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XVII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, XIII Encontro Latino Americano de Pós-Graduação e III Encontro de Iniciação à Docência – Universidade do Vale do Paraíba

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TÉCNICA HISTOLÓGICA APLICADA À AVALIAÇÃO DA FIBROSE HEPÁTICA EM

RATOS

Maria Martin da Cruz, Luciana Barros Sant’ Anna

Universidade do Vale do Paraíba - UNIVAP, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Av. Shishima Hifumi

2911 – Urbanova, São José dos Campos,SP, [email protected], [email protected].

Resumo: A fibrose hepática e sua progressão para a cirrose apresentam elevadas tavas de morbilidade e mortalidade, cujo único tratamento é o transplante de fígado. Seu diagnóstico ainda depende da análise histológica do tecido hepático, a qual está intimamente relacionada à qualidade das lâminas histológicas coradas obtidas pelo laboratório. O objetivo deste estudo foi padronizar a técnica histológica, especificamente a etapa da coloração, para a observação das características morfológicas do fígado com fibrose hepática induzida em ratos pela ligadura do ducto biliar. Ambos os fragmentos foram fixados em formol e processados histologicamente para a coloração pela técnica da hematoxilina e eosina (H/E), por meio de dois protocolos. O protocolo 1, com hematoxilina de Mayer, resultou em lâminas coradas heterogeneamente quando comparado com as lâminas resultantes do protocolo 2, onde foi utilizado a hematoxilina de Harris, que mostrou mais adequado, por possibilitar maior intensidade de coloração em estruturas, tanto eosinófilas, quanto basófilas. Concluiu-se, que sem a padronização não seria possível a correta análise das características morfológicas e patológicas do tecido hepático. Palavras-chave: técnica histológica, coloração, hematoxilina, fibrose hepática, ratos Área do Conhecimento: Biomedicina Introdução

Histologia é o estudo dos tecidos e de como estes tecidos se organizam para constituir órgãos. Os tecidos são constituídos por combinações específicas de células e matriz extracelular, as quais interagem entre si para manter a integridade tecidual. O procedimento mais usado no estudo de tecidos é a preparação de cortes histológicos que são estudados ao microscópio óptico, onde a imagem pode ser examinada porque um feixe de luz é transmitido através do corte. Considerando que tecidos e órgãos são normalmente espessos demais para permitir a passagem da luz, eles devem ser seccionados para se obterem secções delgadas. Para isso, os tecidos necessitam sofrer uma série de tratamentos prévios para então poderem ser fatiados por meio de instrumentos de grande precisão chamados de micrótomos. O conjunto de procedimentos pelos quais passam os fragmentos de tecidos para o exame microscópico denomina-se técnica histológica (JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2004). Estes procedimentos incluem: coleta do material, fixação, clivagem, processamento, inclusão, microtomia e coloração (MOLINARO, 2010).

A fixação é uma das etapas mais importantes da técnica histológica, pois visa interromper o metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os componentes bioquímicos intra e

extracelulares, preservando e conservando os elementos teciduais, além de permitir a penetração de outras substâncias subsequentes à fixação (MOLINARO, 2010). Para obter secções delgadas com o micrótomo, após a fixação os fragmentos de tecidos devem ser infiltrados com substâncias que lhes proporcionem uma consistência rígida. O processo de impregnar os tecidos com parafina é chamado inclusão e é precedido pelas fases de desidratação e clareamento (processamento histológico). Dentre estas, ressalta-se a etapa da desidratação, onde é imprescindível que o tecido seja desidratado aos poucos, em solução alcoólica de concentrações crescentes até a total remoção da água do tecido por banho em álcool absoluto. Do contrário, ocorrerá desidratação violenta e rápida, o que condicionará lesões estruturais da célula em caráter irreversível, o que impedirá a ulterior penetração dos diferentes corantes e solventes para o interior das células. Uma vez os tecidos incluídos em parafina (bloco histológico), eles estão prontos para serem cortados no micrótomo. A coloração, etapa seguinte, consiste em técnicas tintoriais empregadas para facilitar o estudo dos tecidos sob microtomia, pois visa contrastar as estruturas teciduais (GARTNER E HIATT, 1999; JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2004; TOLOSA et al., 2003). Diversos tipos podem ser empregados, porém a escolha esta baseada no tipo de tecido e


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nas características estruturais que se deseja evidenciar. Entretanto, deve-se inicialmente utilizar uma coloração que proporcione uma visão geral do tecido de modo a permitir a identificação dos elementos teciduais, propiciando o diagnóstico histológico. A coloração pela hematoxilina (H) e pela eosina (E) cumpre muito bem esse papel, sendo denominada como coloração de rotina na Histologia (FISHER et al., 2006).

No geral, o processamento dos tecidos possui variáveis que podem afetar consideravelmente os resultados do processo histológico, tais como, condições de operação (manual ou equipamentos automático), temperatura, características e concentração dos reagentes utilizados e as propriedades químicas dos tecidos. Diversos protocolos para a técnica histológica são citados na literatura, não existindo um que seja o ideal para todos os tecidos (MOLINARO, 2010). Segundo Junior (2010), a padronização no laboratório tem a finalidade de prevenir, detectar, identificar e corrigir erros ou variações que possam ocorrer em todas as fases da técnica histológica garantindo, assim a qualidade das lâminas.

A fibrose hepática é uma doença causada por uma grande variedade de doenças crônicas que afetam o fígado após diferentes agressões, dentre elas: infecção viral (hepatite B e C), alcoolismo, doenças auto-imunes, desordens metabólicas, tóxicas ou biliares, como as colestases causadas por cálculos biliares ou compressão do ducto biliar por tumores (LI E CRAWFORD, 2004; HENDERSON E FORBES, 2009). Apesar dos avanços tecnológicos nas últimas décadas e o surgimento de técnicas avançadas de imagem e biologia molecular, o diagnóstico de doenças do fígado ainda depende da análise morfológica do tecido hepático, a qual está intimamente relacionada à qualidade das lâminas histológicas coradas obtidas pelo laboratório (ASSIS E JORGE, 2004). Neste contexto, o objetivo deste estudo foi padronizar a técnica histológica, especificamente a etapa da coloração, para a observação das características morfológicas do fígado com fibrose hepática induzida em ratos pela ligadura do ducto biliar.

Metodologia O trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética

no Uso de Animais do IPD/UNIVAP, protocolo A030/CEUA/2011. Para este estudo foram utilizados 2 ratos machos albinos da raça Wistar, com peso aproximado de 250g, sendo um rato 1 saudável e 1 com fibrose induzida pelo modelo experimental da ligadura do ducto biliar

(KONTOURAS et al., 1984; Sant` Anna et al., 2010).

Imediatamente após a remoção do fígado dos ratos, ele foi fracionado em fragmentos de 2cm² com 3mm de espessura, colocados em cassetes histológicos e fixados em formol tamponado a 10% por 24h. Em seguida, os fragmentos foram lavados em água corrente (3x por 20min) e armazenados em solução de álcool etílico a 70% até o momento do processamento histológico, o qual se realizou após 1 semana. Após este período, os fragmentos foram imersos em álcool a 100%, para a etapa da desidratação (4x por 1h), clarificados em xilol (2x por 40min) e impregnados com paraplast em estufa 58°C, sendo que o primeiro banho de paraplast foi de 1 hora e 15 minutos e o segundo de 2horas e 15 minutos. Em seguida, sobre uma placa aquecida a 60°C, foi colocada uma caçarola contendo parafina fluída, os moldes para a inclusão e os cassetes com fragmentos do fígado, que foram um a um sendo retirados da estufa. Com auxilio de uma pinça pequena e levemente aquecida colocou-se o fragmento no molde de inclusão, já preenchido com a parafina líquida, e posteriormente recolocou-se o cassete com a numeração correspondente sobre cada molde, completando-o com mais parafina líquida. Os moldes foram depositados sobre uma placa fria e após resfriamento (±30min), desenformados os cassetes.

Após a inclusão, os blocos foram seccionados em um micrótomo semi-automático (RM2245 – Leica Microsystems) para obtenção de cortes com 4µm de espessura que foram distendidos em banho-maria a 40ºC e coletados em lâminas de extremidade fosca, numeradas. Posteriormente, estas lâminas foram transferidas para um suporte inclinado e colocadas em estufa a 60°C por 12horas, para melhorar a adesão do corte a lâmina e retirar o excesso de parafina.

A etapa seguinte e final foi a coloração dos cortes histológicos com hematoxilina e eosina (H/E). Primeiramente, as lâminas foram desparafinizadas em 2 banhos de xilol, desidratadas por meio de sequências alcoólicas em concentrações decrescentes, álcool 100%, 95% e 70%, até água destilada. Em cada um desses banhos as lâminas permaneceram por 5min. Para a coloração propriamente dita, foram testados dois protocolos. No primeiro, utilizou-se como corante básico a hematoxilina de Mayer (EasyPath) durante 5min, sendo seguida da lavagem das lâminas em água corrente, também por 5min. Após, as lâminas foram imersas no corante ácido eosina (EasyPath), por 1,5 minutos, água corrente 1 minuto, álcool 100% (3 banhos de 3s cada), xilol (2 banhos de 3s) e montadas com


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uma lamínula de vidro e Permount. No segundo protocolo, utilizou-se hematoxilina de Harris (Dinâmica) por 3 minutos, água destilada por 5min, lavagem das lâminas em água corrente por 5min e ainda água destilada por 2min. Após, as lâminas foram imersas em eosina, por apenas 30s, sendo seguido pelo álcool 95% e álcool 100% (3 banhos por 3s cada) e apenas 1 banho em xilol por 4s, deixando-o neste até o final da montagem das lâminas. Estas foram analisadas e fotografadas em microscópico trinocular Leica DM2500 (Leica Microsystems) e câmera de vídeo digital Leica DFC295 (Leica Microsystems).

Resultados Os resultados dos aspectos microscópicos do

fígado normal e com fibrose, com os protocolos de coloração 1 e 2, podem ser observados nas Figuras 1 a 3.

As Figuras 1A e 2A são fotomicrografias do fígado normal corado com o protocolo 2. Observa-se um espaço porta do fígado caracterizado por 3 estruturas: ramo do ducto biliar, formado por um epitélio simples de células cúbicas, com núcleos claros e parede conjuntiva delgada corada em rosa; ramo da veia porta, que se destaca por sua luz ampla e parede muscular delgada; ramo da artéria hepática, com luz relativamente estreita e parede muscular espessa. Os hepatócitos apresentam forma poliédrica, núcleo arredondado e central corado em diferentes intensidades de azul púrpura, nucléolo evidente e citoplasma fortemente corado em rosa. Observa-se, também que os hepatócitos se dispõem em cordões anastomosadas entre capilares sinusóides com epitélio descontínuo de células achatadas com núcleo corado intensamente em roxo. Na Figura 2A ainda se observa algumas células mononucleares coradas em roxo e agrupadas no tecido conjuntivo denso do espaço porta.

As Figuras 1B e 3A são fotomicrografias do fígado com fibrose corado com o protocolo 2. Observa-se em espaço porta expandido pela intensa proliferação ductular que se irradia para o parênquima hepático causando uma desorganização dos hepatócitos, os quais aparecem em grupos ou isolados rodeados por ductos neoformados de vários diâmetros. Grande quantidade de células mononucleares (infiltrado inflamatório) aparece no tecido conjuntivo do espaço porta ao redor da veia porta, mas principalmente ao redor do ducto biliar. Nota-se nessa figura que o formato das células mononucleares é igual no fígado normal, tendo apenas a diferenciação na quantidade analisada. As Figuras 2B e 3B correspondem ao fígado normal e com fibrose corados com o protocolo 1,

respectivamente. Os hepatócitos apresentam o núcleo fracamente corado em lilás, com formato pouco delimitado e citoplasma corado em rosa, porém sem muita diferenciação entre as demais estruturas coradas também pela eosina, como a matriz extracelular do tecido conjuntivo do espaço porta. Os capilares sinusóides, entre os cordões de hepatócitos não são nítidos. No fígado com fibrose (Figura 3B) não se nota a delimitação entre os ductos neoformados da proliferação dúctular e os grupos de hepatócitos.

Figura 1- Fotomicrografia do fígado corado com eosina e hematoxilina de Harris (protocolo 2). A) fígado normal: espaço porta típico e parênquima hepático com arquitetura normal. B) espaço porta expandido pela intensa proliferação ductular (�) e parênquima hepático desarranjado: “ilhas” de hepatócitos (�).Veia porta (VP), artéria hepática (AH), ducto biliar (DB) e o parênquima hepático com arquitetura normal: hepatócitos (�), e células inflamatórias(� ), 20x.


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Figura 2- Fotomicrografia do fígado normal. A) corado com eosina e hematoxilina de Harris (protocolo 2): hepatócitos com núcleos arredondados e centrais nitidamente evidenciado pelas várias tonalidades de roxo e citoplasma fortemente corado em rosa. B) corado com eosina e hematoxilina de Mayer (protocolo 1): hepatócitos e células do epitélio dúctular com núcleos corados fracamente com a perda da delimitação do formato celular. Veia porta (VP), artéria hepática (AH), ducto biliar (DB), hepatócitos (�) e células inflamatórias(�), 40x. Discussão

De acordo com os resultados dos aspectos microscópicos do fígado, no que se refere à integridade tecidual após o processamento histológico verificamos, que a padronização da técnica histológica foi eficiente para preservar todos os componentes do tecido, tanto normal, quanto alterado, permitindo que a coloração cumprisse seu papel, ou seja, contrastar as estruturas teciduais do espaço porta e do parênquima hepático (hepatócitos e capilares sinusóides) (Figuras 1 a 3).

A técnica de coloração mais comumente usada em histologia animal e patologia de rotina é a H & E (Hematoxilina e Eosina). O corante básico, hematoxilina, cora estruturas ácidas de azul

Figura3- Fotomicrografia do fígado com fibrose. A) Corado com eosina e hematoxilina de Harris (protocolo 2) epitélio ductular nitidamente diferenciado. B) corado com eosina e hematoxilina de Mayer (protocolo 1): tecido claro com pouca nitidez dos contornos nucleares. Veia porta (VP), artéria hepática (AH), ducto biliar (DB), hepatócitos (�), células inflamatórias(�) e proliferação ductular (�), 40x.

púrpura. O núcleo celular e o retículo endoplasmático granular possuem uma forte afinidade por este corante devido ao seu elevado conteúdo de DNA e RNA respectivamente, sendo assim denominadas de estruturas basófilas. Por outro lado, a eosina é um corante ácido que cora estruturas básicas de vermelho ou rosa. A maioria das proteínas citoplasmáticas é básica e, portanto, o citoplasma geralmente cora-se em vermelho-rosado, sendo denominada estrutura eosinófila (BURKITT et al; 1994). Segundo Junqueira e Carneiro (2004) o fígado é revestido por uma cápsula delgada de tecido conjuntivo que se torna mais espessa no hilo, por onde a veia porta e a artéria hepática penetram no fígado e por onde saem os ductos hepáticos direito e esquerdo e os linfáticos. Estes vasos e ductos são circundados por tecido conjuntivo ao longo de toda a sua extensão, até o término (ou origem) nos espaços porta entre os lóbulos hepáticos. Neste ponto,


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formam-se uma delicada rede de fibras reticulares que suporta os hepatócitos (células do fígado) e células endoteliais dos capilares sinusóides. O componente estrutural básico do fígado é o hepatócito, células epiteliais agrupadas em placas interconectadas entre as quais estão os sinusóides, vasos irregularmente dilatados por onde o sangue passa em direção à veia hepática terminal.

Em nosso estudo foram utilizados 2 protocolos de coloração H/E, com 2 tipos diferentes do corante hematoxilina. Dentre todas as etapas da técnica histológica, a coloração foi a que mais apresentou variações, sendo que o protocolo 1 com hematoxilina de Mayer resultou em lâminas coradas heterogeneamente (Figuras 2B e 3B), quando comparado com as lâminas resultantes do protocolo 2 (Figuras 1A, 1B, 2A e 3A). Os resultados da análise histológica do fígado normal corado com o protocolo 2 (Figuras 1A e 2A) demonstrou núcleos dos hepatócitos corados em roxo ou azul, evidenciando sua cromatina dispersa e nucléolo evidente. Estas células mostraram eosinofilia citoplasmática, principalmente devido ao grande número de mitocôndrias e algum retículo endoplasmático liso. A matriz extracelular do tecido conjuntivo denso presente no espaço porta corou-se em rosa pela eosina, devido à concentração das fibras colágenas, as quais são estruturas eosinófilas. Esses achados estão de acordo com Junqueira e Carneiro (2004) e Silva et al. (2011). Sendo assim, o protocolo 2 de coloração H/E usando a hematoxilina de Harris, mostrou-se mais adequado, uma vez que possibilitou maior intensidade de coloração tanto das estruturas basófilas, quanto das eosinófilas.

Com relação ao fígado com fibrose corado pelo protocolo 2 (Figuras 1B e 3A), os resultados da análise histológica demonstraram hepatócitos com núcleos em roxo e citoplasma fortemente eosinófilo agrupados ou isolados em meio à intensa proliferação de ductos neoformados, constituídos por epitélio cúbico/cilíndrico e núcleos claros, além do aumento na espessura da camada de colágeno ao redor do ducto biliar no espaço porta, evidenciado pela intensa coloração pela eosina. Esses achados estão de acordo com os observados no estudo de Gibelli et al. (2003).

Segundo Gayotto e Alves (2001), a proliferação de dúctulos biliares (ductos neoformados) é uma resposta frequente, e inespecífica, do tecido hepático às mais variadas formas de agressão. Li e Crawford, (2004) verificaram que a ligadura do ducto biliar causa a obstrução do fluxo biliar, resultando em aumento no número de ductos e um leve grau de infiltração mononuclear ao redor do ducto biliar de grande diâmetro. Essa característica também foi evidenciada em nosso

estudo, principalmente com o protocolo 2 de coloração, o qual permitiu maior distinção entre as estruturas alteradas pela doença (Figura 1B). De acordo com Gayotto e Alves (2001), a análise cuidadosa dos padrões morfológicos dos ductos neoformados, sua intensidade e proliferação, podem trazer valiosos subsídios para o diagnóstico histológico e interpretação da história natural de vários tipos de doenças hepáticas. Acreditamos que isto reforça a importância de uma boa coloração do tecido hepático alterado pela fibrose.

Diferentes estudos (JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2004; CALDINI, 2002) apontam variações nos protocolos da coloração H/E, principalmente no tempo em que os cortes histológicos ficam em contato com os reagentes (xilol, diferentes concentrações de álcool, água e os corantes propriamente ditos). Segundo Junqueira e Carneiro (1983), a grande maioria dos corantes é diluída em água ou álcool fraco, razão pela qual é necessário retirar a parafina e hidratar os cortes permitindo assim que o corante possa penetrar no tecido e corá-lo. Para isto os cortes histológicos são passados pela seguinte sequência: xilol 1 (10min), xilol 2 (10min), álcool 100% (5min), álcool 95% (5min), álcool 70% (10min), água e corantes (CALDINI, 2002). Já Junqueira (1983) relata que é necessário a passagem por 3 cubas de xilol (8min), álcool 100% (1min), álcool 95% (1min), álcool 70% (1min), água e corantes.

Em nosso estudo, para corar o tecido hepático, realizamos a mesma sequência dos protocolos de Junqueira e Carneiro (1983) e Caldini (2002), porém com alteração nos tempos, totalizando 10min para xilol 1 e xilol 2, 15 minutos para os álcoois, e 5min para água destilada. Os passos seguintes foram à passagem dos cortes histológicos na hematoxilina de Mayer por 5min, água corrente 5min, eosina 1,5min e água corrente. Uma vez o tecido corado, ele foi ainda desidratado rapidamente em álcool 100% (9s), passado em xilol (3s) e selado com um adesivo e lamínula. Este protocolo, o qual denominamos de protocolo 1, não permitiu uma boa diferenciação entre os componentes teciduais do fígado, tanto normal, quanto com fibrose. No geral os cortes histológicos mostravam-se fracamente corados (Figuras 2B e 3B). Já no protocolo 2 a hematoxilina de Mayer foi substituída pela de Harris e o tempo neste corante também foi diminuído para 3min. Outra alteração foi à passagem da lâmina pela eosina apenas por 30s e colocação direta no álcool 100% excluindo, assim uma passagem em água corrente. Com esse protocolo obteve-se uma coloração mais intensa, tanto da hematoxilina, quanto da eosina.


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A alteração na hematoxilina está de acordo com Caldini (2002), que relata que a hematoxilina de Harris cora mais o tecido e em um tempo mais curto. Outro ponto a considerar é a retirada da passagem dos cortes em água após a coloração pela eosina, além do tempo que foi menor. Isto também contribuiu para a coloração mais intensa e homogênea, permitindo diferenciar com maior nitidez os contornos das estruturas normais e alteradas no fígado com fibrose (Figuras 1A, 1B, 2A, 3A). Conclusão

A técnica histológica realizada neste estudo permitiu a evidenciação de todas as características morfológicas do tecido hepático normal, assim como as alterações estruturais no tecido hepático com fibrose.A coloração realizada com o protoloco 2 (hematoxilina de Harris) tornou mais nítida as estruturas basófilas e acidófilas do tecido hepático, diferenciando os principais componentes da fibrose hepática visualizadas com a coloração H/E. Por fim, verificou-se que sem a padronização não seria possível a análise concisa do material coletado e o reconhecimento das atipias do tecido fibrótico para um estudo de futuras terapias para a fibrose hepática. Referências - ASSIS, E.A.C.P.; JORGE, S.G. Histologia hepática. Disponível em: http://www.hepcentro.com.br/histologia.htm. Acesso em 5 set. 2013. - BURKITT, H.G; YOUNG, B; HEATH, J. W. Histologia Funcional. 3.ed. Rio de Janeiro: Ed.Guanabara Koogan, 1994. - CALDINI, E.G. Manual de técnica em histologia e biologia celular do laboratório de biologia celular. 2002. 21f da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, 2002. - DI FIORE, M.S.H. Atlas de histologia. 7.ed. Rio de Janeiro: Ed.-Guanabara Koogan, 1991. - GAYOTTO, L.C.C.; ALVES, V.A.F.A. Doenças do fígado e vias biliares. 1.ed. São Paulo: Ed. Atheneu, 2001. - GARTNER, L.P.; HIATT, J.L. Tratado de Histologia. Rio de Janeiro: Ed.-Guanabara Koogan, 1999. - GIBELLI, N. E. M. Fibrose portal e periportal na obstrução extra-hepática experimental em ratos

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