terapia génica: da produção de modelos animais de doença ao tratamento luís pereira de almeida...
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Terapia Génica:da produção de modelos animais de doença
ao tratamento
Luís Pereira de Almeida
Departamento de Vectores e Terapia Génica Head: Mª Conceição Pedroso de Lima
Encontro de Ciência em PortugalFundação Calouste GulbenkianLisboa, 12 e 13 de Abril de 2007
Vectores virais
Transplantação de células
Células encapsuladas
Bombas osmóticas
Aebischer and Ridet TINs; 2000
Sistemas poliméricos
Terapia génica ex vivo
Terapia génica in vivo
Estratégias de administração para o sistema nervoso central
LPAlmeida
Transferência de genes com vectores lentivirais
Célula alvo
LTR GAGPRO POL
VIFVPR VPU NEF
LTRENV
TATREV
HIV-1
PGKGAG RRE
SASD
LTR
SIN
Transgene WHV
Genoma do vector
• Terceira geração - Seguros
• Sem capacidade de replicação
• Transdução de células que não se dividem
• Neurotropismo
• Expressão prolongada
• Ausência de resposta imunitária
LPAlmeida
Medula espinal
estriado
SN
200 000 a 300 000 células com o gene de interesse
Transferência de genes para diferentes regiões do sistema nervoso central do rato
RNA genome
surface glycoprotein
transmembrane proteins
matrixcapsidnucleocapsid
integrasereverse transcriptase
RNA genome
surface glycoprotein
transmembrane proteins
matrixcapsidnucleocapsid
integrasereverse transcriptase
RNA genome
surface glycoprotein
transmembrane proteins
matrixcapsidnucleocapsid
integrasereverse transcriptase
RNA genome
surface glycoprotein
transmembrane proteins
matrixcapsidnucleocapsid
integrasereverse transcriptase
RNA genome
surface glycoprotein
transmembrane proteins
matrixcapsidnucleocapsid
integrasereverse transcriptase
RNA genome
surface glycoprotein
transmembrane proteins
matrixcapsidnucleocapsid
integrasereverse transcriptase
LPAlmeida
Doença de Huntington
transcrição Huntingtina- 350kDa
traduçãoNH2
>40 Doença de Huntington
(CAG)n
huntingtin gene
8-29 normal
- 67 exões- 200 kb- cromossoma 4
Gene da Huntingtina
• Movimentos involuntários descoordenados, demencia, depressão, psicose
• morte 15-20 anos após manifestação• Sem terapia• Modelos transgénicos com
neurodegeneração, quando existente, muito ligeira
Neurónios Gabaérgicos
striatum
LPAlmeida
Gene mutado
Promotor5’LTR 3’ LTRGene da doença
1vector lentiviral
4
Modelos animais
Injecção no cérebro3
2
Produção de vectores lentivirais
- Doença de Huntington - Doença de Machado-Joseph- Doença de Parkinson- Doença de Alzheimer
Vectores lentivirais para produzir modelos animais de doenças neurodegenerativas
LPAlmeida
Vectores
controlo
Produção de um modelo da doença de Huntington utilizando vectores lentivirais
0.5mm
Agregados de huntingtina
Lesão neuronal
Huntingtina mutante 82 Q
transgene
transgene
Vectores
Huntintina mutante
VectoresHuntingtina mutante
50 µm
100 µm
Huntingtinacontrolo 19 Q
Ausência de agregados de huntingtina
Ausência de lesão neuronal
Injecção estereotáxica no cérebro do rato
LPAlmeida
• Novos modelos genéticos
• Transponíveis para outras espécies
• Estudo dos mecanismos moleculares da doença in vivo
• Avaliação de terapias
Utilização de vectores lentivirais para produzir modelos animais de doenças neurodegenerativas
Ataxia espinocerebelosa do tipo 3 ou doença de Machado Joseph
• Doença neurodegenerativa
• Maior incidência em Portugal (Ilha das Flores)
• Principal sintoma: ataxia - descoordenação dos movimentos musculares voluntários
Taroni F & DiDonato Nat Rev Neurosci. 2004 Aug;5(8):641-55
gene SCA3/MJD1
(CAG)n
n= 13-36 normal
n= 61 a 84 doença
Ataxina 3transcrição
translação
-14q32.1
NH2
gene da ataxina-3
42 kDa
LPAlmeida
AGCAGCAGCGGGACCTATC shAtax mut
T T C AA
A G AGTCGTCGTCGCCCTGGATAG
AGCAGCAGGGGGACCTATC shAtax wt
T T C AA
A G AGTCGTCGTCCCCCTGGATAG
Nova estratégia para o tratamento da doença de Machado-Joseph
silenciamento da expressão da ataxina-3 mutante com vectores lentivirais
Ataxina mutante
+
sequencias controlo
Ataxina mutante
+
sequências para silenciamento
ataxina-3 mutante
1H9 DARPP-32 Dupla marcação
1H9 DARPP-32
3 semanas
Neuroprotecção mediada pelos lentivirus que silenciam a produção da ataxina mutante
Ausência de agregados e de perda de DARPP-32
Agregados de Ataxina-3 perda de IR-DARPP-32
Ataxina-3 mutante
+ sequencias
controlo
Ataxina-3 mutante
+ sequências
para silenciamento
ataxina-3 mutante
LPAlmeida
Vectores lentivirais: plataforma tecnológica de administração no Sistema Nervoso Central
Mutantgene
Therapeuticgene
Therapy / validation ofmolecular targets
Models ofdisease
Mutantgene
Mutantgene
Therapeuticgene
Therapeuticgene
Therapy / validation ofmolecular targets
Models ofdisease
• Gerar novos modelos animais de doenças do Sistema Nervoso Central
• Validar alvos terapêuticos
• Terapia génica para o Sistema Nervoso Central
Terapia/validação de alvos moleculares
Modelos de doença
LPAlmeida
Agradecimentos
MIRCen
Nicole Déglon
Philippe Hantraye
Emmanuel Brouillet
Raymonde Hassig
Nöelle Dufour
Patrick Aebischer
Ruth Luthi-Carter
Étienne Regulier
Philippe Colin
Valérie Perrin
Veronica ColomerJohns Hopkins School of
Medicine, USA
Sebastian KuglerGottingen University, DE
Sandro AlvesIsabel FerreiraAna Luísa Carvalho Conceição Pedroso LimaSérgio SimõesJoão Nuno Moreira
1H9 DARPP-32 Dupla marcação
1H9 DARPP-32
3 semanas
Neuroprotecção mediada pelos lentivirus que silenciam a produção da ataxina mutante
Ausência de agregados e de perda de DARPP-32
Agregados de Ataxina-3 perda de IR-DARPP-32
Ataxina-3 mutante
+ sequencias
controlo
Ataxina-3 mutante
+ sequências
para silenciamento
ataxina-3 mutante
LPAlmeida
• Vectores lentivirais que expressam RNAs curtos de cadeia dupla permitem silenciar a expressão da ataxina-3 mutante envolvida na doença de Machado-Joseph- potencial interesse terapêutico
Vectores
controlo
VectoresHuntingtina mutante
de Almeida et al. (2002) J. Neurosci. 22: 3473-3483
Lentiviral-based Model of Huntington’s disease in adult rats
0.5mm
50 µm 100 µm
Agregados de huntingtina Lesão neuronal
Hu
nti
ng
tin
a m
uta
nte
82
Q
transgene
Hu
nti
ng
tin
aco
ntr
olo
19
Q
transgene