tese de doutorado efeito de estÍmulos fÍsicos … · entre os sinais ambientais mais relevantes...

TESE DE DOUTORADO

EFEITO DE ESTÍMULOS FÍSICOS SOBRE A ATIVIDADE DAS

BOMBAS DE PRÓTONS DE CÉLULAS VEGETAIS E SUA

PARTICIPAÇÃO NAS RESPOSTAS MORFOGÊNICAS

TATIANA DE FELICE ELIAS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIB EIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RIO DE JANEIRO

ABRIL DE 2008

iii





“Tese submetida ao Centro de Biociências e Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Biociências e Biotecnologia”

Orientador: Prof. Arnoldo Rocha Façanha

CAMPOS DOS GOYTACAZES – R.J.

ABRIL DE 2008

iv





“Tese submetida ao Centro de Biociências e Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Biociências e Biotecnologia”

Aprovada em 16 de Abril de 2008 Comissão Examinadora:

______________________________________________________________ Prof. Marcelo Gomes da Silva (D.S. – Física) – UENF

______________________________________________________________ Profª. Claudete Santa-Catarina (D.S. – Biotecnologia) – UENF

______________________________________________________________ Profª. Solange Silva Samarão (D.S. – Biociências e Biotecnologia) – FAETEC

______________________________________________________________ Prof. Ricardo Enrique Bressan-Smith (D.S. – Fisiologia Vegetal) – UENF

(Co-orientador)

______________________________________________________________ Prof. Arnoldo Rocha Façanha (D.S. – Química Biológica) – UENF

(Orientador)

v

Aos meus pais Elaine e Acir

Aos meus irmãos Nathalia e Fernando

Pela compreensão e incentivo

Dedico e ofereço

vi

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida e oportunidades que me tem sido dadas.

Aos meus amados: pais e irmãos, pelo amor, amizade e constante incentivo.

A Jorge André Sacramento de Magalhães, pelo inestimável apoio, carinho e

compreensão. Por ter me dado força nos momentos mais difíceis.

A Antônio Carlos de Jesus Carvalho, meus tios e primos, e a todos os meus demais

familiares que torceram por esta conquista.

Ao Professor Arnoldo Rocha Façanha, pela confiança, apoio, oportunidade,

orientação e, amizade.

Ao Professor Ricardo Henrique Bressan-Smith, pelos ensinamentos, incentivo, co-

orientação e, principalmente, pela amizade.

A Paulo Marcelo de Souza, pela amizade e incentivo.

A Liane Cristina da S. Ferreira, pelo carinho, amizade, apoio. Obrigada pela

colaboração nos muitos trabalhos que desenvolvemos juntas durante todos esses

anos.

Aos amigos Leandro Viana, Alena Netto, Francisco Filho, Rosivany Gomes, Michelle

vii

Catunda, Inga Azevedo, pelo companheirismo, carinho e amizade dedicada.

Aos demais amigos, professores e técnicos do LBCT e LMGV (Setor de Fisiologia

Vegetal), por tornarem nossa convivência agradável e enriquecedora.

Aos funcionários do CBB e do CCTA, pelos valiosos serviços prestados.

À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), pela

oportunidade.

A CAPES, pela concessão da bolsa.

A todos que, na grandeza do anonimato, contribuíram para com o meu

Doutoramento.

viii

SUMÁRIO

RESUMO xii

ABSTRACT xiv

1. INTRODUÇÃO 01

2. REVISÃO DE LITERATURA 04

2.1 H+-ATPase de membrana plasmática 04

2.2 H+-ATPase vacuolar 06

2.3 H+-PPase vacuolar 10

2.4 H+-ATPase mitocondrial e cloroplastídica 13

2.5 Estímulos e estresses físicos 15

2.5.1 Estimulação e estresse luminoso 15

2.5.1.1 Fotorreceptores em plantas - Fitocromos e Criptocromos 17

2.5.1.2 Efeito fotoinibitório em plantas 22

2.5.1.3 Fluorescência da clorofila a 24

2.5.1.4 Efeito da luz na célula vegetal – o papel das H+-ATPases 25

2.5.2 Estimulação mecânica – “Brushing” 28

2.5.2.1 Perturbação mecânica 28

2.5.2.2 Efeito do toque no crescimento e desenvolvimento das plantas - o

papel das H+-ATPases 30

2.5.3 Estimulação Sonora 35

2.5.3.1 Som e ultrasom 35

2.5.3.2 Efeito do som e ultrasom na célula vegetal – o papel das H+-

ATPases. 37

3. OBJETIVOS 43

ix

3.1 Objetivo geral 43

3.2 Objetivos específicos 43

4. TRABALHOS 45

4.1 RÁPIDAS RESPOSTAS DOS LIPÍDIOS DE MEMBRANA E DA EFICIÊNCIA

FOTOQUÍMICA EM PLANTAS DE FEIJÃO COMUM E CAUPI (Phaseolus vulgaris e

Vigna unguiculata) SUBMETIDAS A ALTA IRRADIÂNCIA 46

4.1.1 RESUMO 47

4.1.2 ABSTRACT 48

4.1.3 INTRODUÇÃO 49

4.1.4 MATERIAL E MÉTODOS 51

4.1.4.1 Material vegetal 51

4.1.4.2 Condições de crescimento 51

4.1.4.3 Tratamento por alta irradiância 51

4.1.4.4 Fluorescência da clorofila a 52

4.1.4.5 Integridade das membranas - peroxidação lipídica 53

4.1.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 55

4.1.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60

4.2 MODULAÇÃO DA V-ATPase E DA P-ATPase DE HIPOCÓTILOS

ESTIOLADOS DE CAUPI (Vigna unguiculata (L.) Walp.) PELA LUZ 65

4.2.1 RESUMO 66

4.2.2 ABSTRACT 68





4.2.4.3 Tratamentos de luz 73

4.2.4.4 Preparação da fração microssomal 73

4.2.4.5 Purificação das vesículas de membrana plasmática e de tonoplasto 74

4.2.4.6 Determinação de proteínas 74

4.2.4.7 Determinação da atividade ATPásica do tonoplasto e da plasmalema e

da atividade PPásica do tonoplasto 74

4.2.4.8 Monitoramento do gradiente de prótons 75

4.2.4.9 Determinação da velocidade inicial (V0) e da variação da fluorescência

máxima (∆Fmáx.) do transporte de prótons 76

x



4.3 ATIVIDADE DAS H+-ATPases DO TONOPLASTO E DA PLASMALEMA EM

RESPOSTA A ESTIMULAÇÃO MECÂNICA DE MAMOEIROS (Carica papaya L.) 91

4.3.1 RESUMO 92

4.3.2 ABSTRACT 94





4.3.4.3 Tratamento mecânico 98



4.3.4.6 Determinação da atividade ATPásica do tonoplasto e plasmalema 99

4.3.4.7 Monitoramento do gradiente de prótons 100

4.3.4.8 Determinação da velocidade inicial (V0) e da variação da fluorescência

máxima (∆Fmáx.) do transporte de prótons 101

4.3.4.9 Microscopia ótica convencional 102

4.3.4.10 Microscopia eletrônica de varredura 103



4.4 EFEITO DO ULTRASOM NA ATIVIDADE DAS BOMBAS DE PRÓTONS DO

TONOPLASTO E DA PLASMALEMA DE CÉLULAS DE TABACO (Nicotiana

tabacum L.) EM SUSPENSÃO 115

4.4.1 RESUMO 116

4.4.2 ABSTRACT 118





4.4.4.3 Preparo do pré-inoculo para isolamento de membranas 124

4.4.4.4 Tratamento sonoro 124



xi

4.4.4.7 Determinação da atividade ATPásica do tonoplasto e da plasmalema e

da atividade PPásica do tonoplasto 126

4.4.4.8 Microscopia ótica convencional 126

4.4.4.9 Eletroforese e “imunoblotting” de proteínas 126



5. CONCLUSÕES 137

6. BIBLIOGRAFIA GERAL 140

xii

RESUMO

As plantas são capazes de perceber e responder a estímulos internos e ambientais,

o que é de grande importância para a sobrevivência desses organismos. Entre os

estímulos ambientais mais comuns, detectados pelos organismos vivos estão as

variações de luz, temperatura, som e uma variedade de sinais mecânicos. A célula

vegetal pode perceber a gravidade; a pressão causada pelas células e estruturas

extracelulares adjacentes e pelo crescimento interno; o estresse mecânico gerado

pela neve, gelo, vento, chuva, toque, som; e o seu estado de hidratação (pressão de

turgor). Após processar essas informações, as células respondem com respostas

altamente reguladas, específicas do tipo de crescimento de cada espécie. A luz está

entre os sinais ambientais mais relevantes que afetam o desenvolvimento das

plantas, e essa pesquisa foi iniciada investigando as respostas, quanto à eficiência

fotoquímica e a integridade da membrana celular em Vigna unguiculata Walp.

Baseado na tolerância a alta irradiância demonstrada por essas espécies elas foram

escolhidas para verificarmos a sensibilidade das bombas de prótons ao estímulo

luminoso. As bombas de prótons das membranas plasmáticas (P-ATPase) e

vacuolares (V-ATPase e V-PPase) são essenciais para os eventos de absorção de

moléculas e íons e têm sido relacionadas ao controle do turgor e crescimento

celular. Estas bombas são reguladas por sinais internos e externos, e oscilações de

suas atividades em função de mudanças fisiológicas e/ou ambientais podem induzir

mudanças críticas no potencial de membrana e no funcionamento de canais iônicos

e outras proteínas relacionadas à sinalização celular. Em função disso, o presente

estudo investigou se essas bombas da célula vegetal funcionariam como sistemas

perceptores e/ou mediadores de estímulos físicos. Os resultados sugerem que a V-

ATPase é o sistema mais sensível ao estímulo luminoso. Vesículas de tonoplasto

xiii

isoladas de hipocótilos estiolados de caupi exibiram uma atividade maior quando

expostas à luz, sendo o estímulo de 30%. Quanto ao estímulo por toque e por

vibrações sonoras, os resultados sugerem que as bombas do tonoplasto e da

plasmalema são sensíveis a esses estímulos, atuando como mecanoperceptores da

célula vegetal. Vesículas de tonoplasto e plasmalema isoladas do caule de

mamoeiros estimulados mecanicamente exibiram aumento de transporte de prótons

e de atividade pelas ATPases quando estimuladas com 20 passadas (brushing) em

relação ao controle e uma redução do transporte de prótons e de atividade quando

estimuladas com 40 passadas. Para vesículas de tonoplasto e plasmalema isoladas

de células de tabaco em suspensão estimuladas por ondas ultrassônicas, os

resultados mostram um aumento da atividade da V e da P-ATPase e da V-PPase. A

PPase vacuolar exibiu pouca ou nenhuma resposta aos estímulos luminoso e por

toque. Esses resultados mostram que as V e as P-ATPases podem funcionar como

sistemas perceptores e/ou mediadores de estímulos físicos, participando

efetivamente do processo de desencadeamento e/ou transdução de sinais

ambientais na célula vegetal.

xiv

ABSTRACT

Higher plants are capable to perceive and respond to a wide range of internal and

environmental stimuli, what is of greatest importance for the survival of these

organisms. Light, temperature, sound and a variety of mechanical signals are among

the most common environmental stimuli detected by living organisms. The plant cell

may perceive gravity; strains caused by self-loading and internal growth; mechanical

loading by snow, ice, and fruit, wind, rainfall, touch, sound; and the state of hydration

within a cell (turgor pressure). After processing this information, they respond with

highly appropriate, typically growth-related responses. Light is among the most

relevant environmental signals that affects the plant development, and this research

was initiated investigating short-term responses of the photochemical efficiency and

cell membrane integrity in Vigna unguiculata Walp. Based on the tolerance to high

irradiance demonstrated by this species it was chosen to verify the sensibility of the

proton pumps to the light stimuli. The proton pumps of the tonoplast (V-ATPase e V-

PPase) and of the plasmalemma (P-ATPase) are essential for events of molecules

and ions absorption of the plant cell and they have been related to the control of the

turgor and cellular growth. These pumps are regulated by either internal or external

signals, and oscillations of their activities in function of physiological and/or

environmental signals can induce critical changes in the membrane potential and

functioning of ion channels and other proteins related to the cell signaling. In function

of this, the present study investigated whether these pumps of the plant cell could

function as perceptor and/or mediator systems of the physical stimuli such as light,

brushing and sound waves. The main results suggest that the vacuolar H+-ATPase

(V-ATPase) is the most sensitive system to the light. Tonoplast vesicles isolated from

etiolated hypocotyls of Vigna unguiculata Walp exhibited around 30% higher V-

xv

ATPase activitiy when exposed to the white light than when assayed in the dark. In

regard of the brushing and sound stimuli, the results suggest that both ATP-

dependent H+-pumps of tonoplast and plasmalemma are sensible to these stimuli,

acting also as mechanoperception of the plant cell. Tonoplast and plasmalemma

vesicles isolated from stems of papaya plants stimulated mechanically shown

increase of transport of protons and activity for the ATPases when stimulated with 20

steps of brushing in relation to the control and a reduction of the transport of protons

and activity when stimulated with 40 steps. For isolated vesicles of tonoplast and

plasmalemma of tobacco cells in suspension stimulated by ultrasonic waves, the

results show an increase of the activity of the V and the P-ATPase and the V-PPase.

In contrast, the vacuolar H+-PPase showed slight or no response to the light as well

as to the mechanical stimuli. These results show that the V and the P-ATPases can

function as perceptors and/or mediators systems of physical stimuli, participating

effectively of the process of triggering and/or transduction of environmental signals in

the plant cell.

1

1. INTRODUÇÃO

A habilidade dos organismos vivos para perceber e responder a estímulos

físicos sempre foi um fator crucial para a sobrevivência e evolução das espécies. Na

natureza, múltiplos estímulos físicos estão sempre presentes e influenciaram a

evolução de intrincados mecanismos bioquímicos responsáveis pela percepção da

luz, das sensações térmicas, do tigmotismo e uma miríade de respostas primárias e

secundárias oriundas das interações de diferentes estímulos ambientais. As plantas,

por serem organismos sésseis, precisaram desenvolver ao longo de sua evolução

mecanismos de sinalização que possibilitassem uma extensiva associação entre

vias de estímulos ambientais e respostas fisiológicas (Fasano et al., 2002). Dentre

os mecanismos bioquímicos de percepção mais estudados estão as cascatas de

sinalização desencadeadas por estímulos químicos hormonais e de

neurotransmissores. Todavia, os mecanismos pelos quais estímulos primários,

próprios do desenvolvimento da planta ou oriundos do meio ambiente, desencadeam

estas cascatas de sinalisadores químicos são menos conhecidos. Existem

relativamente poucos estudos abordando as respostas primárias da célula vegetal

aos estímulos físicos.

O movimento seletivo e a redistribuição de íons e pequenas moléculas

orgânicas através das membranas biológicas é essencial para a homeostase celular

e, consequentemente, para o desenvolvimento dos organismos. O controle dos

transportes desses íons e moléculas através da membrana plasmática e

endomembranas dos diferentes compartimentos celulares são desempenhados por

proteínas de membrana que constituem canais, carreadores e bombas

eletrogênicas. Esses sistemas possibilitam não somente os trânsitos de metabólitos

nessas membranas, como também estabelecem e mantêm gradientes iônicos que

2

são essenciais para vários processos metabólicos (Chasan e Schroeder, 1992; Taiz

e Zeiger, 1998). Os sistemas de transporte presentes nas biomembranas podem ser

divididos em dois grupos: os sistemas primários (bombas eletrogênicas), capazes de

gerar um gradiente eletroquímico ao transportar íons contra um gradiente de

concentração, utilizando-se da energia liberada na quebra de ligações covalentes, e

os sistemas secundários desempenhado por canais, carreadores ou

transportadores, onde o transporte de íons através da membrana não envolve

quebra de ligações covalentes, mas depende do desequilíbrio de cargas e diferença

de pH (∆pH) gerado na membrana pelos sistemas primários (Logan et al., 1997).

As H+-ATPases, são as principais bombas eletrogênicas responsáveis pela

interconversão da energia química, elétrica e luminosa nas células de todos os

organismos vivos. Nas membranas das células vegetais, encontram-se três

diferentes tipos de H+-ATPases (a H+-ATPase da membrana vacuolar e

endomembranas – tipo V, a H+-ATPase da membrana plasmática – tipo P e a H+-

ATPase das membranas do cloroplasto e mitocôndrio – tipo F) que se distinguem

por suas estruturas, funções, mecanismos de ação e evolução, cada uma

representando uma das três classes de ATPases translocadoras de cátions

(Pedersen e Carafoli, 1987).

Uma outra classe de enzimas, as pirofosfatases (H+-PPases) têm sido

caracterizadas tanto ao nível bioquímico quanto molecular e, atualmente, são

consideradas como um quarto grupo de enzimas translocadoras capazes de acoplar

a hidrólise do pirofosfato inorgânico à translocação de prótons através do tonoplasto

(Rea et al., 1992).

As bombas de prótons das membranas vacuolar e plasmática exercem um

papel fundamental no controle do pH citoplasmático e na manutenção da

homeostase celular, bem como no transporte de moléculas e íons e no crescimento

celular (Taiz e Zeiger, 1998). As H+-ATPases e H+-PPases vacuolares, geram um

gradiente eletroquímico de prótons através do tonoplasto, acidificando o vacúolo e

fornecendo energia para o transporte de íons e outros metabólitos. Isso possibilita a

incorporação de solutos e de água no vacúolo, induzindo à expansão da célula

devido à pressão de turgescência gerada pelo vacúolo central (Frey e Randall,

1998). A H+-ATPase de membrana plasmática, acidifica o apoplasto, o que ativa as

expansinas (proteínas que promovem a quebra e reorganização dos polímeros de

celulose da parede celular), possibilitando assim, o crescimento celular (Buchanan et

3

al., 2000). Além disso, o gradiente eletroquímico de prótons que se desenvolve

através da membrana plasmática impulsiona o transporte secundário possibilitando a

absorção de nutrientes (Serrano, 1989; 1990).

Foi postulado que dado à essencialidade das bombas eletrogênicas para os

eventos de absorção de moléculas e íons, quaisquer variações detectadas no

crescimento celular, sejam elas reguladas por fitohormônios, sinais químicos, luz, ou

estímulos mecânicos podem ter forte associação com alterações no funcionamento

dessas bombas (Serrano, 1989; 1990). Apesar disso, pouco se conhece sobre os

efeitos da luz, da estimulação mecânica (brushing) e do som sobre a atividade

destes sistemas, principalmente das bombas de H+ do tonoplasto. Nesse estudo,

objetivou-se avaliar o efeito destes estímulos (ou estresses) físicos e mecânicos

sobre a atividade das enzimas H+-ATPase e H+-PPase do tonoplasto e da H+-

ATPase da plasmalema. Com isso pretende-se estabelecer uma nova dimensão do

papel regulador dessas enzimas sobre o desenvolvimento das plantas, investigando

também o potencial destes sistemas como marcadores bioquímicos para prospecção

da intensidade e qualidade de estímulos mais efetivos à produtividade vegetal e para

a determinação fisiológica mais precisa das condições de estresse. O uso destes

marcadores poderá vir a guiar a programação de protocolos de robotização para

brushing e outros sistemas controlados de estimulação mecânica e luminosa, além

de fornecer informações básicas, necessárias à futura compreensão dos limites que

devem ser impostos em áreas agrícolas no que concerne ao controle mecânico pelo

toque e por vibrações sonoras (vento, mecanização da lavoura, pisoteio do gado,

proximidade de rodovias, e etc.) visando maximizar a produtividade agrícola.

4

2. REVISAO DE LITERATURA

2.1 H+-ATPase de membrana plasmática

A H+-ATPase de membrana plasmática (P-ATPase) de plantas desempenha

funções chave na fisiologia das plantas. Ela bombeia prótons através da membrana

plasmática do citoplasma para o exterior da célula (apoplasto) a partir da utilização

da energia proveniente da hidrólise da ligação fosfato terminal da molécula de ATP.

A bomba de prótons da membrana plasmática é uma H+-ATPase tipo P,

caracterizando-se por assumir dois estados conformacionais designados E1 e E2

(Serrano, 1989). A enzima é formada por um único polipeptídio de 100 KDa, que é

ativo nas formas monomérica e homodimérica. O monômero tem 10 domínios

transmembranares e uma grande alça hidrofílica contendo a região de ligação do

ATP (Sze et al., 1999) (Figura 1). As ATPases de membrana plasmática são inibidas

por ortovanadato (H2VO4-) (Sze et al., 1999) e por complexos de fluoreto de alumínio

(Façanha e de Meis, 1995) por competirem com o fosfato pelo sítio de fosforilação

da enzima .

A H+-ATPase de membrana plasmática constitui uma base para processos de

transporte pela membrana plasmática, devido à formação do gradiente de pH e do

potencial elétrico gerado pela bomba. Contudo, além do fluxo dirigido através de

outros sistemas de transporte, a H+-ATPase de membrana plasmática representa

várias outras funções essenciais na biologia celular da planta. A acidificação da

parede celular induz a plasticidade da parede, possibilitando, assim, a expansão

celular, e a bomba também é essencial na remoção do excesso de H+ do citossol. A

alcalinização do citoplasma talvez seja um dos fatores disparadores da divisão

celular (Serrano, 1989; Serrano, 1990).

5

Figura 1. Estrutura geral da H+-ATPase de membrana plasmática, exibindo os 10

domínios hidrofóbicos e a grande alça que contém a região de ligação do ATP.

Fonte: Buchanan et al., 2000.

Como outras enzimas, a ATPase de membrana plasmática é regulada por

variáveis tais como a concentração de substrato (ATP), pH, temperatura e

fosforilação/desfosforilação (Sze et al., 1999). Moléculas individuais de H+-ATPase

podem ser reversivelmente ativadas ou desativadas em resposta a uma variedade

de sinais, tais como luz, hormônios, ataque de patógenos, dentre outros. Esse tipo

de regulação é mediado por um especializado domínio autoinibitório da região C-

terminal da cadeia polipeptídica, o qual age como uma válvula, regulando a atividade

da bomba de prótons (Taiz e Zeiger, 1998).

Eventos de fosforilação e desfosforilação são mecanismos de regulação das

H+-ATPases de membrana plasmática que podem alterar a atividade da bomba.

Assim, a promoção ou inibição da atividade dessas enzimas, resulta da modulação

dependente de fosforilação, promovendo com isso, a ligação da proteína 14-3-3

ativada ao domínio autoinibitório. A ligação da proteína 14-3-3 depende da

fosforilação de um resíduo de treonina na conservada seqüência C-terminal da

enzima. Análises desse complexo formado entre a H+-ATPase de membrana

plasmática e a proteína 14-3-3 (H+-ATPase●14-3-3) mostram que ele apresenta a

estrutura em forma de roda, com 6 H+-ATPases associadas por 6 proteínas 14-3-3.

6

A H+-ATPase de membrana plasmática é mais efetivamente regulada ao nível pós-

translacional (Kanczewska et al., 2005; Ottmann et al., 2007).

As proteínas 14-3-3 estão presentes em todos os eucariotos e agem como

reguladores em várias vias de transdução de sinal, desempenhando um papel

funcional chave em muitas rotas fisiológicas que são reguladas por fosforilação. Sua

função é completar o processo de tradução de sinais, atuando como ligante

fisiológico; completando uma mudança na estrutura, o que regula a atividade de

enzimas (DeLille et al., 2001).

2.2 H+-ATPase vacuolar

A H+-ATPase vacuolar (V-ATPase) está presente em endomembranas de

todos os eucariotos. Isso inclui o retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi, o

lisossomo, o tonoplasto, e vesículas intracelulares que traficam entre todas essas

membranas (Dettmer et al., 2006).

Os sistemas de transporte primários de prótons da membrana vacuolar de

plantas, denominada tonoplasto, exercem um papel fundamental no controle do pH

citoplasmático e na manutenção da homeostase celular. Sob condições de estresse

como salinidade, seca, frio, estresse ácido, anoxia e excesso de metais pesados no

solo, a sobrevivência da célula depende fortemente da manutenção ou ajuste da

atividade da V-ATPase (Dietz et al., 2001). Por isso, fatores que afetam a atividade

dessas enzimas geralmente provocam reflexos severos sobre o desenvolvimento da

planta (Taiz e Zeiger, 1998).

O vacúolo é a maior organela da maioria das células vegetais, podendo

compreender mais de 90% do espaço intracelular de uma célula madura (Taiz,

1992). No tonoplasto, encontram-se duas diferentes bombas de prótons, uma H+-

ATPase do tipo V e uma próton-pirofosfatase (H+-PPase) ligadas à membrana (Rea

et al., 1992). Ambas as enzimas são capazes de gerar um gradiente eletroquímico

de prótons no tonoplasto pela hidrólise de ATP ou de PPi, os quais são utilizados

para energizar a translocação de solutos (como íons inorgânicos, açúcares e ácidos

orgânicos) do citoplasma para o interior do vacúolo (Rea e Sanders, 1987). Essa

atividade é de vital importância para o controle da concentração de metabólitos e

para a compartimentação de agentes tóxicos, que, eventualmente, possam vir a

acessar o citoplasma (Taiz, 1992). Esse gradiente de H+ gerado através da

7

membrana vacuolar pode, também, impulsionar a síntese de ATP e PPi, devido à

capacidade de reversibilidade dos ciclos catalíticos dessas enzimas (Façanha e de

Meis, 1998).

A H+-ATPase do tonoplasto consiste de várias subunidades polipeptídicas, as

quais estão localizadas em dois domínios, um domínio globular hidrofílico na

periferia da membrana (V1), contendo o sítio de ligação nucleotídica, e um domínio

hidrofóbico integral da membrana (V0), contendo o canal de próton (Ratajczak, 2000)

(Figura 2). Análises de membranas vacuolares utilizando técnicas de microscopia

eletrônica, revelaram que a ATPase vacuolar apresenta uma estrutura “cabeça e

talo” similar na forma mas diferente no tamanho àquele apresentada pela H+-ATPase

do tilacóide e da membrana mitocondrial (F-ATPase) (Figura 4) (Bowman et al.,

1989). Apesar do alto grau de homologia estrutural entre essas enzimas, “in vivo” as

V-ATPases operam hidrolisando o ATP, enquanto as F-ATPases promovem a

síntese do ATP (Grabe et al., 2000).

Devido a grande semelhança estrutural existente entre as V-ATPases e as F-

ATPases, acredita-se que as V-ATPases também compartilhem um modelo

mecânico funcional comum com as F-ATPases, onde cada subunidade da V-ATPase

seria atribuída a uma das 4 partes da “máquina mecânoquímica” de Paul Boyer (F-

ATPase), apresentando-se da seguinte forma: 1-unidade catalítica, 2-talo, 3-gancho

e 4-turbina. A unidade catalítica seria composta pelas subunidades A e B, o

tradicional tronco agora dividido em gancho seria composto pelas subunidades E e

G, o talo pela subunidade D, e, a turbina seria composta pelas subunidades a e c. O

setor catalítico teria a função de ligar e hidrolisar ATP, promovendo uma rotação

momentânea do talo, que por sua vez irá rodar a turbina. A turbina tem a função de

conduzir H+ através da membrana e o gancho previne a rotação da unidade

catalítica (Nelson e Harvey, 1999).

A homologia na seqüência de várias subunidades das ATPases do tilacóide e

da membrana mitocondrial com a ATPase do tonoplasto e a similaridade na

estrutura das holoenzimas sugerem a existência de uma proteína ancestral comum

no passado evolutivo de ambas as ATPases (Ratajczak, 2000). Entretanto, as

ATPases do tonoplasto mostram uma complexidade ainda maior que suas parentais,

as ATPases do tipo F (Lai et al., 1991).

A ATPase vacuolar de plantas possui um peso molecular de,

aproximadamente, 730 kDa, mas, tem sido observado que a composição das

8

subunidades da ATPase do tonoplasto em preparações de diferentes espécies de

plantas não tem sido a mesma. Se a composição da subunidade realmente variar

entre espécies, a atividade enzimática também poderia sofrer variações entre as

espécies (Ratajczak, 2000).

A configuração básica da porção periférica (V1) consiste em três cópias da

subunidade catalítica A, onde se situam os sítios de ligação de ATP (Nelson e Taiz,

1989), intercaladas por três cópias da subunidade B, subunidade não-catalítica de

ligação do substrato; apresentando massa molecular de 67 a 73 kDa e 55 a 60 kDa,

respectivamente (Ratajczak, 2000). As subunidades A e B apresentam semelhanças

estruturais com as subunidades ββββ e αααα, respectivamente, da ATPase do tilacóide e da

membrana mitocondrial. As subunidades D (32 a 33 kDa) e G (12-16 kDa) participam

no acoplamento da hidrólise de ATP e no transporte de H+ (Ratajczak, 2000)

enquanto as subunidades F (13-14 kDa) e E (28 a 32 kDa) parecem estar envolvidas

na conexão dos setores V0 e V1, mantendo a estabilidade estrutural da enzima

(Tomashek et al., 1997). Podemos observar ainda as subunidades C (40 a 45 kDa) e

H (51-54 kDa). A configuração básica da porção integral de membrana (V0) é

composta por 6 subunidades (a, c, c' , c'' , d e e). A subunidade c é um peptídio

altamente hidrofóbico (Ratajczak, 2000; Drory e Nelson, 2006) e parece estar

envolvida diretamente na translocação de H+ (Figura 2).

Figura 2. Estrutura geral da H+-ATPase do tonoplasto mostrando o setor V1,

orientado para o citossol, e o setor V0, integral de membrana com suas múltiplas

subunidades. Fonte: Forgac, M. (1998).

exterior celular

citoplasma

membrana

9

Liu et al. (2004) mostraram que a fosforilação aumentou a atividade da V-

ATPase em vesículas isoladas de raízes de milho. Os autores identificaram a

subunidade A como sendo fosforilada em um resíduo serina conservado da

subunidade. Em virtude da seqüência de aminoácidos dessa região fosforilada e

pelo fato da subunidade A da V-ATPase parecer ser homóloga com a subunidade β

da F-ATPase, foi hipotetizado que a V-ATPase pode interagir com membros da

família de proteínas 14-3-3, de maneira dependente de fosforilação, justamente

como as F-ATPases. Recentemente foi encontrado que a subunidade β da F-

ATPase de plantas pode se ligar a proteínas 14-3-3, o que resulta na inibição da

atividade das ATPases (Bunney et al., 2002).

As V-ATPases são estimuladas por ânions, como o cloreto, e,

especificamente, inibidas por nitrato e pelos antibióticos bafilomicina A1 e

concanamicina A, e podem, também, ser inibidas pelo ADP citosólico, que compete

com o ATP pelo sítio catalítico (Kettner et al., 2003). Entretanto, são insensíveis ao

inibidor da ATPase de membrana plasmática (ortovanadato) e ao inibidor da ATPase

do tilacóide e da membrana mitocondrial (azida e oligomicina). O nitrato promove a

dissociação entre os setores V1 e V0 da enzima (Kane et al., 1989; Bowman et al.,

1989). A ação da bafilomicina A1 se dá pela ligação desse inibidor ao setor V0 da V-

ATPase impedindo assim o fluxo de prótons através do canal de prótons da enzima

(Crider et al., 1994). Foi demonstrado que a ligação da bafilomicina A1 ao setor V0

ocorre na subunidade c (16 kDa) (Bowman e Bowman, 2002).

O pH ótimo para atividade dessas enzimas está entre 7.0 e 8.0. Diferentes

mecanismos estão envolvidos na regulação da atividade dessas enzimas, tais como:

fosforilação das subunidades da ATPase do tonoplasto, modificações do estado

redox da enzima por oxidação e redução de grupos sulfidrilas essenciais, presentes

nas subunidades A e B da ATPase do tonoplasto (Merzendorfer et al., 1997).

Mudanças na disponibilidade do substrato Mg-ATP no citoplasma e os fosfolipídios

presentes na fase cristalina líquida do tonoplasto são importantes fatores para a

regulação, o que mostra a complexidade dos mecanismos regulatórios da atividade

dessas enzimas (Merzendorfer et al., 1997). Outro mecanismo de regulação da V-

ATPase é a dissociação reversível do complexo enzimático (setores V1 e V0 da

enzima) (Kane, 1995; 2000). Os setores V1 e V0 da V-ATPase quando dissociados

não são capazes de hidrolisar ATP e transportar H+, diferentemente dos setores F1 e

F0 da F-ATPase (Zhang et al., 1992; Finbow e Harrison, 1997; Parra et al., 2000).

10

A mudança na eficiência do acoplamento do transporte de H+ à hidrólise de

ATP é outro mecanismo de regulação da H+-ATPase vacuolar (Sze et al., 1999,

Forgac, 1999). Vários fatores podem causar mudanças na taxa de acoplamento do

transporte de prótons e hidrólise de ATP (Forgac, 1998; Müller et al., 1999). A

atividade da V-ATPase também pode ser regulada pela interação com proteínas

ativadoras e inibidoras de baixo peso molecular (Merzendorfer et al., 1997).

Além da regulação no nível protéico (pós-traducional), a regulação da

expressão de genes da V-ATPase também é uma importante forma de se modular

os fenômenos associados a atividade desta enzima. Foi observado que a

quantidade de RNAs mensageiros das subunidades da V-ATPase e da holoenzima é

alterada em resposta a estresses ambientais como temperatura e salinidade bem

como por fitormônios que também podem influenciar a expressão de genes da V-

ATPase e a modificação em nível de proteína. A regulação pela expressão das

diferentes isoformas das subunidades da ATPase do tonoplasto em vários tecidos ou

sob certas condições ambientais exerce influência sobre o desenvolvimento da

morfologia geral da planta (Ratajczak, 2000).

2.3 H+-PPase vacuolar

As H+-PPases são encontradas principalmente em plantas superiores, em

alguns protozoários, e em várias espécies de eubactéria e archeobactéria (Karlsson,

1975; Drozdowicz e Rea, 2001; Mimura et al., 2004; Au et al., 2006). São proteínas

com uma única classe de polipeptídios de 75 KDa, altamente hidrofóbicas, com 14-

17 domínios α-hélices expandidos na membrana, funcionando provavelmente, como

um homodímero na geração de gradientes de prótons através de endomembranas

usando a energia da ligação fosfoanidrida de moléculas de pirofosfato inorgânico

(PPi) como substrato de baixo custo, mas de alta energia (Buchanan et al., 2000,

Maeshima, 2000) (Figura 3). O pH ótimo para sua atividade varia na faixa de 6,5 a

7,5 (Maeshima e Yoshida, 1989). A região catalítica que contém o sítio de ligação do

substrato (Mg-PPi) é formada por 5 alças citoplasmáticas (e, i, K, m e o) com

sequências de aminoácidos relativamente conservadas na região C-terminal

(Mimura et al., 2004).

As H+-PPases são inibidas, especificamente, por bifosfonatos (compostos

contendo ligação P-C-P não hidrolisável ao invés da cadeia P-O-P), por análogos de

11

PPi como o imidodifosfatos (IDP) (contêm grupo P-N-P não hidrolisável), fluoretos

(KF e NaF), e aminometilenodifosfonato (AMDP), um potente inibidor específico de

H+-PPase de plantas (Baykov et al., 1993; Zhen et al. 1997; Baykov et al., 2000;

Szabo e Oldfield, 2001).

Figura 3. Estrutura geral da H+-PPase do tonoplasto, exibindo os domínios

hidrofóbicos e o sítio de ligação do PPi. Fonte: Maeshima, 2000.

Essas enzimas, em alguns casos, podem gerar um gradiente de prótons de

magnitude similar ao gerado por H+-ATPases vacuolares de algumas espécies

vegetais (Lüttge et al.,1995). A quantidade estimada sugere que a H+-PPase K+-

dependente representa entre 1% a 5-10% da proteína total do tonoplasto enquanto

que a H+-ATPase pode constituir mais de 30% (Maeshima e Yoshida, 1989; Klink et

al., 1990). Na maioria dos tecidos a V-ATPase é a bomba de prótons dominante

(Müller et al., 1996).

Experimentos têm sido realizados com a finalidade de esclarecer porque a H+-

PPase coexiste com a H+-ATPase na mesma membrana vacuolar. A existência da

H+-PPase em células de plantas pode estar relacionada à imensa área dos vacúolos

nas plantas (Nakanishi e Maeshima, 1998). Além da H+-PPase ser funcional na

energização dos sistemas de transporte secundários da membrana vacuolar em

sincronismo com a V-ATPase nas plantas sob diversas condições fisiológicas, o PPi

tem sido considerado um substrato alternativo ao ATP, atuando como doador de

energia metabólica da célula sob estresse energético. Os níveis da atividade

Sítio de ligação do PPi Citoplasma

Vacúolo

12

enzimática e dos transcritos da H+-PPase, apresentaram notáveis aumentos em

plântulas de arroz submetidas a condições de estresse (anoxia e baixa temperatura).

De acordo com esses dados, acredita-se que a H+-PPase possa atuar,

principalmente, em condições de estresse (Carystinos et al., 1995).

É proposto que esta enzima facilita a conservação da demanda limitada de

ATP e recicla Pi durante condições de estresse (Palma et al., 2000). Uma vez que

grandes quantidades de PPi inorgânico são produzidas como subproduto da síntese

de macromoléculas, reações que utilizem PPi em vez de ATP consistem em uma

vantagem bioenergética óbvia para plantas sujeitas a balanços desfavoráveis de

energia. Todas as principais vias biossintéticas geram PPi. Como exemplos

podemos citar: a acetilação da CoA na síntese de ácidos graxos; a aminoacilação do

tRNA na síntese de polipeptídeos; a formação de ligações fosfodiéster na síntese de

polinucleotídeos e a ativação de açúcares na síntese de polissacarídeos. Outras

importantes reações que formam PPi são a síntese de nucleosídeos e lipídeos, e a

formação de fosfosulfato de adenosina a partir de ATP e SO42- (Rea e Sanders,

1987).

Essas enzimas podem funcionar como um sistema de fornecimento de

energia em forma de um gradiente de pH através do tonoplasto, que é utilizado para

energizar o transporte ativo secundário, e também podem contribuir juntamente com

a V-ATPase na regulação do pH citossólico (Barkla e Pantoja, 1996; Maeshima,

2001). Em sementes e coleóptilos de milho, o gradiente de H+ gerado pela H+-PPase

e pela V-ATPase pode ser utilizado por essas enzimas para a síntese de ATP e PPi,

respectivamente, mostrando um caráter de reversibilidade dessas bombas de H+

(Façanha e de Meis, 1998). Em condições onde haveria uma limitação no

suprimento de ATP, a H+-PPase teria o papel de gerar e manter o gradiente

eletroquímico de H+ através do tonoplasto.

As H+-PPases têm sido clonadas de diferentes organismos como plantas

terrestres, algas marinhas e verdes, bactérias fotossintéticas, protozoários e

arqueobactérias (Maeshima, 2001). O primeiro cDNA para H+-PPase clonado foi de

Arabidopsis thaliana, apresentando uma isoforma AVP1 (Sarafian et al., 1992) K+

dependente e mais recentemente foi caracterizado o cDNA para uma outra isoforma,

K+ independente, AVP2 (Drozdowicz et al., 2000).

Drozdowicz et al., (2000) verificaram que a AVP2 apresenta algumas

características semelhantes a H+-PPase estimulada por K+ (AVP1). Tanto AVP1

13

quanto AVP2 apresentam cinética de hidrólise de PPi praticamente idênticas e

ambas apresentam um requerimento obrigatório por Mg2+ e a inibição por

aminometilenodifosfonato (AMDP) é semelhante em ambas H+-PPases. Por outro

lado, ao contrário de AVP1, cuja atividade apresentou um aumento de oito vezes

com a inclusão de 50 mM de KCl ao meio de ensaio, AVP2 não apresentou estímulo

por K+ na hidrólise de PPi e no transporte de H+, sendo então considerada K+-

independente. Outra diferença entre essas duas H+-PPases é sua sensibilidade ao

cátion Ca2+. AVP2 é 3 vezes mais sensível ao Ca2+ livre do que AVP1. Além do

mais, AVP2 apresenta somente 36% de identidade de seqüência de aminoácidos

com AVP1, enquanto que AVP1 mostram 80% ou mais de identidade entre si. A

partir desses resultados, Drozdowicz et al. (2000) designaram AVP1 como sendo H+-

PPase do tipo I e AVP2 como H+-PPase do tipo II.

O bombeamento de prótons, pela H+-ATPase e pela H+-PPase, não somente

energiza o tonoplasto para o transporte mediado por carreadores, mas também gera

o baixo pH do vacúolo, onde proteases, glucosidases, fosfatases, e nucleotidases

permanecem e funcionam em pH ácido (Buchanan et al.,2000).

2.4 H+-ATPase mitocondrial e cloroplastídica

Assim como as V-ATPases, as H+-ATPases mitocondrial e cloroplastídica (F-

ATPases) consistem de duas principais porções: uma porção expandida na

membrana (F0), contendo o canal de próton, e uma porção solúvel (F1), contendo os

sítios de ligação nucleotídica (Figura 4) (McCarty et al., 2000).

As H+-ATPases do tipo F são encontradas nas membranas mitocondrial

interna (F1F0-ATPase) e cloroplastídica (CF1CF0-ATPase) das plantas e sintetizam

ATP. Esses dois tipos de membranas contêm cadeias de transporte de elétrons

bombeando prótons impulsionadas pelo potencial redox e pela energia luminosa,

respectivamente. A força próton motora estabelecida pela cadeia de transporte de

elétrons aciona o fluxo de prótons por meio das ATPases tipo F, assim resultando na

síntese de ATP. As enzimas possuem várias subunidades em comum que são

essenciais para catálise e as subunidades adicionais provavelmente executam

funções regulatórias (Buchanan et al., 2000).

14

H+-ATPase mitocondrial

Estudos de cinética enzimática realizados por Paul Boyer, nas décadas de 50

e 60, o levaram a propor o ciclo catalítico das F-ATPases ou ATP sintases que

predizia a existência de três sítios de ligação para nucleotídeos, os quais

apresentariam três conformações distintas. Em um dado instante, um sítio está em

uma conformação aberta, outro está ligando um nucleotídeo de adenina (ADP+Pi /

ATP) e o terceiro está ligando firmemente o nucleotídeo sintetizado (ATP).

Posteriormente, esses estudos foram confirmados através de estudos

cristalográficos do setor F1 de mitocôndria de boi, realizados por Jonh Walker, o qual

apresentou um modelo conformacional para síntese de ATP estruturado como

predito por Paul Boyer, o qual postula que o ATP é sintetizado pelas ATPases tipo F

através de um processo de catálise rotacional, onde os três sítios catalíticos

alternam-se nas atividades de ligação de substratos (ADP e Pi), catálise/sintese e

liberação do produto (ATP) (Boyer, 1997; Grabe et al., 2000; Buchanan et al., 2000).

Estes estudos abriram novas perspectivas na compreensão da catálise enzimática, e

a enorme quantidade de pesquisas que se seguiram têm demonstrado que a

transdução de energia realizada por essas enzimas envolve principalmente discretas

perturbações mecânicas nas subunidades envolvidas na catálise da reação. Parte

da energia que é transformada em síntese de ATP ou em gradiente eletroquímico

(via reversa) provém da própria ligação do substrato á enzima (energia de ligação) e

outra parte advêm de energia cinética (elástica) acumulada na estrutura da

subunidade catalítica (Boyer, 1989).

15

Figura 4. Estrutura geral da H+-ATPase do mitocôndrio mostrando o setor F1,

orientado para a matriz mitocondrial, e o setor F0, integral de membrana com suas

múltiplas subunidades. Fonte: www.abcbodybuilding.com/.../simpleatpase.jpg.

H+-ATPase cloroplastídica

As ATPases do cloroplasto são enzimas multiméricas com pesos moleculares

por volta de 450 KDa, capazes de utilizar a energia do gradiente eletroquímico

gerado na membrana dessa organela para sintetizar ATP a partir de ADP e Pi

(Pedersen e Carafoli, 1987). Esse gradiente eletroquímico é gerado por sistemas

translocadores de prótons localizados nos tilacóides. No cloroplasto, existem

fotorreceptores capazes de captar a energia luminosa elevando seus elétrons a

camadas mais energéticas, desencadeando assim um processo de transporte

eletrônico que, por sua vez, energiza o transporte de prótons através dos tilacóides.

Tem-se, então, a conversão da energia luminosa em energia eletroquímica do

gradiente de prótons, e essa, se converte em energia química, pela ação da ATP-

sintase ao catalisar a síntese de ATP.

É também importante entender que a atividade da ATPase de cloroplasto

(bombeando prótons para dentro) é controlada tanto pela ativação pelo pH do próton

conduzido pelo canal transtilacoidal (CF0, a parte da ATPase ligada a membrana),

bem como pelo estado de redução do resíduo chave de cisteína (SH-HS) da

subunidade γ da porção CF1 da proteína (exposto para o estroma, porção extrínseca

da ATPase que tem a atividade enzimática) (Mills e Mitchell, 1982).

Matriz

Espaço inter membrana

16

2.5 Estímulos e estresses físicos

2.5.1 Estimulação e estresse luminoso

Por não se locomoverem, as plantas desenvolveram estratégias para se

adaptarem a diversas mudanças ambientais, incluindo a luz, otimizando assim, o

crescimento (Chamovitz e Deng, 1996). Dos muitos estímulos afetando o

desenvolvimento das plantas, a luz é o mais importante sinal ambiental. Ela é a fonte

de energia para o processo fotossintético, um sofisticado processo modulado pela

quantidade e qualidade de luz, provendo a energia química na forma de açúcares

necessária para a manutenção e o crescimento da célula, e por isso, as plantas

desenvolveram uma complexa e sofisticada maquinaria que lhes capacita

perceberem a presença, ausência, qualidade, intensidade, direcionalidade e

durabilidade dessa luz incidente e usam isso como um sinal para otimizar o

crescimento e desenvolvimento durante seu ciclo de vida (Batschauer, 1998; Quail,

2002).

A luz está envolvida em todos os aspectos do desenvolvimento, tendo

particularmente intenso efeito na morfogênese de plântulas durante a transição da

forma de vida heterotrófica (sob a terra) para o crescimento fotoautotrófico. Durante

o desenvolvimento da plântula, a luz inibe o crescimento do hipocótilo, estimula a

abertura do gancho, a expansão do cotilédone, induz a diferenciação de folhas e

cloroplastos, e a formação de pigmentos e tricomas, e a expressão de um grande

número de genes codificados pelo núcleo e pelo cloroplasto (Chory, 1997;

Batschauer, 1998). Vários outros aspectos do crescimento e desenvolvimento das

plantas são afetados pela luz, tais como, germinação de sementes, percepção e

resposta de plantas próximas, abertura estomática, fototropismo e indução do

florescimento (Batschauer, 1998; Lin, 2000).

A informação fornecida pelo ambiente de luz pode ser percebida por um

complexo sistema de diferentes fotorreceptores, os quais detectam diferentes

qualidades de luz sobre uma ampla área espectral. Esses receptores são os

fitocromos, que são os fotorreceptores mais bem caracterizados e responsáveis pela

detecção de luz vermelha (600 – 700 nm) e luz vermelha distante (700 – 750 nm), os

criptocromos e as fototropinas são fotorreceptores de luz azul (390 – 500 nm) e luz

UV-A (320 – 390 nm) e os fotorreceptores de luz UV-B. Esses pigmentos traduzem

17

sinais de luz em sinais bioquímicos, subseqüentemente, traduzindo rotas

desconhecidas diretamente em mudanças moleculares e fisiológicas que modulam o

crescimento e o desenvolvimento (Casal et al., 1998). Existem ainda os pigmentos

fotossintéticos que compreendem um grupo adicional de fotorreceptores. Esse grupo

inclui as várias clorofilas e carotenóides envolvidos primariamente na transferência

da energia luminosa para a cadeia transportadora de elétrons na fotossíntese

(Goodwin, 1988).

2.5.1.1 Fotorreceptores em plantas - Fitocromos e C riptocromos

Os fitocromos constituem uma pequena família de proteínas diméricas e são

compostos de dois polipeptídios de, aproximadamente, 125 KDa. A região

fotorreativa (cromóforo) dessas proteínas é formada por uma cadeia aberta

tetrapirrólica fixada a um resíduo conservado de cisteína na região do domínio amino

terminal de cada subunidade, o qual retém a habilidade de fotoconverter o fitocromo

natural entre FV e FVD (ver a explicação abaixo). Por outro lado, o menos bem

conservado domínio C-terminal está envolvido na dimerização dos dois monômeros

e na tradução do sinal luminoso (Chory, 1997; Buchanan et al., 2000).

A atividade fotossensora da molécula de fitocromo é caracterizada pela

capacidade de ser submetida à reversibilidade, interconversão induzida por luz entre

duas conformações: a forma biologicamente inativa, que absorve luz vermelha (FV),

e a forma biologicamente ativa, que absorve luz na faixa do vermelho distante (FVD)

(Smith, 2000). Essa fototransformação envolve uma isomerização cis-trans de uma

das cópias ligadas ao cromóforo, resultando em uma reorientação do cromóforo

relativo ao polipeptídio, e múltiplas mudanças conformacionais na estrutura

tridimensional da proteína (Chamovitz e Deng, 1996). Os fitocromos são sintetizados

na forma FV e é nesta forma, também, que são encontrados no citossol e/ou talvez

associados com a membrana plasmática (Nagy et al., 2000).

A luz, como uma onda eletromagnética, pode facilmente penetrar nos tecidos

das plantas. Luz vermelha (V) e vermelho distante (VD) podem, então, passar

através de múltiplas fileiras de folhas ou órgãos compactos como hastes e ativar os

fotorreceptores fitocromos provavelmente em todas as células de qualquer tecido

exposto diretamente ou indiretamente à luz (Nagy et al., 2000). Estudos fisiológicos

indicaram que o fitocromo está distribuído por toda parte da planta, apesar de certos

18

tipos celulares, dependendo do estádio de desenvolvimento, conterem diferentes

quantidades do fotorreceptor (Clack et al., 1994), entretanto, cada célula da planta

contém, no mínimo, um tipo de fitocromo para algum estádio de desenvolvimento

(Nagy et al., 2000).

Em Arabidopsis thaliana, o componente da apoproteína do fitocromo é

codificado por cinco genes designados phyA - phyE (Clack et al., 1994). O fitocromo

A (PHYA, também referido como fitocromo tipo I) é necessário para percepção de

luz vermelha distante (VD) contínua. É uma molécula solúvel que está

uniformemente distribuída no citoplasma de plantas crescidas no escuro e,

comparado a outros fitocromos, o PHYA é altamente abundante em plântulas

estioladas. A converção da forma FVD pela absorção de luz vermelha origina o PHYA

para, rapidamente, agregar-se ao citoplasma e degradar-se (Vierstra, 1994). O

fitocromo B (PHYB) é necessário para percepção de luz vermelha (V) contínua. Está

presente em baixos níveis nas condições de escuro e luz, sendo estável na forma

FVD (Reed et al., 1994). O PHYA e o PHYB têm diferentes funções fotoperceptoras.

O PHYB parece estar envolvido na percepção de raios V/VD, enquanto que PHYA

percebe transições de escuro/luz, se igualando sobre espessa cobertura ou após

curta exposição à luz (Casal et al., 1997). Em contraste, o ponto final do processo

controlado pelos fitocromos A e B é o mesmo. Em Arabidopsis, ambos os fitocromos

controlam o processo de germinação e as mudanças fotomorfogênicas (Reed et al.,

1994). Pouco se conhece sobre as funções dos PHYC, -D e -E.

Em plântulas estioladas e adaptadas ao escuro, os fitocromos A e B estão

localizados no citossol. O transporte nuclear desses fitocromos é dependente de luz

e cada espécie de fitocromo mostra ser dependente de uma qualidade e quantidade

de luz específica para o transporte ou formação nuclear (Nagy et al., 2000).

Tradicionalmente, três “modos de ação” de fitocromos têm sido descritos:

resposta de muito baixa fluência (RMBF); resposta de baixa fluência (RBF) e

resposta de alta irradiância (RAI) (Casal et al., 1998). Os efeitos de pulsos de luz

seguidos por escuridão são chamados respostas “indutivas” porque o sinal de luz

estabelecido durante o pulso de luz continua operando durante algum tempo no

escuro. Esses efeitos (promoção ou inibição) podem ser classificados como RMBF

ou RBF, dependendo das fluências de vermelho necessárias para estabelecer esses

valores de FVD. Proporções muito baixas de fitocromos como FVD (FVD/F) são

suficientes para induzir RMBF, enquanto altos níveis de FVD/F são necessários para

19

induzir RBF. Em alguns processos, um único pulso de luz não mostra efeito

detectável, mas repetidos pulsos de luz (de hora em hora) são efetivos (Casal et al.,

1998). Os efeitos de luz contínua são chamados RAI, entretanto, alguns efeitos não

requerem especificamente luz contínua e podem ser induzidos (ao menos

parcialmente) com repetidos pulsos do mesmo comprimento de onda, dando, na

mesma fluência total, como luz contínua (Casal et al., 1998).

Os tecidos podem se adaptar ou tornar-se menos sensíveis a contínuos

sinais, e as concentrações dos receptores podem mudar durante o desenvolvimento

da planta. Quando plântulas estioladas são expostas à luz branca ou vermelha,

ocorre uma rápida redução nas concentrações de fitocromo, devido à degradação.

Concentrações de fitocromos em plantas verdes são bem menores (cerca de 100

vezes menor do que em plântulas estioladas) (Buchanan et al., 2000). Isso,

provavelmente, ocorre devido à necessidade das plântulas estioladas de otimizarem

a capacidade de captação de luz, necessitando, com isso, de um número maior de

fotorreceptores, enquanto as plantas verdes, que já estão inseridas em ambientes

iluminados, conseguem captar a luz com facilidade (Buchanan et al., 2000).

Um modelo geral para sinalização requer fotorreceptores extranucleares

iniciando uma cascata de sinalização, onde o resultado final é a modulação da

expressão gênica ou uma mudança nos parâmetros fisiológicos celulares, tais como

potencial de membrana e/ou pH local, para modificar a morfologia e otimizar a

fotossíntese (Chamovitz e Deng, 1996).

A ativação do fitocromo por luz vermelha parece envolver eventos de

fosforilação de proteínas, sugerindo que uma cascata de fosforilação/desfosforilação

talvez exerça um papel importante na rota de sinalização (Singh e Song, 1990;

Harter et al., 1994). As proteínas G heterotriméricas são mediadores que transmitem

sinais externos via moléculas receptoras para moléculas efetoras (Fujisawa et al.,

2001). Elas são proteínas associadas à membrana, com peso molecular de 40 KDa,

que ligam um GTP análogo em uma forma dependente de luz (Warpeha et al.,

1991). Trabalhando com frações enriquecidas com membrana plasmática isolada do

botão apical de ervilha estiolada, Warpeha et al. (1991) demonstraram que a luz azul

excita a atividade de uma GTPase, sendo ADP-ribosilada. Experimentos com

inibidores e ativadores de algumas proteínas G heterotriméricas indicaram que

várias dessas proteínas podem estar envolvidas em respostas celulares e na

20

regulação da expressão gênica mediada por fitocromos (Romero e Lam, 1993;

Assmann, 2002).

De acordo com Schneider-Poetsch et al. (1991) e Thummler et al. (1995) o

domínio catalítico do fitocromo apresenta potenciais similaridades com o domínio

catalítico da proteína quinase. Entretanto, nenhuma atividade quinase tem sido

mostrada pelo fitocromo, e de fato, várias linhas de evidência debatem contra uma

funcional similaridade entre o fitocromo e as proteínas quinases (Quail, 1994).

O cálcio tem muitos importantes papéis estruturais e fisiológicos nas plantas,

atuando como um mensageiro secundário em diversas cascatas intracelulares de

processos bioquímicos nas plantas em resposta a luz (Nayyar, 2003). O cálcio e a

calmodulina ativada por cálcio estão envolvidos na transdução de sinais do

fitocromo, levando à expressão da clorofila a/b (Neuhaus et al., 1993), enquanto que

guanosina monofosfato (GMPc) medeia o sinal de biossíntese de antocianina

induzido pelo fitocromo (Bowler et al., 1994a). Além disso, a GMPc e

Ca2+/calmodulina são necessários para o desenvolvimento dos cloroplastos (Bowler

et al., 1994a; Bowler et al., 1994b), indicando que há ligação na rota entre a GMPc e

Ca2+/calmodulina. A ligação entre os processos dependentes de energia (transporte)

e as mudanças celulares nos níveis de GMPc levaram Suwastika e Gehring (1999) a

investigarem o efeito do segundo mensageiro na regulação da ATPase in vitro. Seus

resultados sugerem que, em células de folha e haste, o segundo mensageiro, o

GMPc, pode modular a atividade da H+-ATPase de membrana plasmática e que,

dependendo das concentrações, induz inibição in vitro.

Apesar dos fitocromos não detectarem somente luz vermelha e vermelha

distante, mas também luz azul e luz UV, várias linhas de evidências indicam a

presença em plantas superiores, de fotorreceptores específicos para região do azul

e UV-A. A espectroscopia de ação tem mostrado que flavinas, pterinas ou

carotenóides podem agir como cromóforos absorvedores de luz UV-A e luz azul dos

receptores de luz azul (Galland e Senger, 1991; Quinones e Zeiger, 1994).

Entretanto, ao contrário dos fitocromos, uma proteína receptora de luz azul nunca foi

purificada de uma planta com sucesso.

Vários estudos têm mostrado evidências da função da zeaxantina na

fotorrecepção de luz azul em células guarda. A zeaxantina é uma xantofila

sintetizada na rota biossintética dos carotenóides (Pogson et al., 1996). Junto com

21

violaxantina e anteraxantina, a zeaxantina é um membro do ciclo das xantofilas, e

está envolvida na fotoproteção do cloroplasto (Demmig-Adams e Adams, 1996a).

A relação entre o conteúdo de zeaxantina e a radiação incidente através do

dia sugere que a função primária da zeaxantina em cloroplastos de células guarda é

a percepção da luz, preferivelmente a fotoproteção (Zeiger e Zhu, 1998).

Movimentos estomáticos e fototropismo de coleóptilos estimulados por luz azul têm

similar espectro de ação, sugerindo que os dois processos fotobiológicos

compartilham passos na tradução sensora (Quiñones et al., 1996). A percepção da

luz azul pela zeaxantina nas células guarda dos cloroplastos e a tradução de sinais

de luz azul em eventos metabólicos, tais como a hidrólise de amido e a biossíntese

de malato (Talbott e Zeiger, 1993) e os eventos elétricos, como a ativação do

bombeamento de prótons, pela ATPase da membrana plasmática de células guarda

(Assmann et al., 1985) mostram o envolvimento de um segundo mensageiro

conduzindo o sinal das células guarda do cloroplasto para o apropriado alvo

extracloroplastídico.

Experimentos genéticos e de biologia molecular com Arabidopsis thaliana têm

levado a um maior aprofundamento na caracterização molecular de receptores de

luz azul. Os criptocromos foram os primeiros receptores de luz azul identificados.

Vários mutantes fotomorfogênicos foram isolados, um dos quais, o hy4, possui

deficiência na inibição do alongamento do hipocótilo dependente de luz azul,

resultando em um hipocótilo longo quando crescido na luz azul. Esses mutantes

tornaram possível o isolamento do gene hy4 (posteriormente renomeado cry1). O

criptocromo 1 tem sido considerado como o maior receptor de luz azul regulando o

processo de desestiolação, o CRY1 é uma flavoproteína de 75 KDa codificada pelo

gene cry1 em Arabidopsis (Lin et al., 1998). O gene CRY2 foi o segundo criptocromo

isolado de Arabidopsis thaliana. O CRY2 também desempenha uma função na

regulação do crescimento do hipocótilo (Lin, 2000). A expressão do Cry2, em

contraste ao Cry1, é rapidamente inibida por luz azul, o que está, provavelmente,

associado a um mecanismo de degradação da proteína. O rápido declínio nos níveis

do Cry2 ocorre sob alta intensidade de luz azul. Assim, ele funciona melhor sob

baixas intensidades (Lin et al., 1998).

Estudos recentes têm mostrado que plântulas crescidas sob luz verde, são

mais longas do que aquelas crescidas sob luz vermelha e azul. Segundo Folta

(2004), a irradiação por luz verde de plântulas de Arabidopsis estioladas causou um

22

rápido aumento no alongamento da haste, indicando que um novo sensor de luz

ativado por luz verde promove esse alongamento, uma resposta que é contrária à

induzida por todas as outras condições de luz estudadas. Esses achados são uma

resposta biologicamente relevante, possivelmente mediada através de um sistema

fotomorfogênico não caracterizado que forma a planta durante a primeira hora de

percepção da luz e estabalacimento da plântula (Folta, 2004).

A tradução do sinal de luz é uma cadeia integrada entre os fitocromos, os

criptocromos e, provavelmente, a luz verde. Essa interconexão é observada pelo

efeito sinergístico ou antagônico que diferentes comprimentos de onda têm na

expressão dos genes (Terzaghi e Cashmore, 1995; Spalding e Folta, 2005).

2.5.1.2 Efeito fotoinibitório em plantas

A incidência de fótons sobre as plantas desencadeia o processo fotossintético

nos cloroplastos, que contêm os pigmentos especializados na absorção de luz,

denominados clorofilas. Esse processo resulta no crescimento da planta e produção

de biomassa (Greer, 1995). Entretanto, a capacidade fotossintética de uma planta

pode ser severamente reduzida quando ela é exposta a níveis de radiação que

excedem à requerida para saturar a fotossíntese (Kyle e Ohad, 1986). O excesso de

energia luminosa pode levar à produção de espécies reativas de oxigênio e danificar

o sistema fotossintético, se essas não forem dissipadas (Horton et al., 1996).

Também, o excesso de luz pode danificar e inativar o centro de reação do

fotossistema II (PSII), resultando em um fenômeno conhecido como fotoinibição

(Barber e Andersson, 1992; Long et al., 1994).

Os danos fotoinibitórios também estão relacionados com alterações nas

propriedades físico-químicas das membranas tilacoidais, no aumento da dissipação

do excesso de energia não fotoquímica e no decréscimo da eficiência carboxilativa,

provavelmente devido à formação de espécies reativas de oxigênio (Gilmore e

Govindjee, 1999). Essas espécies reativas de oxigênio podem causar peroxidação

lipídica, levando a um aumento da permeabilidade da membrana para íons, incluindo

prótons. O tratamento fotoinibitório pode afetar as propriedades da H+-ATPase do

cloroplasto e de canais de íon, induzindo o extravasamento de prótons (Buege e

Aust, 1978; Foyer et al., 1994; Mittler, 2002 ).

23

O fenômeno da fotoinibição inicia-se pela inativação do transporte de elétrons

ocasionando redução no rendimento quântico fotoquímico do PSII. Em seguida,

pode haver dano irreversível na proteína D1, removendo-a da membrana. A proteína

D1, junto com sua análoga proteína D2, encontram-se inseridas aos principais

cromóforos e cofatores de oxido-redução envolvidos no transporte de elétrons, no

PSII (Tang et al., 1990). A inativação do transporte de elétrons pode ser reversível,

dependendo da intensidade do dano provocado. A degradação proteolítica da

proteína D1 leva à desmontagem do PSII, porém, a resíntese dessa proteína

promove o seu restabelecimento após algum tempo. Com isso, a fotoinibição resulta

em decréscimo na fotossíntese líquida quando as folhas são expostas à alta

radiação luminosa por várias horas (Greer, 1998).

A fotoinibição é uma forma de estresse oxidativo, porque está relacionado à

produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Embora as ROS possam operar

como mensageiros secundários envolvidos na transdução de sinais em resposta a

estresses abióticos (Mittler, 2002), elevadas concentrações de ROS são altamente

prejudiciais à integridade celular. Moléculas ativas de oxigênio, como superóxido

(O2¯), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais hidroxilas (OH•) são extremamente

reativas e citotóxicas para todos os organismos, inativando enzimas e provocando

importantes danos celulares, como a peroxidação lipídica da membrana (Choudhury

e Behera, 2001). Particularmente, os oxirradicais têm sido associados à destruição

da proteína D1 do centro de reação do PSII (Bowler et al., 1992).

A habilidade das plantas para manter sua integridade de membrana sob

estresse por alta irradiância determina sua capacidade de resistência, e pode ser

usada como um critério para avaliação da resistência ao estresse (Lauriano et al.,

2000). A intensidade do dano fotoinibitório depende de fatores como: a espécie, o

estado fisiológico da planta, o tempo de exposição, entre outros (Krause, 1988). A

magnitude dos efeitos fotoinibitórios também depende da eficiência dos mecanismos

protetores e dos processos que permitem o reparo e reversibilidade do dano (Barber

e Andersson, 1992).

Plantas superiores adaptadas e aclimatadas a níveis de luz em seus

ambientes otimizam e preservam a produtividade fotossintética (Osmond e Grace,

1995; Demmig-Adams e Adams, 1996b; Srivastava e Strasser, 1997). Otimizar a

produtividade fotossintética em um dado ambiente de luz requer o balanço do uso da

luz absorvida pela fotossíntese e a dissipação fotoprotetora do excesso

24

potencialmente prejudicial da energia luminosa (Björkman e Demmig-Adams, 1994;

Horton et al., 1996).

Diversas pesquisas demonstraram que a susceptibilidade a fotoinibição é

significativamente incrementada quando o estresse luminoso se combina com outros

estresses ambientais, tais como baixa temperatura (Powles et al., 1983;

Hetherington et al., 1989), seca (Björkman e Powles, 1984; Ludlow e Powles, 1988;

Masojidek et al., 1991), e salinidade (Masojidek e Hall, 1992), entre outros. De

particular importância é a combinação entre estresse hídrico, luminoso e térmico;

freqüentemente observada em algumas regiões de clima tropical.

2.5.1.3 Fluorescência da clorofila a

A determinação das características da fluorescência da clorofila a é rápida,

precisa e não destrutiva, possibilitando a monitoração da utilização da energia

luminosa em plantas crescidas, tanto em laboratório quanto no campo, detectando o

desequilíbrio energético e metabólico da fotossíntese (Araus et al., 1998). Esse

método é, atualmente, utilizado para determinar os efeitos de diversos estresses

bióticos e abióticos no funcionamento do aparelho fotossintético, possibilitando

avaliar, precocemente, os efeitos de diferentes estresses, antes que os sintomas

relacionados tornem-se evidentes (Smillie e Hetherington, 1990).

A estimativa do desempenho funcional do PSII pode ser monitorada pelas

características da fluorescência, como a fluorescência inicial (F0), a fluorescência

máxima (Fm), a fluorescência variável (Fv), a relação Fv/Fm, os “quenchings”

fotoquímicos (qP) e não – fotoquímico (qN) (Van Kooten e Snel, 1990) e, finalmente,

a taxa relativa de transporte de elétrons (ETR).

A eficiência quântica do PSII (Fv/Fm) pode variar numa faixa de 0,75 a 0,85

em plantas não submetidas a estresses (Bolhar-Nordenkampf et al., 1989). Essa

relação é altamente correlacionada com o rendimento fotossintético das folhas. A

diminuição da relação Fv/Fm é um excelente indicador de efeito fotoinibitório quando

as plantas estão submetidas a qualquer tipo de estresse (Araus e Hogan, 1994;

Angelopoulos et al., 1996). Essa redução em Fv/Fm pode representar tanto uma

regulação fotoprotetora reversível ou uma inativação irreversível do fotossistema II

(PSII) (Long et al., 1994; Araus e Hogan, 1994).

25

Folhas expostas a altos valores de fluxo de fótons sempre exibem um

decréscimo no rendimento quântico fotoquímico do PSII resultado de uma

diminuição na taxa de dissipação fotoquímica (qP) da energia e por um aumento na

taxa de dissipação do excesso de energia de excitação não fotoquímica (qN) (Baker

e Rosenqvist, 2004). A relação entre aumento de qN e acidificação do lúmen do

tilacóide pode fornecer evidências sobre o potencial de dissipação energética de

espécies tolerantes a condições adversas.

2.5.1.4 Efeito da luz na célula vegetal – o papel d as H+-ATPases

Em células vegetais a manutenção do potencial de membrana e a

homeostase do pH citoplasmático dependem intimamente do funcionamento das

bombas de prótons presentes nessas membranas. Já é bem conhecido que a H+-

ATPase de membrana plasmática de células estomáticas é regulada por pulsos de

luz azul e vermelha. Na célula, os pulsos ativam o bombeamento eletrogênico de

prótons em protoplastos de células guarda (Assmann et al., 1985). Kinoshita e

Shimazaki (1999) demonstraram que um pulso de luz azul ativa a H+-ATPase de

membrana plasmática por fosforilação da região C-terminal da enzima.

Estudos posteriores mostraram que a fosforilação do penúltimo resíduo,

treonina, da região C-terminal da H+-ATPase por luz azul, é essencial para a ligação

da proteína 14-3-3 dependente ou independente de fusicoccina nas células-guarda

(Kinoshita e Shimazaki; 2001; 2002; Kinoshita et al., 2003). Essa fosforilação é

mediada por uma proteína quinase, o qual parece estar também envolvida na rota

de sinalização para abertura dos estômatos. O complexo H+-ATPase●14-3-3

formado nas plantas é lábil e somente pode ser estudado na presença de

fusicoccina. Essa toxina fúngica se liga ao complexo formado pelas H+-ATPases e

proteínas 14-3-3, estabilizando-o. O receptor de luz azul envolvido na percepção do

sinal de luz e ativação da bomba, fototropina (Phot 1 e Phot 2), também se liga a 14-

3-3 sob ativação por luz azul (Kinoshita et al., 2003; Ueno et al., 2005).

Parece que as H+-ATPases de membrana plasmática existem em um estado

parcialmente desacoplado, e que a ativação pós-traducional aumenta o acoplamento

entre hidrólise de ATP e bombeamento de prótons (Venema e Palmgren, 1995;

Baunsgaard et al., 1996; Morsomme et al., 1996). Ainda não se sabe porque isso

ocorre, mas a indução pós-traducional do maior acoplamento pode prover um

26

significado para uma resposta mais rápida da bomba ao ambiente. O mecanismo

envolvido nesse desacoplamento ainda é desconhecido, sabe-se que as H+-

ATPases da membrana plasmática geram intermediários fosforilados do ciclo de

reação (não podendo ser confundido com fosforilação regulatória estável)

(Palmgren, 2001). O K+ é ligado a bomba de prótons em um sítio no domínio

citoplasmático que é fosforilado durante a catálise (Buch-Pedersen et al., 2006). A

ligação do K+ a esse sítio induz desfosforilação dos intermediários do ciclo de reação

(Buch-Pedersen et al., 2006). Desfosforilação direta dos intermediários do ciclo de

reação causa a reversão da bomba para um estado não fosforilado sem

concomitante transporte de prótons. Esses dados identificam o K+ como um

desacoplador intrínseco da bomba de prótons.

Pelo fato da P- e da V-ATPases estarem envolvidas em processos similares

nas células, tais como, geração de diferenças de potencial eletroquímico através das

membranas plasmática e vacuolar, respectivamente, estabilização do pH

citoplasmático, controle da pressão de turgor, e expansão das células das plantas,

não é surpreendente que sejam igualmente influenciadas por estímulos externos.

Klychnikov et al. (2007) avaliaram o envolvimento da V-ATPase em resposta a luz

azul. Nesse estudo, esses autores demonstraram que o curto tratamento de

coleóptilos estiolados de cevada com luz azul resulta na ativação da hidrólise de

ATP pela V-ATPase. Os resultados indicam que a parte hidrolítica da V-ATPase, V1,

interage com a proteína regulatória 14-3-3, necessitando para isso de fosforilação da

ATPase por uma quinase, assim como ocorre para a P-ATPase, no processo de

sinalização para abertura dos estômatos O aumento no gradiente eletroquímico

através do tonoplasto, pode então dirigir o transporte ativo secundário de outros íons

e solutos através do tonoplasto, necessário para a apropriada resposta

fotomorfogênica (Klychnikov et al., 2007).

Estudando o efeito de curto tempo de irradiação luminosa no metabolismo do

inositol fosfolipídio em hipocótilos de girassol, Memon e Boss (1990) mostraram que

a atividade quinase dos fosfolipídios da membrana plasmática reduz em resposta a

irradiação luminosa in vivo, e a atividade da ATPase de membrana plasmática

também diminui, como um resultado do tratamento com luz branca. Como o fosfatidil

inositol fosfato (PIP) e o fosfatidil inositol bisfosfato (PIP2) têm mostrado afetar

diretamente a atividade ATPásica em membranas plasmáticas isoladas de plantas

(Memon et al., 1989), mudanças na atividade quinase dos lipídios inositol podem

27

afetar a H+-ATPase de membrana plasmática in vivo. PIP e PIP2 aumentam

diretamente o tipo E1-E2 ou ATPase de membrana plasmática que opera através de

um intermediário fosforilado (Memon et al., 1989), além de regularem a fosforilação

de proteínas (Chauhan e Brockerhoff, 1988).

Alguns trabalhos têm sido realizados em folhas, com o intuito de verificar o

efeito da luz no funcionamento da ATPase de membrana plasmática do mesófilo.

Blom-Zandstra et al. (1997) avaliaram as transientes mudanças induzidas pela luz na

atividade dos canais de ions e das bombas de prótons na membrana plasmática de

protoplastos do mesófilo de tabaco, e demonstraram que, independente da atividade

dos canais, a bomba de prótons parece substancialmente contribuir para mudanças

induzidas pela luz na carga da membrana. Linnemeyer et al. (1990) observaram que

a atividade da ATPase de folhas jovens crescidas na luz vermelha foi menor do que

das folhas crescidas no escuro. Isso parece ser devido a uma redução na

quantidade da proteína na membrana plasmática. Segundo estes autores, a menor

resposta para luz sugere que a luz está inibindo algum passo na síntese da ATPase,

enquanto que a ATPase parece simplesmente ser diluída pela adição de largas

quantidades de outras proteínas na membrana plasmática.

A luz azul induz mudanças no potencial da membrana plasmática nas células

de plantas, participa nas reações redox e no transporte de elétrons, e induz uma

mudança na absorção de luz na membrana plasmática envolvendo uma

fotorredução do citocromo mediada por uma flavina (Buchanan et al., 2000). Em

células de hipocótilos tem sido observado que a luz azul causa uma despolarização

da membrana (Spalding e Cosgrove, 1989).

Em mesocótilos, o alongamento de células é o resultado da extensão celular

direcional e é inibido por exposição à luz (Viereck et al., 1996). Estudos realizados

com hipocótilos de pepino revelaram que a luz azul inibe o alongamento da haste,

reduzindo o crescimento, o qual é precedido por uma despolarização da membrana

plasmática de células do hipocótilo, indicando uma inicial inibição da H+-ATPase de

membrana plasmática, e subseqüente ativação de um ou mais tipos de canais de

ions, contribuindo para essa despolarização induzida por luz azul (Spalding e

Cosgrove, 1989; Spalding e Cosgrove, 1992; Cho e Spalding, 1996).

Padmanaban et al. (2004), avaliando a expressão diferencial dos genes da

subunidade c da H+-ATPase vacuolar em tecidos de plantas observaram que

plântulas crescidas na luz e crescidas no escuro mostraram grandes diferenças na

28

expressão do gene VHA-c1, indicando que os genes da subunidade c da H+-ATPase

são diferencialmente influenciados por luz. Em tecidos em alongamento, houve forte

expressão do gene VHA-c1, em contraste, a expressão do gene VHA-c3 nas

plântulas não foi alterada por luz ou por escuro. Esse aumento na expressão VHA-c1

e no alongamento celular podem indicar um papel para atividade da V-ATPase na

fase de alongamento celular do crescimento.

Em contraste, a expressão do gene VHA-c1 nas raízes não foi alterada por

luz. Esses genes da subunidade c são diferencialmente regulados em diferentes

tipos de células provavelmente dependendo da demanda funcional e do estágio de

desenvolvimento das células. É interessante que um único gene, VHA-c1, possa ser

regulado de forma específica dependendo do órgão. Assim, o promotor VHA-c1 é

diferencialmente regulado por luz ou escuro em uma forma específica para o órgão

ou tecido que provavelmente depende de receptores de luz específico da célula e

vias de sinalização que são acopladas ao crescimento celular (Padmanaban et al.,

2004).

2.5.2 Estimulação mecânica – “Brushing”

2.5.2.1 Perturbação mecânica

A relativa imobilidade das plantas quando comparado aos animais tem

naturalmente provocado uma dependência sob sua habilidade para sentir e

responder a sinais ambientais, se adaptando a um ambiente sempre em mudança

(Jaffe et al., 2002). As plantas podem perceber numerosos estímulos ambientais,

tais como flutuações de temperatura e de luz, e podem ainda perceber o peso

mecânico gerado pelo vento, pela neve, o gelo, o impacto das gotas da chuva, do

granizo, o peso dos frutos, o toque, o som e outros organismos (insetos e pássaros),

os quais induzem uma variedade de respostas fisiológicas em diferentes órgãos e

tecidos (Telewski, 1995; 2006). As células por si podem perceber a gravidade, a

tensão causada pelo próprio peso, o estado de hidratação (pressão de turgor) e o

crescimento interno (Telewski, 2006).

Mark Jaffe, que realizou análises sistemáticas das respostas de crescimento

da planta às perturbações mecânicas sobre os últimos 30 anos, inventou o termo

“tigmomorfogênese” para descrever a resposta desenvolvimental induzida pelo toque

29

nas plantas (Jaffe, 1973). Os estímulos mecânicos têm sido coletivamente

chamados de estímulo de toque ou tigmo e produzem um número de respostas

tigmo nas plantas, incluindo tigmomorfogênese, tigmotropismo, tigmonastia, e as

respostas tigmotáticas (Jaffe et al., 2002; Braam, 2005).

Em contraste às respostas tigmonásticas e tigmotrópicas geralmente rápidas

das plantas ou órgãos especializados para responder ao estresse mecânico aplicado

externamente, alterações morfogenéticas graduais em resposta ao estímulo tal como

o toque e o vento são comuns, se não universais, entre as plantas superiores. As

plantas têm se adaptado a seus ambientes com um elevado grau de plasticidade,

tendo recursos e habilidades para responder às mudanças ambientais. Essas

mudanças morfogenéticas induzidas pelo toque ocorrem lentamente ao longo do

tempo e são conseqüentemente, não prontamente aparente ou apreciada (Braam,

2005). Essas respostas tigmomorfogênicas são definidas como a influência dessas

perturbações no crescimento e desenvolvimento das plantas. Estudos fisiológicos e

moleculares têm mostrado que as alterações no crescimento e desenvolvimento das

plantas envolvem uma cascata de eventos biológicos iniciando com uma transdução

do estímulo mecânico em um sinal biológico e finalizando com uma resposta global

como a modificação do crescimento, o qual tem sido mostrado ser dependente da

intensidade e frequência (Trewavas e Knight, 1994). Isso usualmente resulta em

uma redução no alongamento do caule e uma estimulação do crescimento radial

(Garner e Björkman, 1996; Latimer, 1998; Björkman, 1999).

A tigmomorfogênese parece fortalecer as plantas, tornando-as mais

resistentes a estresses futuros, o que ocorre devido à habilidade das plantas para

responder a esses estímulos mecânicos, alterando a morfologia, a anatomia e as

propriedades biomecânicas. As mudanças morfogênicas induzidas pelo toque são

correlacionadas com a produção aumentada de tecido fortalecido e uma melhora na

resistência a perturbação mecânica induzida pelo dano (Jaffe et al., 1984; Telewski e

Jaffe, 1986; Biddington, 1986). Tecidos mais jovens mostram superior magnitude de

resposta quando comparado aos tecidos mais velhos (Biddington, 1986). A

sinalização a longas distâncias é também provável de ocorrer porque as alterações

do crescimento não são limitadas às regiões que são diretamente estimuladas, mas

são também encontradas nos locais não estimulados diretamente (Biddington, 1986;

Coutand et al., 2000).

30

Mais do que 2,5% dos genes de Arabidopsis thaliana são rapidamente

regulados em plantas estimuladas pelo toque. Com esses genes como ferramentas,

métodos genéticos moleculares podem possibilitar a elucidação de mecanismos de

percepção ao toque, transdução do sinal e resposta de regulação. Provavelmente

todas as plantas sentem e respondem às forças mecânicas. Certamente, as

respostas celulares podem ser críticas para processos fundamentais tal como, a

regulação do turgor, a expansão celular e a morfogênese. As bases mecanísticas da

percepção ao toque e da sinalização inter e intracelular ainda não são bem

entendidas. Não está claro se as respostas amplamente diversas estão relacionadas

ao nível de percepção ou resposta, ou se os mecanismos e a maquinaria usada por

células únicas para responder as perturbações mecânicas tal como, flutuações no

turgor, estão relacionadas aquelas usadas pelo órgão ou tecido para reagir a forças

mecânicas externamente aplicadas (Telewski, 2006).

Uma prática que pode impedir o excessivo alongamento do caule consiste na

estimulação mecânica (“brushing”) das plantas. Alguns estudos têm mostrado a

aplicação dessa prática na produção agrícola, com o intuito de conduzir o

crescimento de mudas, melhorando sua qualidade (Latimer et al., 1991). Esta

técnica consiste em uma estimulação física ou estresse aplicado às plantas com o

auxílio de um anteparo ligeiramente abrasivo, tal como papel (Biddington e

Dearman, 1985), papelão (Latimer, 1990), cano ou tubo de polivinil (Latimer e

Thomas, 1991), ou um pedaço de madeira (Latimer e Baden, 1991). O anteparo

causa uma curvatura nos caules à medida que entra em contato com as plantas.

Esse estresse mecânico normalmente aumenta o teor de celulose no caule, o que

pode conferir uma maior resistência mecânica da parte aérea da planta (Heuchert et

al., 1983). A estimulação mecânica também pode ser obtida expondo as mudas a

efeitos vibratórios, tais como correntes de vento ou de ar forçado.

2.5.2.2 Efeito do toque no crescimento e desenvolvi mento das plantas - o papel

das H+-ATPases

O efeito das perturbações mecânicas no crescimento das plantas tem sido

relatado em muitos estudos e vários esforços têm sido feito para elucidar a fisiologia

dos passos primários da mecanosensibilidade. A relativa contribuição dos diferentes

tecidos da planta para a mecanosensibilidade e a maneira como a sensibilidade

31

local é integrada na planta para produzir a resposta de crescimento ainda não está

claro (Coutand et al., 2000). Tem sido gradualmente reconhecido que a percepção e

resposta a estímulos mecânicos exógenos estão comumente ocorrendo

essencialmente ao nível celular e subcelular.

O alongamento e o relaxamento da membrana celular em resposta as

mudanças no ambiente mecânico das células como um componente da

mecanosensibilidade encaixa bem com os relatos anteriores do papel dos canais de

membrana ativados por força mecânica nas respostas das plantas aos estresses

mecânicos (Massa, et al., 2003; Dutta e Robinson, 2004; Martinac, 2004; Kung,

2005). A percepção de um sinal mecânico pelas células é um processo rápido com

uma rápida transdução da força mecânica em uma mensagem bioquímica ou

bioelétrica. Significantes progressos têm sido relatados na elucidação da base

molecular da percepção e transdução mecanosensora em sistemas animais,

particularmente o acoplamento físico entre o citoesqueleto e a membrana celular, o

qual provê uma contínua rede estrutural/mecânica através da célula (Telewski,

2006). A membrana celular como um alvo principal das forças mecânicas externas

que agem sobre uma célula, e os canais de íons mecanosensitivos desempenham

um papel crucial na fisiologia da mecanotransdução. Essas forças mecânicas

externas detectam e traduzem em sinais intracelulares elétricos e/ou químicos.

Recentes trabalhos têm aumentado nosso entendimento de seu mecanismo,

funções fisiológicas e origens evolucionárias (Telewski, 2006).

As células eucarióticas tipicamente afastam-se da forma esférica devido a

complexas interações entre os elementos de seu citoesqueleto e a matriz

extracelular. A comunicação entre o citoesqueleto e a matriz extracelular é uma das

características mais destacadas da mecânica celular e permite as células

responderem efetivamente a vários sinais, especificamente ao estímulo mecânico

(Baluška et al., 2003). Células desprovidas de matriz extracelular e/ou citoesqueleto

inevitavelmente perdem sua forma polar, retornando a forma preferencialmente

esférica (Smith, 2001). Essa perda de polarização celular evita que as células

interajam e se comuniquem com outras células. As plantas são organismos

supracelulares com canais citoplásmicos célula a célula chamados plasmodesmata

(Lucas et al., 1993). Conseqüentemente, as células das plantas não são totalmente

separadas, e a membrana plasmática e o retículo endoplasmático cruzam as

fronteiras celulares através dos plasmodesmata. Essas membranas são fisicamente

32

interligadas em sistemas membranosos contínuos essencialmente expandidos na

planta inteira.

O citoesqueleto integrado e sua adesão dinâmica à membrana plasmática

permitem essas complexas interações entre as forças mecânicas e os sinais

químicos (Sheetz, 2001). Entre as moléculas responsáveis por unir o citoesqueleto à

parede celular, propostas por Baluška et al., (2003), estão proteínas quinases

associadas à parede celular, pectinas, proteínas arabinogalactanas, celulose

sintase, forminas, miosinas específicas de plantas, fosfolipase D e calose sintase. A

síntese de calose está associada com um número de respostas a diversos

estresses, incluindo o estresse mecânico (Jaffe et al., 2002). Esses estudos

suportam um papel para a síntese de calose na mecanopercepção.

Uma das novas prioridades na biologia celular é compreender como as forças

mecânicas regulam e integram as atividades celulares (Ingber, 2003a, 2003b). É

bem conhecido que as forças mecânicas são rapidamente, e praticamente sem

perda de informação, traduzidas em mensagens bioquímicas. Além disso, as forças

mecânicas desempenham papéis essenciais no controle do comportamento celular

(Riveline et al., 2001; Ingber, 2003a, 2003b).

Os modelos propostos para explicar como uma força mecânica pode ser

traduzida em um sinal bioquímico não somente sugerem as características espacial

e temporal que nós podemos esperar dos elementos de sinalização ao toque, mas

também enfatizam que uma parede celular rígida e uma substancial pressão de

turgor coloca significante coação em tais sistemas de sinalização nas plantas

(Fasano et al., 2002). A percepção de um sinal mecânico pelas células parece

envolver a parede celular, a membrana plasmática e o citoesqueleto, formando uma

rede mecanosensora (Jaffe et al., 2002). A força exercida na parede pode ser

transmitida através da membrana plasmática para o citoesqueleto, o qual pode

então, amplificar e retransmitir a força para a membrana plasmática; ou talvez, mais

comumente aceito, para uma proteína responsiva tal como um canal de íon

embebido na membrana plasmática (Fasano et al., 2002). Como já foi dito, os canais

de íons parecem ser mecanosensitivos, atuando na sinalização ao estímulo

mecânico (Kung, 2005). Alternativamente, o estímulo mecânico pode passar da

parede, para o citoesqueleto, para endomembranas tais como a membrana do

retículo endoplasmático e o tonoplasto. Tal sítio interno de transdução pode enganar

a coação imposta pela pressão de turgor na membrana plasmática e permitir

33

substancial deformação da membrana, com associado acionamento de canais de

íons. Outro modelo para a mecanopercepção se dá pela ligação do citoesqueleto

(através de ligantes) à membrana plasmática, a endomembranas, transmitindo e

amplificando a força ao citoplasma (Jaffe et al., 2002; Fasano et al., 2002). Os

canais podem ser uma resposta secundária a uma perturbação mecânica em um

regulador global tal como pH citosólico ou potencial de membrana. A ativação da H+-

ATPase da membrana plasmática pode resultar em hiperpolarização da membrana e

alterar o pH citosólico e apoplástico (Fasano et al., 2002).

A primeira resposta detectável para um sinal mecânico é uma mudança nos

potenciais de ação e na resistência elétrica, o qual ocorre dentro de segundos após

a perturbação (Jaffe, 1976), posteriormente o abalo mecânico da haste bloqueia o

transporte do floema (Jaeger et al., 1988). A próxima medida mensurável ocorre com

transientes elevações no Ca2+ intracelular, o qual desencadeia uma cascata de

sinalização que pode variar de acordo com a espécie (Nayyar, 2003), levando a

alterações no crescimento. Tem sido observado o envolvimento de proteínas

regulatórias que se ligam ao Ca2+ na cascata de eventos, tais como a calmodulina,

as quais compreendem um componente da transdução de sinal baseada em Ca2+

em eucariotos (Bourgeade et al., 1991; Fasano et al., 2002). Assim, mudanças na

abundância ou localização de calmodulinas específicas podem pontuar para a

ativação de vias de resposta ao toque altamente específicas mediadas por Ca2+.

Os estímulos externos são capazes de afetar o transporte transmembrana de

Ca2+ dependente de ATP e a distribuição intracelular da proteína calmodulina

(Bourgeade et al., 1991) e da proteína anexina (Thonat et al., 1997), em plantas

superiores. O sinal induz despolarização da membrana, sugerindo mudanças na

compartimentalização de íons. As mudanças ambientais talvez distorçam o equilíbrio

iônico intracelular nas células de plantas, particularmente de íons cálcio (Bourgeade

et al., 1991; Thonat et al., 1997). Alguns trabalhos tem mostrado a participação do

peróxido de hidrogênio e de outras espécies reativas de oxigênio (ROS) na resposta

de defesa das plantas a esses estímulos. A indução de ROS e um aumento no Ca2+

citosólico parecem ser simultâneas, e tem sido sugerido que as ROS regulam os

canais de Ca2+ (Mori e Schroeder, 2004; Braam, 2005).

Tem sido observado também um aumento na biossíntese de etileno (Prasad e

Cline, 1985; Telewski, 1995) e um aumento nas divisões celulares pelo câmbio

vascular (Biro et al., 1980). O papel do etileno em resposta ao estresse mecânico

34

parece afetar o crescimento secundário e subsequentemente o desenvolvimento e

diferenciação do câmbio vascular e não impactar o crescimento primário associado

com os meristemas apicais (Coutand et al., 2000; Braam, 2005). A biossíntese de

etileno tem sido relacionada com as respostas a um número de estresses

ambientais, incluindo estresse mecânico, e vários pesquisadores tem sugerido que o

etileno serve como uma molécula sinalizadora. O toque induz a formação de etileno

em plantas vasculares, e o etileno perece estar envolvido em respostas

gravitrópicas, resultando em curvatura estática em relação à força vetora

gravitacional (Prasad e Cline, 1985; Dolan, 1997).

O rápido acionamento de canais de íons e sua inerente amplificação do sinal

os fazem elementos ideais de transdução de sinal e mudanças na concentração de

íons (por exemplo, Ca2+ e H+) e no potencial de membrana estão freqüentemente

envolvidas em eventos de rápida sinalização nas plantas (Fasano et al., 2002). Nas

células das plantas o íon cálcio é um mensageiro secundário envolvido em

numerosas vias de sinalização, participando de um amplo número de respostas

fisiológicas apropriadas a estímulos ambientais e desenvolvimentais (Nayyar, 2003).

Não surpreendentemente, entretanto, a sinalização iônica tem sido proposta

transduzir a percepção ao toque nas plantas (Lecourieux et al., 2006). A

especificidade de uma resposta celular ao Ca2+ se dá em parte pelo sincronismo,

duração, e magnitude do pulso de Ca2+ eliciado, a tão chamada “assinatura de Ca2+”

do estímulo (Lecourieux et al., 2006). Alternativamente, um ambiente celular ou

subcelular especializado (microdomínio) pode existir onde fatores tal como pH,

interações citoesqueleto, a disponibilidade de proteínas regulatórias dependentes de

Ca2+ ou um número de outros compostos pode também impor especificidade em

sinais de Ca2+ espacialmente distintos. O mesmo sinal induz diferentes assinaturas

de Ca2+, dependendo do órgão, do tecido, ou do tipo de célula dentro de um tecido

(Lecourieux et al., 2006).

O Ca2+ é talvez o mensageiro secundário iônico mais amplamente

reconhecido nas plantas, mas mudanças no pH citoplásmico são também

conhecidas por terem difundido efeitos regulatórios na função celular. Entretanto,

diferentemente do Ca2+, os prótons se difundem rapidamente dentro da célula. Em

função disso, sem alguma significante arquitetura citoplásmica para reduzir seu

movimento, os prótons são improváveis de regular mudanças localizadas nos

microdomínios celulares. Ao invéz disso, mudanças no pH relacionadas ao sinal

35

podem servir como um sistema regulatório global para a célula. Assim como o Ca2+,

alteração no pH talvez seja um significante mensageiro secundário intracelular

agindo para gerar um redirecionamento global do conjunto de vias de transdução de

sinal operando na célula, provendo alusão para um possível mecanismo pelo qual

pH e Ca2+ relacionado a transdução de sinal ao toque possam interagir (Fasano et

al., 2002).

Em adição ao Ca2+ e pH, mudanças no potencial de membrana também tem

sido proposto como eventos na sinalização ao toque (Massa et al., 2003; Kung,

2005). Mudanças no potencial de membrana podem diretamente modular mudanças

na atividade de transporte da membrana por abrir canais acionados por tensão.

Entretanto, o potencial de membrana pode agir como um regulador global dos

componentes da membrana plasmática tal como o pH pode globalmente regular os

componentes citoplásmicos. Em adição, flutuações no potencial de membrana

parecem importantes para transmitir informação na forma de potenciais de ação,

auto-propagando ondas de despolarização induzida pela troca de íons através da

membrana (Massa et al., 2003; Kung, 2005).

A estimulação mecânica de internós jovens de Bryonia dióica inicialmente

reduziram a atividade da H+-ATPase da membrana plasmática seguido por uma

estimulação mais prolongada, o que mostra que a H+-ATPase de membrana

plasmática desempenha um papel chave na transdução do sinal por sua

contribuição no desequilíbrio iônico com cessação da atividade e por sua

subseqüente participação direta na restauração dos balanços iônicos (Bourgeade e

Boyer, 1994).

2.5.3 Estimulação Sonora

2.5.3.1 Som e ultrasom

O som é resultado de um movimento vibratório da matéria transmitido através

de meios materiais e elásticos. É energia que se propaga através de ondas, de

forma circuncêntrica, chamadas de ondas mecânicas porque precisam de um meio

material para se propagar. Este meio pode ser sólido, líquido, ou gasoso. Na maioria

das vezes, ouvimos sons sendo transmitidos através do ar (Halliday et al., 2002).

36

Os meios de propagação são denominados meios elásticos por serem

capazes de se deformarem a passagem das ondas sonoras e restaurarem sua forma

original após a passagem das mesmas. Qualquer meio material que propague uma

onda sonora é considerado elástico (Halliday et al., 2002).

As ondas sonoras são ondas longitudinais e tridimensionais. Por serem

longitudinais, são ondas de pressão, e caminham no meio de propagação através de

sucessivas compressões e rarefações das partículas do meio. As ondas ao se

propagarem através de um meio elástico alcançam o ouvido causando a sensação

sonora (Halliday et al., 2002).

Seres humanos e vários animais percebem sons com o sentido da audição, o

que permite saber a distância e a posição da fonte sonora (audição estereofônica).

As ondas sonoras são ondas periódicas; classificadas em audíveis e inaudíveis,

dependendo do número de períodos que ocorram na unidade de tempo (freqüência).

Ondas sonoras com freqüência entre 20 Hz e 20.000 Hz, são audíveis para os seres

humanos. Acima e abaixo desta faixa estão ultrasom e infra-som, respectivamente,

que são sons inaudíveis para os seres humanos (Halliday et al., 2002).

Os cães conseguem ouvir sons numa “banda de freqüências” mais larga do

que o homem, sendo sensíveis a ondas sonoras compreendidas entre 15 Hz e 50

000 Hz. Os morcegos, as baleias e os golfinhos podem ouvir e emitir ondas sonoras

com freqüências de até 120 000 Hz. Muitos sons de baixa freqüência também

podem ser sentidos por outras partes do corpo e pesquisas revelam que elefantes se

comunicam através de infra-sons (Halliday et al., 2002).

Os sons tem sido usados de várias maneiras, muito especialmente para

comunicação através da fala ou, por exemplo, música. A percepção do som também

pode ser usada para adquirir informações sobre ambientes em propriedades com

características espaciais (forma, topografia) e presença de outros animais ou

objetos. Por exemplo, morcegos, baleias e golfinhos usam a ecolocalização para

voar e nadar por entre obstáculos e caçar suas presas. Navios e submarinos usam o

sonar, um sistema de localização e prospecção de obstáculos por meio de ondas

sonoras, tirando partido da sua reflexão. È conhecido que a vegetação pode

absorver a energia acústica (Price et al., 1988) e tem sido utilizada para amortecer

os barulhos do ambiente urbano (Attenborough, 2002).

O ultrasom é uma forma de energia mecânica, vibracional, que pode ter ação

deletéria ou indutora do desenvolvimento em tecidos vivos, dependendo da

37

intensidade, do tempo de exposição, da freqüência de aplicação e da distância do

transdutor ao alvo (Hebling e da Silva, 1995). Em tecidos vivos de animais, o

ultrasom pode causar a destruição ou a indução do crescimento dependendo,

principalmente, da intensidade utilizada (Duarte, 1983; Alves, 1988; O’Brien Jr.,

2007).

Amplamente usado em tratamentos fisioterápicos, o ultrasom é um auxiliar

eficaz no tratamento de lesões, traumas e processos inflamatórios. A vibração das

moléculas, causada pela emissão de ondas, aumenta a elasticidade em tecidos que

sofreram traumas, enquanto o calor gerado é responsável pela dilatação dos vasos

sangüíneos na região afetada. Esses efeitos aceleram a cura de inflamações, a

cicatrização de lesões e o retorno dos movimentos nas áreas tratadas (Duarte, 1983;

Alves, 1988; Hebling e da Silva, 1995).

O ultrasom também tem sido amplamente usado em diagnóstico médico,

através das ecografias. Com a ecografia podem obter-se imagens do interior do

corpo humano, por exemplo, dos bebes antes de nascerem.

Apesar de muitos avanços terem sido alcançados no que diz respeito à

utilização do ultrasom na medicina, poucos estudos têm revelado os efeitos do

ultrasom nas células de plantas. Nas plantas, o ultrasom tem sido aplicado na

germinação de sementes, aumentando as taxas de germinação (Creath e Schwartz,

2004); e aumenta o metabolismo nas raízes de crisântemo, caracterizado pelo

aumento na atividade amilase, açúcar solúvel, e de proteínas, influenciando o

crescimento das plantas (Yi et al., 2003).

2.5.3.2 Efeito do som e ultrasom na célula vegetal – o papel das H +-ATPases

Recentemente, elevada atenção tem sido dada aos efeitos benéficos e as

potenciais aplicações do ultrasom, particularmente o de baixa intensidade, em

sistemas biológicos e processos biotecnológicos. O ultrasom de alta intensidade é

muito conhecido por destruir materiais biológicos, rompendo as membranas

celulares e desativando moléculas biológicas pela degradação de macromoléculas.

O ultrasom de baixa intensidade, por outro lado, tem mostrado uma extensão de

efeitos biológicos subletais, que são de potencial significância na biotecnologia

(O’Brien Jr., 2007).

38

A irradiação ultrassônica pode causar estresse térmico e mecânico em

materiais biológicos. O estresse mecânico do ultrassom resulta de dois eventos

hidrodinâmicos, a cavitação acústica e a cavitação induzida por microcorrente. A

cavitação acústica é um dos efeitos mais expressivos do ultrasom. Dois fenômenos

de cavitação acústica foram descritos. O primeiro descreve a cavitação transiente ou

de colapso, onde "microbolhas" são formadas e crescem até implodir, gerando

pressão e temperatura altas durante os estágios finais do colapso. A onda de

choque de alta pressão que emana do lugar antes ocupado pela bolha é capaz de

causar danos às células ou macromoléculas circundantes (Joersbo e Brunstedt,

1992).

O outro fenômeno, a cavitação estável, consiste em amplas e rápidas

oscilações no tamanho da bolha. Isso causa um forte fluxo de líquidos no meio que a

circunda. Esse processo é conhecido como "microcorrente". Baixas velocidades

dessa microcorrente resultam na mistura do meio circundante, enquanto altas

velocidades podem ocasionar danos às células (Frizzell, 1988). A microcorrente

acústica nas células em suspensão pode causar estresse e aumento da

transferência de massa, o qual pode estimular as atividades metabólicas dentro das

células. Tem sido observados a rotação de organelas e o movimento em círculos

nos vacúolos de células de plantas em níveis apropriados de intensidade

ultrassônica (Sinisterra, 1992). Esses eventos podem produzir um aumento nas

funções metabólicas das células e promover a proliferação celular.

As ondas sonoras têm grande efeito no crescimento das plantas (Shen e Xi,

1999). Em certa intensidade e freqüência, o estresse por ondas sonoras reduz

significativamente a temperatura de transição de fase, aumenta o conteúdo de

proteínas solúveis nas raízes, o que torna o crescimento e a divisão das células mais

rápido e mais fácil (Keli et al., 1999; Yi et al., 2003). Tao et al. (2001) demonstraram

que a estimulação sonora promoveu a absorção de nutrientes e a síntese de DNA, o

que poderia favorecer o maior crescimento e divisão celular. Liu et al. (2003b)

observaram a promoção do crescimento e a proliferação de células de Oryza sativa

quando estas foram estimuladas com ultrasom (28 KHz) até 5 segundos. Após esse

tempo de exposição, o crescimento e a proliferação das células foram inibidos, o que

pode ter ocorrido devido à destruição da estrutura celular, tal como a membrana

celular, o citoesqueleto e o mitocôndrio onde muitas enzimas e canais de íons são

39

afetados. O aumento da perede celular e da fluidez da membrana podem ter sido os

fatores de promoção do crescimento celular nos tempos mais curtos de exposição.

Um dos resultados imediatos da aplicação do ultrasom de alta intensidade é o

rompimento celular e a desnaturação de enzimas (Joersbo e Brunstedt, 1990). A

aplicação de ultrasom apresenta efeitos químicos, bioquímicos e fisiológicos. Nos

sistemas biológicos, os efeitos químicos do ultrasom envolvem a formação de

radicais livres, que são formados nos estágios finais da cavitação transiente (Makino

et al., 1982). Aparentemente, em estudos com células de mamíferos, os radicais

livres liberados não são os responsáveis pelo rompimento celular, já que o

tratamento das células com um seqüestrador desses radicais; não aumentou a

eficiência de plaqueamento das mesmas. No entanto, os radicais livres podem ter

efeito na capacidade de divisão das células intactas remanescentes, por afetar a

integridade das membranas (Fu et al., 1979).

O ultrasom de baixa intensidade pode modificar o metabolismo celular, induzir

a inibição e a estimulação de atividades enzimáticas, o crescimento celular, a

biossíntese e a alteração das membranas celulares e de outras estruturas das

organelas celulares (Bochu et al., 1998; Liu et al., 2003a; 2003b; Liu et al., 2006;

Chen et al., 2008). Uma das consequências mais amplamente observadas do

ultrasom em células vivas é o aumento na permeabilidade ou na permeabilização da

membrana, aumentando a absorção de substâncias externas, tal como a absorção

de nutrientes e a liberação de produtos intracelular. Os efeitos estimulantes do

ultrasom nas reações biológicas e no crescimento celular não são ainda bem

entendidos, os quais podem ser atribuídos aos efeitos mecânicos do ultrasom, tais

como o aumento de transferência de massa e a combinação nos sistemas de

reação; outros pesquisadores relatam que esses efeitos estimulantes são devido à

estimulação de enzimas ou a atividade metabólica celular. Entretanto, os efeitos

benéficos do ultrasom dependem de sua intensidade, do tempo de exposição e

também das condições fisiológicas dos tecidos das plantas (Bochu et al., 1998; Liu

et al., 2003a; 2003b; Liu et al., 2006; Chen et al., 2008).

A exposição das células ao ultrasom pode causar a degradação de

macromoléculas, tais como, polissacarídeos, proteínas, DNA e, provavelmente,

RNA. Miller et al. (1976) observaram a inibição da síntese de DNA, RNA e proteínas

em meristemas radiculares de Pisum sativum, logo após a exposição a 1 minuto de

ultrasom (1MHz; 30 Watts/cm2). A síntese de RNA e de proteínas foi diminuída em

40

60 a 70%, 1 hora após a exposição, mas foram recuperadas 4 horas mais tarde. De

maneira similar, o índice mitótico foi reduzido depois do tratamento com o ultrasom e

recuperado após 6 a 7 horas. Os efeitos fisiológicos do ultrasom estão relacionados

à parede celular, à membrana plasmática e ao crescimento. Miller et al. (1974)

relataram a ocorrência de ruptura nas paredes celulares na zona de alongamento da

raiz primária de Vicia faba em resposta ao ultrasom. As observações histológicas

demonstraram um grau mais alto de dano na face das células que estava orientada

em direção ao transdutor. Bleaney e Oliver (1972) trataram plântulas de Vicia faba

com ultrasom de 1,5 MHz em intensidade, variando de 1 a 4 Watts/cm2 durante

períodos de 2 a 60 minutos. Foi observado um decréscimo no crescimento em

relação ao aumento do tempo e da intensidade de exposição. O decréscimo foi

máximo no primeiro dia após o tratamento, porém o crescimento foi recuperado ao

longo de oito dias. Esses resultados sugeriram a possibilidade de estar havendo

alterações temporárias nas células em divisão no meristema e nas regiões de

alongamento celular.

Os ácidos nucléicos são materiais hereditários para reserva, transferência e

expressão das informações genéticas, e os efeitos dos fatores físicos sobre esse

material é de grande interesse para as pesquisas genéticas. Xiujuan et al. (2003)

avaliando os efeitos das ondas sonoras na síntese de ácidos nucléicos e de

proteínas observaram que as ondas sonoras não têm influência óbvia no conteúdo

de DNA, mas aceleram a síntese de RNA e proteínas solúveis, aumentando o nível

de transcrição.

O ultrasom tem sido usado para promover a transferência de genes para

células vegetais. Resultados positivos foram obtidos, utilizando protoplastos,

suspensões celulares e pedaços intactos de tecidos. O método emprega os mesmos

princípios básicos, independente da natureza do material vegetal a ser

transformado. Nessa técnica, os tecidos vegetais em suspensão podem ser

submetidos ao tratamento de ultrasom em um tubo de microcentrífuga com baixo

volume de solução (tampão ou meio de cultura), contendo o DNA a ser introduzido

nas células. Joersbo e Brunstedt (1990) obtiveram a introdução de DNA exógeno em

protoplastos de Nicotiana tabacum e Beta vulgaris através da aplicação de pulsos de

ultrasom 20KHz a 0,5-1,5 Watts/cm2 de potência acústica. Para Beta vulgaris, a

freqüência de expressão transiente do gene introduzido foi maior utilizando ultrasom

do que a obtida com eletroporação. Até o presente momento, o mecanismo da

41

permeabilização acústica não está completamente esclarecido. Parece estar

relacionado ao violento colapso das bolhas, gerando pressão e temperatura altas.

Isso poderia causar ruptura localizada do plasmalema e levar à absorção das

substâncias dissolvidas na solução onde as células se encontram, com a posterior

restauração da integridade da membrana (Joersbo e Brunstedt, 1992). Zhang et al.

(1991) obtiveram a integração estável do gene da p-glucuronidase (GUS) em tecidos

foliares de Nicotiana tabacum através do ultrasom. Neste trabalho, foi indispensável

a adição de DNA carregador e os resultados indicaram que a presença de

dimetilsulfóxido (DMSO) na solução tampão para o tratamento de ultrasom

aumentou a expressão transiente do gene repórter.

Já é bem conhecido que as H+-ATPases do tonoplasto e da plasmalema

desempenham papéis centrais na fisiologia e bioquímica da célula vegetal. Muitas

pesquisas têm sido realizadas em células ou tecidos animais para identificar os

efeitos do ultrasom, mas, existem poucos estudos dos efeitos do ultrasom em

células de plantas. Alguns poucos trabalhos tem sido realizados com o intuito de

avaliar os efeitos do som e do ultrasom na célula vegetal e de desvendar como

essas forças mecânicas afetam a atividade dessas enzimas (Bochu et al., 1998;

Bochu et al., 2002; Zhao et al., 2002a; Xiaocheng et al., 2003; Xiujuan et al., 2003;

Liu et al., 2003a; 2003b; Liu et al., 2006; Chen et al., 2008).

A estimulação sonora em calos de Chrysanthemum aumenta a atividade H+-

ATPase de membrana plasmática. Esse aumento de atividade é dependente de um

processo de fosforilação reversível da H+-ATPase da membrana plasmática, por

uma proteína quinase dependente de Ca2+, o qual está envolvida na transmissão do

sinal. As ondas sonoras aumentaram a concentração de Ca2+ intracelular (Bochu et

al., 2002), e este foi redistribuído nas organelas em decorrência ao estresse,

aumentando sua concentração no vacúolo e no citoplasma (Liu et al., 2001). A

atividade H+-ATPase foi parcialmente reduzida quando Ca2+ foi quelado, o que

evidenciou o envolvimento do Ca2+, provavelmente desempenhando um importante

papel como mensageiro secundário na estimulação sonora (Zhao et al., 2002a; Yi et

al., 2003). Zhao et al. (2002a) demonstraram, que, em contrapartida, a calmodulina

não está envolvida na promoção da atividade da H+-ATPase da plasmalema. Os

canais de K+ também parecem estar relacionados ao crescimento dos calos

estimulados pelo som, uma vez que o som ativa a abertura desses canais Zhao et al.

(2002b). Ao aplicar a estimulação sonora em vesículas isoladas de crisântemo a

42

resposta foi contrária à observada quando a estimulação foi dada in vivo, sugerindo

que as mudanças na atividade das H+-ATPases de membrana plasmática talvez

sejam devido a uma série de reações fisiológicas e bioquímicas (Zhao et al., 2002).

A atividade de transporte de prótons e de hidrólise de ATP pela V-ATPase

isolada de células de babosa aumentou quando as células foram submetidas a

ultrasom de baixa intensidade. O que pode ter sido o fator principal para o aumento

no crescimento observado nessas células (Liu et al., 2003a). Em estudos mais

recentes Liu et al. (2006), observaram uma promoção na atividade da Ca2+-ATPase

de células de babosa submetidas a ultrasom de baixa intensidade, o que provê boa

condição fisiológica para as células se adaptarem as condições ambientais, uma vez

que o Ca2+ funciona como um mensageiro secundário em muitos vias de sinalização.

Quando as células foram submetidas a ultrasom de alta intensidade, houve uma

inibição dessas enzimas (Liu et al., 2006).

Foi observado um aumento da atividade das enzimas superóxido dismutase

(SOD), peroxidase (POD) e catalase (CAT) em Chrysanthemum estimulados por

ondas sonoras, até determinado tempo de exposição. Essas enzimas ajudam as

células a manter os níveis de radicais livres baixos, decompondo o peróxido de

hidrogênio (H2O2), que pode gerar mais espécies reativas de oxigênio e eliminando o

radical superóxido (O2¯) (Xiujuan et al., 2003). Em pesquisas mais recentes, Chen et

al. (2008) avaliando o sistema de defesa antioxidante de células de algas sonicadas,

também observaram um aumento na atividade das enzimas SOD e CAT, quando

comparado ao controle, bem como na atividade ATPásica de membrana plasmática,

no nível de glutationa e no conteúdo de carotenóides. O ultrasom aumentou também

o conteúdo de malondialdeído (MDA), indicando um aumento na peroxidação lipídica

das células tratadas.

43

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar as respostas, quanto à eficiência fotoquímica e a peroxidação lipídica,

em folhas de dois cultivares de Phaseolus vulgaris L. (Carioca e Negro Huasteco) e

um cultivar de Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10) expostas à alta irradiância.

Verificar se as bombas de prótons presentes na membrana plasmática e no

tonoplasto de Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10), de células de tabaco

(Nicotiana tabacum) - linhagem By2 e de mamoeiro (Carica papaya L.) – grupo

“Solo” – cv. Golden são sensíveis a estímulos físicos (luminosos, sonoros e

estimulados mecanicamente, respectivamente) atuando como perceptores e/ou

mediadores desses estímulos na célula vegetal e estudar sua participação nas

respostas morfogênicas.

3.2 Objetivos específicos

a. Determinar a fluorescência da clorofila a e a peroxidação lipídica em folhas de

dois cultivares de feijão comum Phaseolus vulgaris L. (Carioca e Negro

Huasteco) e um cultivar de caupi Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10)

expostas à alta irradiância;

b. Estudar o efeito da luz na atividade das enzimas H+-ATPase e H+-PPase do

tonoplasto e da H+-ATPase da plasmalema isoladas de hipocótilos de caupi

Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10);

c. Verificar os efeitos da perturbação mecânica (“brushing”) sobre a atividade

das enzimas H+-ATPase do tonoplasto e da H+-ATPase da plasmalema

44

isoladas do caule de mamoeiros (Carica papaya L.) – grupo “Solo” – cv.

Golden, estimulados mecanicamente;

d. Estabelecer a relação entre as respostas morfogênicas ao nível celular e

tecidual com os efeitos encontrados nas bombas de prótons das membranas

plasmática e vacuolar isoladas do caule de mamoeiros (Carica papaya L.)

submetidos à perturbação mecânica;

e. Avaliar os efeitos do ultrasom na atividade das enzimas H+-ATPase e H+-

PPase do tonoplasto e da H+-ATPase da plasmalema isoladas de células de

tabaco (Nicotiana tabacum) - linhagem By2 estimuladas por ondas

ultrassônicas;

f. Verificar a relação entre as respostas morfogênicas a nível celular e tecidual

com os efeitos encontrados nas bombas de prótons das membranas

plasmática e vacuolar isoladas de células de tabaco (Nicotiana tabacum)

submetidas a ondas ultrassônicas.

45

4. TRABALHOS

46

4.1. RÁPIDAS RESPOSTAS DOS LIPÍDIOS DE MEMBRANA E D A EFICIÊNCIA

FOTOQUÍMICA EM PLANTAS DE FEIJÃO COMUM E CAUPI ( Phaseolus vulgaris

e Vigna unguiculata ) SUBMETIDAS A ALTA IRRADIÂNCIA

47

4.1.1 RESUMO

Neste trabalho, nós investigamos as respostas em curto prazo da eficiência

fotoquímica e dos lipídios da membrana em plantas de feijão comum e caupi

submetidas a estresse por alta irradiância. Folhas primárias de plantas jovens de

feijão comum [Phaseolus vulgaris (“Carioca” e “Negro Huasteco”)] e de caupi [Vigna

unguiculata Walp (“Epace 10“)] foram expostas a 2000 µmol m-2 s-1 por 10, 20 e 30

minutos. A fluorescência inicial (F0) foi quase constante para os genótipos em

resposta a alta irradiância exceto para o genótipo Carioca. Uma distinta redução da

fluorescência máxima (Fm) foi claramente observada nos genótipos de feijão

estressados em 20 minutos, seguidos por uma leve recuperação. Em feijão comum,

o rendimento quântico máximo (Fv/Fm), foi reduzido lentamente de 10 a 30 minutos

de exposição à alta irradiância. Em caupi, somente uma ligeira redução de Fv/Fm foi

observada em 20 minutos seguida pela recuperação para os valores normais em 30

min. Em adição, a peroxidação lipídica mudou significativamente nos genótipos de

feijão comum com um evidente aumento em 20 min. Nossos resultados sugerem

que o aparelho fotossintético de caupi é mais tolerante à alta irradiância do que o de

feijão comum e a integridade das membranas celulares de caupi foram

aparentemente mantidas sob condições de alta irradiância.

48

4.1.2 ABSTRACT

In this work, we investigated the short-term responses of the photochemical

efficiency and membrane lipids in common bean and cowpea plants submitted to

high light stress. Primary leaves of young plants of common bean [Phaseolus

vulgaris (“Carioca” e “Negro Huasteco”)] and cowpea [Vigna unguiculata Walp

(“Epace 10”)] were exposed to 2000 µmol m-2 s-1 for 10, 20 and 30 minutes. Initial

fluorescence (Fo) was nearly constant in response to high light genotype except for

Carioca genotype. A distinct reduction of maximum fluorescence (Fm) was clearly

observed in bean stressed genotypes at 20 min followed by a slight recovery. In

common bean, the maximum quantum yield (Fv/Fm), was reduced slowly from 10 to

30 min of high light. In cowpea, only a slight reduction of Fv/Fm was observed at 20

min followed by recovery to normal values at 30 min. In addition, the lipid

peroxidation changed significantly in common bean genotypes with an evident

increase at 20 min. Our findings suggest that the photosynthetic apparatus of

cowpea is more tolerant to high light than common bean and the integrity of cowpea

cell membranes was apparently maintained under high light conditions.

49

4.1.3 INTRODUÇÃO

A energia luminosa é essencial para as plantas, mas em excesso pode ser

prejudicial ao aparelho fotossintético. A fotoinibição ocorre quando a energia do

fóton absorvido excede a capacidade do uso de energia pelo transporte de elétrons

fotossintético (Gilmore e Govindjee, 1999). Sob essa condição, algumas mudanças

ocorrem nas propriedades físico-químicas dos tilacóides levando a uma diminuição,

ou mesmo inativação, do transporte de elétrons fotossintético (Schansker e van

Rensen, 1999) e ao dano oxidativo do fotossistema II, FSII (Longe et al., 1994).

Como resultado, observa-se uma redução na eficiência quântica do FSII (Aro et al.,

1993).

O excesso de energia pode ser dissipado através de processos não

fotoquímicos como calor e fluorescência, não prejudiciais à integridade do aparelho

fotossintético. Porém, outra forma de utilização da energia excedente pode se dar

através da formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). Embora as EROs

possam operar como mensageiros secundários envolvidos na transdução do sinal

em resposta a estresses abióticos (Mittler, 2002), altas concentrações dessas EROs

são altamente prejudiciais para o funcionamento e integridade celular (Wise e

Naylor, 1987 a,b), causando peroxidação lipídica na membrana (Choudhury e

Behera, 2001). Conseqüentemente, a habilidade das plantas para manter sua

integridade de membrana sob estresse por alta irradiância determina sua

capacidade de resistência, e pode ser usada como um critério para avaliar a

resistência ao estresse (Lauriano et al., 2000).

Como uma defesa, vários mecanismos fotoprotetores são ativados pelas

plantas para manter a função do cloroplasto, tais como a de-epoxidação das

xantofilas, o desvio do fluxo de elétrons do fotossistema I (FSI) para o oxigênio

50

molecular, e o aumento do pH dependente da dissipação pela ATP sintase (Hideg e

Murata, 1997; Gilmore e Govindjee, 1999). A inativação do transporte de elétrons

pode ser reversível, mas isso depende da intensidade do dano provocado. Segundo

Barber e Andersson (1992), o dano fotoinibitório atinge a estrutura e função do FSII.

Em folhas intactas, o dano do FSII é reparado pela síntese de novo da proteína D1,

a qual é responsável pela manutenção da funcionalidade do centro de reação do

FSII. A degradação proteolítica da proteína D1 resulta na desmontagem do FSII,

entretanto, a ressíntese dessa proteína promove o seu restabelecimento após

algum tempo. O grau do dano do FSII é o resultado do desbalanço entre a

inativação induzida pela luz e o subseqüente reparo (Greer et al., 1986).

Os efeitos da fotoinibição são usualmente monitorados pelo rendimento

quântico máximo (Fv/Fm), o qual está associado à eficiência fotoquímica máxima do

aparato fotossintético sob saturação de luz. Para respostas em longo prazo, pouco é

conhecido sob as conseqüências da alta irradiância na produtividade de biomassa

(Laing et al., 1995), especialmente em termos de análise da fluorescência da

clorofila a. Powles et al. (1983) demonstraram que a recuperação do estresse por

irradiância ocorreu entre 4 e 8 horas de baixa irradiância em Phaseolus vulgaris. Em

adição, as plantas de P. vulgaris crescidas em baixa irradiância usaram mais

eficientemente o sistema protetor, isto é as xantofilas, com aumentada atividade do

estado de de-epoxidação, suficiente para eliminar as EROs quando a irradiação foi

estimulada por luz direta a baixa temperatura (Tsonev et al., 2003). Entretanto,

pouco é conhecido sobre a relação entre a integridade da membrana, a capacidade

de resistência, e a eficiência fotoquímica, o qual pode representar um critério de

seleção para estresse abiótico.

No presente estudo, a integridade da membrana foi usada para acessar a

resistência à alta irradiância em P. vulgaris e V. unguiculata, as quais diferem

significativamente em suas respostas a alta temperatura (Costa et al., 2002). O

resultado é contrastado com análises dos parâmetros de fluorescência do FSII, o

qual foi medido quando a severidade do tratamento fotoinibitório aumentou. Essas

avaliações provêem alguns indícios para distinguir capacidade de tolerância ao

estresse por alta irradiância entre as duas espécies.

51

4.1.4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1.4.1 Material vegetal

Utilizou-se sementes de dois cultivares de Phaseolus vulgaris L. (Carioca e

Negro Huasteco) e um cultivar de Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10) oriundas

do Banco Ativo de Germoplasma da UENF.

4.1.4 2 Condições de crescimento

As sementes foram semeadas em recipientes plásticos com capacidade de

300 cm3 contendo substrato orgânico e crescidas em uma câmara Biotronette IV

(Lab-Line Instruments, USA) durante 10 ou 11 dias. Esse tempo foi considerado

ótimo para as folhas primárias alcançarem o tamanho máximo. A câmara de

crescimento permitiu um fluxo de fótons fotossintético (FFF) de 200 µmol m-2 s-1 com

fotoperíodo de 12 horas, temperatura de 24 - 26±1 °C, e 48,0 / 72,5 % de umidade

relativa (dia/noite), respectivamente. O FFF foi medido por meio de um fotômetro/

quantômetro/ radiâmetro modelo LI-159 (Licor, USA). A temperatura e a umidade

relativa do ar foram registradas por meio de sensores automáticos (modelo 250,

Spectrum Technologies, USA) acoplado a um data logger (WatchDog Data Logger,

Spectrum Technologies, USA).

4.1.4.3 Tratamento por alta irradiância

As folhas primárias expandidas foram usadas para os experimentos. Uma

folha foi exposta à alta irradiância (HI) de 2000 µmol m-2 s-1 durante 10, 20 e 30 min,

52

e a segunda folha foi coberta com papel alumínio a fim de evitar a irradiação. Essa

folha foi considerada como o controle. Para a indução do estresse, foi utilizada uma

fonte de luz cujo feixe foi passado por um filtro de água a fim de evitar o calor sob as

folhas fotoinibidas durante a irradiação e para concentrar os feixes de luz (Figura 1).

O FFF foi quantificado após o filtro de água. Foram realizados cinco experimentos

para cada tratamento usando plantas distintas.

Figura 1. Esquema montado para submeter as plantas ao estresse luminoso.

Projetor de slide como fonte luminosa, balão com água para reduzir o calor e

concentrar os feixes de luz.

4.1.4.4 Fluorescência da clorofila a

A fluorescência da clorofila a (Chl a) foi medida por meio de um fluorímetro de

luz modulada MINI-PAM (Walz, Germany) em temperatura ambiente (25±2 °C)

(Figura 2). Após o tratamento por HI, as folhas utilizadas nos experimentos foram

adaptadas ao escuro por 30 minutos garantindo o estado oxidado da quinona A. Os

parâmetros de fluorescência avaliados foram os seguintes: a fluorescência inicial

(F0) obtida com luz modulada de baixa intensidade (< 0,1 µmol m-2 s-1), a

fluorescência máxima (Fm) determinada com um pulso de luz saturante (~ 6000 µmol

m-2 s-1) com duração de 0,3 s, e o rendimento quântico máximo do FSII: Fv/Fm = (Fm

53

– F0)/Fm. Consequentemente, esses parâmetros foram usados para obtenção da

dissipação (quenching) fotoquímica: qP = (F’m – F)/(F’m – F0), e da dissipação

(quenching) não-fotoquímica: qN = (Fm – F’m)/(Fm – F0). Esses coeficientes de

dissipação foram automaticamente calculados pelo MINI-PAM. A taxa de transporte

de elétrons foi estimada com ETR = ∆F/F’m × PAR × 0,5 × fator ETR, onde ∆F/F’m é

o rendimento quântico efetivo das amostras irradiadas (fluorescência

variável/fluorescência máxima efetiva), PAR é a radiação fotossinteticamente ativa, e

o fator ETR corresponde a fração de radiação incidente absorvida pelas folhas

verdes (valor de 0,84) (Schreiber et al., 1994). qP, qN, e ETR foram medidos em

resposta a diferentes fluxos de fótons fotossintéticos constituindo de oito períodos

consecutivos de “luz actinica” (0, 190, 285, 432, 598, 894, 1213, e 2000 µmol m-2 s-

1). Cada período de FFF durou por volta de 10 segundos seguido por um pulso de

radiação saturante (6000 µmol m-2 s-1) de 0,3 segundo de duração. Antes da

seqüência de medições com radiação actinica, uma medição foi realizada no escuro.

Figura 2. Medição da fluorescência da clorofila a por meio de um fluorímetro de luz

modulada MINI-PAM, mostrando a pinça onde o emissor de luz é inserido.

54

4.1.4.5 Integridade das membranas - peroxidação lip ídica

As folhas fotoinibidas foram ensaiadas para determinação da peroxidação

lipídica imediatamente após as medições da fluorescência da Chl a. Primeiramente,

os tecidos foliares foram pesados e macerados usando-se gral e pistilo com 5 mL de

ácido tricloroacético (TCA) 0,1% na presença de polivinil polipirrolidona (PVPP). O

uso de PVPP é necessário para proteção contra a formação de complexos fenólicos,

que poderiam interferir nas leituras de absorvância mascarando os resultados. O

homogenato foi então centrifugado a 8000×g por 5 min, e do sobrenadante retirou-se

uma alíquota de 1 mL e adicionou-a a 4 mL de TCA 20%, contendo TBA (ácido

tiobarbitúrico) 0,5%. Essa mistura foi mantida a 95oC por 30 min, seguindo-se por

um rápido resfriamento em gelo. Após centrifugação a 8000×g por 10 min, a

densidade óptica foi determinada a 535 e a 600 nm em espectrofotômetro, (Modelo

6405 UV/Vis, Jenway, UK). A peroxidação lipídica foi estimada através da formação

de malondialdeído (MDA) nos extratos das folhas. A concentração de MDA foi

calculada utilizando um coeficiente de extinção de 155 mM cm-1, de acordo com

Dhindsa et al. (1981).

55

4.1.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os genótipos testados [Phaseolus vulgaris (‘Carioca e ‘Negro Huasteco’)] e

[Vigna unguiculata Walp (‘Epace 10’)] em 3 períodos (10, 20, e 30 min) exibiram

distintas respostas de fluorescência a alta intensidade luminosa (2000 µmol m-2 s-1),

como observado na Figura 3.

56

Figura 3 - Fluorescência inicial (Fo), fluorescência máxima (Fm) e eficiência quântica

(Fv/Fm) medida em folhas de Phaseolus vulgaris L. (Carioca e Negro Huasteco) e de

Vigna unguiculata (L.) Walp. (Epace 10) expostas a FFF de 2000 µmol m-2 s-1 por

10, 20 e 30 minutos. As medidas com o MINI-PAM foram feitas a 25°C, 30 min após

adaptação ao escuro. Fonte: Ferreira et al. (2007).

100

150

200

250

300

350

400

Fo (

a.u.

)

Carioca Negro Huasteco Epace 10

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Fm (

a.u.

)


Control 10 20 300,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Fv/F

m (

a.u.

)

Duration of high light (min)


Tempo de exposição a irradiância

57

Os resultados da Figura 3 mostram que os genótipos mais sensíveis

pareceram ser N. Huasteco e Carioca, cujos valores para a eficiência fotoquímica do

FSII (Fv/Fm) diminuiram quando o tempo de exposição à alta intensidade luminosa

aumentou. Diferentemente dos outros, os valores de Fv/Fm para Epace 10

demonstraram somente pequenas variações com o tempo, decaindo levemente em

20 min, e recuperando em 30 min. Esses parâmetros, os quais caracterizam o

rendimento quântico máximo das reações fotoquímicas iniciais em folhas adaptadas

ao escuro, é o mais adequado para indicar estresse ambiental pelo excesso de

irradiação (Maxwell e Johnson, 2000) e isso foi confirmado em nossa investigação.

Quando os diferentes genótipos foram comparados em relação a F0, um

aumento em N. Huasteco foi inicialmente observado (10 min) seguido por uma

aparente manutenção (20 e 30 min) (Figura 3). O aumento de F0 sob condições

desfavoráveis é usualmente devido à redução do pool de plastoquinona e então

quinona A, a qual nessas condições deixa de ser completamente oxidada por causa

de uma limitação do fluxo de elétrons através do FSII (Krause e Weis, 1984; Krause,

1988). O Cv. Carioca exibiu um comportamento diferente com valores decrescentes

em 10 min seguidos por uma aparente recuperação em 20 e 30 min. Essa queda

em F0 tem sido associada com a destruição do centro de reação do FSII (Bolhàr-

Nordenkampf et al., 1989), mas essa não é provavelmente a situação em Carioca

por causa da rápida recuperação dos valores entre 20-30 min. Em Epace 10,

nenhuma diferença foi detectada nos valores de F0 sob condições fotoinibitórias.

Em relação a Fm, todos os genótipos mostraram redução nos valores com o

aumento da exposição à alta irradiância, mas houve uma tendência de recuperação

em Epace 10 após 30 min (Figura 3). Essa redução em Fm é bem caracterizada visto

que é devido a uma degradação proteolítica da proteína D1 danificada (Aro et al.,

1993). A pequena recuperação de Fm observada para Epace 10 em 30 min pode

sugerir um reparo dos centros de reação dos PSII via síntese de novo da proteína

D1 e remontagem dos centros de reação funcionais do PSII (Mishra e Ghanotakis,

1994). Essa situação provavelmente não ocorre nos outros genótipos, porque o PAR

continua a atingir o complexo FSII danificado e outras proteínas além da D1, talvez a

D2 (Schuster et al., 1988), CP43 e CP47 (Nedbal et al., 1990), e talvez resulte em

perda irreversível do transporte de elétrons do FSII.

De acordo com Ohad et al. (1984), a baixa irradiância é necessária para o

processo de recuperação da fotoinibição. Entretanto, é imperativo aceitar que

58

situações de alta irradiância não são convenientes para o processo de recuperação,

quando ocorreu a transição de 20 para 30 min, especialmente em Carioca e N.

Huasteco. Nesses cultivares, um desbalanço entre inativação e subseqüente reparo

induzido por PAR pode ter levado a uma forte perda do rendimento quântico (Greer

et al., 1986). Essa situação está relacionada com os baixos valores observados de

Fv/Fm (Figura 3). Então, um dano fotoinduzido ocorre no complexo do FSII em todos

os três genótipos, com uma evidência de fotoinibição irreversível (Hideg e Murata,

1997) em Carioca e N. Huasteco, e um rápido processo de reparo somente em

Epace 10.

Tabela 1 – Peroxidação lipídica, medida pelo conteúdo de malondialdeído (MDA)

em plantas dos cultivares Carioca, Negro Huasteco (Phaseolus vulgaris L.) e Epace

10 (Vigna unguiculata (L.) Walp.) expostas a 2000 µmol m-2 s-1 por 10, 20 e 30

minutos. Os valores representam a porcentagem do controle da média de cinco

plantas para cada tratamento.

MDA (% do controle) Duração da luz (minutos)

Cultivares

10 20 30 Carioca 1,20 69,48 16,32 Negro Huasteco 32,81 41,64 -20,75 Epace-10 13,11 19,35 -3,56

Fonte: Ferreira et al. (2007).

Foram encontrados importantes indícios de que o aparelho fotossintético de

Carioca e N. Huasteco demonstraram limitações impostas pelo tempo de exposição

sob alta irradiância. Essa situação é noticiável porque a eficiência fotoquímica foi

quase constante em Epace 10. A exposição das plantas a irradiância normal

usualmente levou a produção de espécies reativas de oxigênio devido às limitações

no “pool” de ATP e NADP+ (Macpherson et al., 1993) e essas moléculas deletérias

são minimizadas por um intricado sistema de defesa que envolve várias enzimas

antioxidantes (Scandalios, 1993). Com uma disponibilidade inadequada do “pool” de

ATP e de NADP+, a energia de excitação está sujeita a transferir moléculas de O2 e

isso pode promover a formação de perigosas espécies de O2¯ ou 1O2. Uma completa

investigação foi conduzida para prover os níveis de peroxidação lipídica em tecidos

59

foliares expostos à alta irradiância (Tabela 1). Esse protocolo foi baseado no fato de

que a inabilidade para transportar elétrons via reações fotoquímicas resulta em um

aumento no conteúdo de MDA (Buege e Aust, 1978; Foyer et al., 1994). A evidência

mostra um maior conteúdo de MDA em Carioca e N. Huasteco sem considerar o

tempo de exposição para alta irradiância. A despeito do aumento de MDA em 20 e

30 min para Epace 10, uma substancial redução posterior para valores do controle

foi observada em 30 min, indicando uma possível re-adaptação do aparelho

fotossintético.

Nessa investigação, tornou-se claro que o aparelho fotossintético de V.

unguiculata (Epace 10) é distinguido dos outros genótipos de P. vulgaris (Carioca e

N. Huasteco) em termos de usar os mecanismos fotoprotetores contra alta

irradiância sob indução de curto tempo. Diferentemente de V. unguiculata, os

genotipos estão expostos a irradiâncias inferiores a ∼ 2000 µmol m-2s-1 ou maiores

em períodos quentes e isso pode resultar em perda de eficiência fotossintética e

conseqüentemente redução de produção de biomassa. Em adição, a alta irradiância

está comumente associada com alta temperatura nos trópicos, constituindo

condições otimizadas para o crescimento e produtividade para V. unguiculata, mas

deletério para P. vulgaris (Silva, 2001; Costa et al., 2002). Nós mostramos que

Carioca e N. Huasteco são menos tolerantes e provavelmente essas cultivares

sofrem fotoinibição irreversível sob alta irradiância diária em condições de campo,

como demonstrado para alta temperatura (Silva, 2001). Os dados de fluorescência

podem prover excelentes achados sob a eficiência da atividade fotoquímica sob alta

irradiância. Novos estudos precisam ser realizados permitindo detectar os

mecanismos bioquímicos de tolerância à alta irradiância como a capacidade de

regeneração da proteína D1, o mecanismo de dissipação do ciclo das xantofilas, o

gradiente de prótons transtilacoidal, e as reações de Mehler tão bem como os efeitos

da fotoinibição crônica na eficiência fotossintética e produtividade.

60

4.1.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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65

4.2. MODULAÇÃO DA V-ATPase E DA P-ATPase DE HIPOCÓT ILOS

ESTIOLADOS DE CAUPI ( Vigna unguiculata (L.) Walp.)

PELA LUZ

66

4.2.1 RESUMO

As bombas de prótons do tonoplasto e da plasmalema são essenciais para os

eventos de absorção de nutrientes e exclusão de íons tóxicos da célula das plantas.

Variações no crescimento celular sejam elas, reguladas por sinais internos ou

externos, podem ter forte associação com alterações observadas no funcionamento

dessas bombas eletrogênicas. Dos muitos estímulos que afetam o desenvolvimento

vegetal, a luz é um dos mais importantes sinais ambientais. Neste trabalho, foi

investigada a modulação das bombas de H+ do tonoplasto e da plasmalema em

hipocótilos de Vigna unguiculata (L.) Walp. pela luz em plântulas crescidas no escuro

por 7 dias a 25+1oC. Após esse período, as vesículas de tonoplasto e plasmalema

foram isoladas dos hipocótilos por meio de centrifugação diferencial e as

preparações foram expostas à luz branca. As atividades das bombas eletrogênicas

foram determinadas colorimetricamente e o transporte de prótons medido em

espectrofluorímetro. As atividades H+-ATPásicas em vesículas do tonoplasto (V-

ATPase) foram estimuladas quando expostas à luz branca, exibindo uma atividade

30 % maior que o controle (escuro), enquanto a ATPase de membrana plasmática

mostrou apenas uma pequena diferença quando comparada ao controle. Quando as

vesículas foram submetidas a fluxos de fótons fotossintéticos (FFF) crescentes, a

ATPase do tonoplasto mostrou, inicialmente, um incremento de atividade. Em outro

ensaio, hipocótilos foram submetidos a 14 horas de luz branca e, logo após, as

vesículas de tonoplasto e de plasmalema foram isoladas. A atividade ATPásica foi

menor nos hipocótilos tratados, quando comparado com o controle (hipocótilos

estiolados). Em relação a velocidade inicial (Vo) e a amplitude máxima (∆Fmáx) do

transporte de prótons, observou-se que houve um aumento do transporte de H+

67

dependente de ATP na ATPase do tonoplasto e uma redução no transporte de H+

dependente de ATP na ATPase de membrana plasmática.

68

4.2.2 ABSTRACT

The proton pumps of the tonoplast and of the plasmalemma are essential for events

of nutrient absorption and exclusion of toxic ions of the plant cell. Variations in the

cellular growth, regulated by either internal or external signals, can be strongly

associated with changes observed in the functioning of these eletrogenic pumps.

Among various stimulatons that affect the plant development, the light is one of the

foremost environmental signals. In this work, the modulation of the tonoplast and

plasmalemma H+ pumps by light was investigated in hypocotyls of Vigna unguiculata

(L.) Walp. in 7-days-old seedlings grown in the dark at 25+1oC. Afterward, the

tonoplast and plasmalemma vesicles were isolated from hypocotyls using differential

centrifugation and the obtained preparations were exposed to the white light. The

activities of the eletrogenic pumps were determined colorimetrically and the H+

transport measured in fluorimeter. The H+-ATPasic activity of tonoplast vesicles were

stimulated in response to the white light exposition, exhibiting an average activity 30

% greater than that of the control (dark), while the plasma membrane H+-ATPase

showed little difference when compared to the control. When the vesicles were

submitted to increasing photossintetic photon fluxes (FFF), the tonoplastic ATPase

showed an enhanced activity. In another assay, hypocotyls were submitted to 14

hours of white light and, straight after, the vesicles of tonoplast and plasmalemma

were isolated. The ATPase activities of treated hypocotyls were lesser than that of

the control (dark-grown hypocotyls). In relation to the initial rate (Vo) and maximal

amplitude (∆Fmáx) of the proton transport, it was observed an increase of the ATP-

dependent H+-transport related to the tonoplast and a reduction in the activity of

transport of the plasma membrane ATPase.

69

4.2.3 INTRODUÇÃO



homeostase celular, bem como no transporte de moléculas e íons e na extensão do

crescimento celular (Taiz e Zeiger, 1998).

A H+-ATPase e H+-PPase vacuolar, geram um gradiente eletroquímico de

prótons através do tonoplasto, acidificando o vacúolo e fornecendo energia para o

transporte de íons e outros metabólitos. Isso possibilita a incorporação de solutos e

de água no vacúolo, induzindo à expansão da célula devido à pressão de

turgescência gerada pelo vacúolo central (Frey e Randall, 1998). A H+-ATPase de

membrana plasmática bombeia prótons através da membrana plasmática do

citoplasma para o exterior celular, acidificando o apoplasto, o que ativa as

expansinas (proteínas que promovem a quebra e reorganização dos polímeros de

celulose da parede celular), possibilitando também, o crescimento celular (Buchanan

et al., 2000). Além disso, o gradiente eletroquímico de prótons que se desenvolve

através da membrana plasmática impulsiona o transporte secundário possibilitando a

absorção de nutrientes, tais como, K+, nitrato, sulfato, sacarose e aminoácidos

(Serrano, 1989, Serrano, 1990). Devido à essencialidade das bombas eletrogênicas

para os eventos de absorção de nutrientes e de crescimento, quaisquer variações

detectadas no crescimento celular, sejam elas reguladas por fitohormônios, sinais

químicos ou luz, podem ter forte associação com alterações no funcionamento

dessas bombas (Serrano, 1989, Serrano 1990).

Dos muitos estímulos que afetam o desenvolvimento vegetal, a luz é o mais

importante sinal ambiental, cujos principais papéis são: (1) a luz como a principal

fonte de energia para a fotossíntese, um sofisticado processo modulado pela

70

quantidade e qualidade de luz, provendo a energia química na forma de açúcares

necessária para a manutenção e o crescimento da célula; (2) a luz atua como um

sinal que é percebido por um sistema de fotorreceptores singular, possibilitando à

planta utilizar um amplo espectro energético, desde o ultra-violeta (UV) até o

vermelho distante, para controlar a morfogênese em todas as etapas do

desenvolvimento (Chamovitz e Deng, 1996).

A luz influencia diretamente a morfogênese da plântula no período pós-

germinativo, durante a transição do crescimento heterotrófico para o crescimento

fotoautotrófico. Durante o desenvolvimento das plântulas, inicialmente, ocorre

inibição do crescimento do hipocótilo por luz, estimulação da abertura do gancho,

expansão e enverdecimento do cotilédone, diferenciação de folhas e cloroplastos e

formação de diversos pigmentos. Além disso, outros eventos fisiológicos como

germinação de sementes, fototropismo, modulação da abertura estomática e

indução do florescimento também são afetados pela luz (Mcnellis e Deng, 1995;

Chory, 1997).

Esses eventos fisiológicos são mediados por um complexo sistema de

fotorreceptores, incluindo os fitocromos, os receptores de luz azul, UV-A e UV-B e,

por fim, as clorofilas e carotenóides. A percepção da luz pelos fotorreceptores inicia

uma cascata de sinalização cujas respostas levam à modulação da expressão

gênica ou a variações em diversos eventos fisiológicos das plantas, tal como

potencial de membrana ou pH local, levando a ativação de enzimas por mecanismos

de fosforilação/desfosforilação (Terzaghi e Cashmore, 1995; Batschauer, 1998). O

que dirige as várias respostas de crescimento e desenvolvimento celular e tecidual

nas plantas (Chamovitz e Deng, 1996; Terzaghi e Cashmore, 1995; Batschauer,

1998; Quail, 2002).

A fotopercepção pelos receptores inicia uma cascata de sinalização

intracelular específica, que induz mudanças na expressão gênica que proporciona

as várias respostas de crescimento e desenvolvimento pelo sinal de luz, modificando

a morfologia e otimizando a fotossíntese (Chamovitz e Deng, 1996; Quail, 2002). Os

sinais de luz azul e UV-A são percebidos primariamente por fototropina (NPH1 e

NPH2) e criptocromo (CRY1 e CRY2), enquanto que sinais de luz vermelha e

vermelha-distante são percebidos pelo fitocromo (PHYA-E), com o PHYA

responsável por sinais de vermelho distante contínuo e PHYB-E primariamente

responsável por sinais de vermelho contínuo. O PHYA também responde a sinais de

71

luz azul e UV-A, bem como para vermelho contínuo. As fototropinas controlam o

fototropismo e os movimentos do cloroplasto. Os outros fotorreceptores controlam

vários outros aspectos da fotomorfogênese e o relógio circadiano através de rotas de

sinalização que convergem em um processo mecanisticamente indefinido de

integração de sinais. Vários intermediários da sinalização e genes regulados por luz

parecem estar envolvidos.

Em células vegetais a manutenção do potencial de membrana e a

homeostase do pH citoplasmático dependem intimamente do funcionamento das

bombas de prótons presentes nessas membranas. A H+-ATPase de membrana

plasmática de células estomáticas é regulada por pulsos de luz azul e vermelha. Na

célula, os pulsos ativam o bombeamento eletrogênico de prótons em protoplastos de

células guarda através de fosforilação da H+-ATPase de membrana plasmática

(Assmann et al., 1985; Kinoshita e Shimazaki, 1999). Enquanto que a luz azul inibe o

alongamento da haste, reduzindo o crescimento do hipocótilo. Há uma inicial inibição

da H+-ATPase da membrana plasmática e subsequente ativação de um ou mais

tipos de canais de ions que contribuem para despolarizar a membrana plasmática

induzido por luz azul (Spalding e Cosgrove, 1989; Spalding e Cosgrove, 1992; Cho e

Spalding, 1996).

Pouco é conhecido sobre o papel da luz na ativação das bombas

eletrogênicas, principalmente das ATPases e PPases do tonoplasto. Assim, o

objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da luz branca (in vitro) na atividade

hidrolítica das enzimas H+-ATPase e H+-PPase do tonoplasto e da H+-ATPase da

plasmalema isoladas de hipocótilos estiolados de plântulas de Vigna unguiculata

Walp, estabelecer o efeito da quantidade de luz na enzima (in vitro). Foram também

analisados o efeito da luz branca na atividade hidrolítica e no transporte de prótons

dessas enzimas em hipocótilos submetidos a 14 horas de luz (in vivo), provendo um

melhor entendimento dos papéis reguladores dessas enzimas no desenvolvimento

das plantas.

72



Utilizou-se uma cultivar de feijão de corda (Epace 10) de Vigna unguiculata

(L.) Walp oriunda do Banco Ativo de Germoplasma da UENF.

4.2.4.2 Condições de crescimento

Sementes selecionadas foram lavadas com hipoclorito de sódio e água

deionizada, e germinadas em papel Germitest. As sementes foram enroladas em

folhas de papel umedecidas com água desionizada, dispostas em duas fileiras, com

um espaçamento de, aproximadamente, dois centímetros entre as sementes, sendo

os rolos acondicionados em um recipiente contendo água suficiente para mantê-los

umedecidos durante o tempo de crescimento. O recipiente foi, então, armazenado

em germinador, sendo o material submetido à temperatura de 28°C e escuro total

por sete dias.

Para os ensaios onde a incidência de luz foi dada diretamente nos hipocótilos,

utilizou-se o mesmo processo descrito acima, porém, após seis dias, os hipocótilos

estiolados foram divididos em dois grupos: um grupo permaneceu no escuro até

completarem os sete dias, os quais consistiram no material controle e o outro grupo

foi transferido para o germinador, sendo o material submetido a 28°C e 14 horas de

luz branca, quando então completaram sete dias.

73

4.2.4.3 Tratamentos de luz

O primeiro ensaio realizado buscou determinar a atividade das H+-ATPases e

H+-PPases vacuolares e das H+-ATPases da plasmalema no escuro e na luz branca

in vitro (600 µmol m-2 s-1 de luz incidindo nas vesículas isoladas), de acordo com o

tempo, objetivando-se verificar se há efeito da luz na ativação das enzimas. Foi

retirada uma alíquota do tubo de reação a cada 10 minutos, iniciando-se com o

tempo zero e finalizando-se com 60 minutos. O ensaio seguinte foi determinar a

atividade das enzimas em diversas quantidades de luz branca in vitro, iniciando-se

com zero (escuro) e seguindo com as quantidades 20, 60, 100, 400, 600, 800, 1100,

1500 e 2000 µmol m-2 s-1 para estabelecer qual quantidade de luz seria utilizada nos

experimentos seguintes. Caso houvesse diferença de atividade entre os tratamentos,

utilizar-se-ia a quantidade de luz na qual as enzimas apresentassem maior atividade.

Também foi determinada a atividade hidrolítica das H+-ATPases e H+-PPases

vacuolares e das H+-ATPases da plasmalema isoladas de hipocótilos submetidos a

14 horas de luz branca, in vivo, sendo o experimento realizado na bancada sob luz

ambiente. Foi retirada uma alíquota do tubo de reação a cada 5 minutos, iniciando-

se com o tempo zero e finalizando-se com 30 minutos.

A quantidade de luz foi monitorada por meio de um fotômetro/ quantômetro/

radiâmetro modelo LI 189 (Li-cor Inc., Nebraska, USA). Foi utilizada uma fonte de

luz, cujo feixe passou por um filtro de água que reduziu a temperatura e concentrou

o foco dos feixes de luz. Foram realizados três experimentos usando preparações

diferentes para cada ensaio, sendo estes realizados com três repetições.

4.2.4.4 Preparação da fração microssomal

As frações microssomais contendo vesículas de membrana plasmática e de

tonoplasto foram isoladas de hipocótilos de Vigna unguiculata Walp. crescidos no

escuro ou submetidos a 14 horas de luz, através de centrifugação diferencial, como

descrito por Giannini e Briskin (1987), com algumas modificações.

Os primórdios foliares e radiculares dos hipocótilos foram removidos com uma

tesoura. Após serem pesados, os hipocótilos foram homogeneizados, usando-se gral

e pistilo em meio tamponado, gelado, sendo o volume de tampão proporcional à

quantidade de matéria fresca, na proporção de 1:2. O tampão de extração foi

74

composto de 250 mM sacarose, 10% glicerol, 100mM Tris-base, 5mM EDTA, 5mM

DTT, 1mM PMSF, 0,4% PVP-40T, 0,3% BSA, 100mM KCl e 10mM glicerol-P. O

homogenato foi filtrado em duas camadas de gaze e, em seguida, o extrato foi

centrifugado a 3.000×g por 10 minutos a 4°C para a remoção de células não

rompidas, núcleos e mitocôndrios, que foram depositados no “pellet”. O

sobrenadante foi, então, centrifugado em ultracentrífuga (modelo CP 75 β, HITACHI,

Japan) a 100.000×g por 30 minutos a 4°C. O precipitado dessa segunda

centrifugação foi ressuspendido em solução tampão contendo: 15% glicerol, 70mM

Tris-HCl (pH 7,6), 1mM EDTA, 1mM DTT e 1mM PMSF.

4.2.4.5 Purificação das vesículas de membrana plasm ática e de

tonoplasto

A fração microssomal foi aplicada sobre um gradiente de sacarose nas

concentrações de 25% e 45%, contendo ainda: 70mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 1mM

DTT e 1mM PMSF. O gradiente com a fração microssomal foi submetido a uma

centrifugação de 100.000×g, em ultracentrífuga (modelo CP 75 β, HITACHI, Japan),

durante 2 horas a 4°C. Após a centrifugação, a band a contendo as vesículas de

membrana plasmática purificadas foi localizada na face inferior (entre as

concentrações de sacarose de 25% e 45%), enquanto as vesículas de tonoplasto

estavam situadas na face superior dos tubos de centrifugação. As bandas foram

coletadas com pipetas “Pasteur” e diluídas com meio de ressuspensão, na

proporção de 1:1. O material foi então congelado em nitrogênio líquido e

armazenado a –70°C até o uso.

4.2.4.6 Determinação de proteínas

As dosagens das proteínas foram realizadas segundo o método descrito por

Bradford (1976).

75

4.2.4.7 Determinação da atividade ATPásica do tonop lasto e da

plasmalema e da atividade PPásica do tonoplasto

As atividades ATPásica e PPásica foram determinadas colorimetricamente,

consistindo na determinação do Pi liberado durante a hidrólise do ATP e do PPi,

respectivamente, segundo o método descrito por Fiske e Subbarrow (1925), com

modificações propostas por Façanha e de Meis (1998).

As reações foram iniciadas com a adição da proteína e finalizadas através da

adição de ácido tricloroacético (gelado) para uma concentração final de 20% (p/V),

sendo os tubos colocados imediatamente no gelo. O material das reações foi

colorido com a mistura de uma solução de 0,5% molibdato de amônio mais 2% ácido

sulfúrico com uma solução de 10% ácido ascórbico, na proporção de 10:1, a qual foi

preparada na hora do uso. Passado 20 minutos fez-se a leitura em

espectrofotômetro (modelo 6405 UV-Vis, JENWAY, England) com comprimento de

onda de 750 nm, obtendo-se a densidade ótica. Quanto maior a atividade hidrolítica

das bombas, maior a liberação de Pi e, conseqüentemente, mais azulada a

coloração do material. O meio reacional foi composto de 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) –

tonoplasto ou 50 mM HEPES-KOH (pH 6,5) – membrana plasmática, 100 mM KCl, 5

mM MgSO4, 0,2 mM Na2MoO4, 0,2 mM H2VO4- e 1mM de ATP para as reações de

atividade da H+-ATPase, e 1 mM de PPi para as reações de atividade da PPase e,

ainda, 30 µg de proteína/mL e H2O.

4.2.4.8 Monitoramento do gradiente de prótons

O gradiente de prótons foi medido como descrito por Michelis e Spanswick

(1986), com algumas modificações propostas por Façanha e de Meis (1998),

monitorando a taxa de decréscimo da fluorescência (∆F/min) da sonda fluorescente

metacromática, 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina (ACMA), excitada com um feixe de

comprimento de onda de 415 nm e a emissão captada a 485 nm, utilizando-se um

espectrofluorímetro (modelo F 4500, HITACHI, Japan).

O ACMA contém um grupo amina que funciona como uma base fraca,

pressupondo que não protonado tem a capacidade de atravessar livremente a

bicamada lipídica das membranas. A protonação da base do grupo amina limita essa

capacidade de movimento transmembranar e, assim, a sonda distribui-se através da

76

membrana conforme a diferença de pH entre o interior e o exterior das vesículas. O

meio reacional foi composto de 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) – tonoplasto ou 10 mM

HEPES-KOH (pH 6,5) – membrana plasmática, 100 mM KCl, 5 mM MgSO4, 250 mM

sacarose, 2 µM ACMA, 1 mM de ATP ou PPi e 30 µg de proteína/mL. Após atingir o

equilíbrio entre efluxo e influxo de prótons, utilizou-se 20 µL de NH4Cl para dissipar o

gradiente formado. Essa dissipação ocorre devido à capacidade da amônia de

atravessar livremente a membrana, passando a forma NH3+, a qual se liga aos

prótons localizados no interior das vesículas, e transporta-os para o exterior.

A partir dos dados obtidos da curva de variação de pH (∆pH) determinou-se a

velocidade inicial (V0) e a variação da fluorescência máxima (∆Fmáx), conforme

mostra a Figura 1.

F 0

F Máx.

F F

F eq

T

PPi

ATP

NH 4 Cl

Seg

Figura 1. Determinação do transporte de H+ para quantificação da velocidade inicial

de transporte de H+ (V0) e da amplitude máxima de transporte de H+ (Fmáx). A queda

da fluorescência do ACMA reflete o transporte de H+ para dentro das vesículas de

membranas.

77

4.2.4.9 Determinação da velocidade inicial (V 0) e da variação da

fluorescência máxima ( ∆∆∆∆Fmáx) do transporte de prótons

Os cálculos da velocidade inicial de formação do ∆pH (V0) e da variação da

fluorescência máxima (∆Fmáx.) foram realizados da seguinte forma:

V0 = [F0 / (Fmáx * T)] * 100, onde:

F0 = fluorescência dependente de V0 em um tempo T qualquer, determinada pela

extrapolação de uma reta tangente à maior inclinação inicial da curva para o eixo do

tempo;

Fmáx = fluorescência máxima;

T = tempo em minutos.

∆∆∆∆Fmáx = Feq / Fmáx * 100, onde:

Feq = fluorescência de equilíbrio, determinada como fluorescência que reflete o

equilíbrio entre o influxo e o efluxo de H+ nas vesículas, sendo calculada da seguinte

forma:

Feq = Fmáx – FF, onde:


FF = fluorescência final.

Com os gráficos obtidos no espectrofluorímetro, determinaram-se os

parâmetros definidos na Figura 1, com o auxílio de um esquadro e respeitando a

escala dada pelo espectrofluorímetro em relação à fluorescência e ao tempo.

78


Com os resultados do trabalho anterior, foi verificado que o aparelho

fotossintético de V. unguiculata (Epace 10) é distinto dos outros genótipos de P.

vulgaris (Carioca e N. Huasteco), sendo mais tolerante a alta irradiância. Em função

disso, selecionou-se esse genótipo para dar continuidade aos experimentos com luz.

Nessa etapa de nossa pesquisa, foi avaliado o efeito da luz sobre a modulação das

bombas de prótons do tonoplasto e da plasmalema isoladas de hipocótilos

estiolados.

Inicialmente, verificou-se a atividade das H+-ATPases do tonoplasto e da

plasmalema submetidas a luz e escuro (Tabela 1). A análise comparativa desses

resultados revelou um aumento da atividade da V-ATPase, enquanto que a P-

ATPase mostrou uma pequena resposta ao estímulo luminoso.

Tabela 1. Hidrólise de ATP e PPi in vitro por vesículas de tonoplasto e de membrana

plasmática de hipocótilos estiolados. Uma reação foi conduzida no escuro e a outra

recebeu 600 µmol m-2 s-1 de luz branca. Os valores representam a média de seis

repetições.

Atividade específica (µmol Pi mg -1 min -1)

Enzimas Escuro Luz branca

(600 µµµµmol m -2 s-1)

V-ATPase 89,10 ± 57,94 ∗ 108,93 ± 71,12 ∗

V-PPase 34,31 ± 6,02 ns 29,18 ± 8,69 ns

P-ATPase 83,42 ± 35,09 ∗ 95,70 ± 41,06 ∗ ∗ (P < 0,05) entre escuro e luz

79

A Tabela 1 exibe os resultados do efeito da luz sobre a atividade das

enzimas. Houve aumento da hidrólise do ATP pela V e P-ATPases por efeito

luminoso. A partir desses resultados, as H+-ATPases da plasmalema e do tonoplasto

surgem como elementos ativos do sistema de percepção/transdução destes sinais

físicos. Contudo, a PPase não revelou resposta ao estímulo.

Devido ao seu papel na regulação da homeostase de íons citoplasmáticos e

na pressão de turgor, não é surpreendente que a atividade da bomba mude em

resposta a estímulos/estresses ambientais tais como: salinidade e seca, baixas e

altas temperaturas e luz (Dietz et al., 2001). As H+-ATPases do tonoplasto e da

plasmalema são enzimas chaves que controlam o gradiente eletroquímico de

prótons nas membranas e endomembranas das células, por essa razão, é de se

esperar que essas enzimas sejam sensíveis a estímulos físicos.

A H+-ATPase tipo V é uma bomba de próton altamente regulada em vários

diferentes caminhos envolvendo mecanismos distintos de regulação, com suas

subunidades regulatórias influenciando a atividade da enzima. Eventos como:

fosforilação das subunidades da V-ATPase, modificações do estado redox da

enzima por oxidação e redução de grupos sulfidrila, presentes nas subunidades A e

B da V-ATPase, proteínas regulatórias que inibem ou ativam a bomba, mudanças na

disponibilidade do substrato, variações no pH citoplasmático e vacuolar e também,

os lipídios da bicamada lipídica onde a enzima está inserida são cruciais para a

atividade da bomba (Ratajczak, 2000). O controle da dissociação e remontagem do

subcomplexo V1 da enzima também está envolvido na regulação (Sze et al., 1999).

A existência de evidências de que distintas isoformas da V-ATPase podem

diferir quanto à composição da subunidade, quanto às propriedades de

bombeamento e regulação (Sze et al., 1999), mostram a diversidade existente entre

as V-ATPases. Dessa forma, em diferentes espécies e em diferentes tipos celulares

dentro de uma mesma planta poder-se-ia observar respostas distintas quanto à

regulação dessas enzimas. Padmanaban et al. (2004), observaram que os genes da

subunidade c da H+-ATPase vacuolar em tecidos de plantas são diferencialmente

influenciados por luz em diferentes tipos de células provavelmente dependendo da

demanda funcional e do estágio de desenvolvimento das células.

A análise da atividade da H+-ATPase tipo P na luz e no escuro, apesar de

mostrar significância, evidenciou um estímulo pela luz de 6%, enquanto que o

estímulo da V-ATPase foi de 30% (Tabela 1).

80

Muitos estudos envolvendo bombas de prótons e luz tem sido conduzidos em

células guarda do estômato, os quais têm demonstrado que a fosforilação do

domínio autoinibitório localizado na região C-terminal da H+-ATPase tipo P, ativa a

enzima, o que parece ser desencadeado por pulsos de luz azul (Assmann, 1985;

Kinoshita e Shimazaki, 1999; 2001; 2002). Em contraste, algumas linhas de

evidências indicam que a desfosforilação ativa a H+-ATPase de membrana

plasmática e que a fosforilação inibe a atividade. Desfosforilação induzida por

patógenos fúngicos da H+-ATPase in vivo em cultura de células de tomate (Xing et

al., 1996) e a desfosforilação mediada por fosfatase alcalina da H+-ATPase in vitro

em células de tabaco (Desbrosses et al., 1998) resultam em um aumento na

atividade da H+-ATPase. Essa controvérsia parece ser devido a diferenças no sítio e

resíduo de fosforilação na H+-ATPase; tipos celulares diferentes podem apresentar

mecanismos de ativação e inibição diferenciados.

A observação de que a H+-ATPase de membrana plasmática de plantas

contém uma região C-terminal autoinibitória implica em vários caminhos possíveis de

regulação da enzima. A proteólise pode simplesmente remover a região inibidora. A

introdução de carga negativa pela fosforilação mediada por uma proteína quinase ou

uma modificação nos lipídios do ambiente por lisofosfolipídios pode resultar em

mudanças conformacionais do domínio inibitório da H+-ATPase tipo P, resultando em

ativação da bomba (Palmgren et al., 1991).

Tem sido mostrado também, o envolvimento da V-ATPase em resposta a

sinalização por luz azul em coleóptilos estiolados (Klychnikov et al., 2007). Nesse

estudo, foi demonstrado que a parte hidrolítica da V-ATPase, V1, interage com a

proteína regulatória 14-3-3, sendo necessário para essa interação a fosforilação da

ATPase por uma quinase, assim como ocorre para a P-ATPase, no processo de

sinalização para abertura dos estômatos (Kinoshita e Shimazaki; 2001; 2002;

Kinoshita et al., 2003).

Os genes da subunidade c da H+-ATPase vacuolar de plântulas crescidas na

luz e crescidas no escuro mostraram grandes diferenças na expressão. Esses genes

da subunidade c são diferencialmente regulados por luz ou escuro em uma forma

específica para o órgão ou tecido que provavelmente depende de receptores de luz

específico da célula e vias de sinalização que são acopladas ao crescimento celular

(Padmanaban et al., 2004).

81

Pelos trabalhos descritos podemos observar que existem mudanças de

expressão de genes de ATPases via estímulo dos tecidos por luz vermelha e azul

(Assmann, 1985; Kinoshita e Shimazaki, 1999; 2001; 2002; Padmanaban et al.,

2004; Klychnikov et al., 2007), entretanto, o aumento na atividade da H+-ATPase

vacuolar em decorrência da luz branca in vitro, isto é, quando esta é aplicada

diretamente nas vesículas isoladas, reflete respostas a mudanças conformacionais

da própria enzima e/ou do microambiente que a circunda.

Os mecanismos de transdução de sinais para essa resposta são ainda pouco

conhecidos, mas, algumas hipóteses podem ser discutidas. O aumento pela luz na

atividade das bombas de prótons leva a mudanças nos parâmetros fisiológicos

celulares, tais como, potencial de membrana ou pH local, que ocorrem quase que

instantaneamente após o estímulo físico atingir a célula. As bombas de prótons do

tonoplasto e da plasmalema estariam atuando como sistemas primários para o

desencadeamento do processo de transdução de sinais na célula vegetal.

A atividade da H+-PPase, ao contrário da H+-ATPase tipo V e tipo P, não foi

estimulada pela luz (Tabela 1). Este resultado sugere papéis fisiológicos distintos

para as duas enzimas no tonoplasto e evidencia que as mudanças de atividade da

V-ATPase não correspondem a simples artefatos provocados pelo tratamento

imposto as vesículas, uma vez que a H+-PPase do tonoplasto foi relativamente

insensível ao estímulo.

Avaliou-se também a atividade da V-ATPase em reposta a quantidades

crescentes de luz (Figura 2). Os dados mostram que houve aumento de atividade

até 400 µmol m-2 s-1 e em 2000 µmol m-2 s-1. Isso mostra que grandes quantidades

de luz não favorecem ao aumento da atividade da V-ATPase. Possivelmente, a

ativação estaria ligada apenas a um efeito de liga/desliga (ausência/presença de

luz).

82

0

20

40

60

80

100

120

140

0 20 60 100 400 600 800 1100 1500 2000

Fluxo de fótons fotossintéticos (µmol m-2 s-1)

A E

(µm

ol P

i mg-1

30

min

-1)

Figura 2. Hidrólise de ATP in vitro por vesículas de tonoplasto de hipocótilos

estiolados. Foram aplicadas diferentes quantidades crescentes de luz branca. Os

valores representam média de três repetições.

Ao aplicar o tratamento de luz diretamente no hipocótilo (in vivo), observou-se

uma inibição da H+-ATPase tipo V e tipo P comparado ao escuro (Figura 3 e 5),

sendo que a inibição foi mais forte na V-ATPase (Figura 3). A PPase não exibiu

diferença entre o controle e o tratamento (Figura 4).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Escuro

Luz branca

A.E

. ( µ

mol

P i m

g -1 )

Figura 3. Hidrólise de ATP in vivo por vesículas de tonoplasto de hipocótilos

estiolados (controle) e hipocótilos submetidos à 14hs de luz branca (tratamento).

83

A.E

. ( µ

mol

P i m

g -1 )

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Escuro

Luz branca

Figura 4. Hidrólise de PPi in vivo por vesículas de tonoplasto de hipocótilos


A.E

. ( µ

mol

P i m

g -1 )

0

200

400

600

800

1000

1200

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Escuro

Luz branca

Figura 5. Hidrólise de ATP por vesículas de membrana plasmática de hipocótilos


É possível que a luz esteja afetando os lipídios da membrana onde estão

inseridas as bombas de prótons, causando uma redução na atividade da P-ATPase

isolada de hipocótilos submetidos a 14 horas de luz branca. Memon e Boss (1990),

ao avaliarem o efeito de curto tempo de radiação luminosa em hipocótilos de

girassol, evidenciaram que a luz causou uma redução da atividade quinase do

fosfatidilinositol monofosfato (PIP), reduzindo, conseqüentemente, as quantidades

de fosfatidilinositol bisfosfato (PIP2). No mesmo trabalho, foi demonstrado que a

84

adição de PIP ou PIP2 em membranas isoladas aumentou a atividade da bomba.

Talvez o PIP2 possa agir diretamente na enzima, associando-se a ela e ativando-a.

Embora a presente pesquisa não tenha sido avaliada nessa instância, os resultados

de Memon e Boss (1990) dão suporte aos presentes dados (Figura 5).

Uma redução no transporte de prótons pela ATPase tipo P também foi

observada (Figura 8), o que pode ter sido causado por uma modificação pela luz na

região responsável pelo acoplamento entre os domínios de transporte de H+ e de

hidrólise de ATP, alterando a estequiometria de 1/1, ou seja, 1 H+ bombeado para 1

ATP hidrolisado. As H+-ATPases tipo V isoladas de hipocótilos que receberam luz

exibiram uma menor atividade hidrolítica quando comparadas ao controle (Figura 3),

isso mostra que a V-ATPase parece responder de forma diferenciada ao estímulo

luminoso fornecido in vitro e in vivo, uma vez que observou-se ativação da enzima

pela luz in vitro e inibição pela luz in vivo. Em contrapartida, um aumento no

bombeamento de prótons pela V-ATPase foi observado (Figura 6) o que talvez tenha

ocorrido por uma mudança conformacional da enzima pela luz, tornando-a mais

eficiente no transporte de H+, com menor gasto de ATP. A H+-PPase também não

respondeu ao estímulo luminoso in vivo (Figura 4), não mostrando diferença de

atividade entre controle e tratamento e, em compensação exibiu um aumento no

transporte de prótons quando os hipocótilos foram tratados com luz (Figura 7).

85

Figura 6. Transporte de prótons pela V-ATPase em vesículas de tonoplasto de

hipocótilos estiolados e hipocótilos estiolados submetidos a tratamento de 14hs de

luz branca, seguido pela queda da fluorescência de uma sonda sensível a diferenças

de pH nas membranas, ACMA.

Figura 7. Transporte de prótons pela V-PPase em vesículas de tonoplasto de

hipocótilos estiolados e hipocótilos estiolados submetidos a tratamento de 14hs de

luz branca, seguido pela queda da fluorescência de uma sonda sensível a diferenças

de pH nas membranas, ACMA.

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Tempo (seg)

Flu

ores

cênc

ia (

%)

hipocótilos estioladoshipocótilos submetidos a luz branca

Controle: V0 = 14,08 ∆Fmáx = 76,81 Tratam.: V0 = 22,24 ∆Fmáx = 75,00

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500

Tempo (seg)

Flu

ores

cênc

ia (

%)



86

Figura 8. Transporte de prótons pela P-ATPase em vesículas de membrana

plasmática de hipocótilos estiolados e hipocótilos estiolados submetidos a

tratamento de 14hs de luz branca, seguido pela queda da fluorescência de uma

sonda sensível a diferenças de pH nas membranas, ACMA.

As alterações na atividade das H+-ATPases em decorrência ao estímulo

luminoso imposto sobre as membranas isoladas, nos permitem sugerir que essas

mudanças estão relacionadas a modulações pós-transcripcionais, não podendo ser

atribuídas ou confundidas com respostas secundárias oriundas da regulação da

expressão gênica, já relatadas na literatura. Acredita-se que as H+-ATPases estejam

no topo da sinalização para esse estímulo, onde as oscilações do pH e do Ca2+

intracelular, amplificariam o sinal, atuando como mensageiros secundários.

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500 600

Tempo (seg)

Flu

ores

cênc

ia (

%)



87


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91

4.3. ATIVIDADE DAS H +-ATPases DO TONOPLASTO E DA PLASMALEMA

EM RESPOSTA A ESTIMULAÇÃO MECÂNICA DE MAMOEIROS

(Carica papaya L.)

92

4.3.1 RESUMO

As bombas de prótons do tonoplasto e da plasmalema são essenciais para os

eventos de absorção de nutrientes e exclusão de íons tóxicos da célula das plantas.

Variações no crescimento celular sejam elas, reguladas por sinais internos ou

externos, podem ter forte associação com alterações observadas no funcionamento

dessas bombas eletrogênicas. Neste trabalho, foi investigada a modulação das

bombas de H+ do tonoplasto e da plasmalema em caules de mudas de mamoeiro do

cultivar “Golden” (Carica papaya L.) submetidas à perturbação mecânica, usando

para isso a técnica do “brushing”. Foram também investigados cortes estruturais do

caule, provendo um melhor entendimento dos papéis reguladores dessas enzimas

no desenvolvimento das plantas. As sementes foram semeadas em tubetes com

capacidade de 53 cm3, contendo como substrato o ‘Plantmax-hortaliças’ + osmocot®

NPK 14-14-14 (660g / 20kg). Os tratamentos de estímulo mecânico corresponderam

a 0, 20 e 40 passadas, com início aos 7 dias após a germinação das sementes, pela

manhã, por 1 dia. Após um dia da indução ao estímulo mecânico, as vesículas de

tonoplasto e plasmalema foram isoladas do caule por meio de centrifugação

diferencial. As atividades das bombas eletrogênicas foram determinadas

colorimetricamente e o transporte de prótons medido em espectrofluorímetro. As

atividades H+-ATPásicas em vesículas do tonoplasto e plasmalema isoladas de

mamoeiros submetidos a 20 EM (estímulos mecânicos) apresentaram um maior

estimulo, quando comparado ao controle; quando dobrou-se o estímulo (40 EM),

observou-se inibição da atividade dessas enzimas. A atividade de hidrólise de ATP

azida sensível pela ATPase do mitocôndrio mostrou redução tanto para 20 EM

quanto para 40 EM. Em relação à velocidade inicial (Vo) e a amplitude máxima

(∆Fmáx) do transporte de prótons, observou-se que houve um aumento do transporte

93

de H+ dependente de ATP na ATPase do tonoplasto e da plasmalema em 20 EM e

uma redução no transporte de H+ dependente de ATP quando aumentou-se o

estímulo para 40 EM.

94

4.3.2 ABSTRACT

The proton pumps of the tonoplast and of the plasmalemma are essential for events

of nutrient absorption and exclusion of toxic ions of the plant cell. Variations in the

cellular growth, regulated by either internal or external signals, can be strongly

associated with changes observed in the functioning of these eletrogenic pumps. In

this work, the modulation of the tonoplast and plasmalemma H+ pumps by

mechanical conditioning was investigated in plants of Carica papaya L. (cv. “Golden”)

using for this the technique of “brushing”. It was also investigated the structure by

microscopy. The seeds were sowed in tubetes with capacity of 53 cm3, containing as

substratum the Plantmax-vegetables + osmocot 14-14-14 (660 g/ 20 kg). The

treatments of mechanical conditioning of 0, 20, and 40 times, they start at 07 days

after the germination of the seeds, daily in the period of the morning, for a period of 1

day. After one day of the induction to the mechanical stimulation (MS), the

tonoplast and plasmalemma vesicles were isolated using differential centrifugation.

The activities of the eletrogenic pumps were determined colorimetrically and the H+

transport measured in fluorimeter. The H+-ATPase activities in tonoplast and

plasmalemma vesicles isolated from papaya plants with 20 MS were stimulated when

compared to the control. In 40 MS the inhibition of the activity of these enzymes was

observed. The hydrolysis activity in ATPase mitochondrial, showed reduction both in

20 MS with as for 40 MS. In relation to the initial rate (Vo) and maximal amplitude

(∆Fmáx) of the proton transport, it was observed an increase of the ATP-dependent

H+-transport related to the tonoplast and plasmalemma in 20 MS and a reduction in

the activity of transport in the 40 MS.

95

4.3.3 INTRODUÇÃO

A habilidade das plantas para perceber e reagir a estímulos mecânicos é

crucial para seu crescimento e sua sobrevivência. As plantas podem perceber o

peso mecânico gerado pelo vento, pela neve, o gelo, o impacto das gotas da chuva,

do granizo, o peso dos frutos, o toque, o som e outros organismos (insetos e

pássaros), os quais induzem uma variedade de respostas fisiológicas em diferentes

órgãos e tecidos (Telewski, 1995; 2006). As células por si podem perceber a

gravidade, a tensão causada pelo próprio peso, o estado de hidratação (pressão de

turgor) e o crescimento interno (Telewski, 2006).

As respostas tigmomorfogênicas pelo qual as plantas reagem ao peso

mecânico envolvem uma série de eventos. Estudos fisiológicos e moleculares têm

mostrado que a perturbação mecânica causa inicialmente uma transdução do

estímulo mecânico em um sinal biológico, finalizando com uma resposta global como

a modificação do crescimento, alterando a morfologia, a anatomia e as propriedades

biomecânicas (Trewavas e Knight, 1994). Isso usualmente resulta em uma redução

no alongamento do caule e uma estimulação do crescimento radial (Garner e

Björkman, 1996; Latimer, 1998; Björkman, 1999). Essas modificações induzidas pela

perturbação mecânica são relevantes por tornar as plantas mais endurecidas e

resistentes às condições ambientais diversas, tornando-as mais resistentes a

estresses futuros (Jaffe et al., 1984; Telewski e Jaffe, 1986b; Biddington, 1986).

Provavelmente todas as plantas sentem e respondem às forças mecânicas. A

relativa contribuição dos diferentes tecidos da planta para a mecanosensibilidade e a

maneira como a sensibilidade local é integrada na planta para produzir a resposta de

crescimento ainda não está claro (Coutand et al., 2000). Tem sido gradualmente

reconhecido que a percepção e resposta a estímulos mecânicos exógenos estão

96

comumente ocorrendo ao nível celular e subcelular. As bases mecanísticas da

percepção ao toque e da sinalização inter e intracelular ainda não são bem

entendidas. Não está claro se as respostas amplamente diversas estão relacionadas

ao nível de percepção ou resposta, ou se os mecanismos e a maquinaria usada por

células únicas para responder as perturbações mecânicas tal como, flutuações no

turgor, estão relacionadas aquelas usadas pelo órgão ou tecido para reagir a forças

mecânicas externamente aplicadas (Telewski, 2006).

A percepção de um sinal mecânico pelas células parece envolver a parede

celular, a membrana plasmática e o citoesqueleto, formando uma rede

mecanosensora (Jaffe et al., 2002). Fasano et al. (2002) propuseram alguns

modelos para explicar como uma força mecânica pode ser traduzida em um sinal

bioquímico. Um desses modelos para a mecanopercepção se dá pela ligação do

citoesqueleto (através de ligantes) à membrana plasmática, a endomembranas,

transmitindo e amplificando a força ao citoplasma (Jaffe et al., 2002; Fasano et al.,

2002). A primeira resposta detectável para um sinal mecânico é uma mudança nos

potenciais de ação e na resistência elétrica, o qual ocorre dentro de segundos após

a perturbação (Jaffe, 1976). A perturbação mecânica levaria a ativação de canais e

bombas de prótons localizados na membrana plasmática e em endomembranas, os

quais atuariam como uma resposta secundária à perturbação em um regulador

global tal como pH citosólico ou potencial de membrana. A ativação da H+-ATPase

da membrana plasmática pode resultar em hiperpolarização da membrana e alterar

o pH citosólico e apoplástico (Fasano et al., 2002).



homeostase celular, bem como no transporte de moléculas e íons e no crescimento

celular (Taiz e Zeiger, 1998). Devido à essencialidade dessas bombas eletrogênicas

para os eventos de absorção de moléculas e íons, quaisquer variações detectadas

no crescimento celular reguladas por estímulos mecânicos, podem ter forte

associação com alterações no funcionamento dessas bombas (Serrano, 1989;

1990). Apesar disso, pouco se conhece sobre os efeitos da estimulação mecânica

sobre a atividade destes sistemas, principalmente das bombas de H+ do tonoplasto.

Alguns trabalhos mostram que a estimulação mecânica de internós jovens de

Bryonia dióica inicialmente reduziu a atividade da H+-ATPase da membrana

plasmática e posteriormente promoveu uma estimulação da enzima, o que mostra

97

que a H+-ATPase de membrana plasmática desempenha um papel chave na

transdução de sinal por sua contribuição no desequilíbrio iônico com cessação da

atividade e por sua subseqüente participação direta na restauração dos balanços

iônicos (Bourgeade e Boyer, 1994). Com isto, o objetivo desse estudo foi avaliar o

efeito da perturbação mecânica, usando para isso a técnica do “brushing”, na

atividade de hidrólise e de transporte de H+ das enzimas H+-ATPase e H+-PPase do

tonoplasto e da H+-ATPase da plasmalema isoladas de caules de mamoeiros. Foram

também analisados cortes estruturais do caule, provendo um melhor entendimento

dos papéis reguladores dessas enzimas no desenvolvimento das plantas.

98



Nessa pesquisa foram utilizadas sementes do genótipo de mamão (Carica

papaya L.), do grupo ‘Solo’ (cv. Golden) extraídas de frutos fornecidos pela Empresa

Caliman Agrícola S/A, localizada no município de Linhares - ES.


As sementes foram semeadas em tubetes de modelo cônico com capacidade

de 53cm3, tendo como substrato o “Plantimax-hortaliças” + osmocot® NPK 14-14-14

NPK (660g /20kg).

As bandejas de tubetes foram mantidas em casa de vegetação, sobre

bancadas, a 90 cm de altura da superfície do solo, sendo realizadas regas diárias,

controladas por meio de micro-aspersores. Aos cinco dias após a germinação das

sementes, foi realizado um desbaste mantendo-se apenas a muda mais vigorosa.

4.3.4.3 Tratamento mecânico

O tratamento de estimulação mecânica (“brushing”), o qual consiste em uma

estimulação física ou estresse aplicado às plantas com o auxílio de um anteparo

ligeiramente abrasivo, foi realizado sete dias após o desbaste. Foi utilizado como

anteparo, uma folha de isopor com as seguintes dimensões: 3cm de espessura x

20cm de largura x 30cm de comprimento. As plantas foram submetidas ao impacto

de 0, 20 e 40 vezes com o auxílio do isopor que foi passado ao longo da fileira das

99

bandejas no sentido ida e volta. As plantas foram submetidas a estimulação

mecânica por um dia, no período da manhã (8:00 - 9:00 horas).



tonoplasto foram isoladas do caule de mamoeiros (Carica papaya L.), do grupo ‘Solo’

(cv. Golden), através de centrifugação diferencial, como descrito por Giannini e

Briskin (1987), com algumas modificações.

Após um dia da indução ao estímulo mecânico, as folhas e as raízes das

plantas de mamoeiro foram removidas com uma tesoura. Após serem pesados, os

caules dos mamoeiros foram homogeneizados, usando-se gral e pistilo em meio

tamponado, gelado, sendo o volume de tampão proporcional à quantidade de

matéria fresca, na proporção de 1:2. O tampão de extração foi composto de 250 mM

sacarose, 10% glicerol, 100mM Tris-base, 5mM EDTA, 5mM DTT, 1mM PMSF, 0,4%

PVP-40T, 0,3% BSA, 100mM KCl e 10mM glicerol-P. O homogenato foi filtrado em

duas camadas de gaze e, em seguida, o extrato foi centrifugado a 3.000×g por 10

minutos a 4°C para a remoção de células não rompida s, núcleos e mitocôndrios, que

foram depositados no “pellet”. O sobrenadante foi, então, centrifugado em

ultracentrífuga (modelo CP 75 β, HITACHI, Japan) a 100.000×g por 30 minutos a

4°C. O precipitado dessa segunda centrifugação, o q ual se constitui na fração

microssomal, foi ressuspendido em solução tampão contendo: 15% glicerol, 70mM

Tris-HCl (pH 7,6), 1mM EDTA, 1mM DTT e 1mM PMSF. A fração microssomal foi

então congelada em nitrogênio líquido e armazenada a –70°C até o uso.



Bradford (1976).

4.3.4.6 Determinação da atividade ATPásica do tonop lasto e da plasmalema

As atividades ATPásicas foram determinadas colorimetricamente, consistindo

na determinação do Pi liberado durante a hidrólise do ATP, segundo o método

100

descrito por Fiske e Subbarrow (1925), com modificações propostas por Façanha e

de Meis (1998).










coloração do material. Foram utilizados inibidores específicos das enzimas para

diferenciá-las. O meio reacional foi composto de 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) –


mM MgSO4, 0,2 mM Na2MoO4, 0,2 mM H2VO4-, 1mM de ATP e, ainda, 30 µg de

proteína/mL e H2O.

4.3.4.7 Monitoramento do gradiente de prótons

O gradiente de prótons foi medido como descrito por Michelis e Spanswick

(1986), com algumas modificações propostas por Façanha e de Meis (1998),

monitorando a taxa de decréscimo da fluorescência (∆F/min) da sonda fluorescente

metacromática, 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina (ACMA), excitada com um feixe de

comprimento de onda de 415 nm e a emissão captada a 485 nm, utilizando-se um

espectrofluorímetro (modelo F 4500, HITACHI, Japan).

O ACMA contém um grupo amina que funciona como uma base fraca,

pressupondo que não protonado tem a capacidade de atravessar livremente a

bicamada lipídica das membranas. A protonação da base do grupo amina limita essa

capacidade de movimento transmembranar e, assim, a sonda distribui-se através da

membrana conforme a diferença de pH entre o interior e o exterior das vesículas. O

meio reacional foi composto de 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) – tonoplasto ou 10 mM

HEPES-KOH (pH 6,5) – membrana plasmática, 100 mM KCl, 5 mM MgSO4, 250 mM

sacarose, 2 µM ACMA, 1 mM de ATP ou PPi e 30 µg de proteína/mL. Foram

utilizados inibidores específicos das enzimas para diferenciá-las. Após atingir o

101

equilíbrio entre efluxo e influxo de prótons, utilizou-se 20 µL de NH4Cl para dissipar o

gradiente formado. Essa dissipação ocorre devido à capacidade da amônia de

atravessar livremente a membrana, passando a forma NH3+, a qual se liga aos

prótons localizados no interior das vesículas, e transporta-os para o exterior.

A partir dos dados obtidos da curva de variação de pH (∆pH) determinou-se a

velocidade inicial (V0) e a variação da fluorescência máxima (∆Fmáx), conforme

mostra a Figura 1.

F 0

F Máx.

F F

F eq

T

PPi

ATP

NH 4 Cl

Seg

Figura 1. Determinação do transporte de H+ para quantificação da velocidade inicial

de transporte de H+ (V0) e da amplitude máxima de transporte de H+ (Fmáx). A queda

da fluorescência do ACMA reflete o transporte de H+ para dentro das vesículas de

membranas.

4.3.4.8 Determinação da velocidade inicial (V 0) e da variação da fluorescência

máxima ( ∆∆∆∆Fmáx) do transporte de prótons

Os cálculos da velocidade inicial de formação do ∆pH (V0) e da variação da

fluorescência máxima (∆Fmáx.) foram realizados da seguinte forma:

102

V0 = [F0 / (Fmáx * T)] * 100, onde:

F0 = fluorescência dependente de V0 em um tempo T qualquer, determinada pela

extrapolação de uma reta tangente à maior inclinação inicial da curva para o eixo do

tempo;


T = tempo em minutos.

∆∆∆∆Fmáx = Feq / Fmáx * 100, onde:

Feq = fluorescência de equilíbrio, determinada como fluorescência que reflete o

equilíbrio entre o influxo e o efluxo de H+ nas vesículas, sendo calculada da seguinte

forma:

Feq = Fmáx – FF, onde:


FF = fluorescência final.

Com os gráficos obtidos no espectrofluorímetro, determinaram-se os

parâmetros definidos na Figura 1, com o auxílio de um esquadro e respeitando a

escala dada pelo espectrofluorímetro em relação à fluorescência e ao tempo.

4.3.4.9 Microscopia Ótica Convencional

Os caules dos mamoeiros submetidos aos tratamentos mecânicos foram

embebidos em solução aquosa de 5% de sacarose, para preservação da

osmolaridade. Foi então, realizado cortes a mão livre desses caules, com o auxílio

de uma base de isopor e uma gilete. Posteriormente, os cortes foram corados com

Safranina, observados e fotografados em um microscópio ótico Axioplan ZEISS

acoplado a um sistema digital de análise de imagem.

103

4.3.4.10 Microscopia Eletrônica de Varredura

As amostras foram fixadas por imersão em uma solução de glutaraldeído 2,5

% e paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1M a temperatura ambiente. Após três

lavagens em tampão fosfato 0,1M para remoção do glutaraldeído residual, as

amostras foram pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio (OsO4) 1% em

tampão fosfato 0,1M, por 2 horas, no escuro e em temperatura ambiente.

Posteriormente, as amostras foram lavadas por três vezes em tampão fosfato 0,1M e

desidratadas em série acetônica crescente (30, 50, 70, 90, 100%).

Em seguida, as amostras selecionadas foram tratadas com a técnica de

secagem pelo ponto crítico do dióxido de carbono em um aparelho Critical Point

Drying Apparatus (Mod CPD 030, Bal-tec), e após secagem, foram metalizadas

utilizando o Automatic Sputter Coater SCD 050, Bal-tec. Finalizado este processo, as

amostras foram observadas em microscópio eletrônico de varredura DSEM 962

(Zeiss).

104


A Tabela 1 mostra a velocidade inicial do transporte de prótons das bombas

do tonoplasto e da plasmalema e a variação da fluorescência máxima quando o

gradiente foi dissipado.

Tabela 1. Velocidade inicial (V0) e amplitude máxima (∆Fmáx) do transporte de

prótons por membranas microssomais isoladas do caule de plantas de mamoeiros

controle e submetidas ao brushing por 20 vezes e 40 vezes (1 dia de tratamento).

Controle Tratamento 20 X Tratamento 40 X

V0 (%/min.) ∆∆∆∆F Max. (%) V0 (%/min.) ∆∆∆∆F Max. (%) V0 (%/min.) ∆∆∆∆FMax. (%)

V-ATPase 4,99 14,07 5,21 16,20 3,10 9,23

P-ATPase 12,99 50,69 15,66 52,05 9,46 46,5

As velocidades iniciais de formação do gradiente de H+, assim como os

valores da variação da fluorescência máxima deste são apresentadas em unidades

arbitrárias.

Nas Figuras 2 e 3 vemos o efeito do estímulo mecânico na atividade da

ATPase tipo P (vanadato sensível) em frações microssomais isoladas de mamoeiros

submetidos a 20 e 40 estímulos mecânicos. Podemos observar um aumento na

atividade da enzima da fração isolada das plantas estimuladas com brushing de 20

EM e uma redução na atividade da enzima de frações isoladas das plantas

estimuladas com brushing de 40 EM, quando comparado ao controle.

Podemos observar na Tabela 1 que houve um pequeno aumento no

transporte de prótons em frações microssomais isoladas de mamoeiros submetidos

ao brushing de 20 EM e uma pequena redução quando estimuladas com brushing

105

de 40 EM quando comparado ao controle, tanto para a V-ATPase quanto para a P-

ATPase. O estímulo mecânico mais brando brushing (20 EM) nas plantas de

mamoeiro não causou danos ao funcionamento dessas enzimas, ao contrário,

aparentemente esse estímulo tornou-as mais eficientes ao verificarmos que o

transporte de H+ ocorreu com menor gasto de ATP. Em contrapartida, após dobrar o

estímulo de brushing (40 EM), observou-se uma certa inibição da atividade de

transporte, indicando uma inibição destas enzimas. Esses resultados são

condizentes com os encontrados para a atividade de hidrólise de ATP, vanadato

sensível (um inibidor da ATPase de membrana plasmática) (Figuras 2 e 3) e

concanamicina sensível (um inibidor da ATPase do tonoplasto) (Figura 5), em

frações microssomais isoladas do caule de plantas de mamoeiro; onde podemos

observar que com brushing de 20 EM, houve um aumento de atividade em relação

ao controle e com 40 EM houve uma redução desta atividade.

R2 = 0,9867

R2 = 0,9965

R2 = 0,8516

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

A E

(um

ol P

i mg-1

ptn

)

Linear (Controle) Linear (20X) Linear (40X)

Figura 2. Hidrólise de ATP (vanadato sensível) pela P-ATPase em frações

microssomais de plantas de mamoeiro controle, submetidas a 20 e 40 passadas (ida

e volta) de tratamento por brushing.

Nas Figuras 2 e 3 vemos o efeito do estímulo mecânico na atividade da

ATPase tipo P (vanadato sensível) em frações microssomais isoladas de mamoeiros

submetidos a 20 e 40 estímulos mecânicos. Podemos observar um aumento na

atividade da enzima da fração isolada das plantas submetidas a tratamento com 20

estímulos mecânicos e uma redução na atividade da enzima de frações isoladas das

plantas submetidas a tratamento com 40 estímulos mecânicos, quando comparado

ao controle. Assim como os resultados encontrados nessa pesquisa, Bourgeade e

106

Boyer (1994) avaliando a estimulação mecânica de internós jovens de Bryonia dióica

observaram que, inicialmente, a atividade da H+-ATPase da membrana plasmática

sofreu uma redução, seguida por uma estimulação prolongada, mostrando que a H+-

ATPase de membrana plasmática desempenha um papel chave na transdução de

sinal por sua contribuição no desequilíbrio iônico com cessação da atividade e por

sua subseqüente participação direta na restauração dos balanços iônicos. A Figura 4

exibe a porcentagem de estímulo em relação ao controle, o qual foi de

aproximadamente 28%.

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

Controle 20X 40X

A E

(um

ol P

i mg-1

ptn

min

-1)

Figura 3. Hidrólise de ATP (vanadato sensível) pela P-ATPase em frações

microssomais de plantas de mamoeiro controle, submetidas a 20 e 40 passadas (ida


107

28,66

-61,68-70,00

-60,00

-50,00

-40,00

-30,00

-20,00

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

20X 40X%

estí

mul

o/in

ibiç

ão

Figura 4. Porcentagem de estímulo/inibição da hidrólise de ATP (vanadato sensível)

pela P-ATPase em frações microssomais de mudas de mamoeiro submetidas a 20 e

40 passadas (ida e volta) de tratamento por brushing em relação ao controle.

A percepção de um sinal mecânico pelas células é um processo rápido com

uma rápida transdução (Baluška et al., 2003) que parece envolver a parede celular,

a membrana plasmática e o citoesqueleto, formando uma rede mecanosensora

(Jaffe et al., 2002). Existem alguns modelos propostos para explicar como uma força

mecânica é traduzida em um sinal bioquímico (Fasano et al., 2002). Um desses

modelos propõe que o citoesqueleto transmite a força para proteínas de membrana

que alteram a “estabilidade” da célula, afetando indiretamente a atividade de canais

(Fasano et al., 2002). Fasano et al., (2002) especulam que a ativação da H+-ATPase

da membrana plasmática poderia resultar em hiperpolarização da membrana e

alteração do pH citosólico e apoplástico, levando a uma cascata de sinalização.

Assim, segundo esses autores, o pH citosólico e o potencial de membrana estariam

atuando como reguladores globais. Esse modelo proposto vai de encontro aos

nossos resultados, onde observamos um aumento na atividade das H+-ATPases

(Figuras 2 e 5) em decorrência ao estímulo mecânico imposto em plantas de

mamoeiro para o brushing de 20 EM.

40X

108

R2 = 0,8812

R2 = 0,9788

R2 = 0,9706

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0 10 20 30 40 50 60

Tempo (minuto)

A.E

.

(um

ol P

i mg-1

ptn

)

Polinômio (controle) Polinômio (20X) Polinômio (40X)

Figura 5. Hidrólise de ATP (concanamicina sensível) pela V-ATPase em frações

microssomais de mudas de mamoeiro controle, submetidas a 20 e 40 passadas (ida


Então a mecanopercepção se dá pela ligação do citoesqueleto (através de

ligantes) à membrana plasmática, a endomembranas, transmitindo e amplificando o

estímulo recebido ao citoplasma (Jaffe et al., 2002; Fasano et al., 2002). Os canais

podem ser uma resposta secundária a uma perturbação mecânica em um regulador

global tal como pH citosólico ou potencial de membrana. A ativação da H+-ATPase

na membrana plasmática pode resultar em hiperpolarização da membrana e alterar

o pH citosólico e apoplástico.

O cálcio é talvez o mensageiro secundário iônico mais amplamente

reconhecido nas plantas, mas mudanças no pH citoplásmico são também

conhecidas por terem difundido efeitos regulatórios na função celular. Entretanto,

diferentemente do Ca2+, os prótons se difundem rapidamente dentro da célula. Em

função disso, sem alguma significante arquitetura citoplásmica para reduzir seu

movimento, os prótons são improváveis de regular mudanças localizadas nos

microdomínios celulares. Ao invez disso, mudanças no pH relacionadas ao sinal

podem servir como um sistema regulatório global para a célula. Assim como o Ca2+,

alteração no pH talvez seja um significante mensageiro secundário intracelular

agindo para gerar um redirecionamento global do conjunto de vias de transdução de

sinal operando na célula, provendo alusão para um possível mecanismo pelo qual

pH e Ca2+ relacionado a transdução de sinal ao toque possam interagir (Fasano et

al., 2002).

109

Apesar de Fasano et al. (2002) não terem estudado o comportamento das H+-

ATPases em função do estímulo mecânico, pelo aumento de atividade de hidrólise

de ATP e também de transporte de prótons observados em relação ao controle para

brushing de 20 EM em nossa pesquisa, podemos sugerir que essas bombas de

prótons estão envolvidas na resposta de sinalização ao estímulo mecânico,

participando na percepção/transdução destes sinais na célula vegetal, levando a

modulações no potencial de membrana e no pH interno e externo.

Em adição ao Ca2+ e pH, mudanças no potencial de membrana também tem

sido proposta como eventos na sinalização ao toque (Fasano et al., 2002).

Mudanças no potencial de membrana podem diretamente modular mudanças na

atividade de transporte da membrana por abrir canais acionados por tensão.

Entretanto, o potencial de membrana pode agir como um regulador global dos

componentes da membrana plasmática tal como o pH pode globalmente regular os

componentes citoplásmicos. Em adição, flutuações no potencial de membrana

parecem importantes para transmitir informação na forma de potenciais de ação,

auto-propagando ondas de despolarização induzida pela troca de íons através da

membrana (Fasano et al., 2002). Maiores estudos precisam ser realizados com o

intuito de evidenciar a caracterização do envolvimento de íons H+ em parceria com

íons Ca2+ como mensageiros celulares de estímulos mecânicos.

R2 = 0,9186

R2 = 0,9424

R2 = 0,8291

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30 40 50

Tempo (min)

AE

(um

ol P

i mg-1

ptn

)

Linear (controle) Linear (20X) Linear (40X)

Figura 6. Hidrólise de ATP (azida sensível) pela F-ATPase em frações mitocondriais

isoladas de mudas de mamoeiro controle, submetidas a 20 e 40 passadas (ida e

volta) de tratamento por brushing.

Em relação à atividade de hidrólise de ATP, azida sensível (um inibidor da

ATPase mitocondrial), em frações microssomais isoladas do caule de plantas de

110

mamoeiro; podemos observar que houve uma redução de atividade em relação ao

controle, tanto para o estímulo de 20 EM quanto para o estímulo de 40 EM (Figura

6), o que mostra que o estímulo mecânico pode ter causado danos ao

funcionamento dessas enzimas.

A Figura 7 mostra cortes transversais da região mediana do caule de

mamoeiros controle e submetidos ao brushing de 20 e 40 EM, observados em

microscópio ótico.

Figura 7. Microscopia ótica do caule de mamoeiros submetidos ao brushing. A -

controle, B - 20 passadas e C - 40 passadas. Aumento de 2,5X.

Podemos observar na Figura 7 um aumento no diâmetro do caule quando

esses foram submetidos ao estímulo mais brando (B) em relação ao controle (A) e

ao tratamento mais forte (C). O que pode ser devido a um aumento no número de

células e/ou a um aumento no tamanho das células do cilindro central e/ou também,

das células do parênquima cortical. Bem como a uma expansão/reestruturação dos

feixes vasculares.

A Figura 8 exibe cortes transversais da região mediana do caule de

mamoeiros controle e submetidos ao brushing de 20 e 40 EM, observados em

microscópio eletrônico de varredura (1A, 2A e 3A, respectivamente) e detalhe

exibindo as células do parênquima cortical (1B, 2B e 3B, respectivamente).

A B C

111

Figura 8. Microscopia eletrônica de varredura do caule de plantas de mamoeiro

submetidas ao brushing. 1A/1B – controle, 2A/2B - 20 estímulos mecânicos, 3A/3B -

40 estímulos mecânicos, 4 – longitudinal.

Foi observada uma melhor distribuição dos elementos de vaso do xilema,

associados a uma uniformidade de distribuição dos espessamentos de parede dos

mesmos elementos em função da maior estimulação mecânica, essas observações

estão de acordo com as propostas por Christensen-Dalsgaard et al. (2007), porém

esses autores propuseram uma descontinuidade do floema pelo estimulo mecânico,

que não foram observadas nesse estudo (Figuras 7 e 8).

112


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115

4.4. EFEITO DO ULTRASOM NA ATIVIDADE DAS BOMBAS DE PRÓTONS

DO TONOPLASTO E DA PLASMALEMA DE CÉLULAS DE TABACO (Nicotiana

tabacum L.) EM SUSPENSÃO

116

4.4.1 RESUMO

O ultrasom é uma forma de energia mecânica que quando aplicado em baixas

intensidades pode induzir o crescimento em plantas. Variações no crescimento

celular sejam elas, reguladas por sinais internos ou externos, podem ter forte

associação com alterações observadas no funcionamento das bombas de prótons

do tonoplasto e da plasmalema, uma vez que essas bombas eletrogênicas são

essenciais para os eventos de absorção de nutrientes e exclusão de íons tóxicos

das células das plantas. Neste trabalho, foi investigado o efeito do ultrasom na

atividade das bombas de prótons do tonoplasto e da plasmalema em células de

tabaco (Nicotiana tabacum L.) em suspensão submetidas à sonicação. As culturas

de tabaco foram acondicionadas em meio MS e mantidas no escuro, sendo

repicadas a cada 15 dias. Os calos de tabaco foram então transferidos para frascos

Erlenmeyer contendo meio MS suplementado com hormônio 2,4D (2,4-ácido

diclorofenoxiacético). Após um período de 15 dias obteve-se o estabelecimento da

cultura em suspensão. Os frascos foram mantidos sob agitação constante com

rotação de 120 rpm, no escuro, a temperatura de aproximadamente 28°C. As células

foram estimuladas recebendo 6 pulsos de ondas ultrassônicas aplicadas com o

auxílio de uma sonda de um aparelho de ultrasom que forneceu intensidade de 2W

durante 5 minutos/pulso. Após um dia da indução ao estímulo ultrassônico, as

vesículas de tonoplasto e plasmalema foram isoladas das células por meio de

centrifugação diferencial. As atividades das bombas eletrogênicas foram

determinadas colorimetricamente. Uma parte das células (controle e tratamento) foi

fixada para posteriormente serem observadas em microscópio ótico, com o intuito de

determinar a integridade dessas células antes e após o tratamento. Verificou-se

também a expressão da V-ATPase através de eletroforese e “imunoblotting” de

117

proteínas, sendo a imunoresposta quantificada densitometricamente. A atividade H+-

ATPásica e H+-PPásica em vesículas do tonoplasto e a atividade H+-ATPásica em

vesículas da plasmalema isoladas de células sonicadas foram estimuladas em

relação ao controle. Em relação às imagens de microscopia, podemos observar uma

manutenção da integridade celular quando as células sofreram sonicação, o que

mostra que o estímulo não causou danos a essas células. No resultado relativo a

expressão da V-ATPase, observamos um aumento significativo de expressão dessa

enzima em relação ao controle, o que confirma nossos resultados de aumento de

atividade.

118

4.4.2 ABSTRACT

Ultrasound is a mechanical energy form that when has been applied in low intensities

can induce the plants growth. Variations in the cellular growth, regulated by either

internal or external signals, can be strongly associated with changes observed in the

functioning of the protons pumps of tonoplast and plasmalemma. These eletrogenic

pumps are essential for events of nutrient absorption and exclusion of toxic ions of

the plant cell. In this work, was investigated the effect of ultrasound in the activity of

protons pumps of the tonoplast and plasmalemma in tobacco cells (Nicotiana

tabacum L.) in suspension culture submitted the sonication. The tobacco cultures

cells were led in MS media and maintained in the darkness and passage culture

conducted each 15 days. The tobacco callus were then transferred to Erlenmeyer

flasks contend MS media, supplemented with hormone 2,4D (2,4-acid

diclorofenoxiacético). After 15 day period was obtained the culture suspension. The

flasks were maintained under constant agitation with rotation gives 120 rpm, in the

darkness, at 28°C temperature approximately. The ce lls were stimulated receiving 6

ultrasonic pulses applied with a probe. Ultrasound pulse measurement had intensity

of 2W for 5 minutes/pulse. After one day of the induction to the ultrasound, the

tonoplast and plasmalemma vesicles were isolated using differential centrifugation.

The activities of the eletrogenic pumps were determined colorimetrically. One faction

of cells (control and treatment) was fixed for posteriori observation in optical

microscopy, with aim of evaluates cell integrity, before and after the treatment. Were

verified the proteins expression of the V-ATPase through electrophoresis and

“imunoblotting”, techniques and immune response quantified densitometrical

methods. The H+-ATPase and H+-PPase activities in tonoplast vesicles and the H+-

ATPase activities in plasmalemma vesicles isolated from sonicated cells were

119

stimulated when compared to the control. The microscopy images reveal cellular

integrity of cells that had ultrasound stimulations. The stimulus did not cause

damages to these cells. Expression results from V-ATPase, showed a significant

increase itself expression in comparation from control cells, what confirms our results

for its activity increase.

120

4.4.3 INTRODUÇÃO

O ultrasom é uma forma de energia mecânica, vibracional, que pode ter ação

deletéria ou indutora do desenvolvimento em tecidos vivos, dependendo da

intensidade, do tempo de exposição, da freqüência de aplicação e da distância do

transdutor ao alvo (Hebling e da Silva, 1995). Recentemente, elevada atenção tem

sido dada aos efeitos benéficos e as potenciais aplicações do ultrasom,

particularmente o de baixa intensidade, em sistemas biológicos e processos

biotecnológicos. Apesar de muitos avanços terem sido alcançados no que diz

respeito à utilização do ultrasom na medicina, poucos estudos têm revelado os

efeitos do ultrasom nas células de plantas (Chen et al., 2008).

A irradiação ultrassônica pode causar estresse térmico e mecânico em

materiais biológicos. O estresse mecânico resulta de dois eventos hidrodinâmicos, a

cavitação acústica e a cavitação induzida por microcorrente. A cavitação acústica

consiste na formação de "microbolhas" que crescem até implodir, gerando pressão e

temperatura altas durante os estágios finais do colapso, podendo causar danos às

células ou macromoléculas circundantes (Joersbo e Brunstedt, 1992). O outro

fenômeno, a cavitação induzida por microcorrente, consiste em amplas e rápidas

oscilações no tamanho da bolha, o que causa um forte fluxo de líquidos no meio que

a circunda (microcorrente). Baixas velocidades dessa microcorrente resultam na

mistura do meio circundante, enquanto altas velocidades podem ocasionar danos às

células (Frizzell, 1988).

O ultrasom de baixa intensidade pode modificar o metabolismo celular, induzir

a inibição e a estimulação de atividades enzimáticas, o crescimento celular, a

biossíntese e a alteração das membranas celulares e de outras estruturas das

organelas celulares (Bochu et al., 1998; Liu et al., 2003a; 2003b; Liu et al., 2006;

121

Chen et al., 2008). Uma das consequências mais amplamente observadas do

ultrasom em células vivas é o aumento na permeabilidade ou na permeabilização da

membrana, aumentando a absorção de substâncias externas, tal como a absorção

de nutrientes e a liberação de produtos intracelular.

Os efeitos estimulantes do ultrasom nas reações biológicas e no crescimento

celular não são ainda bem entendidos, os quais podem ser atribuídos aos efeitos

mecânicos do ultrasom, tais como o aumento da transferência de massa e a

combinação nos sistemas de reação; ou ainda podem ser devido à estimulação de

enzimas ou da atividade metabólica celular. Entretanto, os efeitos benéficos do

ultrasom dependem de sua intensidade, do tempo de exposição e também das

condições fisiológicas dos tecidos das plantas (Bochu et al., 1998; Liu et al., 2003a;

2003b; Liu et al., 2006; Chen et al., 2008).

Já é bem conhecido que as H+-ATPases do tonoplasto e da plasmalema

desempenham papéis centrais na fisiologia e bioquímica da célula vegetal, mas

alguns poucos trabalhos tem sido realizados com o intuito de avaliar o

comportamento dessas enzimas em relação aos efeitos do som e do ultrasom na

célula vegetal, desvendando como essas forças mecânicas afetam a atividade

dessas enzimas (Bochu et al., 1998; Bochu et al., 2002; Zhao et al., 2002a;

Xiaocheng et al., 2003; Xiujuan et al., 2003; Liu et al., 2003a; 2003b; Liu et al., 2006;

Chen et al., 2008).

Alguns trabalhos têm mostrado que o som e o ultrasom afetam a atividade

das bombas de prótons. Tem sido mostrado um aumento de atividade da H+-ATPase

de membrana plasmática em calos de crisântemo, após serem submetidos a ondas

sonoras (Bochu et al., 2002), sendo essa atividade parcialmente reduzida quando

Ca2+ foi quelado, o que evidenciou o envolvimento do Ca2+, provavelmente

desempenhando um importante papel como mensageiro secundário na estimulação

sonora (Liu et al., 2001; Zhao et al., 2002a; Yi et al., 2003). Ao aplicar a estimulação

sonora em vesículas isoladas de crisântemo, a resposta foi contrária à observada

quando a estimulação foi dada in vivo, sugerindo que as mudanças na atividade das

H+-ATPases de membrana plasmática talvez sejam devido a uma série de reações

fisiológicas e bioquímicas (Zhao et al., 2002a). Para a V-ATPase, também tem sido

observado um aumento na atividade de transporte de prótons e na hidrólise de ATP

de células de babosa submetidas ao ultrasom de baixa intensidade (Liu et al.,

122

2003a). Em pesquisas mais recentes, Chen et al. (2008) também observaram um

aumento na atividade da ATPase de membrana plasmática.

Dado à essencialidade das bombas eletrogênicas para os eventos de

absorção de moléculas e íons, quaisquer variações detectadas no crescimento

celular, sejam elas reguladas por fitohormônios, sinais químicos, luz, ou estímulos

mecânicos podem ter forte associação com alterações no funcionamento dessas

bombas (Serrano, 1989; 1990). Apesar disso, pouco se conhece sobre os efeitos do

som e ultrasom sobre a atividade destes sistemas, principalmente das bombas de H+

do tonoplasto. Nesse estudo, objetivou-se avaliar o efeito do ultrasom sobre a

atividade das enzimas H+-ATPase e H+-PPase do tonoplasto e da H+-ATPase da

plasmalema.

123



Para este estudo foram utilizados calos de tabaco (Nicotiana tabacum L.),

linhagem By2, cedidos pela USP, mantidos e multiplicados em nosso laboratório.


As culturas de tabaco foram acondicionadas em meio MS (Murashige e

Skoog, 1962) de indução de calos, contendo 3% de sacarose, previamente

distribuído em placas de Petri e mantidas no escuro (Figura 1A), sendo repicadas a

cada 15 dias em meio novo, retirando-se uma porção do estoque com auxílio de

uma espátula de metal estéril. Após as etapas anteriores de propagação, os calos

de tabaco foram transferidos para frascos Erlenmeyer com capacidade de 1000 mL

devidamente esterilizados, contendo 300 mL de meio MS suplementado com

hormônio 2,4D (2,4-ácido diclorofenoxiacético). Os frascos foram mantidos sob

agitação constante e no abrigo de luz. Após um período de 15 dias obteve-se o

estabelecimento da cultura em suspensão, quando a densidade celular foi apreciável

(Figura 1B). Foram realizados repiques periódicos a cada sete dias retirando

alíquotas de 30 mL com pipeta para propagação das culturas.

124

Figura 1: Aspecto de calos de tabaco (A) e células de tabaco em suspensão

(B).

4.4.4.3 Preparo do pré-inóculo para isolamento de m embranas

Foram inoculados 30 mL de inóculo da cultura líquida em 8 frascos

Erlenmeyers de 1000 mL contendo 300 mL de meio MS novo, previamente

distribuídos e autoclavados, onde foram mantidos no escuro, a temperatura de

aproximadamente 28°C, em shaker com rotação de 120 rpm durante 5 dias, visando

a obtenção de massa celular suficiente para o isolamento das enzimas.

4.4.4.4 Tratamento sonoro

As células em suspensão foram centrifugadas a 3.000×g, durante 10 minutos,

para separá-las do meio de cultura. Retirou-se então grande parte do meio de

cultura, deixando no tubo falcon apenas uma pequena lâmina de meio sobre as

células. As células foram estimuladas recebendo 6 pulsos de ondas ultrassônicas

aplicadas com o auxílio de uma sonda de um aparelho de ultrasom que forneceu

intensidade de 2W durante 5 minutos/pulso. A sonda foi posicionada no meio de

cultura restante no tubo falcon, sem entrar em contato direto com as células. O

material foi dividido em dois grupos, um foi o controle e o outro recebeu o tratamento

sônico. Todo esse procedimento foi realizado em capela de fluxo laminar

previamente limpa e desinfetada, utilizando-se material estéril. As células receberam

então novo meio de cultura e permaneceram nas mesmas condições de

crescimento. Passado um dia após o tratamento, foi realizado o isolamento da fração

microssomal.

125



tonoplasto foram isoladas de células de tabaco (Nicotiana tabacum L.) através de

centrifugação diferencial, como descrito por Giannini e Briskin (1987), com algumas

modificações propostas.

Primeiramente, as células em suspensão foram centrifugadas a 3.000xg,

durante 10 minutos, para precipitá-las, separando-as do meio de cultura, o qual foi

descartado. Após a retirada do meio, as células foram pesadas e incubadas com

uma pectinase [Polygalacturonase solution from aspergillus niger, poly-(1,4-α-D-

galacturonide) glycanohydrolase], durante 40 minutos, para facilitar o processo de

rompimento da parede celular, em temperatura ambiente. Após esse período,

acrescentou-se o tampão de extração gelado, composto de 250 mM sacarose, 10%

glicerol, 100mM Tris-base, 5mM EDTA, 5mM DTT, 1mM PMSF, 0,4% PVP-40T,

0,3% BSA, 100mM KCl e 10mM glicerol-P, sendo o volume de tampão utilizado

proporcional à quantidade de matéria fresca, na proporção de 1:1. Aplicou-se então,

6 pulsos curtos do tipo liga/desliga com um “mixer” (Turratec TE 102-TECNAL) no

tubo falcon contendo as células e o meio de extração, no gelo, para o rompimento e

homogeneização das mesmas. O homogenato foi centrifugado a 3.000×g por 10

minutos a 4°C para a remoção de células não rompida s, núcleos e mitocôndrios, que

foram depositados no “pellet”. O sobrenadante foi, então, centrifugado em

ultracentrífuga (modelo CP 75 β, HITACHI, Japan) a 100.000×g por 30 minutos a

4°C. O precipitado dessa segunda centrifugação foi ressuspendido em solução

tampão contendo: 15% glicerol, 70mM Tris-HCl (pH 7,6), 1mM EDTA, 1mM DTT e

1mM PMSF. A fração microssomal foi então congelada em nitrogênio líquido e

armazenada a –70°C até o uso.



Bradford (1976).

126

4.4.4.7 Determinação da atividade ATPásica do tonop lasto e da

plasmalema e da atividade PPásica do tonoplasto

As atividades ATPásica e PPásica foram determinadas colorimetricamente,

consistindo na determinação do Pi liberado durante a hidrólise do ATP e do PPi,

respectivamente, segundo o método descrito por Fiske e Subbarrow (1925), com

modificações propostas por Façanha e de Meis (1998).










coloração do material. Foram utilizados inibidores específicos das enzimas para

diferenciá-las. O meio reacional foi composto de 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) –


mM MgSO4, 0,2 mM Na2MoO4, 0,2 mM H2VO4- e 1mM de ATP para as reações de

atividade da H+-ATPase, e 1 mM de PPi para as reações de atividade da PPase e,

ainda, 30 µg de proteína/mL e H2O.

4.4.4.8 Microscopia Ótica Convencional

As células foram fixadas em solução de glutaraldeído 2,5 % em tampão

fosfato por 24 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, foram coradas com

Azul de toluidina, observadas e fotografadas em um microscópio ótico Axioplan

ZEISS acoplado a um sistema digital de análise de imagem.

4.4.4.9 Eletroforese e “imunoblotting” de proteínas

As análises de SDS-PAGE e “western blotting” foram realizadas como

descrito em Sambrook et al. (2001) com modificações para avaliação do

comportamento da V-ATPase nas amostras controle e tratadas com ultrasom. As

127

amostras foram aquecidas com β-mercaptoetanol 5% a 100 ºC durante dois minutos

e após terem sido resfriadas, foram aplicadas em SDS-PAGE constituído de gel de

separação (Tris-HCl 187,5 mM pH 8,7, SDS 0,1%, acrilamida 10%, persulfato de

amônio 0,08%, TEMED 0,17%) e gel de concentração (Tris-HCl 125 mM pH 6,8,

SDS 0,1%, acrilamida 3%, persulfato de amônio 0,08%, TEMED 0,17%). A

eletroforese foi realizada em tampão de corrida contendo Glicina 192 mM, Tris 25

mM e SDS 0,1% sob voltagem de 50-100 V. Após a eletroforese, o gel foi imerso em

tampão de transferência (glicina 182 mM, Tris 25 mM e metanol 20%) por 15

minutos para retirada do SDS. Em seguida, as proteínas separadas no gel foram

transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Amersham) no sistema semi-seco

utilizando para isso, uma célula comercial “trans-blot” semi-seco (Amersham

Pharmacia Biotec). Membranas de nitrocelulose cortadas nas mesmas dimensões

do gel foram imersas em tampão de transferência por aproximadamente 5 minutos.

Na célula de transferência, foi montado um sistema onde, para cada gel, foram

colocadas duas folhas de papel de filtro Whatman embebidas em tampão de

transferência. Sobre estas folhas foi colocada a membrana de nitrocelulose e em

seguida o gel e mais duas folhas de papel de filtro embebidas em tampão de

transferência, formando um “sanduíche”. Após este procedimento, a célula de

transferência foi fechada e a transferência de proteínas foi realizada sob uma

corrente contínua de 150 mA durante duas horas no sentido gel-membrana.

Após a transferência, a membrana de nitrocelulose foi corada com uma

solução de Ponceau S (0,1%) para verificação da qualidade da transferência. Em

seguida, a membrana foi descorada em solução PBS (NaCl 150 mM, NaH2PO4 9,1

mM e Na2HPO4 1,7 mM, pH 7,4).

A membrana descorada foi embebida em PBS contendo leite em pó

desnatado 5% durante uma hora a temperatura ambiente sob agitação contínua.

Após o bloqueio, a membrana de nitrocelulose foi imersa em PBS contendo leite em

pó 5% e anti-corpo primário contra subunidade A ou B da V-ATPase (diluição

1:1000), durante 16 horas a 4ºC. Passado este período, a membrana foi lavada em

PBS + leite por 4 vezes com intervalos de 15 minutos (total 1 hora) e após a

lavagem, a membrana foi incubada com anticorpo secundário conjugado com

peroxidase alcalina (anti IgG de coelho, diluição 1:2000) durante 1 hora sob

agitação. Após a incubação com anticorpo secundário a membrana foi novamente

128

lavada em PBS + leite por 4 vezes durante 60 minutos e em seguida lavada por 3

vezes em PBS.

A revelação da reação imunológica foi feita utilizando-se o kit Sigma Fast

(3,3'Diaminobenzidine-DAB peroxidase substrate) seguindo instruções do fabricante.

Após o surgimento das bandas, a membrana foi lavada em água destilada e seca

com o auxílio de papel de filtro. As bandas na membrana de nitrocelulose foram

quantificadas densitometricamente como descrito por Retamal et al. (1999).

129


A Figura 2 exibe a atividade de hidrólise de ATP pela P-ATPase em frações

microssomais isoladas de células de tabaco controle e submetidas a ondas

ultrassônicas. Houve aumento da hidrólise do ATP pela P-ATPase por efeito

ultrassônico.

R2 = 0,8855

R2 = 0,9788

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 10 20 30 40Tempo (min)

A E

(u

mol

Pi m

g-1 p

tn)

Linear (controle) Linear (ultrassom)

Figura 2. Hidrólise de ATP pela P-ATPase em frações microssomais isoladas de

células de tabaco controle e submetidas a ondas ultrassonicas.

Nas Figuras 3 e 4 podemos observar a atividade de hidrólise de ATP e PPi

pela V-ATPase e V-PPase, respectivamente, em frações microssomais isoladas de

células de tabaco controle e submetidas a ondas ultrassônicas. Ambas as enzimas

também mostram um aumento da atividade hidrolítica por efeito ultrassônico.

130

R2 = 0,8106

R2 = 0,9113

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40

Tempo (min)

A E

(um

ol P

i mg-1

de

ptn)

Polinômio (controle) Polinômio (ultrassom)

Figura 3. Hidrólise de ATP pela V-ATPase em frações microssomais isoladas de


R2 = 0,8299

R2 = 0,911

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 10 20 30 40

Tempo (min)

A E

(um

ol P

i mg

-1 p

tn)

Polinômio (controle) Polinômio (ultrassom)

Figura 4. Hidrólise de PPi pela V-PPase em frações microssomais isoladas de


O ultrasom influenciou a atividade das H+-ATPases da plasmalema e do

tonoplasto (Figura 2 e 3, respectivamente) e também da H+-PPase do tonoplasto

(Figura 4) isoladas de células de tabaco. Os dados mostram que a atividade de

hidrólise de ATP e PPi aumentou em decorrência ao estímulo. Acredita-se que a

intensidade e o tempo de exposição não tenham causado danos às células, mas sim

uma alteração no metabolismo celular, levando a ativação das enzimas. Assim como

na presente pesquisa, tem sido observado um aumento na atividade de hidrólise e

de transporte de prótons para a V-ATPase em cultura de calos de babosa expostas

a ultrasom de baixa intensidade e um aumento no crescimento desses calos, o que

131

acredita-se ser decorrente do aumento na atividade de transporte de prótons dessa

enzima (Liu et al., 2003a). Tem sido demonstrado também um aumento de atividade

da Ca2+-ATPase de membrana plasmática em calos de babosa submetidos a

ultrasom de baixa intensidade. Parece que o aumento na atividade dessas enzimas

e a maior taxa de crescimento observados nessas pesquisas são decorrentes de

mudanças na fluidez da membrana dessas células, o qual pode acelerar a absorção

de nutrientes (Liu et al., 2006).

Figura 5: Microscopia ótica de células de tabaco em suspensão controle (A e B) e

sonicadas (C e D) em aumento de 10X.

Na Figura 5 podemos observar células de tabaco controle e submetidas à

estimulação ultrassônica, em suspensão. Percebe-se um maior intumescimento nas

células de tabaco controle (Figuras 5, A e B) quando comparadas às células

sonicadas (Figuras 5, C e D). A sonicação pode ter afetado o balanço hídrico celular.

132

Figura 6: Microscopia ótica em células de tabaco controle e submetidas em

suspensão controle (A e B) e sonicadas (C e D) em aumento de 20X.

Na Figura 6 podemos observar células de tabaco controle e submetidas à

estimulação ultrassônica, em suspensão, em um maior aumento. Pode-se observar

com mais detalhe em maior aumento, um maior intumescimento nas células do

controle (Figura 6, A e B), quando comparadas às células sonicadas (Figura 6, C e

D).

Evidências têm mostrado que o ultrasom aumenta significativamente o

conteúdo de MDA, indicando aumento na peroxidação lipídica e também na

formação de espécies reativas de oxigênio. Por gerar mudanças nos ácidos graxos

insaturados que afetam a estrutura e as propriedades da membrana, esse aumento

na formação de radicais livres e na peroxidação lipídica sob irradiação ultrassônica

pode ter trazido um aumento na permeabilidade da membrana ou perda de

integridade de membrana (Chen et al., 2008). O aumento na permeabilidade da

membrana e a perda de integridade que podem ser gerados pelo ultrassom podem

estar acontecendo em nossa pesquisa (Figuras 5 e 6 – C e D), proporcionando

dessa forma perda de água pela célula e acúmulo de conteúdo celular.

40µµµµm 40µµµµm

40µµµµm

A

C

B

D

40µµµµm

133

Figura 7: “Imunoblotting” da V-ATPase em frações microssomais isoladas de células

de tabaco controle (1) e sonicadas (2). A imunoresposta foi quantificada

densitometricamente como descrito nos “Materiais e métodos”.

A Figura 7 exibe a expressão da V-ATPase por análise de “western blotting”

em frações microssomais isoladas de células de tabaco controle e submetidas a

ondas ultrassonicas (1 e 2, respectivamente). Esses resultados confirmam os dados

de atividade de hidrólise de ATP pela V-ATPase. Podemos observar o aumento na

expressão dessas enzimas em função do tratamento ultrassônico em relação ao

controle, esse aumento pela quantificação densitométrica foi aproximadamente de

474%.

As bombas de prótons do tonoplasto e da plasmalema se mostraram

sensíveis aos estímulos ultrassônicos, atuando para o desencadeamento do

processo de transdução de sinais ambientais na célula vegetal.

100%

1 2

474%

70 KDa

134


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137

5. CONCLUSÕES

Estudos sobre a percepção das plantas a estímulos e estresses físicos vem

progredindo rapidamente, mas vários aspectos dos efeitos da estimulação das

plantas por esses fatores ambientais permanecem desconhecidos. Mesmo com esse

rápido avanço nas pesquisas, ainda estamos longe de elucidar os mecanismos de

percepção das plantas, principalmente no que tange a descrição das bases

bioquímicas e moleculares deste fenômeno. Todavia, várias evidências sugerem que

oscilações finamente controladas de fluxos iônicos, nas membranas biológicas,

representam eventos fundamentais aos processos de percepção e transdução de

sinais físicos provenientes do ambiente. Aqui apresentamos um conjunto de

evidências que fornecem suporte a tese de que as bombas de prótons das

membranas da célula vegetal sejam sistemas sensíveis e atuantes na sinalização

desencadeada por estímulos luminosos e mecânicos. A partir dos resultados

obtidos, especificamente as H+-ATPases da plasmalema e do tonoplasto emergem

como elementos ativos do sistema de percepção/transdução destes tipos de sinais

físicos. A estimulação ou a inibição da atividade destas enzimas em função de um

determinado estímulo ou estresse, quando este é imposto diretamente sobre as

membranas isoladas, reflete respostas a mudanças conformacionais da própria

enzima e/ou do microambiente que a circunda. Isto implica em modulações no

potencial de membrana e do pH interno e externo, que ocorrem quase que

instantaneamente após o estímulo físico atingir a célula. As bombas de prótons do

tonoplasto e da plasmalema se mostraram sensíveis a alguns desses estímulos,

atuando como sistemas primários não só para a transdução de energia, como são

usualmente reconhecidos, mas também para o desencadeamento do processo de

transdução de sinais ambientais na célula vegetal.

138

A relativa insensibilidade da H+-PPase do tonoplasto aos estímulos luminosos

que induziram respostas na V-ATPase presente na mesma membrana, nos permite

concluir que as mudanças de atividade da ATPase não correspondem a simples

artefatos provocados pelo tratamento imposto as vesículas.

Os eventos de transdução de sinais nas células vegetais têm sido descritos

em várias fases, se iniciando com a percepção do estímulo, que desencadearia a

ativação de canais iônicos e de outras proteínas transportadoras, gerando

oscilações do pH e do Ca2+ intracelular, as quais induziriam cascatas de

fosforilação/desfosforilação e por fim regulação da expressão gênica, culminando em

uma resposta fisiológica específica. Os dados relatados nesta tese colocam as H+-

ATPases no início deste processo ao demonstrar, pela primeira vez, mudanças de

atividade das bombas provocadas por estímulos luminosos impostos diretamente

sobre as membranas isoladas. Ou seja, os dados necessariamente estão

relacionados a modulações pós-transcripcionais das bombas e não podem ser

atribuídas ou confundidas com respostas secundárias oriundas de regulação da

expressão gênica, já relatadas na literatura. No caso dos estímulos mecânicos

(brushing e ultrasom) onde os estímulos foram feitos nas plantas ou células vivas,

não se pode falar somente na possibilidade de mudanças conformacionais. De fato,

o bloting da V-ATPase de células sob ultrasom demonstra uma clara regulação em

nível de expressão da enzima, mas ainda não existem evidencias fortes na literatura

que tais estímulos poderiam modular as bombas, quer seja via expressão e/ou

atividade.

Entretanto, o relacionamento inequívoco das oscilações do gradiente

eletroquímico gerado por tais modulações das H+-ATPases com as oscilações do pH

e do Ca2+ intra- e extracelular, necessitam a aplicação de outras técnicas capazes

de medir a atividade das bombas e o fluxo de íons em células vivas. Futuros estudos

eletrofisiológicos aplicando técnicas de patch clamp e sondas vibráteis 3D, e o uso

de sondas fluorescentes sensíveis a diferentes íons podem vir a desvendar as

variações nos potenciais de membrana, e seus reflexos sobre a modulação de

canais iônicos específicos. A caracterização do envolvimento de íons H+ como

mensageiros celulares de estímulos ambientais, tal qual já descrito para os íons

Ca2+, é uma possibilidade que surge da presente tese. A partir dos dados torna-se

possível especular que mudanças de ativação e/ou de localização das H+-ATPases

nas membranas, constituam a base de oscilações transientes espaço-temporais de

139

pH que consolidem estáveis assinaturas de prótons da célula vegetal, específicas

para cada tipo de estímulo ambiental. Para testar tal hipótese a utilização de

técnicas de microscopia óptica e eletrônica para a imunolocalização das H+-

ATPases; paralelamente com técnicas de biologia molecular, como PCR em tempo

real para a quantificação dos transcriptos serão muito úteis.

A ativação das bombas de H+ presentes nas membranas e endomembranas

das células vegetais, em respostas aos estímulos sonoros, luminosos e mecânicos,

identificam as H+-ATPases da plasmalema e do tonoplasto como marcadores

bioquímicos em potencial para prospecção da magnitude e qualidade de estímulos

mais efetivos à produção vegetal. Esses resultados consistem em dados

absolutamente originais e devem contribuir significativamente para a determinação

fisiológica mais precisa das condições de estresse, evitando condições ambientais

adversas em áreas agrícolas, maximizando condições que promovam a

produtividade.

140

6. BIBLIOGRAFIA GERAL

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