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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

TESE DE DOUTORADO

Estudo da produção de biossurfactantes sintetizados por

Pseudomonas aeruginosa AP029-GVIIA utilizando

manipueira como fonte de carbono

Márcio Silva Bezerra

Natal/RN

Junho/2012

Márcio Silva Bezerra

Estudo da produção de biossurfactantes sintetizados por

Pseudomonas aeruginosa AP029-GVIIA utilizando

manipueira como fonte de carbono

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Engenharia Química – PPGEQ,

da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, como parte dos requisitos para obtenção

do título de Doutor em Engenharia Química,

sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo Silvino

dos Santos e a co-orientação da Profª. Drª.

Gorete Ribeiro de Macedo.

Natal/RN

Junho/2012

Catalogação da Publicação na Fonte.

UFRN / CT / PPGEQ

Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nicolas Solimo”.

Bezerra, Márcio Silva.

Estudo da produção de biossurfactantes sintetizados por Pseudomonas

aeruginosa AP029-GVIIA utilizando manipueira como fonte de carbono / Márcio

Silva Bezerra. - Natal, 2012.

123 f.: il.

Orientador: Everaldo Silvino dos Santos.

Co-orientador: Gorete Ribeiro de Macedo.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de

Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação

em Engenharia Química.

1. Biossurfactantes - Produção - Tese. 2. Manipueira - Resíduo agroindustrial -

Tese. 3. Pseudomonas aeruginosa - Tese. 4. Cinética - Tese. I. Santos, Everaldo

Silvino dos. II. Macedo, Gorete Ribeiro de. III. Universidade Federal do Rio Grande

do Norte. IV. Título.

CDU 604.2:661.185(043.2)

RN/UF/BSEQ

BEZERRA, Márcio Silva – Estudo da produção de biossurfactantes sintetizados por

Pseudomonas aeruginosa AP029-GVIIA utilizando manipueira como fonte de carbono. Tese

de Doutorado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de

concentração: Engenharia de Processos, Natal/RN, Brasil.

Orientação: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos

Co-orientação: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo

___________________________________________________________________________

RESUMO: O presente trabalho avalia a produção de biossurfactantes a partir de

manipueira, um resíduo agroindustrial a ser utilizado como fonte de carbono. Empregando um

planejamento fatorial 24-1

(fração meia), 10 ensaios foram realizados utilizando Pseudomonas

aeruginosa AP029-GVIIA em cultivo descontínuo submerso em incubador rotatório (shaker).

Foi analisada a influência dos fatores (temperatura, agitação, razão de aeração e concentração

do substrato) em dois diferentes níveis para a síntese do biossurfactante. Amostras foram

coletadas em intervalos regulares durante o cultivo até 132 horas de fermentação. Buscou-se o

melhor resultado acompanhando a produção através do consumo de substrato, massa seca,

redução da tensão superficial (método do anel) e índice de emulsificação. O comportamento

cinético do micro-organismo foi avaliado para a fonte de carbono utilizada. Os resultados

mostraram que a manipueira é bastante assimilável e potencial substrato na produção do

biotensoativo, onde se observou 91% de consumo pelo micro-organismo em estudo. A

temperatura de cultivo revelou ser um dos fatores preponderantes na síntese do metabólito,

acompanhada pela razão de aeração e agitação. Os melhores resultados mostraram redução de

30% da tensão superficial (%RTS) em relação ao meio inicial, alcançando valores de 31

mN/m; 3,0 g/L de biomassa e índice de emulsificação superior a 65%. O metabólito

sintetizado ainda se mostrou estável para diferentes concentrações salinas (1, 5 e 10% m/v) e

pH alcalino (8-10).

Palavras-chaves: Biossurfactante, Pseudomonas aeruginosa, manipueira, cinética.

ABSTRACT

This study evaluates the biosurfactants production from cassava wastewater, an agro

industrial residue, to be used as carbon source. Using a factorial design 24-1

(half

fraction), 10 tests were performed using Pseudomonas aeruginosa AP029/GVII-A in

submerged batch cultivation in rotating incubator (shaker). The influence of factors

(temperature, agitation, aeration ratio and concentration of cultivation medium) at two

different levels for the synthesis of the biosurfactant. Samples were collected

throughout the cultivation by 132 hours of fermentation were completed. The best

outcome was intended by following production through substrate consumption, dry

matter, reduction of surface tension (ring method) and emulsification index. The

kinetics of microorganism was assessed for the carbon source used. The results showed

that the cassava wastewater is a well assimilable substrate for the production of

biotensoactive, reaching 91 % of consumption by the micro-organism under study. The

growth temperature was found to be one of the leading factors in the synthesis of the

metabolite, followed by aeration and also due to the agitation. The best results showed a

30 % reduction in surface tension (% RTS) for the environment, reaching values of 30

mN/m; 3.0 g /L of biomass and emulsifying index greater than 65 %. The metabolite

synthesized still remained stable for different salt concentrations (1, 5 and 10 % w/ v)

and alkaline pH (8-10).

Key-words: Biosurfactants, Pseudomonas aeruginosa, cassava flour wastewater,

kinetics.

A minha família, em especial aos meus pais, irmãos e sobrinhos, principal razão da minha vida.

AGRADECIMENTOS

“Cada sonho que você deixa para trás é um pedaço do seu futuro que deixa de existir”

(Steve Jobs)

Inicio agradecendo a Deus. Ele esteve sempre ao meu lado durante esta

caminhada, muitas vezes o caminho tornou-se tortuoso e pensei em desistir. Porém, Ele

me deu duas características que estão inseridas em minha alma: persistência e

determinação! Contudo, não teria chegado até aqui sem a ajuda de alguns anjos que Ele

me enviou, a saber:

Agradeço aos meus pais, José Breno Cruz Bezerra e Telma Maria Silva Bezerra,

que mesmo distantes, estiveram sempre comigo, ensinando-me, apoiando-me, amando-

me incondicionalmente e acreditando em meu potencial. Eu amo vocês!

Obrigado a todos os meus familiares e aos meus amigos, em particular aos meus

irmãos e meus sobrinhos que entenderam (às vezes nem tanto) a minha ausência em

muitas (quase todas) datas comemorativas.

Meu muitíssimo obrigado ao meu orientador e Professor Doutor Everaldo S. dos

Santos. Obrigado por acreditar em mim e aceitar-me como orientando, incentivar-me,

apoiar-me sempre que precisei. Ainda no âmbito acadêmico, devo agradecer a

Professora Doutora Gorete Ribeiro de Macedo, um exemplo que sempre levarei comigo,

como pessoa e como profissional. Agradeço a Professora Doutora Roberta Targino

Pinto Correia pelas sugestões pertinentes durante a construção final desse trabalho.

Não haveria como descrever a imensa ajuda que tive dos meus bolsistas Vinícius

Carlos D. Holanda e Luís Henrique D. Mendes, inexperientes em pesquisa, mas que se

dedicaram de corpo e alma para a realização dessa tese. Em especial a minha ex-aluna,

agora técnica em alimentos, Jéssica Andrade de Amorim, obrigado pela dedicação,

carinho e por ter tomado muito dos ensaios como se fossem seus, ajudando-me nos

finais de semana, feriados, dias, noites e madrugadas.

Agradeço também aos amigos Engenheiros Químicos, Ana Carmen, Ana

Katerine, Andrea Farias, Anita Lima, Priscila Vanini, Roberta Chaves, Sirtys Lessa,

Magna Angélica e ao Biólogo Daniel Souza, que sempre me ouviram, me auxiliaram e

me cederam à mão amiga nos dias em que a luz não brilhava tanto.

Agradeço a todos que fazem parte da família do Instituto Federal de Educação,

Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte/Câmpus Pau dos Ferros, em especial as

diretoras Antônia Francimar da Silva e Amélia Reis e Silva. Sem a ajuda dessas duas

AMIGAS e excelentes profissionais não haveria como realizar meus experimentos no

IFRN. Obrigado pela confiança e apoio! Estendo-me esse agradecimento ao Reitor do

IFRN, Belchior de Oliveira Rocha pelo apoio financeiro para a pesquisa realizada nesse

Câmpus.

Obrigado a todos os meus alunos do IFRN/Câmpus Pau dos Ferros. Vocês são

muito especiais. Obrigado pelo carinho e pelas palavras de incentivo que eu ouvi

durante todos esses anos!

Não poderia esquecer a secretária do departamento do PPGEQ, Eusamar Coelho

de Lima, a Mazinha, pela paciência e pela ajuda na parte burocrática do processo.

Por fim, agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química e a

todos os professores do departamento de Engenharia Química e Engenharia de

Alimentos da UFRN que lutam por uma educação digna e ensino de qualidades. Muito

obrigado!

Divido com todos vocês mais uma etapa de minha vida.

Deus abençoe a todos!

Carpe diem

Sumário

Lista de Figuras .................................................................................................................................. i

Lista de Tabelas ................................................................................................................................ iii

Abreviaturas...................................................................................................................................... iv

Lista de Variáveis .............................................................................................................................. v

1. Introdução ...................................................................................................................................... 2

2. Revisão Bibliográfica .................................................................................................................... 6

2.1 – Tensão superficial ................................................................................................................. 6

2.2 – Surfactantes .......................................................................................................................... 8

2.3 – Biossurfactantes .................................................................................................................... 9

2.3.1 – Biossurfactantes produzidos por leveduras e fungos filamentosos ......................... 10

2.3.2 – Biossurfactantes produzidos por bactérias .............................................................. 11

2.3.3 – Classificação dos biossurfactantes........................................................................... 11

a) Glicolipídeos ................................................................................................................... 12

b) Lipopeptídeo e lipoproteína ............................................................................................ 14

c) Ácidos graxos e fosfolipídeos ......................................................................................... 15

d) Surfactantes poliméricos ................................................................................................. 16

2.3.4 – Propriedades gerais e funções fisiológicas dos biossurfactantes ............................. 16

a) emulsificação e solubilização de hidrocarbonetos ou compostos insolúveis em água ... 17

b) transporte de hidrocarbonetos ......................................................................................... 17

c) aderência-liberação da célula a superfícies ..................................................................... 17

d) atividade antibiótica ........................................................................................................ 17

2.3.5 – Comparação entre biossurfactantes e surfactantes sintéticos .................................. 18

a) biodegradabilidade .......................................................................................................... 18

b) diversidade química ........................................................................................................ 18

c) biocompatibilidade e baixa toxicidade ............................................................................ 18

d) disponibilidade de matéria-prima para a síntese ............................................................. 18

e) uso em controle ambiental .............................................................................................. 18

f) elevada eficácia em condições extremas ......................................................................... 19

g) maior eficiência e efetividade ......................................................................................... 19

2.3.6 – Biossurfactantes e suas aplicações .......................................................................... 19

2.3.6.1 – Aplicações Industriais ...................................................................................... 19

a) Biorremediação ............................................................................................................... 19

b) Limpeza de reservatório de óleos.................................................................................... 20

c) Recuperação avançada do óleo (MEOR) ........................................................................ 21

d) Aplicações terapêuticas e agentes de saúde .................................................................... 23

e) Biossurfactantes na indústria de cosméticos ................................................................... 23

f) Biossurfactantes na indústria de alimentos ..................................................................... 24

g) Outras aplicações ............................................................................................................ 24

2.4 – Produção de biossurfactantes ............................................................................................. 24

2.4.1 – Micro-organismo ..................................................................................................... 25

2.4.1.1 – Pseudomonas aeruginosa como produtora de biossurfactantes ...................... 26

2.4.2 – Meio de Cultivo ....................................................................................................... 27

2.4.2.1 – Fonte de carbono .............................................................................................. 27

2.4.2.2 – Mandioca e manipueira .................................................................................... 29

2.4.2.3 – Sais e minerais ................................................................................................. 34

2.4.3 – Efeito de fatores ambientais na produção de biossurfactantes ................................ 35

a) pH .................................................................................................................................... 35

b) Temperatura .................................................................................................................... 35

c) Agitação e aeração .......................................................................................................... 36

2.5 – Recuperação de biossurfactante ......................................................................................... 37

2.5.1 – Técnicas de recuperação de biossurfactantes .......................................................... 38

a) Precipitação ..................................................................................................................... 38

b) Extração com solvente .................................................................................................... 38

2.6 –Cinética dos processos biotecnológicos .............................................................................. 39

2.6.1 – Parâmetros cinéticos ................................................................................................ 39

2.7 – Planejamento experimental................................................................................................. 42

2.7.1 – Planejamento fatorial ............................................................................................... 43

2.7.2 – Planejamento fatorial fracionário ............................................................................ 43

3. Metodologia Experimental .......................................................................................................... 46

3.1 – Obtenção da manipueira ..................................................................................................... 47

3.1.1 – Caracterização da manipueira .................................................................................. 47

3.2 – Processo fermentativo......................................................................................................... 47

3.2.1 – Micro-organismo ..................................................................................................... 47

3.2.2 – Ensaios preliminares utilizando a manipueira como substrato ................................ 48

3.2.3 – Propagação das células para a obtenção do inóculo ................................................ 48

3.3 – Planejamento fatorial .......................................................................................................... 49

3.4 – Procedimento para o cultivo ............................................................................................... 50

3.5 – Análises .............................................................................................................................. 51

3.5.1 – Contagem de micro-organismo ............................................................................... 51

3.5.2 – Determinação da concentração celular .................................................................... 51

3.5.3 – Determinação da concentração de substrato ............................................................ 52

3.5.4 – Determinação da tensão superficial ......................................................................... 53

3.5.5 – Estudos de estabilidade ............................................................................................ 53

3.5.5.1 – Estabilidade de pH ........................................................................................... 53

3.5.5.2 – Estabilidade de temperatura ............................................................................. 53

3.5.5.3 – Estabilidade de salinidade ................................................................................ 53

3.5.6 – Determinação da diluição micelar crítica (DMC-1

e DMC-2

) .................................. 54

3.5.7 – Determinação do pH ................................................................................................ 54

3.5.8 – Determinação do índice de emulsificação ............................................................... 54

3.5.9 – Extração do biossurfactante bruto ........................................................................... 55

3.5.9.1 – Precipitação ácida ............................................................................................ 55

3.5.9.2 – Extração por solvente ....................................................................................... 55

3.5.10 – Quantificação do biossurfactante........................................................................... 55

3.5.10.1 – Método do orcinol .......................................................................................... 56

3.5.10.2 – Método do fenol-sulfúrico ............................................................................. 56

3.5.10.3 – Método do ácido tioglicólico ......................................................................... 56

4. Resultados e discussão ................................................................................................................ 65

4.1 – Caracterização da manipueira ............................................................................................. 66

4.2 – Avaliação da concentração inicial de substrato e do tempo ótimo para a inoculação ........ 68

4.3 – Avalição da influência das condições operacionais de cultivo........................................... 72

4.4 – Estudo cinético para Pseudomonas aeruginosa AP029-GVIIA em manipueira como

substrato. ...................................................................................................................................... 80

4.5 – Quantificação do biossurfactante sintetizado ..................................................................... 90

4.6 – Avaliação da Diluição Micelar Crítica (DMC) .................................................................. 91

4.7 – Avaliação do índice de emulsificação (E24) ....................................................................... 94

4.8 – Análise da estabilidade em relação à variação de pH, temperatura e salinidade................ 95

4.8.1 – Estabilidade ao pH ................................................................................................... 95

4.8.2 – Estabilidade a variação de temperatura ................................................................... 96

4.8.3 – Estabilidade a variação da salinidade ...................................................................... 97

Referências bibliográficas ............................................................................................................. 103

Lista de Figuras

Figura 2.1 – Esquema das forças intermoleculares no interior e na superfície do líquido .............. 6

Figura 2.2 – Esquema didático para tensão superficial, tensão interfacial e solubilidade em

função da concentração de surfatante. ............................................................................................. 8

Figura 2.3 – Estrutura do biossurfactante L-ramnosil-L-ramnosil--hidroxidecanoil--

hidroxidecanoato ........................................................................................................................... 13 Figura 2.4 – Estrutura do biossurfactante dimycolates trealose .................................................... 14

Figura 2.5 – Estrutura do biossurfactante soforolipídeo ácido ...................................................... 14 Figura 2.6 – Estrutura da surfactina............................................................................................... 15

Figura 2.7 – Estrutura do biossurfactante fosfatidiliositol ............................................................ 15

Figura 2.8 – Estrutura do biossurfactante emulsan ....................................................................... 16 Figura 2.9 – Mecanismo de recuperação do óleo por biossurfactantes ......................................... 22 Figura 2.10 – Cianogênese a partir da linamarina ......................................................................... 30 Figura 2.11 – Extração da manipueira em processo de fabricação de farinha .............................. 32 Figura 2.12 – Obtenção da manipueira .......................................................................................... 33

Figura 3.1 – Fluxograma de blocos para metodologia experimental ............................................ 46 Figura 4.1 – Curvas cinéticas para o meio MI ............................................................................... 70 Figura 4.2 – Curvas cinéticas para o meio MD ............................................................................. 70

Figura 4.3 – Curvas cinéticas para o meio MDS ........................................................................... 71 Figura 4.4 – Diagrama de Pareto para estimativa dos efeitos sobre a redução da tensão superficial

para um planejamento fatorial de fração meia (24-1

) ..................................................................... 73

Figura 4.5 – Diagrama de Pareto para estimativa dos efeitos sobre a redução da tensão superficial

para um planejamento fatorial completo (23) ................................................................................ 73

Figura 4.6 – Valores observados vs. valores preditos para o planejamento 23 para um modelo

linear .............................................................................................................................................. 75

Figura 4.7 – Valores observados vs. valores preditos para o planejamento 23 para um modelo

quadrático utilizando o teste de curvatura ..................................................................................... 76

Figura 4.8 – Diagrama de Pareto em um planejamento com curvatura para estimativa dos efeitos

sobre a redução da tensão superficial (23) ..................................................................................... 76

Figura 4.9 – Superfície de resposta da redução da tensão superficial (%RTS) em função da

temperatura e da agitação .............................................................................................................. 77

Figura 4.10 – Espuma formada pela presença do biossurfactante nos ensaios 6 e 7..................... 78 Figura 4.11 – Formação de espuma durante o cultivo ................................................................... 78


temperatura e da razão de aeração ................................................................................................. 79 Figura 4.13 – Superfície de resposta da redução da tensão superficial (%RTS) em função da

razão de aeração e da agitação ....................................................................................................... 79 Figura 4.14 – Curvas de crescimento celular em função do tempo para os ensaios realizados a 30

ºC ................................................................................................................................................... 80 Figura 4.15 – Curvas de crescimento celular em função do tempo para os ensaios realizados a 40

ºC ................................................................................................................................................... 81 Figura 4.16 – Curva de crescimento celular e tensão superficial para o ensaio 5 ......................... 83 Figura 4.17 – Curva de crescimento celular e tensão superficial para o ensaio 6 ......................... 83 Figura 4.18 – Curvas de consumo de substrato em função do tempo para os ensaios 1, 3, 5 e 7

(meio manipueira diluído em 50 % em água destilada) ................................................................ 85

Figura 4.19 – Curvas de consumo de substrato em função do tempo para os ensaios 2, 4, 6 e 8

(meio manipueira integral) ............................................................................................................ 86

Figura 4.20 – Curvas de tensão superficial em função do tempo para os ensaios 1, 2, 5 e 6

realizados a 30 ºC .......................................................................................................................... 87 Figura 4.21 – Curvas de tensão superficial em função do tempo para os ensaios 3, 4, 7 e 8

realizados a 40 ºC .......................................................................................................................... 88

Figura 4.22 – Mudança de coloração do meio fermentativo ......................................................... 90 Figura 4.23 – Quantificação do ramnolipídeo pelo método tio-glicólico...................................... 90 Figura 4.24 – Medidas da Tensão Superficial (TS), Diluição Micelar Crítica 1/10 (DMC

-1) e

Diluição Micelar Crítica 1/100 (DMC-2

) para o ensaio 1. ............................................................. 91 Figura 4.25 – Medidas da Tensão Superficial (TS), Diluição Micelar Crítica 1/10 (DMC

-1) e


) para o ensaio 2. ............................................................. 92 Figura 4.26 – Medidas da Tensão Superficial (TS), Diluição Micelar Crítica 1/10 (DMC

-1) e


) para o ensaio 5. ............................................................. 92

Figura 4.27 – Medidas da Tensão Superficial (TS), Diluição Micelar Crítica 1/10 (DMC-1

) e


) para o ensaio 6. ............................................................. 93 Figura 4.28 – Teste de emulsificação para os ensaios 2, 3, 4, 5, 6 e 7 .......................................... 95

Lista de Tabelas

Tabela 2.1 – Biossurfactantes produzidos por micro-organismos. .................................................. 12

Tabela 2.2 – Substratos de baixo custo utilizados na produção de biossurfactante ........................ 28

Tabela 2.3 – Composição da Manipueira ........................................................................................ 31

Tabela 3.1 – Matriz do planejamento fatorial 24-1

com duplicata no ponto central. ....................... 50

Tabela 3.2 – Fatores e níveis para o planejamento fatorial 24-1

com duplicata no ponto central .... 50

Tabela 4.1 – Composição da Manipueira ........................................................................................ 66

Tabela 4.2 – Resultados para biomassa (X), substrato (S) e tensão superficial (TS) dos meios MI,

MD e MDS. ..................................................................................................................................... 69

Tabela 4.3 – Condições dos ensaios realizados ............................................................................... 72

Tabela 4.4 – Fatores significativos e seus efeitos ............................................................................ 74

Tabela 4.5 – Análise de variância (ANOVA) para um planejamento 23 em um intervalo de 95% de

confiança .......................................................................................................................................... 75

Tabela 4.6 – Produtividade celular, velocidade específica de crescimento e conversão de substrato

em células para os ensaios realizados .............................................................................................. 82

Tabela 4.7 – Variação e porcentagem de consumo de substrato ..................................................... 86

Tabela 4.8 – Parâmetros cinéticos dos ensaios realizados............................................................... 89

Tabela 4.9 – Avaliação da redução da tensão superficial na DMC-1

e DMC-2

................................ 93

Tabela 4.10 – Índice de emulsificação para os ensaios de 1 a 10.................................................... 94

Tabela 4.11 – Estabilidade de pH para os ensaios 1, 2, 5 e 6 .......................................................... 95

Tabela 4.11 – Estabilidade de pH para os ensaios 1, 2, 5 e 6 .......................................................... 96

Tabela 4.12 – Estabilidade a salinidade para os ensaios 1, 2, 5 e 6 ................................................ 97

Abreviaturas

ANOVA – Análise de Variância

CMC – Concentração Micelar Crítica

DMC – Diluição Micelar Crítica

Emulsões O/A – Emulsões Óleo e Água

GRAS – generally regarded as safe

MEOR – Recuperação Avançada do Óleo

MD – Meio Diluído

MDS – Meio Diluído com Adição de Sais

MI – Meio Integral

MQr – Média quadrática dos resíduos

MQR – Média quadrática da regressão

MQfaj – Média quadrática da falta de ajuste

MQep – Média quadrática do erro puro

PCA – Plate Count Agar

R.A, – Razão de Aeração (Vm/Vf)

RTS – Redução da Tensão Superficial

SQR – Soma quadrática da regressão

SQT – Soma quadrática total

TSB – Triptone Soy Broth

TS – Tensão Superficial

TSmin – Tensão superficial de menor valor

ufc – unidade formadora de colônia

UNRN/CE – Unidade de Negócios Rio Grande do Norte/Ceará

Vm – Volume do meio

Vf – Volume do frasco

Lista de Variáveis

(S) – Concentração de Substrato

(P) – Concentração de Produto

(X) – Concentração Celular

(t) – tempo

(rx) – Velocidade instantânea para o crescimento celular

(rs) – Velocidade instantânea de consumo de substrato

(rp) – Velocidade instantânea de formação de produto

E24 – Índice de emulsificação após 24h

E48-72 – Índice de emulsificação entre 48 e 72h

Hemulsão – Altura da emulsão

Ht – Altura total

mseca – Massa seca

N – Número de gerações

tg – tempo de geração

T1 – Tubo com biomassa

T2 – Tubo vazio

YX/S – Coeficiente global de conversão de substrato em células

YP/S – Coeficiente global de conversão de substrato em produto

x, – Velocidade específica de crescimento

máx – Velocidade máxima específica de crescimento

s – Velocidade específica de consumo de substrato

p – Velocidade específica de formação de produto

Capítulo 1

Introdução

Capítulo 1 Introdução

______________________________________________________________________Márcio Silva Bezerra – Tese de Doutorado – UFRN – PPGEQ

2

1. Introdução

Surfactantes (SURFace ACTive AgenTS) é a denominação dada a compostos

comumente presentes em sabões e detergentes. São moléculas anfipáticas, de superfície

ativa, consistindo de dois domínios, um hidrofílico e outro hidrofóbico, onde o domínio

hidrofóbico incide em um hidrocarboneto, enquanto que a parte hidrofílica pode ser não

iônica, iônica (catiônica ou aniônica) ou anfotérica (Mohammad et al., 2010; Sabatini et

al., 2006). Por essa natureza, os surfactantes podem atuar entre duas interfaces de

fluidos de diferentes polaridades tais como óleo/água ou água/ar (Sekhon et al., 2011;

Banat et al., 2010).

Os biossurfactantes também são substâncias com caráter anfipático assim como

os surfactantes sintéticos, porém, sintetizados por micro-organismos como bactérias,

leveduras e fungos filamentosos em diferentes fontes de carbono (Migliorelli, 2003).

Geralmente, a estrutura do biossurfactante inclui um domínio hidrofílico composto de

aminoácidos ou peptídeos, ânions ou cátions, mono-, di- ou polissacarídeos; e um

domínio hidrofóbico, composto frequentemente de ácidos graxos saturados, insaturados

ou hidroxilados (Georgiou et al., 1992). Essa diversidade leva à indução de que

diferentes grupos de biossurfactantes possuem diferentes papeis naturais no crescimento

dos micro-organismos produtores (Ron & Rosenberg, 2002).

Os motivos que levam os micro-organismos a produzirem tais metabólitos são

assuntos ainda a serem elucidados, porém, vários trabalhos já foram publicados

associando esta produção a uma resposta fisiológica dos micro-organismos, entre elas,

pode-se citar: aumentar a biodisponibilidade de substratos hidrofóbicos (Das et al.,

2008; Calvo et al., 2004); complexar metais pesados, reduzindo a sua toxicidade

(Pacwa-Płociniczak et al., 2011; Das et al.,2008; Sandrin et al., 2000); aumentar a

atividade antimicrobiana (Saravanakumari & Mani, 2010); aumentar a patogenicidade e

fixar ou desprender substratos (Gomes & Nitschke, 2012).

Os biossurfactantes utilizados nas indústrias, como por exemplo, de alimentos

(Nitschke & Costa, 2007), farmacêutica (Cohen et al., 2010), de petróleo, de produtos

de higiene e de cosméticos (Lourith & Kanlayavattanakul, 2009), de mineração e na

indústria agrícola (Fathabad, 2010; Banat et al., 2010). O uso do biotensoativo também

se estende a aplicações ambientais, em tratamento de solo e água contaminados por

hidrocarbonetos (Cameotra & Makkar, 2010).



3

A utilização dos biossurfactantes ainda é limitada pela competição com os

surfactantes de origem sintética devido ao alto custo de produção, associado à baixa

produtividade e ao uso de substratos caros (Li et al., 2011; Makkar et al., 2011;

Mukherjee et al., 2006; Banat et al., 2000). As indústrias da área petrolífera requerem

grandes quantidades de surfactantes, dessa forma, é fundamental que estes gastos sejam

reduzidos, o que pode ser em parte obtido com o uso de matérias-primas de baixo custo,

a exemplo de resíduos agroindustriais.

Os resíduos lançados ao meio ambiente são atualmente uma preocupação

relevante para as indústrias, fazendo-se necessário um tratamento prévio destes

efluentes para que atendam a legislação vigente antes de terem sua disposição final.

Os metabólitos produzidos a partir de substratos baratos, renováveis e através de

processos economicamente viáveis com alto rendimento, permitem diminuir os custos

de produção para níveis competitivos em relação aos similares obtidos por via

petroquímica e, ao mesmo tempo, reduzir os problemas ambientais relativos ao descarte

e aos custos do tratamento (Kronemberger et al., 2007; Makkar & Cameotra, 2002;

Cameotra & Makkar, 1998). Todavia, estes substratos alternativos para a produção de

biossurfactantes apresentam dificuldades em sua padronização; tal dificuldade deve-se

às variações naturais de composição, bem como aos custos de transporte, armazenagem

e tratamentos prévios necessários.

A manipueira é o efluente resultante da industrialização da mandioca, decorrente

da prensagem da mandioca ralada e lavada no processo da obtenção da farinha (Costa et

al., 2009). A manipueira possui um elevado teor de matéria orgânica e um glicosídeo

chamado linamarina que é facilmente hidrolisado a cianeto, composto tóxico ao

metabolismo, sendo na maioria das vezes descartada in natura nos cursos d’água

acarretando em problema ambiental (Costa et al., 2009; Cordeiro, 2006).

Apesar de poluente, a manipueira pode ser empregada como matéria-prima para

outros processos industriais, por apresentar concentrações de carboidratos, nitrogênio e

sais minerais. Entre as alternativas, encontra-se a produção de biossurfactantes.

A síntese do biossurfactante utilizando manipueira como substrato ainda é pouco

explorada, sendo fonte de estudo de alguns pesquisadores na atualidade. Poucos

trabalhos foram publicados até o momento (Costa et al., 2009; Barros et al., 2008;



4

Nitschke & Pastore, 2006), fazendo-se necessário o aprofundamento desse estudo

quanto ao melhoramento das condições de produção do metabólito.

Quando comparados aos surfactantes sintéticos, os biossurfactantes apresentam

um desempenho superior em se tratando de situações extremas de temperatura e pH,

elevada concentração de sais, baixa toxicidade e principalmente por serem

biodegradáveis (Nitschke & Pastore, 2002; Desai & Banat, 1997).

Bactérias do gênero Pseudomonas têm se destacado como produtoras de

biossurfactantes mais utilizadas em pesquisas. O potencial de Pseudomonas tem sido

explorado para aplicação na MEOR (recuperação avançada do óleo) e em outros setores

da cadeia do petróleo devido às propriedades ativas de superfície e a estabilidade das

emulsões obtidas com os metabólitos sintetizados por espécies desse gênero (Das &

Mukherjee, 2005; Li et al., 2002).

Dentro do contexto apresentado, o presente trabalho objetiva mostrar a

potencialidade da manipueira para a produção do biossurfactante, bem como a sua

cinética de síntese. É utilizado Pseudomonas aeruginosa AP029-GVIIA, analisando-se

variáveis selecionadas (agitação, temperatura, razão de aeração e meio de cultivo) e

utilizando a ferramenta estatística para melhor avaliação dos resultados. Efetua-se

estudo cinético para avaliar o comportamento microbiano em meio manipueira,

analisando a sua capacidade de produzir biossurfactante. Nesse estudo, também é

avaliado a capacidade do metabólito formar emulsões com querosene comercial e

quanto à sua estabilidade em resposta a variações de salinidade, temperatura e acidez

(pH).

A presente tese está dividida em seis capítulos. A introdução mostra uma visão

geral do que será visto durante toda a leitura e o capítulo 2, apresenta a fundamentação

teórica e revisão bibliográfica encontrada em alguns livros e sobre o tema. O capítulo 3

descreve a metodologia aplicada para os experimentos realizados enquanto a discussão

e os resultados do trabalho são apresentados no capítulo 4. O capítulo 5 mostra de forma

objetiva a conclusão dessa tese, seguido do capítulo 6 que traz as referências

bibliográficas citadas no texto.

Capítulo 2

Revisão Bibliográfica

Capítulo 2 Revisão Bibliográfica


6

2. Revisão Bibliográfica

2.1 – Tensão superficial

O fenômeno da tensão superficial está presente em toda parte na natureza e é de

extrema relevância em tecnologia. É do conhecimento comum que a tensão superficial é

responsável pela forma esférica de pequenas gotas de água, como as gotas de orvalho,

ou pelo fato de um mosquito ou um palito horizontal sobre uma superfície de água não

se afundar (Ferreira, 2004).

Os líquidos tendem a adotar uma forma que minimize sua área de superfície em

uma tentativa de manter as moléculas com um maior número possível de vizinhos

semelhantes. As gotas de líquidos tendem a assumir a forma esférica, pois a esfera é a

forma com a menor razão superfície/volume (Hewitt, 2002).

As forças coesivas entre as moléculas no interior de um líquido são

compartilhadas com os átomos vizinhos. As moléculas presentes na superfície não têm

átomos vizinhos acima delas e exibem uma força atrativa mais forte sobre suas vizinhas

mais próximas na superfície. Este aumento das forças atrativas intermoleculares na

superfície é chamado tensão superficial (Hewitt, 2002). Na Figura 2.1 é apresentado um

esquema ilustrando as forças intermoleculares no interior e na superfície do líquido.

Figura 2.1 – Esquema das forças intermoleculares no interior e na superfície do líquido Fonte: Pirôllo (2006).

A adição de um soluto a um líquido altera a sua tensão superficial, tornando-a

maior ou menor que a tensão superficial do solvente puro. Quando o soluto se concentra

na interface, então a tensão superficial da solução é menor, verificando-se o oposto

quando o soluto evita a interface (Ferreira, 2004).



7

Estes comportamentos podem ser explicados com base nas interações

intermoleculares. Se as interações soluto-solvente são mais fortes que as soluto-fase

gasosa, então o soluto evita a interface e a tensão superficial da solução é aumentada.

Todavia, se o soluto atrai fracamente o solvente, ou apenas interage favoravelmente

com uma parte da sua molécula, então a tensão superficial é diminuída.

Entre os solutos que fazem aumentar a tensão superficial de água incluem-se os

sais iônicos solúveis e os carboidratos. Os primeiros formam interações íon-dipolo com

a água, enquanto o segundo, tendo muitos grupos hidroxila, formam pontes de

hidrogênio com a água (Ferreira, 2004). Os solutos que diminuem a tensão superficial

são designados agentes tensoativos ou surfactantes.

A eficácia dos surfactantes é definida através da capacidade de reduzir a tensão

superficial, que é a medida de energia livre da superfície por unidade de área, necessária

para trazer uma molécula do interior do líquido para a superfície (Rosen, 1978 apud

Mulligan, 2005). Devido à presença de surfactantes, menor energia é requerida para

trazer uma molécula até a superfície e a tensão superficial é reduzida. Por exemplo, um

bom surfactante pode reduzir a tensão superficial da água de 72 para 35 mN/m (Pirôllo,

2006).

Um dos índices mais utilizados para avaliar a eficiência de um surfactante é a

concentração micelar crítica (CMC). A CMC é a concentração mínima de surfactante

requerida para alcançar os valores mais baixos de tensão interfacial ou de tensão

superficial (Lin, 1996). A partir dessa concentração os surfactantes se associam em

estruturas como micelas, vesículas ou lamelas e não ocorrerá maior redução na tensão

superficial ou interfacial (Maier, 2003; Desai & Banat, 1997). Vale salientar que a

medida da tensão superficial do sobrenadante é o método mais empregado para

determinar indiretamente a atividade surfactante (Matsuura, 2004).

Observa-se na Figura 2.2 que os surfactantes encontram-se na forma

monomérica abaixo da concentração micelar crítica; todavia, acima da CMC, grandes

agregados moleculares de dimensões coloidais são formados. Estas micelas, assim

denominadas, são termicamente estáveis, facilmente reprodutíveis e são destruídas pela

diluição com água (Makkar & Rockne, 2003).



8

Figura 2.2 – Esquema didático para tensão superficial, tensão interfacial e solubilidade em

função da concentração de surfatante. Fonte: (Mulligan, 2005 adaptado por Cara, 2009).

2.2 – Surfactantes

Surfactantes são moléculas anfipáticas que consistem em duas porções: uma

parte hidrofílica e outra hidrofóbica em uma mesma molécula (Fathabad, 2010; Desai &

Banat, 1997).

A porção hidrofílica (solúvel em água) ou grupo polar pode ser iônica, não

iônica ou anfotérica, ou seja, exibir características aniônicas ou catiônicas dependendo

das condições de pH da solução aquosa. Neste grupo encontram-se os aminoácidos ou

peptídeos, carboidratos, fosfatos, álcool e ácidos carboxílicos (Desai & Banat, 1997). A

porção hidrofóbica (solúvel em óleo) ou não polar é frequentemente uma cadeia de

hidrocarbonetos composta de ácidos graxos saturados e insaturados.

Em função da presença desses dois grupos na mesma molécula, os surfactantes

tendem a se distribuir preferencialmente nas interfaces entre fases fluidas com

diferentes graus de polaridade tais como óleo/água e ar/água (Banat et al., 2000).

A formação de uma película molecular nas interfaces reduz a tensão nessa

região, sendo essa uma particularidade única dos surfactantes. Além disso, surfactantes

formam microemulsões onde hidrocarbonetos podem se solubilizar em água como

também a água pode ser solubilizada em hidrocarbonetos (Banat et al.,2000; Desai &

Banat, 1997).

A redução da tensão interfacial torna estes compostos adequados para várias

aplicações industriais envolvendo: detergência, emulsificação, lubrificação, capacidade

espumante, molhabilidade, solubilização e dispersão de fases. Muitos surfactantes são



9

sintetizados quimicamente a partir do petróleo, o que leva a um processo de produção

ambientalmente nocivo. Além disso, muitos surfactantes sintéticos apresentam baixa

biodegradabilidade, o que limita seu uso em diversas aplicações industriais e ambientais

(Makkar & Cameotra, 2002).

Os surfactantes compõem uma importante classe de compostos químicos

utilizados tanto em escala doméstica quanto industrial (Makkar et al., 2011). Derivados

quimicamente do petróleo, estes compostos vem sendo usados na indústria do petróleo

para auxiliar a limpeza, como no caso de derramamentos, e para melhorar a recuperação

de óleo dos reservatórios. Van Bogaert e colaboradores (2007) estimaram uma produção

de 10 milhões de toneladas de surfactantes por ano. Contudo, estes compostos não são

biodegradáveis e podem ser tóxicos para o meio ambiente (Desai & Banat, 1997).

Dessa forma, uma alternativa que vem ao longo dos anos sendo estudada é a

síntese dos biossurfactantes, pois estes demonstram equivalentes propriedades

emulsificantes e são biodegradáveis.

2.3 – Biossurfactantes

Os biossurfactantes foram descobertos na década de 60 como compostos

extracelulares anfifílicos em pesquisas de fermentações de hidrocarbonetos (Matsuura,

2004).

Estes metabólitos são sintetizados por uma variedade de micro-organismos como

leveduras, fungos filamentosos e principalmente por bactérias e arqueas, apresentando

diferentes estruturas químicas e propriedades surfactantes, fazendo com que apresentem

diferentes funções naturais com diferentes aplicações (Matsuura, 2004).

Os biossurfactantes são classificados em dois principais grupos: aqueles que

reduzem a tensão superficial da interface ar/água, conhecidos como biossurfactantes e

aqueles que reduzem a tensão interfacial entre líquidos imiscíveis, ou ainda atuam em

interfaces sólido/líquido, os bioemulsificantes. Geralmente os biossurfactantes também

exibem capacidade de emulsificar, mas nem sempre os bioemulsificantes reduzem a

tensão superficial (Freitas et al., 2009).

Os biossurfactantes são produzidos principalmente durante o crescimento

aeróbio ou em fase estacionária do desenvolvimento dos micro-organismos, em meios



10

de cultura a partir de carboidratos, hidrocarbonetos, óleos e gorduras ou uma mistura

destes (Pirôllo, 2006; Úbeda, 2004).

A produção de biossurfactante pode ser espontânea ou induzida através da

presença de compostos lipídicos, por variações de pH, temperatura, aeração e agitação

ou ainda, quando o crescimento celular é mantido sob condições de estresse como

baixas concentrações de nitrogênio e alterações nas condições ótimas de pH e

temperatura (Úbeda, 2004). Quando são excretados no meio de cultivo durante o

crescimento microbiano, auxiliam o transporte e transposição de substratos insolúveis

através da membrana celular (Bognolo, 1999).

Todos os biossurfactantes são do tipo não-iônico ou aniônico. Não há na

literatura registros de estruturas catiônicas, embora, algumas vezes, a presença de

grupos de nitrogênio confira certo grau catiônico a estes metabólitos (Bognolo, 1999).

A produção de biossurfactante por diversos micro-organismos tem sido

amplamente estudada, apresentando uma gama de dados bastante relevantes sobre a

produção, tipo, bem como suas propriedades (Mukherjee et al., 2006).

2.3.1 – Biossurfactantes produzidos por leveduras e fungos

filamentosos

A grande vantagem do uso de leveduras na síntese do biossurfactantes reside no

status de GRAS (generally regarded as safe), organismos com essa classificação não

apresentam riscos de toxicidade e patogenicidade, o que permite sua utilização para

aplicações nas indústrias de alimentos e farmacêuticas. O que não ocorre com a grande

maioria dos metabólitos sintetizados por bactérias, pois não é adequada para a utilização

na indústria alimentícia devido a sua possível natureza patogênica (Fontes et al., 2008).

Rufino e Sarubbo (2007) sintetizaram um novo biossurfactante, capaz de reduzir

a tensão superficial e também de emulsificar, utilizando Candida lipolytica em meio

contendo óleo de fritura, um resíduo industrial, como fonte de carbono.

A produção de soforolipídeos em uma concentração de 23,23 g/L pela levedura

Candida bombicola utilizando substrato agroindustrial (melaço de cana-de-açúcar, óleo

de soja, de girassol e azeite de oliva) e de baixo custo no processo fermentativo foi

investigada por Pakshirajan e Daverey (2009). A produtividade foi comparável à obtida

quando substratos convencionais são utilizados, como extrato de levedura e ureia.



11

Paraszkiewicz et al. (2002) estudaram o fungo Curvalaria lunata IM 2901 e

verificaram a produção associada e parcialmente associada de um bioemulsificante

extracelular sintetizado em compostos solúveis em água (cortexolone dissolvido em

etanol).

Lipídeos Mannosylerythritol (MEL) são biossurfactantes glicolipídicos

excretados por cepas fúngicas. A cepa de Ustilago scitaminea NBRC 32730 foi

utilizada na síntese desse metabólito utilizando caldo de cana (sugarcane juice) por

Morita et al.(2011) obtendo altos rendimentos de biotensoativos (25 g/L).

2.3.2 – Biossurfactantes produzidos por bactérias

As bactérias produzem principalmente biossurfactantes tipo ramnolipídeos,

trealolipídeos e lipopeptídeos (Bognolo, 1999). Bactérias como as Pseudomonas

fluorescens, Antrobacter, Micrococcus varians são capazes de sintetizar

biossurfactantes à medida que degradam hidrocarbonetos (Barathi & Vasudevan, 2001).

Nitschke et al. (2004), utilizando substratos de baixo custo e Bacillus sp.,

sintetizaram biotensoativos que reduziu a tensão superficial do meio em estudo em 42

%, alcançando tensões inferiores a 30 mN/m. Utilizando Pseudomonas putida 21BN,

Tuleva et al. (2002) produziram biossurfactantes identificado como ramnolipídeos. A

produção foi alcançada na fase exponencial de crescimento em substratos solúveis

(glicose) e insolúveis (hexadecano). Em hexadecano o meio alcançou a tensão de 29

mN/m e emulsão de 69 %.

Ramnolipídeos também foram sintetizados por Nitschke et al. (2010) utilizando

resíduo de óleo de soja como fonte de carbono e cepas de Pseudomonas aeruginosa

LB1. O biossurfactante sintetizado nesse estudo foi capaz de emulsificar 100% de óleo

de soja, bem como gordura de frango mostrando elevada potencialidade para ser

utilizado em biorremediações e também na indústria de alimentos.

2.3.3 – Classificação dos biossurfactantes

Ao contrário dos surfactantes sintetizados quimicamente, onde são classificados

pela natureza do seu grupo polar, biossurfactantes são classificados por sua composição

química e também pela origem microbiana (Fathabad, 2010).



12

As principais classes de biossurfactantes incluem glicolipídeos, lipopeptídeos,

lipoproteínas, fosfolipídeos e ácidos graxos, surfactantes poliméricos e surfactantes

particulados (Gautam & Tyagi, 2006; Dubey & Juwarkar, 2001; Desai & Banat, 1997;

Kosaric, 1992). Alguns autores preferem agrupar os biossurfactantes de acordo com seu

peso molecular (Bach et al.,2003; Ron & Rosenberg, 2002).

Alguns biossurfactantes e seus respectivos micro-organismos produtores são

apresentados na Tabela 2.1

Tabela 2.1 – Biossurfactantes produzidos por micro-organismos.

Biossurfactante Micro-organismo

Glicolipídeo

Ramnolipídeo

Trealolipídeo

Soforolipídeo

Pseudomonas sp. P. aeruginosa Rhodococcus erythropolis Nocardia erythropolis Mycobacterium sp. Torulopsis cândida T. bombicola T. petrophilium

Lipopetídeo e Lipoproteína

Peptídeo-lipídeo Serrawettina Viscosina Surfactina Subtilisina Gramicidins Polymyxins

Bacillus licheniformis Serratia marcescens P. fluorescens B. subtilis B. subtilis B. brevis, B. polymyxa

Ácidos Graxos, Lipídeos Neutros e

Fosfolipídeo

Ácidos Graxos Lipídeos Neutros Fosfolipídeos

Candida lepus Nocardia erythropolis Thiobacillus thiooxidans

Surfactantes Poliméricos Emulsan Biodispersan Mannan-lipid-protein Liposan Carboidrato-proteína-lipideo Proteína PA

Acinetobacter calcoaceticus A. calcoaceticus Candida tropicalis C. lipolytica P. fluorescens P. aeruginosa

fonte: Desai & Banat (1997).

Os principais biossurfactantes estudados são:

a) Glicolipídeos

É a classe mais conhecida dos biossurfactantes (Mercade & Manresa, 1994). São

carboidratos combinados com cadeias longas de ácidos alifáticos ou hidroxialifáticos.



13

Entre os glicolipídeos, os mais conhecidos são os ramnolipídeos, trealolipídeos,

soforolipídeos e mannosileritritol lipídeos (Banat et al., 2010).

Ramnolipídeo – Os ramnolipídeos são os glicolipídeos mais estudados. São

formados por uma ou duas moléculas de ramnose ligadas a uma ou duas moléculas

de ácido β-hidroxidecanóico. A produção de glicolipídeos por Pseudomonas

aeruginosa contendo ramnose foi primeiro descrito por Javis & Johnson em 1949

(citado por Desai & Banat, 1997).

Os principais glicolipídeos sintetizados por P. aeruginosa são os ramnolipídeos

dos tipos 1 e 2, L-ramnosil--hidroxidecanoil--hidroxidecanoato e L-ramnosil-L-

ramnosil--hidroxidecanoil--hidroxidecanoato (Figura 2.3), respectivamente. A

formação de ramnolipídeos do tipo 3, contendo uma molécula de ácido -

hidroxidecanóico; do tipo 4, com uma ou duas unidades de ramnose; metil-ésteres

derivados dos ramnolipídeos 1 e 2 e, ramnolipídeos com outras cadeias de ácidos graxos

também já foram previamente citadas (Kronemberger et al., 2007; Desai & Banat,

1997).

Os ramnolipídeos mostram rendimentos elevados em comparação a outros

biossurfactantes em diversas fontes de materiais renováveis, como por exemplo, óleos e

resíduos agroindustriais (Sánchez et al., 2007), além de apresentar toxicidade dez vezes

menor quando comparados a surfactantes sintéticos (Santa Anna et al., 2002).

Figura 2.3 – Estrutura do biossurfactante L-ramnosil-L-ramnosil--hidroxidecanoil--

hidroxidecanoato Fonte: Mulligan (2005).

Trealolipídeo – Desai (1987) definiu trealolipídeos como compostos formados

pela ligação do dissacarídeo trealose ligado a duas moléculas de ácido-

hidroxicarboxílico de cadeia longa e ramificada. Trealolipídeos são produzidos por uma

série de micro-organismos diferentes, tais como Mycobacterium, Nocardiae

Corynebacterium e sua composição é influenciada pelas condições de cultivo (Banat et



14

al.,2010). No entanto, o mais extensivamente composto estudado nesta classe são

dimycolates trealose (Figura 2.4) produzido por Rhodococcus erythropolis.

Figura 2.4 – Estrutura do biossurfactante dimycolates trealose

Fonte: Banat et al.(2010).

Soforolipídeos – são formados por molécula de soforose ligada a uma longa

cadeia de ácido graxo hidroxilado (Figura 2.5). Esses biossurfactantes são

sintetizados principalmente por leveduras tais como Candida bombicola, também

conhecida como Torulopsis bombicola, Centrolene petrophilum, Candida apicola e

Rhodotorula bogoriensis, Pseudozyma, Pseudozyma aphidis, Pseudozyma

antarctica and Pseudozyma rugulosa (Banat, et al., 2010).

Estudos realizados por Shin e colaboradores (2010) utilizando óleo de cozinha

como fonte de carbono e a levedura Candidade bombicola ATCC 22214 como micro-

organismo, obtiveram em seus resultados um elevado poder de biodegradabilidade e

uma alta produtividade.

Figura 2.5 – Estrutura do biossurfactante soforolipídeo ácido Fonte: Banat et al.(2010).

b) Lipopeptídeo e lipoproteína

Entre as muitas classes de biossurfactantes, lipopeptídeos são particularmente

interessantes por causa de suas altas atividades superficiais e potencial antibiótico



15

(Ahimou et al., 2000), apresentando alta eficiência como tensoativo (Fiechter, 1992). A

surfactina, lipopeptídeo cícliclo (Figura 2.6) formado por uma cadeia com sete

aminoácidos e extremidades ligadas a grupamentos carboxila e hidroxila de ácido graxo,

é um tipo de lipopeptídeo produzido por linhagens de B. subtilis, um dos

biossurfactantes mais conhecidos desta classificação (Lang, 2002; Kim et al., 1997).

Figura 2.6 – Estrutura da surfactina Fonte: Lang (2002).

c) Ácidos graxos e fosfolipídeos

Uma grande quantidade de biossurfactantes desse tipo é sintetizada por micro-

organismos do tipo bactérias e leveduras durante o crescimento que possui n-alcanos

como fonte de carbono (Desai & Banat, 1997).

Os fosfolipídeos fazem parte da estrutura de membranas de micro-organismos e

são formados por uma molécula de glicerol ligada a duas moléculas de ácidos graxos

por uma ligação éster. Também são ligados a um grupamento fosfato e este grupamento

pode apresentar diferentes constituintes.

De acordo com Desai & Banat (1997), a produção de fosfolipídeos também é

afetada pelas condições de cultivo, bem como pela fonte de carbono usada como

substrato e assim, diferentes tipos podem ser sintetizados. Os principais tipos de

fosfolipídeos são: fosfatidiliositol (Figura 2.7), fosfatildiglicerol e ácido fosfatídico.

Figura 2.7 – Estrutura do biossurfactante fosfatidiliositol (Fonte: http://themedicalbiochemistrypage.org/spanish/lipid-synthesis-sp.html, acessado em 27/12/2011)



16

d) Surfactantes poliméricos

Os biossurfactantes poliméricos mais bem estudados são emulsan (Figura 2.8),

liposan, mannoproteína e outros complexos polissacarídeo-proteína (Fathabad, 2010).

Essa classe de biossurfactantes apresenta alta afinidade por interfaces óleo/água,

facilitando a formação de emulsões estáveis, fazendo com que mesmo em baixas

concentrações sejam alcançados elevados índices de emulsificações (Borges, 2011).

Figura 2.8 – Estrutura do biossurfactante emulsan Fonte: Desai e Banat (1997).

2.3.4 – Propriedades gerais e funções fisiológicas dos biossurfactantes

A exata função fisiológica dos biossurfactantes ainda não foi totalmente

esclarecida. Sabe-se que os biossurfactantes exercem influência sobre a sobrevivência

de micro-organismos por estar relacionadas com a sua mobilidade, movimentação,

deslizamento, ou ainda, desprendimento de superfícies. A função da sua síntese também

pode ser explicada para que existam interações entre células, formação, manutenção e

maturação de biofilme; patogênese; quorum sensing (mecanismo de comunicação entre

células geralmente estimulada por mudanças ambientais e populacionais); amensalismo,

inibição do crescimento de outras populações microbianas; acesso ao substrato através

do contato direto interfacial e falsa solubilização (Van-Hamme et al., 2006).

Uma síntese dessas funções fisiológicas é apresentada a seguir baseado nos

artigos de revisão da Nitschke & Pastore (2002) e Ron & Rosenberg (2002).



17

a) emulsificação e solubilização de hidrocarbonetos ou compostos insolúveis

em água

Essa característica facilita o crescimento de micro-organismos nestes substratos.

Trabalhos publicados afirmam que micro-organismos como Pseudomonas

aeruginosa não absorvem hidrocarbonetos através do contato direto, fazendo-se

necessário sintetizar ramnolipídeos para poder solubilizá-los e degradá-los

(Noordman & Janssen, 2002). Todavia, de acordo com Nitschke e Pastore

(2002), bactérias do tipo Bacillus subtilis produzem biossurfactantes apenas em

substratos hidrossolúveis;

b) transporte de hidrocarbonetos

Função atribuída aos biossurfactantes ligados à parede celular de Candida

tropicalis, onde um aumento significativo da porção lipídica do polissacarídeo da

membrana foi detectado quando o micro-organismo crescia em alcanos, indicando que o

complexo polissacarídeo-ácido-graxo presente na superfície celular estaria envolvido no

transporte de hidrocarbonetos;

c) aderência-liberação da célula a superfícies

Uma das mais importantes estratégias de sobrevivência dos micro-organismos é

sua habilidade em colonizar um nicho ecológico onde possa se multiplicar. O elemento

chave nesta estratégia são estruturas da superfície celular responsáveis pela aderência

das células às superfícies. Os micro-organismos podem utilizar biossurfactantes ligados

à parede para regular as propriedades da superfície celular, visando aderir ou se desligar

de um determinado local de acordo com sua necessidade para encontrar novos habitats

com maior disponibilidade de nutrientes ou se livrar de ambientes desfavoráveis;

d) atividade antibiótica

Demonstrada por vários biossurfactantes, principalmente da classe dos

lipopeptídeos e glicopeptídeos. Os ramnolipídeos de P. aeruginosa e a surfactina de B.

subtilis funcionam como antibióticos, solubilizando os principais componentes das

membranas celulares microbianas. Através da excreção destes biossurfactantes no meio,

os micro-organismos adquirem maior chance de sobrevivência e maior competitividade

na busca por nutrientes. Benincasa et al., em 2004, publicaram que ramnolipídeos

produzidos por Pseudomonas aeruginosa LBI inibem o crescimento de algumas

bactérias, entre elas, o Bacillus subitilis, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris,



18

Streptococcus fecalis, outras espécies de Pseudomonas aeruginosa e, alguns fungos

patogênicos, Penicillium, Alternaria, Gliocadium virens e Chaetonium globosum.

2.3.5 – Comparação entre biossurfactantes e surfactantes sintéticos

Os biossurfactantes apresentam características que representam vantagens sobre

os surfactantes sintéticos, são elas:

a) biodegradabilidade

Os biossurfactantes são facilmente degradáveis na água e no solo, o que os torna

adequados para aplicações como biorremediação, tratamento de resíduos e

derramamento de óleo (Whanga et al., 2008; Das & Mukherjee, 2007; Kosaric, 2001).

b) diversidade química

Os biossurfactantes oferecem uma grande seleção de compostos de superfície-ativa

com propriedades intimamente relacionadas com aplicações específicas (Gautam &

Tyagi, 2006).

c) biocompatibilidade e baixa toxicidade

Devido à crescente preocupação da população com os efeitos alérgicos dos produtos

artificiais, os biossurfactantes produzidos por leveduras possuem baixa toxicidade,

permitindo o uso em alimentos, cosméticos e produtos farmacêutico (Cohen et al.,

2010; Kosaric, 2001; Cameotra & Makkar, 1998).

d) disponibilidade de matéria-prima para a síntese

Os biotensoativos podem ser sintetizados a partir de fontes inesgotáveis de matérias-

primas de baixo custo (Rahman et al., 2002), os resíduos agroindustriais, sendo de

interesse particular para a produção em grande escala (ex: aplicações diversas na

indústria do petróleo).

e) uso em controle ambiental

Biossurfactantes podem ser utilizadas de forma eficiente na manipulação de

emulsões industrial, controle de vazamentos de petróleo, biodegradação, e

desintoxicação de efluentes industriais e na biorremediação (Franzetti et al.,2006;

Noordman & Janssen, 2002).



19

f) elevada eficácia em condições extremas

Em condições de elevada temperatura, salinidade ou variações de pH, os

biossurfactantes geralmente não perdem sua capacidade de emulsificar ou de reduzir a

tensão superficial do meio. Alguns tensoativos biológicos são capazes de suportar

concentração de até 10 % de NaCl, enquanto uma concentração salina de 2-3 % é

suficiente para inativar surfactantes químicos convencionais (Bognolo, 1999).

g) maior eficiência e efetividade

Os biossurfactantes atingem menores tensões superficiais em menores

concentrações quando comparados aos surfactantes sintéticos (Cooper & Paddock,

1984).

2.3.6 – Biossurfactantes e suas aplicações

2.3.6.1 – Aplicações Industriais

O crescente interesse nas aplicações de compostos tensoativos microbianos é

baseado em suas variadas propriedades funcionais, que incluem emulsificação,

desemulsificação, separação de fases, molhamento, formação de espumas, solubilização

e redução de viscosidades de óleos pesados.

Algumas aplicações são descritas a seguir:

a) Biorremediação

O acúmulo de materiais tóxicos na água e no solo representa um dos principais

problemas a ser enfrentado nos últimos anos (Kosaric, 2001). Do ponto de vista

ambiental, biossurfactantes são mais aceitáveis para o processo de remediação, tanto no

mar, quanto em terra (Cameotra & Makkar, 2010). Como os biotensoativos aumentam a

interação superficial água/óleo, aceleram a degradação de vários óleos por micro-

organismos e promovem a biorremediação de águas e solos (Nitschke & Pastore, 2002).

Métodos biológicos se mostram mais vantajosos e mais eficientes em degradar

compostos orgânicos em processos aeróbios e/ou anaeróbios. Embora para a degradação

destes compostos recalcitrantes, a adaptação das culturas de micro-organismos se faz

necessária (Kosaric, 2001).

Outras tecnologias que usam processos físicos e/ou químicos são também

indicadas para descontaminar ambientes poluídos, todavia, o processo biológico de



20

biorremediação é uma alternativa ecologicamente mais adequada e eficaz para o

tratamento de ambientes contaminados com moléculas orgânicas de difícil degradação e

metais tóxicos.

O tratamento de um solo contaminado é mais complexo e difícil de ser tratado

quando comparado ao tratamento de um efluente, principalmente quando o solo

contaminado abrange uma área extensa. Segundo Kosaric (2001) há duas maneiras de

fazer este tratamento de forma biológica, a primeira é a adição de nutrientes no solo,

como nitrogênio, fósforo e se necessário, compostos orgânicos; permitindo assim a

população microbiana a se desenvolver, degradando o poluente. O segundo processo é o

método ex situ em que a população microbiana é adaptada ao poluente e mostrando-se

eficientemente capaz de metabolizar, é então colocada na área contaminada. Apesar das

propriedades do solo estar em condições inferiores, a população microbiana é capaz de

sobreviver e degradar os compostos desejados.

Estes dois métodos expostos são bastante populares, mas a estratégia a ser

utilizada dependerá do tipo de poluente, das condições ambientais do solo e da

viabilidade de adaptação da cultura (Kosaric, 2001; Nitschke & Pastore, 2002).

O Emulsan®, biotensoativo composto por um heteropolissacarídeos, sintetizado

por bactérias do tipo Acinetobacter calcoaceticus (Rosenberg & Rosenberg, 1981) tem

sido comercializado para a recuperação e tratamento de áreas contaminadas por

hidrocarbonetos provenientes do petróleo, sendo bastante efetivo na diminuição da

tensão superficial do óleo e na redução da viscosidade do óleo.

Santa Anna et al. 2007 utilizando ramnolipídeos sintetizados por Pseudomonas

aeruginosa estudaram a aplicação do metabólito em processo de remediação do solos

impactados por derramamento de óleo e concluíram que a ação do biossurfactante foi

similar aos surfactantes comerciais concentrados, porém ainda limitado quanto ao

processo de produção em larga escala.

b) Limpeza de reservatório de óleos

Resíduos e frações de óleos pesados que sedimentam no fundo de tanques de

estocagem são altamente viscosos e podem se tornar depósitos sólidos que não são

removidos através de bombeamento convencional (Nitschke & Pastore, 2002). Um

processo alternativo de limpeza é o uso de biossurfactantes que promovem a diminuição



21

na viscosidade e a formação de emulsões O/A, facilitando o bombeamento dos resíduos

e a recuperação do óleo cru após quebra da emulsão (Banat et al., 2000).

Banat et al. (1991) escreveram que testes usando biossurfactantes foram

realizados para avaliar a capacidade de limpar tanques de armazenamento de petróleo e

de recuperar os hidrocarbonetos da lama. Uma planta piloto produziu 2 toneladas de

caldo de cultura. O caldo contendo biossurfactante foi usado como teste em um tanque

de armazenamento de petróleo pertencente ao Kuwait Oil Company, do Kuwait.

Ao final do processo, quase 91 % do petróleo bruto foi recuperado. O óleo bruto

extraído após a limpeza foi encontrado em valores que variam entre 27,6 API e 29,8;

semelhante à faixa de API para o óleo padrão bruto do Kuwait, com teor de

hidrocarbonetos totais de 100 %. Assim, aproximadamente 5550 barris de petróleo

comercializáveis foram produzidos.

Este óleo pode ser vendido para cobrir os custos da limpeza por tanque de

armazenamento. Tal processo é altamente desejável, pois é economicamente

compensador, ambientalmente saudável e é menos perigoso para as pessoas envolvidas

do que o processo convencional. Além disso, é uma aplicação limitada de

biossurfactantes que pode ser facilmente controlado e, portanto, seria um adequado

caminho para progredir no sentido de que envolve as companhias de petróleo que são

geralmente relutantes em adotar essa tecnologia (Banat et al.,1991).

c) Recuperação avançada do óleo (MEOR)

O maior interesse no uso dos biossurfactantes em indústrias petrolíferas,

segundo Kosaric (1992), é para a recuperação avançada do óleo (MEOR). Esta técnica

de recuperação terciária do petróleo consiste na utilização de micro-organismos ou

produtos de seu metabolismo para a recuperação de óleo residual.

Os micro-organismos produzem polímeros e biossurfactantes que reduzem a

tensão superficial óleo-rocha, reduzindo as forças capilares que impedem a

movimentação do óleo através dos poros da rocha. Estes biossurfactantes também

auxiliam na emulsificação e na quebra dos filmes de óleo das rochas (Nitschke &

Pastore, 2002; Banat et al., 2000).

A Figura 2.9 mostra um esquema da utilização do biossurfactante na

recuperação avançada do óleo.



22

Figura 2.9 – Mecanismo de recuperação do óleo por biossurfactantes Fonte: Pacwa-Płociniczak et al.(2011) (adaptado)

Para esta utilização, os biossurfactantes podem ser usados ex situ e in situ. Em

ambos os casos, os biossurfactantes são aplicados para melhorar a recuperação do óleo

da terra, que por métodos preliminares de bombeamento somente possibilita à

recuperação de aproximadamente 30 % do reservatório (Kosaric, 1992).

As estratégias envolvidas para a recuperação avançada do óleo dependem das

condições do reservatório, incluindo temperatura, pressão, pH, porosidade, salinidade,

estrutura geológica do reservatório, nutrientes disponíveis e a presença de micro-

organismos selvagens (Banat et al., 2000). Três estratégias são conhecidas no processo

de MEOR (Singh et al., 2007; Banat et al., 2000):

1- Produção de biossurfactante em batelada ou contínuo em baixas condições

permitindo ser adicionados de maneira convencional com a alimentação de água (ex

situ),

2- Produção de biossurfactante pela injeção de micro-organismos na interface

óleo-célula dentro do reservatório e

3- Injeção de nutrientes selecionados dentro do reservatório para estimular a

produção de biossurfactantes produzido por bactérias selvagens.

De acordo com Banat et al. (2010), a primeira estratégia é a mais explorada. Na

prática um grande obstáculo para a produção in situ de biossurfactantes se deve a

dificuldade de isolar cepas de micro-organismos adaptadas às condições ambientais

extremas que se encontram o reservatório, elevada pressão, temperatura de até 85 °C e

alta variação de pH.

Entre os glicolipídeos, os ramnolipídeos têm sido mais utilizados nesse processo,

contudo, outros vários tipos de biossurfactantes como surfactina, um lipopeptídeo,

Biossurfactante

Rocha

Óleo



23

Emulsan® (surfactante polimérico) têm se mostrado eficaz na recuperação de petróleo

(Sen, 2008).

d) Aplicações terapêuticas e agentes de saúde

Os biossurfactantes têm algumas aplicações terapêuticas. Estas incluem

aplicações possíveis dos ramnolipídeos produzidos por P. aeruginosa entre outros

micro-organismos como agentes biocidas. Makkar & Cameotra (2002) descrevem como

possíveis aplicações dos biossurfactantes a formação de uma emulsão para o transporte

de droga ao local da infecção, para suplementar o surfactante pulmonar e como

adjuntores para vacinas.

A surfactina, um dos mais conhecidos biossurfactantes, possui várias aplicações

farmacêuticas como a inibição da formação de coágulos; formação de canais iônicos em

membranas; atividade antibacteriana e antifúngica; atividade antiviral e antitumoral

(Seydlová & Svobodova, 2008). O biossurfactante produzido por R. erythropolis inibiu

o vírus do herpes simples e vírus parainfluenza (Barros et al., 2008).

Mimee et al. (2005) isolou um glicolipídeo produzido a partir do fungo do tipo

levedura P. flocculosa, chamado flocculosin, o biotensoativo mostrou-se atividade

contra diversas leveduras patogênicas associadas a micoses humanas.

Ramnolipídeos produzidos a partir de resíduos de óleo de soja teve atividade

antimicrobiana contra várias bactérias e fungos, entre eles, Bacillus cereus, S. aureus,

Micrococcus luteus, Mucor miehei e Neurospora crassa (Nitschke et al., 2010).

Uma deficiência no surfactante natural pulmonar (complexo proteico

fosfolipídico) é responsável pela morte de bebês prematuros. Biossurfactantes

produzidos por bactérias têm sido aplicados em medicamentos (Gautam & Tyagi,

2006).

e) Biossurfactantes na indústria de cosméticos

As indústrias de cosméticos utilizam uma larga quantidade de biossurfactantes

em uma variedade de produtos. Eles são usados como emulsificantes, agentes

espumantes, solubilizantes, agentes umidificantes e de limpeza. Vários produtos contêm

biossurfactantes na sua formulação, como por exemplo, repelentes, xampus anticaspas,

soluções para lentes de contato, pastas de dente, cremes faciais, entre outros

(Prommachan, 2002; Makkar & Cameotra, 2002).



24

f) Biossurfactantes na indústria de alimentos

Biossurfactantes têm sido amplamente aplicados na indústria alimentícia

(Nitschke & Costa, 2007). Lecitina e seus derivados, ésteres de ácidos graxos contendo

glicerol, sorbitol, ou etileno glicol, derivados etoxilados de monoglicerídeos incluindo

recentes oligopepitídeos sintetizados, são usados como emulsificantes na indústria de

alimentos (Gautam & Tyagi, 2006; Prommachan, 2002). Os biossurfactantes também

são aplicados na panificação e em produtos de carne onde influenciam nas

características reológicas da farinha e na emulsificação de gordura (Gautam & Tyagi,

2006; Nitschke & Pastore, 2002; Prommachan, 2002).

Biossurfactantes atuam no controle da consistência, solubilização e também na

emulsificação em produtos de padaria e sorveteria. Também serve como estabilizador

de gordura e antiaderente no cozimento de óleos e gorduras (Kosaric, 2001).

Uma melhoria de estabilidade de massa, textura, volume e conservação de

produtos de padaria foi descrita por Van Haesendonck e Vanzeveren (2004) através da

adição de ramnolipídeos.

g) Outras aplicações

Outras aplicações destes metabólitos incluem a propriedade emulsificante no

processamento de matérias-primas, a formulação de herbicidas e pesticidas, para a

agricultura; no setor de mineração são utilizados no processo de separação dos minerais;

na indústria de tintas são empregados por gerar uma maior dispersão dos componentes e

aumentar as propriedades da mistura (Kosaric, 2001). Há ainda aplicações na indústria

têxtil, papel, construção civil, entre outros (Nitschke & Pastore, 2002).

2.4 – Produção de biossurfactantes

Apesar das propriedades serem comercialmente atrativas e vantajosas em relação

aos surfactantes sintéticos, a produção econômica do biotensoativo apresenta diversas

barreiras a serem derrubadas.

Entre estas barreiras pode ser citado o baixo rendimento e alto custo para a

produção em grande escala, a necessidade de esterilização, problemas no controle do

processo como a formação de espumas, problemas na recuperação e purificação do

produto e a dificuldade em proceder à análise química dos produtos dada a natureza

complexa do metabólito produzido (Bezerra, 2006; Healy et al.,1996).



25

De Acordo com Mukherjee et al.(2006), a economia de produção do

biossurfactante é conduzida pelos seguintes fatores básicos:

I. custo inicial do material;

II. disponibilidade de procedimentos apropriados e econômicos da produção e

de recuperação;

III. o rendimento do produto dos micro-organismos produtores.

Dessa forma, devem-se utilizar estratégias básicas para tornar o custo da

produção de biossurfactantes competitivo, são elas (Fitcher, 1992):

a) uso de substratos mais baratos para reduzir os custos inicias do processo;

b) desenvolvimento de bioprocessos eficientes, incluindo a otimização das

condições de cultivo e o custo de recuperação e separação máxima de

biossurfactante;

c) o uso de mutantes e cepas recombinantes para altos rendimentos de

biossurfactante.

Num processo fermentativo devem-se levar em consideração alguns pontos

básicos: o micro-organismo, o meio de cultivo, a forma de condução do processo e as

etapas de recuperação do produto final. É importante defini-los de forma conjunta, pois

interagem entre si, levando em consideração os aspectos biológicos e econômicos.

2.4.1 – Micro-organismo

O êxito ou fracasso em um processo fermentativo começa com a escolha do

micro-organismo. O micro-organismo escolhido deve apresentar elevada eficiência na

conversão do substrato em produto, permitindo o acúmulo do produto no meio, de

forma a obter elevada concentração do metabólito no caldo fermentado. (Bezerra,

2006).

De uma forma geral, visando aplicações industriais, as principais características

desejáveis para os micro-organismos seriam: elevada eficiência na conversão de

substrato em produto, uma vez que as matérias-primas incidem significativamente no

custo do produto final. Permitir a rápida liberação e acúmulo do produto no meio de

cultivo, de forma a se obter em alta concentração, sem que o acúmulo do produto iniba

o crescimento celular. (Bastos, 2010; Schmidell et al., 2001).



26

Da mesma forma, também se espera que outros produtos não desejáveis tenham

sua produção minimizada durante o processo. Estabilidade quanto ao comportamento

fisiológico; não ser patogênico; não exigir condições de processo muito complexas; não

exigir meios de cultivo dispendiosos (Bastos, 2010).

O micro-organismo não deve exigir condições de processo muito complexas por

motivos claros de economia na produção e como se pretende empregar meios de

cultivos mais baratos, o micro-organismo deve encontrar condições adequadas para

realizar a conversão pretendida (Schmidell et al., 2001).

O micro-organismo utilizado nos processos fermentativos é obtido através de

isolamentos de fontes naturais como solo, água, plantas, etc., de coleções de culturas ou

até mesmo de programas de melhoramento genético, no caso da produção de

antibióticos (Schmidell et al., 2001). A modificação genética destes micro-organismos

atribui certa especificidade aos mesmos, sendo então protegido por patentes. Isto

significa que uma grande porcentagem de micro-organismos isolados ou modificados

não está disponível para o uso geral em laboratórios (Bezerra, 2006).

2.4.1.1 – Pseudomonas aeruginosa como produtora de biossurfactantes

A Pseudomona aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa podendo ser isolada

de diferentes habitat, incluindo a água, o solo e plantas, esses bastonetes gram-

negativos constituem a maior gênero de bactérias que existe em alimentos frescos. As

Pseudomonas são amplamente distribuídas entre os alimentos, especialmente verduras,

carnes, aves e produtos do mar. Eles são, de longe, o mais importante grupo que causam

deterioração em alimentos quando refrigerado, pois muitas espécies são psicotróficas e

seu crescimento é notável através de pigmentos verdes-azulados (Jay, 2005). É um

patógeno oportunista humano que causa infecções nosocomiais sérias e também é

resistente a antibióticos.

Fisiologicamente, Pseudomonas aeruginosa é classificada como uma bactéria

aeróbia, podendo crescer anaerobicamente quando há presença de nitrato. Embora a

espécie seja quimiorganotrófica, a obtenção de energia a partir de carboidratos implica

um metabolismo oxidativo, ou seja, dependente de O2 (Lincopan & Trabulsi, 2008).

A versatilidade aos requerimentos nutricionais e energéticos permite que

Pseudomonas aeruginosa cresçam rapidamente em meios muito simples, numa ampla

variedade de temperatura (4ºC a 42ºC) (Lincopan & Trabulsi, 2008.).



27

Sob condições ambientais específicas essa bactéria produz um biossurfactante

contendo ramnose – glicolipídeo (Sánchez et al, 2007), caracterizado como um

ramnolipídeo. Há diversos fatores que influenciam no tipo de ramnolipídeo produzido,

entre estes fatores podem ser citados a cepa bacteriana, a fonte do carbono utilizada e a

estratégia do processo (Lang & Wullbrandt, 1999; Déziel et al., 1999).

Além de biossurfactante, a maioria das cepas produz pigmentos hidrossolúveis,

difusíveis no meio de cultura, tais como a piocianina (azul); pioverdina (verde) e

pigmentos em menor frequência como piomelanina (marrom) e piorrubina (vermelho)

(Lincopan & Trabulsi, 2008).

2.4.2 – Meio de Cultivo

2.4.2.1 – Fonte de carbono

A fonte de carbono geralmente usada na produção deste metabólito pode ser

proveniente de três categorias: carboidratos, óleos vegetais e hidrocarbonetos (Raza et

al.,2006; Kim et al, 1997). Fontes de carbono solúveis em água como glicose, manitol,

glicerol e etanol já foram estudados para a produção de ramnolipídeos por diversos tipos

de Pseudomonas sp. As fontes de carbono imiscíveis como n-alcano e óleo de oliva

apresentaram maior rendimento na produção do biotensoativo (Prommachan, 2002).

Na produção de biossurfactantes diversos substratos de fontes renováveis,

especialmente os de indústrias geradoras de resíduos, têm sido utilizados para o cultivo

de micro-organismo e produção de biossurfactante em escala experimental (Bezerra,

2006; Nitschke et al., 2005). Todavia, o principal problema encontrado para o uso de

substratos alternativos como meio de cultura é encontrar um resíduo que tenha alto

valor de nutrientes e que permita além do crescimento celular a acumulação do produto

(Bezerra, 2006; Nitschke et al., 2005; Makkar & Cameotra, 2002).

A utilização de resíduos agroindustriais de baixo valor agregado é importante na

redução do custo da produção de biossurfactante e na economia do processo, chegando

a reduzir cerca de 50 % do valor do produto final (Gautam & Tyagi, 2006).

Efluentes provenientes da extração do óleo de oliva, gordura animal, óleo de

fritura, soapstock (um coproduto de refinaria de óleo vegetal), melaço, soro do leite e

outros resíduos ricos em amido (Maneerat, 2005; Desai & Banat, 1997) têm sido

utilizados como substrato para a produção de biossurfactante. Além da própria



28

manipueira, vários outros substratos agroindustriais já foram investigados: semente de

soja, açúcar de beterraba, batata doce e batata inglesa. Além de outros resíduos como:

farelo e palha de trigo e de arroz; casca de soja, de milho e de arroz; bagaço de cana-de-

açúcar e de mandioca, resíduos da indústria de processamento de café, como a polpa de

café; resíduos da indústria de processamento de frutas como polpa de maçã e de uva,

sobras do processamento de abacaxi e de cenoura, sobras de banana; sobras

provenientes de moinhos de processamento de óleos como o de coco, de soja, de

amendoim e de canola (Mukherjee et al., 2006; Makkar & Cameotra, 2002; Rahman et

al., 2002).

O uso de óleo de buriti, cupuaçu, óleo de maracujá, andiroba, castanha do Pará e

babaçu para a síntese de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa LB1 foram

testados, havendo uma excelente redução da tensão superficial como também uma boa

emulsificação para os óleos extraídos do maracujá e castanha do Pará (Costa et al.,

2006).

Na Tabela 2.2 são apresentados alguns substratos de baixo custo que são

utilizados como fontes de carbono na produção de biossurfactantes.

Tabela 2.2 – Substratos de baixo custo utilizados na produção de biossurfactante

Substratos de baixo

custo Biossurfactante Micro-organismo

Rendimentos

(g/L)

Óleo de Babassu soforolipídeo Candida lipolytica IA

1055 -

Óleo de soja e

girassol ramnolipídeo

Pseudomonas

aeruginosa DS10–129 4,31 / 2,98

Óleo de girassol lipopeptídeo Serratia marcescens -

Óleo de fritura

(girassol e soja) ramnolipídeo

Pseudomonas

aeruginosa 47T2 NCIB

40044

2,7

Resíduos de refinaria

de óleo glicolipídeo

Candida antarctica

e/ou Candida apicola 10,5 / 13,4

Efluente do

processamento de

batata

lipopeptídeo Bacillus subitillis -

Manipueira lipopeptídeo

Bacillus subtilis ATCC

21332 e

Bacillus subtilis LB5a

2,2 – 3,0

Fonte: Mukherjee et al. (2006).



29

Entre as fontes alternativas de carbono e de baixo custo, destaca-se a

manipueira, um efluente gerado em grande quantidade extraído da mandioca no

processo de fabricação de farinha. Os principais nutrientes presentes neste resíduo são

sais minerais e açúcares (Nitschke & Pastore, 2006).

2.4.2.2 – Mandioca e manipueira

A mandioca é uma raiz com alto teor de amido cultivada na América Tropical há

mais de 5000 anos. A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é originária do Brasil,

região amazônica fronteiriça com a Venezuela e se constitui em alimento energético

para mais de 400 milhões de pessoas no mundo, sobretudo nos países em

desenvolvimento, onde o cultivo é realizado por pequenos agricultores, em áreas

reduzidas e com baixa produtividade (Cangnon et al., 2002).

Em área cultivada a mandioca ocupa o 7º lugar no mundo e o 4º nos trópicos.

(Cangnon et al., 2002). Em conjunto com o Brasil, os países Paraguai, Colômbia, Peru e

Bolívia respondem por quase 95 % da produção latino-americana. Sendo a mandioca de

fácil adaptação, ela é cultivada em todos os territórios brasileiros (Cardoso & Sousa,

2002).

A mandioca é uma das culturas mais difundidas nas regiões Norte e Nordeste do

Brasil. Inicialmente usada como alimento de índio, passou a ser o sustento dos europeus

que não podiam cultivar o trigo (Mattos et al., 2002). As regiões Norte e Nordeste

destacam-se como principais consumidoras, sendo a produção essencialmente utilizada

na dieta alimentar, na forma de farinha. Nas regiões Sul e Sudeste, em que os

rendimentos médios são foram 18,7 toneladas/semestre e 17,1 toneladas/semestre,

respectivamente, a maior parte da produção é orientada para a indústria, principalmente

nos Estados do Paraná, São Paulo e Minas Gerais. (Cardoso & Sousa, 2002).

Uma das características das plantas de mandioca é a presença de um glicosídeo

(tipo de açúcar) potencialmente hidrolisável liberando cianeto (HCN). A hidrólise não é

evidente e só se realiza naturalmente quando ocorre livre uma enzima da própria planta.

Se a hidrólise não ocorre, o glicosídeo, tecnicamente denominado linamarina, é estável

e inócuo. A Manihot sculenta Crantz é a espécie mais conhecida por acumular este

glicosídeo. (Cangnon et al.,2002).

A liberação de HCN por plantas cianogênicas, como a mandioca, ocorre com

velocidade significante somente após o tecido ser dilacerado e o glicosídeo cianogênico



30

entrar em contato com as enzimas catabólicas. No caso específico do glicosídeo

linamarina, a primeira etapa é catalisada por uma -glicosidase nomeada linamarase. A

clivagem produz glicose e acetonacianoidrina que se dissocia espontaneamente em pH

maiores que 5.0, ou por ação da hidroxinitrila liase (HNL), formando HCN e acetona.

(Cangnon et al., 2002). A Figura 2.10 apresenta a cianogênese a partir da linamarina.

Figura 2.10 – Cianogênese a partir da linamarina Fonte: Cangnon et al.(2002).

No caso específico da mandioca, a linamarase e HNL estão localizadas nas

paredes celulares das folhas, em contrapartida, linamarina e lotaustralina encontram-se

compartimentalizadas em vacúolos (Sayre, 1995 apud Cangnon et al.,2002).

No Brasil, há duas estruturas importantes para a produção de farinha. A primeira

estrutura é conhecida como farinheira, uma agroindústria que apresenta trabalho

profissional. A segunda estrutura apresenta alto índice de informalidade e não possui

marca própria, são conhecidas como casas de farinhas, estruturas menos

profissionalizada, baseadas geralmente em trabalho familiar (Granco et al., 2005).

A manipueira é o principal efluente, em termos de agressão à natureza,

produzido pelas casas de farinha e pelas farinheiras. De vocábulo indígena incorporado

à língua portuguesa, manipueira é o suco ou água de constituição das raízes, de aspecto

leitoso, de cor amarelo-clara que é extraída das raízes carnosas da mandioca (Manihot

esculenta Crantz) por ocasião da prensagem das raízes frescas, picadas ou massa ralada

da indústria da Farinha (Cordeiro, 2006; Oliveira, 2003). Este efluente residuário foi

sempre desprezado sem qualquer aproveitamento econômico. (Pantarotto & Cereda,

2001).

A preocupação com esse resíduo deve-se ao fato de que a produção da farinha de

mandioca gera entre 267 a 419 litros desse resíduo para cada tonelada de raiz

processada. Esse volume é extremamente elevado quando se considera o total gerado no



31

processamento em farinheiras e fecularias, 80 % das 26,6 milhões de toneladas de

mandioca produzidas no Brasil em 2006 (Rossmann, 2008).

De acordo com Cordeiro (2006), este efluente de cor amarelada possui uma

composição química variada que está associada à variedade da mandioca utilizada, ao

período da safra, à fertilidade do solo, entre outros fatores. A manipueira é constituída

por carboidratos, nitrogênio e diversos sais minerais que tornam este resíduo passível de

ser aproveitado para o cultivo de micro-organismos.

Este efluente tem sido observado como um subproduto passível de ser

aproveitado em outras atividades. Na gama de opções para o seu aproveitamento,

encontra-se a produção de biomassa lipídica na qual o mesmo é utilizado como

substrato. O estudo de tal alternativa fundamenta-se no fato de que a levedura

Trichosporon sp, considerada levedura oleaginosa, é encontrada naturalmente na

manipueira, estando adaptada a este resíduo. Entre os possíveis usos que estão sendo

investigados para a manipueira encontram-se a produção de biogás, ácido cítrico e ferti-

irrigação e produção de biossurfactante (Nitschke, 2002; Pantarotto & Cereda, 2001).

Na Tabela 2.3 é apresentada a composição da manipueira em alguns trabalhos

publicados.

Tabela 2.3 – Composição da Manipueira

Componentes Concentração1

Concentração2

Concentração3

Sólidos Totais (g/L) * * 45,02

Açúcares totais (g/L) 35,3 56,4 47,07

Açúcares redutores (g/L) 12,8 * 0,35

Açúcares não-redutores (g/L) 22,2 * 47,03

Nitrogênio total (g/L) 2,5 * 0,21

Fósforo (mg/L) 225,9 900 643

Potássio (mg/L) 2.665,1 3.600,00 49

Cálcio (mg/L) 272,5 * 352,00

Magnésio (mg/L) 519,0 500,00 8,12

Enxofre (mg/L) 104,0 * *

Ferro (mg/L) 7,8 6,1 ND

Zinco (mg/L) 7,3 11,1 *

Manganês (mg/L) 1,8 4,1 0,16

Cobre (mg/L) 0,6 14,1 *

pH 5,9 * 4,56 1Fonte: Nitschke & Pastore (2006)

2Fonte: Costa et al. (2009).

3Fonte: Rossman (2008).

* Análise não realizada

O processo da fabricação da farinha começa com a colheita da mandioca, que

ocorre entre 16 e 20 meses após o cultivo. O tempo máximo após a colheita até a



32

fabricação deve ser de 36 horas para que a mandioca não entre em reações de

escurecimento ocasionando um aspecto desagradável como também indevida para a

produção da farinha. Esse processo é apresentado através da Figura 2.11.

Mandioca

SeleçãoLavador

DescascadorTriturador

Água

Prensa

EsfareladorFornoPeneira

Farinha

Farelo

Água de lavagem

Cascas, Areia

Manipueira

Figura 2.11 – Extração da manipueira em processo de fabricação de farinha

Após o descarregamento, a mandioca é selecionada e descascada. Nesta mesma

etapa, as mandiocas são lavadas para a retirada de areia e resíduos da casca.

O passo seguinte é o triturador, uma máquina geralmente elétrica, que mói a

mandioca, deixando em forma de grãos. Após a moagem, esta farinha que contém muita

umidade é levada à prensa. Na prensa, da mandioca triturada é extraído o suco

amarelado, com odor característico, a manipueira (Figura 2.12).

A massa prensada, em forma de blocos, segue para um tanque onde é esfarelada.

Operários se encarregam de quebrar esta massa compactada utilizando ferramentas

diversas como ciscadores, pás e até mesmo as mãos, tornado a massa homogênea antes

de levar ao forno.

No forno, a massa esfarelada perde toda a água e enquanto é torrada, pás estão

sempre homogeneizando para que a farinha produzida seja a mais uniforme possível.

Na última etapa encontra-se o peneiramento. O retido na peneira é denominado

farelo, podendo ser retriturado em outro equipamento para depois ser novamente



33

peneirado. O peneirado é o produto final, a farinha, que logo em seguida é pesada e

ensacada estando pronta para o consumo.

Figura 2.12 – Obtenção da manipueira

2.4.2.3 – Fonte de nitrogênio

Outros constituintes além da fonte de carbono também afetam a produção de

biossurfactantes e a fonte de nitrogênio e/ou nitrogênio limitante tem um papel

importante na síntese destes metabólitos (Desai & Banat, 1997). Pseudomonas utilizam

nitratos, amônias e aminoácidos como fonte de nitrogênio (Mulligan & Gibbs, 1989).

Na produção de biotensoativos por Bacillus subitilis, Makkar & Cameotra

(1997) estudaram o efeito de diversas fontes de nitrogênio (ureia, peptona, extrato de

levedura, estrato de carne, triptona, nitrato de potássio, nitrato de sódio e nitrato de

amônio), onde a ureia apresentou a melhor influência no rendimento do biossurfactante

uma menor tensão superficial do meio em estudo.

De um modo geral, adicionar aminoácidos ou hidrolisados de proteínas favorece

o crescimento da maioria dos micro-organismos heterotróficos. Deve-se considerar o

custo, a sua disponibilidade, e os problemas de impureza que acompanham estas fontes

(Desai & Banat, 1997).

Abouseoud et al. 2008, utilizando Pseudomonas fluorescens, mostraram que os

melhores resultados na produção de biossurfactante e no crescimento da bactéria foram

obtidos com o fornecimento de nitrato de sódio, entre as três fontes de nitrogênio

testadas (cloreto de amônio, nitrato de amônio e nitrato de sódio). Esses autores



34

ressaltam a necessidade de controle desse nutriente para se obter altas concentrações de

biossurfactante.

2.4.2.3 – Sais e minerais

Na maioria das vezes, produtores de metabólitos de interesse industrial

produzem esses metabólitos em níveis baixos fazendo-se necessário o incremento de

nutrientes para uma maior rentabilidade do processo.

A produção de biossurfactantes é influenciada não só pelas fontes de carbono e

nitrogênio. A composição de outros nutrientes ao meio de cultura como fósforo, ferro,

manganês e magnésio também contribuem para o rendimento da síntese do metabólito

(Fontes et al., 2008).

A adição de extrato de levedura e a adição de licor de milho também exercem

influência positiva (Schmidell et al., 2001). Traços de elementos como zinco,

manganês, molibdênio, cobalto, cobre e cálcio podem ser requeridos pelos micro-

organismos na síntese dos produtos.

A carência destes minerais ocorre geralmente em níveis baixos e podem,

algumas vezes, ser suprida pela própria água ou por resquícios encontrados nos

equipamentos. Traços dos elementos acima citados podem contribuir para produção de

metabolismos tanto primários quanto secundários (Kampen, 1997).

Makkar & Cameotra (1997) reportaram que o B. subtilis aumentou a produção

do biossurfactante em diferentes concentrações de NaCl (0,01-4,0 %). Para as altas

concentrações de NaCl no meio, não houve efeito na capacidade do micro-organismo

crescer e sintetizar o biosurfactante, porém a biosíntese foi reduzida a 4,0 % de NaCl.

A concentração de ferro pode induzir como reprimir a produção de ramnolipídeo

por Pseudomona aeruginosa. De acordo com Abu-Ruwaida et al. (1991), ao reduzir a

concentração de ferro de 36 μM para 18 μM no meio, acarretou em um aumento de 3

vezes na produção de biossurfactante. Cooper et al. (1981) mostraram que para a

produção de biossurfactante utilizando o B. subtilis se faz necessária uma alta

concentração de ferro (1,3 x 10-3

M), embora, maiores concentrações de ferro não

implicou em um aumento no rendimento da produção do metabólito.



35

2.4.3 – Efeito de fatores ambientais na produção de biossurfactantes

Fatores ambientais e as condições de crescimento, também conhecidos como

operacionais, tais como o pH, a temperatura, a agitação e a disponibilidade do oxigênio

afetam também a produção de biossurfactante com seus efeitos no crescimento celular

ou na atividade (Fontes et al., 2008; Gautam & Tiagy, 2006; Desai & Banat, 1997).

a) pH

Os micro-organismos podem crescer em uma faixa de pH que varia de 2,0 para

os acidófilos até pH 11,0 para os alcalófilos e independentemente do pH que o micro-

organismo seja capaz de suportar, se faz necessário conhecer o pH ótimo para o

crescimento deste.

Os fungos têm pH ótimo em torno de 5,0, enquanto as bactérias têm pH ótimo

por volta de 7,0. Variações de 0,5 para mais ou para menos não apresentam grandes

variações no crescimento. Alguns micro-organismos modificam o pH do meio de

cultivo durante seu crescimento, tornando necessária a inclusão de soluções tampão a

fim de garantir que o pH mantenha-se dentro dos limites ótimos para crescimento e

formação do produto esperado (Franco & Landgraf, 2003).

Estudos realizados por Reiling et al. (1986) utilizando Pseudomonas sp. para a

produção de ramnolipídeos e variando a faixa de pH do meio, mostraram que a maior

produção ocorreu na faixa entre 6,0 e 6,5. Quando modificado para pH acima de 7,0; foi

verificado um decréscimo acentuado na síntese do biossurfactante. Contudo, o trabalho

publicado por Cooper e Goldemberg (1987) apresentou que a síntese de surfactina por

Bacillus sp. não era afetado ao se elevar o pH de 6,5 para 7,0.

b) Temperatura

A temperatura tem uma grande influência no crescimento dos micro-organismos.

Não é de se surpreender, uma vez que todos os processos de crescimento são

dependentes das reações químicas que são afetadas pela temperatura. Micro-organismos

podem crescer em uma ampla faixa de temperatura. Entretanto, esta variação pode ser

maior para alguns do que para outros. A temperatura na qual uma espécie de micro-

organismo cresce mais rapidamente é conhecida como temperatura ótima de

crescimento (Pelczar Júnior et al., 2009).



36

Estudos publicados por Gautam e Tyagi (2006) apresentaram que um micro-

organismo termofílico Bacillus sp. Foi capaz de produzir biossurfactante em

temperaturas acima de 40 °C. O metabólito produzido não alterou suas propriedades

surfactantes quando foi submetido à autoclave a 115 °C por 15 minutos.

c) Agitação e aeração

Uma das consequências da agitação é promover melhor aeração do meio,

favorecendo o crescimento de micro-organismos aeróbios e facultativos. Além disso, a

agitação auxilia na dispersão dos nutrientes e em sua homogeneização, favorecendo o

crescimento dos micro-organismos (Schmidell et al., 2001).

A velocidade de agitação é um parâmetro importante para otimização da

produção de biossurfactante, quando produzidos por micro-organismos aeróbios e isto

depende tanto do reator utilizado quanto do micro-organismo. O aumento na velocidade

de agitação pode diminuir a produção de biossurfactante devido ao efeito de

cisalhamento na parede celular, influindo na cinética de crescimento do micro-

organismo, ou pode aumentar a produção, junto com a aeração, devido ao aumento da

taxa de transferência de oxigênio (Schmidell et al., 2001).

Bezerra (2006) ao estudar a produção de ramnolipídeo por Pseudomonas

aeruginosa, concluiu que ao aumentar a velocidade de agitação de 200 rpm para 250

rpm, uma menor redução na tensão superficial era observada, indicando assim uma

menor quantidade de biossurfactante no caldo fermentado livre de células.

Um aumento na velocidade de agitação também resultou em um menor

rendimento na síntese de biosurfactante por Nocardia erythropolis (Margaritis et al.,

1979 apud Desai & Banat, 1997). Por outro lado, para as leveduras, a produção de

biossurfactante aumenta quando a agitação e a razão de aeração são acrescidas (Gautam

& Tiagy, 2006). Contudo, Fontes et al. (2008) apresentaram dados que ao aumentar a

razão de aeração, ocorria uma grande formação de espumas, decaindo a concentração de

biossurfactantes em 84 %.

Sheppard e Cooper (1990) citados por Prommachan (2002) concluíram que a

transferência de oxigênio foi um dos parâmetros chave para o processo de otimização

do aumento de escala (scale up) na produção de surfactina por B. subtilis.



37

2.5 – Recuperação de biossurfactante

O processo de downstream engloba 60 % dos custos na síntese do

biossurfactante (Desai & Banat, 1997). A recuperação do biossurfactante depende da

sua carga iônica, solubilidade em água e principalmente se o produto sintetizado é

intracelular, extracelular ou se faz parte da estrutura da célula (Gautam & Tyagi, 2006;

Desai & Banat, 1997).

De acordo com Sarachat et al. (2009), a maioria dos biossurfactantes pode ser

recuperada facilmente após o processo de fermentação da cultura de micro-organismos

a partir de técnicas como a precipitação, cristalização ou centrifugação. A recuperação e

concentração do biossurfactante do meio de cultura é que vão determinar a viabilidade

da produção em grande escala (Kim et al., 1997).

Geralmente a baixa concentração e a estrutura do biossurfactante limitam a

extração. Diferentes métodos são utilizados nos processos de isolamento como a

ultrafiltração, centrifugação, precipitação com ácido, base ou sal, extração por solvente

e adsorção em cromatografia.

Uma grande variedade de solventes (ex: metanol, etanol, éter etílico, acetona,

clorofórmio, diclorometano) tem sido usada na forma pura ou combinada nos processos

de extração (Kuyukina et al., 2001).

Diversas técnicas são aplicadas no isolamento desses produtos e em muitos

casos uma combinação de operações adequadas para recuperação de produtos tem sido

desenvolvida para todos os novos compostos isolados (Lobato, 2003).

Métodos convencionais para a recuperação dos biossurfactantes tais como a

precipitação ácida, extração com solvente, cristalização, precipitação com sulfato de

amônia e centrifugação (Desai & Banat, 1997) foram relatados extensamente na

literatura, bem como métodos não convencionais e interessantes de recuperação foram

relatados também em anos recentes. Alguns exemplos destas estratégias para a

recuperação do biossurfactante incluem: o fracionamento da espuma; ultrafiltração; a

adsorção-desorção em resinas de poliestireno e cromatografia de troca iônica; e

adsorção-desorção em carvão ativado. Uma das vantagens principais destes métodos é

sua habilidade de se operar em uma modalidade contínua para recuperar

biossurfactantes com o nível elevado de pureza (Mukherjee et al., 2006).



38

2.5.1 – Técnicas de recuperação de biossurfactantes

a) Precipitação

A técnica de precipitação é bastante empregada para a obtenção da massa do

biossurfactante bruto. O procedimento mais comum consiste em acidificar o caldo

isento de células, o sobrenadante, a um pH 2,0 ou 3,0, com o objetivo de reduzir a

solubilidade do metabólito por um período de 12 horas a uma temperatura de 4 °C em

geladeira. Encontra-se também na literatura metodologias que segue o mesmo

procedimento, todavia usando bases como o NaOH por exemplo, basificando-se o meio

até o pH 10,0.

Os ácidos mais usados são o HCl (Lotfabad et al., 2009; Yin et al., 2009; Raza

et al., 2007a; Dubey & Juwarkar, 2001) e o H2SO4 (Sarin & Sarin, 2008; Costa et al.,

2006). Após a precipitação, o biossurfactante encontra-se na forma bruta (Nitschke &

Pastore, 2002), o sobrenadante é descartado e o precipitado é recolhido para a

recuperação. Todavia, Mata-Sandoval et al. (1999) ao analisar também o sobrenadante

após a precipitação detectou a presença de biossurfactante ainda no meio.

b) Extração com solvente

Outro método bastante aplicado na recuperação do biossurfactante é a extração

por solvente. Após a biomassa ser separada do meio de cultivo, diferentes solventes

podem ser utilizados, entre eles, destacam-se: clorofórmio-metanol (2:1) (Pansiripat et

al., 2010; Sarin & Sarin, 2008; Costa et al., 2006); clorofórmio-etanol (2:1) (Lotfabad et

al., 2009; Pornsunthorntawee et al., 2008), acetato de etila (Yin et al., 2009); acetona

(Úbeda, 2004).

Os biossurfactantes do tipo ramnolipídeo encontram-se menos solúveis em água

pelo fato de estarem na sua forma protonada (Heyd et al., 2008), sendo o seu

rendimento aumentado após a acidificação do meio, onde acarretará a precipitação do

metabólito.

Após a precipitação do ramnolipídeo, o biossurfactante sintetizado é extraído

através do solvente (éter de petróleo, por exemplo). A remoção do solvente geralmente

ocorre em rota-evaporador a 40 °C, sendo o produto recuperado em água destilada para

ser purificado e colunas cromatográficas e em seguida cristalizado (Dubey & Juwarkar,

2001).



39

2.6 –Cinética dos processos biotecnológicos

Quando uma quantidade de células viáveis é colocada em uma solução contendo

nutrientes essenciais em condições favoráveis de pH e temperatura, as células se

adaptam ao ambiente e se multiplicam, atingindo uma fase de crescimento máximo. O

crescimento envolve consumo de material do meio, o substrato, e liberação de

metabólitos (Bastos, 2010).

Em vista, há dois aspectos claramente diferenciados que descrevem o

crescimento microbiano, um estequiométrico, no qual a concentração final do micro-

organismo obtido dependerá da concentração e composição do meio de cultivo e o outro

cinético, o qual indicará com que velocidade ocorre todo o processo.

Para estudo cinético, escolhe-se entre os produtos formados (caso o micro-

organismo produza mais de um) o de maior valor econômico, em relação aos substratos.

O processo continua até que algum substrato do meio de cultivo acabe (substrato

limitante) e cesse o crescimento do micro-organismo (Schmidell et al., 2001).

2.6.1 – Parâmetros cinéticos

Nos processos fermentativos, a partir de amostras retiradas ao longo do cultivo,

é possível visualizar os perfis de concentração celular (X), de produtos formados

(metabólitos) (P) e os substratos que compõem o meio de cultura (S) em função do

tempo (t) e determinar as taxas de transformação (Figura 2.13) (Bastos, 2010; Schmidell

et al., 2001).

A cinética possibilita uma comparação entre diferentes formas de cultivo e

através deste estudo é traçada a melhor condição de cultivo (pH, temperatura,

velocidade de agitação, taxa de aeração, entre outros.) (Schmidell et al., 2001).

Figura 2.13 – Perfis de concentração celular (X), substrato (S) e produto (P) para o cultivo em

batelada Fonte: Bastos (2010).



40

Através da Figura 2.13 abaixo, pode-se definir:

(1)

(2)

(3)

As inclinações das curvas apresentadas nos perfis definem as velocidades

instantâneas de transformação, ou seja, crescimento celular ou biomassa (rx), de

consumo de substrato (rs) e de formação de produto (rp) para um tempo t:

(4)

(5)

(6)

Os rendimentos são valores obtidos através do estudo do crescimento

microbiano e da produção de metabólitos, com estes resultados tem-se base para obter

os fatores de conversão de substrato-microrganismo e substrato-produto.

Para a relação entre o produto obtido e o substrato consumido, o rendimento

celular é definido por:

(7)

Onde X é a concentração da biomassa e S representa a concentração do

substrato.

YX/S é definido como o coeficiente global de conversão de substrato em células,

também conhecido como coeficiente de rendimento aparente ou observado. O valor

desse parâmetro varia ao longo de um cultivo, alcançando o valor máximo durante a

etapa de crescimento exponencial em cultivos descontínuos.



41

A relação entre a massa de produto formada devido à ação do micro-organismo e

a massa de substrato consumida, fornece o fator de conversão substrato-produto.

(8)

Da mesma forma, o fator de conversão YP/S, trata-se de um coeficiente global de

conversão de substrato em produto, variável durante o cultivo. Os coeficientes globais

levam em consideração o consumo total de um material para a formação de outro.

Assim, pode-se calcular os fatores de conversão ou rendimento, analisando a

variação da concentração de células, substrato e produto. O rendimento de substrato

pode ser calculado como:

(9)

Da mesma maneira, o rendimento de substrato em produto pode ser dado por:

(10)

A concentração celular varia durante um processo descontínuo, aumentando

normalmente. Geralmente, as células constituem o “catalisador” das reações

microbianas, onde o aumento da concentração celular ocasiona também uma variação

das taxas.

Resultados mais precisos são obtidos ao analisar as velocidades instantâneas em

relação à concentração celular (X). Logo, torna-se necessária a definição das

velocidades específicas de crescimento celular (x ou ), consumo de substrato (S) e de

formação de produto (p), apresentadas abaixo, essas equações foram definidas por

Gaden (Gaden, 1955 citado por Schmidell et al., 2001):

(11)

(

) (12)



42

(13)

Conforme as definições de velocidades instantâneas e velocidades específicas,

os rendimentos resultam das seguintes relações.

(14)

(15)

Embora dependam da espécie do micro-organismo, com relação a determinado

substrato, os micro-organismo não dependem somente da natureza deste; os demais

componentes do meio também exercem influência sobre tais conversões, bem como, o

tempo de mistura e a transferência de oxigênio do sistema de agitação (Schmidell et

al.,2001).

2.7 – Planejamento experimental

O planejamento experimental é uma ferramenta poderosa para estudar o efeito

conjunto de vários fatores sobre uma variável resposta de interesse. Em estudos que

envolvem processos biotecnológicos pode-se interessar pela análise de vários fatores ou

variáveis que influenciam na variável de resposta, fazendo-se necessário um

planejamento experimental para auxiliar na análise dessas variáveis.

De acordo com Barros Neto et al. (2001), no planejamento de um experimento, a

primeira coisa a fazer é determinar quais são os fatores e as respostas de interesse para o

sistema que se deseja estudar. Os fatores, que são as variáveis controladas pelo

experimentador, tanto podem ser quantitativas como qualitativas. Dependendo do

problema, poderá haver mais de uma resposta de interesse. Em alguns casos, as

respostas de interesse também podem ser qualitativas. Em seguida, é preciso definir

claramente que objetivo se pretende alcançar com os experimentos, pois isso

determinará qual o tipo de planejamento experimental que será utilizado.

A principal vantagem do uso dessa ferramenta é justamente em agrupar

variáveis, reduzindo ou o número de variáveis em estudo ou o número de níveis de



43

cada, correlacionando experimentalmente. Dessa maneira, torna-se possível reduzir

consideravelmente o número de ensaios a realizar.

2.7.1 – Planejamento fatorial

O planejamento fatorial tem sido bastante aplicado em pesquisas básicas e

tecnológicas e é classificado como um método do tipo simultâneo, onde as variáveis de

interesse que realmente apresentam influências significativas na resposta são avaliadas

ao mesmo tempo (Silva, 2008).

No planejamento fatorial faz-se necessário inicialmente especificar os valores

dos fatores que irão ser utilizados nos experimentos, conhecido como níveis. Neste tipo

de planejamento é construída uma matriz para que os diversos experimentos em todas as

possíveis combinações de níveis possam ser realizados.

O planejamento fatorial busca relacionar empiricamente as variáveis

dependentes (respostas) com as variáveis independentes (variáveis de entrada), além de

poder determinar estatisticamente o efeito de cada variável na(s) resposta(s) desejada(s)

(Barros Neto et al., 2001).

Um dos objetivos do planejamento experimental fatorial é executar o mínimo de

ensaios e determinar inicialmente as variáveis de entrada com significativa influência ou

não sobre a resposta, é necessário fazer inicialmente um planejamento fatorial de dois

níveis para cada fator. Costuma-se identificar os níveis como superior e inferior com os

sinais (+) e (-), respectivamente.

Se n fatores estão contidos no estudo, o planejamento fatorial necessitará da

realização de 2n

ensaios diferentes, cobrindo todas as combinações possíveis (Barros

Neto et al., 2001).

2.7.2 – Planejamento fatorial fracionário

Quando o número de variáveis em estudo aumenta, o experimento torna-se

custoso para seu desenvolvimento é, então, quando se utilizam outras técnicas a partir

das quais se podem realizar experimentos blocados ou fracionados a dois níveis sem

repetição, tendo em conta um grande número de fatores a estudar (Aranda et al., 2007).

Um projeto fatorial completo permite estudar os efeitos principais e todas as

interações entre os fatores controláveis. Com o aumento do número de fatores, o



44

número de interações entre eles aumenta rapidamente. No entanto, as interações de alta

ordem são difíceis de interpretar e, em geral, não são significativas. Desta forma pode-

se optar por rodar um projeto fatorial fracionado, executando apenas uma fração dos

ensaios e obtendo quase a mesma informação do projeto fatorial completo (Aranda et

al., 2007).

A técnica de planejamento fatorial fracionado 2k-p

(k é o número de fatores de

controle do experimento e p é o número de colunas inseridas na matriz experimental)

tem grande potencial de aplicação, pois com essa técnica, uma pequena quantidade de

ensaios consegue-se analisar a influência de um número grande de fatores.

Capítulo 3

Metodologia

Experimental

Capítulo 3 Metodologia Experimental

______________________________________________________________________ Márcio Silva Bezerra – Tese de Doutorado – UFRN – PPGEQ

46

3. Metodologia Experimental

Neste capítulo são descritos o micro-organismo empregado no processo, o modo de

preservação e cultivo; a fonte de carbono (manipueira) e o tratamento por ela recebido para

ser utilizada na síntese do metabólito em estudo. Ainda, a matriz do planejamento

experimental em que se basearam os experimentos com o objetivo de identificar as melhores

condições do processo para a agitação, temperatura, razão de aeração e concentração do

substrato.

São apresentadas também detalhes do processo fermentativo e as análises qualitativa e

quantitativa realizadas durante os experimentos, bem como o estudo dos parâmetros cinéticos:

biomassa, consumo de substrato e técnicas realizadas para a quantificação do produto.

A Figura 3.1 apresenta um fluxograma de blocos com o objetivo de auxiliar na leitura

para a metodologia aplicada

Figura 3.1 – Fluxograma de blocos para metodologia experimental



47

3.1 – Obtenção da manipueira

A manipueira foi coletada em uma única vez na fábrica de farinha (Casa de Farinha dos

Anjos), localizada no município de Vera Cruz/RN, sendo então armazenadas em três

bombonas plásticas estéreis de 20 L cada uma. O substrato foi levado imediatamente para a

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Laboratório de Bioprocessos no

bloco de laboratórios do curso de Engenharia de Alimentos, onde foi aquecida até a fervura

para inativação das enzimas e micro-organismos fermentativos presentes, como também, para

remoção do material sólido insolúvel. Após resfriamento em temperatura ambiente, a

manipueira foi centrifugada a 3000 rpm (2620 x g) (Marca SOLAB Modelo SL-701) por 30

minutos. O sobrenadante foi armazenado em fracos plásticos de 1,5 L a -18 ºC (Nitschke,

2004).

3.1.1 – Caracterização da manipueira

A manipueira pré-tratada foi caracterizada de acordo com o manual Standard Methods

for the Examination of Water and Wastewater, 21th

, American Public Health Associations

(2005) no Núcleo de Análises de Águas, Alimentos e Efluentes do IFRN/Câmpus Central. De

acordo com os dados fornecidos pelo laboratório, utilizou-se a técnica de absorção atômica

para cobre, ferro, manganês e zinco. Também foi verificado o pH (potenciometria), sólidos

totais (gravimentria), potássio (fotometria de chama) e fósforo total (colorimetria). Cálcio,

magnésio, nitrogênio amoniacal, nitrogênio orgânico, nitrogênio amoniacal total, nitrito foram

quantificados por titulometria.

Os açúcares redutores foram determinados pelo método de Fehling. Os não-redutores

foram hidrolisados e determinou-se novamente os açúcares redutores totais. A diferença

obtida entre os açúcares redutores após a hidrólise e a quantidade de açúcares redutores

calculados anteriormente (sem hidrólise) é expressa em açúcares não-redutores. (Gomes &

Oliveira, 2011).

3.2 – Processo fermentativo

3.2.1 – Micro-organismo

Para os ensaios utilizou-se uma cepa de Pseudomonas aeruginosa AP029-GLVIIA

isolada de poço de petróleo. Essa cepa pertencente à UFRN e a UNRN/CE guardadas na

coleção de culturas do Departamento de Antibióticos da UFPE.



48

A Pseudomona aeruginosa AP029-GVIIA foi selecionada e isolada entre os micro-

organismos produtores de biossurfactantes por apresentar maior propriedade tensoativa.

(Almeida & Macedo, 2001).

A cultura foi mantida em meio sólido inclinado em tubos de ensaio de 10 mL com

Triptone Soy Broth (TSB) 25 g/L e ágar bacteriológico (20 g/L). A renovação das células foi

realizada uma vez por mês por repique no meio e incubação a 36 ºC durante 48 horas. Após a

incubação, a cepa foi mantida em geladeira a 4 °C.

3.2.2 – Ensaios preliminares utilizando a manipueira como substrato

Para os ensaios preliminares, foi realizado um estudo com o objetivo de avaliar o

desempenho do micro-organismo no meio utilizando apenas manipueira em suas variáveis

(meio integral, meio diluído e meio diluído acrescido de sais) tendo como respostas o

crescimento celular, o consumo da fonte de carbono e a porcentagem da redução da tensão

superficial (%RTS).

Foram testados três meios utilizando manipueira como substrato, sendo eles:

Meio Manipueira 01 – Denominou-se Meio Integral (MI), o meio constituído apenas

de manipueira sem adição de sais ou diluição.

Meio Manipueira 02 – Denominou-se Meio Diluído (MD), o meio constituído apenas

de manipueira com diluição de 50 % em água destilada, sem adição de sais.

Meio Manipueira 03 – Denominou-se Meio Diluído com Adição de Sais (MDS), o

meio constituído de manipueira e diluído 50 % em água destilada, com adição de 1,0 mL de

solução de estoque de sais (0,01g/100mL de EDTA, 0,3g/100mL de MnSO4.H2O,

0,01g/100mL de FeSO4.7H2O, 0,01g/100mL de CaCl2, 0,01g/100mL de CoCl2.6H2O e

0,01g/100mL de ZnSO4.7H2O) (Bezerra, 2006).

3.2.3 – Propagação das células para a obtenção do inóculo

Foram realizadas três cinéticas de cultivo até alcançar redução da tensão superficial

constante.

Cultivo 01 – Neste cultivo, o meio MI foi descongelado, homogeneizado e 1,0 L foi

distribuído em sete frascos Erlenmeyers de 250 mL, onde cada frasco recebeu 100 mL do

meio, lacrados com rodilhões de algodão e gaze.



49

Cultivo 02 – Para este cultivo, a manipueira foi descongelada, retirou-se 500 mL e

adicionou-se 500 mL de água destilada, homogeneizou-se por inversão, obtendo-se assim o

meio MD. O meio foi distribuído em sete frascos Erlenmeyers de 250 mL, onde cada frasco

recebeu 100 mL do meio, lacrados com rodilhões de algodão e gaze.

Cultivo 03 – Neste cultivo foram utilizados a manipueira descongelada e diluída (500

mL de manipueira e 500 mL de Água destilada), adicionando 1mL da solução estoque de sais,

homogeneizou-se por inversão, obtendo-se o meio MDS. O meio foi distribuído em sete

frascos Erlenmeyers de 250 mL, contendo 100 mL do meio e lacrados com rodilhões de

algodão e gaze.

Os frascos de cada cultivo foram levados à autoclave para esterilização (131 °C, 20

minutos, 1 kgf). Após esfriamento em temperatura ambiente, os frascos Erlenmeyers

seguiram para a câmara de fluxo laminar onde três alçadas de células oriundas do meio de

manutenção foram transferidas assepticamente para os frascos contendo o meio (MI, MD ou

MDS). Os frascos foram colocados em incubador rotatório (Nova Técnica Modelo NT-714) a

35 ºC, por 24 horas, sob agitação de 200 rpm.

A cada 4 horas de cultivo, um frasco foi retirado para análises de crescimento celular,

consumo de substrato e redução da tensão superficial até completar 24 horas. Esta cinética foi

realizada para obtenção da velocidade máxima específica de crescimento μmax.

3.3 – Planejamento fatorial

Neste estudo, utilizou-se um projeto fatorial fracionado 24-1

, onde os fatores analisados

foram agitação, temperatura, razão de aeração e meio de cultivo. O projeto fatorial completo

24 que envolveria dezesseis ensaios ficou reduzido a oito ensaios com a aplicação desse

método.

O planejamento fracionário 24-1

é construído da seguinte forma, primeiro se constrói

um planejamento fatorial completo 23 para os fatores 1, 2 e 3. Para o fator 4 será atribuído o

produto dos sinais obtido pela interação das colunas 1, 2 e 3. A Tabela 3.1 apresenta a matriz

do planejamento fatorial 24-1

com duplicata no ponto central. Os ensaios foram realizados

obedecendo à aleatoriedade (Barros Neto et al., 2001).



50

Tabela 3.1 – Matriz do planejamento fatorial 24-1

com duplicata no ponto central.

Ensaios

Fatores 1 2 3 4

Ordem de

execução

1 - - - - 1º

2 + - - + 8º

3 - + - + 6º

4 + + - - 7º

5 - - + + 3º

6 + - + - 4º

7 - + + - 2º

8 + + + + 5º

9 0 0 0 0 9º

10 0 0 0 0 10º

Foi avaliada a influência dos seguintes fatores: velocidade de agitação (100 e 200

rpm), temperatura, razão de aeração (0,4 e 0,8) e concentração de substrato (meio integral e

meio diluído). A razão de aeração é definida como a razão entre o volume de meio de cultivo

e o volume do frasco (Vm/Vf).

A análise do planejamento foi efetuada com o auxílio do programa Statistica 8.0. A

Tabela 3.2 apresenta as variáveis (fatores) com os níveis estudados, onde esses níveis foram

escolhidos a partir de dados da literatura e de ensaios preliminares realizados.

Tabela 3.2 – Fatores e níveis para o planejamento fatorial 24-1

com duplicata no ponto central

Variáveis Níveis

(-1) (0) (1)

Agitação (rpm) 100 150 200

Temperatura (ºC) 30 35 40

Razão de Aeração (RA) 0,4 0,6 0,8

Meio de Cultivo (%) 50 75 100

3.4 – Procedimento para o cultivo

Frascos Erlenmeyers com capacidade para 250 mL, contendo quantidade variada do

meio de cultura (90 mL, 135 mL, 180 mL), foram lacrados, esterilizados a 131 ºC por 15

minutos sendo, em seguida, submetidos à temperatura ambiente até atingir 40 °C. Na câmara

de fluxo laminar, estes frascos foram inoculados com 10 % v/v do inóculo (MDS). Após a

inoculação, os frascos foram levados ao incubador rotativo em diferentes condições, conforme

matriz do planejamento fatorial, sendo suas variáveis de estudo: meio manipueira; velocidade

de agitação e razão de aeração.



51

Em intervalos regulares, a cada 4 horas nas 12 primeiras horas de cultivo, passando a

ser coletada a cada 12 horas até 132 horas de cultivo, amostras foram retiradas e centrifugadas

para acompanhamento de pH, concentração de biomassa, concentração de substrato, variação

da tensão superficial, índice de emulsificação (E24) do último ponto analisado para querosene

comercial, diluição micelar crítica (DCM-1

e DCM-2

) e extração do biossurfactante bruto.

O caldo produzido, após centrifugação, para cada ponto foi armazenado em coletores

universais e congelados a -18 ºC.

3.5 – Análises

3.5.1 – Contagem de micro-organismo

Durante o cultivo, a cada quatro horas uma amostra era retirada para a contagem de

células, essa contagem foi realizada através da contagem em placas passando previamente

pelo método das diluições seriadas. De acordo com Vermelho et al. (2006), esse método é o

principal para a contagem de células viáveis.

A partir de uma amostra recolhida, 1 mL é adicionado a 9 mL de solução salina estéril

em sequência, obtendo-se diluições 10-1

, 10-2

, 10-3

e 10-4

. Para cada diluição, foram utilizadas

duas placas, onde cada placa recebeu 1mL da amostra ou diluições em superfície em meio

PCA (Plate Count Agar) previamente esterilizado em autoclave e distribuído assepticamente

em placas de petri estéreis.

As placas foram levadas para estufa bacteriológica a 36 ºC por 3 a 5 dias. Em seguida,

foi realizada a contagem na placa utilizando o contador de colônia (QUIMIS – Q295B),

multiplicando o número encontrado por seu fator de diluição.

3.5.2 – Determinação da concentração celular

O método utilizado para quantificar a concentração celular foi o de massa seca (ou

peso seco). Este método consiste em separar as células do meio, secá-las e pesá-las (Bezerra

2006; Lobato, 2003). As amostras retiradas do shaker foram centrifugadas em tubos

Eppendorfs de 2,0 mL a 16.464 x g (Nova Técnica – NT800) por 10 minutos. Os tubos

Eppendorfs vazios eram previamente colocados em estufa (BIOPAR) a 70 °C por 24 horas até

obter peso constante.



52

Depois da centrifugação, o sobrenadante foi recolhido para outras análises. Nos tubos

com a massa úmida foram adicionados 2,0 mL de água destilada para a lavagem e retirada de

outros componentes solúveis ainda presentes. Após a segunda lavagem, as amostras foram

colocadas na estufa a 70 °C por 24 horas. Corrido este tempo, os Eppendorfs foram colocados

em dessecadores por 5 minutos e pesados. Cada ponto foi realizado em duplicata e o valor

médio obtido considerado para os cálculos.

A quantidade de biomassa (g/L), mseca, foi expressa pela seguinte equação:

( )

(16)

Onde:

T1 = Tubo com biomassa

T2 = Tubo vazio

3.5.3 – Determinação da concentração de substrato

Na determinação da concentração de substrato utilizou-se o método do DNS (Miller,

1959). O método do DNS baseia-se na redução do ácido 3,5 dinitro-salicílico a ácido 3-

amino-5- nitrosalicílico, ao mesmo tempo em que o grupo aldeído do açúcar é oxidado a

grupo carboxílico com o desenvolvimento de coloração avermelhada, medida

espectofotometricamente em 600 nm (Zanin et al.,1998).

No procedimento utilizou-se uma curva padrão de (glicose) principais produtos da

hidrólise do amido.

Em um balão volumétrico de 25 ou 50 mL, adicionou-se 1,0 mL da amostra, 0,5 mL

de HCl e 6,0 mL de água. A solução foi então aquecida a 70 ºC por 10 minutos, resfriada com

água corrente e neutralizada com solução de NaOH 4,0 M, utilizando-se duas gotas de

fenolftaleína como indicador. O balão foi completado com água destilada.

Após a hidrólise, tomou-se 0,5 mL desta amostra; 2,5 mL do reagente DNS foram

adicionados e os tubos levados para o banho termostático à 100 ºC por 10 minutos. Em

seguida, os tubos de ensaio foram deixados em água gelada por 3-5 minutos. Na sequência,

3,0 mL de água destilada foi adicionada, a solução foi agitada no vórtex e a absorbância a 600

nm foi medida.

Utilizou-se como branco uma amostra com 0,5 mL de água destilada no lugar de 0,5

mL da amostra hidrolisada. O valor obtido foi multiplicado pelo fator de diluição, neste caso

25 ou 50, dependendo do balão volumétrico utilizado.



53

Uma curva de calibração foi construída, correlacionando a concentração de glicose

com a leitura da absorbância.

3.5.4 – Determinação da tensão superficial

A medida da tensão superficial é uma ferramenta comum e um método indireto para

monitorar a produção de biossurfactantes. À medida que o micro-organismo cresce, ele

sintetiza o biossurfactante e este metabólito é lançado ao caldo, reduzindo a tensão superficial.

A tensão superficial foi medida no tensiômetro modelo alemão Kruss (K-6), que

utiliza o método do anel. As análises foram realizadas com o sobrenadante obtido após a

centrifugação da amostra bruta, a uma temperatura de aproximadamente 25 ºC. A cada início

das análises, o anel foi esterilizado em bico de Bunsen e calibrado verificando a tensão

superficial da água destilada, cujo valor é de aproximadamente 72,8 mN/m.

Foram realizadas três medidas para cada ponto em estudo, sendo considerada a média

aritmética dos resultados.

3.5.5 – Estudos de estabilidade

Após traçar as curvas representativas para as medidas de tensão superficial para o

sobrenadante e comparado os melhores resultados, os pontos que apresentaram os menores

índices de tensão superficial foram levados a testes de estabilidade de pH, temperatura e

salinidade.

3.5.5.1 – Estabilidade de pH

O pH do meio foi ajustado para diferentes valores de pH (2, 5, 8 e 10), utilizando a

base NaOH (1 M) e o ácido HCl (1 M). Após 30 minutos, verificou a tensão superficial

conforme descrito 3.6.4 (Nitschke, 2004).

3.5.5.2 – Estabilidade de temperatura

O sobrenadante foi aquecido a 50, 60 e 70 ºC por 24h em estufa, esperou-se esfriar em

temperatura ambiente e verificou-se a tensão superficial pelo método do anel.

3.5.5.3 – Estabilidade de salinidade

O efeito da salinidade foi determinado variando a concentração de NaCl para 1, 5 e 10

% (p/v). As amostras permaneceram em repouso por 3 horas, verificando-se a tensão

superficial em seguida (metodologia descrita em 3.6.4).



54

3.5.6 – Determinação da diluição micelar crítica (DMC-1

e DMC-2

)

A concentração do biossurfactante produzido pode ser medida indiretamente através

da diluição micelar crítica (DMC). Quanto menores os valores de DMC, maior a diluição

necessária para causar mudança significativa na tensão superficial, portanto é maior a

concentração de biossurfactante no meio.

Nesse caso, o sobrenadante é diluído em água destilada por 10 vezes (DMC-1

) e 100

vezes (DMC-2

) (Nitschke et al., 2004), determinando-se, em seguida, a tensão superficial

conforme método apresentado anteriormente em 3.6.4.

3.5.7 – Determinação do pH

O acompanhamento do potencial hidrogeniônico (pH) foi verificado ao longo de toda

a fermentação utilizando-se o potenciômetro HANNA INSTRUMENTS HI 221.

3.5.8 – Determinação do índice de emulsificação

A capacidade dos biossurfactantes, para emulsificar hidrocarbonetos, foi avaliada pelo

índice de emulsificação do sobrenadante da amostra final do processo fermentativo. Este

índice foi determinado de acordo com o método de Wei et al.(2005). Neste caso, 2,0 mL do

sobrenadante foi adicionado em um tubo contendo 2,0 mL de querosene comercial. A mistura

foi agitada em vórtex por 2 minutos e permaneceu em repouso por 24 horas.

O índice de emulsificação foi obtido pela seguinte relação:

(17)

Onde:

E24 = índice de emulsificação após 24h (%),

Hemulsão = Altura da emulsão

Ht = Altura total

Com o objetivo de avaliar a estabilidade por um tempo maior para a emulsão formada,

o índice de emulsificação também foi verificado para o tempo de 48 e 72 horas para cada

ensaio.



55

3.5.9 – Extração do biossurfactante bruto

3.5.9.1 – Precipitação ácida

Para esta análise, retirou-se 10 mL do sobrenadante centrifugado de cada ponto da

cinética e acidificou com HCl 6,0 N até alcança pH 2,0. Em seguida transferiu-se 2 mL para

tubos ependorffs (amostras feitas em duplicatas) acondicionando-as em geladeira por 12 horas

a temperatura de 4 ºC. Após 12 horas (overnight), foram centrifugadas a 14000 rpm (16.464 x

g) por 20 minutos, o sobrenadante foi extraído e medido a tensão superficial.

Os tubos com a massa precipitada seguiram para a estufa a 50 ºC por 24 horas. Os

pellets foram obtidos e suspendido em 2 mL de água e também armazenado.

3.5.9.2 – Extração por solvente

Para esta etapa, utilizou-se a extração com o éter de petróleo, visando extrair o

biossurfactante através de sua porção lipídica.

Após a precipitação ácida (3.6.8), o sobrenadante obtido, armazenado em coletor

universal estéril, foi colocado em um funil de separação onde foi adicionado 20 mL de éter de

petróleo (1:1 v/v) para a extração do metabólito sintetizado.

Agitou-se o funil de separação por 20 segundos, passando a ficar em repouso por 30

minutos para a separação das fases. Este procedimento foi repetido três vezes para garantir a

máxima extração do biotensoativo.

A cada ciclo de 30 minutos, o éter de petróleo contendo o biossurfactante era estocado

em um béquer para posterior concentração do biossurfactante para a realização das análises

colorimétricas de quantificação.

3.5.10 – Quantificação do biossurfactante

O biossurfactante obtido da fase orgânica foi levado ao rotaevaporador (R 215 –

Buchi) para ser concentrado a uma temperatura de 40 ºC. O concentrado obtido foi

ressuspenso em 20 mL de água destilada e guardado sob refrigeração. (Costa et al., 2006;

Rashedi et al., 2005; Mata-Sandoval et al., 1999; Patel & Desai, 1997).

O concentrado ressuspendido seguiu para as próximas análises. De acordo com Heyd

et al. (2008), os métodos colorimétricos são os mais utilizados para a quantificação dos

ramnolipídeos. O método consiste na reação entre a molécula de ramnose e o colorante

presente. Entre os métodos colorimétricos para a quantificação dos ramnolipídeos em termos



56

de ramnose destacam-se o método do orcinol, o método fenol-sulfúrico e o método que utiliza

o ácido tioglicólico em sua composição.

3.5.10.1 – Método do orcinol

O método do orcinol (Chandrasekaran e Bemiller, 1980) é utilizado para avaliar

diretamente a quantidade de glicolipídeo na amostra. Uma amostra de 333 L do

sobrenadante é primeiramente extraída com 1 mL de dietil-éter, essa operação é repetida por

mais duas vezes. As frações de éter são reunidas em um pequeno tubo de ensaio e evaporadas

em temperatura ambiente. Adiciona-se em seguida 1 mL de água destilada. Para cada 100 L

de amostra, adiciona-se 900 L de uma solução contendo 0,19% orcinol (em 53% (v/v)

H2SO4). As amostras são aquecidas a 80ºC por 30 minutos e depois são esfriadas a

temperatura ambiente (tempo de aproximadamente 15 min). Em seguida as amostradas são

levadas ao espectrofotômetro a 421 nm.

As concentrações de ramnolipídeo foram calculadas a partir dos dados com os obtidos

através de uma curva de calibração com os padrões ramnose entre 0,1 e 1 g/L.

3.5.10.2 – Método do fenol-sulfúrico

A quantificação indireta de ramnolipídeos também pode ser realizada pela medida de

açúcares totais pelo método de DUBOIS et al. (1956). A metodologia consiste na adição de

0,5 mL do caldo livre de células em tubo de ensaio de vidro de 20 mL, seguido da adição de

0,5 mL de solução de fenol 5% (m/v). Acrescenta-se 2,5 mL de ácido sulfúrico concentrado.

A mistura é então homogeneizada em um vórtex por 1 minuto e deixada em repouso por 15

minutos. Após esse período, faz-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 480 nm.

A medida deve ser lida utilizando a água destilada (branco reacional).

A curva de ramnose foi construída utilizando-se uma solução estoque de ramnose

padrão com 1 g/L em água destilada. A partir desta solução foram preparadas diversas

diluições correspondentes as concentrações (g/L) para a construção da curva de calibração.

3.5.10.3 – Método do ácido tioglicólico

O método tioglicólico expressa em ramnose o biossurfactante (ramnolipídeo)

sintetizado. O método consiste em adicionar 4,5 mL de ácido sulfúrico diluído (6:1) ao

sobrenadante, agitando vigorosamente por 1 minuto em vórtex. A mistura é aquecida a 100 °C

por 10 minutos e esfriada a temperatura ambiente. Depois de esfriada a temperatura ambiente,

adiciona-se 0,1 mL de solução de ácido tioglicólico 3 % recém preparada à mistura, agita-se

novamente em vórtex por mais 1 minuto. A mistura deve ser guardada em um local sobre



57

ausência de luz por 3 horas. Absorbância deve ser medida em 2 comprimentos de onda, a 400

e 430 nm utilizando-se o espectofotômetro (Rahman et al., 2002).

A concentração de ramnose é determinada a partir da diferença entre os dois

comprimentos de onda (400 e 430 nm) usando-se curva de calibração, previamente

determinada com ramnose comercial. A diferença é realizada porque o valor de absorbância

obtido na leitura de 430 nm indica a interferência de outros açúcares. As medidas devem ser

feitas em triplicatas e considerar à média entre elas. O valor obtido é multiplicado pelo fator

3,4, esse relaciona o ramnolipídeo em termos de ramnose, segundo Raza et al. (2007).

Capítulo 4

Resultados e

Discussão

Capítulo 4 Resultados e discussão


65

4. Resultados e discussão

Na presente tese utiliza-se a manipueira, resíduo agroindustrial de baixo custo e

renovável na síntese de biossurfactantes. Nesse capítulo, apresenta-se e discute-se a

caracterização da manipueira, avalia-se a melhor concentração da fonte carbono, bem como o

tempo ótimo para a síntese do metabólito. Avaliam-se as condições operacionais para melhor

produção do biossurfactante usando-se planejamentos fatoriais como ferramentas. Um estudo

cinético é apresentado, enfatizando o comportamento do micro-organismo sob as diferentes

condições de cultivos. Avalia-se a concentração do biossurfactante através da Diluição

Micelar Crítica (DMC). Por fim, um estudo sobre o poder bioemulsificante (E24) do

metabólito é apresentado como também a estabilidade do biossurfactante produzido em

relação ao pH, temperatura e salinidade.

Os resultados são apresentados em oito tópicos:

4.1 – Caracterização da manipueira

4.2 – Avaliação da concentração inicial de substrato e do tempo ótimo para a

inoculação

4.3 – Avalição da influência das condições operacionais de cultivo

4.4 – Estudo cinético para a Pseudomona aeruginosa AP029-GVIIA em manipueira

como substrato

4.5 – Quantificação do biossurfactante sintetizado

4.6 – Avaliação da diluição micelar crítica (DMC)

4.7 – Avaliação do índice de emulsificação (E24)

4.8 – Análise da estabilidade do biossurfactante em relação à variação de pH,

temperatura e salinidade.



66

4.1 – Caracterização da manipueira

A manipueira foi caracterizada no Núcleo de Análises de Águas, Alimentos e

Efluentes do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte

(IFRN), Câmpus Natal Central (tópico 3.2.1). A Tabela 4.1 mostra os resultados da

caracterização do efluente utilizado como substrato nos ensaios bem como a composição de

diferentes manipueiras existentes na literatura.

Tabela 4.1 – Composição da Manipueira

Variáveis Concentraçãoa

Concentração1

Concentração2

Concentração3

Sólidos Totais (g/L) 26,92 * * 45,02 Açúcares totais (g/L) 48,20 35,3 56,4 47,07 Açúcares redutores

(g/L) 16,25 12,8 * 0,35

Açúcares não-

redutores (g/L) 31,67 22,2 * 47,03

Nitrogênio total

(g/L) 1,68 2,5 * 0,21

Fósforo (mg/L) 210 225,9 900 643 Potássio (mg/L) 5.450,00 2.665,1 3.600,00 49 Cálcio (mg/L) 244,80 272,5 * 352,00

Magnésio (mg/L) 718,18 519,0 500,00 8,12 Enxofre (mg/L) 154,00 104,0 * *

Ferro (mg/L) 2,07 7,8 6,1 ND Zinco (mg/L) 2,80 7,3 11,1 *

Manganês (mg/L) 0,89 1,8 4,1 0,16 Cobre (mg/L) 0,69 0,6 14,1 *

pH 6,21 5,9 * 4,56 aEsse trabalho;

1Fonte: Nitschke & Pastore (2006).

2Fonte: Costa et al. (2009).

3Fonte: Rossmann (2008).

*Análise não realizada.

Conforme se observa na Tabela 4.1, existem diferenças significativas ao se comparar

os resultados obtidos pela caracterização da manipueira utilizada no presente trabalho com os

dados encontrados na literatura. Essa variação pode ocorrer devido ao clima, o solo ou estação

do ano, além dos diversos tipos de mandiocas encontrados na natureza, alterando as

propriedades físico-químicas do tubérculo e modificando a composição da fonte de carbono,

podendo influenciar positivamente ou negativamente na síntese do metabólito.

Entre as variáveis, algumas merecem destaques, entre elas a fonte de carbono e

nitrogênio. A razão Carbono-Nitrogênio (C/N) é um fator que pode influenciar a síntese do

biossurfactante. Wu e colaboradores (2008) descrevem que a produção de ramnolipídeos por

Pseudomonas aeruginosa é baixa quando a razão Carbono-Nitrogênio é alta. Trabalhos

apresentados por Benincasa et al. (2002) e Davis et al. (1999) mencionam que a produção é

mais eficiente em condições limitantes de nitrogênio e ainda expõem que o provável efeito de



67

inibição, para elevadas razões, se deve a possível deficiência de transporte de nutrientes para a

célula.

A partir dos dados obtidos foram calculadas as razões Carbono-Nitrogênio (C/N),

Carbono-Ferro (C/F) e Carbono-Fósforo (C/P). Sabendo-se que o peso molecular da glicose é

180u e que o Carbono representa 40 % do peso molecular (72u), com os valores obtidos na

caracterização e apresentados na Tabela 4.1, 40 % dos açúcares totais (48,20 g/L)

correspondem a 19,28 g/L para a concentração de Carbono presente. Assim, pode-se calcular

a razão C/N, onde a concentração do Nitrogênio foi de 1,68 g/L.

O valor para a razão Carbono-Nitrogênio utilizado nesse trabalho, após a

caracterização do efluente, foi de 11,5. Wu et al. (2008) utilizando cepa selvagem de

Pseudomonas aeruginosa realizaram experimentos empregando glicose e glicerol como fonte

de carbono e NaNO3 como fonte de nitrogênio. Nesse estudo, diversas razões (C/N) foram

avaliadas, obtendo-se maior produtividade de ramnolipídeos para razões (C/N) de 26 e 52.

Contudo, a síntese do biossurfactante também foi observada para razões mais baixas, de 6,5 e

13. Um decréscimo acentuado de rendimento e produtividade foi apresentado para valores de

razão (C/N) acima de 130.

Guerra-Santos et al. (1984) sintetizaram ramnolipídeos utilizando glicose como fonte

de carbono e amônio e nitrato como fonte de nitrogênio. A produção atingiu o ponto ótimo

quando a razão entre a fonte de carbono (glicose) e a fonte de nitrogênio (nitrato) foi igual a

18.

Guerra-Santos et al. (1984) também avaliaram a influência da razão Carbono-Ferro

(C/Fe) na síntese de ramnolipídeos e destacaram que o Fe teve considerável influência na

produção por Pseudomonas aeruginosa. Altas concentrações de Fe contribuíram

negativamente para a síntese do metabólito. Após testes com várias concentrações, encontrou-

se uma razão ótima (C/Fe) de 72.400 onde à medida que decrescia a razão, a concentração de

biossurfactante no meio também era diminuída. Pode-se observar na Tabela 4.1, que a

concentração de Fe no substrato é de 2,07 mg/L. No meio em estudo houve um acréscimo de

Fe através dos traços de sais (0,1 mg/L) durante o preparo, elevando a concentração de Fe

para 2,17 mg/L.

Calculando a razão C/Fe para esse trabalho, onde a concentração de Carbono é de

19,28 g/L (19.200 mg/L) obtém-se uma razão C/Fe de aproximadamente 8.848; valor menor

que o apresentado por Guerra-Santos e colaboradores.



68

Para a razão Carbono-Fósforo (C/P) o presente trabalho apresenta o valor de 91,8.

Estudos realizados por Guerra-Santos e colaboradores (1984), variando a razão (C/P) de 10 a

32, mostraram que a biomassa não teve grandes alterações no estudo das variadas razões.

Todavia, a produção do metabólito obteve a sua máxima produção para a razão de 16. Em

maiores razões (C/P) houve um pequeno decréscimo na síntese do biossurfactante. Ainda

nesse estudo, os pesquisadores chegaram à conclusão que a Pseudomonas aeruginosa

aparentemente requer uma concentração a mais de fosfato para alcançar um maior rendimento

de biossurfactante no meio.

A manipueira empregada nesse trabalho apresenta nutrientes em sua composição que

são fundamentais no processo fermentativo para a obtenção do biossurfactante.

4.2 – Avaliação da concentração inicial de substrato e do tempo ótimo para

a inoculação

Para o estudo dos ensaios iniciais foram testados três meios utilizando manipueira

como substrato: Meio Integral (MI), Meio Diluído (MD) em água destilada (1:1) e Meio

Diluído com Sais (MDS), conforme descritos no item 3.3.

Os ensaios realizados objetivaram estudar os parâmetros para o crescimento celular

(biomassa), consumo de substrato e tensão superficial para encontrar o tempo ótimo

necessário de inóculo do meio, garantindo a redução do tempo da fase lag para os próximos

experimentos. Os ensaios ocorreram nas mesmas condições de cultivo, 35 °C e 200 rpm,

variando-se a concentração da fonte de carbono (Manipueira) do meio em estudo. A Tabela

4.2 apresenta os resultados obtidos em relação à biomassa (X), consumo de substrato (S) e

Tensão Superficial (TS) em função do tempo.



69

Tabela 4.2 – Resultados para biomassa (X), substrato (S) e tensão superficial (TS) dos meios MI, MD

e MDS.

(t)

Meios

MI MD MDS

X

(g/L)

S

(g/L)

TS

(mN/m)

X

(g/L)

S

(g/L)

TS

(mN/m)

X

(g/L)

S

(g/L)

TS

(mN/m)

0h 0,25

(±0,013)

47,39

(±0,61)

50,29

(±0,58)

0,00

(±0,000)

19,22

(±0,18)

47,84

(±1,00)

0,25

(±0,013)

20,40

(±0,18)

45,91

(±0,58)

4h 0,50

(±0,025)

45,42

(±0,06)

49,94

(±0,58)

0,00

(±0,000)

15,19

(±0,12)

51,65

(±0,58)

0,50

(±0,025)

23,61

(±1,94)

46,89

(±0,58)

8h 0,75

(±0,038)

43,28

(±0,48)

48,87

(±1,00)

0,25

(±0,012)

10,31

(±0,06)

50,96

(±0,00)

0,25

(±0,013)

14,75

(±0,06)

40,33

(±0,58)

12h 1,50

(±0,075)

43,36

(±0,18)

48,20

(±0,58)

0,75

(±0,038)

11,92

(±0,33)

43,75

(±0,58)

0,50

(±0,025)

10,94

(±0,00)

37,25

(±0,58)

16h 2,50

(±0,125)

43,36

(±0,03)

48,53

(±0,58)

1,50

(±0,075)

9,78

(±0,09)

40,67

(±0,58)

1,75

(±0,088)

7,00

(±0,00)

36,40

(±0,00)

20h 3,00

(±0,150)

37,20

(±0,03)

48,19

(±0,58)

1,00

(±0,050)

5,93

(±0,15)

36,40

(±0,00)

2,50

(±0,125)

2,84

(±0,09)

32,24

(±0,58)

24h 3,75

(±0,188)

31,55

(±0,33)

43,21

(±0,58)

1,25

(±0,063)

4,00

(±0,18)

35,87

(±0,00)

2,75

(±0,138)

5,24

(±0,21)

30,76

(±0,00)

MI – Meio Integral; MD – Meio Diluído; MDS – Meio Diluído com Sais; (t) – tempo; X – biomassa; S –

Substrato; TS – Tensão Superficial.

Todos os ensaios apresentaram redução da tensão superficial, confirmando a presença

do biossurfactante. O metabólito, medido indiretamente através da redução da tensão

superficial, deu indícios de ser parcialmente associado ao crescimento, pois após o consumo

do substrato e a biomassa ter atingido a fase estacionária de crescimento, a síntese continuou

sendo realizada, podendo ser evidenciada indiretamente através da redução da tensão

superficial. As Figuras 4.1; 4.2 e 4.3 apresentam as curvas desses ensaios.

Percebe-se, através da Figura 4.1, que o MI mostrou-se favorável para o aumento da

biomassa, atingido 3,75 g/L (±0,188) para 24 horas de cultivo. Nota-se que esse aumento

celular é crescente, não apresentando fase lag para a biomassa. Observa-se que após 24 horas

ainda existe uma alta quantidade de fonte de carbono no meio, 31,55 g/L (±0,33). O consumo

da fonte de carbono foi de apenas 33,4 %, acontecendo neste momento maior redução da

tensão superficial, de 50,29 mN/m (±0,58) (ponto 0 horas) para 43,21 mN/m (±0,58) (ponto

24 horas), causando uma redução de 15,0%.



70

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

Su

bstr

ato

(g

/L)

Ten

são

(m

N/m

)

Tensão

0 4 8 12 16 20 24

30

32

34

36

38

40

42

44

46

48

50

Tempo (h)

Substrato

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Células

Co

nc

en

traç

ão

Celu

lar

(g/L

)

Figura 4.1 – Curvas cinéticas para o meio MI

O ensaio realizado para o meio MD, mostrado através da Figura 4.2, mostrou a

existência de uma fase lag que durou até aproximadamente 4 horas de cultivo. Após esse

tempo, observou-se a fase de crescimento exponencial que durou até o ponto de 16 horas. À

medida que o micro-organismo consome o substrato, há aumento da biomassa e a síntese do

biossurfactante. Todavia, a maior redução da tensão superficial ocorre quando é atingida a

fase estacionária do crescimento celular;1,5 g/L (±0,075), após 16 horas de cultivo.

36

40

44

48

52

Su

bstr

ato

(g

/L)

Ten

são

(m

N/m

)

Tensão

0 4 8 12 16 20 24

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Tempo (h)

Substrato

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Células

Co

nc

en

traç

ão

Celu

lar

(g/L

)

Figura 4.2 – Curvas cinéticas para o meio MD

A síntese do metabólito ocorreu após atingir praticamente o esgotamento do

substrato (Figura 4.2), partindo de 19,22 g/L (±0,18) no ponto zero (0 horas) para 4,0 g/L

(±0,18) após 24 horas de cultivo, um consumo de aproximadamente 80 %, mostrando que a

manipueira, após diluição, é um substrato bastante assimilável pelo micro-organismo.



71

Observa-se ainda na Figura 4.2 que ocorre uma redução de 25 % da tensão superficial, que

atinge o valor de 35,87 mN/m em 24 horas de cultivo, resultado superior ao ensaio

apresentado com Meio Integral.

A fim de se investigar a influência de adição de sais, preparou-se o meio MDS. A

Figura 4.3 ilustra o perfil de consumo de substrato, da concentração celular e da redução da

tensão superficial em função do tempo de cultivo. Observa-se que o meio MDS utilizado

apresentou maior tempo para a fase lag do micro-organismo, de aproximadamente 12 horas

de cultivo como pode ser verificado através da Figura 4.3. O meio mostrou-se mais eficiente

na síntese do biossurfactante, uma vez que houve uma redução na tensão superficial de 33 %

após 24 horas de cultivo, alcançando uma tensão superficial de 30,76 mN/m. O consumo do

substrato ultrapassou os 76 %, resultado semelhante ao encontrado para o meio MD.

28

32

36

40

44

48

Su

bstr

ato

(g

/L)

Ten

são

(m

N/m

)

Tensão

0 4 8 12 16 20 24 28

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Tempo (h)

Substrato

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2,8

3,2

Células

Co

nc

en

traç

ão

Celu

lar

(g/L

)

Figura 4.3 – Curvas cinéticas para o meio MDS

No presente trabalho foi possível obter valores da tensão superficial após 24 horas

variando de 43,21 mN/m (±0,58) para o meio MI até 30,76 mN/m para o meio MDS. Batista

et al. (2006) destacam que para ser considerado um bom biossurfactante, o mesmo deve

reduzir a tensão do meio para uma tensão menor ou igual a 40 mN/m. Dessa forma, observa-

se que essa condição foi atingida ao se utilizar o meio MD e MDS. A partir dos resultados

para os ensaios preliminares, acordou-se de que os demais ensaios seriam inoculados com 10

% (v/v) do meio MDS, pois esse atingiu valores ainda menores para a Tensão Superficial

Mínima (TSmín).



72

Com o propósito de quantificar a biomassa inicial para o inóculo, efetuou-se a

quantificação utilizando-se o método de contagem em placas, de acordo com o item 3.6.1; os

valores encontrados ficaram na ordem de 106 a 10

8 ufc para o tempo de 16 horas de cultivo.

Esses valores estão de acordo com o encontrado na literatura (Nitschke & Pastore, 2006;

Sandrin et al., 2000).

4.3 – Avalição da influência das condições operacionais de cultivo

Para avaliar a influência das condições de cultivo (variáveis de processo) na síntese do

biossurfactante efetuou-se um planejamento fatorial fracionado, do tipo fração meia. Foram

realizados 10 ensaios em shaker, avaliando-se os seguintes fatores: agitação (100, 150 e 200

rpm), temperatura (30, 35 e 40 ºC), razão de aeração (0,4; 0,6 e 0,8) e concentração da fonte

de carbono (diluído 50 % em água destilada, diluído 25 % e sem diluição (SD)) com o

objetivo de examinar a influência destas diferentes condições na produção de biossurfactante.

A Tabela 4.3 apresenta as condições desses ensaios.

Tabela 4.3 – Condições dos ensaios realizados

Ensaios

Condições

Agitação

(RPM)

(1)

Temperatura

(ºC)

(2)

RA

(3)

Meio

(%)

(4)

RTS

(%)

1 100 30 0,4 50 31,03

2 100 30 0,8 SD**

28,96

3 100 40 0,8 50 18,14

4 100 40 0,4 SD 4,65

5 200 30 0,8 50 22,31

6 200 30 0,4 SD 30,08

7 200 40 0,4 50 6,28

8 200 40 0,8 SD 6,23

9*

150 35 0,6 25 25,75

10*

150 35 0,6 25 25,50

*Ensaios 9 e 10 – Pontos centrais. **SD – Sem diluição.

Utilizando o programa Statistica 8.0, o Diagrama de Pareto (Figura 4.4) mostra os

contrastes significativos sobre a síntese do biossurfactante e as interações entre os fatores,

tendo como resposta a porcentagem da redução da tensão superficial (%RTS).



73

-5,36

7,2

-15,68

-35,76

-38,48

46,56

-154,16

p=,05

Efeito Estimado Padronizado (Valor Absoluto)

%RTS

(1) Agitação x (4) Meio

(4) Meio

(1) Agitação

(3) R.A.

(1) Agitação x (2) Temperatura

(1) Agitação x (3) R.A.

(2)Temperatura

-5,36

7,2

Figura 4.4 – Diagrama de Pareto para estimativa dos efeitos sobre a redução da tensão superficial para

um planejamento fatorial de fração meia (24-1

)

O único contraste em estudo não significativo, apresentado na Figura 4.4, foi o que

representa a concentração da fonte de carbono (Meio), onde sua composição na forma diluída

(50 %) ou na modalidade integral, não influenciou na porcentagem da redução da tensão

superficial. Uma vez que dos quatro fatores avaliados, apenas três foram significativos, pode-

se obter então um planejamento completo para esses três fatores. Dessa forma, utilizou-se o

programa Statistica 8.0 para analisar a influência desses três fatores na redução da tensão

superficial do meio durante a síntese do biossurfactante. A Figura 4.5 ilustra o diagrama de

Pareto obtido para o planejamento fatorial completo 23 com repetição no ponto central.

%RTS

-5,36

-15,68

-35,76

-38,48

46,56

-154,16

p=,05

Efeito Estimado Padrão (Valor Absoluto)

(2) Temperatura x (3) R.A.

(1)Agitação

(3)R.A.

(1) Agitação x (2) Temperatura

(1) Agitação x (3) R.A.

(2)Temperatura

-5,36

Figura 4.5 – Diagrama de Pareto para estimativa dos efeitos sobre a redução da tensão superficial para

um planejamento fatorial completo (23)



74

Nota-se que quando comparadas as Figuras 4.4 e 4.5, os valores obtidos para os

contrastes (Figura 4.4) são os mesmos para os fatores apresentados pela Figura 4.5. A

Temperatura é o fator que mais influencia na síntese do biossurfactante. Nesse caso, o

aumento da temperatura, ao passar de 30 ºC para 40 ºC reduz em média 19,27 % (ver Tabela

4.4).

Fatores como razão de aeração (R.A.) e agitação também se mostraram significativos.

Nesse caso, o aumento dos níveis desses fatores implicou em redução de síntese de

biossurfactante, ou seja, a produção é favorecida pelos valores nos níveis inferiores em

estudo: 0,4 para a R.A. e 100 rpm para a velocidade de agitação. Ainda, as interações entre

agitação e razão de aeração e, agitação e temperatura, também contribuíram para a redução da

tensão superficial. A Tabela 4.4 ilustra os efeitos para os fatores significativos.

Tabela 4.4 – Fatores significativos e seus efeitos

Fatores Efeito significativo

Agitação -1,96

Temperatura -19,27

Razão de aeração (R. A.) -4,47

Agitação x Temperatura -4,81

Agitação x Razão de Aeração 5,82

Observa-se na Tabela 4.4 que os fatores significativos têm como resposta um efeito

acompanhado do sinal negativo, exceto para o fator combinado Agitação x Razão de Aeração.

Esse sinal diz respeito ao fato de que ao sair do nível inferior (-1) para o nível superior (+1)

haverá um decréscimo no efeito resposta (%RTS). Para o fator Razão de Aeração, o aumento

do volume do meio de 100 mL (R.A. igual a 0,4) para 200 mL (R.A. igual a 0,8), haverá uma

diminuição de 4,47 % na síntese do biossurfactante. O aumento de 100 rpm para 200 rpm para

o fator Agitação ocasionará em uma diminuição de aproximadamente 2 % na porcentagem da

redução da tensão superficial. O fator combinado para a agitação e temperatura também

ocasionará uma redução do efeito (4,81 %). Todavia, o fator combinado da agitação e razão

de aeração contribui positivamente para o efeito resposta.

Buscou-se ajustar um modelo linear para os dados obtidos, o qual mostrou

significância para o intervalo de 95 % confiança. Observa-se na Tabela 4.5 que a variação

explicada pela regressão é de 91,44 % (valor obtido pela relação SQR/SQT) para variação



75

máxima explicável de 99,99 %. O valor para o Fcal (8,63), que relaciona a média quadrática da

regressão pela média quadrática dos resíduos (MQR/MQr), comparado ao FTab 5,4 (6,26; no

nível de 95 %), apresentou-se superior a 1, indicando uma regressão significativa. Todavia, o

modelo linear não se mostrou preditivo, pois o valor do Fcal = 1338,013, que relaciona a

média quadrática da falta de ajuste pela média quadrática do erro puro (MQfaj/MQep),

apresentou-se muito superior quando comparado ao FTab 2,1 = 199,5 (ao nível de 95%). Assim,

a ANOVA diz que o modelo proposto não é útil para fazer previsões, uma vez que a relação

entre o Fcal e o FTab é muito maior que 1.

Tabela 4.5 – Análise de variância (ANOVA) para um planejamento 23 em um intervalo de 95% de

confiança

Fonte de

Variação

Soma

Quadrática

(SQ)

Nº de graus de

liberdade

Média

Quadrática

(MQ)

Regressão 904,32 5 180,864

Resíduo 83,7909 4 20,9478

Falta de Ajuste 83,7596 2 41,8798

Erro Puro 0,0313 1 0,0313

Total 989,0164 9

Utilizando o ajuste do modelo linear através da dispersão dos dados em relação aos

valores preditos em função dos valores observados (Figura 4.6), observa-se a distribuição dos

valores obtidos próximos aos valores preditos, em que os valores preditos pelo modelo são

representados pela reta, enquanto que os valores observados são representados pelos pontos.

0 5 10 15 20 25 30 35

Valores Observados

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Va

lore

s P

red

itiv

os

Figura 4.6 – Valores observados vs. valores preditos para o planejamento 23 para um modelo linear

A fim de avaliar a possibilidade de um modelo quadrático ajustar melhor os resultados

obtidos, utilizou-se o teste de curvatura. Observa-se na Figura 4.7 que a curvatura mostra-se



76

significativa indicando que o modelo quadrático ajustaria melhor os dados. A Figura 4.8

apresenta o Diagrama de Pareto para os valores observados em função dos valores preditos

para esse modelo.

0 5 10 15 20 25 30 35

Valores Observados

0

5

10

15

20

25

30

35

Va

lore

s P

red

itiv

os

Figura 4.7 – Valores observados vs. valores preditos para o planejamento 2

3 para um modelo

quadrático utilizando o teste de curvatura

%RTS

-5,36

-15,68

-35,76

-38,48

46,56

51,26857

-154,16

p=,05

(2)Temperatura x (3)R.A.

(1)Agitação

(3)R.A.

(1)Agitação x (2)Temperatura

(1)Agitação x (3)R.A.

Curvatura

(2)Temperatura

-5,36

Figura 4.8 – Diagrama de Pareto em um planejamento com curvatura para estimativa dos efeitos sobre

a redução da tensão superficial (23)

Após aplicado o teste de curvatura e obtido o diagrama de Pareto, gerou-se as

superfícies de resposta para as interações apresentadas. Sabendo-se que a Temperatura foi o

efeito de maior significância para a %RTS, a primeira interação envolvendo esse fator é a

combinação da Temperatura com a Agitação. A Figura 4.9 apresentada a superfície de

resposta para a interação temperatura e agitação.



77

> 25 < 21 < 16 < 11 < 6


temperatura e da agitação

Alguns autores citam que a temperatura não é um fator preponderante na síntese do

metabólito, porém influencia em sua produção. Batista et al. (2006) estudaram diferentes

cepas isoladas do solo e da água do mar na síntese de biossurfactante e de bioemulsificantes.

Ao elevar a temperatura de 25 ºC para 35 ºC verificaram que a temperatura não influenciava

ou influenciava muito pouco na síntese do metabólito. A temperatura também não foi o

principal fator na síntese de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa selvagem para Wei

et al.(2005). Contudo, a temperatura ótima de produção esteve entre 30 e 37 ºC e um

decréscimo foi observado quando a temperatura atingiu a marca de 42 ºC. Os resultados

apresentados por esses pesquisadores corroboram com os resultados obtidos para esse

trabalho quando se utiliza espécie Pseudomonas. Todavia, nas condições de estudo

apresentadas, e de acordo com a análise estatística, a temperatura mostra-se como principal

variável de influência na síntese.

De acordo com Wei et al.(2005), a agitação influencia na eficiência da transferência de

oxigênio e dos componentes presentes no meio e é considerado fator crucial para o

crescimento celular e produção do biossurfactante, principalmente quando a síntese é

realizada em Erlenmeyers. Ao analisarem o efeito da agitação na síntese do biossurfactante

descreveram que se elevando a rotação de 50 para 200 rpm, a produção do biotensoativo

aumentava em 80 %. No presente trabalho, foi observado através do planejamento, que o

aumento da agitação reduz em média 2 % a redução da tensão superficial. Entretanto, o efeito

da combinação temperatura e agitação também foi significativo, nesse caso, esse efeito

combinado reduz em aproximadamente 5% a redução da tensão superficial.



78

Wei et al. (2005) comentam que uma das características do biossurfactante é a

capacidade de formar espumas. A formação de espuma densa causada por emulsificação de

ramnolipídeo durante agitação vigorosa (por exemplo, 250 rpm) pode diminuir a eficiência de

transferência de gás oxigênio no meio líquido, sendo, portanto, inadequado para a produção

de ramnolipídeo em frasco agitados de culturas submersas. No presente trabalho, observou-se

uma formação de espuma considerável, conforme ilustrado na Figura 4.10. Dessa forma, esse

fenômeno pode ter ocorrido durante a síntese do biossurfactante justificando a diminuição da

porcentagem de redução da tensão ao se aumentar a agitação.

Figura 4.10 – Espuma formada pela presença do biossurfactante nos ensaios 6 e 7.

Vale ressaltar que todos os ensaios apresentaram formação de espuma após 12 horas

de cultivo. Essa espuma apresentava-se às vezes densa como pode ser visto na Figura 4.11.

Figura 4.11 – Formação de espuma durante o cultivo

A Figura 4.12 ilustra a superfície de resposta para os fatores temperatura e razão de

aeração, ratificando o fator temperatura como principal efeito na síntese do biossurfactante.

Entretanto, havendo um pequeno acréscimo na porcentagem da redução da tensão superficial



79

quando a razão de aeração passa a ser 0,4, ou seja, com o volume menor de inóculo no frasco

(100 mL) e mais oxigênio.

> 30 < 29 < 24 < 19 < 14 < 9


temperatura e da razão de aeração

O resultado apresentado está de acordo com o publicado por Wei et al. (2005) e

também por Chayabruta e Wu (2001) que comentam que a produção de biossurfactante por

Pseudomonas aeruginosa diminui em condições de oxigênio limitante, preferindo um

ambiente de aerobiose.

A Figura 4.13 apresenta a superfície de resposta para a interação razão de aeração e

agitação.

> 24 < 23 < 21 < 19 < 17 < 15

Figura 4.13 – Superfície de resposta da redução da tensão superficial (%RTS) em função da razão de

aeração e da agitação

Observa-se através da Figura 4.13 que o aumento da porcentagem da redução da

tensão superficial ocorre quando a R.A. aproxima-se para seu menor valor (0,4) e para uma



80

agitação de 100 rpm. Esse efeito combinado pode ser explicado pelo fato do micro-organismo

preferir meio com oxigênio e de que em uma elevada agitação poderia provocar o

cisalhamento das células.

4.4 – Estudo cinético para Pseudomonas aeruginosa AP029-GVIIA em

manipueira como substrato.

Buscou-se avaliar fenomenologicamente o comportamento do micro-organismo para

as condições cinéticas aferidas com o objetivo de ratificar o estudo estatístico apresentado

anteriormente.

Para melhor análise e facilitação do estudo, os ensaios foram primeiramente separados

de acordo com a temperatura os quais foram submetidos, 30 ºC e 40 ºC. As Figuras 4.14 e

4.15 apresentam o crescimento microbiano em função do tempo para essas temperaturas.

0 4 8 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Co

ncen

tração

Celu

lar

g/L

Tempo (h)

Ensaio (1)

Ensaio (2)

Ensaio (5)

Ensaio (6)

Figura 4.14 – Curvas de crescimento celular em função do tempo para os ensaios realizados a 30 ºC



81

0 4 8 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Co

ncen

tração

Celu

lar

g/L

Tempo (h)

Ensaio (3)

Ensaio (4)

Ensaio (7)

Ensaio (8)

Figura 4.15 – Curvas de crescimento celular em função do tempo para os ensaios realizados a 40 ºC

De acordo com os gráficos apresentados pelas Figuras 4.14 e 4.15, quando

comparados os ensaios que foram submetidos a 30 ºC (1, 2, 5 e 6) com os ensaios realizados a

40 ºC (3, 4, 7, 8) percebe-se um aumento maior da biomassa, embora sutil, em menor tempo

para os ensaios realizados a 30 ºC, indicando uma maior adaptabilidade do micro-organismo

em estudo para essa temperatura.

Quando comparadas as condições de cultivos dos ensaios 1 e 2 com os ensaios 5 e 6

(Figura 4.14), o fator de conversão de substrato em células (Yx/s) apresentou-se maior para

esses últimos ensaios, mostrando que nessas condições de cultivos, o substrato é mais

facilmente assimilável, aumentando-se o número de células e consequentemente a produção

do metabólito no meio.



82

A Tabela 4.6 apresenta a produtividade celular para esses ensaios, a velocidade

específica de crescimento e o fator de conversão de substrato em células.

Tabela 4.6 – Produtividade celular, velocidade específica de crescimento e conversão de substrato em

células para os ensaios realizados

Ensaio Produtividade

celular (g L

-1 h

-1)

Velocidade Específica

de crescimento

x (h-1

)

YX/S

1 0,031 0,078 0,087

2 0,024 0,087 0,060

3 0,019 0,064 0,060

4 0,029 0,041 0,130

5 0,062 0,026 0,180

6 0,135 0,036 0,123

7 0,031 0,040 0,126

8 0,031 0,2434 0,112

A maior produtividade foi encontrada para os ensaios 5 e 6, ambos realizados em

condições análogas de temperatura (30 ºC) e velocidade de agitação (200 rpm). Contudo, a

produtividade apresentada para o ensaio 6 é superior ao do ensaio 5. Esse fato pode ser

explicado pela variável razão de aeração (R.A.), pois o ensaio 6 ocorre a um R.A. igual a 0,4,

o que significa um menor volume de meio no frasco (100 mL); enquanto para o ensaio 5, essa

razão é de 0,8 (200 mL de meio no frasco). Esse resultado mostra a preferência do micro-

organismo para ambientes de aerobiose em mesmas condições de cultivo. As Figuras 4.16 e

4.17 ilustram a redução da tensão e o crescimento celular em função do tempo para os ensaios

5 e 6.

Observa-se para o ensaio 1, realizado a 30 ºC; e para os ensaios 7 e 8, realizados a 40

ºC, o mesmo valor para a produtividade. Porém, em relação a volume de biomassa obtida, o

ensaio 1 foi um pouco superior, o que também pode ratificar a influência positiva da

temperatura mais baixa na síntese.



83

0 4 8 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

32

34

36

38

40

42

44

Ten

são

Su

perf

icia

l (m

N/m

)

Tempo (h)

Tensão

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Células

Co

nc

en

traç

ão

Celu

lar

(g/L

)

Figura 4.16 – Curva de crescimento celular e tensão superficial para o ensaio 5

0 4 8 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

30

32

34

36

38

40

42

44

46

Ten

são

Su

perf

icia

l (m

N/m

)

Tempo (h)

Tensão

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Células

Co

nc

en

traç

ão

Celu

lar

(g/L

)

Figura 4.17 – Curva de crescimento celular e tensão superficial para o ensaio 6

Observa-se pelas Figuras 4.16 e 4.17 que a produção do biossurfactante parece estar

parcialmente associada ao crescimento, pois à medida que o micro-organismo cresce, há um

decréscimo na tensão superficial e este decréscimo continua durante a fase estacionária de

crescimento do micro-organismo.

Comparando-se os ensaios 7 e 8, os mesmos foram realizados a 200 rpm e diferenciam

entre si pela razão de aeração: 0,4 e 0,8 para os ensaios 7 e 8, respectivamente. Percebe-se,

então, que a razão de aeração para uma mesma agitação de 200 rpm e para a temperatura de

cultivo a 40ºC pouco influenciou no crescimento celular.

O ensaio 1, apesar de ocorrer a temperatura de 30 ºC e com razão de aeração de 0,4;

possui velocidade de agitação baixa, 100 rpm, o que pode induzir a uma baixa transferência

massa, ou seja, de fonte de carbono e de compostos minerais para a célula, sendo que muitos



84

micronutrientes atuam como cofatores para reações do metabolismo. Esse fato pode ser

comprovado ao se comparar com o ensaio 6, que possui as mesmas condições de cultivo do

ensaio 1 e se diferenciam pela maior velocidade de agitação (200 rpm) favorecendo a uma

maior transferência de massa, implicando em maior produtividade celular (0,135 g L-1

h-1

).

Em ordem decrescente para a produtividade celular estão os ensaios 4, 2 e 3. Esses

ensaios têm em comum a baixa velocidade de agitação, 100 rpm. Percebe-se ainda que o valor

obtido para a produtividade para o ensaio 4 é próximo dos valores encontrados para os ensaios

1, 7 e 8. Contudo, a combinação de variáveis para o ensaio 4, onde a agitação é baixa (100

rpm) quando comparada com a agitação para os ensaios 7 e 8 fez com que sua produtividade

fosse um pouco inferior, confirmando mais uma vez a importância da agitação para o

crescimento celular.

Correlacionando as variáveis dos ensaios que apresentaram a maior produtividade

celular (ensaio 6) com a mais baixa (ensaio 3), atenta-se que para o ensaio 6 tem-se a mais

baixa temperatura (30 ºC), maior agitação (200 rpm) e razão de aeração igual a 0,4 (100 mL

de meio) enquanto para o ensaio 3, as condições de cultivo estão na outra extremidade:

temperatura igual a 40 ºC, velocidade de agitação de 100 rpm e razão de aeração igual a 0,8;

que corresponde a 200 mL de meio em um frasco de 250 mL.

Para que ocorra uma elevada concentração de biomassa, faz-se necessário que o

micro-organismo assimile a fonte de carbono utilizada como substrato. As Figuras 4.18 e 4.19

apresentam o consumo da fonte de carbono pela Pseudomona aeruginosa AP029-GVIIA para

as suas diferentes condições de cultivo.

Para uma melhor análise dos dados, os ensaios foram avaliados de acordo com a

concentração de fonte de carbono. A Figura 4.18 mostra o consumo do substrato para a fonte

de carbono, meio manipueira, diluído em 50 % em água destilada. Os ensaios que foram

realizados nessas condições de cultivo são os ensaios 1, 3, 5 e 7.



85

0 4 8 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

Co

ncen

tração

de S

ub

str

ato

(g

/L)

Tempo (h)

Ensaio (1)

Ensaio (3)

Ensaio (5)

Ensaio (7)

Figura 4.18 – Curvas de consumo de substrato em função do tempo para os ensaios 1, 3, 5 e 7 (meio

manipueira diluído em 50 % em água destilada)

Os maiores consumos ocorreram para os ensaios 5 e 7, com consumo de 91,6 % e 91,9

%, respectivamente. Quando comparados, percebe-se que para os ensaios 5 e 7, o consumo da

fonte de carbono ocorreu a partir do início do cultivo. Para os ensaios 1 e 3, o consumo se

tornou presente a partir das 12 horas de fermentação, onde o consumo para o ensaio 1 foi de

76,2 % e para o ensaio 3 foi de 55,7 %.

Verifica-se para os ensaios 5 e 7, que possuem a mesma velocidade de agitação (200

rpm) e diferentes temperaturas e razão de aeração, que a faixa de variação apresentada por

esses fatores não foi significativa para o consumo do substrato. Quando comparados com os

ensaios 1 e 3, ambos a 100 rpm, nota-se que a agitação de maior velocidade apresentada pelos

ensaios 5 e 7, influenciou positivamente na transferência de substrato para a célula, ocorrendo

maior consumo da fonte de carbono.

A Figura 4.19 apresenta o consumo de substrato para os ensaios realizados com o

meio integral, ou seja, sem diluição.



86

0 4 8 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Co

ncen

tração

de S

ub

str

ato

(g

/L)

Tempo (h)

Ensaio (2)

Ensaio (4)

Ensaio (6)

Ensaio (8)

Figura 4.19 – Curvas de consumo de substrato em função do tempo para os ensaios 2, 4, 6 e 8 (meio

manipueira integral)

Todos os ensaios apresentaram consumo de substrato acentuado após 24 horas de

cultivo. Entretanto, os ensaios 4 e 8 obtiveram o maior consumo de substrato, 79,7 % e 81,7

%, respectivamente. Para o ensaio 2, o consumo foi de 71,6 % e de 61,5 % para o ensaio 6.

Avaliando esses quatro ensaios, encontra-se uma variação nas condições de cultivo entre eles,

criando uma compensação para o consumo da fonte de carbono entre os fatores estudados, o

que inviabiliza uma análise mais detalhada.

A Tabela 4.7 mostra o S (variação de consumo) e a porcentagem de consumo do

substrato para cada um dos oito ensaios realizados.

Tabela 4.7 – Variação e porcentagem de consumo de substrato

Ensaio

Variação

de consumo

(g/L)

S

Consumo

(%)

1 14,7 76,2

2 29,2 71,6

3 8,7 55,7

4 27,0 79,7

5 12,6 91,6

6 20,3 61,5

7 13,9 91,9

8 17,9 81,7



87

Observa-se através da Tabela 4.7 que o substrato, a manipueira, sugere ser bastante

assimilável pelo micro-organismo em estudo, tanto em modo integral quando diluído (1:1) em

água destilada, alcançando valores acima de 91 % de consumo.

À medida que o micro-organismo consome o substrato, ele cresce e excreta

metabólitos. Entre esses metabólitos, tem-se o biossurfactante que pode ser medido

indiretamente através da tensão superficial. As Figuras 4.20 e 4.21 apresentam as curvas da

tensão superficial para os ensaios realizados a temperatura de 30 ºC e 40 ºC, respectivamente.

0 4 8 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

30

32

34

36

38

40

42

44

46

48

50

Ten

são

Su

perf

icia

l (m

N/m

)

Tempo (h)

Ensaio (1)

Ensaio (2)

Ensaio (5)

Ensaio (6)

Figura 4.20 – Curvas de tensão superficial em função do tempo para os ensaios 1, 2, 5 e 6 realizados a

30 ºC

Os resultados apontam uma tensão superficial média por volta de 33 mN/m para esses

ensaios, atingindo valor mínimo de 30,9 mN/m (30,1 % de redução da tensão superficial) para

o ensaio 6 em apenas 48 horas de cultivo. Haba et al. (2000) ao produzir ramnolipídeos por

Pseudomonas aeruginosa, em diferentes fontes de carbono (óleos), obtiveram redução de

tensão superficial que variou de 32 mN/m a 36 mN/m.

Wei et al.(2005) utilizando outra espécie, Pseudomonas aeruginosa J4 e efluente da

indústria petroquímica, obtiveram tensão superficial superior aos 31 mN/m. Raza et al.

(2007b) avaliaram diversas fontes de carbono para a síntese do biossurfactante, utilizando

Pseudomonas putida e alcançaram tensões superficiais de aproximadamente 35 mN/m após 7

dias de cultivo.

Estudos realizados por Nitschke e Pastore (2006) utilizando manipueira como

substrato e Bacillus subtilis na síntese do biossurfactante (surfactina) obtiveram uma redução



88

da tensão superficial de 37 % em relação ao ponto inicial, alcançando índices abaixo de 30

mN/m.

Através da Figura 4.14, observa-se que para os ensaios 1, 5 e 6 que o crescimento

microbiano ocorre até 24 horas de cultivo e que a redução da tensão superficial também

acompanha esse aumento da biomassa (Figura 4.20). Esses resultados ratificam o indício de

que a síntese do metabólito está parcialmente associada ao crescimento celular, pois o micro-

organismo ao entrar na fase estacionária, tempo de 24 horas, ainda não atingiu a Concentração

Micelar Crítica (CMC). Observa-se que a tensão superficial continua a ser reduzida por mais

12 horas até o tempo de 36 horas.

A Figura 4.21 apresenta as curvas para tensão superficial em função do tempo para os

ensaios realizados a 40 ºC.

0 4 8 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

36

38

40

42

44

46

48

Ten

são

Su

perf

icia

l (m

N/m

)

Tempo (h)

Ensaio (3)

Ensaio (4)

Ensaio (7)

Ensaio (8)

Figura 4.21 – Curvas de tensão superficial em função do tempo para os ensaios 3, 4, 7 e 8 realizados a

40 ºC

Os ensaios 3, 4, 7 e 8, realizados a 40 ºC mostram que os resultados para a redução da

tensão superficial foram inferiores aos ensaios realizados a 30 ºC, bem como os valores para a

Tensão Superficial mínima obtida. A Tabela 4.8 mostra de forma resumida os parâmetros

cinéticos dos ensaios realizados.



89

Tabela 4.8 – Parâmetros cinéticos dos ensaios realizados

Ensaio

Conc.

Cel.

(g/L)

YX/S Xmáx

(h-1

)

Red. da

Tensão

Sup.

(%)

TSmín

(mN/m) t(h)

1 2,20 0,087 0,078 31,03 33,24 120

2 2,00 0,060 0,087 28,96 33,78 108

3 2,25 0,260 0,064 18,14 38,37 84

4 3,00 0,130 0,041 4,65 40,89 72

5 2,25 0,178 0,025 22,31 33,12 36

6 2,50 0,123 0,036 30,08 30,92 48

7 1,75 0,126 0,040 6,28 36,40 108

8 2,00 0,112 0,243 6,23 43,36 120

9 1,75 0,117 0,070 25,75 36,40 48

10 2,00 0,137 0,022 25,50 36,40 72

Os micro-organismos também se apresentam como uma valiosa fonte de corantes

naturais, permitindo sua fácil obtenção alcançando altos rendimentos em processos

fermentativos (Nakau, 2011). Alguns pigmentos podem ser produzidos por bactérias, entre

eles pode-se citar a piocianina, um pigmento de coloração azulada que pode ser sintetizado

por Pseudomonas aeruginosa associada à produção de biossurfactante (Ishigami & Suzuki,

1997). Esses pigmentos provenientes do metabolismo secundário também agem como

antibiótico ativo (Nakau, 2011). No presente trabalho, durante o cultivo, em todas as

condições de estudo, um corante de coloração avermelhada surgiu após 12 horas de

fermentação. A Figura 4.22 mostra a mudança da coloração do meio associada à síntese do

biossurfactante.



90

Figura 4.22 – Mudança de coloração do meio fermentativo

4.5 – Quantificação do biossurfactante sintetizado

Os três métodos colorimétricos testados, orcinol, fenol-sulfúrico e tio-glicólico foram

utilizados com o objetivo de compará-los e identificar qual a melhor técnica para a

quantificação do metabólito sintetizado, gerando o maior rendimento, todavia todos os

resultados mostraram que nenhum dos métodos aplicados foi eficaz. Esse resultado leva a

hipótese de que a presença da glicose no substrato hidrossolúvel, a manipueira, pode ocultar

os valores reais obtidos.

A Figura 4.23 ilustra o decréscimo na quantificação do ramnolipídeo pelo método tio-

glicólico. Observa-se que pelo método havia consumo de biossurfactante, indicado pelo

decréscimo de ramnose, que é uma pentose, cuja estrutura está presente no biossurfactante

(ramnolipídeo).

0 4 8 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Ra

mno

se

(g/L

)

Tempo (h)

Figura 4.23 – Quantificação do ramnolipídeo pelo método tio-glicólico

Os resultados para o orcinol, bem como para o fenol sulfúrico apresentaram gráficos

similares ao ilustrado pela Figura 4.23.



91

4.6 – Avaliação da Diluição Micelar Crítica (DMC)

A diluição micelar crítica (DMC) é também uma indicação indireta da concentração de

biossurfactantes medindo o poder tensoativo do metabólito. A diluição micelar crítica foi

realizada para todos os 10 ensaios, com o objetivo de comparar a variação da tensão

superficial do sobrenadante sem diluição, com o sobrenadante diluído 10 vezes (DMC-1

) e

100 vezes (DMC-2

).

As curvas que serão mostradas a seguir são dos ensaios que apresentavam a maior

redução da tensão superficial independentemente do tempo obtido para este resultado. Os

ensaios que apresentaram maior redução de tensão superficial para DMC-1

e DMC-2

coincidem com os melhores resultados apresentados na Tabela 4.8 do item 4.4.

As Figuras 4.24, 4.25, 4.26 e 4.27 apresentam as curvas para a variação da Tensão

Superficial (TS) no sobrenadante, na DMC-1

e DMC-2

para os ensaios 1, 2, 5 e 6.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

30

35

40

45

50

55

60

65

70

Ten

sã

o S

up

erf

icia

l (m

N/m

)

Tempo (h)

TS

DMC-1

DMC-2

Figura 4.24 – Medidas da Tensão Superficial (TS), Diluição Micelar Crítica 1/10 (DMC

-1) e Diluição

Micelar Crítica 1/100 (DMC-2

) para o ensaio 1.



92

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

Ten

sã

o S

up

erf

icia

l (m

N/m

)

Tempo (h)

TS

DMC-1

DMC-2


-1) e Diluição


) para o ensaio 2.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

30

35

40

45

50

55

60

65

70

Ten

sã

o S

up

erf

icia

l (m

N/m

)

Tempo (h)

TS

DMC-1

DMC-2


-1) e Diluição


) para o ensaio 5.



93

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

30

35

40

45

50

55

60

65

Ten

sã

o S

up

erf

icia

l (m

N/m

)

Tempo (h)

TS

DMC-1

DMC-2


-1) e Diluição


) para o ensaio 6.

Observa-se através das Figuras 4.24 a 4.27, que o comportamento observado para as

curvas DMC-1

e DMC-2

acompanha as oscilações apresentadas pela curva da Tensão

Superficial. Após a diluição pode-se avaliar indiretamente a concentração do biossurfactante

no meio. Percebe-se que para a DMC-2

há algumas flutuações e essas estão provavelmente

associadas a variações experimentais.

A Tabela 4.8 apresenta os resultados obtidos para os ensaios 1, 2, 5 e 6 em valores

percentuais para a redução da tensão medida na diluição micelar crítica DMC-1

e DMC-2

.

Tabela 4.9 – Avaliação da redução da tensão superficial na DMC-1

e DMC-2

Ensaio %RTS-DMC-1

%RTS-DMC-2

1 17,81% 7,23%

2* 18,80% 22,96%

5 22,96% 12,50%

6* 32,23% 16,41% *Considerando o menor e o maior valor medido

O ensaio 6 apresentou a maior redução de tensão superficial para a diluição micelar

crítica DMC-1

sugerindo ser o ensaio com maior concentração de biossurfactante no meio.

Quando comparado com os outros ensaios em estudo, o DMC-2

apresentou uma maior

redução de tensão superficial para o ensaio 2 em %RTS, porém, os menores valores da tensão

superficial foram encontrados para o ensaio 6, o que indica a maior concentração de

biossurfactantes presente.



94

4.7 – Avaliação do índice de emulsificação (E24)

A atividade de emulsificação expressa à capacidade dos biossurfactantes produzidos

de emulsificarem hidrocarbonetos. De acordo com Willumsen e Karlson (1997), um critério

obedecido para ser considerado como bom emulsificante é a capacidade de formar emulsão

com o hidrocarboneto e essa se manter emulsionada acima de 50 % por 24 horas ou mais.

A Tabela 4.10 ilustra os valores obtidos para a análise de emulsificação E24 para 24

horas e de 48 até 72 horas, utilizando-se querosene comercial.

Tabela 4.10 – Índice de emulsificação para os ensaios de 1 a 10

Ensaio E24% E48-72%

1 66,00 *

2 60,00 *

3 55,60 55,60

4 65,38 65,38

5 68,97 68,97

6 62,96 *

7 50,00 48,43

8 60,00 55,00

9 66,00 66,00

10 65,38 65,38

* Não permaneceram estáveis após 24h

Percebe-se, de acordo com os resultados obtidos, que os ensaios apresentaram um

excelente poder de emulsificação, variando de 50 a 68 % para as 24 primeiras horas, ainda

acompanhando este índice, muitos deles permaneceram estáveis por 72 horas ou mais.

A Figura 4.28 mostra o teste de emulsificação para os ensaios 2, 3, 4, 5, 6 e 7.



95

(2) (3) (4) (5) (6) (7) Figura 4.28 – Teste de emulsificação para os ensaios 2, 3, 4, 5, 6 e 7

Testes de emulsificação realizados por Haba et al. (2000) apresentaram índice de

emulsificação variando de 12 a 64 % para o metabólito sintetizado por diversos tipos de

Pseudomonas. Costa et al. (2008) obtiveram rendimentos acima de 90 % de emulsificação

para o gênero Pseudomonas. Wei et al. (2005) utilizaram diferentes fontes de substratos como

fonte de carbono, entre elas, óleo de girassol, óleo de semente de uva e glicose e obtiveram

índices de emulsificação entre 70 % e 80 % para o querosene. Dessa forma, os índices de

emulsificação obtidos no presente trabalho são de valores consideráveis indicando que o

biossurfactante produzindo é um bom agente emulsificante.

4.8 – Análise da estabilidade em relação à variação de pH, temperatura e

salinidade.

Foram realizados testes de estabilidade de pH, temperatura e salinidade para os

biossurfactantes obtidos nos cultivos durantes os ensaios 1, 2, 5 e 6, por apresentarem maior

porcentagem de redução de tensão superficial.

4.8.1 – Estabilidade ao pH

Os pontos analisados mostraram boa estabilidade de pH para o meio alcalino ou

ligeiramente ácido, permanecendo a tensão superficial com pequena variação, podendo ser

esse valor atribuído a erro de leitura do equipamento. A Tabela 4.11 apresenta os valores

obtidos pela tensão superficial após a adição de HCl (1N) e NaOH (1N).

Tabela 4.11 – Estabilidade de pH para os ensaios 1, 2, 5 e 6

Ensaios pH do ponto

avaliado

Tensão Inicial

(mN/m)

Medida da tensão superficial (mN/m)* para

diferentes valores de pH



96

2,0 5,0 8,0 10,0

1 6,61 33,24 49,00 34,00 34,33 35,00

2 6,77 33,78 48,00 34,33 34,00 34,66

5 7,66 33,12 42,33 35,00 34,33 35,33

6 7,88 30,92 44,66 34,00 31,00 31,33

Através dos resultados acima, nota-se que para o meio muito ácido, pH igual a 2,0,

ocorre uma aumento na tensão superficial do meio. Uma possível explicação para esse

aumento deve-se ao fato da mudança da forma micelar, na qual não há redução da tensão

superficial para a forma de monômeros, que implicaria em um aumento da tensão superficial.

Observa-se que a tensão voltou a ser a mesma (ou aproximadamente a mesma) apresentada

pelo ponto zero de cada cultivo. Para os outros valores de pH, a tensão teve pouca variação,

havendo um pequeno aumento à medida que se afastava do pH do ponto avaliado para aquele

cultivo.

Estudos realizados por Bello et al. (2012), na síntese do biossurfactante por

Lactobacillus pentosus e resíduo da poda de videira, mostrou que o pH foi a variável que teve

o maior efeito sobre a superfície-ativa. Baixos valores de pH eliminaram as propriedades

biossurfactantes como também as propriedades bioemulsificantes. Em mesmo estudo,

mostraram que em efeito sinérgico com a salinidade e temperatura, para pH maior que 5,5 e

salinidade (entre 1 a 5%) não alterou a estabilidade para as propriedades bioemussificantes do

metabólito sintetizado.

Rossmann (2008) utilizando como substrato um combinado de melaço e manipueira e

consórcios bacterianos, ao analisar a influência do pH nas propriedades emulsificantes

constatou que para pH com valores abaixo de 4,0, as emulsões não foram estáveis. Para

valores acima de pH igual a 6,0 , os resultados ainda apresentaram a estabilidade da emulsão.

4.8.2 – Estabilidade a variação de temperatura

No presente trabalho avaliou-se a estabilidade do biossurfactante em função da

temperatura. Considerando os ensaios 1,2, 5 e 6, coletou-se 30 mL de amostra durante o

cultivo, em cada uma dessas condições, que apresentou a menor Tensão Superficial mínima e

levou-se a estufa (BIOPAR) à diferentes valores de temperatura por 24 horas. A Tabela 4.11

apresenta a variação da tensão superficial à medida que a temperatura foi elevada.

Tabela 4.11 – Estabilidade de pH para os ensaios 1, 2, 5 e 6



97

Ensaios

Tensão

Inicial

(mN/m)

Medida da tensão superficial (mN/m) para

diferentes valores de temperatura

50ºC 60ºC 70ºC

1 33,24 42,00 42,00 50,00

2 33,78 43,00 44,00 49,66

5 33,12 38,33 43,66 44,33

6 30,92 40,66 41,00 43,66

Os ensaios mostram que o biossurfactante sintetizado apresentou-se pouco estável

quando aquecido. Para os ensaios 1 e 2 que apresentam tensão superficial 48,20 e 47,50

mN/m para os pontos zeros, respectivamente; nota-se que a medida da tensão superficial

apresentada na Tabela 4.11 para os pontos analisados aproxima-se dos valores iniciais da

tensão superficial. Os ensaios 5 e 6 também não se mostraram estáveis para a variação de

temperatura. Após 24 horas na estufa a 50ºC, os valores das tensões superficiais já estavam

próximos aos pontos zeros de cada cultivo.

Para os estudos realizados por Nitschke e Pastore (2006), diferente dos resultados

obtidos nesse trabalho, mostram que a temperatura não influenciou na tensão superficial para

a surfactina produzida por Bacillus subtilis em meio manipueira a 100ºC por 120 minutos.

4.8.3 – Estabilidade a variação da salinidade

A estabilidade do biossurfactante quanto à variação da salinidade é mostrada através

da Tabela 4.12.

Tabela 4.12 – Estabilidade a salinidade para os ensaios 1, 2, 5 e 6

Ensaios

Tensão

Inicial

(mN/m)

Medida da tensão superficial (mN/m) para

diferentes valores de temperatura

1% 5% 10%

1 33,24 34,33 34,00 34,66

2 33,78 34,33 33,00 34,00

5 33,12 34,00 33,66 33,24

6 30,92 32,24 32,00 32,33

A adição do NaCl não afetou a tensão superficial do meio contendo o biossurfactante.

A tensão superficial permaneceu em mesmos valores (ou aproximados) para cada ponto

durante o cultivo avaliado. Estudos realizados por Rossmann (2008) e Nitschke e Pastore

(2006) mostraram que a adição de sal não influenciou na tensão superficial como também no

índice de emulsificação E24. Os resultados obtidos nesse trabalho para os biossurfactantes são

promissores uma vez que uma das vantagens dos biossurfactantes em relação aos surfactantes

sintéticos, baseia-se no fato que esses último são sensíveis a salinidade e variação de pH.



98

Capítulo 5

Conclusão

Capítulo 5 Conclusão


100

5. Conclusão

A presente tese teve por objetivo estudar a síntese de biossurfactantes

empregando a manipueira, resíduo agroindustrial, como substrato. Um planejamento

experimental de fração meia (24-1

) foi utilizado como ferramenta a fim de auxiliar no

tratamento dos dados obtidos para entender a influência dos principais fatores durante a

produção do metabólito. Um estudo cinético foi realizado para estudar o comportamento

do micro-organismo no meio manipueira e ratificar os resultados estatísticos. O caldo

fermentado livre de células foi avaliado em termos de estabilidade de pH, salinidade e

temperatura.

A manipueira foi caracterizada e apresentou nutrientes como: Fe, P e N,

fundamentais na síntese do biossurfactante. O substrato indicou ser bastante assimilável

pela Pseudomona aeruginosa AP029-GVIIA, onde o consumo dessa fonte de carbono

alcançou valores entre 55 e 90 %.

Nos cultivos iniciais, o tempo de 16 horas foi suficiente para adaptação do

micro-organismo ao meio. Contudo, houve a necessidade da adição de solução estoque

de sais (1,0 mL/L) para a fim de induzir uma maior porcentagem na redução da tensão

superficial (%RTS).

A análise estatística dos dados mostrou que a temperatura de 30 ºC é a principal

variável na síntese do biossurfactante para essas condições de cultivo, em que os

principais ensaios alcançaram uma tensão superficial mínima entre 31 mN/m e 34

mN/m e uma redução de tensão superficial do meio (%RTS) em torno de 30 %. A razão

de aeração e a agitação também se mostraram significativos. Apenas o fator

concentração da fonte de carbono não apresentou significância na síntese do metabólito.

A análise fenomenológica ratificou o planejamento estatístico, mostrando que a

temperatura foi a variável que mais contribuiu na síntese da biomassa e,

consequentemente, na produção do biossurfactante, pois a produção do metabólito

indicou ser parcialmente associada ao crescimento. A velocidade de 200 rpm e a razão

de aeração 0,4 (100 mL do meio em Erlenmeyer de 250mL) também apresentaram-se

relevantes na produção do metabólito.

Os métodos colorimétricos utilizados, orcinol, fenol-sulfúrico e tio-glicólico

foram ineficazes na quantificação do biossurfactante, podendo ter sido ocultada pelo

Capítulo 5 Conclusão


101

substrato em estudo, fazendo-se necessário, para trabalhos futuros, novos estudos para a

quantificação do metabólito sintetizado.

Para as análises de Diluição Micelar Crítica, tendo a porcentagem de redução da

tensão superficial como resposta, os melhores ensaios apresentaram resultados de

redução de tensão superficial para a DMC-1

variando de 17,81 % a 32,23 %. Para a

DMC-2

, em que o sobrenadante é diluído 100 vezes, a redução da tensão superficial

variou entre 7,23 e 22,96 %, indicando concentração de biossurfactantes ainda no meio.

Com relação ao bioproduto, observou-se poder de emulsificação, caracterizando

o metabólito como bom bioemulsificante, onde a solução emulsionada variou de 50 a 68

% para as 24 primeiras horas. Após 72 horas ou mais, ainda acompanhando o índice de

emulsificação, muitos deles permaneceram estáveis.

No estudo da estabilidade para o biossurfactante, esse se mostrou estável para o

aumento da concentração salina, bem como para pH alcalino, onde a tensão superficial

teve pequenas oscilações, mas mantendo-se próximo aos valores mínimos encontrados

para a tensão superficial e foi instável para temperaturas acima de 50 ºC e pH igual a

2,0.

Com base nos resultados obtidos na presente tese, pode-se concluir que as

variáveis de processo, temperatura, agitação e razão de aeração contribuíram para a

síntese do biossurfactante por Pseudomona aeruginosa AP029-GVIIA e que a

manipueira é uma boa fonte de carbono e de sais minerais, onde o micro-organismo em

estudo se mostrou adaptável e produtor do metabólito em cultivo descontínuo submerso.

Entre os ensaios realizados, o ensaio 6, que tinha as seguintes condições de cultivo:

agitação de 200 rpm, temperatura de 30 ºC; razão de aeração igual a 0,4 e com o meio

integral, ou seja, sem diluição; foi o ensaio que apresentou os melhores resultados na

síntese do biossurfactante. O ensaio 6 mostrou uma redução da tensão superficial de

30,08 % e tensão superficial mínima de 30,98 mN/m em 48 horas de cultivo.

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