sÍntese e avaliaÇÃo de propriedades fÍsico … · com que eu me encantasse pela pesquisa e me...
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UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO
PRISCILA VALLES ROCHA
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS E
MORFOLÓGICAS DE NANOCRISTAIS DE HIDROXIAPATITA
DOPADOS COM ÁCIDO ZOLENDRÔNICO
SÃO PAULO
2015
1
PRISCILA VALLES ROCHA
MESTRADO EM BIOMATERIAIS
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS E
MORFOLÓGICAS DE NANOCRISTAIS DE HIDROXIAPATITA
DOPADOS COM ÁCIDO ZOLÊNDRONICO
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia da Universidade Anhanguera de São
Paulo, como requisito para obtenção do título de
MESTRE em Biomateriais. Área de Concentração:
Biomateriais em Odontologia.
Orientadora: Profª. Dra. Marcela Rocha de Oliveira
Carrilho
Co-orientadora: Profª Dra. Alejandra Hortencia M.
González
SÃO PAULO
2015
2
Rocha, Priscila Valles
Síntese e avaliação de propriedades físico-químicas e
morfológicas de nanocristais de hidroxiapatita dopados com ácido
zolendrônico/ Priscila Valles Rocha. -- São Paulo: [s.n.], 2015.
89fls; il.; 30 cm
Dissertação apresentada a Faculdade de Odontologia da
Universidade Anhanguera de São Paulo, como exigência para obtenção
do título de MESTRE em Biomateriais. Área de Concentração:
Biomateriais em Odontologia.
Orientadora: Profª. Dra. Marcela Rocha de Oliveira Carrilho
Co-orientadora: Profª Dra. Alejandra Hortencia M. González
1. Bifosfonatos 2. Administração local 3. Hidroxiapatita
3
Dedico este trabalho à meu esposo, Luis Fernando, que sempre presente
me apoia para a busca do crescimento pessoal e profissional e aos
meus pais Gerson e Leila pelo acalentamento diário, mesmo diante
das muitas ausências.
4
Agradecimentos
À Deus incomparável e inconfundível, que em sua bondade infinita, compreendeu
meus anseios e me deu a vida, para buscar meus objetivos. Ao meu pai Gerson, pela
coragem; minha mãe Leila, pelo eterno amor e dedicação. À todos os meus familiares por
entenderem minhas ausências em especial à minha Vó Maria que com seu sorriso constante
alegrou minhas angústias e minha Tia Déia, por saber que sou seu orgulho e sempre
acreditar em mim. À minha sobrinha Fernanda por todas as milhares de mensagens de
carinho me alegrando em todas as minhas ausências. Ao meu esposo Luis Fernando
essencial à minha vida, pilar do repouso, conforto e amor, por sua incansável paciência em
todos os dias das muitas aflições. Amo vocês.
À minha querida orientadora, Profa. Dra. Marcela Rocha de Oliveira Carrilho, peça
chave de toda a evolução deste estudo, que alimentou diariamente minhas dúvidas... fez
com que eu me encantasse pela pesquisa e me guiou para além das teorias, minha eterna
gratidão e admiração, não haveria outros dois sentimentos mais puros para te dedicar neste
momento.
À Prof. Dra. Alejandra Hortencia M. González, co-orientadora deste estudo, que
com toda sua doce disposição e solicitude me orientou para as teorias que desejava e achava
além do meu alcance, muito obrigada por muitas horas de seu trabalho dedicadas à
elaboração deste estudo.
Ao Prof. Dr. Camillo Anauate Netto, Coordenador do Programa de Biomateriais em
Odontologia, que de braços abertos me aceitou no programa, me presenteando com toda
sua colaboração para minha formação acadêmica e profissional.
Ao professor Dr. Fabio Dupart Nascimento que convidado a compor a banca de
qualificação dispostamente aceitou e contribuíu de forma muito ativa na correção deste
estudo, com sugestões muito pertinentes e com todo apoio para a realização da parte
experimental.
5
À professora Dra. Andrea Anido Anido, muito querida, (que me acompanham desde
a Graduação participando da minha evolução profissional), que compôs brilhantemente a
banca de qualificação e me presenteia novamente com suas considerações que engrandecem
este estudo.
Ao professor Dr. André De Vito que através de suas considerações irá colaborar para
a qualificação deste estudo.
A todos os docentes do Programa de Biomateriais em Odontologia, que
participaram no cumprimento dos créditos e para o processo da minha formação. Meus
sinceros agradecimentos. Profa. Dra. Andrea Anido Anido, Profa. Dra. Alejandra Hortência
M. González, Prof. Dr. Camillo Anauate Netto, Prof. Dr. Fabio Dupart Nascimento, Profa.
Dra. Marcela Rocha de Oliveira Carrilho, Prof. Dr. Paulo Henrique Perlatti D’Alpino, Prof.
Dr. Ricardo Amore, Profa. Dra. Roberta Caroline Bruschi Alonso e Prof. Dr. Vinícius Di
Hipólito.
Agradeço todos os colegas do Mestrado que pelo convívio diário no comprimento
dos créditos engrandeceram a troca de experiências, agregadas à amizade e companheirismo
desprendido. Em especial à Talita Zanluqui, amiga pessoal, companheira de mestrado,
presente em todos os momentos, minha admiração e apreço pela amizade depositada em
mim e pela importante cumplicidade em todos esses dias.
Aos amigos, companheiros de atendimento, professores e funcionários da UNIAN,
os quais nem me ousaria em nomeá-los e que acompanham a trajetória profissional árdua e
que tanto amo agradeço pela convivência que de forma direta ou indireta contribuíram para
o meu crescimento pessoal e profissional. À todos que mantiveram tudo funcionando para
que eu seguisse esta minha jornada, o meu muito obrigada.
6
“A menos que modifiquemos a nossa maneira de pensar, não
seremos capazes de resolver os problemas causados pela
forma como nos acostumamos a ver o mundo”.
(Albert Einstein)
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão
uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe
faltasse uma gota”.
(Madre Teresa de Calcutá)
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RESUMO
ROCHA, P. V. Síntese e avaliação de propriedades físico-químicas e
morfológicas de nanocristais de hidroxiapatita dopados com ácido
zolendrônico. 2015. 89fls. Dissertação apresentada a Faculdade de Odontologia da
Universidade Anhanguera de São Paulo. Área de Concentração: Mestrado de
Biomateriais em Odontologia. São Paulo, 2015.
Os bifosfonatos (BFs) são fármacos estruturalmente análogos ao pirofosfato
inorgânico (PPi), um metabólito comum em diversas cascatas bioquímicas celulares,
que dentre várias funções, por exemplo, age como um regulador endogeno da
mineralizacao ossea. Acredita-se que os bisfosfonatos diminuem potencialmente a
reabsorcao ossea por inibirem tanto a atividade de osteoclastos maduros como o
recrutamento de seus precursores, e estimularem a atividade de osteoblastos. Mesmo
diante de seus inúmeros benefícios. a associação entre o uso sistêmico de
bisfosfonatos e uma forma peculiar de osteonecrose dos ossos maxilares tem sido
relatada, principalmente, em pacientes submetidos à exodontias ou outros tipos de
intervenção cirúrgica sobre o tecido ósseo, como por exemplo a colocação de
implantes dentais. Por outro lado, o recobrimento de implantes dentais com alguns
BFs, e a consequente liberação local destes fármacos, tem sido associado com o
aumento da taxa de sucesso de fixação dos implantes. Dado que até o momento, a
literatura careça de evidências sobre a real possibilidade de que a administração
sistêmica de BFs torne as estruturas ósseas potencialmente suscetíveis à
osteonecrose, o uso de BFs no local da ferida/intervenção cirúrgica poderia trazer
benefícios à remodelação do tecido ósseo, favorecendo a sua formação. O objetivo do
presente estudo foi realizar a síntese e a caracterização físico-química e morfológica
da interação da hidroxiapatita (HA) com um bisfosfonato de 3a geração, o ácido
zolendrônico (ZA). A síntese da HA foi obtida pelo método sol-gel utilizando
precursores alternativos como o nitrato de cálcio e ácido fosfórico (Santos et al.,
2005); enquanto a dopagem dessa HA com ácido zolendrônico seguiu a metodologia
proposta por Pascaud et al., 2013. As propriedades físico-químicas da associação
HAS+ZA foram caracterizadas por difração de Raio-X (DRX) e espectroscopia
vibracional no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR); enquanto a
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morfologia das amostras foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV).
As análises foram realizadas logo após a síntese da HA e em seguida da dopagem
desta com o ácido zolendrônico. Resultando na síntese de nanocristais de
hidroxiapatita e na efetiva adsorção química do ácido zolendrônico.
Palavras-chave: bifosfonatos, administração local, hidroxiapatita
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ABSTRACT
ROCHA, P. V. Synthesis and evaluation of physical -chemical and morphological nanocrystals of hydroxyapatite doped zolendronic acid. 2015. 89fls. Dissertação apresentada a Faculdade de Odontologia da Universidade Anhanguera de São Paulo. Área de Concentração: Mestrado de Biomateriais em Odontologia. São Paulo, 2015.
Bisphosphonates (BFs) are structurally analogs to pyrophosphate (PPi), a natural
metabolic of numerous cellular biochemical cascades, which for instance perform an
endogenous regulation of bone mineralization. It is thought that the BFs may reduce
bone resorption due to both inhibition of the activity of mature osteoclasts and
recruitment of their cellular precursors, and also due to osteoblasts activation. The
association between bisphosphonates and a peculiar maxillary osteonecrosis has
been reported, mainly after tooth extraction or other bone chirurgic intervention, such
as dental implants’ fixation. On the other hand, once released locally from the surface
of a coated dental implant, bisphosphonates have shown to improve bone fixation of
such implants. Since the literature has been still scare on showing real evidence that
system administration of BFs renders bone structure more susceptible to
osteonecrosis, the local use of BFs could become an important resource to change the
balance of bone turnover in favor of bone formation, leading to a net gain in local bone
density. The aim this study was to evaluate the interaction phenomena between
hydroxypatite (HA) and molecules of a 3rd generation bisphosphonate, the zolendric
acid (ZA). HA synthesis was performed by a sol-gel method using alternative
precursors such as calcium nitrate and phosphoric acid (Santos et al., 2005); while the
grafiting of HA with zolendronate followed the method proposed by Pascaud et al.,
2013. Analysis involving physicochemical and morphological characterization of the
solid HA, HAS+ZA were done by X-ray diffraction (XRD), vibrational spectroscopy by
Fourier transform infrared (FTIR), roughness and scanning electron microscopy
(SEM). Resulting in the synthesis of hydroxyapatite nanocrystals and effective
chemical adsorption zolendronic acid.
Key Works: biphosphonates, local administration, hidroxiapatite.
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LISTA DE ABREVIATURAS
ATP Adenosina trifosfasto BF Bifosfonato BFs Bifosfonatos BMP Proteína Morfogenética Óssea CTX Telopeptídeo C-Terminal DRX Difratometria de Raio X FTIR Espectroscopia Vibracional no Infravermelho por transformada de Fourier HA Hidroxiapatita HAS Hidroxiapatita Sintética ICDD International Centre for Diffraction Data IL-1 Interleucina-1 IL-6 Interleucina-6 INF-γ Interferon gamma MEV Microscopia Eletrônica de Varredura OAB Osteonecrose Associada à Bifosfonato PCR Proteína C reativa PGs Prostaglandinas Ppi Pirofosfato inorgânico PRP Plasma rico em Plaquetas PTH Paratormônio
R1 Radical 1
R2 Radical 2 RER Retículo Endoplasmático Rugoso SBF Fluido Corporal Simulado TGF-β Fator de transformação do crescimento beta Ti Titânio ZA Ácido Zolendrônico
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 11
2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................. 14
2.1 Aspectos gerais do tecido ósseo ............................................................ 14
2.2 Bifosfonatos .............................................................................................. 22
2.3 Hidroxiapatita ............................................................................................ 26
2.4 Osteonecrose Associada ao uso de BFs (OAB) .................................... 30
2.5 A administração de BFs em benefício do quadro local ........................ 33
2.5.1 Administração sistêmica .......................................................................... 33
2.5.2 Administração local .................................................................................. 35
2.5.3 Associação de BFs com biomateriais...................................................... 38
3 PROPOSIÇÃO ........................................................................................ 40
4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 41
4.1 Material ....................................................................................................... 41
4.2 Métodos ...................................................................................................... 42
4.2.1 Síntese de hidroxiapatita (HA) via sol-gel ............................................... 42
4.2.2 Adsorção de Ácido Zolendrônico à Hidroxiapatita sintética 43
4.3 Caracterização das Amostra .................................................................... 44
4.3.1 Difratometria de raios X (DRX) ................................................................. 45
4.3.2 Espectroscopia Vibracional no Infravermelho ....................................... 46
4.3.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ........................................... 46
5 RESULTADOS ....................................................................................... 48
5.1 Caracterização da cristalinidade do pó de HA e HA + ZA por DRX ..... 48
5.2 Caracterização das ligações químicas nos pós de HAS e HAS + ZA
por FTIR ....................................................................................................... 53
5.3 Caracterização da morfologia dos pós de HAS e HAS + ZA por MEV.... 58
6 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 61
7 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 69
8 REFERÊNCIAS .................................................................................................. 70
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1. INTRODUÇÃO
O aumento da expectativa de vida tem resultado no crescimento da população
de idosos e, consequentemente, das doenças relacionadas à vetustez. Dentre os
diversos males, os que afetam a estrutura óssea, como a osteoporose e a perda de
massa óssea, têm sido intensamente estudados devido aos efeitos contundentes na
qualidade de vida destes pacientes (KAWACHI, 2000).
O tecido ósseo é complexo e constituído, macroscopicamente, de uma fase
orgânica, preponderantemente de colágeno, e uma fase mineral formada por sais de
fosfato de cálcio depositados e arranjados como nanocristais de hidroxiapatita. Sua
fisiologia é marcada por um processo contínuo de remodelação dinâmica, sendo
caracterizado, portanto, por duas atividades simultâneas e opostas: deposição e
reabsorção óssea. O equilíbrio entre a formação e a degradação do tecido ósseo tem
como resultado uma renovação da micro-arquitetura óssea. Durante a deposição
óssea, os osteoblastos sintetizam uma matriz que a posteriori sofre mineralização
(deposição de íons inorgânicos, na forma de fosfato de cálcio). Já a reabsorção óssea
é realizada pelos osteoclastos, e consiste na dissolução do mineral ósseo e
catabolismo dos componentes orgânicos da matriz óssea. Essa atividade dos
osteoclastos pode levar à formação de extensas cavidades do tecido e à liberação dos
componentes da matriz óssea (SANTOS et al., 2011).
Os bifosfonatos (BFs) são fármacos sintéticos quimicamente análogos, porém
mais estáveis do pirofosfato inorgânico (PPi) e, portanto, fazem parte do arsenal de
drogas antirreabsortivas, utilizados no tratamento e prevenção de doenças que
envolvem as diferentes alterações do metabolismo ósseo. Quando comparado ao
pirofofato (P-O-P), ou seja, o composto natural que participa do metabolismo ósseo, a
síntese de bifosfonatos resulta da substituição do átomo central de oxigênio por um
átomo de carbono (P-C-P), o que torna a estrutura da molécula sintética menos
susceptível à hidrólise química e enzimática (RUSSELL, 2011).
Essa classe de medicamentos é utilizada para terapia e prevenção de
distúrbios ósseos, bem como para a prevenção de problemas ósseos em doentes com
câncer, doença de Paget, e representam a primeira escolha para a prevenção
secundária e tratamento da osteoporose. São classificados em três categorias (3) ou
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gerações, e a escolha do BF a ser empregado no controle de uma dada patologia é
determinada a partir de parâmetros bem definidos que variam em função da
capacidade do fármaco em ligar-se à superfície óssea mineral, da sua potência
farmacológica, da possibilidade de adquirir nova atividade farmacológica e,
evidentemente, da sua biodisponibilidade. Após absorvidos, a atividade dos BFs está
relacionada tanto a efeitos físico-químicos, quanto biológicos, e se deve principalmente
à afinidade relativa do BF quanto à adsorção aos cristais de apatita, à prevenção da
dissolução de mineral do osso e também à inibição da atividade de osteoclastos,
induzindo sua apoptose. O uso de BFs tem sido associado com a diminuição da
reabsorção óssea, o que indiretamente permitiria o aumento da densidade óssea e a
melhora da remineralização do tecido (KODAMA et al., 2012).
O tratamento clássico com BFs é realizado por administração sistêmica por via
oral ou intravenosa. No entanto, seu uso sistêmico e prolongado, apesar da eficácia
clínica, pode resultar em efeitos adversos tal como a ocorrência de osteonecrose de
maxila e mandíbula (OAB), complicação severa que põe em risco a saúde dos
pacientes, sendo essencial prevenir e minimizar os riscos do desenvolvimento desta
intercorrência colateral. O risco de OAB impediu, por alguns anos, pacientes que
utilizavam BFs de serem submetidos a procedimentos odontológicos invasivos
(cirúrgicos) pela crença de que tais procedimentos os predispusessem a
desenvolverem OAB. Entretanto, um pergunta que se coloca é: Como um fármaco com
tantos benefícios sistêmicos, poderia predispor indivíduos à consequências tão
deletérias no que tange ao seu aparato ósseo oral?
A fim de previnir estes efeitos adversos e aumentar a biodisponibilidade dos
BFs, o desenvolvimento de estratégias para a administração local, torna-se uma
alternativa interessante. Tendo em conta a afinidade dos BFs ao tecido ósseo, os
biomateriais à base de fosfato de cálcio como as hidroxiapatitas sintéticas, constituem-
se como veículos apropriados para essas moléculas; e estas associações de BFs com
vários compostos de fosfato de cálcio têm sido estudadas para a evolução da
administração local deste fármaco. Adicionalmente, por exemplo, tem sido reportado
que o recobrimento de implantes dentais tratados com BFs, e a consequente liberação
local destes fármacos, foi capaz de promover aumento da taxa de sucesso de fixação
desses implantes (TENGVALL et al., 2004 e WERMELIN et al., 2008).
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Os BFs atualmente registrados no Brasil são: alendronato, ibandronato,
risedronato, pamidronato, clodronato e zolendronato (ácido zoledrônico). A literatura
apresenta poucos, mas consistentes dados sobre a interação de alguns BFs e cristais
de fosfato de cálcio, como apatita e hidroxiapatita (MUKHERJEE et al., 2008; JOSSE et
al., 2005 e COLEMAN, 2008). Estudos correlatos caracterizam que, por sua vez dentre
muitas ações, esses materiais bioativos tem efeito positivo na biosdiponibilização local
de BFs, e consequentemente poderiam favorecer a deposição óssea (ABTAHI et al.,
2010 e ABTAHI et al., 2012). Estes estudos, porém, investigam BFs que, infelizmente,
não estão comercialmente disponíveis/registrados no Brasil.
Com base nestas informações, o presente trabalho visou sintetizar e
caracterizar um material com potencial bioativo que resultou da interação de nanocritais
de hidroxiapatita com ácido zolendrônico, um BFs de 3ª geração resgitrado no Brasil e
cuja associação com hidroxiapatita é pouco estudada.
14
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos gerais do tecido ósseo
Para melhor compreensão da ação de BFs na atividade metabólica do tecido
ósseo é importante revisar alguns aspectos básicos morfofuncionais deste tecido, bem
como descrever em termos breves o seu metabolismo.
Essencial às funções orgânicas de homeostase mineral, proteção das vísceras,
suporte mecânico e locomoção esquelética, o tecido ósseo funciona sob um intrincado
controle de fatores sistêmicos, como os hormônios, e fatores locais, como os fatores de
crescimento e citocinas (KATCHBURIAN & ARANA, 2004). Portanto, o funcionamento
dos sistemas imune e esquelético se encontra em íntima relação. Por exemplo, a
homeostase do sistema esquelético está na dependência de uma dinâmica balanceada
da remodelação óssea, ou seja, do equilíbrio entre a atividade dos osteoblastos
(células de formação óssea) e osteoclastos (células de reabsorção óssea), que por sua
vez é minuciosamente controlado por inúmeras cascatas bioquímicas do sistema
imune.
Em termos macroscópicos, o tecido ósseo se apresenta como uma estrutura
bastante compacta, localizada na região mais periférica dos ossos (sobretudo de ossos
longos) que recebe a denominação de cortical ou córtex; ao passo que nas regiões
mais centrais (core), pode se constituir, em geral, por uma estrutura mais esponjosa ou
trabécula que contém espaços intercomunicantes e são altamente vascularizados. As
superfícies ósseas internas e externas são revestidas respectivamente pelo endósteo e
periósteo.
Microscopicamente, o tecido ósseo pode ser classificado como primário
(osteóide) (ROBBINS & COTRAN, 2005) em que a disposição e organização das fibras
de colágeno é irregular e há menor quantidade de cristais de hidroxiapatita. Este tipo
de osso está presente em fetos, no calo ósseo, nas osteomielites, nos tumores ósseos
e na doença óssea de Paget. Uma outra categoria, por sua vez, se classifica como
tecido ósseo secundário (maduro, haversiano ou lamelar) em que as fibras de colágeno
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encontram-se dispostas em lamelas paralelas ou concêntricas em torno dos canais de
Harvers, formando ora o osso compacto ora o esponjoso (COTRAM et al., 2005).
Bioquimicamente, o tecido ósseo apresenta uma composição distinta de
elementos inorgânicos (65%) depositados sobre e em íntima relação com uma matriz
orgânica (35%) (ROBBINS & COTRAN, 2005). O componente inorgânico é
representado predominantemente pelos depósitos de Fosfato de Cálcio organizados
em cristais de Hidroxiapatita (HA), que proporcionam resistência e rigidez ao tecido
ósseo. A taxa de mineralização da matriz orgânica pode variar, mas normalmente 12 a
15 dias são necessários entre a formação da matriz e sua mineralização inicial. Ao
microscópio de luz, o tecido osteóide apresenta aspecto amorfo e eosinofílico; e além
de ser encontrado em situações fisiológicas também é recorrente em tumores
formadores de tecido ósseo (KATCHBURIAN & ARANA, 2004 e COTRAM et al., 2005).
O componente orgânico do tecido ósseo, compreende as células ósseas típicas
e a matriz extracelular secretada por estas células, composta, principalmente, de
proteínas, fatores de crescimento e um arsenal de outras substâncias precursoras da
regulação do metabolismo celular, além de vasos sanguíneos e terminações nervosas.
Nos processos fisiológicos do metabolismo ósseos, ou seja, na formação,
reabsorção, manutenção e remodelação óssea participam quatro tipos celulares
distintos, que derivam de duas linhagens: uma relacionada à formação e manutenção:
osteoblastos, células de revestimento ósseo e osteócitos, e outra à reabsorção:
osteoclastos. As células que sintetizam a matriz incluem as células osteoprogenitoras e
osteoblastos. As osteoprogenitoras são células-tronco mesenquimais, pluripotentes
situadas próximo às superfícies ósseas, que quando estimuladas sofrem divisão celular
e produzem descendentes que se diferenciam em osteoblastos e, após a formação da
matriz óssea primária, em osteócitos, sendo os primeiros os tipos celulares vitais para o
crescimento, remodelação e reparo do tecido ósseo durante toda vida (ROBBINS &
COTRAN, 2005).
Os osteócitos são o tipo celular mais prevalente no tecido ósseo adulto
(maduro), em uma proporção de dez (10) osteócitos para cada osteoblasto
(MANOLAGAS, 2000). Sao, na verdade, osteoblastos “primitivos” que, à medida que
secretam a matriz, tornam-se aprisionados no interior de lacunas, e sofrem uma
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diminuição gradativa da quantidade de organelas de síntese e de secreção como
retículo endoplasmático rugoso (RER) e complexo de Golgi, caracterizando-se por
atividade metabólica muito abreviada, porém essencial para a manutenção da
homeostase óssea (KATCHBURIAN & ARANA, 2004). São células elípticas, menores
que os osteoblastos, que possuem diversos prolongamentos citoplasmáticos,
localizados no interior de pequenos canais chamados canalículos ósseos. Estes
prolongamentos citoplasmáticos se estendem em direção dos prolongamentos de
outros osteócitos adjacentes, de osteoblastos e células de revestimento ósseo do
endósteo e periósteo, estabelecendo junções (tipo gap) entre estas células. Estas
junções do tipo gap entre os prolongamentos dos osteócitos e entre os prolongamentos
dos osteoblastos permitem, por exemplo, que mesmo os osteócitos situados nas
regiões mais profundas do osso possam responder às variações sistêmicas, bem como
às variações na superfície óssea (RAISZ & RODAN, 1998 e KATCHBURIAN & CERRI,
2002). Os osteócitos são considerados fundamentais não somente para a manutenção
como também para a remodelação óssea, uma vez que tem sido sugerido que a
apoptose destas células pode atrair e estimular a atividade de osteoclastos (JILKA et
al., 1998 e BOABAID et al., 2001).
Osteoblastos são células mononucleadas polarizadas, que apresentam um
núcleo esférico e um citoplasma basófilo. São cubóides ou ligeiramente cilíndricas e
estão organizados em uma camada celular contínua sobre a superfície óssea que está
sendo constituída (osteóide). São as células responsáveis pela síntese da matriz
orgânica do osso, bem como pela sua mineralização (MACKIE, 2003 e CERRI, 2005).
Quando ativas (i.e. quando secretam componentes da matriz extracelular), possuem um
citoplasma rico em organelas de síntese e secreção, como retículo endoplasmático
rugoso (RER) e complexo de Golgi, grânulos de secreção, mitocôndrias, vesículas de
transporte, vesículas endossômicas e lisossômicas, além de proteínas do citoesqueleto
(RAISZ & RODAN, 1998 e SODEK & MCKEE, 2000). Sintetizam a matriz orgânica,
constituída de proteínas colagênicas, sobretudo colágeno tipo I, e proteínas não
colagênicas, tais como osteocalcina, osteopontina, proteoglicanas, fosfoproteínas e
citocinas. Estes componentes interagem e se organizam, fornecendo um arcabouço que
favorece e guia a deposição e a cristalização de sais minerais por meio da sinalização
de algumas destas moléculas (JILKA et al., 1998 e BOABAID et al., 2001).
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Osteoblastos e pré-osteoblastos exibem uma alta concentração de uma
enzima, a fosfatase alcalina, presente na superfície de suas membranas
citoplasmáticas, e que quando liberada deflagra o início do processo de precipitação,
deposição e formação progressiva de cristais de hidroxiapatita (MANOLAGAS, 2000;
KATCHBURIAN & CERRI, 2002 e MUNDY, 1991).
No processo inicial de formação do tecido ósseo, os osteoblastos parecem
assumir um importante papel na sua mineralização. Assim, após secreção da primeira
camada de matriz orgânica, vesículas microscópicas começam a se formar na
superfície dos osteoblastos, adjacentes a essa matriz orgânica óssea recentemente
sintetizada. Estas vesículas se desprendem da superfície externa dos osteoblastos,
tornando-se totalmente dissociados destes, e abrigam um conteúdo rico em
glicoproteínas e a superfície externa de sua membrana tem intensa marcação para
fosfatase alcalina. A fosfatase alcalina é uma família de enzimas que hidrolisam sais de
fosfato, fornecendo os íons derivados desta hidrólise para o interior das vesículas.
Paralelamente ocorre um aumento da concentração de íons cálcio no interior dessas
vesículas, provavelmente oriundos da hidrólise de fosfolipídios que também constituem
as membranas dessas vesículas. Com isso, decorre uma supersaturação de fosfato e
cálcio e, consequentemente, a formação e precipitação de sais de fosfato de cálcio no
interior das vesículas, que se tornando repletas desses sais são levadas ao
rompimento, disponibilizando e dispersando assim o seu conteúdo na matriz orgânica
extracelular. Este processo é característico dos locais em que está ocorrendo pela
primeira vez a síntese da matriz extracelular seguida da mineralização do tecido ósseo
(MARKS & POPOFF, 1988; ARANA-CHAVES et al., 1995 e KATCHBURIAN & CERRI,
2002), e repetido ao longo da vida durante a remodelação fisiológica desse tecido.
Os osteoblastos também funcionam como receptores e transmissores de
sinais para remodelação óssea, tais como hormônios da tireóide, da paratireóide
(PTH), estrogênios, glicocorticóides, insulina, Vitamina D (1,25 Dihidroxivitamina D3) e,
adicionalmente, secretam fatores de regulação como Interleucina-6 (IL-6) e fatores de
crescimento como TGF-β, que por sua vez sao agentes locais da proliferacao,
diferenciação e da própria atividade osteoblástica (RAISZ & RODAN, 1998 e TEN
CATE, 2001). Os osteoblastos têm ainda a capacidade de modificar a matriz orgânica
adjacente a eles, degradando ou alterando uma série de componentes extracelulares,
como por exemplo as proteoglicanas ou glicoproteínas dispersas nessa matriz. Desta
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forma, então, inicia-se o processo de mineralização da matriz, por meio da secreção de
vários agentes reguladores como IL-6, TGF-β e Interferon-γ (INF-γ) (SODEK &
MCKEE, 2000). Recentemente, foi demonstrado que os osteoblastos, podem ainda
participar da fagocitose de corpos apoptóticos oriundos de outros osteoblastos e/ou de
células de revestimento ósseo durante o início da formação óssea (CERRI, 2005).
As células de revestimento ósseo representam os osteoblastos que recobrem
as superfícies ósseas quiescentes e, portanto, exibem uma quantidade reduzida de
organelas de síntese e secreção de proteínas. Formam uma camada contínua de
células interconectadas que tem a capacidade de manter a homeostase local,
regulando a concentração plasmática de cálcio por mecanismos parcialmente
independentes daqueles relacionados com o sistema de remodelação óssea (MUNDY,
1991), sendo consideradas como sítio primário de troca de íons entre o sangue e o
osso do adulto. A transição do osteoblasto para células de revestimento ósseo envolve
mudanças morfofuncionais paulatinas que resultam na restrição da secreção de
proteínas. No caminho inverso, estas células que revestem a superfície óssea podem
se diferenciar, sob determinados estímulos, em osteoblastos e consequentemente
produzir matriz óssea (KATCHBURIAN & CERRI, 2002), tendo assim um importante
papel na manutenção/homeostase da matriz óssea, influenciando por exemplo no
metabolismo de cálcio e fosfato e na troca de substâncias. Acredita-se, ainda, que
essas células de revestimento ósseo produzam moléculas que ativam a complexa
cascata molecular que culmina na remodelação óssea (SODEK & MCKEE, 2000 e
MILLER & JEE, 1987).
Osteoclastos são células gigantes e multinucleadas, derivadas de células
osteoprogenitoras hematopoiéticas que se formam pela fusão de células
mononucleares que também dão origem aos monócitos e macrófagos (WELLS et al.,
2012). Caracterizam-se, citoquimicamente, por apresentar fosfatase ácida resistente ao
tartarato, adenosina ácida trisfosfatada vanadato sensitiva, isosima anidrase carbônica
II, entre outras enzimas (KATCHBURIAN & CERRI, 2002 e SODEK & MCKEE, 2000).
Os osteoclastos são responsáveis pela reabsorção óssea, promovendo sulcos na
superfície óssea denominadas lacunas de Howship. Adjacente à superfície óssea, sua
membrana celular exibe numerosas invaginações, formando uma borda em
escova/estriada. Nela há uma região citoplasmática, denominada de zona clara. A zona
clara, região carente de organelas e rica em actina e miosina, está intimamente aderida
19
à superfície óssea. De tal modo, ela parece ser responsável pela adesão do
osteoclasto à superfície óssea, delimitando portanto a borda em escova,
compartimento em que ocorre a desmineralização, bem como a degradação da matriz
do tecido ósseo. Este compartimento gera um microambiente propício a síntese e
atividade das enzimas proteolíticas do osteoclasto, que conjuntamente à liberação de
prótons pela enzima anidrase carbônica, promovem um ambiente ácido que favorece a
desmineralização da matriz. A liberação de prótons é, provavelmente necessária, à
desmineralização do osso, mas sobretudo deve ser essencial para criação de um
ambiente ótimo (ácido) para as enzimas lisossomais exercerem suas atividades
catalíticas (MANOLAGAS, 2000; KATCHBURIAN & CERRI, 2002 e SODEK & MCKEE,
2000), dentre essas destaca-se a ação da cisteíno-proteinase, a Catepsina K. Algumas
metaloproteinases da matriz (MMPs) que podem ser ativadas em ambientes ácidos
também têm sido observadas nas lacunas de reabsorção e poderiam participar das
vias metabólicas de degradação da matriz óssea (MANOLAGAS, 2000 e SODEK &
OVERALL, 1992). A atividade dos osteoclastos e a morfologia da borda da membrana
que fica em contato com o tecido ósseo podem ser modificadas e reguladas por
hormônios, tais como o paratormônio (indiretamente) e a calcitonina, para os quais
existem, inclusive, receptores na membrana dos osteoclastos.
O processo de reabsorção óssea pode ser auto-regulável, em função da
dissolução mineral que precede a degradação da matriz orgânica, o que implicaria no
desenvolvimento de uma matriz porosa adjacente à borda em escova do osteoclasto.
Esta matriz porosa pode provocar a ruptura da adesão do osteoclasto, culminando no
descolamento deste (TEN CATE, 2001). Adicionalmente, após a reabsorção, os
osteoclastos podem migrar para outros sítios em que o tecido ósseo deve ser
reabsorvido, ou simplesmente se deslocarem da superfície óssea e permanecerem
como células inativas. Os osteoclastos inativos continuam sendo células gigantes,
multinucleadas que, porém, não apresentam a borda em escova e zona clara,
estruturas diretamente relacionadas com a atividade reabsortiva dos osteoclastos
(FUKUSHIMA et al., 1991). Assim, o fator de crescimento tumoral (TGF-β) e o
estrógeno parecem promover a apoptose, enquanto o paratormônio (PTH) e a
Interleucina-1 (IL-1) podem agir como supressores da apoptose, prolongando a
atividade osteoclástica (SODEK & MCKEE, 2000).
20
O tecido ósseo, em diversos momentos, precisa modificar sua forma ou
estrutura. Seja para um osso primário tornar-se maduro, ou crescer mantendo sua
forma, ou para de esponjoso tornar-se compacto ou para se adaptar a novas situações
fisiológicas ou patológicas, o osso está em constante remodelação, por meio de
reabsorção e deposição de matriz óssea, que são processos estreitamente acoplados
(ROBBINS & COTRAN, 2005). Portanto, a remodelação óssea fisiológica é um
fenômeno que nos acompanha ao longo da vida, sendo fundamental para renovação
do esqueleto e preservação de sua qualidade.
Na remodelação a reabsorção é seguida da formação óssea em ciclos
constantemente orquestrados pelas células do tecido ósseo. Em situações fisiológicas,
a reabsorção e a formação são fenômenos vinculados e dependentes, onde qualquer
interferência no sistema pode mudar o equilíbrio entre aposição e reabsorção ósseas e
o predomínio de um sobre o outro pode resultar em ganho ou perda de massa óssea
(BUSER, 2010). O desenvolvimento e a homeostase do sistema esquelético está,
portanto, na dependência de uma remodelação óssea equilibrada, isto é, da dinâmica
balanceada entre a atividade dos osteoblastos e osteoclastos, controlada pelo sistema
imune. Se este balanço inclinar-se a favor da atividade osteoclástica, levará a
reabsorções patológicas, como nas periodontites, artrites reumatóides, doenças
osteoporóticas primárias ou secundárias e tumores ósseos (TAKAYANAGI, 2005).
A regulação da remodelação óssea é um processo complexo que envolve
hormônios e fatores locais que controlam, de maneira autócrina, a geração e atividade
de células ósseas diferenciadas. O primeiro evento celular na sequência de
remodelação é a ativação dos osteoclastos. Previamente à reabsorção da matriz
mineralizada liderada pelos osteoclastos, os osteoblastos/células de revestimento
ósseo produzem colagenases e com isso degradam a camada de osteóide, expondo a
matriz mineralizada aos osteoclastos que se tornam ativos em contato direto com a
matriz óssea mineralizada (MARKS & POPOFF, 1988). Outra possibilidade de modular
a formação e atividade osteoclástica seria a partir de sinais gerados no microambiente,
com a liberação de citocinas. As citocinas são moléculas de regulação, solúveis, de
baixo peso molecular, expressas como proteínas de membrana ou secretadas, que se
ligam a receptores específicos, em células alvo. As citocinas têm um papel vital tanto
na regulação do tecido ósseo em condições fisiológicas quanto patológicas
(WERMELIN et al., 2008; KATCHBURIAN & ARANA, 2004 e MACKIE, 2003). Este
21
processo é controlado por uma cascata de eventos combinados a uma programação
genética com a regulação de genes por fatores sistêmicos e locais. A maioria dos
fatores que controla a reabsorção óssea age diretamente nos osteoblastos, tais como
PTH (MUNDY, 1991 e TANI-ISHII et al., 1999), dihidroxivitamina D3, esteróides
sexuais, prostaglandinas (PGs), citocinas (Interleucina-1, Interleucina-6 e Interleucina-
11), TGF-β. Portanto, estes fatores estimulam os osteoblastos a liberarem moléculas
que estimulam a migração e adesão à superfície óssea que deve ser reabsorvida.
Sendo assim, os osteoblastos participam do processo de remodelação óssea, não
somente produzindo matriz óssea, mas também controlando a atividade dos
osteclastos. As citocinas e os fatores de crescimento, especialmente o TGF-β,
liberados da matriz durante sua degradacao, atuam como uma alca de “feed-back” e
desencadeiam a formação e ativação de osteoblastos para sintetizar e depositar uma
quantidade equivalente de osso novo na lacuna de reabsorção (KATCHBURIAN &
CERRI, 2002; BUSER, 2010 e JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
Estudos têm sido realizados com a finalidade de encontrar tratamentos efetivos
para as doenças que promovem a perda óssea, tais como: doença osteoporótica pós-
transplante que acometem pacientes imunossuprimidos, doença periodontal ou
osteopatias metabólicas, como a osteoporose e a osteomalácia, entre outras. A maior
parte dos estudos de biologia molecular relacionados visa esclarecer os diversos
fatores que interferem com a proliferação, migração, diferenciação, atividade e
sobrevivência das células ósseas. No entanto, os estudos revelam que há uma
multiplicidade de fatores e via de regra estes fatores agem de forma coordenada. A
compreensão deste processo, como um todo, pode ser a chave para o
desenvolvimento de um protocolo de tratamento que poderia levar ao equilíbrio dessas
doenças ósseas. Neste sentido, o uso dos fármacos da classe dos bisfosfonatos tem
sido tão explorado em função da sua capacidade de alterar, em parte, a fisiologia da
remodelação óssea. Estes fármacos se tornaram o foco de interesse principal desta
presente proposta de dissertação de mestrado, e uma breve descrição da constituição
e função deles será revisada a seguir.
22
2.2 Bifosfonatos
Os bifosfonatos (BFs) são análogos sintéticos quimicamente estáveis do
pirofosfato inorgânico (PPi), que são compostos naturais do organismo que apresentam
alta afinidade ao cálcio, fazem parte de um grupo de fármacos antirreabsortivos
(GREEN, 2004 e BENFORD et al., 1999), utilizados no tratamento e prevenção de
doenças que apresentam alterações do metabolismo ósseo, como a osteoporose
(ROSSINI et al., 2001 e KISHIMOTO, 2006), doença de Paget (POLYZOS et al., 2012
e KEATING & SCOTT, 2007), mieloma múltiplo (BIANCHI et al., 2014 e ARTUR et al.,
2013), osteopenia (GUTTENBERG, 2008), hiperparatireoidismo (ROSSINI et al., 2001),
osteogênese imperfeita (LINDAHL et al., 2014), artrite reumatoide (LE GOFF &
HEYMANN, 2011 e NAGASHIMA et al., 2005) e tumores que envolvam metástases
ósseas (AZURI & HALABE, 1998 e BARNI et al., 2006).
Os pirofosfatos são instáveis em solução aquosa, possuem hidrólise rápida e
regulam fisiologicamente os processos de mineralização e reabsorção da matriz da
óssea (RUSSELL, 2011 e EDWARDS et al., 2008) ora participando da inibição da
calcificação ectópica; ora, quando clivado pela fosfatase alcalina, disponibilizando
maior quantidade de fosfato ao meio, favorecendo a deposição de cristais de apatita e
reabsorvendo água (GARTNER, 2007). Nos bifosfonatos tem-se a substituição do
átomo central de oxigênio do pirofosfato (P-O-P) por um átomo de carbono (P-C-P)
(Figura 1), o que torna a estrutura da molécula menos susceptível à hidrólise química e
enzimática quando comparado com o composto natural (RODAN & FLEISCH, 1996) .
Estes fármacos foram inicialmente utilizados em aplicações industriais devido
à capacidade de evitarem a precipitação de Carbonato de Cálcio e impedirem a
dissolução do Fosfato de Cálcio, mas apenas nas três últimas décadas ocorreu a
descoberta de seus efeitos biológicos, quando então passaram a ser utilizados no
tratamento de desordens do metabolismo ósseo, pela capacidade de retardar o
processo de reabsorção (FLEISH, 2000).
23
Figura 1. Estrutura química do pirofosfato (A) e dos bifosfonatos (B). Nos bifosfonatos
observamos o Carbono central com dois grupos fosfatos ligados a cada um de seus lados. Esta
estrutura permite uma grande biodisponibilidade dos BFs para a estrutura óssea. O grupo R1
uma cadeia curta, confere propriedades químicas e farmacocinéticas, além de fornecer alta
afinidade à HA, enquanto o grupo R2 uma cadeia longa, determina a potência anti-reabsortiva
e o mecanismo de ação farmacológica (modificado de FERNANDES et al., 2005 e FERREIRA
et al., 2007).
Em função de sua estrutura molecular, os bifosfonatos apresentam diferenças
em afinidade óssea, potência e mecanismo de ação (MEMON et al. 2012), podendo ser
administrados em diferentes doses e vias. Desta forma, classificaremos de acordo com
suas cadeias laterais em 3 gerações:
Quadro 1. Potencial anti-absortivo das diferentes gerações de bisfosfonatos.
Bifosfonato R1 R2 Potência
Clodronato Cl Cl ~ 10x
Etidronato OH CH3 ~ 1x
Pamidronato OH (CH2)2 NH2 ~ 100x
Alendronato OH (CH2)3 NH2 >100 - < 1.000x
Ibandronato OH (CH2)2 N(CH3) (CH2)4 CH3 >1.000 - < 10.000x
Risendronato OH CH2-3- piridina >1.000 - < 10.000x
Ácido zolendrônico OH CH2- imidazol >10.000x
R1 radical de cadeia curta. R2 radical de cadeia longa. Fonte: (Pascaud, 2014)
Os BFs de 1ª geração são denominados não nitrogenados, possuem cadeias laterais
curtas (etidronato/clodronato/medronato) (HARDMAN et al., 2006), ligam-se fracamente
aos cristais de hidroxiapatita e ao serem metabolizados pelos osteoclastos produzem
análogos citotóxicos de ATP, que inibem os processos metabólicos da celular ATP-
dependentes e, portanto, se acumulam no interior da célula, levando, portanto, à morte
A B
24
do osteoclasto (BENFORD et al., 1999 e ROGERS et al., 1999). Apresentam janela
terapêutica estreita e, por isso, devem ser administrados em altas doses para atingirem
o efeito sistêmico desejado (regulação do metabolismo ósseo).
Figura 2. Estrutura química exemplificando os bifosfonatos de 1a geração. A. Clodronato B.
Etidronato.
- Os BFs de 2ª geração são moléculas modificadas pela nitrogenação, recebendo
assim a denominação de aminobifosfonatos (pamidronato/alendronato/ risendronato
/ibandonado). A presença do nitrogênio na cadeia lateral aumenta em cerca de 10 a
100 vezes a potência dos BFs de 1a geração. Atuam interrompendo a via do
mevalonato (BENFORD et al., 1999), responsável por guiar a síntese de colesterol e
lipídeos isoprenóides, requeridos para a prenilação (adição de moléculas hidrófobas –
lipídeos) de várias proteínas (ROGERS et al., 1999) e comprometendo, assim, o
transporte vesicular intracelular; sem o qual os osteoclastos tornam-se incapazes de
formar a borda estriada (HARDMAN et al., 2006) essencial para a reabsorção óssea,
pela liberação de ácidos e hidrolases (ALBERTS, 2010).
Figura 3. Estrutura química exemplificando os bifosfonatos de 2a geração. A. Risendronato B.
Ibandronato C. Alendronato e D. Pamidronato.
A B C D
25
- Finalmente, os BFs de 3ª geração também são nitrogenados (ácido zolendrônico),
contendo o átomo de N dentro de um anel heterocíclico, o que confere uma potência
farmacológica ainda maior que os fármacos da 1a e 2a gerações. Além de
apresentarem um efeito anti-reabsortivo mais potente que os primeiros, podem ser
usados de forma contínua, pois a dose anti-reabsortiva é muito inferior.
Figura 4. Estrutura química exemplificando os bifosfonatos de 3a geração. Ácido Zolendrônico.
A escolha do fármaco é determinada por propósitos definidos assim como a
busca por formulações mais evoluídas, como a 3ª geração visam: aumentar a afinidade
óssea; melhorar o perfil terapêutico (i.e. potência, seletividade, toxicidade; possibilidade
de adquirir nova atividade farmacológica e alterar a biodisponibilidade da molécula)
(MEMON et al. 2012). Os BFs podem ser administrados por via oral ou endovenosa; na
via oral têm biodisponibilidade limitada por sofrerem hidrólise no trato gastrointestinal.
Após absorvidos são rapidamente incorporados ao tecido ósseo, se ligando à
hidroxiapatita. Uma vez depositado no tecido ósseo, se concentram em locais de
remodelação óssea ativa e serão eliminados apenas quando for iniciado o processo de
reabsorção, quando há uma alteração do pH do microambiente, tornando-se ácido, nas
lacunas de reabsorção e ao serem internalizados pelos osteoclastos induzem à
apoptose (RUGGIERO & WOO, 2008). Estas células morrem por fragmentação
estrutural, sem o derramamento enzimático que induza inflamação, resultando na
diminuição da reabsorção óssea, e indiretamente permitindo o aumento da densidade
óssea e a melhora da mineralização (KODAMA et al., 2012 e FRITH et al., 1997). Os
BFs são primariamente excretados pelas vias renais e têm meia vida de meses a anos
após a administração (MISCH, 2009).
26
2.3 Hidroxiapatita
As apatitas são encontradas na natureza, principalmente, como constituintes de
rochas ígneas e metamórficas, especialmente em calcários cristalinos (ELLIOT, 1994)
e em grandes depósitos calcários amorfos dispersos em vários lugares da crosta
terrestre. Estes calcários de baixa cristalinidade (ou amorfos) e composição variável
são denominadas rochas de fosfato ou fosforitos; e compõem uma das maiores fontes
do mundo de fornecimento de fósforo para indústrias químicas e de fertilizantes
(MAVROPOULOS, 1999). O fosfato de cálcio que se encontra em rochas ígneas e
sedimentares é exclusivamente apatítico (POSNER, 1969). Originalmente, todas as
apatitas terrestres estavam presentes em rochas ígneas. Acredita-se que através do
tempo geológico, a extensa e contínua lixiviação dessas rochas primárias pelas águas
se constituiu como fonte para a formação de fosfato de cálcio biológico, na forma de
apatita (MAVROPOULOS, 1999).
Os esqueletos de algumas espécies marinhas também são fontes deste mineral.
Alguns contêm carbonato de cálcio, porém, a maioria contém fosfato de cálcio. Alguns
autores acreditam que depósitos de apatitas podem também ser formados por
precipitação direta da água do mar, e alguns dos depósitos de carbonatos de cálcio são
convertidos em apatita pela reação direta com fosfato dissolvido (MAVROPOULOS,
1999). A precipitação de fosfato de cálcio dos oceanos, mares e lagos produzem
apatitas formadas por cristais de tamanho muito pequeno e com propriedades
dependentes da sua alta superfície de contato por unidade de massa (NEUMAN,
1958).
A forma predominante entre as apatitas é a apatita de cálcio, Ca10(PO4)6X2, onde
X pode, por exemplo, representar o grupo funcional hidroxila (-OH), e neste caso tem-
se a formação da hidroxiapatita (HA) na sua forma estequiométrica (LORENZO, 2000).
Com razão Ca/P igual a 1,67, a HA forma um dos cristais de fosfato de cálcio mais
estáveis e menos solúveis de todos, sobretudo em condições fisiológicas. Porém,
composições relativamente estáveis podem também ser obtidas na razão Ca/P de até
1,5 (FULMER et al., 1992). Embora sua ocorrência seja rara em sistemas não
biológicos, a HA é um constituinte mineral abundantemente encontrado no corpo
humano, representando cerca de 30 a 70% em massa da parte mineral dos ossos e
27
elementos dentais. O osso apresenta cristais de fosfato de cálcio sob a forma de
agulha, de tamanhos nanómetricos de cerca de 5-20nm de largura por 60nm
comprimento, com uma fase de apatita mal cristalizada, não estequiométrica contendo
CO32-, Na+, F- e outros íons em uma matriz de fibras colágenas (FERRAZ M.P, 2004).
Diante da perda de tecido ósseo do complexo maxilomandibular, seja ela
fisiológica ou patológica, e com necessidade de reabilitação oral destes pacientes é
exigido o reparo do defeito, que preferencialmente deve ser preenchido com o osso
autógeno, isto é, proveniente do próprio indivíduo. Entretanto, sua utilização não
elimina a possibilidade de uma infecção além de apresentar problemas de
disponibilidade. Consequentemente, os estudos recentes estão sendo direcionados
para o desenvolvimento de um biomaterial sintético que tenha propriedades biológicas
semelhantes ao tecido ósseo (BEZZI et al, 2003).
O termo biomaterial é definido como um composto de natureza sintética ou
natural, utilizado por um período de tempo para melhorar, aumentar e substituir, parcial
ou inteiramente, tecidos ou órgãos (PARK, 1985). Os biomateriais utilizados como
substitutos do tecido ósseo devem possuir características peculiares, como
biocompatibilidade, biodegradação e osteocondutibilidade, proporcionando a condução
de osteoblastos ou de células precursoras de osteoblastos para o sítio lesado e de
fatores regulatórios que promovam esse recrutamento, assim como o crescimento
celular neste sítio (LIU et al; 2004; CHEN et al., 2009). Dentre os biomateriais
estudados, há grande interesse pelas biocerâmicas devido à sua similaridade química
com diversos componentes inorgânicos natuaris e dentre as cerâmicas com melhor
desempenho, estão os biovidros, a alumina, o beta-fosfato tricálcico (β-TCP) e a
hidroxiapatita (HA). Desta forma o grande interesse pela HA como biomaterial, está
relacionado com o fato desta ser a principal fase mineral encontrada no tecido ósseo e
ter alta biocompatibilidade em relação a este tecido. Classificada como uma
biocerâmica a base de fosfato de cálcio, a hidoxiapatita sintética (HAS) tem merecido
lugar de destaque entre os materiais com aplicação biomédica, em especial para
aplicações em implantes ósseos, sobretudo, em função de sua similaridade química,
biológica e cristalográfica com a fase mineral do osso humano (YANG, 2002;
HWANG,1999; VERCIK;2004). Estas características indicam que, além de
biocompatíveis, os constituintes HAS participariam ativamente do equilíbrio iônico entre
28
o fluido biológico e a cerâmica (KAWACHI et al., 2000), garantindo sua propriedade
bioativa, em particular quanto à habilidade para formar ligação química com os tecidos
duros vizinhos, após a sua colocação em contato com os mesmos (LIU et al., 2002).
Estas propriedades somadas à sua alta capacidade de adsorver e/ou absorver
moléculas fazem da HAS um excelente suporte para ação prolongada de drogas no
tratamento de tumores ósseos, e também eficiente no tratamento de remoção de
metais pesados em águas e solos poluídos (MAVROPOULOS, 1999).
A biocompatibilidade, bioatividade, osteocondutividade, dimensão, tamanho,
morfologia e funcionalização de superfície representam as propriedades físicas e
químicas, que devem ser adaptadas em cristais de HAS para otimizar suas
especificidades e aplicações biomédicas (ROVERI, 2010). A tendência, porém, está
mudando no sentido de melhorar as respostas biológicas da HA a partir da síntese de
nanocristais, já que esses são mais compatíveis em relação aos cristais encontrados
naturalmente no tecido ósseo (ROVERI, 2010). Várias metodologias têm sido
investigadas e desenvolvidas com intuito de sintetizar cristais de HA (KURIAKOSE et
al, 2004). Hidroxiapatita natural pode ser obtida por desproteinização de tecido ósseo
de um doador (PARK, 1984) ou por tratamento hidrotérmico de corais (WHITE &
SHORS, 1986), mas a síntese de HA pode ser obtida por processos como: a
precipitação de fosfato de cálcio em soluções aquosas (OSAKA et al, 1991 & JARCHO
et al., 1976), reações no estado sólido (VIDEAU & DUPUIS, 1991) e reação sol-gel
(HWANG et al., 1999 e 2000). A HAS pode ser amorfa ou policristalina, com vários
graus de cristalinidade de acordo com o seu preparo. Durante a sinterização, a pressão
e/ou a temperatura originam um produto policristalino, que varia em porosidade
(PINCHUK, 2003). Em termos de aplicação prática, micromateriais ou nanos com
morfologias específicas não só precisam ser capazes de serem sintetizados em
grandes quantidades, como também possuírem composição desejada adequada,
tamanho e estrutura reproduzíveis (ZHOU, 2011). Em função da alta complexidade e
diversificação na química dos fosfatos de cálcio, pode-se facilmente modificar as
características do material variando-se o método utilizado na sua preparação. Por isso,
a escolha e o controle da metodologia adotada no preparo do material são
fundamentais para cada aplicação do produto final.
29
Um dos métodos mais utilizados na síntese de HA é a técnica de precipitação,
que envolve reações em solução entre precursores de cálcio e fósforo com controle de
temperatura e pH. O pó precipitado é calcinado entre 400-600°C ou até mesmo a
temperaturas mais elevadas, a fim de obter uma estrutura de apatita estequiométrica. A
precipitação rápida durante a titulação da solução de fosfato em solução de cálcio pode
levar a falta de homogeneidade química no produto final. A titulação lenta e soluções
diluídas devem ser utilizadas para melhorar a homogeneidade química e a
estequiometria da HAS resultante. O controle cuidadoso das condições da solução é
crítico na precipitação via úmida, caso contrário, uma diminuição do pH da solução
abaixo de 9, por exemplo, pode conduzir à formação da estrutura da HAS deficiente em
íons Ca2+ (BEZZI et al., 2003 & LIU et al., 2001).
Recentemente, a utilização do processo sol-gel para a síntese de HA tornou-se
objeto importante de pesquisa. Este processo é um método químico via úmida, o qual
dispensa a utilização de alto vácuo e temperaturas elevadas, sendo considerado um
dos métodos mais flexíveis e promissores para a síntese desses materiais (WANG et
al., 1999 e 2000). É um método eletivo para a preparação de um pó altamente puro
devido à possibilidade de um controle cuidadoso dos parâmetros do processo,
favorecido por uma mistura em nível molecular dos íons cálcio e fósforo que é capaz de
melhorar a homogeneidade química e física, resultando, geralmente, em uma
microestrutura de granulação fina que contém uma mistura de cristais de tamanho que
variam de uma escala micro a nanoscópica, o que resulta em uma melhora da reação
de contato e a estabilidade da interface biomaterial/osso natural (BEZZI et al., 2003). A
escolha dos precursores e solventes comuns para a obtenção do sol deve sempre
seguir a regra de se utilizar reagentes mais reativos, que em geral são os alcóxidos dos
respectivos cátions e ânions que devem compor a fase inorgânica final desejada.
Estes, normalmente, são solúveis em álcoois e sofrem hidrólise e condensação
formando uma solução homogênea, o que não é o caso dos alcóxidos de fósforo e
cálcio. Neste caso, os precursores mais indicados são o ácido fosfórico e o nitrato de
cálcio que são solúveis em alcoóis e água, minimizando os problemas de elevada
volatilidade e baixa reatividade dos precursores quando da utilização do trietil fosfato
(MANSO et al., 2003).
30
O método de síntese adotado para a obtenção de hidroxiapatita ou o seu
tratamento posterior pode levar ao aparecimento de outras fases de compostos de
fosfato de cálcio. Estando presentes, estas fases podem ser detectadas por meio de
difratometria de raios-X. Normalmente estas fases apresentam-se em quantidades
pequenas (ao redor de 5%) em compostos comerciais. Entretanto cuidados devem ser
tomados para controlar a quantidade destes compostos, uma vez que estes possuem
propriedades extremamente diferentes da hidroxiapatita, podendo comprometer a
osteocondução, como no caso do surgimento de pirofosfato de cálcio ou metafosfato
de cálcio, ou ainda comprometer a integridade e eficiência mecânica do material em
função de sua solubilização (SALEH et al., 2004).
2.4 Osteonecrose Associada ao uso de Bifosfonatos (OAB)
Apesar da eficácia clínica dos bisfosfonatos, algumas complicações e efeitos
adversos são associados ao seu uso prolongado, tal como a pretensa ocorrência de
osteonecrose de maxila (GODINHO et al., 2013) e mandíbula (RUGGIERO & WOO,
2008 e EDWARDS et al. J, 2008), fibrilação atrial (SEWERYNEK & STUSS, 2011),
hipocalcemia (KREUTLE et al., 2014), náusea, esofagite, úlcera esofágica
(MACEACHERN et al., 2013), dores de cabeça e constipação intestinal (CHEN et al.,
2013). O conhecimento dos efeitos adversos do medicamento tem fundamental
importância na escolha do fármaco a ser empregado e o manejo do paciente sob a
terapia medicamentosa pode ser dificultado por tais danos.
A complicação severamente importante relacionada à classe odontológica é a
Osteonecrose Associada ao uso dos Bifosfonatos (OAB), descrita como região de osso
necrótico em maxila ou mandíbula, presente por mais de 8 semanas em paciente
usuário corrente ou anterior do fármaco e sem histórico de radioterapias cervicais
(ADVISORY TASK FORCE ON BISPHOSPHONATE-RELATED OSTENONECROSIS
OF THE JAWS, AMERICAN ASSOCIATION OF ORAL AND MAXILLOFACIAL
SURGEONS, 2007). A OAB foi descrita pela primeira vez por Marx em 2003 que
observou osteonecrose em pacientes que receberam terapia com bifosfonato
intravenoso após tratamento dental (MARX, 2003). Embora a maioria dos relatos
31
clínicos que descreve a ocorrência de OAB esteja associada à administração de
bisfosfonato pela via intravenosa, em 2004 foi sugerido por Ruggiero que a
administração oral a longo prazo também poderia contribuir para a ocorrência de OAB
(RUGGIERO et al., 2004).
Pela dificuldade de determinação das causas da OAB, acredita-se que seja
devida a uma etiologia multifatorial, podendo estar associado às ações
antiosteoclásticas e antiangiogênicas (YAMADA et al., 2009 e WALTER et al., 2010),
levando a alteração do metabolismo ósseo pelo fármaco por meio da supressão da
remodelação (WANG et al., 2007; ALLEN & BURR, 2008 e KODAMA et al., 2012),
aumento da necessidade de reparo ósseo (LANDESBERG et al., 2011), infecção
(KOKA et al., 2010), hipovascularização (MARX et al., 2005) e proliferação de células
epiteliais (KOBAYASHI et al., 2010).
A OAB pode surgir, entretanto, “espontaneamente” em indivíduos que nao
façam uso de BFs (VASCONCELOS et al., 2012), após trauma ou após realização de
procedimentos cirúrgicos (MARTIN et al., 2010) como extração dentária, instalação de
implantes e cirurgia periodontal, podendo ser sintomática ou assintomática
(LANDESBERG et al., 2011). Como seu desenvolvimento pode levar a graves
complicações pondo em risco a saúde dos pacientes, é essencial prevenir e minimizar
os riscos do desenvolvimento desta patologia, definindo protocolos de atuações em
pacientes que fazem uso de bifosfonatos (EDWARDS et al. J, 2008).
O risco de OAB para os usuários de bisfosfonatos levou à sugestão de que
qualquer cirurgia eletiva deveria ser evitada (SCULLY et al., 2006). Embora seja
aparentemente prudente, esta ampla proposta não está fundamentada em dados que
demonstrem diretamente que a intervenção cirúrgica seja o agente etiológico primário
para o desenvolvimento da OAB (KOKA et al., 2010), mesmo porque não está
associada predominantemente ao procedimento (LAZAROVICI et al., 2010); portando,
interventos cirúrgicos invasivos, como a realização de exodontias e a colocação de
implantes e enxertos ósseos, não devem ser absolutamente contraindicados
(MATTHEOS et al., 2013 e GÓMEZ-DE DIEGO et al., 2014). Sendo relevante o tempo
de tratamento quando usuário a longo prazo, por isso devem ser acompanhados por
longos períodos (LAZAROVICI et al., 2010) evidenciando riscos para os tratamentos
maiores a 3 anos (MARTIN et al., 2010 e RUGGIERO et al., 2009), que 5 anos
(MADRID & SANZ, 2009) ou até superiores a 10 (LANDESBERG et al., 2011).
32
Quanto à via de administração, a endovenosa era considerada uma
contraindicação absoluta para a realização de procedimentos cirúrgicos
(LANDESBERG et al., 2011), por estarem associadas a maiores relatos sobre a
incidências de OAB, mas a recepção de uma única dose injetável de ácido
zolendrônico não é contra indicação absoluta para procedimentos cirúrgicos (IKEDA &
KOHNO, 2012). Este aumento de incidência, também pode estar associada a outras
condições sistêmicas, pois foi observada nos pacientes em tratamento de câncer,
associada à altas doses endovenosas e à outras terapias hormonais,
imunossupressoras e corticóides (GÓMEZ-DE DIEGO et al., 2014 e RUGGIERO et al.,
2009), sendo menos evidente em pacientes sob tratamento de osteoporose e
osteopenia, não sendo possível definir ainda a dose que provavelmente leve a necrose
(AYAN et al., 2012).
Apesar do baixo risco mesmo quando associado a outros fatores de risco, a
prevenção é o melhor a se fazer. Aconselhamento médico e monitoramento dos
pacientes, com análise mais criteriosa (MARTIN et al., 2010), podem minimizar o risco
de OAB. Não há métodos atualmente eficazes para determinar o risco, mas deve-se
proceder de forma conservadora sob a presença de focos infecciosos e cirurgias
avançadas devendo ser indicadas com cautela. Uma análise preventiva para auxilio na
determinação do plano de tratamento pode incluir avaliação da taxa de rotatividade do
osso que quando em níveis aceitáveis é passível de pausa do medicamento
(GUTTENBERG, 2008). Níveis séricos reduzidos de telopeptídeo C-Terminal (CTX)
podem determinar as taxas de supressão de osteoclastos e auxiliar na determinação
do risco de OAB, para outros pesquisadores o CTX pode não oferecer uma abordagem
útil e confiável para avaliar os riscos do paciente quanto às complicações relacionadas
com o uso do bifosfonato (KEATING & SCOTT, 2007 e ARTUR et al., 2013), o
tratamento do paciente não deve ser alterado pelo uso do fármaco e sim o manejo para
a realização do tratamento proposto, pois o risco é muito baixo perto do beneficio. Os
bifosfonatos são tão importantes para o tratamento destes pacientes que mesmo
havendo o risco, na maioria das vezes, não é recomendado à interrupção.
A OAB é uma complicação importante, mas na maioria das vezes gerenciável
e passível de prevenção, exames odontológicos preventivos frequentes, identificação
de pacientes de risco e higiene oral ideal podem melhorar os resultados e reduzir a
33
incidência. O tratamento geralmente envolve antibioticoterapia, debridamento da ferida,
uso analgésicos para alivio dos sintomas (KODAMA et al., 2012), higiene oral rigorosa
associada ao uso de antissépticos a base de clorexidina (PARK et al., 2013).
Após extensas discussões sobre OAB e da determinação de medidas
terapêuticas e preventivas no envolvimento de práticas invasivas dos BFs, atualmente,
tem entrado em destaque na Odontologia, movidos pela curiosidade e necessidade
permanente de busca por compostos químicos mais complexos, surgem, portanto,
como uma possível alternativa para a redução da perda e aumento da densidade
óssea.
2. 5 - A administração de BFs em benefício do quadro local
2. 5. 1 Administração Sistêmica
Quanto ao uso dos BFs na administração sistêmica é importante ressaltar que
os estudos disponíveis neste tema são de moderada a fraca força de evidência com
preconceitos e limitações; e os resultados devem ser interpretados no contexto. São
necessários estudos com maiores força de evidência (CHADHA et al., 2012) pois, os
posicionamentos sobre o uso ainda continuam muito diversos e controversos.
Já foram demonstradas algumas desvantagens como a presença de lacunas
vazias no tecido ósseo (LAZAROVICI et al., 2010; KIM et al., 2011 e PARK et al.,
2013), osso envelhecido (BRENNAN et al., 2010) ao redor dos implantes, podendo
relacionar ao seu fracasso, porém, sempre associado à períodos longos de
administração sistêmica e em casos isolados sem grandes casuísticas.
Por outro lado, em outros estudos não foi encontrado nenhum caso de OAB
(JEFFCOAT et al., 2007; MADRID & SANZ, 2009 e BRENNAN et al., 2010)
ressaltando não haver nenhuma evidência para apoiar o efeito de bifosfonato por via
oral sobre a taxa de sobrevivência do implante, isto é, com prejuízo a implantação em
função de alteração do metabolismo do tecido ósseo (GRANT et al., 2008).
Há, ainda, estudos indicando possíveis efeitos positivos dos bifosfonatos
sistêmicos orais na integração de implantes e no tratamento periodontal (BHANDARI et
al., 2005; NETO et al., 2009 e TAXEL et al., 2014), por isso a importância de novos
34
dados que emergem de novos casos. Supõe-se que a formação óssea nos pacientes,
que fazem o uso de BFs nessas condições, poderia aumentar pela supressão da
reabsorção, o que seria útil para a cicatrização óssea e para a estabilidade de
implantes (CHACON et al, 2006 e MADRID & SANZ, 2009).
Em estudo sobre a análise de falhas de implantes em pacientes usuários
sistêmicos de bifosfonatos, foram observados mais fracassos tardios do que precoces,
mais predominantemente em mandíbula do que em maxila, ao contrário da maioria dos
estudos de falhas de implantes, geralmente as falhas precoces estão associadas a
infecções pós operatórias, má qualidade e pouca quantidade óssea, ou técnica
incorreta e comum na menopausa, já as tardias podem ser associadas ao uso de BFs,
mas sem avaliar o excesso de cargas oclusais, periimplantites, não podem excluir
fatores específicos e individuais dos pacientes, nem tampouco, descartar que a
pequena quantidade de falha encontrada no estudo pode estar associada à
possibilidade dos BFs melhorarem a cicatrização (MARTIN et al., 2010), pois a taxa de
sobrevivência dos implantes variam de 95 a 100% em usuários de BFs e 96,5 a 99,2%
nos não usuários (KUMAR & HONNE, 2012).
Implantes instalados em mulheres pós menopausa tem o mesmo índice de
sucesso independente do histórico de uso sistêmico de BFs e do tempo de uso.
Mostrando um excelente perfil de sobrevivência e ressaltando que estes usuários
quando se submetem a cirurgia de implante têm baixo risco para OAB e não
necessitam interromper o uso do fármaco. Sendo a implantação um método seguro e
previsível para gerenciar o edentulismo (KOKA et al., 2010).
Dentre as ações do fármaco na administração sistêmica para melhora local
podemos ressaltar a otimização de enxertos ósseos autógenos indicados para reduzir o
volume ósseo perdido após reconstruções, demonstrando maior formação e aceleração
do processo cicatricial em volume ósseo (NETO et al., 2009), a aceleração da
remodelação óssea, mantendo a densidade mineral ao redor de próteses articulares
(BHANDARI et al., 2005) e melhor estabilidade do implante em pacientes com histórico
de exposição aos BFs (BRENNAN et al., 2010).
Há, ainda, relatos de que uma única aplicação do BFs Zolendronato IV durante
o procedimento cirúrgico de pacientes submetidos à terapia de exodontias e implantes
aumentou o conteúdo mineral e o contato osso implante (KIM et al., 2013) em 2 e 4
35
semanas (AYAN et al., 2012) e que o Zolendronato inibiu a proliferação dos fibroblastos
orais e células epiteliais bucais não afetando marcadores angiogênicos da medula
óssea e a cicatrização de feridas na cavidade oral (YAMASHITA et al., 2011).
Para elucidar mais um caso de benefício, há um relato de enxerto de crista
ilíaca com sucesso em paciente com displasia fibrosa poliostotica e fissura lábio-
palatal, que havia recebido terapia intravenosa com BFs. Na displasia temos o tecido
ósseo sendo substituído por tecido fibroso, enfraquecendo-o, e retardando a
cicatrização óssea, em que se observou redução da remodelação e possibilitou ainda,
uma posterior movimentação ortodôntica com resultado satisfatório (KODAMA et al.,
2012). Cabe lembrar que até aquele momento era contra indicado este tipo de
procedimento nestes pacientes.
Incidimos na necessidade de maiores estudos, pois estes dados podem
fortemente alterar decisões de prática clínica (TAXEL et al., 2014). Os grandes
questionamentos sobre o risco de OAB, derivam quando de seu uso sistêmico (ABTAHI
et al., 2013), e não são conclusivas sobre todas as potenciais ações benéficas do
fármaco. A questão que nos colocamos é porque não utilizá-lo localmente para buscar
um efeito benéfico?
2. 5. 2 Administração local
Em função dos relatos sobre possíveis limitações associadas ao uso sistêmico
dos BFs e na busca de seus benefícios para a Odontologia, caminha-se para a
avaliação de seu uso local. A motivação para a esta utilização é que quando induzimos
a supressão da ação osteoclástica, a atividade osteoblástica seja mantida,
proporcionando equilíbrio positivo e ganho na qualidade óssea. Acreditava-se,
anteriormente, que a remodelação óssea era realizada pela combinação da atividade
de osteoclastos e osteoblastos, e que a supressão da reabsorção poderia reduzir
igualmente a formação, induzindo a ideia de que o uso de BFs retardaria a cicatrização.
No entanto, foi descrito atualmente que os osteoblastos podem trabalhar de forma
independente, ou seja, formação e reabsorção podem estar vinculados no processo de
remodelação fisiológica, mas não necessariamente em resposta ao trauma
(ASPENBERG, 2009), reforçando a teoria que o uso de BFs locais em procedimentos
36
cirúrgicos geradores de estímulos traumáticos poderiam inibir seletivamente os
osteoclastos, sem prejudicar a ação osteoblástica e a formação óssea (KIM et al.,
2011).
Estes agentes terapêuticos capazes de inibir reabsorção e estimular formação
óssea, podem ter sua eficácia aumentada por meio da liberação seletiva para os ossos.
Ressaltando seus benefícios na necessidade de aumento de tecido mineralizado
devido ao desequilíbrio metabólico sistêmico e úteis em condições degenerativas
locais, que necessitem de estímulo para regeneração óssea, incluindo a integração dos
implantes. Há também relatos de utilização de BFs como transportadores osteotrópicos
no planejamento de fármacos dirigidos (CASTRO et al., 2004), devido à sua alta
afinidade óssea.
Apontamos, portanto, duas principais razões para utilizar o fármaco
localmente: primeiramente por conseguir concentrações inicialmente superiores, pois
as concentrações elevadas diretamente para as superfícies ósseas tendem a preservar
o osso e melhorar a fixação (HILDING & ASPENBERG, 2007) e segundo sem as
complicações onde um tratamento sistêmico levaria ao risco de OAB e fraturas atípicas
(ABTAHI et al., 2013).
Na Implantodontia e Ortopedia estudos buscam incessantemente materiais para
abreviar o tempo de cicatrização e melhorar a qualidade da integração de implantes e
parafusos de fixação com uso do PRP, BMP, fator de crescimento Melatonina com
fibroblastos e também BFs. Nas utilizações de BFs como revestimento as mensurações
do nível ósseo marginal e estabilidade de implantes e parafusos, seja logo após o ato
cirúrgico ou em 6 meses, mostram a formação de maior quantidade de osso
periimplantar (KNOCH et al., 2006) e tecido ósseo neoformado (KAJIWARA et al.,
2005 e BOBYN et al., 2014). Outros relatos indicam ainda que o uso de BFs local
poderia: 1) reduzir o tempo de osseointegração (ASPENBERG, 2009) e inibir a
reabsorção ao redor dos implantes (ABTAHI et al., 2012); 2) proporcionar uma
formação óssea que proporcionam maior torque de remoção (ASPENBERG, 2009 e
LEE et al., 2011); 3) maior quantidade de deposição de Ca e P sobre o implante
(MOON et al., 2012); 4) maior área de contato osso/implante (YOSHINARI et al., 2002;
MOON et al., 2012 e ALGHAMDI et al., 2014) e 5) nenhuma complicação adversa
(CHACON et al, 2006).
37
A eluição lenta e pouco concentrada de BFs sobre um revestimento de
fibrinogênio colocado na superfície dos implantes que sofreram alterações de superfície
parece ter melhorado a fixação dos mesmos. Especulou-se, inclusive, que a utilização
local da droga poderia ser mais promissora do que modificações físicas na superfície
do implante, pois a fixação depende da qualidade óssea neorformada. Assim quando
esses fármacos são lançados localmente a partir da superfície do implante, eles se
aderem à superfície óssea adjacente se mantendo por longo período, levando a um
efeito concentrado no local desejado, sendo mais fácil de controlar a ação (ABTAHI et
al., 2012).
Outro estudo demonstra a possibilidade de carregamento rápido de BFs pelo
método de imersão direta de implantes e também por co-precipitação por pulverização
catódica. Na imersão em Fluido Corporal Simulado (SBF), os BFs foram precipitados
simultaneamente à hidroxiapatita (HA) e não apenas adsorvidos em sua superfície. A
inclusão de BFs poderia permitir uma contínua administração do fármaco até o
crescimento ósseo completo. É preferível que a inclusão de BFs seja feita no momento
de formação da camada de HA, antes que a mesma seja depositada sobre o implante.
Porém, neste caso não existe a possibilidade de escolha de não administrar a droga.
Por esta razão, defende-se em alguns casos a proposição do carregamento imediato,
ou seja, a embebição do implante revestido com HA em uma solução de BFs, o que
garantiria ao cirurgião-dentista a possibilidade de decidir pela necessidade da droga
por indicação do caso (KATCHBURIAN & ARANA, 2004).
Na Periodontia os géis de BFs (ex. alendronato) foram aplicados diretamente
nas bolsas periodontais de pacientes diabéticos, resultando em diminuição da
profundidade de sondagem, ganho no nível de inserção óssea e melhor preenchimento
ósseo (ABERG et al., 2009 e PRADEEP et al., 2012).
38
2.5.3 - Associação de BFs com biomateriais
Revisamos, ainda, estudos sobre a aplicação de BFs associadamente a alguns
biomateriais, com propósito de aumentar do compósito associado. Dentre os estudos
realizados, identificamos um relato de revestimento de parafusos ortopédicos para
melhora de afrouxamentos em osso esponjoso, em que foi realizado o revestimento
com HA e com HA associada a um BF. Este relato fundamenta o uso de BF justificando
que quando um parafuso de HA torna-se integrado à camada de tecido ósseo recém-
formado na superfície, ele irá transmitir forças ao osso circundante de maneira mais
eficiente, o que pode, em seguida, levaria à melhor resistência óssea por adaptação.
Assim, o BF liberado a partir da superfície influenciaria o osso circundante diretamente,
alterando o equilíbrio entre formação e reabsorção. Assim, os autores discutem porque
provavelmente parafusos revestidos com HA dopada com BF apresentaram os
melhores resultados em termos de fixação em osso cortical e esponjoso (TOKSVIG-
LARSEN & ASPENBERG, 2013).
O desempenho de diferentes BFs foram observados em alguns poucos estudos.
Uma outra associação descrita foi de uma superfície com associação de heparina e
alendronato, que imobilizado sobre a superficie do Titânio (Ti) tornou um implante
bioativo, melhorando a diferenciação de osteoblastos e inibindo a diferenciação de
osteoclastos simultaneamente, melhorando a adesão do implante no hospedeiro. O
PCR mostrou expressões de osteocalcina, colágeno tipo I (LEE et al., 2011) e
osteopontina, marcadores da osteogênese (MOON et al., 2011).
Associações de BFs com compostos de fosfato de cálcio têm sido estudados
para o desenvolvimento de novas estratégias para a administração local de BPs, por
exemplo, dentro de sítios osteoporóticos (COLEMAN, 2008). Uma associação
extremamente promissora resulta, portanto, da interação de BPs com as apatitas,
sobretudo a hidroxiapatita. No entanto, alguns poucos estudos foram realizados ate o
momento com o intuito de associar e caracterizar os BFs da 3ª geração, como o Ácido
Zolendrônico, a micro e nanoscritsais de hidroxiapatita. Considerando a escassez de
estudos neste âmbito, o presente trabalho visou caracterizar a associação do Ácido
39
Zolendrônico, o único BFs de 3a geração registrado no Brasil, a cristais de
hidroxiapatita sintética.
40
3. PROPOSIÇÃO
Objetivos Gerais
Realizar a síntese e a caracterização físico-química e morfológica da interação
de nanoscristais de hidroxiapatita (HA) com um bisfosfonato de 3a geração, o ácido
zolendrônico (zolendronato).
Objetivos específicos
Testar a hipótese de que as propriedades físico-química e morfológicas da HA
sintética são diferentes daquelas da HA sintética dopada com ácido zolendrônico.
41
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
Os instrumentos e reagentes utilizados para a realização do presente estudo
encontram-se listados nos quadros 2, 3 e 4:
Quadro 2. Equipamentos utilizados para a realização do estudo.
Equipamento Modelo Fabricante Procedência
Agitador Q 261-22 QUIMIS Brasil
Balança/HAS AW220 SHIMADZU Brasil
Difratômetro de Raio X Ultima+ Rigaku DMAX EUA
Espectofotômetro 800 XI FEMTO Brasil
Estufa (370C) 502 –C FANEM Brasil
Estufa (1200C) G4023D GEHAKA Brasil
Forno Mufla FL 1300 INTI Brasil
Freezer 902 Thermo Fisher
Scientific EUA
Espectrômetro
Infravermelho Nexus 670 Thermo-Nicolet EUA
Liofilizador L101 LIOTOP Brasil
Microscópio eletrônico de
varredura EVO LS15 Zeiss Alemanha
Centrífuga Excelsa 205 Fanem Brasil
Ultrassom Jet Sonic Total Gnatus Brasil
Quadro 3. Reagentes utilizados para a preparação das soluções precursoras da síntese de hidroxiapatita.
42
Reagentes pureza ( % ) Fornecedor Fórmula
Nitrato de cálcio 99,0 – 103,0% Dinâmica, Brasil Ca(NO3)2.4H2O
Ácido Fosfórico 85% Dinâmica, Brasil H3PO4
Metanol 99,8% Dinâmica, Brasil CH3OH
Quadro 4. Reagentes utilizados para os ensaios de adsorção do ácido zolendrônico à
hidroxiapatita.
Reagentes pureza ( % ) Fornecedor, País Fórmula
Cloreto de Potássio 99,5 Merck, EUA KCL
Ácido Zolendrônico
mono-hidratado ≥ 98,0 Sigma-Aldrich, EUA C5H10N2O7P2˚H2O
4.2 Métodos
4.2.1 - Síntese de hidroxiapatita (HAS) via sol-gel
Foram utilizados como agentes precursores de Cálcio e Fósforo
respectivamente, nitrato de cálcio e ácido fosfórico (SANTOS et al., 2005 e COSTA,
2009), estabelecendo a relação estequiométrica Ca:P = 1,67 para a síntese final de 5 g
de HAS. O álcool metílico (metanol) foi utilizado para facilitar a solubilização dos
precursores em água destilada.
Após a mistura dos reagentes, o sol obtido foi mantido sob agitação vigorosa por
30 minutos, de modo a se obter uma solução transparente que, em seguida, foi deixada
em repouso à temperatura ambiente por 24 horas. A solução obtida foi então mantida
sob agitação e aquecimento a 80°C para volatilização parcial dos solventes. Após esta
etapa, obteve-se um líquido viscoso que finalmente foi levado à estufa e seco a 100°C
por 12 horas. O gel resultante obtido foi desaglomerado em um almofariz com auxílio
de um pistilo até a obtenção de um pó fino que foi submetido a aquecimento em forno
mufla a 700°C por 3 horas a fim de promover a cristalização da hidroxiapatita.
43
O fluxograma abaixo sumariza as etapas recém descritas de síntese da
hidroxiapatita (HAS) pela via sol-gel.
Figura 5. Fluxograma representativo da Síntese de HAS pelo método sol-gel.
4.2.2 Adsorção de ácido zolendrônico à Hidroxiapatita sintética
A adsorção do zolendronato foi efetuada por dispersão de 50 mg do pó de HAS
em 5 mL de meio de adsorção, que consistiu de uma solução aquosa de zolendronato
a uma concentração de 0,2342 g/L diluída em uma solução de KCl 1mM. O pH do meio
foi verificado com papel indicador e confirmou-se o pH fisiológico. As suspensões foram
sonificadas durante 3 minutos e incubadas durante 2 h à temperatura fisiológica (37oC),
sem agitação. Em seguida, realizou-se a centrifugação a 5000 rpm durante 20 minutos.
Os sobrenadantes obtidos foram filtrados em membranas Millipore (dimensão de poro
de 0,22 µm) antes da análise química. Os pós de HAS foram mantidos em freezer -
44
80oC por 72 horas, liofilizados e armazenados em ambiente livre de umidade para
posterior caracterização (PASCAUD et al., 2013 e PASCAUD et al., 2014) .
Figura 6. Fluxograma representativo do método de adsorção do zolendronato.
4.3 - Caracterização das amostras
As amostras de HAS dopadas com zolendronato foram caracterizadas por
físico-quimicamente por difração de Raio-X (DRX) e espectroscopia vibracional em
infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e morfologicamente por microscopia
eletrônica de varredura (MEV). Como controle, foram empregadas amostras de HAS
sem tratamento com zolendronato.
45
4.3.1 - Difratometria de raios X (DRX)
O principio deste método analítico se baseia no fato de que os raios X são
radiações eletromagnéticas que possuem elevadas energias e curtos comprimentos de
onda, e que uma vez que incidem sobre um material sólido, uma fração do feixe se
dispersa, ou se espalha, em todas as direções pelos elétrons associados a cada átomo
ou íon que se encontra na trajetória do feixe (CALLISTER, 1994).
Considerando dois planos paralelos de átomos os quais possuem os mesmos
índices de Miller h, k, e l e que estão separados por um espaçamento interplanar dhkl.
Assumindo que um feixe de raios X paralelo, monocromático e coerente (em fase), com
comprimento de onda esteja incidindo sobre esses dois planos, de acordo com um
ângulo , a condição para difração é:
n = dhkl sen + dhkl sen = 2 dhkl sen (1)
A Equação 1 é conhecida como lei de Bragg, n representa a ordem da reflexão,
que pode ser qualquer número inteiro (1, 2, 3,...) que seja consistente com o fato de
que sen não pode exceder a unidade. Dessa forma, temos uma expressão simples
que relaciona o comprimento de raios X e espaçamento interatômico ao ângulo do feixe
difratado. A magnitude da distância entre dois planos adjacentes e paralelos de átomos
é uma função dos índices de Miller (h, k, e l), bem como dos parâmetros de rede.
Um dos principais usos da difratometria de raios X está na determinação da
estrutura cristalina. O tamanho e geometria da célula unitária podem ser resolvidos a
partir das posições angulares dos picos de difração, enquanto o arranjo dos átomos
dentro da célula unitária está associado com as intensidades relativas desses picos.
Uma pequena alíquota de HAS ou HAS+ZA (1 mg/cada) foi colocada dentro do
porta-amostras (dispositivo específico do equipamento utilizado – vide Quadro 1),
separadamente, e levada ao difratometro de raio X e a análise das amostras foi feita
diretamente, sem qualquer preparo adicional das mesmas.
46
4.3.2 - Espectroscopia Vibracional no Infravermelho por transformada de Fourier
A espectroscopia vibracional no infravermelho é uma técnica utilizada para a análise e
caracterização das unidades estruturais dos compostos, e se baseia nas frequências
vibracionais de cada grupo presente no composto (NAKAMOTO, 1986). Para obter o espectro
de infravermelhos de uma amostra, faz-se passar através da amostra um feixe de luz
infravermelha, e mede-se a quantidade de energia absorvida pela amostra a cada comprimento
de onda.
As bandas formadas no espectro ocorrem devido à absorção da radiação
infravermelha, sendo que cada grupo absorve uma freqüência selecionada desta
radiação. A radiação absorvida corresponde às frequências vibracionais abrangidas
pelo estiramento e deformação do ângulo de ligação pela maioria dos íons
poliatômicos.
No processo de absorção, estas frequências de radiação infravermelha, que
combinam com a frequência vibracional natural do grupo em questão, são absorvidas,
e esta energia serve para aumentar a amplitude do movimento vibracional da ligação
na molécula.
Uma pequena alíquota de HAS ou HAS+ZA (0.3 mg/cada) foi colocada
diretamente sobre o cristal de ATR (técnica de reflectância total atenuada - um cristal
com um índice de refracao muito elevado e superior ao da amostra e baixa absorcao
na regiao do infra-vermelho) e levada à análise sem qualquer preparo adicional da
amostra.
4.3.3 - Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
A investigação microscópica é uma ferramenta extremamente útil no estudo e
caracterização de materiais, e permite correlacionar a microestrutura com diversas
características e propriedades (CALLISTER, 1994).
Na microscopia eletrônica de varredura a superfície de uma amostra a ser
examinada é rastreada com um feixe colimado de elétrons. O feixe de elétrons refletido
(ou retroespalhado) é coletado e, então, exibido à mesma taxa de varredura sobre um
47
tubo de raios catódicos (semelhante à tela de uma TV). A imagem que aparece na tela,
que pode ser fotografada, representa as características morfológicas da superfície da
amostra. A superfície pode ou não estar polida, porém deve, necessariamente, ser
condutora de eletricidade; um revestimento metálico extremamente fino deve ser
aplicado sobre a superfície de materiais não condutores. Os equipamentos possibilitam
ampliações que variam entre 10 e mais de 50.000 vezes.
Assim, foram montadas em bases metálicas (stubs) pequenas alíquotas de HAS
ou HAS+ZA (0,5 mg/cada) previamente desidratas e recobertas com ouro para análise
em MEV. Buscou-se sobretudo identificar o tamanho e formato dos cristais formados.
48
5. RESULTADOS
5.1 Caracterização da cristalinidade o pó de HAS e HAS + ZA por DRX
A caracterização por DRX possibilitou acompanhar a evolução e identificação
das fases formadas . A Figura 7 ilustra o padrão de difração de raios X do pó de HA
sintetizado pelo método sol-gel. O difratograma do pó de HA calcinado a 700°C por 3 h
indica que o pó cerâmico sintetizado apresenta alta cristalinidade. Além disso, o
tratamento térmico realizado favoreceu apenas a cristalização da fase referente à HA,
portanto nenhuma outra fase secundária foi identificada no difratograma.
20 30 40 50 60 70 80
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
(10
4)
(25
2)
(144)
(21
5)
(24
3)(5
20
)(43
1)
(51
2)
(14
3)
(51
1)
(304
)(5
02
)(2
41
)
(24
0)
(501
)(3
13
)(3
22
)(004
)(3
03
)(1
40
)(3
21
)(2
13
)(1
32
)(2
22
)(2
03
)
(11
3)
(13
1)
(13
0)
(21
2)
(30
1)
(20
2)
(30
0)
(11
2)
(21
1)
(21
0)
(10
2)
(00
2)
(11
1)
(20
0)
Inte
nsid
ad
e (
cts
)
2°
(hkl) HAS
Figura 7
- Difratograma de raios X do pó de Hidroxiapatita sintetizado pelo método sol-gel e tratado
termicamente a 700°C por 3h.
Todos os picos observados e planos (hkl) associados estão de acordo com a ficha
cristalográfica 74-0565 da hidroxiapatita com estequiometria Ca10(PO4)6(OH)2, obtida a partir da
base de dados PCPDFWIN do International Centre for Diffraction Data (ICDD), Figura 8. De
acordo com a base de dados, o padrão apresenta uma célula hexagonal com os seguintes
parâmetros de rede: a = 9,424 Å e c = 6,879 Å.
49
Figura 8 - Ficha cristalográfica 74-0565 da hidroxiapatita com estequiometria Ca10(PO4)6(OH)2,
obtida a partir da base de dados PCPDFWIN.
A Figura 9 ilustra os difratogramas de raios X dos pós de hidroxiapatita sintetizada
(HAS) e hidroxiapatita após adsorção de zolendronato (HAS+ZA). Da análise do
difratograma da amostra de HAS+ZA pode-se observar que não houve a formação de
novas fases cristalinas uma vez que todos os picos observados e planos (hkl)
associados estão de acordo com a ficha cristalográfica 74-0565 da hidroxiapatita.
Na Figura 9 ambos difratogramas estão apresentados na mesma escala de
intensidade. Assim, após a adsorção de zolendronato verificou-se a diminuição da
intensidade relativa de todos os picos de difração da hidroxiapatita.
50
20 30 40 50 60 70 80
Inte
nsid
ad
e r
ela
tiva (
u.a
.)
2°
HAS
HAS + ZA
Figura 9- Difratogramas de raios X dos pós de HAS e HAS após a adsorção de zolendronato.
representa os planos cristalinos associados à HAS.
A fim de ilustrar mais claramente a diminuição da intensidade dos picos de
difração após a adsorção do zolendronato, dois intervalos distintos em 2 foram
escolhidos para a análise.
A Figura 10 ilustra os difratogramas de raios X dos pós de HAS e HAS+ZA no
intervalo de 2 entre 22,5° e 35°, enquanto a Figura 5 ilustra estes mesmos
difratogramas no intervalo de 45° e 55°.
51
24 26 28 30 32 34
(202)
(300)
(112)
(211)
(210)
(102)
(111)
(002)
Inte
nsid
ad
e r
ela
tiva (
u.a
.)
2°
HAS
HAS + ZA
Figura 10- Difratogramas de raios X dos pós de Hidroxiapatita e Hidroxiapatita após a
adsorção de zolendronato, no intervalo de 2 entre 22,5° e 35°.
46 48 50 52 54
(004)
(303)
(140)
(321)(2
13)
(132)(2
22)
(203)
Inte
nsid
ad
e r
ela
tiva (
u.a
.)
2°
HAS
HAS + ZA
Figura 11- Difratogramas de raios X dos pós de Hidroxiapatita e Hidroxiapatita após a
adsorção de zolendronato, no intervalo de 2 entre 45° e 55°.
A partir da nova análise dos difratogramas confirmou-se a diminuição da
intensidade dos picos de difração.
52
5.1.1 Efeito da adsorção de zolendronato na evolução do tamanho de cristalito da fase
cristalina de HA
A partir dos difratogramas dos pós de HAS e HA+ZA foi possível quantificar o
tamanho dos cristalitos aplicando a Equação de Scherrer, descrita pela Equação 1, e
que considera as medidas da largura média dos picos de difração:
θβ
λ
cos
kd (1)
Na equação acima d é o diâmetro médio do cristalito, k é a constante de
proporcionalidade que depende da forma das partículas, assumida como sendo
esférica (0,9), é o comprimento de onda da radiação do Cobre (1,5406 Å), é a
largura à meia altura do pico de difração (rad) e o ângulo em graus correspondente
ao mesmo pico utilizado para . O pico em 2 = 31,7° que corresponde ao plano (211)
da fase hexagonal de HA foi usado para os cálculos, por ser o pico de maior
intensidade.
A Tabela 1 apresenta os valores de e , bem como os valores de diâmetro
médio do cristalito, d, calculados a partir da Equação de Scherrer para os sistemas
estudados.
Tabela 1- Tamanho de cristalito para os pós de HAS e HAS + ZA.
Amostra HAS HAS + ZA
(rad) 0,004886922 0,005235987
(°) 15,87 15,86
d (nm) 29,49 27,52
∆d (%) - -6,68
Da análise dos dados da Tabela 1 pode-se verificar que ambos os sistemas
estudados apresentam tamanhos de cristalito da ordem de nanômetros. Além disso, a
adsorção de zolendronato pela hidroxiapatita favoreceu a redução do tamanho de
cristalito em 6,68%.
Este efeito pode estar relacionado à interação menos eficiente entre os cristalitos
de HA à medida que o zolendronato foi adsorvido. Estes resultados são corroborados
pelos já apresentados da análise dos padrões de difração de raios X (Figuras 9 a 11).
53
5.2 Caracterização das ligações químicas nos pós de HAS e HAS + ZA por FTIR
O pó de HAS sintetizado pelo método sol-gel e tratado termicamente a 700°C por
3h foi caracterizado também por espectroscopia vibracional na região de 400-4000 cm-1
do Infravermelho com transformada de Fourier. Esta análise também foi realizada para
a amostra de HAS + ZA. Os resultados obtidos das análises de FTIR, ilustrados nas
Figuras 12 e 13 respectivamente, permitiram a identificação das ligações químicas nas
duas amostras. Na Figura 14 os espectros estão apresentados na mesma escala de
intensidade.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Ab
so
rbân
cia
(u
.a.)
Número de onda (cm-1)
HAS
Figura
12- Espectro vibracional no infravermelho para o pó de Hidroxiapatita sintetizado pelo método
sol-gel e tratado termicamente a 700°C por 3h.
54
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Ab
so
rbân
cia
(u
.a.)
Número de onda (cm-1)
HAS + ZA
Figura 13 Espectro vibracional no infravermelho para o pó de Hidroxiapatita após a adsorção
de zolendronato.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Ab
so
rbân
cia
rela
tiva (
u.a
.)
Número de onda (cm-1)
HAS
HAS + ZA
Figura 14- Espectros vibracionais no infravermelho para os pós de Hidroxiapatita e
Hidroxiapatita após a adsorção de zolendronato.
A fim de atribuir com maior rigor as ligações químicas presentes nas amostras,
três intervalos distintos do espectro eletromagnético foram escolhidos para a análise.
55
A Figura 15 ilustra os espectros vibracionais dos pós HAS e HAS + ZA entre 3700
e 3400 cm-1. Neste intervalo foram observadas bandas de pequena intensidade em 3642
cm-1 e 3572 cm-1 para a amostra HAS e uma única banda em 3572 cm-1 para a amostra
HAS + ZA. Estas duas bandas estão relacionadas à presença de ligações O-H e que
podem ser atribuídas à adsorção de umidade superficial pelas amostras durante a
realização das análises.
3700 3600 3500 3400
Ab
so
rbân
cia
rela
tiva (
u.a
.)
Número de onda (cm-1)
HAS
3572
3572
3642
HAS + ZA
Figura 15- Espectros vibracionais entre 3700-3400 cm-1 para os pós de Hidroxiapatita e
Hidroxiapatita após a adsorção de zolendronato.
A Figura 16 ilustra os espectros vibracionais dos pós HAS e HAS + ZA entre 2500
e 2250 cm-1. Independente da amostra, neste intervalo foi observada uma única banda
de pequena intensidade em 2359 cm-1 para a amostra HAS e 2358 cm-1 para HAS + ZA,
atribuída à presença de CO2. Da mesma forma que no caso anterior, a presença de gás
carbônico nos espectros é devida provavelmente à adsorção do gás durante a realização
das medidas.
56
2500 2450 2400 2350 2300 2250
Ab
so
rbân
cia
rela
tiva (
u.a
.)
Número de onda (cm-1)
HAS
2358
2359
HAS + ZA
Figura 16- Espectros vibracionais entre 2500-2250 cm-1 para os pós de Hidroxiapatita e
Hidroxiapatita após a adsorção de zolendronato.
A Figura 17 ilustra os espectros vibracionais dos pós HAS e HAS + ZA entre 1700
e 400 cm-1. Neste intervalo do espectro eletromagnético é evidente a redução da
intensidade de todas as bandas vibracionais uma vez que houve a adsorção do
zolendronato. Em ambos os espectros foi identificada uma banda pouco intensa em
aproximadamente 1460 cm-1 a qual está relacionada à presença de ligações C-H. Estas
ligações são provavelmente devidas aos resíduos de metanol usado na etapa de
síntese da HAS. Além destas, o pó de HAS apresenta outras bandas características
das bandas vibracionais dos íons PO43-. Em 1088 e 1023 cm-1 verificam-se duas
bandas, de média e alta intensidade respectivamente, associadas ao estiramento
assimétrico (ass) dos íons PO43-. Em 960 cm-1 verifica-se a banda referente ao
estiramento simétrico (sim) destes íons. Em 876 cm-1 observa-se uma banda pouco
intensa relativa ao estiramento da ligação P-OH. Já em 628 cm-1 foi identificada a
banda associada à vibração dos íons OH-. Por fim, em 599, 559 e 473 cm-1 foram
identificadas três bandas atribuídas à deformação angular () dos íons PO43-.
Todas estas ligações atribuídas ao espectro vibracional da HAS foram também
identificadas para a amostra HAS + ZA, porém como mencionado anteriormente, com
intensidade reduzida de todas as bandas para o último caso.
57
1500 1000 500
474
473
559
599
628
876
960
1022
1023
1087
1088
1458
1456
Ab
so
rbân
cia
rela
tiva (
u.a
.)
Número de onda (cm-1)
HAS
HAS + ZA
Figura 17- Espectros vibracionais entre 1700-400 cm-1 para os pós de Hidroxiapatita e
Hidroxiapatita após a adsorção de zolendronato.
Quadro 5- Dados obtidos por FTIR para os pós de HAS e HAS + ZA. Abreviações: ,
estiramento da ligação, ass, estiramento assimétrico da ligação, sim, estiramento
simétrico da ligação, e , deformação angular.
Número de onda (cm-1) Atribuição (79)
HAS HAS + Zol
3642 e 3572 3572 O-H
2359 2358 C=O
1456 1458 C-H
1088 1087 ass PO4
1023 1022 ass PO4
960 960 sim PO4
876 876 P-OH
628 628 O-H
599 599 PO4
559 559 PO4
473 474 PO4
58
5.3 Caracterização da morfologia dos pós de HAS e HAS + ZA por MEV
A Figura 18 ilustra as caracterizações morfológicas por MEV, em diferentes
aumentos, para o pó de HAS tratado termicamente a 700°C por 3h.
Figura 18- Caracterizações morfológicas por MEV em diferentes aumentos para o pó de HAS: (a) 5000x; (b) 10000x; (c) 15000x; (d) 20000x e (e) 30000x.
Na imagem com 5000x de aumento, Figura 18a, observa-se que o tratamento
térmico a 700°C por 3 h conduziu a cristalização do pó de HAS com uma morfologia de
(a) (b)
(c) (d)
(e)
59
partículas nanométricas. Por outro lado, as Figuras 18c-e mostram que estas partículas
se reúnem formando aglomerados com tamanhos na escala micrométrica. Também é
possível observar pela imagem com 30000x de aumento, Figura 18e, que algumas das
partículas nanométricas apresentam forma esférica.
A Figura 19 ilustra as imagens obtidas por MEV para a amostra HAS + ZA. A
análise das imagens indica que a adsorção de zolendronato parece não ter influenciado
o tamanho e forma das partículas nanométricas. Da mesma forma que o apresentado
pela amostra HAS, as partículas de HAS + ZA também formam aglomerados
micrométricos. Porém, parte destas partículas parece estar menos aglomerada que no
primeiro caso. Por outro lado, é possível observar também a aglomeração das
partículas em diferentes formatos e dimensões. Para ambas as amostras, a
cristalização de nanopartículas está em concordância com o que foi apontado
anteriormente a partir da determinação dos tamanhos de cristalitos pela equação de
Scherrer.
(a) (b)
(c) (d)
60
Figura 19- Caracterizações morfológicas por MEV em diferentes aumentos para o pó de HAS + ZA: (a) 5000x; (b) 10000x; (c) 15000x; (d) 20000x e (e) 30000x.
(e)
61
6. DISCUSSÃO
O presente trabalho ilustra algumas das propriedades físico-químicas e
morfológicas de cristais de hidroxiapatita (HAS) dopados com um bisfosfonato de 3a
geração, o ácido zolendrônico (ZA). Como se antecipava, a interação do ZA com HAS
reduziu a intensidade relativa de todos os picos de difração da HAS e alterou os
padrões vibracionais de sua estrutura cristalina. Por outro lado, embora a HAS dopada
com ZA tenha se apresentado como aglomerados de nanocristais aparentemente
menores (cerca de 6,68% menores – Tabela 1) do que aqueles de HAS sem ZA, não
se observaram diferenças morfológicas notáveis entre esses nanocristais. Combinados
esses achados, nos cabe aceitar apenas parcialmente a hipótese inicial de que as
propriedades físico-química e morfológicas da HA sintética são diferentes daquelas da
HA sintética dopada com ácido ZA.
Sendo uma molécula orgânica e amorfa, o zolendronato não exibe atributos para
difratar raios X e uma vez, verdadeiramente, adsorvido a uma estrutura cristalina
organizada como a da HAS, deveria reduzir a intensidade dos picos de difração e o
tamanho dos cristalitos dessa estrutura (MILIAN et al., 2012), o que de fato se confirma
com os resultados do presente estudo.
Quando se expõe um sólido finamente dividido a uma pressão moderada de um
gás, geralmente a pressão do gás decresce, indicando que parte das moléculas do gás
foram adsorvidas na superfície do sólido. Pelo mesmo motivo, observa-se que expondo
uma solução de um corante a um sólido, a intensidade da coloração da solução
decresce acentuadamente. Estas observações explicitam a reação empírica de
adsorção de gases e líquidos a estruturas sólidas, que é diretamente dependente da
temperatura, da natureza das substâncias presentes no meio, da pressão do gás ou da
concentração do corante, e das características de superfície do sólido (RUTHVEN,
1984; OUIZAT et al., 1999; BENAZIZ L et al., 2001; GÓMEZ-MORALES et al., 2013 e
PASCAUD ET AL., 2014). Quanto mais finamente fragmentado estiver este sólido,
maior será sua superfície de contanto, e portanto maior será a sua eficiência em
adsorver as moléculas (gases ou líquidos) presentes no meio. Salienta-se que o grau e
distribuição de porosidades presentes no sólido podem também influenciar os
62
fenômenos de adsorção (COULSON & RICHARDSON, 1982). O fenômeno de
adsorção é classificado em dois tipos: adsorção química (ou quimissorção) e adsorção
física (ou fisiossorção). A adsorção química inclui interações entre as partículas do
adsorbato (gás ou líquido) e a superfície do adsorvente bastante fortes, com energias
de ligação muito próximas às energias características de ligações efetivamente
químicas. São específicas e de forma geral alteram as características iniciais do
adsorvente (sólido) e do adsorbato (FOGLER, 1999 e SCHEER, 2002). Já a adsorção
física envolve interações fracas entre o adsorvente e o adsorbato, do tipo forças de Van
der Waals (RUTHVEN, 1984) que apresentam baixos valores de energia de ligação, e
não são específicas. Os modelos que evocam em termos equacionais os mecanismos
de adsorção de gases e líquidos a sólidos são descritos, preponderantemente, pelos
isotermas de Langmuir e Freundlich (SPOSITO, 1989). Experimentalmente, as medidas
nestes sistemas são feitas em termos de quantidade de substância adsorvida por
grama do sólido, com a finalidade de se obter as chamadas isotermas de adsorção.
Essas isotermas são gráficos onde estão representados o número de moles de
substância adsorvida por grama de sólido (N), versus a concentração de soluto em
equilíbrio (C), ou a pressão do gás sobre o sólido (P). A equação de Langmuir tornou-
se muito atrativa, pois, fornece parâmetros simplificados que permitem estimar a
capacidade máxima de retenção e suas energias associadas. Em geral, se aplica à
descrição de adsorção considerando que o processo só finaliza quando todos os sítios
(“poros”) da superfície do sólido forem preenchidos, formando uma monocamada
(quimissorção) (RUTHVEN, 1984). Já a isoterma de Freundlich, mesmo sem uma base
teórica é um modelo empírico que descreve resultados experimentais em que a
adsorção somente depende da concentração e de uma constante, que pode
representar uma isoterma linear. As derivações dos parâmetros de Freundlich se
aplicam melhor aos fenômenos de adsorção que ocorrem com formação de
multicamadas (fisiossorção) (STACHIW, 2006).
Embora o presente estudo não tivesse como foco analisar o padrão e a cinética
de adsorção do ZA à HAS, supõe-se, baseando-se em outros estudos, que esses
parâmetros pudessem ter seguido aqueles de uma isoterma de Langmuir (OUIZAT et
al., 1999; BENAZIZ L et al., 2001 e GÓMEZ-MORALES et al., 2013), em que se
aceitam os seguintes pressupostos: i) as superfícies do adsorvente (sólido – no
63
presente caso a HAS) são homogêneas, todos os sítios ativos têm igual afinidade pelo
soluto (no presente caso o ácido zolendrônico) e não ocorrem interações entre as
moléculas adsorvidas; ii) forma-se uma monocamada de moléculas do soluto e a
adsorção é um fenômeno reversível. De acordo com esses estudos prévios (OUIZAT et
al., 1999; BENAZIZ L et al., 2001 e GÓMEZ-MORALES et al., 2013), a adsorção de
moléculas BFs em apatitas sintéticas é bem descrito por uma curva isotérmica de
Langmuir, como previamente observado para as moléculas bioativas, tais como
fármacos e proteínas, interagindo fortemente com a superfície da apatita. Porém, um
aspecto que cabe relembrar sobre a adsorção de BFs em apatitas sintéticas ou
naturais é que os parâmetros de adsorção podem variar dependendo das condições
físico-químicas da reação de adsorção, o que em parte explicaria situações em que o
princípio da reversibilidade da reação de adsorção não pode ser verificado (PASCAUD
et al., 2014). Pascaud et al. (2014) mostram, por exemplo, que uma redução do pH, um
aumento da temperatura ou um decréscimo na concentração fosfato na solução
induzem o acréscimo na quantidade máxima de BF absorvido. A influência da
temperatura em pH neutro (7,4) indica, por exemplo, maior limite de adsorção em
temperaturas fisiológicas se comparada aquela obtida em temperatura ambiente. De
qualquer forma, uma confirmação sobre o tipo e padrão de adsorção de ZA à HAS do
presente estudo deverá ser evidenciada em estudos futuros em que será avaliada a
cinética de dessorção do ZA em condições mimeticamente fisiológicas.
Estudos de modelagem matemática mais recentes (RUSSELL et al., 2007 e
RUSSELL et al., 2008) tendem a confirmar os achados empíricos de Mukherjee et al.
(2008), dando conta de que a adsorção dos BFs às diferentes apatitas deve ocorrer
primordialmente por quimissorção envolvendo basicamente um dos dois processos de
troca de íons: i) remoção de um íon fosfato da superfície da apatita ou ii) remoção de
dois íons fosfatos da superfície da apatita. De acordo com estes autores, o processo de
adsorção depende claramente do tipo de BPs em questão (parecendo ser maior para
os BFs nitrogenados com N em cadeia heterocíclica) (LAWSON et al., 2010) e,
especificamente, da energia livre para adsorção (RUSSELL et al., 2007; MUKHERJEE
et al., 2008 e RUSSELL et al., 2008). Adicionalmente, foi demonstrado, por exemplo,
que a liberação de um fosfato da hidroxiapatita (para troca com um fosfato do BFs)
pode variar também em função do tipo e tamanho dos cristalitos, sendo potencialmente
64
maior em cristais de dimensões nanométricas (GÓMEZ-MORALES et al., 2013 e
PASCAUD et al., 2013). Pascaud et al., (2003), consideram ainda que a substituição de
dois fosfatos parece não realística, em função dos átomos de fósforo (P) da molécula
de alguns BFs distarem, um relação ao outro, em apenas 3,3 Å, enquanto que em
apatitas naturais os grupos fosfatos estão distantes pelo menos a 4,1 Å. Outro
mecanismo proposto para adsorção de BF em apatitas, considera não uma substituição
de fosfatos, e sim uma interação com grupos cálcio da superfície (BOANINI et al., 2007
e CUKROWSKI et al., 2007). Neste caso, a distância atômica é mais coerente e este
tipo de interação comportaria o envolvimento de dois íons de cálcio na superfície da
apatita. Finalmente, Pascaud et al., (2013) propõem que considerando o variável
número de íons fosfatos liberado por molécula de BF adsorvida, e a improvável
possibilidade de substituição de 2 grupos fosfatos, pode-se sugerir que a adsorção
ocorreria em dois passos: i) interação do BF com íons cálcio da superfície levando a
parcial ou total desprotonação de grupos fosfatos; ii) liberação de prótons que
interagem com grupos de fosfato de hidrogênio da superfície, gerando íons H2PO4–,
que então seriam liberados; hipóteses que precisam, porém, ser ainda investigadas.
Quimicamente, os BFs de interesse biomédico/farmacológico são todos
caracterizados por dois grupos fosfonato que compartilham um átomo de carbono
comum (P–C–P). Esta espinha dorsal –O–P–C–P–O– é responsável pela forte
afinidade à estrutura mineral dos ossos, facilitando assim os seus efeitos inibitórios
sobre o metabolismo ósseo, in vitro e in vivo. Ambos os grupos fosfonato são
necessários para esta ligação e modificações em um ou em ambos reduz/potencializa
a afinidade do BF com a fase mineral óssea. Tem sido bem estabelecido que BFs que
contenham substituintes R1 (Quadro I) com uma capacidade adicional para coordenar-
se ao cálcio, tais como o grupo funcional hidroxila (OH), podem exibir reforçada
quimissorção à estrutura mineral (RUSSELL et al., 1970 e RUSSELL et al., 2008).
Alterando os substituintes R2 dos BFs pode resultar em diferentes potências
antirreabsortivas que variam em grande escala de magnitude. BFs com uma cadeia
lateral R2 contendo um átomo único de nitrogênio (N) em disposição linear (alendronato
e pamidronato) são mais potentes do que o clodronato ou etidronato (que não
apresentam N em sua estrutura), enquanto compostos que apresentam mais de um
átomo de N na cadeia lateral R2 (ibandronato) podem ter potências antirreabsortivas
65
ainda maiores. Os BFs que apresentam a maior potência antirreabsortiva apresentam
R2 nos quais o(s) átomo(s) de N está (estão) dentro de um anel heterocíclico
(risedronato e zoledronato).
Os primeiros estudos que investigaram os efeitos de BFs sobre o metabolismo
ósseo especulavam que, por sua afinidade com a hidroxiapatita, os BFs teriam a
capacidade de inibir o crescimento de cristais e retardar sua dissolução, de um modo
semelhante ao que faria o seu análogo natural, o pirofosfato (FLEISCH et al., 1969 e
RUSSELL et al., 1970). Assim, a capacidade dos BFs para inibir a reabsorção óssea foi
por muito tempo atribuída simplesmente a estes efeitos inibitórios diretos sobre a
dissolução mineral. Contudo, com estudos mais recentes e o desenvolvimento de BFs
cada vez mais potentes, tornou-se claro que esses efeitos físico-químicos sobre o
mineral ósseo seriam provavelmente insuficientes para explicar completamente a
inibição da reabsorção óssea frente ao uso desses fármacos, e que efeitos sobre o
metabolismo celular deveriam também estar envolvidos (RUSSELL et al., 2007 e
RUSSELL et al., 2008). Sabe-se agora que os BFs podem atuar diretamente sobre os
osteoclastos e interferir em processos bioquímicos intracelulares específicos, tais como
a biossíntese de isoprenóides e subsequente prenilação de proteínas que inibem a
atividade celular (RUSSELL et al., 2007; RUSSELL et al., 2008 e RUSSELL, 2011). É
provável que os BFs sejam internalizados seletivamente pelos osteoclastos, ao invés
vez de por outros tipos celulares, devido a sua facilidade de se acumular no osso (por
interação com a hidroxiapatita) e ao fato da atividade de osteoclastos ser
proeminentemente endocítica. Assim, durante o processo de reabsorção óssea, o
espaço sub-celular abaixo dos osteoclastos é acidificada por ação das bombas do tipo
vacuolar que liberam protons na porcao “escovada” da membrana dos osteoclastos. O
pH ácido deste microambiente provoca a dissolução do mineral de hidroxiapatita,
enquanto que a quebra da matriz extracelular óssea é provocada pela ação de enzimas
proteolíticas. A dissolução do mineral por ação dos ácidos, favoreceria a liberação
também de BFs que estejam adsorvidos ao mineral do tecido especialmente em locais
de maior reabsorção do tecido (AZUMA et al., 1995 e MASARACHIA et al., 1996).
Assim, os osteoclastos seriam o tipo celular mais susceptível ao efeito da alta
concentração de BFs livre (não ligado ao mineral) (RUSSELL, 2011).
66
Além de efeitos sobre os osteoclastos, BFs também podem ter ações em
osteócitos. Os primeiros trabalhos nesta área, iniciados por Teresita Bellido e Lilian
Plotkin, atestam que, em contraste com os potenciais efeitos pró-apoptóticos em
osteoclastos, os BFs seriam capazes de prevenir a apoptose de osteoblastos e
osteócitos induzida por administração de glucocorticóides, em condições tanto in vitro
quanto in vivo (PLOTKIN et al., 1999). Este efeito pró-sobrevivência celular é,
aparentemente, independente das junções comunicantes entre estas células e resulta,
sobretudo, da abertura de hemicanais de conexina Cx43. Esta abertura de hemicanais
conduz à ativação de quinases reguladas por sinais extracelulares, seguida da
fosforilação do alvo citoplasmático ERK, p90RSK quinase e os seus substratos BAD e
C/EBP, resultando assim na inibição da apoptose (PLOTKIN et al., 2005). O efeito anti-
apoptótico de BFs parece ser independente do efeito dos BFs sobre osteoclastos, uma
vez que se verificou que análogos de BF que não possuem atividade anti-absorvente, e
portanto não afetam o metabolismo de osteoclastos, são capazes de inibir a apoptose
in vitro de osteoblastos e osteócito (PLOTKIN et al., 2011). A extensão em que esses
efeitos em osteócitos podem contribuir para os efeitos terapêuticos dos BFs em
humanos ainda carece de investigação mais profunda.
Curiosamente, o emprego de BFs mostrou também ser efetivo na indução de
apoptose de células de mieloma humano (SHIPMAN et al., 1997) e na inibição da
síntese de metaloproteinases da matriz por células humanas PC3 ML de carcinoma de
próstata (STEARNS & WANG, 1996 e STEARNS & WANG, 1998), indicando assim um
potencial efeito dessa classe de fármacos no controle da invasão celular em casos de
metástase. Devido essa atividade inibitória sobre as metaloproteinases da matriz,
MMP-2, MMP-9 e MMP-12 (BOISSIER et al., 2000), a ação do ácido zolendrônico
também foi avaliada quanto a sua capacidade de inibir a atividade de proteases do
complexo dentina-polpa com vistas a controlar, indiretamente, a progressão de lesões
de cárie estimulada (SULKALA et al., 2001). Cabe lembrar aqui que durante a
progressão das lesões de cárie, entende-se que a destruição da matriz orgânica dos
tecidos dentários, sobretudo da dentina, seja primordialmente governada pela atividade
de proteases do hospedeiro (TJÄDERHANE et al., 1998), nas quais se incluem pelo
menos duas famílias: as metaloproteinases da matriz e as cisteíno-catepsinas
(TJÄDERHANE et al., 2015). Essas proteases seriam, obviamente, secretadas por
67
odontoblastos (PALOSAARI et al., 2003 e TERSARIOL et al., 2010) e/ou outras células
do tecido pulpar diante de um estimulo fisiopatológico. Em um modelo in vivo de
indução de cárie que durou 21 dias, ratos fêmeas da linhagem Wistar foram
submetidos a uma dieta rica em sacarose, semanalmente inoculados por via oral com
uma suspensão fresca de Streptococcus sobrinus e, 5 vezes por semana, receberam
uma dose intra-oral (20 mg/Kg) de ácido zolendronico dissolvido em um veículo
contendo 1% de carbometil celulose. Ratos do grupo controle, receberam o mesmo
tratamento com exceção de que a dose intra-oral não continha ácido zolendronico, mas
somente o veículo de 1% de carbometil celulose. Os resultados indicaram que a
destruição da matriz orgânica da dentina na lesões de cárie induzidas foi
significativamente menor para os ratos que foram tratados com ácido zolendronico. Os
autores especularam que a ação terapêutica do ácido zolendronico seria devida sua
ação sobre as metaloproteinases da matriz, que uma vez parcialmente inibidas não
teriam condições de efetuar a livre digestão do colágeno da dentina, refletindo assim na
redução da taxa de destruição desse tecido (SULKALA et al., 2001).
No Brasil, os BFs aprovados para uso pela ANVISA (Agência Nacional de
Vigilância Sanitária) incluem o de 1a geração: ácido clodronico; os de 2a geração:
alendronato, ibandronato, risedronato, pamidronato e o de 3a geração: ácido
zolendronico. Dentre eles, o alendronato, risedronato e pamidronato foram
incorporados pelo Sistema Unico de Saude (SUS) (MINISTERIO DA SAUDE, 2012). O
pamidronato e o zolendronato, em apresentacao injetável, sao indicados para tumores
osseos e doenca de Paget. O zolendronato, ibandronato, alendronato e risedronato sao
indicados para o tratamento da osteoporose pos-menopausa em mulheres, sendo
apenas o alendronato e risendronato indicados para a osteoporose em homens
(BULARIO ANVISA. Disponível em: < www.anvisa.gov.br/fila_bula/>. Acesso em: 07
ago 2015).
Sendo da última geração de BFs, o ácido zolendrônico tem demonstrado ser o
mais potente dessa classe de fármacos, podendo ter efetividade 10.000 vezes maior
que etidronato e 100 vezes maior que o pamidronato (FLEISCH et al., 2000). Em
contraste com os demais BFs à base de nitrogênio, o ácido zolendrônico possui 2
átomos de nitrogênio em um anel imidazol heterocíclico. Em culturas de osteoclastos
humanos e de coelhos, o ácido zolendrônico (100 nM) induziu à apoptose daquelas
68
células (COXON et al., 2000). Atualmente, há forte evidência de que os BFs à base de
nitrogênio exercem seus efeitos celulares por meio da inibição específica de uma
enzima na via do mevalonato, a farnesil difosfato sintase (DUNFORD et al., 2001). A
inibição da via do mevalonato em osteoclastos intactos tratados com ácido
zolendrônico também foi demonstrada e, em culturas de osteoclastos maduros de
coelhos in vitro, inibiu a prenilação das proteínas de modo dependente da
concentração, com inibição acentuada já aparente na concentração de 10 nM. Em
relação aos efeitos adversos, o risco de hipofosfatemia, hipocalemia e hipocalcemia
semelhante aos outros BFs é baixo, como também febre, calafrios, mialgia e artralgia.
Em relação à osteonecrose de mandíbula, que vem sendo especulativamente
associada ao uso de BFs, não existe referência na literatura de que esta complicação
ocorra com o ácido zolendrônico na dose usada no tratamento, por exemplo, da
doença de Paget (GRIZ et al., 2006).
A associação de ácido zolendrônico à hidroxiapatita, objeto desse estudo,
mostrou-se viável, pelo menos sob o ponto de vista da síntese. Ao acesso que
pudemos ter às bases de dados, detectamos não haver até o momento relato sobre a
associação HAS+ZA, o que imbui originalidade ao presente trabalho. Vislumbramos
que este novo material possa ser bioativo e se aplique a uma série de situações
clínicas que visam interferir no metabolismo de células como osteoclastos (RUSSELL
et al., 2007; RUSSELL et al., 2008 e RUSSELL, 2011), osteoblastos (PLOTKIN et al.,
2005 e PLOTIKIN et al., 2011) ou odontoblastos (SULKALA et al., 2001), seja para
controlar os níveis de remodelação óssea ou para acelerar a formação do osso,
permitindo, por exemplo, maior velocidade de ósseo-integração de implantes dentários;
como também para controlar a síntese e/ou atividade de proteases, por exemplo, de
origem odontoblástica. Para tanto são requeridos, igualmente, uma série de estudos
nos quais pretendemos, inicialmente, avaliar a cinética de liberação dos BFs da HAS; a
farmacodinâmica do BFs após liberação da HAS em células do tecido ósseo e do
complexo dentina-polpa e o efeito das concentrações de BFs liberadas da HAS na
atividade de proteases da dentina. Objetivamos com isso conhecer o potencial
biológico e as possíveis aplicações desse novo material.
69
7. CONCLUSÃO
Tendo em vista as limitações do presente estudo, conclui-se que: os métodos
empregados permitiram a síntese de nanocristais de hidroxiapatita com a subsequente
adsorção de ácido zolendrônico e que a caracterização físico-química e morfológica
desse novo material sintetizado indica que o processo de adsorção química foi efetivo.
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