tese de doutorado...bifásico, a extração líquido-líquido e a sublação por solvente, em termos...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
TESE DE DOUTORADO
RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE
BIOMOLÉCULAS POR FLOTAÇÃO EM SISTEMAS
AQUOSOS BIFÁSICOS
Carlos Eduardo de Araújo Padilha
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos - DEQ/UFRN
Coorientador: Prof. Dr. Jackson Araújo de Oliveira - DEQ/UFRN
NATAL/RN
FEVEREIRO/2018
Carlos Eduardo de Araújo Padilha
RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE
BIOMOLÉCULAS POR FLOTAÇÃO EM SISTEMAS
AQUOSOS BIFÁSICOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Química da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do grau de Doutor em Engenharia
Química, sob a orientação do Prof. Dr.
Everaldo Silvino dos Santos e coorientação do
Prof. Dr. Jackson Araújo de Oliveira.
NATAL/RN
FEVEREIRO/2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
Sistema de Bibliotecas – SISBI
Catalogação da Publicação na Fonte - Biblioteca Central Zila Mamede
Padilha, Carlos Eduardo de Araújo.
Recuperação e concentração de biomoléculas por flotação em sistemas aquosos bifásicos / Carlos
Eduardo de Araújo Padilha. - 2018.
141 f. : il.
Tese (doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Tecnologia, Programa
de Pós-Graduação em Engenharia Química. Natal, RN, 2018.
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos.
Coorientador: Prof. Dr. Jackson Araújo de Oliveira.
1. Extração - Tese. 2. Componentes fenólicos - Tese. 3. Ácido gálico - Tese. 4. 2-hidroxibifenil -
Tese. 5. Camu-camu - Tese. 6. Polietilenoglicol - Tese. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Oliveira,
Jackson Araújo de. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 577.1
Ana Cristina Cavalcanti Tinôco
CRB 15/262
PADILHA, Carlos Eduardo de Araújo – Recuperação e concentração de biomoléculas por
flotação em sistemas aquosos bifásicos. Tese de Doutorado, UFRN, Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Química. Área de Concentração: Engenharia Química, Linha de
pesquisa: Processos químicos, catalíticos e biotecnológicos, Natal/RN, Brasil.
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos
Coorientador: Prof. Dr. Jackson Araújo de Oliveira
Resumo: A sublação por solvente (SS) é uma técnica baseada na adsorção de substâncias de
supercífie ativa em uma interface gás/líquido e tem se destacado, em relação à extração
líquido-líquido (ELL), por alguns benefícios como a simples operação, baixa dosagem de
solvente, altos índices de eficiência de separação e concentração do produto; embora, não seja
apropriado para tratar todas as biomoléculas. Advinda da sublação por solvente, a flotação em
sistemas aquosos bifásicos (FSAB) opera em um ambiente com elevado teor de água e tem
ganhado destaque nos últimos anos na recuperação de componentes fenólicos. Neste contexto,
a presente tese explora a FSAB como técnica de separação para recuperar moléculas de
diferentes fontes tais como de extrato vegetal: ácido gálico (AG) - a partir da infusão de
folhas de goiaba, e polifenóis como (+)-catequina e quercetina do resíduo despolpado de uma
fruta típica da região amazônica, o camu-camu. Além disso, o agente bactericida 2-
hidroxibifenil (2-HBF) produzido via biodessulfurização do 4-metil-dibenzotiofeno por
Rhodococcus rhodochrous foi recuperado por FSAB. Nesses estudos, sistemas aquosos
bifásicos foram formados a partir do polímero Polietilenogligol (PEG) e o sal sulfato de
amônio, sendo que a flotação foi favorecida pela injeção de ar comprimido para geração das
bolhas ascendentes. A coluna no sistema FSAB foi confeccionada em vidro com 2,64 cm de
diâmetro interno e capacidade de 180 mL. A coluna era equipada no fundo com um disco de
vidro sinterizado de porosidade G4. Uma ampliação de escala, com a proporção
altura:diâmetro (≈ 8,0) usado como critério, também foi efetuada (para FSAB-camu camu) em
uma coluna de vidro de dimensões 60,0 x 8,00 cm e volume útil de 2,5 L. Os resultados
mostraram que as condições operacionais ótimas para recuperação de ácido gálico por FSAB
foram: pH igual a 4,0, concentração de sulfato de amônio de 450 g/L, concentração de PEG
de 80% (m/m), concentração de ácido gálico de 500 μg/mL, tempo de flotação de 120 min,
vazão de ar igual a 37,5 mL/min e razão volumétrica de 0,1. Quando alimentada com extrato
de folhas de goiaba, a FSAB apresentou maiores índices de enriquecimento do ácido gálico do
que a extração em sistema aquoso bifásico convencional. No estudo de captura de polifenóis a
partir do resíduo de camu-camu, as condições experimentais ótimas foram: pH igual a 5,0,
concentração de sulfato de amônio de 450 g/L, vazão de ar igual a 37,5 mL/min, tempo de
flotação de 60 min e razão volumétrica de 0,1. Nesse caso, na condição ótima obteve-se uma
eficiência de separação de 81,02% e coeficiente de concentração duas vezes superior à
tradicional extração em sistema aquoso bifásico. Além disso, observou-se o aumento de
aproximadamente duas vezes no poder antioxidante na fase superior, resultado da migração de
alguns componentes fenólicos como ácido gálico, ácido siríngico, quercetina e (+)-catequina.
Destaca-se que a ampliação de escala foi bem sucedida, uma vez que o desempenho do
processo em escala semi-piloto foi similar àquele obtido em escala menor. Alternativamente,
uma metodologia multivariada foi usada para definir as melhores condições operacionais da
FSAB do 2-HBF. Após um planejamento experimental fracionário, apenas as variáveis vazão
de ar, tempo de flotação e volume da fase topo foram otimizadas pelo planejamento Box-
Behnken, no qual foi possível alcançar valores de eficiência de separação de 43,55-57,55% e
coeficientes de concentração de 3,84-5,88. Assim como nos processos com os componentes
bioativos, a FSAB aplicada à captura de 2-HBF superou a extração em sistema aquoso
bifásico, a extração líquido-líquido e a sublação por solvente, em termos de fatores de
enriquecimento. O processo de flotação também obteve êxito na recuperação e concentração
do 2-HBF a partir do caldo fermentado, embora a análise por CLAE indique a elevada
concentração de contaminantes na fase topo. Assim, os resultados mostraram que a FSAB é
uma técnica promissora para recuperar e, principalmente, concentrar componentes fenólicos
advindos de meios complexos como extratos naturais e caldos de fermentação.
Palavras-chave: Extração, componentes fenólicos, ácido gálico, 2-hidroxibifenil, camu-
camu, polietilenoglicol.
Recovery and concentration of biomolecules by aqueous
two-phase flotation
Abstract: Solvent sublation (SS) is a technique based on the adsorption of active superficial
substances at a gas / liquid interface and has been highlighted, in relation to liquid-liquid
extraction (LLE), by some benefits such as simple operation, low dosage high solvent
separation rates and product concentration; although, it is not suitable for treating all
biomolecules. Derived from solvent sublation, aqueous two-phase flotation (ATPF) operates
in an environment with high water content and has gained prominence in recent years in the
recovery of phenolic components. In this context, the present thesis explores ATPF as a
separation technique to recover molecules from different sources such as plant extract: gallic
acid (GA) - from infusion of guava leaves, and polyphenols like (+) - catechin and quercetin
of the depulped residue of a typical Amazonian fruit, camu-camu. In addition, the bactericidal
agent 2-hydroxybiphenyl (2-HBP) produced via biodesulfurization of 4-methyl-
dibenzothiophene by Rhodococcus rhodochrous was recovered by ATPF. In these studies,
aqueous biphasic systems were formed from the polymer Polyethyleneglycol (PEG) and
ammonium sulfate salt, and flotation was favored by the injection of compressed air to
generate the ascending bubbles. The column in the ATPF system was made of glass with a
2.64 cm internal diameter and a capacity of 180 mL. The column was fitted to the bottom with
a sintered glass disk of G4 porosity. A scale magnification, with the height: diameter ratio
used as a criterion, was also performed (for ATPF-camu camu) in a glass column of
dimensions 60.0 x 8.00 cm and a useful volume of 2.5 L. results showed that the optimal
operating conditions for recovery of gallic acid by ATPF were: pH equal to 4.0, ammonium
sulfate concentration of 450 g/L, PEG concentration of 80% (w/w), gallic acid concentration
of 500 μg/mL, flotation time of 120 min, air flow equal to 37.5 mL/min and volumetric ratio
of 0.1. When fed with guava leaf extract, the ATPF showed higher enrichment indexes and
gallic acid distribution ratios than extraction in a conventional biphasic aqueous system. In the
study with the camu-camu residue, the optimal experimental conditions were: pH equal to 5.0,
ammonium sulfate concentration of 450 g/L, air flow equal to 37.5 mL/min, flotation time of
60 minm and volumetric ratio of 0.1. In this case, in the optimum condition, a separation
efficiency of 81.02% and a concentration coefficient two times higher than the traditional
two-phase aqueous extraction were obtained. In addition, the increase in antioxidant power in
the upper phase was observed, resulting from the migration of some phenolic components
such as gallic acid, syringic acid, quercetin and (+) - catechin. It should be noted that the
scale-up was successful. Alternatively, a multivariate methodology was used to define the
best operating conditions of ATPF to recover 2-HBP. After a fractional experimental design,
only the variables of air flow, float time and volume of the top phase were optimized by the
Box-Behnken design, in which it was possible to reach separation efficiency values of 43.55-
57.55% and coefficients concentration of 3.84-5.88. As in the previous chapters, ATPF
surpassed the two-phase aqueous system extraction, liquid-liquid extraction and solvent
sublation in terms of enrichment factors. The flotation process was also successful in the
recovery and concentration of 2-HBP from the fermented broth, although analysis by HPLC
indicates the high concentration of contaminants in the top phase. Thus, the results showed
that ATPF is a promising technique to recover and, mainly, concentrate phenolic components
from complex media such as natural extracts and fermentation broths.
Key-words: Extraction, phenolic compounds, gallic acid, ortho-phenylphenol, camu-camu,
polyethylene glycol.
AGRADECIMENTOS
À minha família, meu pai José, minha mãe Raimunda, e meus irmãos Ana Maria e
Carlinhos, pelo amor incondicional e apoio ao longo de todos esses anos. Eu não seria nada
sem vocês.
À minha namorada Cleitiane, por todo carinho e paciência durante esta etapa.
Aos meus orientadores, Prof. Everaldo Silvino dos Santos, Prof. Jackson Araújo de
Oliveira, Profa. Gorete Ribeiro de Macedo e Prof. Domingos Fabiano de Santana Souza, pelas
contribuições no meu trabalho e por serem exemplos de profissionalismo.
Aos meus alunos de iniciação científica, Paulo e Hanna, pelo companherismo e por me
ajudarem na realização dos experimentos.
Aos técnicos do LEB, Waleska e Francisco (agora professor), pela gestão do
laboratório, sendo então, importantes para a execução da tese.
Aos colegas de trabalho do LEB, Ana Laura, Marcos, Sérgio, Alexandre, Ruthineia,
Cinthia, Naldo, Emylliany, Priscilla, Jaciara, Juliene, Vitor, Júlia e Luan, pela colaboração e
por me aturarem quase todos os dias.
Aos funcionários da UFRN pela disponibilidade e atenção nos atendimentos.
Por fim, agradeço ao PPGEQ e a CAPES pela bolsa concedida durante o doutorado.
Sumário
Lista de Figuras ........................................................................................................................... i
Lista de Tabelas ........................................................................................................................ iv
Lista de abreviaturas e siglas ...................................................................................................... v
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 19
2. RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO DE FOLHAS DE
GOIABA POR FLOTAÇÃO EM SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS ...................... 23
2.1. Revisão bibliográfica ......................................................................................................... 23
2.1.1. Compostos fenólicos bioativos ........................................................................... 23
2.1.2. Ácido gálico ........................................................................................................ 26
2.1.3. Extração líquido-líquido ..................................................................................... 28
2.1.4. Extração em sistemas aquosos bifásicos (ESAB) ............................................... 29
2.1.4.1. Diagrama de fases ................................................................................ 31
2.1.4.2. Particionamento em ESAB. ................................................................ 33
2.1.5. Sublação por solvente (SS) ................................................................................. 37
2.1.5.1. Mecanismos de transferência de massa .............................................. 38
2.1.5.1.1. Transporte por adsorção em bolhas....................................... 39
2.1.5.1.2. Transporte por drenagem da fase aquosa .............................. 40
2.1.5.1.3. Difusão na interface líquido/líquido ...................................... 41
2.1.5.2. Aplicações da SS .................................................................................. 42
2.2. Objetivos ............................................................................................................................ 47
2.2.1. Objetivos específicos .......................................................................................... 47
2.3. Materiais e Métodos .......................................................................................................... 48
2.3.1. Reagentes e aparato experimental ...................................................................... 48
2.3.2. Preparação do extrato de follhas de goiaba ........................................................ 49
2.3.3. Otimização das condições operacionais ............................................................. 49
2.3.4. Experimentos de comparação ............................................................................ 51
2.3.5. Determinação do ácido gálico e análise por cromatografia líquida de alta
eficiência ................................................................................................................................... 51
2.4. Resultados e Discussões .................................................................................................... 52
2.4.1. Efeito do tipo de solvente orgânico .................................................................... 52
2.4.2. Efeito do pH na fase aquosa ............................................................................... 53
2.4.3. Efeito da concentração de sulfato de amônio .................................................... 55
2.4.4. Efeito do percentual de PEG na camada de topo ............................................... 56
2.4.5. Efeito da concentração inicial do sublado ......................................................... 57
2.4.6. Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação ..................................................... 58
2.4.7. Efeito do volume da fase orgânica ..................................................................... 59
2.4.8. Comparação entre FSAB e ESAB ..................................................................... 61
2.5. Conclusões ......................................................................................................................... 63
3. RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DO RESÍDUO DE CAMU-
CAMU (Myrciaria dubia H.B.K. Vaugh) POR FLOTAÇÃO EM DUAS FASES AQUOSAS
.................................................................................................................................................. 65
3.1. Revisão bibliográfica ......................................................................................................... 65
3.1.1. Valorização de resíduos agroindustriais ............................................................. 65
3.1.2. Camu-camu ......................................................................................................... 66
3.1.2.1. Resíduo despolpado de camu-camu ..................................................... 67
3.2. Objetivos ............................................................................................................................ 69
3.2.1. Objetivos específicos .......................................................................................... 69
3.3. Materiais e Métodos ......................................................................................................... 70
3.3.1. Reagentes e aparato experimental ..................................................................... 70
3.3.2. Preparação do extrato do resíduo de camu-camu .............................................. 70
3.3.3. Experimentos FSAB .......................................................................................... 70
3.3.4. Ampliação de escala da FSAB ........................................................................... 71
3.3.5. Determinação da concentração de polifenóis totais ............................................ 71
3.3.6. Determinação da atividade antioxidante ............................................................. 72
3.3.7. Análise de polifenóis por CLAE ......................................................................... 72
3.4. Resultados e Discussões ................................................................................................... 73
3.4.1. Recuperação de polifenóis por FSAB ................................................................. 73
3.4.1.1. Efeito do tipo de solvente .................................................................... 73
3.4.1.2. Efeito do pH da fase fundo .................................................................. 74
3.4.1.3. Efeito da concentração sulfato de amônio na fase fundo .................... 75
3.4.1.4. Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação ..................................... 77
3.4.1.5. Efeito da razão volumétrica ................................................................ 78
3.4.2. Experimentos comparativos e aumento de escala .............................................. 80
3.4.3. Cromatogramas de CLAE ................................................................................... 81
3.5. Conclusões ......................................................................................................................... 83
4. RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DO 2-HIDROXIBIFENIL A PARTIR DE
CALDO FERMENTADO POR FLOTAÇÃO EM DUAS FASES AQUOSAS .................... 86
4.1. Revisão bibliográfica ......................................................................................................... 86
4.1.1. Biodessulfurização e 2-hidróxibifenil ................................................................. 86
4.1.2. Técnicas de enriquecimento para amostras orgânicas ........................................ 88
4.2. Objetivos ............................................................................................................................ 92
4.2.1. Objetivos específicos .......................................................................................... 92
4.3. Materiais e Métodos ......................................................................................................... 93
4.3.1. Reagentes e aparato experimental ..................................................................... 93
4.3.2. Microrganismos e biodessulfurização ............................................................... 93
4.3.3. Experimentos FSAB .......................................................................................... 94
4.3.4. Comparação entre as técnicas de separação ....................................................... 95
4.3.5. Determinação do 2-HBF e análise por CLAE ................................................... 95
4.4. Resultados e Discussões ................................................................................................... 97
4.4.1. Triagem das variáveis FSAB .............................................................................. 97
4.4.2. Planejamento Box-Behnken ............................................................................ 100
4.4.3. Experimentos de comparação ........................................................................... 104
4.4.4. Recuperação e concentração de 2-HBF obtido da biodessulfurização do 4-
MDBT .................................................................................................................................... 104
4.5. Conclusões ....................................................................................................................... 106
CONCLUSÕES GERAIS ...................................................................................................... 108
Referências bibliográficas ...................................................................................................... 110
i
Lista de Figuras
Figura 2.1 – Esquema simplificado das rotas metabólicas das plantas para produção de
componentes fenólicos. ........................................................................................................... 24
Figura 2.2 – Estrutura química do AG e valores de lipofilicidade do AG e seus galatos de
alquila ....................................................................................................................................... 27
Figura 2.3 – Ilustração esquemática da separação de fases em SABs do tipo polímero/sal. ... 32
Figura 2.4 – Diagrama de fases genérico de um sistema formado pela mistura de PEG e sal . 33
Figura 2.5 – Esquema da classificação dos métodos de separação envolvendo adsorção na
interface gás/líquido. ................................................................................................................ 38
Figura 2.6 – Mecanismos de transferência de massa no processo de sublação por solvente. .. 42
Figura 2.7 – Ilustração do aparato usado na FSAB .................................................................. 48
Figura 2.8 – Efeito do pH no desempenho da FSAB. Os experimentos foram realizados nas
seguintes condições: [sulfato de amônio] = 450 g/L, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL,
vazão de ar = 25 mL/min, tf = 30 min, razão volumétrica = 0.1. ............................................ 54
Figura 2.9 – Efeito do sulfato de amônio no desempenho da FSAB. Os experimentos foram
realizados nas seguintes condições: pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão
de ar = 25 mL/min, tf = 30 min, razão volumétrica = 0,1. ..................................................... 55
Figura 2.10 – Efeito do percentual de PEG no desempenho da FSAB. Os experimentos foram
realizados nas seguintes condições: pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão
de ar = 25 mL/min, tf = 30 min, razão volumétrica = 0,1. ....................................................... 57
Figura 2.11 – Efeito da concentração do sublado no desempenho da FSAB. Os experimentos
foram realizados nas seguintes condições: [sulfato de amônio] = 450 g/L, pH = 4,0, %PEG
(m/m) = 80,0, vazão de ar = 25 mL/min , tf = 30 min, razão volumétrica = 0,1. .. .................. 58
Figura 2.12 – Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação na eficiência de separação usando
a FSAB. Os experimentos foram realizados nas seguintes condições: [sufato de amônio] =
450 g/L, pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, razão volumétrica = 0,1. ......... 59
ii
Figura 2.13 – Efeito do volume inicial da fase rica em PEG no desempenho da FSAB. Os
experimentos foram realizados nas seguintes condições: [sulfato de amônio] = 450 g/L, pH =
4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de ar = 37,5 mL/min , tf = 120 min. ..... 60
Figura 2.14 – Cromatogramas de CLAE para a fase rica em sal antes da FSAB (A), fase rica
em sal depois da FSAB (B) e fase rica em PEG depois da FSAB (C). .................................... 61
Figura 2.15 – Cromatogramas CLAE para o extrato de folhas de goiaba anterior ao processo
de flotação (A), fase rica em sal após a FSAB (B) e fase rica em PEG após a FSAB (C). ...... 63
Figura 3.1 – Frutos de camu-camu.. ......................................................................................... 67
Figura 3.2 – Desempenho da FSAB com diferentes solventes orgânicos. As condições
experimentais usadas foram: pH = 3,8 (sem ajuste do pH); [(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de
ar = 37,5 mL/min; tf = 30 min; razão volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b e c foram
usadas para comparação de respostas; respostas com a mesma letra indicam que não há
diferença entre elas a 95% de confiança ................................................................................... 73
Figura 3.3 – Efeito do pH da fase rica em sal sobre a FSAB. As condições experimentais
usadas foram:% PEG (m/m) = 80,0; [(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de ar = 37,5 mL/min; tf =
30 min; razão volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b, c, d e e foram usadas para
comparação de respostas; respostas com a mesma letra indicam que não há diferença entre
elas a 95% de confiança. .......................................................................................................... 75
Figura 3.4 – Efeito da concentração de sulfato de amônio na fase rica em sal sobre a FSAB.
As condições experimentais usadas foram:% PEG (m/m) = 80,0; pH = 5,0, vazão de ar = 37,5
mL/min; tf = 30 min; razão volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b e c foram usadas para
comparação de respostas; respostas com a mesma letra indicam que não há diferença entre
elas a 95% de confiança............................................................................................................ 76
Figura 3.5 – Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação sobre a FSAB. As condições
experimentais usadas foram:% PEG (m/m) = 80,0; pH = 5,0, [(NH4)2SO4] = 450 g/L; razão
volumétrica = 0,1. As letras maiúsculas A e B foram usadas para comparação de E% para as
diferentes vazões de ar para o mesmo tempo de flotação. As letras minúsculas a, b, c e d
foram usadas para comparação de E% de diferentes tempos de flotação em uma mesma vazão
de ar; respostas com a mesma letra indicam que não há diferença entre elas a 95% de
confiança ................................................................................................................................... 78
iii
Figura 3.6 – Efeito da razão volumétrica sobre a FSAB. As condições experimentais usadas
foram:% PEG (m/m) = 80,0, pH = 5,0, [(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de ar = 37,5 mL/min, tf
= 30 min, razão volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b e c foram usadas para
comparação de respostas; respostas com a mesma letra indicam que não há diferença entre
elas a 95% de confiança............................................................................................................ 79
Figura 3.7 – Aparato experimental em escala piloto antes (A) e depois do processo (B) ........ 82
Figura 3.8 – Cromatograma de CLAE da fase rica em PEG da FSAB sob condições ótimas a
280 nm. Os picos 1, 2, 3, 4, 5 e 6 correspondem ao ácido gálico, (+) catequina, ácido vanílico,
ácido siríngico, ácido elágico e quercetina. ............................................................................. 83
Figura 4.1 – Ilustração simplificada da rota metabólica 4S para biodessulfurização do DBT. 87
Figura 4.2 – Cromatogramas de CLAE 75 μg/L de 2-HBF (A) e curva de calibração (B).. .... 96
Figura 4.3 – Efeitos das variáveis FSAB no planejamento fatorial fracionário sobre o
percentual de eficiência de separação. ...................................................................................... 99
Figura 4.4 – Superfície de respota e gráficos de contorno para eficiência de separação (A),
coeficiente de concentração (B) e razão de distribuição (C) de 2-HBF sob efeitos de duas
variáveis FSAB. A outra variável foi mantida no nível codificado igual a zero .................... 102
Figura 4.5 – Comparação de desempenho de diferentes métodos de separação. FSAB, vo/vw
=1:8; ESAB, vo/vw =1:4; SS, vo/vw =1:8; ELL, vo/vw =1:4. As letras minúsculas a, b, c e d são
usados para comparação de desempenho entre FSAB, ESAB, SS e ELL; valores com a
mesma letra não são significativamente diferentes entre si (p < 0,05) .................................. 105
Figura 4.6 – Cromatogramas CLAE para o caldo fermentado anterior ao processo de flotação
(A), fase rica em sal após a FSAB (B) e fase rica em PEG após a FSAB (C) ...................... 106
iv
Lista de Tabelas
Tabela 2.1 - Classes de componentes fenólicos em plantas ..................................................... 26
Tabela 2.2 - Ordem de execução dos experimentos e as respectivas faixas de operação
estudadas ................................................................................................................................... 50
Tabela 2.3 - Desempenho da FSAB com diferentes solventes orgânicos. As condições
experimentais usadas foram: pH = 4,0, [sulfato de amônio] = 450 g/L,% solvente orgânico
(m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de ar = 25 mL/min , tempo de flotação = 30 min,
razão volumétrica = 0,1 ............................................................................................................ 53
Tabela 2.4 - Comparação de desempenhos entre a ESAB (1:4) e FSAB (1:10) para a solução
modelo e o extrato de folhas de goiaba .................................................................................... 62
Tabela 3.1 - Comparação entre os métodos de separação na recuperação de polifenóis de
resíduo de camu-camu .............................................................................................................. 80
Tabela 3.2 - Valores médios de concentração de componentes fenólicos (definidos em mg/100
g do material seco) e poder antioxidante (μmol TE/g do material seco) no resíduo de camu-
camu e no produto da FSAB .................................................................................................... 81
Tabela 4.1 - Valores das variáveis FSAB e seus níveis no planejamento de meia fração ....... 94
Tabela 4.2 - Matriz do planejamento fatorial fracionário 26-1
com o percentual de eficiência de
separação como resposta .......................................................................................................... 98
Tabela 4.3 - Valores das variáveis FSAB e seus níveis no planejamento Box-Behnken ....... 100
Tabela 4.4 - Matriz do BBD com três fatores. O pH da fase aquosa, a concentração de sal e a
concentração inicial de sublado foram fixados em 4,0, 425 g/L e 75 mg/L, respectivamente
................................................................................................................................................ 101
v
Lista de abreviaturas e siglas
2-HBF - 2-Hidróxibifenil
AD2EHF - Ácido di- ácido di(2-etilhexil) fosfórico
AG - Ácido gálico
BB - Box-Behnken
C - Concentração volumétrica
C0 - Número de repetições no ponto central
Ca - Concentração de soluto na fase aquosa
Co - Concentração de soluto na fase orgânica
CPEG - Concentração do sublado na fase de fundo em um determinado tempo t
Cw - Concentração do sublado na fase de fundo em um determinado tempo t
Cwi - Concentração inicial do sublado na fase de fundo
CG - Cromatografia gasosa
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
CTAB - Brometo de cetrimônio
D - Razão de distribuição
D-TISB - D-tartarato de isobutila
DBT - Dibenzotiófeno
DPPH - 2,2 difenil-1-picrilhidrazil
DPR - Desvio padrão relativo
EAA - Espectrometria de absorção atômica
EAG - Equivalentes a ácido gálico
ELL - Extração líquido-líquido
EM - Espectrometria de massa
EOPO - Etileno óxido/propileno óxido
EPN - Extração por ponto de nuvem
vi
ESAB - Extração em sistema aquoso bifásico
ESL - Extração sólido-líquido
E% - Percentual de eficiência de separação
FCE - Flotação/Complexação/Extração
FSAB - Flotação em sistema aquoso bifásico
HDS - Hidrodessulfurização
HDT - hexadeciltrimetilamõnio
HTMAB - Brometo de hexadeciltrimetilamônio
k - Número de fatores
K - Coeficiente de partição
L-ADBT - Ácido dibezoil-L-tartárico
LSS - Lauril sulfato de sódio
N - Número de ensaios no planejamento Box-Behnken
P - Lipofilicidade relativa
PCP - Ftacianina de cobre
PEG - Polietileno glicol
SAB - Sistema aquoso bifásico
SS - Sublação por solvente
Xi - Fatores codificados do planejamento fracionário 26-1
Xi ‘- Fatores codificados do planejamento Box-Behnken
W - Concentração mássica
α - Coeficiente de concentração
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
Introdução 19
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
1. Introdução
Os surgimentos recentes de novos fármacos e outros produtos de natureza
biotecnológica tornaram urgentes inovações nas técnicas downstream processing (VICENTE
Os surgimentos recentes de novos fármacos e outros produtos de natureza
biotecnológica tornaram urgentes inovações nas técnicas downstream processing (VICENTE
et al., 2014). Estas técnicas correspondem às operações unitárias usadas para separar materiais
insolúveis, recuperar e purificar produtos de uma conversão enzimática ou de um processo de
produção microbiológica. A extração líquido-líquido (ELL) é uma operação unitária própria
da Engenharia Química, embora tenha sido incluída há tempos em esquemas de recuperação e
purificação de biomoléculas. A separação por ELL convencional se baseia na diferença entre
os coeficientes de partição dos componentes de sistemas formados por água e solventes
orgânicos (WEI et al., 2002). Contudo, algumas restrições são conhecidas quanto ao uso de
solventes orgânicos bem como às condições operacionais ríspidas da ELL, os quais podem
causar a degradação dos produtos (DUTRA-MOLINO et al., 2014). SALCES et al. (2001)
afirmaram que extrações realizadas sob temperaturas superiores a 60 oC provocam a
degradação de componentes fenólicos, atribuídas à hidrólise, reações de redução e
polimerização do analito. Segundo PESSOA JR. & KILIKIAN (2005), componentes como
hexano, diclorometano e benzeno não são apropriados para purificar proteínas, devido ao
comprometimento da estrutura terciária e, consequentemente, à perda da atividade biológica.
Tratando-se especificamente destas biomoléculas, o alto conteúdo de água nas fases (entre 80-
90% m/m) é fundamental para sua estabilidade (ASENJO & ANDREWS, 2012; DUTRA-
MOLINO et al., 2014).
Neste sentido, a extração líquido-líquido em sistemas aquosos bifásicos (SABs) tem se
provado uma valiosa técnica para separar, concentrar e purificar materiais biológicos como
proteínas, enzimas, ácidos nucléicos, componentes fenólicos, células de plantas e animais
(WEI et al., 2002; RAJA et al., 2011; KARKAŞ & ÖNAL, 2012). Os SABs são empregados,
na maioria dos casos, na forma de uma mistura de polietilenoglicol (PEG) e sal (fosfato,
sulfato, citrato, etc.) devido a sua baixa tensão interfacial, rápida segregação das fases e baixo
custo (BABU et al., 2008; SHAHRIARI et al., 2010; KARKAŞ & ÖNAL, 2012; ALMEIDA
et al., 2014; FERREIRA et al., 2014). Apesar das vantagens supracitadas, a extração líquido-
líquido por SABs pode não ser a técnica mais indicada em estudos de detecção por
cromatografia, seja pelos níveis inadequados de enriquecimento, seja pela necessidade de
Introdução 20
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
múltiplos estágios. Além disto, observou-se que o desempenho de separação muitas vezes é
limitado pela natureza do PEG, já que o polímero pode sofrer apenas mudanças na massa
molecular e nos grupos álcool por substituição de ligantes (SILVA et al., 1999; BARBOSA et
al., 2010; ALMEIDA et al., 2014). Para superar estes obstáculos, trabalhos recentes têm
combinado a sublação com solvente e a extração em SABs resultando em uma técnica
chamada flotação em sistemas aquosos bifásicos (FSAB). A FSAB se baseia na transferência
de componentes de superfície-ativa de uma fase rica em sal para uma fase rica em solvente
orgânico hidrofílico promovida, principalmente, pela adsorção do soluto nas bolhas (BI et al.,
2009a). Por conta deste mecanismo, o processo alcança elevados índices de enriquecimento e
recuperação, ainda que uma baixa dosagem de solvente seja usada (BI et al., 2010a). Devido a
estes benefícios, vários sistemas FSAB foram empregados com sucesso na recuperação de
enzimas (SHOW et al., 2011; PAKHALE et al., 2013; SHOW et al., 2013; TAN et al., 2014;
LIN et al., 2015; MATHIAZAKAN et al., 2016), antibióticos (BI et al., 2009a; HAN et al.,
2014), componentes bioativos (CHANG et al., 2014), éster ftalatos (CHANG et al., 2015),
clorofilina sódica (XIA et al., 2016), etc.
Alternativamente, é possível acompanhar o aumento do número de pesquisas de
prospecção resíduos agroindustriais como fontes de conponentes bioativos (MARTINS et al.,
2011). Por beneficiar a saúde humana devido às suas propriedades anticarcinogênicas, há um
profundo interesse do mercado no sentido de obtenção de preparados de componentes
fenólicos com características específicas bem como em modos de melhorar suas análises
(KAMMERER et al., 2010). Ao mesmo tempo, a consolidação das metas de redução de
emissões de poluentes depende da inclusão de etapas de remoção de substâncias derivadas de
enxofre. Algumas dessas substâncias, como é o caso do dibenzotiófeno (DBT), são bastante
recalcitrantes durante os tratamentos convencionais de dessulfurização. Portanto, os
tratamentos biológicos surgem como rotas alternativas de conversão de componentes
derivados do DBT para metabólitos menos danosos e de maior valor agregado. Logo, em
ambos os casos vê-se que a valorização de correntes residuárias é um passo fundamental para
minimizar o impacto ambiental devido ao lançamento equivocado de descartes.
Assim, a presente tese aborda a aplicação da FSAB na recuperação e concentração de
biomoléculas. Os experimentos FSAB foram realizados no Laboratório de Engenharia
Bioquímica (LEB), onde foram desenvolvidos diversos trabalhos na área de downstream
processing, tais como captura de biomoléculas via cromatografia de adsorção (ARAÚJO et al.
2016a, 2016b, SOUSA JÚNIOR et al. 2015, 2016; PADILHA et al., 2015, 2016a, 2016b,
Introdução 21
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
2017e) e métodos de extração em sistemas aquosos bifásicos (PADILHA et al., 2017c,
2017d). O documento está dividido em quatro capítulos, apresentados da seguinte forma: o
capítulo 1 consiste da introdução do trabalho. No capítulo 2 é apresentado o estudo da
recuperação e concentração de ácido gálico obtido da infusão de folhas de goiaba através da
FSAB. Nesta seção, em particular, a descrição da técnica de flotação foi mais bem detalhada
em relação aos demais capítulos. O capítulo 3 trata do estudo de recuperação e concentração
de polifenóis do resíduo despolpado de Myrciaria dubia pelo processo de flotação,
juntamente com sua ampliação de escala. Já no capítulo 4, uma abordagem multivariada foi
usada para otimizar as condições operacionais da FSAB na recuperação do 2-hidróxibifenil a
partir de soluções modelo, seguidos de ensaios usando caldo de fermentação de Rhodococcus
rhodochrous. Finalmente, considerações finais e perspectivas futuras da técnica de separação
são retratadas no capítulo final.
CAPÍTULO 2
RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE
ÁCIDO GÁLICO DE FOLHAS DE GOIABA
POR FLOTAÇÃO EM SISTEMA DE DUAS
FASES AQUOSAS
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 23
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
2. Recuperação e concentração de ácido gálico de
folhas de goiaba por flotação em sistema de duas
fases aquosas
Neste capítulo são apresentados os resultados da aplicação da flotação em sistemas de
duas fases aquosas na recuperação e concentração de ácido gálico. Primeiramente, de maneira
a realizar a triagem das condições operacionais favoráveis à captura deste componente
fenólico, uma solução modelo de ácido gálico foi usada nos estudos iniciais. Definidas as
condições ótimas, a infusão de folhas de goiaba foi usada como fonte de ácido gálico e o
desempenho da flotação foi comparado àquele obtido da extração em sistemas bifásicos
aquosos. Esses resultados foram organizados na forma do artigo entitulado “Optimization of
Separation of Bioactive Compounds in Daily Foods by Aqueous Two-´Phase Flotation
Coupled With HPLC-DAD”, o qual foi publicado no periódico International .Journal of
Chromatography and Separation Techniques.
2.1. Revisão bibliográfica
2.1.1. Compostos fenólicos bioativos
É notório que os hábitos alimentares podem ser os mais diversos; logo, o que
poderíamos inferir se as dietas de cidadãos de países como o Brasil e a China, de culturas
totalmente distintas, fossem alvo de comparações? Obviamente, claras diferenças podem ser
observadas nos itens das refeições, contudo, ainda é possível perceber um ponto de
confluência entre elas. Independentemente da localidade, a ingestão de frutas e vegetais bem
como cacau, café, vinhos e chás tornou-se comum no dia a dia (OVASKAINEN et al., 2008).
Estudos epidemiológicos apontam que o consumo desses alimentos está associado à redução
da ocorrência de diferentes tipos de câncer e doenças cardiovasculares (KHAN et al., 2014).
Como resultado, há um grande interesse em avaliar o papel de componentes bioativos
advindos de alimentos na redução do risco de doenças crônicas e degenerativas. Esses
componentes bioativos representam um grupo de constuintes extra-nutricionais que ocorrem
apenas em pequenas quantidades em plantas e produtos alimentícios; muitos desses, gerados a
partir do metabolismo secundário como, por exemplo, antibióticos, micotoxinas, alcalóides e
componentes fenólicos (ETHERTON et al., 2002; MARTINS et al., 2011 ; HUERTA et al.,
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 24
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
2015). Assim como as outras substâncias, os componentes fenólicos ou polifenóis são
produzidos como mecanismo de defesa das plantas contra vários tipos de estresse bióticos e
abióticos (TSAO, 2010). Os compostos fenólicos são caracterizados pela presença de um ou
mais anéis aromáticos substituídos por grupos hidroxilas, que compreendem de simples
moléculas fenólicas a componentes altamente polimerizados (BRAVO, 1998;
BALASUNDRAM et al., 2006). Biogeneticamente, todos os componentes fenólicos são
gerados a partir de um intermediário comum, a fenilalanina, ou um precursor mais próximo,
como o ácido chiquímico. Esta conclusão também se estende para os flavonóides, classe mais
abundante dos componentes fenólicos, que são expressos pela combinação de rotas
metabólicas (PANDEY & RIZVI, 2009). Uma descrição simplificada da expressão dos
componentes fenólicos é mostrada na Figura 2.1.
Figura 2.1. Esquema simplificado das rotas metabólicas das plantas para produção de componentes fenólicos.
Fonte: Adaptação de EWANÉ et al. (2012).
A abundância de componentes fenólicos existentes está fortemente ligada à
diversidade de plantas e funções biológicas desempenhadas por estas substâncias em
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 25
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
organismos (TSAO, 2010). Quanto às fontes naturais, MITIĆ et al. (2011) evidenciaram que
frutas vermelhas podem ter diferentes componentes fenólicos predominantes. Os autores
observaram que a cereja ácida possuia até 83% de cianidina-3-glicosil-rutinosídeo, enquanto
que a groselha negra continha aproximadamente 45% de malvidina-3-glicosídeo. Por sua vez,
FATEMEH et al. (2012) mostraram diferenças nas concentrações de componentes fenólicos
entre as variedades de bananas Cavendish e Dream, o que refletiu em diferentes atividades
antioxidantes observadas. Alguns estudos também indicaram que as condições climáticas,
modos de cultivo e características do solo tem impacto sobre o conteúdo de componentes
fenólicos em plantas. Por exemplo, MORI et al. (2007) mostraram que a concentração de
antocianinas em uvas pode reduzir pela metade caso o dia de colheita seja quente.
BORGUINI et al. (2013) observaram que tomates orgânicos apresentaram maior capacidade
antioxidante em testes do sequestro do radical 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em relação
à tomates cultivadas de modo convencional. No que diz respeito às funções, as lignanas
podem atuar como fitoestrogênio, uma vez que possuem uma estrutura semelhante ao 17β-
estradiol, um importante hormônio sexual feminino (SUNITA & PATTANAYAK, 2011). Por
outro lado, uma planta com alta percentagem de lignina (um polímero altamente ramificado
de grupos fenilpropanóides, assim como as lignanas) possui maior resistência a ataques de
herbívoros e insetos, bem como consegue combater possíveis infecções e ferimentos
(BHUIYAN et al., 2009).
Contudo, um grande destaque dos componentes fenólicos é sua variedade de estruturas
químicas. Na Tabela 2.1 são apresentadas as principais classes de componentes fenólicos que,
muitas vezes, ocorrem na natureza associados a monossacarídeos ou polissacarídeos (SALAS
et al., 2010). Até mesmo a posição das ligações é fator interessante, uma vez que o tipo de
ligação entre os açúcares e os flavonóides (que juntos formam as antocianinas) é determinante
para o sabor e coloração de produtos alimentícios (SALAS et al., 2010; WU et al., 2014).
Ademais, também foram reportadas ligações de componentes fenólicos com ésteres e
proteínas (PANDEY & RIZVI, 2009).
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 26
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Tabela 2.1 Classes de componentes fenólicos em plantas
Classe Fórmula química
Fenólicos simples e benzoquinonas C6
Ácidos hidroxibenzóicos C6-C1
Acetofenonas e ácidos fenilacéticos C6-C2
Ácidos hidroxicinâmicos e fenilpropanóides C6-C3
Naftoquinonas C6-C4
Xantonas C6-C1-C6
Estilbenos e antraquinonas C6-C2-C6
Flavonóides e isoflavonóides C6-C3-C6
Lignanas e neolignanas (C6-C3)2
Biflavonóides (C6-C3-C6)2
Ligninas (C6-C3)n
Taninos condensados (C6-C3-C6)n Fonte: Próprio autor.
2.1.2. Ácido gálico
O ácido gálico (AG), também chamado de ácido 3,4,5 trihidroxibenzóico, é um ácido
orgânico de composição C6H2(OH3)COOH, cuja fórmula química é dada pela Figura 2.2.
Encontrado de forma livre em folhas de chá, uvas e castanhas, sua obtenção também pode ser
via hidrólise ácida de taninos (GRUNDHÖFER et al., 2001). A alteração da estrutura do AG
e suas implicações nas atividades biológicas e farmacológicas também são bastante
investigadas (ASNAASHARI et al., 2014). Os derivados de alquila, ou galatos, são
sintetizados a partir da adição de carbonos na cadeia lateral do precursor, conferindo à
estrutura química uma menor solubilidade em meio aquoso (GOMES, 2015). A lipofilicidade
relativa é geralmente expressa em termos de um coeficiente P, conforme a Figura 2.2.
Por conta de suas propriedades físico-químicas, várias são as aplicações do AG e seus
derivados. Por exemplo, o AG é frequentemente usado em pesquisas como padrão para
quantificação de componentes fenólicos totais através do método de Folin-Ciocalteau, o qual
expressa seus resultados em equivalentes de ácido gálico ou EAG. Outra aplicação desse
ácido fenólico é no desenvolvimento de cores. Em 1910, Ehrmann citou que o AG forma um
complexo de coloração avermelhada quando em contato com 3-hidroxifenilamina, tornando-
se uma opção para a indústria de tinturas (ROSSO, 2005). Ademais, AOUF et al. (2013) e
HOU et al. (2016) mostraram que o AG pode ser multifuncionalizado para sintetizar
bioresinas epóxi de alto desempenho.
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 27
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
O AG e seus derivados também tem sido reportados como potentes agentes
antitumorais. Na literatura constam diversas pesquisas in vitro e in vivo que exploram os
efeitos do AG e seus derivados contra diferentes tipos de câncer em células do pulmão
(OHNO et al., 1999; OHNO et al., 2001), cólon (YOSHIOKA et al., 2000; HAMID et al.,
2011; YUMNAM et al., 2014), hepáticas (LI et al., 2014), próstata (CHEN et al., 2009;
RUSSELL et al., 2012; LIU et al., 2013), entre outros (LO et al., 2011; ZHEN et al., 2012).
SUBRAMANIAN et al. (2015) sugere que a atividade anticâncer da AG está associada a
diferentes mecanismos de apoptose como geração de espécies reativas de oxigênio, regulação
de proteínas promotoras de apoptose e não-apoptose, atuação sobre os oncogenes e inibição
de matrizes de metaloproteinases.
Figura 2.2. Estrutura química do AG e valores de lipofilicidade do AG e seus galatos de alquila.
Abreviação Galatos -R C log P
AG Ácido gálico -H 0,89
G1 Metil -CH3 0,92
G2 Etil -(CH2)-CH3 1,27
G3 Propil -(CH2)2-CH3 1,73
G4 Butil -(CH2)3-CH3 2,13
G5 Pentil -(CH2)4-CH3 2,53
G6 Hexil -(CH2)5-CH3 2,92
G7 Heptil -(CH2)6-CH3 3,32
G8 Octil -(CH2)7-CH3 3,72 Fonte: Próprio autor.
Desde a década de 70, as técnicas de recuperação e isolamento se aperfeiçoaram a
ponto do AG ser obtido a partir de plantas e microrganismos, bem como facilitaram a triagem
dos materiais com maior conteúdo do ácido fenólico (CACACE & MAZZA, 2003; ROSSO,
2005). Dentre elas, os métodos extrativos tem sido amplamente empregados nos protocolos de
purificação do AG, bem como de outros componentes fenólicos (SALAS et al., 2010).
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 28
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
2.1.3. Extração líquido-líquido (ELL)
A extração é geralmente usada como primeira etapa na análise do conteúdo de
polifenóis, a qual realiza a recuperação dos componentes para uma fase fluida a partir de
materiais vegetais. Portanto, o método torna-se essencial para a quantificação adequada e
determinação da atividade antioxidante relativa àquela fonte (BOEING et al., 2014). A
extração é dependente da estrutura química dos componentes fenólicos, método de extração,
tempo de contato, granulometria da amostra sólida e substâncias interferentes (AZEVÊDO,
2010; FAUSTINO et al., 2010; BOEING et al., 2014). Logo, não existe um procedimento
padrão que se aplique adequadamente para a extração de todos os componentes fenólicos.
Além desses efeitos citados, a polaridade dos solventes pode ditar a natureza e a quantidade
de componentes fenólicos que são transferidos para o extrato (SALAS et al., 2010;
KADJŽANOSKA et al., 2011; DENT et al., 2013; DO et al., 2014). SCHERER & GODOY
(2014) observaram que a composição da mistura de solventes é crucial na extração de
componentes fenólicos bem como na atividade antioxidante do extrato de Xanthium
strumarium L. Para a extração de componentes fenólicos do chá verde, a solução aquosa de
etanol foi mais eficiente do que as soluções aquosas de metanol e acetona, como foi reportado
por WANG & HELLIWLL (2001). Tradicionalmente, nos procedimentos de extração de
antocianinas, o solvente é formado pela mistura aquosa de etanol ou metanol e o processo é
realizado em ambiente levemente ácido sob temperatura ambiente (SALAS et al., 2010).
Temperaturas elevadas aumentam a difusão do soluto através da matriz sólida; entretanto,
alguns componentes fenólicos são sensíveis à degradação por aquecimento (SANTANA et al.,
2009).
A extração por solvente pode ser classificada de acordo com o tipo de amostra a ser
manipulada. Quando a matriz que contém o soluto é sólida, a técnica extrativa é chamada de
extração sólido-líquido (ESL) ou lixiviação; enquanto que o método usado para tratar
amostras líquidas é definido como extração líquido-líquido (ELL) (LLANO et al., 2015). A
ELL é uma técnica de separação que consiste na partição de um soluto entre duas fases
líquidas com base na afinidade. A separação é promovida pela adição de um terceiro
componente ao sistema, sendo requisitada quando a destilação não é adequada,
principalmente, por conta da termossensibilidade do soluto. A partição é expressa em termos
do coeficiente de partição (K), definida pela razão entre as concentrações de soluto na fase
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 29
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
orgânica (Co) e aquosa (Ca) no equilíbrio (PADILHA et al., 2017c), como mostrado na Eq.
2.1.
o
a
CK
C (2.1)
Como citado acima, a escolha do extratante pode determinar a seletividade do soluto;
todavia, deve-se atentar também à miscibilidade mútua entre o solvente e o dispersante da
alimentação. Em situações em que há miscibilidade razoável entre essas substâncias, o
processo sofrerá com a perda de extratante e terá possíveis dificuldades de recuperação do
soluto (GITIRANA, 2007).
Alguns procedimentos tradicionais de ELL na recuperação de fenólicos tem sido
reportados na literatura, principalmente, para preparação de amostras de águas. ANDRÉS et
al. (2000) usaram diclorometano como solvente na preconcentração de fenólicos poluentes
(clorofenóis, nitrofenóis, metilfenóis, etc.) em águas para detecção em CLAE. ALMEDA et
al. (2007) mostraram que o éter diexil é mais adequado para extração de clorofenóis a partir
de águas fluviais do que outros solventes polares como octanol, triclorometano e éter 2-
nitrofenil octílico. Por sua vez, DANESHFAR & KHEZELI (2009) propuseram um método
de separação baseado na emulsão de óleo-em-água, o qual é formado pela mistura de
tetracloreto de carbono e acetato de butila, para detecção de fenólicos por cromatografia
gasosa. Apesar desses trabalhos, a ELL apresenta algumas limitações significativas e
desvantagens ligadas ao custo excessivo, toxicidade e inflamabilidade dos solventes orgânicos
(SANTANA et al., 2009; EL-ABASSI et al., 2014). Além disso, muitos desses métodos não
se aplicam a alguns tipos de amostras como, por exemplo, a água residual da extração azeite
de oliva, devido a razões práticas e econômicas (EL-ABASSI et al., 2014). Desta forma,
inspiradas no conceito de química verde, alternativas à ELL tradicional foram desenvolvidas
de modo a eliminar os solventes orgânicos (XAVIER et al., 2015).
2.1.4. Extração em sistemas aquosos bifásicos (ESAB)
A extração em sistemas aquosos bifásicos (ESAB) é uma modalidade da ELL, na qual
a mistura de soluções de componentes hidrofílicos permite a separação de biomoléculas em
um ambiente ameno, sem danos acentuados à estrutura dos produtos (ASENJO &
ANDREWS, 2011; PADILHA et al., 2017d; ZENG et al., 2016). Por conta da variedade de
analitos, o número de trabalhos com ESAB ainda é crescente, embora suas origens sejam
datadas do final do século XIX. Em 1896, Beijerinck observou que, quando misturadas,
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 30
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
soluções aquosas de gelatina e ágar ou gelatina e amido solúvel poderiam formar duas
camadas de líquido (Beijerinck, 1896). Inspirado em tal fenômeno, CRAIG & CRAIG (1956)
aplicaram um sistema bifásico aquoso/orgânico para a purificação de proteínas usando
distribuição contracorrente. Entretanto, o pionerismo é muitas vezes atribuído a Albertsson,
que a partir de 1955 começou a usar sistemas aquosos bifásicos (SAB’s), formados por
soluções aquosas de polietilenoglicol/dextrana e polietilenoglicol/sal, para separação de
macromoléculas e partículas biológicas (ALBERTSSON, 1958). Igualmente, SACKS &
ALDERTON (1961) aplicaram um SAB constituído por polietilenoglicol 400 e fosfato de
potássio na partição de esporos de Bacillus e Clostridium. Além disso, tal método possibilitou
que os autores detectassem dois tipos de esporos no cultivo do Bacillus megaterium. Apesar
dos anos decorridos, os sistemas usados nesses trabalhos, polímero/polímero e polímero/sal,
continuam a ser empregados em protocolos de purificação (PÉREZ et al., 2015;
MOHAMMADI et al., 2015; PADILHA et al., 2017c; PADILHA et al., 2017d), inclusive
voltados para a recuperação de componentes fenólicos. Componentes fenólicos de madeira de
Eucalyptus globulus foram isolados pela ESAB de polietilenoglicol/fosfato e
polietilenoglicol/citrato em XAVIER et al. (2015) e XAVIER et al. (2016), respectivamente.
A partir da técnica foi possível detectar a presença de vários componentes fenólicos por
CLAE-FR-ESI-TOF como, por exemplo, ácido gálico, ácido elágico, monogaloil glicosídeo e
quercitina 3-o-ramnosídeo. REIS et al. (2015) alcançaram valores de K na ordem de 9,5 de
ácido gálico obtido de resíduos de Psidium guajava L em sistemas polietilenoglicol
8000/fosfato de potássio.
O polietilenoglicol (PEG) é um poliéter diol, de composição
HO(CH2CH2O)nCH2CH2OH, que é disponível no mercado em uma ampla variedade de
massas moleculares médias (ALMEIDA et al., 2014). Os PEGs com massa molecular
superior a 1000 Da se apresentam na forma de pós ou flocos, enquanto aqueles de massa
molecular inferior a este patamar são fornecidos na forma líquida (PESSOA JR, 2001). O
PEG é muito presente em trabalhos envolvendo ESAB como um dos componentes
formadores de fases, devido à sua eficiência na exclusão de outros polímeros e sais.
Geralmente, a exclusão estérica observada nas SABs é dependente da massa molecular do
PEG, uma vez que a concentração necessária para separação das fases diminui à medida que a
cadeia carbônica do polímero aumenta (JOHANSSON et al., 2011; WYSOCZANSKA &
MACEDO, 2016). Quando ele é acrescido em soluções salinas, os SABs formados oferecem
vantagens como baixa tensão interfacial, boa biocompatibilidade, baixa toxicidade, rápida
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 31
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
separação e baixo custo (BABU et al., 2008; SHAHRIARI et al., 2010; PEREIRA et al.,
2010; KARKAŞ & ÖNAL, 2012; ALMEIDA et al., 2014; FERREIRA et al., 2014). Contudo,
segundo KULA (1990), a presença dos sistemas PEG/sal em aplicações de escala industrial
foi assegurada somente após o surgimento de separadores comerciais adaptáveis, os quais
possibilitaram o particionamento mais acelerado de proteínas. Ademais, ainda em relação ao
PEG, a presença de grupos hidroxilas terminais confere certa versatilidade ao polímero, uma
vez que tal substância pode ser derivatizada. Uma variedade de grupos pode ser incorporada à
estrutura do PEG através de reações de alquilação tais como ácidos carboxílicos, anidridos e
líquidos iônicos (ROSA et al., 2007; WU et al., 2008a). Esse método mostrou sensível
aumento de afinidade do polímero para proteínas com cauda de histidina, conforme mostrado
em PLUNKETT & ARNOLD (1990), XU et al. (2003) e BARBOSA et al. (2010).
Obviamente, outros sistemas têm sido elaborados de modo a superar alguns
inconvenientes das combinações entre polímero/polímero e polímero/sal como a dificuldade
no reciclo de reagentes, corrosão em equipamentos e baixa seletividade (CARDOSO et al.,
2013; GOJA et al., 2013; AMID et al., 2015). Sistemas alternativos podem ser criados pelos
pares de álcool/sal (REIS et al., 2014; REIS et al., 2015), líquidos iônicos/sal (LI et al., 2016;
WU et al., 2016), líquidos iônicos/polímero (FREIRE et al., 2012; PEREIRA et al., 2013;
SONG et al., 2015), líquidos iônicos/carboidratos (WU et al., 2008b; FREIRE et al., 2011) e
acetonitrila/carboidratos (CARDOSO et al., 2013; AMID et al., 2015), os quais também
foram aplicados para recuperação de componentes fenólicos. A apigenina e a genisteína, dois
principais flavonóides presentes nas raízes de Cajanus cajan, foram extraídos e concentrados
por sistemas formados por etanol/fosfato de potássio em ZHANG et al. (2013). Em
CARDOSO et al. (2013), a partição de vanilina foi investigada em SAB’s criados por
misturas aquosas de acetonitrila e polióis. WU et al. (2014) propuseram SAB’s formados por
etanol/sulfato de amônio e etanol/fosfato de sódio para extração de antocianinas e remoção
simultânea de açúcares a partir do suco integral de uva.
2.1.4.1. Diagrama de fases
A formação do sistema bifásico ocorre após a sedimentação de grandes agregados
formados pelos dois componentes majoritários, como mostrado na Figura 2.3. Nessa
representação genérica, soluções estoques de um polímero e sal foram misturadas em uma
dada proporção para que houvesse a formação de duas fases aquosas e, consequentemente,
particionamento do soluto entre as fases.
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 32
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
A formação do sistema aquoso bifásico e, na maioria das vezes, o desempenho da
extração estão intimamente vinculados à composição do sistema. Logo, informações sobre o
equilíbrio de fases pode ser de grande valia para aplicações em potencial (MURARI et al.,
2015). A construção do diagrama pode ser realizada por alguns procedimentos, mas o método
de titulação turbidométrica é o mais comum deles. Nessa titulação, duas soluções estoques são
misturadas em várias proporções e gradualmente tituladas até o desaparecimento da interface.
Assim, a composição do sistema imediatamente anterior à formação da fase única é
considerada como um dos pontos da curva binodal (ATEFI et al., 2016). Logo, novas
proporções são sucessivamente testadas para que a curva obtenha sua extensão plena,
delimitada pelas condições de precipitação de um dos constituintes em meio aquoso
(RAYNER, 1969).
Figura 2.3. Ilustração esquemática da separação de fases em SABs do tipo polímero/sal.
Fonte: Próprio autor.
Na Figura 2.4 é apresentado um diagrama de fases de SAB, que mostra as regiões
monofásica e bifásica em função da concentração de PEG e sal, expressa em% m/m.
Geralmente, as curvas binodais em estudos com SAB são representados em triângulos
retângulos, onde as concentrações dos constituintes são definido nos eixos x e y, enquanto a
intersecção dos eixos é considerada como água pura (MC CABE et al., 2005). No gráfico da
Figura 2.4, é observado que uma mistura de composição A deixada em equilíbrio resultou em
um SAB, cujas fases topo (rica em PEG) e fundo (rica em sal) são representadas pelos pontos
T1 e F1. O segmento T1-A-F1 é chamado de linha de amarração (tie-line), a qual delimita a
composição final de quaisquer sistemas em equilíbrio dentro desta região. O ponto B,
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 33
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
pertencente à outra linha de amarração, é gerado a partir do ponto A através da adição de
água. Por consequência, a composição final do sistema diferirá do preparado anterior (agora
caracterizadas pelos pontos T2 e F2) bem como o comprimento da linha de amarração será
reduzido. A contínua adição de água deslocou o sistema para o ponto C, também conhecido
como ponto crítico. Nessa condição, a composição e o volume das fases do sistema são
praticamente iguais, assim como o particionamento do soluto (SCHINDLER &
NOTHWANG, 2006; ASENJO & ANDREWS, 2011; RAJA et al., 2011). Assim, as
condições de operação da ESAB devem estar acima do ponto crítico, além de levar em
consideração o comportamento de migração do soluto e a razão volumétrica obtida (KAUL,
2000).
Figura 2.4. Diagrama de fases genérico de um sistema formado pela mistura de PEG e sal.
Fonte: Próprio autor.
2.1.4.2. Particionamento em ESAB
Os conceitos abordados no tópico 2.1.3 acerca da migração do soluto entre as fases,
assim como a expressão de partição do soluto, mostrada na Eq. 2.1, também são válidos aqui,
embora os mecanismos responsáveis pela partição na ESAB sejam mais complexos (KAUL,
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 34
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
2001). As relações entre as biomoléculas e as fases do sistema podem ser de diferentes
naturezas, como exemplo, forças de Van der Waals, pontes de hidrogênio, interação
hidrofóbica e forças eletrostáticas, o que dificulta a sua predição por modelos termodinâmicos
(ZHI et al., 2004; ASENJO & ANDREWS, 2011, PORFIRI et al., 2011; GRILO et al., 2016;
PADILHA et al., 2017c; PADILHA et al., 2017d). Para sistemas envolvendo proteínas,
ALBERTSSON (1986) propôs uma modificação sobre a expressão de coeficiente de partição,
tratando-a como o produto de contribuições ligadas às propriedades do soluto, conforme Eq.
2.2.
0el hfob biosp tam confK K K K K K K (2.2)
Enquanto que o termo K0 é adotado como referência, dependendo da solvatação
relativa do soluto e das condições do ambiente SAB, os demais termos são basicamente
associados à estrutura do produto (ALBERTSSON, 1986; ASENJO & ANDREWS, 2011;
GRILO et al., 2016). As abreviações el, hfob, biosp, tam, conf são referentes às propriedades
eletroquímicas, hidrofobicidade, bioespecificidade, tamanho e conformação da molécula-alvo.
Como tais fatores são praticamente inflexíveis quando um dado produto é selecionado, os
estudos tem como enfoque avaliar os efeitos das variáveis manipuláveis sobre o desempenho
de extração e razão volumétrica. Temperatura, pH, o tipo e a concentração dos constituintes
são alguns das variáveis frequentemente manipuladas em pesquisas com ESAB. A seguir, os
efeitos de cada um dos fatores sobre esse processo de extração são detalhados.
É amplamente difundido que o aquecimento proporciona maiores taxas de difusão e,
em alguns casos, o aumento da solubilidade de substâncias (JOKIĆ et al., 2010;
RADOJKOVIĆ et al., 2012). Contudo, mais especificamente nos SAB’s, é observado que a
temperatura tem um papel particular na construção dos diagramas de fases. Segundo
BARBOSA et al. (2016), a aplicação de temperaturas de equilíbrio elevadas em sistemas
polímero/sal é acompanhada da redução da inclinação das linhas de amarração bem como do
aumento de seu comprimento; resultado do deslocamento da água presente na fase topo para a
fase fundo. Logo, o comportamento de partição com a temperatura deve ser atribuído às
variações da composição do sistema (NAGARAJA & IYYASWAMI, 2015; XAVIER et al.,
2016;). TAN et al. (2011) observaram que a recuperação de antraquinonas de folhas de
Curacao aloe em PEG 6000/sulfato foi intensificada quando o SAB foi deixado em equilíbrio
a 40 oC, alcançando partição e rendimento máximos nos valores de 9,0 e 90,5%,
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 35
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
respectivamente. Em XAVIER et al. (2016), que investigaram o particionamento de fenólicos
totais do tronco de Eucalyptus globulus por sistema PEG/fosfato, o aumento da temperatura
de 25 oC para 65
oC reduziu sensivelmente os valores de K de 52,5 para 21,7. Por outro lado,
em sistemas formados por etanol/sal, o efeito da temperatura é pouco significativo sobre as
curvas binodais e linhas de amarração (LI et al., 2017). De acordo com os últimos trabalhos
da literatura, tal comportamento reflete diretamente sobre a migração do soluto, uma vez que
WU et al. (2014) não observaram variações expressivas na partição de antocianinas de suco
de uva, mesmo quando o sistema etanol/fosfato foi submetido a temperaturas na faixa de 15-
55 oC. Similarmente, a variação de temperatura de 10
oC a 30
oC no sistema etanol/fosfato não
afetou a partição de componentes fenólicos de Ficus carica L, permanecendo no patamar de
4,0, conforme foi apresentado em FENG et al. (2015).
A temperatura também exerce outro papel fundamental em uma das modalidades da
ESAB, denominada extração em sistema aquoso bifásico micelar ou extração por ponto de
nuvem (EPN). Quando soluções aquosas de surfactantes não-iônicos são submetidas a
aquecimento podem gerar espontaneamente duas camadas: a fase coacervato, rica em micelas;
e a fase diluída, pobre em micelas (MUKHERJEE et al., 2011). A primeira temperatura que
provoca a turbidez do sistema, um indicativo de formação de duas fases, é considerada
temperatura de ponto nuvem. Nessa técnica, a temperatura de equilíbrio é obviamente
superior a temperatura de ponto nuvem e seu efeito é convencionalmente investigado. WANG
et al. (2006) propuseram a extração de estrogênio usando Triton X-114 e o rendimento da
EPN mostrou-se diretamente proporcional à temperatura de equilíbrio. EL-ABASSI et al.
(2014) verificaram que a partição dos componentes fenólicos da água residual da produção de
azeite de oliva em EPN é intimamente ligada à temperatura. Neste trabalho, reportou-se que a
temperatura de 90 oC superou as demais temperaturas testadas (70 e 80
oC) em termos do
desempenho, permitindo que a recuperação por EPN se aproxime de 100%.
O valor de pH do sistema é um fator crítico para a partição em ESAB. A carga líquida
do soluto e a razão de moléculas eletricamente carregadas no sistema são afetadas por esse
fator, o que determina a transferência de analitos entre fases de caráteres distintos (MA et al.,
2012; RAJA et al., 2011). Na Figura 2.1 se observa que os componentes fenólicos biativos
dispõem, muitas vezes, de grupos carboxila e hidroxila em sua estrutura, os quais são
facilmente ionizáveis em ambientes alcalinos (REIS et al., 2015). Em tal estado, os
componentes fenólicos tendem a migrar para regiões mais hidrofílicas, o que provoca declínio
nos valores de partição. ŠALIĆ et al. (2011) avaliaram o efeito do pH dentro de uma análise
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 36
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
multivariada envolvendo a recuperação de polifenóis em sistema PEG 6000/sulfato. Como
esperado, os resultados do trabalho indicaram que o pH do sistema teve impacto negativo no
desempenho do processo. No mesmo sentido, ZHANG et al. (2015) observaram que o
acréscimo nos valores de pH, de 4,0 para 6,0, provocou a redução de 40% no valor de K
durante a purificação parcial do ácido oleanólico obtido de cascas de uva através do sistema
etanol/sulfato.
Como mencionado previamente, as concentrações dos constituintes determinam a
obtenção da região bifásica bem como afetam diretamente o comprimento da linha de
amarração. Embora ambas as fases das SAB’s sejam hidrofílicas, o aumento no comprimento
das linhas de amarração leva à redução do conteúdo de água disponível e intensificação das
interações hidrofóbicas, as quais são expressas pelos efeitos de exclusão de volume e salting-
out (SILVA & FRANCO, 2000; PADILHA et al., 2017d). Na recuperação de componentes
bioativos usando o sistema polímero/sal proposta por MARTÍNEZ et al. (2014), observou-se
que o incremento de PEG elevou a partição de iohexol, salicina, ácido clorogênico,
epicatequina e ácido gálico. HUA et al. (2013) observaram que o acréscimo no conteúdo de
sulfato de amônio no sistema aumentou sensivelmente a seletividade da fase topo por
polifenóis do resíduo de Vaccinium uliginosum Linn. Neste estudo, o incremento do sal de
16% para 20% (m/m) no sistema etanol/sulfato aumentou o valor de K em mais de 500%.
Alternativamente, a escolha do constituinte também pode ser decisiva para o sucesso da
técnica. Por exemplo, em LI et al. (2017), sulfato de amônio e sulfato de sódio foram usados
na extração de alicina e ambos alcançaram rendimento semelhante, na ordem de 80%; ao
mesmo tempo que o uso do fosfato de potássio dibásico rendeu pouco mais de 8% desta
resposta. Variações nos resultados por conta da mudança no tipo do sal também estão ligadas
ao efeito do salting-out, o qual pode ser explicado a partir das séries de Hofmeister. Essas
séries estratificam os íons catiônicos e aniônicos de acordo com a sua capacidade de
“ordenação da água”. Efetivamente, os íons caotrópicos reduzem a solubilidade de moléculas
não-polares devido à intensificação das interações hidrofóbicas, enquanto que a adição de íons
cosmotrópicos leva à situação oposta (HOFMEISTER, 1888; ZHANG & CREMER, 2006;
XAVIER et al., 2016). Em SAB’s envolvendo polímeros, é comum a variação da massa
molecular desse componente na busca por melhores desempenhos de extração. Da mesma
forma que em sua concentração, o uso de um polímero com massa molecular elevada provoca
a redução do volume livre devido a um maior comprimento da cadeia, resultando em menores
valores de partição. Por outro lado, sistemas formados por polímeros de massas moleculares
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 37
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menores possuem baixa tensão superficial, o que facilita a migração do soluto entre as fases e,
por consequência, possibilita maiores valores de K (BABU et al., 2008; RAJA et al., 2011;
GOJA et al., 2013; CHETHANA et al., 2015).
2.1.5. Sublação por solvente (SS)
Apesar do detalhamento das bases da ELL e da ESAB nos tópicos anteriores, é
importante ressaltar a existência de outras formas de separação de produtos em meios
aquosos. Em algumas delas é explorada a diferença de natureza da surperfície ativa dos
componentes dispersos bem como sua capacidade de adsorver na interface gás/líquido
(VALSARAJ & THIBODEAUX, 1991; LU & ZHU, 2001). Na Figura 2.5 é apresentada uma
classificação básica de todas as técnicas envolvidas, as quais são agrupadas como métodos de
separação por bolhas, termo primeiramente introduzido por Lemlich (LEMLICH, 1968). A
principal divisão dos grupos é estabelecida quanto à presença de espuma durante a execução
do método; a maior e mais difundida categoria, a separação por espuma, é representada pela
flotação e fracionamento por espuma. Em ambas é observada a formação de uma coluna de
espuma na superfície do líquido devido à passagem do gás, todavia o tipo de material
recuperado após o colapso da espuma é distinto. Enquanto que a alimentação no
fracionamento por espuma é formada por misturas homogêneas, a flotação é responsável por
separar ou concentrar partículas em suspensão (PERNA, 2010). Por sua vez, a segunda
categoria compreende a sublação por solvente e o fracionamento por bolhas. Assim como as
demais, o soluto (ou sublado) é capturado pela interface gás/líquido e ascende até a superfície
do líquido, região onde ocorre o rompimento da bolha e liberação de seu conteúdo. Logo, a
diferença entre as técnicas sem formação de espuma é encontrada pela presença de uma
camada imiscível sobre o topo da coluna do líquido no processo de sublação. Essa
peculiaridade pode ser considerada como uma combinação do próprio fracionamento por
bolhas com a ELL, o que confere características singulares à técnica (SMITH et al., 1996).
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 38
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Figura 2.5 Esquema da classificação dos métodos de separação envolvendo adsorção na interface gás/líquido.
Fonte: Próprio autor.
Desenvolvido por SEBBA (1962), a sublação por solvente (SS) apresenta algumas
vantagens práticas e teóricas sobre a ELL e as demais técnicas de separação por bolhas. Na
ELL, a quantidade de soluto transferida é limitada pela constante de equilíbrio; já na SS, o
interior da fase líquida não atinge, em tese, o estado de equilíbrio, uma vez que a transferência
de massa é fortemente ligada à adsorção nas bolhas, possibilitando rendimentos próximos a
100% (BI et al., 2010a). Outro destaque da SS sobre a ELL está ligado ao tratamento de
grandes volumes de amostra usando pequenas quantidades de solvente orgânico, o que
assegura elevados índices de concentração do produto na camada de topo (BI et al., 2010a;
SHOHAIB et al., 2014). Soma-se aos benefícios da técnica, o fato de que espécies ionizáveis
com baixa superfície ativa para serem separados por fracionamento por espuma podem ser
tratadas na sublação por solvente (GRIEVES et al., 1974).
2.1.5.1. Mecanismos de transferência de massa
Na sublação por solvente, a migração de soluto entre a fase aquosa e fase orgânica
pode ocorrer de diferentes formas. A primeira teoria acerca dos mecanismos de separação foi
descrita por SEBBA (1962), na qual foi considerado que a captura do sublado ocorre
unicamente por adsorção nas bolhas de gás. Em contrapartida, SPARGO & PINFOLD (1970),
SHEIHAM & PINFOLD (1972) e KARGER et al. (1970) observaram que a transferência de
massa envolvida na SS é bem mais complexa. Além da adsorção na interface gás/líquido, o
transporte difusivo e a drenagem de água também foram sugeridos para explicar o
comportamento da remoção de poluentes pela SS. Desde então, a literatura tem sido
enriquecida com dados experimentais e modelos matemáticos de modo a auxiliar na
compreensão do processo de separação. A concepção recente dos mecanismos de
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 39
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
transferência de massa que atuam na SS é ilustrada na Figura 2.6 e abaixo são descritos mais
aspectos de cada um deles.
2.1.5.1.1. Transporte por adsorção em bolhas
O transporte por bolhas de ar é o principal mecanismo de captura do sublado na SS.
As bolhas ascendentes que percorrem a coluna arrastam ambas as substâncias voláteis e não-
voláteis em seus interiores e em suas superfícies. No tratamento de componentes hidrofóbicos
que apresentam baixa volatilidade (por exemplo, hidrocarbonetos poliaromáticos, pesticidas,
corantes, componentes fenólicos bioativos, etc.), a quantidade de soluto retida na superfície
das bolhas é majoritariamente superior àquela dispersa na fase gasosa. Já no caso de
componentes com elevada pressão de vapor, a lei de Henry deve ser considerada para uma
descrição adequada do processo devido aos efeitos da adsorção e do dessorção (SMITH et al.,
1996; BI et al., 2010a). Outras decisões ligadas à composição do sistema, condições
operacionais e projeto do flotador podem influenciar na efetividade desse mecanismo; e o
primeiro fator a ser comentado é o tamanho das bolhas.
As bolhas são geradas a partir da passagem forçada de uma corrente de gás (nitrogênio
ou ar comprimido) por um distribuidor com interstícios diminutos, por volta de 300 μm
(COWARD et al., 2015). Esses distribuidores podem ser confeccionados de cerâmica, aço
inoxidável, vidro sinterizado, borracha e tecido, sendo capazes de gerar tamanhos de bolhas
na faixa de 0,01-0,2 cm (LEMLICH, 1968; AHMAD, 1975; SMITH et al., 1996). Segundo
MUBADDEL (2010), bolhas de menor tamanho oferecem maior área interfacial e maior
tempo de contato com a fase aquosa, o que proporciona teoricamente melhores resultados de
eficiência. Simulações matemáticas desenvolvidas por SMITH et al. (1996), LU & ZHU
(2001), MUBADDEL (2010) ratificaram a importância do tamanho das bolhas na SS. Em
situações práticas, SHOW et al. (2013) mostraram que o desempenho da SS na recuperação
da lipase de Burkholderia cenopacia ST8 é levemente dependente do tamanho das bolhas.
Três distribuidores de vidro sinterizado foram testados nesse trabalho e foi verificado que as
placas G4 e G5 ofereceram os índices de rendimento e fator de purificação da enzima pouco
superiores aos experimentos com a placa G3 (aspersor com maior tamanho de poros).
A vazão de gás é uma importante variável da SS, uma vez que ela afeta a área da
interface gás-líquido por unidade de volume da fase aquosa por minuto (NAIMI-JAMAL et
al., 2009; SHOW et al., 2013). Dessa forma, espera-se que o aumento da vazão de gás seja
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 40
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acompanhado da melhoria na eficiência do processo, mas relatos da literatura indicam que
esse fato não ocorre necessariamente. Independentemente do projeto da coluna de sublação, a
tendência geral é que o aumento da vazão de gás também acarreta aumento no tamanho de
bolhas e elevação da dispersão axial na fase aquosa (VALSARAJ et al., 1991; MUBADDEL,
2010; TIRUNEHE & NORDDAHL, 2016). Além disso, em experimentos com vazão de gás
muito elevada e aspersores inadequados, a integridade da fase orgânica é comprometida
devido ao regime heterogêneo da coluna, o que resulta no declínio da eficiência (BRYSON &
VALSARAJ, 2001; MUBADDEL, 2010; LOBACHEVA & BERLINSKII, 2016).
No que diz respeito à composição; a adição de surfactantes ao sistema, prática comum
no fracionamento por espuma, deve ser feita na SS apenas nos casos em que o sublado
apresenta baixa hidrofobicidade. Nesse caso, o surfactante se agrupa em camadas sobre a
superfície das bolhas e interage com o produto através da formação de complexos, atração
eletrostática ou ambas (SCHNEPF & GADEN, 1959; LEMLICH, 1968). Assim, o produto
que exibe baixa superfície ativa é chamado de coligante, enquanto que o surfactante
adicionado para elevar a eficiência do processo é chamado de coletor (Lemlich, 1968).
Obviamente, tais interações coligante/coletor e seus impactos na SS já foram alvo de
investigações na literatura. VALSARAJ & THIDODEAUX (1991) propuseram a remoção do
corante ftalocianina de cobre (PCP) através da complexação por brometo de
hexadeciltrimetilamônio (HTMAB). Em seus experimentos foi observado que a presença do
surfactante foi fundamental para a remoção do PCP, embora sua dosagem elevada provocasse
um declínio no desempenho da SS devido à extrema competição pelos sítios de adsorção nas
bolhas. Resultados similares foram relatados em LU et al. (2005a). Tal estudo avaliou o efeito
da razão molar entre coletor e coligante na remoção do corante índigo carmim com auxílio do
surfactante CTAB. A razão do surfactante 2:1 possibilitou a eficiência máxima de remoção do
corante, o que expõe a sua importância nesse processo, uma vez que a eficiência do processo
foi próxima a 0% quando o surfactante estava ausente. Por outro lado, o contínuo acréscimo
de CTAB no sistema aumentou a emulsificação do 2-octanol e muitos dos complexos
formados retornaram à fase aquosa, o que reduziu significativamente a eficiência da SS.
2.1.5.1.2. Transporte por drenagem da fase aquosa
Após a captura do sublado na fase aquosa, as bolhas de gás alcançam a interface
líquido/líquido; contudo, não conseguem superar essa resistência imediatamente e tendem a
coalescer para formar bolhas maiores (CABALLERO et al., 1990; SMITH et al., 1996). No
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instante em que a força de empuxo supera a força de sentido inverso provocada pela tensão
interfacial, bolhas entram na fase orgânica e são recobertas por uma fina camada de fase
aquosa, como é mostrado na Figura 2.6. Com o decorrer do processo e o contínuo
rompimento das bolhas, certa quantidade de fase aquosa se acumula na superfície da fase
orgânica até retornar sob a forma de gotas (MA et al., 2007; LU & ZHU, 2002). Assim, a
água é drenada para cima, levando consigo o soluto, na mesma medida em que as gotas
descendentes esgotam a concentração do soluto na fase orgânica. Segundo VALSARAJ &
THIBODEAUX (1991), tal dinâmica eventualmente alcança o estado estacionário e não
ocorre mais ganho líquido de soluto na fase orgânica. Por outro lado, durante a formulação de
um modelo matemático para a SS, BI et al. (2008) assumiram que o sublado não dissolve
imediatamente na fase orgânica após o rompimento das bolhas e que também é transferido por
difusão enquanto cai novamente para a fase aquosa. Assim, os autores incorporaram um termo
ao balanço de massa devido à área média de transferência proporcionada pelas gotas de água,
tendo resultados bastante satisfatórios na descrição da sublação do complexo ditizona-Co (II).
2.1.5.1.3. Difusão na interface líquido/líquido
A interface líquido-líquido é o ponto focal de todo o transporte de massa envolvida no
SS. Como pode ser visto na Figura 2.6, a difusão molecular, o último mecanismo da SS,
ocorre exatamente nessa região e se baseia no gradiente de concentração entre as fases.
Diferentemente da extração líquido-líquido, no qual esse mecanismo é único; na SS, o
transporte de massa por difusão molecular é notoriamente inferior ao transporte convectivo
(SMITH et al., 1996). Em VALSARAJ & THIBODEAUX (1991) foi observado que o efeito
do coeficiente de partição é irrelevante quando a difusão molecular é pouco significativa para
o processo. Contudo, quando a difusão molecular é predominante, tal parâmetro define a
concentração final do sublado no topo, assim como na extração líquido-líquido. De modo
semelhante, LU & ZHU (2002) mostraram que sistemas com elevadas constantes de difusão
molecular obedecem à cinética de primeira ordem e atingem o estado de equilíbrio
rapidamente.
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 42
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Figura 2.6. Mecanismos de transferência de massa no processo de sublação por solvente.
Fonte: Adaptação de Bi et al. (2010a).
2.1.5.2. Aplicações da SS
Por conta de sua origem na flotação de íons, os primeiros trabalhos ligados à SS
envolvem a separação e determinação de metais traços (LU & ZHU, 2001; LOBACHEVA,
2008; BI et al., 2010a). Em KOTSUJI et al. (1977), a SS foi usada para separar Fe (II) pelo
complexo 3-(2-piridil)-5,6-difenil-1,4-triazina e o surfactante lauril sulfato de sódio (LSS),
alcançando valores de eficiência de até 97% na amostra marinha. BERG & DOWNEY (1980)
averiguaram o potencial da SS na remoção dos metais de transição dos períodos 5 e 6. Na
separação foi explorada a interação entre clorocomplexos aniônicos e surfactantes
quaternários de amônio e a sequência de seletividade Au (III) > Pt (IV), Ir (IV), Pd (II) > Ir
(III) > Rh (III) foi observada. CERVERA et al. (1982) propuseram a remoção de Cu (II)
através da formação de ditizonatos e sua coleta pela ação do LSS. Em uma coluna de flotação
de escala semi-piloto, os autores conseguiram obter valores de eficiência próximos a 100%
usando a razão de LSS/Cu (II) e tempo de processo equivalentes a 20:1 e 20 min,
respectivamente. No que diz respeito à aplicação da SS no tratamento de amostras para
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 43
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
espectrometria de absorção atômica (EAA), as contribuições dadas por KIM et al. devem ser
ressaltadas. Através desses trabalhos, a SS se firmou como técnica de tratamento na detecção
de metais por EAA devido ao seu sucesso em um número expressivo de aplicações (KIM et
al., 1998a; KIM et al., 1998b; KIM et al., 1999; KIM et al., 2001a; KIM et al., 2001b; KIM et
al., 2001c; KIM et al., 2002; KIM et al., 2003). Outra colaboração feita por Kim e
colaboradores foi a descoberta de um solvente adequado para esse tipo de análise de metais, a
isobutil metilcetona (MIC). Comparado aos solventes tradicionalmente usados na SS (xileno,
hexano, n-butanol, n-octanol, etc.), a MIC apresentou o valor máximo de remoção e menor
efeito de interferência na análise via EAA. Nos últimos anos poucos trabalhos foram
desenvolvidos (TUREK et al., 2016; LOBACHEVA & BERLINSKII, 2016), não havendo
grandes inovações na linha de remoção de metais.
A remoção e recuperação de poluentes orgânicos (por exemplo, corantes, solventes
orgânicos tóxicos, lubrificantes, etc.) têm sido extensivamente realizadas através da SS
(SOBIANOWSKA et al., 2009). Em 1966, Caragay e Karger estudaram a seletividade da
sublação de dois corantes, alaranjado de metila e rodamina B, por meio da complexação com
o brometo de hexadeciltrimetilamônio (HDT). Mesmo com uma pequena dosagem de
surfactante e baixa vazão de nitrogênio (5 mL/min), o processo conseguiu razão de
concentrações rodamina B/ alaranjado de metila superior a 510, tendo como alimentação uma
solução diluída equimolar (CARAGAY & KARGER, 1966). Técnicas de separação por
adsorção em bolhas, a flotação por íons e a sublação por solvente, foram aplicadas em
HORNG & HUANG (1993) na remoção do corante azul direto 1 disperso em água residuária
sintética. Sob a vazão de gás de 150 mL/min e tempo de flotação de 5 min, a remoção de azul
direto 1 foi superior 98% na presença do surfactante HDT. LU e colaboradores mostraram
êxito da SS na remoção de diferentes corantes como o azul de bromofenol (LU et al., 2001),
violeta de metilo (LU et al., 2003), índigo carmim (LU et al., 2005a) e verde bromocresol
(LU et al., 2007). Um número expressivo de processos industriais produz resíduos contendo
substâncias carcinogênicas como, por exemplo, hidrocarbonetos aromáticos multinucleares.
Em virtude disso, HUANG et al. (1983) mostraram a viabilidade da SS na remoção de
naftaleno e fenantreno de uma água residuária sintética. Com o intuito de aproveitar a água
residuária advinda da gaseificação do carvão em torres de resfriamento, NOLAN III &
MCTERNAN (1988) propuseram a aplicação da SS na remoção simultânea de benzeno e
partículas diminutas. A eliminação desses constituintes foi considerada importante, uma vez
que compostos orgânicos solúveis e sólidos suspensos podem causar incrustações nas paredes
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 44
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
do aparato. A otimização das condições operacionais possibilitou que a configuração final do
processo alcançasse índices de eficiência de remoção iguais a 93% e 90% para o benzeno e os
sólidos suspensos, respectivamente (NOLAN III & MCTERNAN, 1988). O acetato de butila
é comumente usado na extração de penicilina G, embora leve à geração de uma água
residuária imprópria para o descarte imediato devido à elevada concentração do solvente (MA
et al. 2010). LIU et al. aplicaram a SS sobre águas residuárias de plantas de produção de
penicilina G e conseguiram remover 60-70% do acetato de butila da corrente fluida (SUN et
al., 2005a; SUN et al., 2005b; SUN et al., 2006; SHEN et al., 2006; MA et al. 2010). Em
relação a outros contaminantes de águas; LU et al. (2005b) reportaram o sucesso da SS na
remoção de ácidos húmicos da água usando um sistema com o solvente isopentanol e cloreto
de hexadecil piridinio como coletor.
A recuperação de compostos de superfície ativa advindas de extratos naturais pela SS
também já foi alvo de estudos na literatura. Entre os componentes abordados nesses trabalhos,
encontra-se a efedrina e pseudoefedrina (DONG & WANG, 2004), magnolol e honokiol
(DONG & LIU, 2008), baicalina (DONG et al., 2005), icarina (WANG et al., 2007),
andrografólido (TANG et al., 2009) e fitosterona (LI & DONG, 2007). Como todos eles
possuem partes polares em sua estrutura e dispõem de grupos hidrofóbicos do tipo fenil e/ou
alquil, a separação por métodos de adsorção em bolhas é viável, muito embora seu
desempenho não seja tão satisfatório quanto foi no tratamento de metais. Além disso, foi
observado que o uso de solventes tradicionais (por exemplo, n-butanol, 2-octanol, acetato de
etila, etc.) dificulta a operação da SS quando esta é alimentada por extratos naturais baeados
em álcool (BI et al., 2010a). Assim, alterações foram realizadas sobre a SS convencional, de
modo que a técnica pudesse obter maiores níveis de desempenho e que fosse usada com êxito
na biosseparação e bioengenharia (BI et al., 2010a). Recentemente, duas novas vertentes da
SS foram desenvolvidas: a flotação/complexação/extração; e a flotação em sistema aquoso
bifásico.
Os aminoácidos são encontrados amplamente em microorganismos, animais e plantas,
podendo ser aplicados em diferentes segmentos como fármacos, cosméticos e suplementos
(GAO et al., 2015). Geralmente, a cromatografia de troca iônica é empregada no tratamento
de aminoácidos presentes em um líquido de fermentação; todavia, o baixo desempenho, o
consumo de tempo e o investimento requerido são alguns empecilhos desta etapa de produção
(WU et al., 2009). Outro fator que dificulta a recuperação desse produto é sua elevada
polaridade, o que dificulta o uso eficaz da ELL e SS uma vez que ele não solubiliza em
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 45
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
qualquer solvente (BI et al., 2008; WU et al., 2009). Inspirado nos progressos da extração de
aminoácidos reportados em LIU et al. (1999) e LIU et al. (2000), BI et al. (2008) foram os
primeiros a incorporar na SS seletores de componentes polares, em um processo chamado de
flotação/complexação/extração (FCE). O ácido di(2-etilhexil) fosfórico (AD2EHF), ácido
dibezoil-L-tartárico (L-ADBT) e D-tartarato de isobutila (D-TISB) são os seletores mais
usados. Diferentemente dos experimentos realizados com metais, na FCE a substância
responsável pela complexação é dispersa na fase topo. Em BI et al. (2008), a FCE foi aplicada
para recuperar L-fenilalanina de um caldo de fermentação de E. coli. Após a otimização de
algumas condições operacionais, a FCE foi capaz de atingir valores de razão de concentrações
superiores a 25, com um produto de 98% de pureza. WU et al. (2009) destacaram o
desempenho da FCE na separação de L-lisina, usando AD2EHF como seletor, o ácido
dodecilbenzeno sulfônico como surfactante e n-heptano como solvente. A ação dos seletores
também mostrou eficácia na separação de misturas racêmicas, apresentando bons resultados
de rendimentos para ambos os enantiômeros, conforme mostrado em JIAO et al. (2012) e
CHEN et al. (2012).
Nos estudos de extração da penicilina G por ELL, várias tentativas frustradas foram
realizadas para intensificar a recuperação do antibiótico na fase orgânica, rica em acetato de
butila (BI et al., 2009b; BI et al., 2010a). Da mesma forma, a aplicação da SS nesse cenário
não levou a resultados animadores. Apesar de seus benefícios já assinalados sobre a ELL, a
SS obteve valores baixos de eficiência, da ordem de 48%, o que não atendia às demandas da
produção massiva na indústria (BI et al., 2010a). No sentido de superar esse gargalo, BI et al.
(2009a) propuseram alterações nos constituintes das fases; mais especificamente, foi proposto
um sistema que compreende uma fase de fundo rica em sulfato de amônio sobreposta por uma
fase rica em PEG (50-80% m/m). Tal processo que combina sistema aquoso bifásico com
sublação por solvente foi denominado de flotação em sistema aquoso bifásico (FSAB). Com
essa nova técnica, os autores conseguiram 95% de rendimento para a penicilina G obtida de
caldo de fermentação bem como melhores índices de concentração do que a ELL, ESAB e SS.
O grande potencial da FSAB é ligado à substituição de solventes tradicionais (como
tolueno, n-octanol, n-butanol, entre outros) pelo uso de PEGs com baixa massa molecular ou
líquidos iônicos. Além de sua atoxicidade e baixo custo, a elevada polaridade atribuída a esses
compostos assegura a solubilização de sublados com a mesma propriedade. CHANG et al.
(2014) destacaram que durante a FSAB com PEG como solvente orgânico, uma camada de
emulsificação é claramente observada na fase topo da coluna. Para os autores, este fenômeno
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 46
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
permite maior captura de componentes de superfície ativa do que nos experimentos com
álcoois como solvente. Logo, várias aplicações da FSAB têm sido reportadas na literatura nos
últimos anos, as quais abrangem diferentes tipos de bioprodutos. BI et al. (2013) relataram
que a FSAB é um método efetivo para a purificação de baicalina obtida do extrato de
Scutellaria Baicalensis Georgi. Por sua vez, XIA et al. (2015) estudaram a recuperação de
clorofilina sódica e remoção de açúcares realizadas simultaneamente por FSAB. O sistema
proposto foi formado por etanol/fosfato e um extrato saponificado de folhas de bambu foi
usado como alimentação. Por conta dos elevados índices de recuperação da clorofilina
(88,28%) e remoção de açúcares (95,84%), a FSAB pode alavancar a produção industrial de
clorofilina cúprica de sódio. Já em LIN et al. (2015) foi avaliado o potencial da FSAB na
purificação parcial da ciclodextrinaglicosiltransferase produzida por Bacillus cereus. Em
condições ótimas, observou-se que a FSAB obteve valores expressivos de fator de purificação
e rendimento iguais a 21,8 e 97,1%, respectivamente. Ainda na linha de recuperação de
enzimas, MATHIAZAKAN et al. (2016) tiveram sucesso no estabelecimento de uma planta
piloto da FSAB para tratar lipases produzidas por Burkholderia cepacia ST8. Os resultados
obtidos em uma escala superior foram muito parecidas com aqueles da escala de laboratório,
com eficiência de 93% e fator de purificação igual a 13. Entretanto, para o nosso
conhecimento nenhum trabalho usando a FSAB foi realizado para a separação de ácidos
fenólicos. Assim, o presente capítulo apresenta um estudo exploratório da FSAB bem como
sua comparação com o desempenho da ESAB na recuperação e concentração de ácido gálico
do extrato de folhas de goiaba.
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 47
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
2.2. Objetivos
Recuperar e concentrar ácido gálico obtido de folhas de goiaba através da FSAB.
2.2.1. Objetivos específicos
Selecionar o solvente hidrofílico apropriado na recuperação do ácido gálico;
Avaliar os efeitos do pH da fase aquosa, concentração de sulfato de amônio,
percentual de PEG na camada do topo, concentração inicial de sublado, tempo de
flotação, vazão de ar e volume inicial da fase rica em PEG no desempenho da FSAB a
partir de uma solução modelo de ácido gálico;
Comparar o desempenho da FSAB com a ESAB em termos de eficiência de
separação, coeficiente de concentração e razão de distribuição;
Observar a captura de ácido gálico pela ação da flotação através da cromatografia
líquida de alta eficiência.
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 48
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
2.3. Materiais e métodos
2.3.1. Reagentes e aparato experimental
Ácido gálico (97.5-102.5% titration) usado como sublado nos experimentos FSAB foi
adquirida na Sigma-Aldrich. Polietileno glicol (PEG) com diferentes massas moleculares
(400, 1500, 4000, 6000 Da), etanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, sulfato de amônio
foram adquiridos da Synth (Diadema, São Paulo, Brasil). Todos os reagentes possuíam grau
analítico e, portanto, não necessitaram de purificação prévia. Água deionizada foi obtida a
partir de um sistema MiliQ e prontamente usada nos experimentos FSAB.
O aparato usado para realizar os experimentos FSAB (Figura 2.7) foi confeccionado a
partir de uma coluna de vidro de 2.64 cm de diâmetro interno e capacidade de 180 mL. A
coluna foi equipada no fundo com um disco de vidro sinterizado de porosidade G4 e ar
comprimido foi usado para gerar as bolhas ascendentes. A vazão de ar foi medida usando um
rotâmetro (Dwyer RMA-1-SSV, USA) acoplado ao compressor via regulador.
Figura 2.7. Ilustração do aparato usado na FSAB.
Fonte: Próprio autor.
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 49
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
2.3.2. Preparação do extrato de folhas de goiaba
O extrato de folhas de goiaba (Psidium guajava) foi preparado de acordo com
KANDIL et al. (1994) e SEO et al. (2014). Primeiramente, folhas de goiaba foram coletadas
em áreas urbanas da cidade de Natal/Brasil, lavadas com água corrente para remoção de
detritos e secas em temperatura ambiente (25 ± 2 oC). Em seguida, a mistura de 100 g de
folhas de goiaba e 1,5 L de água destilada foi aquecida a ponto de fervura durante 4 h. O
sobrenadante foi obtido por filtração à vácuo e levado para concentrar em evaporador rotativo
(Buchi R215, Alemanha) a 60 oC até a redução de volume em 1,5 vezes. Por fim, o extrato
resultante foi usado nos experimentos comparativos entre FSAB e ESAB.
2.3.3. Operação da coluna e otimização das condições experimentais
De modo a avaliar o transporte em situação monocomponente, os experimentos de
FSAB foram executados usando soluções aquosas modelo de ácido gálico (AG) como
alimentação. Primeiramente, uma dada quantidade de AG foi solubilizada em solução salina
de sulfato de amônio em agitador magnético e o pH da mistura foi ajustado pela adição de
soluções de NaOH e HCl, ambas a 3 M. Por tratar-se de um método que evita a mistura entre
as fases, a base de cálculo para a concentração salina da fase de fundo foi massa:volume (C),
ao invés da convenção massa:massa (W). Assim, a seguinte equação foi usada para converter
as concentrações volumétricas para concentrações mássicas na solução de sulfato de amônio:
W = 0.0771C + 2.6067 (R2 = 0.9990), conforme reportado em BI et al. (2009a). Após isso,
100 mL de mistura salina foram colocadas na coluna de flotação e, em seguida, certo volume
de solvente orgânico foi adicionado gentilmente sobre a solução anterior. A admissão de ar ao
sistema bifásico foi então permitida e, após um determinado tempo de experimento (também
chamado de tempo de flotação), os volumes finais das fases topo e fundo foram registrados e
amostras de ambas as fases foram coletadas para análises posteriores.
Os estudos foram direcionados para investigar a influência das condições operacionais
da FSAB (tipo de solvente hidrofílico, pH da fase fundo, concentração de sulfato de amônio,
concentração do sublado, vazão de ar, tempo de flotação (tf) e volume da fase orgânica) na
recuperação e concentração do ácido gálico. A eficiência de separação (E%), a razão de
distribuição (D) e o coeficiente de concentração (α), descritos nas equações 2.3-2.5, foram
usados para avaliar o desempenho da FSAB:
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 50
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
% 1 100w
wi
CE
C
(2.3)
PEG
w
CD
C (2.4)
PEG
wi
C
C (2.5)
onde Cw é a concentração de ácido gálico na fase rica em sal no tempo t, Cwi é a concentração
inicial de ácido gálico na fase rica em sal e CPEG é a concentração de ácido gálico na fase PEG
no tempo t. As condições experimentais de partida foram selecionadas com base nos trabalhos
de Bi e colaboradores (BI et al. 2009a, 2010b, 2013), cujos valores foram: pH da fase fundo
igual a 4,0, concentração de sulfato de amônio igual a 450 g/L, %solvente orgânico (m/m)
igual a 80,0, concentração de AG igual a 500 μg/mL, vazão de ar igual a 25 mL/min, tempo
de flotação de 30 minutos e razão volumétrica de 0,1. A Tabela 2.2 apresenta a ordem de
execução dos experimentos.
Tabela 2.2 Ordem de execução dos experimentos e as respectivas faixas de operação estudadas.
Ordem de execução Tipo de variável Faixa de operação Unidades
1 Tipo de solvente
orgânico
Etanol, n-propanol,
isopropanol, n-
butanol, PEG 6000,
PEG 4000, PEG
1500 e PEG 400
N/A
2 pH da fase fundo 2,0-8,0 N/A
3 concentração de
sulfato de amônio 350-500 g/L
4 percentual de
solvente orgânico 50-100 %
5 concentração de AG 25-10000 μg/mL
6 Vazão de ar e tempo
de flotação 12,5-50 e 1-120
mL/min e min,
respectivamente
7 Volume da fase PEG 5,0-15,0 mL
Fonte: Próprio autor.
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 51
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Todos experimentos foram realizados em duplicata a temperatura ambiente. As análises
estatísticas foram realizadas usando teste de médias (teste de Tukey) no software Statistica 7.0
a um nível de significância de 5% (p < 0,05).
2.3.4. Experimentos de comparação
Finalizada a etapa de otimização, o sistema FSAB foi comparado com a ESAB. No
experimento da FSAB, 100 mL da solução aquosa (mistura entre AG ou infusão de folhas,
água e sulfato de amônio) foram extraídos por 10,0 mL da solução PEG 400 usando vazão de
ar de 37,5 mL/min durante 120 min. No experimento da ESAB, 8,0 mL de solução aquosa foi
agitada com 2,0 mL de solução de PEG 400 em um tubo de centrífuga de 15,0 mL e a
separação de fases foi acelerada por centrifugação a 2100 x g por 10 minutos. Não foi
possível realizar a ESAB sob a razão volumétrica de 0,1, uma vez que não ocorreu a formação
de duas fases. Em ambos os experimentos, a concentração de sulfato de amônio na fase
aquosa foi 450 g/L, o pH da fase aquosa foi 4,0, o percentual mássico de PEG na fase
orgânica foi 80% (m/m) e a concentração inicial de ácido gálico na fase aquosa foi 500 μg/mL
.
2.3.5. Determinação do ácido gálico e análise por cromatografia líquida de alta
eficiência
A quantificação de ácido gálico em experimentos FSAB e ESAB com solução modelo
foi realizada por espectroscopia UV, no comprimento de onda de 262 nm a partir de uma
curva de calibração com o mesmo analito. Outras curvas de calibração também foram
realizadas considerando os efeitos da concentração de sal, concentração de solvente orgânico
e pH.
A concentração de ácido gálico em meios complexos foi determinada em um sistema
de cromatografia líquida de alta-eficiência (CLAE) modelo Accela (Thermo Scientific, USA),
provido de detector por arranjo de diodo (operado em 278 nm) e amostrador automático. O
método analítico foi adaptado de KIM et al. (2013) usando a coluna Hypersil GOLD RP- C18
com dimensões de 50 x 2,1 mm (Thermo Scientific, USA) e uma solução contendo 5,0% de
metanol e 0,1% de ácido acético como fase móvel, sob fluxo de 0,9 mL/min. Todas as
amostras foram filtradas com membrana 0,22 µm e analisadas em três replicatas. A curva de
calibração para o AG foi realizada na faixa de 0,005-0,5 mg/mL. A equação da regressão
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 52
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
[AG] (mg/mL) = 4,7192 x 10-8
x Área do pico (mAu) x (R2
= 0,9938) foi usada para avaliar
quantitativamente esse componente fenólico nos experimentos envolvendo o extrato de folhas
de goiaba.
2.4. Resultados e Discussões
2.4.1. Efeito do tipo de solvente orgânico
Na ESAB, a escolha do solvente orgânico é fundamental na formação de um sistema
bifásico e afeta o comportamento de partição da molécula-alvo (HAN et al., 2014). Desta
forma, uma investigação preliminar foi realizada para avaliar o efeito do tipo de solvente
orgânico na recuperação e concentração do ácido gálico por FSAB usando como fase orgânica
soluções aquosas de PEG (PEG 6000, PEG 4000, PEG 1500 e PEG 400) e de álcoois (etanol,
n-propanol, isopropanol e n-butanol). Os experimentos com PEG 6000, PEG 4000 e PEG
1500 não puderam ser convenientemente monitorados devido à elevada viscosidade da fase
orgânica e ao acúmulo de espuma no topo da coluna, enquanto que nos experimentos usando
PEG 400 nenhum problema foi registrado. Em alguns estudos, polímeros com elevada massa
molecular foram usados como solvente e, aparentemente, nenhum problema com a espuma foi
observado. Esse é o caso de LI & DONG (2011), que usaram PEG 1000, PEG 2000 e PEG
4000 na recuperação da lincomicina; SHOW et al. (2011), na recuperação de lipase de
Burkholderia cepacia por intermédio de polímeros Etileno óxido-Propileno óxido (EOPO)
com massas moleculares de até 12000; LIN et al. (2015) usaram como solvente PEG 4000,
PEG 6000, PEG 8000, PEG 10000 e PEG 20000 na recuperação de ciclodextrina
glicosiltransferase; entre outros. Provavelmente, isso só foi possível devido à prática de
misturar a solução salina e o solvente hidrofílico conforme as metodologias apresentadas, que
são conflitantes às bases desta técnica de separação.
De acordo com a Tabela 2.3, os valores de eficiência de separação, assim como do
coeficiente de concentração e razão de distribuição para o ácido gálico foram superiores com
PEG do que com álcoois de baixo peso molecular. A grande disponibilidade de grupos éter
concede ao PEG forte polaridade, permitindo a dissolução mais fácil de sublados com
estruturas polares na fase orgânica e, consequentemente, maior desempenho da FSAB (BI et
al., 2009a; BI et al., 2010b; CHANG et al., 2014). Além disso, notou-se que o aumento da
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 53
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
cadeia carbônica nos álcoois desfavoreceu a migração do ácido gálico para a camada de topo,
o que refletiu no decréscimo dos valores de E%, a e D. Dessa forma, o solvente orgânico que
apresentou melhor desempenho foi o PEG 400.
Tabela 2.3 Desempenho da FSAB com diferentes solventes orgânicos. As condições experimentais usadas
foram: pH = 4,0, [sulfato de amônio] = 450 g/L,% solvente orgânico (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de
ar = 25 mL/min , tf = 30 min, razão volumétrica = 0,1.
Tipo de solvente hidrofílico Eficiência de
separação (E%)
Coeficiente de
concentração (α) Razão de distribuição (D)
PEG 400 49,68 ± 1,57a 2,70 ± 0,09
a 5,18 ± 0,34
a
etanol 17,41 ± 1,77b 1,78 ± 0,17
bc 2,15 ± 0,15
c
isopropanol 19,61 ± 1,00b 1,88 ± 0,00
b 2,30 ± 0,01
b
n-propanol 18,90 ± 0,15b 1,55 ± 0,05
c 1,91 ± 0,06
d
n-butanol 13,55 ± 1,86c 1,35 ± 0,04
d 1,53 ± 0,05
e
As letras minúsculas a, b, c, d e e foram usadas para comparação de desempenho entre os solventes orgânicos;
valores com a mesma letra em uma coluna indica que não há diferença significativa entre eles a 5% de
significância (p < 0,05). Fonte: Próprio autor.
2.4.2. Efeito do pH na fase aquosa
O uso de níveis adequados de pH na FSAB conduz à redução da estabilidade do
sublado na fase aquosa bem como o aumento de sua solubilidade na fase orgânica (LU &
ZHU, 2001; BI et al., 2010a; BI et al., 2013; CHANG et al., 2014; CHANG et al., 2015).
Neste estudo, o efeito do pH da solução aquosa na FSAB foi avaliado na faixa 2 a 8 pela
adição de soluções de ácido clorídrico e hidróxido de sódio. Em concordância com BI et al.
(2013), foi observado que o sistema PEG/sulfato de amônio apresenta fase única quando o pH
da solução aquosa é menor do que 2,0. Por outro lado, em níveis de pH superiores a 7,0
ocorre a liberação de um forte odor de amônia, indicativo da decomposição do cátion NH4+
em NH3.H2O. Conforme a Figura 2.8, a eficiência de separação, coeficiente de concentração e
razão de distribuição mantêm-se constantes na faixa de pH 2-4 e decaem com o aumento do
pH.
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 54
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
A estrutura do ácido gálico, mostrado na Figura 2.2, dispõe de quatro grupos
hidroxilas potencialmente ionizáveis com diferentes valores de pKa (4,0, 8,7, 11,4 e >13,0)
(REIS et al., 2015). Possivelmente, nos experimentos com pH ≤ 4,0 a maior parte das
moléculas de ácido gálico se encontra no estado não-acidificado e, portanto, mais susceptíveis
à adsorção por bolhas. Por outro lado, o aumento do pH levou ao ganho de cargas de elétricas
no ácido gálico, tornando-o mais afim à fase rica em sal. Como o preparo da solução rica em
sal apresenta pH próximo a 4,0 sem qualquer adição de ácido ou base, este valor de pH foi
usado nas etapas seguintes.
Figura 2.8 Efeito do pH no desempenho da FSAB. Os experimentos foram realizados nas seguintes condições:
[sulfato de amônio] = 450 g/L, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de ar = 25 mL/min, tf = 30 min,
razão volumétrica = 0,1.
Fonte: Próprio autor.
Embora sistemas FSAB convencionais corroborem os resultados obtidos neste
capítulo quanto ao efeito do pH (Ver tópico 2.1.4.1), a tendência oposta também foi reportada
na literatura. LI & DONG (2010) mostraram que a razão de distribuição da lincomicina é
afetada positivamente pelo aumento do pH da fase rica em sal durante a FSAB. Os autores
argumentaram que as moléculas do antibiótico podem interagir entre si quando o pH se
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 55
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
encontra superior a 10, permitindo o seu transporte para a fase topo. Por sua vez, CHANG et
al. (2014) observaram que o aumento de pH na faixa de 2,0-7,0 melhorou o desempenho da
FSAB na recuperação de liquiritina e ácido glicirrízico de Glycyrrhiza uralensis. Neste
trabalho, a justificativa dada para tais resultados foi a manifestação mais intensa da camada de
emulsão em pHs mais álcalis, o que afetou a recuperação total dos componentes.
2.4.3. Efeito da concentração de sulfato de amônio
Para assegurar altos níveis de concentração do sublado na fase orgânica durante
processo FSAB, é recomendado que o volume da fase aquosa deva ser muito superior ao
volume da fase orgânica (PAKHALE et al., 2013). Assim, a concentração do sal na fase
aquosa torna-se chave para a existência de duas fases imiscíveis no sistema PEG/sulfato de
amônio (BI et al., 2009a, BI et al., 2010b; BI et al., 2013; CHANG et al., 2014). Com base
nessa informação, investigou-se a influência da concentração de sulfato de amônio na FSAB
na faixa de 350 g/L a 500 g/L e os resultados dos experimentos são mostrados na Figura 2.9.
Figura 2.9 Efeito do sulfato de amônio no desempenho da FSAB. Os experimentos foram realizados nas
seguintes condições: pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de ar = 25 mL/min, tf = 30 min,
razão volumétrica = 0,1.
Fonte: Próprio autor.
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 56
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Como esperado, os valores de eficiência de separação, coeficiente de separação e
razão de distribuição foram mais altos nos experimentos com concentrações elevadas de
sulfato de amônio. Em contrapartida ao efeito do pH, o acréscimo de sal na fase aquosa leva à
redução da solubilidade do ácido gálico e ao aumento da adsorção do sublado nas bolhas. Nos
experimentos com concentração de sulfato de amônio igual a 325 g/L foi registrada uma
mistura vigorosa na interface fase aquosa-fase orgânica, o que levou a perda de volume da
fase orgânica e, consequentemente, altos níveis de coeficiente de concentração (4,70) e razão
de distribuição (7,96) foram obtidos. Esse comportamento também foi observado nos
trabalhos de BI et al. (2009a), BI et al. (2010a) e LI & DONG (2010). Quando a concentração
de sulfato de amônio foi superior a 500 g/L, observou-se o aumento marginal do desempenho
da FSAB devido à precipitação do ácido gálico. Perante tais resultados e buscando minimizar
os gastos com sal, a concentração de sulfato de amônio igual a 450 g/L foi mantida para os
experimentos seguintes.
2.4.4. Efeito do percentual de PEG na camada de topo
Assim como a concentração salina, o percentual do solvente hidrofílico na camada do
topo exerce um papel importante para o estabelecimento de um sistema bifásico (SHOW et al.
2013). Além disso, como o PEG 400 é um líquido com elevada viscosidade, o aumento de seu
percentual na camada de topo também afeta a dinâmica das bolhas ascendentes, que pode
refletir sobre o desempenho do processo. Isso ocorre quando há uma alta tensão interfacial
entre as fases aquosa e orgânica, impedindo a livre passagem das bolhas e favorecendo a
coalescência delas para superar tal resistência física (BI et al., 2007). Contudo, no que se
observa nos valores de E%, α e D expressos na Figura 2.10, esse fenômeno não foi decisivo
na faixa estudada de 50-100% PEG (m/m). À exceção dos experimentos a 50% (m/m), o
aumento de PEG possibilitou maiores índices de desempenho, alcançando seu máximo em
100% (m/m). Entretanto, nos experimentos usando a maior concentração bem como a 90%
(m/m) do polímero, foi observada a formação de grânulos de sal à medida que o processo
transcorria. Sendo uma característica indesejável de operação, ainda que o processo obtenha
bom desempenho, tais percentuais de PEG foram descartados e o nível imediatamente inferior
(80% m/m) foi selecionado. Nesta condição, o experimento realizado alcançou valores de E%,
α e D iguais a 49,68, 2,78 e 5,18, respectivamente.
O percentual de solvente no processo de flotação já foi alvo de investigação em outros
trabalhos. SHOW et al. (2013) observaram que a adição de 2-propanol na FSAB aumentou o
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 57
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
rendimento na recuperação de lipases de Burkholderia cepacia ST8, independentemente da
razão volumétrica usada. SHOW et al. (2011) também observaram uma correlação positiva
entre a adição de EOPO e o rendimento da flotação durante a recuperação e purificação da
mesma enzima. De maneira contrária, PAKHALE et al. (2013) registraram que o acréscimo
de PEG na camada de topo de 12% (m/m) para 18% (m/m) reduziu a eficiência da FSAB na
captura da bromelina de 86% para 81%. Os autores atribuíram essa tendência ao fenômeno de
exclusão de tamanho, no qual o espaço disponível para dissolução da enzima na camada de
topo fora gradativamente ocupada pela presença do polímero.
Figura 2.10 Efeito do percentual de PEG no desempenho da FSAB. Os experimentos foram realizados nas
seguintes condições: pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de ar = 25 mL/min, tf = 30 min,
razão volumétrica = 0,1.
Fonte: Próprio autor.
2.4.5. Efeito da concentração inicial do sublado
Usualmente, as técnicas de separação por adsorção em bolhas mostram excelentes
resultados na recuperação de componentes de superfície-ativa em soluções diluídas
(LEMLICH, 1968). Com o objetivo de estudar a influência da concentração inicial de sublado
no desempenho da FSAB, a concentração de ácido gálico foi variada na faixa de 25 μg/mL a
10 mg/mL (limite de solubilidade) e os resultados experimentais são mostrados na Figura
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 58
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
2.11. Em baixas concentrações iniciais de sublado na fase aquosa foram observados menores
taxas de recuperação e o desempenho máximo da FSAB (em termos de E% e D) foi obtido no
experimento com concentração de sublado igual a 500 μg/mL. Quando a concentração inicial
de ácido gálico foi superior a 500 μg/mL, foi observado o declínio dos valores de E%, α e D,
que pode ser atribuído à saturação do sublado na interface gás-líquido.
Figura 2.11. Efeito da concentração do sublado no desempenho da FSAB. Os experimentos foram realizados
nas seguintes condições: [sulfato de amônio] = 450 g/L, pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, vazão de ar = 25
mL/min , tf = 30 min, razão volumétrica = 0,1.
Fonte: Próprio autor.
2.4.6. Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação
Neste ponto, ambos os efeitos da vazão de ar e do tempo de flotação sobre a eficiência
de separação da FSAB foram investigados e seus resultados são mostrados na Figura 2.12.
Neste estudo, a faixa da vazão de ar foi de 12,5 mL/min a 50 mL/min e os valores de
eficiência de separação foram estimados a partir de 1 min até 120 min. Obviamente, a
eficiência de separação do ácido gálico foi superior em maiores níveis de vazão de ar e tempo
de flotação. Além disso, nota-se que existe um padrão em todas as curvas cinéticas, dividido
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 59
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
em dois momentos: um aumento abrupto nos primeiros 5-10 min e um aumento gradativo até
os 120 min, devido à baixa interação entre o analito restante e a interface gás-líquido. Ainda
que permitam o equilíbrio mais rápido do sistema, elevadas vazões de gás (≥ 50 mL/min)
devem ser evitadas porque provocam a mistura turbulenta na interface fase aquosa-fase
orgânica e o acúmulo de bolhas no topo da coluna, como reportado em DONG et al. (2008),
BI et al. (2010b), CHANG et al. (2014). Portanto, a vazão de ar de 37,5 mL/min e o tempo de
flotação de 120 min foram selecionados para a etapa seguinte.
Figura 2.12. Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação na eficiência de separação usando a FSAB. Os
experimentos foram realizados nas seguintes condições: [sufato de amônio] = 450 g/L, pH = 4,0, %PEG (m/m) =
80,0, [AG] = 500 μg/mL, razão volumétrica = 0,1.
Fonte: Próprio autor.
2.4.7. Efeito do volume da fase orgânica
Segundo SEBBA (1962), em um sistema de remoção de íons por complexação com
surfactante, o desempenho da sublação por solvente mostrou-se independente da razão
volumétrica usada. Em concordância, CABALLERO (1990) concluiu que o efeito do volume
da fase orgânica sobre o desempenho da sublação é insignificante até a saturação da fase pelo
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 60
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
sublado. Apesar disto, trabalhos recentes (BI et al., 2009a; MA et al., 2010; LIN et al., 2015)
têm apontado que o aumento da altura da camada topo possibilita a maior solvatação do
sublado e, consequentemente, maior eficiência de separação. Portanto, para esclarecer o efeito
desta variável, experimentos foram realizados pela variação do volume da fase orgânica de
5,0 mL a 15,0 mL. De acordo com a Figura 2.13, baixos volumes da fase PEG levaram a
menores valores de E% e altos valores de α e D, enquanto que o uso de maiores volumes de
fase PEG resultou em altos índices de E% e baixos valores de α e D. De modo a garantir
simultaneamente boa separação e concentração do ácido gálico, o volume inicial de solução
PEG de 10,0 mL foi selecionado para as etapas seguintes.
Figura 2.13. Efeito do volume inicial da fase rica em PEG no desempenho da FSAB. Os experimentos foram
realizados nas seguintes condições: [sulfato de amônio] = 450 g/L, pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500
μg/mL, vazão de ar = 37,5 mL/min , tf = 120 min.
Fonte: Próprio autor.
Baseado nos resultados acima, as condições ótimas da FSAB foram resumidas em:
PEG 400 como solvente orgânico, pH da fase aquosa de 4,0, concentração de sulfato de
amônio na fase aquosa de 450 g/L, concentração de ácido gálico de 500 μg/mL, vazão de ar
de 37,5 mL/min, tempo de flotação de 120 min e volume inicial de fase orgânica de 10 mL.
Sob condições ótimas, o ácido gálico pode ser efetivamente separado e concentrado da fase
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 61
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
aquosa para a fase orgânica como pode ser observado nos cromatogramas de CLAE (Figura
2.14). A redução na intensidade dos picos constatada pela comparação das Figuras 2.14A e
2.14B indica a migração de ácido gálico da fase rica em sal para a fase rica em PEG.
Figura 2.14. Cromatogramas de CLAE para a fase rica em sal antes da FSAB (A), fase rica em sal depois da
FSAB (B) e fase rica em PEG depois da FSAB (C).
Fonte: Próprio autor.
2.4.8. Comparação entre FSAB e ESAB
Nesta seção comparamos a FSAB com a tradicional ESAB em relação à separação e
concentração de AG a partir da solução modelo. Para assegurar a formação de duas fases, a
razão volumétrica do sistema ESAB foi fixada em 1:3 (volume da fase orgânica/volume da
fase rica em sal), enquanto que foi usada a razão volumétrica na FSAB de 1:10. Quando a
solução modelo de ácido gálico foi usada, como pode ser observado na Tabela 2.4, os valores
para eficiência de separação e razão de distribuição foram inferiores a FSAB (E% = 81,62 ±
1,07; D = 26,94 ± 1,34) frente ao desempenho mostrado na ESAB (E% = 96,21 ; D = 54,81).
Entretanto, o coeficiente de concentração na FSAB (α = 2,53) foi 1,8 vezes superior àquele
mostrado na ESAB (α = 2,53). Por outro lado, a FSAB (D = 27,92; α = 5,72) mostrou maior
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 62
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
desempenho para ambos os coeficiente de concentração e razão de distribuição que a ESAB
(D = 22,08; α = 2,63) quando o extrato de folhas de goiaba foi usado, de concentração de
ácido gálico igual a 37,36 μg/mL. Além disso, a eficiência de separação foi levemente inferior
na FSAB (E% = 80,28) do que na ESAB (E% = 88,73).
Tabela 2.4 - Comparação de desempenhos entre a ESAB (1:4) e FSAB (1:10) para a solução modelo e o extrato
de folhas de goiaba
Respostas Solução modelo
Extrato de folhas de
goiaba
ESAB (1:4) FSAB (1:10) ESAB (1:4) FSAB (1:10)
Eficiência de separação (E%) 96,21 ± 0,39a
81,62 ± 1,07b
88,73 ± 1,20a
80,28 ± 0,05b
Coeficiente de concentração (α) 2,53 ± 0,01b
4,76 ± 0,15a
2,63 ± 0,24b
5,72 ± 0,39a
Razão de distribuição (D) 54,81 ± 5,41a
26,94 ± 1,34b
22,08 ± 3,45b
27,92 ± 1,83a
As letras minúsculas a e b são usados para comparação dos desempenhos entre ESAB e FSAB; valores com a
mesma letra em uma linha indica que não há diferença significativa entre eles a 5% de significância (p < 0,05).
Portanto, os resultados mostraram que a FSAB pode ser usada de modo eficaz na
recuperação e concentração de componentes fenólicos de extratos reais, não se restringindo à
captura do ácido gálico, como pode ser observado na Figura 2.15. Além do ácido gálico,
componentes fenólicos como taninos e flavonóides também são abundantes no extrato de
folhas de goiaba (SEO et al., 2014). Assim, a diminuição dos picos nos cromatogramas de
CLAE indica que provavelmente a maior parte dos componentes fenólicos migrou para a
camada de topo. Comparado a outras técnicas de separação, a FSAB mostrou algumas
vantagens como a simples operação, baixo custo e necessidade de pequenas quantidades de
solvente.
Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 63
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Figura 2.15 – Cromatogramas CLAE para o extrato de folhas de goiaba anterior ao processo de flotação (A), fase
rica em sal após a FSAB (B) e fase rica em PEG após a FSAB (C).
Fonte: Próprio autor.
2.5. Conclusões
Neste trabalho, o sistema PEG/sulfato de amônio proposto obteve sucesso na
recuperação e concentração de ácido gálico através da FSAB. Usando a solução modelo de
ácido gálico como alimentação, o melhor desempenho da FSAB foi alcançado sob as
seguintes condições: PEG 400 como solvente orgânico, pH da fase inferior de 4,0,
concentração de sulfato de amônio de 450 g/L, concentração de sublado de 500 μg/mL, vazão
de ar de 37,5 mL/min, tempo de flotação de 120 min e volume de fase orgânica de 10 mL.
Sob condições ótimas e extrato de folhas de goiaba como alimentação, a FSAB alcançou
eficiência de separação igual a 80,28% e coeficiente de concentração de 5,72. Além disso, os
experimentos comparativos apontaram que não houve impacto da complexidade do extrato
sobre o desempenho da FSAB e que a técnica de flotação atingiu valores de coeficiente de
concentração ao menos duas vezes superior àqueles obtidos pela ESAB. Finalmente, a FSAB
mostrou ser uma técnica em potencial para separação e concentração do ácido gálico, o que
sugere sua aplicação para moléculas de superfície-ativa de extratos naturais.
CAPÍTULO 3
RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE
POLIFENÓIS DO RESÍDUO DE CAMU-
CAMU (Myrciaria dubia H.B.K. McVaugh)
POR FLOTAÇÃO EM SISTEMA AQUOSO
BIFÁSICO
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 65
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
3. Recuperação e concentração de polifenóis de
camu-camu (Myrciaria dubia H.B.K. McVaugh) por
flotação em sistema aquoso bifásico
Neste capítulo, polifenóis obtidos do resíduo despolpado de camu-camu foram
recuperados via FSAB usando o par de agentes de separação de fases PEG/sulfato de amônio.
Inicialmente, investigações foram realizadas de modo univariado na FSAB para maximizar a
captura de polifenóis na fase rica em polímero. Em seguida, os desempenhos das técnicas
foram comparados em termos do percentual de recuperação bem como dos índices de
enriquecimento. Enfim, os componentes fenólicos presentes em cada uma das fases foram
identificados por CLAE-DAD e a FSAB foi realizada em escala semi-piloto. Esses resultados
foram organizados na forma do artigo entitulado “Enhancing the recovery and concentration
of polyphenols from camu-camu (Myrciaria dubia H.B.K. McVaugh) by aqueous two-phase
flotation and scale-up process”, o qual foi publicado no periódico Separation and Science
Technology.
3.1. Revisão bibliográfica
3.1.1. Valorização de resíduos agroindustriais
Atualmente, por conta da brutal atividade humana sobre a natureza, faz-se urgente o
estabelecimento de tecnologias sustentáveis; ao mesmo tempo, em que o crescimento
populacional impulsiona a atividade da agroindústria para processamento de alimentos. Por
exemplo, em países como o Brasil, cujo agronegócio tem forte impacto sobre a economia
nacional, a gestão de resíduos vem se tornando cada vez mais importante nas empresas
(SHARMA et al., 2016). Não apenas para se enquadrar no rigor das leis ambientais, a
preocupação com o ambiente melhora a imagem da empresa com os consumidores, além de
possibilitar o aumento na margem de lucro pela valorização de subprodutos (CARVALHO et
al., 2011). No que diz respeito à indústria de processamento de alimentos, os resíduos gerados
são na forma de cascas, sementes, folhas, palhas, refugo, bagaço, etc. A compreensão da
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 66
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
estrutura química e das funções biológicas dos constituintes destes resíduos é fundamental
para o seu direcionamento eficiente e seguro (SOUSA et al., 2011).
3.1.2. Camu-camu
O camu-camu (Myrciaria dubia H. B. K. Vaugh), também conhecido como caçari ou
araçá-d’água, é um fruto de origem amazônica pertencente à família Myrtaceae. Tal fruto é do
tipo globuloso, com diâmetro médio de 20 mm, cuja coloração varia de verde a vermelho ou
roxo escuro, no último estágio de maturação (conforme a Figura 3.1). A polpa do camu-camu
é macia e suculenta; contudo, por sua elevada acidez e adstringência, dificilmente é feito o
consumo do fruto na forma natural. Isso se deve ao seu alto teor de ácido ascórbico, por volta
de 2606 mg/100 g de fruto; o qual é significativamente superior aos níveis encontrados em
frutas consideradas ricas nesta vitamina como acerola, laranja e limão (ZANATTA et al.,
2005). Além disso, na polpa da fruta são detectadas concentrações significativas de alguns
ácidos fenólicos (ácido gálico, ácido siríngico, ácido elágico), flavonóides (catequina,
quercetina, kaempferol, naringenina e eriodctiol), antocianinas (cianidina-3-glicosídeo e
delfinidina-3-glicosídeo) e taninos (elagitaninos) (AKTER et al., 2011; FRACASSETTI et
al., 2013). Por conta disto, estudos foram realizados para explorar os possíveis benefícios
atribuídos ao consumo do fruto. A pesquisa desenvolvida por INOUE et al. (2008) sugerem
que o suco de camu-camu oferece propriedades antioxidativos e antiinflamatórios superiores à
vitamina C comercial, ainda que estejam na mesma dosagem da vitamina. AKACHI et al.
(2010) destacaram o potencial hepatoprotetor do suco de camu-camu em ratos, quando estes
foram submetidos a lesões induzidas por D-galactosamina. NASCIMENTO et al. (2013)
reportaram a atividade antiobesidade da polpa de camu-camu quando inserida na alimentação
de ratos. Esses resultados estimularam o interesse da indústria alimentícia e farmacêutica pelo
fruto, o que levou ao aumento de sua exploração. Os principais países para exportação do
camu-camu são Japão e Estados Unidos, os quais consideram o fruto como alimento
funcional, mas também o consomem na forma processada como sucos, sorvetes, picolés,
geléias, licores e sobremesas (MAEDA & ANDRADE, 2003).
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 67
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Figura 3.1 Frutos de camu-camu.
Fonte: Imagens da internet.
3.1.2.1. Resíduo despolpado de camu-camu
Ainda que o camu-camu seja sazonal, a demanda pelo fruto exigiu a implementação de
tecnologias de produção. Seleções de plantas e técnicas de clonagem proporcionaram
colheitas com alta produtividade (10 a 23 kg/planta/safra) e elevado teor de ácido ascórbico
nos frutos. Os dados sobre a exploração do camu-camu ainda são escassos, embora se indica
que ela seja majoritariamente realizada no Peru, com aproximadamente 800 toneladas de
polpa produzidas, enquanto que a produção no Brasil não ultrapassa 20 toneladas de polpa
(YUYAMA, 2011).
Equivalendo a 40% da massa do fruto, o resíduo despolpado gerado pode ser
alavancado com o crescente processamento do camu-camu, o que pode agravar a poluição
ambiental. Assim, com vistas às propriedades biológicas observadas na polpa, algumas
pesquisas também foram realizadas com o resíduo despolpado, conforme reportado em
MYODA et al. (2010). Neste trabalho, os autores observaram elevada atividade antioxidante
em extratos metanólicos do resíduo bem como quantidades significativas de constituintes
lipolíticos, os quais oferecem atividade antimicrobiana. FRACASSETTI et al. (2013)
mostraram que a concentração de componentes fenólicos bem como a capacidade
antioxidante da farinha do resíduo despolpado de camu-camu (4007,95 mg/100 g and 752,3
μmol Trolox/g) foram superiores aos resultados obtidos a partir da polpa (48,54 mg/100 g and
167,5 μmol Trolox/g). Por sua vez, o extrato aquoso deste resíduo exibiu atividade
neuroprotetor em C. elegans in vivo, conforme apresentado em AZEVÊDO et al. (2014).
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 68
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Assim, o uso de métodos de separação permitirá a elaboração de preparações com
propriedades específicas bem como possibilita identificar outros constituintes do resíduo após
concentração de extratos. Em nosso estudo, a técnica flotação em sistema bifásico aquoso foi
escolhida para a captura de componentes fenólicos do extrato aquoso do resíduo de camu-
camu.
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 69
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
3.2. Objetivos
Recuperar e concentrar polifenóis do resíduo despolpado de camu-camu por FSAB.
3.2.1. Objetivos específicos
Investigar os efeitos do tipo de solvente orgânico, pH da fase aquosa, concentração de
sulfato de amônio, tempo de flotação, vazão de ar e volume inicial de topo no
desempenho da FSAB;
Comparar os métodos baseados em extração líquido-líquido em termos de eficiência
de separação, coeficiente de concentração e razão de distribuição;
Realizar ensaios de FSAB em escala ampliada;
Identificar os componentes fenólicos dispersos em cada fase após o método extrativo;
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 70
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3.3. Materiais e métodos
3.3.1. Reagentes
O resíduo despolpado de camu-camu (Myrciaria dubia H.B.K. Vaugh), formado
principalmente de sementes e cascas, foi cedido pela Cupuaçu do Amazonas Comércio e
Indústria Ltda (Amazonas, Brazil). Os reagentes Folin-Ciocalteau e Triton X-114 bem como
os padrões (+)-catequina, ácido elágico, eugenol, ácido gálico, quercetina, ácido siríngico,
vanilina e ácido vanílico foram adquiridos pela Sigma-Aldrich (USA). Polietilenoglicol
(PEG) 400, 1500, 4000 e 6000, etanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, sulfato de amônio
e cloreto de sódio foram adquiridos da Synth (Diadema, São Paulo/Brazil). Todos os
reagentes usados possuíam grau analítico e, portanto, não necessitaram de purificação prévia.
Água deionizada obtida do sistema MiliQ EasyPure RF (ThermoFisher Scientific, USA) foi
usada nos experimentos FSAB.
3.3.2. Preparação do extrato do resíduo de camu-camu
A secagem do resíduo de camu-camu foi realizada em equipamento de freeze dryer
Liobras modelo L101 (Campinas, Brazil) sob temperatura de -40 oC e pressão de vácuo de 13
Pa. Finalizada a etapa, o resíduo seco foi armazenado em freezer a -20 oC e envolto em lona
para isolamento da luz. No preparo do extrato, as amostras secas foram trituradas e extraídas
em água deionizada na proporção 1:100 (m/v), para a EPN, e 1:200 (m/v), para a FSAB e
ESAB. Após 30 min de incubação a temperatura ambiente, os extratos foram finalmente
levados para centrifugação a 2100 x g e os sobrenadantes foram recolhidos.
3.3.3. Experimentos de FSAB, ESAB e EPN
A partir dos extratos do resíduo de camu-camu, os passos para execução dos
experimentos de FSAB foram semelhantes aos descritos no Tópico 2.3.3. De modo a
maximizar o desempenho do processo, os efeitos de algumas variáveis da FSAB foram
investigados usando uma coluna com dimensões de 30,0 x 2,64 cm, a qual dispunha de placa
porosa de vidro sinterizado G4. A ordem de otimização das variáveis da FSAB seguiu a
modificação do tipo de solvente hidrofílico (álcoois e PEG 400), pH da fase fundo (3,0-7,0),
concentração de sulfato de amônio da fase fundo (350-500 g/L), vazão de ar (12,5-50
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 71
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
mL/min), tempo de flotação (1-120 min) e volume da fase orgânica (2,5-12,5 mL). Para
avaliar o desempenho do processo, a eficiência de separação (E%), o coeficiente de
distribuição (D) e o coeficiente de concentração (α) são calculados através das equações 2.3-
2.5. Nestes experimentos, as condições operacionais iniciais foram selecionadas com base em
PADILHA et al. (2017b). Além disso, o volume da fase fundo e o percentual de PEG na
camada de topo foram fixados em 100 mL e 80% (m/m), respectivamente; Ar comprimido foi
usado como gás passante e todos os experimentos FSAB foram realizados em duplicata a
temperatura ambiente (25 ± 2 oC).
Para confrontar com os resultados da FSAB, experimentos ESAB e EPN também
foram realizados. Na ESAB, tubos cônicos com 8 mL de extrato modificado de camu-camu,
já acrescido de 450 g/L de sulfato de amônio e pH 5,0, foram agitados vigorosamente em
vórtex com 2 mL de solução aquosa de PEG 400 a 80% (m/m). Em seguida, os tubos
contendo a mistura foram centrifugados a 2100 x g e as fases resultantes foram analisadas.
Por sua vez, o sistema aquoso micelar foi preparado em tubos de centrífuga a partir da mistura
de 80% extrato de camu-camu (m/m), 7% Triton X-114 (m/m) e água deionizada em um total
de 5 g. Os tubos foram agitados em vórtex, prontamente levados em banho termostático a 30
oC por 3 h e a fase diluída foi coletada para determinação da concentração de polifenóis.
Todos os resultados de particionamento de polifenóis passaram por testes de médias (teste de
Tukey), no software Statistica 7.0 (Statsoft/USA), usando o nível de confiança de 95% (p <
0,05).
3.3.4. Ampliação de escala da FSAB
De modo a avaliar o aumento de escala da técnica proposta, um aparato FSAB semi-
piloto foi confeccionado. Uma coluna de vidro de dimensões 60,0 x 8,00 cm foi acoplada a
um funil de Buchner com placa porosa G4 por meio de conectores de poliamida 6.6
(Technyl®). Com um volume útil de 2,5 L, o experimento de FSAB em escala maior foi
realizado com as condições ótimas da menor escala, usando a razão altura:diâmetro de 8.0
(critério de ampliação de escala).
3.3.5. Determinação da concentração de polifenóis totais
A quantificação de polifenóis nos experimentos EPN, ESAB e FSAB foi realizada
usando o método Folin-Ciocalteau, conforme mostrado em FUJITA et al. (2013). Alíquotas
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 72
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
de 0,5 mL da amostra foram reagidas com 2,5 mL do reagente Folin (0,2 M) a 50 oC durante 5
min, em seguida a mistura foi acrescida de 2,0 mL da solução de carbonato de sódio a 75 g/L.
Os tubos foram deixados em repouso por 20 min a 25 oC e suas absorbâncias foram medidas
em espectrofotômetro (ThermoSpectronic Genesys 10 UV/Vis) a 760 nm. Amostras foram
coletadas das fases de topo e de fundo na ESAB e FSAB, enquanto que na EPN a
concentração de polifenóis foi determinada apenas para a fase diluída. Nessa última técnica, a
concentração da fase topo foi estimada através de um balanço de massa, uma vez que a
presença do Triton X-114 poderia interferir na leitura (RAYCHAUDHURI &
CHATTERJEE, 1985). Ácido gálico foi usado nas curvas de calibração e os efeitos do sal,
PEG e pH sobre os métodos foram considerados no cálculo da concentração do produto.
3.3.6. Determinação da atividade antioxidante
A atividade antioxidante é frequentemente usada como um indicativo da degeneração
dos componentes fenólicos durante um método de extração (BOI et al., 2017). A captura do
radical DPPH foi determinada de acordo com DO et al. (2014) usando misturas metanólicas
de PEG e sulfato de amônio como controle da fase de topo e fundo, respectivamente. Os
resultados foram expressos como concentração de equivalentes a Trolox (μmol TE/g do
material seco).
3.3.7. Análise de polifenóis por CLAE
Os polifenóis presentes no extrato e da fase diluída foram identificados em um sistema
de cromatografia líquida de alta-eficiência (CLAE) modelo Accela (ThermoFisher Scientific,
USA). Este equipamento é provido de detector por arranjo de diodo (operado em 278 nm) e
coluna Shimadzu Shim-pack C18 (Thermo Scientific, USA) de dimensões 250 x 4,6 mm. Sob
vazão de 1000 μL/min e temperatura de 30 oC, a eluição das amostras foi inspirada em KIM
et al. (2013), através da mistura de 1% ácido acético (v/v) (A) e acetonitrila (B) nas seguintes
proporções: 100% A como condição inicial, 70% A e 30% B até 10 min, 30% A e 70% B até
15 min, 100% B até 25 min. Por fim, a eluição foi mantida sob a máxima dosagem de
acetonitrila por mais 5 min. As amostras analisadas foram previamente filtradas com
membrana 0,22 µm e seus resultados foram obtidos após três replicatas.
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 73
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
3.4. Resultados e discussões
3.4.1. Recuperação de polifenóis por FSAB
3.4.1.1. Efeito do tipo de solvente
A escolha dos componentes formadores de fases é o primeiro passo no
desenvolvimento de um processo FSAB, uma vez que afeta fortemente a solubilidade do
sublado no topo bem como a tensão interfacial entre as fases (OLIVEIRA et al., 2012; SHOW
et al., 2013). Neste estudo, diferentes soluções aquosas de álcoois e PEG 400 foram usadas
como fase de topo e seus respectivos desempenhos foram expressos em termos de E%, a e D,
como mostrado na Figura 3.2. Algumas tentativas foram realizadas com PEG’s de massa
molecular maiores, porém a formação excessiva de espuma foi decisiva para declinar desses
polímeros.
Figura 3.2 Desempenho da FSAB com diferentes solventes orgânicos. As condições experimentais usadas foram:
pH = 3,8 (sem ajuste do pH); [(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de ar = 37,5 mL/min; tf = 30 min; razão volumétrica
= 0,1. As letras minúsculas a, b e c foram usadas para comparação de respostas; respostas com a mesma letra
indicam que não há diferença entre elas a 95% de confiança.
Fonte: Próprio autor.
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 74
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Na Figura 3.2, observa-se que os valores das três respostas no experimento com PEG
400 foram bem superiores em relação aos valores encontrados nos demais experimentos.
Enquanto que nos experimentos com n-propanol o valor obtido de E% foi apenas 7,33%, o
uso do PEG 400 permitiu que tal resposta alcançasse um valor oito vezes maior. Este
comportamento pode ser explicado pela grande disponibilidade de grupos éter na estrutura do
polímero, o que confere maior capacidade de dissolução de sublados polares na fase topo (BI
et al. 2009, 2010; PADILHA et al., 2017b). Além disso, não foi possível estabelecer
correlações entre o aumento da cadeia carbônica dos álcoois e quaisquer respostas da FSAB.
Portanto, a solução polimérica de PEG 400 a 80% (m/m) foi usada nos experimentos
seguintes.
3.4.1.2. Efeito do pH da fase fundo
Estudos anteriores reportaram o impacto do estado ionizável de componentes fenólicos
sobre sua solubilidade e estabilidade em meios aquosos. CLÁUDIO et al. (2012) e REIS et al.
(2015) sugeriram que a partição do ácido gálico para a fase orgânica reduz com a elevação do
pH devido ao aumento da interação eletrostática do componente fenólico com sais durante
extração em duas fases aquosas. FRIEDMAN & JÜRGENS (2000) relataram que algumas
espécies de componentes fenólicos são facilmente degradadas quando expostas a valores de
pH superiores a 7,0.
Desta forma, experimentos foram realizados para investigar o efeito do pH da fase
fundo, na faixa de 3,0 a 7,0, pela adição de HCl e NaOH. Entretanto, como pode ser
observado pela Figura 3.3, a eficiência de separação, o coeficiente de concentração e o
coeficiente de distribuição não se comportam exatamente conforme explicado acima. O
experimento sem ajuste de pH (pH = 3,8) bem como os outros experimentos da faixa de 3,0-
4,5 alcançaram aproximadamente os valores iguais a 60%, 4,3 e 10 para eficiência de
separação, coeficiente de concentração e coeficiente de distribuição, respectivamente. A partir
desse limite, a adição de NaOH possibilitou o aumento abrupto do desempenho da FSAB,
principalmente sobre os valores de E% e D.
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 75
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Figura 3.3 Efeito do pH da fase rica em sal sobre a FSAB. As condições experimentais usadas foram:% PEG
(m/m) = 80,0; [(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de ar = 37,5 mL/min; tf = 30 min; razão volumétrica = 0,1. As
letras minúsculas a, b, c, d e e foram usadas para comparação de respostas; respostas com a mesma letra indicam
que não há diferença entre elas a 95% de confiança.
Fonte: Próprio autor.
Esse comportamento inesperado pode ser atribuído à complexidade do extrato de
camu-camu, uma vez que cada componente fenólico dispõe de diferentes grupos orgânicos
com diferentes valores de pKa. Por sua vez, CHANG et al. (2014) afirmam que em ambientes
alcalinos a fase rica em PEG adquire maior efeito emulsificante e, portanto, aumenta a
recuperação do sublado. Particularmente, nos experimentos com pH 5,0, foi possível alcançar
elevados valores de E% (76,26 ± 0,73) e α (5,33 ± 0,23) bem como o maior valor de D (22,55
± 0,18; p < 0,05), logo essa condição foi escolhida para as etapas seguintes.
3.4.1.3. Efeito da concentração sulfato de amônio na fase fundo
A baixa razão volumétrica é uma das características marcantes da sublação com
solvente, o que permite alcançar altos índices de coeficiente concentração do produto na fase
de topo. Especialmente em sistemas PEG/sal, a concentração salina determina a
incompatibilidade das fases e, consequentemente, pode evitar a turbulência na interface
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 76
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(PADILHA et al., 2017c). Assim, para que o processo proposto pudesse operar com apenas
10,0 mL de fase orgânica, elevadas dosagens de sulfato de amônio foram requeridas (350-500
g/L) e seus resultados são mostrados na Figura 3.4.
Figura 3.4 Efeito da concentração de sulfato de amônio na fase rica em sal sobre a FSAB. As condições
experimentais usadas foram:% PEG (m/m) = 80,0; pH = 5,0, vazão de ar = 37,5 mL/min; tf = 30 min; razão
volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b e c foram usadas para comparação de respostas; respostas com a
mesma letra indicam que não há diferença entre elas a 95% de confiança.
Fonte: Próprio autor.
Como esperado, o efeito de salting-out possibilitou maiores valores de E%, α e D nos
experimentos com concentrações do sal mais elevadas. À exceção dos valores de E%, o
acréscimo de sal a partir da concentração de 425 g/L possibilitou outro aumento repentino do
desempenho da FSAB. Em termos de coeficiente de concentração, o crescimento foi de 3,37
para 5,33; enquanto que para o coeficiente de distribuição, o aumento do conteúdo salino
provocou o crescimento de 12,05 para 22,55. Uma vez que os experimentos realizados na
faixa 450-500 g/L obtiveram respostas similares (p > 0,05), optou-se por manter a condição
com menor concentração salina (450 g/L).
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 77
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
3.4.1.4. Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação
Em contrapartida às variáveis avaliadas anteriormente, a vazão de gás passante atua
basicamente no mecanismo de transferência de massa. Tal condição afeta a área interfacial
gás-líquido por unidade de volume e tempo, ou seja, acelera a migração do sublado da fase
fundo para fase topo (LIN et al., 2015). Entretanto, autores sugerem que a vazão de gás em
níveis mais elevados provoca a mistura das fases, o que descaracteriza a FSAB. Logo, para
investigar o efeito da vazão sobre a técnica proposta, os valores de eficiência de separação
foram determinados sob diferentes vazões de ar (12,5-50,0 mL/min) durante 120 min.
Obviamente, o tempo de flotação favoreceu a maior recuperação dos componentes fenólicos,
embora a migração do sublado tenha ocorrido principalmente nos primeiros instantes do
processo conforme a Figura 3.5.
Por exemplo, na condição de 12,5 mL/min, o valor de E% alcançou 69,67 já no
primeiro minuto e alcançou apenas o valor de 80,75 a 120 min. Por sua vez, nos experimentos
com maiores vazões de ar foram obtidos elevados valores médios de E%, porém na análise
estatística não foram observadas diferenças significativas de desempenho ao longo da
cinética. De modo a combinar desempenho de recuperação e produtividade, a vazão de ar
igual a 37,5 mL/min e o tempo de flotação de 60 min foram escolhidos.
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 78
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Figura 3.5 Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação sobre a FSAB. As condições experimentais usadas
foram:% PEG (m/m) = 80,0; pH = 5,0, [(NH4)2SO4] = 450 g/L; razão volumétrica = 0,1. As letras maiúsculas A
e B foram usadas para comparação de E% para as diferentes vazões de ar para o mesmo tempo de flotação. As
letras minúsculas a, b, c e d foram usadas para comparação de E% de diferentes tempos de flotação em uma
mesma vazão de ar; respostas com a mesma letra indicam que não há diferença entre elas a 95% de confiança.
Fonte: Próprio autor.
3.4.1.5. Efeito da razão volumétrica
Por fim, os impactos de mudanças na razão volumétrica sobre o desempenho da FSAB
foram investigados e os resultados, expressos em termos de E%, α e D, são mostrados na
Figura 3.6. A elevada concentração salina definida anteriormente (450 g/L) permitiu a
execução do processo em baixa razões volumétricas, como por exemplo 0,025. Em tal
condição, apenas 2,5 mL da solução de PEG foram depositadas sobre 100 mL da fase fundo.
Os valores de α reduziram com a elevação da razão volumétrica, provavelmente devido ao
efeito da diluição, todavia as outras duas respostas seguem comportamentos diferentes.
Diferentemente do que foi relatado nos trabalhos de SEBBA (1962) e CABALLERO et al.
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 79
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
(1990), no presente estudo os valores de E% foram afetados pela razão volumétrica, ainda que
o limite de saturação na camada de topo estivesse distante. Enquanto que na razão
volumétrica de 0,025 foi alcançado E% no valor de 63,17 ± 1,22, na razão volumétrica de 0,1
foi obtido o valor máximo de eficiência de separação (82,37 ± 0,81). Além disso, observou-se
que o coeficiente de distribuição sofreu menor efeito da diluição e, portanto, não reduziu com
o aumento da razão volumétrica. Um comportamento anômalo foi observado no experimento
com razão volumétrica de 0,125, uma vez que não foi possível conseguir um valor elevado de
E%. Usando como critério de escolha a eficiência de separação, a razão volumétrica de 0,1
superou as demais condições operacionais e também forneceu alto coeficiente de distribuição
(27,56 ± 1,33), o qual não possui diferença estatística do valor obtido no experimento com
menor dosagem de PEG (p = 0,16).
Figura 3.6 Efeito da razão volumétrica sobre a FSAB. As condições experimentais usadas foram:% PEG (m/m)
= 80,0; pH = 5,0, vazão de ar = 37,5 mL/min; tf = 60 min; razão volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b e c
foram usadas para comparação de respostas; respostas com a mesma letra indicam que não há diferença entre
elas a 95% de confiança.
Fonte: Próprio autor.
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 80
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
3.4.2. Experimentos comparativos e aumento de escala
Nesta seção, as técnicas FSAB (menor escala), ESAB e EPN foram aplicadas para a
recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu e o comparativo dos
resultados foi expresso na Tabela 3.1. Ainda que sob condições ótimas, a FSAB obteve
valores de E% inferiores a ESAB e EPN, nessa última técnica foi alcançada a maior eficiência
de separação. A extração com soluções aquosas de Triton X-114 é um método tradicional de
tratamento de componentes fenólicos a partir de resíduos agroindustriais. Em nossos
experimentos, foi registrada uma forte interação entre os polifenóis do resíduo de camu-camu
e as micelas do surfactante, mesmo em ambientes com pH superior a 10,0 (dados não
mostrados). Por outro lado, devido à diminuta razão volumétrica adotada na FSAB, seu valor
de α foi duas vezes maior que a ESAB e quatro vezes maior que a EPN. Em termos do
coeficiente de distribuição, a FSAB (27,56 ± 1,32) foi levemente superior a ESAB (23,06 ±
1,43) e três vezes maior que a EPN (8,92 ± 0,08).
Baseado no sucesso do aumento de escala da FSAB na recuperação de lipases (Show
et al., 2013; Mathiazakan et al., 2016), o protótipo semi-piloto da coluna FSAB foi usado para
separação e concentração dos polifenóis do resíduo de camu-camu. As respostas mostradas na
Tabela 3.1 foram similares àquelas obtidas pela escala menor, principalmente em termos de
E%. Quanto aos índices ligados à concentração do sublado na fase topo, notou-se um leve
declínio nos valores médios de α e D de 5,21 e 27,56 para 4,32 e 22,64, respectivamente. O
bom desempenho da escala maior também é confirmado pela mudança de coloração das fases
após o processo FSAB, conforme a Figura 3.7. Comparado a outras técnicas de separação, a
aplicação da FSAB mostrou vantagens como simples operação, baixo custo, fácil aumento de
escala e alto poder de concentração das moléculas-alvo.
Tabela 3.1. Comparação de desempenho entre os métodos de separação na recuperação de
polifenóis do resíduo de camu-camu
Técnicas de separação E% α D
Extração por ponto de nuvem 95,75 ± 0,22a
1,25 ± 0,02d
8,92 ± 0,08c
Extração em sistema aquoso
bifásico 90,52 ± 0,16
b 2,18 ± 0,16
c 23,06 ± 1,43
b
Flotação em sistema aquoso
bifásico (menor escala) 81,02 ± 1,12
c 5,21 ± 0,06
a 27,56 ± 1,32
a
Flotação em sistema aquoso
bifásico (maior escala) 80,91 ± 0,49
c 4,32 ± 0,02
b 22,64 ± 0,08
b
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 81
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3.4.3. Cromatogramas de CLAE
A otimização do processo de flotação possibilitou a elevada concentração de
polifenóis na fase rica em PEG (≈ 350 μg GAE/mL), portanto a análise de CLAE foi usada
para detectar os compostos no produto da FSAB. O perfil cromatográfico apresentado na
Figura 3.8 revela a presença de diversas espécies de polifenóis na fase rica em PEG. Não foi
possível determinar quais eram os compostos principais do produto, cujos tempos de retenção
foram 6,79 e 7,71 min. Contudo, pela comparação de tempos de retenção, foram identificados
alguns compostos minoritários como o ácido gálico (t = 6,09 min), (+)-catequina (t = 9,67
min), ácido vanílico (t = 10,73 min), ácido siríngico (t = 10,87 min), ácido elágico (t = 12,57
min) e quercetina (t = 15,44 min). Considerando o conteúdo de polifenóis na camada de topo
pela massa de resíduo usada no extrato, a produtividade estimada de ácido gálico, catequina,
ácido vanílico, ácido siríngico, ácido elágico e quercetina seria 93,21, 40,93, 7,48, 56,31,
10,79 e 26,23 mg/100 g do material seco conforme mostrado na Tabela 3.2.
Tabela 3.2. Valores médios de concentração de componentes fenólicos (definidos em mg/100
g do material seco) e poder antioxidante (μmol TE/g do material seco) no resíduo de camu-
camu e no produto da FSAB.
Referências
(+)
Catequina
Ácido
elágico
Ácido
gálico
Quercetina
Ácido
siríngico
Ácido
vanílico
Atividade
antioxidante
AZEVÊDO et
al. (2014)
1,6 9,6 - 0.4 4,1 - 32,40
Presente
trabalho
40,93 10,79 93,21 26,23 56,31 7,48 70,33
Fonte: Próprio autor.
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 82
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Figura 3.7 Aparato experimental em escala piloto antes (A) e depois do processo (B).
Fonte: Próprio autor.
Quando comparados com os resultados de AZÊVEDO et al. (2014) usando o extrato
aquoso do resíduo de camu-camu, verifica-se uma intensa concentração dos componentes
fenólicos citados durante a FSAB. Quanto ao poder antioxidante, a fase rica em PEG (70,33
μmol TE/g do material seco) possuiu maior atividade de eliminação do radical DPPH do que
o extrato aquoso original (32,40 μmol TE/g do material seco), embora esse aumento não tenha
acompanhado a diferença no teor de polifenóis das amostras.
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 83
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Figura 3.8 Cromatograma de CLAE da fase rica em PEG da FSAB sob condições ótimas a
280 nm. Os picos 1, 2, 3, 4, 5 e 6 correspondem ao ácido gálico, (+) catequina, ácido vanílico,
ácido siríngico, ácido elágico e quercetina.
Fonte:
Próprio autor.
3.5. Conclusões
O presente trabalho mostrou o sucesso da extração por ponto de nuvem e da sublação
por solvente na recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu. Usando
polietilenoglicol e sulfato de amônio como compostos formadores de fases, as seguintes
condições operacionais da FSAB foram otimizadas via avaliação univariada: pH = 5,0,
[(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de ar = 37,5 mL/min, tempo de flotação = 60 min e razão
volumétrica = 0,1. Em tais condições, foi obtido o desempenho máximo da FSAB em termos
de E% (81,02 ± 1,12) e a ampliação de escala de 110 mL para 2,5 L pouco afetou o valor
desta resposta. Em relação à ESAB e EPN, os processos de flotação, seja em pequena escala
ou escala semi-piloto, obtiveram coeficientes de concentração duas vezes superior. Observou-
se também que uma parcela do sublado que migrou para a fase rica em PEG é composta de
Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 84
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polifenóis com elevado poder antioxidante como ácido gálico, ácido siríngico, (+)-catequina e
quercetina. A FSAB é uma alternativa eficiente às outras técnicas de downstream processing
para recuperar e concentrar compostos fenólicos bioativos de extratos naturais.
CAPÍTULO 4
RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DO
2-HIDROXIBIFENIL A PARTIR DE CALDO
FERMENTADO POR FLOTAÇÃO EM
DUAS FASES AQUOSAS
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 86
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4. Recuperação e concentração do 2-hidroxibifenil a
partir de caldo fermentado por flotação em duas
fases aquosas
Aqui, a flotação em sistema de duas fases aquosas foi aplicada à recuperação e
concentração de um biocida, obtido a partir da biodessulfurização do dibenzotiófeno,
realizada por meio de uma metodologia multivariada usando uma solução modelo. Além
disso, a FSAB foi comparada com outras técnicas de separação como a extração líquido-
líquido, extração em sistemas bifásicos aquosos e sublação por solvente. Por fim, sob
condições ótimas, a flotação foi executada com caldo de fermentado como alimentação. Esses
resultados foram organizados na forma do artigo entitulado “Recovery and concentration of
ortho-phenylphenol from biodesulfurization of 4-methyl dibenzothiophene by aqueous two-
phase flotation”, o qual foi publicado no periódico Separation and Purification Technology.
4.1. Revisão bibliográfica
4.1.1. Biodessulfurização e 2-hidróxibifenil
A queima de combustíveis com alto teor de enxofre tem sido considerada como a
principal causa dos eventos de poluição do ar devido às emissões de óxidos de enxofre e ácido
sulfídrico (NAKAYAMA et al., 2002; YU & WANG, 2013). O percentual mássico de
enxofre em óleos crus varia de 0,03 a 7,39% e ele é amplamente classificado como inorgânico
e orgânico (MEHRAN et al., 2007; JAVADLI & DE KLERK, 2012). O enxofre inorgânico
ocorre majoritariamente como pirita, enquanto que o enxofre orgânico é encontrado na forma
de tióis, tiofenos e sulfetos (SHEN et al., 2012). Com o objetivo de remover o enxofre dos
componentes organosulfurados, as indústrias petrolíferas comumente recorrem à
hidrodessulfurização (HDS). Esse método de dessulfurização é baseado na redução do
enxofre em ácido sulfídrico a partir de condições drásticas de temperatura e pressão (LI et al.,
2003). Contudo, em um cenário de leis ambientais mais restritivas, a HDS mostra-se pouco
efetiva sobre os tiofenos como o dibenzotiofeno (DBT) (FURUYA et al., 2003). Uma
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 87
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
estratégia para superar este gargalo é a associação da HDS com a dessulfurização microbiana
(VAN HAMME et al., 2003). Algumas cepas bacterianas como Rhodococcus sp. (DEL
OLMO et al., 2005; DERIKVAND & ETEMADIFAR, 2014; DINAMARCA et al., 2014),
Mycobacterium sp. (LI et al., 2003; FURUYA et al., 2003) and Pseudomonas sp.
recombinantes (GALLARDO et al., 1997; GUOBIN et al., 2005; MARTÍNEZ et al., 2015)
são capazes de consumir o DBT e seus derivados, convertendo-os em 2-hidroxibifenil (2-
HBF). Esta reação é obtida a partir da rota metabólica 4S, que compreende na atuação de um
sistema multienzimático, formado por monooxigenases e desulfinases, sobre a estrutura de
componentes tiofênicos (MOHAMED et al., 2015), como foi ilustrado na Figura 4.1.
Figura 4.1. Ilustração simplificada da rota metabólica 4S para biodessulfurização do DBT.
Fonte: Próprio autor.
O 2-HBF é um popular biocida que extermina bactéria, fungos e leveduras, usado
principalmente como defensivo agrícola em lavouras de frutas cítricas e desinfetante em
hospitais e indústrias (GARCÍA et al., 2014). Embora o 2-HBF não exiba elevada toxicidade
em animais (BOMHARD et al., 2002), alguns estudos mostraram a formação de lesões no
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 88
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
DNA de células V79 (HENSCHKE et al., 2000) bem como a maior incidência de câncer de
bexiga em ratos machos quando expostos ao composto (HIRAGA & FUJII, 1984; APPEL,
2000). Isto é um motivo de preocupação, uma vez que baixas concentrações de 2-HBF podem
ser encontradas persistentemente em produtos agrícolas (NAKAZATO et al., 1995; SAAD et
al., 2004; KOLBE & ANDERSSON, 2006) e cerveja (COELHAN et al., 2006). Neste
sentido, a detecção de elementos traços por técnicas analíticas como cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE), espectrometria de massa, cromatografia gasosa (CG) acoplada com
espectrometria de massa (EM) requer procedimentos de enriquecimento de amostras
(GÖKMEN et al., 2009).
4.1.2. Técnicas de enriquecimento para amostras orgânicas
A determinação da concentração de compostos orgânicos nem sempre é uma tarefa
simples e inúmeras complicações podem ocorrer; de modo que o uso de pré-tratamentos de
amostras eficientes pode ser a chave para o sucesso de análises (QUEIROZ et al., 2001;
HYÖTYLÄINEN, 2007; CALDAS et al., 2011). Particularmente para vegetais e águas, onde
as concentrações de pesticidas são baixas (da ordem de pg.L-1
a μg.L-1
), a amostragem
adequada e as técnicas de enriquecimento de amostras são necessárias para que a substância
esteja na faixa de sensibilidade do instrumento analítico proposto (DEMEESTERE et al.,
2007). Quanto à determinação de drogas no plasma humano; além da concentração ínfima
(0,1-10 ng.mL-1
), problemas extras podem surgir como a adsorção do analito por proteínas
e/ou o volume limitado de amostra (PRABU & SURIYAPRAKASH, 2012). A
implementação dessas técnicas também é importante para a eliminação ou, ao menos, para a
redução dos efeitos de matriz sobre as análises. O efeito de matriz é definido como a alteração
direta e indireta ou interferência na resposta devido à presença de analitos indesejáveis na
amostra, o qual se aplica a diferentes análises (TAHBOUD, 2014). MENEZES et al. (2013)
reportaram a flutuações na determinação de concentrações de hemoglobina glicada por CLAE
devido a presença das variantes hemoglobina C e hemoglobina S. Os autores salientaram a
deficiência da metodologia analítica, uma vez que ela pode levar à interpretações equivocadas
do índice glicêmico de pacientes. TANG et al. (2013) observaram a co-eluição de metabólitos
interferentes na determinação de naftaleno hidroxilado em amostras de urina por CLAE-
EM/EM. Esse efeito é dependente das propriedades físico-químicas do analito de interesse
bem como das características dos componentes endógenos da matriz; por exemplo, tamanho
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 89
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
de moléculas, polaridade, estabilidade térmica, pressão de vapor, entre outros (PINHO et al,
2010). Em algumas situações, a escolha inapropriada das técnicas de preparação pode levar
intensificação da interferência devido à elevação da concentração dos interferentes juntamente
com o analito de interesse. Segundo HLADIK & MCWAYNE (2012), a presença persistente
de ácido húmico e/ou ácido fúlvico em amostras de água pode comprometer a análise de
inseticidas por CG. Tratando-se de determinações realizadas em CLAE, CG ou eletroforese
capilar (EC), os métodos de preparação asseguram a leitura correta das moléculas de interesse
bem como garante uma maior longevidade das colunas analíticas ou dos capilares (JARDIM,
2010).
Tradicionalmente, a preparação de amostras para análises é baseada na extração
líquido-líquido (ELL) e na extração sólido-líquido (ESL). A ELL, como já mencionado no
tópico 2.1.3, envolve a partição do analito entre as duas fases, sendo limitada apenas pela
solubilidade do soluto. Já a ESL é fundamentada no fenômeno de adsorção e dessorção do
analito em uma fase sólida. O procedimento geral dessa técnica compreende no contato dos
analitos com o adsorvente, lavagem dos componentes indesejáveis e fracionamento de
componentes-alvo por ação de um eluente (PADILHA et al., 2016a; PADILHA et al., 2016b;
PADILHA et al., 2017e).
Diferentemente da ELL, durante o tratamento da amostra na ESL a purificação parcial
pode ser realizada na carga e/ou na eluição (FERENC & BIZIUK, 2006). Os mecanismos de
retenção são variados (por exemplo, força de Van der Waals, força dipolo-dipolo, ligação de
hidrogênio, etc.) e cada adsorvente oferece uma combinação peculiar dessas propriedades,
possibilitando ao analista uma gama de opções para solucionar seu problema específico. No
entanto, VAS & VÉKEY (2004) e KONING et al. (2009) apontaram que as técnicas
tradicionais são bastante onerosas e consomem um tempo elevado bem como expuseram
algumas limitações quanto ao desempenho delas. Em uma situação ideal, o solvente usado na
ELL deve apresentar seletividade suficiente para eliminar potenciais substâncias interferentes
da amostra (RAIKOS et al., 2009). Entretanto, em um caso real, apenas uma parcela desses
interferentes é efetivamente removida em uma única etapa, necessitando de múltiplos passos
até a obtenção de um preparado ótimo. Obviamente, um número razoável de extrações
sucessivas também introduz contaminações e erros ao procedimento bem como acarreta na
perda de analito.
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 90
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Na ESL é frequente a ocorrência de problemas ligados ao leito adsorvente como
coagulação, colmatação e canalização, o que pode refletir negativamente sobre o rendimento.
Embora o volume de solventes orgânicos usada na ESL seja bastante reduzido se comparado à
ELL, essa quantidade ainda é significante e pode causar complicações no seu descarte (VAS
& VÉKEY, 2004). Soma-se ainda o fato de que traços do solvente da ELL e do eluente da
ESL podem permanecer no preparado, a menos que etapas adicionais sejam realizadas
(DUROVIĆ et al., 2012). Nesse contexto, pesquisas recentes tem reportado a necessidade da
substituição das técnicas tradicionais por outras mais vantajosas.
A sublação por solvente (SS), uma classe de técnicas baseadas na adsorção por bolhas,
possui como um dos seus maiores trunfos sobre as técnicas extrativas a possibilidade de
alcançar fatores de enriquecimento superiores a 100:1. Embora isto não tenha sido
aprofundado no capítulo anterior, tal aspecto da SS a assegura como eficiente método de pré-
tratamento e enriquecimento de amostras para cromatografia líquida de alta eficiência e
cromatografia gasosa, principalmente para análises de pesticidas (BI et al., 2010a). LU &
HUANG (1992) propuseram a remoção de dois pesticidas organofosforados da água por meio
de três técnicas de separação por bolhas: stripping, sublação por solvente e flotação com
adsorção coloidal. A partir da leitura via CG, foi observado que a remoção de forato foi
superior a 97%; enquanto que nos experimentos com diclorvós, a SS conseguir eliminar
pouco mais de 50% do pesticida presente na fase de fundo. XI & DONG (2007) determinaram
a concentração de dimetoato, paratião metílico, malatião e clorpirifós (também pesticidas
organofosforados) em vegetais através da SS. Sob as condições ótimas, os valores de
recuperação variaram de 81,3 a 98,9% e o desvio padrão relativo (DPR) na análise de CC
oscilou de 0,46 a 4,83%. Por sua vez, DONG et al. (2008) usaram a SS para determinar a
concentração de pesticidas piretróides em vegetais. Assim como os trabalhos anteriores, os
valores de recuperação foram superiores a 85% para a fempropatina, deltametrina e bifentrina
em amostras reais. Para esse último pesticida, observou-se uma ligeira perturbação em seus
valores de recuperação, uma vez que esses ultrapassaram 100% nos preparados de alface e
repolho. Por fim, foram alcançados os valores de sensibilidade de 4,2 μg/kg para a
fempropatina, 2,4 μg/kg para a deltametrina e 1,4 μg/kg para a bifentrina, com DPR máximo
de 6,19% na análise por CLAE com SS acoplada.
Nos últimos anos, outras modalidades da SS também tem sido usadas como
ferramentas de enriquecimento de amostras para análises, especialmente a flotação em
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 91
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
sistema de aquoso bifásico (FSAB). Com um sistema formado por n-propanol/sulfato de
amônio, GE et al. (2011) avaliaram o potencial da FSAB na determinação da concentração do
antibiótico tilmicosina em amostras de água coletadas em Zhenjiang, na China. Os valores de
eficiência de separação e fator de enriquecimento da FSAB quando alimentada com uma
solução modelo de tilmicosina foram 84,7% e 16,8, respectivamente. Ainda que nenhum
resíduo de tilmicosina tenha sido encontrado em amostras de águas da área agrícola, a técnica
mostrou sucesso na recuperação do antibiótico quando esse foi prontamente adicionado às
amostras. Em HAN et al. (2014), a FSAB foi usada como etapa preliminar na determinação
da concentração do cloranfenicol em alimentos. Quando comparada com outros métodos de
preparação (ESAB, microextração líquido-líquido dispersiva e dispersão da matriz em fase
sólida), a FSAB possibilitou menores índices nos limites de detecção e quantificação do
antibiótico pela CLAE. Assim como o trabalho citado anteriormente, nenhum traço do
cloranfenicol foi detectado nas amostras de carne, leite integral e leite em pó; embora a
técnica tenha mostrado resultados de eficiência de separação de praticamente 100% quando o
antibiótico foi adicionado de maneira proposital. Nesta mesma linha de detecção de
antibióticos em alimentos, LU et al. (2016) estudaram a aplicação da FSAB na recuperação de
ciprofloxacina e lomefloxacina usando o polímero Etileno óxido-propileno óxido (EOPO)
como solvente da fase topo. Nos experimentos com solução modelo, o processo de flotação
conseguiu recuperar mais do que 95% de ambos os antibióticos, em pouco mais de 20 min de
execução. No tratamento de amostras de ovo, leite e carne de porco, observou-se que o
desempenho da FSAB se manteve no mesmo patamar (91,4-99,1%), apresentando baixos
índices de DPR (0,3-0,7%). Apesar deste enfoque em análises de antibióticos, não
observamos na literatura nenhum estudo usando a FSAB como método de preparação de
amostras de pesticidas. Assim, o presente capítulo propõe a otimização multivariada das
condições operacionais da FSAB na recuperação e concentração do 2-HBF bem como sua
aplicação em um meio complexo contendo o pesticida.
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 92
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
4.2. Objetivos
Recuperar e concentrar 2-hidroxibifenil do caldo de fermentação de Rhodococcus
rhodochrous através da FSAB.
4.2.1. Objetivos específicos
Realizar a triagem das variáveis mais significativas ao processo de flotação por meio
de um planejamento fatorial de meia fração;
Avaliar os efeitos da vazão de ar, tempo de flotação e volume inicial da fase rica em
PEG (os fatores de maior impacto do planejamento anterior) no desempenho da FSAB
a partir de uma solução modelo de 2-hidroxibifenil;
Empregar o caldo de fermentação de Rhodococcus rhodochrous como fonte de 2-
hidroxibifenil para o processo de flotação e seu desempenho foi comparado com os
ensaios anteriores com solução modelo;
Observar a captura de 2-hidroxibifenil pela ação da flotação através de cromatogramas
de CLAE.
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 93
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
4.3. Materiais e Métodos
4.3.1. Reagentes e aparato experimental
Os reagentes 2-hidroxibifenil 99% e 4-metil dibenzotiófeno ≥96% foram obtidos pela
Sigma-Aldrich (Ohio, USA). Polietilenoglicol 400 (PEG 400), sulfato de amônio, triptona,
extrato de levedura, cloreto de sódio foram adquiridos pela Synth (Diadema, São
Paulo/Brazil). Água deionizada foi obtida a partir de um sistema MiliQ e foi usada nos
ensaios FSAB.
O aparato usado nos experimentos FSAB foi confeccionado a partir de uma coluna de
vidro de 2,64 cm de diâmetro interno e capacidade máxima de 180 mL. O fundo da coluna foi
equipado com um disco de vidro sinterizado (porosidade G4) para geração de bolhas com
tamanho uniforme. A vazão de ar foi medida usando um rotâmetro modelo RMA-1-SSV
(Dwyer, USA) acoplado ao compressor por meio do regulador.
4.3.2. Microrganismos e biodessulfurização
A cepa Rhodococcus rhodochrous (NRRL B - 2149) foi cedida pela National Center
for Agricultural Utilization Research (USA) e usada neste estudo. Para preparação do
inóculo, amostras de 1 mL do concentrado celular a 10% de glicerol (v/v) foram suspensas em
50 mL de meio Luria-Bertani (10 g/L triptona, 5 g/L de extrato de levedura e 10 g/L NaCl)
sob agitação de 120 rpm e 32 oC durante 24 h.
A produção do 2-hidroxibifenil foi realizada via dessulfurização usando o 4-MDBT
como fonte de carbono secundária. Como a solubilidade do 4-MDBT em água é baixa, foi
necessária a prévia dissolução de 100 mg do reagente em 10 mL de hexadecano para
finalmente ser homogeneizado com 990 mL da solução nutriente (20 g/L glicose, 4 g/L
NaH2PO4, 4 g/L K2HPO4, 2 g/L NH4Cl, 0,0245 g/L MgCl2, 0,001 g/L FeCl3, 0,001 g/L CaCl2,
8 mL glicerol). Alíquotas de 2.5 mL do inóculo foram transferidas para 47,5 mL do meio de
produção e incubados sob agitação de 120 rpm e 32 oC durante 72 h. A biomassa celular foi
removida por centrifugação e o sobrenadante acrescido de 0,05% de azida de sódio (m/v) foi
armazenado em freezer.
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 94
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
4.3.3. Estudo da FSAB por abordagem multivariada
A otimização das condições operacionais da FSAB na recuperação do 2-HBF foi
baseada nos métodos estatísticos multivariados. Primeiramente, com o objetivo de avaliar os
efeitos das variáveis independentes do processo a partir de um pequeno número de
experimentos, um planejamento fatorial de meia fração foi usado. A concentração de sulfato
de amônio, pH da fase aquosa, concentração inicial de 2-HBF, vazão de ar, tempo de flotação
e volume inicial da fase orgânica foram adotados como fatores e a eficiência de separação
(E%) como resposta. Na Tabela 4.1 são mostrados os valores reais e codificados das variáveis
independentes e o cálculo de E% foi realizado com a Equação 2.3.
Tabela 4.1 - Valores das variáveis FSAB e seus níveis no planejamento de meia fração
Variáveis Variável
codificada
Níveis codificadas
-1 0 +1
pH X1 4,0 5,0 6,0
[(NH4)2SO4] (g/L) X2 425,0 450,0 475,0
[2-HBF] (mg/L) X3 37,50 56,25 75,00
Vazão de ar (mL/min) X4 12,5 25,0 37,5
Tempo de flotação (min) X5 30 60 90
Volume inicial da fase rica
em PEG (mL) X6 5,0 7,5 10,0
Finalizada a etapa anterior, o comportamento da FSAB foi avaliado novamente através
de um planejamento Box-Behnken (BBD). O BBD é uma classe de planejamentos rotacionais
(ou quase rotacional) baseado em planejamentos de três níveis incompletos (FERREIRA et
al., 2007), que combina pontos centrais de uma variável com níveis inferior (-1) e superior
(+1) de outras variáveis. O número de experimentos (N) requeridos para o BBD completo é
representado na Eq. 3.1,
02 1N k k C (3.1)
onde k é o número de fatores e C0 é o número de repetições no ponto central. Assim, as três
variáveis mais relevantes do planejamento fatorial de meia fração foram selecionadas como
fatores, enquanto que as demais variáveis foram mantidas em níveis favoráveis ao
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 95
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
desempenho do processo. Também, assim como na primeira triagem, uma solução modelo foi
usada. Nesta etapa, além dos valores de E%, as respostas dos ensaios foram expressas em
termos do coeficiente de concentração (α) (Eq. 2.4) e razão de distribuição (D) (Eq. 2.5).
Obviamente, para efetuação dos cálculos de α e D foi necessário obter a concentração de 2-
HBF na fase rica em PEG (CPEG). Os procedimentos necessários para a execução de cada
experimento são similares àqueles descritos no Tópico 2.3.3 e as condições iniciais da Tabela
4.1 foram definidas com base no trabalho de PADILHA et al. (2017a). As análises dos
planejamentos experimentais, a análise de regressão bem como os gráficos de superfície de
resposta foram realizados usando STATISTICA 7.0 (Statsoft, USA).
4.3.4. Comparação entre as técnicas de separação
Neste estudo o sistema FSAB foi comparado com a ESAB, SS e ELL. Nos
experimentos FSAB e SS, 100 mL da solução salina contendo 2-HBF foram extraídos por
12,5 mL da solução PEG 400 e 12,5 mL da mistura de n-butanol e acetato de etila 1:1 (v/v),
respectivamente. Nestes experimentos, a vazão de ar foi fixada em 37,5 mL/min, enquanto
que o tempo de flotação foi de 120 min. Por sua vez, os experimentos ESAB e SS, 8,0 mL da
solução salina de 2-HBF foram adicionados em tubos de centífuga contendo 2,0 mL da
solução de PEG 400 e 2,0 mL da mistura de n-butanol e acetato de etila 1:1 (v/v),
respectivamente. Os tubos foram agitados em vórtex, centrifugados a 2100 x g e as fases
foram coletadas. Em todos os ensaios a concentração de sulfato de amônio foi 425 g/L, o pH
inicial da fase aquosa foi 4,0 e a concentração inicial de 2-HBF na fase aquosa foi 75 μg/mL.
Particularmente, o percentual de PEG na fase orgânica foi fixado em 80,0% (m/m) nos
ensaios FSAB e ESAB.
4.3.5. Determinação do 2-HBF e análise por CLAE
A quantificação de 2-HBF nos ensaios com soluções modelo foi realizada por leitura
direta por meio da espectroscopia UV (comprimento de onda igual a 252 nm). De modo a
reduzir os efeitos do pH, sal e PEG na análise, diluições foram preparadas com tampão fosfato
20 mM (pH 7,0) e as concentrações foram obtidas através de uma curva de calibração.
Nos ensaios FSAB com caldo fermentado obtido da dessulfurização, a concentração
de 2-HBF foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) modelo
Accela (Thermo Scientific, USA) provido de detector por arranjo de diodo (operado em 278
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 96
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nm) e amostrador automático. Foi utilizada a coluna Hypersil GOLD RP-C18 com dimensões
de 50 x 2,1 mm (Thermo Scientific, USA), e uma solução contendo 50% de acetonitrila e
50% água deionizada como fase móvel, sob fluxo de 0,9 mL/min a 25 oC. Todas as amostras
foram filtradas com membrana 0,22 µm e analisadas em três replicatas. A seguir são
apresentados o cromatograma de CLAE a 75 μg/L de 2-HBF (Figura 4.2A) e sua curva de
calibração (Figura 4.2B) para determinar a concentração do biocida no caldo de fermentação.
Figura 4.2. Cromatogramas de CLAE 75 μg/L de 2-HBF (A) e curva de calibração (B).
Fonte: Próprio autor.
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 97
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4.4. Resultados e discussões
4.4.1. Triagem das variáveis FSAB
Em virtude do elevado número de fatores que afetam a FSAB, a identificação das
variáveis mais significativas é fundamental na busca pelo desempenho ótimo do processo de
separação. Desta forma, um planejamento fracionário 26-1
com adição de quatro repetições no
ponto central foi usado para a triagem das variáveis FSAB sobre os valores de eficiência de
separação (E%). Os fatores deste planejamento foram: pH da fase aquosa, concentração de
sulfato de amônio, concentração inicial de 2-HBF, vazão de ar, tempo de flotação e volume
inicial da fase PEG. Os limites superiores e inferiores das variáveis FSAB foram definidos de
acordo com estudos prévios da literatura (BI et al., 2009a; BI et al., 2010b; LI & DONG,
2010; PADILHA et al., 2017). Na Tabela 4.2 são mostrados os 36 ensaios do planejamento
meia fração com três níveis de cada variável independente e os correspondentes valores de
E%. Como pode ser observado, a combinação dos fatores afetou fortemente o desempenho do
processo, com valores de E% que compreendem de 27,48% (Ensaio 4) até 54,83% (Ensaio
29).
Considerando o nível de confiança de 95% (p < 0,05), as variáveis da FSAB que mais
impactaram os valores de E% foram: X5 (tempo de flotação), X4 (vazão de ar), X6 (volume
inicial da fase orgânica), X3 (concentração inicial de 2-HBF) e X1 (pH da fase aquosa), como
ilustrado na Figura 4.3. Neste diagrama de Pareto é observado que os efeitos dos quatro
primeiros fatores foram positivos, enquanto que o efeito do último fator foi negativo. Por
outro lado, o efeito da variável X2 (concentração de sulfato de amônio) não foi significativo
sobre o desempenho da FSAB usando o critério estatístico proposto. Algumas justificativas
para tais efeitos são reportadas na literatura, sendo detalhadas a seguir.
O uso mais prolongado da flotação assegura o contato entre o sublado e as bolhas
ascendentes, o que possibilitou alcançar maiores valores de E% (HAN et al., 2014). Também
favoráveis ao desempenho da FSAB são os aumentos na vazão de ar e no volume inicial da
fase orgânica, já que permitem respectivamente a intensificação da adsorção do sublado nas
bolhas e sua maior solvatação na camada topo (BI et al., 2009a; MA et al., 2010; LIN et al.,
2015). No que diz respeito à concentração inicial de sublado, LEMLICH (1968) sugeriu o uso
de soluções muito diluídas em técnicas de separação baseadas em adsorção em bolhas.
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 98
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Tabela 4.2 - Matriz do planejamento fatorial fracionário 26-1
com o percentual de eficiência de
separação como resposta.
Ensaio
no. X1 X2 X3 X4 X5 X6 E%
1 (34) -1 -1 -1 -1 -1 -1 30,26
2 (21) 1 -1 -1 -1 -1 1 35,98
3 (33) -1 1 -1 -1 -1 1 39,91
4 (26) 1 1 -1 -1 -1 -1 27,48
5 (11) -1 -1 1 -1 -1 1 35,59
6 (36) 1 -1 1 -1 -1 -1 28,25
7 (35) -1 1 1 -1 -1 -1 36,40
8 (1) 1 1 1 -1 -1 1 38,27
9 (15) -1 -1 -1 1 -1 1 42,30
10 (10) 1 -1 -1 1 -1 -1 34,05
11 (20) -1 1 -1 1 -1 -1 38,73
12 (19) 1 1 -1 1 -1 1 40,49
13 (4) -1 -1 1 1 -1 -1 39,73
14 (9) 1 -1 1 1 -1 1 38,70
15 (18) -1 1 1 1 -1 1 44,98
16 (32) 1 1 1 1 -1 -1 36,70
17 (27) -1 -1 -1 -1 1 1 39,83
18 (8) 1 -1 -1 -1 1 -1 31,89
19 (12) -1 1 -1 -1 1 -1 40,94
20 (29) 1 1 -1 -1 1 1 40,35
21 (3) -1 -1 1 -1 1 -1 45,70
22 (16) 1 -1 1 -1 1 1 48,77
23 (30) -1 1 1 -1 1 1 43,73
24 (17) 1 1 1 -1 1 -1 39,87
25 (28) -1 -1 -1 1 1 -1 40,94
26 (7) 1 -1 -1 1 1 1 44,55
27 (25) -1 1 -1 1 1 1 45,12
28 (6) 1 1 -1 1 1 -1 42,09
29 (13) -1 -1 1 1 1 1 54,83
30 (24) 1 -1 1 1 1 -1 46,17
31 (5) -1 1 1 1 1 -1 48,39
32 (23) 1 1 1 1 1 1 47,87
33 (31) 0 0 0 0 0 0 40,99
34 (2) 0 0 0 0 0 0 42,92
35 (14) 0 0 0 0 0 0 41,36
36 (22) 0 0 0 0 0 0 40,62
Fonte: Próprio autor
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 99
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No capítulo 2 foi reportado que o efeito da concentração de ácido gálico (sublado) não
obedeceu necessariamente às observações dos trabalhos anteriores. Neste estudo, os melhores
resultados de E% foram obtidos no maior nível de concentração de 2-HBF (75 mg/L).
O pH tem um papel fundamental no desempenho da FSAB, uma vez que atua na
solubilidade do sublado na fase aquosa (LU & ZHU, 2001; BI et al., 2010a; BI et al., 2013;
CHANG et al., 2014; CHANG et al., 2015). O 2-HBF é um componente de superfície ativa
que possui um grupamento hidroxila, o qual pode ser ionizável em ambientes álcalis,
tornando-o menos susceptível ao transporte para a fase orgânica. Por fim, a concentração de
sal na fase aquosa afeta a estabilidade do sublado devido ao efeito salting-out (MA et al.,
2010; ZHAO et al., 2011; BI et al., 2013). Contudo, na faixa de concentração de sulfato de
amônio usada neste trabalho (425-475 g/L), não foi possível observar qualquer influência do
sal sobre o processo.
Figura 4.3. Efeitos das variáveis FSAB no planejamento fatorial fracionário sobre o
percentual de eficiência de separação.
Fonte: Próprio autor.
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 100
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4.4.2. Planejamento Box-Behnken
Como resultado, outra investigação foi realizada usando as três variáveis mais
relevantes (vazão de ar, tempo de flotação e volume inicial da fase orgânica) a partir do
planejamento Box-Behnken. Nesta etapa, as variáveis antes codificadas por X4, X5 e X6 foram
chamadas de X1’, X2’ e X3’. Além disso, devido aos efeitos positivos provocados por estas
variáveis no planejamento de meia-fração, novos níveis de estudo foram definidos no BBD,
como pode ser observado na Tabela 4.3. As demais variáveis da FSAB foram fixadas também
com base no planejamento anterior. Assim, o pH da fase aquosa e a concentração inicial de
sublado foram mantidos em 4,0 e 75 mg/L, respectivamente. Por não apresentar efeito
significativo e visando reduzir o gasto excessivo com sal no processo, a concentração de
sulfato de amônio de 425 g/L foi usada nos experimentos seguintes.
Tabela 4.3 - Valores das variáveis FSAB e seus níveis no planejamento Box-Behnken
Variáveis Variáveis
codificadas
Níveis codificados
-1 0 +1
Vazão de ar (mL/min) X1’ 25,0 37,5 50,0
Tempo de flotação
(min) X2’ 60 90 120,0
Volume inicial da fase
rica PEG (mL) X3’ 7,5 10,0 12,5
Na Tabela 4.4 são mostrados os 15 ensaios do BBD com três níveis de cada variável
independente e suas correspondentes respostas. A análise de variância (ANOVA) foi realizada
na matriz BBD e expressões polinomiais de segundo grau foram geradas para descrever E%
(Eq. 5), α (Eq. 6) e D (Eq. 7), com base nas variáveis codificadas.
' '2 ' '2 '1 1 2 2 3% 0,556 0,08850,520 1,476 1,862 3,822E X X X X X
(5)
'2 ' ' ' ' ' '3 1 2 1 3 2 30,175 0,180 0,4591,491X X X X X X X
' '2 ' '2 '1 1 2 2 30,014,897 0,153 0,042 0,179 0,784X X X X X
(6)
'2 ' ' ' ' ' '3 1 2 1 3 2 30,002 0,037 0,0040,038X X X X X X X
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 101
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' '2 ' '2 '1 1 2 2 30,0439,788 0,219 0,213 0,731 0,801D X X X X X
(7)
'2 ' ' ' ' ' '3 1 2 1 3 2 30,056 0,007 0,1060,413X X X X X X X
A ANOVA mostrou a significância estatística dos modelos de regressão a 95% de
confiança (p < 0,05), com valores de Fcal/Ftab iguais a 10,12 (for E%) e 8,03 (for D). No caso
de α, a probabilidade de erro é inferior a 0,01%, uma vez que o valor de Fcal foi 456,09.
Apesar disto, foi observado que a falta de ajuste não foi significativa em relação ao erro puro
apenas nos modelos de E% e α, enquanto que em D o valor de Fcal/Ftab foi superior a 1,0 (falta
de ajuste p = 0,048). Isto não confere ao modelo de D a característica preditiva, embora não
elimine sua importância, que também pode ser mostrada através dos coeficientes de
determinação (R2). Os valores de R
2, como medida de ajuste do modelo, indicaram que
98,8%, 99,1% e 98,5% das variâncias totais podem ser explicadas pelos modelos de regressão
de E%, α e D, respectivamente.
Tabela 4.4 - Matriz do planejamento Box-Behnken com três fatores. O pH da fase aquosa, a
concentração de sal e a concentração inicial de sublado foram fixados em 4,0, 425 g/L e 75
mg/L, respectivamente.
Run no. X1’ X2’ X3’ E% α D
1 (15) -1 -1 0 50,15 4,64 9,21
2 (6) 1 -1 0 49,75 4,97 9,90
3 (13) -1 1 0 53,53 4,96 10,55
4 (14) 1 1 0 52,43 5,30 11,01
5 (9) -1 0 -1 45,38 5,53 10,02
6 (12) 1 0 -1 43,55 5,88 10,31
7 (3) -1 0 1 53,41 4,02 8,53
8 (5) 1 0 1 52,30 4,22 8,85
9 (8) 0 -1 -1 46,24 5,38 9,89
10 (10) 0 1 -1 49,74 5,78 11,38
11 (11) 0 -1 1 52,22 3,84 7,95
12 (7) 0 1 1 57,55 4,23 9,86
13 (2) 0 0 0 54,60 4,92 10,72
14 (4) 0 0 0 54,83 4,90 10,71
15 (1) 0 0 0 54,35 4,90 10,62
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 102
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Gráficos de superfície de resposta e de contorno (Fig. 4.4) foram construídos para
estudar as interações entre dois fatores e determinar os níveis ótimos para cada uma das
respostas. Em concordância com os valores de R2, observa-se que os dados experimentais
estão próximos das curvas de superfície para as três respostas. No que diz respeito aos efeitos
das variáveis independentes, é exibido na Fig. 4.4A que o aumento combinado do volume
inicial da fase PEG e do tempo de flotação contribui para maiores índices de E%. Na Fig.
4.4B é mostrado o comportamento de α como função do volume inicial de PEG e da vazão de
ar.
Figura 4.4. Superfície de respota e gráficos de contorno para eficiência de separação (A),
coeficiente de concentração (B) e razão de distribuição (C) de 2-HBF sob efeitos de duas
variáveis FSAB. A outra variável foi mantida no nível codificado igual a zero.
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 103
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Fonte: Próprio autor.
Assim como na seção anterior, a adição do solvente hidrofílico favoreceu a captura do
2-HBF, mas provocou a redução severa da concentração do sublado. Alternativamente, a
aplicação de vazões de ar baixas como 25 mL/min não favoreceu o aumento da concentração
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 104
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
de 2-HBF na camada topo. Além disso, não foram observadas diferenças nos valores de α
obtidos no nível superior (50 mL/min) e no ponto central (37,5 mL/min). Similarmente a α, os
valores de D decrescem com o aumento do volume inicial de PEG. O valor máximo de D
(11,38) é obtido no nível inferior do volume de PEG e no nível superior no tempo de flotação
como ilustrado na Fig. 4.4C. Usando como critério apenas os valores de E%, na etapa
seguinte foram mantidos a vazão de ar, tempo de flotação e volume inicial de PEG em 37,5
mL/min, 120 min e 12,5 mL, respectivamente (Ensaio 12 da Tabela 3.4).
4.4.3. Experimentos de comparação
Sob condições ótimas, a FSAB foi comparada com a ESAB, SS e ELL para
recuperação e concentração de 2-HBF a partir de uma solução modelo. Na Figura 4.5 é
mostrado que a eficiência de separação da FSAB (E% = 57,55 ± 0,65) foi sensivelmente
superior a ESAB (E% = 42,66 ± 2,37), ELL (E% = 33,69 ± 1,63) e SS (29,56 ± 1,27). Este é
um resultado surpreendente, uma vez que em trabalhos prévios com componentes fenólicos
(BI et al., 2009a; BI et al., 2010b; BI et al., 2013; PADILHA et al., 2017b) é mostrado que a
ESAB sempre supera a FSAB em termos de E%. Isto indica que a intensificação do processo
promovida pela adsorção nas bolhas é fundamental para o bom desempenho da FSAB na
recuperação do 2-HBF. Obviamente, a baixa razão volumétrica (vPEG/vw) usada na FSAB
possibilitou valores de coeficiente de concentração e distribuição (α = 4,23 ± 0,00; D = 9,86 ±
0,26) expressivamente maiores do que outras técnicas (ESAB: α = 1,60 ± 0,12; D = 2,88 ±
0,33; SS: α = 3,60 ± 0,15; D = 5,12 ± 0,31; ELL: α = 1,26 ± 0,06; D = 1,96 ± 0,12).
4.4.4. Recuperação e concentração de 2-HBF obtido da biodessulfurização do 4-
MDBT
De modo a avaliar a viabilidade da recuperação do 2-HBF pela FSAB envolvendo
uma solução complexa, um caldo de fermentação obtido da biodessulfurização do 4-MDBT
foi usado. A exceção da concentração inicial do sublado, as condições operacionais usadas
foram as mesmas definidas pela metodologia multivariada. Segundo a análise por CLAE, a
concentração de 2-HBF no caldo de fermentação foi de 87,29 mg/L.
Após a flotação, foram obtidos os valores de E%, α e D equivalentes a 49,62 ± 0,29,
3,39 ± 0,00 e 6,29 ± 0,01. Esta redução do desempenho da FSAB em relação aos
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 105
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
experimentos com solução modelo pode ser atribuída à maior polaridade dos contaminantes, o
que interferiu na transferência de massa do 2-HBF. Como pode ser observado na Figura 4.6,
dois picos são registrados nos cromatogramas de CLAE, sendo o primeiro e de maior
intensidade pertencente aos contaminantes e o último pico pertencente ao 2-HBF. Baseado
nas escalas de absorbância dos gráficos, conclui-se que uma grande quantidade de
contaminantes migrou para a fase topo juntamente com o sublado desejado (Figura 4.6C).
Atentamos-nos que na literatura ligada a essa técnica de separação, a aplicação da FSAB
formada por PEG/sulfato de amônio também permitiu a captura de contaminantes advindos
do extrato como em BI et al. (2010b) e CHANG et al. (2014). Apesar disto, não houve
alteração expressiva do tempo de residência do pesticida em relação ao padrão (Figura 4.2A)
bem como o DPR da análise por CLAE foi diminuto, no valor de 2,57%. Mesmo com a baixa
seletividade do sistema proposto, nós consideramos que a FSAB mostrou-se uma técnica em
potencial para recuperação e concentração de 2-HBF a partir de misturas reais.
Figura 4.5. Comparação de desempenho de diferentes métodos de separação. FSAB, vo/vw
=1:8; ESAB, vo/vw =1:4; SS, vo/vw =1:8; ELL, vo/vw =1:4. As letras minúsculas a, b, c e d são
usados para comparação de desempenho entre FSAB, ESAB, SS e ELL; valores com a
mesma letra não são significativamente diferentes entre si (p < 0,05).
Fonte: Próprio autor.
Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 106
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
Figura 4.6. Cromatogramas CLAE para o caldo de fermentação anterior ao processo de
flotação (A), fase rica em sal após a FSAB (B) e fase rica em PEG após a FSAB (C).
Fonte: Próprio autor.
4.5. Conclusões
Neste trabalho o sistema PEG/sulfato de amônio foi usado no estudo da FSAB para
recuperação e concentração de 2-HBF. A partir da metodologia multivariada, as condições
ótimas da FSAB foram: pH da fase aquosa igual a 4,0, concentração de sulfato de amônio
igual a 425 g/L, concentração inicial de sublado igual a 75 mg/mL, vazão de ar igual a 37,5
mL/min, tempo de flotação de 120 min e volume inicial da fase PEG igual a 12,5 mL. Além
disso, a FSAB mostrou maior desempenho em termos de E%, α e D do que ESAB, SS e ELL.
Usando o caldo de fermentação, o processo conseguiu bons índices na captura do 2-HBF,
embora uma quantidade significativa de contaminantes também tenha migrado para a fase rica
em PEG. De forma geral, a FSAB é uma técnica simples e de baixo custo com resultados
satisfatórios no contexto da análise e detecção do 2-HBF.
Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado
CONCLUSÕES GERAIS
Concluisões gerais 108
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Conclusões gerais
A renovação da sublação por solvente pela incorporação do sistema aquoso bifásico
tem garantido à técnica um maior leque de aplicações em potencial. Nos experimentos da
FSAB com ácido gálico e polifenóis do resíduo de camu-camu buscou-se maximizar as
respostas através da manipulação univariada das condições experimentais bem como
estabelecer os limites de operação da técnica. Em contraste, uma metodologia multivariada foi
aplicada para realizar a triagem das variáveis mais significativas e otimizar a FSAB para
recuperação e concentração do 2-HBF. Sob condições ótimas, os valores de E%, e D da
FSAB com ácido gálico foram 81,62, 4,76 e 26,94, respectivamente; enquanto que os valores
de E%, e D da FSAB com polifenóis do resíduo de camu-camu foram obtidos na seguinte
ordem: 81,02, 5,21 e 27,56. Por outro lado, os experimentos conduzidos com 2-HBF foi
possível alcançar apenas os valores de eficiência de separação de 57,55%, coeficiente de
concentração de 4,23 e coeficiente de distribuição de 9,86. Tal disparidade de desempenho
entre os experimentos pode ser atribuída à baixa polaridade do 2-HBF, ocasionando em uma
baixa solubilidade do pesticida na solução aquosa de PEG. Quando a FSAB foi comparada
com outros métodos extrativos, a referida técnica apresentou resultados surpreendentes para
ambos sublados não apenas em termos de enriquecimento, mas também em eficiência de
separação. Apesar dos benefícios apresentados, a seletividade reduzida do sistema
PEG/sulfato de amônio foi vista como ponto negativo. Como pode ser observado nos
cromatogramas para ambas as aplicações, contaminantes dos meios complexos migraram
intensamente da fase fundo para a fase topo. O caso mais grave foi para a biodessulfurização
do 4-MDBT, uma vez que a concentração do contaminante foi bem superior à concentração
do 2-HBF, o produto-alvo. De forma a superar esse obstáculo, em trabalhos futuros
buscaremos inserir seletores na fase topo e/ou substituir o sistema de aquoso bifásico
convencional por outros tipos mais vantajosos. Outra atrativa vertente para a técnica é sua
integração com processos fermentativos. A baixa miscibilidade entre as fases e a passagem de
gás pelo sistema abrem a possibilidade de se obter produtos microbianos via sublação com
solvente, contanto que as células e produtos tenham preferência por fases diferentes. Ainda
assim, consideramos que o presente trabalho contribuiu para a pesquisa voltada ao
downstream processing e que a FSAB é uma alternativa promissora na recuperação e
concentração de componentes fenólicos provenientes de extratos naturais e caldos de
fermentação.
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