experimentais são

potentes ferramentas para elucidar tais mecanismos e direcionar novas estratégias de

intervenção na doença humana.

1.2.1 Genética

Observa-se que nem todos os indivíduos infectados com um microrganismo desenvolve

doença e estudos têm demonstrado a importância dos genes humanos em determinar a resistência

ou suscetibilidade à determinada infecção (CASANOVA; ABEL, 2005). Acredita-se que a resistência ou

predisposição a uma doença infecciosa pode seguir um padrão de herança simples ou complexo

(PICARD;CASANOVA; ABEL, 2006)

Devido a isso, diversos autores têm buscado identificar os fatores que contribuam com a

suscetibilidade à doença que atinge apenas uma minoria. (HILL et al., 1991; McGUIRE et al., 1994;

CABRERA et al., 1995; CHEVILLARD et al., 2002; FLORI et al., 2005).

O estudo dos fatores de suscetibilidade ou resistência às doenças infecciosas parasitárias é

um enorme desafio. Provavelmente envolve muitos genes do hospedeiro, interagindo com a

genética do parasita e com o ambiente. Sendo uma relação complexa, o que dificulta o

entendimento dos mecanismos responsáveis pela diversidade clínica observada em áreas endêmicas.

(CAMPINO et al., 2006).

Parasitos apresentam mecanismos sofisticados de escape do sistema imunológico, tornando-

se extremamente adaptados ao microambiente do organismo humano. A plasticidade do genoma de

certos parasito tem levado a estudos que tentam ligar as diferentes formas clinicas e sub clínicas,

causadas pela infecção, à existência de clones e cepas de diferentes virulências e/ou patogenicidade

na população de parasitos. (MELLO; BRENER, 1978; DE DIEGO et al., 1998; MACEDO; PENA, 1998)

A importância da genética do hospedeiro no desenvolvimento da doença tem sido difícil de

ser estudada devido à multiplicidade dos fatores que podem interferir com o curso da doença,

incluindo a heterogeneidade de parasitas que podem determiná-la. Entretanto, estudos bem

desenvolvidos têm mostrado resultados interessantes e de grande valia para a comunidade

científica, permitindo identificar passos críticos em mecanismos patogênicos em algumas infecções

(DESSEIN et al., 2001)

O primeiro locus de suscetibilidade a uma doença parasitária foi mapeado em 1996, para a

esquistossomose (MARQUET et al., 1996). O estudo das doenças infecciosas difere do de outras

doenças complexas porque os fatores ambientais envolvidos são conhecidos na maioria dos casos e

podem ser incluídos na análise (CLEMENTI; GIANANTONIO, 2006). Vários estudos têm tentado

identificar os fatores que causam o desenvolvimento da doença em apenas uma fração da população

exposta aos parasitos. Muita atenção tem sido dada ao ambiente, pois a transmissão do parasito

depende sobretudo de fatores ambientais, tais como a densidade e distribuição do vetor e virulência

do parasito. Os parasitos, devido ao seu grande genoma, têm desenvolvido mecanismos sofisticados

de escape do sistema imune, como a variação antigênica (DESSEIN et al., 2001).

O papel da variabilidade genética do hospedeiro desperta interesses na suscetibilidade à

infecção, em relação a sua gravidade individual, sua progressão e as taxas de infecção em nível

populacional (SEGAL; HILL, 2003). Em seres humanos, a avaliação da suscetibilidade/resistência a

infecções significa identificar o papel de fatores genéticos na expressão de fenótipos complexos. Tal

papel pode ser estudado por métodos de epidemiologia genética, combinando informações

epidemiológicas (medida de fatores de risco) e genéticas (relações familiares entre indivíduos,

marcadores genéticos) (ABEL; DESSEIN, 1997).

Há inúmeras vantagens em estudar as doenças infecciosas humanas, visto que a influência

de fatores ambientais no risco de infecção já é bem conhecida, podendo ser considerada na análise.

Além disso, há forte indicação na escolha de genes candidatos por associação ou por estudos de

ligação, com base na função (biologia) do gene candidato e seu papel na resposta imunológica ao

patógeno estudado, e/ou em estudos de genes homólogos identificados em modelos animais, ou em

genes implicados em doenças semelhantes (ABEL; DESSEIN, 1997; SEGAL; HILL, 2003; BURGNER;

JAMIESON; BLACKWELL, 2004). Contribuindo com a relevância é que o processo de identificação de

genes principais envolvidos na resposta a um determinado patógeno oportuniza o estudo de várias

características complementares,como fenótipos clínicos (afetado/não afetado), fenótipos biológicos

(medida da intensidade da infecção) e fenótipos imunológicos (níveis de anticorpos ou de citocinas).

(ABEL; DESSEIN, 1997).

Ainda é preciso considerar que a suscetibilidade genética a infecções raramente segue um

simples padrão de herança mendeliana, exceto em raros casos familiares em que os defeitos

ocorrem em um único gene. Há duas principais técnicas para mapear e identificar associações

genéticas em doenças complexas: estudos de associação e de ligação (SEGAL; HILL, 2003;

FRODSHAM; HILL, 2004). Os estudos de associação, normalmente, precisam ser realizados com um

grupo pré-selecionado de polimorfismos em um único nucleotídeo (SNP) (WEISS; TERWILLINGER,

2000) e testam uma associação significativa entre o polimorfismo genético e um fenótipo, dentro de

uma população (QUINTANA-MURCI et al., 2007). Os métodos de associação apresentam como

limitação a necessidade de identificação prévia de polimorfismos, preferencialmente aqueles de

relevância funcional (SEGAL; HILL, 2003; FRODSHAM; HILL, 2004). Entretanto, apresenta grande

importância o fato de poderem ser usados em estudos de associação entre afetados e controles, ou

dentro de famílias. Em testes de associação familiares, utilizam-se os pais e um filho afetado para

testar se um alelo em particular é transmitido mais frequentemente do que seria esperado pela

herança mendeliana. Isto é conhecido como teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) (SEGAL;

HILL, 2003).

Na doença de Chagas, o achado de agregação familial de casos de Cardiopatia Chagásica

Crônica (CCC) reforça o papel da genética do hospedeiro nas manifestações da forma crônica

cardíaca. É possível, então, que polimorfismos genéticos afetando a resposta imune poderiam

influenciar a progressão para a CCC entre os indivíduos infectados por T. cruzi (BILATE; CUNHA-NETO,

2008). Vários trabalhos, estudando diferentes genes candidatos, têm sido realizados.

Com relação aos genes do HLA, alguns estudos apontam associação de polimorfismos nesses

genes e a progressão para a forma cardíaca da doença e/ou desenvolvimento da infecção crônica

(FERNANDEZ-MESTRE et al., 1998; DEGHAIDE; DANTAS; DONADI, 1998; COLORADO et al., 2000;

CRUZ-ROBLES et al., 2004) e um estudo não conseguiu confirmar essa relação (FAÉ et al., 2000).

Considerando a resistência à infecção, o haplótipo DRB1*14-DQB1*0301 protegeu contra a infecção

em uma área altamente endêmica do Peru, sendo uma herança dominante (NIETO et al., 2000). A

comparação da frequência dos alelos DRB1 e DQB1 entre pacientes e controles mostrou uma

frequência reduzida de DRB1*14 e DQB1*0303 nos pacientes, sugerindo efeitos protetores

independentes na infecção crônica na população estudada. A comparação das frequências alélicas

entre pacientes com ou sem cardiopatia mostrou maior frequência de DRB*01, DRB*08 e

DQB1*0501 e frequência reduzida de DRB1*1501 nos pacientes com arritmia e insuficiência cardíaca

congestiva. Os resultados sugerem que os genes do HLA classe II podem estar associados com o

desenvolvimento da infecção crônica e com o dano cardíaco na doença de Chagas (FERNANDEZ-

MESTRE et al., 1998). Outro trabalho mostrou que HLA-A30 conferiu suscetibilidade, enquanto HLA-

DQB1*06 conferiu proteção contra o desenvolvimento da doença, independente da forma clínica

apresentada (cardíaca ou digestiva) (DEGHAIDE; DANTAS; DONADI, 1998). As frequências do

haplótipo DRB1*01 DQB1*0501 do alelo DPB1*0401 estavam significativamente aumentadas nos

pacientes com cardiopatia, enquanto a frequência de DPB1*0101 foi maior entre os assintomáticos

do que entre o grupo com insuficiência cardíaca congestiva (COLORADO et al., 2000). Nesse mesmo

aspecto, Cruz-Robes et al. (2004) sugerem que os alelos do HLA podem estar associados com o

desenvolvimento da infecção crônica e com o dano cardíaco na doença de Chagas. No entanto, os

dados obtidos por Faé et al. (2000) indicam que os polimorfismos nas moléculas HLA-DR e DQ não

influenciam a suscetibilidade às diferentes formas clínicas da doença de Chagas nem a progressão à

cardiopatia. Esses estudos falham em apontar genes relevantes que causem a dicotomia clínica

observada. Isso pode ser devido à heterogeneidade genética das populações estudadas (BILATE;

CUNHA-NETO, 2008). Vários estudos têm indicado diferentes marcadores de suscetibilidade genética

em pacientes com CCC

Polimorfismos em citocinas têm sido estudados a fim de se obter uma associação com o

desenvolvimento da infecção e/ou com a progressão para a CCC. A freqüência do genótipo alto

produtor de TGF-β1 10C/C foi maior no grupo de pacientes nas populações peruana e colombiana

comparada ao grupo controle, indicando suscetibilidade diferencial à infecção por T. cruzi (CALZADA

et al., 2009).

Trabalho realizado por Pissetti e colaboradores (2011), sugerem que o polimorfismo na

posição -238 influencia a susceptibilidade para a infecção juntamente com o aumento da produção

sérica de TNF-α em pacientes soropositivos para a Doença de Chagas.

GENETICA DO HOSPEDEIRO

Além desses fatores há estudos que sugerem que fatores: a) genéticos do hospedeiro humano;

b) ambientais; e c) variabilidade do T. cruzi são importantes para determinar a prevalência da doença

de Chagas assim como as manifestações clínicas. (VASCONCELOS et al., 2012). Os fatores genéticos

envolvidos na suscetibilidade à doença de Chagas têm se tornado cada vez mais estudados. Tais

fatores contribuiriam para a compreensão da heterogeneidade clínica observada na doença. Ainda,

conforme observado por Zicker et al. (1990), há agregação familiar da cardiopatia chagásica crônica,

reforçando a hipótese de que fatores genéticos do hospedeiro contribuiriam para o desenvolvimento

das diferentes formas clínicas.

Estudos como de Deghaide, Dantes e Donadi (1998) e de Layrisse e outros (2000) relatam

genes que atuam no interior do complexo de histocompatibilidade principal e outros autores como

Rodriguéz- Pérez e colaboradores (2005) indicam genes de citocinas e quimiocinas determinando a

susceptibilidade e forma clínica desenvolvida.

A doença de Chagas manifesta-se influenciada por muitos fatores ainda não totalmente

esclarecidos, que desenvolvem uma variedade de quadros, cuja maioria é acompanhada de uma fase

aguda assintomática ou sintomática que evolui para a fase crônica. Várias citocinas são detectadas

em pacientes chagásicos nas diversas formas da doença. Muitas destas têm efeito protetor e outras

estão relacionadas com gravidade da lesão. Assim, o objetivo deste estudo é associar a presença de

polimorfismos genéticos nos genes da IL-10 e IL-4 com a presença de infecção por T.cruzi.

Trischaman e outros (1978) estudaram a suscetibilidade de camundongos de diferentes

linhagens isogênicas à infecção pelo T. cruzi, observando que a resistência está ligada ao padrão

genético. Boyer et al. (1983) comprovaram a importância do padrão genético ao estudarem a

infecção em camundongos portadores de um único gen lpr, ligado à linfoproliferação e que controla

certas reações auto-imunes.

DeTitto (1994), postulou que, embora a resposta imune tenha importante papel na

resistência, em conjunto, a sobrevida está mais relacionada com o padrão genético dos animais.

Concluindo que o resultado da infecção depende das características do parasito infectante e da

combinação de alelos presentes em cada linhagem de camundongo, incluindo fatores imunológicos e

não-imunológicos.

Vários métodos de estudo (familiar, de população e mapeamento de genes em modelos

experimentais) têm sido utilizados para mapear e identificar genes ou lócus relevantes, que

influenciam na resistência ou suscetibilidade às infecções. Dentre eles, o estudo de população tem

contribuído também com informações evolucionárias. Em particular, tem sido estabelecido que

doenças causadas por infecções parasitárias podem agir com uma forte influencia seletiva na

diversidade genética da população exposta, favorecendo a sobrevivência de indivíduos mais

resistentes à doença. (CAMPINO et al., 2006).

Os primeiros estudos de genética foram desenvolvidos em modelos experimentais, nos quais

foi possível um maior controle de variáveis ambientais (estado nutricional, condições climáticas,

outras infecções) e parasitárias (heterogeneidade, tamanho do inoculo), comprovando que o

componente genético está fortemente associado à suscetibilidade às doenças. Um exemplo clássico

foi quando Bradley et al., (1979) identificaram o locus lsh do cromossomo 1 que controla a rápida

multiplicação de Leishmania donovani em camundongos.

Os estudos iniciais da genética humana e suscetibilidade às infecções parasitárias começaram

com observações da alta prevalência de alelos mutantes do gene da β-globina em áreas de alta

endemicidade para malária, levando a hipótese de que esses alelos eram protetores contra a

infecção por Plasmodium. Desde então, vários estudos genéticos têm sido desenvolvidos, com o

objetivo de identificar passos críticos no processo patogênico e para determinar novos alvos para

vacinas e quimioterapias (DESSEIN et al., 2001)

No decorrer dos anos, houve grande interesse em associar genes relacionados à resposta

imunológica, com genes do antígeno leucocitário humano (HLA) e genes que codificam produtos da

resposta imunológica, com doenças infecciosas parasitárias. Estudos comprovaram a ação de vários

componentes genéticos na susceptibilidade de doenças como malária, esquistossomose e

leishmaniose, e com menos progresso , na filariose, oncocercose, ascaridíase, tripanossomíase

africana e doença de Chagas (CAMPINO et al., 2006)

O gene HLA, cuja função é apresentar antígenos ao sistema imunológico, teve haplótipos

associados com doença hepática grave em indivíduos com esquistossomose (SECOR et al., 1996;

HIRAYAMA, 2002), leishamaniose cutânea em indivíduos de área endêmica (LARA et al., 1991;

OLIVIO-DIAZ et al., 2004) e resistência durante a malária grave (HILL et al., 1991). Outros estudos

associaram ao HLA a filariose linfática (YAZDANBAKHSH et al., 1995), oncocercose (MURDOCH et al.,

1997) e doença de Chagas (FERNANDEZ-MESTRE et al., 1998; NIETO et al., 2000)

Genes de produtos da resposta imune também apresentam grande importância devido ao

papel destas moléculas na defesa do hospedeiro e na patogênese de doenças. Polimorfismos do

gene da sintaxe do óxido nítrico (NOS) do tipo 2 foram associados à proteção à malária grave e á re-

infecção (KWIATKOWSKI, 2005).Variantes do gene do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) foram

associados à malária grave e risco de re-infecçao (MCGUIRE et al., 1994; MCGUIRE et al., 1999;

MEYER et al., 2002; FLORI et al., 2005), risco aumentado em desenvolver leshmaniose mucocutânea

(CABRERA et al., 1955) e doença de Chagas (PISSETTI et al., 2011).

Variantes do gene do fator de necrose tumoral α (TNF-α) foram associados à malária grave e

risco de re-infecção (McGUIRE ETA al., 1994; McGUIRE et al., 1999; MEYER et al., 2002; FLORI et al.,

2005), risco aumentado em desenvolver leishmaniose mucocutânea (CABRERA et al., 1955) e

tripanossomíase africana em indivíduos expostos (COURTINI et al., 2005).

Polimorfismos do gene do interferon – γ (IFN-γ) foram associados à malária grave, risco

reduzido de desenvolver malária cerebral (CABANTOUS et al., 2005; KOCH et al., 2005) e controle da

doença hepática avançada em esquistossomose (CHEVILLARD et al., 2002) Variantes do gene da

interleucina – 4 (IL-4) demonstraram afetar a produção de anticorpos contra antígenos maláricos

(LUON et al., 2001) e controle da leishmaniose visceral. (MOHAMED et al., 2003). Um polimorfismo

do gene da interleucina -10 (IL-10) foi associado a menor risco de desenvolver tripanossomíase

africana após longos períodos de exposição ao parasito (COURTIN et al., 2005).

Pesquisas genéticas são de grande importância para o estudo das infecções parasitárias,

entretanto, muitos efeitos genéticos ainda precisam ser elucidados na biologia destas doenças. Existe

um grande progresso no estudo do papel do gene da IL-10 no desenvolvimento de doenças auto-

imunes, virais e bacterianas, porém, pouco se sabe sobre os efeitos deste gene em doenças causadas

por parasitos como, por exemplo, a doença de chagas.

Diante disso os “genes candidatos” são para IL-4, IL-10, IL-12 p40, FcγRIIa, iNOS e TNF-α,

devido a suas funções biológicas podem desempenhar um envolvimento protetor ou susceptível na

doença de Chagas.

IL-4

A Interleucina 4 (IL-4) é uma glicoproteína de 18 kDa, localizado na região do cromossomo

5q31. Desempenha um papel importante na produção de imunoglobulina E (IgE), na atividades do

fator de crescimento celular de células T e mastócitos. (YOKOTA et al. 1986)

A IL4 é produzida por células T, que regula a proliferação e diferenciação de uma variedade

de células. Ele modula a atividade destas células após a ligação aos receptores da superfície celular.

A citocina IL-4 faz parte da resposta Th2, sendo uma das principais desse padrão de resposta.

Entretanto, algumas células Th1 podem produzi-la em pequena quantidade. Ela induz a proliferação

e diferenciação dos linfócitos B, que aumenta a expressão de MHC II. Tem ação inclusive na

expressão dos receptores com alta afinidade para a imunoglobulina E (IgE), mastócitos e basófilos.

Agindo sobre os linfócitos T, B, NK, mastócitos, sinoviócitos e células endoteliais, usando a via

JAK/STAT. Induz a diferenciação de linfócitos-B para produzir IgG e IgE. Atua sobre macrófagos

ativados, reduzindo os efeitos das citocinas IL-1, FNTα, IL-6 e IL-8, e inibindo a produção de radicais

livres de oxigênio. Além disso, aumenta a suscetibilidade dos macrófagos aos efeitos dos

glicocorticoides (SOMMER; WHITE, 2010; CURFS; MEIS; HOOGKAMP-KORSTANJE, 1997)

A IL-4 tem potencial terapêutico em muitas situações clínicas, como, por exemplo, em

psoríase, osteoartrite, linfoma e asma (KURTZ ET AL., 2007)

A substituição do nucleotídeo (C-T) na posição -590 da região promotora do gene da IL-4 está

presente 27% dos caucasoides. Sendo que o alelo IL-4 -590T foi associado com a expressão

aumentada do gene in vitro e com maiores níveis de IgE in vivo. (ROSENWASSER et al., 1995). O alelo

IL-4 -590T foi associado com asma, rinite e atopia em crianças com risco para doenças alérgicas

(MARSH et al., 1994). Trabalho de Burchard et al., 1999 também associou o alelo T com baixos

valores de volume expiratório em pacientes com asma. Esses dados sugerem que o polimorfismo C-

590T poderia influenciar a gravidade da asma.

Kotanides e Reich (1996) identificaram uma STAT6 específica de ligação a ADN local alvo no

promotor do gene do receptor de IL4 (IL4R) e mostraram que a IL4 STAT6 ativa a expressão dos

genes através deste local.

Hunt et al . (2000 ) analisou os polimorfismos no gene IL4 na doença de Graves e no

hipotireoidismo auto-imune. A análise mostrou uma proporção reduzida do alelo T na variante de

polimorfismo do promotor de IL4 (- 590C -T), em pacientes com Graves e por todo o grupo de

pacientes de hipotireoidismo auto imune em comparação com o grupo de controle. Isto refletiu em

uma redução no genótipo heterozigoto nos grupos de pacientes , quando comparada com os

controles. Os autores concluíram que a IL4 uma variante , ou um gene intimamente ligado , tem um

efeito de proteção modesto contra o desenvolvimento da doença da tiróide auto-imune,

particularmente GD.

Kawashima et ai. (1998) investigaram ligação e associação entre marcadores do gene em

dermatite 5q31 -33 e atópica em 88 famílias com dermatite atópica japoneses. Análise par de irmãos

afetados sugere ligação entre o gene IL4 e dermatite atópica (LOD = 2,28 ) . Testes de desequilíbrio

de transmissão mostrou uma transmissão significativamente preferencial a dermatite atópica prole

do alelo T do polimorfismo a - 590C / T do gene de IL4 ( p = 0,001). A comparação de caso-controle

sugerem uma associação genotípica do genótipo T / T com dermatite atópica (odds ratio = 1,88 , p =

0,01). Uma vez que o alelo T pode estar associada com o aumento da actividade do promotor do

gene de IL4 em comparação com o alelo C , Kawashima et ai. (1998 ) sugeriram que as diferenças

genéticas na actividade de transcrição do gene de IL4 pode influenciar a predisposição a dermatite

atópica .

Zee et ai. (2004) coletaram amostras de DNA no início do estudo , em uma coorte

prospectiva de 14.916 homens inicialmente saudáveis americanos. Os autores então genotipados 92

polimorfismos de 56 genes candidatos entre os 319 indivíduos que , posteriormente, desenvolveram

AVC isquêmico e entre os 2.092 indivíduos que permaneceram livres de doença cardiovascular

relatados ao longo de um período de seguimento médio de 13,2 anos. Dois polimorfismos

relacionados com a inflamação, val640 -to -leu no gene SELP ( 173.610,0002 ) e uma transição 582C -

T no gene IL4 , foram encontrados para ser preditores independentes de relação de acidente vascular

cerebral (odds tromboembólica de 1,63 , p = 0,001 , e as probabilidades proporção de 1,40, P =

0,003, respectivamente).

IL-10

Interleucina 10 (IL-10) é uma citocina com função antiinflamatória, produzida por macrófagos

e células mononucleares, cujo gene está localizado no cromossomo 1q31-32, com tamanho

aproximado em 5,2 kb do genoma do DNA contendo 5 éxons (PALMER et al., 2003). Tem papel na

regulação da imunidade celular quanto à humoral, regulando a liberação de macrófagos e citocinas

pró-inflamatórias com a IL-1, IL-6, IL-8 e fator estimulador de colônia de granulócitos, fator de

necrose tumoral alfa e consequentemente efeito imunossupressor sobre as células T, monócitos e

macrófagos. Suprimindo a Th1, que promove a ativação celular e inibindo a apoptose das Células B.

(MOORE et al., 2001).

A IL-10 foi originalmente descrita como um fator inibidor de síntese de interferon gama

(FIORENTINO et al., 1991). Essa citocina é expressa em vários subtipos de linfócitos T, macrófagos,

monócitos, células dendríticas, mastócitos, linfócitos B, eosinófilos, queratinócitos, células epiteliais e

várias linhagens de células tumorais (MOORE et al., 2001). Dentre suas principais funções biológicas

estão: limitar ou anular a resposta inflamatória, bloquear a secreção de citocinas pró-inflamatórias e

regular a diferenciação e proliferação de várias células imunológicas como os linfócitos T, linfócitos B,

células natural killer (NK) e mastócitos (ASADULLAH et al., 2003).

Como a proteção imune contra o T.cruzi envolve a produção de óxido nítrico (VESPA et al.,

1994). No início da infecção, células NK produzem IFN-γ e direcionam um mecanismo microbicida

frente ao T. cruzi, ao induzir a síntese de NO nas células macrocíticas (MUNOZ-FERNANDES et al.,

1992b). Assim como o IFN-γ, o TNF-α também são capazes de induzir a ativação de macrófagos

(SILVA et al., 1991), enquanto que, o TGF-β e a IL-10 inibem essa ativação. Dessa forma uma alta

produção de IL-10 proprocionaria uma susceptibilidade para o agravamento da Doença de Chagas.

Cerca de 20 SNPs foram descritos na região promotora da IL-10. Dentre eles, os mais

estudados estão situados nas posições -1082 (G/A), -819 (C/T) e -592 (C/A) do sítio inicial da

transcrição. Estes polimorfismos se combinam formando haplótipos: ACC, GCC, ATA e GTA, sendo o

ultimo extremamente raro na população. Os polimorfismos das regiões -819 e -592 estão em

desequilíbrio de ligação, ou seja -819 C e -592C são herdados juntos, e o mesmo acontece para -

819/T e -592A. (TURNER et al., 1997). Um estudo realizado com brasileiros do Rio de Janeiro e índios

Terena do Centro-Oeste do Brasil comprovou o desequilibrio de ligação entre as regiões -819 e -592

em 100% dos casos. (ALBUQUERQUE et al., 2004).

Turner et al. (1997), demonstraram que esses polimorfismos desencadeiam uma expressão

variável do gene, determinada predominantemente pelo alelo -1082. Entretanto, tem sido difícil

determinar a relação exata entre o genótipo e o padrão de expressão genética correspondente

(LOWE et al., 2003; SUAREZ et al., 2003; WARLE et al., 2003). Os resultados são contraditórios,

dependem do tipo de ensaio, célula e estímulo utilizado. Portanto, ainda não é totalmente claro qual

haplótipo/genótipo causa alta ou baixa produção de IL-10 (WARLE et al., 2003; OPDAL, 2004).

Vários autores, utilizando ensaios in vitro e estratégias de manipulação de genes, em que a

região promotora da IL-10 foi ligada ao gene da luciferase, encontraram o haplótipo GCC como maior

produtos de IL-10 e o ATA como menor, determinando assim, três fenótipos possíveis: baixo

produtor – ATA/ATA, produtor intermediário – ACC/ATA, ACC/ACC, GCC/ATA ou GCC/ACC e alto

produtor – GCC/GCC (TURNER et al., 1997; CRAWLEY et al., 1999; MIYAZOE et al., 2002; REUSS et al.,

2002; SUAREZ et al., 2003).

Por outro lado, outros autores utilizando ensaios in vitro com PBMC (células monucleares de

sangue periférico) e sangue total, encontraram associação entre maior produção de citocina e o alelo

-1082A (KEIJSERS et al., 1997, 1998; ESKDALE et al., 1999; WARLE et al., 2003). Bozzi et al. (2006)

observaram, por citometria de fluxo, que indivíduos -1082G/G apresentam quatro vezes menos

células produtoras de IL-10 que indivíduos G/A e A/A. Um ensaio utilizando estratégias de

manipulação de genes, em que a região promotora da IL-10 foi ligada ao gene da luciferase e

expressas células B transformadas, demonstrou que a atividade de transcrição do gene é

predominantemente regulada pelo polimorfismo na posição -1082, onde a troca do nucleotídeo G

pelo A aumenta em 2 vezes a capacidade de transcrição. Porem este mesmo trabalho não observou o

mesmo efeito com culturas de PBMC estimuladas com concavalina – A (REES et al., 2002).

A diferença de expressão entre os genótipos deve ocorrer provavelmente pela alteração de

ligação a fatores de transcrição. O polimorfismo da região -1082 está localizado entre uma sequencia

de ligação a um fator de transcrição ETS-like (KUBE et al., 1995). Sequencias com o genótipo -1082A

apresentam maior afinidade a fatores nucleares de monócitos que sequencias com -1082G,

sugerindo diferença de afinidade de ligação entre os genes.

A patogênese de doenças infecciosas graves é determinada, em parte, pela intensidade da

resposta inflamatória, que varia entre indivíduos e que pode ser regulada a nível genético. Culturas

de células sanguíneas humanas estimuladas com LPS (lipopolissacarídeo) mostram uma grande

variação interindividual na secreção da IL-10 e cerca de 50 a 75% dessa variabilidade é explicada por

fatores genéticos (REUSS et al., 2002).

Estas diferenças genéticas e, portanto, a capacidade de produção diferenciada, tem sido

associada com várias doenças. Em duas populações diferentes do Norte e Sul da Itália foi encontrada

uma frequência significativamente aumentada de -1082G/G entre indivíduos com idade avançada

em relação a controles e pacientes com infarto agudo do miocárdio. Ao mesmo tempo, a frequência

de -1082A/A foi significativamente maior em pacientes que sofreram infarto agudo do miocárdio em

relação aos grupos controle e de idade avançada. O autor conclui que o genótipo -1082G/G é

protetor contra o infarto agudo do miocárdio e possivelmente um parâmetro determinante para a

longevidade. (LIO et al., 2004)

Summers et al. (2000) demonstraram que o haplótipo ATA, especialmente o alelo -592A, foi

significativamente mais frequente em um grupo de 23 casos de síndrome de morte subida infantil

(SIDS). Este grupo propôs que o déficit de IL-10, devido ao polimorfismo, poderia contribuir com a

SIDS pela iniciação tardia de produção de anticorpo protetores e pela baixa capacidade de inibir

produção de citocinas inflamatórias (SUMMERS et al., 2000). Entretanto, em um estudo maior,

OPDAL et al., (2003) encontraram associação entre o mesmo haplótipo com morte súbita infantil de

causa infecciosa, porém não encontraram a mesma associação com SIDS (OPDAL et al., 2003). Estes

trabalhos evidenciam a importancia qualitativa e quantitativa na escolha da casuística do estudo.

Oral et al. (2006) encontraram frequencia alélica de -1082G significantemente mais comum

entre pacientes com tuberculose em relação a controles saudáveis. Diminuição da frequência do

alelo -1082ª parece estar correlacionada com progressão na tuberculose pulmonar (SCOLA et al.,

2003). Recentemente um estudo demonstrou correlação entre o genótipo -1082ª/A com

tuberculose pleural, que é uma forma autolimitada da doença. (HENAO et al, 2006). Estes autores

sugerem que este polimorfismo pode afetar a suscetibilidade à tuberculose e aumentar o risco de

desenvolver doença.

Estudos com indivíduos com pneumonia mostraram que o genótipo -1082 G/G está correlacionado

com doença mais grave e maior risco de choque séptico (GALLAGHER et al., 2003; SCHAAF et al.,

2003). Outro estudo com pacientes em estado crítico admitidos em unidade de terapia intensiva, o

alelo -292A foi associado com baixa produção de IL-10 e correlacionado com alta mortalidade (LOWE

et al., 2003). Novamente diferenças na casuística mostraram resultados diferentes.

Outras doenças foram correlacionadas aos polimorfismos do gene da IL-10: artrite

reumatoide juvenil, lúpus eritematoso, diabetes, doença inflamatória intestinal, evolução clínica de

doenças neoplásicas como linfomas de não-Hodgkin, ocorrência de abortos de repetição. (CRAWLEY

et al., 1999; TAGORE et al., 1999; GIBSON et al., 2001; DAHER et al., 2003; LECH-MARANDA et al.,

2004; TSIAVOU et al., 2004)

IL-10 é um potente inibidor da ativação de macrófagos e outras células polimorfonucleares.

Esta inibição resulta na redução na expressão de citocinas “pró-inflamatórias” como TNF-α, IL-1, IL-

12, IL-6 e fator de proliferação de granulócitos/maccrófagos (GMCSF); de enzimas inflamatórias

como ciclo-oxigenase 2 e sintease indutível do óxido-nítrico (iNOS); e quimiocinas como RANTES,

MIP1α e IL-8, portanto, limitando o curso da resposta inflamatória pela redução da ativação e

recrutamento de várias células (MOORE et al., 2001). O efeito inibitório da IL-10 também está

associado à liberação de receptores solúveis de TNF-α e do antagonista do receptor da IL-1 (JENKINS

et al., 1994; JOYCE et al., 1994).

Uma característica chave de capacidade imunossupressiva da IL-10 é a eficácia em inibir a

ativação de células T durante a apresentação de antígeno, através da inibição de expressão de MHC-

II (complexo de histocompatibilidade principal), CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2) em macrófagos e células

dendríticas (DE WAAL et al., FIORENTINO et al, 1991; DING et al., 1993; CHANG et al., 1995). Além

destes efeitos indiretos sobre as células T, via inibição da função das células apresentadoras

profissionais (APCs), a IL-10 apresenta efeitos diretos sobre esta célula. Atividades inibitórias foram

mostradas em linfócitos T CD4+ pela supressão da produção de IL-2, IFN-γ, IL-4 e IL-5 (DE WAAL et al.,

1993; TAGA et al., 1993; SCHANDENE et al., 1994). Esta citocina apresenta ainda um papel direto na

diferenciação de células T regulatórias (T reg), e esse papel parece ser controlado por APCs que

produzem IL-10 e expressam moléculas estimulatórias tolerogênicas (WAKKACH et al., 2003).

Os efeitos da IL-10 em células B são mais estimulatórios. IL-10 aumenta a sobrevivência e é

um potente cofator para a proliferação de precursores de células B e células B maduras (ROUSSET et

al., 1992). Além disso, essa citocina também atua na diferenciação e na escolha de isotipos nestes

linfócitos. (BURDIM et al., 1995).

Camundongos deficientes em IL-10 apresentam uma resposta altamente polarizada para Th1

e desenvolvem colites fatais, sustentando o papel essencial desta citocina no balanço de citocinas

(ETLING et al., 2007). A administração de IL-10 diminui a mortalidade de camundongos durante a

endotoxemia induzida através da inibição de super-expressão de TNF-α (GERARD et al., 1993). A

potência dos efeitos antiinflamatórios da IL-10 tem sido demonstrada em vários outros modelos

experimentais de inflamação como artrite induzida por colágeno (WALMSLEY et al., 1996) e

encefalite auto-imune (CUA et al., 1996)

Devido a essa propriedade de inibir respostas inflamatórias dominantemente Th1, esta

citocina foi por muito tempo considerada como uma citocina do padrão Th2. Atualmente, sabe-se

que, a IL-10 é uma das principais citocinas produzidas por células T regulatórias que são células com

funções imunossupressores e são capazes de inibir tanto o desenvolvimento de respostas de células

Th2 quanto o desenvolvimento de respostas de células Th1 efetoras (COTTREZ et al., 2000; AKDIS et

al., 2004)

Estudos na tentativa de esclarecer o papel das células T reguladoras e da IL-10 têm sido

realizado em diversas situações e patologias. Como a associação da IL-10 à alergia alimentar, estudo

realizado por Scott-Taylor e colaboradores (2005) citado por VAN DER VELDEN, et al., 2001 que ao

extrair linfócitos de crianças sensibilizado a diversos alimentos e ao estimular estes linfócitos in vitro

com outras substâncias constataram redução nos níveis de IL-10 e IFN-G. Contrastando a essa

diminuição, houve aumento significativo da IL-4. Corroborando com esta hipótese outra pesquisa

avaliando o risco de crianças desenvolverem doenças atópicas constatou redução dos níveis de IL-10.

Estudos demostram que o polimorfismo da IL-10 na posição -571 tem relação com altas

concentrações de IgE, levando a uma alteração na resposta inflamatória e desencadeando

fenômenos alérgicos. (HOBBS et al., 1998). Trabalho desenvolvido por Turner e colaboradores

(1997), relata que os níveis da IL-10 têm influencia do polimorfismo da IL-10 nas posições -1082 e -

819. Também há registro de uma pesquisa com crianças japonesas no qual avaliariam a relação dos

níveis da IL-10 com a gravidade da alergia alimentar e eczema atópico, no qual constataram baixa

expressão dessa citocina associada com concentrações de IgE e gravidade na alergia alimentar.

(NEGORO et al., 2006)

IL-12

A geração de imunidade mediada por células contra diversos agentes infecciosos envolve a

produção de interleucina-12, um sinal chave do sistema imune inato. No entanto, para muitos

patógenos, as moléculas que induzem a produção de IL12 por macrófagos e os mecanismos pelos

quais eles assim permanecem indefinidos. Brightbill et ai. (1999) demonstraram que as lipoproteínas

microbianas são potentes estimuladores de produção de IL12 por macrófagos humanos e que a

indução é mediado pelos receptores toll-like (TLR). Várias lipoproteínas estimulam a transcrição

dependente de TLR-induzível da óxido nítrico sintase e a produção de óxido nítrico. Ativação de TLRs

pelas lipoproteínas microbianas pode iniciar mecanismos de defesa inata contra patógenos

infecciosos.

O gene candidato da IL-12 é um candidato codifica as citocinas Th1, que diferencia as células

NK e TCD4+ e secreção de IFN-γ. (TRINCHIERI, 2003). Estudo em modelos de camundongos, foi

mostrado que a IL-12 não somente inibe a tumorigênese como também induz a regressão do tumor

por promover a imunidade adaptativa por resposta citotóxica. (SANGRO et al., 2005).

A IL-12 é um heterodímero (IL-12 p70) composto por duas subunidade (p35 e p40), localizada

no cromosso 5q31 - q33 codificada pelos genes do polimorfismo da IL12A e IL12B (MAILLIARD et al.,

2003). Estudo da associação genética destes dois loci esta relacionada com várias desordens imunes,

infecções, auto-imunidade e ao câncer. (HOFFMAN et al., 2008) . Uma alteração de nucleotídeo da

1188 A para 1188 C na região 3’ não tradutora do locus IL12B (HUANG; CANCILLA; MORAHAN, 2000)

está associada com a produção diminuída de citocinas (STANILOVA; MITEVA; PARAKOVA, 2007) e foi

associada com a susceptibilidade do câncer cervical em vários grupos de população (HAN, et al.,

2008; CHEN et al., 2009; KORDI; SHEKARI; SURI, 2009).

Também há trabalho no qual o alelo C da IL-12 +1188 aumenta o risco da incidência do

carcinoma nasofaringe (WEI, 2009). Este polimorfismo tinha sido mostrado previamente para ser

funcionalmente relevante , o tipo IL-12 1188 AA genótipo selvagem está relacionado com a

expressão relativamente mais elevada de IL -12 de citocina do que com os genótipos AC e CC no ma

infecção pelo Epstein Barr (MORAH et al., 2001) e em pacientes com câncer (ZHAO, 2009).

FCGAMMA

As imunoglobulinas da classe G (IgG) realizam várias funções biológicas devido a sua

interação com diversos tipos celulares. Sendo que isso acontece pela ligação com os domínios Fc

(fragmento cristalizável) da IgG com receptores específicos (FcγR: Fcgamma receptors) presentes nas

membranas das células do sistema imune. (Binstadt et al. 2003, Nimmerjahn & Ravetch 2006).

Os FcγR são glicoproteínas de membrana, descritas há mais de 30anos. No homem, todos os

FcγR fazem parte da superfamília das imunoglobulinas e as três principais identificadas são: FcγRI

(CD64), FcγRII (D32) e FcγRIII (CD16). Estas classes de FcγR são codificadas pro oito genes distintos

localizados no cromossomo 1, nas bandas 1p13 e q21 (FcγRI), na banda 1q22 (FcγRII e FcγRIII).

(DAERON, 1997). Todos os FcγR de cadeia α são receptores de baixa afinidade (FcγRIIb, FcγRIIa/c e

FcγRIIIb).

Durante a década passada aumentou o interesse no papel do FcγR em leucócitos, uma vez

que estes receptores oferecem uma importante ponte entre a resposta imune humoral e celular.

Dependendo da ligação da IgG aos FcγR estimula uma variedade de respostas biológicas, que

dependem do tipo celular, do tipo de receptor Fcγ e da natureza do complexo de IgG. (VAN DE

WINKEL; CAPEL, 1993). Estas respostas podem agir sobre a eliminação de antígenos através da

fagocitose, citotoxidade celular dependente de anticorpo, geração de espécies reativas de oxigênio,

liberação de enzimas lisossomais, depuração de imunocomplexos e regulação da produção de

anticorpos (DAERON, 1997). Conforme estudos, a função do FcγR também depende do polimorfismo

genético que ocasiona variações entre os indivíduos (RASCU et al., 1997), bem como à geração de

formas solúveis de FcγR (GALON et al., 1995) e ao sinergismo com outros receptores. (ZHOU;

BROWN, 1994).

Os FcγR participam da regulação imunológica na patogênese de reações alérgicas, auto-

imunes e inflamatórias (KIMBERLY; SALMON; EDBERG, 1995). Em consequência da sua importância

ao sistema imune, há um grande interesse científico e clínico, na busca de descobertas sobre a

susceptibilidade às doenças, a fisiopatologia e a intervenção terapêutica. (RASCU et al., 1997;

KIMBERLY; SALMON; EDBERG, 1995)

Entre as três categorias de FcγR de baixa afinidade (FcyRI, FcyRII e FcyRIII), o polimorfismo

na FcγRII tem sido estudado extensivamente pois é amplamente distribuído entre as células. (VAN

DE WINKEL; CAPEL, 1993; WARMERDAM et al., 1991). Existem três genes (A, B e C) para este

receptor e seis RNAs-m diferentes (a1, a2, b1, b2, b3 e c) são transcritos. Porém somente o FcγRIIa2

(solúvel), o FcγRIIa1 (transmembrana) e duas isoformas do FcγRIIb (b1 e b2) têm sido demonstrados

in vivo. (BROOKS et al., 1989).

O FcγRII liga IC de IgG1 e IgG3, mas interage de maneira fraca com a IgG4. Dependendo da

ligação à IgG2 do polimorfismo do FcγRIIa, quer apresenta duas variantes alotípicas: o FcγRIIa- R131

(arginina) e o FcγRIIa – H131 (histidina 131). A troca de um aminoácido na posição 131 do segundo

domínio EC interfere na ligação da IgG ao receptor. (WARMERDAM et al., 1991). A IgG2 humano liga-

se eficientemente a FcγIIa-His/His131 mas não FcγRIIa-Arg/Arg131, embora ambos os alotipos

FcγRIIa interagir com IgG1 e IgG3. FcγRIIa é particularmente importante neste contexto, uma vez que

nenhuma das outras classes FcγR ligam IgG2 humana de forma eficiente (VAN DE WINKEL; CAPEL,

1993; WARMERDAM et al., 1991).

O polimorfismo do FcγRIIa (CD32) é muito estudado devido as suas implicações clínicas.

Principalmente pela variação alélica pela mutação de um único aminoácido na posição 131, sendo

crítico para a ligação da IgG2. O Polimorfismo de um único nucleotídeo do FcγRIIa localizado no

cromossomo 1q23 (Callanan et al., 2000) pode resultar em variações na resposta imune e conferir

risco para algumas doenças (KYOGOKU et al, 2002).

As diferenças na distribuição da FcγRIIa alotipos foram identificados através diferentes

grupos étnicos (RASCU et al., 1997) . Essa diferença levanta a importância que este polimorfismo no

gene FcγRIIa humana nas populações, bem como o impacto do polimorfismo na evolução da infecção

e manifestação clínica da doença . A importância clínica do polimorfismo FcγRIIa foi avaliada por

infecções bacterianas encapsuladas, em que a IgG2 desempenha um papel crítico na defesa do

hospedeiro . Vários estudos de caso-controle de base hospitalar recentes têm mostrado uma

associação entre FcγRIIa-His/His131 e proteção contra infecções por bactérias encapsuladas,

enquanto a IgG2 de ligação FcγRIIa-Arg/Arg131 está associado com o aumento da suscetibilidade a

esses patógenos (MUSSER; KROLL; GRANOFF, 1990; SANDERS et al., 1994; YEE et al., 200). Apesar de

sua associação com susceptibilidade aumentada a infecções bacterianas encapsulados , a frequência

do FcγRIIa - Arg/Arg131 genótipo permanece relativamente estável em populações humanas.

A subclasse IgG2 é essencial para a proteção do indivíduo contra bactérias encapsuladas

(Neisseria meningitidis e Haemophilus influenzae). (KIMBERLY; SALMON; EDBERG, 1995). Os

neutrófilos de indivíduos homozigotos para FcγRIIa – H/H131 fagocitam bactérias opzonizadas por

IgG2 significativamente melhor do que as células FcγRIIa – R/R 131(SANDERS et al., 1995).

O polimorfismo do FcγRIIa correlaciona-se com a atividade da nefrite e os níveis séricos de

imunocomplexo. Havendo associação significativa entre o alótipo R/R 131 e a nefrite lúpica. (DUITS

et al., 1995). Algumas manifestações do lúpus eritematosos sistêmico (LES), tais como anemia

hemolítica auto-imune e hipocomplementemia pronunciada, foram observadas com maior

frequencia em pacientes com o alótipo R/R 131 (RASCU et al., 1997)

O polimorfismo do FcγIIa tem sido descrito também para o risco de trombocitopenia induzida

por heparina. Caracterizada pela ativação das plaquetas mediada por FcγRIIa na presença do soro do

paciente e heparina. A frequência do alótipo H/H 131 foi significativamente maior em pacientes

com trombocitopenia induzida por heparina (34,4%), comparada com os pacientes não

trombocitopênicos. (BRANDT et al., 1995).

iNOS

O óxido nítrico (NO) é uma molécula mensageira, com diversas funções em todo o corpo. Está

implicado na neurotoxicidade associada a doenças neurodegenerativas, acidente vascular cerebral e

de regulação neural do músculo liso, incluindo o peristaltismo, ereção peniana, responsável pelo

relaxamento vascular e regulação da pressão sanguínea. Em macrófagos, NO tem a ações

tumoricidas e bactericidas, como indicado pelo fato de que os inibidores da NO sintase (NOS)

bloqueiam estes efeitos. (Lowenstein et ai., 1992)

O gene NOS2 Foi mapeado por Marsden et al . (1994 ) ao cromossoma 17 , que refinados a

atribuição para 17q11.2 - q12.

1. HIPÓTESE

Devido a novos estudos, acredita-se que o polimorfismos em genes de citocinas podem ter

importância protegendo ou colaborando para a patogênese da cardiopatia chagásica crônica.

Esclarecendo a razão de alguns indivíduos soropositivos permanecerem assintomáticos, enquanto

outros progridem para situações crônicas sintomáticas.

Tnf

O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), uma das mais importantes citocinas pró-inflamatórias, tem

papel essencial na patogênese na resposta inflamatória aguda (reação de fase aguda) e está

envolvido na inflamação sistêmica. (BEUTLER; GRAU, 1993). O gene do TNF-α está localizado no

cromossomo 6p21.3, tem comprimento de aproximadamente 3 kb e contém quatro éxons que

produzem proteína transmembrana tipo II com 212 aminoácidos e disposta em homotrímeros

estáveis. (NEDWIN et al., 1985). Além disso, o TNF-α tem várias funções na imunopatologia humana,

desde produzir inflamação, proliferação e diferenciação celular, tumorigênese, replicação viral até

induzir a morte celular por apoptose. No nível in vivo, observou-se um aumento nos níveis de TNF-

α após desafio com endotoxinas em voluntários saudáveis13 (MICHIE et al., 1988) e também em

pacientes com choque séptico devido tanto a bacteremia gram-postiva quanto a bacteremia gram-

negativa (CALANDRA et al., 1990). Por meio dessas análises, principalmente em populações

caucasianas, foi possível identificar o principal polimorfismo genético presente nas regiões

reguladoras do gene que codifica o TNF-α: -308 (G→A). Essa transição de guanina para adenina

localizada no par de bases -308 do local de início da transição foi observada em vários estudos in

vitro, demonstrando que essa alteração polimórfica está associada a um aumento na secreção de

TNF-α por macrófagos após estímulo com lipopolissacarídeo e que esse aumento potencial pode

conferir uma resposta semelhante, levando à sepse clínica in vivo. (LOUIS et al., 1998).

Considerando ser amplamente aceito o fato de que o polimorfismo genético varia entre grupos

étnicos, quaisquer estudos comparativos devem ser realizados dentro do mesmo fundo genético19.

Contudo, continua sendo importante rever todos os principais polimorfismos relatados em qualquer

população, a fim de demonstrar se é possível utilizar esses marcadores genéticos como um risco

genético universal para uma determinada condição clínica. Nesse sentido, realizamos o primeiro

estudo prospectivo em uma população do sudeste asiático a avaliar se existe uma associação entre o

polimorfismo -308A do TNF e o desenvolvimento de sepse e choque séptico em pacientes pediátricos

tailandeses.

Justificativa

A Doença de Chagas manifesta-se influenciada por muitos fatores ainda não totalmente

esclarecidos, e desencadeia em uma variedade de quadros clínicos. Várias citocinas são detectadas

em pacientes chagásicos nas diversas formas da doença. Muitas destas têm efeito protetor e outras

estão relacionadas com gravidade da lesão. Dessa forma, avaliamos a presença de polimorfismos

genéticos para IL-4, IL-10, IL-12, FcγRIIa, iNOS e TNF-α, de cada indivíduo para correlacionar a

presença ou ausência do polimorfismo dos genes candidatos nos indivíduos infectados e não

infectados e avaliar no grupo infectado a forma cardíaca e indeterminada nos pacientes crônicos.

Assim, poderemos contribuir com o processo de entendimento dos principais genes

envolvidos na resposta ao T. cruzi.

Objetivos

OBJETIVO GERAL

Investigar a importância de polimorfismos genéticos (SNP) nos genes da IL- 4, IL-10, IL-12,

TNF-α, FcγRIIa e iNOS no desenvolvimento das formas clínicas da Doença de Chagas.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Analisar a freqüência dos polimorfismos genéticos (SNPs) comparando os grupos infectados

e controle; e no grupo de pacientes infectados, comparando os com forma Cardíaca e Indeterminada

da Doença de Chagas em cada uma das posições dos seguintes genes:

� + 33 C/T do gene IL-4 (rs 2070874)

� - 819 C/T do gene IL-10 (rs 1800871)

� -1082 A/G do gene IL-10 (rs 1800896)

� + 1188 C/A do gene IL-12B (rs 3212227)

� + 131 A/G do gene FcγRIIa (rs1801274)

� − 1173 C/T do gene iNOS (rs1113283)

� - 308 A/G do gene TNF - α (rs 1800629)

Metodologia

Amostra de Estudo

Foram incluídos neste estudo 670 indivíduos (sendo 295 do gênero masculino e 361 do sexo

feminino), todos maiores de 30 anos, que residem ou residiram em área endêmica para Doença de

Chagas (região do Triângulo Mineiro), acompanhados no Ambulatório de Cardiologia/Marcapasso e

Doença de Chagas do Hospital de Clínicas da UFTM. No período de Fevereiro de 2011 à Abril de

2013. Foram excluídos indivíduos com sorologia positiva para HIV e doença autoimune.

Aspectos éticos

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal

do Triângulo Mineiro (UFTM), sob protocolo número 2013.Todos indivíduos envolvidos receberam

esclarecimentos a respeito da pesquisa e assinaram o termo de consentimento (Anexo 1).

Coleta sanguínea e avaliação clínica e laboratorial

De cada paciente foram coletadas duas amostras de sangue (10mL e 5mL em cada tubo) por

meio de punção venosa periférica com agulhas e tubos de coleta a vácuo (BD VACUNTAINERTM),

sendo um tubo contendo EDTA como anticoagulante e outro sem aditivo, respectivamente. A

presença ou ausência da infecção por T. cruzi foi avaliada por hemaglutinação passiva (Wiener,

Brasil), ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Abbott, Brasil) e Imunofluorescência Indireta.

Os testes foram realizados conforme descrição do fabricante e os resultados foram expressos

quantitativamente.

O grupo controle foi composto por 243 Indivíduos com sorologias negativas e residentes em

área endêmica. Foram incluídos como casos positivos para T. cruzi os 372 indivíduos com sorologia

positiva para pelo menos dois testes (citados acima), conforme normas vigentes do Ministério da

Saúde. Estes pacientes tiveram seus prontuários avaliados e, quando necessário, foram realizados

exames complementares de eletrocardiograma, raio-X de tórax, esofagograma, raio-X contrastado de

intestino e ecocardiograma. Em seguida, foram classificados nas formas clínicas da doença de

Chagas: cardíaco, digestivo, indeterminado ou misto (cardiodigestivo). A caracterização clínica dos

portadores da Doença de Chagas foi realizada pelo Dr. Maurício Manuel Lhaguno Lazo de acordo

com os critérios estabelecidos no Consenso Brasileiro de Chagas, em 2005.

Purificação do DNA genômico

O DNA foi extraído do sangue dos pacientes utilizando o kit QIAamp® DNA blood Maxi

(QIAGEN), seguindo instruções do fabricante. O sangue total (10 mL) colhido com EDTA foi

transferido para um tubo falcon de 50 mL, no qual foi adicionado 500 µL de protease e

homogeneizado por inversão durante um minuto. Foram adicionados 12 mL de tampão de lise e o

tubo foi vortexado por 1 minuto. Após incubação de 10 minutos em banho-maria a 70ºC, foram

adicionados 10 mL de Etanol 92% sob agitação. Em novo tubo falcon, foram colocadas as colunas de

extração e a suspensão lisada previamente foi então transferida para as colunas. Após centrifugação

por 3 minutos a 3000 rpm. Acrescentou-se o tampão de lavagem 1 e centrifugou-se por 5000 rpm por

um minuto. O filtrado foi descartado, e adicionado 5mL do tampão de lavagem 2 na coluna e

centrifugação a 5000rpm por 15 minutos. A coluna foi transferida para um tubo falcon novo de 50mL,

acrescentou-se 350 uL de água ultra pura (MILLIPORE) filtrada em filtro de 0,22 µm e autoclavada.

Após 20 minutos a temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 5000 rpm por 5

minutos. Repetiu-se novamente a adição da água e a centrifugação. O filtrado foi então retirado a

quantidade de DNA presente foi avaliada por absorbância em equipamento GeneQuant II e

armazenamos a -20ºC para realização do PCR em Tempo Real

qPCR e genotipagem

Para a genotipagem dos polimorfismos propostos foi utilizado o sistema TaqMan® SNP

Genotyping Assays(Applied Biosystems, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. As

amostras foram processadas pelo sistema de PCR Real-Time-7300 (Applied Biosystems) no

Laboratório Multiusuário da UFTM.

Os polimorfismos escolhidos foram:

• Gene da IL-4: rs2070874 posição 33 C/T (C -16176215-10; Applied Biosystems)

• Gene da IL-10: rs1800871 posição -819 T/C (C - 1747362-10; Applied Biosystems)

• Gene da IL-10: rs1800896 posição -1082 A/G (C - 1747360-10; Applied Biosystems)

• Gene do IL-12B : rs 3212227 posição 1188 C/A (C – 2084793-10; Applied Biosystems)

• Gene do FcγRIIa : rs 1801274 posição 131 A/G (C – 9077661-20; Applied Biosystems)

• Gene da iNOS : rs1113283 posição −1173 C/T (C – 1748189-10; Applied Biosystems)

• Gene do TNF: RS 1800629 posição -308 A/G (C – 7514879-10; Applied Biosystems)

As amostras anteriormente quantificadas foram ajustadas para concentração de 5 ng/µL. O

protocolo para a realização do mix para PCR em tempo Real foi padronizado para uso em nosso

laboratório. O mix continha:

- Água MILLI-Q estéril, filtrada em filtro de 0,22µm (0,5 µL)

- Mix para sonda: Taqman Universal Pcr Master Mix (1,875 µL)

- Sonda/primers específicos para os polimorfismos alvo (0,125 µL)

Foi colocado 2,5 µL do mix de PCR em Tempo Real em cada poço da placa (de 96 poços) e

adicionado 2,5 µL de DNA no respectivo poço, homogenizando a amostra. A placa foi selada e

centrifugada rapidamente. Logo depois ela foi introduzida no aparelho de PCR em Tempo Real PCR

7300. E o programa foi configurado para a amplificação do fragmento de interesse, e escolhemos o

programa para realização da curva e para a discriminação alélica.

O programa de amplificação do fragmento de interesse se deu nas seguintes condições:

desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos, seguido de 40 ciclos sendo a desnaturação a 92ºC por 15

segundos e a hibridização/extensão a 60ºC por um minuto.

Análise Estatística :

Foi montado um banco de dados no programa MS-Excel, cujos dados foram usados para

análise estatística com uso do programa GrandPrisma. As freqüências dos genótipos e alelos entre

os grupos foram analisadas pelo teste Chi-quadrado. Odds ratios (OR) com 95% de intervalo de

confiança foi calculado para uma tabela de contingência 2x2.

Resutlados

Caracterização das Amostras

Nesse estudo, foram analisados 670 indivíduos provenientes de região do Triângulo Mineiro,

classificados de acordo com a sorologia para T. cruzi em positiva ou negativa. Sendo 427 (63,7%)

soropositivos e 243 (36,3%) soronegativos para a doença de Chagas. Aqueles com sorologia positiva

para T. cruzi foram classificados de acordo com a forma clínica, segundo os critérios estabelecidos no

Consenso Brasileiro de Chagas em 2005. Dentre os 427 indivíduos chagásicos, 238 (55,8%) foram

classificados em cardíacos, 8 (1,9%) digestivos, 45 (10,5%) mistos, 130 indeterminado (30,4%) e 6

(1,4%) não puderam ser classificados por ausência de exames complementares. Devido ao pequeno

número de indivíduos com forma digestiva e por 6 indivíduos não ter sido possível classificar a forma

clínica, eles foram excluídos das análises. Considerando o número de indivíduos soropositivo de 413.

Visto que os pacientes com a forma mista apresentam lesão cardíaca neste estudo eles

foram considerados no grupo cardiopata.

Do total de 656 indivíduos, 361 (55 %) foram do gênero feminino e 295 (45%) do gênero

masculino. Dos indivíduos do gênero feminino, 219 (33,4 %) apresentaram sorologia positiva e 142

(21,6 %) sorologia negativa para T. cruzi. Dos indivíduos do gênero masculino, 194 (29,6 %) foram

soropositivo e 101 (15,4 %) soronegativo para T. cruzi (tabela 01).

Tabela 01 - Distribuição das frequências das sorologias positiva e negativa para T. cruzi em relação

ao gênero dos indivíduos da amostra.

Sorologia

Positiva Negativa Total

Gênero n % n % n %

Feminino 219 33,4 142 21,6 361 55,0

Masculino 194 29,6 101 15,4 295 45,0

Total 413 63,0 243 37,0 656 100

A média de idade da amostra foi de 62 anos, com desvio padrão de 15,39. Tanto o grupo

chagásico como controle a média de idade foi similar. Inclusive não houve diferença entre os gêneros

masculino e feminino. Dessa forma não houve diferença estatística em relação a idade gênero ou

sorologia.

Classificados de acordo com gênero foram observados na forma cardíaca, 113 (27,3 %)

indivíduos do gênero feminino e 125 (30,3 %) do gênero masculino, na forma indeterminada 78 (18,9

%) femininos e 52 (12,6 %) masculinos e na forma mista, 28 (6,8 %) femininos e 17 (4,1 %)

masculinos (tabela 02).

Tabela 02 - Distribuição das frequências das formas clínicas da doença de Chagas crônica, em

relação aos gêneros feminino e masculino dos indivíduos da amostra.

Formas Clínicas

Cardíaca Indeterminada Mista Total

Gênero N % n % n % n %

Feminino 113 27,3 78 18,9 28 6,8 219 53,0

Masculino 125 30,3 52 12,6 17 4,1 194 47,4

Total 238 57,6 130 31,5 45 10,9 413 100

Interleucina 10 (IL-10) região promotora -1082

Realizado o polimorfismo da IL-10 posição -1082 G/A, obtivemos resultado para 519

indivíduos. Sendo a frequência para AA, AG e GG respectivamente, 218 (42%), 225 (43,4%) e 76

(14,6 %). A figura 1 ilustra a representação gráfica dos resultados obtidos.

Figura 1 – Distribuição alélica da Interleucina -10 região promotora -1082

Indivíduos com sorologia negativa para a Doença de Chagas (n=171) apresentou a

distribuição dos genótipos: 78 (45,6%) AA; 57 (33,4%) AG e 36 (21%) GG. Mostrando significância

(P<0,05) ao comparar com a sorologia positiva (n= 348) dos quais 140 (40,2%) eram AA; 168 (48,3%)

AG e apenas 40 (11,5%) foi GG. Frente a esta distribuição com significante diferença estatistica,

determinou-se o fator de risco o ORAG x AA= 1,642 (95% CI=1,091–2,471). (Tabela 3)

Observando a frequência dos alelos não houve diferença significativa entre as frequências do

alelo A, nos grupos com sorologia positiva (64,4%) e sorologia negativa (62,3%). O alelo G

apresentou frequencia de 35,6% nos indivíduos com sorologia positiva e 37,7% nos com sorologia

negativa.

Tabela 3 – Distribuição da frequência dos genótipos e dos alelos do polimorfismo da Interleucina 10

(IL-10) na região promotora –1082 em indivíduos com sorologia positiva e negativa para o

Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Positivos

(n = 348)

Negativo

(n = 171) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipo

(%)

Frequência

Alelos

Genótipo

(%)

Frequência

Alelos

-1082

AA 140

(40,2%)

64,4 % 78

(45,6%)

62,3%

0,0010*

AG 168

(48,3%)

57

(33,4%)

0,511

GG 40 35,6% 36 37,7%

(11,5%) (21,0%)

*ORAG x AA= 1,642 (95% CI=1,091–2,471). Estatística significativa para distribuição da frequencia dos

genótipos avaliandos usando o teste x2 . GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego

California USA. O nível de significância adotada foi P<0,05.

Não se observou diferença significativa quando a distribuição dos genótipos foi analisada pela

forma clínica nos pacientes positivos. Nos grupos dos pacientes com sorologia positiva e

apresentando alteração cardíaca os genótipos AA, AG e GG, foram de 39% (92), 49,6% (117) e

11,4% (27), respectivamente. Similar resultado foi encontrado para o grupo indeterminado, onde os

genótipos AA, AG e GG apresentaram frequência de 43,6% (51), 45,3% (53) e 11,1% (13),

respectivamente. Também não observou-se diferença signiicativa para os alelos em relação a forma

clínica. Na forma Cardíaca a frequência do alelo A foi de 63,8% e para o Alelo G de 36,2%. Resultado

parecido foi para o grupo dos indeterminados, cuja frequência do alelo A foi de 66,2% e para o alelo

G de 33,8%.

Tabela 4 Genótipo e frequência dos alelos para polimorfismo da Interleucina 10 (IL-10) na região

promotora -1082 em indivíduos com alteração cardíaca e forma indeterminada para infecção por

Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Alteração Cardíaca

(n = 236)

Indeterminada

(n= 117) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipos

(%)

Frequência

Alelos

Genótipo

(%)

Frequência

Alelos

-1082

AA 92

(39,0%)

63,8% 51

(43,6%)

66,2%

0,6996

AG 117

(49,6%)

53

(45,3%)

0,5186

GG

27

(11,4%)

36,2%

13

(11,1%)

33,8%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2 .

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05.

IL-10 (-819)

Para o polimorfismo da Interleucina -10 região promotora -819 T/C houve resultado para 504

indivíduos. Sendo a frequência para TT, TC e CC respectivamente, 65 (12,9%), 230 (45,6%) e 209

(41,5%). É possível constatar que a frequência do alelo Y (genótipo CC) e para ambos (TC) foram

encontrados com maior frequência.

Avaliando a sorologia verificou que indivíduos negativo (n=170) o genótipo ficou 21 (12,4%)

TT, 82 (48,2%) TC e 67 (39,4%) CC. Não havendo significância (P<0,05) ao comparar com os

indivíduos de sorologia positiva (n= 334) dos quais 44 (13,2%) eram TT, 148 (44,3%) TC e 142

(42,5%) foi CC. (gráfico 5)

Observando a frequência dos alelos não houve significância entre positivo e negativo. Sendo

a frequência do alelo T de 35,3% para sorologia positiva e 36,5% para a sorologia negativa. Já o alelo

C ficou de 64,7% para os indivíduos com sorologia positiva e 63,5% para os de sorologia negativa.

Tabela 5 – Genótipo e frequência dos alelos do polimorfismo da Interleucina 10 (IL-10) na região

promotora -819 em indivíduos com sorologia positiva e negativa para o Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Positivos

(n = 334)

Negativo

(n = 170) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipo

(%)

Frequencia

Alelos

Genótipo

(%)

Frequencia

Alelos

-819

TT 44

(13,2%)

35,3 % 21

(12,4%)

36,5%

0,7045

TC 148

(44,3%)

82

(48,2%)

0,7207

CC 142

(42,5%)

64,7% 67

(39,4%)

63,5%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2 .

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05.

Os genótipos da forma clínica nos pacientes positivos, também não foram observados

diferença. No grupo dos pacientes com sorologia positiva e apresentando alteração cardíaca o

genótipo TT, TC e CC, ficou respectivamente: 8,5% (29), 29,2% (99) e 28,9% (98). Similar resultado

foi encontrado para o grupo indeterminado para os genótipos TT, TC e CC, respectivamente: 4,7%

(16), 14,8 % (50) e 13,9 % (47). Também não houve diferença para os alelos em relação a forma

clínica. Alteração Cardíaca a frequência do alelo T foi de 34,7% e para o Alelo C de 65,3%. Resultado

parecido foi para o grupo dos indeterminados, cuja frequência do alelo T foi de 36,3% e para o alelo C

de 63,7%.

Tabela 6 Genótipo e frequência dos alelos para polimorfismo Interleucina 10 (IL-10) na região

promotora -819 em indivíduos com alteração cardiaca e forma indeterminada para infecção por

Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Alteração Cardíaca

(n = 226)

Indeterminada

(n = 113) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipos

(%)

Frequência

Alelos

Genótipo

(%)

Frequência

Alelos

-819 TT 29 34,7% 16 36,3% 0,9238

(8,5%) (4,7%)

TC 99

(29,2%)

50

(14,8%)

0,6907

CC 98

(28,9%)

65,3% 47

(13,9%)

63,7%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05.

Fator de necrose tumoral (TNF-α) região promotora -308

Realizando o PCR em Tempo Real para o polimorfismo do TNF posição -308 G/A obtivemos

resultado para 580 indivíduos. Sendo a frequência para AA, AG e GG respectivamente, 16 (2,7%),

254 (43,8%) e 310 (53,5%). Conforme a distribuição da frequência do genótipo observamos

frequência para o alelo 2 (genótipo GG) e para ambos (genótipo heterozigoto AG).

Indivíduos com sorologia para Chagas negativo (n=203) o genótipo ficou 7 (3,5%) AA, 64

(31,5%) AG e 132 (65%) GG. Havendo significância devido ao P der dado <0,0001 (P<0,05) ao

comparar com os indivíduos de sorologia positiva (n= 377) dos quais 9 (2,4%) foi AA, , 190 (50,4%)

AG e 178 (47,2%) GG. (gráfico 7)

Como observado houve diferença entre os genótipos dos indivíduos com sorologia positiva e

sorologia negativa. Diante disso, foi realizado o Odds do genótipo. Comparando odds entre genótipo

AA e genótipo GG do TNF-α, foi encontrado odds de 1,602 com 95% confiança 1,194 até 2,150. Já

odds entre AG e GG, foi de 2,202 com confiança 1,533 até 3,162. Também houve resultado ao

agruparmos os indivíduos com o genótipo AA e AG comparando com os indivíduos GG, cujo odds

ratio foi de 2,078 com confiança entre 1,461 até 2,956

Observando a frequência dos alelos houve significância entre positivo e negativo. Sendo a

frequência do alelo G de 35,3% para sorologia positiva e 36,5% para a sorologia negativa. Já o alelo

A ficou de 64,7% para os indivíduos com sorologia positiva e 63,5% para os de sorologia negativa.

Tabela 7 – Genótipo e frequência dos alelos do polimorfismo do Fator de Necrose Tecidual (TNF) na

região promotora –308 em indivíduos com sorologia positiva e negativa para o Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Positivos

(n = 377)

Negativo

(n = 203) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipo

(%)

Frequencia

Alelos

Genótipo

(%)

Frequencia

Alelos

-308 AA 9 27,6 % 7 37,5%

(2,4%) (3,4%)

0,0001* AG 190

(50,4%)

64

(31,6%)

0,0016*

GG 178

(47,2%)

72,4% 132

(65,0%)

62,5%

*ORAA x GG= 1,602 (95% CI=1,194–2,150); ORAG x GG= 2,202 (95% CI=1,533–3,162) e ORAA + AG x GG=

2,078 (95% CI=1,461–2,956) Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos

avaliandos usando o teste x2 . GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA.

O nível de significância adotada foi P<0,05.

Os genótipos da forma clínica nos pacientes positivos, não foram observados diferença. No

grupo dos pacientes com sorologia positiva e apresentando alteração cardíaca o genótipo AA, AG e

GG, ficou respectivamente: 2,4% (6), 50,6% (129) e 47,0% (120). Similar resultado foi encontrado

para o grupo indeterminado para os genótipos AA, AG e GG, respectivamente: 2,5 % (3), 50% (61) e

72,5% (58). Também não houve diferença para os alelos em relação à forma clínica. Alteração

Cardíaca a frequência do alelo G foi de 72,4% e para o Alelo A de 27,6%. Resultado parecido foi para

o grupo dos indeterminados, cuja frequência do alelo G foi de 72,5% e para o alelo A de 27,5%.

Tabela 8 Genótipo e frequência dos alelos para polimorfismo do Fator de Necrose Tecidual (TNF) na

região promotora –308 em indivíduos com alteração cardiaca e forma indeterminada para infecção

por Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Alteração Cardíaca

(n = 255)

Indeterminada

(n = 122) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipos

(%)

Frequência

Alelos

Genótipo

(%)

Frequência

Alelos

-308

AA 6

(2,4%)

27,6% 3

(2,5%)

27,5%

0,9932

AG 129

(50,6%)

61

(50,0%)

0,9569

GG 120

(47,0%)

72,4% 58

(47,5%)

72,5%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2 .

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05

Interleucina 12

Para a IL-12 posição 1188 A/C de obteve resultado para 258 indivíduos. Sendo a frequência

para CC, CA e AA respectivamente, 21 (8,1%), 117 (45,4%) e120 (46,5%). (Figura 4)

Indivíduos com sorologia para Chagas negativo (n=38) o genótipo ficou 2 (5,3%) CC, 21

(55,2%) CA e15 (39,5%) AA. Não havendo significância (P<0,05) ao comparar com os indivíduos de

sorologia positiva (n= 220) dos quais, 19 (8,7%) foi CC, 96 (43,6%) CA e 105 (47,7%) eram AA.

(gráfico 9)

Observando a frequência dos alelos não houve significância entre positivo e negativo. Sendo

a frequência do alelo T de 35,3% para sorologia positiva e 36,5% para a sorologia negativa. Já o alelo

C ficou de 64,7% para os indivíduos com sorologia positiva e 63,5% para os de sorologia negativa.

Tabela 9 – Genótipo e frequência dos alelos do polimorfismo da Interleucina 12 (IL-12) na região

promotora 1188 em indivíduos com sorologia positiva e negativa para o Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Positivos

(n = 220)

Negativo

(n = 38) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipo

(%)

Frequencia

Alelos

Genótipo

(%)

Frequencia

Alelos

1188

AA 105

(47,7%)

69,5 % 15

(39,5%)

67,1%

0,3880

AC 96

(43,6%)

21

(55,2%)

0,6705

CC 19

(8,7%)

30,5% 2

(5,3%)

32,9%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05

Os genótipos da forma clínica nos pacientes positivos, também não foi observada diferença. No grupo

dos pacientes com sorologia positiva e apresentando alteração cardíaca o genótipo AA, AC e CC,

ficou respectivamente: 49% (76), 41,3% (64) e 9,7% (15). Similar resultado foi encontrado para o

grupo indeterminado para os genótipos AA, AC e CC, respectivamente: 41,4% (29), 52,9 % (37) e 5,7

% (4). Também não houve diferença para a frequência dos alelos em relação à forma clínica.

Alteração Cardíaca a frequência do alelo T foi de 34,7% e para o Alelo C de 65,3%. Resultado

parecido foi para o grupo dos indeterminados, cuja frequência do alelo T foi de 36,3% e para o alelo C

de 63,7%.

Tabela 10 Genótipo e frequência dos alelos para polimorfismo Interleucina 12 (IL-12) na região

promotora 1188 em indivíduos com alteração cardiaca e forma indeterminada para infecção por

Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Alteração Cardíaca

(n = 155)

Indeterminada

(n = 70)

Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipos Frequência Genótipo Frequência

(%) Alelos (%) Alelos

1188

AA 76

(49%)

69,7% 29

(41,4%)

67,9%

0,2309

AC 64

(41,3%)

37

(52,9%)

0,6988

CC 15

(9,7%)

30,3% 4

(5,7%)

32,1%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2 .

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05

FCGAMA (-)

Dos 656 indivíduos estudados, foi realizado o polimorfismo do FcGAMMA posição 131 A/G de

270. Sendo a frequência para AA, AG e GG respectivamente, 39 (14,4%), 126 (46,7%) e 105

(38,9%).

Indivíduos com sorologia para Chagas negativo (n=39) o genótipo ficou 6 (15,4%) AA, 14

(35,9%) AG e 19 (48,7%) GG. Não havendo significância (P<0,05) ao comparar com os indivíduos de

sorologia positiva (n= 231) dos quais 33 (47,7%) eram AA, 112 (43,6%) AG e 86 (8,7%) foi GG.

(tabela 11)

Observando a frequência dos alelos não houve significância entre positivo e negativo. Sendo

a frequência do alelo A de 38,5% para sorologia positiva e 33,3% para a sorologia negativa. Já o alelo

G ficou de 61,5% para os indivíduos com sorologia positiva e 66,7% para os de sorologia negativa.

Tabela 11 – Genótipo e frequência dos alelos do polimorfismo do FcGAMMA na região promotora -

131 em indivíduos com sorologia positiva e negativa para o Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Positivos (n = 231) Negativo (n = 39) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor

Genótipo

(%)

Frequencia

Alelos

Genótipo (%) Frequencia

Alelos

131

AA 33 (47,7%) 38,5 % 6

(15,4%)

33,3%

0,3177

AG 112 (43,6%) 14

(35,9%)

0,3814

GG 86 (8,7%) 61,5% 19 (48,7%) 66,7%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2 .

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05

Os genótipos da forma clínica nos pacientes positivos, também não foi observada diferença.

No grupo dos pacientes com sorologia positiva e apresentando alteração cardíaca o genótipo AA, AG

e GG, ficou respectivamente: 14% (23), 51,2% (84) e 34,8% (57). Similar resultado foi encontrado

para o grupo indeterminado para os genótipos AA, AG e GG, respectivamente: 16,7% (12), 43 % (31)

e 40,3 % (29). Também não houve diferença para a frequência dos alelos em relação à forma clínica.

Alteração Cardíaca a frequência do alelo A foi de 39,6% e para o Alelo G de 60,4%. Resultado

parecido foi para o grupo dos indeterminados, cuja frequência do alelo A foi de 38,2% e para o alelo

G de 61,8%.

Tabela 12 Genótipo e frequência dos alelos para polimorfismo Interleucina FcGAMMA na região

promotora 131 em indivíduos com alteração cardiaca e forma indeterminada para infecção por

Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Alteração Cardíaca

(n = 164)

Indeterminada

(n = 72) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipos

(%)

Frequência

Alelos

Genótipo

(%)

Frequência

Alelos

131

AA 23

(14%)

39,6% 12

(16,7%)

38,2%

0,2309

AC 84

(51,2%)

31

(43,0%)

0,6988

CC 57

(34,8%)

60,4% 29

(40,3%)

61,8%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2 .

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05

Interleucina 4 (IL-4)

Dos 656 indivíduos estudados, foi realizado o polimorfismo da Interleucina 4 (IL-4) na posição

33 C/T de 455. Sendo a frequência para CC, CT e TT respectivamente, 259 (57%), 161 (35,4%) e 35

(7,6%).

Indivíduos com sorologia para Chagas negativo (n=173) o genótipo ficou 107 (61,9%) CC, 50

(28,9%) CT e 16 (9,2%) TT. Não havendo significância (P<0,05) ao comparar com os indivíduos de

sorologia positiva (n= 282) dos quais 152 (53,9%) eram CC, 111 (39,4%) CT e 19 (6,7%) foi TT.

(tabela 13)

Observando a frequência dos alelos não houve significância entre positivo e negativo. Sendo

a frequência do alelo C de 73,6% para sorologia positiva e 76,3% para a sorologia negativa. Já o

alelo T ficou de 26,4% para os indivíduos com sorologia positiva e 23,7% para os de sorologia

negativa.

Tabela 13 – Genótipo e frequência dos alelos do polimorfismo da interleucina 4 (IL-4) na região

promotora 33 em indivíduos com sorologia positiva e negativa para o Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Positivos

(n = 282)

Negativo

(n = 173) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipo

(%)

Frequencia

Alelos

Genótipo

(%)

Frequencia

Alelos

33

CC 152

(53,9%)

73,6 % 107

(61,9%)

76,3%

0,0677

CT 111

(39,4%)

50

(28,9%)

0,3602

TT 19

(6,7%)

26,4% 16

(9,2%)

23,7%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2 .

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05

Os genótipos da forma clínica nos pacientes positivos, também não foi observada diferença.

No grupo dos pacientes com sorologia positiva e apresentando alteração cardíaca o genótipo CC, CT

e TT, ficou respectivamente: 53,1% (96), 40,3% (73) e 6,6% (12). Similar resultado foi encontrado

para o grupo indeterminado para os genótipos CC, CT e TT, respectivamente: 54,7% (58), 37,7 %

(40) e 7,6 % (8). Também não houve diferença para a frequência dos alelos em relação à forma

clínica. Alteração Cardíaca a frequência do alelo C foi de 73,2% e para o Alelo T de 26,8%. Resultado

parecido foi para o grupo dos indeterminados, cuja frequência do alelo C foi de 73,6% e para o alelo T

de 26,4%.

Tabela 14 Genótipo e frequência dos alelos para polimorfismo Interleucina 4 (IL-4) na região

promotora 33 em indivíduos com alteração cardíaca e forma indeterminada para infecção por

Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Alteração Cardíaca

(n = 181)

Indeterminada

(n = 106) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipos

(%)

Frequência

Alelos

Genótipo

(%)

Frequência

Alelos

33

CC 96

(53,1%)

73,2% 58

(54,7%)

73,6%

0,8913

CT 73

(40,3%)

40

(37,7%)

0,9207

TT 12

(6,6%)

26,8% 8

(7,6%)

26,4%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2 .

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05

iNOS

Dos 656 indivíduos estudados, foi realizado o polimorfismo da iNOS posição -1173 C/T de

370. Sendo a frequência para CC, CT e TT respectivamente, 254 (68,6%), 104 (28,1%) e 12 (3,3 %).

Indivíduos com sorologia para Chagas negativo (n=103) o genótipo ficou 67 (65%) CC, 33

(32,1%) CT e 3 (2,9%) TT. Não observando diferença estatística significativa (P<0,05) ao comparar

com a sorologia positiva (n= 267) dos quais 187 (70%) eram CC, 71 (26,6%) CT e apenas 9 (3,4%) foi

TT. (tabela 15)

Observando a frequência dos alelos não houve significância entre positivo e negativo. Sendo

a frequência do alelo C de 83,3% para sorologia positiva e 81% para a sorologia negativa. Já o alelo

T ficou de 16,7% para os indivíduos com sorologia positiva e 19% para os de sorologia negativa.

Tabela 15 – Genótipo e frequência dos alelos do polimorfismo iNOS na região promotora em

indivíduos com sorologia positiva e negativa para o Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Positivos

(n = 267)

Negativo

(n = 103) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipo

(%)

Frequência

Alelos

Genótipo

(%)

Frequência

Alelos

-1173

CC 187

(70,0%)

83,3 % 67

(65%)

81%

0,5763

CT 71

(26,6%)

33

(32,1%)

0,4652

TT 9

(3,4%)

16,7% 3

(2,9%)

19%

Estatística significativa para distribuição da frequencia dos genótipos avaliandos usando o teste x2 .

GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego California USA. O nível de significância

adotada foi P<0,05

Os genótipos da forma clínica nos pacientes positivos não houve diferença. Nos grupo dos

pacientes com sorologia positiva e apresentando alteração cardíaca o genótipo CC, CT e TT, ficou

respectivamente: 73,6% (131), 23,6% (42) e 2,8% (5). Similar resultado foi encontrado para o grupo

indeterminado para os genótipos CC, CT e TT, respectivamente: 60,6% (57), 34,1% (32) e 5,3 % (5).

Ao analisar a frequência dos alelos, houve significância em os alelos C e T. Indivíduos com sorologia

positiva e apresentando alteração Cardíaca a frequência do alelo C foi de 85,4% e para o Alelo G de

14,6%. Para o grupo dos indeterminados, cuja frequência do alelo C foi de 77,7% e para o alelo T de

22,3%.

Tabela 4 Genótipo e frequência dos alelos para polimorfismo da iNOS na região promotora -1173 em

indivíduos com alteração cardíaca e forma indeterminada para infecção por Trypanosoma cruzi.

Polimorfismo

Alteração Cardíaca

(n = 178)

Indeterminada

(n= 94) Genótipo

Valor X 2 p

Alelos

Valor Genótipos

(%)

Frequência

Alelos

Genótipo

(%)

Frequência

Alelos

-1173

CC 131

(73,6%)

85,4% 57

(60,6)

77,7%

0,0814

CT 42

(23,6%)

32

(34,1%)

0,0233*

TT 5

(2,8%)

14,6% 5

(5,3%)

22,3%

*ORCC x TT= 1,682 (95% CI=1,070–2,643) Estatística significativa para distribuição da frequencia dos

genótipos avaliandos usando o teste x2 . GraphPad Prism verão 5.00 para Windows, San Diego

California USA. O nível de significância adotada foi P<0,05

Discussão

Na Doença de chagas, como em outras situações de morbidade há fatores associados

que podem estar protegendo ou favorecendo a infecção e o aparecimento de sinais e sintomas.

Dentre esses fatores existem aqueles relacionados ao ambiente, genéticos do indivíduo e do

microrganismo. Nas doenças humanas, recentemente diversos estudos têm colocado em

evidencia que a susceptibilidade ou proteção estão associados à variações alélicas funcionais.

Dessa forma, a identificação de polimorfismos de genes relacionados a diversas doenças

podem contribuir para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico precoce e

estabelecimento de medidas preventivas.

Nos últimos anos, loci polimórficos de genes do sistema imune dentro e fora da região

do CPH (Complexo Principal de Histocompatibilidade) do inglês MHC (Major

Histocompatibility Complex) têm sido identificados e podem ter efeito no desenvolvimento de

doenças infecciosas (KWIATKOWSKI, 2000). Polimorfismos de um único nucleotídeo

(SNPs), nestes loci, alteram a resposta imune à infecção por modulares a expressão dos genes

nos quais se encontram.

Na doença de Chagas, é indiscutível o papel da resposta imune no processo patogênico

e conseqüente desenvolvimento da forma clínica. Higuchi (1997) sugere que indivíduos que

produzem uma resposta imunológica eficiente contra o parasito evoluem para a forma

indeterminada, enquanto que, indivíduos que respondem de forma ineficiente e hiperérgica

evoluem para a cardiopatia chagásica. A resposta eficiente contra o parasito tem forte caráter

Th1, com produção de IL-12, IFN-γ, TNF-α e NO (SILVA et al., 1995; ALIBERTI et al.,

1996; HUNTER et al., 1996; MARTINS et al., 1998, 1999; MICHAILOWSKY et al., 1998;

SILVA et al., 1998; TEIXEIRA et al., 2002).

Vários autores têm investigado o papel da imunogenética na

suscetibilidade/resistência a doenças infecciosas (HILL et al., 1991; MCGUIRE et al.,

1994; CABRERA et al., 1995; LEVESQUE et al., 1999; MCGUIRE et al., 1999; CRAIG

et al., 2000; CHEVILLARD et al., 2002; MEYER et al., 2002; COURTIN et al., 2005;

FLORI et al., 2005). Estes trabalhos contribuíram para o questionamento do motivo porquê

alguns indivíduos não desenvolvem algumas doenças ou as apresentam da forma mais

branda, enquanto outros as apresentam de forma grave ou até fatal. O papel das

características genéticas individuais na suscetibilidade/resistência a alguns tipos de

doenças trouxe uma explicação plausível para essas questões.

Vários métodos de estudo (familiar, de população e mapeamento de genes em

modelos experimentais) têm sido utilizados para mapear e identificar genes ou lócus

relevantes, que influenciam na resistência ou suscetibilidade nas infecções. Alguns tipos de

estudos necessitam da escolha de um gene candidato. Esta escolha se baseia na função

biológica e no papel do produto desse gene na patogênese da doença estudada. Estes dados

são obtidos a partir de estudos experimentais em cromossomos homólogos ou pela

semelhança com outras doenças (ABEL e DESSEIN, 1997; SEGAL e HILL, 2003).

Diferentes polimorfismos no gene de citocinas podem existir na população. É

possível que genótipos específicos possam trazer benefícios na imunidade a doenças

infecciosas, por intensificarem mecanismos imuno-efetores que poderiam, no entanto,

predispor a doenças inflamatórias crônicas. Por outro lado, outros genótipos poderiam

resultar em um fenótipo “imunorregulador”, que diminui a intensidade da resposta

“proinflamatória”, amenizando seus efeitos lesivos nos tecidos que, no entanto, pode

favorecer o escape de agentes infecciosos (CAMPINO et al., 2006).

A influência da genética sobre a mortalidade associada a certas doenças infecciosas

vem sendo analisada há muito tempo, desde a década de 1980.(SORENSEN et al., 1988).

Sorensen et al., (1988) Relataram que a morte dos pais biológicos em decorrência de

infecções aumentou o risco de que seus filhos venham a óbito pelo mesmo motivo, o que não

ocorreu no caso de pais adotivos. Nos últimos 10 anos, após a finalização do projeto genoma

humano, vários estudos, principalmente em populações caucasianas, demonstraram que existe

uma variação genética significativa em diversas doenças humanas comuns.(BAYLEY;

OTTENHOFF; VERWEIJ, 2004). Além disso, descobriu-se que várias infecções são afetadas

pela variação genética, incluindo malária, tuberculose, hanseníase, e infecções por

Helicobacter pylori, HIV e hepatite B, entre outras. (BURT, 1999)

Apesar de vários trabalhos terem sido realizados nos últimos tempos, não esclareceram

totalmente os mecanismos responsáveis pela suscetibilidade à infecção e nem o curso da

doença. Os marcadores genéticos mais utilizados atualmente em estudos de associação são o

polimorfismo de nucleotídeo único (SNPs), que podem resultar na variação da produção e a

quantidade de uma proteína (citocina).

A produção de citocinas em decorrência da resposta imune frente a infecção por T.

cruzi parece modular a progressão da doença assim como inibir a replicação do parasita. Em

especial, a IL-4 com o perfil Th2 mantém a inflamação na persistência do parasita (enquanto

que as citocinas Th1 promoveo controle do parasitismo, embora possa contribuir com o

desenvolvimento da miocardite crônica (GOMES et al., 2003).

O gene da IL-4 foi associado com o aumento da transcrição e aumento dos níveis da

IgE em pacientes com asma e atopia, bem como na malária.

O gene IL10 contém cinco éxons e localiza-se no cromossomo 1 entre 1q31 e 1q32

(ESKDALE et al., 1997) ocupando aproximadamente 5,1 kb (KIM et al., 1992). A IL-10 tem

potentes efeitos imunomoduladores, mais intensos sobre a resposta Th1, emboramodule

também a resposta Th2. Dentre as principais funções da IL-10, está a capacidade de bloquear

a ativação da síntese de citocinas, enzimas e quimiocinas pró-inflamatórias (MOORE et al.,

2001); inibir a expressão de MHC II e moléculas co-estimulatórias em APCs (DE WAAL et

al., FIORENTINO et al., 1991; DING et al., 1993; CHANG et al., 1995). Nos linfócitos T

inibe a síntese de algumas citocinas como a IL-2, IFN-γ, IL-4 e IL-5 (DE WAAL et al., 1993;

TAGA et al., 1993; SCHANDENE et al., 1994 MOSMANN e COFFMANN, 1989). Estas

características tornam a IL-10 uma importante molécula reguladora do processo inflamatório

e de funções efetoras como as do macrófago, células T e células NK (

A presença da base nitrogenada A na posição -1082 foi associada com baixa produção

da IL-10 após estimulação de células T in vitro (TURNER et al, 1997). Esta variante parece

ter aplicabilidade clínica, visto que alguns alelos da região promotora podem determinar

baixa, intermediária ou alta produção de IL- 10 (ESKDALE et al., 1997). Polimorfismos da

IL-10 ja foram associados a outras doenças infecciosas, dentre elas a Leishmanise cutânea

(SALHI e cols, 2008).

Neste estudo, pacientes com sorologia positiva (63%), apresentavam a base

nitrogenada A, sugerindo uma predisposição à infecção quando em contato com o T. cruzi.

Ressaltando que um polimorfismo apenas não determinaria a infecção, pois o combate

imunológico é complexo e envolve diversos fatores. Também foi observado, que pacientes

com acometimento cardíaco tanto para IL-10 na posição -1082 e -819 apresentavam variantes

no seu genótipo.

Corroborando com nosso resultado, o estudo de Araujo e colaboradores (2011)

reconhecem a importância das células T regulatória na patogênese da doença de Chagas, no

qual mostrou que as células T podem suprimir o sistema imunológico ao produzir citocinas

anti-inflamatórias como IL-10 e TGF-β. Outro trabalho, envolvendo células T regulatórias em

pacientes chagásicos crônicos, constatou um aumento dessas células em pacientes

assintomáticos quando comparados com os cardíacos. Pacientes assintomáticos produziam e

secretavam maiores quantidades de IL-10 e TGF-β. (ARAUJO et al., 2011).

Trabalho de Costa e outros (2009) constatou que o gene da IL-10 da posição -1082 a

região promotora é altamente polimórfico e que a o alelo A leva a produção reduzida da IL-

10, associando o alelo A com a forma cardíaca para a doença de Chagas. Eles também

analisaram os pacientes cardíacos e dividiram de acordo com o grau de lesão do órgão.

Outro estudo avaliando o polimorfismo da IL-10, não somente o -1082 G/A, mas

também o -819 C/T e -592 C/A, não encontrou significância estatística, mas sugere que fator

genético na produção da IL-10 pode influenciar a susceptibilidade e a forma clínica na doença

de Chagas. (FLÓREZ et al., 2011)

Na literatura, a IL-4, uma citocina com função anti-inflamatória, podendo estar

contribuindo com a permanência do parasita em pacientes crônicos. (RIBEIRO; CREMA;

RODRIGUES, 2008). Estudo de Flórez e Gonzálvez (2011) analisou a posição 509C/T da IL-

4 em pacientes chagásicos colombianos. Esse alelo está associado a um aumento da expressão

da IL-4. Os autores não observaram diferença estatística no genótipo e frequência do alelo

quando comparado entre a forma cardíaca e paciente assintomático. Trabalho envolvendo a

população boliviana também para a posição 590 C/T encontrou um aumento da frequência do

alelo T em indivíduos saudáveis, sugerindo um marcador genético protetor contra a infecção

por T. cruzi. Sugerindo que a frequência do alelo T possa reduzir a produção da IL- 4 e

consequentemente proteger os indivíduos, que embora sejam provenientes de área endêmica,

não têm a infecção. Embora nosso estudo analisou a posição 33C/T IL-4, não encontramos

aumento significativo entre indivíduos com sorologia negativa em relação aos positivos.

Têm sido sugerido que indivíduos com cardiopatia chagásica grave têm uma tendência

de produzir mais IFN-γ, comparado com pacientes com forma indeterminada, após a

estimulação com antígenos parasitários (GOMES et al., 2003). A correlação com níveis

séricos de TNF-α e a ocorrência de cardiopatia grave também tem sido estabelecida

(FERREIRA et al., 2003). Entretanto, outros têm encontrado o oposto em relação a expressão

de IFN-γ e doença cardíaca (LAUCELLA et al., 2004). BAHIA-OLIVEIRA et al, (2000)

demonstraram que níveis de IFN-γ foram maiores em indivíduos curados em relação a

indivíduos que receberam quimioterapia e não alcançaram cura parasitológica.

Considerando a natureza crônica da forma cardíaca e o fato que muitos pacientes com

forma indeterminada também produzem altos níveis de IFN-γ, em adição a outras citocinas

inflamatórias (DUTRA et al., 1997; GOMES et al., 2003; DE BARROS-MAZON et al.,

2004), fica claro que mecanismos imunorregulatórios estão presentes na doença e podem

influenciar fortemente na evolução clínica. Tem sido demonstrado que IL-10 é produzida por

indivíduos com as formas cardíaca e indeterminada da doença (DUTRA et al., 1997) e ainda

que PBMC de indivíduos com forma indeterminada produzem mais IL-10 que indivíduos com

forma cardíaca (BAHIA-OLIVEIRA et al., 1998; GOMES et al., 2003; SOUZA et al.,2004).

Na Doença de Chagas experimental, a IL-10 está associada tanto à suscetibilidade à

infecção por T. cruzi, através da diminuição da eficácia da resposta antiparasitária, quanto à

patologia, através da inibição de uma resposta Th1 exacerbada (SILVA et al., 1992; REED et

al., 1994).

A partir desses resultados, vários autores sugerem que, em indivíduos com forma

indeterminada, a ação modulatória da IL-10 mantém um balanço entre parasitismo e

integridade tecidual, onde o fraco foco inflamatório se resolve em fibrose focal e a resposta

Th1 continuada pode manter o parasitismo sob um controle relativo. O processo

progressivamente destrutivo da forma cardíaca pode resultar da falha no controle da resposta

Th1 pela ação modulatória da IL-10 (DUTRA et al., 2005). Poderíamos assim, levantar a

hipótese de que os polimorfismos genéticos da IL-10 teriam a capacidade de interferir nos

mecanismos de controle do parasito, assim como no controle da resposta inflamatória com

repercussão no desenvolvimento das formas clínicas da doença.

Alguns estudos têm demonstrado que diferentes genótipos das posições –819 e –

1082 do promotor do gene do IL-10 estão associados a várias doenças (CRAWLEY et al.,

1999; HELMINEN et al., 1999; TAGORE et al., 1999; SHIN et al., 2000; GIBSON et al.,

2001; MIYAZOE et al., 2002; SMOLNIKOVA et al., 2002; DAHER et al, 2003;

GALLAGHER et al., 2003; KNAPP et al., 2003; LOWE et al., 2003; SCHAAF et al., 2001,

HAANPAA et al., 2002; 2003; SCOLA et al., 2003; LECH-MARANDA et al, 2004;

TSIAVOU et al., 2004; HENAO et al., 2006; ORAL et al., 2006). Além da associação a

doenças, outros autores demonstraram que estes polimorfismos desempenham efeitos na

atividade transcricional da citocina (KEIJSERS et al., 1997, 1998; CRAWLEY et al., 1999;

ESKDALE et al., 1999; MIYAZOE et al., 2002; REES et al., 2002; SUÁREZ et al., 2003;

WARLÉ et al., 2003). Entretanto, os resultados têm sido contraditórios e ainda não se sabe

com certeza qual haplótipo/genótipo causa alta ou baixa produção de IL-10 (WARLÉ et al.,

2003; OPDAL, 2004).

Em nosso estudo, analisando-se a freqüência de distribuição dos genótipos da

posição –819 do gene da IL-10, não foi evidenciada correlação entre os genótipos C/C, T/C e

T/T e a sorologia. Calculando-se a freqüência dos alelos C e T, não houve diferenças

significativas entre as frequências dos alelos, entretanto, o alelo T teve preponderância entre

os soropositivos (38,12%). Comparando-se os genótipos com as formas clínicas, cardíaca e

indeterminada, não houve correlação entre o genótipo e a forma clínica desenvolvida pelo

paciente. Em relação às frequências dos alelos, o alelo T foi mais frequente no grupo de

indeterminados (42,45%) do que entre os cardíacos (35,42%), embora sem significância

estatística.

A posição -819 não tem sido isoladamente correlacionada com doenças, porém,

junto a outros polimorfismos (posições –592 e –1082), na forma de haplótipos, tem sido

correlacionado a várias doenças. Além disso, existem trabalhos mostrando correlações entre

genótipos da posição -592 e doenças. Este polimorfismo se encontra em total desequilíbrio de

ligação com o da posição –819, de forma que os alelos -819C e –592C são herdados juntos, e

o mesmo acontece para –819T e –592A (TURNER et al., 1997; ALBUQUERQUE et al.,

2004).

Summers et al. (2000) encontraram maior freqüência do haplótipo ATA,

especialmente o alelo –592A, em casos de síndrome de morte súbita infantil, enquanto que

Opdal et al. (2003), com uma casuística mais expressiva, encontraram associação entre o

mesmo haplótipo e morte súbita infantil não esperada devido à infecção (OPDAL et al.,

2003). O haplótipo ATA foi associado a primoinfecção tardia por EBV em crianças, enquanto

que adultos EBV-soronegativos são na maioria das vezes homozigotos GCC (HELMINEN, et

al., 2001). Na infecção crônica pelo vírus da hepatite B, a freqüência do haplótipo ATA foi

significativamente maior entre portadores assintomáticos que em pacientes com doença

crônica e progressiva no fígado (MIYAZOE et al., 2002). O mesmo haplótipo foi

correlacionado à infecção pelo vírus do herpes zoster (HAANPAA et al., 2002).

Levando em conta o desequilíbrio de ligação entre as regiões -819 e -592, alguns

trabalhos podem ser discutidos. Em pacientes com pneumonia grave, admitidos em unidade

de terapia intensiva, foi observada uma correlação entre o alelo –592A e alta mortalidade

(LOWE et al., 2003). Porém, na hepatites C, foi encontrada uma correlação entre o genótipo –

592A/A e infecção autolimitada (KNAPP et al., 2003). Indivíduos contendo o alelo –592A

apresentaram um risco maior para a infecção por HIV e, depois de infectados, a progredir para

AIDS mais rapidamente que homozigotos –592G/G (SHIN et al., 2000; SMOLNIKOVA et

al., 2002). Coutrin et al, (2006) observou que o alelo –592A confere um risco diminuído de

adquirir tripanossomíase africana em indivíduos com longos períodos de exposição.

Cada patógeno atua de forma específica no organismo do hospedeiro. A resposta

imunológica se desenvolve de forma diferente dependendo da natureza do patógeno

(protozoários, bactérias ou vírus) e determinados compartimentos imunológicos se tornam

mais eficientes para o controle da infecção. Desta forma, as diferenças observadas entre as

doenças podem decorrer da via de ativação do gene, da natureza das células produtoras de IL-

10 e dos compartimentos teciduais em que a citocina é secretada. Desta forma, se torna difícil

a comparação de resultados referentes a diferentes patógenos.

O polimorfismo da posição -819 do gene da IL-10 tem sido pouco correlacionado a

doenças em relação à posição -1082. Além disso, foi demonstrado que o efeito na expressão

do gene é determinado predominantemente pelo alelo –1082 (TURNER et al., 1997). Talvez,

as correlações demonstradas entre vários haplótipos e diferentes doenças sejam determinadas

predominantemente pelo polimorfismo da posição –1082.

Analisando-se a freqüência de distribuição dos genótipos da posição –1082 do gene

da IL-10, foi verificada uma correlação estatisticamente significativa entre o genótipo G/G e

sorologia negativa para T. cruzi. Calculando-se a freqüência dos alelos G e C, não houve

diferenças significativas entre as freqüências dos alelos, entretanto, o alelo G teve

preponderância entre os soronegativos (40,68%) em relação aos soropositivos (34,80).

Comparando-se os genótipos com as formas clínicas, cardíaca e indeterminada, houve uma

correlação estatisticamente significativa entre o genótipo A/A e a forma clínica indeterminada.

Em relação às freqüências dos alelos, o alelo A foi mais freqüente no grupo de indeterminados

(70,37%) do que entre os cardíacos (59,38%), embora sem significância estatística.

Além dos trabalhos correlacionando haplótipos discutidos anteriormente, muitos

estudos têm observado correlações entre os genótipos (ou alelos G/A) da posição -1082 e

algumas doenças. Em duas populações diferentes do Norte e Sul da Itália foi encontrada uma

freqüência significantemente aumentada de –1082A/A entre indivíduos com idade avançada

com infarto agudo do miocárdio enquanto que o grupo controle pareado apresentou

freqüência aumentada de–1082G/G. O autor sugere que o genótipo -1082G/G é protetor

contra o infarto agudo do miocárdio e possivelmente é um parâmetro determinante para a

longevidade (LIO et al., 2004).

A freqüência alélica de –1082G foi significantemente mais comum entre pacientes

com tuberculose em relação a controles saudáveis (ORAL et al., 2006) e a progressão na

tuberculose pulmonar foi correlacionada com a diminuição da freqüência do alelo –1082A

(SCOLA et al., 2003). Outro estudo demonstrou associação entre o genótipo –1082 A/A com

tuberculose pleural, que é uma forma autolimitada da doença (HENAO et al., 2006). Estudos

com indivíduos com pneumonia mostraram que o genótipo -1082G/G está associado com

doença mais grave e maior risco de choque séptico (GALLAGHER et al., 2003; SCHAAF et

al., 2003). O alelo –1082G foi mais presente em indivíduos soronegativos para EBV em

relação a soropositivos com infecção aguda e agressiva (HELMINEN et al., 1999). Em

infecção pelo vírus da hepatite C, o genótipo –1082G/G foi associado com infecção

persistente (KNAPP et al., 2003).

Como o efeito funcional desses polimorfismos sobre a expressão do gene ainda não

está claramente definido, a explicação mais consistente com a literatura, para nossos

resultados, seria que a maior freqüência de A/A, encontrada entre os indivíduos com forma

indeterminada, poderia ocorrer devido a uma provável maior expressão de IL-10

desempenhada por esse genótipo (KEIJSERS et al., 1997, 1998; ESKDALE et al., 1999;

REES et al., 2002; WARLÉ et al., 2003; BOZZI et al., 2006). Esta maior expressão permitiria

um maior controle da resposta inflamatória, impedindo o excesso de lesões teciduais (DUTRA

et al., 2005).

A correlação entre o genótipo GG e a sorologia negativa para T. cruzi é mais

complexa. Deve-se levar em conta que a fase aguda da doença é fatal em cerca de 10% dos

casos (COURA, 2003), e este genótipo pode ter alguma correlação com este grupo de

indivíduos. Além disso, aspectos relacionados com a transmissão da doença ainda não estão

bem esclarecidos. Levando em conta que os indivíduos do grupo controle são oriundos de

área endêmica e habitavam residências onde foram identificados indivíduos soropositivos,

pode-se inferir que esse grupo também estava exposto ao parasito. Estes fatos permitem

levantar a possibilidade de que indivíduos soronegativos entraram em contato com o parasito

e, por motivos relacionados a uma maior resistência, conseguiriam eliminar rapidamente o

parasito. Neste sentido, a associação do genótipo com a sorologia negativa poderia representar

uma maior facilidade destes indivíduos em controlar o parasito e manter-se com sorologia

negativa.

Diferentes padrões de produção de citocina foram associados a polimorfismos tanto

na forma de alelos, quanto a genótipos e a haplótipos. Entretanto, ainda não se chegou a um

consenso sobre qual fenótipo está associado a cada polimorfismo.

Nesse trabalho, foram comparados os níveis de IL-10 produzidos em culturas de

PBMC de pacientes e controles com os genótipos da região promotora do gene da IL-10

desses mesmos indivíduos. Foram realizadas culturas sem estímulos e com estímulos de LPS,

PHA e antígenos de T. cruzi. Não foi observada diferença estatística entre os níveis da citocina

nos diferentes genótipos, tanto para a posição –819 quanto para a posição –1082.

Turner et al. (1997), utilizando culturas de PBMC (isolados de indivíduos voluntários

saudáveis) estimuladas com ConA, associou o genótipo –1082G/G com altos níveis de IL-10.

Em um estudo semelhante, Warlé et al. (2003) observou o contrário, sendo que o genótipo –

1082G/G foi associado a baixos níveis de IL-10 em relação aos outros genótipos. Em outro

estudo, utilizando menor concentração de ConA, não foi observada diferença na produção

entre os genótipos (HOFFMANN et al., 2001).

Existe controvérsias na relação entre certos polimorfismos de gene de citocinas e

produção in vitro de citocina. Os trabalhos encontrados na literatura apresentam muitas

diferenças nos métodos utilizados. Enquanto alguns investigam a ação dos polimorfismos em

indivíduos saudáveis, outros utilizam grupos de indivíduos doentes e expostos a patógenos.

Warlé et al. (2003) questionam se é possível determinar contribuição genética para os níveis

de citocina em indivíduos submetidos a certos “estímulos” ambientais (como doenças,

medicação ou imunossupressão), comparados com indivíduos jovens e sadios nos quais a

contribuição genética pode ser mais facilmente revelada.

Além disso, para estes estudos, células de sangue total, monócitos isolados e PBMC

são utilizados. Certamente, o tipo de célula do ensaio também é um fator importante para o

padrão de expressão da citocina. Variações no protocolo de cultura também são

constantemente observadas, como por exemplo o tipo de estímulo utilizado, concentração do

estímulo e tempo de incubação. É possível, então, que a utilização de diferentes métodos

sejam causas de resultados conflitantes (WARLÉ et al., 2003).

Suárez et al. (2003), utilizando culturas estimuladas por LPS, análise da produção de

citocina por ELISA e de RNA por RT-PCR, encontraram o haplótipo GCC como maior

produtor de IL-10 e o ATA como menor. Por outro lado, Eskdale et al. (1999), utilizando

culturas de PBMC estimuladas com LPS encontraram associação entre maior produção de

citocina e o alelo –1082A. O mesmo foi encontrado por Keijsers et al. (1997, 1998) utilizando

culturas de sangue total. BOZZI et al. (2006) observaram, por citometria de fluxo, que

indivíduos –1082 G/G apresentam quatro vezes menos células produtoras de IL-10 que

indivíduos G/A e A/A.

Foram realizados ensaios utilizando estratégias de manipulação de genes, nos quais a

região promotora da IL-10 foi ligada ao gene da luciferase e expressa em células de linhagem

monocítica. Crawley et al. (1999) encontraram maior atividade em promotores com alelo –

1082G em relação ao –1082A. Porém, Paterson et al, (1999), utilizando ensaios semelhantes

em diferentes tipos celulares, demonstrou que a diferença de transcrição entre os diferentes

haplótipos é dependente do tipo celular utilizado. Provavelmente, esta dependência se deve

aos diferentes fatores de transcrição que existem nos diferentes tipos celulares.

Estratégia de manipulação de genes utilizando expressão em células de linhagem

monocítica também foram utilizados por Reuss et al. (2002), os quais observaram que

promotores com o haplótipo GCC apresentaram atividade transcricional 20% maior que

promotores contendo ATA. Por outro lado, Rees et al. (2002) utilizando ensaio semelhante,

porém com linhagens de células B transformadas, observou que o alelo –1082A confere uma

atividade transcricional duas vezes maior que o alelo –1082G. Para os dois trabalhos, não

houve diferença nos níveis de IL10 em culturas de PBMC estimuladas com ConA para os

diferentes genótipos.

É válido salientar que os trabalhos que analisam a expressão do gene em culturas

celulares e aqueles que utilizam ensaios de manipulação de genes em diferentes tipos

celulares apresentam vantagens e desvantagens. O primeiro deles, realizado na própria célula

que contém o gene que se quer analisar, permite reprodução fidedigna do que ocorre dentro do

organismo. Todavia, a análise pode sofrer influências de outros polimorfismos próximos da

região analisada (em desequilíbrio de ligação) ou mesmo de outros fatores que influenciam a

transcrição, codificados por genes distantes. O segundo modelo permite a análise de um único

polimorfismo, entretanto, não reproduz exatamente o que ocorre in vivo, como alterações de

cromatina e presença de alguns fatores de transcrição. É possível que a falta de um modelo

padrão e confiável seja a principal causa desses resultados conflitantes.

O polimorfismo da região –1082 está localizado entre uma seqüência de ligação a um

fator de transcrição ETS-like (KUBE et al., 1995). Seqüências com o genótipo –1082A

apresentam maior afinidade a fatores nucleares de monócitos que seqüências com –1082G,

sugerindo diferença de afinidade de ligação entre os genótipos (REES et al., 2002). REUSS et

al. (2002) mostraram que um fator de transcrição PU.1, expresso em todas as linhagens de

células hematopoiéticas, com exceção de Linfócitos T periféricos, se ligam a essa região e

apresentam maior afinidade ao alelo –1082A. Entretanto, outros fatores, bem como sua ação

nos diferentes tipos celulares, devem ser melhor caracterizados para um maior entendimento

do efeito transcricional (REES et al., 2002).

Analisando os níveis de IL-10 em relação à sorologia para T. cruzi, os níveis de IL-10

produzidos em culturas com AtgTc, LPS e PHA foram significativamente maiores entre os

chagásicos em relação aos controles. Após o estímulo com AtgTc, a maior produção de IL-10

por indivíduos chagásicos pode ser explicada pelo repertório de células T destes indivíduos

contra os antígenos de T. cruzi. O fenótipo alto produtor de IL-10 entre os chagásicos,

evidenciado após estímulo com LPS e PHA, pode estar associado à suscetibilidade à infecção

e nos leva novamente à dúvida lançada anteriormente.

Não houve diferença de produção de IL-10 entre cardíacos e indeterminados. Porém

esta diferença foi observada por vários autores, sendo a principal célula responsável pela

produção monócitos (BAHIA-OLIVEIRA et al., 1998; GOMES et al., 2003; SOUZA et

al.,2004).

Neste trabalho, para a maioria dos genótipos, foi observada correlação positiva entre a

produção de IL-10 após estímulos com LPS e PHA. Entretanto, para os genótipos TT da

posição -819 e GG da posição –1082 não foi observado correlação. Considerando que LPS e

PHA são estímulos predominantes para monócitos e linfócitos respectivamente, a ausência de

correlação entre os genótipos TT e GG sugere que a ação destes sobre a expressão gênica

possa ser diferente entre linfócitos e monócitos. Se isto for comprovado, explicaria diferenças

observadas em vários trabalhos que utilizaram diferentes tipos celulares. Culturas de PBMC e

dosagem de citocina por ELISA provavelmente são métodos inadequados para a detecção da

diferença de produção entre os genótipos nos diferentes tipos de células.

As freqüências dos genótipos observadas neste trabalho foram semelhantes às

observadas em dois trabalhos realizados com voluntários saudáveis, no Rio de Janeiro

(MORAES et al., 2003; ALBUQUERQUE et al., 2004). Entretanto, a freqüência de GG

(posição –1082) foi maior nos indivíduos deste estudo em relação aos do Rio de Janeiro. O

fato dos estudos de Moraes e Albuquerque serem realizados com indivíduos saudáveis e

nosso trabalho com indivíduos de área endêmica expostos ao T. cruzi, pode explicar a

diferença observada para o genótipo GG. Além disso, esse genótipo foi mais freqüente entre

indivíduos não infectados em relação aos chagásicos.

Para confirmar o efeito destes genótipos na doença de Chagas e elucidar o significado

biológico destes polimorfismos na doença e na expressão da IL-10, estudos com técnicas mais

elaboradas, como citometria de fluxo, deverão ser realizados em áreas endêmicas para a

doença de Chagas e em outros grupos populacionais.

Trabalho de Chaabe et al., (2011) avaliando a IL-12p40 na posição 1188 encontraram

que a prevalência significativa do genótipo CC nos pacientes com carcinoma nasofaringe em

comparação com o grupo controle, conferindo susceptibilidade alelo/genótipo. comportando-

se como uma susceptibilidade Alelo/genótipo. Também foi observado que o genótipo CC

apresentava associação significativa com o estágio mais avançados do tumor quando

comparados com os pacientes em fase inicial.

Como o FcγRIIa, é uma importante proteína na defesa do hospedeiro contra a

infecção. FcR pertencem à família de immunereceptors, que inclui receptores de células T ,

receptores de células B e de receptores natural killer (BRAGA et al., 2005). Estudo realizado

por Maiga et al., 2013 verificaram que a frequência de genótipo AA apresentava uma defesa

contra a malária, e o genótipo GG se tornavam mais suscetível. Porém outros estudos

mostraram um efeito protetor para o genótipo 131G/G (alelo G) e reduzindo o risco de alta

densidade parasitemia (SHI et al., 2001; OUMA et al., 2006). Da mesma forma, outros três

estudos demonstraram uma aumento do risco com 131 genótipo A / A para a malária grave,

cerebral ou da placenta (Omi et al., 2002; BROUWER et al., 2004). Um estudo realizado no

Sudão descobriram que o genótipo 131G /G (alelo G) foi significativamente associada com as

chances de a doença da malária grave quando comparado com o da malária leve (NASR et al.,

2007). Algumas das diferenças nos resultados destes estudos pode ser devida ao desenho do

estudo, onde alguns compararam o efeito entre os grupos étnicos, enquanto outros comparam

a gravidade da doença. Todos concordam que este marcador está associada a malária e

embora o polimorfismo FcγRIIa 131 é conhecido por ser funcional, a heterogeneidade da os

resultados sugerem que pode haver outros polimorfismos no gene que modificam a resposta.

Alternativamente, uma vez que este receptor é sensível a diferentes subtipos de IgG parte a

heterogeneidade pode ser até que os anticorpos são produzidos por indivíduos e eles podem

também estar sob um certo nível de controlo genético.

Ao estudar 2504 crianças do Gana com malária grave ( 611.162 ) e 2.027 controles

pareados saudáveis , Schuldt et al . (2010 ) constataram que homozigose para 131R foi

positivamente associado com malária severa (odds ratio = 1,20 , p = 0,007 , p corrigido para

testes múltiplos = 0,021) . Schuldt et ai. (2010 ) concluíram que a variante de ligação de PCR

FCGR2A está associada com anemia malarial , sugerindo um papel para os mecanismos de

defesa de PCR na patogênese desta condição.

Moser et al., (1998) encontraram ligação dos múltiplos casos de LES, com o

polimorfismo do gene G131A FCGR2A . De Rose et al . (2005) descobriram que pacientes

com fibrose cística que possuíam o alelo G na posição 131 do FCGR2a apresentaram um

risco quatro vezes maior de contrair a infecção por Pseudomonas aeruginosa crônica ( p =

0,042).

Asano et al., 200J, avaliar am o polimorfismo do fcgr2a encontraram associação de

colite ulcerosa com o alelo G, havendo uma inversão dos estudos anteriores em doenças auto-

imunes.

Como há estudos que demonstram a importância do Fcgama em parasitose e, devido

ao escasso material da ação do Fcgamma na doença de Chagas e avaliamos e não obtivemos

resultado significante. Não ocorrendo diferença entre os indivíduos.

Alguns estudos analisaram o polimorfismo FcγRIIa131 em relação à gravidez na

malária. Por exemplo, um estudo recente realizado na Arábia Saudita mostrou que o 131H / H

genótipo e H são alelo associado com protecção nos controlos livres de malária , em

comparação com infecção por malária assintomática em mulheres grávidas que mostrou um

aumento na RR genótipo de alelo e R [ nasr et al., 2013] . Coleta de tais informações em

nosso meio nos permita ver se este efeito poderia ser replicado em ambas as nossas etnias que

ajudam na implementar e monitorar estratégias de pesquisa da malária em áreas endêmicas.

Em 193 pacientes japoneses com lúpus eritematoso sistêmico (LES ; 152.700 ) e 303

controles saudáveis , Kyogoku et al. (2002 ) constataram que a homozigose para um

polimorfismo ile232 -to - thr na região transmembrana do gene FCGR2B ( I232T ;

604.590,0002 ) foi significativamente maior em pacientes com LES em comparação com os

controles.

Su et al. (2004 ) identificaram 10 SNPs no primeiro promotor FCGR2B em 66

pacientes com LES e 66 controles . Eles determinaram que o promotor proximal contém dois

haplótipos funcionalmente distintas . A análise mostrou que o promotor de luciferase do

haplótipo menos frequentes , que tinha uma frequência de 9 % , foi associada com o aumento

da expressão do gene. Um estudo de 243 pacientes com LES e 366 controles pareados de

caso-controle demonstraram que o haplótipo mais freqüente foi significativamente associada

com o fenótipo SLE e não estava em desequilíbrio de ligação com FCGR2A e FCGR3A

polimorfismos. Su et al. (2004 ) concluíram que uma variante do FCGR2B expressão é um

fator de risco para o LES .

Em 190 pacientes americanos europeus com LES e 130 controles européias , Blank et

al . (2005) encontraram uma associação significativa entre homozigose para um polimorfismo

- 343C na região promotora do gene FCGR2B ( 604.590,0001 ) e LES.

Mueller et al. (2013 ) identificou e designou um gene quimérico , FCGR2B -prime ,

que ocorre como conseqüência da FCGR3B ( 610.665 ) exclusão no FCGR3B haplótipos zero

cópia. O gene FCGR2B -prime é constituído por elementos a montante e uma região 5 -prime

codificação que derivam FCGR2C ( 612.169 ) , e uma região 3 -prime codificação que deriva

FCGR2B . A sequência de codificação de FCGR2B - prima é idêntica à do FCGR2B , mas

FCGR2B -prime seria esperado para estar sob o controlo de sequências de 5 -prime

flanqueamento derivadas FCGR2C . Mueller et al. (2013 ) encontraram por citometria de

fluxo , immunoblotting, e sequenciamento de cDNA que a presença dos quiméricos FCGR2B

-prime gene resulta na presença ectópica de Fc- gamma- RIIB em células natural killer ,

fornecendo uma explicação para o risco de LES associado à redução do número de cópias

FCGR3B . Para prosseguir o mecanismo subjacente da doença LES associação com FCGR3B

variação do número de cópia , Mueller et al . ( 2013), a sequência de referência alinhada (

GRCh37 ) do bloco proximal do locus de FcgR ( chr1 :161,480,906 -161 , 564,008 ), para que

o bloco de distal ( chr1 :161,562,570 -161 , 645,839 ) . Identificação de informativos

variações da seqüência parálogas ( PSVs ) habilitado Mueller et al . (2013 ) para restringir a

região breakpoint potencial para uma região de 24,5 kb de paralogia então entre dois

ancestrais blocos duplicados. A ausência completa de PSVs nonpolymorphic na região de

24,5 kb impediu a localização mais precisa dos pontos de interrupção em haplótipos FCGR3B

- excluídos ou FCGR3B - duplicado.

Em 193 pacientes japoneses com lúpus eritematoso sistêmico (LES ; 152.700 ) e 303

controles saudáveis , Kyogoku et al. (2002 ) constataram que a homozigose para um

polimorfismo ile232 -to - thr na região transmembrana do gene FCGR2B ( I232T ;

604.590,0002 ) foi significativamente maior em pacientes com LES em comparação com os

controles.

Su et al. (2004 ) identificaram 10 SNPs no primeiro promotor FCGR2B em 66 pacientes com

LES e 66 controles . Eles determinaram que o promotor proximal contém dois haplótipos

funcionalmente distintas . A análise mostrou que o promotor de luciferase do haplótipo menos

frequentes , que tinha uma frequência de 9 % , foi associada com o aumento da expressão do

gene. Um estudo de 243 pacientes com LES e 366 controles pareados de caso-controle

demonstraram que o haplótipo mais freqüente foi significativamente associada com o fenótipo

SLE e não estava em desequilíbrio de ligação com FCGR2A e FCGR3A polimorfismos. Su et

al. (2004 ) concluíram que uma variante do FCGR2B expressão é um fator de risco para o

LES .

Em 190 pacientes americanos europeus com LES e 130 controles européias , Blank et

al . (2005) encontraram uma associação significativa entre homozigose para um polimorfismo

- 343C na região promotora do gene FCGR2B ( 604.590,0001 ) e LES.

Mueller et al. (2013 ) identificou e designou um gene quimérico , FCGR2B -prime ,

que ocorre como conseqüência da FCGR3B ( 610.665 ) exclusão no FCGR3B haplótipos zero

cópia. O gene FCGR2B -prime é constituído por elementos a montante e uma região 5 -prime

codificação que derivam FCGR2C ( 612.169 ) , e uma região 3 -prime codificação que deriva

FCGR2B . A sequência de codificação de FCGR2B - prima é idêntica à do FCGR2B , mas

FCGR2B -prime seria esperado para estar sob o controlo de sequências de 5 -prime

flanqueamento derivadas FCGR2C . Mueller et al. (2013 ) encontraram por citometria de

fluxo , immunoblotting, e sequenciamento de cDNA que a presença dos quiméricos FCGR2B

-prime gene resulta na presença ectópica de Fc- gamma- RIIB em células natural killer ,

fornecendo uma explicação para o risco de LES associado à redução do número de cópias

FCGR3B . Para prosseguir o mecanismo subjacente da doença LES associação com FCGR3B

variação do número de cópia , Mueller et al . ( 2013), a sequência de referência alinhada (

GRCh37 ) do bloco proximal do locus de FcgR ( chr1 :161,480,906 -161 , 564,008 ), para que

o bloco de distal ( chr1 :161,562,570 -161 , 645,839 ) . Identificação de informativos

variações da seqüência parálogas ( PSVs ) habilitado Mueller et al . (2013 ) para restringir a

região breakpoint potencial para uma região de 24,5 kb de paralogia então entre dois

ancestrais blocos duplicados. A ausência completa de PSVs nonpolymorphic na região de

24,5 kb impediu a localização mais precisa dos pontos de interrupção em haplótipos FCGR3B

- excluídos ou FCGR3B - duplicado.

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