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BRUNO HIROSHI TSUNEDA Suplementação oral com selênio para touros Brangus: integridade da membrana
espermática e qualidade do sêmen fresco e pós-congelamento
Cuiabá – MT Março-2009
BRUNO HIROSHI TSUNEDA Suplementação oral com selênio para touros Brangus: integridade da membrana
espermática e qualidade do sêmen fresco e pós-congelamento
Cuiabá – MT Março - 2009
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal Área de concentração: Produção Animal Orientadora: Profa. Dra. Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis Co-orientador: Prof. Dr. Joanis Tilemahos Zervoudakis
FICHA CATALOGRÁFICA T882s Tsuneda, Bruno Hiroshi Suplementação oral com selênio para touros
Brangus: integridade da membrana espermática e qualidade do sêmen fresco e pós-congelamento / Bruno Hiroshi Tsuneda. – 2009.
69p. : il. : color. ; 30 cm. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal
de Mato Grosso, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Pós-Graduação em Ciência Animal, Área de concentração: Produção Animal, 2009.
“Orientadora: Profª. Drª. Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis”. “Co-orientador: Prof. Dr. Joanis Tilemahos Zervoudakis”.
CDU – 636.2-087.7 Ficha elaborada por: Rosângela Aparecida Vicente
Söhn – CRB-1/931
Índice para Catálogo Sistemático 1. Gado bovino – Pecuária - Zootecnia 2. Bovino – Pecuária – Zootecnia 3. Touros – Suplementação dietética 4. Touros – Sêmen – Qualidade 5. Selênio – Suplemento alimentar – Touros
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO OU PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
Aluno: BRUNO HIROSHI TSUNEDA Título: SUPLEMENTAÇÃO ORAL COM SELÊNIO PARA TOUROS BRANGUS:
INTEGRIDADE DA MEMBRANA ESPERMÁTICA E QUALIDADE DO SÊMEN FRESCO E PÓS-CONGELAMENTO
Aprovado em: 30/03/2009
Banca Examinadora:
___________________________________________________ Profª. Drª.: Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis
(FAMEV/UFMT - Orientadora)
___________________________________________________ Prof. Dr.:Joanis Tilemahos Zervoudakis
(FAMEV/UFMT – Co-orientador)
___________________________________________________ Prof. Dr.: Luciano da Silva Cabral
(FAMEV/UFMT – Membro)
___________________________________________________ Profª. Drª.: Carmen Neusa Martins Cortada
(TECPAR – Pesquisadora)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de mestre em Ciência Animal
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a todos que, de forma direta ou indireta, participaram e contribuíram para a conclusão desta etapa
na minha vida acadêmica e profissional.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Pedro e Marilene e aos meus irmãos Pedro e Maryele, por tudo que sou
e tudo que tenho.
À Universidade Federal de Mato Grosso e a Faculdade de Medicina Veterinária pela
minha formação acadêmica.
Ao programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, pelos dois anos de aprendizado e
crescimento profissional.
A amiga orientadora Dra. Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis, pela confiança
depositada em seus orientados, pela paciência nos ensinamentos e pela competência
profissional.
Ao meu co-orientador Joanis Tilemahos Zervoudakis pela grande ajuda durante a
elaboração da dissertação e pelos esforços como coordenador do Programa de Pós-Graduação.
Ao professor Dr. Luciano da Silva Cabral, pelo aprendizado transmitido, pela
dedicação e profissionalismo demonstrado no dia a dia e principalmente por estar sempre
disposto a nos ajudar.
Aos demais professores do PGCA, mas em especial ao Anselmo Santos, João
Caramori e Joadil Abreu, pelo entusiasmo nas aulas e amizade fora da sala de aula.
A Dra. Carmen Neusa Martins Cortada, por aceitar participar da banca de defesa e que
com certeza, muito contribuirá nessa etapa final.
Ao Santana da Fazenda Sereno, por nos ceder o espaço, os animais e toda estrutura
para a realização do experimento, e também ao Tonho, Baixinho, Sérgio, Paulo, Aldo e Dona
Fátima , pessoas que de forma direta ou indireta nos ajudaram no experimento.
Ao Nhônho, Júlia, Moacir “Balancin” e Eleonora (Aprendiz do Mago), estagiários de
fundamental importância para a conclusão desse trabalho.
Aos demais estagiários que nos auxiliaram nos dias de coletas: Marilia, Mario Fabio,
Rafael e Sara.
A Renatinha, pela ajuda com a análise das forragens.
Aos amigos de mestrado:
• Aos outros integrantes da Equipe Cachimbo: Walter “Fóscrim”e Guto“Pescotapa”
• Patricia Cosentino e Lourival “The Magic” Júnior e Jonanthan “Pelota”, integrantes da
“Cia do Manejo”
• Cassiano “2T”, Lorenzo “Estivador”, Alisson “Praieiro”, Ronaldinho, Zé Rainha,
Evandro Alberton, Danillo “El Loko”, Nelcino e Welton, integrantes da lendária
equipe do Realmatismo FC
• Carol, Isis, Frava, Vivian e Giselde, nossas guerreiras do Real Mastite
• A Rafaela, João Paulo “Malmita”, Inácio, Johnnie Violeiro e André Aquidauana,
pelos simpósios de sexta no espaço Eskininha
• Aos amigos “Detestáveis” de longa data: Zé Patrola, Bunda, Peba, Boi e até o Alex.
Aos secretários e também amigos Douglas Bombomzinho e a Elaine.
A FAPEMAT pelo financiamento do projeto e pela bolsa concedida.
RESUMO
TSUNEDA, B.H. Suplementação oral com selênio para touros Brangus: integridade da membrana espermática e qualidade do sêmen fresco e pós-congelamento. 2009, 69f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Programa de Pós Graduação em Ciência Animal, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, 2009.
O experimento foi realizado na Fazenda Sereno, localizada em Jaciara-MT,
objetivando avaliar a integridade da membrana plasmática e qualidade seminal de bovinos jovens alimentados com dieta experimental suplementada com selênio. Foram utilizados 16 touros Brangus em pastejo, distribuídos em dois tratamentos: grupo controle (GC, suplemento concentrado) e grupo selênio (GS, suplemento concentrado com adição de selênio de 0,1mg/kg/MS de dieta). O experimento teve duração de 75 dias, sendo os animais suplementados por 60 dias e realizadas quatro avaliações andrológicas durante o período: COL 1 (início da suplementação), COL 2 (30 dias de suplementação), COL 3 (60 dias de suplementação) e COL 4 (15 dias após término da suplementação, para avaliação de efeito residual). Em cada coleta os animais foram pesados em tronco com balança digital e mensuradas a circunferência escrotal e a consistência testicular. Para a coleta de sêmen foi utilizada a técnica de eletroejaculação. O sêmen foi coletado em tubo graduado, onde foi observado o volume, a coloração e o aspecto do ejaculado. Em seguida foram realizados os exames imediatos (motilidade, vigor e turbilhonamento espermático) e confeccionadas lâminas coradas e retiradas alíquotas para exames complementares de viabilidade espermática (eosina/nigrosina), integridade acrossomal (Pope), integridade de membrana espermática (HIPO) e reação acrossomal (TRI). Foram congeladas cinco palhetas de sêmen de cada animal em cada coleta, utilizando meio diluidor a base de tris, citrato de sódio e gema, as quais posteriormente foram descongeladas e analisadas. O experimento foi instalado em delineamento inteiramente casualizado com medidas repetidas no tempo e os dados analisados através de ANOVA com um nível de significância de 10% com auxílio do programa estatístico SAS. Para o sêmen fresco foi encontrado efeito da suplementação para as variáveis motilidade (MOT) (p= 0,0183), vigor (VIG) (p= 0,0125) e integridade da membrana espermática (HIPO) (p= 0,0287), sendo GC superior ao GS para MOT e VIG e GS superior ao GC para HIPO, para as demais variáveis não foi observado efeito da suplementação com selênio (p> 0,10). No sêmen criopreservado foi observado efeito da suplementação apenas para integridade de membrana (HIPO), sendo o GS superior ao GC (p= 0,0480). Com base nos resultados encontrados conclui-se que, nas condições experimentais presentes, a suplementação com selênio, na concentração de 0,1 mg/kg de MS para reprodutores bovinos com as exigências de selênio atendidas, diminui a motilidade e o vigor espermático, entretanto, melhora a integridade da membrana espermática no sêmen fresco e não altera a qualidade seminal, porém reduz a lesão da membrana espermática no sêmen criopreservado.
ABSTRACT
TSUNEDA, B.H. Oral supplementation with selenium for Brangus bulls, spermatic membrane integrity and quality fresh and frozen-thawed of semen. 2009, 69f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Programa de Pós Graduação em Ciência Animal, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, 2009.
The experiment was realized in Sereno Farm, Jaciara-MT, and aimed to evaluate plasmatic membrane integrity and seminal quality of young bulls fed with experimental diet supplemented with selenium. Were used sixteen Brangus bulls, distributed in two treatments: controlled group (GC, intent supplement) and selenium group (GS, concentrated supplement with selenium addition of 0.1mg/kg/DM on diet). Experiment had duration of 75 days, animals were supplemented for 60 days and realized four andrologics evaluations during experimental period: COL 1 (before supplementation), COL 2 (30 days of supplementation), COL 3 (60 days of supplementation), and COL 4 (15 days after end of supplementation, for residual effect evaluation). In each collect the animals had been weighed in trunk with digital scale and were measured the scrotal circumference and testicular consistency. For semen collection electroejaculation technique was used. Semen was collected in graduated pipe, where it was observed volume, coloration and aspect. After that, was realized immediate exams (spermatic motility and vigor and mass moviment) and was collected aliquots for complementary examinations: spermatic viability (eosine/nigrosin stain), acrossomal integrity (Pope stain), spermatic membrane integrity (HIPO, hipoosmotic swelling test) and acrosomes reaction (TRI, triple stain). Were freezing five semen straws (0.25mL) of each animal in each collect, using tris-yolk sodium citrate dilute for posterior analyze. Randomised complete design with repeated measures in time were used and results analyzed through ANOVA with a significance level of 10% with statistical program SAS. For fresh semen was found supplementation effect for the variables spermatic motility (MOT) (p= 0.0183), spermatic vigor VIG (p= 0.0125) and spermatic membrane integrity (HIPO) (p= 0.0287), GC superior to GS for MOT and VIG, and GS superior to the GC for HIPO, for others variables weren’t observed effect of selenium supplementation (p>0.10). In cryopreserved semen was observed supplementation effect only for membrane integrity (HIPO) (p= 0.0480), GS superior to GC in the fresh and cryopreserved semen. Based in found results conclude that, in presents experiment conditions selenium supplementation, in concentration of 0.1 mg/kg of DM for bulls with attended nutritional need, reduces spermatic motility and vigor, however improve spermatic membrane integrity in fresh semen and it does not modify the seminal quality, however it reduces the injury of the spermatic membrane in the frozen-thawed semen.
LISTA DE ABREVIATURAS
AGPI Ácidos graxos poli insaturados
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
Cu+ Íon cobre monovalente
DNA Ácido desoxirribonucléico
EROs Espécies reativas de oxigênio
Fe++ Íon ferroso
Fe3+ Íon férrico
GPx Glutationa peroxidase
GRD Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Próton de hidrogênio
H2O Molécula de água
H2O2 Peróxido de hidrogênio
IA Inseminação artificial
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato reduzida
O2 Molécula de oxigênio
O2- Ânion superóxido
OH- Radical hidroxila
RNA Ácido ribonucléico
ROO- Radical peroxila
ROOH Peróxido
SOD Superóxido dismutase
TBARS Substâncias reativas ao ácido tio-barbíturico
LISTA DE FIGURAS
Revisão Bibliográfica
Figura 1 - Formação do ânion superóxido......................................................................20
Figura 2 - Formação do peróxido de hidrogênio (H2O2)................................................20
Figura 3 – Formação do radical hidroxila; Reação de Fenton........................................21
Figura 4. Reação de dismutação do íon superóxido catalisada pela superóxido dismutase
(SOD) e formando peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio (O2)...............25
Figura 5 - Ação da catalase (CAT) na inativação do peróxido de hidrogênio...............26
Figura 6 - Ação da Glutationa peroxidase na inativação do peróxido de hidrogênio....26
Capitulo 1
Figura 1 - Dados metereológicos (temperatura mínima, máxima e média) da região de
Jaciara, MT - 02/06/2008 à 17/09/2008, Fonte: INMET, 2009...................41
Capitulo 2 Figura 1 - Dados metereológicos (temperatura mínima, máxima e média) da região de
Jaciara, MT - 02/06/2008 à 17/09/2008, Fonte: INMET, 2009...................60
LISTA DE TABELAS
Capítulo I
Página Tabela 1. Composição percentual do suplemento fornecido aos animais em
experimento, expresso com base na matéria natural................................
42
Tabela 2. Composição químico-bromatológica do suplemento concentrado e da forragem utilizada na alimentação dos animais experimentais com base na matéria natural.....................................................................................
42
Tabela 3. Média, erro padrão da média do grupo controle (GC) e grupo suplementado (GS) e nível de significância do efeito da suplementação via oral com selênio no sêmen de reprodutores bovinos Brangus das variáveis: peso (PESO), circunferência escrotal (CE), consistência (CONS), volume (VOL), motilidade (MOT), vigor (VIG), concentração (CONC), total do ejaculado (TOTEJA), defeitos menores (DEFME), defeitos maiores (DEFMA), defeitos totais (DEFTOT), viabilidade espermática (EOS), integridade de acrossoma (POPE) e integridade de membrana plasmática (HIPO)
46
Tabela 4. Consumo estimado de selênio em quatro situações de manejo nutricional (NRC, 1996)................................................................................................
50
Capítulo II
Tabela 1. Composição percentual do suplemento fornecido aos animais em experimento, expresso com base na matéria natural...................................
61
Tabela 2. Composição químico-bromatológica do suplemento concentrado e da forragem utilizada na alimentação dos animais experimentais com base na matéria natural........................................................................................
61
Tabela 3. Média, erro padrão da média do grupo controle (GC) e grupo suplementado (GS) e nível de significância do efeito da suplementação via oral com selênio no sêmen a fresco e congelado de reprodutores bovinos Brangus das variáveis: motilidade (MOT), vigor (VIG), viabilidade espermática (EOS), integridade de acrossoma (POPE), integridade de membrana plasmática (HIPO) e espermatozóide morto com acrossoma íntegro (TRI 3)..................................................................
64
Tabela 4. Consumo estimado de selênio em quatro situações de manejo nutricional (NRC, 1996)................................................................................................
65
SUMÁRIO
Página
1. Introdução..................................................................................................................... 13
2. Revisão bibliográfica.................................................................................................... 16
2.1. Nutrição x Reprodução.......................................................................................... 16
2.2. Estresse térmico x Reprodução.............................................................................. 17
2.3. Espécies reativas de oxigênio (EROs)................................................................... 19
2.3.1. Ânion superóxido (O2-)....................................................................................... 20
2.3.2. Peróxido de hidrogênio (H2O2)........................................................................... 20
2.3.3. Radical hidroxila (OH-)....................................................................................... 21
2.4. Estresse oxidativo................................................................................................... 21
2.5. Estresse oxidativo x Espermatozóides .................................................................. 21
2.6. Sistema de defesas antioxidantes........................................................................... 23
2.6.1. Sistema de proteção enzimático.......................................................................... 24
2.6.1.1. Superóxido dismutase (SOD).......................................................................... 24
2.6.1.2. Catalase (CAT)................................................................................................ 25
2.6.1.3. Glutationa peroxidase (GPx)........................................................................... 26
2.7. Selênio................................................................................................................... 26
2.8. Criopreservação de sêmen..................................................................................... 28
2.9. Referências bibliográficas..................................................................................... 31
3. Capítulo 1. SUPLEMENTAÇÃO ORAL COM SELÊNIO PARA TOUROS BRANGUS A PASTO: INTEGRIDADE DA MEMBRANA ESPERMÁTICA E QUALIDADE DO SÊMEM FRESCO ...................
36 3.1. Introdução................................................................................................................. 39
3.2. Material e Métodos................................................................................................. 40
3.3. Resultado e Discussão............................................................................................ 46
3.5. Referências ............................................................................................................. 53
4. Capítulo 2. SUPLEMENTAÇÃO ORAL COM SELÊNIO PARA TOUROS BRANGUS A PASTO: INTEGRIDADE DA MEMBRANA ESPERMÁTICA E QUALIDADE DO SÊMEN PÓS-CONGELAMENTO ................................................................................
55
4.1. Introdução............................................................................................................... 58
4.2. Material e Métodos................................................................................................. 59
4.3. Resultado e Discussão............................................................................................. 63
4.5. Referências............................................................................................................... 67
5. Conclusões Gerais....................................................................................................... 69
13
1. Introdução
A economia brasileira tem passado por rápidas transformações nos últimos anos.
Neste contexto, produtividade, custo e eficiência se impõem como regras básicas de
sobrevivência em um mercado cada vez mais competitivo (CNA, 2000). Da mesma forma,
transformações intensas marcaram a pecuária de corte brasileira na última década.
A bovinocultura de corte brasileira que foi caracterizada pela criação extensiva com
baixo uso de insumos, resultado de um crescimento histórico baseado na incorporação de
novas áreas, dada à abundância de terras, em detrimento da intensificação, passou por
mudanças devido à escassez de investimentos públicos na expansão da fronteira agrícola e
pela crescente preocupação com o meio ambiente, conduzindo a pecuária a um novo perfil
tecnológico (CORRÊA, 2000).
O sistema de produção de bovinos de corte no Brasil tornou-se mais ágil, o que acabou
refletindo em um significativo aumento na taxa de desfrute durante o período. Resultado
principalmente da aplicação de técnicas modernas de produção, do melhoramento genético
dos animais e de uma estabilização da economia, permitindo ao setor ganhos extraordinários
de volume e produtividade, os quais foram determinantes para colocar o Brasil em condição
de destaque como grande produtor e exportador de carne bovina (SEGUI, 2007).
No entanto ainda há um longo caminho para que sejam alcançados os níveis de
produtividade dos rebanhos mais competitivos do mundo. Este aspecto pode ser comprovado
ao se observar a baixa taxa de desfrute do rebanho brasileiro, que se deve aos baixos índices
produtivos e reprodutivos obtidos na pecuária, sendo a taxa de natalidade do rebanho
brasileiro, a idade ao primeiro parto e taxa de abate aproximadamente 60%, quatro anos e
17% respectivamente, contra 80%, dois anos e 22% em sistemas tecnificados (Zimmer e
Euclides Filho1, 1997, citado por Oliveira et al., 2006).
Desenvolver tecnologias apenas não é suficiente, se efetivamente pouco dela é
incorporado ao sistema de produção. Sistemas mais tecnificados de produção de carne bovina
requerem a intensificação dos fatores básicos de produção, ou seja, da terra, do capital e do
trabalho. Desta forma, surge como condição fundamental a necessidade de elevada eficiência
reprodutiva como meta principal dos produtores que objetivam rentabilidade na atividade
pecuária.
1 ZIMMER, A.H.; EUCLIDES FILHO, K. As pastagens e a pecuária de corte brasileira. In. Simpósio Internacional sobre produção animal em pastejo, Anais, Viçosa-MG, p. 349-379, 1997.
14
No entanto, na maioria das propriedades brasileiras, a adoção de novas técnicas é um
processo lento, seja por falta de capital, falta de conhecimento por parte dos produtores, ou
mesmo aversão às inovações. Mesmo a inseminação artificial (IA) apresentando vantagens e a
facilidade de seu uso e apesar de estar disponível há mais de cinco décadas com material
congelado, apresenta taxa de utilização em relação ao número de fêmeas em reprodução em
nosso País, ao redor de 7%. Deduz-se, portanto, que mais de 90% dos bezerros nascidos no
Brasil provêm de acasalamentos ocorridos em monta natural (ASBIA, 2007). Demonstrando o
grande potencial de expansão do uso da IA.
Para a obtenção de índices reprodutivos adequados é de extrema importância o
monitoramento de todos os fatores que possam influenciar o desempenho reprodutivo da
fêmea e, principalmente, do macho. Isto porque, em termos zootécnicos, a fertilidade do
macho exerce um impacto muito maior sobre a eficiência de um rebanho, quando comparada
à da fêmea (VALENÇA et al., 2007).
O baixo desempenho reprodutivo reflete em baixa lucratividade da pecuária de cria. O
número de bezerros desmamados por vacas colocadas em monta natural é o principal fator
determinante da lucratividade, e ao contrário do preço de venda de bezerros e do preço de
compra de insumos, é um dos principais fatores sobre o qual o pecuarista pode exercer algum
tipo de controle (PRADA e SILVA, 2005).
Segundo Sereno et al. (2002), o número de touros zebuínos inférteis e subférteis em
serviço no Brasil é elevado, sendo que aproximadamente 40% apresentam algum distúrbio de
fertilidade ao exame andrológico. Segundo Amman e Schanbacher (1983), a identificação de
touros inférteis é muito simples, enquanto que, nos casos de subfertilidade o problema é mais
grave, pois o animal só é identificado no final da estação de monta, quando as fêmeas
apresentarem baixas taxas de fecundação, ou em propriedades que não realizem controle
zootécnico adequado esses animais podem nunca ser detectados.
Como consequência dos sistemas de criação estabelecidos no Brasil, os grandes
rebanhos (50% do efetivo brasileiro) estão localizados na região dos cerrados no Brasil
Central (IBGE, 2005), onde os efeitos climáticos frequentemente levam os animais criados
nessa região a um estresse térmico, o que afeta negativamente seu comportamento
reprodutivo, diminuindo a eficiência reprodutiva, podendo levar a infertilidade do macho,
com significativo impacto na fertilidade dos rebanhos. Segundo Gabaldi e Wolf (2002) a
degeneração testicular é a mais importante causa de subfertilidade e infertilidade em touros
que servem a campo no Brasil Central, a qual está diretamente relacionada ao estresse térmico
sofrido pelos animais. De fato o estresse térmico prejudica não somente a normalidade da
15
função testicular, mas também afeta negativamente a capacidade fecundante dos
espermatozóides produzidos e põe em risco o desenvolvimento dos embriões gerados a partir
de gametas anormais (GARCIA, 2004).
Uma provável explicação para a influência da temperatura nos testículos de mamíferos
seria que os mesmos trabalham no limite da hipóxia. O aumento na temperatura local resulta
em aumento da taxa metabólica e, consequentemente, no aumento na demanda por oxigênio
(BARTH e BOWMAN, 1994) de forma tal que a vascularização sanguínea testicular não
consegue supri-la, aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs)
(SETCHELL, 1998).
A produção de EROs pelos espermatozóides é um processo fisiológico normal.
Entretanto, quando há um desbalanço entre a produção e inativação dos EROs,
tem-se o estresse oxidativo, que provoca danos às estruturas das biomoléculas (SHARMA e
AGARWAL, 1996).
Os EROs são continuamente produzidos in vivo, consequentemente, os organismos
desenvolveram sistemas antioxidantes de defesa (VANNUCCHI et al., 1998). Entre os
antioxidantes, destacam-se alguns nutrientes, tais como a vitamina E e o selênio, além de
várias enzimas, as quais são encontradas no plasma seminal (VANNUCCHI et al., 1998).
O selênio é um componente essencial de várias enzimas, atuando como co-fator da
GPx, que é uma enzima citoplasmática antioxidante (ALVARES e MORAES, 2006) e por
essa razão, protege o tecido celular contra o estresse oxidativo, atuando na desintoxicação do
peróxido de hidrogênio e de hidroperóxidos de lipídios (NORDBERG e ARNÉR, 2001).
Os espermatozóides também sofrem injúrias durante o processo de congelamento,
devido a peroxidação lipídica de suas membranas provocada por uma produção excessiva de
EROs, os quais estão associados com declínio da fertilidade durante este processo (RUIZ et
al., 2007) e durante a estocagem (MAXWELL e WATSON, 1996).
A maioria dos solos no Brasil são lixiviados e apresentam baixo teor de matéria
orgânica, dessa maneira a suplementação com selênio traria e feitos benéficos, tanto na
produção como na reprodução desses animais (SURAI, 1998).
Dada à importância dos efeitos climáticos sobre a fertilidade de reprodutores bovinos
e dos possíveis efeitos benéficos da suplementação com selênio, objetivou-se com esse
trabalho avaliar a influência da suplementação oral com selênio sobre a qualidade seminal e
integridade da membrana plasmática do sêmen fresco e pós-congelamento de touros Brangus
criados no Brasil Central, uma vez que, poucos estudos são encontrados na literatura
relacionando o efeito do mineral com a eficiência reprodutiva dos reprodutores.
16
2. Revisão Bibliográfica
2.1. Nutrição x Reprodução
Índices reprodutivos adequados em qualquer criação animal exigem um adequado
manejo nutricional. Existe uma complexidade de fatores associados ao efeito direto do manejo
nutricional sobre a fertilidade dos animais. Como exemplo a quantidade e qualidade dos
alimentos consumidos, as reservas de nutrientes corporais, bem como a própria partição de
nutrientes (BORGES, 2006).
As funções reprodutivas também podem ser afetadas pela intensa seleção genética,
visando maior produtividade, em virtude do acréscimo na demanda de nutrientes para a
síntese de carne e leite. Desta forma, a elevação das exigências por nutrientes deve ser seguida
de um aumento na ingestão dos mesmos. Os fatores de maior impacto na reprodução estão
principalmente relacionados com um consumo adequado e balanceado de energia, lipídeos,
vitaminas, minerais e proteína (PIRES e RIBEIRO, 2006).
A alimentação adequada dos animais destinados à reprodução deve ser realizada desde
o momento do desmame e perdurar durante todo o seu desenvolvimento. Dessa forma, estarão
assegurados os processos de maturação fisiológica e comportamental que se desenrolam até a
puberdade, o que, nos machos, refletirá em um encaminhamento normal da espermatogênese,
na expressão da libido e na qualidade do ejaculado (BROWN, 1994). Os níveis nutricionais
podem afetar o desenvolvimento, a função dos órgãos reprodutivos e acarretar alterações no
funcionamento do sistema endócrino envolvido com a reprodução (MAGGIONI et al., 2008).
Apesar da reprodução ser o processo fisiológico mais importante para a preservação
de qualquer espécie, a alocação de nutrientes para a reprodução não é prioridade no
organismo (PRADA e SILVA, 2005). Sendo a ordem preferencial na partição de nutrientes
dentro do organismo a descrita a seguir (BORGES, 2006):
1) metabolismo basal;
2) atividades;
3) crescimento;
4) reserva de energia;
5) prenhez;
6) lactação;
7) reserva de energia adicional;
8) ciclos estrais e início de prenhez;
9) reservas excedentes de energia.
17
A partição de nutrientes é um mecanismo pelo qual, em condições de baixa
disponibilidade de alimentos, o organismo animal determina uma ordem de prioridade para o
uso da energia disponível às funções orgânicas. Nesta ordem de importância, as funções
reprodutivas só serão ativadas quando o balanço quantidade e qualidade da dieta, reservas de
nutrientes, demanda para crescimento, metabolismo e outras funções forem supridas
(BORGES, 2006).
Os teores de minerais e vitaminas são sempre os primeiros fatores questionados
quando o desempenho reprodutivo de um rebanho está comprometido. As deficiências
marginais dos microminerais são de difícil diagnóstico por não apresentarem sinais clínicos
característicos, e, geralmente estão associados às interações com outros microminerais. Na
grande maioria, a deficiência se reflete nos índices zootécnicos com baixos índices de
produtividade, como baixo ganho de peso, altos índices de repetição de cio e abortos. As
deficiências de microminerais vão afetar não somente o desempenho reprodutivo, mas também a
imunidade e a produção de leite. Em rebanhos de corte, isso pode significar uma redução no
número de bezerros nascidos, decréscimos no número de bezerros desmamados e também menor
peso do bezerro à desmama. Embora a deficiência de minerais e vitaminas predisponha os
animais aos problemas reprodutivos, poucas informações estão disponíveis a respeito das
necessidades de nutrientes para um ótimo desempenho reprodutivo (BARBOSA e SOUZA,
2009).
A deficiência de vitamina A pode levar a baixa taxa de concepção, redução na duração
da gestação e aumento nos índices de retenção de placenta. Outros elementos estudados são o
selênio e a vitamina E, que possuem função antioxidante, prevenindo a peroxidação das
membranas celulares. A vitamina E está presente em altas concentrações nas forragens, no
entanto, essa vitamina se degrada rapidamente quando as forragens são conservadas. Já a
deficiência de selênio ocorre em regiões geográficas onde as concentrações desse mineral são
baixas (PIRES e RIBEIRO, 2006). Embora as falhas reprodutivas no macho proporcionem
maiores perdas econômicas quando comparado com a falha reprodutiva da fêmea, o que se
observa é o enfoque de quase que a totalidade dos trabalhos que relacionam o papel da
nutrição na reprodução apenas da fêmea.
2.2. Estresse térmico x Reprodução
A temperatura é um dos mais importantes fatores que interferem na reprodução em
geral e é o fator de maior importância na espermatogênese. Temperaturas corporais elevadas,
em decorrência de altas temperaturas do ambiente ou pirexia por doenças, levam a
18
degeneração testicular reduzindo o número de espermatozóides normais e férteis na
ejaculação (JAINUDEEN e HAFEZ, 2004).
O testículo tem por funções básicas sintetizar hormônios e realizar a
espermatogênese. Esta última é um processo longo e sensível que exige manutenção da
temperatura testicular de 2 a 6°C abaixo da temperatura corporal para que sejam produzidos
espermatozóides férteis (GABALDI e WOLF, 2002). Pequenos aumentos na temperatura
testicular, ainda que menores que a temperatura corporal, causa acentuado distúrbio na
espermatogênese (BARTH e BOWMAN, 1994), sendo prejudicial tanto nas etapas de
formação dos espermatozóides como sobre os espermatozóides já formados e em trânsito pelo
epidídimo (MIES FILHO, 1982).
Com a elevação da temperatura corporal, a espermatogênese sofre um efeito deletério,
podendo ficar completamente reduzida, como é observado em animais criptorquídicos ou em
indução experimental (insulação escrotal). É sabido que a elevação da temperatura ambiental
altera o mecanismo de termorregulação, sendo esta a principal causa de subfertilidade e
infertilidade em reprodutores, e que ocorre principalmente em animais que vivem em
condições climáticas desfavoráveis (GABALDI e WOLF, 2002). Uma provável explicação
para a influência da temperatura nos testículos de mamíferos seria que os mesmos trabalham
no limite da hipóxia, pois o aumento na temperatura local resulta em aumento da taxa
metabólica e, consequentemente, no aumento na demanda por oxigênio (BARTH e
BOWMAN, 1994), de forma que a vascularização sanguínea testicular não consegue supri-la
(SETCHELL, 1998).
Considera-se que os animais estão expostos a estresse térmico quando a temperatura
do ambiente estiver acima da zona de conforto térmico e há necessidade de gasto de energia
para manutenção da temperatura corporal (BRIDI, 2009). Ainda não há consenso na literatura
sobre os limites para a zona de conforto térmico, mas comumente considera-se que para
taurinos a zona de conforto térmico encontra-se entre 0 e 26° C, já para zebuínos está entre 10
e 27°C (PEREIRA, 2005).
Animais que estejam fora da zona de conforto térmico apresentam redução na
fertilidade. Nichi (2003) encontrou maior porcentagem de defeitos espermáticos maiores em
animais da raça Simental, do que em animais da raça Nelore em amostras coletadas em
invernos e verões consecutivos. Dentro da raça Simental, foi encontrada maior porcentagem
de defeitos maiores na estação do verão, quando comparado com a estação de inverno. Na
estação de verão, também foi observado um maior porcentagem de defeitos maiores em
animais Simental, do que em animais Nelore.
19
2.3. Espécies Reativas de Oxigênio (EROs)
O oxigênio (O2) é um elemento essencial para a vida dos organismos aeróbios e sua
maior parte é utilizada para a geração de energia, a qual é liberada durante as oxidações
biológicas e armazenada pelas células na forma de ATP. O O2 atua como um receptor final de
elétrons na cadeia respiratória mitocondrial, uma consequência direta deste processo é que
como intermediário se formam várias moléculas com diferentes graus de oxidação, algumas
das quais podem também entregar um dos elétrons ao O2 e produzir intermediários
parcialmente reduzidos, tais como ânion superóxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila
entre outros (VILLA-ARCILLA e CEBALLOS-MARQUEZ, 2007).
Aproximadamente 95% do oxigênio é consumido durante o metabolismo aeróbico,
sendo utilizado nas mitocôndrias para produção de energia (o O2 sofre uma redução
tetravalente, resultando em formação de água), o restante não é completamente oxidado em
água, produzindo radicais livres, que são tóxicos (LEITE e SARNI, 2003).
Radicais livres podem ser definidos como qualquer molécula ou átomo que tenha um
ou mais elétrons desemparelhado em sua última camada eletrônica (HALLIWELL e
GUTTERIDGE, 1984; SHARMA e AGARWAL, 1996), conferindo a estes, alta reatividade,
por tenderem a acoplar o elétron não pareado com outro que esteja presente em estruturas
próximas à sua formação (LEITE e SARNI, 2003). Eles podem ser formados pela perda ou
ganho de um único elétron de uma substância não radical (VANNUCCHI et al., 1998).
Espécies reativas de oxigênio (EROs) são produtos intermediários do metabolismo
normal do oxigênio, ou ainda de situações não fisiológicas. Embora os termos EROs e
radicais livres sejam comumente usados para descrever uma molécula de conduta instável,
nem toda EROs é um radical livre (TREMELLEN, 2008). As EROs são moléculas altamente
reativas quando comparadas aos outros radicais livres (SIKKA, 1996).
As EROs podem ter origem endógena ou exógena. Do ponto de vista endógeno, como
visto anteriormente, a cadeia respiratória mitocondrial é uma fonte de EROs durante a
transferência de elétrons. Também nos processos de fagocitose, as relações de desintoxicação
onde intervem o citocromo P-450 e a síntese dos derivados do ácido araquidônico, entre
outras são reações geradoras de EROs. Dentro das fontes exógenas se encontram a radiação
ultravioleta (UV), a exposição ao ozônio, intoxicação por herbicidas, o abuso de suplementos
minerais e o calor excessivo (VILLA-ARCILLA e CEBALLOS-MARQUEZ, 2007).
As EROs que mais implicam na biologia reprodutiva incluem o ânion superóxido
(O2-), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (OH-) (SIKKA, 1996;
AGARWAL e ALLAMANENI, 2004; MANEESH e JAYALEKSHMI, 2006).
20
2.3.1 Ânion superóxido (O2-)
O ânion superóxido (O2-) é gerado a partir da molécula do oxigênio pela adição de um
elétron (Figura 1), sendo sua formação espontânea, que ocorre próxima à membrana
mitocondrial interna, através da cadeia respiratória (NORDBERG e ARNÉR, 2001). Embora
seja um radical livre, não consegue penetrar em membranas lipídicas, ficando restrito ao
compartimento onde é produzido. Apesar de ser considerado pouco reativo, têm sido
observadas lesões biológicas secundárias aos sistemas geradores de O2 (FERREIRA e
MATSUBARA, 1997).
O ânion superóxido pode ser convertido diretamente ou indiretamente através da ação
enzimática ou catalisado por metais em EROs secundários como peróxido de hidrogênio ou
no radical hidroxila (TREMELLEN, 2008).
O2 + e- O2
-
Figura 1 - Formação do ânion superóxido.
2.3.2. Peróxido de hidrogênio (H2O2)
Apesar de não ser um radical livre, pela ausência de elétrons desemparelhados na
última camada (TREMELLEN, 2008), o peróxido de hidrogênio (H2O2) é um metabólito do
oxigênio extremamente deletério, pois participa como intermediário da reação que produz
outra EROs, como o radical hidroxila (OH-). O H2O2 se forma a partir da dismutação do ânion
superóxido em uma reação catalisada pela enzima superóxido dismutase (SOD)
(Figura 2) (FERREIRA e MATSUBARA, 1997). Além disso, o H2O2 tem meia vida longa e é
capaz de atravessar membranas biológicas (NORDBERG e ARNÉR, 2001), podendo reagir
com proteínas ligadas ao Fe ++, sendo dessa maneira altamente tóxico para as células
(FERREIRA e MATSUBARA, 1997).
Uma vez produzido, o H2O2 é removido por um dos três sistemas de enzimas
antioxidantes como a catalase, a glutationa peroxidase e as peroxiredutases (NORDBERG e
ARNÉR, 2001).
2O2- + 2H+ H2O2 + O2
Figura 2 – Formação do peróxido de hidrogênio (H2O2).
21
2.3.3. Radical hidroxila (OH-)
O radical hidroxila se forma no organismo a partir de H2O2 em uma reação catalisada
na presença de íons metálicos (Fe++ ou Cu+), que é conhecida por reação de Fenton (Figura 3).
O radical hidroxila é considerada a EROs mais reativa e prejudicial em sistemas
biológicos, capaz de subtrair átomos de hidrogênio de qualquer molécula biológica (DNA,
lipídios e proteínas) (NORDBERG e ARNÉR, 2001). Sua alta reatividade é confirmada com
sua combinação extremamente rápida a metais e outros radicais no próprio sítio onde é
produzido (FERREIRA e MATSUBARA, 1997) e sua vida muito curta quase que o impede
de ser sequestrado do organismo (BARREIROS et al. 2006). Assim, se o radical hidroxila for
produzido próximo ao DNA, e a este DNA estiver fixado um metal, poderão ocorrer
modificações nas bases purínicas e pirimidínicas, levando a inativação ou mutação do DNA.
Além disso, o radical hidroxila pode inativar varias proteínas (enzimas e membrana celular)
ao oxidar seus grupos sulfidrilas (-SH) a pontes de sulfeto (-SS). Podendo também iniciar a
oxidação dos ácidos graxos poliinsaturados das membranas celulares (FERREIRA e
MATSUBARA, 1997).
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH-
Figura 3 – Formação do radical hidroxila; Reação de Fenton.
2.4. Estresse oxidativo
Considera-se estresse oxidativo os danos causados as estruturas das biomoléculas
(DNA, lipídios, carboidratos e proteínas) além de outros componentes celulares, devido a um
desbalanço entre a produção de EROs e a sua eliminação por antioxidantes. Pode ser causado
por uma redução na quantidade de antioxidantes nos sistemas de defesa celular ou por uma
elevada produção de EROs (SHARMA e AGARWAL, 1996; SIKKA, 1996).
2.5. Estresse oxidativo x Espermatozóides
A produção de espécies reativas ao oxigênio (EROs) pelos espermatozóides é um
processo fisiologicamente normal. No entanto, um desbalanço entre a produção de EROs e a
capacidade de eliminá-las é prejudicial ao espermatozóide e está associada com infertilidade
nos machos (SHARMA e AGARWAL, 1996).
Inúmeras pesquisas têm sido realizadas relatando os efeitos do estresse oxidativo sobre
as células espermáticas (JONES e MANN, 1977; AITKEN et al., 1989; AITKEN e KRAUSZ,
2001; ZALATA et al., 2004).
22
Os espermatozóides, diferente de outras células, são únicos em estrutura, função e
susceptibilidade aos danos da lipoperoxidação. As células espermáticas são sensíveis a lesões
peroxidativas devido à grande quantidade de ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) presentes
em sua membrana (SHARMA e AGARWAL, 1996). Estes AGPI dão à membrana plasmática
do espermatozóide a fluidez necessária para participar na fusão de membranas nos eventos
associados à fertilização (AITKEN e KRAUSZ, 2001). As EROS atacam a cadeia lipídica em
sítios susceptíveis como o grupo metilênico alílico, convertendo-o em novo centro radical
livre. O carbono radicular facilmente adiciona oxigênio gerando o radical lipídio-peroxila, que
podem facilmente atacar as proteínas de membrana, produzindo danos à célula
(BARREIROS et al., 2006). Estas lesões induzem a geração de EROs, que atacam as duplas
ligações dos ácidos graxos insaturados, iniciando uma reação em cadeia de peroxidação
lipídica, levando a perda da fluidez da membrana e consequente perda da função espermática
(AITKEN e KRAUSZ, 2001), sendo os grandes responsáveis por danos à viabilidade e
fertilidade de espermatozóides (ALVAREZ e MORAES, 2006). A lipoperoxidação causa
extensivas alterações estruturais, rápida e irreversível perda de motilidade, grande mudanças
metabólicas e altas taxas de passagem nos constituintes intracelular espermático (JONES e
MANN, 1977).
A peroxidação lipídica tem efeitos múltiplos no metabolismo. Segundo
De Lamirande et al. (1997) a ação das EROs pode resultar em diminuição na motilidade
espermática, na viabilidade espermática e aumento de defeitos morfológicos de cauda, o que
promove efeitos deletérios para a capacitação espermática e reação acrossomal. No entanto,
EROs podem promover efeitos benéficos na função espermática dependendo da natureza e da
concentração envolvida (SHARMA e AGARWAL, 1996), pois baixos níveis de produção de
EROs pelo espermatozóide têm um papel positivo na preparação para a fertilização (em
especial na capacitação), uma vez que o próprio peróxido de hidrogênio estimula a reação
acrossômica e a hiperativação espermática (DE LAMIRANDE et al., 1997), auxiliando assim,
no trânsito dos espermatozóides através do cumulus e da zona pelúcida.
Entretanto a alta produção de EROs pode conduzir à peroxidação da membrana
acrossomal espermática e diminuir a sua atividade (ZALATA et al., 2004) prejudicando a
fusão do espermatozóide com o oócito (AITKEN et al., 1989), o que compromete seriamente
a integridade funcional dessas células.
A peroxidação lipídica pode ser definida como uma deterioração oxidativa dos AGPI
(MANEESH e JAYALEKSHMI, 2006), sendo representada como uma reação em cadeia
compostas pelas etapas de iniciação, propagação e terminação. A reação se inicia com o
23
sequestro um átomo de hidrogênio dos AGPI da membrana celular por parte do OH-,
formando assim um radical livre que reage com o O2, gerando um radical peroxila (ROO-).
O ROO- ao reagir com as cadeias de ácidos graxos vizinhas, libera hidrogênio e forma
peróxidos (ROOH) instáveis. Estes peróxidos se estabilizam sequestrando átomos de
hidrogênio de outros ácidos, iniciando dessa maneira uma reação de propagação em cadeia.
A propagação dos danos peroxidativos é catalisada pela presença de metais de transição, tais
como o ferro ou cobre, que podem mudar seu estado de valência por ganhar ou perder elétrons
(WATHES et al., 2007).
As EROs são produzidas por uma variedade de componentes do sêmen, incluindo
espermatozóide com morfologia anormal ou imóvel, leucócitos e até espermatozóides com
morfologia normal, mas com funcionalidade anormal. Já o plasma seminal e espermatozóides
com motilidade normal não produzem altos níveis de EROs em condições fisiológicas
(SHARMA e AGARWAL, 1996).
2.6. Sistema de defesas antioxidantes
Os radicais livres podem ocasionar danos às biomoléculas e, consequentemente, afetar
a saúde do organismo animal. Os danos mais graves são aqueles causados ao DNA e RNA. Se
a cadeia é quebrada, pode ser reconectada em outra posição, alterando assim, a ordem de suas
bases. Este é um processo básico da mutação e o acúmulo de bases danificadas pode levar a
oncogênese. Uma enzima que tenha seus aminoácidos alterados pode perder sua atividade ou,
ainda, assumir atividade diferente. Ocorrendo na membrana celular, a oxidação de lipídios
interfere no transporte ativo e passivo normal através da membrana, ou ocasiona a ruptura
dessa, levando à morte celular (BARREIROS et al., 2006).
Os EROs são continuamente produzidos in vivo, consequentemente, os organismos
desenvolveram sistemas antioxidantes de defesa, para proteção, como também sistemas
de reparação, que previnem o acúmulo de moléculas alteradas por oxidação
(VANNUCCHI et al., 1998). As proteções conhecidas do organismo contra EROs abragem o
sistema de proteção enzimática ou por micromoléculas, que podem ter origem no próprio
organismo ou são adquiridas através da dieta (BARREIROS et al., 2006).
Entre os antioxidantes, destaca-se alguns nutrientes, tais como a vitamina E e o
β-caroteno, várias enzimas e seqüestradores não enzimáticos, os quais quase sempre atuam
em sinergismo, localizados tanto intra como extracelularmente (VANNUCCHI et al., 1998).
O plasma seminal é dotado de diversos mecanismos antioxidantes para proteger o
espermatozóide das EROs, pois ele contém enzimas antioxidantes como a superóxido
24
dismutase (SOD), o sistema glutationa peroxidase/redutase (GPx/GRD) e a catalase (CAT).
Também contém inúmeros antioxidantes não enzimáticos, como o ascorbato, urato,
α-tocoferol, piruvato, glutationa, taurina e hipotaurina (SALEH e AGARWAL, 2002).
O termo antioxidante pode ser definido como qualquer substância que, quando
presente em baixas concentrações, quando comparadas com as de um substrato oxidável, que
retarda ou previne significativamente a oxidação desse substrato (GUTTERIDGE, 1995).
Em condições normais, as células somáticas contêm substâncias antioxidantes em seu
citoplasma. No entanto, o espermatozóide, durante o processo de maturação, perde a maioria
de seu citoplasma e com isso, perde parte dos antioxidantes endógenos, ficando mais
susceptível a ação das EROs (SIKKA, 1996).
Os mecanismos de defesa antioxidante incluem três níveis de proteção: prevenção,
interceptação e reparação (SIES, 1993), sendo:
Prevenção – prevenir a formação de EROs é a primeira linha de defesa contra os danos
oxidativos. Um exemplo é a quelação dos íons metálicos, íons de ferro e cobre
em particular, prevenindo o inicio da reação em cadeia;
Interceptação – os EROs têm a tendência de reagir em cadeia, sendo o papel da interceptação a
quebra dessa reação em cadeia pela formação de produtos finais não radicais;
Reparação – em algumas situações os danos causados pela oxidação podem ser reparados. No
entanto, os espermatozóides são incapazes de reparar os danos causados pelas
EROs, devido a falta do sistema de enzimas citoplasmático, tornando o
espermatozóide uma célula única em susceptibilidade.
2.6.1. Sistema de proteção enzimático
O sistema de defesa enzimático atua como inibidor preventivo, retardando a fase de
iniciação, impedindo a geração de EROs ou sequestrando essas espécies, impedindo sua
interação com os alvos celulares. São conhecidos três sistemas enzimáticos antioxidantes
principais: superóxido dismutase, glutationa e catalase (NORDBERG e ARNÉR, 2001).
2.6.1.1. Superóxido Dismutase (SOD)
As superóxido dismutase (SOD) são a primeira linha de defesa contra os danos
oxidativos do O2, sendo a membrana permeáveis as SOD. (VILLA-ARCILLA e
CEBALLOS-MARQUEZ, 2007).
25
A SOD catalisa a reação entre os íons superóxido e o hidrogênio, em que duas
moléculas de O2- formam uma molécula de O2 e uma de H2O2 (Figura 4), sendo esta última
posteriormente destruída pela catalase ou pelo sistema glutationa peroxidase.
2O2- + 2H+
SOD H2O2 + O2
Figura 4. Reação de dismutação do íon superóxido catalisada pela superóxido dismutase (SOD) e formando peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio (O2).
A decomposição do radical ânion superóxido ocorre naturalmente, porém, por ser
uma reação de segunda ordem, necessita que ocorra a colisão entre duas moléculas de O2- de
forma que há necessidade de maior concentração do ânion superóxido. A presença da enzima
SOD favorece essa dismutação, tornando a reação de primeira ordem, eliminando a
necessidade de colisão entre as moléculas, permitindo a eliminação do O2- mesmo em baixas
concentrações (BARREIROS et al., 2005). A SOD transforma um radical altamente reativo
(O2-) em outro menos reativo (H2O2). Outro papel importante das SOD é proteger as
desidratases (ácido dihidroxil dehidratase, aconitase, 6-fosfogluconase dehidratase e
fumarases A e B) contra a inativação pelo radical superóxido. Em humanos foram
identificadas três formas de SOD, a citosólica (dependente de cobre e zinco), a mitocondrial
(dependente de magnésio) e uma extracelular (dependente de cobre e zinco)
(VILLA-ARCILLA e CEBALLOS-MARQUEZ, 2007).
Beconi et al. (1991) encontraram correlação positiva entre a atividade de SOD e
motilidade progressiva em amostras com diferentes qualidades seminais a fresco e
congeladas, onde as amostras que tinham maior atividade de SOD apresentavam maior
motilidade progressiva. Segundo os autores, a atividade de SOD pode ser usada como
indicador do nível de dano à membrana plasmática, bem como da viabilidade espermática.
2.6.1.2. Catalase (CAT)
A catalase é umas das enzimas mais eficientes conhecidas, pois não pode ser saturada
por nenhuma concentração de seu substrato. A catalase age catalisando a reação que
transforma duas moléculas de H2O2 em duas moléculas de água (H2O) e uma de oxigênio (O2)
(NORDBERG e ARNÉR, 2001) (Figura 5). A catalase e a superóxido dismutase estão
presentes no plasma seminal e na célula espermática, sendo produzida nos testículos,
epidídimos e glândulas acessórias (PASQUALOTTO et al., 2000).
Segundo Pasqualotto et al. (2006) homens com infertilidade apresentaram baixas
concentrações de SOD e CAT no plasma seminal.
26
2H2O2 CAT
2H2O + O2
Figura 5 – Ação da catalase (CAT) na inativação do peróxido de hidrogênio.
2.6.1.3. Glutationa peroxidase (GPx)
As glutationas peroxidases são de uma família de enzimas que podem ser divididas em
dois grupos, as selênio dependente e as selênio independentes. As do grupo selênio
dependentes podem decompor o H2O2 em vários hidro ou lipoperóxidos. A presença do
selênio na enzima (seleno-cisteína) explica a importância desse metal e sua atuação como
antioxidante nos organismos vivos (BARREIROS et al., 2006). Nesta reação catalisada pela
glutationa peroxidase (GPx), a glutationa reduzida (GSH) é usada como substrato para
metabolizar o H2O2 resultando em H2O e glutationa oxidada (GSSG) (Figura 6). A glutationa
oxidada, por sua vez, pode ser novamente reduzida a GSH pela enzima glutationa redutase
(GRD), dependendo do NAHDP (VANNUCCHI et al., 1998).
2GSH + H2O2 GPx
GSSG + 2 H2O
Figura 6 – Ação da Glutationa peroxidase (GPx) na inativação do peróxido de hidrogênio.
2.7. Selênio
Os elementos minerais estão em todas as células e tecidos corporais em uma grande
variedade de funções, dentre elas destacam-se as funções estruturais, catalíticas e reguladoras
(BARBOSA e SOUZA, 2009). Durante as ultimas décadas, a compreensão da importância do
selênio para os bovinos aumentou significativamente. Provavelmente nenhum dos minerais
envolvidos na nutrição animal sofreu tantas mudanças de conceitos, quanto a sua real
importância na nutrição dos animais (CARVALHO et al., 2003).
Por muitos anos, o interesse biológico no selênio foi restrito ao seu efeito tóxico aos
animais. Duas doenças de bovinos que ocorriam naturalmente no norte dos Estados Unidos,
foram identificadas como manifestações de envenenamento agudo e crônico por selênio,
respectivamente. Essas descobertas geraram estímulos às investigações do selênio em solos,
plantas e tecidos animais, com a perspectiva de determinar o nível mínimo para o consumo
tóxico e desenvolver praticas de prevenção e controle. Na década de 50 foi descoberto que o
selênio desempenhava papel essencial na fisiologia dos animais, apesar de estar presente em
baixas concentrações, quando comparado com outros elementos (UNDERWOOD e
SUTTLE, 1999). O selênio é um elemento essencial para várias funções do organismo, tais como
27
crescimento, reprodução, resposta imunológica, prevenção de várias doenças (distrofia muscular
nutricional, degeneração do miocárdio, retenção de placenta) e manutenção da integridade das
células e dos tecidos (CARVALHO et al., 2003).
Por volta de 1973, outro papel bioquímico específico do selênio surgiu, com a
descoberta da glutationa peroxidase (GPx), tornando-se um elemento essencial e importante
na reprodução animal (UNDERWOOD e SUTTLE, 1999). O selênio é um componente
essencial de varias enzimas, atuando como co-fator da GPx, que é uma enzima citoplasmática
antioxidante (ALVARES e MORAES, 2006) e por essa razão, protege o tecido celular contra
o estresse oxidativo, atuando na desintoxicação do peróxido de hidrogênio e de
hidroperóxidos de lipídios (NORDBERG e ARNÉR, 2001).
O selênio apresenta versatilidade na capacidade de oxi-redução no centro ativo da
enzima GPx, uma característica fundamental para sua ação na eliminação de peróxidos
(ARTEEL e SIES, 2001), e ainda, aumenta a disponibilidade de glutationa (GSH) que é uma
dos mais abundantes antioxidantes intrínsecos, que ajudam na prevenção da lipoperoxidação e
os componentes dos danos celulares (HSU e GUO, 2002).
No entanto, em muitos lugares do mundo a dieta com selênio para os animais é
limitada. De uma maneira em geral, as forrageiras são pobres em microminerais essenciais
para a produtividade adequada, deste modo, se a demanda por esses minerais não for suprida
através de uma correta suplementação mineral, o desempenho dos animais poderá ficar
comprometido (BARBOSA e SOUZA, 2009).
Entre as doenças causadas pela deficiência de selênio encontra-se a distrofia muscular
nutricional ou doença do músculo branco, que é uma enfermidade degenerativa caracterizada
por afetar animais de produção com rápido desenvolvimento corporal, ocasionando severa
lesão muscular e consequente decúbito. Dietas deficientes em selênio predispõe a
lipoperoxidação tecidual intensa levando a calcificação das fibras musculares, umas vez que o
selênio é um componente da enzima GPx, responsável pela neutralização dos efeitos tóxicos
do EROs (NRC, 1996).
No Brasil, para animais criados sob pastejo o selênio não se encontra facilmente
disponível, pois como a grande maioria dos nossos solos são altamente lixiviados associado
ao baixo teor de matéria orgânica, o selênio se perde facilmente (CARVALHO et al., 2003).
Sendo assim, a suplementação com selênio traria efeitos benéficos, tanto na produção como
na reprodução desses animais (SURAI et al., 1998).
O selênio pode ser tanto um elemento essencial quanto tóxico, dependendo da
concentração nas células. Em touros, o selênio se encontra nos testículos e epidídimo, e neles
28
exerce importantes funções metabólicas (CARVALHO et al., 2003), sendo necessário para o
desenvolvimento normal do espermatozóide e sua deficiência tem sido associada à redução no
número de espermatozóides vivos e aumento na ocorrência de patologias de cabeça, cauda e a
danos na arquitetura da peça intermediária do espermatozóide, o que acaba comprometendo
sua motilidade e capacidade de fertilização (SURAI, 20022 citado por GÓES, 2008). Segundo
Sergerson e Johnson (1980), a suplementação com selênio em bovinos, aumenta os níveis
desse mineral nos testículos e no epidídimo.
Em galos, a inclusão de selênio na dieta aumentou a atividade de glutationa peroxidase
no fígado, espermatozóides e plasma seminal, consequentemente observou-se diminuição da
suscetibilidade a peroxidação lipídica dos espermatozóides e tecidos, sendo o resultado mais
expressivo no sêmen armazenado do que a fresco (SURAI et al., 1998).
2.8. Criopreservação de sêmen
A utilização de biotecnologias no processo de reprodução animal vem gerando
diversos benefícios para as diferentes espécies. Dentre estas biotecnologias, a criopreservação
de sêmen se destaca por gerar inúmeras vantagens, principalmente entre os animais de
produção (diminuição no custo de aquisição de reprodutores geneticamente superiores,
armazenamento de material genético por tempo indeterminado, controle de doenças
reprodutivas, utilização de reprodutores mesmo após a perda da capacidade reprodutiva dos
mesmos, ou mesmo depois de mortos), no entanto, o sucesso desta técnica depende da
viabilidade do sêmen criopreservado para a fertilização do oócito (WATSON, 2000).
O objetivo da congelação do sêmen é a produção de um banco de células
espermáticas utilizadas principalmente para a inseminação artificial, sendo uma importante
ferramenta para potencializar a genética do macho. No entanto, as estruturas espermáticas
podem sofrer mudanças anatômicas ou bioquímicas durante o processo de criopreservação
(AMIRAT et al., 2004), as quais acabam causando um impacto limitante na indústria da
inseminação artificial (GARNER et al., 2001). Conseqüentemente, o intuito dos protocolos de
congelação visa minimizar esses efeitos deletérios aos espermatozóides (AMIRAT et al., 2004).
O processo de criopreservação promove a diminuição da motilidade e da viabilidade
espermática, e também diminuição da capacidade fecundante do sêmen criopreservado, e que
ao ser utilizado, apresenta menores taxas de concepção, quando comparado ao sêmen fresco
(MAXWELL e WATSON 1996; WATSON, 2000).
2 SURAI, P.F. Natura amtioxidants in avian nutricion and reproduction. Nottingham: Nottingham University Press, 2002. 615p.
29
Lesões celulares podem ser causadas diretamente, pelo processo de criopreservação
afetando organelas através da ruptura de membranas, ou indiretamente, alterando as funções
celulares através do processo metabólico (HOLT, 2000; WATSON, 2000).
As diferenças de temperatura e osmolaridade entre o meio de congelamento e os
espermatozóides promovem grande variação no volume de água celular, gerando um
mecanismo de estresse na membrana celular. A reorganização da membrana plasmática dos
espermatozóides parece perturbar as ligações lipídio-lipidio ou lipídio-proteina necessárias
para o perfeito funcionamento da membrana (WATSON, 2000). A fase de transição durante o
congelamento altera a estrutura da membrana plasmática criando regiões livres de partículas
proteícas, reduzindo sua proteção como consequência da desestabilização a membrana torna-
se permeável aos íons de cálcio, ocorrendo reação acrossômica e capacitação desordenada e
precipitada (HOLT, 2000).
Durante o processo de congelação também ocorrem danos provocados pelas baixas
temperaturas a que são submetidos os espermatozóides: formação de cristais de gelo
intracelulares, aumento da concentração intracelular de solutos e modificações
correlacionadas, resultantes da desidratação celular (HOLT, 2000).
A congelabilidade e a sobrevivência pós-descongelamento do sêmen criopreservado
varia entre as espécies e entre machos da mesma espécie, sendo a aplicação do procedimento
mais bem sucedida em bovinos que em outras espécies. Essas variações individuais
e interespecíficas estão relacionadas às características biofísicas e bioquímicas das
membranas dos espermatozóides (HAFEZ, 2004).
O processamento de sêmen para resfriamento ou congelação induz a produção de
EROs em diversas fases. Segundo Santiani, 20033 citado por Ruiz et al., 2007, a produção de
EROs ocorre principalmente durante o período de resfriamento, alcançando valores máximos
quando o sêmen é mantido a 5° C.
Já, Bilodeau et al. (1999) encontraram maior produção de EROs durante a congelação,
e consequentemente, maior dano celular. A criopreservação promove uma condição
de estresse causando rearranjos na membrana plasmática dos espermatozóides, formando
pontos vulneráveis alterando sua permeabilidade e tornando-os mais susceptíveis a
peroxidação lipídica, causada pelo estresse oxidativo devido à produção excessiva de radicais
livres, os quais estão associados com declínio da fertilidade do sêmen depois de estocado
(MAXWELL e WATSON, 1996). Algumas explicações para o aumento na produção de
3 Santiani, A. 2003. Criopreservación de sêmen ovino: efecto de la adición de antioxidantes al diluyente. Tesis de Maestría em Ciências. Temuco, Chile: Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. 95p.
30
EROs durante a criopreservação seriam a presença de substâncias pró-oxidantes nos
diluidores (BILODEAU et al., 2002) e também a diminuição da atividade e da concentração
das enzimas antioxidantes (ALVAREZ e STOREY, 1992).
O processo de descongelamento também causa danos oxidativos à célula, decorrente
do rápido aumento na utilização do oxigênio pelos espermatozóides, após o período de
interrupção no metabolismo, determinando maior produção de EROs (BALL et al., 2001).
Buscando melhora na preservação da integridade celular e na qualidade seminal, a
suplementação com antioxidantes, tanto na dieta (HATAMOTO, 2004; GÓES, 2008) quanto
nos meio de congelamento de sêmen (BORGES, 2003), tem sido utilizadas para várias
espécies, entretanto, os resultados ainda são conflitantes. No entanto, nenhum trabalho
envolvendo os possíveis efeitos benéficos da suplementação com selênio sobre a eficiência
reprodutiva dos reprodutores bovinos criados em regiões tropicais foi encontrado. Dessa
maneira, o presente estudo visou avaliar o efeito da suplementação com selênio sobre a
qualidade seminal e a integridade da membrana espermática do sêmen a fresco e pós-
congelamento de reprodutores bovinos da raça Brangus criados em regiões tropicais.
Este estudo deu origem a dois artigos, apresentados a seguir, os quais foram
elaborados segundo as normas da Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal.
31
2.9. Referências bibliográficas
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36
3. Capitulo 1
Suplementação oral com selênio para touros Brangus a pasto: integridade da
membrana espermática e qualidade do sêmem fresco
Oral supplementation with selenium for Brangus bulls in pasture: spermatic membrane
integrity and fresh semen quality
Resumo
O experimento foi realizado na Fazenda Sereno, localizada em Jaciara-MT, objetivando
avaliar a integridade da membrana plasmática e qualidade seminal de bovinos jovens
mantidos em pastejo contínuo em gramínea mombaça recebendo suplementação
concentrada com adição de selênio. Foram utilizados 16 touros Brangus, distribuídos
em dois tratamentos: grupo controle (GC, suplemento concentrado) e grupo selênio
(GS, suplemento concentrado com adição de 0,1mg/kg/MS da dieta, de selênio). O
experimento teve duração de 75 dias, sendo os animais suplementados por 60 dias e
realizadas quatro avaliações andrológicas durante o período. Em cada coleta os animais
foram pesados em tronco com balança digital e mensurada a circunferência escrotal e
consistência testicular. Para a coleta de sêmen foi utilizada a técnica da eletroejaculação,
sendo o sêmen coletado em tubo graduado, onde se aferiu o volume, coloração e
aspecto. Em seguida foram realizados os exames imediatos (motilidade, vigor e
turbilhonamento), confeccionadas lâminas coradas e coletadas alíquotas para exames
complementares. O experimento foi instalado em delineamento inteiramente
casualizado com medidas repetidas no tempo e os dados analisados através de ANOVA
com nível de significância de 10%, com auxílio do programa estatístico SAS. Foi obtido
efeito da suplementação para as variáveis MOT (p= 0,0183), VIG (p= 0,0125) e HIPO
(p= 0,0287), sendo GC superior ao GS para MOT e VIG e GS superior ao GC para
37
HIPO, para as demais variáveis não foi observado efeito da suplementação. A
suplementação com selênio reduziu a motilidade e o vigor espermático, entretanto
melhorou a integridade da membrana espermática de bovinos Brangus.
Palavras-chaves: antioxidantes, bovinos, estresse oxidativo, lipoperoxidação
Summary
The experiment was realized in Sereno Farm, Jaciara-MT, and aimed to evaluate the
plasmatic membrane integrity and seminal quality of young bovines fed with
experimental diet supplemented with selenium. Sixteen Brangus bulls were used,
distributed in two treatments: controlled group (GC, intent supplement) and selenium
group (GS, concentrated supplement with selenium addition of 0.1mg/kg/DM on diet).
Experiment had duration of 75 days, being animals supplemented per 60 days and
accomplished four andrologics evaluations during period. In each collection the animals
had been weighed in trunk with digital scale and were measured scrotal circumference
and testicular consistency. For semen collection eletroejaculation technique was used
and the semen was collected in graduated pipe, where it was observed the volume,
coloration and aspect. After that, was realized immediate exams (spermatic motility and
vigor and mass moviment) and had been confectioned color blades and aliquot was
collected for complementary exams. Randomised complete design with repeated
measures in time were used and results analyzed through ANOVA with a significance
level of 10% with statistical program SAS. For fresh semen was found supplementation
effect for variable MOT (p= 0.0183), VIG (p= 0.0125) and HIPO (p= 0.0287), being
GC superior to the GS for MOT and VIG and GS being superior to the GC for HIPO. In
the experimental conditions present are concluded that the supplementation with
38
selenium reduced the motility and the spermatic vigor, however improved the spermatic
membrane integrity of Brangus bulls.
Keywords: antioxidants, bovine, oxidative stress, lipid peroxidation
39
Introdução
Cerca da metade do rebanho brasileiro de corte localiza-se nos cerrados do
Brasil Central, região onde os animais recebem com máxima intensidade os efeitos do
clima, o que proporciona significativo impacto na fertilidade dos rebanhos. A
degeneração testicular é a mais importante causa de subfertilidade e infertilidade em
touros que realizam serviço a campo no Brasil Central (Gabaldi & Wolf, 2002),
prejudicando a normalidade da função testicular e afetando negativamente a capacidade
fecundante dos espermatozóides produzidos (Garcia, 2004).
Uma provável explicação para a influência da temperatura nos testículos de
mamíferos seria que os mesmos trabalham no limite da hipóxia. O aumento na
temperatura local resulta em aumento da taxa metabólica e, consequentemente, no
aumento na demanda por oxigênio (Barth & Bowman, 1994) de forma tal que a
vascularização sanguínea testicular não consegue suprí-la, o que favorece o aumento da
produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) (Setchell, 1998).
A produção de EROs pelos espermatozóides é um processo fisiológico normal.
Entretanto, quando há um desbalanço entre a produção e inativação dos EROs, tem-se o
estresse oxidativo, que provoca danos às estruturas das biomoléculas de DNA, lipídios,
carboidratos e proteínas (Sharma & Agarwal, 1996).
Em condições normais, as células somáticas contêm substâncias antioxidantes
em seu citoplasma. No entanto, o espermatozóide, durante o processo de maturação,
perde a maioria de seu citoplasma, que associado ao fato da membrana espermática ser
rica em ácidos graxos poliinsaturados, torna-o altamente susceptível à peroxidação
lipídica (Villa-Arcilla & Ceballos-Marquez, 2007). Consequentemente, os organismos
desenvolveram sistemas antioxidantes para proteger o espermatozóide das EROs
40
(Nordberg & Arnér, 2001). O selênio é um elemento essencial para várias funções do
organismo, tais como crescimento, reprodução, prevenção de doenças e manutenção da
integridade das células e tecidos (Carvalho et al, 2003). O selênio atua como co-fator da
glutationa peroxidase, e por essa razão, protege o tecido celular contra o estresse
oxidativo, atuando na desintoxicação do peróxido de hidrogênio e de hidroperóxidos de
lipídios (Nordberg & Arnér, 2001).
Dada à importância dos efeitos climáticos sobre a fertilidade de reprodutores
bovinos e dos possíveis efeitos benéficos da suplementação com selênio, objetivou-se
com esse trabalho avaliar a influência da suplementação oral com selênio sobre a
qualidade seminal e integridade da membrana plasmática de touros Brangus criados no
Brasil Central, uma vez que, poucos estudos são encontrados na literatura relacionando
o efeito do mineral na eficiência reprodutiva dos reprodutores.
Material e Métodos
O experimento foi realizado na Fazenda Sereno - GAP, localizada no município
de Jaciara, distante 140 km de Cuiabá, Mato Grosso, no período de junho a setembro de
2008. O município de Jaciara encontra-se na altitude de 367m, latitude 15° 57’ 55” sul e
longitude 54° 58’ 06” oeste. O clima da região é tropical, sazonal, com duas estações
bem definidas, verão chuvoso (outubro a março) e inverno seco (abril a setembro). A
temperatura média anual é 28°C e pluviosidade média anual de 2000 mm
(Wikipédia, 2009).
41
Temperatura Ambiente - Jaciara/MT
0
5
10
15
20
25
30
35
2/6/2008
10/6/2008
17/6/2008
24/6/2008
1/7/2008
8/7/2008
15/7/2008
22/7/2008
29/7/2008
6/8/2008
13/8/2008
20/8/2008
27/8/2008
3/9/2008
10/9/2008
17/9/2008
Temperaturas Mínimas Temperaturas Máximas Temperaturas Médias
Data
ºC
Figura 1 – Dados metereológicos (temperatura mínima, máxima e média) da região de
Jaciara, MT - 02/06/2008 à 17/09/2008, Fonte: INMET, 2009.
Foram utilizados 16 touros da raça Brangus (5/8 Angus 3/8 zebu) com idade
média de dois anos e peso vivo médio inicial de 472 kg. Ao inicio do experimento os
animais foram submetidos ao controle de endoparasitas (Doramectina 1%, Dectomax®
Pfizer) e ectoparasitas (Cipermetrina e Ethion, Ciperthion®, Shering-Plough) sendo o
controle de ectoparasitas também realizado a cada coleta de dados.
A área experimental destinada aos animais foi constituída por dois piquetes de
7,35/ha cada, com Panicum maximum cv. Mombaça, os quais foram providos de
bebedouro e cocho para fornecimento do suplemento, cujas dimensões permitiam o
acesso de todos os animais simultaneamente.
Os animais foram mantidos em pastejo contínuo, recebendo diariamente
suplementação concentrada (Tabela 1).
42
Tabela 1. Composição percentual do suplemento fornecido aos animais em experimento, expresso com base na matéria natural
Ingrediente Quantidade (%)
Farelo de soja 27,50
Milho moído 67,25
Calcário 1,50
Enxofre 0,25
Uréia Pecuária 0,50
Sal mineral 88* 3,00
*Niveis de garantia por kg de suplemento mineral: Ca – 154g; F – 88g; Cu – 1700mg; S – 12g; Co – 200mg; Mn – 1300mg; Zn – 5000mg; I – 130mg; Se – 20mg; Mg – 6mg; Na – 130g.
Os suplementos foram formulados para apresentarem 21% de PB na matéria
natural, sendo fornecidos em quantidade equivalente a 4,5 kg/animal/dia, sempre as
11:00h, afim de se minimizar as interferências no comportamento de pastejo dos
animais. Foram coletadas amostras de forragem e do suplemento para posteriores
análises laboratoriais, as quais foram realizadas no Laboratório de Nutrição Animal da
FAMEV- UFMT (Tabela 2).
Tabela 2. Composição químico-bromatológica do suplemento concentrado e da forragem utilizada na alimentação dos animais experimentais com base na matéria seca
Nutriente Concentrado (%) Forragem (%)
Matéria seca (MS) 90,00 37,99
Proteína bruta (PB) 21,00 6,23
Fibra em detergente neutro (FDN) 29,40 67,57
Extrato etéreo (EE) 2,50 1,05
Matéria mineral (MM) 8,43 7,80
Os animais foram divididos aleatoriamente em dois lotes, os quais foram
submetidos aos tratamentos:
• GC= controle (suplementação concentrada sem adição de selênio)
• GS= selênio (suplementação concentrada com adição de selênio)
43
No concentrado fornecido aos animais do GS foi adicionado 0,1mg de Se/kg de
MS (tendo como fonte o selenito de sódio). Os animais passaram por um período de
adaptação de 10 dias aos piquetes e ao suplemento, antes do experimento. Durante o
período experimental, foram realizadas quatro coletas de dados, sendo estas nos dias
zero, 30, 60 e 75 (COL 1, COL 2, COL 3 e COL 4, respectivamente). Seria ideal que
fossem realizadas um maior número de coletas e com um menor intervalo entre coletas,
no entanto, isso não foi possível por se tratar de animais de uma propriedade comercial.
Adotou-se para dia 0 (D0) o dia anterior ao início da suplementação, a COL 4 foi
realizada com intuito de avaliar a existência de efeito residual.
Antes do início das coletas os animais foram pesados em tronco equipado com
balança digital. Em seguida foram contidos para realização do exame clínico exterior,
limpeza do exterior do pênis, palpação das glândulas acessórias, mensuração da
circunferência escrotal (CE) com fita métrica e avaliação da consistência testicular
(CONS) por palpação (1-duro; 5-mole).
Para a coleta de sêmen, foi utilizada a técnica de eletroejaculação por meio do
aparelho Eletrovet® (Eletro Veterinária Ltda), e o sêmen recolhido em tubo plástico
graduado, protegido de choque térmico e de luz. A análise do sêmen iniciava-se
imediatamente após a coleta, o volume (VOL), o aspecto, a coloração do ejaculado e
possíveis contaminações com urina foram aferidos no próprio tubo graduado onde o
sêmen era coletado. O turbilhonamento, motilidade e vigor espermático foram avaliados
no momento da coleta e as demais análises realizadas no LABRA/UFMT.
O turbilhonamento espermático (TURB) foi classificado em uma escala de 0-5,
onde 0 indica ausência de movimento e 5 intenso movimento de massa, através do
depósito de uma gota de sêmen em lâmina previamente aquecida, a qual foi observada
44
em microscópio óptico em aumento de 40x. A motilidade e o vigor espermáticos foram
mensurados através do depósito de uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula
previamente aquecidas e observadas em microscópio óptico em aumento de 100x. A
motilidade espermática (MOT) foi classificada numa escala de 0 a 100%, de acordo
com a proporção de espermatozóides móveis nos campos observados, sendo 0% para
nenhum espermatozóide móvel e 100% para todos os espermatozóides móveis. O vigor
espermático (VIG) foi analisado como intensidade do movimento espermático, numa
escala de 0-5, em que o valor zero indica ausência de movimento e 5 movimentos
intensos e contínuos (CBRA, 1998).
Para a avaliação da concentração espermática (CONC), foi diluída uma alíquota
de sêmen em solução de formol salina tamponada, na proporção de 1:200, sendo
realizada posteriormente a contagem das células em câmara de Neubauer, e a
concentração espermática expressa em milhões de espermatozóides por mL. Para
efetuar a análise de morfologia espermática, utilizou-se a amostra de sêmen diluída em
solução de formol salina tamponada. A morfologia foi avaliada em preparações úmidas
entre lâmina e lamínula, em aumento de 1000 vezes sob objetiva de imersão, em
microscópio de contraste de fase. Em cada preparação foram avaliadas 200 células, e
determinou-se o total de células normais e de anomalias (Barth & Oko, 1989). As
alterações foram agrupadas em defeitos menores (DEFME), defeitos maiores (DEFMA)
e defeitos totais (DEFTOT) (CBRA, 1998).
O teste de expansão hipo-osmótico (HIPO) foi realizado segundo a técnica
descrita por Jeyendran et al (1984) e avaliou a integridade da membrana espermática. O
exame baseia-se na observação de que espermatozóides cujas membranas estão íntegras
absorvem água, quando exposto a uma solução hipo-osmótica em relação ao meio
45
intracelular e são capazes de manter um gradiente osmótico, enquanto aqueles com
membranas lesadas não o fazem. Neste teste, os espermatozóides com membranas
íntegras exibem um enrolamento da cauda quando colocados em uma solução
hipo-osmótica em relação ao meio intracelular. O padrão de enrolamento de cauda
utilizado foi o descrito por Fonseca et al. (2005).
Para observar a reação acrossômica foi realizada a técnica de Harayama et al.
(1993) que consiste na coloração tripla dos espermatozóides capacitados. Esta técnica
possibilita a visualização de quatro padrões de coloração espermática:
• espermatozóides vivos com acrossoma intacto (Classe 1, TRI 1);
• espermatozóides vivos com reação acrossomal (Classe 2, TRI 2);
• espermatozóides mortos com acrossoma intacto (Classe 3, TRI 3);
• espermatozóides mortos com reação acrossomal (Classe 4, TRI 4).
Na análise da integridade da membrana espermática foi utilizada a coloração de
eosina e nigrosina (E/N) (WHO, 1992), onde os espermatozóides vivos são
impermeáveis ao corante, mantendo-se incolores, e os mortos se coram de rosa. Foram
contadas 200 células em microscópio de luz sob imersão e aumento de 1000x.
Para avaliação da integridade acrossomal utilizou-se o Corante Simples de Pope
(POPE et al., 1991) avaliado em microscópio de luz sob imersão e aumento de 1000x.
Foram avaliadas 200 células classificadas em:
• Acrossoma íntegro: região acrossomal de coloração lilás.
• Acrossoma não íntegro: região acrossomal de coloração rosa.
Foi estimado o consumo diário de selênio dos animais experimentais, para melhor
discutir os resultados encontrados, e os valores do mineral existentes na gramínea e nos
ingredientes do suplemento obtidos no NRC, (2001).
46
O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado com
medidas repetidas no tempo e os dados analisados através de ANOVA e do teste SNK
com um nível de significância de 10% com auxilio do programa estatístico SAS (SAS,
2001). Os valores de algumas variáveis foram transformados para serem analisadas
como dados paramétricos. Os dados estão apresentados na forma de média e erro padrão
da média dos dados originais.
Resultados e Discussão
Para a variável peso foi observado efeito de coleta (p<0,001), não sendo
encontrada diferença entre COL4 (544,50 ± 11,90) e COL3 (539,31 ± 9,44), mas ambas
foram superiores a COL2 (510,37 ± 7,90) que por sua vez foi superior a COL1 (472,16
± 8,26). Os animais utilizados no experimento estavam sendo preparados para a
exposição e por essa razão recebendo suplementação concentrada, formulada para
ganhos de 1kg/dia (NRC, 2001).
Não foi observado efeito da suplementação adicional de selênio para a variável
CE (p> 0,10), sendo que a média encontrada para esta variável nos animais do grupo
GC foi de 38,59 ± 0,49 cm e nos animais do grupo GS de 37,92 ± 0,38cm (Tabela 3).
Moraes et al., (1998) avaliando a qualidade dos indicadores da aptidão
reprodutiva em diferentes grupos genéticos encontraram para Brangus valores de CE
próximos (36,46 ± 0,46) aos do presente experimento. Medidas essas, acima de 35cm,
consideradas como excelentes de acordo com a classificação de Fernandes4 (2005)
citado por Santos et al (2005), para animais de 24-36 meses, indicando que esses
animais estavam dentro da média da raça e em condições adequadas de manejo
nutricional. Há indicações de que testículos maiores conferem aumento quantitativo e
4 FERNANDES, C.A.C. Manejo de touros. Curso on-line de reprodução em gado de corte. 2005. 30p.
47
possivelmente qualitativo na produção espermática, o que proporciona uma maior
capacidade de serviço ao touro (Santos et al., 2005).
Tabela 3. Média, erro padrão da média do grupo controle (GC) e grupo suplementado (GS) e nível de significância do efeito da suplementação via oral com selênio no sêmen de reprodutores bovinos Brangus das variáveis: peso (PESO), circunferência escrotal (CE), consistência (CONS), volume (VOL), motilidade (MOT), vigor (VIG), concentração (CONC), total do ejaculado (TOTEJA), defeitos menores (DEFME), defeitos maiores (DEFMA), defeitos totais (DEFTOT), viabilidade espermática (EOS), integridade de acrossoma (POPE) e integridade de membrana plasmática (HIPO)
Variável GC GS P PESO (kg) 528,48 ± 9,28 528,60 ± 6,28 0,9749 CE (cm) 38,59 ± 0,49 37,92 ± 0,38 0,2764 CONS (1-5) 3,17 ± 0,08 3,17 ± 0,08 1,00 VOL (mL) 6,44 ± 0,76 6,54 ± 0,63 0,8560 MOT (%) 60,83 ± 3,21ª 47,17 ± 4,80b 0,0183 VIG (1-5) 2,71 ± 0,09ª 2,17 ± 0,16 b 0,0125 CONC (x106 SPTZ/mL) 52,70 ± 8,09 43,16 ± 6,39 0,3324 TOTEJA (x106 SPTZ/ejaculado) 333,42 ± 59,98 275,69 ± 39,92 0,1176 DEFME (%) 4,33 ± 0,63 5,14 ± 0,80 0,3165 DEFMA (%) 9,46 ± 1.6 9,71 ± 0,95 0,4101 DEFTOT (%) 13,79 ± 1,70 14,84 ± 1,51 0,4946 EOS (%) 77,13 ± 2,03 80,52 ± 1,86 0,2309 POPE (%) 89,78 ± 3,83 93,52 ± 2,04 0,1062 HIPO (%) 26,71 ± 2,89 b 37,45 ± 4,14ª 0,0287 a,b Médias com letras diferentes na mesma linha indicam que houve diferença pela ANOVA a 10% de significância. Não foi observado efeito da suplementação na variável VOL (p> 0,10). As médias de
volume de ejaculado obtidas (6,44 ± 0,76 para GC e 6,54 ± 0,63 para GS) encontram-se
dentro da normalidade para coleta de sêmen em bovinos através do método de
eletroejaculação (CBRA, 1998). Xavier et al. (2008), utilizando o método de
eletroejaculação em caprinos submetidos à insulação escrotal e tratados ou não com
selênio e vitamina E, também não encontraram diferença significativa entre grupos que
receberam ou não suplementação de selênio via dieta, resultado esse que corrobora com
os encontrados no presente experimento.
Para a variável MOT foi observado efeito de suplementação (p=0,0183), sendo o
GC (60,83 ± 3,21) superior ao GS (47,17 ± 4,80). Moraes et al. (1998) avaliando a
48
qualidade dos indicadores da aptidão reprodutiva em diferentes grupos genéticos
encontraram para Brangus valores de motilidade espermática próximos (58,49 ± 1,55)
aos dos animais não suplementados com selênio do presente experimento.
Bartle et al. (1980), avaliando a influência da suplementação via parenteral com
selênio em touros com aptidão leiteira, não observaram diferença na motilidade seminal
entre animais tratados com selênio e os controle. Xavier et al. (2008) também não
encontraram efeito de suplementação com selênio e vitamina E em caprinos submetidos
à insulação escrotal.
Para a variável VIG foi observado efeito da suplementação (p=0.0125), sendo
GC (2,71 ± 0,09) superior ao GS (2,17 ± 0,16). Moraes et al. (1998) encontraram para
Brangus valores de vigor espermático de 2,51 ± 0,08, resultados estes que diferem dos
encontrados no presente estudo. O CBRA (1998) preconiza o valor igual ou superior a 3
para vigor espermático de animais que servem a campo. Os resultados encontrados no
presente experimento diferem dos encontrados por Xavier et al. (2008), que não
observaram efeito de suplementação com selênio e vitamina E no vigor dos
espermatozóides de caprinos submetidos à insulação escrotal.
Os valores obtidos para os animais do GC e do GS para a variável VIG estão
abaixo dos recomendados pelo CBRA para reprodutores bovinos que servem a campo
(≥ 3). Os valores observados podem ser explicados por se tratar de animais jovens e
que, anteriormente ao experimento, se encontravam em repouso sexual.
Não foi observado efeito da suplementação com selênio para a variável TURB
(p> 0,10). O turbilhonamento é uma variável dependente da motilidade, do vigor, do
volume e da concentração do ejaculado, portanto, seus valores dependem do método de
49
coleta, não sendo um item considerado para descarte de um reprodutor, embora se
deseje um turbilhão igual ou superior a três (CBRA, 1998).
Não houve efeito da suplementação (p> 0,10) para a variável CONC,
corroborando com Xavier et al. (2008), que trabalhando com caprinos, também não
encontraram efeito de suplementação com selênio e vitamina E sobre esta variável.
Bartle et al. (1980) que também não observaram efeito na produção espermática em
animais suplementados com selênio quando comparados aos não suplementados.
Não foi observado efeito da suplementação de Se (p> 0,10) para a variável
DEFMA. No entanto, os valores encontrados no presente estudo (GC= 9,46 ± 1,60 e
GS 9,70 ± 0,95) encontram-se dentro da porcentagem considerada aceitável pelo CBRA
(1998) para reprodutores, os quais devem ser inferiores a 20 %.
Para a variável DEFME não foi observado efeito da suplementação de Se
(p> 0,10). Xavier et al. (2008) encontraram após a insulação escrotal em caprinos, maior
percentagem de espermatozóides com cabeça destacada no grupo que não recebeu
suplementação com selênio e vitamina E.
Para a variável DEFTOT não foi observado efeito da suplementação (p> 0,10),
resultados esses que corroboram com os encontrados por Bartle et al. (1980), que
também não observaram diferença na porcentagem de espermatozóides normais em
bovinos que suplementados ou não com selênio via parenteral. Diferente de Xavier et al.
(2008) que encontraram, em caprinos, maior porcentagem de espermatozóides com
patologias após a insulação escrotal, evidenciando o efeito deletério do estresse térmico
sobre a espermatogênese, sendo o número de células normais encontradas pós-insulação
nos animais suplementados (65,0%) superior que nos animais do grupo não
suplementado (26,5%).
50
Não foi observado efeito da suplementação adicional com Se para a viabilidade
espermática (EOS), sendo o GC (77,13 ± 2,03) e GS (80,52 ± 1,36).
Foi observado efeito de tratamento (p=0,0287) para integridade de membrana
(HIPO), sendo GS (37,44 ± 4,14) superior a GC (26,71 ± 2,90).
Não foi observado efeito de tratamento para a integridade de acrossoma (POPE).
Os resultados encontrados no presente trabalho corroboram com os encontrados por
Xavier et al., (2008), que trabalhando com caprinos submetidos à insulação escrotal,
também não observaram influência da suplementação com selênio e vitamina E sobre a
integridade do acrossoma.
Não foi observado efeito da suplementação para integridade de membrana e
reação acrossomal (TRI 1, TRI 2, TRI 3 e TRI4).
Segundo o NRC (1996), a exigência de selênio para reprodutores bovinos é de
0,1 mg/kg de MS ingerida, sendo assim, a exigência dos animais experimentais seria de
aproximadamente 1,2 mg de Se/dia. Nesse contexto, animais dessa categoria que
possuem em sua dieta apenas a forragem como fonte do mineral, não têm suas
exigências atendidas, fazendo-se necessário a suplementação mineral. Já animais que,
além da forragem, recebem suplementação mineral ad libitum, estima-se que suas
exigências de selênio sejam quase ou completamente atendidas (Tabela 4).
51
Tabela 4. Consumo estimado de selênio em quatro situações de manejo nutricional(NRC, 1996)
Forragem1 Mistura
Mineral
Grãos
(FS + M)2
Suplementação
Oral
Total
(mg/dia)
Dieta I3 + - - - 0,5285
Dieta II4 + + - - 1,1685
Dieta III5 + + + - 1,9802
Dieta IV + + + + 2,4600
1 consumo de matéria seca (1,5 % de peso vivo) (Nicodemo, 2001) 2 FS – farelo de soja ; M – milho grão 3 Dieta I – Animais mantidos em sistema de pastejo 4 Dieta II – Animais mantidos em sistema de pastejo, suplementados com mistura mineral 5 DietaIII – Animais mantidos em sistema de pastejo, suplementados com mistura mineral e grãos (dieta recebida pelo grupo controle) 6 Dieta IV - Animais mantidos em sistema de pastejo, suplementados com mistura mineral, grãos e suplementação adicional de Se(dieta recebida pelo grupo selênio)
O efeito positivo na qualidade seminal, pela adição de selênio na dieta, deve-se
ao fato de que, a suplementação com selênio aumenta os níveis séricos do mesmo e a
concentração desse mineral no testículo e no epidídimo, promovendo maior atividade da
Glutationa peroxidase e melhora na qualidade seminal (SENGERSON &
JOHNSON, 1980). Os animais do presente experimento receberam suplementação
concentrada a 1% do PV, nível de suplementação este que não retrata a realidade
aplicada no manejo reprodutivo dos touros que servem em regime de monta natural no
Brasil. Devido ao alto nível de suplementação concentrada, os animais do GC
consumiram o equivalente a 1,5 vezes as exigências de selênio, enquanto os animais do
GS receberam duas vezes a exigência desse mineral, considerando-se reprodutores
(NRC, 1996) (Tabela 4), indicando que não houve deficiência deste mineral nos grupos
avaliados, o que possivelmente explicaria a ausência de efeito da suplementação com
selênio. Todavia, para as variáveis MOT e VIG, observou-se efeito negativo da
suplementação com o selênio (Tabela 3). Kaushal e Bansal (2006) observaram que tanto
a deficiência quanto o excesso de selênio estão associados ao aumento na
52
lipoperoxidação e consequentemente ao aumento do estresse oxidativo, o que poderia
explicar o pior desempenho dos animais suplementados para estas variáveis.
Com base nos resultados encontrados, conclui-se que, a suplementação com
selênio na concentração de 0,1 mg/kg de MS para reprodutores bovinos com exigências
nutricionais de Se atendidas, apresenta efeitos controversos, reduzindo a qualidade
seminal e melhorando a integridade da membrana espermática.
53
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55
4. Capitulo 2
Suplementação oral com selênio para touros Brangus a pasto: integridade da
membrana espermática e qualidade do sêmen pós-congelamento
Oral supplementation with selenium for Brangus bulls in pasture: spermatic membrane
integrity and frozen-thawed seminal quality
Resumo
O experimento foi realizado na Fazenda Sereno, localizada em Jaciara-MT, objetivando
avaliar a integridade da membrana plasmática e qualidade seminal pós-congelamento,
em bovinos jovens alimentados com dieta suplementada com selênio. Foram utilizados
16 touros Brangus, distribuídos em dois tratamentos: grupo controle (GC, suplemento
concentrado) e grupo selênio (GS, suplemento concentrado com adição de selênio de
0,1mg de Se/kg de MS de dieta). O experimento teve duração de 75 dias, sendo os
animais suplementados por 60 dias e realizadas quatro avaliações andrológicas durante
o período. Para a coleta de sêmen foi utilizada técnica de eletroejaculação. Foram
congeladas cinco palhetas de sêmen de cada animal em cada coleta utilizando o meio o
tris-gema citrato de sódio, e as palhetas mantidas em nitrogênio até o momento das
análises. Após o descongelamento foi avaliado a motilidade e o vigor espermático.
Foram confeccionadas lâminas coradas e coletadas alíquotas para testes
complementares. O experimento foi instalado em delineamento inteiramente
casualizado com medidas repetidas no tempo e os dados analisados através de ANOVA
com nível de significância de 10%, com auxílio do programa estatístico SAS. Foi
observado efeito da suplementação apenas para integridade de membrana (HIPO),
sendo que o GS foi superior ao GC no sêmen fresco e no criopreservado. Com base nos
resultados encontrados conclui-se que a suplementação com selênio na concentração de
56
0,1 mg/kg de MS para touros Brangus a pasto, com exigência de selênio atendida, não
altera a motilidade e o vigor espermática do sêmen criopreservado, no entanto, melhora
a integridade da membrana espermática.
Palavras chaves: antioxidantes, bovinos, criopreservação, espermatozóide
Summary
The experiment was realized in Sereno Farm, Jaciará-MT, and aimed to evaluate
plasmatic membrane integrity and seminal quality post-freezing, in young bulls fed with
diet supplemented with selenium. Sixteen Brangus bulls was used, distributed in two
treatments: controlled group (GC, intent supplement) and selenium group (GS,
concentrated supplement with selenium addition of 0.1mg/kg/DM on diet). Experiment
had duration of 75 days, being the animals supplemented per 60 days and accomplished
four andrologics evaluations during the period. In each collect the animals were
weighted and restrained in trunk with digital scale. For semen collection
electroejaculation technique was used. Five semen straws of each animal in each collect
were freezing, using diluents of tris-yolk sodium citrate, being conserved in nitrogen
until analyses moment. After thawed, motility and vigor spermatic was evaluated.
Confectioned color blades and aliquot was collected for complementary exams.
Randomised complete design with repeated measures in time were used and results
analyzed through ANOVA with a significance level of 10% with statistical program
SAS. Supplementation effect for membrane integrity (HIPO) was observed, being GS
superior to GC in fresh semen and in frozen-thawed. Based in founded results conclude
that supplementation with selenium in concentration of 0.1 mg/kg of DM for Brangus
bulls with selenium nutritional exigencies attended, does not modify motility and
57
spermatic vigor, however, it improves spermatic membrane integrity of frozen-thawed
semen.
Keywords: antioxidants, bovine, cryopreservation, spermatozoa
58
Introdução
Dentre as biotecnologias reprodutivas, a criopreservação de sêmen se destaca
por gerar inúmeras vantagens, principalmente entre os animais de produção. No entanto,
durante o processo de criopreservação as estruturas dos espermatozóides sofrem
mudanças anatômicas e bioquímicas (Amirat et al., 2004) as quais acabam limitando sua
utilização (Garner et al., 2001).
Umas das injúrias ocasionadas aos espermatozóides durante o processo de
congelamento é a peroxidação lipídica das suas membranas, provocada pelo estresse
oxidativo devido à produção excessiva de radicais livres, os quais estão associados com
declínio da fertilidade durante este processo (Ruiz et al., 2007) e durante a estocagem
(Maxwell & Watson, 1996).
O processamento do sêmen para o congelação induz a produção de EROs em
diversas fases. Uma explicação para o aumento na produção de EROs durante a
criopreservação seria a presença de substâncias pró-oxidantes nos diluidores
(Bilodeau et al., 2002) e pela diminuição da atividade e da concentração das enzimas
antioxidantes (Alvarez & Storey, 1992). O processo de descongelamento também causa
danos oxidativos aos espermatozóides, decorrente do rápido aumento na utilização do
oxigênio pelos espermatozóides, após período de interrupção no metabolismo,
determinando maior produção de EROs (Ball et al, 2001).
Consequentemente os organismos desenvolveram sistemas antioxidantes de
defesa, para proteção, como também sistemas de reparação, que previnem o acúmulo de
moléculas alteradas pela oxidação (Vannucchi et al., 1998) os quais abrangem o sistema
de proteção enzimática ou por micromoléculas (Barreiros et al., 2006). Entre os
antioxidantes destacam-se alguns nutrientes, seqüestradores não enzimáticos e algumas
59
enzimas, entre elas a glutationa peroxidase (GPx). O selênio é um elemento essencial
para várias funções do organismo, tais como crescimento, resposta imunológica e
manutenção da integridade das células e tecidos. O selênio atua como co-fator da
glutationa peroxidase, que é uma enzima citoplasmática antioxidante (Alvares &
Moraes, 2006) e por essa razão, protege o tecido celular contra o estresse oxidativo
(Nordberg & Arnér, 2001).
Dada à importância dos danos oxidativos provocados pelo processo de
congelamento sobre a fertilidade do sêmen de reprodutores bovinos e dos possíveis
efeitos benéficos da suplementação com selênio, objetivou-se com esse trabalho avaliar
a influência da suplementação oral com selênio sobre a qualidade seminal e integridade
da membrana plasmática do sêmen criopreservado de touros Brangus criados no Brasil
Central, visto que, poucos estudos são encontrados relacionando o efeito da
suplementação com selênio e as características seminais.
Material e Métodos
O experimento foi realizado na Fazenda Sereno - GAP, localizada no município
de Jaciara, distante 140 km de Cuiabá, Mato Grosso, no período de junho a setembro de
2008. O município de Jaciara encontra-se na altitude de 367m, latitude 15° 57’ 55” sul e
longitude 54° 58’ 06” oeste. O clima da região é tropical, sazonal, com duas estações
bem definidas, verão chuvoso (outubro a março) e inverno seco (abril a setembro). A
temperatura média anual é 28°C e pluviosidade média anual de 2000 mm
(Wikipédia, 2009).
60
Temperatura Ambiente - Jaciara/MT
0
5
10
15
20
25
30
35
2/6/2008
10/6/2008
17/6/2008
24/6/2008
1/7/2008
8/7/2008
15/7/2008
22/7/2008
29/7/2008
6/8/2008
13/8/2008
20/8/2008
27/8/2008
3/9/2008
10/9/2008
17/9/2008
Temperaturas Mínimas Temperaturas Máximas Temperaturas Médias
Data
ºC
Figura 1 – Dados metereológicos (temperatura mínima, máxima e média) da região de
Jaciara, MT - 02/06/2008 – 17/09/2008, Fonte: INMET, 2009.
Foram utilizados 16 touros da raça Brangus (5/8 Angus 3/8 zebu) com idade
média de dois anos e peso vivo médio inicial de 472 kg. Ao inicio do experimento os
animais foram submetidos ao controle de endoparasitas (Doramectina 1%, Dectomax®
Pfizer) e ectoparasitas (Cipermetrina e Ethion, Ciperthion®, Shering-Plough) sendo o
controle de ectoparasitas também realizado a cada coleta de dados.
A área experimental destinada aos animais foi constituída por dois piquetes de
7,35/ha cada, com Panicum maximum cv. Mombaça, os quais foram providos de
bebedouro e cocho para fornecimento do suplemento, cujas dimensões permitiam o
acesso de todos os animais simultaneamente.
Os animais foram mantidos em pastejo contínuo, recebendo diariamente
suplementação concentrada (Tabela 1).
61
Tabela 1. Composição percentual do suplemento fornecido aos animais em experimento, expresso com base na matéria natural
Ingrediente Quantidade (%)
Farelo de soja 27,50
Milho moído 67,25
Calcário 1,50
Enxofre 0,25
Uréia Pecuária 0,50
Sal mineral 88* 3,00
*Niveis de garantia por kg de suplemento mineral: Ca – 154g; F – 88g; Cu – 1700mg; S – 12g; Co – 200mg; Mn – 1300mg; Zn – 5000mg; I – 130mg; Se – 20mg; Mg – 6mg; Na – 130g.
Os suplementos foram formulados para apresentarem 21% de PB na matéria
natural, sendo fornecidos em quantidade equivalentes a 4,5 kg/animal/dia, sempre as
11:00h, afim de se minimizar as interferências no comportamento de pastejo. Foram
coletadas amostras de pasto e do suplemento para posteriores análises laboratoriais no
Laboratório de Nutrição Animal da FAMEV- UFMT (Tabela 2).
Tabela 2. Composição químico-bromatológica do suplemento concentrado e da forragem utilizada na alimentação dos animais experimentais com base na matéria natural
Nutriente Concentrado (%) Forragem (%)
Matéria seca (MS) 90,00 37,99
Proteína bruta (PB) 21,00 6,23
Fibra em detergente neutro (FDN) 29,40 67,57
Extrato etéreo (EE) 2,50 1,05
Matéria mineral (MM) 8,43 7,80
O experimento teve duração de 75 dias, sendo os animais suplementados por um
período de 60 dias. Ao final dos 60 dias os animais continuaram recebendo o mesmo
manejo, sendo fornecido concentrado sem a suplementação de Selênio durante 15 dias,
para avaliação de possível efeito residual. Antes do período experimental os animais
passaram por um período de adaptação de 10 dias, aos piquetes e ao concentrado.
62
Os animais foram divididos aleatoriamente em dois lotes, os quais foram
submetidos aos tratamentos:
• GC= controle (suplementação concentrada sem adição de selênio);
• GS= selênio (suplementação concentrada com adição de selênio).
No concentrado fornecido aos animais do GS foi adicionado 0,1mg de Se/kg de
MS (na forma de selenito de sódio). Durante o período experimental, foram realizadas
quatro coletas de dados, sendo estas nos dias zero, 30, 60 e 75 (COL 1, COL 2, COL 3 e
COL 4, respectivamente). Adotou-se para dia 0 (D0) o dia anterior ao início da
suplementação.
Após a contenção dos animais foi realizado o exame clínico do exterior e
limpeza do prepúcio e pênis. Para a coleta de sêmen foi utilizada a técnica de
eletroejaculação, sendo utilizado o aparelho Eletrovet® (Eletro Veterinária Ltda). O
sêmen foi recolhido em tubo plástico graduado, protegido de choque térmico e de luz.
Imediatamente após a coleta foram avaliados a motilidade (MOT) e o vigor
(VIG) espermáticos (CBRA, 1998) e retiradas aliquotas para realização do teste de
expansão hipo-osmótico (HIPO; JEYENDRAN et al., 1984) e para as colorações de
viabilidade espermática (eosina/nigrosina (E/N); WHO, 1992), Fast-Green/Rosa
Bengala (POPE et al., 1991) e coloração tripla (HARAYAMA et al., 1993).
Foi retirada uma alíquota de 0,5 mL de sêmen, sendo essa diluída na proporção
de 1:3 no meio tris-gema citrato de sódio.
Foram congeladas cinco palhetas de sêmen de cada animal em cada coleta,
utilizando a metodologia descrita por Beconi et al. (1991), e o sêmen envasado em
palhetas de 0,25 mL, identificadas com número da coleta e animal e mantido em
nitrogênio até o momento das análises.
63
O descongelamento foi realizado segundo a metodologia proposta por Beconi et
al. (1991). Logo após o descongelamento era realizada a avaliação de motilidade e
vigor espermáticos e coletadas alíquotas para realização do HIPO, E/N, POPE e
coloração tripla.
O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado com
medidas repetidas no tempo. Os dados foram analisados através de ANOVA com um
nível de significância de 10% com auxilio do programa estatístico SAS (SAS, 2001).
Algumas variáveis foram transformadas para serem analisadas como dados
paramétricos. Os dados serão apresentados na forma de média e erro padrão da média
dos dados originais.
Resultados e discussão
Não foi observado efeito da suplementação adicional com Se (p>0,10) para a
variável MOT tanto no sêmen fresco como no sêmen congelado, sendo GC (60,83 ±
3,21 e 16,46 ± 3,38) e GS (53,50 ± 3,81 e 16,58 ± 3,52), respectivamente.
Bartle et al. (1980) trabalhando com bovinos suplementados ou não com selênio,
via parenteral, também não encontraram diferença na variável motilidade entre os
tratamentos.
Não foi observado efeito da suplementação de Se para a variável VIG no sêmen
fresco e congelado, sendo GC (2,71 ± 0,09 e 2,04 ± 0,24) e GS (2,35 ± 0,15 e 2, 05 ±
0,19), respectivamente. Durante o processo de criopreservação os espermatozóides
sofrem injúrias pela diferença de osmolaridade, temperatura ou por formação de cristais
de gelo dentro da célula, lesando as membranas espermáticas, diminuindo a motilidade
e a viabilidade dos mesmos (Watson, 2000). Os valores encontrados para as variáveis
MOT e VIG no presente experimento (Tabela 3) são menores que os recomendados
64
para o uso de sêmen congelado pelo CBRA (1998), sendo o mínimo aceitável de 30%
para motilidade e vigor 3. O fato de utilizar animais jovens e que estavam em repouso
sexual, pode explicar a baixa qualidade do sêmen a fresco, o que consequentemente, foi
a causa dos valores obtidos no processo de criopreservação.
Tabela 3. Média, erro padrão da média do grupo controle (GC) e grupo suplementado (GS) e nível de significância do efeito da suplementação via oral com selênio no sêmen a fresco e congelado de reprodutores bovinos Brangus das variáveis: motilidade (MOT), vigor (VIG), viabilidade espermática (EOS), integridade de acrossoma (POPE), integridade de membrana plasmática (HIPO) e espermatozóide morto com acrossoma íntegro (TRI 3)
Fresco Congelado
Variável GC GS GC GS
MOT 60,83 ± 3,21 53,50 ± 3,81 16,46 ± 3,38 16,58 ± 3,52
VIG 2,71 ± 0,09 2,35 ± 0,15 2,04 ± 0,24 2, 05 ± 0,19
EOS 77,13 ± 2,02 82,80 ± 1,86 76,83 ± 2,07 77,34 ± 3,69
POPE 93,32 ± 2,68 95,64 ± 1,95 98,39 ± 0,14 97,88 ± 0,20
HIPO 26,71 ± 2.89b 37,45 ± 4,14ª 8,75 ± 1,42B 9,90 ± 1,59A
TRI 3 5,85 ± 0,99 8,24 ± 2,52 83,48 ± 4,08 89,43 ± 2,62 a,b, A, B Médias com letras diferentes na mesma linha indicam que houve diferença pela ANOVA a 10% de significância.
Não foi observado efeito da suplementação de Se para a viabilidade espermática
(EOS) sendo GC (77,13 ± 2,02 e 76,83 ± 2,07) e GS (82,80 ± 1,86 e 77,34 ± 3,69). Os
resultados do presente experimento corroboram com os resultados encontrados por
Sengerson e Johnson (1980), que avaliando a função reprodutiva do selênio para touros
Angus ao sobreano também não observaram efeito da suplementação adicional de
selênio para viabilidade espermática.
Não foi observado efeito da suplementação de Se para integridade de acrossoma
(POPE) sendo GC (93,32 ± 2,68 e 98,39 ± 0,14) e GS (95,64 ± 1,95 e 97,88 ± 0,20). Os
resultados encontrados no presente experimento corroboram com os resultados
65
encontrados por Bartle et al. (1980), que suplementando com selênio via parenteral não
encontraram diferença entre os animais tratados e não tratados.
Foi observado efeito da suplementação (p=0,0480) para integridade de
membrana (HIPO), sendo os animais tratados superiores aos animais não tratados.
Não foi observado efeito de suplementação para integridade de membrana e
reação acrossomal (TRI).
Segundo o NRC (1996), a exigência de selênio para touros é de 0,1 mg/kg de
MS ingerida, sendo assim, a exigência dos animais experimentais seria de
aproximadamente 1,2 mg de Se/dia (consumo de forragem de 1,5% do PV, Nicodemo,
2001). Nesse contexto, os animais dessa categoria que possuem, em sua dieta, apenas a
forragem como fonte do mineral, não têm suas exigências atendidas, fazendo-se
necessário a suplementação mineral. Para animais que, além da forragem, recebem
suplementação mineral ad libitum, estima-se que suas exigências de selênio sejam quase
ou completamente atendidas (Tabela 4).
Tabela 4. Consumo estimado de selênio em quatro situações de manejo nutricional (NRC, 1996).
Forragem1 Mistura
Mineral
Grãos
(FS + M)2
Suplementação
Oral
Total
(mg/dia)
Dieta I3 + - - - 0,5285
Dieta II4 + + - - 1,1685
Dieta III5 + + + - 1,9802
Dieta IV + + + + 2,4600
1 consumo de matéria seca (1,5 % de peso vivo) (Nicodemo, 2001) 2 FS – farelo de soja ; M – milho grão 3 Dieta I – Animais mantidos em sistema de pastejo 4 Dieta II – Animais mantidos em sistema de pastejo, suplementados com mistura mineral 5 DietaIII – Animais mantidos em sistema de pastejo, suplementados com mistura mineral e grãos (dieta recebida pelo grupo controle) 6 Dieta IV - Animais mantidos em sistema de pastejo, suplementados com mistura mineral, grãos e suplementação adicional de Se(dieta recebida pelo grupo selênio)
66
O efeito positivo na qualidade seminal, pela adição de selênio na dieta, deve-se
ao fato de que, a suplementação com selênio aumenta os níveis séricos do mesmo e a
concentração desse mineral no testículo e no epidídimo, promovendo maior atividade da
Glutationa peroxidase e melhora na qualidade seminal (Sengerson & Johnson, 1980).
Os animais do presente experimento receberam suplementação concentrada a
1% do PV, nível de suplementação este que não retrata a realidade aplicada no manejo
reprodutivo dos touros que servem em regime de monta natural no Brasil. Devido ao
alto nível de suplementação concentrada, os animais do GC consumiram o equivalente a
1,5 vezes a exigência de selênio, enquanto os animais do GS receberam duas vezes a
exigência desse mineral para animais em terminação (NRC, 1996) (Tabela 4), indicando
que não houve deficiência deste mineral nos grupos avaliados. O que possivelmente
explicaria a ausência de efeito da suplementação com selênio. Kaushal e Bansal (2006)
observaram que tanto a deficiência quanto o excesso de selênio estão associados ao
aumento na lipoperoxidação e consequentemente desencadeando do estresse oxidativo,
o que poderia explicar o pior desempenho dos animais suplementados nestas variáveis.
Com base nos resultados encontrados conclui-se que a suplementação com
selênio na concentração de 0,1 mg/kg de MS para reprodutores bovinos com exigências
de selênio atendidas, não altera a qualidade espermática do sêmen criopreservado, no
entanto, melhora a integridade da membrana espermática.
Trabalhos que relacionem o efeito da suplementação com selênio com os
parâmetros qualitativos e quantitativos do sêmen de bovinos são raros, mais estudos na
área, variando os níveis e a fonte do selênio se faz necessário para elucidar o efeito
desse mineral na atividade reprodutiva desses animais.
67
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69
5.Conclusões Gerais
A suplementação com selênio na concentração de 0,1 mg/kg de MS para
reprodutores Brangus criados no Brasil Central, mantidos a pasto e recebendo
suplementação múltipla a 1% do PV com exigências de Se atendidas, apresenta efeitos
controversos no sêmen fresco, reduzindo a motilidade e o vigor espermático e
melhorando a integridade da membrana espermática. Já para o sêmen criopreservado a
suplementação com selênio não altera a motilidade e o vigor espermático e melhora a
integridade da membrana espermática.
Trabalhos que relacionem o efeito da suplementação com selênio com os
parâmetros qualitativos e quantitativos do sêmen de bovinos são raros, desta forma,
mais estudos na área, variando os níveis e a fonte do selênio faz-se necessário para
elucidar o efeito desse mineral na atividade reprodutiva desses animais.
70