tegumentos de sementes como barreiras quÍmicas de defesa contra o ataque do inseto...
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TEGUMENTOS DE SEMENTES COMO BARREIRAS QUÍMICAS DE
DEFESA CONTRA O ATAQUE DO INSETO Callosobruchus
maculatus E FUNGOS FITOPATOGÊNICOS
PATRÍCIA DE OLIVEIRA SANTOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
ABRIL - 2007
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II
TEGUMENTOS DE SEMENTES COMO BARREIRAS QUÍMICAS DE
DEFESA CONTRA O ATAQUE DO INSETO Callosobruchus
maculatus E FUNGOS FITOPATOGÊNICOS
PATRÍCIA DE OLIVEIRA SANTOS
Tese apresentada ao Centro de Biociências e
Biotecnologia, da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do Título de
Mestre em Biociências e Biotecnologia.
Orientadora: Profa. Antônia Elenir Amâncio Oliveira
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
ABRIL - 2007
III
TEGUMENTOS DE SEMENTES COMO BARREIRAS QUÍMICAS DE
DEFESA CONTRA O ATAQUE DO INSETO Callosobruchus
maculatus E FUNGOS FITOPATOGÊNICOS
PATRÍCIA DE OLIVEIRA SANTOS
Tese apresentada ao Centro de Biociências e
Biotecnologia, da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do Título de
Mestre em Biociências e Biotecnologia.
Aprovada em 10 de abril de 2007.
Comissão Examinadora:
_____________________________________________________
Prof. Dr. José Roberto da Silva – UNIG
_____________________________________________________
Profa. Dra. Valdirene Moreira Gomes – UENF
_____________________________________________________
Profa. Dra. Maria das Graças Machado Freire – ISECENSA
_____________________________________________________
Profa. Dra. Antônia Elenir Amâncio Oliveira – UENF
Orientadora
IV
Ao Mestre dos mestres, Jesus Cristo,
Honra, glória e louvor sejam dados a Ele.
À minha amada família,
Por grande amor e estímulo.
A Gustavo,
Por todo companheirismo
e amor.
V
AGRADECIMENTOS
À Profa. Elenir por ter sido uma orientadora sempre atenciosa e presente.
Agradeço por sua paciência, amizade e confiança em mim depositada.
Ao Prof. José Xavier-Filho e à Profa. Kátia Valevski Sales Fernandes pelas
contribuições neste trabalho.
Aos Professores Maria da Graça Machado Freire, José Roberto da Silva e
Valdirene Moreira Gomes por aceitarem fazer parte da banca examinadora.
À Professora Marília Amorim Berbert de Molina por aceitar ser a revisora
deste trabalho.
À Profa. Valdirene Moreira Gomes pelas inúmeras contribuições durante e
minha pós-graduação e colaboração nos ensaios com os fungos.
À Profa. Olga Lima Tavares Machado por gentilmente ter colaborado no
seqüenciamento.
À Profa. Maura da Cunha pela colaboração e auxílio nos ensaios
imunohistoquímicos.
À doutora Adriana Uchôa, com quem muito aprendi no decorrer deste
trabalho. Muito obrigada pela paciência, pelas valiosas sugestões e também pelo
cuidado na manutenção da colônia dos insetos.
À doutoranda Izabela Santos por gentilmente ter cedido o anticorpo contra
quitinase e a quitinase de Adenanthera pavonina.
Às grandes amigas do grupo: Elane, Amanda, Simone, Sheila, Alice, Jamile,
Iara Daniela e Karla.
Aos colegas de laboratório: Adriana, Luciana, Patrícia, Fábio, Natália,
Lucilene, Cassiana, Márcio, Rodrigo e Flávia, pelo agradável convívio no ambiente
de trabalho.
VI
Aos colegas do LFBM: Marta, Izabela, Suzana, Ana Paula e André por toda
ajuda nos experimentos com os fungos.
Aos técnicos do LQFPP: Cristóvão, Sheila, Jucélia e Izabela por contribuírem
para o bom andamento deste trabalho.
Às técnicas do LBCT: Giovana Alves e Beatriz Ferreira pela contribuição nos
experimentos de microscopia.
A todos que de alguma forma contribuíram na minha formação acadêmica e
na realização deste trabalho.
VII
SUMÁRIO
Pág.
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................... XI
LISTA DE TABELAS ........................................................................................ XIII
ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES ...................................................................... XIV
RESUMO ............................................................................................................. XV
ABSTRACT ......................................................................................................... XVI
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 1
1.1- Sementes ...................................................................................................... 1
1.1.1-Tegumento de sementes de legumes .................................................. 2
1.2- Mecanismo de defesa de sementes .............................................................. 6
1.2.1- Proteínas tóxicas ................................................................................. 6
1.2.2- Participação do tegumento nos mecanismos de defesa ..................... 9
1.3- Glycine max ................................................................................................. 10
1.3.1- Proteínas do tegumento da semente de soja .................................. 11
1.4- O bruquídeo Callosobruchus maculatus ....................................................... 14
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 16
2.1- Objetivo geral ............................................................................................... 16
2.2- Objetivos específicos ................................................................................... 16
3. MATERIAL ................................................................................................. 17
3.1- Material biológico .......................................................................................... 17
3.1.1- Sementes ........................................................................................... 17
3.1.2- Insetos ................................................................................................ 17
3.1.3- Microrganismos .................................................................................. 17
VIII
3.2- Reagentes ................................................................................................... 18
4. MÉTODOS ................................................................................................... 19
4.1- Ensaios biológicos com sementes artificiais cobertas com tegumento de
sementes naturais ............................................................................................... 19
4.2- Obtenção das farinhas dos tegumentos das sementes .............................. 21
4.3- Ensaios biológicos com sementes artificiais contendo farinha do
tegumento de sementes naturais ........................................................................ 21
4.4- Extração de proteínas do tegumento e fracionamento com sulfato de
amônio ................................................................................................................. 22
4.5- Cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose .................................. 22
4.6- Atividade biológica das frações não retida (DI) e retida (DII) obtidas na
cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose ........................................... 22
4.7- Dosagem de proteínas ................................................................................ 23
4.8- Eletroforese em gel de poliacrilamida .......................................................... 23
4.9- Seqüenciamento de aminoácidos ................................................................ 23
4.10- Ensaio de atividade fosfatásica em gel ........................................................ 24
4.11- Análise da atividade peroxidásica nas frações do tegumento de soja ......... 24
4.12- “Western Blotting” ......................................................................................... 25
4.13- Dosagem de vicilina pelo método de ELISA ................................................. 26
4.14- Cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-100 ....................... 26
4.15- Atividade biológica das frações obtidas na cromatografia de exclusão
molecular em Sephacryl S-100 ........................................................................... 27
4.16- Dosagem de quitinase pelo método de ELISA ............................................ 27
4.17- Determinação da atividade peroxidásica ..................................................... 27
4.18- Determinação da atividade inibitória de tripsina .......................................... 28
IX
4.19- Localização de quitinase nas larvas de C. maculatus ................................. 28
4.19.1-Preparação do material de rotina para microscopia de luz .............. 28
4.19.2- Preparação do material para imunohistoquímica em resina Unicryl 29
4.19.3- Imunohistoquímica .......................................................................... 29
4.20- Atividade biológica de frações protéicas sobre o crescimento de fungos
fitopatogênicos .................................................................................................... 30
5. RESULTADOS ........................................................................................... 31
5.1- Experimentos de sementes artificiais cobertas com tegumento de
sementes naturais................................................................................................ 31
5.2- Experimentos de sementes artificiais com a farinha de tegumento de
sementes ............................................................................................................. 35
5.3- Perfil cromatográfico da fração precipitada 0-90% do tegumento de soja
em coluna de troca iônica em DEAE-Sepharose ................................................ 37
5.4- Toxicidade das frações não retida (DI) e retida (DII) obtidas na
cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose para C. maculatus ............ 39
5.5- Caracterização das proteínas presentes no tegumento de soja ................ 39
5.6- Detecção de vicilinas nas frações do tegumento de G. max ...................... 40
5.7- Dosagem de vicilina pelo método de ELISA ............................................... 44
5.8- Cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-100 da fração DII.. 44
5.9- Toxicidade das frações obtidas na cromatografia de exclusão molecular
em Sephacryl S-100 para C. maculatus ............................................................ 47
5.10- Dosagem de quitinase pelo método de ELISA ........................................... 47
5.11- Atividade peroxidásica ................................................................................ 51
5.12- Atividade inibitória de tripsina ..................................................................... 51
5.13- Microscopia de luz para rotina das larvas de C. maculatus crescidas em
sementes artificiais .............................................................................................. 54
5.14- Imunohistoquímica ...................................................................................... 54
X
5.15- Toxicidade das frações cromatográficas sobre o crescimento de fungos
fitopatogênicos .................................................................................................... 57
6. DISCUSSÃO .............................................................................................. 59
7. CONCLUSÕES ........................................................................................... 71
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 73
XI
LISTA DE FIGURAS
Pág. Figura 1 Anatomia do tegumento da semente de Glycine max (soja)
analisada por Microscopia Eletrônica de Varredura.
5
Figura 2 Sementes de Glycine max. A, sementes íntegras; B, sementes sem tegumento; C, tegumento.
13
Figura 3 Fêmea de Callosobruchus maculatus infestando sementes de Glycine max.
15
Figura 4 Sementes artificiais cobertas com tegumento de sementes naturais de Canavalia ensiformis (A) e Vigna unguiculata (B).
20
Figura 5 Experimentos de sementes artificiais cobertas com tegumento natural das sementes de Vigna unguiculata cv EPACE-10 (controle), Glycine max, Albizia sp, Dioclea altissima, Canavalia ensiformis e Phaseolus vulgaris (cultivares manteiga vermelho, vermelho e manteiga).
33
Figura 6 Massa das larvas de Callosobruchus maculatus desenvolvidas nos experimentos de sementes artificiais cobertas com tegumento natural de Vigna unguiculata (cv EPACE-10) e Glycine max.
34
Figura 7 (A) Valores de WD50 (concentração que diminui em 50% a massa das larvas) e (B) Valores de LD50 (concentração que diminui em 50% o número de larvas) para os tegumentos das sementes de Glycine max, Albizia sp, Dioclea altissima, Adenantera pavonina e Phaseolus vulgaris (cultivares manteiga vermelho, vermelho e manteiga).
36
Figura 8 Cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose da fração precipitada 0-90% com sulfato de amônia do tegumento de soja.
38
Figura 9 Atividade biológica das frações não retida (A) e retida em DEAE-Sepharose eluída com NaCl 0,25 M (B).
41
Figura 10 (A) Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida 15% das proteínas presentes no tegumento de soja. (B) Atividade peroxidásica em membrana de nitrocelulose de proteínas separadas em gel de poliacrilamida 15% na presença de SDS. (C) Atividade fosfatásica em gel de poliacrilamida nativo 15%. (D) Deteccção de quitinase na fração DII através de “Western blotting”. (E) Seqüência parcial de aminoácidos da proteína de 24 kDa da fração DIII.
42
XII
Figura 11 Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida 15% na presença de SDS (A) e detecção de vicilina por “Western blotting” (B) na farinha do tegumento de soja e na fração precipitada com sulfato de amônio (0-90% de saturação).
43
Figura 12 Dosagem de vicilina na farinha do tegumento, precipitado 0-90% e frações da DEAE-Sepharose. Resultados expressos em concentração de vicilina (ng) por µg proteína (A) e percentagem de vicilina nas frações (B).
45
Figura 13 Cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-100 da fração DII obtida em DEAE-Sepharose.
46
Figura 14 Atividade biológica das frações obtidas em Sephacryl S-100. Massa de uma larva (A) e Percentagem de sobrevivência das larvas (B).
48
Figura 15 Dosagem de quitinase no precipitado 0-90%, fração DII e frações da Sephacryl S-100.
49
Figura 16 Dosagem de quitinase em tegumento das sementes: Canavalia ensiformis (Ce), Adenanthera pavonina (Ap), Dioclea altissima (Da), Albizia sp (A), Vigna unguiculata cv EPACE-10 (Vu), Glycine max (Gm), Phaseolus vulgaris cv manteiga (Pvm), Phaseolus vulgaris cv vermelho (Pvv) e Phaseolus vulgaris cv preto (Pvp).
50
Figura 17 Atividade peroxidásica da fração DII (DEAE-Sepharose) e das frações da Sephacryl S-100.
52
Figura 18 Atividade triptica das frações do tegumento de soja obtidas em DEAE-Sepharose.
53
Figura 19 Corte histológicos de larvas de C. maculatus mantidas em sementes artificiais controle (preparadas apenas com farinha de EPACE-10), corados por azul de toluidina.
55
Figura 20 Cortes histológicos de larvas de C. maculatus mantidas em sementes artificiais contendo 1% da fração S-3.
56
XIII
LISTA DE TABELAS Pág.
Tabela 1 Efeito das frações obtidas após cromatografia em DEAE-Sepharose sobre o crescimento dos fungos filamentosos Fusarium oxysporum e Fusarium lateritium.
60
XIV
ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES
BAPNA N-benzoil-DL-arginina p-nitroanilida
BSA Albumina sérica bovina
DAB Diaminobenzidina
DEAE Dietil aminoetil
DI Fração não retida em DEAE-Sepharose
DII Fração retida em DEAE-Sepharose eluída com cloreto de sódio 0,25 M.
DIII Fração retida em DEAE-Sepharose eluída com cloreto de sódio 0,5 M.
ELISA “Enzime Linked Immunossorbent Assay”
EPACE-10 Genótipo de Vigna unguiculata susceptível ao gorgulho
IgG Imunoglobulina G
kDa Kilodalton
LD50 Concentração da fração protéica que diminui o número de larvas a 50% do número de larvas do controle.
LTP Proteína transportadora de lipídio
MEV Microscopia eletrônica de varredura
PBS Tampão fosfato salina
p-NPP Para-nitrofenilfosfato
S-1 Primeiro pico obtido da Sephacryl S-100
S-2 Segundo pico obtido da Sephacryl S-100
S-3 Terceiro pico obtido da Sephacryl S-100
S-4 Quarto pico obtido da Sephacryl S-100
SDS Dodecil sulfato de sódio
TEMED N’N’N’N’ tetrametiletilenodiamino
Tris Tris-hidroximetil amino etano WD50 Concentração da fração protéica que diminui a massa da larva a
50% da massa do controle.
XV
RESUMO
As fêmeas do bruquídeo Callosobruchus maculatus põem seus ovos no
tegumento da semente. O tegumento é a primeira barreira que o inseto precisa
atravessar antes de alcançar os cotilédones, onde completará o seu ciclo de vida, o
que representa um evento crítico por causa das características físicas e da
toxicidade desse tecido. Neste trabalho, estudamos a influência do tegumento na
capacidade das larvas de C. maculatus em penetrar algumas sementes e
analisamos a participação de proteínas presentes no tegumento de Glycine max
(soja) e seus possíveis potenciais defensivos contra o inseto e fungos
fitopatogênicos. A toxicidade do tegumento foi estudada utilizando um sistema de
sementes artificiais cobertas com tegumentos naturais. Após 20 dias, a toxicidade foi
avaliada determinando a massa e a taxa de sobrevivência das larvas comparadas
com larvas controle. Nossos resultados mostraram que os tegumentos de G. max,
Albizia sp, Dioclea altissima, Canavalia ensiformis e Phaseolus vulgaris (manteiga
vermelho, vermelho e manteiga) interferiram no desenvolvimento das larvas. A
presença de proteínas tóxicas no tegumento de G. max foi analisada. Foram
identificadas proteínas do tipo vicilina, fosfatase, quitinase, além de atividades
peroxidásica e inibitória de tripsina. Frações do tegumento de soja tiveram sua
atividade biológica testada para C. maculatus através de um sistema de sementes
artificiais e foram capazes de reduzir consideravelmente a massa das larvas. DII
(fração obtida em DEAE-Sepharose), S-1 e S-3 (frações obtidas em Sephacryl S-
100) foram as mais tóxicas, com valores de WD50 de 1,14%, 0,9% e 1,65%,
respectivamente. Através de experimentos de ELISA, quantificamos quitinase nas
frações do tegumento de soja (precipitado, DII, S-1, S-2, S-3, S-4) e na farinha do
tegumento de algumas sementes. Apenas a fração S-4 e a farinha de Albizia sp. não
apresentaram proteínas imunorreativas com o anticorpo anti-quitinase. Observamos
a presença de quitinases nos órgãos das larvas de C. maculatus mantidas em
sementes artificiais contendo 1% da fração S-3. Ensaios para inibição de fungos
mostraram que as frações da DEAE-Sepharose foram capazes de inibir o
crescimento de Fusarium lateritium e Fusarium oxysporum. Esses resultados
sugerem que proteínas tóxicas do tegumento de G. max podem ser responsáveis
pela resistência dessas sementes a C. maculatus e a fungos fitopatogênicos.
XVI
ABSTRACT
The bruchid Callosobruchus maculatus females attach their eggs to the seed
coat. The seed coat is the first barrier that the insect needs to cross before reaching
the cotyledons, where it will complete its life cycle, which represents a critical event
because of the physical characteristics and toxicity of this tissue. In this work we
studied the influence of the seed coat in the capacity of the C. maculatus larvae to
penetrate some seeds and analyzed the participation of proteins present in the
Glycine max (soybean) seed coat and their possible defensive potentials against the
insect and phytopathogenic fungi. The toxicity of seed coat was studied by using an
artificial seed system covered with natural seed coats. After 20 days, the toxicity was
evaluated by determining the mass and rate of survival of larvae compared with
control larvae. Our results shown that the seed coats of G. max, Albizia sp, Dioclea
altissima, Canavalia ensiformis and Phaseolus vulgaris (“red butter”, “red” and
“butter”) interfered in the larval development. The presence of toxic proteins was
analyzed in G. max seed coat. Vicilin like, phosphatase and chitinase proteins and
peroxidase and trypsin inhibitory activities were identified. Soybean seed coat
fractions had their biological activities tested against C. maculatus through an
artificial seed system and they were able to reduce the mass of the larvae
considerably. DII (fraction obtained on DEAE-Sepharose), S-1 and S-3 (fractions
obtained on Sephacryl S-100) were the most toxic, with values of WD50 of 1.14%,
0.9% and 1.65%, respectively. By ELISA assays we quantified chitinase in the
fractions of the soybean seed coat (precipitate, DII, S-1, S-2, S-3 and S-4) and in the
flour of the seed coat of some seeds. Only the fraction S-4 and the flour of Albizia sp.
did not present immunoreactive proteins for the anti-chitinase antibody. We observed
the presence of chitinases in the organs of the larvae of C. maculatus maintained in
artificial seeds with 1% of the fraction S-3. Assays for fungi inhibition showed that
DEAE-Sepharose fractions were able to inhibit the Fusarium lateritium and Fusarium
oxysporum growth. These results suggest that toxic proteins of the G. max seed coat
may be responsible for resistance of these seeds to C. maculatus and to
phytopathogenic fungi.
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
1
1. INTRODUÇÃO
Com a descoberta de que uma semente posta no solo originava uma planta,
que posteriormente produziria muitas sementes e que isso representava uma fonte
de alimentação mais segura, o homem modificou seus hábitos nômades, tornando-
se sedentário. Desta forma, as sementes foram consideradas pedras fundamentais
para a edificação das civilizações (Kozlowski, 1972).
A utilização de sementes como alimento pelo homem foi certamente estímulo
para o início da atividade agrícola (Xavier-Filho, 1993), a qual tem sua produção
mundial limitada por doenças e pestes de plantas. Pragas e agentes causadores de
doenças como fungos, bactérias, vírus, nematóides e insetos causam perdas tanto
no rendimento como na qualidade dos produtos agrícolas. O controle de pestes e
doenças de plantas é normalmente obtido por 0é s a ns ie p m
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tis (e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(p)Tj-0.03624 Tc6.23984 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.7Td(d)Tj-0.15168 Tc6.2v1992 0 c17.2797-0.01584 Tc3.71992 0 Td(í)Tj0Tc9.47969 0 Td((m)Tj-0.15168 Tc.71992 0 Td(X)Tj-0.03168 Tc7.4398 Td(a)Tj-0.10416 Tc6.23984 0 T)Tj0.01584 Tc12.4797 0 Td(i)Tj0.08376 Tc2.51992 0 Td(m)Tj-0.15168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992 369 0 Td(u)Tjd(r3984 0 Td0.826.12c6.1190.03168 Tc3.11992 0 Td1.21584 Twd(il)Tj-0.1516426.12c6.1190 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.11992 0éTd(i)Tj-0.01584 Tc2.67969 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.84 Tw(o -0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc2.51992 0 Td(f)Tj-0.10416 Tc3.23984 0 Td(i)Tj0 T9897 0 Td Tc6.11992 0 Td1.13712c6.119 0 Td(v)Tj0.01584 Tc5.63984 (e)Tj0 Tc6.11992o)Tj 0 Td(d)Tj-a)Tj-0.023984 0 Td(r)Tj-0.01584 Tc3.71992(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td2.29584 Tw(a )Tj11.643 0 Td( Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(a )Tj-0.15168 Tc10.43986e4Td(o)Tj0. Td(v)Tj0.015151d(e d)Tj-00.03168 Tc6.11992 0 Td1.33584 Tw(o )Tj0.08376 Tc10.6797 0 Td(m)Tj-0.15168 Tc6.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc.11992 0 Td(eeTd(m)Tj-0.03168 Tc6.11992 fTd(t)Tj-0.15168Tc12.4797 0 Td(t)Tj-00.15168 Tc.67969)TjTd(n)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(í)Tj0 Tc3.239 (e a)Tj-0.15168 Tc16.4398 0 Td(g)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(en)Tj-0.01584 Tc1.10.2 0 Td(p)Tj-0.03168 Tc66.4892 0 Td(o)Tj0 Tc6.23Tf1 0 00.8350-0.15168 Tc10.2 0 Td1.57584 Tw(e )Tj-0.03168 Tc10.6797 6.37j0 Tc6.11992o)Tj.11992 0 Td(ot)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td1.81584 Tw(o )Tj0 Tc11.1598 0 Td(c)hi
ovt o23984 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(e)Tj0 Tc6.23984 0Td(f)Tj-0.03168 Tc3.23984 0 (s s)Tj-0.1516868 Tc6.11992 0 Td2.2j-0.15168 T2773Tc2.4 Td(rn)Tj.28 Tf322.44 -696.719Td(d)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(oe)Tj-0.15168 Tc10 9 0 Td(u)aj-0.10416 trh iemeo 16 Tc6.95977 Tw(é )Tj-0.15168 Tc9.83984 03984 0 Td(l)Tj0.034 0 Td1.32 Tw(. )Tj0.01584 Tc7-0 9 0 Td(u)(t)Tj-0.03168 Tc63984 0 Td(õ0TcTd(o)Tje.0316-r)Tj-0.01584 Tc12.4797 X Td(e)Tj-0.151 Tc11.6398 0 Td(()Tj-0 Tc9.47969 c17.8797 0 Td(t)Tj-0.10416 Tc3.23984 0 Td(i)Tj0 Tc2.4 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992[ 0 (e)270546(-)]TJ(e)Tj0.0837 Tc43361992 0 Td(r)Tj-0.03624 Tc3.84219 0 Td(-)Tj-0.05208 Tc3.71992 0 Td(F)Tj0.01584 Tc6.83984 0 Td(il)Tj-0.15168 Tc5.03984 04 0 Td(sk)Tj-0.03168 Tc11.2797 0 Td(i)Tj0.1j0.01584 Tc6.83984 0 994 Td(e)Tj-0.031181992 0 Td(oTd(9)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(72)Tj-0.0001.18416.4797 0 Td())Tj-1711566.23984 0 Td33.4797 Td())Tj3361992 0.4797 0 Td())Tj-.1j0.01584920 l5866 10.-3w( )Tj-a)T7 Td(i)Tj0.1j-0.15168 Tc9.47969 0.d(g)Tj-0.03168 Tc6.11992 00 9 0 Td(u)1). e ..170.083784 Tc5.63984 0 Td(o)Tj-0.03682416 Tw(s0 Td(e)T50.083784Tc6.23984 0 Td(8 Tc-0.03168 Tc3.84219 Td(g)Tj-0.03168 T Td2.05584 Tw(o )TTj0.08376 Tc6.23984 0sd(()Tj-0 210911992 36 nq10 0 0 10 e)Tj-0.03160 0 cm BT/R11 514 Tcf1 0 0 1 190.42c3.12461 0 Td0Td1.133984 0 Td(1992 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(a )Tj0 Tc10.4398 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.15168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992 (e4Td(o)Tj0.é.5168 Tc12251.1004 Tw2.3497 0 Td11992 0 Td1.78413. Tc5.63984 óTd(8 Tc-0.03168 Tc6.11992 0 Td2.29584 Tw(a )Tj11.643 0Td(f)Tj-0.03168 Tc3.23984 00.37j0 Tc663984 0 Td(a)Tj0 Tc2..11992 (e4Td(o)Tj7. Td-0.03168 Tc3.11992 0 .15168 Tc6.23984 0 Td0.97584 Tw(e )Tj-0.03168 Tc10.0797 0 Td(p)Tj0.01584 Tc6.23984 0 Td(l)Tj-0.15168 Tc2.51992 0 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.11992 0.37j0 Tc60 Td(o)Tj0.015849 Tc6.23984 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(p)Tj-0.03624 Tc6.23984 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3..15168 Tc17.2797 0 Td1.93584 Tw(a )Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(i)Tj-0.01584 Tc2.23984 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.áTd(i)Tj-0.01584 Tc2.11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3.71992 0 Tj0.08376 Tc3.11992 (e44(q)Tj-0.03168 Tcd(t)Tj-0 Tc6.95977 d(n)Tj-0.01584 T0 Td2.05584 Tw(a q)TTj0.01584 Tc12.40.37j0 Tc60 Td(015849 Tc6.23984 023984 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.uc3.71992 0 Td2.1651992c6.119(.15168 TTj0.01584 Tc5.63984 0 Td(i)9584 Tw(a Tw(s )Tj-0 Tw(a )Tj0.08376 Tc6.23984 0pTd(o)Tj-0.03624 Tc6.11992 0 Td(f)Tj-0.03168 Tc3.23984 0 c3.23984 0 Td(i)Tj0 Tc2.4 0 Td(c)Tj-0.03168 Tc5.615168 Tc17.2797 0 Td1.93584 Tw(s )Tj-0.2 0 Td(ó)T51d(e d)Tj-2.3497 0 Td11992 0 Td1.78413. Tc5.63984 Td(u)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Tdt)Tj-00.15168 Tc.0416 Tw(s c)Tj-0.03168 Tc15. 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.4 0 T84 Tw8 Tc-0.03168 Tc6.11992 0 Td003168 Tc6.11992 023984 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.ãTd(il)Tj-0.1516426d2.05584 092 0 Td(o)Tj0 Tc6.23.11992 2)Tj-0.15168 T.15168 Tc17.2797 0 Td1.93584 Tw(a )Tj0.22416 Tc10.6797 0 Td(r)Tj-0.03168 6.11992 0 Td(ua)Tj-00 Tdt)Tj-00.15168 Tc.00 Td1.45584 Tw(e )Tj-0.10412416 Tw(s )o.0 Td(v)-0.1516466.23984 0 Td(t)Tj-Tj-0.03168 Tc10.0797Tc3.35977 00 Td(01584 Tc6.23984 0 c2.51992 0 Td(f)Tj-0.10416 Tc3.28 Tc-0.03168 Tc6.11992 0 Td(e)Tj-0.0316 Tc11.6398 0 71992 0 Td(e)Tj0 Tc6.23984 0Td(f)Tj-0.03168 Tc3.23984 0.11992 0 Td(a)Tj0 T)-0.15164Tc6.11992 0 0 Td(b)Tj0.01584 Tc6.11992 0 Td(i)Tj-0.01584 Tc2.51992 0Tc3.35977 00 Td((o)Tj-0.0368246.23984 0.11992 0 Td(a)Tj0 Tc3168 Tc3.76.11992 0 -0.03168 Tc10.0797 0 Td1.45584)Tj-0.03168 Tc6.11992 fTd((b)Tj0.01584 Td1.93584 Tw(a )Tj0.22416 Tc9.83984 0 Td(n)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(o)Tj-0.03624 Tc6.23984 0 Td3984 0 Td(i)Tj0 Tc2.4 0 (s c)Tj-0.03168 Tc15.51992 0 Td(a)Tj0 Tc6.23984 0.08376 Tc6.23984 0 6 Tw(s )Tj-0.03168 Tc9.6 0 Td0.85584 TwéTd(l)Tj-0.1516181992 0 Td(o Td()Tj-0.03168 Tc10.6797 0 Td(m)Tj-0.15168 Tc.67969)Tj-0.01584 Tc8.15977 0Tc3.35977 00 Td((o)Tj-0.0368246.23984 0 1992 0 Td(o)Tj0 Tc6.23984 0 0 Td(9.6 0 Td0.85584 To)Tj-0.10416 Tc6.23984 0 Td0.8083r)Tj-0.01584 Tc2.20 Td1.45584 Tw(e )Tj-0.10416 Td(n)Tj-0.01584 Tc6.23984 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(á)Tj-0.03168 Tc10.0797 0 Td((o)Tj-0.0368246.23984 0 (l)Tj-0.03168 Tc2.4 0 Td0.01584 Tw(o )Tj-420.112 -19.4402 Td(p)Tj-0.15168 Tc6.23984 .11992 0 Td(aTd(e)Tj-0 T6j-0.1041244797 0 Tdjd(r)TTc5.639831992 0 Td0.80.03168 Tc3.11992 0 Td1.33584 Tw(a )Tj0.22416 Tc10.6797 0 Td(f)Tj-0.15168 Tc3.35977 0 Td(o)Tj-0.03624 Tc6.11992 0 Td3984 0 Td(i)Tj0 Tc2.4 0 Td(c)Tj-0.03168 Tc5.615168 Tc17.2797 0 Td1.93584.11992 0 Td0.08376 T0 Tc6.2382416 Tw(2416 Tw(s )9Tc6.23984 0 Td0.816.23984 0 Td 0 Td(v)Tj-0.03168 Tc5.6390e02d(s)Tj-0.15168 Tc5.639-4Tc27t)Tj--0.15168 Tc3.23984 0 Td0.25584 Tw(o 0 Td(n)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc30 Td(a)Tj-03624 Tc6.11992 .13.11992 0 Td03168 Tc3.71992 0 Td2.41584 Tw(a 3168 Tc9.6 0 Td0.85584 T Td(u)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Tdt)Tj-00.15168 Tc.3984 0 Td(s)Tj-0.01584 Tc5.63984 0 Td0.01584 Tc6.11992 0dTj0.08376 Tc-42 Tc6.11992 0 0 Td()Tj-0.03168 Tc7.559772.4 Td(sk)Tj-0.03168 Tc16 Tc6.95977 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(e )Tj-0.15168 Tc10.8 0 Td(l)Tj-0.15168 Tc2.51992 0 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.11992 (eTd(P)Tj-0.03624 Tc7.55977 0 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(a)Tj-ndTjd(r))Tj246.12c6.1190(c)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td1.21584 Tw(ou )Tj0 Tc16.8 0 Td(P)Tj-0.03624 84 Tcf4 0 Td1.21584 Tw(ou )Tj0 Tc16.8 0n.81584 Tw(o )Tj426d2.05584 T0 Td(nd)Tj0.01584 Tc12.4797 Td(()Tj-0 238323984 0 T097 0 Td11992 0 Td1.7841-0.15168 Tc30 Td(a)Tj-Tc6.23984 0 Td0.813712c6.119 0 Td(v)-0.03168 Tc3.23984 0 cn 0 Td(c)Tj-0.10411992 0 Td(0 Td(a)Tj-03624 Td0.813w(, )Tj-0 Td(a)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td1.1)Tj-0.03624 Tc7.55977 0 Td(u)Tj-0.15168 Tc10.6797 0 Td(m)Tj-0.15168 Tc.c2.4 0 Td(z)Tj-0.03168 Tc5.51992 0 Td(a)Tj0 Tc6.2.3984 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3133984 0 Td(o)Tj0 Tc6.23984 0 Td1.90416 1w(r )Tj-0.15168 Tc7.67969 0 .03168 Tc8.63984 0 Td2.29584 Tw(a )Tj)Tj-0.10416 Tc2.51992 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.4 0 0 Tdi)Tj-0.01584 Tc2.51992 0 T0 Tc6.233133984 0 Td(p584 Tw(o )Tj-42 Tc10.0797 0 Td(p)Tj-0.03168 Tc6.11992 00 Td(a)Tj-a3624 Td0.813w(, )Tj-023984 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc30 9 0 Td(u)uc3.7194c3.766.23984 0 Td0.8083r)Tj-0.01584 Tc2.x416 Tw(s c)Tj-0.03168 Tc15. 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(e )Tj-0.15168 Tc10.8 0.8083r)Tj-0.01584 Tc2.20 Td1.45584 Tw(e )Tj-0.10416ãTd(il)Tj-0.1516426d2.05584 d(rTd(j-0.03164 Tc5.639c11.6398 0 A8083r)Tj1992 0 Td(a)Tj0797 0 Td(ts.151)Tj03168 Tc.116.11992 0 Td(m) Td(e )Tj0 Tc9.95977 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Td(n)Tj0.10416 Tc6.63984 0 Td(e)Tj-0.Tj-0.0316893984 0 Td(a)Tj0 Tc17.2797 0 Td1.93584 Tw(e )Tj-0.03168 Tc11.0398-0.10416 Tc6.23984 0 Td0.8083r Td(e )Tj0 Tc9.95977 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.63984 pw(r )Tj-0.15168 Tc7.67969 0 w(a 3168 Tc9.6 0 Td0.85584 Th7199 0 Td(au)Tj1Tc2.51992 0 Td8d(s)Tj-0.15168 Tc5.63984 0 Td1.68 T 0 Td(v)Tj-0.031 Td1.93584.11d(p)Tj-0.15168-0.15168 3.71992 0 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.4 0 Ta.15168 Tc17.27978Tc6.11992 0 Td(m))Tj-0.15168 Tc10.6797.116(q)Tj-0.03168m)Tj-0.03168Tw(s )Tj-071992 0 Td(a)Tj0 Tc6.11992 0 Td(s )Tj0.10416 Tc10.0797 0 Td(f)Tj-0.03168 Tc3.23984 0 Td(un)Tj-0.15168 Tc12.4797 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.23984 Tw(o )Tj0.08376 Tc10.6797Tj04(q)Tj-0.03168 TcTj0.08376 7d2.41584 Tw(a 3168 Tc9.6 0 Td0.85584 .11992 0 Td0.15168 Tc5.63984 0 T66.11992 0 Td(m))Tj-0.03168 Tc11.0398-0.10416 Tc6.23984 0 Td0.Td(d)Tj-0.15168 Tc6.2v1992 0 c17.2797-0.01584 Tc3.71992 0 Td(í)Tj0Tc9.47969 0 Td((m)Tj-0.15168 Tc.71992 0 Td(X)Tj-0.03168 Tc7.4398 Td(a)Tj-0.10416 Tc6.23984 0 T)Tj0.01584 Tc12.4797 0 Td(i)Tj0.08376 Tc2.51992 0 Td(4)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(n)Tj0.10416 Tc6.23984 0 Td(t)Tj0.15168 T0 Td(v)Tj0.01584 Tc5.63984 0 Td((s)Tj0.10416 Tc53.4797 0 Td(t67969 097 0 Td(2.4 0 Td(o d)0 Tdt)Tj-00.15168 Tc.3984 0 TTd(n)Tj0.10416 Tc6.11992 097 0 Td(797 0 Td1l992 0 Td(i)Tj8 Tc3.71992 0zc3.239Tj-0.03154 Tc6.23984 Td(()Tj-0 Tc9.47969 c2.4 0 Td(z)Tj-0.03168 Tc5.51992 0 Td(a)Tj0 Tc6.3.3497 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc(a) Tcf4 0 Td.15168 Tc12.4797 0 Td0.97584 3e3Td(t)Tjr Td(01584 Tc19961992 0 6 Tc10.8 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.4 0 T-0.15168 Tc3.71992 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(p )j-0.15168 Tc12.47973Tc6d(t)Tj-0.03)Tj03168 Tc.11923984 0 Td 0 Tdl)Tj-0.15168 Tc2.51992 0 Td()Tj-0.03168 Tc10.6797 0c14.5199 0 Td(i)Tj0 Tc2.4 0 Td(v)Tj0.01584 Tc5.63984 0 Td(il)Tj-0.10416 Tc5.0Td(i)Tj-0.01584 Tc2.51992 00 Td((s)Tj0.10416 Tc53.4797 0 Td(t67969)Tj03168 Tc..4 0 Td(o d).81584 Tw(o )Tj0 Tc11.1598 0 Td(c))Tj0.01584 Tc12.47973Tw(s )Tj-0.Td(e)Tj-0.1516181d(e d)Tj-0 Tw(o )Tj-0.15168 Tc10.0797 0 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.23984 Tw(o)Tj-0 Tc9.47969 c2.4 0 Td(z)Tj-0.03168 Tc5.ãTd(il)Tj-0.1516426d2.05584 3e3692 0 Td(o)Tj0 0.015849 5996171992 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992 00 Td3984 0 Td(i)Tj0 Tc2.4 0 Td(c)Tj-0.03168 Tc53.37j0 Tc6639a84 Tw(o -0.01583176.11992 0 -0.0 Td(a)Tj-0.10.0797 0 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.11992 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(r)Tj-0.15168 Tc6.23984343692 0 Td(o)Tj0 -0.031685996171992 0 Td(r)Tj-0.15168 Tc3.71992 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(p)Tj-0.03624 Tc6.24375 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(4)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.11992 Td1.(s)Tj0.10416 Tc52. nq10 0 Tc6.11992 0 Td1 0 Td711)Tj--0.15168 Tc3.23984 0 Td0.25584 Tw(o )Tj-0.03168 Tc68 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.23984 (s s)Tj-0.1516868Tc14.0398 0 Td(p)Tj-0.15168 Tc6.23984 0Td(r)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Tdt)Tj-00.15168 Tc(r)Tj-0.1(u)(t)Tj-0.03168 Tc63984 0 Td(õ0T9 0 Td(u)Tc6.20)Tj-0.015840 Td1.335840 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.11992 0d4 Tw(o -0.01588 Tc3.71992 0 Td(eTj-0.10.0797 c2.51992 0 Td(f)Tj-0.10416 Tc3.23)Tj-0.15168 Tc12.4797 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.23984 Td1.(s)Tj0.10416 Tc52. nq10 0 Tc6.11990 Tc6.119 Tc6.95977 Td(o)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(n)Tj-0.01584 Tc6.23984 011992 0 Td(u)Tj0 Tc6.23984 0 Td(u)Tj-0.15168 Tc10.6797 0 Td(m)Tj-0.15168 Tc.67969 097 0 Td(t)Tj-0.10416 Tc3.239Tj-0.03168 Tc5.63984 Tw(a )Tj0.08376 Tc6.23984 0 w(a )Tj-0.15168 Tc11.6398 00 Td(eTj-0.10.0797 (ç)Tj-0.j-0.151619 Tc6.95977 Td(l)Tj15-0.03168 Tc6.23984 0M Td(d)Tj-0.03168 Td1.93584 Tw(a )T-0.03168 Tc3.11992 ïTd(eTj-30.03168 Tc11.0398-0.10416 Tc6.23984 0 Td0T9 0 Td(u)Tc6.2/R37cm BT/R1161.2523.11992 0 Td(e)j-0.15168 Tc5.03984 0d(u)tt)Tj-0.03168 Tc.25584 Tw(o )Tj-0.j-0.03168 Tc3.11992 0 Td(r)Tj-0.1510 0 cm BT/R1168 2031.11992 .Td(m)Tj-0.03130.03168 Tc1-04 0 Td(sk)Tj-0.03168 Tc.20 Td1.3358421992 0 Td(u)Tj0 Tc6.23984 00Tw(a )Tj0.08376 Tc6.23984 0055168 Tc12.4797 0 Td0.97584 oTd(9)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(72)Tj-0. 210911992 .4797 0 Td())TjTc12.4797 -254.889Tj-0.15168 0.42c3.12461 0 Td0Td1.133984 0 Td(1992 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(a )Tj0 Tc10.4398 0 Td(s)Tj-0.03168 Td Td1.090 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.23984 Tw(s )Tj-0. Td(r)Tj-0.0316151d(e d)Tj-0Td(an)Tj-0.01584 Tc12.3497 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.c9.47969 0 T84 Tw(o )Tj0.10416 Tc10.8 0 Td(f)Tj-0.15168 Tc10.6797 0 Td-0.03168 Tc24 Tc6.11992 Td(i)Tj-0.01584 Tc2.5c3.239Tj-0.0315403168 Tc15. 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.4 0 T84 Tw8 Tc-0.03168 Tc6.11992 0 Td0)Tj-0.15168 Tc3.35977 0 Td(o)Tj-0.03624 Tc6.11992 0 Td3984 0 Td(i)Tj0 T(t)Tj-0.03168 Tc3.c9.47969 00.37j0 Tc6.23984 0 Td0.46416 Tc3.35977 b0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.4 0 T Td(a)Tj-0.15168 Tc6c10.2 0 Td(X)Tj-0.03168 Tc7.4398 m)Tj-0.15168 Tc.67969239Tj-0.0315403168 Tc15.7199 0 Td(au)Tj0 Tc12.47977969 0 Td(a)Tj-0.10416 Tc6.23984 0 Td(l)Tj0.08376 Tc2.4 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td4398 m)Tj6 Tc3.35977 23984 0 Td(r)Tj-0.01584 Tc3.71992(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc11.0398 0 Td(p)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 68 Tc18 0 Td2.65584 Tw(a Tj-0.03168 6.11992 0 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.11992 uTd(S)Tj-0.03168 Tc7.55977 3984 0 Tj-0.03168 Tc6.11992 Td(f)Tj-0.03168 Tc3.23984 0 T d0 Td(e)j-0.1516c2..11992 (e3692 0 :k)Tj-0.03168 Tc.262.4 0 T84 Tw8 T -0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tx3984 0 Td(r)Tj-0.01584 Tc30.37j0 Tc6o.0 Td(v)Tj0.015151992c6.1197969 0 Td(a)Tj-0.10416 Tc6.23b0 Td(i)T-0.03168 Tc6.11992 0 Td2.29-0.03168 Tc10.3199 0 Td(-0.03168 Tc2423984 0 Td1.1)Tj-0.03624 Tc7.55977 0 Td(n)Tj-0.01584 Tc5.63984 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3.23984 0 Td(é)Tj-0.03624 Tc6.11992 Td((e)j-0.15168 Tc5.03984 04 0 Td(sk)Tj-11992 3)Tj--0.15168 Td(g)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(en)Tj-0.01584 Tc1.67969 097 0 Td(t)Tj-0.10416 Tc3.239Tj-0.03168 Tc5.63984 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 Tw(s )Tj-0.deç)Tj-0.j-0.151626.Td(n)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Td2.05584 Tw(om)Tj-0.03168 Tc11.039810.8 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.4 0 T-0.15168 Tc3.71992 0 Td(03984 0 Td2.05584 11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3(e4Td(o)Tj7. Td-0.Td0.46416 8Tc6.23984 07Td(o)Tje.0316-r)T8 Tc2.506 Tc3.84219 Td(g)Tj-0.03168 T8 Tc2.4 0 T84 Tw8 TTd(e)Tj0 Tc6.23984 0Td(f)Tj-0.03168 Tc3.23984 0 (s s3)Tj-0.15168 Tc12.4797 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.23984 Td1.()Tj-0.03168 Tc9.47969(e3692 0 Td(a)Tj0 Tc6.16 8Tc6.23984 04892 0 O Td(g)Tj-0.03168.116.11992 0 Td(m))Tj-0.01584 Tc1.67969 097 0 Td(t)Tj-0.10416 Tc3.239Tj-0.03624 Tc6.11992 0 Td(v)Tj0.01584 Tc5.63984 (ew(s )Tj-0.10410)Tj-0.01584 Tc3.35977 0 Td(o)Tj-0.03624 Tc6.11992 84 Tw8 Tc-0.03168 Tc6.11992 0 Td0)Tj-0.15168 Tc3.23984 0 Td m)Tj-0.15168 Tc.10.2 0 Td(p)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(e)Tj0 Tc6.23984 0 Td(s Td(a )Tj0 Tc10.4398 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.63984 áTd(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(e)T68 Tc18 0 Td2.65584 Tw(a Tc2423984 0 23984 0 Td(r)Tj-0.01584 Tc3(e4Td(o)Tjo ou. Td-0.Td0.4641251.1004 Tw Td(m))Tj-0.15168 Tc10.6797 0 Td m)Tj-0.15168 Tc.x3984 0 Td(r)Tj-0.01584 Tc30.08376 Tc6.2398406 Tc3.84219 0 Td(v)Tj0.01584 Tc5.63984 0 Td(o)Tj-0.03624 Tc6.23984 b0 Td(i)T-0.03168 Tc6.11992 0 Tdt)Tj-0.15168 Tc3.23984 0 Td(é)Tj-0.03624 Tc6.11992 Td((e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(8 Tc3.11992 0 Td1.21584 Td(n)Tj-0.01584 Tc6.23984 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(á)Tj-0.03168 Tc10.0797 Tw(s )Tj-0.10416 Tc6.239849 Tc6.23984 0 Td(r)Tj-0.15168 Tc3.71992 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(3)Tj-0.15168 Tc12.4797 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6.11992 Td(i)Tj-0.01584 Tc2.v1992 0 c17.2797-0.01584 Tc3 Tw(s )Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(d)Tj-984 0 Td1.57(s )Tj-0.de Td m)Tj3.10.0797 (7969239Tj-0.0315403168 Tc15.0 Td(i)Tj0.08376 Tc2.51992 0 Td(4)Tj-0.01584 Tc2.v1992 0 Td(r)Tj-0.01584 Tc3.71992(e)Tj0.08376 Tc3.71992 0 Td(m Tc2423984 0 71992 0 Td(X)Tj-0.03168 Tc7.4398 Td(a)Tj-0.10416 Tc6.23984 0 TTj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.239840 Td(n)Tj-0.0158)Tj-0.03168.01.1004 Tw c10.5598 0 Td0.25584 Tw(e )Tj-0.m)Tj-0.03168 Tc11.6797 0 Td(t)Tj-0.)Tj0.015 0 6 Tw(s )TjTd(m))Tj-0.15168 Tc10.6797 0 Td m)Tj-0.15168 Tc.x3984 0 Td(r)Tj-0.01584 Tc30Td(4)Tj-0.01584 Tc21.5497 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc(246.23984 0.1)Tj0 Tc1n03624 Td0.87.(e d)Tj-0.0398-0.10416 Tc6.23984 0 Td0.Td(dTd(l)Tj0.08376 Tc2.4 0 Td(mt)Tj-0.03168 Tc10.6797 0 Td-0.Tj-0.03168 Tc5.63984 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 1.57(s )Tj-0.)Tj-0.)Tj0.015 0 1.1004 Tw c10.559-0.03168 Tc3.23984 0 T Td(r)Tj-0.1516 0 1.1004 Tw .15168 Tc6.23984 0 Td2.05584 Tw(o )Tj0.08376 Tc10.6797 0 Td-)Tj0.0158503168 Tc11.6797 0 Tdz.)Tj-0.)Tj0.015 0 68 Tc11.6Td(o)Tj0. 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INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
2
Além disso, é influenciada por diferentes práticas culturais e condições ambientais
(Bewley e Black, 1994). As proteínas constituem um valioso componente de reserva
nas sementes da maioria das espécies de plantas. A soja é uma das poucas
espécies conhecidas em que a quantidade de proteínas é maior do que a de lipídios
ou carboidratos. A grande maioria das proteínas de sementes maduras está
metabolicamente inativa e serve somente como reserva para ser utilizada para o
crescimento do embrião durante a germinação (Copland e McDonald, 1985).
1.1.1- Tegumento de sementes de leguminosas
O tegumento é a estrutura externa que delimita a semente, sendo formado
por camadas de células originadas dos integumentos do óvulo. Sua estrutura
depende de características específicas do óvulo e das modificações sofridas pelos
integumentos do óvulo durante o desenvolvimento e maturação da semente,
principalmente características relacionadas à espessura e arranjo do tecido vascular
(Kozlowski, 1972).
Os tegumentos de sementes de leguminosas como Glycine max (soja),
Phaseolus vulgaris (feijão comum) e Pisum sativum (ervilha) são relativamente
complexos. Entretanto, ainda faltam informações sobre a diferenciação e o
desenvolvimento de células e tecidos específicos dos tegumentos. O
desenvolvimento do tegumento de G. max é um dos poucos que tem sido
examinado em detalhe (Miller et al., 1999).
A estrutura do tegumento de sementes varia entre espécies e variedades.
Especialmente entre espécies de Glycine e Phaseolus, o tegumento é bastante
similar entre espécies diferentes, consistindo de quatro camadas: cutícula encerada,
epiderme, hipoderme e o parênquima interior (Swanson et al., 1985). Na Figura 1 é
mostrada a anatomia do tegumento de semente de G. max, como exemplo (Cassab
et al., 1985). Exteriormente, o tegumento apresenta as seguintes estruturas: hilo,
micrópila, rafe e região chalazal.
A camada mais externa do tegumento é a cutícula encerada, que representa
a primeira barreira à embebição (Figura 1B), e possui espessura variável. Na
verdade, duas camadas de depósitos de cera, uma muito estável e a outra
ambientalmente lábil, são sugeridas para sementes de soja (Souza e Marcos-Filho,
2001).
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
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A epiderme origina-se da camada celular externa do integumento externo
(Zeng et al., 2004). É composta de uma camada de células paliçádicas de paredes
espessas, denominadas macroesclereídeos, dispostas de forma alongada
perpendicularmente à superfície da semente (Figura 1A e 1B). Apenas uma camada
paliçádica é encontrada, exceto sob o hilo, onde se encontram duas (Souza e
Marcos-Filho, 2001). A pigmentação do tegumento está localizada principalmente na
camada paliçádica, constituindo-se de antocianos nos vacúolos, clorofila nos
plastídios
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
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A próxima camada mais interna é o endosperma (Figura 1A). As camadas de
células endospérmicas adjacen
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
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Figura 1 – Anatomia do tegumento da semente de Glycine max (soja) analisada por
Microscopia Eletrônica de Varredura. PC, células paliçádicas; HG, células
ampulhetas; P, parênquima; C, células comprimidas; Cot, cotilédone; Cutícula, A,
Secção do tegumento inteiro. B, Camada externa e um fragmento da cutícula. C,
Camada externa isolada do tegumento. Fonte: Adaptado de Cassab et al. (1985).
PC Camada externa
A
PC
PC
HG
HG
HG
Camada interna
B C
Cot
Cut
P
P
C
230x 153x
206x
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
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1.2 – Mecanismos de defesa de sementes
As plantas têm selecionado, sob pressão evolutiva, vários mecanismos e
estratégias de proteção para solucionar problemas de defesa e enfrentar o estresse
do ambiente em geral (Rhoades, 1979; Kogan, 1986).
As defesas de plantas podem ser agrupadas, de acordo com a natureza do
mecanismo envolvido, em 2 principais grupos: (1) defesas estruturais, que são
aquelas que atuam como barreiras físicas, e previnem contra o ataque de insetos e a
penetração de patógenos; e (2) defesas químicas, que envolvem a ação de
componentes tóxicos a pestes e patógenos, inibindo o desenvolvimento dos
mesmos (Agrios, 1988).
As defesas podem ainda ser classificadas como induzidas ou constitutivas.
Estas são do primeiro tipo quando sintetizadas em resposta a estímulos ambientais,
como por exemplo, a mastigação de uma folha de tomate por uma lagarta que induz
à síntese de inibidores de proteases. Esse tipo de defesa é mais importante para a
defesa de partes vegetativas das plantas do que para proteção de sementes. As
sementes maduras, por se encontrarem em estado de dormência, são incapazes de
disparar mecanismos de defesas induzidos pelo ataque de agressores. Desta forma,
suas defesas são exclusivamente do tipo constitutivas, isto é, fazem parte do plano
de desenvolvimento da planta, sendo depositadas durante a sua formação (Chesin e
Zipf, 1990; Xavier-Filho, 1993).
1.2.1- Proteínas tóxicas
Uma grande variedade de proteínas tem sido envolvidas nos mecanismos de
resistência contra insetos e patógenos. Algumas dessas pertencem às classes de
proteínas cujos mecanismos de ação baseiam-se na modificação das propriedades
da matriz extracelular (como as peroxidases; glicoproteínas ricas em hidroxiprolina,
HRGPs e proteínas ricas em glicina, GRPs), nas atividades inibitórias sobre enzimas
digestivas de insetos (inibidores de tripsina, cistatinas e inibidores de α-amilases), na
capacidade de ligação a quitina e/ou glicoconjugados do trato intestinal de insetos
ou parede celular de fungos (vicilinas e lectinas) ou possuem atividades
antimicrobianas, como tioninas, quitinases, LTPs e β-1,3 glucanases (Carlini, 2002;
Ng, 2004; Shewry e Lucas, 1997; Xavier-Filho, 1993).
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
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Peroxidases
Peroxidases são freqüentemente associadas aos mecanismos de defesa de
plantas contra patógenos (Caruso et al., 2001; Ye e Ng, 2002). Estas enzimas têm
sido muito estudadas em plantas superiores, e suas atividades no processo de
resistência podem estar relacionadas com quatro mecanismos diferentes, que
ocorrem na matriz extracelular: liberação de peróxido de hidrogênio, síntese de
lignina, síntese de suberina e auxílio na construção de ligações intermoleculares
durante a organização da parede celular nos sítios de agressão por patógenos
(Gomes e Xavier-Filho, 1994). Em Oryza sativa, foram observados aumento de
atividade e acúmulo de uma peroxidase catiônica após interação com Xanthomonas
oryzae pv. oryzae (Reimers et al., 1992; Young et al., 1995). Aumentos na atividade
enzimática de peroxidases após infecção estão também relacionados à síntese de
taninos, ao aumento nos níveis de fenóis e quinonas, e à biossíntese de etileno
(Reimers et al., 1992; Gomes e Xavier-Filho, 1994; Mohammadi e Kazemi, 2002).
Quitinases
Quitinases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações de β-1,4-N-
acetilglicosamina presente na quitina. Como a quitina é o principal componente da
parede celular de fungos e está ausente em plantas, quitinases desempenham um
importante papel na defesa contra estes patógenos. Evidências reforçam que o
papel defensivo de quitinases inclui inibição do crescimento fúngico in vitro, aumento
da resistência a patógenos em plantas que expressam constitutivamente altos níveis
de quitinase e quebra de quitina in vivo (Benhamou et al., 1993; Gijzen et al., 2001).
A indução de quitinase é freqüentemente coordenada com a expressão de β-1,3-
glucanases específicas e outras proteínas PR em resposta ao ataque de patógenos,
bem como em resposta ao tratamento com eliciadores e fatores abióticos. Genes de
quitinases são diferentemente regulados em resposta ao desenvolvimento ou à
colonização de tecidos vegetais por microrganismos (Salzer et al., 2000). O uso
potencial de quitinases como inseticidas tem sido estudado (Wang et al., 1996;
Fitches et al., 2004). Ding et al. (1998) observaram que a sobrevivência e o
crescimento de larvas de Heliothis virescens, crescidas em plantas expressando
quitinase em nível de 0,02–0,03% de proteína total, foram significativamente
reduzidos. Plantas expressando genes de quitinase podem ter potencial agronômico
para o controle de insetos (Ding et al., 1998; Fitches et al., 2004). Além disso,
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
8
quitinases constitutivas participam da defesa de sementes contra o ataque de
insetos (Gomes et al., 19
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
9
Em adição à função como reserva protéica, trabalhos confirmam a idéia da
participação das vicilinas no mecanismo de defesa de sementes. Vicilinas variantes
de sementes de feijão-de-corda (Vigna unguiculata) são consideradas o principal
fator de resistência presente nos genótipos africanos IT81D-1045, IT81D-1032 e
Tvu-2027 contra C. maculatus (Macedo et al., 1993). Trabalhos anteriores
mostraram que o grau de digestibilidade de vicilinas 7S, dos cultivares de V.
unguiculata resistentes ao ataque de insetos, por proteinases do intestino médio de
C. maculatus, é menor do que o de vicilina de cultivares susceptíveis (Sales et al.,
1992). Proteinases do intestino médio de Z. subfasciatus, bruquídeo que ataca
cultivares resistentes e susceptíveis a C. maculatus, digeriram bem ambos os tipos
de vicilinas.
Sabendo-se que as vicilinas associam-se a matrizes de quitina e a estruturas
que contêm quitina no intestino médio de insetos (Sales et al., 1996; Firmino et al.,
1996; Yunes et al., 1998), estudos foram realizados para investigar a ação dessas
proteínas no crescimento e desenvolvimento de organismos que contenham este
polissacarídeo como componente externo de membrana, como é o caso dos fungos,
que contêm quitina como parte de sua parede celular (Xavier-Filho e Fernandes,
1998). Gomes et al. (1997) mostraram que vicilinas de feijão-de-corda e de outras
sementes leguminosas inibem o desenvolvimento de fungos filamentosos.
O mecanismo de ação de vicilinas ainda não é completamente entendido.
Propriedades tóxicas de vicilinas parecem estar relacionadas ao seu reconhecimento
e interação com glicoproteínas. Mota et al. (2003) mostraram que vicilinas de V.
unguiculata ligam-se à membrana peritrófica de larvas de Diatrea saccharalis.
Estudos ainda mais recentes também mostraram a existência de efeito sistêmico
destas proteínas (Uchôa et al., 2006). Os dados obtidos por este grupo detectaram
vicilina em vários órgãos de larvas de C. maculatus, após alimentação com vicilinas
de V. unguiculata. Estas proteínas foram encontradas na hemolinfa, no intestino
médio, no corpo gorduroso e nos túbulos de Malpighi. Além disso, a ligação de
vicilinas a microvilosidases, sugere a existência de ligantes específicos.
� 1.2.2- Participação do tegumento nos mecanismos de defesa
O tegumento tem um papel vital no ciclo de vida das plantas. Antigamente,
acreditava-se que o tegumento estivesse associado unicamente à proteção
mecânica dos tecidos meristemáticos e de reserva contra choques e abrasões.
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Santos, P.O. (2007)
10
Entretanto, hoje, muitas outras funções são atribuídas a essa estrutura, podendo-se
citar a capacidade de manter unidas as partes internas da semente; regular a
velocidade de trocas gasosas entre a semente e o meio; regular a velocidade de
hidratação da semente, diminuindo ou evitando possíveis danos causados pelas
pressões desenvolvidas durante a embebição; regular a germinação e servir de
barreira (física e/ou química) contra a entrada de microrganismos e insetos
(Kozlowski, 1972; Moïse et al., 2005).
A participação do tegumento nos mecanismos de defesa das sementes
sempre esteve relacionada à sua dureza e principalmente espessura. Entretanto,
estudos realizados com Callosobruchus maculatus infestando sementes de 73
espécies diferentes, evidenciaram claramente a participação de compostos químicos
do tegumento nos mecanismos de resistência dessas sementes (Janzen, 1977).
Neste trabalho, foi analisada a relação entre a espessura e dureza do tegumento
com a sobrevivência ou morte das larvas desse bruquídeo, nos primeiros estágios
do desenvolvimento. Para as sementes de Erythrina berteroana e Ormosia
venezolana, observou-se uma alta mortalidade das larvas do inseto quando da
passagem pelo tegumento, apesar dessas sementes possuírem tegumentos muitos
finos (Janzen, 1977). Consideráveis variações na mortalidade no primeiro estágio
larval de desenvolvimento de Acanthoscelides obtectus também foram observadas
em sementes de Phaseolus vulgaris (Thiery, 1984).
Estudos realizados pelo nosso grupo mostraram a presença de proteínas no
tegumento de sementes de Canavalia ensiformis, Phaseolus vulgaris e Phaseolus
lunatus, que apresentaram homologia de seqüência de aminoácidos com vicilinas e
foram tóxicas ao bruquídeo C. maculatus, quando incorporadas em sementes
artificiais (Oliveira et al., 1999; Moraes et al., 2000; Silva et al., 2004).
1.3 – Glycine max (soja)
A soja é uma planta herbácea anual, cujo ciclo de vida, desde a germinação
até a completa maturação, dura de 75 a 200 dias, dependendo do cultivar, das
condições climáticas e do solo (Williams, 1950).
A semente de soja é constituída por um tegumento envolvendo um embrião
bem desenvolvido (Figura 3). Este tegumento é muito duro e impermeável. A água
entra através de pequenas rachaduras na cutícula (Ma et al., 2004). O número de
sementes por vagem varia de 1 a 4. Quanto à forma é, em geral, oval, mas varia de
acordo com o cultivar, podendo ser globosa, oval ou elipsoidal (Brandão, 1961). A
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Santos, P.O. (2007)
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cor das sementes pode ser amarela, marrom, preta ou verde, apresentando-se
uniforme, bicolor ou variegada (Minor et al., 1975).
1.3.1- Proteínas do tegumento da semente de soja
As proteínas do tegumento de sementes de soja têm sido investigadas por
mais de duas décadas. Neste período, já foram identificadas proteínas como o
inibidor de tripsina Kunitz (Kunitz, 1945 apud Gijzen et al., 2001); a peroxidase
(Gillikin e Graham, 1991); a extensina (Cassab et al., 1985), uma proteína rica em
glicina (Fukuda et al., 1994 apud Sessa e Wolf, 2001) e uma quitinase (Gijzen et al.
2001).
Kapoor e Gupta (1978) mostraram a presença de um inibidor de tripsina (TI)
em semente de soja e constataram que sua atividade estava presente no tegumento
da semente, mas não isolaram nem caracterizaram o composto ativo. Uma
glicoproteína de parede celular rica em hidroxiprolina, denominada extensina, foi
isolada e imunolocalizada. A extensina acumula-se durante o desenvolvimento da
semente de soja e está concentrada principalmente na parede celular das células
paliçádicas e ampulhetas (Cassab et al., 1985; Cassab e Varner, 1987). Sessa e
Wolf (2001) isolaram e caracterizaram do tegumento de soja, um inibidor de tripsina
e quimotripsina (Bowman-Birk), já bem caracterizado em cotilédones de soja e
conhecido por possuir propriedades anticarcinogênicas.
Quatro isoformas de fosfatases ácidas de sementes de soja maduras foram
purificadas e caracterizadas, no entanto, a localização não foi determinada (Ferreira
et al., 1998). As fosfatases ácidas formam um grupo de enzimas que catalisam a
hidrólise de uma variedade de ésteres de fosfato em meios ácidos. Estas enzimas
são amplamente distribuídas na natureza, presentes tanto em mamíferos como em
plantas e microrganismos (Ferreira et al, 1999). Diversos estudos têm mostrado a
caracterização de fosfatases ácidas. Em plantas, essas enzimas já foram
caracterizadas em raízes (Penheiter et al., 1997), tubérculos (Gellatly et al, 1994),
sementes (Park e Van Etten, 1986; Mallotra e Kayastha, 1990; Ferreira et al., 1998;
Granjeiro et al., 1999), folhas (Staswick et al., 1994), entre outros órgãos (Gabard e
Jones, 1990; Rossi et al., 1981).
SBP (peroxidase do tegumento de soja) é uma importante enzima encontrada
em tegumentos que pertence à classe III de peroxidases vegetais e atua na
biossíntese da parede celular, na defesa e em outros processos oxidativos
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
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(Welinder, 1992). Pode também ser importante na lignificação, ou suberização,
dureza e permeabilidade. A peroxidase do tegumento de soja é muito estável em
alta temperatura, extremos de pH, e em solventes orgânicos. Ao mesmo tempo, é
altamente reativa para substratos orgânicos e inorgânicos usando peróxido de
hidrogênio (Henriksen et al., 2001). SBP tem atraído considerável atenção
biotecnológica devido à alta estabilidade e atividade, podendo ser facilmente
purificada (Gijzen, 1993; Nissum et al., 2001; Kamal e Behere, 2003; Welinder e
Larsen, 2004).
Proteínas da superfície do tegumento são responsáveis pela alergenicidade
da semente de soja (Gonzalez et al., 1995; Gijzen et al., 1999). Foi recentemente
descoberto que uma proteína hidrofóbica (HPS), sintetizada no endocarpo e,
subseqüentemente, depositada na superfície da semente, é a principal proteína
alergênica de soja. A hidrofobicidade e a topografia da superfície de variedades de
soja expressando altos níveis de HPS podem afetar a fixação e penetração de
patógenos, influenciar as propriedades de absorção de água e/ou mediar a fixação
do endocarpo para a superfície da semente (Odani et al., 1987; Swanson et al.,
1991; Gonzalez et al., 1995; Gijzen et al., 1999).
Gijzen et al. (2001) isolaram uma quitinase de classe I do tegumento de
semente de soja. A quitinase de tegumento é expressa no final do desenvolvimento
de sementes, com níveis de expressão mais altos no tegumento. Além disso, sua
expressão está associada com senescência, amadurecimento e resposta à infecção
patogênica (Gijzen et al., 2001).
Recentemente, uma proteína de 24 kDa, denominada SC24, foi purificada de
sementes de soja e identificada. Nas sementes maduras, a proteína SC24 encontra-
se mais abundante no parênquima e na camada aleurona do tegumento. A
expressão de SC24 foi também induzida em tecido vegetativo por infecção pelo
patógeno da soja Phytophthora sojae e por injúria. A análise de aminoácidos de
SC24, revelou uma seqüência N-terminal similar à seqüência parcial relatada para
uma globulina 7S básica (Bg) liberada de sementes de soja em água quente,
presente nos cotilédones (Hirano et al., 1992; Dhaubhadel et al., 2005).
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Santos, P.O. (2007)
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Figura 2 – Sementes de Glycine max. A, sementes íntegras; B, sementes sem
tegumento; C, tegumento.
1 cm
A B
C
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
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1.4– O bruquídeo Callosobruchus maculatus
Muitos insetos mastigadores ou sugadores de várias ordens são predadores
de leguminosas. Alguns destes insetos se tornaram especializados em predar
sementes, como os carunchos ou gorgulhos da família Bruchidae, da ordem
Coleoptera. Dentre estes, o gorgulho Callosobruchus maculatus, destaca-se como a
principal praga dos grãos armazenados de Vigna unguiculata, popularmente
conhecido como feijão-de-corda (Santos et al., 1977).
O adulto de C. maculatus apresenta um comprimento de cerca de 2,5 a 3,0
mm; cabeça preta com antenas contendo 11 segmentos ligeiramente serrilhados,
tórax preto com pubescências douradas, élitros marrons com manchas pretas. O
fêmur é aproximadamente do tamanho da tíbia, porém duas vezes mais grosso, e o
fêmur da pata posterior traz um dente agudo e reto (Figura 2). O ovo é branco, de
forma sub-elíptica, com comprimento de, aproximadamente, 0,5 mm e largura de 0,3
mm. A larva é de forma curva e cor branca, enquanto a pupa é de cor marrom e nos
últimos estágios apresenta vestígios de asas, patas e olhos (Bastos, 1981).
A condição ideal para o desenvolvimento do inseto é temperatura de 32,5 oC
e 90% de umidade relativa, sendo o período médio de desenvolvimento de 23 dias.
Entre 20 oC e 30 oC e umidade relativa de 60%, a duração dos períodos de
oviposição, incubação do ovo, desenvolvimento das larvas e pupas são de 8, 8, 16 e
7 dias, respectivamente. A longevidade do adulto é de 9 a 11 dias (Mookherjee e
Chawla, 1964). A postura é realizada um ou dois dias após a emergência e os ovos
são postos na parte externa da semente. Os ovos ficam aderidos ao tegumento e,
posteriormente, a larva penetra na semente, onde completa seu desenvolvimento.
Completado o desenvolvimento, os insetos emergem deixando rajerias
nns1 Tc-420.119 -28.8 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.15168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(n)Tj-0.01584 Tc6.23984 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(a)Tj0 Tc6 0 Td(n)TTd0.10416 Tw(s )Tj-0760984 Tc6.87969 0 51(r)Tj-0.03168 Tc3.W93584 Tw(a )Tj0.10416 Tc16.5598 0 Td(l)Tj-0.10416 Tc2.l93584 Tw(a )Tj0.01584 Tc71992 0 Td(i)TjTj-0.12 Tc5.c2.4 0 Td(a)Tj-0.03624 Tc6.m1992 0 Td-0.15168 Tc9.11992 0 Td(s)Tj0.10416 Tc5.63984 0 Td-0.12 Tw(, )Tj-0.03168 Tc6.393984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc1287969 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.02.4 0 Td(a)Tj-0.03624 Tc6..4797 0 Td())Tj-0.01584 Tc3.23984 0 Td0.12. l i vo
so ss ão os ti po a ãu de n.03168 Tc6.11992 0 Td2.50416 Tw(s c)Tj-0.15168 Tc10.6797 0 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.u2.4 0 Td(o)Tj0 Tc65.4797 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(a)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6.c2.4 0 Td(o)Tj0 Tc6.23484 0 Td6.22410 Td(a )Tj-0.15168 Tc13p51992 0 Td(o)Tj-0.03168 Tc1.23984 0 Td0.3804 TTd(m)Tj-8 Tc3.11992 0 Td(n)Tj0 Tc6.13984 0 Td(ss)Tj-0.03168 Tc1111992 0 Td(a)Tj0 Tc6.23484 0 Td6.22416 w(o )Tj-0.15168 Tc1371992 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.51992 0 Td(n)Tj0 Tc6..4797 0 Td(s)Tj-0.15168 Tc5.63984 0 Td(n)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3.24797 0 Td(.03168 Tc6.11992 0 Td2.0416 Tw(s c)Tj-0.01584 Tc11à1992 0 Td(n)Tj0 Tc6.1.46416 Tw(s s)Tj-6.03168 Tc10.6797 0 Td(a)Tj0.08376 Tc6.11992 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(en)Tj-0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.63984 0 Td(e)Tj0 Tc6.23984 0 Td(s)Tj-0.01584 Tc50.8 0 Td0.12 Tw(, )Tj-0.03168 Tc-423.231 -.6797 0 Td(d)Tj-0.15168 Tc6.21992 0 Td(n)Tj0 Tc6.11992 0 Td(s)Tj0.10416 Tc5.63984 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3.71992 0 Td(a)Tj0 Tc6.23984 0 Td(c)Tj-0.03168 Tc5.611992 0 Td(nd)Tj-0.15168 Tc1863984 0 Td(o)Tj-0.2084 Tc12-3984 )Tj-0.03168 Tc3.28.8 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.11992 0 Td1.63984 0 TdTd(t)Tj-4.24 Tc12.8398 0 Td(r)Tj-0.15168 Tc3..1598 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td3.495p21992 0 Td40 ce, pprazsvce p ralida ds li viojrgice, dapoa esta, s4 Tc-423.232 -qc15 0 Td(p)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Td0 Td0 Td(r)Tj-0.032.1598 0 Td0.25584sa il40 Tc2.51992 0 Td(v)Tj0.01584 Tc5.63984 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.63984 0 Td(a)Tj0.08376 Tc6.27492 0 Td0.3804 Tw(4.)Tj0 Tc11.7598 0 Td(c)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(o)Tj0.08376 Tc6.21.3404 Tw(m )Tj-0.vimplrs ipj ar i vtg umentoC gu(o)Tj-0.03168 Tc23984 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(o)Tj0 Tc6.11992 0 Td(v)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(o)Tj0 Tc6.51992 0 Td(c)Tj-0.15168 Tc5.6.73584 Tw(a u)Tj0.03168 T.27492 0 Td0.3800 Td(gu)Tj-4.aamenr e na inteevi da de respirar eria d4.03168 Tc1428.8 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.15168 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(n)Tj-0.01584 Tc6.23984 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.1.37584 Tw(a-0.15168 Tc28.7598 0 Td(c)Tj-0.15168 Tc5.63984 0 Td(o)Tj-0.03168 Tc6.15977 0 Td(e)Tj0 Tc6.23984 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.q3984 0 Td(o)Tj-0.03168 Tc6.ü63984 0 Td(e)Tj-0.01584 Tc1223984 0 Td(n)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3.23984 0 Td(o)Tj--0.9924 Tc12.4816 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(ad)Tj-0.15168 Tc1.u2.4 0 Td(a)Tj0 Tc6.11992 0 Td(ç)Tj-0.03168 Tc5423984 0 Tdã0.37584 Tw(o d)Tj26.68 Tc5426992 0 Td1.57580)Tj--0.9924 Tc1251992 0 Td(v)Tj0.01584 Tc5.63984 0 Td(i)Tj-0.15168 Tc2.71992 0 Td(g)Tj-0.15168 Tc6.63984 0 Td(o)Tj-0.03624 Tc6.11992 0 Td(r)Tj0.10416 Tc34.3984 0 Td0.12 Tw(. )Tj0..9924 Tc12C3984 0 Td(i)Tj-0.15168 Tc8.15977 0 Td(o)Tj0203168 Tc5424984 0 Td0.2604 T(e n)Tj-7.15168 Tc11.1598 0 Td23984 0 Td(a )Tj0.01584 Tc-443.232 -19.5602 Td(p)Tj-0.15168 Tc6.47969 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc6.121584 Tw(o e)Tj-0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03624 Tc3.11992 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(e)Tj0 Tc6.c2.4 0 Td(ç)Tj-0.03168 Tc5.69.5602 Td(p)Tj-0.15168 Tc62.7984 0 Td1.57584 Tw(o )Tj-1.15168 Tc12.6598 0 Tdda.22410 TTd(s )Tj80.1514 Tc6.23984 0 Td(i)Tj-0.03168 T03984 0 Td(e)Tj-0.03624 Tc6.239840vn , prndass a n0 Tc6..4797 0 Td(s)Tj-0.15168 Tc52.7984 0 Td23984 0 Td(e )Tj-1.15168 Tc1168 Tc0 Td(a)Tj0.01584 Tc6.23984 0 Td(l)Tj-0.10416 Tc2.51992 0 Td(i)Tj0.08376 Tc2.4 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(en)Tj-0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.03984 0 Td(e)Tj-0.03624 Tc62.6684 0 Td0.3804 TTd(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6.17969 0 Td(en)Tj-0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03624 Tc3.11992 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3-0.384 0 Td1.57584 T(s c)Tj-0.85168 Tc12.4797 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6a.25584
semente, viaal i nd a
pdde fico to túimente.03168 Tc3.83984 0 Td(c)Tj-0.15168 Tc5.63984 0 Td(o)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(p)Tj-0.03624 Tc6.23984 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(e)Tj0.08376 Tc6.23984 0 Td(m)Tj-0.15168 Tc9.47969 0 Td(n)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.10416 Tc3.23984 0 Td(i)Tj-068 Tc6.d63984 0 Td(n)Tj-0.01584 Tc12.684 0 Td1.44 Tw(.50.03168 Tc(n2 0 Td0.70416 Tw(s )Tj-0303168 Tc8.75977 Td(ú)Tj-0.10416 Tc6..0797 0 Td(f)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(e)Tj0.01584 Tc6.23984 0 Td(n)Tj-0.01584 Tc2.51992 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(o)Tj0 Tc6.23984 0 Td(s )Tj-0303168 Tc8.71992 0 Td(n)Tj-0.15168 Tc6.47969 0 Td0.73584 Td(s )Tj-0801584 Tc5.q1992 0 Td(gu)Tj-0.15168 Tc1.23984 0 Td(a)Tj0.01584 Tc6.11992 0 Tdd(c)Tj-0.01584 Tc8.51992 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6.51992 0 Tda0.49584 Tw(de )Tj-0.03168 Tc26f3984 0 Td(l)Tj-0.10416 Tc3.23984 0 Td(i)Tj0 T11992 0 Td(v)Tj0.01584 Tc5.63984 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.63984 0 Td(o)Tj0.01584 Tc6.23984 0 Td(j)Tj-0.15168 Tc2.ó3984 0 Td0 Td0 Td(r)Tj-0.03123984 0 Td(g)Tj0.01584 Tc3.23984 0 Td(i)Tj0 Tc2.51992 0 Td(c)Tj-0.15168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj0.10416 Tc6.23984 0 Td0.36 TTd(n)Tj-0801584 Tc5..6.11992 0 Td0 Td(r)Tj-0.03111992 0 Td(e)Tj-0.03624 Tc6.23984 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.68 Tc0 Td(a)Tj0.01584 Tc6.23984 0 Td(i)Tj-0.03624 Tc2.51992 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.35977 0 Td(en)Tj-0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(e)Tj-0.01584 Tc6.2984 0 Td-0.10)Tj0.01584 Tc-420.119 -28.8 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.69.5602 Td(p)Tj-0.15168 Tc6463392 0 Td1.9584 Tw(de )Tj4.03168 Tc14.4797 0 Td(t)Tj-0.03624 Tc6.23984 0 Td(r)Tj-0.15168 Tc3.719921992 0 Td0 Td(r)Tj-0.03149584 TwTd(a)-0.01584 Tc12z3984 0 Td(l)Tj50.10416 Tc2.51992 0 Td(i)Tj-068 Tc6.c5199 0 Td(po)Tj0 Tc14.7(n2 0 Td0.70416 Tw(m )Tj-0.10416 Tc1663984 0 Td(p)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(o)Tj0.01584 Tc6.23984 0 Td(j)Tj-0.15168 Tc2411992 0 Td1.81584 Td(e )Tj-3.15168 Tc13.1992 0 Td(ge)Tj0 Tc12c4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc5.23984 0 Td(r)Tj-0.15168 Tc3.73584 Tw(-0.22624 Tc12s51992 0 Td(v)Tj-0.03168 Tc1163984 0 Td(i)Tj0.08376 Tc2.51992 0 d(s )Tj-0.15168 Tc9.4.81584 Td(e )Tj-3.15168 Tc1423984 0 Tdn63984 0 TdTd(t)Tj-2.)Tj0 Tc11239840)Tj-0.03168 Tc3..7598 0 Td(c)Tj-0.03168 Tc5.47969 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Td(n)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3.719921992 0 Td0 Td(r)Tj-0.03171992 0 Td(ge)Tj0.08376 Tc1423884 0 Td0.2604 T(e n)Tj-7.25168 Tc12.4797 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6426992 0 Td1.81584 Tw(e )Tj-4.03168 Tc14.6.11992 0 Td0 Td(r)Tj-0.03111992 0 Td(e)Tj-0.03624 Tc6.2398400 Td(r)Tj0.08376 Tc3.71992 0 Td(v)Tj0.01584 Tc9.47969 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.71992 0 Td(n)Tj-0.15168 Tc6.21992 0 Td(n)Tj0 Tc6Tc2.4 0 Td(ç)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(ão)Tj-0.01584 Tc1426884 0 Td6.24 Tw(, )Tj-0.15168 Tc1363984 0 Td(a)Tj-0.15168 Tc6..5598 0 Td(u)Tj0.08376 Tc6.11992 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(en)Tj-0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3423984 0 Td1..1992 0 Td26.68 Tc50 Td(en)TTd0.10416 Tw( )Tj-0.03165 Tc-420.713 -19.5602 Td(e)Tj-0.10416 Tc6.23984 0 Td(l)Tj-0.03168 Tâ5977 0 Td(en)Tj-0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.u9.5602 Td(e)Tj-0.10416 Tc6.23984 0 Td(l)Tj-0.03168 T63984 0 Td(a)Tj0 Tc6.21992 0 Td0.10416 Tw(, )Tj-0.03624 Tc8.23984 0 Td(a)Tj-0.03168 Tc6.n5199 0 Td(e)Tj-0.03624 Tc12.479700 Td(r)Tj0.08376 Tc3.71992 0 d(s )Tj-0.15168 Tc9.23984 0 Td(a)Tj0.01584 Tc6.23984 0 Td(i)Tj0 Tc20 Td(en)TTd0.01584 Tw(s )Tj-0.03168 Tc8.75977 0 Td0.199 0 Td(e)Tj-0.03168 Tc9..4816 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(ad)Tj-0.15168 Tc1.u2.4 0 Td(a)Tj0 Tc6.11992 0 Td(ç)Tj-0.03168 Tc5.63984-0.10)Tj31.84 Tc6.51992 0 Td(v)Tj0.01584 Tc5.63984 0 Td(j)Tj-0.15168 Tc2..6.11992 0 Td0 Td(r)Tj-0.03151992 0 Td(o)Tj-0.03624 Tc60 T284 0 Td0.3804 Tw 0 Td0 Td803624 Tc60 T992 0 Td0a 19.5602 Td(e)Tj21.15168 Tc1823984 0 Td(l)Tj-0.03168 T67969 0 Td(en)Tj-0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.0d0.12 Tw(. )Tj-0.03168 Tc9.j3984 0 Td(l)Tj-0.03168 Tc2.51992 0 Td(o)Tj0 Tc6.51992 0 Td(v)Tj-0.15168 Tc5..6797 0 Td(a)Tj0.08376 Tc6 0 T99240 Td087969 0 51(r)Tj. Oenl i a s, 9 a 1rada)
INTRODUÇÃO
Santos, P.O. (2007)
15
Figura 3 – Fêmea de Callosobruchus maculatus infestando sementes de Glycine
max.
1 cm
2. OBJETIVOS
Santos, P.O. (2007)
16
2. OBJETIVOS
2.1 – OBJETIVO GERAL:
O objetivo desse trabalho é investigar o possível envolvimento do tegumento
de sementes de algumas leguminosas nos mecanismos de defesa contra o ataque
do inseto Callosobruchus maculatus e fungos fitopatogênicos.
2.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
��Investigar a possível participação dos tegumentos nos mecanismos de
defesa das sementes de Adenanthera pavonina, Albizia sp, Dioclea
altissima, Glycine max e Phaseolus vulgaris (cultivares manteiga, manteiga
vermelho e vermelho) contra o ataque de C. maculatus;
��Investigar a possível participação de pro(ã)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Td0.49584 Tw(o )Tj-0.03168 Tc9.6 0 Td38 Tc9.6 0 Td4 0 Td0.49584 Tw(o )Tj-0.03 Td(n)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(e)Tj0 Tc6.23984 0 3d3.94416 Tw(s )Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td0.37584d Tw(o )Tj-0.01588 Tc15.9598 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(ng)Tj-0.15168 Tc12.4797 0 Td(u)Tj0.08376 1c7.31992 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0eTd(an)Tj-0.01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td0.25584 Tw(o )Tj-0.15168 .36016 0 Td(d)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(e )Tj-0.01584 Tc/R37 11.28 6058.36016 0GTd(s)Tj/R15 11.24 Tc8.75977 0 Td(.)Tj4 Tc/R37 11.28.2f7.44023 e max nos
mecanismosmd toninldaue de identifica003168 Tc109.4797 algumas dessesmrntetpas; x
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3. MATERIAL
Santos, P.O. (2007)
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3. MATERIAL
3.1 – Material biológico
3.1.1- Sementes
��As sementes de Glycine max, Phaseolus vulgaris preto, P. vulgaris
manteiga, P. vulgaris vermelho e P. vulgaris manteiga vermelho foram
obtidas comercialmente no Mercado Municipal de Campos dos
Goytacazes.
��As sementes de Vigna unguiculata (cultivar EPACE-10), Canavalia
ensiformis, Dioclea altissima, Adenanthera pavonina foram obtidas do
Laboratório de Sementes do Departamento de Fitotecnia, do Centro de
Ciências Agrárias, da Universidade Federal do Ceará.
��As sementes de Albizia sp foram obtidas através de coleta no Campus da
UENF.
3.1.2- Insetos
��Os insetos Callosobruchus maculatus (gorgulho do feijão-de-corda) foram
obtidos a partir de uma colônia mantida desde 1995, no Laboratório de
Química e Função de Proteínas e Peptídeos (LQFPP) da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Esta colônia originou-se de
insetos fornecidos pelo professor José Higino Ribeiro dos Santos, da
colônia mantida no Departamento de Fitotecnia do Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal do Ceará (Fortaleza, Ceará).
��A colônia é mantida em ambiente com 70% de umidade relativa e 28 oC,
em sementes maduras de V. unguiculata da variedade Fradinho, obtidas
comercialmente.
3.1.3- Microrganismos
��Os fungos Fusarium oxysporum e F. lateritium foram obtidos do Centro
Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão (CNPAF)/EMBRAPA, Goiânia,
Goiás.
3. MATERIAL
Santos, P.O. (2007)
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3.2 – Reagentes
��Acrilamida – Sigma Co;
��Anticorpo anti-IgG de coelho complexado a esferas de ouro coloidal (10
nm) – Sigma Co;
��Anticorpo anti-IgG de coelho complexado à fosfatase alcalina – Sigma
Co;
��Anticorpo anti-IgG de coelho complexado à peroxidase – Sigma Co;
��Anticorpo policlonal anti-quitinase de cotilédones de Adenanthera
pavonina, produzido em coelho – Gentilmente cedido pela Doutoranda
Izabela Silva dos Santos;
��Anticorpo policlonal anti-vicilina de cotilédones de Vigna unguiculata cv
EPACE-10, produzido em coelho – Gentilmente cedido pela Doutora
Adriana Ferreira Uchôa;
��Epon 812 – Polyscience Inc;
��Glutaraldeído grau I – Sigma Chemical Company;
��N-N’metileno bis-acrilamida – Sigma Co;
��p-NPP – Merck;
��Quitinase de cotilédones de Adenanthera pavonina – Gentilmente cedida
pela Doutoranda Izabela Silva dos Santos.
��SDS – Merck;
��Unicryl – Polyscience Inc.
Todos os demais reagentes utilizados foram de grau e padrão analíticos e
obtidos comercialmente.
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
19
4. MÉTODOS
4.1– Ensaios biológicos com sementes artificiais cobertas com tegumento de
sementes naturais
Para verificar a eficácia do tegumento como estrutura de defesa, sementes
artificiais com tegumentos naturais foram preparadas com farinha de Vigna
unguiculata (cultivar EPACE-10, susceptível ao ataque de C. maculatus). A farinha
de EPACE-10 (50 mg) foi colocada em um molde cilíndrico e sobre essa massa foi
colocado um pedaço de tegumento de semente natural de soja, com a parte externa
voltada para baixo. Em seguida, mais 450 mg de farinha de EPACE-10 foram
colocados sobre o tegumento. A farinha contendo o pedaço de tegumento foi
prensada com o auxílio de uma prensa manual. A semente artificial foi retirada do
molde e o excesso de farinha (50 mg) sobre o tegumento foi retirado com o auxílio
de um estilete, até que o tegumento ficasse novamente exposto. Sementes controle
contendo pedaço do tegumento de EPACE-10 foram preparadas da mesma forma
(Figura 4).
As partes da semente que não possuíam tegumento foram protegidas com
película Parafilm e fêmeas de 2 dias de idade foram colocadas para ovipositar sobre
a parte da semente artificial que continha o pedaço do tegumento. Após um período
de 24 h, as sementes foram desinfestadas, o excesso de ovos postos foi removido
com o auxílio de uma agulha fina, deixando-se apenas 2 ovos por semente sobre o
tegumento. As sementes foram incubadas a 28 oC em estufa incubadora, e após 20
dias, as sementes foram desfeitas para a retirada das larvas, que foram pesadas. A
massa e o número de larvas foram comparados com larvas de mesma idade que se
desenvolveram nas sementes controle. Os experimentos foram feitos em triplicata
(três sementes para cada experimento).
A fim de verificar se esse efeito é exclusivo do tegumento de soja, ou se é
uma propriedade natural dos tegumentos de sementes, experimentos semelhantes
foram realizados também com tegumento de sementes de Canavalia ensiformis,
Dioclea altissima, Albizia sp e três cultivares de Phaseolus vulgaris (feijão comum):
manteiga vermelho, vermelho e manteiga.
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
20
Figura 4 – Sementes artificiais cobertas com tegumento de sementes naturais de
Canavalia ensiformis (A) e Vigna unguiculata (B).
A B
1 cm
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
21
4.2– Obtenção das farinhas dos tegumentos das sementes
Tegumentos das sementes de Adenanthera pavonina, Albizia sp, Dioclea
altissima, Glycine max, Phaseolus vulgaris (cv manteiga), P. vulgaris (cv vermelho),
P. vulgaris (cv manteiga vermelho), P. vulgaris (cv preto) e Canavalia ensiformis
foram separados do embrião, triturados e peneirados em uma peneira de malha fina
(40 mesh), para obtenção das farinhas dos tegumentos.
4.3– Ensaios biológicos com sementes artificiais contendo farinha do
tegumento de sementes naturais
Ensaios biológicos para C. maculatus foram feitos utilizando-se um sistema
de sementes artificiais. Sementes artificiais, com massa total de 400 mg, foram
preparadas com farinha de cotilédones de Vigna unguiculata (cultivar EPACE-10),
contendo concentrações de 0,1 a 16% da farinha do tegumento das seguintes
sementes: Adenanthera pavonina, Albizia sp, Dioclea altissima, Glycine max,
Phaseolus vulgaris (cv manteiga), P. vulgaris (cv vermelho), P. vulgaris (cv manteiga
vermelho). Essas sementes foram infestadas com fêmeas de 3 dias de idade por um
período de 24 h a 28 °C. Após esse período, as sementes foram desinfestadas, o
excesso de ovos postos foi removido com o auxílio de uma agulha fina, deixando-se
apenas 3 ovos por semente. Após 20 dias incubadas a 28 °C, as sementes foram
desfeitas para a retirada das larvas, que foram contadas e pesadas. A massa e o
número de larvas foram comparados com larvas de mesma idade que se
desenvolveram em sementes controle (preparadas apenas com farinha de EPACE-
10). Os ensaios foram feitos em triplicata, com um total de 6 sementes e 18 ovos por
experimento. Os resultados foram expressos em valores de WD50 (concentração que
diminui 50% a massa das larvas) e LD50 (concentração que diminui 50% o número
de larvas). Esses valores foram calculados levando-se em consideração a massa e o
número de larvas de C. maculatus desenvolvidas em sementes artificiais controle
(contendo apenas farinha de Vigna unguiculata).
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
22
4.4– Extração de proteínas do tegumento e fracionamento com sulfato de
amônio
Para extração das proteínas da farinha do tegumento de sementes de G.
max, a farinha, na proporção de 1:10 (m/v), foi colocada em tampão fosfato de sódio
100 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,6 (PBS) e deixada por 3 h em temperatura
ambiente. O material foi centrifugado a 10.000 x g por 30 min a 4 oC e o
sobrenadante obtido foi precipitado com sulfato de amônio em concentração entre
0 e 90% de saturação por 16 h a 4 oC, seguido de centrifugação a 10.000 x g por 30
min, nesta mesma temperatura. O precipitado obtido foi dialisado contra água por
72 h e liofilizado.
4.5– Cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose
Uma amostra de 50 mg do precipitado obtido conforme descrito no item 4.4 foi
dissolvida em 7 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,6. Esse material foi
aplicado em uma coluna de troca iônica em DEAE-Sepharose (13 x 2,0 cm),
equilibrada e eluída com o mesmo tampão da dissolução e submetida a um fluxo de
60 mL/h. O material não retido (DI) foi eluído com o tampão de equilíbrio da coluna e
o retido foi eluído com cloreto de sódio 0,25 M (DII) e 0,5 M (DIII). Foram coletadas
frações de 5,0 mL por tubo e a densidade óptica medida a 280 nm
(Espectrofotômetro, Shimadzu UV Mini 1240). Essas frações foram dialisadas contra
água por 24 h e liofilizadas.
4.6– Atividade biológica das frações não retida (DI) e retida (DII)
As frações não retida (DI) e retida eluída com cloreto de sódio 0,25 M (DII)
obtidas em DEAE-Sepharose foram testadas com relação à sua toxicidade para as
larvas de C. maculatus através de sistemas de sementes artificiais (Macedo et al.,
1993). Sementes controle e sementes contendo as concentrações de 0,5; 1 e 2%
das frações DI e DII foram feitas e testadas de acordo com a metodologia descrita
no item 4.3.
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
23
4.7– Dosagem de proteínas
Para quantificação de proteínas nas amostras, foi utilizado o método descrito
por Bradford (1976), utilizando-se como padrão ovalbumina (Sigma).
4.8– Eletroforese em gel de poliacrilamida
As amostras (frações não retida e retidas em DEAE-Sepharose) foram
submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 12%, na presença de SDS
(Laemmli, 1970).
O gel principal foi montado em placas de vidro de 10 x 13,5 cm, misturando-
se: 2,3 mL de água destilada; 5,0 mL de uma solução de acrilamida/bis-acrilamida
30%; 2,5 mL de tampão Tris 1,5 M pH 8,8; 100 µL de SDS 10%; 100 µL de
persulfato de amônio 10% e 4 µL de TEMED. O gel de empacotamento foi
preparado misturando-se: 2,1 mL de água destilada; 500 µL da solução
acrilamida/bis-acrilamida 30%; 380 µL de tampão Tris 1,0 M pH 6,8; 30 µL de SDS
10%; 30 µL de persulfato de amônio 10% e 3 µL de TEMED. O tampão utilizado na
cuba de eletroforese foi o tampão de corrida (Tris 25 mM, glicina 192 mM e SDS
0,1%; pH 8,3).
A eletroforese processou-se por aproximadamente 2 h em corrente constante
de 15 mA. As amostras contendo 10 µg de proteína foram dissolvidas em tampão de
amostra (Tris/HCl 0,5M pH 6,8 contendo glicerol 10%, SDS 10% e azul de
bromofenol 1%). O gel foi corado com uma solução de azul brilhante de Coomassie
R 0,25% em metanol, ácido acético e água destilada (5:1:1 v/v/v) durante 2 h e foi
descorado com uma solução composta por 35% de metanol e 10% de ácido acético.
4.9– Seqüenciamento de aminoácidos
Bandas protéicas obtidas nas análises de eletroforese em géis não corados
foram transfereridas para uma membrana de polivinil-difluoreto (PVDF). A
transferência ocorreu em sistema semi-seco, usando-se tampão Tris 25 mM,
metanol 20% e glicina 192 mM, pH 8,0. A membrana de PVDF e pedaços de papel
de filtro foram equilibrados nesse mesmo tampão por 20 min. A transferência foi
montada usando-se três pedaços de papel de filtro, sobrepostos com a membrana,
seguida do gel e outros três pedaços de papel de filtro. O sistema foi fechado e a
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
24
transferência processou-se usando uma corrente de 1 mA/cm2 do gel durante 4 h.
Após a transferência, o pedaço da membrana correspondente à proteína retida em
DEAE-Sepharose eluída com NaCl 0,5 M, com massa molecular de
aproximadamente 24 kDa, foi recortado, procedendo-se o seqüenciamento
automático através de degradação de Edman para determinação da composição em
aminoácidos (Seqüenciador automático de proteínas, Shimadzu PPSQ-10).
4.10– Ensaio de atividade fosfatásica em gel
As frações não retida e retidas em DEAE-6HSKDURVH�� FRQWHQGR� ��� �J� GH�proteína, foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida nativo (15%),
durante 2 h em corrente constante de 15 mA. Após a corrida, o gel foi lavado com
tampão Tris-HCl 150 mM, pH 7,6 e depois disso, incubado no meio de reação
contendo este mesmo tampão, cloreto de cálcio 40 mM e p-NPP 10 mM (substrato).
O gel incubado com essa solução foi mantido na geladeira por 16 h. Após esse
período, a reação foi parada adicionando-se 1 mL de hidróxido de sódio 1 M. A
reação foi visualizada através da precipitação de fosfato de cálcio sobre a enzima.
4.11– Análise da atividade peroxidásica nas frações do tegumento de soja
As amostras (farinha do tegumento, precipitado 0-90% e as frações não retida
e retidas em DEAE-6HSKDURVH�� FRQWHQGR� ��� �J� GH� SURWHína foram submetidas à
eletroforese em gel de poliacrilamida 15%, na presença de SDS, durante 2 h em
corrente constante de 15 mA, conforme descrito no item 4.8. Foram utilizados c72 Tw(. )Tj-0.05208 Tc6.95977 0 Td204 Tw(m )Tj-0.1 Tw(m )Tj0.08374 Tc3.11992 0 Td(r)Tj-0.0208 Tc6.95977 0 Td204 Tw(m4 0 Td(l)Tj-0.3984 0 Td(d)0(rr)Tj-0.15168 Tc7.43984 0 j0 Tc6.23984 0 Td(c)Tj-0837-0.03168 Tc15j-0.03168 Tc6.1Tw(a p)Tj-0.03624 Tc2.51992 0 Td(d)Tj-0Tc6.23984 01(i)Tj-0.03168 Tc2.4 0 Td(d)Tj6.2418 2 Tw(l )Tj-0(. )Tj-0.05208 0 Td(e )Tj-0.15168 Tc11.7598 )Tj0.08374 Tc ps ã a mom4 0 Tam à i eo 1 :Tj0.03624 Tc8.1596 Tc6.11992d Td(t)Tj-0.15168 Tc3.23984íTw(i )Tj-0.1513 0 Td0.70416 Tw(s cTc11.7598 0 Td2.6558)Tj-0.03168 Tc-420 Tc6.95977 0 Td(F)Tj-0.03168 Tc6.839842 Tw(l )Tj23984 0 Td(a)Tj0 188 Tc1(i)Tj-0.030.10416 Tc6.239844 0 Td(ã)Tjh.6797 0 Td1.4558 a m0 Td(i)Tj0 Tc2.51992 0 Td(c)Tj0.01584 Tc5.63984 b584 Tw(a )Tj0.0Td2.41584 Tw(L de )Tj-0.15168 Tc29.7598 0 Td(m)Tj0.01584 Tc9.47969 068 Tc2.4 0 Td0.0150 Td(ã)Tj Td(v)Tj-0.03168 Tc5.63984 02 Tw(l )Tj320.01584 Tcd(ã)Tj k õl z1tm à o a vmn 24 t
Tj-0.01584 Tc17.8797 0 Td2.280 Td(m)Tj0.01584 Tc9.47969 0 Td(d)Tj-1c3.11992 4 2Tj-0.03168 Tc13.6797 0 T992 0 Td(a)Tj 0 Td(l)Tj-0.15168 Tc2.51992 0 Td(e)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(s)Tj0.10416 Tc5.63984 0 Td(p)Tj-0.03624 Tc1763984 0 Td(o)Tj-0.15168 Tc 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992Tj-0.03168 Tc-420 Tc6.95977 0 Td(F)Tj-0.03168 Tc6.83984(êd0.85584 Tw(e )Tj0 Tc10.2 0 Td(c)Tj-0.03168 Tc58 Tc18 0 Td(d)Tj0.01584 Tc6.11992 0 Td(i)Tj0 Tc2.51994 27Tj-0.03(a)Tj3168 Tc3.71992 0 Td(do)Tj-0.01584j0.01584 Tc3.11992 0 Td. )Tj-0.05208 Tc6.95977 0 Td(F)Tj-0.03168 Tc6.83984 0ao E no Tc7.55977 0 Td0.34416 Tw(s )Tj-0.03168 Tc9.119920 Td(s)Tj-0.15168.591 -19.5602 Td(d)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Td(u)Td(e)Tj0 Tc6.11992 04.24531 0 Tdc2.4 0 Td2.29584 2.6812 0 Td4 27Tj-0.03.03624 Tc11.7598 0 001(i)Tj-0.0n584 Tw(a )Tj0.0Td2.41584 Tw(L de )Tc16.3199 0 Td0.85584 Tw(o )Tle.55977 0 Td0.3441(m4 0 Ta)Tj0.08376 Tc6.11992Tj-0.03168 Tc11.1598 0 Td0.01584 Tw(à )Tj-420.118 -19u584 Tw(a )Tj0.08376 Tc19.2 0 Td(m0 Td(i)Tj0 Tc2.51992 0 Td(p)Tj-0.03624 Tc1763980 Td(l)Tj-0.3984 0 Td(4.24531 0 Td(8 Tc2.4 0 Td0.02.6812 0 Td(-0.15624 Tc9.47969 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td1.21584Td(e )Tj0 Tc11.7598 0 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(o)Tj0.10416 Tc6.23984 0 Td(f)Tj-0.15168 Tc3.35977 0 Td(o)Tj-0.03168 Tc15.1199 0 Td(72 T.23984 0 Td0.25584 Tw(de )Tc16.w0.01584 Tc3.71992 0 Td0.12 Tw-0.15168 Tc6.35977 0 Td-0.01584 Tw( ).03168 Tc9.47969 0 Td0.73584 Tw(e d)Tj-0.15168 Tc16.3199 0 Td(e)Tj0 Tc6.11992 0 Td(sc)Tj-0.03624 Tc11.2797 0 Td(r)Tj0.01584 Tc3.719925 Tw(l )Tj23Td(u)Td(e)Tj0 .4 0 Td(e)Tj0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.51992 23Td(u)Td(e )Tj0.4 0 Td(e)Tji21584Td(e )Tj20.118 -19 0 Td(r)Tj-0.15168 Tc3.71992 0 Td(j-0.0158.03624 Tc16.5 0 Td(c)Tj-0.0316c6.23984 0 Td(d)4 Td(t)Tj-0.1516 Tc2.51992 .0 Td(r)Tj-0.15168 Tc3.7199290 Td(o)Tj0.10416.03168 Tc3.7 Td(1)Tj-0.15168 Tc6.239845.1Td(p)Tj-0.08 Tc5.63984 0 Td(ã)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td2.29584 Tw(o )Tj0.22416 Tc11.6395 0 Td(f)Tj-0.1516 Tc5.639802 0 Td(do)T-0.03168 Tc6.11992 0 Td2.2958 Tw(m )Tj-0.15164 Tc5.63984 0 Td(i)Tj-0.15168 Tc2.51992 0 Td(p)Tj0.01584 Tc6.119925j-0.01584 Tc12.479d(e)Tj0 .4 0 Td(e)Tjw(o )Tj-0.0158.03624 Tc16.2 0 Td(E)Tj-0.15168 Tc7.559751.92 Tw(, )T3584 Tw(e d)Tj-4 0 Td(ã)Tj.15168 Tc6.23984 0 Td2.29584 Tw(a p)Tj-0.03624 Tc16.23984 0 Td(t)Tj0.01584 Tc30.15168 Tc11.2797 0 Td2.65584 Tw(à )Tj-0.03168 Tc11.75980 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(e)Tj-0.15168 Tc6.23p0 Td. )Tj-0.052330 Td(,)Tj2 0 Td(e)Tj0.10416 Tc6.119925j-0.01584 Tcj-0.01584j0.015 0023984 0 Td(a)Tj. )Tj-0.05208 Tc6.95977 0 Td(F)Tj-0.03168 Tc6.83984 0 Td(p)Tj-0.03624 Tc1x Tc18 0 Td(d)Tj0.01584 Tc6.11992 )Tj-0.01584 Tc6.23984 0 Td(t)Tj0.01584 Tc3.11992 0 Td(i)Tj-0.15168 Tc17.5199 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Tc11.2797 0 Td2.6555.03168 TTj-0.15624 Tc9.4 Tw(do n)Tj-0.08376 Tc6.23984 0 Td0.6204 Tw(m )Tj-0.15168 Tc13.3199 0 Td(u)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.10416 Tc3.23984 0 Td(i)Tj0.01584 Tc2.4 0 Td(li)Tj-0.12 Tc5.03984 n0 Td(c)Tj0.01584 Tc5.63984 0 Td(i)Tj-0.03168 T273416 Tc30 Td(d)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td(o)Tj-0.03624 Tce )Tc16.w0.e.23984 0 Td2 - 001(i)T3984 0 Td68 Tc11.2797 0 Td2.65586.11992 )Tj-0.01584 Tc6.239840 Td(o)Tj-0.03624 Tc6.23984 0 Td(e)Tj-0.03624 Tc6.11992 0 Td(r)Tj0.08376 Tc3.71992 0 Td(m)Tj0.01584 Tc9.47969 0.13584 Tw(o )Tj0 Tc9.47969 0e3168 Tc3.71994 Tc9.71992 0z Tw(m )Tj-0.15.15168 Tc24.9598 0Tw(à )Tj-420.118 -19 0 Td68 Tc11.2797 0 Td2.65586.11992 )Tj-0.01584 Tc6.23984.47969 0 Td(i)Tj-0.03168 Tc2.4 0 (i)Tj-0.01584 Tc02 3984 0 Td(1)Tj-j-0.031640 TdTc6.1199 Td(v)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(t)Tj-0 Tc23.0398 0 Td10 Tw(o )Tj-0.031e 0 Td(c)Tj-0.03624 Tc5.63984 0 Td(r)Tj-0.10416 Tc3.7 Tw(r )Tj-0.15168 Tc6.95977 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 Tc6.35977 0 Td-0.01584 Tw( ) 0 Td(a)Tj0.08376 Tc02 3984 0 Td.63984 0 Td(õ)Tj-0797 0 Td0.49584 Twe 4 Td(t)Tj-0.1516 Tc2.51992 8832 Tw(H )Tj-0.15168 Tc14.Td(e de)Tj9Tc23.0398 0 Td10 Tw(o )Tj-0.031ad 0.08376 Tc6.11992 0 Td2.060 Td(t)Tj-0uTc12.479d(e)Tj0 6Td(ge)Tj-00.03168 Tc12.3598 0 305204 TwTw(a p)Tj-0.03624 Tc17.5199 0 d(s)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj08 Tc9.47969 0 Td(e)Tj-0.03624 Tc5.63984 0 Td(r)Tj0.01584 Tc3.7190 Td(c)Tj0.01584 Tc5.63984 0 0 Td(s)Tj0.22416 Tc5.63987 0 Td(m)Tj0.(c)Tj0.01587 Tw(o )T30.08376 Tc6.11992 0 Td2.060 Td(t)Tj-000.4797 0 Td726.119/R 0 0.12 Tc186Td1584 Tc3j-0.031tSssenódM0 Td(s)Tj0.22915168 Tc14.Td3168 TTj-0.156584 Tc17.8797 0 Td2.0 Td(en)Tj 00.4797 0 Td726.119/R 0 0.12 Tc1.10440684 Tc3j-0.031,n Ee dea
a.08376 Tc6.236.83984 0 Td(r)Tj0.0d(õ)Tj- 11.28 Tf9.8457 0 0 Td(W)Tj 0 Td(s)Tj-0.03624 Tc5.64141 0 Td(-)Tj0.01584 Tc3.71991.1TTd(H)Tj-0.10416 Tc8.1593984 0 Td0.720624 (e)Tj-0.0316 Tc2.51992 8832 Tw(H )Tj-0.15168 Tc14.Tdj-0.01584 0 Td(ód)Tj-0.10d1d(ge)Tj-0M0 Td(s)Tj0.22915168 Tc14.97 0 Td(Tj-0.156584 Tc17.8Tc5.63984 0984 0 Td(c)Tj-0.10416 Tc5.2 0 Td(f)TjHj-0.156584 Tc172 0 Td(,)Tj)Tj0.9 0 d(s)Tj-0.03624 Tc1,0 Td(s)Tj-0.158 Tc7.43984 0 Td(en)Tj615168 Tc3.84 Tw(2 )Tj92 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.23984 0 TdTd(en)Tj5.4797 0 Td726.119/R 0 0.12 Tc181.610 Tc15 0 Td(s)Tj-0.0310.12 Tc6.11992 60167.5597Td(e de)TjL0 Td(n)Tj0.22 0 Td(do)1.18 0 Td(t)Tj-0.0as Fdróe dent L d e h -15Dm - 0 . 1 5 1 6 8 T c 7 . 4 3 9 8 4 0 0 T d ( d ) T j - 0 . 0 3 6 2 4 T c 1 . 7 1 9 9 2 0 T d ( d ) T j - 0 . 0 3 1 6 8 T c 4 T w ( e ) T j - 0 8 T c 1 6 . w 0 .lic d
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
25
4.12– “Western Blotting”
Com o objetivo de investigar a presença de proteínas do tipo vicilina no
WHJXPHQWR�GH�VRMD������J�GH�SURWHína de amostras de farinha do tegumento de soja,
precipitado 0-90% e vicilinas isoladas de cotilédones de Vigna unguiculata cv
EPACE-10 (padrão) foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 15%,
na presença de SDS, conforme descrito no item 4.8. Em seguida, foram realizados
experimentos de “Western blotting”, de acordo com metodologia de Towbin et al.
(1979). As bandas protéicas de géis não corados foram submetidas à transferência
para uma membrana de nitrocelulose conforme descrito no item 4.9. Após a
transferência, a membrana foi incubada por 2 h à temperatura ambiente em tampão
fosfato de sódio 0,1 M, cloreto de sódio 0,5 M, pH 7,6 contendo leite em pó
desnatado 2% (tampão bloqueador). Após o bloqueio, a membrana foi incubada com
anticorpo anti-vicilina de Vigna unguiculata cv EPACE-10 (1:2000) em tampão
bloqueador por 2 h à temperatura ambiente. A membrana foi lavada por 1 h com
PBS e incubada com anticorpo anti-IgG de coelho complexado com fosfatase
alcalina (1:2000), em tampão bloqueador, por 2 h. Passado o período de incubação,
a membrana
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
26
4.13– Dosagem de vicilina pelo método de ELISA
A extração de proteína das amostras (farinha de tegumento de soja,
precipitado 0-90% e frações DI, DII e DII) foi feita por 1 h em tampão
carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6, a 4 °C. A concentração de proteína extraída
foi determinada, e posteriormente a placa de ELISA foi sensibilizada com uma
concentração de proteína de 20 µg/100 µL de cada fração, durante a noite a 4 °C.
Após esse tempo, a placa foi lavada uma vez com PBS tween 0,05% (300 µL/poço
durante 1 h). Em seguida, a cada poço foram adicionados 300 µL de tampão
bloqueador (gelatina 1% em PBS tween), deixando-se a placa em repouso por 2 h à
temperatura ambiente. Após o tempo de bloqueio, a placa foi novamente lavada com
PBS tween 0,05% (300 µL/poço durante 1 h), e a cada poço foram adicionados
50 µL do anticorpo anti-vicilina de Vigna unguiculata cv EPACE-10 (diluído 1:2000
em tampão bloqueador), durante 1 h à temperatura ambiente. Posteriormente, a
placa foi novamente lavada com PBS tween, por três vezes, 5 min cada, e em
seguida foi incubada com o anticorpo anti-IgG de coelho complexado à fosfatase
alcalina (diluído 1:2000 em 50 µL de PBS tween bloqueador), por 45 min à
temperatura ambiente. A placa foi lavada com PBS tween, três vezes, 5 min cada.
Foram feitos dois tipos de controle para cada amostra: amostra incubada sem
anticorpo e amostra incubada somente com o segundo anticorpo (anti-IgG de coelho
complexado à fosfatase alcalina). A revelação foi realizada com uso de p-NPP (5 mg
de p-NPP para 5 mL de tampão glicina 0,1 M; cloreto de magnésio 1 mM e cloreto
de zinco 1 mM, pH 10,2). Foram aplicados a cada poço da placa, 50 µL da solução
de revelação e a reação foi parada com 50 µL de hidróxido de sódio 3 N, na menor
presença de luz. A leitura foi realizada a 405 nm. Para os cálculos da concentração,
foi utilizada uma curva-padrão de vicilina de cotilédones de V. unguiculata (cv
EPACE 10).
4.14– Cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-100
A fração retida obtida na cromatografia de troca iônica (DII) foi submetida à
cromatografia de exclusão molecular. Uma amostra de 50 mg da fração foi dissolvida
em 2 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,6. Esse material foi aplicado
em uma coluna de exclusão molecular em Sephacryl S-100 (58 x 1,0 cm),
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
27
equilibrada e eluída com o mesmo tampão da dissolução e submetida a um fluxo de
30 mL/h. Foram coletadas frações de 1,0 mL e a densidade óptica medida a 280 nm.
Estas frações foram dialisadas contra água por 24 h e liofilizadas.
4.15– Atividade biológica das frações obtidas na cromatografia de exclusão
molecular em Sephacryl S-100
As frações S-1, S-2, S-3 e S-4 obtidas em Sephacryl S-100 foram testadas
em sua toxicidade para as larvas de C. maculatus através de sistemas de sementes
artificiais (Macedo et al., 1993). Sementes artificiais controle e sementes contendo a
concentração de 1% das frações S-1, S-2, S-3 e S-4 foram feitas e testadas de
acordo com a metodologia descrita no item 4.3.
4.16– Dosagem de quitinase pelo método de ELISA
Foram realizadas dosagens de quitinase nas amostras: precipitado, DII, S-1,
S-2, S-3, S-4 e na farinha de tegumento das sementes C. ensiformis, A. pavonina, D.
altissima, Albizia sp, V. unguiculata, G. max, P. vulgaris (cv manteiga), P. vulgaris (cv
vermelho) e P. vulgaris (cv preto). O primeiro anticorpo utilizado foi o anticorpo
policlonal anti-quitinase de Adenanthera pavonina, produzido em coelho (diluído
1:1000 em PBS tween bloqueador). Para os cálculos da concentração, foi utilizada
uma curva-padrão de quitinase. Todos os demais procedimentos foram realizados
de acordo com a metodologia descrita no item 4.13.
4.17– Determinação da atividade peroxidásica
O ensaio de atividade peroxidásica foi feito segundo metodologia descrita por
Hammerschimidt et al. (1982). A extração de proteínas das amostras (DII, S-1, S-2,
S-3, S-4) foi feita em tampão fosfato de sódio 10 mM pH 6,0. A reação constituiu-se
da mistura de 8,5 µL da amostra e posterior adição de 1 mL do meio contendo
0,25% de guaiacol em peróxido de hidrogênio 10 mM e fosfato de sódio 10 mM, pH
6,0. Para que a reação ocorresse e a atividade peroxidásica fosse medida, as
amostras foram deixadas por 10 min em temperatura ambiente e, em seguida a
leitura de absorbância foi feita a 470 nm. Para os cálculos da atividade peroxidásica
foi utilizada uma curva-padrão de concentrações crescentes de peroxidase (Sigma).
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
28
Uma unidade de atividade peroxidásica foi definida como a quantidade de enzima
que catalisa um aumento de absorbância de 0,01 por minuto a 470 nm.
4.18– Determinação da atividade inibitória de tripsina
Os experimentos de atividade inibitória de tripsina foram realizados segundo
a metodologia descrita por Xavier-Filho e Coelho (1980), usando BAPNA (N-benzoil-
DL-arginina p-nitroanilida) como substrato. As amostras DI (5 mg), DII (6 mg) e DIII
(15 mg) foram extraídas em 1 mL de Tris-HCl 50 mM, CaCl2 20 mM, pH 8,2 por 30
min em temperatura ambiente. Uma amostra de 50 µL do extrato foi misturada ao
meio contendo tripsina (20 µg/100 mL) em Tris-HCl 50 mM, CaCl2 20 mM pH 8,2 a
37 °C por 5 min. Em seguida, foi adicionado o substrato BAPNA em DMSO (dimetil
sulfóxido) 1%, usado em uma concentração final de 1 mM, em um volume final de
1,5 mL . Após 15 min de incubação a 37 °C, a reação foi parada pela adição de 1 mL
de ácido acético 30%. A absorbância foi lida a 410 nm. A atividade foi interpretada
como o aumento de 0,01 unidade de absorbância a 410 nm. Para os cálculos finais
de atividade tríptica nas amostras, foi utilizada uma curva-padrão preparada com
tripsina. A atividade inibitória foi determinada medindo-se a atividade tríptica com o
substrato BAPNA, após pré-incubação com o inibidor.
4.19– Localização de quitinase nas larvas de C. maculatus
4.19.1- Preparação do material de rotina para microscopia de luz
As larvas de C. maculatus, crescidas em sementes artificiais controle, foram
submetidas à perfuração de sua cutícula, para uma melhor fixação em solução
contendo 2,5% de glutaraldeído, paraformaldeído 4% em tampão cacodilato 50 mM,
pH 7,0, durante 120 min. Depois de fixados, os tecidos foram lavados 6 vezes com o
tampão cacodilato 50 mM, pH 7,0 em temperatura ambiente. O tempo entre as
lavagens foi de 20 min.
A pós-fixação foi realizada durante 60 min no escuro, usando tetróxido de
ósmio 2% em água destilada e ferricianeto de potássio 1,6% e cloreto de cálcio
10 mM em tampão cacodilato 50 mM, pH 7,0, na proporção de 1:1 (v/v).
Em seguida, o material foi lavado com tampão cacodilato 50 mM, pH 7,0, 4
vezes durante 20 min. A etapa de desidratação foi realizada em série crescente de
4. MÉTODOS
Santos, P.O. (2007)
30
lavados levemente com PBS (fosfato de sódio 10 mM, NaCl 0,5 M; pH 7,3) e
bloqueados com PBS contendo 1% de BSA por 2 h. Os cortes foram incubados com
o primeiro anticorpo (anti-quitinase de Adenanthera pavonina) na diluição de 1:500
por 4 h. Foram lavados com PBS duas vezes, sendo o intervalo entre as lavagens de
30 min. Nesta etapa, os cortes foram incubados com o segundo anticorpo
complexado com partículas de ouro coloidal (10 nm) na diluição de 1:100 (anti-lgG
de coelho) por 2 h. Os controles foram feitos incubando-se os cortes apenas com o
segundo anticorpo. Após este processo, os cortes foram lavados com PBS. Os
cortes foram revelados por precipitação com prata (inibidor + estimulador - Kit
Amersham) na proporção de 1:1 (v/v), por 10 min, lavados com água destilada e em
seguida observados por microscopia óptica.
4.20– Atividade biológica de frações protéicas sobre fungos fitopatogênicos
A avaliação da toxicidade das frações obtidas em DEAE-Sepharose (DI, DII e
DIII) sobre o crescimento dos fungos Fusarium lateritium e Fusarium oxysporum foi
feita através de ensaios de inibição de crescimento em meio líquido. Esporos (1,0 x
104/mL) foram incubados em 200 µL de meio de cultura (caldo Sabouraud),
contendo 400 µg/mL de proteína das diferentes frações cromatográficas preparadas
em tampão acetato de sódio 100 mM, pH 5,0. O ensaio foi realizado em placas de
cultura de células em temperatura de 28 °C por um período de 60 h, e a
determinação da densidade óptica (reflexo do crescimento micelar) foi feita a cada
6 h em um leitor de microplacas a 620 nm. Foram feitas 3 repetições para cada
amostra e os controles foram feitos nas mesmas condições, mas sem adição de
proteína.
Todo o procedimento do ensaio foi feito sob condições assépticas em cabine
de fluxo laminar, segundo metodologia adaptada de Broekaert et al. (1990).
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
32
sobrevivência das larvas, embora com massas bem menores que as larvas
crescidas nas sementes controle. Devido a isso, o tegumento das sementes de soja
foi o escolhido para a investigação da toxicidade, visto que embora haja toxicidade
também é possível à obtenção das larvas para os experimentos futuros.
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
33
Figura 5 – Experimentos de sementes artificiais cobertas com tegumento natural das
sementes de Vigna unguiculata cv EPACE-10 (controle), Glycine max, Albizia sp,
Dioclea altissima, Canavalia ensiformis e Phaseolus vulgaris (cultivares manteiga
vermelho, vermelho e manteiga). Os experimentos foram feitos em triplicatas (3
sementes para cada experimento) e foram deixados 2 ovos por semente (total de 18
ovos). As sementes foram incubadas por 20 dias.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Per
cent
agem
(%
)
Vigna unguiculata Glycine max Albizia sp Dioclea altissima Canavaliaensiformis
Phaseolus vulgaris(manteigavermelho)
Phaseolus vulgaris(vermelho)
Phaseolus vulgaris(manteiga)
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
34
0
2
4
6
8
10
12
Epace-10 Soja
Tegumento
mas
sa d
e um
a la
rva
(mg)
Figura 6 – Massa das larvas de Callosobruchus maculatus desenvolvidas nos
experimentos de sementes artificiais cobertas com tegumento natural de Vigna
unguiculata (cv EPACE-10) e Glycine max. As sementes foram incubadas por 20
dias e os dados representam a média das 3 repetições.
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
35
5.2– Ensaios biológicos de sementes artificiais contendo farinha de
tegumento de sementes naturais
Sementes artificiais contendo concentrações crescentes das farinhas dos
tegumentos das sementes de Glycine max, Albizia sp, Dioclea altissima, Adenantera
pavonina e Phaseolus vulgaris (cultivares manteiga vermelho, vermelho e manteiga)
foram confeccionadas com o intuito de determinar-se os valores de WD50 e LD50.
Os três cultivares de Phaseolus vulgaris testados foram tóxicos para o
desenvolvimento das larvas de C. maculatus e levando-se em consideração os
valores de WD50 e LD50, o tegumento das sementes do cultivar manteiga foi o mais
tóxico, pois em concentração de 4% foi capaz de reduzir o número (LD50) e a massa
das larvas (WD50) do inseto em 50%. O cultivar manteiga vermelho apresentou
valores de WD50 e LD50 de 4 e 12% respectivamente, enquanto para o tegumento do
cultivar vermelho esses valores foram de 3 e 15% respectivamente (Figura 7A e 7B).
Com relação à toxicidade da farinha do tegumento de soja, a WD50 foi de 8,8% e a
LD50 de 12,4%. Para a farinha do tegumento de A. pavonina foi encontrado o valor
de 9% tanto para WD50 como para LD50 (Figura 7A e 7B). Os valores de WD50 e LD50
para Dioclea altissima foram de 4 e 2%, respectivamente (Figura 7A e 7B). De todas
os tegumentos analisados, o tegumento de Albizia sp mostrou-se o mais tóxico para
as larvas, sendo os valores de WD50 e LD50 de 0,3 e 1%, respectivamente (Figura 7A
e 7B). Em concentração de 2% foi observada uma mortalidade de 100% das larvas
(dados não mostrados). Esses resultados embora mostrem números bastante
diferentes para WD50 e LD50 para os diferentes tegumentos, todos podem ser
considerados muito tóxicos, visto que durante a eclosão através do tegumento a
larva entra em contato com uma concentração de 100% do tegumento.
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
36
Figura 7 – (A) Valores de WD50 (concentração que diminui em 50% a massa das
larvas) e (B) Valores de LD50 (concentração que diminui em 50% o número de
larvas) para os tegumentos das sementes de Glycine max, Albizia sp, Dioclea
altissima, Adenantera pavonina e Phaseolus vulgaris (cultivares manteiga vermelho,
vermelho e manteiga).
9
0.3
2
8.8
4
3
4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A. pavonina
Albizia sp
D. altissima
G. max
P. vulgaris (cv manteiga)
P. vulgaris (cv vermelho)
P.vulgaris (cv manteiga
vermelho)E
spéc
ies
WD50 (%)
9
1
4
12.4
4
15
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
A. pavonina
Albizia sp
D. altissima
G. max
P. vulgaris (cv manteiga)
P. vulgaris (cv vermelho)
P.vulgaris (cv manteiga
vermelho)
Esp
écie
s
LD 50 (%)
A
B
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
37
5.3– Perfil cromatografico da fração precipitada 0-90% do tegumento de soja
em coluna de troca iônica em DEAE-Sepharose
No perfil cromatográfico do precipitado 0-90% em cromatografia em DEAE-
Sepharose, observou-se a presença de um pico de absorbância em 280 nm que não
ficou retido na matriz (DI) e duas frações protéicas que ficaram retidas na coluna e
foram eluídas com cloreto de sódio 0,25 M (DII) e 0,5 M (DIII), mostrando a presença
de proteínas ácidas no tegumento das sementes de soja (Figura 8). Essas frações
foram dialisadas contra água por 24 h e liofilizadas. Essa cromatografia foi repetida
inúmeras vezes para acumular este material para os ensaios de eletroforese,
atividade contra C. maculatus, entre outros.
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
38
Figura 8 – Cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose da fração precipitada
0-90% com sulfato de amônia do tegumento de soja. A coluna foi equilibrada e o
material não retido foi eluído com o tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,6 e os
picos retidos foram eluídos com cloreto de sódio de 0,25 e 0,5 M. Foram coletados
5 mL por tubo sob o fluxo de 60 mL/h.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300
volume (mL)
Abs
(280
nm
)
NaCl0,25M
NaCl0,5M
DI
DII
DIII
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300
volume (mL)
Abs
(280
nm
)
NaCl0,25M
NaCl0,5M
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 50 100 150 200 250 300
volume (mL)
Abs
(280
nm
)
NaCl0,25M
NaCl0,5M
DI
DII
DIII
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
39
5.4– Toxicidade das frações não retida (DI) e retida (DII) obtidas na
cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose para C. maculatus
A fração não retida em DEAE-Sepharose (DI) teve sua atividade tóxica
testada para as larvas de Callosobruchus maculatus através de um sistema de
sementes artificiais contendo concentrações de 0,5; 1 e 2% (Figura 9A). Pode-se
observar que essa fração apresentou toxicidade significativa para as larvas do
inseto, visto que houve uma redução de 46,16% na massa das larvas crescidas em
sementes contendo 2% dessa fração, comparando-se com as larvas que se
desenvolveram em sementes controle (Figura 9A).
A Figura 9B mostra os resultados obtidos com o sistema de sementes
artificiais contendo a fração retida em DEAE-Sepharose, eluída em NaCl 0,25 M
(DII), nas mesmas concentrações testadas para fração DI. Observa-se que a fração
se mostrou tóxica na menor concentração testada (0,5%), sendo que em
concentração de 2%, o material foi capaz de reduzir cerca de 87% da massa das
larvas do inseto de 20 dias de idade. O valor de WD50 da fração DII foi estimado em
1,14%. Não foi possível testar a atividade tóxica da fração DIII por falta de material
suficiente.
5.5– Caracterização das proteínas presentes no tegumento de soja
As frações obtidas na cromatografia de troca iônica do precipitado 0-90%
foram visualizadas através de eletroforese em gel de poliacrilamida 15% na
presença de SDS. Na Figura 10A, observa-se que no pico não retido em DEAE-
Sepharose (DI) predominam bandas protéicas de massas moleculares de
aproximadamente 43 e 36 kDa. Na raia 4 (fração DII), pode-se observar o
predomínio de bandas que possuem massas com cerca de 45, 25 e 23 kDa. Na
fração DIII há o predomínio de bandas protéicas que possuem massas moleculares
de aproximadamente 27, 24, 19 e 15 kDa.
A presença de bandas protéicas com atividade peroxidásica foi também
investigada (Figura 10B). Observou-se a presença de atividade peroxidásica em
todas as frações testadas, com exceção da fração não retida em DEAE-Sepharose
(Figura 10B). Essa atividade foi observada em bandas protéicas com massas
moleculares próximas a 45 kDa, sendo melhor visualizada no precipitado e na fração
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
40
eluída da DEAE-Sepharose com NaCl 0,25 M (DII).
Também foi possível observar no ensaio para fosfatase em gel nativo (Figura
10C), que esta atividade está presente nas três frações obtidas na DEAE-
Sepharose. Entretanto, a maior atividade fosfatásica foi observada na fração DII
(retida em DEAE, eluída com cloreto de sódio 0,25 M).
A presença de quitinase nas frações da cromatografia de troca iônica em
DEAE-Sepharose foi analisada através de “Western blotting” utilizando-se anticorpo
anti-quitinase de Adenanthera pavonina. A presença de duas bandas com reação
imunológica positiva na fração DII confirma a presença de proteínas do tipo quitinase
nesta fração (Figura 10D). As outras frações obtidas na cromatografia em DEAE-
Sepharose não apresentaram reação imunológica com o anticorpo anti-quitinase
(dados não mostrados).
A banda protéica de 24 kDa presente na fração DIII foi submetida a
seqüenciamento aminoterminal, mostrando uma seqüência parcial 85% homóloga à
fosfatase ácida de Synechocystis sp (Figura 10E).
5.6– Detecção de vicilinas nas frações do tegumento de G. max
Observou-se através de “Western blotting” utilizando-se anticorpo anti-vicilina
de Vigna unguiculata cv EPACE-10, a presença de bandas protéicas que reagiram
com o anticorpo, indicando a presença de proteínas do tipo vicilina tanto na farinha
do tegumento quanto na fração precipitada com sulfato de amônia (Figura 11).
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
41
02468
1012141618
Controle DI (0,5 %) DI (1 %) DI (2 %)
Mas
sa d
e um
a la
rva
(mg)
02468
10121416
Controle DII (0,5 %) DII (1 %) DII (2 %)
Mas
sa d
e um
a la
rva
(mg)
Figura 9 – Atividade biológica das frações não retida (A) e retida em DEAE-
Sepharose eluída com NaCl 0,25 M (B). As sementes artificiais continham
concentrações de 0,5; 1 e 2% das frações. As sementes foram incubadas por 20
dias e os resultados representam uma média de 3 repetições.
A
B
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
42
2 F V L T N Q D 8 Proteína de 24 kDa da fração DIII
3 F L L T N D D 9 Fosfatase ácida de Synechocystis sp
Figura 10 – (A) Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida 15% das proteínas
presentes no tegumento de soja. M- marcador de massa molecular (66 kDa – BSA;
45 kDa – ovalbumina; 29 kDa – anidrase carbônica; 24 kDa – tripsinogênio; 18,4 kDa
– β-lactoglobulina; 14,3 kDa – lisozima), 1- farinha do tegumento, 2- precipitado 0-
90%, 3- fração DI, 4- fração DII e 5- fração DIII. (B) Atividade peroxidásica em
membrana de nitrocelulose de proteínas separadas em gel de poliacrilamida 15% na
presença de SDS. 1- farinha do tegumento, 2- precipitado 0-90%, 3- fração DI, 4-
fração DII e 5- fração DIII. (C) Atividade fosfatásica em gel de poliacrilamida nativo
15%. 1: fração DI, 2: fração DII e 3: fração DIII. (D) Deteccção de quitinase na fração
DII através de “Western blotting”. (E) Seqüência parcial de aminoácidos da proteína
de 24 kDa da fração DIII. A seta indica a banda protéica submetida a
seqüenciamento de aminoácidos.
M 1 2 3 4 5M 1 2 3 4 5M 1 2 3 4 5
A B C
1 2 3 4 5 1 2 3 1
kDa
66
45
29
24
18,4
14,3
kDa
66
45
29
24
18,4
14,3
D
E
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
43
Figura 11 – Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida 15% na presença de SDS
(A) e detecção de vicilina por “Western blotting” (B) na farinha do tegumento de soja
e na fração precipitada com sulfato de amônio (0-90% de saturação). Foram
aplicados 50 µL (10 µg de proteína) em cada poço. 1: Vicilina de Vigna unguiculata
cv EPACE-10 (padrão), 2: Farinha do tegumento e 3: Precipitado 0-90%. As setas
indicam as bandas imunorreativas.
B A
1 2 3 1 2 3
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
44
5.7– Dosagem de vicilina pelo método de ELISA
Através de experimentos de ELISA, utilizando-se anticorpo anti-vicilina de
Vigna unguiculata cv EPACE-10, observou-se a presença de proteínas
imunorreativas em todas as frações testadas. A Figura 12 mostra as concentrações
de vicilina encontradas na farinha do tegumento, precipitado 0-90% e frações da
DEAE-Sepharose. Essas proteínas equivalem a 0,59% (ou 5,9 ng/µg) do total de
proteínas (Figura 12A) e representam cerca de 0,005% da massa seca total da
farinha do tegumento (Figura 12B). Na fração precipitada 0-90% a concentração de
vicilina por proteína foi de 3,74 ng/µg. Com relação a quantidade de vicilina por peso
seco da fração foi encontrado um valor de 0,08%. Com relação à concentração de
vicilina encontrada nas frações da DEAE-Sepharose, observou-se que a fração DII
concentra a maior parte dessas proteínas, perfazendo 0,16% do peso seco da
fração e uma concentração dentro do pool de proteínas equivalente a 41 ng de
vicilina por µg de proteína (Figuras 12A e 12B). A menor percentagem (0,028%) foi
detectada na fração DIII (Figura 12B).
5.8– Cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-100 da fração DII.
No perfil cromatográfico da fração retida eluída com NaCl 0,25 M, em
cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-100, observou-se a presença
de 4 picos denominados: S-1, S-2, S-3 e S-4 (Figura 13). Essas frações foram
dialisadas contra água por 24 h e liofilizadas. Essa cromatografia foi repetida
inúmeras vezes para acumular este material para os testes de atividade biológica
contra C. maculatus e atividades protéicas.
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
45
05
101520253035404550
Farinha Precipitado0-90 %
DI DII DIII
ng v
icili
na/u
g pr
oteí
na
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
Farinha Precipitado0-90 %
DI DII DIII
Per
cent
agem
de
vici
lina
(%)
Figura 12 – Dosagem de vicilina na farinha do tegumento, precipitado 0-90% e
frações da DEAE-Sepharose. Resultados expressos em concentração de vicilina
(ng) por µg proteína (A) e percentagem de vicilina nas frações (B). Os ensaios foram
realizados através de experimentos de ELISA, utilizando-se anticorpos anti-vicilina
de Vigna unguiculata cv EPACE-10. As colunas representam a média de 2
repetições e as barras (A), o desvio padrão.
A
B
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
46
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0 30 60 90 120 150
Volume (mL)
Abs
(28
0 nm
)
Figura 13 – Cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-100 da fração DII
obtida em DEAE-Sepharose. A coluna foi equilibrada com tampão fosfato de
potássio 50 mM, pH 7,6 e o material foi eluído com o mesmo tampão de equilíbrio da
coluna. Foram coletadas frações contendo 1 mL por tubo sob o fluxo de 30 mL/h e a
absorbância lida a 280 nm.
S-1
S-2 S-3
S-4
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
47
5.9– Toxicidade das frações obtidas na cromatografia de exclusão molecular
em Sephacryl S-100 para C. maculatus
As frações S-1, S-2, S-3 e S-4, obtidas em Sephacryl S-100, tiveram sua
atividade biológica testada para Callosobruchus maculatus através de um sistema de
sementes artificiais em concentração de 1%. As frações S-1 e S-3 apresentaram as
toxicidades mais acentuadas. A fração S-1, na concentração testada, foi capaz de
reduzir a massa das larvas em 47%. Com relação ao número de larvas, houve uma
diminuição em cerca de 60%. Pode-se observar, no entanto, que as frações S-2 e S-
4 não apresentaram toxicidade para as larvas do inseto, pois estas frações não
promoveram reduções na massa e nem no número de larvas, comparando-se com
as larvas que se desenvolveram em sementes controle. Esses resultados são
apresentados na Figura 14.
5.10– Dosagem de quitinase pelo método de ELISA
Através de experimentos de ELISA, utilizando-se anticorpo anti-quitinase de
Adenanthera pavonina, observou-se a presença de proteínas imunorreativas nas
frações do tegumento de soja (Figura 15) e no tegumento de algumas outras
sementes estudadas (Figura 16). Pode-se observar que a fração DII é a fração mais
rica em quitinase, possuindo 0,2 µg desta proteína por mg de pó. Dentre as frações
obtidas em Sephacryl S-100, a fração S-2 possui a maior quantidade de quitinase
por quantidade de pó: 0,143 µg/mg (Figura 15).
Com relação ao tegumento das sementes, quitinase representa
aproximadamente 9,5 ng/mg de tegumento de A. pavonina. O tegumento das
sementes G. max e P. vulgaris vermelho apresentaram quantidades de quitinase
similares entre elas (cerca de 22 ng/mg). Apenas o tegumento de sementes de
Albizia sp não apresentou proteínas imunorreativas com o anticorpo de A. pavonina
e os tegumentos de C. ensiformis, V. unguiculata cv EPACE-10, D. altissima e os
cultivares de P. vulgaris manteiga e preto apresentaram menos de 7 ng de quitinase
por mg de pó (Figura 16).
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
48
Figura 14 – Atividade biológica das frações obtidas em Sephacryl S-100. Massa de
uma larva (A) e Percentagem de sobrevivência das larvas (B). As sementes artificiais
continham 1% das frações. As sementes foram incubadas por 20 dias e os
resultados representam uma média de 3 repetições.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
controle S-1 S-2 S-3 S-4
Fração da Sephacryl S-100
Per
cent
agem
de
sobr
eviv
ênci
a (%
)
0
2
4
6
8
10
12
14
controle S-1 S-2 S-3 S-4
Fração da Sephacryl S-100
Mas
sa d
e um
a la
rva
(mg)
A
B
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
49
���
��
�
��Figura 15 – Dosagem de quitinase no precipitado 0-90%, fração DII e frações da
Sephacryl S-100. Resultados expressos em concentração de quitinase (µg) por mg
de pó. Os ensaios foram realizados através de experimentos de ELISA, utilizando-se
anticorpos anti-quitinase de Adenanthera pavonina.
�
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
Precipitado DII S-1 S-2 S-3 S-4
Amostras
ug d
e qu
itina
se/m
g de
pó
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
50
Figura 16 – Dosagem de quitinase em tegumento das sementes de Canavalia
ensiformis (Ce), Adenanthera pavonina (Ap), Dioclea altissima (Da), Albizia sp (A),
Vigna unguiculata cv EPACE-10 (Vu), Glycine max (Gm), Phaseolus vulgaris cv
manteiga (Pvm), Phaseolus vulgaris cv vermelho (Pvv) e Phaseolus vulgaris cv preto
(Pvp). Resultados expressos em concentração de quitinase (µg) por mg de pó. Os
ensaios foram realizados através de experimentos de ELISA, utilizando-se
anticorpos anti-quitinase de Adenanthera pavonina.
0
5
10
15
20
25
30
Ce Ap Da A Vu Gm Pvm Pvv Pvp
Tegumento de sementes
ng d
e qu
itina
se/m
g de
pó
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
51
5.11– Atividade peroxidásica
A Figura 17 mostra os resultados da atividade peroxidásica na fração DII e
nas frações obtidas na cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-100.
Pode-se observar que a maior taxa de atividade desta enzima encontra-se na fração
S-2 (382 unidades de atividade/mg/min), seguida pelas frações DII (266,6 unidades
de atividade/mg/min) e S-3 (16,2 unidades de atividade/mg/min). As frações S-1 e
S-4 apresentaram valores muito pequenos desta atividade: 2,06 e 0,7
unidades/mg/min, respectivamente.
5.12– Atividade inibitória de tripsina
Os resultados da atividade anti-tríptica das frações da DEAE-Sepharose são
apresentados na Figura 18, que mostra que houve inibição da atividade tríptica em
duas das frações testadas. A atividade inibitória de tripsina na DI foi cerca de 94% e
na DII, aproximadamente 70%. A fração DIII não foi capaz de inibir a atividade da
tripsina.
�
�
�
�
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
52
�
�
�
�
0
50
100
150
200
250
300
350
400
D-II S-1 S-2 S-3 S-4
Amostras
Uni
dade
de
ativ
idad
e/m
g/m
in
�
Figura 17 – Atividade peroxidásica da fração DII (DEAE-Sepharose) e das frações
da Sephacryl S-100. As amostras foram incubadas usando 0,25% de guaiacol em
peróxido de hidrogênio 10 mM e fosfato de sódio 10 mM, pH 6,0. Resultados
expressos em unidade de atividade por miligrama por minuto. Uma unidade de
atividade peroxidásica é definida como a quantidade de enzima que catalisa um
aumento de absorbância de 0,01 por minuto a 470 nm.
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
53
Figura 18 – Atividade tríptica das frações do tegumento de soja obtidas em DEAE-
Sepharose. As amostras foram incubadas usando BAPNA 1 mM em DMSO 1%, na
presença de tripsina (20 µg/100 mL) em 50 mM de tampão em Tris-HCl 50 mM,
CaCl2 20 mM pH 8,2. Concentração das amostras utilizadas no ensaio: DI (5
mg/mL), DII (6 mg/mL) e DIII (15 mg/mL).
0
20
40
60
80
100
120
Tripsina DI DII DIII
Amostras
% d
e at
ivid
ade
trip
tica
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
54
5.13– Microscopia de luz para rotina das larvas de C. maculatus crescidas em
sementes artificiais
Na Figura 19 são mostrados cortes semifinos longitudinais do trato intestinal
de larvas de Callosobruchus maculatus controle (mantidas em sementes artificiais
contendo apenas farinha de EPACE-10, susceptível a C. maculatus), processados
para rotina e analisados por microscopia de luz. Verificam-se secções longitudinais
das bordas do intestino das larvas de C. maculatus, com detalhe das
microvilosidades e o lúmen do intestino em aumentos de 10 vezes (Painel A), 20
vezes (Painel B) e 40 vezes (Painel C).
5.14 – Imunohistoquímica
Com o intuito de confirmar a presença de quitinases nos órgãos das larvas de
C. maculatus, secções das larvas desenvolvidas em sementes artificiais (não
cobertas com tegumento) contendo 1% da fração S-3, obtida em Sephacryl S-100,
foram analisadas por microscopia de luz. Embora a fração S-1 tenha sido a mais
tóxica, não foi possível a utilização das larvas que se desenvolveram na presença
dessa fração, porque tanto o número de larvas como os tamanhos das mesmas
inviabilizaram esses experimentos. Desta forma, escolheram-se as larvas
desenvolvidas na fração S-3 que, além de ter sido tóxica, embora menos que a
fração S-1, também possui quitinase. Na Figura 20 (A e B), são mostrados os
resultados do experimento controle, em que os cortes não foram incubados com o
primeiro anticorpo. Nos cortes tratados com o anticorpo anti-quitinase, vizualiza-se
uma marcação nas bordas das microvilosidades intestinais, em aumento de 20
vezes (Painel C) e 40 vezes (Painel D), marcação essa que não ocorre nas secções
de larvas controle (Painéis A e B).
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
55
Figura 19 – Cortes histológicos de larvas de C. maculatus mantidas em sementes
artificiais controle (preparadas apenas com farinha de EPACE-10), corados por azul
de toluidina. (A) Secções das larvas no aumento de 10x. (B) Secções das larvas no
aumento de 20x. (C) Secções das larvas no aumento de 40x.
A
B
C
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
56
Figura 20 – Cortes histológicos de larvas de C. maculatus mantidas em sementes
artificiais contendo 1% da fração S-3. (A) Secções das larvas incubadas apenas com
o anticorpo anti-lgG de coelho complexado com partículas de ouro coloidal (10 nm)
no aumento de 20x. (B) Secções das larvas incubadas apenas com o anticorpo anti-
lgG de coelho complexado com partículas de ouro coloidal (10 nm) no aumento de
40x. (C) Secções das larvas incubadas com o anticorpo anti-quitinase de cotilédones
de A. pavonina no aumento de 20x. (D) Secções das larvas incubadas com o
anticorpo anti-quitinase de cotilédones de A. pavonina no aumento de 40x.
A
C
B
D
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
57
5.15– Toxicidade das frações cromatográficas sobre fungos fitopatogênicos
A Tabela 1 mostra o efeito das diferentes frações (DI, DII e DIII) obtidas em
DEAE-Sepharose sobre o crescimento de fungos filamentosos após 48 h de
incubação. Observa-se um efeito inibitório mais acentuado da amostra retida em
DEAE-Sepharose, eluída com cloreto de sódio 0,5 M (DIII). A fração não retida (DI)
não inibiu consideravelmente o crescimento dos fungos testados.
A fração não retida foi mais efetiva na inibição do fungo Fusarium lateritium,
sendo responsável por apenas 9% de inibição.
Pode-se observar ainda, que a fração DII mostrou uma fraca inibição tanto
para F. lateritium (14,4%) quanto para Fusarium oxysporum (21%).
A fração retida em DEAE-Sepharose, eluída com cloreto de sódio 0,5 M, foi
mais efetiva na inibição do fungo F. lateritium, pois em 48 h de crescimento houve
aproximadamente 72% de inibição. Quando o fungo testado foi F. oxysporum, esta
fração também levou a uma inibição significativa, inibindo o crescimento em cerca de
66%, nesse mesmo período de tempo.
5. RESULTADOS
Santos, P.O. (2007)
58
Tabela 1 – Efeito das frações obtidas após cromatografia em DEAE-Sepharose
sobre o crescimento dos fungos filamentosos Fusarium oxysporum e
Fusarium lateritium.
Percentagem de inibição após 48 h de crescimento Espécie
DI DII DIII
F. oxyporum 5,3% 21% 66%
F. laterititum 9% 14,4% 72%
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
59
6. DISCUSSÃO
Em todo o mundo, perdas na produção agrícola sem o uso de pesticidas
estão estimadas em 70% e apesar do uso de inseticidas, as perdas na pré e pós-
colheita, devido o ataque de insetos, é de 15% da produção total (Araújo et al.,
2005).
As sementes de leguminosas são uma importante fonte de alimento para a
humanidade, entretanto, muitas perdas na produtividade dessas sementes são
causadas pelo ataque de insetos e patógenos. Algumas espécies de bruquídeos,
como o Callosobruchus maculatus, atacam sementes durante o armazenamento,
afetando gravemente a qualidade do produto. O desenvolvimento de uma simples
larva em grãos de feijão-de-corda pode levar a perda de peso de 8-22%, causando
até 37% de perda da produção (Murad et al., 2006). Em períodos de grave
infestação, perdas causadas por C. maculatus podem alcançar 100% das sementes
armazenadas, dentro de um período de 6 meses (Hall et al., 1997).
A previsão de crescimento da população humana mundial indica que haverá
necessidade de aumentar substancialmente a produção de alimento (Zhu-Salzman
et al., 2005). Desde o início da década de 80, novas estratégias de controle de
pragas, como o Manejo Integrado de Pragas (IPM) e o uso de safras transgênicas,
têm sido propostas e testadas para evitar perdas de produçã ba v T w ( , ) T j - 4 2 3 . 2 3 1 - 1 9 . 5 6 0 d 2 . 5 0 4 1 6 T w csado pa panfaeraço n i au ae dv nça ia idadmante i u dn ddurtandosspa ple nté
t fetices n n ur e62raçterídadn t feradsse6 2esi
ctã çie6e eg utodntroídd(n)Tj0 Tc6.23984 0 Td(s)Tj-0.15168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3.23984 0 Td(o)Tj0 Tc6.11992 0 Td(s)Tj0.10.5s n
patógenoss sIAragaó t ( l. 005). a ngia de
( ontrole e a pa aiantelment auij taseimt p aigumprtane ps e d05s produtevs rtc nuv do grgutot T j - 0 . 1 5 3 1 6 8 T c 3 . 1 1 9 9 2 0 T dduigudo g due artanstapeassumenleo o a da da
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auntr ln oo n anl u neei de-aord eormaimente a pnei tad uguo eço rdd(n)Tj0 Tc6.23984 0 Td(s)Tj-0.15168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc31.4 0 Td Td(e)Tj0 Tc2.4 0 Td(c)Tj-0.03168 c5.63984 0 Td(i)Tj-0.01584 Tc2.51992 0 Td(a)Tj0.01c168 Tc6.23984 0 Td(n)Tj0 Tc3168 992 0 Td(ç)Tj-0.w(s s)Tj-0.0624 Tc10.5598 0 Td1.33584 T(q168 Tc6.11992 0 Td(o)Tj0 Tc6.23Tc6.23984 0 Td(t)Tj-0.0í76 Tc3.71992 0 T125Tj-0.03168 c6.23984 0 Td(en)Tj-0.416 Tc92 0 Td(a)Tj-0.05168 Tc5.63984 0 Td(u)Tj0.016.11992 0 Td(s)Tj0.104 168 Tc31.4 0 Td Td1.33584 T(416 TTc2.4 0 Td(gu)Tj0.0n416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.0f168 c6.23984 0 Td(e)Tj0 Tc2.4 0 Td(cd(a)Tj-0.05168 Tc5.63984 0 Td(i)Tj0.08376 TTc2.4 0 Td(gu)Tj0..01584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td1.69584 T-6.23984 0 Td(s)Tj-0.w6s )Tj-0.03168 Tc11.0398 0 Td(d)Tj-0.w(e a p)Tj-016 Tc6.11992 0 Td(()Tj-0.5168 Tc3.23984 0 Td(a)Tj0 Tc6.1196.11992 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(en)Tj-0.bé6.1196.11992 0 Td(t)Tj-0.Tc2(p)T-0.15168 Tc5.63984 0-4 Td878 Td(1.33-0.01584 Tc6.23984 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(a)Tj-0.15168 984 0 Td(s)Tj-0.15168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj0.086.11992 0 Td(c)Tj-0.0.5s )Tj-0.03168 Tc10.5598 0 Td(n)Tj-0.03168 Tc6.11992 0 Td0.01584 Tw4o )Tj-0.03168 098 0 T8(i)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(o)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Td(n)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.03624 Tc3.23984 0 Td(r)Tj-0.15168 Tc3.71992 0 Td(o)Tj0.01584 Tc6.11992 0 Td(l)Tj-0.03168 Tc2.51992 0 Td(e )Tj-0104b168 Tc5.11992 0 6d(n)Tj-0.0416 TTc2.4 0 Td(gu)Tj0.03624 c6.11992 0 Td(l)Tj-0.15168 Tc2.51992 0 Td2.53584 Tc3168 Tc6.11992 0 Td(gen)Tj-0.6.1196.23984 0 Td(i)Tj-0.03168 c92 0 Td(a)Tj-0.05168 Tc5.63984 0 Td(u)Tj0.016.1196.11992 0 Td(t)Tj-0.0.3Tj-0.3.231 -c6.23984 0 T8(i)Tj-0.05168 Tc28.8 0 Td Td(u)Tj0.08376 TTc6.11992 0 Td0.01584 Tw4o )Tj-0.-016 Tc6.11992 0 T8(i)Tj-0.03624 Tc3.23984 0 Td(e)Tj0 Tc6.23984 0 Td(v)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(a)Tj0 Tc3168 Tc10.5598 0 Td0.97584 Tw6o og e nctãrtas, 3Tj-0.3.231 -c6.23984 0 Trotozenart st t omataig us s,
et ras ssnen5168 Tc12.4797 0 Td(a)Tj0 Tc6.11992 0 Td(s)Tj0.13(s c)Tj-0.1168 Tc11.0398 0 Td5(p)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Td(n)Tj0.10416 Tc6.11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3.23984 0 Td1.57584 T03168 c6.11992 0 Td(m)Tj-0.15168 Tc9.47969 0 Td(a)Tj-0.115168 Tc12.4797 0 Td(o)Tj0 Tc6.1196.11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3.23984 0 Td(ó)Tj-0.0376 TTc6.11992 0 Td(n)Tj-0.0gê168 Tc12.4797 0 Td(o)Tj0 Tcn168 c17.0398 0 Td(i)Tj0 Tc2.51992 0 Td(c)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td1.21584 Tc6.23984 0 Td(v)Tj-0.3(s s)Tj-0.03168 Tc5.63984 01Td(é)Tj0 Tca5168 Tc12.4797 0 Td(o)Tj0 Tc6.116.11992 0 Td(z)Tj-0.03168 Tc5.51992 0 Td(ena)Tj-06.23984 0 Td(ss)Tj0.010168 Tc11.0398 0 Td(ss)Tj-03(e )Tj-0.0e03624 Tc27.6398 025d5(e)Tj0 Tc6.11Tc6.11992 0 Td0.01584 T(n1584 Tc12.4797 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(r)Tj-0.03168 Tc3.71992 0 Td(a)Tj-0.15168 Tc6.11992 0 Td(r)Tj-0.3(r )Tj0.01584 TTc11.0398 0 Td5(d)Tj-0.36e )Tj-0.a0168 c97 0 Td9(g)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td1.21584 Tc6.23Tc6.23984 0 Td(t)Tj-0.03168 c3.11992 0 Td4.08 Tw(c3.11992 0 Td(c)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(u)Tj0.01584 Tc6.11992 0 Td(l)Tj-0.03168 Tc2.51992 0 Td(a)Tj-0.01 d1584 Tc11.7598 032d(e)Tj0 Tc5168 Tc2.51992 0 Td(n)Tj0 Tc6.11992 0 Td(s)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj-0.01584 Tc6.23984 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc3.11992 0 Td(o)Tj0 T3(e )Tj-0.03168 Tc11.8797 0 3d0.25584 Tw(e 6 )Tj0.0231 092 0-19.4391 Td(t)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj0 Tc6.23984 0 Td-0.01584 03624 Tc5.63984 0 Td(r)Tj-0.15168 Tc3.71992 0 Td(e)Tj0 Tc6.1196.11992 0 Td(t)Tj-0.15168 Tc3.23984 0 Td(ó)Tj-0.03624 Tc6.11992 0 Td(r)Tj-0.3(m )Tj-0.1584 TTc11.0398 0 T8(i)Tj-0.0.1168 Tc1297 0 Td(t)Tj-0.03168 Tc5.63984 0 T5(i)Tj0 Tc2.5192.4 0 Td(m)Tj-0.03168 Tc9.47969 0 Td(en)Tj-0.6.23984 0 Td2.02416 Tw9s s)Tj-0.0624 Tc10.5598 0 Td(i)Tj-0.0h168 c17.0398 0 Td(i)Tj0 Tc2.51Tc2.51992 0 Td(a)Tj0.01c168 Tc6.23984 0 Td(r)Tj-0.15168 Tc3.71992 0 Td(o)Tj-0.15168 Tc6.23984 0 Td(i)Tj0.10376 Tc2.51992 0 Teicume a i eg use st anroteing e nce d g us t
g e nmementa
a dferídadsmeo 1 1 6 8 T c 1 2 9 7 0 T d ( m ) T j - 0 . 1 z 1 1 3 c 1 2 . 4 7 9 7 0 T 5 ( i ) T j 0 T c 2 . 5 1 9 2 . 4 0 T d ( m d ( m ) T j - 0 . 0 3 1 6 8 T c 9 . 4 7 9 6 9 0 T d ( e ) T j - 0 . 1 6 . 2 3 9 8 4 0 T d ( c ) T j - 0 . - 0 ( e ) T j - 4 2 0 3 1 6 8 T c 9 . 4 7 9 6 9 0 T d ( ( ) T j 0 . 0 5 1 6 8 T c 2 8 . 8 0 T d T d ( u ) T j 0 . 0 8 3 7 6 T T c 6 . 1 1 9 9 2 0 T d 0 . 0 1 5 8 4 T w ( e ) T j - 4 2 0 . d 5 1 6 8 T c 6 . 2 3 9 8 4 0 2 1 T d 0 . T j - 0 . 0 3 6 2 4 T c 6 . 1 1 9 9 2 0 T d ( r ) T j - 0 . 0 3 1 6 8 T c 3 . 7 1 9 9 2 0 T d ( a d ) T j - 0 . 1 5 . 7 6 T c 6 . 1 1 9 9 2 0 T d ( o ) T j 0 T - c 2 ( p ) T - 0 . 1 5 1 6 8 7 9 7 0 T d 6 n ) T j - 0 3 1 6 8 T c 5 . 6 3 9 8 4 0 T d 1 . 2 1 5 8 4 T c 6 . 2 3 T c 6 . 2 3 9 8 4 0 T d ( t ) T j - 0 . 0 3 í 6 . 2 3 9 8 4 0 T d ( c ) T j - 0 . 0 3 1 6 8 T c 5 . 6 3 9 8 4 0 T d 1 . 2 1 5 8 4 T c 6 . 2 3 c 6 . 1 1 9 9 2 0 T d ( l ) T j - 0 . 1 5 1 6 8 T c 2 . 5 1 9 9 2 0 T d 2 . 5 3 5 8 4 T 0 ( e 6 ) T j 0 T 1 6 8 T c 2 . 2 3 9 8 4 0 T 3 ( ( ) T j - 0 . 0 1 5 8 4 T c 7 . 0 7 9 6 9 0 T d ( a d ) T j - 0 . M 1 6 8 T c 9 . 4 7 9 6 9 0 T d ( u ) T j 0 . 0 8 3 7 6 T T c 6 . 1 1 9 9 2 0 T d ( r ) T j - 0 . 0 3 1 6 8 T c 3 . 7 1 9 9 2 0 T d ( a d ) T j - 0 w ( e ) T j - 4 2 a d 1 1 . 2 8 T f - 4 1 3 . 8 7 9 0 . 2 0 4t al. 005).
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
60
Algumas sementes conseguem se defender dessas pragas através de uma
combinação de compostos químicos e fatores físicos. Nas últimas décadas, muitos
trabalhos têm se dedicado a investigar um crescente número de substâncias
produzidas por plantas, que participam direta ou indiretamente nos mecanismos
naturais que as plantas desenvolveram para se defender contra insetos e patógenos
em geral (Carlini et al., 1997; Gomes et al., 1997; Paes et al., 2000; Carvalho et al.,
2001; Macedo et al., 2002; Agizzio et al., 2003).
Apesar dos grandes avanços nos estudos sobre os mecanismos de defesa
das sementes, poucos trabalhos têm se dedicado ao estudo do envolvimento de
proteínas dos tegumentos nesses mecanismos, sendo este tecido considerado
exclusivamente uma estrutura que proporciona uma defesa física para a
manutenção da integridade das sementes.
Através de experimentos com sementes de Glycine max, resultados do nosso
grupo mostraram que estas conseguem impedir o desenvolvimento do bruquídeo C.
maculatus (Santos, 2004). A mortalidade observada ocorre possivelmente devido à
ingestão de componentes tóxicos presentes no tegumento da semente. Esse
comportamento contrasta com o observado na maioria dos cultivares de V.
unguiculata, a principal semente hospedeira desse bruquídeo, onde uma alta
percentagem de ovos eclode (90%) e 80 a 90% das larvas sobrevivem após
atravessarem o tegumento e os cotilédones da semente, dando origem a insetos
adultos (Xavier-Filho et al., 1989). Entretanto, nossos resultados assemelham-se aos
observados por Moraes et al. (2000) em sementes de Phaseolus lunatus, que assim
como a soja, não é uma semente hospedeira desse bruquídeo.
No presente trabalho, para confirmar a participação do tegumento na
resistência dessa semente ao ataque do inseto, foi utilizado um sistema de
sementes artificiais cobertas com tegumento natural de soja. Os resultados obtidos
mostraram que, apesar de um grande número de larvas ter atravessado o tegumento
(93%), estas apresentavam metade da massa das larvas que atravessaram o
tegumento de V. unguiculata (semente onde o inseto se desenvolve naturalmente),
evidenciando a toxicidade do tegumento de soja para larvas de C. maculatus.
Toxicidades mais elevadas foram observadas para as outras sementes testadas:
Canavalia ensiformis, Dioclea altissima, Albizia sp e os três cultivares de Phaseolus
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
62
quantidade de amostra obtida não foi suficiente para a realização deste experimento.
Das frações testadas, a fração DII mostrou-se mais tóxica para as larvas desse
inseto que a fração DI, pois em concentração de 1,14%, foi capaz de reduzir a
massa das larvas em 50% (WD50).
Avaliando-se o conteúdo protéico do tegumento de soja, por SDS-PAGE,
observamos a presença de uma variedade de bandas protéicas, com massas
moleculares de aproximadamente 43 e 36 kDa (fração DI), 23, 25 e 29 kDa (fração
DII) e proteínas com massas que variam de 15 a 27 kDa (fração DIII).
Em estudos sobre o tegumento de soja já foram identificadas as seguintes
proteínas: peroxidase, quitinase, extensina, uma proteína denominada SC24,
inibidor do tipo Bowman-Birk, inibidor do tipo Kunitz e uma proteína hidrofóbica
(HPS) (Cassab et al., 1985; Gillikin e Graham, 1991; Welinder, 1992; Gijzen et al.,
1993; Gijzen et al., 1999; Gijzen et al., 2001). Desta forma, a presença de algumas
dessas proteínas foram investigadas nas frações obtidas. A presença de bandas
protéicas próximas a 45 kDa com atividade peroxidásica foi detectada em todas as
frações testadas, com exceção da fração não retida em DEAE-Sepharose. Essa
banda foi mais forte no precipitado e na fração eluída da DEAE-Sepharose com
NaCl 0,25 M (DII). Atividade fosfatásica também está presente nas três frações
obtidas na DEAE-Sepharose. Entretanto, a maior atividade fosfatásica foi observada
na fração DII (retida em DEAE, eluída com cloreto de sódio 0,25 M). A banda
protéica de 24 kDa presente na fração DIII foi submetida a seqüenciamento de
aminoácidos e apresentou uma seqüência parcial 85% homóloga à fosfatase ácida
de Synechocystis sp.
Enzimas como peroxidases, glucosidases e esterases participam das reações
de defesa de plantas superiores, sendo geralmente secretadas no meio (Nishizaki et
al., 1996). Uma fosfatase ácida recombinate de Arabidopsis thaliana foi capaz de
atrasar o desenvolvimento e aumentar a mortalidade de insetos coleópteras e
dípteras, quando incorporada em sementes artificiais, sugerindo o papel desta
proteína na defesa contra insetos herbívoros (Liu et al., 2005). Muitos papéis têm
sido atribuídos às fosfatases ácidas em plantas, como a participação na transdução
de sinal (Plaxton, 1996), a regulação do metabolismo de desfosforilação de
proteínas (Duff et al., 1994) e a liberação de fosfato inorgânico no meio, a partir de
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
63
fosfato orgânico (Lefebvre et al., 1990). Um importante papel no metabolismo de
plantas pode ser exercido pelas fosfatases, já que essas enzimas, purificadas de
cotilédones de sementes de soja, catalisam reações usando como substratos
intermediários chave da via glicolítica como glicose-6-fosfato, frutose-6-fosfato e
fosfoenol-piruvato (Ferreira et al., 1999).
O papel das peroxidases no mecanismo de resistência de plantas está
estabelecido e tem sido correlacionado com o aumento de suas atividades após
inoculação de fitopatógenos em arroz, trigo e cevada (Kerby e Somerville, 1989;
Young et al., 1995; Mohammadi e Kazemi, 2002).
Em virtude das vicilinas exercerem um papel reconhecido na defesa de
sementes (Macedo et al., 1993; Sales et al., 1996; Yunes et al., 1998; Sales et al.,
2001), além de sua participação como reserva, foram analisadas as proteínas do
tegumento visando identificar a presença de vicilinas. Para isso, foram realizados
experimentos de “Western blotting” utilizando anticorpo anti-vicilina de Vigna
unguiculata, cv EPACE-10. Observou-se a presença de bandas protéicas que
reagiram com o anticorpo, indicando a presença de proteínas do tipo vicilina nesses
tecidos. Através do método de ELISA, foi quantificada a concentração de vicilina na
farinha do tegumento, no precipitado 90% e nas frações da DEAE-Sepharose,
constatando-se que essas proteínas representam cerca de 0,005% da massa seca
da farinha do tegumento e equivalem a 0,59% de todas as proteínas presentes.
Esses resultados reforçam o papel defensivo dos tegumentos, visto que proteínas do
tipo vicilina presentes nesses tecidos vêm sendo descritas na literatura como
potencialmente tóxicas contra C. maculatus (Oliveira et al., 1999; Moraes et al.,
2000; Silva et al., 2004) e fungos fitopatogênicos (Gomes et al., 1997).
Quitinases são hidrolases envolvidas na defesa de plantas contra insetos e
patógenos, incluindo fungos. A atividade dessas proteínas consiste principalmente
na capacidade de atuarem sobre a quitina. Vários trabalhos têm mostrado a
presença constitutiva de quitinases em plantas e suas atividades antifúngica e
inseticida (Huynh et al., 1992; Gomes et al., 1996). Uma proteína antifúngica com
seqüência N-terminal similar a quitinase foi isolada de Dolichos lablab. A proteína,
denominada doliquina, possui massa molecular de 28 kDa. Doliquina exerce forte
atividade antifúngica contra Rhizoctonia solani, além de atividade inibitória contra a
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
64
transcriptase reversa de HIV-1, α e β-glucosidases (Ye et al., 2000). Uma proteína
do tipo quitinase, também de 28 kDa, foi isolada de sementes de feijão-de-corda
(Vigna unguiculata), Phaseolus vulgaris cv pinto e Delandia umbellata (Ng, 2004).
Santos et al. (2004) purificaram, caracterizaram e imunolocalizaram uma quitinase
de sementes de Adenanthera pavonina. A enzima, com massa molecular de
aproximadamente 30 kDa, foi localizada principalmente em compartimentos
citosólicos e detectada em exudados liberados pela semente durante a germinação.
Sabendo-se do papel das quitinases na defesa de plantas, a presença de
quitinase em frações do tegumento de soja (DI, DII e DIII) foi analisada através de
“Western blotting”, utilizando-se anticorpo produzido contra quitinase de cotilédones
de Adenanthera pavonina. Bandas protéicas reativas contra o anticorpo anti-
quitinase estavam presentes na fração DII.
A fração que apresentou maior toxicidade para larvas de C. maculatus (DII) foi
submetida à cromatografia de exclusão molecular em resina Sephacryl S-100. O
perfil cromatográfico obtido mostrou 4 picos: S-1, S-2, S-3 e S-4, que tiveram sua
atividade toxica testada para Callosobruchus maculatus, através de um sistema de
sementes artificiais em concentração de 1%. Observou-se que as frações S-1 e S-3
foram as mais tóxicas.
Através de experimentos de ELISA, foi quantificada a concentração de
quitinase nas frações do tegumento de soja (precipitado, DII, S-1, S-2, S-3, S-4) e na
farinha do tegumento das seguintes sementes: Canavalia ensiformis, Adenanthera
pavonina, Dioclea altissima, Albizia sp, Vigna unguiculata, Glycine max, Phaseolus
vulgaris (manteiga), Phaseolus vulgaris (vermelho) e Phaseolus vulgaris (preto).
Dentre as frações do tegumento de G. max, a maior concentração de quitinase foi
observada na fração DII (0,2 µg/mg). As frações da Sephacryl S-100, S-1 e S-2
apresentaram quantidades bastante aproximadas de quitinase: 0,143 µg/mg e 0,136
µg/mg, respectivamente.
Analisando-se a farinha do tegumento de sementes, a maior quantidade de
proteínas imunorreativas com o anticorpo anti-quitinase (cerca de 22,5 ng/mg) foi
detectada em sementes de soja e feijão comum (cv vermelho). Comparando-se com
as outras amostras, esse valor é, por exemplo, cerca de seis vezes maior que o das
farinhas de tegumento de Vigna unguiculata cv EPACE-10 e P. vulgaris preto. Em
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
65
Adenanthera pavonina, a semente da qual o anticorpo foi produzido, foram
detectados 9,5 ng da enzima por mg de pó. No tegumento de P. vulgaris cv
manteiga, a quitinase representa cerca de 6 ng/mg da farinha deste tecido. Em
Canavalia ensiformis, 4 ng/mg e Dioclea altissima, possui cerca de 5 ng/mg. Vale
ressaltar que, devido ao fato de não se poder garantir que o grau de reatividade das
quitinases presentes nas diversas sementes seja semelhante ao anticorpo usado,
talvez esses dados não possam ser comparáveis entre si. A não detecção de
quitinase no tegumento de Albizia sp indica que o fator de resistência desta semente
para C. maculatus não está relacionado à presença dessa enzima.
Os resultados dos ensaios de determinação da atividade peroxidásica
mostram a confirmação da atividade desta enzima na fração DII, o que também foi
observado nas frações S-2 e S-3, obtidas na cromatografia de exclusão molecular.
Esses resultados sugerem a presença de mais de uma isoforma dessa enzima no
tegumento de sementes de soja. Vários experimentos sugerem o envolvimento de
peroxidases vegetais, não apenas em processos biossintéticos relacionados ao
desenvolvimento da parede celular como na lignificação e suberização, mas também
na regulação da elongação da parede e na resistência contra infecção por
patógenos. Tão amplo espectro de funções é consistente com a presença de várias
isoformas, sugerindo que diferentes isoenzimas podem estar envolvidas em distintos
processos. Além disso, peroxidases podem ser considerados marcadores úteis para
estresses ambientais, visto que sua atividade é detectada por baixa temperatura,
poluição de ar, ozônio, metais pesados, injúria, sais, ataque por patógeno e radiação
UV (Caruso et al., 2001).
Estudos anteriores mostraram também a presença de inibidores de tripsina no
tegumento de soja (Kunitz, 1945 apud Gijzen et al., 2001; Kapoor e Gupta, 1978;
Sessa e Wolf, 2001). No presente trabalho, a inibição da atividade tríptica foi
analisada após incubação da tripsina com as frações do tegumento de soja obtidas
em DEAE-Sepharose. Os resultados mostraram que a fração não retida (DI) e a
fração retida eluída com NaCl 0,25M (DII) apresentaram alta atividade inibitória,
94% e 70%, respectivamente, sugerindo a presença deste inibidor nestas frações.
Os inibidores de proteases são conhecidos por seus papéis em resposta a estresses
abióticos (Franco e Melo, 2000; Pernas et al., 2000) e bióticos, especialmente em
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
66
processos de defesa de plantas contra o ataque de insetos praga (Gatehouse e
Gatehouse, 1998), sendo efetivos contra enzimas digestivas de insetos. Girard et al.
(1998) observaram que os inibidores orizacistatina e Bowman-Birk mostraram uma
potente atividade inibitória contra proteinases intestinais de Phaedon cochleariae
(F.). Observações similares foram feitas quando experimentos foram realizados com
proteinases serínicas da traça do tomateiro, Lacanobia oleracea, que foram inibidas
por SKTI (inibidor de tripsina de soja tipo Kunitz) e CpTI (Inibidor de ripsina do feijão-
de-corda) (Gatehouse et al., 1999). Estas observações também estão de acordo
com relatos para Helicoverpa armigera, Heliothis virescens e outros lepidópteros,
nos quais SKTI foi o mais efetivo entre os inibidores testados (Ahamad et al., 1980;
Johnston et al., 1991; Ferreira et al., 1994; Johnston et al., 1995). Outros estudos
têm demonstrado que estes inibidores são altamente ativos in vitro e in vivo, quando
os insetos foram alimentados com uma dieta artificial contendo inibidores
(Gatehouse et al., 1999; Franco et al., 2003). Ensaios in vitro mostraram que o
inibidor de tripsina de soja tipo Kunitz foi capaz de inibir atividades digestivas do tipo
serina proteinase de larvas e insetos adultos do bicudo do algodoeiro (Anthonomus
grandis). Larvas neonatas criadas em dieta artificial contendo STKI apresentaram
aumento na mortalidade e graves deformidades das larvas, pupas e insetos adultos
(Franco et al., 2004). Um inibidor de tripsina isolado de sementes de Adenanthera
pavonina, ApTI, foi altamente efetivo contra proteinases digestivas de C. maculatus,
Acanthoscelides obtectus e Zabrotes subfasciatus. Em C. maculatus alimentados
com dieta artificial contendo 0,25% e 0,5% de ApTI (w/w), a maior concentração
causou 50% de mortalidade e reduziu o ganho de massa das larvas em
aproximadamente 40% (Macedo et al., 2004).
Neste trabalho, a confirmação da presença de quitinases de tegumento de
sementes de G. max, nos órgãos das larvas de C. maculatus, foi realizada. Os
resultados da imunolocalização de quitinase mostraram que moléculas presentes
nas bordas das microvilosidades intestinais das larvas de C. maculatus, mantidas
em sementes artificiais contendo 1% da fração S-3, foram reativas com o anticorpo
anti-quitinase. Apesar da fração S-3 não ter sido a mais rica em quitinase, foi uma
das mais tóxicas para C. maculatus quando incorporada em sementes artificiais.
Além disso, as larvas obtidas nessas sementes apresentavam tamanho possível de
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
67
manipulação na preparação para microscopia. Outros trabalhos mostram a detecção
de proteínas tóxicas a insetos em vários órgãos. Paes et al. (2000) mostraram a
detecção de arcelinas de P. vulgaris na hemolinfa, lúmen intestinal e em vesículas
celulares de Acanthoscelides obtectus e Zabrotes subfasciatus. Proteínas de reserva
presentes nas bordas das microvilosidades do intestino médio de larvas de C.
maculatus foram reconhecidas por imunomarcação de vicilinas. Estes sítios de
marcação coincidem com os locais de marcação com o anticorpo anti-quitina,
confirmando resultados anteriores de ligação de vicilinas a matrizes de quitina (Sales
et al., 2001). Recentemente, proteínas do tipo vicilinas de sementes de V.
unguiculata foram detectadas na hemolinfa, no lúmen intestinal, nas células do
epitélio intestinal, no corpo gorduroso, e nos túbulos de Malpighi de larvas de C.
maculatus e também, na hemolinfa de larvas de Zabrotes subfasciatus e corpo
gorduroso de insetos adultos, mostrando a ação sistêmica dessa proteína (Uchôa,
2006; Uchôa et al., 2006). Assim como as vicilinas, GNA (lectina de Galanthus
nivalis) e ConA (lectina de Canavalia ensiformis), quando inclusas em dieta semi-
artificial e oferecidas a larvas de Lacanobia oleracea, acumularam-se no intestino,
túbulos de Malpighi e na hemolinfa, indicando que ambas as lectinas foram
internalizadas e distribuídas sistemicamente após ligarem-se a glicoproteínas
presentes ao longo do trato digestivo do inseto (Fitches et al., 2001). As lectinas são
consideradas agentes biológicos efetivos contra o ataque de insetos. Embora o
modo preciso da ação inseticida de lectinas vegetais não seja completamente
conhecido, acredita-se que a resistência à degradação proteolítica por enzimas
digestivas e a ligação a estruturas do intestino são os dois pré-requisitos básicos
para que essas proteínas exerçam seus efeitos deletérios em insetos (Vasconcelos,
2004).
Os resultados deste estudo mostraram o efeito das frações obtidas em DEAE-
Sepharose sobre o crescimento dos fungos filamentosos Fusarium lateritium e
Fusarium oxysporum. Foi observado um efeito inibitório mais acentuado da amostra
retida em DEAE-Sepharose, eluída com NaCl 0,5 M (DIII). Várias classes de
proteínas antifúngicas estão envolvidas na inibição da síntese da parede celular dos
fungos ou rompem a estrutura da parede; outras desfazem a estrutura da membrana
do fungo, resultando na lise da célula fúngica (Selitrennikoff, 2001). A ação inibitória
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
68
das frações obtidas em DEAE-Sepharose pode ser explicada provavelmente pela
presença de vicilinas, quitinases, peroxidases, além da presença de inibidores de
tripsina e de outras proteínas não analisadas.
Vários trabalhos têm mostrado a atividade inibitória de vicilinas sobre o
crescimento de fungos fitopatogênicos. Vicilinas de sementes de leguminosas
interferem na germinação dos fungos filamentosos Fusarium solani, Fusarium
oxysporum, Colletotrichum musae, Phytophtora capsici, Neurospora crassa e
Ustilago maydis (Gomes et al., 1997). Wang et al. (2001) purificaram três proteínas
antimicrobianas de sementes de Malva parviflora e observaram atividade antifúngica
contra Phytophthora infestans, da proteína denominada CW-3, que possui
homologia com vicilina de sementes de algodão. Estudos recentes mostraram que
EcV, uma vicilina de sementes de Enterolobium contortisiliquum, testada contra os
fungos fitopatogênicos, F. solani e Colletotrichum lindemuthianum, exerceu um efeito
inibitório na germinação de F. solani em concentrações de 10 a 20 µg/mL (Moura et
al., 2007). Os resultados obtidos neste trabalho mostram que a fração DII possui
cerca de 0,16% de vicilina. Juntamente com a vicilina, esta fração possui outras
proteínas antifúngicas como quitinase (concentração de 0,2 µg/mg) e apresentou
atividade peroxidásica de 266 unidades de atividade/mg/min. A atividade inibitória
exercida pela fração DIII, sobre o crescimento dos fungos F. lateritium (72% de
inibição) e F. oxyporum (66% de inibição), pode ser justificada pela combinação de
proteínas do tipo vicilina e peroxidase.
O efeito inibitório dessas proteínas contra fungos tem sido relatado por vários
autores (Selitrennikoff, 2001; Ng, 2004; Valueva e Mosolov, 2004). Ye e Ng (2005)
isolaram uma quitinase de sementes de Phaseolus mungo, com ação antifúngica
contra Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Mycosphaerella arachidicola, Pythium
aphanidermatum e Sclerotium rolfsii. Um peptídeo de massa molecular de 7,5 kDa,
isolado de sementes de Vicia faba, exerceu ação inibitória sobre o crescimento
micelial de Mycosphaerella arachidicola, Fusarium oxysporum e Botrytis cinerea. A
análise da seqüência N-terminal demonstrou ser um inibidor do tipo Bowman-Birk
(Ye et al., 2001). Estudos recentes mostraram a atividade inibitória de um inibidor de
protease de Phaseolus mungo, denominado mungoin, exercida contra os fungos
Physalospora piricola, M. arachidicola, P. aphanidermatum, F. oxysporum, entre
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
69
outros (Wang et al., 2006). Ensaios antifúngicos realizados in vitro para fungos
fitopatogênicos indicaram que WP1, uma peroxidase básica purificada de sementes
de trigo (Triticum aestivum), foi ativa na inibição da elongação do tubo germinativo
(Caruso et al., 2001). Uma peroxidase, com massa molecular de 37 kDa e atividade
antifúngica contra M. arachidicola, F. oxysporum e B. cinerea, foi isolada de P.
vulgaris (Ye e Ng, 2002).
Além dessas proteínas identificadas no tegumento de G. max, há centenas de
peptídeos e proteínas antifúngicos conhecidos, e muitos outros sendo descobertos
quase diariamente. Uma aglutinina cotiledonária de Luetzelburgia auriculata foi
capaz de inibir o crescimento de Colletotrichum lindemuthianum, F. solani e
Aspergillus niger (Melo et al., 2005). Atividade inibitória contra os fungos B. cinerea,
F. culmorum, F. oxysporum, Phycomyces blakesleeanus, Pyrenophora triticirependis,
Pyricularia oryzae, Septoria nodorum e Trichoderma hamatum foi também relatada
para heveína, uma proteína de Hevea brasiliensis que apresenta a capacidade de se
ligar à quitina (Van Parijs et al., 1991). Há relato de atividade lítica de lisozima
isolada de sementes de P. mungo contra F. oxysporum, F. solani, P.
aphanidermatum, S. rolfsii e B. cinerea (Wang et al., 2005).
Os mecanismos de resistência de plantas ainda não são totalmente
conhecidos, tornando de fundamental importância estudos para a compreensão da
interação entre agressor e hospedeiro, bem como para o desenvolvimento de
métodos de controle adequados (Shewry e Lucas, 1997). Uma alternativa
ambientalmente aceitável no controle de pragas é a exploração dos mecanismos de
defesa da própria planta, pela manipulação da expressão de suas proteínas de
defesa endógenas ou pela introdução de genes de controle derivados de uma outra
planta.
Apesar de muitos estudos estarem voltados à identificação de moléculas de
defesa em cotilédones, o tegumento é o principal modulador das interações entre as
estruturas internas e o ambiente externo, além de ser a primeira barreira enfrentada
pelos organismos predadores de sementes. Portanto, evitar que este agressor
penetre a semente até alcançar o embrião é uma estratégia de defesa mais eficaz.
Desta forma, conhecer compostos químicos de defesa presentes neste tecido é uma
alternativa para produção de plantas resistentes.
6. DISCUSSÃO
Santos, P.O. (2007)
70
Os resultados obtidos neste estudo apontam algumas moléculas que
separadamente ou através de um efeito sinergístico podem estar contribuindo para a
capacidade que as sementes de G. max têm de se defender contra o ataque do
bruquídeo C. maculatus e a penetração de patógenos, como os fungos
fitopatogênicos estudados.
7. CONCLUSÕES
Santos, P.O. (2007)
71
7. CONCLUSÕES
��Os tegumentos das sementes Glycine max, Adenanthera pavonina, Albizia sp,
Dioclea altissima, Canavalia ensiformis e Phaseolus vulgaris (cultivares
manteiga vermelho, vermelho e manteiga) interferiram no desenvolvimento
normal das larvas de C. maculatus desenvolvidas em sementes artificiais;
��As frações DI e DII (obtidas em DEAE-Sepharose) foram altamente tóxicas
para larvas de C. maculatus;
��Uma proteína presente na fração retida em DEAE-Sepharose apresentou
seqüência parcial de aminoácidos com 85% de homologia com a fosfatase
ácida de Synechocystis sp;
��Atividade fosfatásica em gel nativo foi detectada nas frações da DEAE-
Sepharose;
��As frações S-1 e S-3 (obtidas em Sephacryl S-100) foram altamente tóxicas
para larvas de C. maculatus;
��Proteínas do tipo quitinases estavam presentes nas frações DII, S-1, S-2, S-3,
e na farinha do tegumento das sementes Canavalia ensiformis, Adenanthera
pavonina, Dioclea altissima, Vigna unguiculata, Glycine max, Phaseolus
vulgaris (cultivares manteiga, vermelho e preto);
��Atividade peroxidásica foi detectada nas frações retidas em DEAE-Sepharose
e nas frações S-2 e S-3;
�� A atividade anti-tríptica verificada na fração DI foi cerca de 94% e na DII,
aproximadamente 70%;
��Quitinases estão presentes no trato intestinal das larvas de C. maculatus
desenvolvidas em sementes artificiais contendo 1% da fração S-3, obtida em
Sephacryl S-100;
7. CONCLUSÕES
Santos, P.O. (2007)
72
��As frações obtidas em DEAE-Sepharose foram capazes de inibir o
crescimento de F. lateritium e F. oxysporum. A fração DIII mostrou-se mais
tóxica, inibindo o crescimento do F. lateritium em cerca de 70%.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
73
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ahamad, Z., Saleemuddin, M., Siddi, M. (1980) Purification and characterization of
three alkaline proteinases from the midgut of the larvae of army worm,
Spodoptera litura. Insect Biochem. 10: 667-673.
Agizzio, A. P., Carvalho, A. O., Ribeiro, S. de F. F., Machado, O., L., T., Alves, E. W.,
Okorokov, L. A., Samarão, S. S., Bloch Jr., Prates, M. V., Gomes, V. M. (2003) A
2S albumin-homologous protein from passion fruit seeds inhibits the fungal
growth and acidification of the medium by Fusarium oxysporum. Arch. Biochem.
Biophys. 416: 188-195.
Agrios, G. N. (1988) How plants defend themselves against pathogens. In: Plant
Pathology. 3.rd. London: Academic Press, London, p. 97-115.
Algan, G., Büyükkartal, H. N. B. (2000) Ultrastructure of seed coat development in
the natural tetraploid Trifolium pratense L. J. Agron. Crop Sci. 184: 205-213.
Araújo, C. L., Bezerra, I. W. L., Oliveira, A. S., Moura, F. T., Macedo, L. L. P.,
Gomes, C. E. M., Barbosa, A. E. A. D., Macedo, F. P., Souza, T. N. M. S.,
Franco, O. L., B-J., C., Sales, M. P. (2005) In vivo bioinsecticidal activity toward
Ceratitis Capitata (fruit fly) and Callosobruchus maculatus (cowpea weevil) and in
vitro bioinsecticidal activity toward different orders of insect pests of a trypsin
inhibitor purified from tamarind tree (Tamarindus indica) seeds. J. Agric. Food
Chem. 53 (11): 4381-4387.
Bastos, J. A. M. (1981) Principais pragas de cultivares e seus controles. Nobel 50-
84.
Benhamou, N., Broglie, K., Chet, I., Broglie, R. (1993) Cytology of infection of 35S
bean chitinase transgenic canola plants by Rhizoctonia solani: cytochemical
aspects of chitin breakdown in vivo. Plant J. 4: 295-305.
Bewley, J. D., Black, M. (1994) Seeds: Physiology of Development and Germination.
2.nd. New York: Plenum Press, p. 1-31.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
74
Bode, W., Huber, R. (2000) Structural basis of the endoproteinase protein inhibitor
interaction. Biochim. Biophys. Acta 1477: 241-252.
Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal
Biochem. 72: 248-254.
Brandão, S. S. (1961) Contribuição ao Estudo de Variedades de Soja. Experientiae
1(4): 99-119.
Broekaert, W. F., Lee, H. I., Kush, A., Chua, N-R., Raikhel, N. (1990) Wound-induced
accumulation of mRNA containing a hevein sequence in laticifers of rubber tree
(hevea brasiliensis). Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 7633-7637.
Carlini, C. R., Oliveira, A. E. A., Azambuja, P., Xavier-Filho, J., Wells, M. A. (1997)
Biological effects of canatoxin in different insect models: evidence for a proteolytic
activation of the toxin by insect cathepsinlike enzymes. J. Econ. Entomol. 90:
340-348.
Carlini, C. R., Grossi-de-Sá, M. F. (2002) Plant toxic proteins with insecticidal
properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. Toxicon 40(11):
1515-1539.
Carlson, J. B. (1973) Estimating surface area of soybean root systems. J. Minn Acad.
Sci. 36 (1): 16-19.
Caruso, C., Chilosi, G., Leonardi, L., Bertini, L., Magro, P., Buonocore, V., Caporale,
C. (2001) A basic peroxidase from wheat kernel with antifungal activity.
Phytochemistry 58: 743-750.
Cassab, G. I., Nieto-Sotelo, J., Cooper, J. B., van Holst, G. J., Varner, J. E. (1985) A
developmentally regulated hydroxyproline-rich glycoprotein from the cell walls of
soybean seed coats. Plant Physiol. 77: 532-535.
Cassab, G. I., Varner, J. E. (1987) Immunocytolocalization of extensin in developing
soybean seed coats by immunogold-silver staining and by tissue printing on
nitrocellulose paper. J. Cell Biol. 105 (6): 2581-2588.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
75
Carvalho, A. O., Machado, O. L. T., Cunha, M., Santos, I. S., Gomes, V. M. (2001)
Antimicrobial peptides and immunolocalization of a LTP in Vigna unguiculata
seeds. Plant Physiol. Biochem. 39: 137-146.
Chesin, M., Zipf, A. E. (1990) Alarm systems in higher plants. Bot. Rev. 55: 193-235.
Copland, L. O., McDonald, M. B. (1985) Principles of seeds science and technology.
2.nd. New York: Macmillan Budlishing Company, p. 34-49.
Dhaubhadel, S., Kuflu, K., Romero, M. C., Gijzen, M. (2005) A soybean seed protein
with carboxylate-binding activity. J. Exp. Bot. 1-10.
Ding, X., Gopalakrishnan, B., Johnson, L. B., White, F. F., Wang, X., Morgan, T. D.,
Kramer, K. J., Muthukrishnan, S. (1998) Insect resistance of transgenic tobacco
expressing an insect chitinase gene. Transgenic Res. 7(2): 77-84.
Duff, S. M. G., Sarath, G., Plaxton, W. C. (1994) The role of acid phosphatases in
plant phosphorous metabolism. Physiol. Plant 90: 791-800.
Duranti, M., Barbiroli, A., Scarafoni, A., Tedeschi, G., Morazzonic, P. (2003) One-
step purification of Kunitz soybean trypsin inhibitor. Protein Exp. Purif. 30: 167-
170.
Esau, K. (1974) Anatomia das Plantas com Sementes. 2.ed. Reimpressão 1998.
São Paulo: Edgard Blücher, p. 256-262.
Ferreira, C., Capella, A. N., Sitnik, R., Terra, W. R. (1994) Properties of the digestive
enzymes and the permeability of the peritrophic membrane of Spodoptera
frugiperda (Lepidoptera) larvae. Comp. Biochem. Physiol. 107: 631-640.
Ferreira, C. V., Granjeiro, J. M., Taga, E. M., Aoyama, H. (1998) Multiple forms of
soybean seed acid phosphatases. Purification and characterization. Plant
Physiol. Biochem. 36: 487-494.
Ferreira, C. V., Taga, E. M., Aoyama, H. (1999) Glycolysis intermediates as
substrates of acid phosphatases from soybean seeds. Plant Sci. 147: 49-54.
Fields, P. G., Xie, Y. S., Hou, X. (2001) Repellent effect of pea (Pisum sativum)
fractions against stored-product insects. J. Stored Prod. Res. 37: 359-370.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
76
Firmino, F., Fernandes, K. V. S., Sales, M. P., Gomes, V. M., Miranda, M. R. A.,
Domingues, S. J. S., Xavier-Filho, J. (1996) Cowpea (Vigna unguiculata) vicilins
associate with putative chitinous structures in the midgut and feces of the bruchid
beetles Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus. Braz. J. Med. Biol.
Res. 29: 749-756.
Fitches, E., Woodhouse, S. D., Edwards, J. P., Gatehouse, J. A. (2001) In vitro and
in vivo binding of snowdrop (Galanthus nivalis agglutinin; GNA) and jackbean
(Canavalia ensiformis; Con A) lectins within tomato moth (Lacanobia oleracea)
larvae; mechanisms of insecticidal action. J. Insect Physiol. 47: 777-787.
Fitches, E., Wilkinson, H., Bell, H., Bown, D. P., Gatehouse, J. A., Edwards, J. P.
(2004). Cloning, expression and functional characterisation of chitinase from
larvae of tomato moth (Lacanobia oleracea): a demonstration of the insecticidal
activity of insect chitinase. Insect Biochem. Mol. Biol. 34: 1037-1050.
Franco. O. L., Dias, S. C., Magalhães, C. P., Monteiro, A. C. S., Bloch Jr., C., Melo,
F. R., Oliveira-Neto, O. B., Monnerat, R. G., Grossi-de-Sá, M. F. (2004) Effects of
soybean Kunitz trypsin inhibitor on the cotton boll weevil (Anthonomus grandis).
Phytochemistry 65: 81-89.
Franco, O. L., Grossi-de-Sá, M. F., Sales, M. P., Mello, L. V., Oliveira, A. S., Rigden,
D. J. (2002) Overlapping binding sites for trypsin and papain on a Kunitz-type
proteinase inhibitor from Prosopis juliflora. Proteins 49: 335-341.
Franco, O. L., Melo, F. R. (2000) Osmoprotectants, a plant strategy in response to
osmotic stress. Russ. J. Plant Physiol. 47: 137-144.
Franco, O. L., Santos, R. C., Araújo, M. A. M., Mendes, A. C. M., Batista, J. A. N.,
Monnerat, R. G., Grossi-de-Sá, M. F., Freitas, S. M. (2003) Effects of black-eyed
pea trypsin/chymotrypsin inhibitor on proteolytic activity and on development of
Anthonomus grandis. Phytochemistry 63: 343-349.
Fukuda, M., Matsui, M., Takaoka, M., Kakuta, S., Hamauzu, Z., Toyosawa, L. (1994)
Distribution of glycine-rich protein in soybean seed tissue and characterization of
the separated protein. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi 41: 48-50. Apud Sessa,
D. J., Wolf, W. J. (2001) Bowman-Birk inhibitors in soybean seed coats. Ind.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
77
Crops Prod. 14: 73-83.
Gabard, K. A., Jones, R. L. (1986) Localization of phytase and acid phosphatase
isoenzymes in aleurone layers of barley. Physiol. Plant 67: 182-192.
Gatehouse, A. M. R., Gatehouse, J. A. (1998) Identifying proteins with insecticidal
activity: use of encoding genes to produce insect resistant transgenic crops.
Pestic. Sci. 52: 165-175.
Gatehouse, A. M. R., Norton, E., Davison, G. M., Babbe, S. M., Newell, C. A.,
Gatehouse, J. A. (1999). Digestive proteolytic activity in larvae of tomato moth,
Lacanobia oleracea: effects of plant proteinase inhibitor in vitro and in vivo. J.
Insect Physiol., 45: 545-558.
Gellatly, K., Moorhead, G. B. G., Duff, S. M. G., Lefebvre, D. D., Plaxton, W. C.
(1994) Purification of a potato tuber acid phosphatase having characteristics of a
protein tyrosine phosphatase. Plant Physiol. 106: 223-232.
Gijzen, M., Kuflu, K., Qutob, D., Chernys, J. T. (2001) A class I chitinase from
soybean seed coat. J. Exp. Bot. 52 (365): 2283-2289.
Gijzen, M., Miller, S. S., Kuflu, K., Buzzell, R. I., Miki, B. L. A. (1999) Hydrophobic
protein synthesized in the pod endocarp adheres to the seed surface. Plant
Physiol. 120: 951-959.
Gijzen, M., van Huystee, R., Buzzell, R. I. (1993) Soybean seed coat peroxidase. A
comparison of high-activity and low-activity genotypes. Plant Physiol. 103: 1061-
1066.
Gillikin, J. W., Graham, J. S. (1991) Purification and development analysis of the
major anionic peroxidade from the seed coat of Glycine max. Plant Physiol. 96:
214-220.
Girard, C., Le Metayer, M., Bonadé-Bottino, M., Pham-Delegue, M-H., Jouanin, L.
(1998) High level of resistance to proteinase inhibitors may be conferred by
proteolytic cleavage in beetle larvae. Insect Biochem. Mol. Biol. 28: 229-237.
Gomes, V. M., Mosqueda, M. I., Blanco-Labra, A., Sales, M.P., Fernandes, K. V. S.,
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
78
Cordeiro, R. A., Xavier-Filho, J. (1997) Vicilin storage proteins from Vigna
unguiculata (legume) seeds inhibit fungal growth. J. Agric. Food Chem. 45(10):
4110-4115.
Gomes, V. M., Oliveira, A. E. A., Xavier-Filho, J. (1996) A chitinase and a β-1,3-
glucanase isolated from the seeds of cowpea (Vigna unguiculata (Walp)) inhibit
growth of fungi and insect pests of the seed. J. Sci. Food Agric. 72: 86-90.
Gomes, V. M., Xavier-Filho, J. (1994) Biochemical defenses of plants. Arq. Biol.
Tecnol. 37 (2): 371-383.
Gonzalez, R., Valera, J., Carreira, J., Polo, F. (1995) Soybean hydrophobic protein
and soybean hull allergy. Lancet 346: 48-49.
Granjeiro, P. A., Ferreira, C. V., Granjeiro, J. M., Taga, E. M., Aoyama, H. (1999)
Purification and kinetic properties of castor bean seed acid phosphatase
containing sulphydryl groups. Physiol. Plant. 107: 151-158.
Hall, A. E., Singh, B. B., Ehlers, J. D. (1997) Cowpea breeding. Plant Breed. Rev. 15:
217-274.
Hammerschimidt, R., Nuckles, E. M, Kuc, J. (1982) Association of enhanced
peroxidase activity with induced systemic resistance of cucumber to
Colletotrichum lagenarium. Physiol. Plant 20: 73-82.
Henriksen, A., Mirza, O., Indiani, C., Teilum, K., Smulevich, G., Welinder, K. G.,
Gajhede, M. (2001) Structure of soybean seed coat peroxidase: a plant
peroxidase with unusual stability and haem-apoprotein interactions. Protein Sci.
10: 108-115.
Hirano, H., Kagawa, H., Okubo, K. (1992) Characterization of proteins released from
legume seeds in hot water. Phytochemistry 31 (3): 731-735.
Huynh, Q. K., Hironaka, C. M., Levine, E. B., Smith, C. E., Borgmeyer, J. R., Shah,
D. M. (1992) Antifungal proteins from plants. Purification, molecular cloning, and
antifungal properties of chitinases from maize seed. J. Biol. Chem. 267: 6635-
6640.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
79
Janzen, D. H. (1977) How southern cowpea weevil larvae (Bruchidae:
Callosobruchus maculatus) die on nonhost seeds. Ecology 58: 921-927.
Johnston, K. A., Lee, M., Gatehouse, J. A., Anstee, J. H. (1991) The partial
purification and characterization of serine proteinase activity in midgut of larval
Helicoverpa armigera. Insect Biochem. 21: 389-397.
Johnston, K. A., Lee, M., Brough, C., Hilder, V. A., Gatehouse, A. M. R., Gatehouse,
J. A. (1995). Proteinases activity in the larval midgut of Heliothis virenscens:
evidence for trypsin and chymotrypsin-like enzymes. Insect Biochem. Mol. Biol.
25: 375-383.
Kamal, J. K. A., Behere, D. V. (2003) Activity, stability and conformational flexibility of
seed coat soybean peroxidase. J. Inorg. Biochem. 94: 236-242.
Kapoor, A. C., Gupta, Y. P. (1978). Trypsin inhibitor activity in soybean seed as
influenced by storage of its development and different treatments, and the
distribution in its anatomical parts. Ind. J. Nutr. Dietet. 15: 429-433.
Kennedy, A.R. (1998) Chemopreventive agents: protease inhibitors. Pharmacol.
Ther. 78, 167–209.
Kerby, K., Somerville, S. (1989) Enhancement of specific intercellular peroxidase
following inoculation of barley with Erysiphe graminis f. sp. hordei. Physiol. Mol.
Plant Pathol. 35: 323-337.
Kogan, M. M. (1986) Natural Chemicals in Plant Resistance to Insects. Iowa St. J.
Res. 60: 501-527.
Kozlowski, T. T. (1972) Seed Biology. Germination control, metabolism, and
pathology. 2.nd. New York: Academic Press, v.2, p. 4-1114.
Kunitz, M. (1945) Crystallization of a trypsin inhibitor from soybean. Science 101:
668-669. Apud Gijzen, M., Kuflu, K., Qutob, D., Chernys, J. T. (2001) A class I
chitinase from soybean seed coat. J. Exp. Bot. 52 (365): 2283-2289.
Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of head of
bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
80
Lefebvre, D. D., Duff, S. M. G., Fife, C., Plaxton, W. C. (1990) Response to
phosphate deprivation in Brassica nigra suspension cells. Enhancement of
intracellular, cell surface and secreted phosphatase activities compared to
increases in Pi-absorption rate. Plant Physiol. 93: 504-511.
Liu, Y., Ahn, J. E., Datta, S., Salzman, R. A., Moon, J., Huyghues-Despointes, B.,
Pittendrigh, B., Murdock, L. L., Koiwa, H., Zhu-Salzman, K. (2005) Arabidopsis
vegetative storage protein is an anti-insect acid phosphatase. Plant Physiol. 139:
1545-1556.
Macedo, M. L. R., Andrade, L. B. S., Moraes, R. A., Xavier-Filho, J. (1993) Vicilin
variants and the resistance of cowpea (Vigna unguiculata) seeds to the cowpea
weevil (Callosobruchus maculatus). Comp. Biochem. Physiol. 105C (1): 88-94.
Macedo, M. L. R., de Matos, D. G. G., Machado, O. L. T., Marangoni, S., Novello, J.
C. (2000) Trypsin inhibitor from Dimorphandra mollis seeds: purification and
properties. Phytochemistry 54: 553±558.
Macedo, M. L. R., de Sá, C. M., Freire, M. D., Parra, J. R. (2004) A Kunitz-type
inhibitor of coleopteran proteases, isolated from Adenanthera pavonina L. seeds
and its effect on Callosobruchus maculatus. J. Agric. Food Chem. 52(9): 2533-
2540.
Macedo, M. L. R., Mello, G. C., Freire, M. G. M., Novello, J. C., Marangoni, S.,
Matos, D. G. G. (2002) Effect of a trypsin inhibitor from Dimorphandra mollis
seeds on the development of Callosobruchus maculatus. Plant Physiol. Biochem.
40: 891-898.
Ma, F., Cholewa, E., Mohamed, T., Petersen, C. A., Gijzen, M. (2004) Cracks in the
palisade cuticle of soybean seed coats correlate with their permeability to water.
Ann. Bot. 94: 213-228.
Malhotra, O. P., Kayastha, A. M. (1990) Isolation and characterization of
phosphoenolpyruvate phosphatase from germinating mung beans (Vigna
radiata). Plant Physiol. 93: 194-200.
Melo, V. M. M., Vasconcelos, I. M., Gomes, V. M., Da Cunha, M., Soares, A. A.,
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
81
Oliveira, J. T. A. (2005) A cotyledonary agglutinin from Luetzelburgia auriculata
inhibits the fungal growth of Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium solani and
Aspergillus niger and impairs glucose-stimulated acidification of the incubation
medium by Saccharomyces cerevisiae cells. Plant Sci. 169: 629-639.
Miller, S. S., Bowman, L. A., Gijzen, M., Miki, B. L. A. (1999) Early development of
the seed coat of soybean (Glycine max). Ann. Bot. 84: 297-304.
Minor, H. C., Souza, B. H., Gonçalves, H. M. (1975) Caracterização botânica e
fenológica dos cultivares do Banco de Germoplasma de soja. Agronomia
Sulriograndense 11(2), 157-194.
Mohammadi, M., Kazemi, H. (2002) Changes in peroxidase and polyphenol oxidase
activities in susceptible and resistant wheat heads inoculated with Fusarium
graminearum and induced resistance. Plant Sci. 162: 491-498.
Moïse, J. A., Han��6���*XG\QDLW-Savitch, L., Johnson, D. A., Mikica, B. L. A. (2005)
Seed coats: Structure, development, composition, and biotechnology. In vitro
cellular and developmental biology. Plant 41: 620-644.
Mookherjee, P. B., Chawla, M. L. (1964) Effect of temperature and humidity on the
development of Callosobruchus maculatus. Fab. A serious pest of stored pulses.
Indian J. 26(3): 345-351.
Moraes, R. A., Sales, M. P., Pinto. M. S. P., Silva, L. B., Oliveira, A. E. A., Machado,
O. L. T., Fernandes, K. V. S., Xavier-Filho, J. (2000) Lima bean (Phaseolus
lunatus) seed coat phaseolin is detrimental to the cowpea weevil (Callosobruchus
maculatus). Braz. J. Med. Biol. Res. 33: 191-198.
Mota, A. C., Damatta R. A., Lima Filho, M., Silva, C. P., Xavier-Filho, J. (2003)
Cowpea (Vigna unguiculata) vicilins bind to the peritrophic membrane of larval
sugarcane stalk borer (Diatraea saccharalis). J. Insect Physiol. 49(9): 873-880.
Moura, F. T., Oliveira, A. S., Macedo, L. L., Vianna, A. L., Andrade, L. B., Martins-
Miranda, A. S., Oliveira, J. T., Santos, E. A., Sales, M. P. (2007) Effects of a
chitin-binding vicilin from Enterolobium contortisiliquum seeds on bean bruchid
pests (Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus) and
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
82
phytopathogenic fungi (Fusariu
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
83
Insect Physiol. 46: 393-402.
Park, H. S. C., Van Etten, R. (1986) Purification and characterization of
homogeneous sunflower seed acid phosphatase. Phytochemistry 25: 351-357.
Penheiter, A. R., Duff, S. M. G., Sarath, G. (1997) Soybean root nodule acid
phosphatase. Plant Physiol. 114: 597-604.
Pernas, M., Sanchez-Monge, R., Salcedo, G. (2000) Biotic and abiotic stress can
induce cystatin expression in chestnut. FEBS Lett. 467: 206-210.
Plaxton, W. C. (1996) The organization and regulation of plant glycolysis. Ann. Rev.
Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 185-214.
Purcell, J. P., Greenplate, J. T., Sammons, R. D. (1992) Examination of midgut
luminal proteinase activities in six economically important insects. Insect
Biochem. Mol. Biol. 22: 41-47.
Reimers, P. J., Guo, A., Leach, J. E. (1992) Increased activity of a cationic
peroxidase associated with an incompatible interaction between Xanthomonas
oryzae pv. oryzae and rice (Oryza sativa). Plant Physiol. 99: 1044-1050.
Rhoades, D. F. (1979) Evolution of plant chemical defense against herbivores. G. A.
Rosental, D. H. Janzen (eds.). In: Herbivores: Their interaction with secondary
metabolites. New York: Academic Press, p. 3-53.
Rossi, A., Palma, M. S., Leone, F. A., Brigliador, M. A. (1981) Properties of acid
phosphatase from scutella of germinating maize seeds. Phytochemistry 20: 1823-
1826.
Ryan, C. A. (1991) Proteinase inhibitors in plants: genes for improving defenses
against insects and pathogens. Ann. Rev. Phytol. 28: 425- 449.
Sales, M. P., Gomes, V. M., Fernandes, K. V. S., Xavier-Filho, J. (1996) Chitin-
binding proteins from cowpea (Vigna unguiculata) seeds. Braz. J. Med. Biol. Res.
29: 319-326.
Sales, M. P., Macedo, M. L., Xavier-Filho, J. (1992) Digestibily of cowpea (Vigna
unguiculata) vicilins by pepsin, papain and bruchid midgut proteinases. Comp.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
84
Biochem. Physiol. 103b(4): 945-950.
Sales, M. P., Pimenta, P. P., Paes, N. S., Grossi-de-Sá, M. F., Xavier-Filho, J. (2001)
Vicilins (7S storage globulins) of cowpea seeds bind to chitinous structures of the
midgut of Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) larvae. Braz. J.
Med. Biol. Res. 34: 27-34.
Salzer, P., Bonanomi, A., Beyer, K., Vogeli-Lange, R., Aeschbacher, R. A., Lange, J.,
Wiemken, A., Kim, D., Cook, D. R., Boller, T. (2000) Differential expression of
eight chitinase genes in Medicago truncatula roots during mycorrhiza formation,
nodulation, and pathogen infection. Mol. Plant-Microbe Interact. 763–777.
Santos, I. S., Da Cunha, M., Machado, O. L. T., Gomes, V. M. (2004) A chitinase
from Adenanthera pavonina L. seeds: purification, characterisation and
immunolocalisation. Plant Sci. 167: 1203-1210.
Santos, J. H. R., Teófilo, E. M., Almeida, J. M., Oliveira, F. J. (1977) Percentagens de
sementes de cultivares de Vigna sinensis (L) Savi, atacadas pelo Chalcodermus
bimaculatus. Fieldler, 1936 (Col: Curc.). Universidade Federal do Ceará, Centro
de Ciências Agrárias, Depto. de Fitotecnia. Relatório de Pesquisa, Fortaleza. 70-
74.
Santos, P. O. (2004) Investigação da toxicidade do tegumento da semente de soja
(Glycine max) para o gorgulho do feijão-de-corda (Callosobruchus maculatus) e
fungos fitopatogênicos. Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas).
Campos dos Goytacazes-RJ, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro – UENF, 82p.
Selitrennikoff, C. P. (2001) Antifungal Proteins. Appl. Environ. Microbiol. 67 (7): 2883-
2894.
Sessa, D. J., Wolf, W. J. (2001) Bowman-Birk inhibitors in soybean seed coats. Ind.
Crops Prod. 14: 73-83.
Shewry, P. R., Lucas, J. A. (1997) Plant proteins that confer resistance to pest and
pathogens. Adv. Bot. Res. 26: 135-192.
Silva, L. B., Sales, M. P., Oliveira, A. E. A., Machado, O. L. T., Fernandes, K. V. S.,
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
85
Xavier-Filho, J. (2004) The seed coat of Phaseolus vulgaris interferes with the
development of the cowpea weevil [Callosobruchus maculatus (F.) (Coleoptera:
Bruchidae)]. An. Braz. Acad. Sci. 76 (1): 57-65.
Solomon, M., Belenghi, B., Delledone, M., Menachem, E., Levine, A. (1999) The
involvement of cysteine proteinase and proteinase inhibitor genes in the
regulation of programmed cell death in plants. Plant Cell 11: 431-443.
Souza, F. H. D., Marcos-Filho, J. (2001) The seed coat as a modulator of seed-
environment relationships in Fabaceae. Rev. bras. Bot. 24 (4): 365-375.
Staswick, P. E., Papa, C., Huang, J., Rhee, Y. (1994) Purification of the major
soybean leaf acid phosphatase that is increased by seed-pod removal. Plant
Physiol. 104: 49-57.
Swanson, B. G., Hughes, J. S., Rasmussen, H. (1985) Seed microstructure: review
of water imbibition in legumes. Food Microstructure 4: 115-124.
Swanson, M. C., Li, J. T., Wentz-Murtha, P. E., Trudeau, W. L., Fernandez-Caldas,
E., Greife, A., Rodrigo, M. A. J., Morell, F., Reed, C. E. (1991) Source of the
aeroallergen of soybean dust: a low molecular mass glycopeptide from the
soybean tela. J. Allergy Clin. Immunol. 87: 783-788.
Thiery, D. (1984) Hardness of some fabaceous seed coats en relation to larval
penetration by Acanthoscelides obtecus (Say) (Coleoptera: Bruchidae). J. Stored
Prod. Res. 20 (4): 177-181.
Towbin, H., Staehelin, N. T. & Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of protein
from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedures and some
applications. Proc. Natl. Acad. Sci. 176: 4350-4354.
Uchôa, A. F. (2006) Presença sistêmica de vicilinas de sementes de leguminosas
nas larvas dos bruquídeos Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus.
Tese (Doutorado em Biociências e Biotecnologia). Campos dos Goytacazes-RJ,
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF, 122p.
Uchôa, A. F., DaMatta, R. A., Retamal, C. A., Albuquerque-Cunha, J. M., Souza, S.
M., Samuels, R. I., Silva, C. P., Xavier-Filho, J. (2006) Presence of the storage
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
86
seed protein vicilin in internal organs of larval Callosobruchus maculatus
(Coleoptera: Bruchidae). J. Insect Physiol. 52: 169-178.
Valueva, T. A., Mosolov, V. V. (2004) Role of inhibitors of proteolytic enzymes in
plant defense against phytopathogenic microorganisms. Biochemistry (Moscow)
69 (11): 1305-1309. Translated from Biokhimiya, 69 (11): 1600-1606.
van Dongen, J. T., Ammerlaan, A. M. H., Wouterlood, M., van Aelst, A. C., Borstlap,
A. C. (2003) Structure of the developing pea seed coat and the postphloem
transport pathway of nutrients. Ann. Bot. 91: 729-737.
Van Parijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. (1991) Hevein: an
antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta 183: 258-
262.
Vasconcelos, I. M., Oliveira, J. T. A. (2004) Antinutritional properties of plant lectins.
Toxicon 44: 385-403.
Walker, A. J., Ford, L., Majerus, M. E. N., Geoghegan, A. E., Birch, N., Gatehouse, J.
A., Gatehouse, A. M. R. (1998) Characterization of the midgut digestive
proteinase activity of the two-spot ladybird (Adalia bipunctata) and its sensitivity to
proteinase inhibitors. Insect Biochem. Mol. Biol. 28: 173-180.
Wang, H. L., Grusak, M. A. (2005) Structure and development of Medicago truncatula
pod wall and seed coat. Ann. Bot. 95: 737-747.
Wang, S., Lin, J., Mingyu Ye, Ng, T. B., Rao, P., Ye, X. (2006) Isolation and
characterization of a novel mung bean protease inhibitor with antipathogenic and
anti-proliferative activities. Peptides 27: 3129-3136.
Wang, S., Ng, T. B., Chen, T., Lin, D., Wu, J., Rao, P., Ye, X. (2005) First report of a
novel plant lysozyme with both antifungal and antibacterial activities. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 327: 820-827.
Wang, X., Bunkers, G. J., Walters, M. R., Thoma, R. S. (2001) Purification and
characterization of three antifungal proteins from cheeseweed (Malva parviflora).
Biochem. Biophys. Res. Commun. 282 (5): 1224-1228.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
87
Wang, X., Ding, X., Gopalakrishnan, B., Morgan, T. D., Johnson, L., White, F. F.,
Muthukrishnan, S., Kramer, K. J. (1996) Characterisation of a 46 kDa insect
chitinase from transgenic tobacco. Insect Biochem. Mol. Biol. 2610: 1055-1064.
Welinder, K. G. (1992) Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases. Curr.
Opin. Struct. Biol. 2: 388-393.
Welinder, K. G., Larsen, Y. B. (2004) Covalent structure of soybean seed coat
peroxidase. Biochim. Biophys. Acta 1698: 121- 126.
Wildon, D. C., Thain, J. F., Minchin, P. E. H., Gubb, I. R., Reilly, A. J., Skipper, Y. D.,
Doherty, H. M., Donnell, P. J., Bowles, D. J. (1992) Electrical signaling and
systemic proteinase inhibitor induction in the wounded plant. Nature 360: 62-65.
Williams, J. O. (1980) Note on bruchidae associated with stored products in Nigeria.
Tropical Grain Legume Bulletin 26: 5-10.
Williams, L. F. (1950) Structure and genetic characteristics the soybean products.
Interscience Publ. 1: 111-134.
Xavier-Filho, J. (1992) The biological roles of serine and cysteine proteinase
inhibitors in plants. Braz. J. Plant Physiol. 4: 1-6.
Xavier-Filho, J. (1993) Sementes e suas Defesas contra Insetos. Projeto
Multinacional de Biotecnologia e Alimentos. Organização dos Estados
Americanos (OEA). Universidade Federal do Ceará: Imprensa Universitária. 1-9.
Xavier-Filho, J., Campos, F. A. P., Ary, M. B., Silva, C. P., Carvalho, M. M. M.,
Macedo, M. L. R., Lemos, F. J. A., Grant, G. (1989) Poor correlation between the
levels of proteinase inhibitors found in seeds of different cultivars of cowpea
(Vigna unguiculata) and the resistance/susceptibility to predation by
Callosobruchus maculatus. J. Agric. Food Chem. 37: 1139-1145.
Xavier-Filho, J., Coelho, A. N. (1980) Acid proteinases of Callosobruchus maculatus
and proteinase inhibitors of Vigna unguiculata. Plant Physiol. 65: 138.
Xavier-Filho, J., Fernandes, K. V. S. (1998) The biological roles of legume seed
vicilins (7S storage proteins). Trends Comp. Biochem. Physiol. 4: 241-245.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Santos, P.O. (2007)
88
Ye, X. Y., Ng, T. B. (2002) Isolation of a novel peroxidase from French bean legumes
and first demonstration of antifungal activity of a non-milk peroxidase. Life Sci. 71:
1667-1680.
Ye, X.Y., Ng, T.B. (2005) A chitinase with antifungal activity from the mung bean.
Protein Exp. Purif. 40: 230-236.
Ye, X. Y, Ng, T. B., Rao, P. F. (2001) A Bowman–Birk type trypsin–chymotrypsin
inhibitor from broad beans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289: 91-96.
Ye, X. Y., Wang, H. X., Ng, T. B. (2000) Dolichin, a new chitinase-like antifungal
protein isolated from field beans (Dolichos lablab). Biochem. Biophys. Res.
Commun. 269: 155-159.
Young, S. A., Guo, A., Guikema, J. A., White, F. F., Leach, J. A. (1995) Rice cationic
peroxidase accumulates in xylem vessels during incompatible interactions with
Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Plant Physiol. 107: 1333-1341.
Yunes, A. N. A., Andrade, M. T., Sales, M. P., Morais, R. A., Fernandes, K. V. S.,
Gomes, V. M., Xavier-Filho, J. (1998) Legume seed vicilins (7S storage proteins)
interfere with the development of the cowpea weevil [Callosobruchus maculatus
(F.)]. J. Sci. Food Agric. 76: 111-116.
Zeng, C.-L.; Wang, J.-B.; Liu, A.-L.; Wu, X.-M. (2004) Seed coat microsculpturing
changes during seed development in diploid and amphidiploid Brassica species.
Ann. Bot. 93: 555-566.
Zhu-Salzman, K., Bi, J. L., Liu, T-X. (2005) Molecular strategies of plant defense and
insect counter-defense. Insect Sci. 12: 3-15.
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