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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

SÍNTESE E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E

ANTI-T.CRUZI DE DERIVADOS NITRO-

ARILTIOSSEMICARBAZÔNICOS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

DYEGO REVORÊDO DE CARVALHO SILVA

RECIFE, PE, BRASIL

2010

Síntese e Avaliação das Atividades Antimicrobiana e Anti-T.Cruzi de Derivados Nitro-Ariltiossemicarbazônicos

Dyego Revorêdo de Carvalho Silva

SÍNTESE E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E

ANTI-T.CRUZI DE DERIVADOS NITRO-


por


Orientador: Prof. Dr. Dalci José Brondani

RECIFE-PE, BRASIL

2010

Dissertação submetida ao

Programa de Pós-Graduação

em Ciências Farmacêuticas do

Centro de Ciências da Saúde

da UFPE, como requisito

parcial para obtenção do grau

em MESTRE em Ciências

Farmacêuticas.



Silva, Dyego Revorêdo de Carvalho

Síntese e avaliação das atividades antimicrobiana e anti-T.Cruzi de derivados nitroariltiossemicarbazônicos / Dyego Revorêdo de Carvalho Silva. – Recife: O Autor, 2010.

159 folhas: il., fig,, esquemas. ; 30 cm.

Orientador: Dalci José Brondani. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Tiossemicarbazonas. 2. Chagas.

3. Atividade Antimicrobiana. 4. Atividade Anti-T.Cruzi.

5. Nitrocompostos. I. Brondani, Dalci José. II.Título.

UFPE 615.31 CDU (20.ed.) CCS2011-193




CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

LABSINFA – LABORATÓRIO DE PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DE

FÁRMACOS

Recife, 02 de dezembro de 2010

Defesa de Dissertação de Mestrado defendida e APROVADA por decisão unânime, em

02 de dezembro de 2010 e cuja Banca Examinadora foi constituída pelos seguintes

professores.

PRESIDENTE ORIENTADOR E EXAMINADOR INTERNO: Prof. Dr. Dalci José

Brondani

(Deptº de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

Assinatura:

SEGUNDO EXAMINADOR INTERNO: Profa. Dra. Janete Magali de Araújo

( Deptº de Antibióticos da Universidade de Pernambuco – UFPE)

Assinatura:

PRIMEIRO EXAMINADOR EXTERNO: Profa. Dra. Ivani Malvestiti

( Deptº de Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE)

Assinatura:




REITOR

Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins

VICE-REITOR

Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Prof. Dr. José Tadeu Pinheiro

CHEFFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Prof. Dr. Dalci José Brondani

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto

VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Profa. Dra. Beate Saegesser Santos



DEDICATÓRIA

À minha mãe Rosely, uma verdadeira

batalhadora, pela dedicação e amor, pois sem isso

não seria o que sou hoje;

Ao meu pai Marconi (in memorian), pelo

exemplo de respeito, caráter, sinceridade e

dignidade;

Ao meu irmão por todo companheirismo

prestados nas horas que precisei;

À minha namorada por todo amor, atenção e

dedicação durante essa etapa da minha vida.



“Quem sabe concentrar-se numa coisa e insistir

nela como único objetivo, obtém, ao fim e ao cabo,

a capacidade de fazer qualquer coisa”

Mahatma Gandhi



AGRADECIMENTOS

A Deus, por me proporcionar vida e saúde, pois essas são os dois maiores presentes

que um ser humano pode receber.

Ao meu orientador Prof. Dr. Dalci José Brondani pelos ensinamentos, paciência e

ajuda de uma forma geral, além da amizade construída durantes esses anos.

Aos meus pais, Marconi e Rosely por tudo que aprendi durante a vida, pelo apoio e

compreensão, além de carinho, amor e dedicação, me auxiliando a superar todas as

dificuldades e conquistar meus sonhos. As reclamações nas horas pertinentes também

foram importantes. Vocês são os alicerces do meu crescimento.

Ao meu irmão Thyago por todos os momentos de descontração vividos, como também

pelos ensinamentos de determinação e superação.

A minha namorada Priscila por todo amor, dedicação, compreensão, respeito, atenção

e principalmente paciência, com os meus aperreios, e motivação para continuar

vencendo as etapas que a vida oferece.

Aos meus familiares, em especial os mais próximos que sempre estiveram presentes

em todas as etapas da minha vida.

Aos amigos de Laboratório e agregados: Wan, Victor, Lucas Oliveira, Lecílio, Márcia,

Andrea, Daura, Leilane, Jannyeres, Elany, Gevânio, Lucas Coelho, Suellen, Luiz

Carlos, Danniel, Eraldo, Janessa e Tarcilla pela amizade construída nesse tempo, que

tenho certeza que vai durar muito tempo.

Aos Doutorandos Marcos Veríssimo e Diogo Lúcio por todas as dúvidas sanadas, que

não foram poucas, e também por ensinar vários ―macetes laboratoriais‖ que

facilitaram muito a realização das tarefas.

A todos os professores que fazem parte do PPGCF por compartilharem conosco seus

vastos conhecimentos, mostrando-me uma nova visão das coisas.

Aos todos os funcionários do DCFar, em especial Iguaci, Fátima, Conceição e

Margareth.

À FACEPE, pela concessão do auxílio financeiro durante esses dois anos,

possibilitando a realização do projeto.

Aos meus familiares, em especial os mais próximos que sempre estiveram presentes

em todas as etapas da minha vida. Obrigado por todo momento compartilhado, de



apoio e força.



SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS................................................................................................. XII

LISTA DE ESQUEMAS............................................................................................ VX

LISTA DE TABELAS................................................................................................ XVIII

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS................................................................ XIX

RESUMO.................................................................................................................... XXI

ABSTRACT............................................................................................................... XXII

CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO, REVISÃO DA LITERATURA E

OBJETIVOS...............................................................................................................

23

I- 1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 24

I- 2. REVISÃO DA LITERATURA......................................................................... 26

I- 2.1 DOENÇA DE CHAGAS.......................................................................... 26

I- 2.1.1 Generalidades da doença de Chagas................................................ 26

I- 2.1.2 Epidemiologia ................................................................................. 28

I- 2.1.3 Ciclo Biológico................................................................................ 29

I- 2.1.4 Transmissão..................................................................................... 31

I- 2.1.5 Manifestações clínicas ................................................................... 33

I- 2.1.6. Tratamento e novos alvos terapêuticos........................................... 35

I- 2.2 QUÍMICA DAS TIOSSEMICARBAZONAS....................................... 41

I- 2.2.1 Tiossemicarbazonas- Aspectos Químicos........................................ 41



I- 2.2.2 Síntese de tiossemicarbazonas......................................................... 42

I- 2.2.3 Tiossemicarbazonas e seus metais complexos................................. 52

I- 2.3 TIOSSEMICARBAZONAS E SUAS APLICAÇÕES

FARMACOLÓGICAS.......................................................................................

57

I- 2.3.1 Atividade antiviral........................................................................... 57

I- 2.3.2 Atividade Antibacteriana................................................................. 59

I- 2.3.3 Atividade Antifúngica..................................................................... 60

I- 2.3.4 Atividade Antitumoral..................................................................... 61

I- 2.3.5 Atividade antiprotozoária................................................................. 62

I- 2.3.6 Atividade antichagásica................................................................... 64

I- 3. OBJETIVOS...................................................................................................... 68

I- 3.1 Objetivo Geral............................................................................................ 68

I- 3.2 Objetivos Específicos.................................................................................

68

CAPÍTULO II: OBTENÇÃO DOS DERIVADOS NITRO-

ARILTIOSSEMICARBAZÔNICOS........................................................................

69

II- 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 70

II- 2. METODOLOGIA ............................................................................................ 70

II- 2.1 Procedimento Geral de Obtenção dos Aril-aldeídos Nitrados.................. 70

II- 2.2 Procedimento Geral de Obtenção das Nitro-Aril tiossemicarbazonas....... 71

II- 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................

73

CAPÍTULO III: AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS....................

89

III- 1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 90



III- 2. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA ............................................................. 90

III- 2.1 Metodologia.............................................................................................. 90

III- 2.1.1 Método da difusão em discos de papel.......................................... 90

III-2.1.2 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) e

Concentração Mínima Bacteriostática (CMB)............................................

93

III- 2.2 Resultados e discussão.............................................................................. 93

III- 3. ATIVIDADE ANTICHAGÁSICA E AVALIAÇÃO DA

CITOTOXICIDADE..................................................................................................

96

III- 3.1 Metodologia.............................................................................................. 96

III- 3.1.1 Ensaio de citotoxicidade dos compostos em células esplênicas..... 96

III- 3.1.2 Avaliação da atividade dos compostos frente ao T. cruzi............... 97

III- 3.2 Resultados e discussão.............................................................................

97

CAPÍTULO IV: CONCLUSÕES E PERPESCTIVAS...........................................

106

IV- 1. CONCLUSÕES.......................................................................................... 107

IV- 2. PERPESCTIVAS .......................................................................................

108

CAPÍTULO V: PARTE EXPERIMENTAL

109

V- 1. PARTE EXPERIMENTAL.............................................................................. 110

V- 1.1 Materiais e Métodos................................................................................... 110

V- 1.1.1Cromatografias.................................................................................. 110

V- 1.1.2 Pontos de Fusão............................................................................... 110

V- 1.1.3 Espectroscopias de IV, RMN 1H e RMN 13C............................... 110

V- 1.1.4 Equipamentos................................................................................... 110



V- 1.1.5 Reagentes e solventes...................................................................... 111

V- 1.2. Procedimentos Experimentais............................................................ 111

V- 1.2.1 Síntese e Caracterização estrutural......................................... 111

V- 1.2.2 Avaliação da Atividade Antibacteriana.................................. 125

V- 1.2.2.1 Metodologia............................................................. 125

V- 1.2.3 Avalização da atividade anti- T.cruzi...................................... 126

V- 1.2.3.1 Metodologia............................................................. 126

V- 1.2.4 Obtenção de células esplênicas de camundongos isogênicos

e Ensaio de Citotoxicidade...................................................................

126

V- 1.2.4.1 Metodologia............................................................. 126

Referências Bibliográficas......................................................................................... 128

ANEXOS..................................................................................................................... 142

ANEXO A: Espectros de IV dos derivados obtidos……………………………… 143

ANEXO B: Espectros RMN 1H................................................................................. 149



LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Número de novos medicamentos desenvolvidos entre os anos de 1975 e

2004...............................................................................................................................

24

Figura 2: Estrutura química do Benznidazol............................................................... 25

Figura 3. Barbeiro (Triatoma infestans): inseto transmissor da doença de Chagas....... 27

Figura 4: Fatores predisponentes para o aparecimento da doença de Chagas: casas de

pau-a-pique.....................................................................................................................

27

Figura 5: Estimativa da população global afetada pelo Trypanosoma cruzi, 2009....... 29

Figura 6: Formas evolutivas do Trypanosoma cruzi – A: Fibras musculares cardíacas

infestadas pela forma amastigota; B: Forma epimastigota e C: Forma

tripomastigota.................................................................................................................

30

Figura 7: Ciclo biológico da doença de Chagas........................................................... 31

Figura 8: A: Sinal de Romaña; B: chagoma de inoculação.......................................... 33

Figura 9: Coração de pacientes que desenvolveram doença de Chagas e morreram

por: (A) morte súbita, (B) megacólon ou mega-esôfago e (C) insuficiência cardíaca

congestiva......................................................................................................................

34

Figura 10: Subestruturas químicas fundamentais de nitrocompostos empregados em

terapêutica.....................................................................................................................

36

Figura 11: Estrutura molecular da nitrofurazona......................................................... 36

Figura 12: Fármacos utilizados na terapia antichagásica............................................. 37

Figura 13: Estrutura química das tiossemicarbazonas.................................................. 40

Figura 14: Representação das conformações das tiossemicarbazonas.......................... 41

Figura 15: Representação dos estereoisômeros E e Z das Tiossemicarbazonas............ 42

Figura 16: Representação das duas formas tautoméricas das TSCs............................... 52



Figura 17: Estruturas químicas dos compostos sintetizados por Teitz et al., 1994....... 58

Figura 18: Estrutura química do composto 3 sintetizado por Finkielsztein, 2008..... 58

Figura 19: Estrutura química dos compostos sintetizados por Khan et al., 2007.......... 59

Figura 20: Representação geral dos compostos sintetizados por Guzel et al., 2008

que obtiveram melhor atividade.....................................................................................

60

Figura 21: Estruturas químicas das TSCs com atividade antifúngica segundo

Opletalová et al., 2008....................................................................................................

61

Figura 22: Pró- fármaco sintetizado a partir do 3-AP.................................................... 62

Figura 23: Estrutura química dos compostos sintetizados por Dilovic et al., 2008 com

melhores atividades.................................................................................................

62

Figura 24 Estrutura química dos compostos sintetizados por Bhart, 2002.................... 63

Figura 25: Estruturas químicas dos compostos sintetizados por Abid e grupo, 2000... 63

Figura 26: Estrutura química do protótipo antimalárico segundo Duan & Zhang,

2010..................................................................................................................................

64

Figura 27: Mecanismo de inibição da TCC por derivados aril-tiossemicarbazônicos

proposta por Du et al., 2002.............................................................................................

65

Figura 28: Compostos sugeridos como inibidores da TCC segundo Chiyanzu et al.,

2003.................................................................................................................................

65

Figura 29: Estrutura Química dos compostos sintetizados por Aguirre e grupo, 2004. 66

Figura 30: Estrutura química do composto que apresentou melhor atividade

antichagásica segundo Fujii e colaboradores 2005..........................................................

66

Figura 31: Estrutura química dos compostos sintetizados por Siles e grupo, 2006....... 67

Figura 32: Espectro de RMN 1H do composto 2b.......................................................... 80

Figura 33: Espectro de RMN 13

C do composto 2b........................................................ 81



Figura 34: Espectro de RMN 1H do composto 2d......................................................... 82

Figura 35: Espectro de RMN 1H do composto 2g. ........................................................ 83

Figura 36: Espectro de RMN 1H do composto 2i. ........................................................ 84

Figura 37: Espectro de IV do composto 2b. .................................................................. 85

Figura 38: Espectro de IV do composto 2j. ................................................................... 86

Figura 39: Espectro de RMN 1H do composto 2j. ......................................................... 87

Figura 40: Estrutura química dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos

sintetizados.......................................................................................................................

92

Figura 41: Mecanismo de ação das tiossemicarbazonas proposto por Du e

colaboradores (2002).......................................................................................................

99



LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1: Rota de obtenção de tiossemicarbazonas a partir de tiossemicarbazidas..... 43

Esquema 2: esquema da síntese do 1-ciclohexilideno-N (1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-

3-ilideno) tiossemicarbazona.............................................................................................

43

Esquema 3: Rota sintética de bis-[N(4)-tiossemicarbazonas] a partir do 1-fenilglioxal. 44

Esquema 4: Reação global da isatina com N-[4-(4‘-clorofenil) tiazol-2-il]

tiossemicarbazida, produzindo tiossemicarbazona............................................................

44

Esquema 5: Rota sintética de tiossemicarbazonas a partir de aldeídos naturais ((3R)-

(+) citronelal......................................................................................................................

45

Esquema 6: Rota sintética de novas tiossemicarbazonas a partir de

ferrocenilchalconas............................................................................................................

45

Esquema 7: Rota de síntese de metil-piruvatos tiossemicarbazonas................................ 45

Esquema 8: Rota de síntese do composto pirazinaformamida N(4)-

metiltiossemicarbazona.....................................................................................................

46

Esquema 9: Rota de síntese do derivado tiossemicarbazônico da 3-(5-nitrofurfuril)

acroleína.............................................................................................................................

46

Esquema 10: Rota de síntese do composto 1,3-difenil-4-(4‘-fluro)benzal-5-pirazolona-

4-etil tiossemicarbazona (DP4FBP–ETSC)....................................................

47

Esquema 11: Rota de síntese de várias α-silil-substituidas tiossemicarbazonas.............. 47

Esquema 12: Rota de síntese de uma série de 1-metil-2,6-diarilpiperidina-4-ona

tiossemicarbazonas.............................................................................................................

48

Esquema 13: Rota de síntese do composto (5-Bromobenzofuran-2-il)(3-metil-3-

mesitilciclobutil) cetona tiossemicarbazona......................................................................

48

Esquema 14: Rota de síntese de tiossemicarbazonas oriundas de derivados do



salicilaldeído...................................................................................................................... 49

Esquema 15: Rota de síntese de tiossemicarbazonas a partir de hidrazinas..................... 49

Esquema 16: Rota de síntese de bis-tiossemicarbazonas a partir do 3,5´diacetil-1,2,4-

triazol.................................................................................................................................

49

Esquema 17: Rota de síntese de tiossemicarbazonas esteroidais..................................... 50

Esquema 18: Rota de síntese uma série de 2-etoxi-3-metoxi-benzaldeído


50

Esquema 19: Rota de síntese novas 1-indanona-tiossemicarbazonas. 51

Esquema 20: Rota de síntese do (E)-2-(2,4-dihidroxi-benzilideno) tiossemicarbazona,

com rendimento de 87%....................................................................................................

51

Esquema 21: Rota de síntese do (E)-2-[(1H-indol-3-il) metileno] tiossemicarbazona

com rendimento de 67%....................................................................................................

51

Esquema 22: Rota de síntese de 2,4-diaril-3-azobiciclo[3.3.1]nonano-9-ona


52

Esquema 23: Rota sintética de complexos Pt/TSC segundo Horton & Varela................. 53

Esquema 24: Rota de síntese de complexos Oxovanádio/TSC........................................ 54

Esquema 25: Rota de síntese de complexos de Rênio/TSC............................................. 54

Esquema 26: Rota de síntese de complexos de Pd II segundo Shailendra....................... 55

Esquema 27: Rota de síntese de complexos de Ni II/ TSC.............................................. 55

Esquema 28: Rota de síntese de complexos de Pd segundo Kostas................................ 56

Esquema 29: Rota de síntese de complexos de Mo/TSC segundo Vrdoljak.................... 56

Esquema 30: Rota de Nitração dos Aril-aldeídos em presença de CHCl3....................... 71

Esquema 31: Rota de Nitração dos Aril-aldeídos em presença de H2SO4....................... 71

Esquema 32: Rota de obtenção das Nitro-Aril tiossemicarbazonas................................. 72



Esquema 33. Rota geral de síntese da bis-tiossemicarbazona 2g e 2l.............................. 73

Esquema 34: Mecanismo de condensação de compostos carbonilados com a

tiossemicarbazida...............................................................................................................

78



LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Principais efeitos colaterais observados na terapia específica da Doença de

Chagas.............................................................................................................................

39

Tabela 2: Estruturas químicas dos derivados 2a-2l e suas respectivas nomenclaturas.. 74

Tabela 3: As principais bandas de absorção dos grupos inerentes as moléculas

sintetizadas......................................................................................................................

79

Tabela 4: Valores das ZMI dos compostos testados, em mm........................................ 94

Tabela 5: Valores da Concentração Mínima Inibitória e Concentração Mínima

Bactericida para os compostos 2c e 2h frente às cepas avaliadas em µg/mL………….

96

Tabela 6: Atividade anti-T. cruzi dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos........... 98

Tabela 7: Citotoxicidade dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos....................... 103

Tabela 8: Relação IC50 X Citotoxicidade....................................................................... 105



LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

TSC: Tiossemicarbazona

Bdz- Benznidazol

Nfx : Nifurtimox

TCC- Cruzáina do T. Cruzi

TR- Tripanotiona Redutase

DCT- Doença de Chagas Transfusional

HIV: Human Imunodeficiency virus (Vírus da Imunodeficiência Humana)

DCA: Doença de Chagas aguda

IC: Insuficiência Cardíaca

ACTH: Hormônio Adrenocorticotrófico

NO2: Grupo nitro

DNA: Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxiribonucléico)

RMN – Ressonância Magnética nuclear

CCD: Cromatografia em camada delgada

EtOH: Álcool etílico

MeOH: Metanol

p-TsOH: Ácido para-tolueno sulfônico

EtOAc: Acetato de etila

Acac: Acetil-acetonato

DMSO: Dimetil sulfóxido

t-BuOK: Tert-butóxido de Potássio

CMI: Concentração mínima inibitória

CMB: Concentração mínima Bacteriostática



IV: Infra-vermelho



RESUMO

A doença de Chagas apresenta-se como um dos maiores problemas de Saúde Pública

em países da América Latina, chamados países endêmicos. Estima-se que 18 a 20 milhões de

pessoas estejam infectadas e que outros 100 milhões vivam em áreas de risco de

contaminação. No Brasil, apenas o benznidazol (Bdz) está disponível para o tratamento da

doença, e apesar de seu uso clínico, este fármaco apresenta efeitos colaterais severos, sendo

ativo apenas na fase aguda da doença. Neste contexto, faz-se necessário de novas substâncias

com potencial atividade anti-Tcruzi. Dentre os alvos biológicos considerados como mais

promissores no combate a doença de Chagas, encontram-se enzima Cruzaína ou cruzipaína do

T. cruzi (TCC) e a tripanotiona redutase (TR). As tiossemicarbazonas, grupo de moléculas

com amplo perfil farmacológico, vêm sendo relatadas na literatura como potentes inibidores

da TCC, principalmente as aril-tiossemicarbazonas. Nitrocompostos também tem sido

descritos como potentes inibidores irreversíveis da TR em condições anaeróbicas. Focando-se

nessas características, neste trabalho sintetizamos uma série de onze derivados nitro-aril

tiossemicarbazônicos e avaliamos seu potencial antimicrobiano e anti- T. cruzi, assim como as

suas toxicidades. Estes derivados (2a-2l) foram sintetizados a partir de aril-aldeídos

previamente nitrados e tiossemicarbazida, substituida ou não, em etanol sob temperatura

ambiente, acrescidas de quantidades catalíticas de HCl. A elucidação estrutural foi realizada

através da análise dos dados espectroscópicos de RMN 1H,

13C e IV. Em referência as

atividades biológicas, os testes antimicrobianos foram realizados in vitro, frente aos da

coleção do Departamento de Antibióticos da UFPE, onde se mediram as ZMI, CMB e CMI. A

atividade anti- T. cruzi foi avaliada com parasitos das cepas Y, frente à forma evolutiva

epimastigota. Para determinar o efeito antiproliferativo para T. cruzi, o ensaio colorimétrico

MTT (metil tiazol tetrazólio) foi empregado, obtendo os valores de IC50 em μg/mL. A

citotóxicidade foi avaliada em células esplênicas de camundongos utilizando-se o método de

incorporação da timidina tritiada, sendo os valores obtidos em μg/mL. Dos onze derivados

sintetizados e avaliados, o 2c, 2h e 2i obtiveram os melhores resultados nos testes

antimicrobianos, com merecido destaque para o 2h. Este também se mostrou ativo nos testes

anti- T. cruzi, sendo mais potente que o Bdz e possuindo a mesma citotoxicidade, sendo

considerado um possível protótipo na terapêutica da Deonça de Chagas.

Palavras-Chave: Tiossemicarbazonas, Doença de Chagas, Atividade antimicrobiana,

Atividade antiT.Cruzi, Nitrocompostos.



ABSTRACT

Chagas disease presents itself as a major public health problems in Latin America, called

endemic countries. It is estimated that 18 to 20 million people are infected and another 100

million live in areas at risk of contamination. In Brazil, only benznidazole (Bdz) is available

for the treatment of disease, and although its clinical use, this drug has severe side effects,

being active only during acute illness. In this context, it is necessary to new substances with

potential anti-Tcruzi activity. Among the biological targets deemed most promising in the

fight against Chagas disease, there are cruzain enzyme, cruzipain of T. cruzi (TCC) and

trypanothione reductase (TR). The thiosemicarbazones, group of molecules with broad

pharmacological profile, have been reported in the literature as potent inhibitors of TCC,

especially aryl thiosemicarbazones. Nitrocompounds also has been described as potent

irreversible inhibitors of TR under anaerobic conditions. Focusing on these features, in this

work we synthesized a series of eleven nitro-aryl thiosemicarbazones derivatives and we

evaluated their potential antimicrobial and anti-T cruzi, as well as their toxicities. These

derivatives (2a-2l) were synthesized from aryl aldehydes previously nitrated and the

Thiosemicarbazones substituted or not, in ethanol at room temperature, together with catalytic

amounts of HCl. Structural elucidation was performed by analysis of spectroscopic data of

1H, 13C and IV. With reference to the biological activities, antimicrobial tests were performed

in vitro, against to the collection of the Antibiotics Department of UFPE, where he measured

the ZMI, CMB and CMI. Anti-T. cruzi activity was performed with parasites from the Y

strains, against to the evolving form called epimastigote. To determine the antiproliferative

effect of T. cruzi, the MTT colorimetric assay (methyl thiazole tetrazolium) was used,

obtaining the IC50 values in μg/mL. Cytotoxicity was evaluated in spleen cells of mice using

the method of incorporation of tritiated thymidine, and the values obtained in μg/mL. Of the

eleven derivatives synthesized and evaluated, 2c, 2h and 2i showed the best results in

antimicrobial testing, with deserved attention for 2h. This last one was also active in testing

anti-T. cruzi, being more potent than the BDZ and having the same cytotoxicity, therefore it

can be considered a possible prototype in the treatment of Chagas Disease.

Keywords: Thiosemicarbazones, Chagas disease, Antimicrobial activity, anti- T.Cruzi

activity, nitrocompounds.

23


CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO, REVISÃO DA LITERATURA

E OBJETIVOS

24


1. INTRODUÇÃO

Todo ano morrem mais de um milhão de pessoas em todo mundo vítimas de doenças

intituladas negligenciadas. As opções de tratamento para estas patologias, quando disponíveis,

são ineficazes e ultrapassadas, causando uma série de efeitos colaterais, além de não

promoverem a cura definitiva. As doenças tropicais são os principais representantes das

doenças negligenciadas, atingindo em sua grande maioria, pessoas muito pobres, distribuídas

pelos países com baixo nível de desenvolvimento sócio-econômico.

Levando-se em consideração que as pessoas afetadas por essas doenças não

representam um mercado lucrativo para atrair investimentos necessários para a pesquisa e o

desenvolvimento de novos medicamentos, essas doenças vêm sendo progressivamente

marginalizadas por decisões dos responsáveis pelos programas de pesquisa, tanto no setor

privado, quanto no setor público. Como podemos observar na Figura 1, entre 1975 e 2004,

apenas 21 medicamentos foram registrados para doenças tropicais e tuberculose, ainda que

estas doenças constituam mais de 11% da carga global de doença. Durante o mesmo período,

1.535 medicamentos foram registrados para outras doenças1.

Figura 1: Número de novos medicamentos desenvolvidos entre os anos de 1975 e 2004.

Por sua grande difusão, pela gravidade das manifestações que pode apresentar

e pela complexidade de sua profilaxia, a doença de Chagas, causada pelo parasito

Trypanosoma cruzi, apresenta-se como uma doença extremamente negligenciada,

representando grave e alarmante problema sanitário2. Mesmo após mais de 100 anos da sua

descoberta pelo pesquisador Carlos Chagas, o tratamento específico anti- T. Cruzi

permanece inapropriado e irresoluto, permitindo apenas efeitos supressivos, podendo diminuir

a parasitemia no curso do tratamento, não garantindo a cura definitiva3.

25


NN

O

H

N

NO2

Benznidazol

O único fármaco atualmente disponível para a quimioterapia antichagásica no Brasil é

o Benznidazol (N-benzil-2-nitroimidazol-1-acetamida, Bdz, Figura 2), agindo através da

redução do seu grupo nitro e formação de ligações covalentes com macromoléculas do T.

cruzi 4. É eficaz na fase aguda da doença, com excelentes taxas de cura na fase inicial da

doença, e na infecção congênita. No entanto, é ineficaz no estágio crônico da doença e está

associada com efeitos colaterais severos, os quais podem resultar na interrupção do

tratamento5.

Até o ano de 2007, somente uma única formulação farmacêutica do Bdz (comprimidos

de liberação imediata na dose de 100 mg) estava disponível no mercado, o que tornava não

indicado o tratamento para crianças (no qual a dose recomendada é de 25 mg por dia) e para

idosos, que em alguns casos tem dificuldade em deglutir, exemplificando mais uma

característica agravante desta monoterapia5.

Tendo em vista todo esse panorama que define a terapêutica da doença de Chagas

como algo ineficaz, ultrapassado e inapropriado, têm-se cada vez mais intensificada a

necessidade de recorrer a novas alternativas terapêuticas para a obtenção de fármacos mais

seguros, ativos e com alvos biológicos mais específicos, principalmente para a fase crônica da

doença.

Figura 2: Estrutura química do Benznidazol.

As tiossemicarbazonas apresentam um amplo perfil farmacológico e constituem uma

classe importante de compostos cujas propriedades têm sido extensivamente estudadas na

Química Medicinal. Para o desenvolvimento de fármacos antichagásicos, as pesquisas estão

sendo focadas para a inibição da enzima Cruzaína ou cruzipaína do T. cruzi (TCC)7 e a

Tripanotiona redutase (TR)8. A porção tiossemicarbazona presente em alguns compostos

descritos na literatura, mostra-se como um grupo farmacofórico que apresentam potencial

atividade inibitória da TCC 9,10

, principalmente aril-tiossemicarbazonas, descritos desde 2002

como potentes agentes tripanocidas e de baixa citotoxicidade11

.

26


Segundo Du e colaboradores (2002), a interação tiossemicarbazona-TCC, acontece via

ataque covalente do resíduo Cys25 da TCC em direção ao carbono da tiocarbonila e

transferência de um próton do resíduo His159, formando um derivado tetraédrico. Em estudos

de ―docking‖ realizados em 2006 e 2007, Leite e colaboradores, comprovaram a afinidade das

aril-tiossemicarbazonas com a TCC, revelando a capacidade inibitória que as

tiossemicarbazonas possuem.

Tendo em vista todos esses estudos que demonstram e comprovam a atividade das

tiossemicarbazonas, em especial aril-tiossemicarbazonas, como potentes armas na terapêutica

contra o T. cruzi, nesse trabalho decidimos aliar essa notável característica com a conhecida

atividade do grupamento nitro como parasitóforo, presente no Bdz, através do planejamento e

síntese de novos derivados nitro-ariltiossemicarbazônicos, os quais possam apresentar real

atividade contra o T. cruzi, principalmente no estágio crônico da doença.

I- 2. REVISÃO DA LITERATURA

II- 2.1 DOENÇA DE CHAGAS

II- 2.1.1 Generalidades da doença de Chagas

A doença de Chagas constitui-se, pela sua vasta distribuição, altos índices de

prevalência e gravidade de evolução, um dos maiores problemas de Saúde Pública em países

do cone sul das Américas12,13

. Estima-se que sejam de 18 a 20 milhões os indivíduos

infectados nessa região e que outros 100 milhões vivam em áreas de risco de contaminação14

.

Esta enfermidade foi descoberta e descrita pelo grande cientista Carlos Ribeiro

Justiniano das Chagas em Abril de 1909, sendo seu agente etiológico, o protozoário

Trypanosoma cruzi, por ele assim nomeado em homenagem a Oswaldo Cruz, e o inseto vetor,

um triatomíneo conhecido popularmente como barbeiro (Figura 3) pelo hábito de picar o rosto

de suas vítimas, descobertos previamente no final de 190815

.

27


Figura 3. Barbeiro (Triatoma infestans): inseto transmissor da doença de Chagas.

O parasita possui um complexo ciclo biológico passando por hospedeiros vertebrados

e invertebrados, e apresenta diferentes formas evolutivas subdivididas em flageladas

(epimastigota e tripomastigota) e aflagelada (amastigota).

A doença é um exemplo típico de uma injúria resultante das alterações produzidas pelo

ser humano ao meio ambiente. O protozoário responsável pela parasitose vivia restrito à

situação silvestre, circulando entre mamíferos do ambiente natural através do inseto vetor ou,

também, por via oral através da ingestão de vetores e mamíferos infectados. O homem se fez

incluir no ciclo epidemiológico da doença, oferecendo ao vetor hemíptero vivendas rurais de

péssima qualidade (Figura 4), as chamadas casas de pau-a-pique16

.

Figura 4: Fatores predisponentes para o aparecimento da doença de Chagas

As formas mais importantes de transmissão da doença de Chagas ainda são as

vetoriais, seja via lesão resultante da picada, seja por mucosa ocular ou oral. Contudo,

apresenta também grande importância epidemiológica a transmissão transfusional e a

congênita. Mais recentemente, houve surtos de transmissão por meio da via oral, devido

ingestão de alimentos contaminados.

28


Embora considerada eminentemente rural, atualmente a doença de Chagas representa

um problema também para os centros urbanos. Admite-se que dos 3,4 milhões de infectados

existentes no Brasil, 60% estejam vivendo no espaço urbano em grandes centros como

Grande São Paulo (cerca de 300 mil) e Grande Belo Horizonte (cerca de 100 mil). A doença

de Chagas é a terceira mais importante causa mortis entre as doenças infecciosas e parasitárias

(13,6%) e o número absoluto de óbitos ainda é muito relevante, chegando a cerca de 6000 por

ano. Os estados de Minas Gerais, Goiás, São Paulo, Bahia, Paraná, Rio Grande do Sul e os da

região Nordeste apresentam a mais alta endemicidade no Brasil 17,18

.

Enquadrando-se no setor das doenças negligenciáveis, a doença de Chagas não

representa um mercado lucrativo para atrair investimentos necessários para a pesquisa e o

desenvolvimento de novos medicamentos, sendo por este motivo, progressivamente

marginalizadas por decisões dos responsáveis pelos programas de pesquisa, tanto no setor

privado, quanto no setor público1.

II- 2.1.2 Epidemiologia

Endêmica em 21 países, a doença de chagas afeta atualmente cerca de 18 a 20 milhões

de pessoas distribuídas pelo México, Américas Central e do Sul. Globalmente é descrita como

a terceira mais importante doença parasitária, sendo responsável por significativos encargos

econômicos e de saúde pública na América Latina19

. Estimativas informam que essa

enfermidade mata aproximadamente 14 mil pessoas por ano nessa região, matando mais do

que qualquer outra doença negligenciada, inclusive a malária. Relata-se também que outros

100 milhões de indivíduos vivam em áreas de risco de contaminação14,20

.

No final da década de setenta, uma alta incidência de casos da doença de Chagas foi

observado no Brasil, chegando a cerca de 100 mil novos casos por ano. Hoje se estima que

cerca de 3,4 milhões de pessoas estejam infectadas 21,22

. Atualmente, casos e surtos podem ser

observados em diferentes estados (Bahia, Ceará, Piauí, Santa Catarina, São Paulo), sendo sua

maior a freqüência na região da Amazônia Legal, que engloba os estados do Amazonas,

Maranhão, Mato Grosso, Amapá, Pará, Tocantins23

.

Recentes estudos mostraram um crescimento rápido e notável em países fora da

América Latina, intitulados países não-endêmicos (Austrália, Canadá, Espanha e E.U.A). Isto

se deve ao advento da migração de aproximadamente 15 milhões de pessoas vindas de área

conhecidamente endêmicas 24,25

.

29


Figura 5: Estimativa da população global afetada pelo Trypanosoma cruzi, 2009.

Estima-se que nos EUA existam 300.167 pessoas infectadas, sendo este valor

aproximadamente seis vezes maior que os casos relatados na Espanha26,27

. Na Europa

Ocidental, em 2008 foi relatado que o numero total de pessoas infectadas vivendo nesta região

é de 25 a 40 mil, tendendo a aumentar 28,29,30,31

.

III- 2.1.3 Ciclo Biológico

O ciclo biológico do T. cruzi é do tipo heteroxênico, passando o parasito por uma fase

de multiplicação intracelular no hospedeiro vertebrado (homem e mamíferos pertencentes a

sete ordens diferentes) e extracelular no inseto vetor (triatomíneos) 32

. Este ciclo compreende

três estágios ou formas principais, dotadas de características morfológicas e biológicas

distintas. As formas evolutivas envolvidas nesse ciclo são a amastigota, tripomastigota e

epimastigota.

Os amastigotas possuem formas arredondadas ou ovóides, imóveis, desprovidas de

flagelo livre. Agrupam-se em "ninhos" na intimidade de tecidos diversos do hospedeiro

vertebrado. Trata-se da forma de multiplicação do parasita no hospedeiro vertebrado e medem

de 1,5 a 4 µm de diâmetro.

Os tripomastigotas apresentam corpo alongado, com cerca de 20 µm de comprimento.

São formas encontradas no sangue dos hospedeiros vertebrados e nas porções terminais do

http://www.treatchagas.org/cp_chagas_globalview.aspx

30


intestino dos vetores 33

.

A forma epimastigota, apresenta cerca de 20 µm de comprimento e trata-se da forma

multiplicativa do parasita no intestino do triatomíneo, e é também a forma predominante em

cultivo axênico, sendo por isso, mais comumente utilizada em estudos bioquímicos34

.

Figura 6: Formas evolutivas do Trypanosoma cruzi – A: Fibras musculares cardíacas infestadas pela forma

amastigota; B: Forma epimastigota e C: Forma tripomastigota

Considerando o mecanismo natural de infecção pelo T. Cruzi, os tripomastigotas

metacíclicos eliminados nas fezes e urina do vetor, durante ou logo após o repasto sanguíneo,

penetram pelo local da picada e interagem com células do sistema mononuclear fagocitário da

pele ou mucosas. O parasita tem acesso facilitado ao interior do organismo pelo toque das

mãos, já que a picada causa irritação local. Se a picada for próxima dos olhos ou da boca, o

parasita pode penetrar diretamente pelas mucosas. Uma vez dentro do organismo, os

tripomastigotas entram em uma variedade de células, dentro das quais se transformam em

amastigotas. Nesse estágio, os parasitas reproduzem-se por fissão binária35,36,37

.

A seguir, ocorre a diferenciação dos amastígotas em tripomastigotas, que são liberados

da célula hospedeira caindo no interstício. Estes tripomastigotas caem na corrente circulatória,

atingem células de qualquer tecido ou órgão para cumprir novo ciclo celular. Por vezes, estes

podem ser destruídos por mecanismos imunológicos do hospedeiro ou ainda serem ingeridos

por triatomíneos, onde cumprirão seu ciclo extracelular32

.

No estômago do inseto triatomíneo, a forma tripomastigota transforma-se

gradualmente em formas arredondadas, algumas com um longo flagelo colado ao corpo e

outras com um curto flagelo, chamadas de esferomastigotas e epimastigotas, respectivamente.

Em seguida, os parasitas migram para o intestino, onde se multiplicam como formas

epimastigotas, o que pode ser observado cerca de 25 horas após o repasto sanguíneo.

Posteriormente migram para a parte mais posterior, atingindo o reto, e transformam-se em

tripomastigotas metacíclicos, que são eliminados junto com as fezes e urina do triatomíneo

A B C

31


fechando assim o ciclo evolutivo do T. Cruzi 37

. O ciclo evolutivo do T. Cruzi é demonstrado

na Figura 7.

Figura 7: Ciclo biológico da doença de Chagas

I- 2.1.4 Transmissão

A doença de Chagas é transmitida nos países endêmicos principalmente pelo inseto

Triatoma infestans, conhecido popularmente como barbeiro25,38,39

. Relatos da literatura têm

informado que a transmissão vetorial foi significativamente reduzida devido aos esforços de

controle, como a Iniciativa do Cone Sul um dos maiores programas de cooperação

internacional contra a doença de Chagas, criada em Brasília em julho de 1991. 40,41

.

Em nove de junho de 2006, durante sua primeira reunião anual, a Comissão da

Iniciativa do Cone Sul, declarou formalmente que o Brasil está livre da transmissão da doença

de Chagas pelo Triatoma infestans. O Uruguai foi o primeiro país do Cone Sul a conseguir,

em 1997, a interrupção da transmissão vetorial42

. De 100 milhões de pessoas que se estimava

32


estarem em risco de contrair a doença nessa região, 60 milhões vivem agora sem esse risco43

.

Levando em consideração este fato, as transfusões de sangue, transplantes de órgãos e as

transmissões congênitas começam a representar riscos reais de transmissão da doença de

Chagas 29

.

A Triagem das gestantes para a doença de Chagas durante os cuidados de saúde pré-

natal, especialmente quando eles nascem em uma área endêmica, tem importante papel para

diminuir a incidência da transmissão de mãe para filho, a chamada transmissão congênita25

.

Este tipo de contaminação ocorre quando existem ninhos de amastígotas na placenta, que

podem liberar tripomastigotas, chegando à circulação fetal32

.

Na América Latina, a doença de Chagas afeta cerca de dois milhões de mulheres em

idades férteis, que são susceptíveis de transmiti-la para o seu feto44

. Estimativas recentes

indicam que na América do Norte, por ano, pelo menos 2.000 recém-nascidos estejam sujeitos

a contraí-la45

.

A transmissão transfusional ganhou relativa importância epidemiológica nas duas

últimas décadas, em função da migração de indivíduos infectados para os centros urbanos e da

ineficiência no controle das transfusões, nos bancos de sangue23

. A Prevalência de sangue para

doação infectado por T. Cruzi na Europa e América do Norte varia muito, chegando a 0,62%

na Espanha46

. Recentemente, E.U.A., Espanha e França implementaram medidas para reduzir

o risco transfusional através da seleção dos doadores de sangue e as estratégias de exclusão

31.

Comprovada nos anos 50 no Brasil, estima-se que no início da década de 80 cerca de

20 mil novos casos de doença de Chagas transfusional (DCT) eram produzidos anualmente.

Neste mesmo período, a prevalência média de 7,03% em candidatos à doação de sangue, teve

este coeficiente diminuído para 3,18% na década de noventa e atualmente para 0,6% na

hemorrede pública e de 0,7% na rede privada. O risco de transmissão transfusional da

infecção chagásica no Brasil é 10-15 vezes aquela estimada para a infecção pelo HIV, HBV

ou HCV, dependendo da região47

.

Ainda a nível de Brasil, uma Nota Técnica do Ministério da Saúde divulgada em 2007

revelou que a transmissão via oral vem mostrando alguma relevância, principalmente devido

ao surto em Santa Catarina no ano de 2005. Nesse episódio foram identificados 45 casos

suspeitos de Doença de Chagas Aguda (DCA) relacionados à ingestão de caldo de cana, 31

com confirmação laboratorial, sendo que cinco pacientes evoluíram para óbito.

Nos anos de 2000, 2001 e 2004, ocorreram 57 casos de doença de DCA por

33


transmissão oral; no período de 2005 a 2007, esses números somaram 301 casos. No ano de

2006 houve a confirmação de 115 casos de DCA, na região Norte e Nordeste, sendo 94 casos

de transmissão via oral, devido ao consumo na maioria dos casos de açaí contaminado.

Registrou-se também neste período surto pela ingestão de bacaba e de cana-de-açúcar 48

. Em

2008, foram diagnosticados 94 casos de DCA no estado do Pará, dos quais 57 (65%) estavam

envolvidos em transmissão oral; 20, no estado do Amapá, todos por provável transmissão oral

e 7 no estado do Tocantins, 4 por transmissão oral (80%) e 1 vetorial23

.

I- 2.1.5. Manifestações clínicas

A infecção chagásica humana pode se manifestar na forma aguda (sintomática ou

assintomática), na forma crônica e indeterminada. Na maioria dos casos, a fase aguda da

doença é oligossintomática, principalmente em adultos, não sendo valorizada pelo paciente ou

pelo agente de saúde. Esta tem seu início evidenciado através das manifestações locais

geradas quando o T. cruzi penetra na conjuntiva ou na pele, denominadas de sinal de Romaña

e chagoma de inoculação, respectivamente (Figura 8). Estas lesões aparecem em 50% dos

casos agudos dentro de 7-10 dias após a picada do barbeiro, regredindo em um ou dois

meses3.

Figura 8: A: Sinal de Romaña; B: chagoma de inoculação

As manifestações gerais são representadas por febre, mal-estar geral, dor de cabeça,

perda do apetite, fraqueza, edema localizado ou generalizado, inchaço de gânglios linfáticos

(adenopatia), hepato-esplenomegalia. Em alguns pacientes, principalmente crianças ou

indivíduos imunodeficientes, quadros meníngeos graves, alterações no eletrocardiograma e de

Insuficiencia Cardíaca podem estar associados, chegando a óbito. É importante ressaltar que a

gravidade da infecção depende também de outros fatores, como a virulência do parasito e o

tamanho do inóculo 49,50,51

. A fase aguda da doença pode durar de um mês a um ano, podendo

A B

34


o paciente evoluir para a fase crônica ou indeterminada.

Após a fase aguda, os sobreviventes passam por um longo período assintomático,

cerca de 10 a 30 anos, sendo esta fase chamada de indeterminada. Caracteriza-se por

apresentar positividade de exames sorológicos e/ou parasitológicos, ausência de sintomas e/ou

sinais da doença, eletrocardiograma convencional normal e coração, esôfago e cólon

radiologicamente normais. Aproximadamente 50% dos pacientes chagásicos que tiveram a

fase aguda evoluem para a fase indeterminada, que, apesar de assintomática e de apresentarem

lesões muito discretas, pode causar morte súbita de alguns pacientes mais debilitados32

.

Cerca de um terço dos casos agudos da doença de Chagas alcança para a fase crônica.

Esta, em alguns casos, segue imediatamente o período agudo. Em outros, instala-se depois da

fase indeterminada, anteriormente descrita12,52

. Pacientes nessa fase da doença apresentam

manifestações clínicas diversas, afetando de forma irreversível um ou mais órgãos. A

cardiopatia chagásica crônica e o aparecimento dos megas (megaesôfago e megacólon,

principalmente) representam as formas clínicas de maior gravidade 53,54,55

.

Na forma cardíaca, o coração mostra-se macroscopicamente aumentado de volume e

mais pesado do que o normal, com peso de 550 g em média e hipertrofia das paredes (Figura

9). Dentre os seus principais sintomas enquadram-se arritmias (75.000 casos/ano),

insuficiência cardíaca, trombo-embolismo, insônia, congestão visceral e edema dos membros

inferiores 32

.

As manifestações digestivas são representadas principalmente no Brasil e na Argentina

pelos megas, onde aparecem alterações morfológicas e funcionais importantes, como, por

exemplo, a incoordenação motora (aperistalse, discinesia) caracterizando o megaesôfago e o

megacólon.

Figura 9: Coração de pacientes que desenvolveram doença de Chagas e morreram por: (A) morte súbita, (B)

megacólon ou mega-esôfago e (C) insuficiência cardíaca congestiva

35


No caso do megaesôfago (45.000 casos/ano), observa-se o aumento do diâmetro do

órgão e alterações na motilidade, além de sintomas como dores epigástricas, regurgitação,

hipertrofia das glândulas salivares, disfagia, pirose, soluço, tosse e sialose. Acomete mais o

sexo masculino do que o feminino, sendo mais freqüente na zona rural endêmica. O

megacólon (30.000 casos/ano) apresenta como principal característica a obstipação do órgão,

podendo durar semanas, e a perfuração levando por vezes à peritonite 32,54, 56

.

I- 2.1.6. Tratamento e novos alvos terapêuticos

A doença de Chagas, por sua grande difusão, gravidade das manifestações que pode

apresentar e pela complexidade de sua profilaxia, representa grave e alarmante problema

sanitário2. Mesmo após mais de 100 anos da sua descoberta, o tratamento específico anti- T.

Cruzi permanece inapropriado e irresoluto, permitindo efeitos supressivos, podendo apenas

diminuir a parasitemia no curso do tratamento, não garantindo, portanto, a cura definitiva3.

Os primeiros compostos desenvolvidos experimentalmente para o tratamento

específico da tripanossomíase americana, após a sua descoberta em 1909, foram o atoxyl

(arsênico), a tintura de fucsina, o tártaro emético (antimonial pentavalente) e o cloreto de

mercúrio. Todos estes compostos se mostraram ineficazes no tratamento proposto, além de

exibirem uma alta toxicidade 5,57

.

Entre os anos de 1936 e 1960 diversos medicamentos foram testados na tentativa de

obter-se êxito, porém estes apenas obtiveram resultados negativos ou duvidosos. Dentre os

testados destacam-se os derivados de quinoleínas e vários outros antimaláricos, arsenobenzóis

e outros arsemicais, fenantridinas, sais de ouro, bismuto, cobre e de zinco, iodeto de sódio,

violeta de genciana, aminopterinas, ácido para-aminosalicílico, hidrazida do ácido nicotínico,

sulfonamidas, anti-histamínicos, ACTH e cortisona, derivados da estilomicilina, anfotericina

B e mais de 30 antibióticos, e alguns nitrofuranos58

.

Maior atenção foi dada aos nitrocompostos a partir da década de 40 com sua

introdução e emprego em terapêutica, período em que milhares de compostos desta classe

foram sintetizados e testados frente a diversas doenças, dentre estas a doença de Chagas 59

.

Estes pareciam ter atividade biológica dependente da presença do grupo nitro ligado à

molécula, que resultava basicamente, em mudanças na estabilidade do mesmo, intermediada

por interações entre o nitrocomposto e o seu alvo na biofase. Dentre estes nitrocompostos,

36


destacam-se os derivados nitrotiofênicos, nitrofurânicos, nitrobenzênicos e nitroimidazólicos

(Figura 10).

Figura 10: Subestruturas químicas fundamentais de nitrocompostos empregados em terapêutica.

A década de 60 trouxe diversos avanços na terapia da doença de chagas, com

mudanças benéficas a nível de direcionamento para o desenvolvimento de novos fármacos

eficazes no tratamento anti-chagásico. O primeiro passo foi dado a partir da utilização de um

derivado dos nitrofuranos, a Nitrofurazona (5-nitro-2-furaldeído-semicarbazona), em esquema

de duração prolongada (53 dias em média) na dose de 100mg/kg/dia, que curava mais de 95%

dos camundongos cronicamente infectados. Entretanto, a conclusão final foi de que a

Nitrofurazoma poderia ser curativa, mas os pacientes não toleravam os efeitos colaterais nas

doses e no tempo necessário para a cura, devido a sua alta toxicidade60

.

Figura 11: Estrutura molecular da nitrofurazona

No final da década de 1960 e início de 1970 dois novos nitrocompostos, os quais são

utilizados até hoje, surgiram trazendo melhores perspectivas para o tratamento da doença de

Chagas, tanto pelo potencial curativo, particularmente para a fase aguda, como também por

Derivados Derivados Derivados Derivados

Nitrofurânicos Nitrotiofênicos Nitroimidazólicos Nitrobenzênicos

37


N N

NO2

N

O

H

Bdz Nfx

ONO2N

N SO2

exibirem uma melhor tolerância quando comparados aos anteriores. Essas duas drogas são o

nifurtimox (Nfx), um derivado nitrofurânico: 3-metil-4-(5´-nitrofurfurilidenoamino)

tetrahidro-4H-1, 4-tiazina-1,1-dióxido (Bayer 2502) comercializado como nome de Lampit; e

o benznidazol (Bdz), um derivado 2-nitroimidazólico: N-benzyl-2-nitroimidazol acetamida

(RO 7-1051), comercializado com o nome de Rochagan® no Brasil e Radanil® na Argentina.

Figura 12: Fármacos utilizados na terapia antichagásica.

A ação destes fármacos é afetada diretamente por algumas condições, como a duração

do tratamento, a idade e a distribuição geográfica dos pacientes, entre outros. O grupamento

nitro (NO2), considerado como parasitóforo, presente em ambas as moléculas está diretamente

relacionado nos seus mecanismos de ação, também contribuindo para a elevada toxicidade

apresentada por estas14

.

O nifurtimox é tripanossomicida contra as formas amastigotas do T. cruzi. Seu

mecanismo de ação envolve a redução parcial ao ânion radical seguida por auto-oxidação para

regenerar o nitrofurano original e formar o radical ânion superóxido e outras espécies reativas

de oxigênio, como o peróxido de hidrogênio e radical hidroxila. O T. cruzi mostra-se

deficiente em mecanismos de detoxificação para metabólitos do oxigênio, particularmente o

peróxido de hidrogênio, apresentando assim, mais sensível ao estresse oxidativo do que às

células vertebradas 61

.

A ação do benznidazol não envolve danos oxidativos, e seu mecanismo de ação parece

envolver uma diminuição da síntese de proteínas, redução de incorporação dos precursores de

RNA e diminuição da incorporação da timidina em DNA62,63

. O radical nitro estaria envolvido

com seu efeito tripanocida através da formação de ligações covalentes com macromoléculas

do T. cruzi 4.

A duração media do tratamento é de cerca de sessenta dias, mas quando a doença

crônica é reativada como em pacientes imunocomprometidos, este pode durar cinco meses ou

38


mais. Apenas em tratamentos de pacientes contaminados acidentalmente, como por exemplo,

em um laboratório, a duração da profilaxia é aproximadamente dez dias64

.

Segundo requerimentos de 1997 da Organização Mundial de Saúde, uma droga para

ser considerada ideal no tratamento da doença de Chagas deve possuir algumas características

peculiares, que são as seguintes:

1- Cura parasitológica na fase aguda e crônica da doença;

2- Ser efetiva em uma ou poucas doses;

3- Ser de baixo custo para o paciente;

4- Não possuir efeitos colaterais nem teratogênicos

5- Não requerer internação para o tratamento e;

6- Não induzir resistência.

Por não cumprir vários desses pré-requisitos, principalmente as abordadas nos

números 1-4, o Nifurtimox (Lampit®) e o Benznidazol (Rochagan

®) mesmo sendo

apresentadas como drogas promissoras, não podem ser consideradas drogas ideais para a

terapia anti- T. cruzi. Ambas não possuem eficácia considerável na fase crônica da doença e

os efeitos colaterais apresentados são o seu inconveniente principal 53,65

. Devido a este último

fator, desde a década de 1980 apenas o Benznidazol permanece disponível em território

nacional. A tabela abaixo mostra os principais efeitos colaterais apresentados por ambas,

representando as intensidades por cruzes.

39


Tabela 1: Principais efeitos colaterais observados na terapia específica da Doença de Chagas.

Tendo em vista todo esse panorama que define a terapêutica da doença de Chagas

como algo ineficaz, ultrapassado e inapropriado, têm-se cada vez mais intensificada a

necessidade de recorrer a novas alternativas terapêuticas para a obtenção de fármacos mais

seguros, ativos e com alvos biológicos mais específicos, principalmente para a fase crônica da

doença. O desenvolvimento deste tipo de fármacos requer um melhor conhecimento do ciclo

de vida e do metabolismo do T. cruzi.

Vários alvos biológicos têm sido apontados como alvos terapêuticos potenciais para a

doença de Chagas, dentre eles destacam-se: enzima tripanotiona redutase, biossíntese de RNA

mensageiro, biossíntese de esteróis, transialidase, cruzaína do T. cruzi, possibilitando assim

um desenvolvimento racional de fármacos menos tóxicos e mais potentes contra o parasito42

.

A TR é uma flavoenzima NADPH-dependente e tem sido considerada uma enzima

chave no metabolismo oxidativo do parasito. Ocorre exclusivamente em tripanosomatídeos,

sendo indicada por este motivo como um dos mais promissores alvos na busca por drogas

tripanomicidas10

. Derivados nitrofurânicos, como a hidroximetilnitrofurazona, têm

demonstrado produzirem, in vitro, inativação irreversível desta enzima em condições

anaeróbicas 66

.

O T. cruzi requer esteróis específicos para a proliferação e a viabilidade de células em

todos os estágios de seu ciclo, sendo este parasito extremamente susceptível a inibidores da

biossíntese de esteróis. O principal esterol para o crescimento do T. cruzi é o ergosterol, o que

torna, portanto, a via de biossíntese desse lipídeo um alvo atrativo para o desenvolvimento de

Sintoma/sinal Bdz Nfx

Anorexia ++ +++

Cefaléia + ++

Dermatopatia +++ +

Excitação psíquica - +++

Gastralgia + +++

Insônia + ++

Náusea ++ +++

Perda de peso + +++

Polineuropatia + ++

Vômito ++ ++

40


fármacos 67

. Atualmente, as enzimas mais bem estudadas desta cascata metabólica são a

esterol 14-demetilase, lanoesterol sintase, esqualeno epoxidase, esqualeno sintase, D-24(25)

esterol metiltransferase, farnesilpirofosfato sintase e a farnesiltransferase14

.

A TCC é a principal cisteína protease do T. cruzi sendo liberada em todos os estágios

do ciclo de vida do parasita, porém entregue em diferentes compartimentos celulares em cada

estágio. É a enzima crucial para a atividade proteolítica do T. Cruzi e essencial para a

replicação intracelular do parasita, sendo um alvo em potencial para o desenvolvimento de

novas drogas tripanomicidas 68

. Recentemente tem sido demonstrado que a infecção por este

parasito pode ser curada em células de ratos e modelos de cães pelo tratamento com inibição

irreversível da cruzaína69

. Diversos trabalhos têm descrito a atividade inibitória provocada por

diversos grupos de compostos, como por exemplo, N-acilhidrazidas, uréias, tiouréias e

tiossemicarbazonas68

.

As tiossemicarbazonas (Figura 13) apresentam um amplo perfil farmacológico e

constituem uma classe importante de compostos cujas propriedades têm sido extensivamente

estudadas na Química Medicinal. Dentre estas atividades, destacam-se a antitumoral,

antibacteriana, antiviral, antiprotozoária e citotóxica70

.

Figura 13: Estrutura química das tiossemicarbazonas

Engajando-se nesta característica de alta versatilidade farmacológica desta classe de

compostos, vários pesquisadores têm direcionado seus estudos na síntese de novas

tiossemicarbazonas com a intenção de obter moléculas que sirvam como protótipos para o

desenvolvimento de novos fármacos antichagásicos. Desde 2002 as aril-tiossemicarbazonas

estão sendo descritas como potentes agentes tripanocidas e de baixa citotoxicidade 11

.

41


NR1

R2 N

H S

N H

H

Anti

N

R2

R1 N

H

S

NR3R4

Sin

I- 2.2. QUÍMICA DAS TIOSSEMICARBAZONAS

I- 2.2.1 Tiossemicarbazonas- Aspectos Químicos

As tiossemicarbazonas são compostos amplamente explorados na síntese orgânica,

podendo ainda adquiri-las comercialmente com preços bastante acessíveis. Apresentam-se

como sistemas com extrema deslocalização eletrônica, principalmente quando há grupos

aromáticos ligados ao carbono da imina; aproximadamente planar, com o átomo de enxofre

em posição anti em relação ao átomo de nitrogênio da função imina (Figura 14). Fatores

eletrônicos e estéricos contribuem para este arranjo estrutural, porém, possivelmente o fator

mais importante é que o átomo de enxofre em posição anti possibilita a ocorrência de ligação

de hidrogênio intramolecular entre o nitrogênio da imina e os hidrogênios da tioamida, isso

para as tiossemicarbazonas não substituídas em N-4. Levando em consideração as

substituídas, a conformação sin é a preferida pela molécula. 70

Figura 14: Representação das conformações das tiossemicarbazonas.

Devido à presença da ligação dupla na tiossemicarbazonas, podem ser encontrados

diasteisômeros conformacionais (Z e E). Mesmo a configuração E sendo teoricamente a mais

favorável, estudos têm evidenciado a mudança de configuração de aril-tiossemicarazonas

quando complexadas com metais de transição, tornando difícil a determinação

configuracional absoluta.

42


Figura 15: Representação dos estereoisômeros E e Z das Tiossemicarbazonas

Um complicador para a correta elucidação configuracional destes compostos é a difícil

atribuição da configuração por técnicas de RMN, talvez por causa da flexibilidade da ligação

iminíca e os efeitos paramagnéticos do nitrogênio, ou até mesmo devido ao efeito ‗guarda-

chuva‘ que pode ocorrer com os pares de elétrons livres do nitrogênio 71

.

Do ponto de vista sintético apresentam como característica principal, sua versatilidade

de obtenção, assim como sua aplicação como intermediários de muitos núcleos importantes.

Em geral, apresentam baixo custo de síntese, além de grande economia de átomos, uma vez

que, com exceção da água que é liberada em sua síntese, todos os outros átomos dos reagentes

estarão presentes na molécula final 9.

I- 2.2.2 Síntese de tiossemicarbazonas

Uma das formas mais simples de obtenção das tiossemicarbazonas se dá pela reação

de condensação equimolar de um derivado carbonilado (aldeído ou cetona), com

tiossemicarbazidas em meio alcoólico sob refluxo, e com quantidades catalíticas de ácido

(Esquema 1). Esta reação é muito utilizada pelo fato de possuir alta quimiosseletividade e

rapidez apresentando geralmente altos rendimentos 72,73

. As tiossemicarbazonas são

geralmente obtidas como misturas de isômeros E e Z, no estado sólido, havendo, em solução,

isomerização da configuração Z para E, devido a uma maior estabilidade termodinâmica.

R≠H

Isômero Z Isômero E

43


Esquema 1: Rota de obtenção de tiossemicarbazonas a partir de tiossemicarbazidas.

No ano de 1997, Gupta e Narayana, sintetizaram um derivado tiossemicarbazônico,

partindo-se de outra tiossemicarbazona previamente sintetizada segundo metodologia acima

descrita. Nesta nova metodologia, a 1-ciclohexilideno tiossemicarbazona, dissolvido em

álcool (100mL), foi misturado a uma solução de indol 2,3- diona em água (150mL),

produzindo o 1-ciclohexilideno-N (1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-ilideno) tiossemicarbazona.

A mistura foi refluxada em banho de água por 10 minutos, mostrando alto rendimento

(88%)74

.

Esquema 2: esquema da síntese do 1-ciclohexilideno-N (1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-ilideno)

tiossemicarbazona.

Mais tarde, em 1999, Castiñeiras e seu grupo de pesquisa publicaram em um de seus

trabalhos o método de obtenção de duas bis-[N(4)-tiossemicarbazonas]. Estas foram

Isômero Z Isômero E

Ts = Tiossemiarbazida;

R = H ou metil;

R1 e R2 = H, Aril ou Alquil

H+

44


preparadas a partir da reação, na proporção 2:1, do 1-fenilglioxal com uma dada

tiossemicarbazida em solução de etanol e gotas de ácido sulfúrico 72

.

Esquema 3: Rota sintética de bis-[N(4)-tiossemicarbazonas] a partir do 1-fenilglioxal.

Neste mesmo ano, Pandeya e colaboradores mostraram a síntese de

tiossemicarbazonas através da reação equimolar de isatina (indol 2,3 diona) com N-[4-(4‘-

clorofenil) tiazol-2-il] tiossemicarbazida. Ambos foram dissolvidos em etanol morno

contendo 1mL de ácido acético glacial. A mistura ficou sob refluxo por 15 horas e o sólido

resultante foi recristalizado uma mistura de etanol e clorofórmio, alcançando rendimento

excelente de 94,6%73

.

Esquema 4: Reação global da isatina com N-[4-(4‘-clorofenil) tiazol-2-il] tiossemicarbazida, produzindo

tiossemicarbazona.

Já no ano de 2000, Tarasconi e seu grupo realizaram a síntese de tiossemicarbazonas

através de uma reação de condensação de aldeídos naturais com a tiossemicarbazida, ambas

em solução alcoólica a 95% (10mL), sob irradiação ultrassônica(40°) durante 1 hora. Este

método visava aumentar a solubilidade dos reagentes e conseqüentemente o rendimento,

chegando em alguns casos a 95% 75

.

45


Esquema 5: Rota sintética de tiossemicarbazonas a partir de aldeídos naturais ((3R)- (+) citronelal.

No ano de 2001, Klimova e seu grupo de pesquisa demonstraram a síntese de uma

série de acetilferroceno- tiossemicarbazonas através da mistura de ferrocenilchalconas (Fc-

chalconas) com tiossemicarbazida. A reação se processa com excesso de t-BuOK em

isopropanol anidro(150mL) sob agitação e refluxo, durante cerca de 3-5 horas76

.

Esquema 6: Rota sintética de novas tiossemicarbazonas a partir de ferrocenilchalconas.

Novas metil-piruvato TSCs foram descritas por Ferrari et al., 2001. Nessa metodologia

fez-se reagir uma mistura de metil-piruvato e tiossemicarbazidas substituídas em etanol sob

refluxo e borbulhamento de gás nitrogênio por 2 horas, obtendo rendimentos que variam de

58 a 76% 77

.

Esquema 7: Rota de síntese de metil-piruvatos tiossemicarbazonas.

Em 2002, Labisbal e colaboradores, realizaram a síntese do composto

pirazinaformamida N(4)-metiltiossemicarbazona, que serviria de produto de partida para a

46


formação de complexos metálicos. Nesse trabalho, uma solução metanólica de cianopirazina

foi deixada sob agitação por meia hora. Nesse tempo, foi então adicionado lentamente a N(4)-

metiltiossemicarbazida em quantidades equimolares. Em seguida, mais 25 mL de metanol

foram acrescidos a mistura, deixando-se refluxar por no mínimo 4 horas. Não foi mostrado o

rendimento reacional 78

.

Esquema 8: Rota de síntese do composto pirazinaformamida N(4)-metiltiossemicarbazona.

Aguirre et al., 2004 sintetizou tiossemicarbazonas oriundas de derivados do 5-

nitrofuril. O 5-nitrofurfural ou 3-(5-nitrofurfuril) acroleina foram postas para reagir com

derivados da tiossemicarbazida. A reação se procedeu a temperatura ambiente em tolueno

seco, com alíquotas catalíticas de acido p-tolueno sulfônico (p-TsOH) (AGUIRRE et al.,

2004)10

.

Esquema 9: Rota de síntese do derivado tiossemicarbazônico da 3-(5-nitrofurfuril) acroleína.

Mais adiante, no ano de 2005, H. Chai e colaboradores descreveram a rota de síntese

do derivado 1,3-difenil-4-(4‘-fluro)benzal-5-pirazolona-4-etil-TSC (DP4FBP–ETSC). Este foi

obtido através da mistura de 1,3-difenil-4-(4‘-fluro)benzal-5-pirazolona com N(4)- etil

tiossemicarbazida, em etanol (40mL) e ácido acético glacial (2mL), em refluxo por 6 horas

sob agitação magnética. O rendimento da reação foi de 71%79

.

47


Esquema 10: Rota de síntese do composto 1,3-difenil-4-(4‘-fluro)benzal-5-pirazolona-4-etil tiossemicarbazona

(DP4FBP–ETSC).

Também em 2005, Bolm demosntrou a síntese de várias de α-silil-substituidas

tiossemicarbazonas para posterior ciclização. Nessa metodologia, reagiu-se um

correspondente α-silil-ceto éster (10mmol) em solução de 100mL acetato de etila (EtOAc),

com a tiossemicarbazida (20mmol). A suspensão foi agitada durante 1 hora a 50º C e filtrado

após duas. Obteve rendimento de 84 %80

.

Esquema 11: Rota de síntese de várias α-silil-substituidas tiossemicarbazonas.

Utilizando como produtos de partida derivados do 1-metil-2,6-diarilpiperidina-4-ona

(0.01 mol) e a própria tiossemicarbazida (0.01 mol) em metanol (45 ml), Balasubramanian et

al., 2005 sintetizou uma série de 1-metil-2,6-diarilpiperidina-4-ona TSCs. Após adição de

quantidades catalíticas de um acido de força média e refluxo de 3 horas, obteve-se o produto

desejado81

.

48


Esquema 12: Rota de síntese de uma série de 1-metil-2,6-diarilpiperidina-4-ona tiossemicarbazonas.

Karatas et al., 2006 obteve o composto (5-Bromobenzofuran-2-il)(3-metil-3-

mesitilciclobutil) cetona-TSC fazendo-se reagir a tiossemicarbazida (10mmol) com (5-

Bromobenzofuran-2-il)(3-metil-3-mesitilciclobutil) metanona (10mmol) em etanol seco

(80mL) e ácido p-tolueno sulfônico (0,01g), sob refluxo por um período de 8 horas. Obteve

rendimento de 85%, mesmo com a carbonila sofrendo um grande impedimento estérico82

.

Esquema 13: Rota de síntese do composto (5-Bromobenzofuran-2-il)(3-metil-3-mesitilciclobutil) cetona

tiossemicarbazona.

Cukurovali em 2006 preparou uma série de tiossemicarbazonas derivadas do

salicilaldeído. A uma solução de tiossemicarbazida e ácido p-tolueno sulfônico metanol

(50mL), foi adicionada lentamente uma solução de um apropriado salicilaldeído em 20 ml de

etanol absoluto. Manteve-se a mistura em agitação magnética contínua e aquecimento de 60-

70ºC 83

.

49


Esquema 14: Rota de síntese de tiossemicarbazonas oriundas de derivados do salicilaldeído.

No ano seguinte, Bondock demonstrou a síntese de TSC em duas etapas, sem a

utilização da tiossemicarbazida. Na primeira etapa, fez-se reagir 1-cloro-3,4-dihidronaftaleno-

2-carboxaldeído com hidrato de hidrazina, originando o composto 1-((4-cloro-1,2-

dihidronaftaleno-3-il)metileno) hidrazina, uma base de Schiff. Em seguida, essa base de

Schiff foi posta para reagir com uma solução de fenil- isotiocianato em dioxano fervente,

chegando enfim a respectiva tiossemicarbazona. A mistura ficou sob refluxo e agitação por 1

hora, obtendo rendimento de 77%84

. Esta metodologia, além de apresentar bom rendimento,

mostra-se basante versátil quimicamente, visto que torna possível sintetizar inúmeras

tiossemicarbazonas, partindo-se de isotiocianatos e hidrazinas com diferentes substituintes.

Esquema 15: Rota de síntese de tiossemicarbazonas a partir de hidrazinas

Matesanz e grupo, 2007, realizaram a síntese de bis-tiossemicarbazonas através da

reação do 3,5´diacetil-1,2,4-triazol (1,6mmol), previamente sintetizado, com a 4-etil-

tiossemicarbazida (3,2mmol), ambas em solução metanólica. A mistura ficou em refluxo por

no mínimo 6 horas 85

.

Esquema 16: Rota de síntese de bis-tiossemicarbazonas a partir do 3,5´diacetil-1,2,4-triazol.

50


Mais a frente, no ano de 2008, Khan mostrou a síntese de uma série de

tiossemicarbazonas esteroidais. Estas foram obtidas a partir da reação uma solução etanólica

de ciclopentil, ciclohexil e ciclooctil tiossemicarbazidas, na presença de algumas gotas de

HCl, com uma solução também alcoólica de cetonas esteroidais. A mistura ficou em

aquecimento (60ºC) e agitação magnética por 5 horas, obtendo altos rendimentos86

.

Esquema 17: Rota de síntese de tiossemicarbazonas esteroidais.

Núñez-Montenegro et al., 2008 demonstrou a síntese de uma série de 2-etoxi-3-

metoxi-benzaldeído TSC fazendo-se reagir uma solução aquosa(15mL) de tiossemicarbazidas

N(4)-substituidas com uma solução metanólica (15mL), acrescentando ainda algumas gotas

de ácido sulfúrico concentrado. Para evitar a precipitação do aldeído, mais metanol foi

adicionado. A reação ficou em refluxo e agitação por 2 horas87

.

Esquema 18: Rota de síntese uma série de 2-etoxi-3-metoxi-benzaldeído tiossemicarbazonas.

Partindo de derivados da 1-indanona, Finkielsztein e grupo, 2008, sintetizaram novas

1-indanona-tiossemicarbazonas. Nessa metodologia, uma suspensão em etanol de

tiossemicarbazida (2,7mmol) e dos derivados cetônicos (1,2mmol) ficou sob agitação e

refluxo durante 30 minutos. Em seguida adicionou-se 0,1 ml de ácido sulfúrico, mantendo-se

a agitação até o término da reação. Ao término, obteve-se rendimento médio de 65,5%88

.

51


Esquema 19: Rota de síntese novas 1-indanona-tiossemicarbazonas.

No ano seguinte, Yildiz e grupo demonstraram a síntese de duas tiossemicarbazonas, a

(E)-2-(2,4-dihidroxi-benzilideno) tiossemicarbazona (Esquema 20) e (E)-2-[(1H-indol-3-il)

metileno] TSC (Esquema 21), utlizando uma metodologia simples e diferente. Nesse método,

a tiossemicarbazida foi adicionada a uma solução em THF (100mL) do respectivo aldeído,

ficando sob agitação e aquecimento por 2 horas. Não houve a necessidade de adição do ácido

como catalisador. Houve uma pequena queda do rendimento da primeira para a segunda

reação, tendo como possível causa a solubilidade do produto de partida89

, limitando sua

utilização apenas para síntese de tiossemicarbazonas oriundas de aldeídos poucos polares.

Esquema 20: Rota de síntese do (E)-2-(2,4-dihidroxi-benzilideno) tiossemicarbazona, com rendimento de 87%.

Esquema 21: Rota de síntese do (E)-2-[(1H-indol-3-il) metileno] tiossemicarbazona com rendimento de 67%.

Em 2010, Ramachandran e equipe obtiveram uma série de 2,4-diaril-3-

52


azobiciclo[3.3.1]nonano-9-ona TSCs fazendo-se reagir a 2,4-diaril-3-azobiciclo

[3.3.1]nonano-9-ona em solução clorofórmio-etanólica (45mL) fervente com uma mesma

solução de cloridrato de tiossemicarbazida (0,01mol), a frio adicionada gota a gota, por 3

horas sob refluxo em banho de água90

.

Esquema 22: Rota de síntese de 2,4-diaril-3-azobiciclo[3.3.1]nonano-9-ona tiossemicarbazonas.

I- 2.2.3 Tiossemicarbazonas e seus metais complexos

As tiossemicarbazonas possuem uma capacidade intrínseca de formar complexos com

metais de transição, seja na sua forma tiona ou na forma tiol (Figura 16), formas essas

coexistentes em equilíbrio tautomérico, oriundas da intensa deslocalização de elétrons nessas

moléculas. A forma tiona atua como ligante neutro bidentado, enquanto a forma tiol se

desprotona e atua como ligante aniônico91

. Esta capacidade de formar ligação coordenada

com metais é aumentada se houver grupos doadores de elétrons ligados ao carbono da função

azometina92.

Figura 16: Representação das duas formas tautomérias das TSCs.

No âmbito da química medicinal, salvo poucas exceções, vantagens podem ser

observadas quando da utilização de moléculas bioativas complexadas com íons metálicos.

Dentre estas, o incremento da atividade biológica, quando comparado somente ao ligante; a

Tiona Tiol

53


habilidade de mimetizar substratos endógenos; e a modificação do perfil farmacodinâmico e

farmacocinético são alguns que merecem destaques.

Em 2000, Horton & Varela demonstraram a formação de complexos metálicos com a

3-deox-D-eritro-hexos-2-ulose bis-tiossemicarbazona. Essas bis-tiossemicarbazonas

demonstram particular interesse pelo fato de possibilitarem a formação de complexos

altamente estáveis. Utilizou-se para a reação os metais Pd, Cu II, Pt II, sendo este último o de

maior interesse. Para sua síntese, misturou-se K2PtCl4 (1 mmol) dissolvido em água quente

com uma solução hidroalcoólica (40 mL, 1:1) fervente da bis-tiossemicarbazona (1 mmol). A

solução verde resultante foi fervida por 5 minutos, ficando em seguida por 20 horas em

temperatura ambiente, alcançando rendimento de mais de 80%93

.

Esquema 23: Rota sintética de complexos Pt/TSC segundo Horton & Varela.

Mais adiante, no ano de 2001, Gangadharmath e grupo, mostrou a síntese de

complexos de oxovanádio IV tendo como ligantes uma série de 2,6 diformil-p-cresol bis

tiossemicarbazonas, onde o átomo de oxigênio fenólico se complexa com dois átomos de

metal formando a ponte M-O-M. Dessa forma, nota-se que cada metal possui numero de

coordenação cinco. Para a obtenção dos respectivos quelatos, o ligante tiossemicarbazônico

(1mmol) dissolvido em 50 mL de etanol foi tratado com uma solução também etanólica de

0,002mmol de acetil-acetonato de vanádio [(VO)2 acac]. A mistura ficou sob agitação e

refluxo em vapor d‘água por 4-5 horas94

.

54


Esquema 24: Rota de síntese de complexos Oxovanádio/TSC.

Carballo et al., 2002, sintetizou complexos de rênio I (Re) tendo como ligantes

ferrocenilcarbaldeído tiossemicarbazonas, objetivando com isso investigar a reatividade

destes complexos, assim como a capacidade das TSCs de se comunicar com o ferroceno e

centros metálicos. Nessa síntese, uma mistura de bromopentacarbonilrênio I e TSC foi

refluxada por 1 hora em tolueno, alcançando rendimento que variaram de 99,8% a 63,7%95

.

Esquema 25: Rota de síntese de complexos de Rênio/TSC.

Em 2003, Shailendra et al., reportou a obtenção de complexos de paládio II com novas

tiofeno-2-carboxialdeído TSCs, através da reação destas com um precursor necessário para a

síntese complexos Pd II, o [Pd(DMSO)2Cl2]. A mistura foi mantida em refluxo por 5 horas em

metanol. Neste estudo, a forma tiona da TSC parace ser a preferencial para formação destes

quelatos, devido a sua maior nucleofilia96

.

55


Esquema 26: Rota de síntese de complexos de Pd II segundo Shailendra.

Prabhakaran e grupo, em 2005, obtiveram complexos de níquel II tendo como ligante

a salicilaldeído-N-fenil tiossemicarbazona, fazendo-se reagir [NiCl2(PPh3)2] dissolvido em 25

mL de etanol seco, que foi adicionado lentamente a uma solução de tiossemicarbazona em

diclorometano em quantidade equimolar. A mistura foi deixada por quatro dias em

temperatura ambiente, alcançando rendimento de 90% 97

.

Esquema 27: Rota de síntese de complexos de Ni II/ TSC.

No ano de 2006, Kostas et al., demonstrou a síntese de complexos de paládio a partir

de ligantes tiossemicarbazônicos de uma forma diferente daquela utilizada por Shailendra et

al., 2003. Nessa metodologia, dois equivalentes da TSC dissolvidos em metanol, foram

adicionados a 1 equivalente de K2PdCl4 em solução aquosa, sendo o pH em seguida ajustado

para 9,0-9,5 através da adição de NH4OH. A mistura foi agitada por 24 horas em temperatura

ambiente e com pH constante. O rendimento reacional foi de 50% 98

.

56


Esquema 28: Rota de síntese de complexos de Pd segundo Kostas.

Em 2009, Vrdoljak e colaboradores, descreveram a síntese de novos complexos de

dioxomolibdênio IV tendo como ligantes uma série de N-substituídas piridoxal TSCs. O

molibdênio usualmente atua como ligante tridentado, formando complexos ao se coordenar

com três átomos doadores de elétrons, que no caso dessas TSCs são o oxigênio fenólico, o

nitrogênio da ligação imina e o enxofre (tiol ou tiona). Em alguns casos a complexação com o

nitrogênio azometínico pode ocupar o lugar do enxofre. Nessa síntese, uma mistura equimolar

da respectiva TSC e [MoO2(acac)2] em acetonitrila e metanol anidros foi refluxada por 4

horas, ficando em seguida por repouso durante um dia a temperatura ambiente. O rendimento

reacional foi relativamente baixo, ficando por volta de 48% 99

.

Esquema 29: Rota de síntese de complexos de Mo/TSC segundo Vrdoljak.

57


I- 2.3 TIOSSEMICARBAZONAS E SUAS APLICAÇÕES FARMACOLÓGICAS

As Tiossemicarbazonas, como já citado anteriormente, representam uma classe de

compostos cujas propriedades têm despertado cada vez mais interesse em pesquisadores

atuantes na área de Química Medicinal Orgânica e inorgânica. Isto se deve principalmente ao

amplo espectro de aplicação farmacológica demonstrados por seus derivados, como também a

capacidade quelante e o papel da coordenação no seu mecanismo bioquímico de ação.

De modo geral pode-se dizer que tiosemicarbazonas agem, seja como inibidores de

enzimas – através da complexação de metais endógenos ou através de reações de redox – seja

através de interações com o DNA e da inibição da síntese deste. Além disso, alguns

complexos metálicos desses ligantes apresentam a habilidade de mimetizar a ação de certas

enzimas. Por vezes, o complexo mostra-se mais ativos que o ligante ou pode ainda ativar o

ligante como agente citotóxico e fazer decrescer a resistência celular a droga100

.

Vários relatos literários têm demonstrado a gama de atividades biológicas

concernentes as TSCs, tendo-se como destaque a atividade antitumoral, antibacteriana,

antiviral, antiprotozoária, citotóxica, dentre outras.

I- 2.3.1. Atividade antiviral

Em 1950, Hamre et al., mostrou que benzaldeído tiossemicarbazonas eram ativas no

combate a infecção por neurovaccínia vírus quando administradas oralmente100

. Este primeiro

estudo da atividade antiviral dos derivados da TSC serviu como mola propulsora para o

desenvolvimento de várias pesquisas de suas propriedades nessa área.

Em 1994, Teitz e colaboradores relataram a atividade anti HIV para

tiossemicarbazonas, onde foram estudadas duas TSCs dotadas de tal atividade N-metilisatina-

β-4‘:4‘-dietil tiossemicarbazona (Figura 17; composto 1) e N-alil-isatina-β-4‘:4‘-dialil

tiossemicarbazona (Figura 17; composto 2). Ambas mostraram atuar sobre a síntese de

proteínas estruturais do HIV101

.

58


Figura 17: Estruturas químicas dos compostos sintetizados por Teitz et al., 1994.

Em 2008, Finkielsztein sintetizou e avaliou a atividade de novos derivados da 1-

indanona tiossemicarbazonas em inibir a replicação do BDVD (vírus da diarréia bovina) tipo

1, espécie NADL, em células de bois da raça Madin-Darby (MDBK). Esse vírus possui a

organização genômica bastante semelhante ao do vírus da hepatite C (HCV) podendo servir

como modelo para estudos moleculares de proteína virais e avaliação de compostos antivirais

frente ao HCV88

.

Dos quinze compostos testados, seis mostraram alta seletividade (SI) nos testes

quando comparados aos valores de referência da ribavirina (EC50= 4,62μM). Dentre estes

compostos, o composto 3 (Figura 18) foi o que apresentou maior atividade antiviral (EC

50=1,75μM) e seletividade cerca de sete vezes maior que o fármaco de referência. Vale

ressaltar que a porção TSC da molécula é essencial para esta atividade, visto que os derivados

da 1-indanona semicarbazônicos e tiossemicarbazídicos são inativos frente ao BDVD.

Figura 18: Estrutura química do composto 3 sintetizado por Finkielsztein, 2008.

1 2

59


I- 2.3.2. Atividade Antibacteriana

Tiossemicarbazonas apresentam um amplo espectro de atividades antibacterianas e é

sabido que de modo geral, as tiossemicarbazonas, em particular as α(N)-heterocíclicas, inibem

o crescimento de bactérias gram positivas, tais como Neisseria gonorrhoeae, Neisseria

meningitides, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis e Enterococcus, mas não são

bons inibidores de bactérias gram negativas tais como Pseudomonas, Klebsiella,

Enterobacter, Shigella, Escherichia coli e Proteus100

.

Em 2008, Khan et al., sintetizou e avaliou a atividade in vitro de uma série de

tiossemicarbazonas esteroidais contra Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes,

Salmonella typhimurium e E. coli. A atividade in vitro foi testada através do método de

difusão em disco e a concentração inibitória mínima (CMI) pelo teste de macro-diluição. Os

compostos que continham o substituinte cloro ou acetóxi na posição R e ciclopentil ou

ciclohexil na posição R1 (Figura 19) foram os que obtiveram melhores resultados dentre os

testados, embora nenhuma deles superasse a atividade da amoxicilina86

.

Figura 19: Estrutura química dos compostos sintetizados por Khan et al., 2007.

Ainda nesse ano, Güzel e grupo sintetizaram e avaliaram a atividade contra

Mycobacterium tuberculosis de uma série de 5-metil/trifluorometoxi- 1H-indol-2,3-diona 3-

tiossemicarbazonas. Nesse mesmo trabalho avaliou-se também a citotoxicidade e o MIC

(IC90). A inibição do crescimento foi avaliada contra M. tuberculosis H37Rv usando o teste de

micro-diluição em caldo, utilizando rifampicina como controle positivo. Dos 62 compostos

testados, três mostraram atividades significativas, sendo considerados promissores no

tratamento anti-tuberculose102

.

COMPOSTO R R1

4 O-Ac NHC5H9

5 Cl NHC5H9

6 Cl NHC6H11

7 O-Ac NHC6H11

60


R1= CH3, CF3O

R2= C4H9, C6H5, 4-FC6H4, 4-ClC4H6, 3-BrC6H4, Cicl- C6H11

R3= H, CH3, -

8 e 9 10

Figura 20: Representação geral dos compostos sintetizados por Guzel et al., 2008 que obtiveram melhor

atividade.

I- 2.3.3. Atividade Antifúngica

Em 2008, Opletalová e colaboradores demonstraram a síntese e testaram uma série de

pirazina-tiossemicarbazonas frente suas atividades antifúngicas contra Candida albicans,

Candida tropicalis, Candida krusei, Candida glabrata, Trichosporon asahii, Aspergillus

fumigatus, Absidia corymbifera e Trichophyton mentagrophytes. Essas moléculas foram

estudadas, pois relatos da literatura demonstraram que derivados da pirazina se mostram

ativos contra algumas espécies de fungos. O método utilizado para avaliação da inibição do

crescimento das espécies foi o de micro-diluição em caldo, utilizando fluconazol e

anfotericina B como drogas controles. Dentre os testados, os compostos 11, 12 e

principalmente o 13, foram os que demonstram resultados mais promissores. A eficácia do

composto 13 foi similar ou superior ao do fluconazol frente a todas as espécies analisadas103

.

61


Figura 21: Estruturas químicas das TSCs com atividade antifúngica segundo Opletalová et al., 2008

I- 2.3.4. Atividade Antitumoral

A atividade de derivados tiossemicarbazônicos como inibidores da Ribonucleosídeo

difosfato redutase (RDR), enzima chave na fabricação do DNA, é conhecida desde 1956

através dos estudos de Brockman e grupo, que demonstrou a atividade antileucêmica da 2-

formilpiridina tiossemicarbazona. Desde este trabalho pioneiro, vários outros estudos vêm

sendo desenvolvidos.

No ano de 1998, Li e colaboradores desenvolveu o pró-fármaco triapina 3-AP da 3-

aminopirinida-2-carboxialdeído tiossemicarbazona (3-AP) (Figura 22), uma dos mais

importantes substâncias no combate a vários tipos de células tumorais. Com isso, visava-se

uma melhora no perfil farmacocinético da droga e também torná-la mais ativa frente a células

tumorais de carcinoma hepático (células M-109) 104

.

11 12

13

62


Figura 22: Pró- fármaco sintetizado a partir do 3-AP.

Mais recentemente, no ano de 2008, Dilovic et al., sintetizaram uma série de 8

compostos e avaliaram suas atividades antitumorais frente a seis linhagens de células

neoplásicas, HeLa (carcinoma cervical), Hep-2 (carcinoma de laringe), MCF-7 (câncer de

mama) SW620 (câncer de cólon), Mia- PaCa-2 (carcinoma pancreático) Hep-2 (Carcinoma

laríngeo) e WI 38 (fibroblastos diplóides). Destes, os compostos 14 e 15 (Figura 23) foram os

que apresentaram maior porcentagem inibitória das células avaliadas, onde o composto 14

apresentou boa atividade frente a três linhagens, e o composto 15 frente a todas testadas 105

.

Figura 23: Estrutura química dos compostos sintetizados por Dilovic et al., 2008 com melhores atividades.

I- 2.3.5. Atividade antiprotozoária

Em 2002, Bharti et al., realizaram testes antiprotozoários de alguns derivados da 5-

nitro-tiofeno-2-carboxialdeído tiossemicarbazona, obtendo bons resultados frente a

Entamoeba histolytica e Trichomonas vaginalis, utilizando metronidazol como droga de

referência. A substância que apresentou melhor atividade frente a E. histolytica foi a 5-NT-

3-AP Triapina-3-AP

Composto 14 Composto 15

63


HMINTS (Figura 24), que apresentou IC50 igual a 1,71μM, ,enquanto que o metronidazol

apresentou nas mesmas condições IC50 de 2,10μM. Já contra T. vaginalis, a melhor resultado

foi o da substância denominada 5-NTBuTSC (Figura 24), que mostrou uma IC50 de 1,49μM,

em comparação a 1,92μM da droga controle106

.

Figura 24 Estrutura química dos compostos sintetizados por Bhart, 2002.

Em 2008, Abid e colaboradores sintetizaram e avaliaram a atividade antiprotozoária

contra Entamoeba histolytica de análogos tiossemicarbazônicos do metronidazol. O

metronidazol (IC50= 1,81μM) é a droga de escolha para esta terapia e modificações em sua

molécula, como a adição de alguns grupos relatados como possuidores de atividades anti-

amoébica (i.e. tiossemicarbazonas) parecem constituir uma boa estratégia para suplantar os

efeitos colaterais e a resistência demonstrada por algumas cepas desse protozoário. O método

utilizado para avaliação da atividade foi a micro-diluição em disco e, dentre os compostos

analisados, merecem maior atenção os compostos 16, 18, e em especial o 17, ( Figura 25) que

mostrou uma IC50 de 0,56μM 107

.

Figura 25: Estruturas químicas dos compostos sintetizados por Abid e grupo, 2000.

5-NT-HMINTS 5-NTBuTSC


Composto 18

64


Já no ano de 2010, Duan & Zhang testou a atividade contra Plasmodium falciparum de

novas tiossemicarbazonas contendo uma porção aromática com o iodo ligado na posição para.

Os testes foram realizados in vivo em camundongos, respeitando os procedimentos

preconizados pela Organização Mundial de Saúde (OMS). As drogas foram testadas nas

dosagens de 3,9,27 mg/kg de camundongo por dia e, a que apresentou maior grau de inibição

de crescimento do P. falciparum foi o composto 19, se aproximando bastante dos valores para

a droga controle cloroquina, inibindo 88.1 %, 90.7 % e 92.6 % em ordem crescente de

dosagem 108

.

Figura 26: Estrutura química do protótipo antimalárico segundo Duan & Zhang, 2010.

I- 2.3.6. Atividade antichagásica

Para o desenvolvimento de fármacos antichagásicos, as pesquisas têm sido focadas,

como já citado anteriormente, para a inibição da enzima TCC7 e a TR

8. A porção

tiossemicarbazona presente em alguns compostos descritos na literatura, tem sido evidenciada

como um grupo farmacofórico que apresentam potencial atividade inibitória da enzima

cruzaína9,10

. Segundo Du e colaboradores a interação tiossemicarbazona TCC, acontece via


transferência de um próton do resíduo His159, formando um derivado tetraédrico. Em

estudos de ―docking‖ realizados em 2006 e 2007 Leite e colaboradores comprovaram a

afinidade das aril-tiossemicarbazonas com a TCC, revelando a capacidade em inibir a TCC

que moléculas com núcleo tiossemicarbazona possuem 68

.

Composto 19

65


Figura 27: Mecanismo de inibição da TCC por derivados aril-tiossemicarbazônicos proposta por Du et al., 2002.

Chiyanzu et al., 2003 preparam e avaliaram o grau de inibição da TCC de nove

tiossemicarbazonas oriundas de derivados da isatina. Os resultados foram avaliados em

termos de IC50, sempre os comparando com outros derivados da isatina com atividade

inibitória previamente comprovada. Os mais promissores valores foram apresentados pelos

compostos 20 e 21 (Figura 28), com valores de IC50 de 9 e 10,5μM, respectivamente 109

.

Figura 28: Compostos sugeridos como inibidores da TCC segundo Chiyanzu et al., 2003

Em 2004, Aguirre e colaboradores sintetizam e testaram a atividade in vivo de uma

série de tiossemicarbazonas derivadas do 5-nitrofuril frente a duas cepas de T. cruzi. Os

compostos foram testados na concentração de 5μM e suas capacidades de inibição de

crescimento foram avaliadas em comparação com o Nifurtimox. Dentre estes, os que

obtiveram os melhores resultados foram o 22,23, 24 e 25, mostrando serem mais ativos que a


66


droga nitrofurânica comercialmente disponível 10

.

Figura 29: Estrutura Química dos compostos sintetizados por Aguirre e grupo, 2004.

Fujii et al., 2005, analisou a atividade inibitória frente à TCC de uma série de

tiossemicarbazonas análogas da 3,4 diclorofenil ou 3-trifluorometil tiossemicarbazonas, que

em estudos anteriores mostraram-se bons inibidores da TCC. Os resultados obtidos revelaram

que a inserção de um grupo fenil, p-metil-fenil, e alquílicos lineares incrementam a atividade

dessa classe de moléculas. Por outro lado, a substituição do fenil por um ciclohexil diminui

altamente a atividade. Foram testados 10 compostos e o que exibiu maior poder de inibição

foi o 26, com IC50 de 19nm 110

.

Figura 30: Estrutura química do composto que apresentou melhor atividade antichagásica segundo Fujii e

colaboradores 2005.

Em 2006, Siles et al., preparou e avaliou a capacidade de inibição da atividade da TCC

de uma série de TSCs derivadas do tetrahidronaftaleno, benzofenona e propiofenona. Os

resultados obtidos foram comparados ao de um composto previamente descrito na literatura

como potente inibidor da TCC, a 3-bromo propiofenona tiossemicarbazona, cuja menor IC50

descrita foi de 60nM. Os compostos que apresentaram melhores atividades anti-T. cruzi foram

COMPOSTO n R

22 1 H

23 1 Me

24 1 Et

25 1 Ph

Composto 26

67


o 27 e 28, cujas IC50 foi de 24nm e 17nm, respectivamente 111

.

Figura 31: Estrutura química dos compostos sintetizados por Siles e grupo, 2006.


68


I- 3. OBJETIVOS

I- 3.1. OBJETIVO GERAL

Síntese e avaliação biológica de derivados tiossemicarbazônicos, visando obtenção de

compostos ativos contra o T. cruzi e de menor toxicidade que os fármacos utilizados

atualmente na farmacoterapia da doença de Chagas.

I- 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtenção de derivados tiosemicarbazônicos nitro-aril substituídos através da

condensação entre a tiossemicarbazida e uma série de aril-aldeídos previamente

nitrados por métodos convencionais.

Determinação das principais propriedades físico-químicas e elucidação estrutural por

meio de Ressonância Magnética Nuclear de Prótons (RMN-1H) e Infra-vermelho (IV).

Avaliação das atividades biológicas das nitro-ariltiossemicarbazonas: atividade

antimicrobiana e principalmente avaliação da ação tripanocida e citotoxicidade.

69


CAPÍTULO Ii

OBTENÇÃO DOS DERIVADOS NITRO-


70


II- 1. INTRODUÇÃO

Tiossemicarbazonas são compostos obtidos pela reação de condensação de um aldeído

ou uma cetona com uma tiossemicarbazida. Apresentam-se como sistemas com extrema

deslocalização eletrônica, principalmente quando há grupos aromáticos ligados ao carbono da

imina 112

, e devido a presença da ligação dupla na tiossemicarbazonas, podem ser encontrados

diastereoisômeros conformacionais (Z e E).

Do ponto de vista sintético, apresentam como característica principal sua versatilidade

de obtenção, assim como sua vasta aplicação como intermediários de muitos núcleos

importantes. Geralmente, apresentam baixo custo de síntese, além de grande economia de

átomos, já que, com exceção da água que é liberada na sua obtenção, todos os outros átomos

dos compostos reagentes estarão presentes na molécula final 9.

II- 2. METODOLOGIA

II- 2.1 Procedimento Geral de Obtenção dos Aril-aldeídos Nitrados

Para obtenção dos produtos desejados duas metodologias foram utilizadas: na

primeira, a uma solução dos aril-aldeídos em CHCl3, utilizado como solvente e catalisador,

foi adicionada quantidade equimolar de Ácido Nítrico concentrado (HNO3). A mistura

reacional foi mantida sob agitação magnética e banho de gelo por 1 hora, retirando-se então o

banho. Manteve-se a mistura em temperatura ambiente por mais um período de 4-7 horas, de

modo que foi monitorada por cromatografia em camada delgada (CCD). Ao término da

reação, realizaram-se três extrações, sendo a primeira apenas com água, e as demais com

EtOAc / H2O. Em seguida a fase orgânica foi evaporada para obtenção do produto na forma

de cristais, conteúdo esse que foi levado ao dessecador para retirada completa de qualquer

resquício de solvente.

Na outra, a uma mistura dos aril-aldeídos com ácido sulfúrico (H2SO4), utilizado como

solvente e catalisador, em banho de gelo e constante agitação magnética, foi adicionada

lentamente uma solução contendo quantidades equimolares de Ácido Nítrico concentrado

(HNO3) e ácido sulfúrico (H2SO4). Após 1 hora, retirou-se do banho, deixando-se a mistura

reacional em temperatura ambiente por 3-5 horas, também sendo monitorada por CCD. Ao

71


término da reação, adicionou-se água destilada e foi observada a formação de precipitado, o

qual foi filtrado em funil sinterizado e lavado com água vária vezes, sendo por fim levado ao

dessecador.

Esquema 30: Rota de Nitração dos Aril-aldeídos em presença de CHCl3.

Esquema 31: Rota de Nitração dos Aril-aldeídos em presença de H2SO4.

IV- 2.2 Procedimento Geral de Obtenção das Nitro-Aril tiossemicarbazonas

A uma solução etanólica da tiossemicarbazida, adicionou-se 5 gotas do catalisador

ácido clorídrico (HCl), deixando-se sob agitação magnética e temperatura ambiente por 15-30

minutos. Após esse tempo acrescentou-se então quantidades equimolares dos diferentes aril-

aldeídos nitrados, previamente sintetizados. A reação foi mantida à temperatura ambiente e

constante agitação magnética, por um período de 3-5 horas, de modo que foi monitorada por

Composto R1 R2

1a OH H

1b N(CH3)2 H

1c OH OCH3

1d CH3 H

Composto R1 R2

1e Br H

1f Cl H

1g H CHO

Composto X

1h O

1i S

72


CCD. Ao término da reação, adicionou-se água destilada e foi observada a formação de

precipitado, o qual foi filtrado em funil sinterizado e lavado com água. Para a purificação

realizou-se recristalizações em EtOH absoluto.

Esquema 32: Rota de obtenção das Nitro-Aril tiossemicarbazonas

Para obtenção das bis-tiossemicarbazonas 2g e 2l (Esquema 33), utilizaram-se dois

equivalentes da tiossemicarbazida em relação ao 1,3 isoftaldeído.

Composto 2a 2b 2c 2d 2e 2f 2j

R1 OH N(CH3)2 OH CH3 Br Cl Cl

R2 H H OCH3 H H H H

R3 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NHPh

Composto X

2h O

2i S

73


Esquema 33. Rota geral de síntese da bis-tiossemicarbazona 2g e 2l.

II- 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos 2a-2l (Tabela 2) foram sintetizados em

pouco tempo, através de uma metodologia simples e barata. Trata-se de uma etapa inicial de

nitração dos aril-aldeídos, com posterior condensação entre a tiossemicarbazida, ou 4-fenil-

tiossemicarbazida, com uma série de nitro-aril aldeídos sintetizados. As reações de

condensação se procederam à temperatura ambiente, diferentemente do que se encontra

exposto na literatura, no qual a mesma acontece sob refluxo. Todos os produtos finais foram

obtidos na forma de cristais coloridos, que precipitaram quando da adição de água destilada

ao meio reacional, com rendimentos finais variando de bons a ótimos.

Composto R

2g NH2

2l NHPh

74


Tabela 2: Estruturas químicas dos derivados 2a-2l e suas respectivas nomenclaturas.

2a: 3-nitro-4-hidroxibenzaldeído

tiossemicarbazona

2b: 3-nitro-4-dimetilaminobenzaldeído

tiossemicarbazona

2c: 3-metoxi-4 hidroxi-5-nitro

benzaldeído tiossemicarbazona

2d: 3-nitro-4-tolualdeído

tiossemicarbazona

2e: 3-nitro-bromobenzaldeído

tiossemicarbazona

2f: 3-nitro-4-clorobenzaldeído

tiossemicarbazona

75


2g: 5-nitro- isoftaldeído

tiossemicarbazona

2h: 5-nitro-2-furaldeído

tiossemicarbazona

2i: 4-nitro-2-tiofenocarboxaldeído

tiossemicarbazona

2j: 3-nitro-4-clorobenzaldeído N(4)-

fenil-tiossemicarbazona

2l: 5-nitro-isoftaldeído-N(4)-fenil-

tiossemicarbazona

Assim como nas nitrações usuais, a metodologia de nitração dos aril-aldeídos

76


utilizando CHCl3 como solvente e catalisador ácido, tem como primeira etapa reacional a

formação formação do eletrófilo nitrônio. Este é produzido de uma maneira mais lenta, pois

se utiliza como catalisador da reação, um ácido de Lewis fraco (CHCl3), possibilitando assim

um controle maior da reação, dificultando a formação de produtos secundários indesejado.

Esta metodologia mostrou-se útil apenas quando os aldeídos utilizados continham grupos

ativantes como substutuintes. Estes, através dos efeitos mesomérico (+M) e indutivo (+I),

aumentam a densidade eletrônica do anel aromático, proporcionando energia suficiente para

que os elétrons π do anel aromático capturem o hidrogênio do catalisador utilizado, visto que

o mesmo não apresenta-se muito ácido pelo fato de não encontrar-se ligado diretamente a um

elemento de alta eletronegatividade. Em algumas reações lançadas sem o banho de gelo,

houve um forte aquecimento inicial, e por vezes a formação do produto di-nitrado indesejado,

mostrando dessa forma a necessidade do controle inicial das condições reacionais.

Pelo fato da metodologia acima citada mostrar-se inapropriada para nitração de aril-

aldeídos contendo grupos desativantes como substituintes, testaram-se dois ácidos mais fortes

como catalisadores: ácido acético glacial e H2SO4 concentrado. Dentre estes, o primeiro

testado foi o ácido mais fraco, porém os resultados obtidos não se mostraram satisfatórios. O

tempo reacional longo (mais de 48 horas) e a dificuldade de extração, evaporação, purificação

para a retirada do ácido, com baixos rendimentos (30-50%), somado ao fato de alguns aril-

aldeídos nem sequer reagirem, inviabilizaram a sua utilização. Um dos fatores que

contribuíram bastante para os baixos rendimentos foi o baixo poder do ácido em solubilizar os

aril-aldeídos, os quais não reagiam por completo.

Por outro lado, o emprego do ácido sulfúrico possibilitou a obtenção de todos os

produtos desejados de forma rápida (± 6 horas) e altos graus de pureza. Pelo fato de se tratar

de um ácido mais forte, seus hidrogênios encontram-se mais lábeis, e, portanto, mesmo aril-

aldeídos com grupos desativantes fortes possuíam energia suficiente para arrancá-los. Outra

característica importante é sua capacidade em solubilizar os aldeídos utilizados em baixas

temperaturas (banho de gelo), provavelmente devido a sua alta polaridade, se assemelhando á

dos aldeídos. Isto favoreceu para o aumento dos rendimentos quando comparados ao a

metodologia anterior. Não foi necessário realizar uma extração no término da reação, pois ao

adicionar a mistura reacional a um béquer contendo água destilada, o produto precipitava na

forma de cristais coloridos e todo o resquício de ácido presente, era retirado de forma mais

simples através de várias lavagens dos cristais com água destilada.

Independente da metodologia utilizada, os produtos obtidos mostraram-se

77


fotossensíveis e instáveis a temperatura ambiente, sendo necessário armazená-los em vidraria

âmbar e sob refrigeração. Em alguns casos houve degradação dos produtos após

armazenamento por muito tempo, mesmo sob essas condições acima citadas. A recristalização

em EtOH foi o processo de purificação mais eficaz utilizado.

Na etapa de condensação, foi empregada a metodologia clássica de formação de

iminas utilizando-se ácido como catalisador. A tiossemicarbazida ou a 4-fenil-

tiossemicarbazida representam as moléculas que contém o grupo amino. O uso de ácido faz-se

necessário, pois este protona o oxigênio da carbonila do aldeído, possibilitando assim o

ataque nucleofílico do nitrogênio da tiossemicarbazida, como mostrado mais adiante no

esquema 34.

Segundo Holla et al., 2003, para este tipo de reação o catalisador ácido utilizado foi o

ácido acético em meio etanólico sob refluxo. Devido aos vários problemas já expostos quando

da utilização desse ácido, decidiu-se abrir mão do uso deste catalisador, mesmo levando em

consideração que se trata de diferentes procedimentos experimentais. Tendo-se em vista

algumas reações lançadas pelo nosso grupo de pesquisa para a síntese de aril-semicarbazonas,

onde se usou HCl como catalisador, obtendo rendimentos entre 65%-92%, decidiu-se testá-lo

para o preparo das nitro-ariltiossemicarbazonas. O resultado do teste foi útil tanto em relação

a tempo (3-5 horas) quanto em relação a rendimento, que ficou por entre 64-85%. Outra

característica que distingue esta metodologia da descrita na literatura, tornando-a mais

simples, é o fato da mesma acontecer sob temperatura ambiente. O mecanismo reacional desta

etapa encontra-se ilustrado no esquema 34.

78


OH

H

Et

H

ArO

H

ArOH H2NN NH2

S

H

N

Ar

HOH N

H

S

NH2

H H HO Et

N

Ar

HOH N

H

S

NH2

HO

H

H

EtN

Ar

OH N

H

S

NH2

H

H

H

N

N

H

S

NH2

HAr

H+ H2O

HO Et N

N

H

S

NH2

Ar

H

Esquema 34: Mecanismo de condensação de compostos carbonilados com a tiossemicarbazida.

Tiossemicarbazonas sintetizadas a partir de uma amina primária podem ser obtidas nas

configurações Z ou E, o que varia de acordo com o substituinte do aldeído utilizado 70

. Na

síntese das Nitro-ariltiossemicarbazonas realizada por nosso grupo de pesquisa só foi

observada a presença de uma única mancha na CCD e, portanto, pode-se sugerir que foram

obtidas preferencialmente na configuração E, a qual é termodinamicamente mais estável.

Ao final da reação, todos os compostos foram obtidos na forma de cristais insolúveis

em água destilada. Para alguns deles, foi realizada uma purificação por recristalização em

EtOH. Estes cristais não se mostraram fotossensíveis podendo ser armazenados em vidraria

simples na geladeira.

79


A elucidação estrutural das moléculas sintetizadas foi obtida através de análises de

dados fornecidos por técnicas espectroscópicas de RMN de 1H e

13C, e de infravermelho (IV).

As principais bandas de absorção no espectro de IV dos grupamentos inerentes as moléculas

sintetizadas encontram-se listadas na tabela abaixo.

Tabela 3: As principais bandas de absorção dos grupos inerentes as moléculas sintetizadas.

Composto C=S Deformaç.

axial

NH2

Deformaç.

axial

C=N NO2

Deformaç.

Axial Simét.

NH Hidrazínico

2a 1165 3244 e 3393 1530 1281 3150

2b 1203 3236 e 3399 1526 1372 3154

2c 1057 3256 e 3437 1541 1321 3160

2d 1107 3238 e 3422 1518 1364 3158

2e 1091 3258 e 3417 1519 1360 3156

2f 1105 3366 e 3500 1519 1351 3156

2g 1105 3246 e 3423 1524 1343 3155

2h 1057 3301 e 3462 1537 1355 3086

2i 1103 3314 e 3472 1543 1335 3158

2j 1059 3255* 1544 1332 3164

2l 1086 3225* 1527 1446 3124

* Condensação realizada com fenil-tiossemicarbazida.

De posse do conhecimento da existência dos grupamentos funcionais desejados,

evidenciado pela análise de infravermelho, a confirmação estrutural mais detalhada foi

realizada por RMN 1H e

13C. No presente estudo não foi possível a determinação da

configuração das moléculas sintetizadas, porém, para todas as tiossemicarbazonas foi

detectado apenas um isômero na cromatografia de camada delgada, sugerindo que estas

deveriam estar na configuração E, termodinamicamente mais estável.

Através da interpretação dos espectros de IV pode-se afirmar que a metodologia de

nitração empregada foi eficaz, pois em todas as moléculas sintetizadas (2a-2l), se observa

bandas de absorção características a deformação axial simétrica do grupo NO2, situadas entre

1281-1446 cm-1

113

. Como o produto di-nitrado era indesejado, foi necessário se certificar que

80


este não tinha sido sintetizado. Para isso, partiu-se para a análise dos dados de Ressonância

Magnética Nuclear.

Nos espectros de RMN 1H das moléculas 2a, 2b, e 2e nota-se em campo característico

de hidrogênios ligados a anel aromático, a presença de três hidrogênios. Um deles encontra-se

na forma de um singleto, entre 8,12 e 8,56 ppm e, e os outros dois como dubletos na região

de 7,13-7,93 ppm. Isto pode ser visto tomando como exemplo o espectro de RMN 1H do

composto 2b (Figura 32), onde nota-se a presença do singleto acima citado em 8,12 ppm

(H7; figura 32) e dos dubletos, de mesma constante de acoplamento (8,1 Hz), em 7,88 (H

5 ;

figura 32) e 7,13ppm (H6

; figura 32), sendo o mais desblindado localizado na posição orto ao

grupo azometínico. O singleto aparece sempre em campo mais baixo que os dubletos,

provavelmente devido ao efeito anisotrópico causado pela sua proximidade espacial com o

grupamento nitro, sofrendo uma acentuada desblindagem.

Figura 32: Espectro de RMN 1H do composto 2b.

Como partimos, em sua maioria, de aril-aldeídos 4-substituidos, a presença de apenas

três hidrogênios na região dos aromáticos, dois deles vicinais, somado a presença três

81


carbonos quaternários com deslocamentos químicos entre 112,9 ppm e 140,6 ppm no espectro

de RMN 13

C confirma que realmente ocorreu apenas a mono-nitração, como pode ser visto no

espectro do composto 2b onde estes se encontram com deslocamento de 145,83 ppm, 137,88

ppm, 123,29 ppm (Figura 33).

Figura 33: Espectro de RMN 13

C do composto 2b.

Em alguns casos, como para compostos 2d e 2f, houve uma modificação quanto aos

tipos de acoplamentos. A análise do espectro do composto 2d (Figura 34) mostra que, o

hidrogênio que aparecia normalmente como um singleto, mostrou-se agora como um dubleto

com constante de acoplamento de 1,6 Hz (H7; figura 34), caracterizando o acoplamento J

4,

por vezes presente em anéis aromáticos. Em conseqüência disto, o hidrogênio orto ao

grupamento azometínico (H5; figura 34) mostrou-se como um duplo-dubleto.

DMSO

82


Figura 34: Espectro de RMN 1H do composto 2d.

Em relação ao composto 2g, oriundo de um aril-adeído 3-substituído, cujo substituinte

é outro grupo aldeído, a confirmação dá-se pela presença de dois singletos, um deles

integrando para um hidrogênio (δ 8,58ppm; H3; figura 35) e o outro integrando para dois

hidrogênios (δ 8,62ppm; H1 e H

2; figura 35). Isto indica também que a substituição ocorreu

na posição 5, pois em qualquer outra posição, teríamos a presença provavelmente de dois

dubletos. Não se levou em consideração a substituição ocorrer na posição 2, devido ao grande

impedimento estérico oferecido pelos grupos presentes nas posições vizinhas.

83


Figura 35: Espectro de RMN 1H do composto 2g.

Para os heteroaromáticos, a confirmação do padrão de substituição se deu através da

presença de dois hidrogênios na região dos aromáticos. Para o composto 2h esses hidrogênios

apareceram como dois dubletos com deslocamento químico de 7,96 ppm e 7,36 ppm. Além de

confirmar a entrada de apenas um grupo nitro no anel aromático, esses dubletos indicam que a

substituição ocorreu na posição 5, posição favorecida pelo pequeno impedimento estérico e

densidade eletrônica alta durante a ressonância dos elétrons. Já para o composto 2i, têm-se a

presença de dois singletos, com integral para apenas um hidrogênio cada, em 8,05 ppm (H2;

figura 36) e 7,51 ppm ( H1; Figura 36). Estes indicam que a entrada do substituinte ocorreu na

posição 4’, menos impedida estericamente que a posição 3’.

84


Figura 36: Espectro de RMN 1H do composto 2i.

A partir da análise dos espectros de IV, pôde-se também confirmar o sucesso da

condensação com a tiossemicarbazida. Bandas fortes na região 1518-1544 cm-1

foram

atribuídas ao estiramento da ligação C=N 114

, caracterizando que realmente a metodologia

utilizada foi eficaz. Em alguns casos, encontram-se superpostas por bandas de estiramento

C=C. Com relação ao espectro de RMN 1H, também é possível corroborar o que foi dito. Isto

pode ser exemplificado no espectro de IV do composto 2b (Figura 37), onde a banda de

absorção referente a este grupo acima citado encontra-se em 1526 cm-1

.

85


Figura 37: Espectro de IV do composto 2b.

Nos espectros de RMN 1H analisados, a presença de um singleto entre 7,96 ppm e 8,29

ppm, atribuído ao hidrogênio azometínico, como por exemplo para o composto 2b ( H4;

Figura 32), onde este pico encontra-se em ppm. De forma geral, mostra-se mais

desblindado que os hidrogênios do anel aromático, exceto quando estes se encontram em

posição orto ao grupo nitro. Esta maior desblindagem em relação aos hidrogênios aromáticos

deve-se ao efeito anisotrópico causado pelo movimento dos elétrons π da ligação imínica, e

pela proximidade com um átomo mais eletronegativo. Por vezes, este pico pode coincidir com

o singleto referente ao hidrogênio da amina terminal.

Duas bandas de média a fracas das deformações axiais de cada hidrogênio do NH2

podem ser visualizadas entre 3236-3472 cm-1

(113)

. Esses mesmo dois hidrogênios, como se

pode observar nos espectros obtidos, encontram-se dois singletos, integrando para apenas um

hidrogênio cada, situados entre 8,04 ppm e 8,55 ppm. Para o espectro do composto 2b (Figura

32), por exemplo, esses dois picos aparecem com deslocamentos químicos de 8,14 ppm (H2;

Figura 32) e 8,04 ppm (H1; Figura 32), corroborando com os dados do IV. Essa diferença de

86


ambientes químicos deve-se ao bloqueio da rotação livre da ligação C-N em virtude de seu

caráter parcialmente duplo, que favorece interação entre a nuvem eletrônica do enxofre da

tiocarbonila, que possui um raio atômico grande, e o hidrogênio mais próximo a ele, quando

seus orbitais encontram-se no mesmo plano. Este hidrogênio apresenta-se sempre como o

mais desblindado. Vale salientar que para as semicarbazonas esse fenômeno não é observado,

vendo-se apenas um singleto integrando para dois hidrogênios, devido a um menor raio

atômico do oxigênio em relação ao enxofre, impossibilitando sua interação com os

hidrogênios.

Para os compostos 2j e 2l, apenas uma banda na região 3225-3500 cm-1

é encontrada

(Figura 38), pois a condensação foi realizada com a 4-fenil tiossemicarbazida, onde no

produto final, ao invés de uma tioamida primária, temos uma tioamida secundária.

Figura 38: Espectro de IV do composto 2j.

Com relação ao espectro RMN 1H desses dois compostos, aparece um singleto em

campo baixo, com deslocamento químico de 10,27 ppm para o 2j e 10,27 para o 2l, este

último integrando para dois hidrogênios pois trata-se de uma bis-tiossemicarbazonas. Nota-se

87


também a presença de mais hidrogênios na região dos aromáticos, referentes ao grupo fenil.

No espectro de RMN 1H do composto 2j (Figura 39), esses aparecem como um dubleto (H1;

Figura 39) em 7,5 ppm, um duplo-dubleto (H2; Figura 39) em 7,39 ppm e um tripleto (H

3;

Figura 39) em 7,24 ppm.

Figura 39: Espectro de RMN 1H do composto 2j.

A ausência da banda de S-H, observada em geral entre 2500-2600 cm-1

, e a presença

de C=S em 1057-1203 cm-1(113)

confirma a estrutura de todas as tiossemicarbazonas na forma

tiona116

. No espectro de RMN 13

C, o carbono da tiocarbonila, pelo fato deste estar ligado a

três átomos mais eletronegativos (C,N,N) e em um sistema em constante ressonância, aparece

como o sinal mais desblindado em todos os espectros. Para o composto 2b, por exemplo, esse

aparece com deslocamento químico de 177,63 ppm (Figura 32).

88


A banda de absorção encontrada em freqüências entre 3086 e 3164 cm-1

nos espectros

de todas as tiossemicarbazonas foi atribuída ao estiramento da ligação N-H hidrazínico, pois,

de acordo com Tarasconi et al. (2000) e Ferrari et al. (2000), ela é encontrada na região de

3041 – 3178 cm-1 (75,115)

. Esta afirmação pode ser reforçada analisando os espectros de RMN

1H das moléculas obtidas, onde o sinal mais desblindado, sempre um singleto na região de

11,35-12,09 ppm, se refere ao do hidrogênio do N-H hidrazínico, como por exemplo, para o

composto 2b, onde este aparece como um pico com deslocamento químico de 11,35 ppm (H3;

Figura 32).

89


CAPÍTULO III

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS

90


III- 1. INTRODUÇÃO

A propriedade antibacteriana das tiossemicarbazonas tem sido investigada desde 1946,

quando Domagk et al. reportaram suas atividades contra o micro-orgaismo Mycobacterium

tuberculosis. De modo geral, é sabido que as tiossemicarbazonas apresentam um amplo

espectro de atividades antibacterianas e, em particular as α(N)-heterocíclicas, inibem o

crescimento de bactérias gram positivas, tais como Neisseria gonorrhoeae, Neisseria

meningitides, Staphylococcus faecalis, Streptococcus faecalis e Enterococcus, mas não são

bons inibidores de bactérias gram negativas tais como Pseudomonas, Klebsiella,

Enterobacter, Shigella, Escherichia coli e Proteus100

. Alguns outros relatos na literatura

também mostram as atividades de alguns derivados tiossemicarbazônicos frente à

Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Salmonella typhimurium86

e

Mycobacterium tuberculosis102

.

Dentre os alvos biológicos considerados como mais promissores no combate a doença

de Chagas, encontram-se enzima TCC7 e a TR

8. De acordo com vários relatos expostos na

literatura, tiossemicarbazonas são consideradas como grupo farmacofóricos na atividade

tripanocida, mostrando-se capazes de inibir a enzima TCC, além de possuírem uma baixa

citotoxicidade 10,68

. Nitrocompostos, como derivados nitrofurânicos, também tem sido

descritos como potentes inibidores irreversíveis da TR em condições anaeróbicas66

.

III- 2. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA

III- 2.1 Metodologia

III- 2.1.1 Método da difusão em discos de papel

A atividade antimicrobiana das nitro-aril tiossemicarbazonas 2b-2l (Figura 40) foi

verificada in vitro, pelo método de difusão em disco de papel, frente a bactérias Gram-

positivas e Gram-negativas (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium smegmatis) da coleção de

microorganismos do Departamento de Antibióticos da UFPE.

Neste método, os discos contendo concentrações conhecidas dos compostos

91


sintetizados foram colocados na superfície de uma placa de ágar, onde uma suspensão

padronizada dos micro-organismos teste foi inoculada. As suspensões dos micro-organismos

testes foram padronizadas através da escala de McFarland com turbidez correspondente a 0,5,

equivalente a 1 a 2 x108 unidades formadoras de colônias por mililitros (UFC/mL). Discos de

papel contendo apenas o solvente dimetil-formamida (DMF) foram utilizados como controles

negativos. As placas foram levadas a estufa durante 24h e 48h à temperatura de 30°C e 37°C e

após o período de incubação mediram-se os halos de inibição em milímetros (mm). O halo de

inibição será considerado a área sem crescimento detectável a olho nu. A zona média de

inibição para amoxicilina (antibiótico) foi utilizada como valor de referência, a qual foi

medida em outro trabalho realizado por nosso grupo de pesquisa. Os experimentos foram

realizados em duplicata, e repetidos se os resultados apresentassem alguma divergência 127

.

92


Figura 40: Estrutura química dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos sintetizados.

2a 2b 2c 2d

2e 2f 2g

2h

2l

2i 2j

93


III- 2.1.2 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) e Concentração

Mínima Bacteriostática (CMB).

Para os ensaios de CMI e CMB, foi utilizada a técnica de macrodiluição em meio

líquido, onde a partir de uma solução-mãe com concentração de 1mg/mL dos compostos em

análise, solubilizados em dimetilformamida, foram realizadas diluições seriadas para obtenção

das concentrações desejadas. Foram adicionados 100μL da suspensão bacteriana, previamente

padronizadas através da escala de McFarland acima citada, aos tubos de Muller-Hinton

contendo as concentrações desejadas dos compostos em análise. Os tubos foram incubados a

37ºC por 24-48 h, e, em seguida, examinados para visualização da presença ou ausência de

organismos de cultivo. Tubos contendo apenas DMF também foram avaliados. Os valores de

CMI foram obtidos a partir da menor concentração dos compostos onde não foi observado

qualquer crescimento de bactérias. Após plaqueamento, os valores da CMB foram medidos

através da inoculação dos caldos utilizados para determinação do CMI. Os valores de CMB

foram observados a partir do crescimento da diluição subseqüente. Os valores da CMI e da

CMB, foram expressos em µg/mL 128

.

III- 2.2 Resultados e discussão

Neste trabalho a avaliação da atividade antibacteriana deu-se em duas etapas:

inicialmente foi realizado o teste qualitativo por meio da avaliação in vitro da atividade,

através da difusão em discos dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônico testados, medindo-

se a zona média de inibição (ZMI). Esta foi obtida a partir da media dos valores dos halos de

inibição. Em seguida, as substâncias que apresentaram halo de inibição superior a 14 mm,

foram submetidas à determinação da CMI. Os valores da ZMI obtidos frente às bactérias em

análise encontram-se expostos na tabela abaixo.

94


Tabela 4: Valores das ZMI dos compostos testados, em mm.

Microorganismo Compostos Padrão

2b 2c 2d 2e 2f 2g 2h 2i 2j 2l Amox.

S. aureus - - - - - - 34,5 26 - - 18

B. subtilis - - - - - - 39 33,5 - - 18.5

E. faecalis - 15,5 - - - - 20 21 - - 32.5

E. coli - 14,5 - - - - 25,5 14 - - 26

K. pneumoniae - - - - - - - - - - -

M. smegmatis - 22,5 - - - - 25,5 24 - - 35

- : não possui sensibilidade; NT: não testado

Através da análise da tabela acima, foi possível notar que os compostos 2c, 2h e 2i

foram os que se apresentaram ativos, apresentando em alguns casos ZMI maior que a droga

controle de escolha. Também se pode perceber que nenhum dos compostos sintetizados

mostrou-se ativo frente à bactéria K. pneumoniae, assim como a droga padrão utilizada. De

um modo geral, substâncias contendo apenas um grupo ativador (2a, 2b e 2d), ou grupos

desativadores (2e, 2f) ligado ao anel benzênico apresentaram-se inativas frente as espécies em

estudo. Grupos volumosos ligados ao nitrogênio N(4) da porção TSC também parece

interferir negativamente na potencia antimicrobiana, como pode ser visto para os compostos

2j e 2l, os quais contêm um grupo fenil ligado na posição anteriormente citada. As bis-

tiossemicarbazonas, com ou sem o grupo fenil em N(4), 2l e 2g respectivamente, também se

mostraram inativas.

A atividade antibacteriana das tiossemicarbazonas parece envolver a coordenação de

metais presentes nas estruturas das enzimas dos microorganismos com o átomo de enxofre100

.

Por isso, a presença de um substituinte que diminua, ou aumente pouco a deslocalização de

elétrons para a função azometina, ocasiona em uma menor densidade eletrônica próximo do

átomo de enxofre, interferindo na sua capacidade de complexação.

Embora Rozenski e colaboradores, em 1995, tenham conseguido relacionar a ação

antibacteriana com o potencial de redução do grupo nitro em alguns compostos, em nossos

experimentos foi possível observar que nem todos os nitrocompostos sintetizados

apresentaram atividade. Isto sugere que o grupo nitro, na ausência de grupos doadores de

elétrons ligados ao anel aromático, por si só não é capaz de exercer atividade antibacteriana.

95


Por outro, nota-se que de alguma forma o mesmo favorece a atividade quando da presença de

grupos doadores. Isto pode ser confirmado quando comparamos o composto 2i com seu

análogo, desprovido do grupo nitro, o qual mostrou mais baixa atividade, além de menor

espectro de ação.

O composto 2c, que apresenta dois grupos doadores de elétrons ligados ao anel

benzênico, mostrou-se ativo frente a uma bactéria Gram-negativa (E. coli), uma Gram-

positiva (E. faecalis) e uma álcool-ácido resistente (M. smegmatis). Nos três casos, os halos

de inibição foram inferiores ao da amoxicilina.

Os compostos mais ativos da série testada foram o 2h e 2i, onde chama atenção a

semelhança estrutural entre eles, diferenciando-os consideravelmente dos demais. Trata-se de

duas nitro-aril-tiossemicarbazonas heteroaromáticas, onde o heteroátomo é o O e S,

respectivamente. Estas tiveram o mesmo espectro de ação, sendo o composto 2h

consideravelmente mais ativo.

Ambos mostraram atividade frente às três bactérias Gram (+) (S. aureus, E. faecalis,

B. subtilis), além de inibir o crescimento de uma das duas gram (-) testadas e do bacilo álcool-

ácido resistente. Frente às espécies S. aureus e B. subtilis, a ZMI das moléculas mostrou-se

bem superior a da droga controle, sendo um dos resultados mais que o dobro do valor, como

no caso do composto 2h frente a B. subtilis. O composto 2h também foi o mais ativo frente a

E. coli.

Os compostos 2c e 2h, por apresentaram boa atividade bactericida, foram selecionados

para realização dos testes de determinação da CMI e da CMB em meio líquido, cujos

resultados encontram-se mostrados na Tabela 5. Embora tenha apresentado-se bastante ativo,

composto 2i não pôde ser testado, pois o mesmo precipitava em vários meios de culturas

testados, indicando que havia interação entre a molécula e componentes do meio de cultura

testados.

96


Tabela 5: Valores da Concentração Mínima Inibitória e Concentração Mínima Bactericida para os compostos 2c

e 2h frente às cepas avaliadas em µg/mL.

Microoganismos

Compostos Padrão

2c 2h Amoxicilina

CMI CMB CMI CMB CMI

Staphylococcus

aureus

NT NT 31,25 15,625 16

Bacillus subtilis NT NT 500 250 64

Mycobacterium

smegmatis

250 125 500 250 -

Enterococcus faecalis NT NT >500 - 0,39

Escherichia coli NT NT 125 62,5 256

NT: Não testado;

Analisando os dados da tabela, notamos que em geral, os compostos testados

mostraram uma baixa atividade, pois foi necessária uma alta dose para obtenção das

respectivas CMI e CMB em comparação às drogas padrões. Porém, quando analisamos a

atividade do composto 2h frente a bactéria E. coli, nota-se que esta mostrou-se mais ativo que

a droga controle utilizada, sendo este o composto mais promissor sintetizado.

III- 3. ATIVIDADE ANTICHAGÁSICA E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE.

III- 3.1 Metodologia

III- 3.1.1 Ensaio de citotoxicidade dos compostos em células esplênicas

Células esplênicas foram cultivadas em placas de micropoços, contendo meio de

cultura RPMI com de soro bovino fetal. Para o ensaio de citotoxicidade, as células serão

incubadas com os compostos em sete diferentes concentrações e com timidina tritiada durante

24 h em estufa de CO2 a 37ºC. Em paralelo, foram feitos controles com células tratadas com

97


saponina, com células tratadas com DMSO, substâncias com reconhecida atividade tóxica e

um controle sem tratamento. Após incubação, as células foram coletadas em papel de fibra de

vidro e, posteriormente, a captação de timidina tritiada será determinada através do contador

beta de cintilação. O percentual de citotoxicidade foi determinado comparando-se a

percentagem de incorporação de timidina tritiada nos poços com as drogas em relação aos

poços não tratados.

III- 3.1.2 Avaliação da atividade dos compostos frente ao T. cruzi

Para determinar o efeito anti-proliferativo para T. cruzi, formas epimastigotas

crescidos em culturas axênicas, na fase log de crescimento, serão colocadas em placas de 96

poços sob condições de cultura adequadas. Os testes serão conduzidos tendo como controle o

benzonidazol (50 mg/ml) e culturas de parasitos sem tratamento. As substâncias serão

avaliadas quanto à concentração inibidora de 50% do crescimento dos parasitas (IC50%) onde

formas epimastigotas da cepa Y de T. cruzi serão cultivadas, na presença de diferentes

concentrações dos compostos, procedendo-se em seguida a contagem de parasitas viáveis. O

cálculo da IC50% será determinada por meio de uma regressão linear simples utilizando o

software Prisma 4 Graphpad.

III- 3.2 Resultados e discussão

A atividade tripanocida dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos (2a-2l), foi

avaliada, em valores de IC50, frente à forma evolutiva epimastigota do T. cruzi, crescidas em

culturas axênicas. Os valores de IC50, em µg/ml, para cada composto sintetizado encontram-se

dispostos na tabela abaixo.

98


Tabela 6: Atividade anti-T. cruzi dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos.

Compostos IC50 epimastigotas

(µg/ml)

2a 15.87

2b 28.63

2c 16.39

2d 5.12

2e 1.06

2f 2.06

2g 29.90

2h 1.42

2i 1.12

2j 36.25

2l 9,6

BDZ 1.73

BZD = Benznidazol.

Segundo Du e colaboradores (2002), a interação tiossemicarbazona-TCC acontece via


transferência de um próton do resíduo His159, formando um derivado tetraédrico (Figura 41).

Deduz-se, portanto que grupamentos que diminuam a densidade eletrônica no enxofre da

tioarbonila, favoreçam a atividade anti-T. cruzi das TSC 9.

Nossos estudos obtiveram como composto mais ativo da série, o 2e, que apresentou

uma IC50= 1,06 µg/ml. Trata-se de uma nitro-aril tiossemicarbazona, com um substituinte

desativador, o bromo, na posição 4‘ do anel fenílico.

99


Figura 41: Mecanismo de ação das tiossemicarbazonas proposto por Du e colaboradores (2002).

Embora o bromo não influencie na ressonância, o resultado observado para este

composto está em concordância com os dados expostos no trabalho realizado por Greenbaum

et al. (2004), mesmo que os testes tenham sido realizados diretamente na enzima TCC. O

composto mais ativo sintetizado por seu grupo, trata-se de um isômero do nosso composto,

variando-se apenas a posição do átomo de bromo, agora na posição 3‘ do mesmo anel

aromático e substituindo-se o hidrogênio azometínico por um grupo metil, estando ausente o

NO2 119

. Outro trabalho que mostra a eficácia deste substituinte na atividade tripanocida é

mostrado por Siles e colaboradores (2006), onde novamente a tiossemicarbazona com

substituinte bromo na posição 3‘ foi mais ativo dá série. Isto indica que a presença de

halogênios na molécula influencie positivamente na atividade anti-T.cruzi destes compostos

111.

Foi testado também em nosso projeto um bioisóstero do composto 2e, onde na posição

4‘temos um átomo de cloro (2f). O emprego do bioisosterismo como estratégia de

modificação molecular para a descoberta de novos agentes bioativos permite que se antecipe

uma comparável afinidade entre duas substâncias bioisostéricas por um dado sítio receptor e,

conseqüentemente, um potencial de atividade biológica similar120

. No nosso caso, houve uma

redução de quase duas vezes no valor da IC50, que para este composto foi de 2,06 µg/ml.

Segundo Hernandes et al. (2010), a presença de substituintes volumosos como os átomos

halogênios ―Cl‖ e ―Br‖, geralmente permite uma interação de maneira mais adequada destes

com o sítio ativo de alguns alvos biológicos importantes, pois facilita a ligação a cavidades

mais profundas na estrutura destes receptores biomoleculares 121

, podendo este ser o fator

decisivo para uma maior atividade.

De modo geral, os compostos que possuem grupos ativantes 2a, 2b, 2c e 2d

100


mostraram-se pouco ativos quando comparados as drogas controles utilizadas, com valores de

IC50 que variaram de 5,12 a 28,63 µg/ml. Os compostos de 2a, 2b e 2c possuem grupos

ativantes que exercem efeito do tipo +M no anel aromático e em todo sistema nele acoplado.

Na tentativa de esclarecer os motivos da redução da atividade, resolveu-se analisar a

influência destes grupos no mecanismo de ação proposto por Du et al (2002) 9. Sabe-se que

nos compostos sintetizados, grupos ativantes do tipo +M, por ressonância, aumentam a

densidade eletrônica em torno do carbono da tiocarbonila. Isto parece dificultar o ataque

covalente do resíduo Cys25 da TCC em direção ao mesmo. Este efeito negativo de

substituintes ativadores presentes nas moléculas sintetizadas por nosso grupo , parece estar de

acordo com trabalhos realizados por Du et al. (2002) e Chiyanzu et al. (2003), onde ambos

comparam TSC contendo grupos ativantes em anéis aromáticos (OCH3, CH3, OH) e

desativantes, sempre com superior eficácia para estes últimos 9,109

. Outro fator que nos leva a

acreditar que a movimentação dos elétrons no sentido da tiocarbonila influencia

negativamente, é o fato de o composto mais ativo dentre esses quatro, trata-se de um ativante

que exerce efeito +I (2d), o qual não influencia na ressonância.

Dados na literatura relatam que grupos aril, principalmente o fenil, nas

tiossemicarbazonas parecem ocupar um sítio especifíco na enzima TCC, o chamado bolso S2.

Substituições realizadas por Greenbaum e colaboradores (2004) do grupo fenila por alguns

grupos volumosos como bi-fenilas, bi-arilaminas, e bi-aril éter acetofenonas, ou por

heteroaromáticos contendo nitrogênio, causou um decréscimo da atividade 119

.

Contradizendo os dados acima, em nossa série, os derivados nitro-heteroaromáticos 2h

e 2i mostraram-se bastante eficazes em inibir o crescimento do parasito, possuindo IC50 igual

1,42 e 1,12 µg/ml respectivamente, sendo inclusive mais ativos que as drogas de referência.

Estes resultados corroboram com os expostos por Gerpe et al. (2009) onde foram testadas seis

derivados tiofênicos e furânicos que continham a porção tiossemicarbazonas frente a forma

evolutiva epimastigota. Em geral, estes derivados mostraram boa atividade, principalmente os

que possuíam como substituinte o grupo nitro na posição 5‘ do heteroaromático (IC50= 1,9 e

4,2 µg/ml), mostrando ainda a importância do grupo nitro nesse aspecto, o qual está presente

em todas as moléculas em estudo no nosso trabalho 122

.

Nitrocompostos são moléculas bioativas utilizadas como agentes antimicrobianos,

antiparasitários e antitumorais. A maioria dos compostos nitrados apresenta o mecanismo de

biorredução enzimática do NO2, o que resulta na formação de radicais livres com toxicidade

preferencial para células bacterianas e parasitárias 123

. Du et al., 2002, sintetizou três

101


moléculas análogas as nitro-aril tiossemicarbazonas 2c, 2e e 2f, sendo diferentes apenas pela

ausência do grupo nitro9

(Figura 42). Comparando-se os valores de IC50 dos composto

sintetizado por Du et al., 2004 frente a enzima recombinante purificada, cujos valores

mostraram-se sempre superiores a 10 µg/ml, com os valores dos compostos 2e e 2f por nossso

grupo sintetizados, percebe-se um incremento de cerca de dez vezes na atividade. Logo,

nossas moléculas estão de acordo com dados literários que consideram o grupo nitro como

parasitóforo 14

. Não se pôde precisar se o composto 2c foi mais ativo.

Figura 42: Comparação das estruturas 2c, 2e e 2f sintetizada por nosso grupo e as sintetizadas por Du et al.,

2000.

Esta comparação serve também para encorajar testes futuros de avaliação da atividade

diretamente na enzima TCC isolada, visto que os compostos 2e e 2f, mesmo tendo seus testes

anti-T.cruzi realizados frente a forma evolutiva epimastigosta, na qual a TCC encontra-se

localizada dentro de vesículas lisossomais, necessitando, portanto que haja uma penetração

dos compostos no parasito para uma melhor atividade, mostraram-se mais ativos.

No geral, as nitro-aril tiossemicarbazonas 2g, 2j e 2l exibiram uma baixa atividade,

possuindo uma IC50 igual a 29,90 µg/ml; 36,52 µg/ml e 9,6 µg/ml, respectivamente, sendo os

dois primeiros valores os mais baixos da série. O composto 2j é um análogo do composto 2f

onde, a única diferença entre eles é a presença, no primeiro, de um substituinte fenil no grupo

amino da função tioamida terminal. A presença desse grupo volumoso nessa posição resultou

numa diminuição de cerca de doze vezes na atividade anti-T.cruzi. Pode-se dizer que o

resultado obtido por este composto está de acordo com relatos presentes na literatura, como

Moléculas sintetizadas

por nosso grupo de

pesquisa: 2c, 2e e 2f.

Moléculas análogas

sintetizadas

por Du e colaboradores

102


por exemplo, o trabalho realizado por Pérez-Rebolledo et al. (2008), onde testaram-se três

TSCs variando-se os substituintes na posição em questão e, o derivado que obteve menor

atividade foi o que possuía como substituinte um grupo piperidil 124

. Em 2004, Greenbaum e

colaboradores também mostraram a influência negativa dessa substituição, onde os compostos

que a sofreram tiveram uma queda na atividade na magnitude de duas ordens (de 0,06 μM a

20 μM), quando comparados ao seu melhor composto 119

.

Por outro lado, ao se comparar as bis-tiossemicarbazonas 2g e 2l, cuja única diferença

também é a mesma anteriormente citada, notou-se uma melhora na atividade, contradizendo o

que se encontra descrito acima. Alguns dados na literatura mostram que compostos

volumosos, como o itraconazol, cetoconazol e posoconazol, mesmo sem possuírem

semelhança estrutural, exibem certa atividade frente a T. cruzi, sendo este último o de maior

massa molecular e mais potente que os demais na inibição da forma evolutiva epimastigota

125,126. Extrapolando-se esses dados, pode-se pensar que, aumentando-se a massa molecular de

alguns derivados, outros alvos biológicos possam ser ocupados, principalmente quando

grupos volumosos estão presentes na molécula, visto que a molécula que contém os dois

grupos fenil como substituinte em N-4, mostrou-se mais ativa.

A terapia atual da doença de chagas encontra na incidência dos efeitos colaterais um

dos principais obstáculos para ser considerada ideal. Estes, como descrito na literatura, têm

sido atribuídos ao efeito citotóxico inerente ao grupo nitro presente nas drogas disponíveis no

tratamento anti- T.cruzi, sendo, portanto, os nitrocompostos como o benznidazol e nifurtimox,

alvos de inúmeras discussões visando o esclarecimento de sua toxicidade 123

. Neste contexto,

no intuito de se obter uma nova droga na terapêutica da Doença de chagas, a avaliação da

citotoxicidade é de suma importância para considerá-la um protótipo no tratamento anti-

T.cruzi.

Neste trabalho, a avaliação da citotoxicidade dos compostos 2a-2l foi realizada frente

a células esplênicas conforme metodologia anteriormente descrita. Os resultados foram

obtidos em μg/mL, que representa a maior concentração atóxica testada. A tabela dos

compostos e seus respectivos valores encontram-se expostos abaixo.

103


Tabela 7: Citotoxicidade dos derivados nitro-aril tiossemicarbazônicos.

Composto

s

Citotoxicidade

(µg/ml)a

2a >100

2b 10

2c >100

2d 25

2e 1

2f 10

2g 5

2h 25

2i 1

2j 50

2l <1

BDZ 25

NFX 1

a = maior concentração atóxica em células esplênicas de camundongos BALB/c;

Analisando os dados da tabela acima, nota-se que das onze nitro-aril

tiossemicarbazonas sintetizadas e testadas, cinco (2a, 2c, 2d, 2h e 2j) mostraram menor ou

igual citotoxicidade em relação a droga menos tóxica utilizada no tratamento da Doença de

chagas, o Bdz. Alguns relatos na literatura corroboram com o fato de alguns nitrocompostos

possuírem baixa citotoxicidade, como o trabalho publicado por Pérez-Rebolledo et al.(2008),

o qual avaliou a citotoxicidade em macrófagos humanos de três derivados nitro-

tiossemicarbazônicos 124

. Destes, dois mostraram-se menos tóxicos que as drogas Bdz e Nfx

utilizadas como padrão.

Os compostos menos tóxicos da série foram os derivados 2a e 2c. Em outro projeto

desenvolvido em nosso laboratório, sintetizamos e avaliamos a citotoxicidade, utilizando a

mesma metodologia de diversos derivados arilsemicarbazônicos. Dentre estes, dois análogos

dos compostos 2a e 2c, desprovidos do grupamento nitro, obtiveram valores de citotoxicidade

> 100 µg/ml, mostrando que para essas duas estruturas a presença do grupo nitro parece não

104


interferir tanto nas suas propriedades tóxicas.

Comparando-se os resultados dos compostos 2f e 2j, percebe-se que houve uma

diminuição da citotoxicidade em cinco vezes do composto 2f, passando de 10 µg/ml para 50

µg/ml, mostrando que a estratégia de inserção do grupo fenil no grupo amino da função

tioamida terminal embora não tenha melhorado a atividade, foi útil nesse aspecto. Por outro

lado, para os compostos 2g e 2l, essa mesma estratégia de modificação molecular causou uma

aumento de mais cinco vezes no poder tóxico do composto 2g, passando de uma concentração

atóxica de 5 µg/ml para uma menor que 1 µg/ml. Este último dado corrobora com o trabalho

realizado por Greenbaum et al (2004), onde mostra-se que a inserção de alguns grupos

volumosos, seja em N-4, seja no anel aromático das tiossemicarbazonas aumentam

significativamente a citotoxicidade 119

. Por fim, pode-se então dizer que nossos dados estão

em concordância com o trabalho publicado por Paula e colaboradores (2009), onde é dito que

a toxicidade dos nitrocompostos é dependente de fatores como a estrutura química e a posição

do grupo nitro, sendo a primeira mais importante para nossa discussão 123

.

Os compostos 2e, 2i e 2l mostraram-se os mais tóxicos da série analisada, sendo este

último mais tóxico que o Nfx, droga mais tóxica para o tratamento da Doença de chagas. Este

fator pode estar relacionado à sua estrutura, como já comentado anteriormente. O composto

2e, considerado mais ativo da nossa série frente a formas epimastigotas do T. Cruzi,

apresentou-se com uma citotixicidade de 1 µg/ml, a mesma do Nfx. Esse valor parece está de

acordo com o trabalho de Du et al. (2002), onde um isômero de posição do composto 2e, cujo

substituinte bromo encontra-se na posição meta em relação a função azometínica, também

mostrou-se um dos mais citotóxicos da sua série.

Analisando os valores da tabela para os compostos 2h (derivado nitrofurânico) e 2i

(derivado nitro-tiofênico), nota-se que o último apresentou uma citotoxicidade 25 vezes

menor que a do primeiro. Esses dados corroboram com o trabalho de Gerpe et al. (2009),

onde analisou-se a citotoxicidade de algumas tiossemicarbazonas, tendo duas destas a mesma

diferença apresentadas pelos compostos 2h e 2i. Nesse estudo, o derivado nitrofurânico

obteve ID50 = 200 µM, e seu análogo ID50 <100 µM 122

.

Analisado de forma conjunta os valores obtidos de IC50 e citotoxicidade (Tabela 8)

dos compostos sintetizados, que reflete o risco-benefício no tratamento da doença de Chagas,

podemos considerar que os resultados obtidos para o derivado nitro-ariltiossemicarbazônico

2h, o qual apresentou IC50=1.42 μM/ e citotoxicidade= 25 µg/ml, foram os mais promissores

da série, visto que se mostrou mais ativo e com mesmo poder citotóxico da droga de

105


referência, encorajando-nos a dar continuidade a este projeto. Os compostos 2a, 2c e 2j,

embora tenham se mostrado pouco tóxicos, apresentaram IC50 muito baixa em relação ao Bdz,

sendo necessário testar algumas modificações moleculares para melhoria da atividade. Os

compostos 2e e 2i., os mais ativos da série, mostraram-se também como os mais tóxicos,

sendo portanto sempre necessário avaliar essas duas características para eleição de um

possível protótipo a fármaco anti- T. Cruzi.

Tabela 8: Relação IC50 X Citotoxicidade

Comp. IC50 epimastigotas

(µg/ml)

Citotoxicidade

(µg/ml)

2a 15.87 >100

2b 28.63 10

2c 16.39 >100

2d 5.12 25

2e 1.06 1

2f 2.06 10

2g 29.90 5

2h 1.42 25

2i 1.12 1

2j 36.25 50

2l 9,6 <1

BDZ 1.73 25

106


Capítulo IV

CONCLUSÕES E PERPESCTIVAS

107


VI- 1. CONCLUSÕES

Os compostos em estudo foram obtidos partindo-se de metodologia simples,

econômica, rápida, e apresentando rendimentos que variaram de 68-85%. A

confirmação estrutural deu-se através da análise de dados espectroscópicos de IV,

RMN 1H e RMN

13C. Nesse trabalho não foi possível determinar a configuração

absoluta das nitro-ariltiossemicarbazonas.

Quanto à atividade antibacteriana desses deriavados, os compostos 2c,2h e 2i

obtiveram os melhores resultados, merecendo maior destaque o composto 2h, que

mostrou-se mais ativo que a droga controle utilizada.

As nitro-ariltiossemicarbazonas também foram avaliadas frente a atividade anti-T.cruzi

contra a forma evolutiva epimastigota, sendo os compostos 2e, 2h e 2i os que

apresentaram melhores resultados. Dentre estes, o composto 2e apresentou relevância,

mostrando-se cerca de 40% mais ativo que o Bdz.

No ensaio de citotoxicidade frente a células esplênicas de camundongo, todos os

compostos mostraram maior concentração atóxica igual ou inferior ao Bdz (25µg/ml),

excetuando-se os compostos 2a, 2c e 2j, com valores de maior concentração atóxica

igual ou superior a 50µg/ml.

Levando em conta o risco-benefício no tratamento da doença de Chagas, que é

representado pela relação citotoxidade X atividade anti-T. cruzi, podemos considerar

que os resultados obtidos para o derivado nitro-ariltiossemicarbazônico 2h, o qual

apresentou IC50=1.42 μM/ ml e citotoxicidade= 25 µg/ml, foram os mais promissores

da série, visto que se mostrou mais ativo e com mesmo poder citotóxico da droga de

referência, encorajando-nos a dar continuidade a este projeto.

108


IV- 2. PERPESCTIVAS

Realizar estudos de ―docking‖ com os compostos sintetizados

Realizar testes de avaliação da atividade frente às formas evolutivas tripomastigota e

amastigota do T. cruzi, assim como frente a enzima recombinante TCC.

Sintetizar um número maior de moléculas para realizar estudos de QSAR relativas as

atividades biológicas expostas neste trabalho.

Ciclização, complexação com metais e alquilação dos derivados nitro-

ariltiossemicarbazônicos obtidos, com posterior avalização de suas atividades.

109


Capítulo V

PARTE EXPERIMENTAL

110


V- 1. PARTE EXPERIMENTAL

V- 1.1 Materiais e Métodos

V- 1.1.1 Cromatografias

As cromatografias em camada delgada (CCD) foram conduzidas em placas de Sílica

Gel 60 F254 da MERCK de 0,25 mm de espessura. A leitura das mesmas foi realizada através

de radiação de ultravioleta (UV) no comprimento de onda (λ) de 254 nm.

V- 1.1.2 Pontos de Fusão

Os pontos de fusão foram medidos no equipamento QUILMES Q.340.23, em tubos

capilares imersos em banho de silicone.

V- 1.1.3 Espectroscopias de IV, RMN 1H e RMN 13C

Os espectros de IV moram obtidos em espectrofotômetro BRUKER IFS-66, em discos

de KBr. Os espectros de RMN 1H foram obtidos em um equipamento UNITYplus-300 MHz-

VARIAN, utilizando-se DMSO-d6 como solvente. Os deslocamentos químicos (d) foram

reportados em ppm, utilizando tetrametilsilano como referência interna. As constantes de

acoplamento foram indicadas em Hz, e as multiplicidades dos sinais foram designadas da

seguinte forma: s – singleto, d – dubleto, dd – duplo dubleto, t – tripleto, m – multipleto.

V- 1.1.4 Equipamentos

Bomba de vácuo TECNAL TE

058

Placas de agitação e aquecimento FISOTON

752A

Estufa; Vidraria geral;

Evaporador rotativo; Capela com exaustão;

111


Balança analítica BEL 220; Freezer;

Balança semi-analítica BEL

Marc 500 C

Espátulas e pinças metálicas

Espectrofotômetro (Biorad

3550)

V- 1.1.5 Reagentes e solventes

Tiossemicarbazida N(4)-fenil tiossemicarbazida

Aril-aldeídos substituídos. Ácido Clorídrico conc.

Ácido Sulfúrico conc. Ácido Nítrico

Ácido acético glacial Etanol e Metanol

Saponina Dimetil-formamida (DMF)

Hexano Acetato de etila

Água destilada Meio de cultura Muller-Hinton

Amoxicilina Timidina Tritiada

Isopropanol Duodecil sulfato de sódio

Dimetil-sulfóxido (DMSO) Soro Bovino Fetal

V- 1.2 Procedimentos Experimentais

V- 1.2.1 Síntese e Caracterização estrutural

V- 1.2.1.1 Composto 2a: 3-nitro-4-hidroxibenzaldeído tiossemicarbazona

112


Em um balão de fundo redondo com capacidade para 100mL, em banho de gelo,

adicionou-se 20 mL de clorofórmio (CHCl3). Em seguida acrescentou-se 5 mmol (0,61g) do

reagente 4-hidroxibenzaldeído, adquirido comercialmente. A esta mistura, quantidade

equimolar de ácido Nítrico (0,32g) foi adicionada, deixando-se sob agitação e banho de gelo

por uma hora. Após esse tempo, retirou-se o banho e esperou-se o fim da reação, que

aconteceu cinco horas mais tarde. Ao término da reação, realizaram-se três extrações, sendo a

primeira apenas com água (30mL), e as demais com Acetato de etila/ água. Em seguida a fase

orgânica foi evaporada para obtenção do produto na forma de cristais amarelos, os quais

foram levados ao dessecador por 24 horas para retirada completa de qualquer resquício de

solvente.

Os cristais formados foram pesados e utilizados para a condensação. Nesta etapa, a

solução etanólica da tiossemicarbazida, adicionou-se 5 gotas do catalisador ácido clorídrico

(HCl), deixando-se sob agitação magnética e temperatura ambiente por 15 minutos. Após esse

tempo acrescentou-se então quantidades equimolares do 3-nitro-4-hidroxibenzaldeído,

previamente sintetizado. A reação foi mantida à temperatura ambiente e constante agitação

magnética por um período de cinco horas, de modo que foi monitorada por CCD. Ao término

da reação, adicionou-se água destilada (20 mL) e foi observada a formação de precipitado, o

qual foi filtrado em funil sinterizado e lavado com água.

V- 1.2.1.1.1 Caracterização

F.M: C8H8N4O3S

P.M: 240,23g/mol

Sólido amarelo escuro; Rendimento: 74%; Rf: 0,5 (Acetona/Cicloexano 5:5); P.F:

241-243 ºC.

113


RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6): 11.40 (s, 1H, NH); 8.26 (s, 1H, Ar-H);

8.16 (s, 1H, NH2); 8.07 (s, 1H, NH2); 7.98 (s, 1H, CH=N), 7.93 (d, J = 8.10

Hz, 1H, Ar-H); 7.06 (d, J = 8,10 Hz, 1H, Ar); 3.48 (s, 1H, OH).

IV (ν cm-1

KBr): 3244 e 3393 (NH2), 3150 (NH hidrazínico), 1530 (C=N), 1281(NO2),

1165 (C=S).

V- 1.2.1.2 Composto 2b (3-nitro-4-dimetil-aminobenzaldeído tiossemicarbazona)



reagente 4-dimetilaminobenzaldeído, adquirido comercialmente. A esta mistura, quantidade

equimolar de ácido Nítrico (0,32g) foi adicionada, deixando-se sob agitação e banho de gelo

por uma hora. Após esse tempo, retirou-se o banho e esperou-se o fim da reação, que

aconteceu 4,5 horas mais tarde. Ao término da reação, realizaram-se três extrações, sendo a

primeira apenas com água (30mL), e as demais com Acetato de etila/ água. Em seguida a fase

orgânica foi evaporada para obtenção do produto na forma de cristais laranja-escuro, os quais

foram levados ao dessecador por 24 horas para retirada completa de qualquer resquício de

solvente.


solução etanólica da tiossemicarbazida, em quantidade equimolar ao aldeído, adicionou-se 5

gotas do catalisador ácido clorídrico (HCl), deixando-se sob agitação magnética e temperatura

ambiente por 20 minutos. Após esse tempo acrescentou-se então o 3-nitro-4-dimetil-

aminobenzaldeído, previamente sintetizado. A reação foi mantida à temperatura ambiente e

114


constante agitação magnética por um período de três horas, de modo que foi monitorada por

CCD. Ao término da reação, adicionou-se água destilada (20 mL) e foi observada a formação

de precipitado, o qual foi filtrado em funil sinterizado e lavado com água. Foi necessário após

alguns dias do produto armazenado na geladeira, realizar uma recristalização em EtOH.


Fórmula Molecular: C10H13N5O2S

Peso Molecular: 267,22g/mol

Sólido laranja; Rendimento: 73%; Rf: 0,4 (Cicloexano/Acetona 6:4); P.F: 218-220ºC.

RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6): δ 11,35 (s, 1H, NH); δ 8,14 (s, 1H, NH2); δ

8,12 (s,1H, Ar-H); δ 8,04 (s, 1H, NH2); δ 7,96 (s, 1H, CH=N); δ 7,88 (d, J= 8 Hz, 1H,

Ar-H); δ 7,13 (d, J= 8 Hz, 1H, Ar-H); 2,86 [s, 6H, N(CH3)2].

RMN 13

C (100 MHz, ppm, DMSO-d6): δ 177,63 (C=S); δ 145,83 (Cq Ar); δ 140,62

(CH=N); δ 137,88 (Cq Ar); δ 131,52 ( CH Ar); δ 125,08 (CH Ar); δ 123,29 ( Cq Ar); δ

118,02 (CH Ar); δ 41,83 (CH3-N)

IV (ν cm-1

KBr): 3236 e 3399 (NH2), 3154 (NH hidrazínico), 1526 (C=N), 1372 (NO2),

1203 (C=S).

V- 1.2.1.3 Composto 2c (3-metoxi-4 hidroxi-5-nitro-benzaldeído tiossemicarbazona)



reagente 3-metoxi-4 hidroxibenzaldeído, adquirido comercialmente. A esta mistura,

115


quantidade equimolar de ácido Nítrico (0,32g) foi adicionada, deixando-se sob agitação e

banho de gelo por uma hora. Após esse tempo, retirou-se o banho e esperou-se o fim da

reação, que aconteceu duas horas mais tarde. Ao término da reação, realizaram-se quatro

extrações, sendo a primeira apenas com água (30mL), e as demais com Acetato de etila/ água.

Em seguida a fase orgânica foi evaporada para obtenção do produto na forma de cristais

laranja-claros, os quais foram levados ao dessecador por 24 horas para retirada completa de

qualquer resquício de solvente.




ambiente por 15 minutos. Após esse tempo acrescentou-se então o 3-metoxi-4 hidroxi-5-nitro-

benzaldeído tiossemicarbazona, previamente sintetizado. A reação foi mantida à temperatura

ambiente e constante agitação magnética por um período de três horas, de modo que foi

monitorada por CCD. Ao término da reação, adicionou-se água destilada (20 mL) e foi

observada a formação de precipitado, o qual foi filtrado em funil sinterizado e lavado com

água.

V- 1.2.1.3.1. Caracterização

F.M: C9H10N4O4S

P.M: 270,26g/mol

Sólido laranja-claro; Rendimento: 85%; Rf: 0,5 (Acetona/Cicloexano 5:5); P.F: 239-

241ºC.

RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6): δ 11.48 (s, 1H, NH); δ 10.85 (s, 1H, OH); δ

8.27 (s, 1H, NH2); δ 8.20 (s, 1H, NH2); δ 7.97 (s, 1H, Ar); δ 7.75 (s, 1H, Ar); δ 7.75 (s,

1H, CH=N); δ 3.94 (s, 3H, O-CH3).

IV (ν cm-1


1057 (C=S).

V- 1.2.1.4 Composto 2d: 3-nitro-4-tolualdeído tiossemicarbazona.

116


Em um balão de fundo redondo com capacidade para 100 mL, em banho de gelo,


reagente 4-tolualdeído, adquirido comercialmente. A esta mistura, quantidade equimolar de

ácido Nítrico (0,32g) foi adicionada, deixando-se sob agitação e banho de gelo por uma hora.

Após esse tempo, retirou-se o banho e esperou-se o fim da reação, que aconteceu 6 horas mais

tarde. Ao término da reação, realizaram-se quatro extrações, sendo a primeira apenas com

água (30mL), e as demais com Acetato de etila/ água. Em seguida a fase orgânica foi

evaporada para obtenção do produto na forma de cristais amarelos claros, os quais foram

levados ao dessecador por 24 horas para retirada completa de qualquer resquício de solvente.




ambiente por 15 minutos. Após esse tempo acrescentou-se então o 3-nitro-4-tolualdeído,






F.M: C9H10N4O2S

P.M: 238,27g/mol

Sólido amarelo-claro; Rendimento: 68%; Rf: 0,48 (Cicloexano/Acetona 6:4); P.F:

226-228ºC.

117


RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6): δ 11,545 (s, 1H, NH); δ 8,40 (d, J = 1,6 Hz, 1H,

Ar-H); δ 8,26 (s, 1H, NH2); δ 8,20 (s, 1H, NH2); δ 8,06 (s, 1H, CH=N); δ 8,01 (dd, J=

8 Hz e J = 1,6 Hz, 1H, Ar-H); δ 7,13 (d, J= 8 Hz, 1H, Ar-H) ; 2,49 (s, 3H, Ar-CH3).

IV (ν cm-1


1107 (C=S).

V- 1.2.1.5 Composto 2e (3-nitro-4-bromobenzaldeído tiossemicarbazona).


adicionou-se 10 mL de H2SO4. Em seguida acrescentou-se 5 mmol (0,70g) do reagente 4-

bromobenzaldeído, adquirido comercialmente. Ao conteúdo do balão, adicionou-se

lentamente uma mistura de Ácido Nítrico concentrado e ácido sulfúrico em quantidades

equimolares (0,32g e 0,49 respectivamente) em relação ao aldeído, deixando-se sob agitação e


reação, que aconteceu 4,5 horas mais tarde. Ao término da reação, verteu-se o conteúdo do

balão em um béquer com 50 mL de água destilada havendo precipitação do produto na forma

de cristais esbranquiçados. Estes foram filtrados em funil sinterizado e lavados com água

vária vezes, sendo por fim levado ao dessecador por um período de 24 horas para retirada

completa de qualquer resquício de solvente.

Os cristais formados foram pesados e utilizados para a condensação Nesta etapa, a



ambiente por 20 minutos. Após esse tempo acrescentou-se então o 3-nitro-4-

bromobenzaldeído, previamente sintetizado. A reação foi mantida à temperatura ambiente e

118


constante agitação magnética por um período de cinco horas, de modo que foi monitorada por


de precipitado, o qual foi filtrado em funil sinterizado e lavado com água.


F.M: C8H7BrN4O2S

P.M: 303,13g/mol


238-240ºC.

RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6): δ 11,65 (s, 1H, NH); δ 8,56 (s,1H, Ar-H); δ

8,34 (s, 1H, NH2); δ 8,28 (s, 1H, NH2); δ 8,04 (s, 1H, CH=N); δ 7,93 (d, J= 8 Hz, 1H,

Ar-H); δ 7,91 (d, J= 8 Hz, 1H, Ar-H).

RMN 13

C (100 MHz, ppm, DMSO-d6): δ 178,40( C=S); δ 150,49 (Cq Ar); 138,53

(CH=N); 135,63 (Cq Ar); 134,68 ( CH Ar); 131,96 (CH Ar); 122,43 (CH Ar); 112,924

( Cq Ar).

IV (ν cm-1


1091 (C=S).

V- 1.2.1.6 Composto 2f (3-nitro-4-clorobenzaldeído tiossemicarbazona).

Em um balão de fundo redondo com capacidade para 100 mL, em banho de gelo,


clorobenzaldeído, adquirido comercialmente. Ao conteúdo do balão, adicionou-se lentamente

uma mistura de Ácido Nítrico concentrado e ácido sulfúrico em quantidades equimolares

(0,32g e 0,49 respectivamente) em relação ao aldeído, deixando-se sob agitação e banho de

119


gelo por uma hora. Após esse tempo, retirou-se o banho e esperou-se o fim da reação, que

aconteceu três horas mais tarde. Ao término da reação, verteu-se o conteúdo do balão em um

béquer com 50 mL de água destilada havendo precipitação do produto na forma de cristais

amarelos claros. Estes foram filtrados em funil sinterizado e lavados com água vária vezes,

sendo por fim levado ao dessecador por um período de 24 horas para retirada completa de

qualquer resquício de solvente.




ambiente por 20 minutos. Após esse tempo acrescentou-se então o 3-nitro-4-clorobenzaldeído,


magnética por um período de quatro horas, de modo que foi monitorada por cromatografia em

camada delgada (CCD). Ao término da reação, adicionou-se água destilada (20 mL) e foi

observada a formação de precipitado, o qual foi filtrado em funil sinterizado e lavado com

água.


F.M: C8H7ClN4O2S

P.M: 258,69g/mol

Sólido amarelo-claro; Rendimento: 67%; Rf: 0,69 (Cicloexano/Acetona 6:4); Ponto de

Fusão (P.F): 236-237ºC.

RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6): δ 11,65 (s, 1H, NH); δ 8,60 (d, J = 1,6 Hz, 1H,

Ar-H); δ 8,34 (s, 1H, NH2); δ 8,26 (s, 1H, NH2); δ 8,05 (s, 1H, CH=N); δ 8,04 (dd, J=

8,4 Hz e J = 1,6 Hz, 1H, Ar-H); δ 7,7 (d, J= 8,4 Hz, 1H, Ar-H).

IV (ν cm-1


1105 (C=S).

V- 1.2.1.7 Composto 2g: 5-nitro- isoftaldeído tiossemicarbazona

120


Em um balão de fundo redondo com capacidade para 100mL adicionou-se 10 mL de

H2SO4. Em seguida acrescentou-se 5 mmol (0,67g) do reagente 1,3-isoftaldeído, adquirido

comercialmente. Ao conteúdo do balão, adicionou-se lentamente uma mistura de Ácido

Nítrico concentrado e ácido sulfúrico em quantidades equimolares (0,32g e 0,49

respectivamente) em relação ao aldeído, deixando-se sob agitação e esperou-se o fim da

reação, que aconteceu sete horas mais tarde. Ao término da reação, verteu-se o conteúdo do


de cristais amarelo-palha. Estes foram filtrados em funil sinterizado e lavados com água vária

vezes, sendo por fim levado ao dessecador por um período de 24 horas para retirada completa

de qualquer resquício de solvente.


uma solução etanólica de 2 equivalentes de tiossemicarbazida, em relação aldeído, adicionou-

se 5 gotas do catalisador ácido clorídrico (HCl), deixando-se sob agitação magnética e

temperatura ambiente por 20 minutos. Após esse tempo acrescentou-se o 5-nitro- isoftaldeído,






F.M.: C10H11N7O2S2

P.M.: 325,37g/mol


256-258ºC.

121


RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6): 11.69 (s, 2H, NH); 8.62 (s, 2H, Ar-H); 8.58

(s, 1H, Ar-H); 8.35 (s, 4H, NH2); 8.15 (s, 2H, CH=N).

IV (ν cm-1


1105 (C=S).

V- 1.2.1.8 Composto 2h: 5-nitro-2-furaldeído tiossemicarbazona.



furaldeído, adquirido comercialmente. Ao conteúdo do balão, adicionou-se lentamente uma

mistura de Ácido Nítrico concentrado e ácido sulfúrico em quantidades equimolares (0,32g e

0,49 respectivamente) em relação ao aldeído, deixando-se sob agitação e banho de gelo por

uma hora. Após esse tempo, retirou-se o banho e esperou-se o fim da reação, que aconteceu

três horas mais tarde. Ao término da reação, verteu-se o conteúdo do balão em um béquer com

50 mL de água destilada havendo precipitação do produto na forma de cristais amarelos. Estes

foram filtrados em funil sinterizado e lavados com água vária vezes, sendo por fim levado ao

dessecador por um período de 24 horas para retirada completa de qualquer resquício de

solvente.





furfurilcarboxaldeído, previamente sintetizado. A reação foi mantida à temperatura ambiente e

constante agitação magnética por um período de 3 horas, de modo que foi monitorada por



122



Fórmula Molecular: C6H6N4O3S

Peso Molecular: 214,24g/mol

Sólido amarelo-claro; Rendimento: 81%; Rf: 0,58 (Acetona/Cicloexano 6:4); Ponto de

Fusão (P.F): 234-235ºC.


8,06 (s, 1H, NH2); δ 7,96 (s, 1H, CH=N); δ 7,96 (d, J = 3,9 Hz, 1H, Ar-H); δ 7,36 (d, J

= 3,9 Hz, 1H, Ar-H).

RMN 13


(Cq Ar); δ 129,97 (CH=N); δ 115,02 ( CH Ar); δ 113,08 (CH Ar).

IV (ν cm-1


1057 (C=S).

V- 1.2.1.9 Composto 2i: 4-nitro-2-tiofenocarboxaldeído tiossemicarbazona.



tiofenocarboxaldeído, adquirido comercialmente. Ao conteúdo do balão, adicionou-se

lentamente uma mistura de Ácido Nítrico concentrado e ácido sulfúrico em quantidades

equimolares (0,32g e 0,49 respectivamente) em relação ao aldeído, deixando-se sob agitação e


reação, que aconteceu 4,5 horas mais tarde. Ao término da reação, verteu-se o conteúdo do


123


de cristais amarelos. Estes foram filtrados em funil sinterizado e lavados com água vária

vezes, sendo por fim levado ao dessecador por um período de 24 horas para retirada completa

de qualquer resquício de solvente.





tiofenocarboxaldeído, previamente sintetizado. A reação foi mantida à temperatura ambiente e

constante agitação magnética por um período de 3 horas, de modo que foi monitorada por




F.M.: C6H6N4O2S2

P. M.: 230,17g/mol

Sólido amarelo; Rendimento: 76%; Rf: 0,44 (Cicloexano/Acetona 6:4); P.F: 249-

251ºC.


8,18 (s, 1H, CH=N); δ 8,05 (s, 1H, Ar-H); δ 8,00 (s, 1H, NH2); δ 7,51 (s, 1H, Ar-H).

RMN 13


(Cq Ar); δ 135,23 (CH=N); δ 130,34 ( CH Ar); δ 129,11 (CH Ar);

IV (ν cm-1


1103 (C=S).

V- 1.2.1.10 Composto 2j: 3-nitro-4-clorobenzaldeído N(4)-fenil-tiossemicarbazona.

124


A solução etanólica da tiossemicarbazida, em quantidade equimolar ao previamente

nitrado conforme procedimento descrito no item V- 2.1.6, adicionou-se 5 gotas do catalisador

ácido clorídrico (HCl), deixando-se sob agitação magnética e temperatura ambiente por 20

minutos. Após esse tempo acrescentou-se então o 3-nitro-4-clorobenzaldeído, previamente

sintetizado. A reação foi mantida à temperatura ambiente e constante agitação magnética por

um período de 5 horas, de modo que foi monitorada por CCD. Ao término da reação,

adicionou-se água destilada (20 mL) e foi observada a formação de precipitado, o qual foi

filtrado em funil sinterizado e lavado com água.


F.M.: C14H11ClN4O2S

P. M.: 334,78 g/mol


215-216ºC.

RMN 1H (300 MHz, ppm, DMSO-d6): δ 12,04 (s, 1H, NH); δ 10,275 (s, 1H, NH); δ

8,67 (s, 1H, Ar-H); δ 8,17 (s, 1H, CH=N); δ 8,15 (d, J= 8,8 Hz, 1H, Ar-H); δ 7,81 (d,

J= 8,8 Hz, 1H, Ar-H); δ 7,50 (d, J= 7,6 Hz, 2H, Ar-H); δ 7,39 (dd, J= 7,2 Hz e J = 7,6

Hz, 2H, Ar-H); δ 7,50 (t, J= 7,2 Hz, 1H, Ar-H).

IV (ν cm-1

KBr): 3255* (NH2), 3164 (NH hidrazínico), 1544 (C=N), 1332 (NO2), 1059

(C=S).

125


V- 1.2.2 Avaliação da Atividade Antibacteriana

V- 1.2.2.1 Metodologia

Os ensaios preliminares de atividade antibacteriana foram realizados em triplicata,

utilizando-se a metodologia de Difusão em Disco em meio sólido127

. Soluções na

concentração de 10 mg/mL foram preparadas para cada molécula analisada. Discos de papel

foram impregnados com 30 μL das soluções recém-preparadas, resultando numa concentração

final de 300 μg/disco. Os mesmos foram depositados sobre placas de Petri contendo os meios

de cultura previamente semeados com os microrganismos testados, e inoculados a 37 ºC por

24-48 h. Discos previamente umedecidos com DMF foram utilizados como controle negativo.

Os resultados foram analisados através das médias aritméticas dos halos de inibição,

expressas em milímetros, sendo designadas como Zonas Médias de Inibição (ZMI).

Os compostos 2c e 2h, por apresentaram melhor ação em relação aos demais, foram

selecionados determinação das concentrações mínima inibitória (CMI) e mínima bactericida

(CMB), em meio líquido. O composto 2i não pôde ser testado, pois o mesmo precipitava em

vários meios de culturas testados, indicando que havia interação entre a molécula e

componentes do meio de cultura.

Para os ensaios em meio líquido, a partir da solução estoque (10 mg/mL) para cada

composto selecionado, diluições seriadas foram preparadas, obtendo-se concentrações que

variaram entre 500 e 7,8125 μg/mL para os derivados 2h e 2i, e entre 1000 e 15,625 μg/mL

para 2c. Estas concentrações foram adicionadas aos tubos teste contendo os meios de cultura,

e posteriormente as suspensões dos microrganismos foram inoculadas. Para o controle

positivo, foram preparados tubos contendo apenas o meio de cultura e a suspensão do micro-

organismo. Tubos contendo o meio de cultura, a suspensão do microrganismo e o solvente

DMF foram utilizados como controle negativo.

Os tubos foram incubados a 37ºC por 24-48 h, e, em seguida, examinados e

plaqueados para visualização ou não de crescimento. Os valores de CMI foram obtidos a

partir da maior concentração dos compostos onde não se observou crescimento, e os valores

de CMB, observados a partir do crescimento da diluição subseqüente, sempre plaqueando-os

para uma melhor visualização e confirmação.

126


V- 1.2.3 Avalização da atividade anti- T.cruzi.


Para determinar o efeito anti-proliferativo para T. cruzi, formas epimastigotas (106/ml)

crescidos em culturas axênicas, na fase log de crescimento, serão colocadas em placas de 96

poços no volume de 100 ml, sob condições de cultura adequadas (26°C). Os testes serão

conduzidos tendo como controle o benzonidazol (50 mg/ml) e culturas de parasitos sem

tratamento. As substâncias serão avaliadas quanto a concentração inibidora de 50% do

crescimento dos parasitas (IC50%) onde formas epimastigotas da cepa Y de T. cruzi serão

cultivadas durante 24 horas, respectivamente, na presença de diferentes concentrações dos

compostos, procedendo-se em seguida a contagem de parasitas viáveis. O cálculo da IC50%

será determinada por meio de uma regressão linear simples utilizando o software Prisma 4

Graphpad.

V- 1.2.4 Obtenção de células esplênicas de camundongos isogênicos e Ensaio de

Citotoxicidade


Células esplênicas foram obtidas de acordo com metodologia descrita na literatura117

.

Após sacrifício do animal por asfixia em CO2, o baço de cada camundongo foi removido em

condições assépticas e, em fluxo vertical, macerado em placa de Petri contendo meio de

cultura RPMI. As suspensões celulares obtidas serão centrifugadas a 4ºC, durante 5 minutos.

Após descarte do sobrenadante, adiciona-se água destilada ao sedimento promovendo lise das

hemácias. Marca-se cinco minutos, coleta-se o sobrenadante e centrifuga-se novamente a 4ºC,

200 rpm por cinco minutos. O sedimento (contendo as células esplênicas) foi ressuspendido

em meio RPMI 1640 e uma alíquota de cada suspensão celular removida, diluída 1:10 em

azul de trypan e quantificada em câmara de Neubauer para se verificar as células viáveis.

Células esplênicas (6x105 células/poço) foram cultivadas em placas de 96 poços de

fundo plano, contendo meio de cultura RPMI com 10% de soro bovino fetal. Para o ensaio de

citotoxicidade, as células serão incubadas com os compostos em sete diferentes concentrações

127


(faixa de 200 a 0,1 µg/mL) e com 1 µM de timidina tritiada/poço durante 24 h em estufa de

CO2 a 37ºC. Em paralelo, foram feitos controles com células tratadas com saponina (0,05%),

com células tratadas com DMSO (0,05%), substâncias com reconhecida atividade tóxica e um

controle sem tratamento. Após 24 h de incubação, as células foram coletadas em papel de

fibra de vidro e, posteriormente, a captação de timidina tritiada será determinada através do

contador beta de cintilação. O percentual de citotoxicidade foi determinado comparando-se a

percentagem de incorporação de timidina tritiada nos poços com as drogas em relação aos

poços não tratados.

128


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142


ANEXOS

143


ANEXO A: Espectros de IV dos derivados obtidos

Composto 2a: 3-nitro-4-hidroxibenzaldeído tiossemicarbazona

Composto 2b: 3-nitro-4-dimetil-aminobenzaldeído tiossemicarbazona.

144


Composto 2c: 3-metoxi-4 hidróxi-5-nitro-benzaldeído tiossemicarbazona.

Composto 2d: 3-nitro-4-tolualdeído tiossemicarbazona.

145


Composto 2e: 3-nitro-4-bromobenzaldeído tiossemicarbazona.

Composto 2f: 3-nitro-4-clorobenzaldeído tiossemicarbazona.

146


Composto 2g: 5-nitro- isoftaldeído tiossemicarbazona.

Composto 2h: 5-nitro-2-furaldeído tiossemicarbazona.

147


Composto 2i: 4-nitro-2-tiofenocarboxaldeído tiossemicarbazona.

Composto 2j: 3-nitro-4-clorobenzaldeído-N(4)-fenil-tiossemicarbazona.

148


Molécula 2l: 5-nitro-isoftaldeído-N(4)-fenil-

tiossemicarbazona.

149


ANEXO B: Espectros RMN 1H

Composto 2a

150


Composto 2b

151


Composto 2c

152


Composto 2d

153


Composto 2e

154


Composto 2f

155


Composto 2g

156


Composto 2h

157


Composto 2i

158


Composto 2j

159


Composto 2l

sÍntese e avaliaÇÃo das atividades antimicrobiana e …( deptº de química fundamental da...

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