taxonomia: microbiana, de procariontes, de fungos, de

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Taxonomia: Microbiana, de Procariontes, de Fungos, de Protozoários e de Vírus


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DOCUMENTO Taxonomia Microbiana Taxonomia de Procariontes Fabiano L. Thompson & Valéria Maia de Oliveira Divisão de Recursos Microbianos & Coleção Brasileira de Microrganismos do Ambiente e Indústria (CBMAI) CPQBA, UNICAMP Alexandre Caselatto 999, CEP 13140000, Paulínia, Brasil. E-mail: [email protected]; [email protected] Taxonomia de Fungos João Lúcio de Azevedo1, Welington Luiz de Araújo1 & Carlos A. Inácio2 1 Laboratório de Genética de Microrganismos, Departamento de Genética Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ), USP. Av. Pádua Dias, 11, B. Agronomia, Cx Postal 83 13400-970 Piracicaba, São Paulo E-mail: [email protected] e [email protected] 2 Departamento de Fitopatologia, Universidade de Brasília Campus Universitário Darcy Ribeiro CEP 70910-900, Brasília DF E-mail: [email protected] Taxonomia de Protozoários Mirna Helena Regali Seleghim Departamento de Ecologia e Biologia Evolutiva Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) Rodovia Washington Luis, Km 235 - Cx. Postal 676 CEP 13565-905 - São Carlos/SP [email protected] Taxonomia de Vírus Elliot Watanabe Kitajima Centro de microscopia eletrônica (ESALQ/USP) Av. Pádua dias 11- Caixa postal 9 Piracicaba-SP e-mail: [email protected] Palavras-chave: taxonomia, filogenia, evolução, identificação, genética de populações e coleções de cultura.

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SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ...............................................................................................................5 A DIVERSIDADE MICROBIANA ...................................................................................6 CONSIDERAÇÕES SOBRE A TAXONOMIA MICROBIANA .....................................12

Procariontes: Bactérias e Arquéias...........................................................................12 Fungos ......................................................................................................................12 Protozoários ..............................................................................................................13 Vírus..........................................................................................................................14

HISTÓRICO DA TAXONOMIA MICROBIANA ............................................................16 Procariontes: Bactérias e Arquéias...........................................................................16 Fungos ......................................................................................................................19 Protozoários ..............................................................................................................20 Vírus..........................................................................................................................23

Vírus de DNA como genoma:................................................................................23 Potexvirus, Trichovirus, Vitivirus............................................................................23 Tobravirus, Varicosavirus .....................................................................................24

Aspectos históricos da taxonomia microbiana no Brasil e estado da arte....................24 Procariontes: Bactérias e Arquéias...........................................................................24 Fungos ......................................................................................................................25 Protozoários ..............................................................................................................26 Vírus..........................................................................................................................27

Princípios, estratégias e técnicas modernas para a taxonomia ...................................28 Procariontes: Bactérias e Arquéias...........................................................................28 Fungos ......................................................................................................................31 Protozoários ..............................................................................................................35 Vírus..........................................................................................................................35

Impedimentos taxonômicos ..........................................................................................36 TENDÊNCIAS E PERSPECTIVAS ..............................................................................39 RECOMENDAÇÕES ....................................................................................................40 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................42


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INTRODUÇÃO

Uma pesquisa científica ou tecnológica só tem valor se puder ser

convenientemente reproduzida. Quando essa pesquisa ou tecnologia envolve

microrganismos, sejam eles bactérias, arquéias, fungos, vírus, protozoários ou

algas, a manutenção das espécies envolvidas é altamente importante. Mais

ainda, além da preservação, uma classificação apropriada tem que estar

baseada em processos rigorosos a fim de serem sanadas quaisquer dúvidas e

confusões, tanto quando uma pesquisa científica for desenvolvida, como

também se um processo ou produto baseado em culturas microbianas vai ser

reproduzido, muitas vezes gerando produtos sujeitos a regras rígidas de

biossegurança e propriedade industrial. É devido a isso que muitos países,

mantém coleções de culturas internacionais de referência, destinadas a

preservar microrganismos, sua distribuição e também funcionando como

depositárias de culturas reconhecidas por agências de patenteamento.

Algumas importantes coleções de microrganismos existem em diferentes

países do mundo, desde independentes e sem fins lucrativos, até

governamentais. Dentre elas podem ser citadas a American Type Culture

Collection (ATCC) nos Estados Unidos, a DSMZ (Alemanha), BCCM (Bélgica),

JCM (Japão), CBS (Holanda), USDA (Estados Unidos) entre outras. Essas

coleções alem da preservação e distribuição das culturas de microrganismos

mantém também um grupo de pesquisadores envolvidos em estudos de

taxonomia e desenvolvimento de processos de manutenção mais apropriados

em cada caso, preservando inclusive a estabilidade das linhagens estocadas.

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A DIVERSIDADE MICROBIANA

O Brasil é reconhecido como um dos países que apresenta um dos mais

elevados índices de biodiversidade animal e vegetal. É o primeiro colocado no

mundo no segmento plantas superiores, peixes de águas doce e mamíferos.

Ocupa o segundo lugar dentre os países com megadiversidade em anfíbios e

determinados insetos como borboletas e é o terceiro classificado na

biodiversidade em aves.. Entretanto, se formos procurar dados sobre a

diversidade microbiana brasileira verificamos que esses dados são escassos

ou até mesmo inexistentes. No primeiro relatório Nacional para a convenção

sobre diversidade biológica apresentado pelo Ministério do Meio ambiente dos

recursos hídricos e da Amazônia Legal (1998) em suas 283 páginas,

praticamente nada, exceto duas referências bibliográficas mencionam

microrganismos. Essa ausência de dados sobre microrganismos é

surpreendente e revela o descaso e a falta de conhecimento sobre a

diversidade microbiana, tanto por falha dos pesquisadores como pelo

desconhecimento de sua importância por parte dos órgãos governamentais.

Atualmente conhece-se que menos de 5% das espécies existentes de fungos

no nosso planeta foram descritas, pois das estimadas 1,5 milhões de espécies,

pouco mais de 70.000 são mantidas em coleções de culturas no mundo todo.

O mesmo ocorre com os organismos procariontes, pois embora existam 6.500

espécies descritas e estocadas em coleções de culturas, a estimativa é de que

este número constitua apenas 1 a 10% do total existente em nosso planeta.

Sabendo-se que o Brasil apresenta uma alta biodiversidade vegetal e animal e

que as estimativas mencionadas acima são em parte baseadas na constante

descoberta de novos microrganismos que vivem em conjunto com as mais de

300.000 espécies vegetais existentes, é de se esperar que o Brasil possua

também uma enorme diversidade microbiana ainda praticamente não

explorada. A idéia de que microrganismos sejam prejudiciais às atividades

humanas é falsa. A maioria dos microrganismos, especialmente fungos,

procariontes e algas é benéfica ao ser humano, aos animais domésticos, às

plantas e na verdade, esses seres vivos são indispensáveis para a manutenção


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da vida como um todo. Portanto, apenas uma restrita fração das espécies

microbianas é prejudicial ao ser humano. De fato, a participação de produtos

microbianos no mercado global é de 50 a 100 bilhões de dólares anuais, o que

ainda é muito pouco em termos mundiais frente a potencialidade que eles

apresentam do ponto de vista biotecnológico. Verifica-se um aumento

constante na porcentagem de produtos derivados de microrganismos e até

mesmo da utilização dos próprios microrganismos para as mais diversas

finalidades. São lançados no mercado fármacos, cosméticos, enzimas,

alimentos, corantes, aromáticos, bioinseticidas, além de microrganismos

utilizados como inoculantes agrícolas que estimulam o crescimento por fixarem

nitrogênio atmosférico ou produzirem hormônios vegetais, solubilizadores de

fosfatos e controladores de pragas e moléstias, degradadores de compostos

tóxicos entre muitos outros.

Os exemplos citados são algumas das grandes potencialidades dos

microrganismos que anualmente atingem o público consumidor. Daí vem a

importância não só da pesquisa visando a descoberta de novos processos e

produtos microbianos, como da manutenção e caracterização dos

microrganismos. Aliás, isso já foi percebido por diversas empresas e grupos do

exterior que freqüentemente realizam excursões em busca dos microrganismos

de origem tropical não só no Brasil como em parte da América do Sul, Central e

África.

Existe em todo o mundo uma crescente procura por microrganismos com

potencialidade biotecnológica, visando a produção de fármacos como os

antitumorais e produtos destinados principalmente a terceira idade, visando-

se a descoberta de novos microrganismos capazes de diminuir a utilização

de insumos agrícolas como os fertilizantes e agroquímicos, capazes de reduzir

a poluição ambiental, além de muitos outros produtos derivados de

microrganismos que se encontram praticamente inexplorados. A descoberta

desses novos microrganismos, bem como sua preservação e classificação

apropriada são imprescindíveis para que a nossa diversidade seja

convenientemente utilizada, mantida e transformada em riquezas, antes que

grupos de pesquisa e empresas de outros países o façam a partir da mesma.

Ter biodiversidade é importante, mas saber e poder utilizá-la de maneira

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apropriada é muito mais importante ainda. Em geral, microrganismos de

interesse para as áreas industrial, ambiental e agrícola vêm sendo pesquisados

no Brasil por instituições universitárias e de pesquisa eminentemente públicas.

Esse é o caso, por exemplo, da EMBRAPA através de diversos de seus

centros - Agrobiologia, Cenargen, CNPM - ou de universidades públicas

estaduais e federais.

As coleções microbianas que resultam dos esforços de pesquisa das

instituições citadas são, em geral, como a própria origem indica, muito mais

coleções de pesquisa do que de serviço, nas quais os microrganismos são

distribuídos sob um rígido controle de qualidade a fim de atender,

principalmente, finalidades do setor produtivo e da pesquisa acadêmica

aplicada. As coleções de pesquisa muitas vezes se perdem quando um

pesquisador ou mesmo grupo cessa suas atividades ou muda seu foco de

pesquisa. É uma perda irreparável tanto do ponto de vista acadêmico como

financeiro. A tarefa de manutenção de culturas microbianas de modo duradouro

e confiável é feita em determinados países por coleções nacionais, como já

mencionado. Infelizmente, o Brasil não possuiu uma coleção de culturas

comparável com as coleções de outros países. Existem, é verdade, iniciativas

isoladas, mas ainda muito tímidas e restritas à manutenção de culturas para

determinadas finalidades.

Alem de fungos, bactérias e arquéias, há que se considerar outros grupos de

microrganismos também de importância acadêmica e aplicada. É o caso dos

protozoários. Protozoários são organismos unicelulares, eucarióticos e

microscópicos que podem ser parasitas ou de vida livre e são encontrados em

quase que todos ambientes do planeta, sempre vinculados à presença de

água. Vão ser aqui abordados apenas os de vida livre, que podem ser solitários

ou viver em colônias, embora cada organismo seja independente um do outro.

Eles podem ser encontrados em todos tipos de ambientes e foram

tradicionalmente considerados como cosmopolitas, embora evidências

recentes apontem para a possibilidade da ocorrência de espécies endêmicas

(Godinho & Regali Seleghim, 1999).


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Apesar de possuírem diminuto tamanho, atualmente reconhece-se sua

contribuição substancial nos ambientes aquáticos e terrestres, funcionando

como elos de ligação entre diferentes níveis tróficos. Segundo Patterson

(1996), a importância dos protozoários no ambiente está intimamente

relacionada com o uso das bactérias como fonte de alimento. Os protozoários

de vida livre possuem, de um modo geral, duas formas diferentes de obtenção

de alimento: filtração e predação (Hausmann & Hülsmann,1996). Por

possuírem distintas fontes de alimento como, por exemplo, a heterotrófica ou

mesmo a mixotrófica, o grupo dos protozoários é considerado artificial, não

sendo mais, hoje em dia, considerado um filo. Entretanto, o termo protozoário

foi “universalizado” e continua sendo utilizado em trabalhos científicos embora

os pesquisadores estejam cientes do fato do termo não ter mais valor científico.

Fazem parte desse grupo organismos de diversos filos e não existe consenso,

por parte dos pesquisadores da área, um consenso sobre o número exato

destes e a classificação dos mesmos, embora vários sistemas tenham sido

propostos (Cavalier-Smith, 1993). Entretanto, os principais filos de protozoários

de vida livre, segundo Lee et al. (1985) são os Ciliophora (ciliados) e

Sarcomastigophora (amebas, heliozoários e flagelados).

Os protozoários constituem um grupo que apresenta grande diversidade Há

controvérsias sobre o número estimado de espécies. Vickerman (1992) aponta

pelo menos 28.000 para os grupos somados. Existem coleções de cultura de

protozoários vivos que são mantidas para serem vendidas a qualquer

pesquisador que demandar. Estes organismos podem ser usados como

material didático em escolas e universidades ou para pesquisa. No exterior as

principais coleções de cultura se encontram nos EUA (American Type Culture

Collection, Carolina Biological Supply Company e Smitsonian Institution) e na

Inglaterra (Culture Centre of Algae and Protozoa). Elas dispõem de linhagens

de organismos dos mais variados grupos, inclusive de protozoários. No Brasil,

embora tenham ocorrido tentativas para se criarem coleções de cultura de

referência, conhece-se apenas a existência de algumas coleções informais

com linhagens mantidas e usadas para pesquisas e ensino em universidades

ou escolas. Elas são mantidas sem financiamento específico e fornecem

material sem cobrança. Essas coleções sofrem, portanto, com a falta de

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recursos para a compra de material e também com a falta de mão de obra

especializada para o isolamento de novas linhagens, execução dos meios de

cultura e repicagens que são necessárias com freqüência para sua

manutenção. Como exemplo ao que foi relatado acima, existe uma coleção

informal no Laboratório de Ecologia de Microrganismos Aquáticos da

Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) que possui pelo menos 10

linhagens de protozoários mantidas em cultura.

Para fins taxonômicos, existem também coleções de lâminas preparadas de

espécimens-tipo, que são mantidas muitas vezes em laboratórios ou museus

(e.g. Museu de História Natural de Paris). Na tentativa de centralizar tal

material, em benefício de todos os pesquisadores foi criada, em 1963, a

“Coleção Internacional de Espécies-Tipo de Ciliados”, que ficou sediada

inicialmente na Universidade de Illinois e foi posteriormente transferida para a

Smitsonian Institution onde está atualmente (Corliss, 1972). Ela recebe material

proveniente dos pesquisadores quando ocorre a identificação de uma espécie

nova. Após a publicação do trabalho com a descrição da espécie nova, as

lâminas provenientes desse estudo devem ser depositadas no Smitsonian e

ficam à disposição dos pesquisadores para estudos ou checagens

taxonômicas. Tais análises podem ser feitas no local ou as lâminas podem ser

enviadas sob demanda para o pesquisador qualificado que esteja interessado.

Finalmente, os vírus são macromoléculas autoreplicativas que dependem

inteiramente da célula hospedeira invadida para sua multiplicação.

Quimicamente são nucleoproteínas, tendo como genoma DNA ou RNA. São

submicrocópicas com forma helicoidal ou icosaédrica e, eventualmente,

nenhuma delas, sendo então referidas como de morfologia complexa. Podem

ou não ser providas de uma membrana envoltória de origem celular. O genoma

viral codifica um número limitado de genes, mas o suficiente para alterar o

metabolismo celular e assegurar a cópia de um grande número de indivíduos

iguais às que invadiu a célula. Erros na seqüência de nucleotídeos durante a

replicação geram mutantes que podem se adaptar a novas condições, como a

capacidade de infetar uma hospedeira diferente. Sua importância sócio-

econômica é muito grande, pois o agronegócio representa uma parcela


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considerável das atividades sócio-econômicas do País, assegurando a

alimentação de sua população e a exportação dos excedentes. Gera direta e

indiretamente empregos e contribui para a fixação do homem no campo. Citros,

soja, cana-de-açúcar, fruteiras tropicais, café, milho, cereais de inverno,

hortaliças, videira, fruteiras de clima temperado, forrageiras, feijão, girassol,

amendoim, etc. fazem parte do elenco de culturas importantes e que são

cultivadas em diferentes regiões.

Graças às atividades de pesquisas lideradas pela Embrapa além das

instituições estatais e universidades a produtividade tem aumentado

significativamente ao longo do tempo. Contudo, a produtividade tem sido

constantemente ameaçada por vários fatores, dentre os quais os fitossanitários

representam parcela importante. Dentre as doenças, chama atenção às de

etiologia viral, pois ao contrário das causadas por organismos como fungos,

bactérias e nematóides, não contam com métodos curativos após a instalação

do patógeno, sendo as medidas de controle essencialmente preventivas.

Existem poucos exemplos de viroses de planta altamente destrutivos. As mais

citadas no País foram a tristeza dos Citros que destruiu cerca de 10 milhões de

laranjeiras na década dos 1940 e o mosaico dourado do feijoeiro que dizimou

feijoais no início da década dos 1970. Geralmente, entretanto, vírus de plantas

causam prejuízos menores, mas constantes, e muitas vezes ignorados pelos

produtores, pois as plantas infetadas raramente morrem, embora tenham

redução na produção em quantidade e qualidade. Podem ser considerados

atualmente de importância econômica vírus como: begomovírus diversos em

tomateiro e feijoeiro, tospovírus em tomateiro e cucurbitáceas, mosaico em

alface, enrolamento da folha e vírus Y em batata, necrose da haste em soja,

carlavírus causando amarelão do melão, mosaico em mamoeiro, complexo de

vírus em videira, leprose em citros, etc. Deve também ser salientado que certos

vírus como os baculovírus são causadores de doenças de insetos. Tais vírus

podem ser utilizados dessa maneira, no controle biológico de pragas da

agricultura. Este é o caso do controle da lagarta da soja por baculovírus no

Brasil, um programa de controle biológico de grande sucesso e reconhecido

como o maior do planeta em área cultivada abrangida.

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CONSIDERAÇÕES SOBRE A TAXONOMIA MICROBIANA

Procariontes: Bactérias e Arquéias

A taxonomia de procariontes é a ciência que lida com a classificação (= criação

de novos taxa), identificação (= alocação de linhagens dentro de espécies

conhecidas) e nomenclatura (Vandamme et al., 1996). Esta ciência produziu

um sistema estável, predizível e altamente informativo que tem colaborado

para o avanço de vários ramos da ciência, incluindo não somente a

microbiologia, mas também a genômica, ciências médicas, ecologia de

microrganismos, biotecnologia, evolução e epidemiologia (veja o texto opinativo

da revista Nature (Genomics and Taxonomy for all, Vol. 417, número 6889,

página 573, 2002). A taxonomia de procariontes, em geral, esteve em estado

de fluxo por mais de 100 anos, pois sistematas davam grande valor a testes

fenotípicos e características morfológicas nos antigos esquemas de

classificação (veja, por exemplo, o Manual Bergey's ed. 1957), resultando na

formação de grupos taxonômicos relativamente heterogêneos e muitas vezes

artificiais. A proposta e subseqüente aplicação massiva da taxonomia polifásica

a partir de 1970, com o papel pivotal da técnica de hibridização de DNA-DNA

(Colwell, 1970a), produziu grupos taxonômicos robustos que foram

posteriormente posicionados no espaço filogenético com o auxílio de

seqüências do DNAr 16S. Em 1987, Carl Woese publicou seu trabalhou

seminal sobre o uso de cronômetros filogenéticos, principalmente o RNAr 16S,

o que mudou o rumo da taxonomia de procariontes (Woese, 1987). Hoje, a

estrutura da taxonomia de bactérias é baseada na filogenia do DNAr 16S

(Ludwig & Klenk, 2001). As aproximadamente 6500 espécies de procariontes

formalmente descritos atualmente representam, no entanto, possivelmente 1-

10 % de toda a diversidade procarionte porvável no meio ambiente, indicando

uma necessidade premente de avanços nesta área .

Fungos

Como já mencionado, o número estimado de espécies de fungos no planeta

Terra é de 1,5 milhões, mas o número de espécies descritas até hoje é de

aproximadamente 70 mil (Hawksworth & Rossman, 1997). É, portanto, evidente


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que esses números refletem o grande potencial de exploração da

biodiversidade fúngica conhecida e desconhecida. A grande dificuldade na

identificação/classificação de fungos está associada ao fato de que a

taxonomia deste grupo envolve classificações de taxa baseados em aspectos

morfológicos, os quais são aplicados à chaves de classificação (Arx, 1974;

Barnett & Hunter, 1972). Em muitos casos, os taxonomistas têm dificuldades

para determinar quais são as características que realmente definem uma

espécie ou gênero (Guarro et al. 1999). Além disso, fases sexuadas

(teleomórficas) e assexuadas (anamórficas) de um mesmo genótipo são

classificadas com espécies distintas, e apresentam capacidades distintas de

compartilhar material genético, resultando em dificuldade na distinção dos

indivíduos (Carlile & Watkinson., 1994). Neste aspecto, técnicas moleculares

de classificação e identificação estão contribuindo de forma significativa para o

entendimento das relações filogenéticas entre as diferentes espécies de

fungos, bem como contribuir para uma melhor classificação das novas

espécies que poderiam ser catalogadas em projetos de análise da

biodiversidade. Além disso, a utilização de métodos moleculares, como o

sequenciamento de genes conservados, para a identificação de

microrganismos pode possibilitar ainda o desenvolvimento de métodos de

diagnóstico, análises filogenéticas, epidemiologia e genética de populações.

Protozoários

Infelizmente, não existem chaves de identificação de protozoários (ciliados,

flagelados, heliozoários e amebas) de fácil utilização e atualizadas, sobretudo

devido a ocorrência de muitas espécies não descritas, outras mal descritas e a

falta de acordo entre os taxonomistas quanto à posição exata de diversos

organismos desse grupo. Portanto, por exemplo, para se proceder à taxonomia

de ciliados, é necessário, segundo Foissner, 1994, vários livros e algumas

centenas de artigos científicos atualizados. Dentre a literatura mais comumente

utilizada para a taxonomia dos protozoários podem ser incluídos: Bick (1972),

Corliss (1979), Maeda (1985-1986), Dragesco & Dragesco-Kernéis (1986),

Foissner & Berger (1996), Foissner, et al. (1999), Lee, et al. (1985), Page

(1976) e Patterson & Larsen (1991) .

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Vírus

A classificação dos vírus foi muito controvertida até o início da década dos

1950, pela simples razão de que pouco se conhecia sobre o ele em si, havendo

mais informações sobre as enfermidades causadas. No caso dos vírus de

planta, a tendência foi de agrupar conforme a hospedeira e os sintomas. A

introdução do microscópio eletrônico de transmissão na comunidade científica

por volta de 1950 e os avanços verificados nos métodos de análise bioquímica

dos vírus passaram a oferecer dados precisos sobre a forma e composição

química dos vírus. Assim, em 1960, criou-se o International Committee for

Vírus Taxonomy (ICTV) que passou a cuidar da nomenclatura e classificação

dos vírus, gerando periodicamente relatórios que atualizavam-nas. Os vírus

passaram a ser classificados (a) pela natureza do seu genoma (DNA ou RNA),

ser em fita simples ou dupla, ser fita única ou partida (bi-, tri- ou mais) e seu

sentido (positivo ou negativo, em termos de tradução ou transcrição, no caso

de genoma); (b) pela sua forma: helicoidal (em que o ácido nucléico em hélice

é coberta por subnidades protéicas), icosaedral (em que as subunidades

protéicas se organizam em uma cápsula icosaedral, em cujo interior se aloja o

ácido nucléico) e complexa (quando não se enquadram na forma helicoidal ou

na icosaedral); (c) ausência ou presença de membrana envoltória de origem

celular, na qual glicoproteínas codificadas pelo vírus são inseridas.

Vírus que compartilham características comuns (tipo de ácido nucléico e

homologia em sua seqüência, relações sorológicas próximas, forma similar e

certas propriedades biológicas - tipo de hospedeiro, modo de transmissão, etc.)

são agrupados em gêneros e, estes, por sua vez, em famílias. Há apenas uma

ordem reconhecida, a que reúne vírus de RNA senso negativo como genoma, o

Mononegaviral. Podem ser listados alguns exemplos de diferentes famílias e

gêneros de vírus:

Família Poxviridae (que inclui vírus como o da varíola, bouba aviária, vacina,

etc.):

• -DNA duplo, forma complexa, provido de membrana. Infeta vertebrados e

invertebrados.


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Família Reoviridae (inclui vírus como a diarréia infantil viral, nanismo do arroz,

etc.)

• -Genoma de RNA duplo, segmentado, sem membrana. Infeta vertebrados,

invertebrados e plantas.

Família Caudovirales (inclui bacteriófagos como T4 de Escherichia coli)-

• -Genoma DNA duplo contido em uma cápsula prismática dotada de uma

“cauda” usada para o processo de infecção, sem membrana.

Família Bunyaviridae (inclui virus como Tospovirus de planta e Hantavirus que

causa doença em humanos)

• -Genoma de sRNA segmentado (senso negativo e ambisense),

nucleocapsídeo helicoidal provido de membrana.

Por volta de 1970 foi reconhecido outro grupo de patógeno molecular de

plantas, os viróides. São pequenos fragmentos (350-350 nucleotídeos) de

ssRNA, que se anelam e produzem pareamento intramolecular. Replicam-se

nas células permissíveis, aproveitando-se do mecanismo de duplicação do

DNA (polimerase 2) e no processo causam doença.

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HISTÓRICO DA TAXONOMIA MICROBIANA

A classificação de organismos vivos foi um tema de grande interesse para os

cientistas que pesquisavam a História Natural na Europa a partir do século XVI.

Lineu propôs um sistema binomial de classificação que é uma das bases da

classificação atual dos organismos. Em 1758, a décima edição do Systema

Naturae de Lineu incluía 5.897 espécies de plantas e animais, os dois reinos

nos quais ele dividia os organismos vivos. A Taxonomia se tornou uma

profissão durante o século XIX, resultando em um rápido aumento no número

de animais e plantas terrestres conhecidos.

O propósito primário de um sistema taxonômico utilitário é fornecer

classificações que sejam úteis para finalidades científicas ou práticas diversas,

especialmente a identificação, e também gerar bases de dados contendo

informação relevante sobre organismos. Estas classificações devem ser

estáveis, objetivas e preditivas.


Os primeiros sistemas de classificação de procariontes eram baseados apenas

em algumas propriedades fenotípicas que eram usadas para agrupar

linhagens, a despeito de qualquer afinidade evolutiva verdadeira e por isso

foram tidos como artificiais (veja, por exemplo, a quarta edição do Manual

Bergey´s, 1934). Estes sistemas refletiam as limitações tecnológicas daquele

período. Na prática, estes sistemas, baseados em algumas propriedades

morfológicas e comportamentais, levaram à sérios erros de classificação

microbiana, nos mais variados grupos de bactérias (Boone & Castenholz,

2001). Tais métodos microbiológicos tradicionais baseados em características

fenotípicas, como propriedades morfológicas, fisiológicas e bioquímicas,

governaram por décadas a taxonomia microbiana e forneceram informação

descritiva para a estruturação de diversos taxa bacterianos.

Com o advento da taxonomia numérica (Sneath & Sokal, 1962) e o surgimento

da computação, dados fenotípicos começaram a ser analisados por

coeficientes numéricos que expressam similaridade entre linhagens com o


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auxílio de um computador. Sem dúvidas, a taxonomia numérica veio

proporcionar maior objetividade aos esquemas de classificação microbiana e a

abordagem pressupunha a utilização de um grande número de testes

bioquímicos (100 a 200) e uma amostragem grande e diversificada de

linhagens, sendo os resultados expressos em porcentagens (Vandamme et al.,

1996). A aplicação de taxonomia numérica levou à avanços significativos na

classificação dos microrganismos, mais especificamente bactérias. Bons

exemplos de gêneros cuja taxonomia se beneficiou desta abordagem são

Bacillus, Mycobacterium , Rhodococcus (Goodfellow, 2000).

Nos últimos 40 anos, com o desenvolvimento nas áreas de química, biologia

molecular, estatística e informática, a taxonomia de microrganismos sofreu

profundas alterações na direção de um sistema que refletisse as relações

evolutivas entre os organismos aproximando a classificação microbiana o

melhor possível da realidade biológica. O uso da homologia DNA-DNA

associada a uma variedade de características ecológicas e fenotípicas na

classificação de microrganismos foi denominada de taxonomia polifásica por

Colwell (1970ab). Colwell propôs a integração da informação do nível molecular

ao ecológico para obtenção de identificações e classificações mais precisas e

confiáveis. Em princípio, toda informação genotípica, fenotípica e filogenética

pode ser incorporada na taxonomia polifásica, mas a hibridização de DNA-DNA

tem papel pivotal no delineamento de espécies. A abordagem polifásica da

taxonomia tem sido praticada nos últimos 20 anos e pressupõe que as

descrições polifásicas de espécie devem refletir relações filogenéticas, ser

baseadas em hibridização DNA-DNA do genoma total e fornecer informação

genotípica, fenotípica e quimiotaxonômica adicional que dê consistência à

espécie definida em termos filogenéticos.

Woese & Fox (1977) publicaram o trabalho seminal sobre o uso de seqüências

do rRNA 16S para a reconstrução da Árvore da Vida. Subsequentemente, se

demonstrou que o rRNA 16S seria extremamente útil na afiliação filogenética

de bactérias em espécies, gêneros e famílias (Woese, 1987), Seu uso foi

prontamente incorporado à taxonomia polifásica (Stackebrandt & Goebel,

1987). O desenvolvimento rápido dos métodos de sequenciamento de DNA e o

acúmulo da informação de seqüências em bases de dados públicas de livre

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acesso (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), têm permitido o seqüenciamento

comparativo de genes homólogos entre linhagens microbianas e é agora

procedimento padrão em sistemática microbiana.

A aplicação de conceitos e práticas de taxonomia polifásica, a qual apresenta

forte embasamento filogenético, teve um efeito profundo na classificação

microbiana em todos os níveis da hierarquia taxonômica. Em particular, a

crença na divisão dos seres vivos em 5 reinos proposta por Whittaker em 1969

foi desafiada pelo trabalho de Carl Woese e colaboradores, baseado no

seqüenciamento comparativo de moléculas de RNAr e evidência genômica e

bioquímica associada. Foi então proposto que a classificação dos seres vivos

fosse substituída por um esquema baseado em 3 reinos ou Domínios: Bacteria,

Archaea e Eucarya, sendo os dois primeiros exclusivamente microbianos e

compostos por células procarióticas. O terceiro Domínio, Eucarya, engloba

todos os organismos eucariotos, incluindo os microrganismos fungos e

protozoários.

Com relação aos protozoários, segundo a taxonomia tradicional, a

nomenclatura dos protozoários fagotróficos é regida pelo Código Internacional

de Nomenclatura Zoológica (INZ).

Outro grande impacto do uso de seqüências de rDNA como ferramenta na

classificação microbiana se deu em estudos de diversidade de microrganismos

a partir de amostras ambientais. A utilização de metodologias que independem

do isolamento e cultivo de microrganismos levou a uma drástica mudança na

perspectiva da diversidade microbiana existente no ambiente. Diversos grupos

de microrganismos nunca antes cultivados puderam ser detectados no

ambiente por meio das seqüências de rDNA 16S e, por meio da comparação

com seqüências depositadas em bases de dados, observou-se que muitas

delas pertenciam a organismos filogeneticamente não relacionados às divisões

bacterianas já existentes (Pace, 1996; Hugenholtz et al., 1998a). Este impacto

na visão da diversidade microbiana pode ser exemplificado pelo número de

divisões existentes dentro do Domínio Bactéria: em 1987 eram 12 divisões,

todas elas descritas com base em organismos cultivados; já em 1998 o número

de divisões publicado havia subido para 36 (Hugenholtz et al., 1998b), sendo


19

13 delas divisões candidatas, ou seja, sem representante cultivado e descrição

formal. Um levantamento mais recente, publicado em 2003, apontou como 53 o

número de divisões dentro do Domínio Bacteria, sendo que aproximadamente

50% destas não possuem representantes cultivados (Rappé & Giovannoni,

2003). Hoje é um dos maiores desafios para taxonomistas o cultivo de

representantes destas divisões.

Fungos

A identificação clássica de fungos filamentosos leva em consideração,

principalmente, as características morfológicas das estruturas reprodutivas

(sexual e assexual). Dessa forma, para se identificar estas estruturas, os

isolados devem ser cultivados a partir de colônias puras em meios de cultura

apropriados e corada com técnicas apropriadas para manutenção das

estruturas. Em muitos casos, pode não ocorrer a produção de estruturas

reprodutivas, sendo necessário assim alterar as condições de cultivo. Para

induzir a esporulação pode ser utilizado meio de cultura pobre (ágar-água),

aumento da iluminação da cultura, irradiação com doses reduzidas de luz ultra

violeta. Fatos estes possíveis somente para espécies/isolados cultiváveis.Em

todos os casos deve se realizar uma preparação para observação microscópica

das estruturas. As estruturas observadas devem ser comparadas com aquelas

da literatura padrão, por meio de chaves de identificação (Arx, 1974; Barnett &

Hunter, 1972)

Análises bioquímicas também podem ser utilizadas. Para fungos que não

esporulam em meio sintético, técnicas de biologia molecular devem ser

utilizadas. Estas técnicas se baseiam principalmente no seqüenciamento das

regiões espaçadoras (ITS) do DNA ribossomal (rDNA) e comparação com uma

base de dados (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Além das seqüências de

rDNA, outros mecanismos podem ser utilizados como será visto quando

técnicas modernas de classificação serão mais amplamente discutidas. Tudo

isso, torna o desenvolvimento de uma base de dados para seqüências de

DNA, importante para a classificação de espécies fúngicas especialmente para

o Brasil, país detentor de uma biodiversidade substancial, a qual poderia

gerar uma quantidade muito grande de dados para a identificação de fungos.

20

Protozoários

As técnicas utilizadas na taxonomia dos protozoários são baseadas em

microscopia ótica e/ou eletrônica e são utilizados métodos diferentes para cada

grupo. Isso dificulta a aplicação de técnicas taxonômicas adequadas em

estudos ecológicos que queiram englobar todos os protozoários. Para todos os

grupos, entretanto, aconselha-se, independentemente do método que será

aplicado, a análise da amostra “a fresco” pois, com isso são obtidas

informações impossíveis de se obter com material fixado e corado. Por

exemplo, informações sobre o tipo de movimento, pseudópodo e presença de

forma flutuante são vitais para a caracterização taxonômica de amebas nuas.

Nessa etapa da análise do material vivo é aconselhada a obtenção de

fotografias e desenhos bem feitos.

Para os ciliados, a taxonomia é complexa e depende, dentre outras coisas, da

observação da morfologia externa; da posição dos vacúolos pulsáteis; da

quantidade, posição e forma do macro e micronúcleo; do formato do citóstoma

e, por fim, da posição exata dos cílios. Para essas observações, segundo

Foissner (1991), são utilizadas as seguintes técnicas: coloração supravital com

metil verde-pironina, impregnação a seco por nitrato de prata, impregnação

úmida por nitrato de prata, impregnação por carbonato de prata, impregnação

por protargol e microscopia eletrônica de escaneamento. Segundo esse autor,

uma boa descrição taxonômica de ciliados necessita, além da observação do

material vivo, a aplicação de mais de uma dessas técnicas acima citadas.

A taxonomia das tecamebas é baseada na análise da morfologia da carapaça e

na forma e número de pseudópodos, normalmente podendo ser realizada por

microscopia ótica, sem o auxílio de colorações especiais. Eventualmente, para

determinadas espécies é necessária a utilização de microscopia eletrônica para

a confirmação da composição e textura da carapaça. Por isso, e também pelo

fato das tecamebas serem relativamente grandes, o processo de

caracterização taxonômico delas é bem mais simples que dos ciliados. Essa

facilidade é refletida na maior quantidade de pesquisadores trabalhando com

esse grupo de protozoários e, conseqüentemente no número de publicações,

inclusive no Brasil.


21

No caso das amebas nuas, como elas não têm forma definida, a caracterização

morfológica é bastante dificultada. A taxonomia é baseada em análise de

material vivo, anotando-se o tipo de movimento, pseudópode, presença de

forma flutuante, etc.

Quanto aos heliozoários, existem poucas informações à respeito desse grupo e

normalmente sua taxonomia é feita por microscopia eletrônica. Somente em

raras espécies grandes a microscopia ótica é suficiente. São características

importantes para a taxonomia desse grupo: o padrão das axonemas, presença

e tipo de esqueleto, número de núcleos, tipo de organelas extrusivas,

disposição dos microtúbulos e dos centros de organização de microtúbulos

(Febvre-Chevalier, 1982).

Devido ao pequeno tamanho dos flagelados, a identificação segura dos

mesmos necessita da utilização de microscopia eletrônica. Essa dificuldade é

refletida na falta de pesquisadores trabalhando com esse grupo e a falta de

informações e boas descrições na literatura. A maioria dos trabalhos e

descrições, bem como das chaves de flagelados se refere a ambientes

marinhos. No Brasil, por exemplo, não se tem notícia de pesquisadores

trabalhando com taxonomia desse grupo.

Importantes facetas da taxonomia de protozoários estão relacionadas aos

aspectos ecológicos especialmente em relação aos protozoários planctônicos e

os do solo.

Segundo Foissner (1994), a maior parte das publicações ecológicas sobre

protozoários planctônicos sofre pela falta de identificações confiáveis e de uma

nomenclatura moderna. Isso ocorre pelo fato das técnicas usadas em

taxonomia de protozoários serem laboriosas, caras e consumirem muito tempo

para serem executadas, além de que, muitas vezes são incompatíveis com as

técnicas usuais utilizadas em limnologia. Dentre esses problemas, destaca-se o

fato de que essas técnicas tradicionais de taxonomia utilizam-se do

crescimento de protozoários para a posterior aplicação das técnicas de

coloração e impregnação, devido a perdas durante o processo. Além disso, tem

que se considerar também que existem diversas técnicas de impregnação e

cada uma delas é efetiva para determinados grupos de ciliados e menos

eficiente para outros (Foissner, 1991).

22

Tais procedimentos alteram, portanto, a verdadeira composição e densidade de

protozoários encontrada nos locais analisados naquele momento da coleta. Em

estudos ecológicos, essas manipulações da amostra descaracterizariam o

ambiente, uma vez que na maior parte das vezes o ecólogo está interessado

em saber quem estava ativo naquele ambiente e em qual densidade, ou seja,

obter uma “fotografia instantânea” da população naquele exato instante da

coleta da amostra.

Recentemente, algumas técnicas foram propostas para contornar tais

problemas como, por exemplo, a coloração quantitativa por protargol-QPS

(Montagnes & Lynn, 1987 e 1993) ou a coloração quantitativa por protargol

modificada por Skibe (1994), que reduziria o tempo de preparo das amostras

de 24 para 4 horas. Tais técnicas utilizam algumas metodologias da taxonomia

tradicional conjuntamente com outras que atenderiam aos interesses dos

ecólogos: após a fixação das amostras, estas seriam filtradas em membranas

específicas que seriam então montadas em lâminas e coradas com protargol

para evidenciar as cinésias dos ciliados. Tais metodologias, segundo seus

autores, não danificariam espécimens de outros grupos taxonômicos sendo as

membranas então aproveitáveis também para contagens de outros grupos de

protozoários bem como rotíferos, etc.

Entretanto, apesar dessas vantagens, tais técnicas são ainda pouco difundidas

e utilizadas pelos limnólogos. Isso provavelmente é devido ao fato da técnica

de impregnação por protargol ser relativamente cara devido aos reagentes

utilizados na impregnação, ser efetiva para somente para determinados grupos

de ciliados, ser demorada e complexa de executar, demandando bastante

pratica do pesquisador.

Com relação aos protozoários do solo, segundo Foissner (1992), para se

estudar tecamebas de solo, basta analisar microscopicamente suspensões de

solo mas, para os outros grupos de protozoários é mais difícil extraí-los da

amostra. Para isso, foi desenvolvida uma técnica chamada: método da placa

de Petri não alagada (“non-flooded Petri dish”) onde é adicionada água

destilada a uma porção de solo em uma placa de Petri até a saturação. Após 2

dias ou mais a amostra é analisada. Embora seja uma técnica que tem sido


23

extensivamente utilizada para análise de solo, ela apresenta um problema que

é a estimulação do crescimento de espécies que não necessariamente

estavam ativas no solo no momento da coleta e sim encistadas. É, portanto,

uma técnica importante para se avaliar a diversidade críptica do solo.

Recentemente, uma nova metodologia foi introduzida para o estudo de ciliados

do solo que permite a análise quantitativa conjuntamente com a taxonômica: a

coloração quantitativa por protargol edáfica (EQPS), que mescla a técnica do

QPS com a técnica da placa de Petri não alagada (Acosta-Mercado & Lynn

2003)

Vírus

São várias as famílias/gêneros de vírus de plantas descritos no Brasil. As

pesquisas feitas mostram que muitos dos vírus descritos no exterior ocorrem

no Brasil, provavelmente introduzidos junto com sementes ou material

propagativo das culturas exóticas. Por outro lado vários vírus inéditos na

literatura foram aqui encontrados e descritos. Assim, ocorrem no Brasil

representantes de quase todos os gêneros de vírus de plantas:

Vírus de DNA como genoma:

• Família Geminiviridae: gêneros Begomovirus, Curtovirus

• Família Caulimoviridae: gênros Caulimovirus, Cavemovirus, Badnavirus

Vírus de RNA como genoma:

• Família Bromoviridae: gêneros Bromovirus, Alfamovirus, Cucumovirus,

Ilarvirus

• Família Bunyaviridae: gênero Tospovirus

• Família Closteroviridae: gêneros Closterovirus, Ampelovirus

• Família Comoviridae: gêneros Comovirus, Nepovirus

• Família Flexiviridae: gêneros Allexivirus, Carlavirus, Capillovirus,

Foveavirus,

Potexvirus, Trichovirus, Vitivirus

Família Luteoviridae: Gêneros Lutovirus, Polerovirus

24

Família Potyviridae: Gênero Potyvirus

Família Reoviridae: Gênero Fijivirus

Família Rhabdoviridae: Gêneros Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus

Família Sequiviridae: Gênero Sequivirus

Família Tombusviridae: Gêneros Carmovirus, Necrovirus

Familia Tymoviridae: Gêneros Tymovirus, Marafivirus, Maculavirus

Gêneros: Furovirus, Hordeivirus, Ophiovirus, Sobemovirus, Tenuivirus,

Tobamovirus,

Tobravirus, Varicosavirus

Viroides

Família Popsiviroidae: Gêneros Hostuviroid, Apscaviroid, Coleviroi

Aspectos históricos da taxonomia microbiana no Brasil e estado da arte


Existe obviamente uma diferença significativa entre o Brasil e o resto do mundo

em termos de atividade científica em biodiversidade de procariontes. Por

exemplo, nos últimos 15 anos, o Brasil colaborou com menos de dez

publicações científicas por ano no International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology (IJSEM), que é o jornal oficial para caracterizações

taxonômicas, descrições de novos taxa e reclassificações de procariontes.

Para se ter uma idéia, países com maior tradição e investimentos no ramo da

taxonomia, como é o caso dos EUA, Alemanha e Japão, produziram no mesmo

período aproximadamente 80, 70, 55 trabalhos no IJSEM por ano,

respectivamente. Realmente, existem pouquíssimos grupos de pesquisa

dedicados à taxonomia de procariontes no Brasil, particularmente no que diz

respeito a descrição de novos taxa.

Sob o ponto de vista metodológico, um dos principais problemas na taxonomia

de procariontes em geral é a identificação de linhagens ao nível de espécie por

meio de testes fenotípicos e de seqüências de rDNA 16S, pois as

características fenotípicas e de seqüências das espécies existentes são muito


25

semelhantes. Neste caso, o critério decisivo para identificação de espécies

ainda é a similaridade obtida em ensaios de hibridização de DNA entre

genomas de dois organismos (Stackebrandt et al., 2002). A hibridização de

DNA-DNA é a parte mais laboriosa e demorada na taxonomia de procariontes e

requer equipamentos especiais e pessoal treinado. Os resultados obtidos com

esta técnica não são cumulativos em bases de dados, sendo que cada

experimento novo deve incluir as linhagens de referência. Hoje esta técnica é

realizada em poucos laboratórios de referência no mundo.

Fungos

Estudos em fungos começaram ainda no século XIX quando viajantes

coletores de fungos. na maioria estrageiros, realizaram coletas em vários

pontos do país, inclusive na Amazônia. Esses espécimes foram enviados a

outros países para classificação. Como descrevem Fidalgo e Fidalgo (1957)

,ainda no século XIX e início do século XX destacam-se coletas, classificações

preliminares e pequenas coleções de fungos realizadas por Juan Ignácio

Puigarin em 1877, Heinrich Rehm de 1889 a 1912, Arséne Puttemans em

Piracicaba na ESALQ , Fritz Noak no Instituto Agronômico de Campinas (IAC) ,

Averna Saccá na ESALQ e um pouco mais tarde, em 1925, W.A . Mirril cujos

fungos coletados estão na coleção do New York Botanical Garden. Além dos

trabalhos pioneiros realizados com fungos de importância para a saúde, os

quais não serão mencionados no presente documento, fungos causadores de

doenças de plantas foram estudados no IAC por Ahmés Pinto Viegas e

também no Instituto Biológico de São Paulo. O Instituto de Botânica de São

Paulo teve destaque na taxonomia de fungos, especialmente basidiomicetos.

De grande realce foi deve-se citar o trabalho iniciado por Augusto Chaves

Batista em 1954 no Recife, Pernambuco, que no Instituto de Micologia da

Universidade Federal de Pernambuco por ele criado, conduziu importantes

trabalhos sobre taxonomia de fungos organizando a coleção que até hoje é

mantida no Departamento de Micologia da UFPE. Também coleções de

fungos, especialmente leveduras de interesse industrial, foram organizadas no

antigo Instituto Zimotécnico da ESALQ/USP por Jaime Rocha de Almeida.

Atualmente coleções e herbários de fungos existem no Brasil destacando-se

entre outras as da Universidade de Brasília relacionada a fungos isolados de

26

plantas do cerrado, da Universidade Federal de Pernambuco(talvez a mais

completa no Brasil) , do IAC ( fitopatógenos) , do Instituto de Botânica

(Basidiomicetos), do CENARGEN, EMBRAPA em Brasília (fungos usados no

controle biológico de insetos), da ESALQ no Departamento de Tecnologia

Agroindustrial (principalmente leveduras) e Genética (especialmente fungos de

interesse genético e fungos endofíticos), do Instituto de Pesquisas

Tecnológicas do Estado de São Paulo (fungos de interesse industrial). A

maioria delas, entretanto, constituem coleções de pesquisa. Um esforço para

reunir todos esses dados foi realizado nos anos 80 do século XX por

Wanderley Perez Canhos e seu grupo organizando catálogos que reuniam

todos os dados sobre coleções de culturas de microrganismos no Brasil

incluindo os fungos (Canhos et al, 1989). Os trabalhos de classificação

continuam a ser realizados com base nos aspectos morfológicos,

especialmente na UFPE. Mais recentemente, especialmente após programas

financiados primeiro pela FAPESP e depois por órgãos do governo federal

visando estabelecimento de técnicas de seqüenciamento genômico de

diferentes espécies microbianas, diversos laboratórios estão empregando

técnicas moleculares na taxonomia de fungos.

Protozoários

No Brasil, os trabalhos com protozoários se iniciaram nos primórdios do século

20 com os trabalhos de Provazek (1910), Cunha (1913; 1916; 1918) e Pinto

(1925). Depois desse período produtivo, houve um período com poucas

contribuições científicas destacando-se aí os trabalhos de Closs & Madeira

(1962), Closs (1963), Closs & Madeira (1967), Mossmann (1966) e Green

(1977). A partir da década de 80 o estudo de protozoários no Brasil ganhou um

novo impulso e vem se acelerando nos últimos anos. Entretanto, considerando

o crescimento e desenvolvimento do país nos últimos anos, atualmente existem

proporcionalmente poucos pesquisadores trabalhando com ecologia e/ou

taxonomia de protozoários no Brasil.

Em São Paulo, o Laboratório de Ecologia de Microrganismos Aquáticos (LEMA)

da Universidade Federal de São Carlos (UFScar) tem realizado estudos

ecológicos e taxonômicos sobre os diversos grupos de protozoários de água


27

doce desde o início da década de 80, sob a coordenação da prof. Dra Mirna

Januária Godinho, hoje aposentada, tendo produzido diversas publicações,

teses, dissertações e monografias e formado pessoal com experiência nessa

linha de pesquisa. No Rio de Janeiro, estudos taxonômicos de ciliados,

especialmente marinhos, são realizados pelo Dr. Inácio da Silva Neto da UFRJ.

No Paraná, estudos taxonômicos de tecamebas com ênfase ecológica são

realizados pelo Dr. Luiz Felipe Machado Velho do NUPELIA da Universidade

Estadual de Maringá. No Mato Grosso, a Dra. Edna Lopes Hardoim tem se

dedicado ao estudo de vários grupos de protozoários, especialmente

tecamebas.

Vírus

Especialmente com relação a virologia vegetal no Brasil, dada extensão

territorial e o clima ameno a quente (equatorial, tropical e subtropical) as

condições ambientais favorecem a presença permanente de plantas e vetores

(insetos, nematóides, ácaros) assegurando a existência de fontes de inóculo e

a dispersão dos vírus, razão primordial da freqüente incidência de viroses em

nossas culturas. O fato é agravado pela prática do plantio escalonado em uma

dada cultura, como a do milho e as de várias hortaliças, quando o vírus passa

continuamente das culturas mais velhas para as novas. Tais problemas têm

atraído atenção dos fitopatologistas e há um contingente razoável, embora

ainda insuficiente, de pesquisadores atuando em tempo integral na área de

virologia vegetal no País. Estima-se em 80 profissionais, distribuídos em cerca

de 40 centros de pesquisas e universidades. Pode-se agregar cerca de 20 pós-

graduandos desenvolvendo dissertações e teses sobre vírus de plantas a este

contingente. Houve o recente surgimento de empresas privadas de sementes,

defensivos e biotecnologia que contam com virologistas vegetais em seus

quadros. A maioria dos virologistas vegetais do País tem sólida formação

acadêmica no país ou no exterior. Atua tanto diretamente na solução dos

problemas através do equacionamento dos parâmetros epidemiológicos como

pela geração de variedades resistentes. Estes trabalhos, contudo, acham-se

fundamentos em estudos básicos sobre as propriedades biológicas,

morfológicas, citopatológicas, bioquímicas, imunológicas e moleculares dos

vírus. Houve uma rápida assimilação das modernas técnicas imunológicas e

28

moleculares para identificação e caracterização dos vírus e é hoje rotina o uso

de técnicas como Elisa, Western blot, RT-PCR, hibridização, etc. Também há

vários grupos seqüenciando genoma dos vírus e usando esta informação para

gerar plantas transgênicas, expressando genes virais, com potencial para

resistência a estes vírus (em feijoeiro, mamoeiro, citros, cana-de-açúcar, etc.).

Há alguns grupos que lidam também com viróides. Existe, contudo, o problema

da concentração da competência em algumas regiões (Sudeste e Centro-

oeste) e a absoluta falta na região Norte.

Graças a atividade destes pesquisadores conhece-se razoavelmente bem a

situação das viroses em diferentes culturas e o manejo dos mesmos. Desde os

primórdios da virologia vegetal no Brasil na década dos 1930 com o grupo do

Instituto Biológico (A.A. Bitancourt e K.M. Silbershcmidt) e do Instituto

Agronômico de Campinas (A.S. Costa) já foram geradas cerca de 6000

publicações (artigos, revisões, divulgação, resumos) muitas das quais em

revistas de impacto (Nature, Virology, Proc.Natl.Acad.Sci., J.gen.Virology,

Phytopathology, Plant Disease, Arch.virology, Intercvirology, etc.).

Princípios, estratégias e técnicas modernas para a taxonomia


Atualmente a taxonomia polifásica é um consenso entre sistematas

(Vandamme et al., 1996, Guarro et al., 1999). A taxonomia polifásica integra

dados fenotípicos, quimiotaxômicos, moleculares e genômicos com o objetivo

representar a biodiversidade nos seus diferentes níveis, isto é, de linhagem à

supra-famílias (Figura 1). Neste contexto, diversas técnicas genômicas

baseadas em padrões de banda ou códigos de barra (= fingerprints), por

exemplo AFLP, rep-PCR e ribotyping, foram aplicadas na década passada

(Dijkshoorn et al., 2001; Jasalavich et al., 2000; MCCullough et al. 1998).

Vários estudos independentes mostraram uma alta correlação entre a

similaridade de padrões de AFLP e de hibridização de DNA-DNA para diversos

grupos taxonômicos modelo, incluindo, por exemplo, Aeromonas (Huys et al.,

1996). Por este motivo, se sugeriu que AFLP poderia ser uma alternativa para

as hibridizações de DNA (Stackebrandt et al., 2002; Thompson et al., 2004).

Apesar da técnica de AFLP ser rápida, altamente discriminatória e resultados


29

poderem ser acumulados em bases de dados locais, a comparação de padrões

de AFLP gerados em diferentes laboratórios é muito difícil, comprometendo

tremendamente a criação de bancos de dados públicos para a identificação de

microrganismos.

A não-portabilidade de dados fenotípicos, por ex. perfis de ácidos graxos e de

proteínas, e moleculares, por ex. AFLP, resulta na concentração do

conhecimento taxonômico sobre diferentes grupos de microrganismos em

poucos laboratórios internacionais de referência. Esta tendência leva a uma

maior demora na inventarização da biodiversidade Global, uma vez que

diferentes taxonomistas de diferentes partes do Globo usam diferentes

ferramentas para estudarem os mesmos grupos taxonômicos. Além disto, o

emprego destas técnicas requer a inclusão de linhagens de referência em cada

novo estudo. Hoje, cada linhagem de referência chega a custar 300 dólares.

O uso de Multi Locus Sequence Typing (MLST; veja http://www.mlst.net/) tem

ampliado a visão sobre a biodiversidade e evolução de bactérias (Cohan, 2002;

Feil & Spratt, 2001; Feil et al., 2003; Maiden et al, 1998) e fungos (O'Donnell et

al. 2004; Balajee et al. 2005). Esta técnica se originou da eletroforese de

enzimas, amplamente usada por biologistas de populações (Caugant, 2001). A

metodologia moderna consiste no seqüenciamento e análise de fragmentos de

5 a 7 genes, conservados (geralmente housekeeping), espaçados ao longo do

genoma microbiano com pelo menos 100 Kb de distância ou do outro (Maiden

et al., 1998). A grande vantagem desta técnica é que a diferença entre

linhagens é indexada diretamente nas seqüências de DNA. Como estes genes

evoluem muito lentamente, se tornam ideais para estudos de longo termo de

epidemiologia e identificação. Além disto, seqüências gênicas, diferentemente

de padrões de bandas, como AFLP, rpe-PCR, podem ser acumuladas em

bases de dados de domínio público e comparadas com facilidade.

Dados de MLST podem ser utilizados para calcular a contribuição de mutação

e recombinação na evolução de complexos clonais dentro de uma dada

espécie de bactérias (Feil et al., 2003). Informações desta natureza podem

auxiliar, por exemplo, na elaboração de vacinas mais eficientes para

microrganismos patogênicos ou para tomada de medidas epidemiológicas.

Este tipo de metodologia abre uma nova possibilidade para integrar o

30

conhecimento sobre a biodiversidade das diferentes regiões brasileiras. Neste

sentido, a rede genoma nacional poderia servir como arcabouço para o estudo

piloto de diferentes microrganismos de interesse ambiental e clínico.

É importante ressaltar que MLST tem sido empregado apenas na tipagem de

alguns poucos patógenos humanos e pouco ainda é conhecido sobre o uso da

metodologia de MLST para a diferenciação de espécies, gêneros e famílias no

Domínio Bacteria. Ziegler (2003) examinou 49 genomas bacterianos de

diferentes filos e encontrou alta correlação entre a similaridade dos

aproximadamente 30 genes, por ex. recN, thdF, rpoA, ligA, atpA e dnaX, com

as seqüências totais dos genomas. Ele concluiu que as seqüências destes

genes poderiam ser usadas para a alocação de linhagens ambientais em

espécies conhecidas.

Para bactérias , o paradigma atual da taxonomia reside no entendimento das

relações evolutivas baseadas, quase que exclusivamente na filogenia de

seqüências de rRNA 16S (Gupta & Griffiths, 2002). Hoje, existem pelo menos

20 grandes grupos taxonômicos dentro do Domínio Bacteria, os quais ainda

não foram formalmente definidos, mas são referidos na literatura como

“Divisões” (veja Bergey's website

http://dx.doi.org/10.1007/bergeysoutline200210). Divisões seriam categorias

hierárquicas equivalentes aos filos da taxonomia de animais e plantas.

Proteobacteria é o maior grupo, com mais de 1.500 espécies, divididas em

cinco classes: α, β, γ, δ e ε. Porém, existe uma necessidade preemente de se

refinar a filogenia de bactérias por meio da análise de outros genes.

Novas metodologias baseadas na genômica têm sido concebidas para o

estudo da filogenia e evolução de procariontes, incluindo a análise de

inserções/deleções (indels; Gupta & Griffiths, 2002), do conteúdo e ordem de

genes, de seqüências concatenadas (Wolf et al., 2002), super-árvores (Daubin

et al., 2001) e análises de distâncias evolucionárias entre genes ortológos (Wolf

et al., 2002). Análises evolutivas em nível de espécie, que incluem a delineação

de genótipos ancestrais, complexos clonais e da taxa de recombinação entre

linhagens, têm sido aprimoradas pelo uso dos algorítimos “Burst” e “Splits tree

decomposition” (Feil & Spratt, 2001; Feil et al., 2003). Aplicando estes novos


31

princípios, Cohan (2002) reflete que as espécies bacterianas atualmente

delineadas são, na verdade, equivalentes a gêneros. Realmente, a definição

atual de “espécie bacteriana” é pragmática. Atualmente, esta definição

compreende grupos de isolados genomicamente coerentes, que compartilham

elevado grau de similaridade em diversas características independentes.

Apesar de intensa crítica (Lan & Reeves, 2000, 2001; Maynard Smith et al.,

2000), a hibridização de DNA-DNA ainda é o “gold standard” para o

delineamento de espécies em Bacteriologia. Linhagens da mesma espécie

apresentam, sob condições controladas de ensaios, pelo menos 70 % de

hibridização entre seus genomas, conforme definido pelo Comitê Internacional

de Sistemática Bacteriana (Wayne et al., 1987; Stackebrandt et al., 2002).

Recentemente, em uma nova reunião onde foram discutidos a definição e o

conceito de espécies em procariontes (Gevers et al., submetido), concluiu-se

que a definição de espécie atualmente utilizada ainda é útil e operacional.

Também se sugeriu que novas metodologias devam ser desenvolvidas com

urgência para suplantar as limitações da hibridização DNA-DNA, rDNA 16S,

características fenotípicas e fingerprints. Multi Locus Sequence Analysis

(MLSA) é fortemente indicada como a nova alternativa. Diversos pesquisadores

têm sugerido que a definição de espécie seja baseada em seqüências de

genes (Gevers et al., submetido; La Scola et al., 2003), devido às

características de baixo custo de ensaios, facilidade de construção de bases de

dados de acesso público, incorporação de novos dados e recursos de análise

computacional. Não há um consenso sobre o conceito de espécie em

procariontes, mas diferentes modelos evolutivos baseados na seleção natural,

de um lado, e na transferência horizontal de genes, do outro, têm sido

propostos (Gevers et al., submetido). Para se testar estes modelos, são

necessários estudos futuros sobre evolução, filogenia, e genética de

populações de procariontes com dados obtidos através de MLSA.

Fungos

O objetivo da taxonomia moderna é entender as relações evolutivas entre as

diferentes espécies, e por esse motivo quando duas espécies são incluídas em

um mesmo clado, deve ser considerado que apresentam um ancestral comum.

Dessa forma, a estratégia de classificação de indivíduos deve levar em

32

consideração características que de fato representam estas relações

filogenéticas. Neste contexto, a taxonomia do Reino Fungi é extremamente

complexa, tendo em vista a metodologia clássica atualmente utilizada para a

classificação de espécies, que utiliza características morfológicas, fisiológicas e

bioquímicas para a classificação de um indivíduo em diferente espécie. Além

disso, utilizando estruturas reprodutivas, tem sido classificadas espécies

sexuais (teleomorfos) e assexuais (anamorfos), muitas vezes não

representando as relações filogenéticas entre diferentes grupos.

Para resolver e melhorar a classificação de fungos, métodos moleculares têm

sido largamente utilizado, para reclassificar grupos heterogêneos. O conteúdo

de GC do DNA também têm sido utilizado para o estudo da taxonomia de

fungos. Neste caso, embora estudos recentes mostram que uma diferença de

1% no conteúdo de GC pode ser considerado um indicativo de que dois

isolados pertençam a espécies diferentes, têm sido aceito 2% como valor

básico (Gue´ho et al. 1992). Entretanto, em grupos onde as relações

filogenéticas ainda não foram resolvidas têm sido aceito até 8% de diferença

(Boekhout 1991).

Da mesma forma que utilizada para a taxonomia de procariontes, a

hibridização DNA-DNA também tem sido utilizada para a classificação de

fungos. Neste caso, 80% de valor de hibridização pode indicar que dois

isolados pertencem à mesma espécie, enquanto que valores menores que 20%

indicam total falta de identidade (Vilgalys, 1988).

Técnicas de “fingerprinting” como RAPD e AFLP também podem ser utilizadas

para a taxonomia de fungos. Neste caso, os dados devem ser tabulados e uma

matriz de similaridade deve ser calculada para posterior construção de árvores

filogenéticas. Neste caso, estas técnicas podem ser interessantes para a

análise de clados que apresentam alta similaridade, sendo dessa forma úteis

para a identificação ao nível de linhagens.

O RFLP pode ser utilizado da mesma forma que o RAPD e AFLP, entretanto

esta técnica pode ser aplicada à seqüências específicas, permitindo uma

melhor análise. O padrão de RFLP do DNA mitocondrial (mtDNA) ou somente

parte (mtSSU rDNA) dele tem sido amplamente utilizado (Yamamoto et al.,


33

1995), permitindo uma distinção de subespécies. Segundo Gené et al. (1996)

esta técnica pode ser aplicada para o entendimento das relações entre

anamorfos e teleomorfos, visto que para certos grupos o número de espécies

anamórficas não corresponde às espécies teleomórficas.

Uma variação do RFLP, o ARDRA, tem sido amplamente utilizada. Nesta

técnica o rDNA deve ser amplificado e posteriormente digerido com enzimas de

restrição, mostrando as relações evolutivas entre grupos com distância

genética moderada, visto que uma variação do padrão de restrição do rDNA

corresponde a uma variação na seqüência do gene. A limitação desta técnica

pode estar relacionada à presença de diferentes seqüências de ITS em uma

mesma espécies, dificultando posteriormente o entendimento dos resultados. O

ARDRA permite que diferentes padrões de bandas possam ser acumulados em

bases de dados de domínio público e comparados com facilidade.

A utilização da análise de polimorfismo de microssatélites para o estudo de

taxonomia e diversidade de fungos tem crescido substancialmente, permitindo

a caracterização de isolados clínicos e ambientais de diferentes espécies de

fungos (Nascimento et al. 2004; Lasker & Ran, 2004). O desenvolvimento de

novos marcadores de microssatélites para espécies ambientais e associadas à

plantas poderia permitir a organização de um banco de dados com o(s) perfil

(s) de cada espécie identificada, possibilitando a posterior identificação de

isolados com base neste banco de dados.

A cariotipagem eletroforética (migração dos cromossomos em gel de agarose

submetido a um campo elétrico de diferentes direções) pode também ser

utilizada, embora a alta variabilidade intraespecífica pode resultar em

dificuldades para a taxonomia fúngica.

A técnica da PCR têm sido a mais promissora, visto que associada ao

seqüenciamento de regiões conservadas do genoma, e.g rRNA e introns de β-

tubulina, actina, quitina-sintase, acetil-coenzima A sintase, gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase, lignina peroxidase e orotidine 59-monofosfato

descarboxilase. Neste contexto, o rDNA tem sido mais utilizado pelo fato de

apresentar múltiplas cópias no genoma, não codificar proteínas, cópias em

tandem podem ser tratadas como um gene único e está presente em todos os

34

organismos, compartilhando assim uma mesma origem evolutiva (Guarro et al.,

1999). Além disso, o rDNA tem regiões altamente conservadas, que servem de

pontos de referência para estudos de divergências evolutivas, alternadas com

regiões variáveis. O rDNA é subdividido em pelo menos 3 subunidades (5,8S,

18S e 25S) que são transcritas com os espaçadores internos e externos (ITS e

ETS), os quais são removidos posteriormente para formar os ribossomos. Além

destas regiões transcritas, espaçadores intergênicos (NTS ou IGS) que

separam as cópias em tandem nos cromossomos e que não são transcritas,

também podem ser utilizadas.

O 18S rDNA (chamado do SSU - small-subunit) tem sido mais utilizado para o

estudo taxonômico de fungos filamentosos, enquanto que as regiões variáveis

D1 e D2 do 25S rDNA (LSU – large-subunit) tem sido mais usadas para

taxonomia de leveduras. Entretanto, esta padronização deve ser utilizada com

cautela, pois fungos leveduriformes podem ser observados tanto nos grupos

Ascomycotina como Basidiomycotina.

Para uma correta identificação utilizando a seqüências de genes conservados,

se faz necessário uma base de dados confiável para a comparação das

seqüências. Atualmente o GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) tem sido

utilizado, embora erros decorrentes de informações imprecisas podem ser

observados. Neste aspecto, o desenvolvimento de uma base de dados para

seqüências de DNA importantes para a classificação de espécies fúngicas

seria de extrema importância para o desenvolvimento desta área no Brasil,

visto que o país é detentor de uma biodiversidade substancial, a qual poderia

gerar uma quantidade muito grande de dados para a identificação de fungos.

O uso de Multi Locus Sequence Typing (MLST) tem também sido aplicado para

o entendimento da biodiversidade e evolução de fungos (O'Donnell et al. 2004;

Balajee et al. 2005). Esta metodologia, como já descrito para procariontes se

baseia no seqüenciamento e análise de fragmentos de genes conservados

(geralmente housekeeping), espaçados ao longo do genoma microbiano com

pelo menos 100 Kb de distância ou do outro (Maiden et al., 1998). A grande

vantagem desta técnica é que a diferença entre linhagens é indexada

diretamente nas seqüências de DNA. Como estes genes evoluem muito


35

lentamente, se tornam ideais para estudos de longo termo de epidemiologia e

identificação.

Protozoários

Também em protozoários as técnicas moleculares e modernas começaram a

ocupar espaço na taxonomia. Segundo Caron (2004), nos últimos anos tem

ocorrido um espantoso aumento no uso de técnicas moleculares e genéticas

para a caracterização taxonômica de procariontes que, infelizmente, não foi

acompanhado para o grupo dos protozoários. Entretanto, estes estudos estão

sendo iniciados e, segundo esse mesmo autor, os estudos mais recentes sobre

a diversidade de protistas foram feitos utilizando análises filogenéticas de

genes de RNA ribossômico eucariótico amplificados por PCR e clonados de

amostras naturais de água. Tais estudos revelaram seqüências únicas até

então não catalogadas nas bases de dados públicas, indicando linhagens ainda

não descritas. São utilizadas também técnicas para obter o DNA ribossômico

da unidade 18S. Mas, técnicas mais simples para serem utilizadas com rotina

em estudos ecológicos de diversidade de protistas incluem: DGGE, TGGE, T-

RFLP, ARDRA, ALH, LH-PCR.

Embora seja indiscutível o avanço proporcionado pelos métodos moleculares

para a avaliação da diversidade microbiana, segundo Savin et al. (2004),

apesar das vantagens desses métodos, eles não tornam os métodos

tradicionais de identificação obsoletos, pois ambos capturam uma parcela da

comunidade.

Não se tem conhecimento, até o momento, de grupos de pesquisa no Brasil

que estão usando essas técnicas para protozoários.

Vírus

A taxonomia dos vírus baseada em características morfológicas obtidas por

observação em microscopia eletrônica, sofreu grande impacto dos processos

moleculares como auxiliares na identificação e caracterização dos mesmos. b

Um problema é, entretanto a manutenção de uma coleção de vírus vegetais.

Embora, em principio, seja factível manter-se uma coleção de vírus de plantas,

na pratica nem sempre e viável. Manter os vírus em plantas, transferindo

periodicamente por transmissão mecânica, insetos ou enxertia consome muito

36

tempo, mão-de-obra e espaço, alem do risco de ocorrer mutações. E também

possível manter material dessecado ou congelados (-20 C/-80 C ou nitrogênio

liquido) e alguns grupos tem mantido os vírus que trabalham desta maneira,

porém requer-se uma infra-estrutura apreciável para manter um grande numero

de vírus e seus diferentes isolados; Contudo, para se manter um grande

numero de vírus e seus diferentes isolados requer-se uma infra-estrutura

apreciável e pessoal e assim, embora desejável, inexiste entre nos uma

coleção que compreenda a maioria dos vírus descritos no Pais.

Impedimentos taxonômicos

A falta de uma política de financiamento direcionada para pesquisa em

taxonomia e estabelecimento de Centros de Recursos Biológicos é sem

dúvidas o maior impedimento taxonômico no âmbito do Brasil. Coleções

Internacionais de renome, como por ex. a BCCM (Bélgica), CBS (Holanda),

DSMZ (Alemanha) e JCM (Japão) são financiadas pelo governo. A ATCC

(EUA) também tem apoio financeiro massivo do governo por meio de projetos

de pesquisa. Por exemplo, A DSMZ, que acumula hoje o maior acervo de

bactérias e arquéias de referência do mundo, conta com uma equipe de aprox.

90 pessoas, das quais aprox. 30 são pesquisadores renomados. Isto significa

um investimento governamental de pelo menos 2 Milhões de Euros

anualmente, apenas com pagamento de pessoal. No caso da BCCM que

possui cerca de 50 funcionários, sendo que aprox. 15 são pesquisadores, este

montante é de pelo menos 1 milhão de Euros.

O trabalho de pesquisa em taxonomia, particularmente a classificação de

novos taxa, demanda uma quantia considerável de recursos, tanto em

equipamentos e insumos, quanto em horas de trabalho. Para cada descrição

de uma nova espécie de procarionte, se gasta em torno de 10 mil euros (Erko

Stackebrandt, comunicação pessoal)1. Levando em consideração que apenas

1-10 % das espécies de procarionte e fungos já foram formalmente descritas,

serão necessários investimentos na ordem de 585 milhões de euros para se

1 Engloba insumos, mão-de-obra e instalações – de acordo com a realidade na Alemanha. No Brasil, poder-se-ia estimar um valor de até 3 mil Euros. A estimativa leva em conta análises fenotípicas e métodos moleculares modernos.


37

completar a catalogação de todas as espécies de microrganismos presentes no

mundo. Além disto, existe uma necessidade premente de se desenvolverem

técnicas inovadoras para o cultivo de microrganismos que não crescem em

placa (Colwell & Grimes, 2000). Trabalhos pioneiros nesta área vêm sendo

desenvolvidos por alguns poucos grupos norte americanos (Joseph et al.,

2003; Rappe et al., 2002; Stevenson et al., 2004) e por empresas como a

DIVERSA (http://www.diversa.com).

Muitos pesquisadores já ressaltaram que fatores de impacto (FI) por ex. os

indicados pelo Institute of Scientific information (ISI), não refletem a importância

dos trabalhos em taxonomia, especialmente porque trabalhos de descrição de

espécies são citados com mais freqüência, muitos anos depois da publicação,

o que diminui o seu impacto (Krell, 2002). O IJSEM figura na 12a posição entre

os jornais de microbiologia, com um FI de 3,18, enquanto que o jornal

Systematic and Applied Microbiology aparece na 25a posição (FI = 1,91). Por

este motivo, taxonomistas têm muitas vezes dificuldade para obterem recursos

para seus projetos de pesquisa, perdendo para outros ramos mais na moda da

biologia. Há uma relação inversa entre a distribuição da biodiversidade ainda

não estudada e taxonomistas. A maior porção da biodiversidade ainda não

explorada se concentra principalmente em países do terceiro mundo e em

desenvolvimento como o Brasil, cujo número de taxonomistas é muito reduzido.

Este fato é um grande entrave para o desenvolvimento da sistemática e

taxonomia de procariontes. É essencial que Coleções de Culturas Brasileiras

tenham um forte elo de interação com a Universidade, uma vez que as

mesmas devem desempenhar o papel de centros de referência de pesquisa em

biodiversidade. Portanto, para que haja um avanço da taxonomia no Brasil,

pesquisas voltadas à taxonomia, filogenia, evolução, identificação, e genética

de populações devem ser estimuladas dentro das coleções de cultura e em

colaboração com a Academia. O estabelecimento de um programa de pós-

graduação inter-universidades em Sistemática Microbiana poderia estimular a

formação de recursos humanos em taxonomia bem como aumentar a produção

científica nesta área.

A proposta da taxonomia eletrônica vem causando muito debate por parte de

diversos pesquisadores (Bisby et al., 2002; Godfray, 2002; Smith, 2004), mas

38

sem dúvidas ela produzirá um sistema de catalogação de espécies mais

rápido, eficiente, transparente, barato e acessível para toda a comunidade

científica por meio da WWW. Dados de MLSA são facilmente disponibilizados

em bases de dados públicas, necessitando apenas de trabalho de atualização,

por meio da inclusão de seqüências de novas espécies, e a curadoria

continuada de dados, com o intuito de evitar erros e/ou falta de informação

sobre as linhagens. Obviamente, as bases de dados de MLSA ainda precisam

ser produzidas para a maioria dos grupos taxonômicos conhecidos (Gevers et

al., submetido). Este trabalho representará um marco na taxonomia de

procariontes e requererá investimentos massivos no seqüenciamento de DNA

de linhagens de referência e o desenvolvimento de ferramentas

computacionais, incluindo a criação de website ativos, que possibilitem a

integração da informação e análises genômicas in silico. O desenvolvimento

destas bases e ferramentas possibilitará que descrições taxonômicas sejam

feitas com muito maior rapidez e objetividade, resultando em um rápido

desenvolvimento da taxonomia e exploração da biodiversidade no âmbito do

Brasil.


39

TENDÊNCIAS E PERSPECTIVAS

Atualmente, diferentes grupos e países desenvolvem estratégias para

identificar e catalogar a biodiversidade microbiana existente no planeta. Por

exemplo, a organização americana sem fins lucrativos, All species foundation,

quer gerar um inventário completo de todas as espécies vivas na Terra dentro

dos próximos 25 anos (http://www.all-species.org/). Espera-se ter uma

conservação ambiental mais efetiva e uma maior acessibilidade de dados com

esta iniciativa. Neste contexto, várias iniciativas estão sendo tomadas para o

desenvolvimento de websites dedicados a taxonomia e de descrições

eletrônicas de novas espécies. Species 2000 (http://www.sp2000.org/) deseja

enumerar todas as espécies de organismos vivos no planeta em uma base de

dados eletrônica que sirva de portal de entrada para estudos sobre

biodiversidade. Até o presente já foram listadas 500 mil espécies (Peplow,

2005). Enquanto que o GBIF (http://www.gbif.org/) pretende globalizar todo o

conhecimento atual sobre biodiversidade pela internet. No Brasil, o Sinbiota

(http://sinbiota.cria.org.br) visa integrar informações geradas pelos

pesquisadores vinculados ao Programa Biota/Fapesp e relacioná-las a uma

base cartográfica digital de qualidade, provendo assim, mecanismos de difusão

de informação sobre a biodiversidade paulista. Claramente, o momento atual é

fascinante e desafiador para todos aqueles envolvidos com o estudo da

biodiversidade de microrganismos. Agregando a experiência em bioinformática

e genômica já existente no Brasil com os princípios e técnicas modernas para o

estudo da biodiversidade, o nosso país tem a chance se tornar uma referência

internacional no ramo da sistemática microbiana em um horizonte de 10 anos.

Finalmente, o fortalecimento desta disciplina propiciará um melhor

aproveitamento e exploração da biodiversidade microbiana brasileira sem que

haja a necessidade de que tal material biológico seja mandado para

especialistas de fora do país.

40

RECOMENDAÇÕES

1. Fortalecer os centros de pesquisa e as coleções de microrganismos

engajados no estudo e preservação da biodiversidade microbiana, bem

como estabelecer novos núcleos e coleções institucionais em locais

estratégicos, por ex. aqueles que representem hot spots de

biodiversidade, de maneira que possam servir à adequada preservação e

estudo da biodiversidade microbiana brasileira, além da demanda

industrial para uso em ensaios normatizados de rotina e exploração

biotecnológica. Este incentivo deve se dar através da consolidação da

infra-estrutura material e técnica dos acervos, destacando a necessidade

de curadores e pessoal técnico especializado com vínculo efetivo. Neste

sentido, é importante recomendar a criação e o fortalecimento de núcleos

regionais, especialmente nas regiões Nordeste e Centro-Oeste,

engajando-os em projetos nacionais ou regionais em parceria com

instituições consolidadas.

Treinar pessoal em instituições nacionais e internacionais de renome e

implantar infra-estrutura para realização de metodologias moleculares

modernas de caracterização taxonômica microbiana a curto e médio prazo.

Integrar as coleções brasileiras a iniciativas internacionais, especialmente as

que fomentarem parcerias com instituições que possuam acervos importantes

de linhagens tipo e referência, não representadas nas coleções nacionais.

2. Estimular a implementação de tecnologias bioinformáticas para acelerar a

catalogação e difusão do conhecimento sobre a taxonomia de

procariontes e facilitar seu acesso e uso.

3. Produzir e publicar revisões taxonômicas por meio da aplicação das

técnicas modernas, especialmente MLSA, e disponibilização gratuita de

esquemas de identificação na internet.

4. Implementar disciplinas sobre taxonomia, filogenia e evolução microbiana

nos cursos de graduação em ciências da vida nas Universidades do

Brasil.


41

Estruturar programas induzidos de treinamento e pesquisa em taxonomia

microbiana no exterior em tópicos modernos e pertinentes ao estudo da

biodiversidade, como por ex. a taxonomia genômica, microevolução, genética

de populações, técnicas de cultivo de microrganismos não-cultivados,

genômica e bioinformática.

42

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50

Figura 1. Discriminação de diversas técnicas empregadas na taxonomia polifásica (adaptada de Vandamme et al, 1996)

Família

Espécie

Linhagem

Gênero

SupraFamília

TécnicaRFLP

LFRFA

RIBOTYPING

AFLP, AP-PCR, A

RDRA, DAF, R

APD

PHAGE AND BACTERIOCIN TYPING

SEROLOGY

MLEE, MLST

SDS - PAGE

DNA-DNA HYBRIDIZATIO

NS

% G+C

tDNA-PCR

POLYAMINES, Q

UINONES

FAME

CELL WALL STRUCTURE

PHENOTYPIC ANALYSIS

DNA-rRNA HYBRIDIZATIO

NS

rRNA SEQUENCING

DNA PROBES, MICROARRAYS

DNA SEQUENCING

Família

Espécie

Linhagem

Gênero

SupraFamília

TécnicaRFLP

LFRFA

RIBOTYPING

AFLP, AP-PCR, A

RDRA, DAF, R

APD

PHAGE AND BACTERIOCIN TYPING

SEROLOGY

MLEE, MLST

SDS - PAGE

DNA-DNA HYBRIDIZATIO

NS

% G+C

tDNA-PCR

POLYAMINES, Q

UINONES

FAME

CELL WALL STRUCTURE

PHENOTYPIC ANALYSIS

DNA-rRNA HYBRIDIZATIO

NS

rRNA SEQUENCING

DNA PROBES, MICROARRAYS

DNA SEQUENCING

taxonomia: microbiana, de procariontes, de fungos, de

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