i

LÍDIA DORNELAS DE FARIA

TERAPIA POR ONDAS DE CHOQUE

ELETROHIDRÁULICAS AUMENTA A ATIVIDADE DA

ERK-1/2 E Akt EM TÍBIAS ÍNTEGRAS DE RATOS

POR 21 DIAS APÓS ESTÍMULO INICIAL

CAMPINAS

2015

ii

iii

Universidade Estadual de Campinas

Faculdade de Ciências Médicas

LÍDIA DORNELAS DE FARIA

TERAPIA POR ONDAS DE CHOQUE ELETROHIDRÁULICAS

AUMENTA A ATIVIDADE DA ERK-1/2 E Akt EM TÍBIAS ÍNTEGRAS

DE RATOS POR 21 DIAS APÓS ESTÍMULO INICIAL

Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas, como parte dos requisitos

exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, área de concentração

em Fisiopatologia Cirúrgica

Orientadora: Prof. Dr. William Dias Belangero

CAMPINAS

2015

Este exemplar corresponde à versão final da dissertação

defendida pela aluna LÍDIA DORNELAS DE FARIA e

orientada pelo PROF. DR. WILLIAM DIAS BELANGERO

Assinatura do Orientador

IV

V

VI

vii

RESUMO

A Terapia por ondas de choque (TOC) é uma alternativa não invasiva utilizada

como método de indução a formação óssea que consiste em pulsos sonoros de

alta energia transmitidas de modo focal a um tecido específico.

Artigos demonstram aumento de vascularização, que ativação de proteínas como

BMP (bone morphogenic protein) e Erk (extracellular signal-regulated kinase)

induzindo diferenciação osteogênica após sua utilização no tecido ósseo.

O presente estudo visou avaliar os níveis das proteínas Erk e Akt

(akutely transforming), envolvidas na cascata protéica responsiva a deformação

celular gerada por estímulo mecânico e consequente transformação em estímulo

bioquímico induzindo a osteogênese.

Os animais selecionados para o estudo foram anestesiados e divididos em

dois diferentes grupos, onde no dia 1, o primeiro grupo foi submetido a TOC em

sessão única de 500 impulsos gerados por aparelho eletrohidráulico a

0,12mJ/mm² na tíbia intacta e o segundo não recebeu TOC. Na sequência,

os animais foram divididos em 3 subgrupos para cada tempo de segmento de

7, 14 e 21 dias

A determinação dos níveis das proteínas propostas foi realizada por meio de

immunoblotting. A fosforilação das proteínas Erk e Akt dos tecidos ósseos das

tíbias extraídas dos ratos aumentou nos grupos submetidos a TOC após

7, 14 e se manteve elevado até o 21° dia quando comparado ao controle.

viii

ix

ABSTRACT

Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) is a non-invasive alternative used as a

method for inducing bone formation that consists of high-energy acoustic pulses

transmitted in a focal way to a specific tissue. Studies show increase in

vascularization and expressions of angiogenic growth factors which activate

proteins such as BMP (bone morphogenical protein) and Erk (extracellular

signal-regulated kinase), inducing osteogenic differentiation after its use in the

bone tissue.

The present study aimed at evaluating the levels of Erk and Akt (acutely

transforming) proteins involved in the protein cascade responsive to cell

deformation in biochemical stimulus inducing osteogenesis.

Thirty male Wistar rats were selected randomly and divided in two different groups.

The control group received anesthesia and the treated group was submitted to

anesthesia and shock wave therapy in a single 500 pulse-session generated by an

electrohydraulic device at 0,12mJ/mm² in intact tibia and fibula and the second did

not receive ESWT. Then the animals were divided into 3 sub-groups, one for each

segment times of 7, 14 and 21 days.

Immunoblotting analysis was performed to determine the levels of the proposed

proteins. The Erk and Akt protein phosphorylation of the bone tissues of extracted

tibia from the animals increased in the groups submitted to ESWT and kept

elevated until the 21st day when compared to the control group.

x

xi

SUMÁRIO

Pág.

RESUMO...................................................................................................... vii

ABSTRACT.................................................................................................. ix

DEDICATÓRIA............................................................................................ xiii

AGRADECIMENTOS................................................................................... xv

LISTA DE FIGURAS.................................................................................... xvii

LISTA DE TABELA..................................................................................... xix

LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................... xxi

1- INTRODUÇÃO......................................................................................... 1

1.1- Tecido ósseo - Composição.......................................................... 1

1.1.1- Matriz Óssea.......................................................................... 2

1.1.2- Células ósseas....................................................................... 3

1.2- Formação óssea.............................................................................. 5

1.2.1- A célula mecanosensora........................................................ 6

1.2.2- Mecanotransdução................................................................. 10

1.2.3- Integrinas e quinase de adesão focal (Fak)........................... 12

1.3- As vias das proteínas Erk e Akt.................................................... 12

1.4- Terapia por ondas de choque....................................................... 14

1.4.1- Princípios da geração das ondas de choque........................ 15

1.4.2- Aplicabilidade em patologias ósseas..................................... 15

xii

2- OBJETIVOS............................................................................................. 18

2.1- Geral................................................................................................. 18

2.2- Específico........................................................................................ 18

3- MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ 19

3.1- Animais............................................................................................ 19

3.2- Métodos........................................................................................... 20

3.2.1- Estímulo por ondas de choque............................................... 20

3.2.2- Extração do tecido ósseo....................................................... 21

3.3- Immunoblotting............................................................................... 23

3.3.1- Expressão das proteínas totais e fosforiladas (Erk e Akt)

envolvidas no processo de mecanostransdução do tecido

ósseo.....................................................................................

23

3.3.1.1- Eletroforese.............................................................. 23

3.3.1.2- Immunoblotting......................................................... 25

3.4- Análise Estatística......................................................................... 26

4- RESULTADOS........................................................................................ 27

4.1- Expressão das proteínas totais e fosforiladas (Erk e Akt)

envolvidas na sinalização do estímulo mecânico nos ossos

das tíbias........................................................................................

27

5- DISCUSSÃO............................................................................................ 31

6- CONCLUSÕES........................................................................................ 36

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 37

8- ANEXOS.................................................................................................. 44

xiii

Aos meus pais,

Dirceu e Rosa Maria

pelo amor incondicional.

Ao meu namorado

sempre presente,

Sandro

por todo apoio e compreensão,

Ao meu irmão,

Diego

pela amizade.

Aos animais,

minha fonte de inspiração.

xiv

xv

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por me proporcionar saúde e

sabedoria durante as horas de estudo.

Ao meu orientador, Dr. William pela confiança, oportunidade e

ensinamentos de realizar o mestrado e colaboração neste trabalho.

À grande amiga, Juliana Vecina pela amizade, acolhimento, paciência e

disposição em me ensinar e ajudar a qualquer momento, além dos conselhos e

incansáveis horas de laboratório.

A Capes pela bolsa concedida para que o projeto fosse realizado com

sucesso.

À Nilza, grande amiga e companheira, fundamental para que esse

trabalho pudesse ser realizado durante todos os momentos dessa jornada.

Alexandre Gabarra pelos ensinamentos e incentivos.

Ao Dr. Mário Abdalla Saad pela disponibilidade de sua estrutura de

laboratório e auxílio de seus alunos durante o experimento.

Ao Mariolani, pelo convívio e ajuda profissional.

Ao amigo Vinícius Gusmão por ter me passado sua experiência e ajuda

no processo do presente estudo.

A grande amiga Valéria, incentivadora do meu ingresso na Unicamp.

Ao meu namorado e grande incentivador de todas as horas, Sandro.

Pela paciência nos momentos de ausência e apoio incondicional nesse trabalho.

Aos meus pais pelo dom da vida e por terem me proporcionado amparo

emocional e estabilidade para que eu pudesse prosseguir em meus sonhos.

xvi

xvii

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1 Esquema representativo das células ósseas (Junqueira e

Carneiro, 2004)........................................................................

4

Figura 2 Esquema ilustra a amplificação do estímulo mecânico.......... 9

Figura 3 Esquema da disposição das integrinas.................................... 11

Figura 4 Representação esquemática do desenho do estudo............. 14

Figura 5 Procedimento onda de choque: (a) aparelho de onda de

choque (b) procedimento de terapia de onda de choque na

tíbia no rato sob anestesia.......................................................

19

Figura 6 Procedimento de extração ósseo: (a) osso da tíbia e fíbula

extraídos (b) adição do nitrogênio líquido (c) masseração do

osso (d) osso masserado (e) masseração no cadinho

(f) politronagem do material masserado com Triton.................

20

Figura 7 Esquema representativo do processo de pipetagem do gel

de acrilamida, seguido da eletroforese e transferência para a

membrana de nitrocelulose, adição dos anticorpos dos

anticorpos e por fim representação após procedimento de

revelação.................................................................................

22

Figura 8 Gráficos e Blots demonstram a fosforilação em tecido ósseo

de pAkt e Akt em 7, 14 e 21 dias..............................................

26

Figura 9 Gráficos e Blots demonstram a fosforilação em tecido ósseo

de pErk e Erk em 7, 14 e 21 dias.............................................

29

xviii

Figura 10 Efeito do estímulo mecânico produzido pela terapia por

ondas de choque, onde Blots representativos demonstram a

fosforilação em tecido ósseo de pErk Os resultados

representam a média ± DP de 5 animais/grupo.......................

30

xix

LISTA DE TABELA

Pág.

Tabela 1 Apresentação dos valores numéricos da medida em pixels da

densitometria óptica das diferentes bandas e suas

respectivas médias e desvio padrão.........................................

28

xx

xxi

LISTA DE ABREVIATURAS

Akt Akutely transforming

AMPc Monofosfato cíclico de adenosina

ANOVA Análise de variância

ATP Adenosina trifosfato

BMP Bone morphogenic protein

BMP-2 Bone morphogenic protein-2

CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica

CEUA/IB Comissão de Ética em Experimentação Animal

DP Desvio padrão

Erk Extracellular signal-regulated kinase

Fak Quinase de adesão focal

FCM Faculdade de Ciências Médicas

FDA Food and Drug Administration

GC Grupo controle

GT Grupo tratado

IGF-1 insuline-like growth factor

ip Intra peritoneal

xxii

JNK c-Jun amino (N)-terminal kinases

kDa Kilo Daltons

LICRI Laboratório de Investigação Clínica de Resistência à Insulina

MAPK Mitogen-activated protein kinase

MEC Membrana extracelular

MPa Mega Pascals

NF-κB Fator nuclear kappa B

NO Óxido nítrico

PCR Polymerase chain reaction

PGE Prostaglandina

PI3K Fosfoinositídeo 3-quinase

RAKNL Receptor de ativação do fator nuclear kappa B

Tc-DPD Technetium 3.3-diphosphono-1.2-propandicarbon acid

TGF-β1 Fator de transformação de crescimento β1

TOC Terapia por ondas de choque

USbp Ultrassom de baixa potência

VEGF vessel endothelial growth factor

1

INTRODUÇÃO

O osso apresenta como principal função o suporte da carga do corpo, é

responsável também por proteção dos órgãos, armazenar cálcio, nutrientes e

realizar hematopoiese por ter em seu interior a medula óssea, responsável pela

produção das células vermelhas do sangue (Ham, 1983, Carvalho, 2003,

Junqueira e Carneiro, 2004), fatores endógenos como hipotiroidismo (Chow et al.,

1997), tumores (Marx, 1997), osteoporose e o desbalanço nos níveis de cálcio,

podem interferir no metabolismo do tecido ósseo (Frost, 1973, Oliveira, 2003,

Coleman, 2006, Hughes e Petit, 2010)

O osso responde dinamicamente as alterações da carga mecânica,

sendo, portanto o fundamental mecanismo para que ocorram a formação e a

degradação ósseas balanceadas em formato e micro arquitetura (Duncan e

Turner, 1995, Marx, 1997, Carvalho, 2003, Oliveira e Guimarães, 2003) .

1.1- Tecido ósseo - Composição

O tecido ósseo maduro é classificado como um tecido conjuntivo

especializado constituído por células e uma matriz extracelular mineralizada,

a matriz óssea e suas duas principais formas são imaturo (não lamelar) ou maduro

(lamelar). O esqueleto embrionário é formado pelo osso membranoso, o qual

persiste até a idade dos 4 anos e também em calo ósseo de fraturas de adultos e

crianças. Os ossos longos como o fêmur e tíbia e os chatos que são os ossos do

crânio e escápula são os dois tipos presentes na estrutura do corpo humano

(Marx, 1997, Oliveira e Guimarães, 2003, Gartner e Hiatt, 2007, Young et al.,

2007).

O osso longo é composto pelas epífises, localizadas em suas

extremidades as quais são recobertas por cartilagem e logo abaixo, as metáfises

que durante a fase de crescimento possuem cartilagem de crescimento. A região

2

epífise-metafisária é composta por osso trabecular ou esponjoso, que consiste em

uma rede de finas pontes ósseas chamadas trabéculas, sendo essa, uma região

rica em tecido medular hematopoiético e de intensa atividade metabólica

(Gartner e Hiatt, 2007).

Entre as metáfises, há uma porção chamada diáfise ou corpo do osso,

por onde passa o canal medular, região essa que é formada por osso cortical e é

externamente revestida pelo periósteo e internamente por tecido mesenquimal

chamado endósteo. No interior das diáfises há uma rede de condutos para os

vasos sanguíneos, nutrientes e nervos, denominados canais de Havers,

dispostos longitudinalmente e os canais de Volkman transversalmente

(Marx, 1997, Oliveira e Guimarães, 2003, Gartner e Hiatt, 2007, Young et al.,

2007).

1.1.1- Matriz óssea

A matrix extracelular é formada por duas partes, a inorgânica e a

orgânica. A porção inorgância corresponde a 65% do peso seco total do osso e é

constituída por bicarbonato, citrato, magnésio, sódio e potássio,

mas por principalmente, cálcio e fósforo em formato de cristais de hidroxiapatita

Ca10(PO4)6(OH)2 (Gartner e Hiatt, 2007). O componente orgânico é composto por

95% de colágeno tipo I e pequenas quantidades de glicoproteínas e

proteoglicanos, sendo em sua totalidade, constituinte de 35% do peso seco do

tecido (Gartner e Hiatt, 2007). A associação da hidroxiapatita com o colágeno é o

que torna o osso elástico e resistente (Marx, 1997).

O tecido ósseo apresenta em sua composição os canais de Havers,

e perpendicularmente a eles, os espaços vasculares chamados canais de

Volkmann. Cada canal haversiano possui osteoblastos em sua periferia interna e

abriga células osteoprogenitoras (Gartner e Hiatt, 2007). O osso apresenta em sua

estrutura uma grande quantidade de canalículos, os quais são responsáveis pela

3

nutrição e troca de íons entre a corrente sanguínea e os osteócitos,

as células mais numerosas nesse tecido (Junqueira e Carneiro, 2004).

1.1.2- Células ósseas

Os osteoblastos se localizam de forma perfilada na superfície óssea,

onde assumem aparência cuboide e possuem intensa atividade de síntese da

porção orgânica e de mineralização da matriz óssea, possuem grande importância

na formação óssea por meio da produção da fosfatase alcalina e osteocalcina.

No entanto quando sua atividade é diminuída, assumem a forma achatada e são

aprisionados pela matriz óssea dando origem aos osteócitos (Figura 1) (Oliveira e

Carvalho, 2003, Junqueira e Carneiro, 2004). Os osteócitos são células pequenas

e estreladas, as quais comunicam entre si por meio de prolongamentos

citoplasmáticos delgados em diversas direções localizados em lacunas na matriz

óssea, apresentam pouca atividade metabólica, mas importante papel na

manutenção óssea por emitirem sinais entre si quando o osso é submetido ao

estresse mecânico (Marx, 1997, Oliveira e Carvalho, 2003).

4

Figura 1- Osteoblastos localizados na periferia do canalículo sintetizam a matriz

orgânica (em sua maioria colágeno tipo I), após a mineralização da

matriz óssea, dão origem aos osteócitos. Os osteoclastos se encontram

na periferia da matriz óssea (Junqueira e Carneiro, 2004).

Os osteoclastos são as células responsáveis pela reabsorção da matriz

óssea dos osteócitos, devido as vilosidades para o transporte iônico presentes em

sua estrutura, onde há concentração de anidrase carbônica, ajuda a acidificar a

superfície, induzindo a reabsorção e apoptose dos osteócitos, dessa forma,

novos osteblastos são gerados (Ham, 1983, Marx, 1997, Carvalho, 2003).

Segundo Hughes e Petit (2010), o osteócito é a principal célula óssea

capaz de responder ao estímulo mecânico, pois apresenta receptores em formato

de cílios que são mecanosensíveis, tendo papel fundamental na renovação

celular. Há quarenta anos, com o auxílio da microscopia eletrônica, foi provado

que as células ósseas apresentam cílios, no entanto somente na última década foi

confirmada a correlação dessas estruturas com a regulação da homeostase e

formação óssea (Revisado por Hoey et al., 2012). Os cílios são estruturas finas

5

que projetam do citoplasma, geralmente numerosas e curtas constituídas por

microtúbulos, que possuem subunidades proteicas α e β tubulina, apresentam

comprimentos variados de 2 a 10μm e de forma coordenada, permite que

correntes de fluidos impulsionem o contato entre si (Junqueira e Carneiro, 2004).

1.2- Formação óssea

O crescimento ósseo compõem um processo fisiológico e controlado

decorrente da ativação e subsequente formação celular. Esse processo,

inicialmente descrito por Harold Frost em 1964, ocorre de forma simultânea em

todo o esqueleto e é composto por três fases principais: crescimento, remodelação

e modelagem (Frost, 1973, Duncan e Turner, 1995, Hughes, 2010).

O esqueleto maduro por sua vez, passa por constante reabsorção e

formação em resposta ao estímulo mecânico por sofrer desgaste como qualquer

outra estrutura, a sua renovação é baseada na permanente remoção constante da

matriz óssea que envolve os osteócitos, os quais são substituídos ao longo de

meses por osteoblastos que promovem a síntese de matriz óssea e a formação de

um novo osso, dessa forma, o osso está em contínuo processo de remodelação

com simultânea formação óssea osteoblástica e reabsorção osteoclástica.

Caso uma dessas vias, absorção e formação, forem alteradas, tal processo é

afetado levando a diminuição da densidade óssea (Neto, 2003, Carvalho, 2003,

Gartner e Hiatt, 2007).

Crescimento: ocorre até os 20 anos de idade, regulado principalmente

por hormônios e consiste no crescimento trabecular em tamanho do esqueleto

(Oliveira e Guimarães, 2003, Hughes, 2010).

Remodelação: ocorre no osso adulto durante toda a vida do indivíduo,

devido ao desgaste natural e micro lesões induzidas pela contínua variedade de

estímulos mecânicos oriundos de atividade física e força gravitacional,

o que incorre na remodelação óssea. Esse processo leva a reabsorção dos

6

osteócitos pelos osteoclastos e a renovação do tecido ósseo, gerando novos

osteoblastos (Oliveira e Guimarães, 2003, Hughes, 2010, Little et al., 2011).

Tal ciclo dura cerca de 3 a 4 meses, sendo influenciado pelo desuso e pelo

exercício físico, promovendo a reabsorção e formação respectivamente.

Modelagem: Corresponde ao processo biológico que mantém a forma,

resistência e tamanho do osso, ou seja, consiste em uma segunda fase que ocorre

após o remodelamento. Após uma fratura ser consolidada, e o calo ósseo ser

formado, ocorre o modelamento do calo ósseo, em que os osteoclastos absorvem

o tecido antigo e os osteoblastos promovem novo tecido ósseo a ser mineralizado

em sincronia, organizando a fratura que muitas vezes está em desvio (Oliveira e

Guimarães, 2003, Hughes, 2010).

Por outro lado, as vias pelas quais estas células entram em apoptose

devido ao desuso ainda não são totalmente conhecidas (Hughes e Petit, 2010).

Relatos demonstraram que a falta de aporte nutricional decorrente da pressão

irregular de fluidos associados à alteração na remoção de toxinas induz a

apoptose prematura dos osteócitos, resultando em balanço negativo e aumento da

porosidade óssea (Bonewald, 2006).

1.2.1- A célula mecanossensora

Todas as células ósseas são sensíveis a estímulos do meio ambiente,

tais força gravitacional e atividade física diária, os quais têm ação sobre o

metabolismo ósseo (Temiyasathit, 2010). Julius Wolff em 1892 descreveu a Lei de

Wolff, que inicialmente propôs que o tecido ósseo possuía a capacidade de

adaptar-se a diversas solicitações mecânicas ou cargas, e que responde com

formação, se houver estresse mecânico ou reabsorção em consequência da

diminuição do mesmo (Rice 1988, Frost, 2003, Frost, 2004, Little 2011).

7

Em 1964, Frost lançou a teoria do mecanostato, em que o tecido ósseo

possui um sensor de deformações que dirige a resposta celular para

dois caminhos, o da formação ou o da reabsorção, assim deformações relativas

menores do que 50-100μstrain (1-2Mpa=0,1-0,2kg/mm2) seriam consideradas

insuficientes e promoveriam a reabsorção óssea enquanto que deformações entre

1500 até 3000μstrain (60MPa=6kg/mm2) produziriam microfraturas e estimulariam

a sua neoformação. Para que se tenha uma ideia destes valores fraturas são

produzidas por pelo menos 25.000μstrain (120MPa=12kg/mm2) (Duncan e Turner,

1995, Frost, 2003, Scott et al., 2008).

Os osteoblastos, precursores dos osteócitos, são responsáveis pela

produção de componentes orgânicos proteicos e RANK (receptor de ativação do

fator nuclear kappa B), assim como a osteocalcina e osteopontina, responsáveis

por formação e mineralização ósseas (Gartner e Hiatt, 2007). Os fatores

endócrinos paratormônio, vitamina D3, prostaglandina 2 e interleucinas 1 e 2,

secretados naturalmente pelo organismo, estimulam a produção de RANK-L

(receptor de ativação do fator nuclear kappa B ligante), o fator de diferenciação

dos osteoclastos. O RANK-L é produzido na superfície dos osteoblastos e ao se

ligar ao receptor (RANK) na superfície dos osteoclastos imaturos, estimula a

diferenciação dos mesmos e consequente reabsorção óssea. No entanto para que

haja o equilíbrio da reabsorção, a osteoprotegerina, também produzida pelos

osteoblastos, atua competindo pelo sítio de RANK-L e limita a diferenciação dos

osteoclastos (Little et al., 2011).

Por muitos anos, os osteoblastos foram estudados como efetores na

renovação celular e os osteoclastos pela reabsorção. No entanto, os osteócitos

(célula mais numerosa no tecido ósseo), ganharam repercussão no processo da

osteogênese, pois estão envolvidos de forma direta no reconhecimento do

estímulo mecânico, devido a suas propriedades físicas de sustentação e

bioquímicas de renovação celular mediante a estímulos mecânicos (Burger et al.,

1995, Martin, 2007, Bonewald, 2006).

8

Os osteócitos são células que respondem aos estímulos mecânicos ou

de cisalhamento que ocorrem na sua parede pelo fluxo de líquido que existe nos

canalículos que ligam estas células entre si, causando assim, uma série de

reações bioquímicas a nível intracelular responsáveis pela ativação das células

mesenquimais. Esse processo mecânico e bioquímico ou biológico é denominado

de mecano transdução. Em resposta a esse estímulo, os osteócitos liberam

osteocalcina, AMPc (monofosfato cíclico de adenosina) e fatores de crescimento,

promovendo manutenção da homeostase e saúde ósseas (Gartner e Hiatt, 2007).

A presença de BMP (bone morphogenic protein), importante proteína reguladora

da proliferação e diferenciação celular, observada in vitro após o estímulo por fluxo

de fluido contínuo, também reforça a hipótese de que os osteócitos sejam

considerados células primárias na mecanotransdução óssea (Santos et al., 2011).

Ao contrário dos osteoblastos (localizados na periferia do tecido ósseo),

os osteócitos estão presentes em torno do sistema canalicular distribuídos pela

estrutura lamelar e próximos entre si, dessa forma, devido a seu grande número e

localização, estes desempenham importante papel na manutenção da matriz

óssea por possuírem maior comunicação intercelular. Apresentam

prolongamentos citoplasmáticos semelhantes a cílios que são sensibilizados

durante a deformação mecânica e a sua mobilização promove o contato e

comunicação entre as células vizinhas, o que leva a ativação dos mecanismos

osteogênicos dos osteoblastos e geram novos osteócitos (Gusmão e Belangero,

2009).

Os prolongamentos citoplasmáticos estão permeados pelo fluido

intersticial, o que favorece a mobilidade e o contato entre os cílios adjacentes, que

quando submetidos ao estresse mecânico, de forma que um gradiente de pressão

é gerado movendo este fluido, o qual pressiona as áreas de tensão promovendo o

contato entre os mesmos e então a amplificação do estímulo mecânico e ativação

dos osteócitos (Tate, 2003) (Figura 2), o que desencadeia a mobilização

intracelular de óxido nítrico (NO), prostaglandina (PGE) e adenosina trifosfato

(ATP) (Hughes e Petit, 2010).

9

Figura 2- Esquema ilustra a amplificação do estímulo mecânico no espaço

pericelular (PEM) na membrana extracelular (MEC) permeado por

fluido onde se localizam os processos citoplasmáticos dos osteócitos,

permitindo a comunicação entre essas células e levando ao

desencadeamento da resposta bioquímica intracelular (Modificado de

Gusmão e Belangero, 2009).

Para elucidar como a presença dos processos citoplasmáticos é capaz

de induzir a osteogênese por meio do estímulo mecânico (Reinholt et al., 1990,

Choi et al., 2008), estudos in vitro simulam o efeito semelhante por meio do fluxo

de fluido, processo de agitação induzindo pressão de fluidos em células em cultivo

(Weinbaum et al., 1994). Dentre esses estudos, Malone e col. (2007) utilizaram a

osteopontina, proteína estrutural extracelular óssea, que está envolvida na cascata

proteica de ativação da remodelação, para avaliar a resposta dos cílios dos

osteoblastos ao estímulo por fluxo de fluido. Diante a esse estímulo, foi observado

o aumento da expressão gênica dessa mesma proteína, no entanto, o mesmo não

aconteceu em modelos celulares em que os processos citoplasmáticos foram

previamente removidos pela utilização de cloro hidratado.

10

1.2.2- Mecanotransdução

O processo de interação entre um estímulo mecânico,

gerando deformação do tecido ósseo em nível de membrana plasmática,

sua transmissão pelo citoesqueleto e a consequente reação bioquímica

intracelular, é denominada mecanotransdução, o que promove o equilíbrio entre a

apoptose e a proliferação celular óssea (Gusmão e Belangero, 2009). O estresse

mecânico ou elétrico ao ser aplicado em um tecido ósseo, gera o aumento da

pressão de fluidos, e a consequente comunicação intercelular óssea, que por sua

vez ativa fatores de crescimento em osteoblastos e consequentemente dos

osteócitos (Mikic e Carter, 1995, Hung, et al., 1996).

Quando esse estímulo mecânico é aplicado sobre o tecido ósseo,

e é formada a força de arrasto no meio fluido pericelular, ocorre a amplificação

desse estresse em 20 a 100 vezes. Isso demonstra que a célula necessita de uma

deformação relativa ou strain maior do que o tecido ósseo como um todo para

responder e desempenhar seu papel na mecanotransdução. Essa formação óssea

ocorrerá após 3 a 5 dias do estímulo aplicado, tempo esse, o necessário para que

ocorra toda a transmissão da deformação e diferenciação das células

osteoprogenitoras em novos osteoblastos. (Duncan e Turner, 1995).

É conhecido que a carga e a atividade física estimulam a renovação

óssea (Carvalho, 2003), no entanto, métodos geradores de estímulos físicos como

ultrassom terapêutico e a terapia por ondas de choque (TOC) também são

capazes de gerar o estímulo de deformação mecânico o qual será amplificado no

sistema canalicular por meio do fluxo de fluidos levando ao desencadeamento da

resposta bioquímica intracelular (Rockett e Sousa, 2007, Gusmão et al, 2010).

Este processo é regulado pela mecanotransdução, ou seja, pela ação

dos osteócitos que funcionam como sensores mecânico biológicos que a partir de

um estímulo mecânico induzem respostas biológicas mediadas por proteínas que

atuam no interior das células do tecido ósseo regulando em parte, a remodelação

do esqueleto (Duncan e Turner, 1995, Gartner e Hiatt, 2007, Gusmão e Belangero,

2009, Temiyasathit, 2010).

11

A resposta celular decorrente do processo da mecanotransdução,

é iniciada por meio de muitas proteínas transmembrana, dentre elas os canais

iônicos e integrinas (Figura 3), além de proteínas do citoesqueleto associadas à

liberação de fatores de crescimento (Wang et al., 2007), esse sistema gerado

entre a matriz extracelular, integrinas e citoesqueleto interage com o núcleo e

permite a transmissão do estímulo mecânico gerado no tecido ósseo, o que gera

deformação da membrana extracelular até o núcleo (Duncan e Turner, 1995).

De acordo com a disposição dessas estruturas, ocorre um sistema de alavancas,

de forma em que cada uma se conecte com a outra e permita interações

sincronizadas da transmissão da deformação mecânica recebida (Gusmão e

Belangero, 2009).

Figura 3- Esquema da disposição das integrinas apresentando os dois

heterodímero α e β localizados no espaço transmembrana compondo

o citoesqueleto. Actina, vinculina e Paxilina também compõe o

citoesqueleto e apresentam relevante função na adesão local

(Adaptado de Turner e Pavalko, 1998).

12

1.2.3- Integrinas e quinase de adesão focal (Fak)

As integrinas estão dispostas na membrana plasmática das células,

e conectam o citoesqueleto a estruturas da matriz extracelular, como colágeno e

fibronectina. Apresentam-se em heterodímeros compostos por cadeias

glicoprotéicas α e β os quais se ligam a α-actina do citoesqueleto, dessa forma,

permitem a migração das células ao longo da matriz extracelular (Gartner e Hiatt,

2007).

A transdução dos sinais bioquímicos para o meio intracelular também é

função das integrinas, as mesmas são ativadas pela FAK (focal adhesion kinase),

que quando sofrem a deformação mecânica, ativam as cascatas de sinalização de

diversas proteínas no meio intracelular, promovendo assim a ativação do ciclo

celular, regulação da expressão gênica, incluindo regulação de apoptose celular e

reorganização do citoesqueleto (Gartner e Hiatt, 2007).

Segundo Gusmão e Belangero (2009), esta deformação mecânica

estimula a Fak (focal adhesion kinase), que ao sofrer deformação mecânica,

sofre autofosforilação no resíduo de tirosina-397 (Tyr-397) e ativa as cascatas de

sinalização de diversas proteínas no meio intracelular, dentre elas as vias Akt

(akutely transforming) Fak/PI3K/Akt/NF-κB e da Erk (extracellular signal-regulated

kinase) por meio de FAK-Src/Grb2/Sos/Ras-Raf/Mek/Erk-1/2.

1.3- As vias das proteínas Erk e Akt

As proteínas do grupo das MAPK (Mitogen-activated protein kinase) são

responsáveis por reconhecer o estímulo mecânico externo e convertê-los em

resposta celular. Suas vias estão presentes em todas as células eucarióticas e

envolvidas nos processos de mitose, motilidade, expressão de genes,

diferenciação, sobrevivência e apoptose. Dentre as mais estudadas desse grupo

estão as JNK (c-Jun amino (N)-terminal kinases), p-38 e Erk (Cargnello, 2011).

13

A Erk é uma proteína efetora que pode exercer suas funções no

citoplasma e núcleo, isto é a indução da migração, proliferação e diferenciação

celular, além da inibição da apoptose. Sua ativação ocorre pelos receptores

tirosina quinase na superfície celular (Cargnello e Roux, 2011). Apresenta várias

isoformas, destacando-se Erk-1 (44 kDa) e Erk-2 (42KDa), esta última sendo a

mais importante na resposta ao estímulo mecânico (Gusmão et al., 2010).

Akt é uma proteína efetora da via Fak, localizada na membrana

plasmática e responsiva à deformação mecânica, podendo exercer suas funções

no citoplasma e núcleo da célula óssea. Seu peso molecular é 60 kDa e apresenta

3 isoformas, entretanto não há descrição de qual é mais importante para a

resposta ao estímulo mecânico (Gusmão e Belangero, 2009). Estudo demonstrou

que a Akt fosforilada é capaz de aumentar a permeabilidade da membrana

plasmática de osteócitos in vitro após o estímulo mecânico, promovendo a

formação óssea (Batra et al., 2014).

Trabalhos realizados com a utilização de meios físicos como ultrassom

terapêutico (Gusmão et al., 2010), terapia por ondas de choque (TOC) (Rockett e

Sousa, 2007) ou pela atividade física sugerem que os meios físicos estimulam a

renovação óssea (Carvalho, 2003).

14

Figura 4- Esquema que demonstra a cascata de sinalização das proteínas Erk1/2

e Akt e a consequente indução aos fatores da osteogênese.

1.4- Terapia por ondas de choque

As ondas de choque (TOC) foram inicialmente utilizadas na medicina

para fragmentação de cálculos renais em 1980 e posteriormente passaram a ser

usadas no tratamento de doenças musculoesqueléticas. Dentre as indicações da

terapia, as principais são a fascite plantar, a epicondilite lateral do cotovelo,

as tendinoses calcificadas e as pseudoartroses (Rockett e Souza, 2007,

Scott et al., 2008, Xu et al., 2009).

15

1.4.1- Princípios da geração das ondas de choque

O tratamento se caracteriza por aplicar no local da lesão uma

sequência de pulsos mecânicos sonoros de alta energia com alto gradiente de

pressão (positiva acima de 100 MPa seguida por uma queda brusca até

-5 a 10 MPa), em curto espaço de tempo em um ponto específico do corpo

(Rockett e Souza, 2007).

Dentre os métodos de geração de ondas de choque focalizadas,

estão relacionados os aparelhos que emite m as ondas sonoras por meio de

princípios piezoelétrico, eletromagnético e eletro-hidráulico. A forma de geração

das ondas de choque eletro-hidráulicas, representam a primeira geração de

aparelhos utilizados na medicina, no ano 2000 a FDA (Food an Drug

Administration) norte americana, inicialmente aprovou a utilização da tecnologia

como tratamento de patologias ortopédicas, e em 2002 a tecnologia

eletromagnética também se tornou reconhecida (Ogden, 2001, Wang, 2012).

Além dessas formas de se obter onda sonora com aplicabilidade

terapêutica na medicina atual, encontra-se a onda de pressão radial, um método o

qual não é capaz de exceder a barreira do som e possui característica radialmente

divergente do foco (Rockett e Sousa, 2007).

1.4.2- Aplicabilidade em patologias ósseas

Sua ação nos tecidos muscular e tendíneo promove o aumento da

vascularização (Wang et al., 2003) e nova celularidade com reparação fibro

conectiva (Alves et al., 2005, Neuland et al., 2008). No osso condral também é

possível observar células semelhantes aos tecidos moles. Logo, a indução de

nova inflamação em um tecido inflamatório crônico, pode criar uma nova

oportunidade de reparação dessa condição anormal da estrutura

musculoesquelética. Efeitos adversos, tais como sinais de necrose ou displasia

celular não foram observados nos pacientes tratados com TOC (Brañes e

Guiloff, 2007). Além disso, estudos clínicos em animais mostraram alinhamento e

16

neoangiogênese em tendões, após 2-4 semanas e 4-8 semanas de aplicações de

TOC, respectivamente. (Alves, et al., 2005, Wang et al., 2002).

O mecanismo celular para a consolidação de fraturas e cicatrização de

tendões ainda não está totalmente esclarecido. No entanto, relatos da literatura

evidenciam que a TOC pode promover o crescimento e a diferenciação celular da

medula óssea (Wang, et al., 2002). Wang e colaboradores (2001) mostraram que

sua aplicação em fraturas de tíbia de cães, foi capaz de promover a consolidação

mais eficiente e com maior formação de osso cortical após 12 semanas da terapia.

Outros estudos obtiveram 75% de sucesso no tratamento de não uniões ósseas e

fraturas em atraso, o que demonstra que o método pode ser uma excelente

escolha na consolidação destas patologias (Schaden et al., 2001, Xu et al. 2009).

Sabe-se que o estímulo mecânico gerado pela força gravitacional e

atividade física são essenciais para manutenção da homeostase (formação e

reabsorção) óssea (Duncan e Turner, 1995, Frajacomo et al., 2013). Neste sentido

a TOC tem sido utilizada nos últimos anos como método alternativo de estímulo

mecânico inclusive para estimular a consolidação óssea em pacientes com

pseudoartrose (Schaden et al., 2011, Xu et al., 2009). A consolidação óssea por

meio do estímulo da TOC ocorre pela expressão de IGF-1 (insuline-like growth

factor), VEGF (vessel endothelial growth factor), NO (nitric oxide), TGF-β1 (tumor

growth factor-β1) e BMP-2 (bone morphogenic protein-2), que contribuem para o

desencadeamento de fatores angiogênicos, secreção do fator

pro-osteoclastogênico e proliferação e diferenciação das células ósseas (Wang

et al., 2002, Wang et al., 2003, Tamma et al., 2009, Nortanicola et al., 2011).

Alguns estudos in vitro investigaram o efeito da TOC na atividade da

FAK e ERK-1/2, mas nenhum estudo in vivo foi encontrado (Chen et al., 2004,

Wang et al., 2002, Xu et al., 2009). Por isso, é questionado se a atividade da FAK,

ERK-1/2 e Akt aumentam após TOC eletro-hidráulicas em ossos íntegros de ratos

saudáveis. Neste estudo, as tíbias e fíbulas íntegras de ratos Wistar machos foram

estimuladas com ondas de choque eletrohidráulicas uma única vez para investigar

a atividade da FAK, ERK-1/2 e Akt após 7, 14 e 21 dias do estímulo inicial.

17

Levando-se em consideração estes aspectos, o objetivo deste estudo

foi verificar se o estímulo mecânico produzido por ondas de choque do tipo

eletro-hidráulico poderiam induzir a formação das proteínas Akt e Erk em ratos

Wistar, e assim confirmar ou não o efeito que este tipo de tratamento pode ter no

processo de remodelação do tecido ósseo.

18

OBJETIVOS

2.1- Objetivo geral

Para o presente estudo, propõe avaliar o aumento da expressão de

proteínas que estimulam a osteogênese em tíbias e fíbulas intactas de ratos após

7, 14 e 21 dias do tratamento por ondas de choque.

2.2- Objetivos específicos

✓ avaliar a presença da Erk e Akt por meio de immunoblotting nas tíbias e

fíbulas hígidas dos ratos

19

MATERIAL E MÉTODOS

3.1- Animais

Foram tratados 30 ratos brancos machos (Rattus novergicus) da

linhagem Unib: W-H, fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação

Biológica (CEMIB) da Unicamp, com 12 (±2) semanas de idade e massa corpórea

de aproximadamente 300 gramas (±20). Os animais foram mantidos sob

condições estáveis de temperatura em estante ventilada a 22°C em ciclos

claro/escuro de 12 horas controlados, com livre acesso à água e alimentação

ad libitum. Todo experimento foi conduzido de acordo com protocolo n° 2861-1

submetido e aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal

(CEUA/IB - Unicamp). Os animais foram divididos em dois grupos: controle (GC-

somente anestesiados) e tratado (GT) (n=15), e subdivididos de acordo com o

tempo de seguimento pré-estabelecido em: 7, 14 e 21 dias (Figura 5).

Figura 5- Representação esquemática do desenho do estudo.

20

3.2- Métodos

3.2.1- Estímulo por ondas de choque

Os animais foram previamente pesados e anestesiados com xilazina

(5 a 15μg/Kg) e quetamina (80 a 100μg/Kg), via intra peritoneal (ip). Conforme

Figura 5, foi realizada a tricotomia da região das tíbias bilateralmete em todos os

animais. Os ratos do GC foram anestesiados, segundo protocolo acima,

foi realizada a tricotomia e mantidos sem outras intervenções a fim de

recuperarem-se. O GT, após a aplicação de gel de contato a base de água

(meio de condução para transmissão da onda de som), receberam estímulo único

de 500 impulsos a 0,12mJ/mm2 por tíbia aparelho eletro-hidráulico

(Switech Medical, Activator Vet, 2009) (Figura 6), como descrito previamente por

Wang et al., 2003. Após o procedimento de estímulo por ondas de choque,

os ratos foram acondicionados em gaiolas coletivas para 5 animais, como descrito

no item 3.1.

Figura 6- Procedimento de TOC: (A) Aparelho Vetgold120 (adaptado do manual

do fabricante) utilizado para a TOC; (B) Demonstração da aplicação das

ondas de choque com o animal anestesiado e o transdutor na face

lateral do membro posterior (500 impulsos a 0,12mJ/mm2) do rato dos

grupos de estudo (GT; n=5 animais por grupo).

21

3.2.2- Extração do tecido ósseo

Este estudo foi realizado no Laboratório de Investigação Clínica de

Resistência à Insulina (LICRI), na Faculdade de Ciências Médicas (FCM),

sob a coordenação do Prof. Dr. Mário José Abdalla Saad.

Decorrido cada tempo de seguimento pré-estabelecido (7, 14 e 21 dias)

para análise da expressão das proteínas, os animais foram anestesiados por via

IP (intraperitoneal) sendo protocolo citado acima (item 3.2.1), após a perda dos

reflexos podal e corneano, as tíbias foram expostas com o auxílio de bisturi,

os joelhos desarticulados e com auxílio de tesoura apropriada realizou-se a

osteotomia das diáfises das tíbias e fíbulas, as quais foram imediatamente

colocadas em um recipiente contendo nitrogênio líquido, fragmentadas e

homogenizadas (máxima velocidade por 30 segundos; Polytron PTA 20S,

modelo PT 1035; Brinkmann Instruments) em tampão de extração,

conforme representado em Figura 4. Em todas as amostras foi adicionado

triton X-100 1% e as mesmas permaneceram no gelo por 40 minutos.

Todos os animais foram sacrificados por aprofundamento anestésico após a

extração das tíbias.

22

Figura 7- Extração e politronagem: tíbia extraída do animal vivo, adição de

nitrogênio líquido utilizando cadinho para masseração da tíbia e fíbula,

procedimento de politronagem do tecido ósseo adicionado a tampão

de extração, em seguida processo de centrifugação sob refrigeração e

após obtenção da separação do sedimento e sobrenadante,

é realizada a quantificação das proteínas utilizando o teste do Biureto.

O material extraído foi então centrifugado na velocidade de 11.000rpm

por 40 minutos a 4°C, para remover o material insolúvel. O sobrenadante foi

utilizado para as etapas seguintes: uma pequena parte para determinar a

concentração proteica de cada amostra pelo método colorimétrico de biureto em

comprimento de onda a 540nm e a outra parte foi utilizada para avaliação do

extrato total, ou seja, separação das proteínas em gel de dodecil sulfato de sódio e

poliacrilamida (SDS-PAGE), com tampão de Laemmli, acrescido de DTT 200mM,

23

em proporção de 5:1, mantido sempre a 4ºC até o momento de submeter à fervura

a 100ºC durante 5 minutos. As técnicas de immunoblotting estão descritas a

seguir.

3.3- Immunoblotting

3.3.1- Expressão das proteínas totais e fosforiladas (Erk e Akt) envolvidas no

processo de mecanostransdução do tecido ósseo:

3.3.1.1- Eletroforese: Os aparelhos e reagentes para eletroforese em

SDS-PAGE foram da Bio-Rad® (Richomond, C.A.), e

Metanohidroximetilamina (TRIS), fenilmetilsulfonilfluoreto

(PSMF), aprotinina e ditiotreitol (DTT) foram da Sigma

Chemical Co. (St. Louis Mo). A membrana de nitrocelulose BA

85, 0,2μm foi proveniente de Schleider e Schuell.

Os anticorpos anti-Akt e anti-p-Akt, anti-Erk e anti-p-Erk foram

obtidos da Santa Cruz Biotechnology Inc®.

As soluções empregadas no experimento estão descritas abaixo.

. Tampão de extração: Continha: trisma base 100mM, EDTA 10mM,

pirofosfato de sódio 100mM, fluoreto de sódio 10mM, ortovanadato de sódio

10mM, PMSF 2mM (diluído em álcool etílico), triton X 100 1%, aprotimina 10 3%

(0,1mg/mL). Esta solução foi mantida a 4ºC. O ortovanadato, PSMF e aprotinina

foram acrescidos no momento do uso.

. Tampão de Laemmli (5x): Foi utilizado para estocar o material extraído e para

aplicação no gel de poliacrilamida. Continha: Azul de bromofenol 0,1%,

fosfato de sódio 1M pH 7,0, glicerol 50% e SDS 20%.

24

. Solução tampão para eletroforese em gel (SDS-PAGE): Foi utilizada para a

realização da eletroforese das proteínas extraídas no gel SDS-PAGE.

A solução foi diluída 1:4. Continha: Trisma base 0,2M, glicina 1,52M,

EDTA 7,18M e SDS 0,4%.

. Solução tampão para transferência: Foi utilizada para a transferência das

proteínas separadas no SDS-PAGE para a membrana de nitrocelulose.

Continha: Trisma base 25mM, glicina 129mM, Metanol 20% e SDS 0,02% para

facilitar a eluição de proteínas de alto peso molecular. Foi ser estocada a 4ºC.

. Solução tampão para SDS-PAGE, gel de resolução (resolving): Foi utilizada

para o preparo do SDS-PAGE, gel de resolução. Continha: EDTA 4mM, SDS

25% e trisma base 1,5M. O pH da solução foi ajustado para 8,9 com ácido

clorídrico.

. Solução tampão para SDS-PAGE, gel de empilhamento (stacking): Foi utilizada

no preparo do SDS-PAGE, gel de empilhamento das proteínas. Continha:

EDTA 4mM, SDS 2% e trisma base 10mM. O pH foi ajustado para 6,7 com

ácido fosfórico.

. Solução basal: Solução básica foi utilizada para o manuseio da membrana de

nitrocelulose após transferência das proteínas. Continha: cloreto de sódio

0,12M, trisma base 0,01M, Tween 20 0,05%.

. Solução bloqueadora: Foi utilizada para incubar a membrana de nitrocelulose

logo após a transferência. Continha: 5% de leite em pó desnatado (Molico®) e

azida sódica 0,02% dissolvidas em solução basal.

. Solução para anticorpos: Solução onde foram diluídos os anticorpos

específicos. Continha: 0,3% de soro albumina bovino (BSA) e azida sódica

0,02% diluídos em solução basal.

25

3.3.1.2- Procedimento de Immunoblotting

Foram aplicados no SDS-PAGE de 1,5mm, 200µg de proteína por

amostra, sendo o gel balizado por marcador de alto peso molecular comercial,

para gel de poliacrilamida, da Bio Rad®: PageRuler (Thermo Scientific®).

A eletroforese foi efetuada em cuba de minigel Mini- PROTEAN® II Cell da

Bio Rad®, com solução tampão para eletroforese previamente diluída.

O SDS-PAGE foi inicialmente submetido a 20 volts, até a passagem da linha

demarcada pela fase de empilhamento (stacking) e 100 volts até o final do gel de

resolução (resolving).

A seguir, as proteínas separadas no SDS-PAGE, foram transferidas

para membrana de nitrocelulose, utilizando-se o equipamento de

eletrotransferência do minigel da Bio Rad®. Durante a transferência, a cuba foi

mantida a 120 volts por 150 minutos (Towbin et al., 1979). Para evitar aumento

excessivo da temperatura, foram efetuadas trocas sucessivas da forma de gelo

durante a transferência.

As membranas com as proteínas transferidas foram incubadas em

solução bloqueadora por duas horas à temperatura ambiente, e depois lavadas

em solução basal por três sessões de dez minutos para subsequente incubação

com anticorpo específico. Tal incubação foi feita overnight a 4ºC, sob agitação

constante e, novamente, as membranas foram lavadas com solução basal por

quatro sessões de dez minutos. A seguir, utilizando-se a diluição 1:1 dos

reagentes do kit comercial Pierce Western Blot Signal Enhencer (Thermo

Scinetific®, Illinois, EUA) adicionou-se 2mL por membrana e incubou-se

1 a 2 minutos. Após a incubação as membranas foram reveladas com auxílio do

fotodocumentador ChimioDoc MP (Bio-Rad® Laborarie, Hercules, CA-EUA) uma

vez identificadas, as bandas, a leitura foi feita por meio de densitometria óptica

(Un-Scan-It® gel 6.1), quantificando suas áreas. A partir de então, foi realizada a

análise dos dados, comparando o valor obtido no tecido ósseo do animal controle

com o submetido à TOC, de forma que sempre haja controle dentro de um

experimento.

26

Figura 8- Esquema representativo do processo de pipetagem do gel de

acrilamida, seguido da eletroforese e transferência para a membrana

de nitrocelulose, adição dos anticorpos dos anticorpos e por fim

representação após procedimento de revelação.

3.4- Análise Estatística

O immunoblotting foi realizado em triplicata para cada amostra de proteína

e o resultado final para cada espécime considerado, foi a média dos valores

obtidos em cada uma das três análises. O resultado final para cada grupo foi dado

pela média ± desvio-padrão dos resultados de cada espécime intragrupos.

A comparação entre o GT e seu respectivo GC foi realizada empregando-se

one-way ANOVA (α=0,05), seguido do teste de Bonferroni com auxílio do

programa Minitab®17 (Minitab Inc, State College, PA).

27

4- RESULTADOS

4.1- Expressão das proteínas totais e fosforiladas (Erk e Akt) envolvidas na

sinalização do estímulo mecânico nos ossos das tíbias

Após a aplicação de um único estímulo da TOC, pode-se observar por

meio da avaliação das médias dos valores numéricos da medida em pixels da

densitometria óptica das diferentes bandas (Tabela 1) em relação a Erk e Akt o

seguinte:

Com relação a Akt houve a modulação de sua expressão no tecido

ósseo após avaliação por meio de immunoblotting. A atividade de Akt aumentou

1,77 vezes após 7 dias (p=0.005); 2,8 vezes após 14 dias (p

28

Tabela 1- Apresentação dos valores numéricos da medida em pixels da

densitometria óptica das diferentes bandas e suas respectivas médias

e desvio padrão para os ratos dos GC e GT com sete, 14 e 21 dias de

seguimento (n=5).

pAkt Grupo Controle médias/SD Grupo Tratado médias/SD

7 dias 27,14 23,5 20,97 20,06 15,66 21,47±4,25 51,15 35,49 36,74 38,9 27,39 37,93±9,35*

14 dias 27,05 21,12 21,11 9,51 25,87 20.93±6,93 51,19 59,3 53,88 54,13 74,47 58,59±13,66*

21 dias 38,81 19,89 31,59 30,95 39,95 32,24±8,02 62,56 65,9 35,9 41,71 41,65 49,54±13,66*

pErk1/2 Grupo Controle médias/SD Grupo Tratado médias/SD

7 dias 15,03 13,15 16,57 22,49 21,19 17,69±4,01 31,73 32,94 34,63 35,42 37,61 34,47±2,27*

14 dias 6,46 1,82 0,45 1,23 2,13 2,42±2,35 14,84 13,46 16,39 14,19 22 16,18 ±3,43*

21 dias 54,14 72,13 65,08 78,65 72,84 68,57±9,39 77,77 91,29 81,25 77,44 83,6 82,27 ±5,65*

*p

29

*p

30

#p

31

DISCUSSÃO

Segundo Tuner e Pavalko (1998), o processo de formação óssea é

complexo e mediado por proteínas cuja expressão pode ser induzida por

estímulos mecânicos externos. Tais estímulos atingem a membrana plasmática

das células levando a ativação do sistema de proteínas integrina-citoesqueleto-

núcleo. Dentre as proteínas envolvidas nesse processo, tem-se as vias da Erk e

da Akt com grande relevância na conversão do estímulo mecânico em biológico no

interior das células e consequente liberação dos fatores de crescimento e

osteogênese (Cargnello e Roux, 2011).

Com o objetivo de avaliar a expressão de Erk e Akt mediante estímulos

e deformação mecânica, neste estudo foi utilizado a TOC (terapia por ondas de

choque), alternativa segura e não invasiva utilizada no tratamento de não união

óssea (Schaden et al., 2001, Rockett e Souza, 2007, Xu et al., 2009).

O mecanismo de ação pelo qual a TOC estimula a consolidação óssea é pelo o

aumento da vascularização e consequente aumento do aporte nutricional,

(Wang et al., 2003). Embora experimentos in vitro tenham demonstrado sua

eficácia por meio da diferenciação de células osteoprogenitoras, o mecanismo de

ação pelo qual a onda mecânica ativaria o processo de neoformação óssea ainda

não está completamente entendido (Tamma et al., 2009, Yu et al., 2014).

Acredita-se que os estímulos mecânicos gerados pela TOC sejam

altamente eficientes no processo de estimulação do sistema de

integrinas/citoesqueleto/núcleo, corroborando com Harold Frost, que em 1964

lançou a teoria do mecanostato. Para Frost, o tecido ósseo possui um sensor de

deformações que dirige a resposta celular para dois caminhos, o da formação ou o

da reabsorção, assim deformações relativas menores do que 50-100μstrain

(1-2 Mpa=0,1-0,2kg/mm2) seriam consideradas insuficientes e promoveriam a

reabsorção óssea enquanto que deformações entre 1500 até 3000μstrain

(60MPa=6kg/mm2) produziriam microfraturas e estimulariam a sua neoformação.

32

A título de quantificação, fazendo uma analogia, fraturas são produzidas por pelo

menos 25.000μstrain (120MPa=12kg/mm2) (Duncan e Turner, 1995, Fritton et al.,

2000, Scott et al., 2008).

Mais recentemente You e colaboradores (2001) mostraram que a

deformação relativa para o estímulo celular deve ser de aproximadamente

10.000 a 100.000μstrain, ou seja, mais de 30 vezes maior do que o suportado pelo

tecido ósseo. Deste modo, autores sugeriram que a estrutura composta pelos

canalículos ligando os osteócitos e o citoesqueleto de actina e permeados por

fluido no espaço pericelular, que é responsável pela amplificação do estímulo

mecânico (Tate, 2003). Embora ainda não exista comprovação experimental

definitiva, os osteócitos seriam as células responsáveis por este controle da

remodelação óssea (Neve et al., 2012). Com base na teoria do mecanostato,

faz-se possível aventar que o estímulo promovido pela TOC tenha sido

amplificado de modo a manter a modulação da osteogênese por meio da

expressão das proteínas Erk e Akt até 21 dias após uma única aplicação de

500 pulsos a 0,12mJ/mm2.

Ao fazer uma comparação com o ultrassom de baixa potência (USbp),

utilizado por Gusmão e colaboradores (2010) com o objetivo similar de induzir

proteínas envolvidas na osteogênese por meio de estímulo mecânico, o efeito da

onda de choque tende a ser mais prolongado e possivelmente mais eficiente.

Uma vez que o estímulo único promovido pela TOC manteve níveis elevados da

expressão de Erk1/2 e da Akt mesmo após 21 dias o USbp embora tenha tenha

induzido a expressão de Fak e Erk 1/2 após sete e 14 dias de estímulo diário,

os níveis não se mantiveram elevados aos 21 dias de estímulo contínuo,

não havendo assim efeito cumulativo da terapia.

O protocolo estabelecido para tratamento com USbp é de um estímulo

diário (Gusmão et. al., 2010 Xue et al., 2013), ao passo que o protocolo da TOC é

de um único estímulo (Wang et al., 2003). Comparando-se os resultados do

estudo de Gusmão e colaboradores (2010) com o presente estudo, observa-se

que o tratamento com USbp aumentou a atividade da Erk somente por 14 dias nos

33

ossos íntegros de ratos. Provavelmente, 14 dias não é tempo suficiente para

aumentar a massa óssea de forma significativa, o que pode justificar a

superioridade da TOC para aumentar a massa óssea nos ossos íntegros sadios,

com osteoporose e com deficiência de estrógeno (Van der Jagt et al., 2009,

Van der Jagt et al., 2013).

A diferença entre a atividade da Erk após TOC comparada com a

atividade da Erk após estímulo com USbp é consistente com os achados de

Tam e col. (2008) que compararam, num modelo in vitro, a resposta de células

periosteais humanas após TOC e USbp isoladamente e em conjunto. Os autores

observaram que o USbp aumenta a proliferação celular, atividade da fosfatase

alcalina e mineralização óssea após 6 dias de estímulo diário e que as amostras

submetidas a TOC só iniciam esse aumento 18 dias após estímulo único.

Os autores relacionaram a resposta tardia da TOC ao fato do aumento da

permeabilidade de membrana e liberação das citocinas terem seu pico nesse

período (Wang et al., 2003), enquanto o efeito não acumulativo do USbp, por não

permanecer aumentado até o 180 dia, o que consiste com o estudo de Winter e

col. (2003) em que o estímulo mecânico contínuo in vitro diminui o cálcio,

fosfatase alcalina e a atividade do DNA celular dos osteoblastos. Em adição,

nesse mesmo estudo observou-se que a TOC provoca, inicialmente, morte celular

e diminuição da atividade de fosfatase alcalina (Tam et al., 2008). Em contra

partida, o presente estudo contrapõe os achados acima descritos, em que se

obteve como resultado a expressão precoce já aos sete dias da atividade proteica

e consequente osteogênese. Uma hipótese à distinção dos resultados dever-se-á

as diferentes metodologias empregadas nos estudos sendo um modelo in vivo e

outro in vitro, o que sugere novos estudos para melhor entendimento.

Corroborando os achados deste trabalho, o estudo de Wang e col.

(2003) utilizando o mesmo protocolo (0,12mJ/mm²), demonstrou que os níveis dos

fatores angiogênicos NO (óxido nítrico), VEGF (fator de crescimento endotelial

vascular) e BMP-2 (proteína morfogênica óssea-2), mantiveram-se expressos

entre a primeira e a oitava semanas após estímulo único de TOC nas junções

34

tendão-osso intactos, o que reforça o efeito cumulativo da expressão desses

fatores após estímulo único da TOC. No entanto, Maier e col. (2002), ao utilizar

energia menor (0,05 e 0,09mJ/mm²) do que a utilizada no presente estudo,

encontrou que o estímulo biológico produzido pela TOC em estímulo único com

aplicada em ossos íntegros de coelhos vivos, não estimulou a vascularização e

nem foi detectada após 10 dias cintilografia óssea utilizando marcador Tc-DPD

(technetium 3.3-diphosphono-1.2-propandicarbon acid).

Wang e col. (2002) observaram em cultivo celular de medula óssea de

ratos, que a diferenciação osteogênica foi induzida por meio da fosforilação da Erk

mediada pelo superóxido (O2-) após 1h do estímulo de TOC. Além disso,

há relatos que a Erk já pode ser detectada em osteoblastos cultivados in vitro,

10 minutos após a estimulação pela TOC, sendo um método eficaz e rápido no

recrutamento de fatores pró-apoptóticos que promove proliferação e diferenciação

dos mesmos (Tamma et al., 2009). Estes achados podem fortalecer e explicar os

resultados do presente estudo ao serem encontrados níveis altos de Erk aos dias

após a aplicação singular do estímulo.

Ao apresentar aumento da atividade da Erk e Akt por 21 dias após

única sessão de TOC, o presente estudo assemelha-se aos resultados de Chen e

colaboradores (2004) que demonstraram aumento da atividade de Erk e p38 por

42 dias após TOC em ossos de ratos num modelo experimental de defeito

segmentar. Apesar da possibilidade do modelo de defeito segmentar ser similar a

uma situação de osso com fratura, no estudo de Chen e colaboradores (2004),

a TOC foi realizada 8 semanas após a produção do defeito ósseo, quando o osso

já está consolidado. Desse modo, acredita-se que seus resultados podem ser

comparados com os resultados deste estudo, onde foram utilizados membros

intactos, aproximando dessa forma os resultados e dando mais consistência a

terapia por ondas de choque no processo de ganho de massa óssea.

A Akt é encontrada no citoplasma e participa na sinalização dos fatores

de crescimento que promovem a sua modulação e diferenciação e previne a

apoptose durante o processo de renovação celular (Heron-Milhavet et al., 2011).

35

Este efeito foi demonstrado no estudo de Yu e colaboradores (2014),

no qual mioblastos de linhagem celular H9c2 em isquemia/hipóxia induzida,

foram submetidos à TOC, e foi observado que a capacidade de atenuar a

apoptose ocorreu mediada pela ativação da via PI3K/Akt, entretanto, o efeito

protetor da musculatura cardíaca não foi observado de forma significativa pela via

da Erk em relação ao controle. Moon e col. (2011) observaram o aumento da

expressão de Akt durante osteoclastogênese como sugerido no presente estudo,

onde foi observado o aumento da fosforilação dessa mesma proteína no tecido

ósseo extraído das tíbias e fíbulas dos ratos estimulados pela TOC.

Neste experimento, a atividade da Akt permaneceu aumentada por

21 dias após uma única sessão de ondas de choque. Na literatura consultada,

não foram encontrados estudos abordando o efeito da TOC sobre a Akt do tecido

ósseo, no entanto, estudo de Tam e col. (2008) observaram que a viabilidade

celular diminuiu 6 dias após a TOC, mas aumentou 18 dias depois. O aumento da

viabilidade celular observado naquele estudo pode estar relacionado com o

aumento da atividade de Akt observado neste estudo, que ocorreu sete dias após

a TOC.

Vale a pena ressaltar que os resultados podem apresentar algum viés

já que do ponto de vista metodológico, a extração das proteínas apesar de ter sido

exaustivamente planejada e treinada em estudo piloto, pode interferir

negativamente nos resultados (Gusmão et al., 2010) devido ao grande número de

etapas em que podem ocorrer variações no processamento manual das amostras

e da resposta individual de cada animal ao estímulo. Dessa forma faz-se

necessária a utilização de outras metodologias, dentre elas o PCR (polymerase

chain reaction) para aumentar a especificidade e sensibilidade da mensuração dos

níveis das proteínas, dessa forma, futuros trabalhos se fazem necessários para a

compreensão do completo mecanismo de ação da TOC no metabolismo ósseo.

36

CONCLUSÕES

Concluímos que o estímulo mecânico gerado pela TOC de forma

percutânea nas tíbias e fíbulas dos animais ativa a resposta bioquímica

intracelular (deformação mecânica da MEC/Integrina/Fak), onde houve a

fosforilação de Erk e Akt no grupo tratado em relação ao grupo controle.

Os resultados desse estudo contribuirão para melhorar o entendimento

dos efeitos das deformações mecânicas no tecido ósseo e para o aperfeiçoamento

do tratamento de patologias do aparelho locomotor como a osteoporose e fraturas.

6.1- Sugestões para trabalhos futuros

Testar um maior número de proteínas [dentre elas: IRS1

(insulin receptor substrate 1), JNK e p38] para comprovar com melhor eficácia a

resposta do tecido ósseo ao estímulo mecânico. E a utilização de outros métodos

de avaliação como por meio de PCR, onde pode ser observado a expressão

gênica das proteínas a serem pesquisadas.

37

REFERÊNCIAS

Alves ALG, Fonsceca BP, Amorim RL, Thomassian A, Hussno CA, Nicoletti JLM.

Effects of Extracorporeal Shock Wave Treatment on Equine Tendon Healing.

News Letter. 2005; 1(1):12-4.

Batra N, Riquelme MA, Burra S, Kar R, Gu S, Jiang JX. Direct Regulation of

Osteocytic Connexin 43 Hemichannels through AKT Kinase Activated by

Mechanical Stimulation. Journal of Biological Chemistry. 2014;289(15):10582-91.

Bonewald LF. Mechanosensation and Transduction in Osteocytes. Bonekey

Osteovision. 2006; 3(10):7-15.

Brañes JA, Guiloff L. Tendinosis of Shoulder and Related Entities Treated with

ESWT. Histopathological and Clinical Correlation. News letter ISMST. 2007;

3(1):9-10.

Burger EH, Klein-Nulend J, Plast AVD, Nijweide PJ. Function of osteocytes in

bone- their role in mecahnotransduction. The journal of nutrition. 1995; 2020-3.

Cargnello M, Roux PP. Activation and Function of the MAPKs and Their

Substrates, the MAPK-Activated Protein kinases. Microbiology and molecular

biology reviews. Mar. 2011; p.50-83.

Carvalho MI. Diagnóstico de Classificação das Doenças Osteometabólicas.

In: Lima CLA, Oliveira LG. Cínica Ortopédica. Belo Horizonte: Medsi;

2003;4(2):261-72.

Chen YJ, Kuo YR, Yang KD, Wang CJ, Sheen Chen SM, Huang HC, et al.

Activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) and p38 kinase in shock

wave-promoted bone formation of segmental defect in rats. Bone. 2004;

34(3):466-77.

38

Choi ST, Kim JH, Kang EJ, Lee SW, Park MC, Park YB, et al. Osteopontin might

be involved in bone remodelling rather than in inflametion in ankylosing spondylitis.

Rheumatology. 2008;27:1775-9.

Coleman RE. Clinical Features of Metastatic Bone Disease and Risk os Skeletal

Morbidity. Clinical Cancer Research. 2006;12:6243-9.

Duncan RL e Turner CH. Mechanotransduction and the functional response of

bone to mechanical strain. Calcified tissue international. 1995;57:344-58.

Frajacomo FTT, Falcai MJ, Fernandes CR, Shimano AC, Garcia SB. Adaptações

biomecânicas do osso cortical de camundongos submetidos a três diferentes

modalidades de exercício. Acta Ortopédica Brasileira. 2013;(6):328-32.

Fritton SP, McLeod KJ, Rubin CT. Quantifying the strain history of bone: spatial

uniformity and self-similarity of low-magnitude strain. Journal of biomechanics.

2000;33:317-325.

Frost MD, Harold MBMU. Population dynamics in bone remodeling. In: Frost MD,

Harold M. Bone remodeling and its relationship to metabolic bone diseases.

Springfield: Charles C Thomas. 1973;3:54-84.

Frost HM. Bone´s mechanostat: A 2003 update. The anatomical record part A.

2003;275(2):1081-101.

Frost HM. A 2003 update of bone physiology and Wolff´s law for clinicians. Angle

Orthodontist. 2004;74(1):3-15.

Gartner LP, Hiatt JL. Tratado de histologia em cores. 3ed. São Paulo. Futura.

2007:71-160.

Gusmão CVB, Belangero WD. Como a célula óssea reconhece o estímulo

mecânico? Revista Brasileira de Ortopedia. 2009;(44):299-305.

Gusmão CVB, Pauli JR, Saad MJA, Alves JMA, Belangero WD. Low-intensity

Ultrasound Increased Fak, Erk-1/2, and Irs-1 Expression of Intact Rat Bones in a

Noncumulative Manner. Clin Orthop Relat Res. 2010;468:1149-56.

39

Ham AW. Histologia. 8ed. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan. 1983.

Heron-Milhavet L, Khouya N, Fernandez A, Lamb NJ. Akt1 and Akt2:

Differentiating the aktion. Histology and Histopathology. 2011;(26):651-62.

Hoey DA, Chen JC, Jacobs CR. The primary cilium as a novel extracellular sensor

in bone. Frontiers in Endocrinology. 2012;3(75):1-11.

Hughes JM, Petit MA. Biological underpinnings of Frost’s mechanostat thresholds:

The important role of osteocytes. J Musculoskelet Neuronal Interact 2010;

10 (2):128-35.

Hung CT, Allen FD, Pollack SR, Brighton CT. What is the role of the convective

current density in the real-time calcium response of cultured bone cells to fluid

flow? Journal of Biomechanics. 1996;29(11):1403-9.

Junqueira LC, Caneiro J. Histologia básica. Tecido ósseo. 10 ed. Rio de Janeiro

Guanabara koogan. 2004;136-53.

Little N, Rogers B, Flannery M. Bone formation, remodeling and healing.

Basic Science. 2011;29(4):141-145.

Maier M, Milz S, Tischer T, Munzing W, Manthey N, Stabler A, et al. Influence of

extracorporeal shock-wave application on normal bone in an animal model in vivo.

Scintigraphy, MRI and histopatlology. The journal of bone and joint surgery.

2002;84-B(4):592-9.

Malone AMD, Anderson CT, Tummala P, Kwon RY, Johnston TR, Stearns T, et al.

Primary cilia mediated mechanosensing in bone cells by a calcium-independent

mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America. 2007;104(33):13325-30.

Martin RB. The importance of mechanical loading in bone biology and medicine.

Journal of musculoskelet neuronal interact. 2007;7(1):48-53.

40

Marx SJ. Doenças do osso e metabolismo ósseo. In: Bennett JC, Plum F, editors.

Tratado de medicina interna, 20 ed. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan.

1997;1495-540.

Mikic B, Carter DR. Bone strain gage data and theoretical models of functional

adaptation. Jouranl of biomechanics. 1995;28(4):465-9.

Moon BJ, Kim HJ, Kim K, Youn UB, Ko A, Lee YS, et al. Akt induces osteoclast

differentiation through regulation the GSK3 β/NFATc1 signaling cascade. Journal

of Immunologie. 2011;(188):163-9.

Neto JFM. Osteoporose secundária: Mecanismo de instalação e tratamento.

In: Lima CLA, Oliveira LG. Cínica Ortopédica. Belo Horizonte: Medsi; 2003;

4(2):317-23.

Neuland H, Delhase Y, Duchstein HJ, Schmidt A, Bloch W. Extracorporeal Shock

Waves Influences Migration, Proliferation and Growth of Human Mesenchymal

Stem Cells. News Letter. 2008;v.4,n.1,p.13-6.

Neve A, Corrado A, Cantatore FP. Osteocytes: central conductors of bone biology

in normal and pathological conditions. Acta physiologica. 2012;(204):317-30.

Nortanicola A, Tamma R, Moretti L, Panella A, Endice SD, Zallone A, et al.

Effect of shock wave treatment on platelet-rich plasma added to osteoblast culture.

Ultrasound in Medicine and Biology. 2011;v.37,n.1,p.160-8.

Ogden JA, Tóth-Kischkat A, Schultheiss R. Principles of shock wave therapy.

Clinical Orthopaedics and related research. 2001;(387):8-17.

Oliveira LG, Guimarães MLR. Tecido ósseo - estrutura e função. In: Lima CLA,

Oliveira LG. Cínica Ortopédica. Belo Horizonte: Medsi. 2003;4(2):243-51.

Reinholt FP, Hultenby K, Oldberg A, Heinegard D. Osteopontin-a possible anchor

of osteoclasts to bone. Cell Biology. 1990;87:4473-5.

41

Rice JC. On the dependence of the elasticity and strength of cancellous bone on

apparent density. Journal of biomechanics. 1988;21(2):155-68.

Rockett PRP, Souza ACP. Terapia por ondas de Choque. In: Programa de

Atualização em Ortopedia e Traumatologia. Ciclo 4, módulo 1: Artmed. 2007;

p.9-84.

Santos A, Bakker AD, Willems HME, Bravenboer N, Bronckers ALJJ,

Klein-Nulend J. Mechanical Loading Stimulates BMP7, But Not BMP2, Production

by Osteocytes. Calcif Tissue Int. 2011;(89):318-26.

Schaden W, Fischer A, Sailler A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion

or delayed osseous union. Clinical Orthopaedics and Related Research. 2001;

(387):90-4.

Tam KF, Cheung WH, Lee KM, Qin L, Leung KS. Osteogenic effects of

low-intensity pulsed ultrasound, extracorporeal shockwaves and their combination -

an in vitro comparative study on human periosteal cells. Ultrasound Med Biol.

2008;34(12):1957-65.

Tamma R, Endice S, Nortanicola A, Moretti L, Patella S, Patella V, et al.

Extracorporeal shock waves stimulate osteoblast activities. Ultrasound in Medicine

& Biology. 2009;v.35,n.12,p.2093-100.

Tate MLK. “Whither flows the fluid in bone?” An osteocyte´s perspective. Journal of

biomechanics. 2003;36:1409-24.

Temiyasathit S, Jacobs CR. Osteocyte primary cilium and its role in bone

mechanotransduction. Ann. New York Academy Science. 2010;(1192):422-8.

Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Eletrophoretic transfer of proteins from

polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.

Proc Natl Acad Sci USA. 1979;76(9):4350-4.

Turner CH e Pavalko FM. Mechanotransduction and functional response of the

skeleton to physical stress: The mehanisms and mechanics of bone adaptation.

Journal of orthopaedic science. 1998;3:346-55.

42

Van der Jagt OP, Van der Linden JC, Schaden W, Van Schie HT, Oiscaer TM,

Verhaar JA, et al. Unfocused extracorporeal shock wave therapy as a potential

treatment for osteoporosis. Journal of orthopaedic research. 2009;27(11):

1528-33.

Van der Jagt OP, Waarsing JH, Kops N, Schaden W, Jahr H, Verhaar JA, et al.

Unfocused extracorporeal shock wave induces anabolic effects in osteoporotic

rats. Journal of orthopaedic research. 2013;31(5):768-75.

Wang CJ, Huang HY, Chen HH, Pai CH, Yang KD. Effect of shock wave therapy

on acute fractures of the tibia. Clinical Orthopaedics and Related Research. 2001;

(387):112-8.

Wang CJ, Huang HY, Pai CH. Shock wave-enhanced neovascularization at the

tendon-bone junction: An experiment in dogs. The Journal of Foot & Ankle

Surgery. 2002;(41)1:16-22.

Wang CJ, Wang FS, Yang KD, Weng CH, Huang C, Yang L. Shock wave therapy

induces neovascularization at the tendon-bone junction a study in rabbits.

Journal of Orthopaedic Research. 2003;(21):984-9.

Wang CJ. Extracoporeal shockwave therapy in musculoskeletal disorders.

Journal of orthopaedic surgery and research. 2012;7-11.

Wang FS, Wang CJ, Chen SMS, Kuo YR, Chen RF, Yang KD. Superoxide

Mediates Shock Wave Induction of ERK-dependent Osteogenic Transcription

Factor (CBFA1) and Mesenchymal Cell Differentiation toward Osteoprogenitors.

The Journal of Biological Chemistry. 2002;(277)13:10931-7.

Wang Y, McNamara LM, Schaffler MB, Weinbaum S. A model for the role of

integrins in flow induced mechanotranduction in osteocytes. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America.

2007;(104)40:15941-6.

43

Weinbaum S, Cowin SC, Zeng Y. A model for the excitation of osteocytes by

mechanical loading-induced bone fluid shear stresses. Journal of Biomechanics.

1994;(27)3:339-60.

Winter LC, Walboomers XF, Bumgardner JD, Jansen JA. Intermittent versus

continuous stretching effects on osteoblast-like cells in vitro. Journal of biomedical

materials research. 2003;67A(4):1269-75.

Wolff J. The classic: On the inner architecture of bones and its importance for bone

growth. Clinical orthopaedics and related research. 2010;468:1056-65.

Wolff J. The classic: On the significance of the architecture of the spongy

substance for the question of bone growth: a preliminary publication. Clinical

orthopaedics and related research. 2011;469:3077-8.

You L, Cowin SC, Schaffler MB, Weinbaum S. A model f or strain amplification in

the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix.

Journal of Biomechanics. 2001;34(11):1375-86.

Young B, Lowe JS, Stevens A, Heath JW. Tecidos Esqueléticos In: Histologia

funcional. 5.ed. São Paulo. 2007;189-206.

Yu W, Shen T, Liu B, Wang S, Li J, Dai D, et al. Cardiac shock wave therapy

attenuates H9c2 myoblast apoptosis by activating the Akt siganl pathways.

Cellular Physiology and Biochemistry. 2014;(33):1293-303.

Xu ZH, Jiang Q, Chen DY, Xiong J, Shi DQ, Yuan T, et al. Extracorporeal shock

wave treatment in nonunios of long bone fractures. International Orthopaedics.

2009;(33):789-93.

Xue H, Zheng J, Cui Z, Bai X, Li G, Zhang C, et al. Low-intensity pulsed ultrasound

accelerates tooth movement via activation of the BMP-2 signaling pathways.

plosone.org. 2013;8(7):1-10.

44

ANEXO I

Carta de submissão do artigo (20 de janeiro de 2015)

Sta Lídia Dornelas de Faria,

Agradecemos a submissão do seu manuscrito "Terapia por ondas de

choque eletrohidráulicas aumenta a atividade da ERK-1/2 e Akt em tíbias íntegras

de ratos por 21 dias após estímulo inicial." para Acta Ortopédica Brasileira.

Através da interface de administração do sistema, utilizado para a submissão, será

possível acompanhar o progresso do documento dentro do processo editorial,

bastando logar no sistema localizado em:

URL do Manuscrito:

http://submission.scielo.br/index.php/aob/author/submission/145023

Login: lidiadornelas

Em caso de dúvidas, envie suas questões para este email.

Agradecemos mais uma vez considerar nossa revista como meio de transmitir ao

público seu trabalho.

Fernanda Colmatti

Acta Ortopédica Brasileira

Acta Ortopédica Brasileira

http://submission.scielo.br/index.php/aob

Fernanda Colmatti / Arthur Tadeu de Assis.

Atha Comunicação e Editora Ltda.

Fone/ Fax: 55 11 5087-9502/ 5579-5308

http://submission.scielo.br/index.php/aob/author/submission/145023http://submission.scielo.br/index.php/aob

45

ANEXO II

Artigo submetido em 20 de janeiro de 2015.

Terapia por ondas de choque eletrohidráulicas aumenta a atividade da ERK-

1/2 e Akt em tíbias íntegras de ratos por 21 dias após estímulo inicial

Extracorporeal Shock wave therapy increases ERK-1/2 and Akt activity of

intact rat tibia for 21 days following primary stimulation

Lídia Dornelas de Faria¹, Alexandre Gabarra Oliveira², Juliana Falcato Vecina²,

Mario Jose Abdalla Saad², Carlos Vinícius Buarque de Gusmão¹, William Dias

Belangero¹

1-Laboratório de Biomateriais em Ortopedia (LABIMO) - Departamento de

Ortopedia e Traumatologia - Faculdade de Ciências Médicas - Universidade

Estadual de Campinas (Unicamp)

2-Laboratório de Investigação Clínica em Resistência à Insulina (LICRI) -

Departamento de Medicina Interna - Faculdade de Ciências Médicas -

Universidade Estadual de Campinas (Unicamp)

46

RESUMO

Objetivo: Determinar se a atividade da FAK (focal adhesion kinase),

ERK-1/2 (extracellular signal-regulated kinase) e Akt aumentam após terapia por

ondas de choque (TOC) eletrohidráulicas em ossos íntegros de ratos saudáveis.

Métodos: Quinze ratos Unib: WH machos foram submetidos à TOC em uma única

sessão em que foram aplicados 500 pulsos a 4 Hz e 0,12mJ/mm² nas patas

posteriores direita e esquerda. Após 7, 14 ou 21 dias, a atividade da FAK, ERK-1/2

e Akt das tíbias e fíbulas desses animais foram avaliadas por immunoblotting.

Outros quinze ratos foram falsamente estimulados e serviram como grupo

controle. Resultados: A atividade da ERK-1/2 e Akt aumentaram em todos os

grupos, porém a FAK não foi identificada em nenhum espécime.

Conclusões: A TOC aumenta a atividade da ERK-1/2 e Akt por 21 dias,

mas não é capaz de aumentar a atividade nem a expressão da FAK a partir de

7 dias do estímulo inicial. Nível de Evidência II, Estudo Prospectivo e Comparativo.

Descritores: Terapia por ondas de choque, mecanotransdução, osteogênese,

FAK, ERK, Akt.

ABSTRACT

Purpose: Determine whether FAK (focal adhesion kinase), ERK-1/2 (extracellular

signal-regulated kinase) and Akt activation are increased by extracorporeal shock

wave therapy (ESWT) in intact and healthy rat tibia. Methods: Each hindlimb of

15 Unib: WH male rats received 500 impulses of shock waves at 4 Hz and

0.12mJ/mm2. Seven, 14 or 21 days following that single stimulation, FAK, ERK-1/2

and Akt activities were assessed by immunoblotting. Fifteen rats received sham

ESWT and were assigned to the control group. Results: Increased ERK-1/2 and

Akt activation were observed in the treatment groups, but FAK expression and

activation were not detected in any specimen. Conclusions: ESWT increases

47

ERK-1/2 and Akt activation for 21 days, but fails to increase FAK expression and

activity 7 days following primary stimulation. Evidence level II, Prospective and

Comparative Study.

Keywords: Extracorporeal shockwave therapy, mechanotransduction,

osteogenesis, FAK, ERK, Akt.

INTRODUÇÃO

Terapia por ondas de choque (TOC) e ultrassom de baixa potência

(USbp) são métodos físicos não invasivos utilizados na prática ortopédica para

acelerar a consolidação óssea e tratar pseudoartrose(2,12,14,15). As ondas

mecânicas produzidas por esses aparelhos deformam as células ósseas e ativam

proteínas que promovem proliferação celular, migração celular e inibição da

apoptose. Baseado principalmente em estudos in vitro, advoga-se que a FAK

(focal adhesion kinase) é uma das primeiras e principais proteínas ativadas pelas

deformações mecânicas, funcionando como um conversor da deformação

mecânica em sinal biológico. Após ativação, a FAK ativa vias de sinalização

celular nas quais ERK-1/2 (extracelluar signal-regulated