silagem de grão de milho triturado e reidratado contendo ... · avaliou-se o efeito de inoculante...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP
INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
Silagem de grão de milho triturado e reidratado contendo
glicerina bruta e inoculante microbiano
Mircéia Angele Mombach
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação
em Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso,
Campus Universitário de Sinop, como parte das exigências
para a obtenção do título de Mestre em Zootecnia.
Área de concentração: Zootecnia.
Sinop, Mato Grosso
Março de 2014
ii
MIRCÉIA ANGELE MOMBACH
Silagem de grão de milho triturado e reidratado contendo
glicerina bruta e inoculante microbiano
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação
em Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso,
Campus Universitário de Sinop, como parte das exigências
para a obtenção do título de Mestre em Zootecnia.
Área de concentração: Zootecnia.
Orientador: Prof. Dr. Dalton Henrique Pereira
Sinop, Mato Grosso
Março de 2014
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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
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v
Aos meus pais, Adair e Lucinde, por me darem todo a apoio e auxílio para enfrentar
mais este desafio.
Ao meu irmão, Luis, que se espelha em mim como exemplo de profissional que ele
deseja ser.
Ao meu esposo, Marcelo, por toda compreensão, apoio e paciência.
DEDICO.
vi
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus, ser de superioridade incontestável, que permitiu que
concluísse mais um objetivo em minha vida.
Aos meus pais, Adair e Lucinde, e ao meu irmão Luis, por todo carinho,
encorajamento, apoio e auxilio para que eu realizasse mais esse sonho.
Ao meu esposo, Marcelo, companheiro fiel e meu maior incentivador. Você merece
muitos agradecimentos. É o amigo mais verdadeiro e meu grande amor.
À Universidade Federal de Mato Grosso/Campus Sinop, pela oportunidade de
realização do curso de mestrado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo
financiamento deste trabalho e pela concessão da bolsa de estudos.
Ao professor D.Sc. Dalton Henrique Pereira por me orientar durante todos esses anos,
pela confiança em mim depositada e pelos ensinamentos transmitidos que foram fundamentais
para meu crescimento pessoal e profissional.
Ao professor D.Sc. Douglas do Santos Pina, pela co-orientação e principalmente pela
ajuda incondicional ao longo de todo o mestrado. Serei eternamente grata por toda a
colaboração. Muito Obrigada!
Ao professor D.Sc. Odilon Gomes Pereira pela disposição de me receber em Viçosa-
MG, pela colaboração e gentileza.
Ao professor D.Sc. Bruno Carneiro e Pedreira, pelo exemplo de profissional e pelas
valiosas sugestões.
Ao professor D.Sc. André Soares de Oliveira, pela boa vontade e pelos
esclarecimentos prestados.
A empresa Kera Nutrição Animal pelo fornecimento do inoculante microbiano.
vii
A Cooperativa de Biocombustível – COOPERBIO pelo fornecimento da glicerina
bruta.
As minhas amigas Dheyme e Patrícia pelo auxílio, amizade e principalmente por toda
força que me deram.
Aos estagiários Heloísa, Hozane, Isadora, Raul, Rafael e Taise, pela ajuda na
condução do experimento e das análises laboratoriais. Muito Obrigada!
Agradeço em especial a estagiária Denise por toda ajuda e auxílio nas análises
laboratoriais, mas principalmente por sua disposição nos momentos mais difíceis. Sem a sua
ajuda seria impossível à apresentação deste trabalho em tempo hábil. Serei eternamente grata.
A todos os colegas de mestrado que compartilharam de seu tempo e convivência ao
longo destes dois anos.
Ao funcionário do Laboratório de Nutrição e Animal e Forragicultura, Célio, pela
ajuda e pelos momentos de descontração vividos.
A funcionária do Laboratório de Tecnologia de Alimentos, Franciele, pela
disponibilidade nos momentos de necessidade.
Aos demais funcionários que colaboraram para as análises laboratoriais.
Enfim, a todos que em algum momento e de alguma forma contribuíram para a
realização de mais este trabalho.
viii
BIOGRAFIA
MIRCÉIA ANGELE MOMBACH, filha de Adair Jorge Mombach e Lucinde
Bernardete Mombach, nasceu em Iturama, Minas Gerais, em 07 de Julho de 1989.
Em Fevereiro de 2012, conclui o Curso de Bacharel em Zootecnia pela Universidade
Federal de Mato Grosso/Campus Sinop. Iniciou em março de 2012, o Curso de mestrado em
Zootecnia, pela mesma instituição, na área de Produção Animal, submetendo-se à defesa de
dissertação em 10 de Março de 2014.
ix
RESUMO
MOMBACH, Mircéia Angele. Dissertação de Mestrado (Zootecnia), Universidade Federal de
Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop, Março de 2014, 78f. Silagem de grão de
milho triturado e reidratado contendo glicerina bruta e inoculante microbiano.
Orientador: Prof. D.Sc. Dalton Henrique Pereira. Coorientador: Prof. D.Sc. Douglas do
Santos Pina.
Avaliou-se o efeito de inoculante microbiano e de diferentes níveis de glicerina bruta sobre a
composição química, perfil fermentativo e população microbiana de silagens de grão de milho
triturado e reidratado. O grão seco de milho foi moído a 5 mm e, reidratado com água e
glicerina bruta em diferentes níveis para manter o teor de umidade em 32,5%, conferindo a
adição de 0; 7,5; 15,0 e 22,5% de glicerina bruta (na matéria natural). O material foi ensilado
em silos experimentais de PVC (0,1 m de diâmetro e 0,35 m de comprimento), providos de
válvulas do tipo “Bunsen”. Os períodos de fermentação foram: 4, 8, 16, 32 e 64 dias. O
experimento foi conduzido em esquema fatorial (2x4x5) segundo o delineamento inteiramente
casualizado com três repetições por tratamento. A inclusão de glicerina bruta na silagem de
grão de milho seco reidratado promoveu reduções lineares nos teores de PB, EE e CS (g/kg
MS). Contudo, aumentaram as perdas por efluente e matéria seca total (g/kg MS) e reduziram
as perdas por gás (g/kg MS). Os valores de pH aumentaram linearmente com a inclusão de
glicerina bruta, mas não influenciaram os teores de N-NH3 (% NT). As populações
microbianas reduziram com o incremento nos níveis de glicerina bruta. Independente do uso
do inoculante microbiano, o aumento no nível de inclusão de glicerina bruta nas silagens de
milho grão seco reidratado aumentam as perdas e o pH no processo de ensilagem, reduz a
população de bactérias ácido lático e promove poucas alterações sobre a composição química
da mesma.
Palavras-chave: aditivo, água, concentrado, conservação, ensilagem
x
ABSTRACT
MOMBACH, Mircéia Angele. Dissertação de Mestrado (Zootecnia), Universidade Federal de
Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop, Março de 2014, 78p. Grinded and
rehydrated corn grain silage containing crude glycerin and microbial inoculate. Adviser:
Prof. Dr. Dalton Henrique Pereira. Co-adiviser: Prof. Dr. Douglas do Santos Pina.
The objective was to evaluate the effect of the use microbial inoculation and different
inclusion levels of water and crude glycerin on the chemical composition, dynamics and
microbial fermentation of grinded and rehydrated corn grain silage. After disintegration in
mill with sieves of 5 mm, the dry corn grain was rehydrated with water and crude glycerin
different levels to keep the moisture content of 32.5%, giving the addition of 0, 7.5, 15.0 and
22.5% crude glycerin (natural matter). The material was ensiled into PVC silos (0.1 m
diameter and 0.35 of length), containing "Bunsen" valves. The opening times were: 4, 8, 16,
32, 64 days. The experiment was conducted factorial (2x4x5) in a completely randomized
design with three replicates for each treatment, totaling 120 experimental silos. The inclusion
of crude glycerin of on reconstituted dry corn grain silage, with and without inoculant
promoted linear increments in of CP, EE and SC content (g/kg DM). However, increased the
effluent losses and total dry matter losses (g/kg DM) and decreased gas losses (g/kg DM). The
pH values linearly increased with the inclusion of crude glycerin, but did not influence the
levels of NH3-N (% TN). Microbial populations decreased with the increase in levels of crude
glycerin. Regardless of the use of microbial inoculant, the increase in the inclusion of crude
glycerin grinded and rehydrated dry corn grain silage increases losses and pH in the ensiling
process, reduces the population of lactic acid bacteria and promotes few changes on the
chemical composition of this.
Keywords: additive, concentrated, conservation, ensilage, water
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Capacidade estática de armazenamento de produção de grãos do Brasil.............05
FIGURA 2. Fluxograma do processo de obtenção do Biodiesel.............................................07
FIGURA 3. (a) Reação global e (b) Reações consecutivas de transesterificação de
triglicerídeos..............................................................................................................................08
FIGURA 4. Superfície de resposta para efeito de perda de efluente da silagem de grão de
milho reidratado com inoculante com diferentes níveis de glicerina bruta e períodos de
fermentação...............................................................................................................................53
FIGURA 5. Superfície de resposta para efeito de perda de matéria seca da silagem de grão de
milho reidratado com inoculante com diferentes níveis de glicerina bruta e períodos de
fermentação...............................................................................................................................55
xii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Área, produção e produtividade do milho no mundo dos últimos cinco
anos...........................................................................................................................................03
TABELA 2. Matérias-primas utilizadas na produção de biodiesel no Brasil nos últimos cinco
anos......................................................................................................................... ..................09
TABELA 3. Perdas de energia no processo de ensilagem e fatores causativos.......................16
TABELA 4. Perdas calculadas de energia e matéria seca (MS) no processo de
fermentação..................................................................................................................... ..........17
TABELA 5. Concentrações típicas de produtos finais da fermentação em várias
silagens......................................................................................................................................20
TABELA 6. Populações epifíticas (UFC/g forragem) de grupos de bactérias e fungos em
plantas antes da ensilagem........................................................................................................26
TABELA 7. Composição química da glicerina bruta..............................................................44
TABELA 8. Teores médios de matéria seca (MS), matéria mineral (MM), proteína bruta
(PB), extrato etéreo (EE), carboidrato total (CHOT), carboidrato não fibroso (CNF),
carboidrato solúvel (CS) e nutrientes digestíveis totais (NDT) do grão de milho reidratado
com diferentes níveis de inclusão de glicerina bruta (GB), antes da ensilagem.......................49
TABELA 9. Populações médias bactérias ácido lático (BAL), enterobactérias (ENT), fungos
e leveduras (MOFO), poder tampão (PT) e coeficiente de fermentação (CF) do grão de milho
triturado e reidratado com diferentes níveis de inclusão de glicerina bruta (GB), antes da
ensilagem..................................................................................................................................49
TABELA 10. Estimativa dos parâmetros dos modelos de superfície de resposta em função da
glicerina bruta (GB - % MN) e períodos de fermentação (PF - Dias) para matéria seca (MS),
matéria mineral (MM), proteína bruta (PB), extrato etéreo (EE), carboidrato total (CHOT),
carboidrato não fibroso (CNF) e carboidrato solúvel (CS) da silagem de grão de milho
reidratado..................................................................................................................................50
TABELA 11. Estimativa dos parâmetros dos modelos de superfície de resposta em função da
glicerina bruta (GB - % MN) e períodos de fermentação (PF - Dias) para perda de efluente
(PEFLT), perda por gás (PGAS) e perda de matéria seca total (PMST) da silagem de grão de
milho reidratado........................................................................................................................52
TABELA 12. Estimativa dos parâmetros dos modelos de superfície de resposta em função da
glicerina bruta (GB - % MN) e períodos de fermentação (PF - Dias) para pH, acidez titulável
xiii
(AT), poder tampão (PT) e nitrogênio amoniacal (N-NH3) da silagem de grão de milho
reidratado..................................................................................................................................56
TABELA 13. Estimativa dos parâmetros dos modelos de superfície de resposta em função da
glicerina bruta (GB - % MN) e períodos de fermentação (PF - Dias) para bactérias ácido lático
(BAL), enterobactérias (ENT) e fungos e leveduras (MOFO) na silagem de grão de milho
reidratado..................................................................................................................................58
xiv
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL................................................................................................................... 1
REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................................... 3
1. MILHO - IMPORTÂNCIA ECONÔMICA .................................................................................... 3
2. GLICERINA BRUTA ............................................................................................................... 5
3. SILAGEM ............................................................................................................................. 12
3.1 Processo de ensilagem .................................................................................................... 12
3.2 Perdas durante a ensilagem ........................................................................................... 15
3.3 Critérios para a avaliação da qualidade da silagem ........................................................ 19
3.3.1 Ácidos Orgânicos ................................................................................................................... 19
3.3.2 Potencial Hidrogeniônico e Acidez Titulável .......................................................................... 21
3.3.3 Poder Tampão ....................................................................................................................... 23
3.3.4 Nitrogênio amoniacal ............................................................................................................ 24
4. MICROBIOTA DA SILAGEM .................................................................................................. 25
4.1 Bactérias Ácido Lático ................................................................................................... 26
4.2 Enterobactérias .............................................................................................................. 27
4.3 Clostrídios ...................................................................................................................... 28
4.4 Bacilos ........................................................................................................................... 29
4.5 Leveduras ....................................................................................................................... 29
4.6 Fungos ........................................................................................................................... 30
4.7 Bactérias Ácido Acético .................................................................................................. 31
5. USO DE INOCULANTE MICROBIANOS ................................................................................... 32
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................ 34
CAPÍTULO 1 .................................................................................................................................. 41
RESUMO ..................................................................................................................................... 41
ABSTRACT ................................................................................................................................. 42
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 43
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 44
3. RESULTADOS .................................................................................................................. 48
4. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 60
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 60
1
INTRODUÇÃO GERAL
O Brasil, devido a sua extensão territorial, com grande quantidade de terras
agricultáveis, e boa diversidade climática possui uma alta produção agrícola e pecuária.
A estimativa da produção de grãos para a safra 2013/2014 é de 195,90 milhões de
toneladas, superior em 4,8% à safra recorde de 2012/2013 (CONAB, 2013).
Em função da sua grande participação no cenário agrícola nacional como
produtor de grãos, o estado de Mato Grosso chama a atenção para as possibilidades de
produção e uso de ingredientes alternativos na alimentação animal, principalmente os
co-produtos do biodiesel, como tortas, farelos e glicerina bruta. Contudo, este estado
enfrenta problemas com armazenamento da produção de grãos, em especial a de milho
safrinha, que tem apresentado crescimento linear nos últimos anos. Diante disso, boa
parte da safra que é colhida está sujeito às intempéries naturais por falta de armazéns.
Como grande parte do milho produzido no Brasil destina-se à alimentação
animal, uma das alternativas para minimizar o problema da dificuldade de
armazenamento no período da safra seria a utilização do processo de ensilagem. A
adoção dessa técnica justifica-se pelo fato de que a armazenagem dos grãos na forma de
silagem, em condições de manejo adequado, permite eliminar ou reduzir drasticamente
o desenvolvimento de fungos e, por consequência, evitar a contaminação da ração com
micotoxinas, que é um dos graves problemas que acomete o milho em armazéns (Reis et
al., 2001) e causam grandes prejuízos à pecuária nacional. Além disso, para o médio e
pequeno produtor, essa técnica permite reduzir e, ou, eliminar custos com taxas,
impostos, transporte, frete e armazenamento, bem como reduzir perdas por ataques de
insetos e roedores, o que é muito comum no armazenamento.
Apesar do potencial, infelizmente observa-se que a literatura é escassa de
estudos desenvolvidos para avaliar a ensilabilidade do grão de milho triturado e
2
reidratado. Neste sentido, surge também a oportunidade de avaliar o uso de aditivos
microbiológicos nesta silagem. De acordo com Kung Jr. et al. (2003), objetiva-se com
uso desse aditivos, dentre outros, inibir o crescimento de microrganismos indesejáveis,
como enterobactérias, clostrídios, leveduras, listeria, bacilos, etc.; acrescentar
microrganismos benéficos para dominar a fermentação e, com isso, formar produtos
finais que não inibam o consumo e a produção do animal, além de contribuir para
melhorar a recuperação de matéria seca do material conservado.
Entretanto, o uso de aditivos microbiológicos pode ser desnecessário se não
houver substrato suficiente para estes microrganismos, como ocorre no milho. Nesse
contexto, espera-se que a utilização de glicerina bruta no processo de ensilagem de
milho grão triturado e reidratado possa contribuir para potencializar o processo
fermentativo e, por consequência, produzir alimento de qualidade com menores perdas.
Contudo, há poucas informações na literatura a respeito do uso de glicerina no processo
de ensilagem.
Diante do exposto, objetiva-se avaliar o efeito da inclusão de diferentes níveis de
glicerina, com ou sem inoculante microbiano, sobre as populações microbianas,
composição química e perfil fermentativo de silagens de grão de milho triturado
grosseiramente e reidratado. O presente artigo foi formatado de acordo com as normas
da Revista Caatinga.
3
REVISÃO DE LITERATURA
1. Milho - Importância Econômica
O milho é um dos cereais mais cultivados do mundo e sua importância
econômica está relacionada com sua diversidade de utilização, desde a alimentação
animal e humano até a indústria de alta tecnologia. Entretanto, a maior parte da
produção de milho se destina para a produção de ração para aves, suínos e bovinos, os
quais compõem setores de extrema importância econômica e social, tanto no âmbito
nacional, como mundial. Diante do exposto, justifica-se a alta produção dos últimos
cinco anos que atingiu uma média de 874,56 milhões de toneladas (Tabela 1).
Tabela 1. Área, produção e produtividade do milho no mundo dos últimos cinco anos.
Safra Área Produção Produtividade
(milhões de ha) (milhões t) (t/ha)
2009/10 158,8 825,449 5,2
2010/11 164,3 834,210 5,1
2011/12 171,5 885,987 5,2
2012/13 176,3 862,880 4,9
2013/14* 176,7 964,282 5,5 *Estimativa
Fonte: USDA (2013)
O Brasil ocupa o terceiro lugar na produção mundial de milho, atrás dos Estados
Unidos e China (USDA, 2013). Por causa de sua imensa extensão territorial e áreas
altamente agricultáveis, o milho é plantado em praticamente todo o território brasileiro,
havendo registro de produção de milho em 97% dos municípios brasileiros entre 2004 e
2008 (IBGE, 2010). De acordo com a CONAB (2013), para a safra 2013/2014 a
estimativa de área a ser plantada para a produção de milho é de 15,42 milhões hectares
o que poderá resultar em uma produção nacional deste cereal de 78,78 milhões de
toneladas.
4
Devido à grande produção de cereais, a agropecuária avançou significativamente
nos últimos anos, período em que o cerrado brasileiro consolidou a sua alta capacidade
produtiva. Mato Grosso se destaca nesse cenário, pela vastidão de seu território e por
suas extensas áreas de solos com topografia plana.
As primeiras estatísticas sobre a produção de milho no estado de Mato Grosso
não apresentavam informações para produção desta cultura. De acordo com Duarte et al.
(2007) a produção de milho 2ª safra (“safrinha”), só começou a se desenvolver no
estado a partir da safra 1991/92, alguns anos depois do uso deste sistema no Paraná.
Segundo levantamento do IBGE (2013) a produção de milho “safrinha” no ano
2013 foi de aproximadamente 46,2 milhões de sacas, um recorde de produção que
superou a do ano de 2012 em 21,4%, em uma área plantada 20,5% maior, estimada em
8,9 milhões de hectares. Este foi o segundo ano que a produção de milho safrinha foi
maior que a de 1ª safra.
O estado de Mato Grosso é o maior produtor de milho safrinha do Brasil, com
uma produção de 19,7 milhões de toneladas no ano de 2013 (IBGE, 2013). Contudo,
este estado enfrenta muitos problemas relacionados com o armazenamento. Observa-se
na Figura 1 que apesar de serem crescentes, os investimentos em infraestrutura de
armazenagem no Brasil não tem acompanhado o dinamismo da agricultura. Segundo
recomendações da FAO, o número mínimo de armazéns existentes em cada região,
devem suportar completamente a safra produzida mais um acréscimo de 20% para que
não ocorram déficits gerados por superprodução. A capacidade estática de
armazenamento da safra de grãos no Mato Grosso é de 29,64 milhões t, porém, a
estimativa da produção de grãos para este estado é de 46,43 milhões t, gerando um
déficit de 16,79 milhões t. Provavelmente boa parte da safra, principalmente de milho
5
serão estocadas nos pátios de armazéns como é frequentemente demonstrado na mídia
(Jornal Globo Rural, 2012 e 2013).
Figura 1. Capacidade estática de armazenamento de produção de grãos do Brasil. Fonte: IEA (2012)
Apesar do aumento das exportações ao longo dos últimos anos, a principal forma
de uso do milho no Brasil é a para a produção animal. Nesse sentido, dados da Pesquisa
Pecuária Municipal (IBGE, 2011) apontam que o estado de Mato Grosso é responsável
pelo efetivo do rebanho de 29,26; 4,63 e 1,95 milhões de cabeças de bovinos, aves e
suínos, respectivamente, o que representa 13,8; 3,65 e 4,97% da produção nacional que
consomem boa parte do milho produzido no estado.
2. Glicerina Bruta
Devido ao aumento crescente por fontes de energia renováveis e a preocupação
mundial com o meio ambiente, o biodiesel vem se tornando o centro das atenções,
despertando interesses de países e indústrias que buscam aumentar suas produtividades,
mas com sustentabilidade.
O biodiesel é definido tecnicamente como um combustível composto de mono
alquil éster de ácidos graxos de cadeia longa e, segundo Rodrigues & Rondina (2013),
6
pode ser obtido de quatro formas a partir de triglicerídeos: uso direto de óleos vegetais,
microemulsões, craqueamento térmico (pirólise) ou transesterificação, sendo essa a
mais utilizada.
O processo de transesterificação é a substituição do glicerol da molécula por um
álcool primário de cadeia curta, geralmente o metanol ou etanol, para produzir ésteres e
glicerol na presença de catalisador, cujo objetivo é acelerar a velocidade da reação
(Figura 2). O catalisador a ser utilizado pode ser ácido, básico ou enzimático, porém, o
mais empregado pelas indústrias para obtenção do biodiesel a partir de plantas é o
hidróxido de sódio, por ser encontrado com facilidade no mercado e possuir menor
valor comercial (Menten et al., 2009). Para cada 90 m³ de biodiesel produzido pela
reação de transesterificação de óleos vegetais, são gerados aproximadamente 10 m³ de
glicerina bruta (Gonçalves et al., 2006).
A equação global do processo de transesterificação é apresentado na Figura 3a,
onde são necessários três moles de álcool por cada mol de triglicerídeo utilizado. Esta
reação global é consequência de um número de reações reversíveis e consecutivas
(Figura 3b). A primeira consiste na conversão de triglicerídeos em diglicerídeos,
seguida da conversão destes diglicerídeos em monoglicerídeos, e finalmente de
glicerídeos a glicerol, rendendo uma molécula de éster de álcool por cada glicerídeo em
cada etapa da reação (Rivaldi et al., 2007).
No final da etapa de transesterificação, o glicerol e ésteres formam uma massa
líquida de duas fases, que são facilmente separáveis por decantação ou centrifugação. A
fase superior, a mais leve ou menos densa, contém os ésteres metílicos ou etílicos
constituintes do biodiesel. A fase inferior ou pesada é composta de glicerol bruto e
impurezas.
7
Figura 2. Fluxograma do processo de obtenção do Biodiesel. Fonte: Adaptado de Sebrae, 2007.
8
Figura 3. (a) Reação global e (b) Reações consecutivas de transesterificação de
triglicerídeos. R1, R2, R3 e R representam grupos alquilas. Fonte: Rivaldi et al., 2007
Existem várias matérias primas utilizadas na produção de biodiesel que podem
ser divididas nos grupos de óleos vegetais, gordura animal, além de óleos e gorduras
residuais (Lofrano, 2008). As principais fontes para extração do óleo vegetal, com
potencial de uso para produção de biodiesel são a soja (Glycine max), algodão
(Gossypium ssp. L.), amendoim (Arachis hypogaea), canola (Brassica napus), girassol
(Helianthus annuus), mamona (Ricinus communis) e o dendê (Elaeis guineensis).
Contudo, em algumas regiões específicas do país outras culturas também são utilizadas
para a extração de óleo como o coco de babaçu, coco da praia, maracujá, linhaça,
abacate, oiticica e nabo forrajeiro (Raphanus sativus). Entre as gorduras animais,
destacam-se o sebo bovino, os óleos de peixes, o óleo de mocotó, a banha de suíno,
entre outros.
9
De acordo com a Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis
(ANP, 2013) de todas as matérias primas utilizadas para a produção de biocombustíveis,
o óleo de soja, algodão e gordura animal foram os mais utilizados (Tabela 2).
Tabela 2. Matérias-primas utilizadas na produção de biodiesel no Brasil nos últimos
cinco anos.
Matérias
Primas
Matérias-primas utilizadas na produção do Biodiesel (B-100) m³
2008 2009 2010 2011 2012
TOTAL 1.177.638 1.614.834 2.387.639 2.672.771 2.719.897
Óleo de soja 967.326 1.250.590 1.980.346 2.171.113 2.105.334
Óleo de algodão 24.109 70.616 57.054 98.230 116.736
Gordura animal¹ 154.548 255.766 302.459 358.686 458.022
Outros materiais
graxos² 31.655 37.863 47.781 44.742 29.805
¹Inclui gordura bovina, gordura de frango e gordura suína. ² Inclui óleo de palma, óleo de amendoim, óleo de nabo-forrageiro, óleo de girassol, óleo de mamona, óleo de sésamo, óleo de fritura usado e outros
materiais graxos.
Fonte: ANP/SPD (2013)
Desde a implantação do plano Pró-álcool, criado em 14 de novembro de 1975
pelo Decreto n°76.593, visando estimular a produção de álcool e o atendimento das
necessidades do mercado e por meio do Programa Nacional de Produção e Uso de
Biodiesel, que autorizou em 2008 a adição de 3% deste combustível ao óleo diesel e,
que a partir do ano de 2010 passou a ser 5%, a produção de biodiesel teve aumentos
crescentes.
Segundo dados da ANP (2013), a produção de biodiesel no Brasil no ano de
2012 foi de aproximadamente 2,7 milhões m³, o que representa 36,1% da capacidade
total do país. A Região Centro-Oeste foi a maior produtora, com um volume de 1,2
milhões de m³, equivalente a 42,8% da produção nacional.
Todavia, mesmo a produção nacional de biodiesel estando abaixo do potencial, o
volume deste combustível produzido em 2012 gerou a produção de 275 mil m³ de
glicerina, trazendo a preocupação a respeito do seu destino, já que não existe legislação
10
específica para seu descarte. É válido ressaltar que desse total de glicerina, 129 mil m³
são produzidas na Região Centro-Oeste.
A glicerina, resultado do processo de transesterificação de um triglicerídeo,
denominada também glicerina bruta, contém normalmente entre 40 a 85% de glicerol,
sendo o restante composto por água, catalisador (alcalino ou ácido), álcool (não
reagido), impureza dos reagentes, ésteres, propanodióis, monoésteres, oligômeros de
glicerina e polímeros (Oliveira et al.,2010).
Entre os possíveis usos da glicerina bruta, pode-se destacar sua aplicação na
alimentação animal. A utilização da glicerina bruta, principalmente na formulação de
rações para aves e suínos desperta interesse imediato por se constituir em um produto
rico em energia (4.320 kcal de energia bruta por kg para o glicerol puro) e com alta
eficiência de utilização pelos animais. Além de servir como fonte de energia, o glicerol,
principal constituinte da glicerina, também pode ter efeitos positivos sobre a retenção de
aminoácidos ou nitrogênio, conforme resumido por Cerrate et al. (2006).
Segundo DeFrain et al. (2004) a glicerina também pode aliviar os sintomas de
cetose quando administrada, via oral, pois gera um substrato glicogênico, aliviando o
complexo de cetose/fígado gorduroso, para melhorar a lactação.
Os trabalhos sobre efeito da glicerina no consumo e desempenho animal
mostram uma limitação no uso a partir de quantidades superiores a 10%. Parsons et al.
(2009) avaliando o efeito de 0, 2, 4, 8, 12 e 16% na matéria seca de glicerina na dieta de
novilhas mestiças verificaram que acima de 12% de inclusão deste ingrediente houve
redução no ganho de peso e na eficiência alimentar. Schröder e Südekum (1999)
verificaram também que até 10% de glicerina substituindo o amido na dieta de vacas
leiteiras alimentadas não deprimiu o consumo, a digestibilidade ruminal, síntese
microbiana e digestibilidade total dos nutrientes.
11
Apesar de todos esses benefícios o uso da glicerina bruta na alimentação animal
pode apresentar algumas limitações. Segundo o código de regulamentação federal
(C.F.R 582.1320) da Food and Drug Administration (2013) a glicerina pode ser
utilizada na alimentação animal quando o resíduo do metanol na glicerina não
ultrapassar 150 mg/kg de glicerina. Isso porque este composto no organismo animal
pode ser oxidado no fígado a formaldeído e este a ácido fórmico que é uma substância
tóxica. Um aspecto que deve ser salientado é que o potencial efeito prejudicial do
metanol incorporado às rações pode ser desprezado quando a ração for peletizada, uma
vez que a temperatura atingida na peletização é mais alta que a temperatura de
vaporização do metanol (Lammers et al. 2008).
Outra limitação da utilização da glicerina bruta na alimentação animal é o
resíduo do catalisador, que dependendo de qual for utilizado, hidróxido de sódio ou
hidróxido de potássio, ocorrerá à geração de uma glicerina bruta com níveis
diferenciados de Na ou K, que devem ser avaliados para possível utilização da glicerina
nas formulações de rações animais (Penz Junior e Gianfelice, 2008).
Outra forma de utilização da glicerina bruta seria como aditivos em silagens.
Segundo Sousa Filho et al. (2012), o glicerol, principal constituinte da glicerina bruta,
pode ser utilizado como fonte de carbono para a fermentação anaeróbia pelos
microrganismos. Vários compostos químicos de relevância comercial podem ser
gerados a partir do glicerol por fermentação microbiana como 1,3-propanodiol, etanol, e
diversos ácidos orgânicos (lactacto, succinato, acetato, etc) (Franco, 2011). Além disso,
o glicerol pode servir de fonte de energia para os microrganismos fermentativos,
podendo servir como substituinte de diversos carboidratos.
12
3. Silagem
3.1 Processo de ensilagem
O processo de ensilagem pode ser dividido em várias etapas, desde a escolha da
espécie forrageira ou material a ser ensilado, plantio e condução da cultura, seu corte,
desintegração e transporte, até o enchimento, compactação e vedação do silo.
A escolha da espécie forrageira deve priorizar materiais que contenham elevados
teores de matéria seca (MS), acima de 30 a 35% (Muck, 1987), no momento da
ensilagem, bom níveis de carboidratos solúveis (6 – 8%) (McDonald et al., 1991) e
baixa capacidade tamponante. As etapas de corte e desintegração são feitas para
disponibilizar os carboidratos solúveis presentes no material e facilitar a compactação.
Em caso de ensilagem de forrageiras, geralmente essas etapas ocorrem quando a planta
a ser ensilada atinge o estádio de maturação, que varia entre as espécies. O tamanho
adequado da partícula que permite uma boa compactação varia de 1 a 2 cm, porém,
quanto maior for o teor de MS da forrageira ensilada, menor deverá ser o tamanho da
partícula. Já a etapa de enchimento, deve ser o mais breve possível para estabelecer
rapidamente a condição de anaerobiose.
A compactação e a vedação são etapas primordiais para o sucesso do processo
de ensilagem. A primeira reduz o espaço entre as partículas da forragem evitando que
fiquem espaços com a presença de oxigênio que favorece o desenvolvimento de
microrganismos indesejáveis. Já a vedação, evita a exposição total da massa ensilada ao
oxigênio criando uma condição de anaerobiose que é essencial para o processo de
fermentação.
Segundo Pereira e Santos (2006) o processo de fermentação é muito complexo,
sendo considerada uma metabiose, pois ocorre o desenvolvimento simultâneo e
sucessivo de microrganismos de diversos gêneros e espécies que dependem
13
principalmente do pH, do potencial de oxirredução e do tipo e quantidade de substratos
presentes no meio.
Após a vedação do silo tem início o processo de fermentação da silagem
envolvendo quatro fases (Muck e Pitt, 1993; Oude Elferink et al., 1999; Kung Jr.,
2002): fase aeróbia, fase de fermentação ativa, fase estável e fase de descarga (retirada
da silagem). Essas fases apresentam diferentes durações e intensidades e, portanto, não
podem ser separadas precisamente uma da outra (Pereira e Santos, 2006).
A primeira fase é de curta duração e ocorre durante o enchimento do silo
estendendo-se até algumas horas após o fechamento do mesmo. Nessa fase, as células
da planta ensilada e microrganismos aeróbicos obrigatórios e facultativos ainda
permanecem vivos e respirando ativamente. Isso leva ao consumo de oxigênio
reduzindo sua concentração na massa ensilada. Excesso de oxigênio provocado por
falhas na compactação ou pelo tamanho irregular de partículas pode levar a degradação
indesejável de proteína, produção excessiva de calor e ainda pode promover o
crescimento indesejável de alguns fungos e leveduras. Esta fase termina com a exaustão
de oxigênio dentro do silo, dando inicio à fase de fermentação ativa (segunda fase).
A segunda fase de fermentação pode ser subdividida em duas etapas com uma
duração variando de uma a quatro semanas, dependendo das propriedades da cultura
ensilada e das condições de ensilagem e tem início com a proliferação das bactérias
produtoras de ácido lático (BAL) heterofermentativas e com as bactérias produtoras de
ácido acético, também denominadas de enterobactérias. Essas bactérias produzem
alguns ácidos, como o ácido acético e lático e outros produtos como o etanol e o CO2,
utilizando glicose, frutose, xilose e ribose como substratos.
A produção de ácido lático durante o processo de fermentação leva a uma queda
de pH, que ao atingir 5,0 promove uma inibição das BAL heterofermentativas dando
14
início a segunda etapa desta fase onde há o predomínio das BAL homofermentativas
(McAllister e Hristov, 2000). Essas bactérias predominantes na segunda etapa, por
produzirem principalmente ácido lático, promovem uma queda maior no pH. Esta fase
se prolonga até que o pH seja reduzido para, aproximadamente, 3,8 a 4,2, o suficiente
para inibir as BAL homofermentativas, iniciando-se a fase de estabilização.
Na terceira fase, também conhecida como fase estável, várias espécies de
leveduras ácido-tolerantes, segundo Pereira e Santos (2006), sobrevivem em estádio
inativo, juntamente com bacilos e clostrídios que estão dormentes na forma de esporos.
Se acontecer nesse período fermentações secundárias, que estão associadas à deficiência
de carboidratos fermentescíveis, ou a uma lenta produção de ácido lático que leva a uma
ineficiência na inibição da flora deterioradora, como as bactérias do gênero Clostridium,
pode ocorrer à deterioração da silagem.
As bactérias do gênero Clostridium têm efeito pronunciado na qualidade da
silagem se os valores de pH não forem suficientemente baixos para inibir o seu
desenvolvimento. Este grupo estritamente anaeróbio fermenta açúcares, ácido lático e
aminoácidos produzindo ácido butírico e aminas. Este tipo de fermentação representa
significativa perda de matéria seca, pois seus produtos reduzem a aceitabilidade das
silagens, decrescendo o consumo de matéria seca.
Na última fase, chamada de fase de descarga, ocorre à abertura do silo e, em
geral, acontece após a estabilização do material ensilado. Para algumas culturas como o
milho e sorgo, o tempo de estabilização ocorre em média por volta dos 21 dias após a
ensilagem. Porém, costuma-se adotar um tempo médio de 30 dias para todas as culturas.
Para alguns materiais como grão úmido, o período de queda do pH, seguido do tempo
de estabilização ocorre por volta de 7 dias após a ensilagem (Ítavo et al., 2006;
McDonald et al., 1991).
15
Após a abertura do silo, a silagem é previamente exposta ao oxigênio. A
presença deste gás na silagem favorece a atividade de microrganismos indesejáveis, tais
como fungos, leveduras e bactérias produtoras de ácido acético. Estes microrganismos,
segundo Pereira e Santos (2006), utilizam substratos residuais e produtos da
fermentação para seu crescimento, resultando em deterioração da silagem, pois ocorre
um aumento do pH com consequente aumento de temperatura. A união de temperaturas
mais elevadas com um aumento significativo no pH ativam os esporos dormentes e as
leveduras.
Os fungos tem um pequeno efeito na deterioração aeróbica das silagens. O
principal problema da atividade de fungos em silagens é a possível produção de toxinas
que resulta em perdas econômicas significativas para os criadores, uma vez que afetam
a saúde dos animais, reduzem a produtividade e podem até levar a morte.
De um modo geral, os principais indicadores de deterioração das silagens são a
produção de calor e CO2, que são gerados pela respiração celular, diminuição da
concentração de ácido lático e aumento no pH, assim como decréscimo substancial no
valor nutricional.
3.2 Perdas durante a ensilagem
A origem das perdas no processo de ensilagem pode estar relacionada a diversos
fatores, como respiração residual, fermentação, produção de efluente no silo e
deterioração aeróbia (McDonald et al., 1991). Basicamente existem duas categorias de
perdas de nutrientes durante a ensilagem e que são classificadas como evitáveis e
inevitáveis. As perdas evitáveis incluem as perdas com a produção de efluente, de
fermentações secundárias e deterioração aeróbica. As perdas inevitáveis incluem perdas
no campo e aquelas oriundas da respiração das plantas e da fermentação principal
16
(Bolsen, 1995) e representam somente de 5 a 15% do total de perdas. Na Tabela 3
encontra-se uma classificação das perdas que podem ocorrer durante o processo de
ensilagem, junto com seus fatores causativos.
Tabela 3. Perdas de energia no processo de ensilagem e fatores causativos
Processo Tipo de
Perda
Perda %
(MS) Agentes Causais
Respiração Inevitável 1 a 2 Enzimas da Planta
Fermentação Inevitável 2 a 4 Microrganismos
Efluente (In) evitável 5 a 7 Umidade
Emurchimento Inevitável 2 a 5 Clima, técnica, planta
Fermentações
Secundárias Evitável 0 a 5 Planta, ambiente no silo, umidade
Deterioração
anaeróbica no
armazenamento
Evitável 0 a 10 Tempo de enchimento, densidade,
vedação, planta, umidade
Deterioração
anaeróbica no
descarregamento
Evitável 0 a 15 Densidade, umidade, ténica, época
do ano
Perdas Totais - 7 a 40 - Fonte: Adaptado de McDonald et al. (1991).
As perdas no processo de ensilagem tem início na colheita. As três principais
causas de perdas de matéria seca (MS) nessa etapa ocorrem devido a fatores mecânicos
e bioquímicos (McDonald et al., 1991). As perdas mecânicas surgem como resultado do
manejo da cultura durante o período de secagem. As perdas bioquímicas acontecem
principalmente devido a respiração, por microrganismos aeróbicos e por outros
processos enzimáticos que ocorrem na planta após a colheita. Quanto mais longo for o
período de exposição do material ao ar maior será a perda dos carboidratos solúveis,
causando limitações na eficiência da fermentação e alterações de temperatura
controlados por fatores químicos e físicos, como a concentração de oxigênio (Guim et
al., 2002) e também maiores serão as perdas de nutrientes e redução do valor nutritivo
da silagem (McDonald et al., 1991).
17
Durante a fase anaeróbia da ensilagem, as perdas são promovidas pela
fermentação e por efluentes. As perdas decorrentes do processo de fermentação
dependem dos nutrientes fermentados e dos organismos responsáveis. Isso porque
vários produtos da fermentação apresentam um valor bruto de energia maior do que os
substratos (McDonald et al., 1991) e, por isso, as perdas de MS são maiores do que as
perdas de energia durante o processo de fermentação (Tabela 4).
Tabela 4. Perdas calculadas de energia e matéria seca (MS) no processo de fermentação.
Organismo Rota Substrato Produto Perdas (%)
Energia MS
BAL Homo1 Glicose 2 lactato 3,1 0
BAL Hetero² Glicose 1 lactato + 1
acetato 20,4 17
BAL Hetero² Glicose 1 lactato + 1
etanol 2,8 17
Leveduras Glicose 2 etanol 2,6 49
Clostrídios Glicose 1 butirato 22,1 34
Enterobactérias 2 Glicose 1 lactato + 1
acetato + 1 etanol 11,1 17
1 - Homofermentativas; ² - Heterofermentativas
Fonte: Adaptado de McDonald et al. (1991).
Observa-se na tabela que as menores perdas são ocasionadas pelas bactérias
homofermentativas que utilizam glicose como substrato para a síntese de lactato (via
glicolítica anaeróbia). Entretanto, o produto da degradação da glicose por bactérias
heterofermentativas, enterobactérias e leveduras produz um álcool, acarretando em
um aumento considerável das perdas (McDonald et al., 1991).
Goodrich et al. (1975) avaliando a silagem de grão de milho colhido com 27,5%
de umidade e a silagem de grão de milho seco reconstituído para 27,5% de umidade
verificaram que as menores perdas de matéria seca foram obtidas para o milho
reconstituído (3,5% MS) do que para o milho ensilado logo após a colheita (4,5% MS).
18
A produção de efluentes durante o processo de ensilagem é influenciado por
vários fatores como o conteúdo de MS da cultura ensilada, tipo de silo, grau de
compactação e pré-tratamento da cultura. Destes, o teor de MS é o fator mais
importante, isto porque, quanto maior o teor de MS da massa ensilada, menor é o teor
de umidade contido nesta e, portanto, menores serão as perdas por efluente. Segundo
Pereira e Bernardino (2004), a quantidade mínima de efluente geralmente é produzida
quando se utilizam plantas com teor de matéria seca a partir de 29 a 30%.
Contudo, mesmo ao final do processo de ensilagem podem ocorrer perdas. Estas
são ocasionadas pela exposição da massa de forragem a ensilar ou que foi ensilada ao
ar, por exemplo, durante o fornecimento. Segundo Velho et al. (2006), as principais
perdas após a abertura do silo são a oxidação dos açucares solúveis e degradação do
ácido lático produzido durante a fermentação, resultando em maior proporção de parede
celular e menor valor nutritivo e de matéria seca. Ainda, segundo esses autores, se mal
manejado após a abertura, a silagem poderá ter perdas variando de 2 a 19%.
As perdas ocorridas durante a deterioração aeróbia, ocasionada pela exposição
da massa ensilada ao ar, são provocadas pela atividade microbiana de leveduras, fungos
e bactérias. Destes, as leveduras, na maioria dos materiais ensilados, são os
microrganismos responsáveis pelo início da deterioração aeróbia (Woolford, 1990;
Pahlow et al., 2003) e os fungos filamentosos tem papel secundário, pois seu
desenvolvimento ocorre em sucessão ao crescimento de leveduras (McDonald et al.,
1991).
Andrade Filho et al. (2010) avaliando o efeito do uso de Lactobacillus
plantarum e do nível de reconstituição (20, 30 e 40% de umidade final na massa
ensilada) de grãos de milho sobre a qualidade da silagem verificou que o uso deste
inoculante reduziu as perdas por gases durante o processo de fermentação, mas o nível
19
de reconstituição não teve efeito significativo, sendo o maior valor de perda por gás de
1,91% para silagem reidratada para 20% de umidade sem inoculante. Já Basso (2009)
avaliando os efeitos de doses de Lactobacillus buchneri sobre as características
fermentativas de silagens de grãos úmidos de milho (34% umidade) não encontrou
diferença significativa para as perdas por gases entre as doses do inoculante, obtendo
valores próximos a 1,90%, similar ao experimento anterior.
Ítavo et al. (2006) avaliando padrão de fermentação e a composição química de
grãos úmidos de milho (64% umidade), com ou sem o uso de inoculante microbiano,
em função do tempo após a ensilagem, observou que as perdas de matéria seca
chegaram a 0,81% aos 64 dias após a ensilagem.
3.3 Critérios para a avaliação da qualidade da silagem
Como qualidade da forragem é definida como o potencial desta em produzir as
respostas animais desejadas (Nave, 2007), o parâmetro mais consistente para avaliar sua
efeito seria o desempenho animal. No entanto, experimentos desta natureza são
onerosos e demandam tempo para a obtenção dos resultados.
Entretanto, ao longo dos anos, estabeleceram-se diversos parâmetros para avaliar
o valor nutricional da silagem como o teor de ácidos orgânicos, potencial
hidrogeniônico, acidez titulável, poder tampão e o nitrogênio amoniacal. Estes critérios
que definem o valor nutricional da silagem juntamente com a qualidade da forragem
imprime o potencial forrageiro que influência diretamente a produção animal.
3.3.1 Ácidos Orgânicos
Existem vários ácidos que são produzidos durante o processo de fermentação,
como o lático, acético, butírico, isobutírico, propiônico, valérico, isovalérico, succínico
20
e fórmico (McDonald et al., 1991). Porém, os principais ácidos identificados nas
silagens são o acético, butírico e lático, pois representam a maior concentração dos
ácidos (Tabela 5) (Kung e Shaver, 2001).
Tabela 5. Concentrações padrões de produtos finais da fermentação em várias silagens.
Produto Final Silagem de
Leguminosa (300 a 400 g/kg MS)
Silagem de
Capim (300 a 500 g/kg MS)
Silagem de
Milho (300 a 400 g/kg MS)
Ácido Lático¹ 70 – 80 60 -100 40-70
Ácido Acético¹ 20 – 30 10 – 30 10-30
Ácido Butírico¹ <5 0 0
Ácido Propiônico¹ <5 <10 <10
N amoniacal (g/kg PB) 100 – 150 <120 <10 ¹- g/kg MS
Fonte: Adaptado de Kung e Shaver (2001)
O ácido lático é um dos maiores indiciadores do processo de fermentação e deve
aparecer em porcentagem superior aos demais, pois, apesar de todos os ácidos formados
na fermentação contribuírem para redução do pH da silagem, o ácido lático é o principal
responsável nesse processo por apresentar menor constante de dissociação (3,86) que os
demais. Porém, em relação aos outros ácidos, o ácido butírico, quando presente, deve
aparecer em pequena quantidade, já que sua presença revela intensa degradação das
proteínas. Além disso, o conteúdo deste ácido reflete a extensão da atividade
clostridiana sobre o material ensilado e está relacionado a menores taxas de decréscimo
e maiores valores finais de pH nas silagens (Fisher e Burns, 1987).
Apesar de o ácido lático ser o principal ácido da fermentação presente em
silagens de boa qualidade, pequenas quantidades de ácido acético podem aparecer
devido à ação em maior escala das enterobactérias e das bactérias láticas e em menor
escala pela ação dos clostrídios. Altas concentrações deste ácido, superior a 40 g/kg
pode ser um indicativo de fermentação prolongada, enchimento lento do silo ou silo mal
vedado (Kung e Shaver, 2001).
21
Em experimento realizado por Jobim et al. (1999) a silagem de grão úmido de
milho (35% de umidade) apresentou valores de 0,76; 0,12; 0,011 e 0,002% na MS para
os ácidos lático, acético, propiônico e butírico, respectivamente. Também em
experimento realizado por Rezende et al. (2013), o milho colhido com 14% de umidade
e reidratado com água ou soro ácido até os níveis de 30, 35 ou 40% de umidade,
inoculado ou não com inoculante bacteriano associado a enzimas celulolíticas e
proteolíticas apresentou valores de 0,179; 0,12 e 1,38% na MS para os ácidos acético,
propiônico e lático, respectivamente, para a silagem reidratada com soro ácido. Estes
valores foram maiores para esta silagem do que para a silagem reidratada com água. A
silagem com inoculante também apresentou os maiores valores destes ácidos em relação
a silagem não inoculada, porém os valores foram iguais estatisticamente a silagem
reidrata com soro ácido. Já em relação ao teor de umidade, as silagens com 30 e 35% de
umidade apresentaram os maiores valores para estes ácidos.
Carneiro et al. (2013) avaliando a silagem de milho (com 4 níveis de glicerina
(0, 5, 10 e 15% na MS) verificaram que a adição de glicerina causou uma redução linear
de 0,3; 0,35 e 0,12% sobre os ácidos lático, acético e butírico, respectivamente, para
cada 1% de inclusão de glicerina.
3.3.2 Potencial Hidrogeniônico e Acidez Titulável
A silagem é um processo de conservação em ácido e por isso a rápida queda de
pH é fundamental para a qualidade final da massa ensilada, garantindo redução da
atividade proteolítica e reduzindo o crescimento de microrganismos indesejáveis,
particularmente, enterobactérias e clostrídios.
No passado, o valor de pH em silagens era considerado um importante indicador
da qualidade de fermentação, sendo inclusive possível classificar as silagens em termos
22
de qualidade. Nesse contexto, Van Soest (1994) afirmou que o pH final considerado
ideal para uma silagem situa-se entre 3,8 a 4,2. No entanto, essa variável passou a ser
usada com mais critério para fazer inferências à qualidade de fermentação, haja vista
que silagens de materiais com baixo teor de umidade (silagem de forragem
emurchecida) invariavelmente apresentam valores de pH elevados, acima de 4,2, valor
anteriormente utilizado para classificar uma silagem como de qualidade pobre (Jobim et
al., 2007). Outro fator que contribui para essa modificação de classificação refere-se à
velocidade da queda do pH, isso porque geralmente, baixo pH final não garante que a
atividade clostridiana foi inibida durante o processo. De acordo com Woolford (1984), o
pH isoladamente não pode ser considerado como critério seguro para a avaliação das
fermentações, pois seu efeito inibidor sobre as bactérias depende da velocidade do
declínio da concentração iônica e do grau de umidade do meio.
Oliveira (2009) avaliando os efeitos do Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
buchneri e benzoato de sódio, bem como a associação desses inoculantes sobre a
redução das perdas quantitativas e qualitativas das silagens de grãos úmidos de milho
verificaram que após 112 dias de armazenamento a silagem tratada com L. buchenri
apresentou o maior valor de pH, provavelmente devido ao fato desta bactéria ser
heterofermentativa, produtora de ácido acético, reduzindo a capacidade de diminuição
do pH.
Lopes et al. (2005) verificaram valores de pH variando de 4,25 a 4,29 para
silagens de grão de milho (33% de umidade) submetidas a diferentes tratamentos de
reconstituição. Rezende et al. (2013) encontraram valores de pH semelhantes (4,12;
4,25 e 4,06) para a silagem de milho reidratada com água ou soro ácido com 30, 35 e
40% de umidade, respectivamente.
23
Segundo Lindgren (1999), o indicador mais adequado para julgar qualidade de
fermentação das silagens é a concentração de ácidos orgânicos indissociados, pois estes
ácidos penetram a membrana celular e acumulam-se no citoplasma das células
tornando-se dissociados, possibilitando assim a liberação de prótons que abaixam o pH
e ocasionam a destruição das células (Jobim et al. 2007). Sendo assim a acidez titulável
seria um conceito mais apropriado para julgar a fermentação e com isso o conceito de
pKa seria, de fato, mais importante que o pH propriamente dito.
De acordo com Silva e Queiroz (2002) a importância de se determinar a acidez
titulável baseia-se no fato de o pH não guardar perfeita correlação com o teor de ácido
lático da silagem que deveria contribuir para baixá-lo. Entretanto, existem outros íons e
ingredientes comumente adicionados durante a ensilagem, como a ureia e calcário, que,
por certo, interferem na relação do pH e ácido lático, explicando assim, a não
proporcionalidade entre esses dois parâmetros.
Além disso, a análise de acidez titulável permite obter indicação de pureza e
qualidade em produtos fermentados, por analisar os ácidos formados durante esse
processo, que influenciam o sabor, odor, cor, estabilidade e a manutenção da qualidade
da forragem conservada (Nussio et al., 2001).
3.3.3 Poder Tampão
O poder tampão (PT) é definido como a capacidade da massa de forrageira em
resistir as alterações de pH (Jobim et al., 2007). Segundo estes mesmos autores, o
conhecimento da PT da massa a ser ensilada é importante, pois fornece informações em
relação à velocidade de abaixamento do pH. De acordo com Cherney e Cherney (2003),
quando a massa a ser ensilada apresenta alta PT a velocidade de queda do pH é lenta,
24
aumentando as perdas durante o processo de ensilagem que por consequência reduz a
qualidade do material final.
Silva et al. (2010) verificaram valores de PT variando de 42 a 44 e.mg/100 g MS
para silagens de grãos úmidos de milho (com 47% de umidade) com diferentes
inoculantes bacterianos. Já Ítavo et al. (2006) encontraram valores de PT de 22,52 e
22,67 e.mg/100 g MS para silagens de grão úmido de milho (36% umidade) com e sem
inoculante (L. plantarum), respectivamente.
Não há muitos trabalhos na literatura para a análise do poder tampão em silagens
de grãos reconstituídos, por isso, esse tipo de análise para o material que está se
propondo é de extrema importância.
3.3.4 Nitrogênio amoniacal
O conteúdo de amônia das silagens, expresso como percentagem do nitrogênio
amoniacal (N-NH3) em relação ao nitrogênio total é amplamente utilizado na avaliação
da qualidade de silagens e, juntamente com o pH, fornece uma indicação da forma como
se processou a fermentação. Na forragem verde, de 75 a 90% do nitrogênio total (NT)
estão sob a forma de proteína, e o restante, chamado nitrogênio não proteico (NNP),
consiste principalmente de aminoácidos livres e amidas, com menor proporção de
ureídeos, aminas, nucleotídeos, clorofila, peptídeos de baixo peso molecular e nitratos
(Jobim et al., 2007).
Após o corte da forrageira, tem início uma extensa hidrólise de proteínas, com
aumento do NNP para aproximadamente 40% do NT, nas primeiras 24 horas de
ensilagem. Foi demonstrado que a proteólise inicial é mediada, principalmente, por
enzimas da planta, enquanto as degradações subsequentes de aminoácidos ocorrem pela
ação de microrganismos. Quanto maior for o teor de nitrogênio amoniacal, como
25
porcentagem do nitrogênio total, pior será a qualidade da silagem, pois indica
degradação de compostos proteicos. A amônia formada nesse processo, além de inibir o
consumo da silagem e apresentar pouca eficiência na utilização do nitrogênio para
síntese proteica pelos microrganismos do rúmen, altera o curso da fermentação,
impedindo a rápida queda do pH da massa ensilada (Mckersie, 1985). De acordo com
Van Soest (1994), nas silagens onde o nitrogênio amoniacal representa menos de 10%
do nitrogênio total, indica que não ocorreu quebra excessiva de proteína em amônia e os
aminoácidos constituem a maior parte do nitrogênio não proteico, já nas silagens onde o
nitrogênio amoniacal representa mais de 15% do nitrogênio total ocorreu quebra
considerável de proteína e tais silagens são menos consumidas pelos animais.
Andrade Filho et al. (2010) avaliando o efeito da reconstituição da umidade (20,
30 e 40%) de grãos de milho maduros e secos com e sem inoculante microbiano,
verificou que os teores de N-NH3 aumentaram com a elevação da umidade chegando a
0,66 (% N) para a silagem com 40% de umidade. Entretanto, Ítavo et al. (2006)
encontraram valores de N-NH3 de 0,012% na MS para silagens de grão úmido de milho
(36% umidade) com 64 dias de ensilagem.
Já Huck et al. (1999) avaliando a silagem de sorgo reconstituído com água para
atingir os valores de 25, 30 ou 35% de umidade com 90 dias de ensilagem verificaram
que os menores valores de N-NH3 foram obtidos para a silagem com 25% de umidade
(0,25% MS), mas semelhantes para as silagens com 30 (0,52) e 35% de umidade
(0,48% MS).
4. Microbiota da silagem
O sucesso do resultado do processo de conservação depende de vários fatores,
como teor de MS da cultura no momento da ensilagem, quantidade de carboidrato
26
solúvel, capacidade de tamponamento da cultura e, principalmente, da microbiota da
silagem que pode ser dividida em dois grupos de microrganismos, desejáveis e
indesejáveis.
Os microrganismos desejáveis são aqueles necessários para a produção de uma
boa silagem, ou seja, os produtos finais de sua fermentação são essenciais para que uma
silagem de boa qualidade seja obtida. Compreendem esta classe as bactérias ácido
lático. Os indesejáveis são aqueles que podem causar a deterioração anaeróbia (por
exemplo, clostrídios e enterobactérias) ou a deterioração aeróbica (bacilos, listeria e
bolores) (Oude Elferink et al.,1999). A Tabela 6 mostra um resumo dos principais
grupos microbianos e respectivas populações encontradas em plantas antes da ensilagem
e observa-se que a classe de microrganismos dominantes são aeróbios ou aeróbios
facultativos, enquanto que as bactérias ácido lático que são responsáveis por preservar a
cultura estão presentes em menor magnitude e com grande variação.
Tabela 6. Populações epifíticas (UFC/g forragem) de grupos de bactérias e fungos em
plantas antes da ensilagem.
Grupo Populações
Bactérias aeróbicas totais > 10.000.000
Bactérias ácido lático 10 - 1.000.000
Enterobactérias 1.000 - 1.000.000
Leveduras 1.000 - 100.000
Fungos 1.000 - 10.000
Clostrídios (endosporos) 100 - 1.000
Bacillus (endósporos) 100 - 1.000
Bactérias ácido acético 100 - 1.000
Bactérias ácido propiônico 10 - 1000 Fonte: Adaptado de Pahlow et al. (2003)
4.1 Bactérias Ácido Lático
As bactérias ácido lático (BAL) são organismos gram-positivos, catalase
negativos e não formam esporos. Compreendem os gêneros Lactobacillus, Pediococcus,
27
Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus e Leuconostoc (Pawlow et al., 2003)
pertencentes à microbiota epifítica do material e tem como principal produto final da
fermentação de açúcares, o ácido lático, mas outros compostos podem ser produzidos,
como ácido acético, etanol e dióxido de carbono (CO2) (Muck, 2010). Com base no
metabolismo de açúcar as BAL podem ser classificadas como homofermentativas
obrigatórias, heterofermentativas facultativas ou heterofermentativas obrigatórias.
As bactérias homofermentativas obrigatórias produzem mais de 85% de ácido
lático a partir de hexoses, como a glicose, mas não podem degradar pentoses, como a
xilose, pois não possuem a enzima fosfoquetolase (Muck, 2010). As bactérias
heterofermentativas facultativas também produzem ácido lático a partir de hexoses,
mas, além disso, são capazes também de fermentar pentoses a outros produtos, como
ácido acético. Por sua vez, as heterofermentativas obrigatórias fermentam tanto hexoses
como pentoses formando ácido lático, etanol (ou ácido acético) e CO2 (Oude Elferink et
al., 1999). Compreendem espécies de BAL homofermentativas Lactobacillus
plantarum, L. casei, L. acidophilus, Pediococcus pentosaceus, P. acidilactici,
Lactobacillus ssp. e Enterococcus faecium, já as BAL heterofermentativas são, por
exemplo, L. brevis. L. buchneri e Propionibacterium (Muck, 2010; Zopollato et al.,
2009).
Segundo Woolford (1984), as BAL tem uma ampla faixa de tolerância ao pH, ao
redor de 4,0 a 6,8 e também uma amplitude muito variável de temperatura, existindo
crescimento numa faixa de 5 – 50ºC, sendo a temperatura de 30ºC considerado ideal.
4.2 Enterobactérias
As enterobactérias são anaeróbias facultativas, gram-negativos e muitos dos seus
efeitos negativos na silagem ocorrem em condições anaeróbias. De acordo com Muck
28
(2010), várias espécies de enterobactérias usam nitrato como aceptor de elétrons no
lugar do oxigênio, reduzindo nitrato para nitrito ou óxido de nitrogênio que volatilizam
computando as principais perdas por gás no silo.
As enterobactérias são as principais competidoras com as BAL pelos açúcares
disponíveis e o produto final de sua fermentação é o ácido acético e não o lático. Outros
compostos também são produzidos a partir da fermentação realizada por enterobactérias
como ácido succínico e 2,3-butanodiol (Muck, 2010).
A presença de enterobactérias é também um indicativo de proteólise. Esta
degradação de proteínas não só causa uma redução no valor nutricional da silagem, mas
também podem levar à produção de compostos tóxicos, tais como aminas biogênicas,
que são conhecidas por ter um efeito negativo sobre aceitabilidade da silagem, e os
ácidos graxos ramificados (Woolford, 1984; McDonald et al., 1991).
4.3 Clostrídios
Os clostrídios são anaeróbios obrigatórios, porém, sua presença na silagem
geralmente é resultado da contaminação de solo, pois nas plantas sua concentração é
baixa (Woolford, 1984). As espécies mais comuns encontradas nas silagens são
divididas em dois grupos: a) clostrídios proteolíticos que fermentam primeiramente
aminoácidos (Clostridium sporogenes); b) clostrídios sacarolíticos que fermentam
carboidratos (C. butyricum) e que fermentam ácidos orgânicos, principalmente o ácido
lático (C. tyrobutyricum) (Muck, 2010; McDonald et al., 1991). Já o C. perfringens é
uma exceção, pois possui as duas características.
Segundo Oude Elferink et al. (1999) uma silagem com típica atividade
clostridiana é caracterizada por altas concentrações de ácido butírico (>5 g/kg MS), alto
pH (> 5), baixos teores de MS e alto teor de amônia e amina.
29
O principal problema das silagens que sofreram fermentações clostrídicas é a
instabilidade aeróbia. O uso dessas silagens na ração pode diminuir o consumo de
matéria seca e comprometer a ecologia ruminal pelos compostos produzidos (Muck e
Pitt, 1993).
4.4 Bacilos
Esse grupo de microrganismos são aeróbios ou anaeróbios facultativos e assim
como os clostrídios também formam esporos. Alguns bacilos (anaeróbios facultativos)
podem fermentar açúcares e ácidos orgânicos no silo, porém, sua atividade nestas
condições é considerada de baixa importância.
O principal efeito desses microrganismos na silagem está relacionado ao avanço
na deterioração aeróbia da silagem. Segundo Muck (2010) depois da atuação de
leveduras e bactérias ácido acético que elevam o pH e temperatura para valores >4,5 e ±
40ºC, respectivamente, uma segunda onda de aquecimento ocorre, aumentando as
temperaturas para >50ºC, sob responsabilidade dos bacilos.
4.5 Leveduras
As leveduras são aeróbias e anaeróbias facultativas. Sua presença independente
da situação (aerobiose ou anaerobiose) é indesejável. Na ausência do oxigênio e com
carboidrato solúvel remanescente, elas fermentam açúcares a etanol e CO2 (Oude
Elferink et al., 1999). Isso ocorre, pois em pH menor que 4,0 a atividade de muitas BAL
são inibidas, mas as leveduras continuam ativas.
Já na presença de oxigênio, durante o armazenamento ou na descarga da
silagem, esse grupo de microrganismos são um dos primeiros a se desenvolver. Isso
ocorre, pois as leveduras são capazes de crescer em pH baixos (3,5). Fungos também
30
são capazes de se desenvolver nestas condições, contudo devido a menor taxa de
crescimento há um predomínio da população de leveduras (Muck 2010). Nessas
condições de aerobiose, essas espécies de leveduras utilizam como substrato o ácido
lático, promovendo um aumento do pH o que favorece o desenvolvimento de outros
microrganismos deterioradores.
As leveduras, por crescerem na presença do oxigênio, são consideradas um dos
principais grupos envolvidos na instabilidade aeróbia, e são divididos em dois grupos de
acordo com o local em que crescem: a) sedimentares: que crescem na base do silo e
fermentam açúcares, mas não decompõe ácido lático e; b) película: que crescem no topo
do silo e degradam principalmente ácido lático (Woolford, 1984).
4.6 Fungos
Fungos são microrganismos eucariotos, estritamente aeróbios. A presença destes
microrganismos na silagem é facilmente detectada pela presença de grandes estruturas
filamentosas e esporos coloridos (Oude Elferink et al. 1999). Embora eles cresçam em
vários compostos, a presença de fungos filamentosos raramente são aparentes e quando
detectável sua polução na maioria das vezes não é suficiente para causar grandes
alterações na qualidade da silagem (Muck, 2010).
Os fungos presentes na deterioração da silagem são representados por muitos
gêneros como Monascus, Geotrichum, Bissochlamys, Mucor, Monilia, Aspergillus,
Penicillum e Fusarium (McDonald et al, 1991). Contudo, em comparação com outros
microrganismos, estes são o de crescimento mais lento (Muck, 2010).
A principal preocupação com os fungos é a produção de micotoxinas, que
geralmente ocorre quando os fungos são submetidos a situações de estresse ambiental.
Segundo Woolford (1990) os principais fatores que estimulam a produção de
31
micotoxinas são estágio de desenvolvimento da cultura, tipo de solo e principalmente a
presença de oxigênio no silo. Entretanto, para a preservação da cultura no silo a
produção de micotoxinas não é um problema sério, mas o motivo de maior preocupação
é em relação à saúde dos animais.
As micotoxinas de maior impacto na nutrição animal são produzidas por fungos
dos gêneros Aspergillus, Penicillum e Fusarium e seus problemas na saúde podem
variar de distúrbios digestivos, problemas com fertilidade, redução da função
imonológica (Oude Elferink et al., 1999) e contaminação de produtos de origem animal,
como o leite.
4.7 Bactérias Ácido Acético
As bactérias ácido acético, pertencentes principalmente ao gênero Acetobacter,
são aeróbias obrigatórias e ácido-tolerante, crescendo em baixo valores de pH. O
principal produto gerado no processo de fermentação é o ácido acético a partir do
etanol. Uma vez que o etanol tenha sido esgotado ou não esteja presente no material
ensilado, esse grupo de microrganismo pode crescer em ácido acético, produzindo CO2
e água, isto irá aumentar o pH e permitir que outras bactérias aeróbias cresçam (Oude
Elferink et al., 1999; Muck, 2010).
Devido a essas características, esse tipo de microrganismo é considerado
iniciador da deterioração aeróbica, principalmente em silagens de milho, que apresenta
baixa capacidade de tamponamento e altas concentrações de açúcares o que permite a
produção de elevadas concentrações de etanol (Muck, 2010).
32
5. Uso de inoculante microbianos
Os inoculantes microbianos são os aditivos mais comuns utilizados em silagens.
Estes contêm bactérias ácido lático para suplementar esta mesma categoria encontrada
no material de origem e sua finalidade é produzir ácido lático que permita a rápida
queda de pH, com eficiente fermentação do material ensilado (Weinberg e Muck, 1996).
Apesar deste tipo de aditivo ser adotado em todo o mundo, a sua eficiência
depende da quantidade e da qualidade da bactéria adicionada à cultura a ser ensilada, da
presença de substrato adequado, da capacidade de tamponamento e principalmente da
população epífita da forragem (Zopollatto et al., 2009; Vilela, 1998).
Os inoculantes microbianos empregados como aditivos são constituídos por
bactérias homofermentativas, heterofermentativas, a combinação destas e em alguns a
presenças de enzimas celulolíticas ou proteolíticas. De acordo com Muck (2010), o
principal tipo de inoculante microbiano empregado em silagens há décadas é formado
por uma ou mais espécies homofermentativas, como L. plantarum, L. casei,
Enterococcus faecium, Pediococcus ssp., entre outros. Estas cepas são mais empregadas
por apresentar rápido crescimento e dominação da fermentação na silagem em ampla
condição de umidade e temperatura (Muck e Kung Jr, 1997).
Philip e Fellner (1992) realizaram um experimento para determinar o efeito da
inoculação bacteriana sobre a qualidade da fermentação e estabilidade aeróbia da
silagem de espiga de milho com umidade de 35% na MS. Os tratamentos consistiram de
silagem inoculada ou não com L. plantarum, Bacillus subtilis, Serratia rubidaea,
Streptococcus thermophilus, e as associações destes inoculantes. Os autores concluíram
que as silagens com aditivos em associação tiveram os maiores valores de ácido lático
em relação as silagem com inoculante individual e que o teor de ácido lático destas não
33
foi diferente do tratamento controle (sem inoculante). Entretanto, a silagem inoculada
com L. plantarum foi a única que apresentou o menor valor de pH (3,87).
Silva et al. (2010) ao avaliarem a influência do inoculante microbiano (L. casei e
Streptococcus faecalis) e o complexo enzimático (α-galactosidase e β-mananase) sobre
a microbiota e qualidade nutricional da silagem de grão úmido de milho (47% de
umidade), observaram que a silagem inoculada em associação ao complexo enzimático
apresentou maior quantidade de Bacillus (18 UFC/g amostra) do que a silagem controle
(sem aditivo) e as silagens com inoculante ou complexo enzimático apenas. Porém, o
inoculante e o complexo enzimático, individualmente ou em associação, não tiveram
efeito sobre o pH da silagem.
Morais et al. (2012) também não observaram efeito significativo na silagem de
grão úmido de milho (34,21% de umidade) não inoculada ou inoculada com inoculante
microbiano composto de L. plantarum (mesófilo e termófilo), Pediococcus acidófilo e
Propionibacterium acidófilo para os teores de N-NH3 (1,20 e 1,18 % N-total), perdas de
MS (1,18 e 1,19 % MS) e pH (3,91 e 3,91), respectivamente para a silagem não
inoculada e inoculada.
Atualmente, com o avanço nas técnicas de fermentação, de liofilização e
encapsulamento de cepas selecionadas tem surgido no mercado novos produtos
comerciais como os inoculante heterofermentativos, que incluem as espécies L.
burchneri, P. cereviseae, Propionibacterium shermani e P. acidipropionici que
reduzem os efeitos negativos da fermentação homolática (Kung Jr., 2009), uma vez que
o ácido lático é utilizado como substrato na deterioração aeróbia (Muck e Kung Jr.,
1997). Além disso, busca-se por microrganismos que consigam minimizar a
instabilidade das silagens na fase de desabastecimento, visto que as perdas são
pronunciadas nessa fase do processo fermentativo (Oliveira et al., 2011).
34
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41
CAPÍTULO 1
SILAGEM DE GRÃO DE MILHO TRITURADO E REIDRATADO
CONTENDO GLICERINA BRUTA E INOCULANTE MICROBIANO
RESUMO - Avaliou-se o efeito de inoculante microbiano e de diferentes níveis de
glicerina bruta sobre a composição química, perfil fermentativo e população microbiana
de silagens de grão de milho triturado e reidratado. O grão seco de milho foi moído a 5
mm e, reidratado com água e glicerina bruta em diferentes níveis para manter o teor de
umidade em 32,5%, conferindo a adição de 0; 7,5; 15,0 e 22,5% de glicerina bruta (na
matéria natural). O material foi ensilado em silos experimentais de PVC (0,1 m de
diâmetro e 0,35 m de comprimento), providos de válvulas do tipo “Bunsen”. Os
períodos de fermentação foram: 4, 8, 16, 32 e 64 dias. O experimento foi conduzido em
esquema fatorial (2x4x5) segundo o delineamento inteiramente casualizado com três
repetições por tratamento. A inclusão de glicerina bruta na silagem de grão de milho
seco reidratado promoveu reduções lineares nos teores de PB (g/kg MS) e reposta
quadrática nos teores de CS (g/kg MS). Contudo, aumentaram as perdas por efluente e
matéria seca total (g/kg MS) e reduziram as perdas por gás (g/kg MS). Os valores de pH
aumentaram linearmente com a inclusão de glicerina bruta, mas não influenciaram os
teores de N-NH3 (% NT). As populações microbianas reduziram com o incremento nos
níveis de glicerina bruta. Independente do uso do inoculante microbiano, o aumento no
nível de inclusão de glicerina bruta, nas silagens de milho grão seco reidratado
aumentam as perdas e o pH no processo de ensilagem, reduz a população de bactérias
ácido lático e promove poucas alterações sobre a composição química da mesma.
Palavras-chave: aditivo, água, concentrado, conservação, ensilagem
42
GRINDED AND REHYDRATED CORN GRAIN SILAGE CONTAINING
CRUDE GLYCERIN AND MICROBIAL INOCULATE
ABSTRACT - The objective was to evaluate the effect of the use microbial inoculation
and different inclusion levels of water and crude glycerin on the chemical composition,
dynamics and microbial fermentation of grinded and rehydrated corn grain silage. After
disintegration in mill with sieves of 5 mm, the dry corn grain was rehydrated with water
and crude glycerin different levels to keep the moisture content of 22.5%, giving the
addition of 0, 7.5, 15.0 and 32.5% crude glycerin (natural matter). The material was
ensiled into PVC silos (0.1 m diameter and 0.35 of length), containing "Bunsen" valves.
The opening times were: 4, 8, 16, 32, 64 days. The experiment was conducted factorial
(2x4x5) in a completely randomized design with three replicates for each treatment,
totaling 120 experimental silos. The inclusion of crude glycerin of on reconstituted dry
corn grain silage, with and without inoculant promoted linear increments in of CP, EE
and SC content (g/kg DM). However, increased the effluent losses and total dry matter
losses (g/kg DM) and decreased gas losses (g/kg DM). The pH values linearly increased
with the inclusion of crude glycerin, but did not influence the levels of NH3-N (% TN).
Microbial populations decreased with the increase in levels of crude glycerin.
Regardless of the use of microbial inoculant, the increase in the inclusion of crude
glycerin grinded and rehydrated dry corn grain silage increases losses and pH in the
ensiling process, reduces the population of lactic acid bacteria and promotes few
changes on the chemical composition of this.
Keywords: additive, concentrated, conservation, ensilage, water
43
1. INTRODUÇÃO
O Brasil devido à vasta extensão territorial com grandes quantidades de terras
agricultáveis e diversidade climática ocupa a terceira posição no ranking mundial de
produção de grãos (USDA, 2013). O milho é o segundo cereal mais cultivado no país,
com estimativa de produção nacional para a safra 2013/2014 de 78,78 milhões de
toneladas (CONAB, 2013).
Dentre os estados do Brasil, o Mato Grosso é um dos estados de maior
participação no cenário agrícola nacional e chama a atenção para as possibilidades de
uso de ingredientes alternativos na alimentação animal, como os co-produtos do
biodiesel, em especial a glicerina bruta. Contudo, este estado enfrenta problemas com
armazenamento da produção de grãos, em especial a de milho safrinha, que tem
apresentado crescimento linear nos últimos anos. Diante disso, boa parte da safra que é
colhida está sujeito às intempéries naturais por falta de armazéns (FERREIRA, 2013;
SODRÉ, 2013).
Como grande parte do milho produzido no Brasil destina-se à alimentação animal,
uma das alternativas para minimizar o problema da dificuldade de armazenamento no
período da safra seria a utilização do processo de ensilagem, após triturar e reidratar o
material até o teor adequado de umidade para este método de conservação. Porém,
infelizmente observa-se que a literatura é escassa de estudos desenvolvidos para avaliar
a ensilabilidade do grão de milho triturado e reidratado.
Devido à escassez de informações a respeito da silagem do grão de milho
triturado e reidratado, surge a oportunidade também de se avaliar o efeito de aditivos
microbiológicos sobre este material. De acordo com Kung Jr. et al. (2003), objetiva-se
com uso desse aditivos, dentre outros, inibir o crescimento de microrganismos
indesejáveis, como enterobactérias, Clostrídios, leveduras, Listeria, bacilos, etc...;
acrescentar microrganismos benéficos para controlar a fermentação e, com isso, formar
produtos finais que não inibam o consumo e a produção do animal, além de contribuir
para melhorar a recuperação de matéria seca do material conservado.
Entretanto, o uso destes aditivos pode ser desnecessário se não houver carboidrato
solúvel suficiente para estes microrganismos. Nesse contexto, espera-se que a utilização
de glicerina bruta no processo de ensilagem de milho grão triturado e reidratado possa
contribuir para potencializar o processo fermentativo e, por consequência, produzir
alimento de qualidade com menores perdas, pois o glicerol, principal constituinte da
glicerina bruta, pode ser utilizado como fonte de carbono para a fermentação anaeróbia
44
pelos microrganismos na silagem (SOUSA FILHO et al., 2012). Porém, praticamente
não há informações na literatura a respeito do uso de glicerina no processo de
ensilagem, principalmente do material que se está propondo.
Diante do exposto, objetivou-se com este estudo avaliar o efeito da inclusão de
diferentes níveis de glicerina, com ou sem inoculante microbiano, sobre as populações
microbianas, composição química e perfil fermentativo de silagens de grão de milho
triturado grosseiramente e reidratado.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no Laboratório de Nutrição Animal e Forragicultura
do Instituto de Ciências Agrárias e Ambientais da Universidade Federal de Mato
Grosso, no município de Sinop, Mato Grosso, entre os meses de julho de 2013 a Janeiro
de 2014.
O grão de milho seco, foi grosseiramente desintegrado em moinho adaptado com
peneiras de crivo de 5 mm. Antes da ensilagem, o milho moído foi submetido aos
diferentes tratamentos: com e sem inoculante microbiano, reidratado com água e
glicerina bruta (g/kg de matéria natural) na proporção de: 125 e 0; 125 e 75; 125 e 150;
125 e 225, respectivamente, de forma a manter constante o teor de umidade de 32,5%
em todos os tratamentos, conferindo níveis de inclusão de glicerina de 0; 7,5; 15,0 e
22,5% na Matéria Natural (MN). O inoculante microbiano utilizado foi o KERA-SIL
Grão úmido (Kera Nutrição Animal) composto de Lactobacillus plantarum KN3500
(30x109 UFC/g), Propionibacterium acidipropionici KN7300 (20x10
9 UFC/g) e lactose
P.A e a glicerina bruta, cuja composição é apresentada na Tabela 7.
Tabela 7. Composição química da glicerina bruta.
Parâmetro Resultado Valores máximos especificados
Teor de água 79,85 g/kg MAX.:100 g/kg
Massa específica a 20ºC 1290 kg/m³ MIN.: 1290 kg/m³
Teor de glicerol 82,00% (m/m) MIN.: 80,00% (m/m)
pH 6,00 4,5 – 8,0
Metanol 0,52% (m/m) MAX.: 1,00% (m/m)
Mineral 70,34 g/kg MS
45
As silagens foram confeccionadas em silos de PVC, com 0,1 m de diâmetro e 0,35
m de altura, com um volume de 2,75 x 10-3
m3, providos de válvulas do tipo “Bunsen”
para permitir o livre escape dos gases da fermentação.
Os silos experimentais foram mantidos em área coberta, à temperatura ambiente, e
abertos em diferentes períodos (4, 8, 16, 32 e 64 dias) após o fechamento dos mesmos.
Foi utilizado o esquema fatorial (2x4x5), no delineamento inteiramente casualizado
(DIC) com três repetições por tratamento, sendo os mesmos constituídos por: adição ou
não de inoculante bacteriano, quatro níveis de glicerina bruta (0; 7,5; 15,0 e 22,5% da
MN) e cinco períodos de fermentação (4; 8; 16; 32 e 64 dias).
As perdas por efluente, gases e matéria seca total foram quantificadas segundo
equações propostas por Jobim et al. (2007). A medição da produção de efluente foi
realizada por meio da diferença de pesagens do conjunto silo e saquinho de TNT com
areia, antes e depois da ensilagem, em relação à quantidade de matéria natural de
amostra ensilada (MNens). Após ser retirado todo o material do silo experimental, foi
pesado o conjunto (silo + tampa + TNT com areia úmida + tela) e, subtraindo-se deste o
peso do mesmo conjunto antes da ensilagem, efetuando-se a estimativa da produção de
efluente drenado para o fundo do silo, conforme a equação:
Pefluente (% da MNens) = (PCabert – PCens)/ (MNens) x 100
Onde:
P efluente= perda por efluente (% da MN ensilada);
PC abert = peso do conjunto (silo + tampa + TNT com areia úmida + tela) na abertura;
PC ens = peso do conjunto (silo + tampa + TNT com areia seca + tela) na ensilagem;
MVA ens = massa verde de amostra na ensilagem
A perda de MS decorrente da produção de gases foi determinada pela diferença
entre o peso bruto de MS na ensilagem (MSens) e na abertura (MSabert), em relação à
quantidade de MS ensilada (MSens), descontando-se do peso total do conjunto ensilado
(PTCens – amostra + silo + tampa + TNT com areia seca + tela) o peso do conjunto na
ensilagem (PCens) e na abertura (PCabert), conforme a equação:
Pgases = [(PTCens - PCens)xMSens]-[(PTCabert - PCens)xMSabert]/[(PTCens - PCens)xMSens] x100
Onde:
Pgases= perda de gás calculado em função da matéria seca ensilada (%);
46
PTCens = peso total do conjunto na ensilagem (amostra + silo + tampa + TNT com areia
seca + tela);
PTCabert = peso total do conjunto na abertura (amostra + silo + tampa + TNT com úmida
seca + tela);
PCens = peso do conjunto na ensilagem (silo + tampa + TNT com areia seca + tela);
MSens = % de matéria seca da amostra na ensilagem;
MSabert = % de matéria seca da amostra na abertura;
A perda de MS total foi determinada pela diferença entre o peso bruto de MS na
ensilagem (MSens) e na abertura (MSabert), em relação à quantidade de MS ensilada,
conforme a equação:
PMST = [(PTCens - PCens)xMSens]-[(PTCabert – PCabert)xMSabert]/[(PTCens – PCens)xMSens] x100
Onde:
PMST= perda total de matéria seca em função da matéria seca ensilada (%);
PTCens = peso total do conjunto na ensilagem (amostra + silo + tampa + TNT com areia
seca + tela);
PTCabert = peso total do conjunto na abertura (amostra + silo + tampa + TNT com areia
úmida seca + tela);
PCens = peso do conjunto na ensilagem (silo + tampa + TNT com areia seca + tela);
PCabert = peso do conjunto na abertura (silo + tampa + TNT com areia úmida + tela);
MSens = % de matéria seca da amostra na ensilagem;
MSabert = % de matéria seca da amostra na abertura;
Antes da ensilagem e em cada período de abertura foram coletados
aproximadamente 500 g de amostra de silagem destinadas à análise da composição
química. Estas amostras foram pré-secas em estufa com ventilação forçada de ar a 55ºC
e posteriormente moídas em moinho de facas com peneira de porosidade de 1 mm de
diâmetro. As análises de matéria seca (MS) foram determinadas pelo método nº 934.01
(AOAC, 1990), a matéria mineral (MM) de acordo com a método nº. 924.05 (AOAC,
1990), a proteína bruta (PB) obtida pela determinação do nitrogênio total, de acordo
com o método de micro Kjedahl, método nº 920.87 (AOAC, 1990), utilizando um fator
de conversão de 6,25, o extrato etéreo (EE) determinado gravimetricamente após
extração com éter de petróleo, num aparelho de Soxhlet, método nº 920.85 (AOAC,
1990). Os carboidratos totais (CHOT) das amostras foram calculados segundo metódo
47
descrito por Sniffen et al. (1992), em que CHOT(%) = 100 - (%PB + %EE + %Cinzas).
A quantificação dos carboidratos não fibrosos (CNF) foi feita de acordo com a equação
adaptada por Hall (2000). As determinações de carboidratos solúveis (CS) foram
realizadas por meio de espectrofotometria utilizando o espectrofotômetro Bioespectro
SP-220 com leitura em 490 nm conforme técnica descrita por Johnson et al. (1966).
O pH e a acidez titulável (AT) foram determinados segundo técnica descrita por
Silva e Queiroz (2002) e o poder tampão (PT) segundo método proposto por Playne e
McDonald (1966) utilizando um potenciômetro de mesa. A partir do teor de matéria
seca, do poder tampão e do teor de carboidratos solúveis das amostras de forragem
fresca, foi calculada a capacidade de fermentação, segundo equação proposta por
Weissbach & Honig (1996), citados por Oude Elferink et al. (2000).
A avaliação do N-NH3 foi realizada pelo método proposto por Chaney e Marbach
(1962) em amostra de silagem diluída em água e ácido tricloroacético (10%) utilizando
um espectrofotômetro (Bioespectro SP-220) com leitura no comprimento de onda de
625 nm.
Para a enumeração dos microrganismos da silagem foi utilizada a técnica proposta
por Cherney e Cherney (2003). A quantificação de BAL foi realizada por meio do
plaqueamento em MRS Agar (Fluka Anylitcal) sendo as placas incubadas a 35ºC por
72h. O número de enterobactérias foi determinado pelo plaqueamento em Violet Red
Bile Glucose Agar (Fluka Anylitcal), incubadas a 35ºC, por 48h. Fungos e Leveduras
foram determinados por meio do plaqueamento em Potato Dextrose Agar (Acumedia),
acidificado com ácido tartárico 10% (p/v), após a autoclavagem. Estas placas foram
incubadas a 25ºC pelo tempo de 5 dias.
Em uma amostra de 25 g de silagem foram adicionados 225 mL de solução
ringer’s e homogeneizadas em liquidificador industrial por 1 minuto, obtendo-se a
diluição 10-1
. Em seguida, diluições sucessivas foram realizadas, objetivando-se obter
diluições variando de 10-1
a 10-7
e o cultivo foi realizado em placas de Pétri estéreis. Foi
adotado o plaqueamento em pour-plate e foram consideradas passíveis de contagem, as
placas com valores entre 30 e 300 unidades formadoras de colônias (UFC).
Todas as variáveis foram submetidas à análise de variância e de regressão (PROC
REG – SAS), considerando o seguinte modelo estatístico:
Yijk = µ + Ii + Gj + Ii*Gj + Pk + Ii*Pk + Gj2 + Ii*Gj
2 + Pk
2 + Ii*Pk
2 + Gj*Pk + eijk.
Onde:
48
Yijk = resposta observada no tempo k, do nível de glicerina j, submetido ao
inoculante i; µ = média geral observada; Ii = efeito do inoculante i, i = (Sem; Com); Gj e
Gj2
= efeito do nível de glicerina j, j = (0; 7,5; 15,0 e 22,5); Pk e Pk2
= efeito do período
de fermentação (4; 8; 16; 32; 64); Ii*Gj e Ii*Gj2 = efeitos da interação entre inoculante e
nível de glicerina; Ii*Tk e Ii*Tk2
= efeitos da interação entre inoculante e período de
fermentação; Gj*Pk = efeitos da interação entre nível de glicerina e período de
fermentação e eijk = erro aleatório associado a cada observação.
O efeito de inoculante foi considerado como variável “dummy” e para as variáveis
repostas onde o mesmo não foi significativo, foi construído o modelo de superfície de
resposta considerando apenas o nível de glicerina e o período de fermentação. Caso
contrário foi construído um modelo de superfície de resposta para a variável em cada
um dos níveis de inoculante (PROC RSREG – SAS). Para todos os modelos avaliados
foi considerado um nível de significância de 0,05 para o erro tipo I.
3. RESULTADOS
Na Tabela 8 podem ser observados os valores médios da composição química do
grão de milho reidratado com diferentes níveis de inclusão de glicerina bruta.
Tabela 8. Teores médios de matéria seca (MS), matéria mineral (MM), proteína bruta
(PB), extrato etéreo (EE), carboidrato total (CHOT), carboidrato não fibroso (CNF),
carboidrato solúvel (CS) e nutrientes digestíveis totais (NDT) do grão de milho
reidratado com diferentes níveis de inclusão de glicerina bruta (GB), antes da
ensilagem.
Níveis de GB
(% da MN) MS¹ MM² PB² EE² CHOT² CNF² CS²
0 669,73 14,77 91,54 71,16 822,52 652,52 230,5
7,5 693,24 21,95 78,02 69,06 830,96 705,23 198
15 687,79 28,2 74,68 57,72 839,39 715,76 176,5
22,5 695,75 32,73 65,74 46,03 855,49 762,12 211,5
¹g/kg; ²g/kg de MS
Houve um aumento nos teores de MM do grão de milho reidratado com o
incremento nos níveis de glicerina bruta devido ao alto teor de mineral, 70,34 g/kg MS,
49
deste composto, o que aumentou proporcionalmente o teor de mineral nos tratamentos
com maior nível de inclusão de glicerina bruta. Entretanto, os valores de PB reduziram
com o incremento nos níveis de glicerina bruta, provavelmente por efeito de diluição.
Constata-se também redução nos teores de EE do grão de milho reidratado com o
incremento nos níveis de glicerina bruta, porém os teores de CHOT e CNF aumentaram
com a inclusão de glicerina bruta.
Na Tabela 9 são apresentados os valores médios para as populações de
microrganismos, o poder tampão (PT) e o coeficiente de fermentação (CF) do grão de
milho reidratado com diferentes níveis de inclusão de glicerina bruta.
Tabela 9. Populações médias bactérias ácido lático (BAL), enterobactérias (ENT),
fungos e leveduras (MOFO), poder tampão (PT) e coeficiente de fermentação (CF) do
grão de milho triturado e reidratado com diferentes níveis de inclusão de glicerina bruta
(GB), antes da ensilagem.
Níveis de GB
(% da MN) BAL¹ ENT¹ MOFO¹ PT
2 CF
0 5,3 6,06 5,58 3,55 118,95
7,5 5,24 5,23 4,17 4,2 107,21
15 5,59 3,85 3,92 4,15 102,80
22,5 6,23 4,96 3,62 4,05 111,35
¹Log UFC/g silagem; 2 e.mg HCl/100 g MS;
A população de BAL variou de 5,3 a 6,23 para o grão de milho com diferentes
níveis de glicerina bruta, sem grandes alterações nessas populações. Contudo, as
populações de ENT e MOFO reduziram com o incremento nos níveis de glicerina bruta.
O CF calculado para estas silagens são superiores aos valores indicados por
Weissbach & Honig (1996), citados por Oude Elferink et al. (2000). Segundo estes
autores, materiais ensilados com baixo teor de MS ou teores insuficientes de
carboidratos solúveis apresentam baixo CF (<35) o que pode acarretar fermentações
inadequadas com a produção de uma silagem de baixo valor nutricional.
Os teores de MS não apresentaram equação ajustada para o modelo de superfície
de resposta, mas apresentou um teor médio de 686,63% de MS (Tabela 8).
50
Com relação às variáveis da composição química, somente a MM foi influenciada
pelo inoculante microbiano. Os teores desta variável foram explicados pelos modelos de
superfície de resposta, com valores mínimos de 12,29 e 12,46 g/kg MS, sem e com
inoculante, respectivamente, em 0% de glicerina bruta (Tabela 10).
Tabela 10. Estimativa dos parâmetros dos modelos de superfície de resposta em função
da glicerina bruta (GB - % MN) e períodos de fermentação (PF - Dias) para matéria
seca (MS), matéria mineral (MM), proteína bruta (PB), extrato etéreo (EE), carboidrato
total (CHOT), carboidrato não fibroso (CNF) e carboidrato solúvel (CS) da silagem de
grão de milho reidratado.
+Sem inoculante; ++Com inoculante; ¹g/kg de MS; ²% da MN; ³Dias; *Significativo a
5% de probabilidade pelo teste F.
Os teores de PB apresentaram ponto de mínimo segundo o modelo de superfície
de resposta, apresentando o valor mínimo de 64,77 g/kg MS com a inclusão de 22,5%
de glicerina bruta e no período de fermentação de 64 dias. As reduções nos teores de PB
ocorreram por efeito de diluição devido à ausência desse composto na constituição da
glicerina bruta. Mesmo comportamento foi observado para o teor de EE, o qual
Parâmetros MM¹+ MM¹++ PB¹ EE¹ CHOT¹ CNF¹ CS¹
Intercepto 16,77* 14,02* 91,75* 80,15* 813,31* 654,37* 205,53*
GB 0,69* 0,86* -1,91* -1,34* 2,40* 4,57* -11,44*
PF -0,238 -0,079 -0,06 -0,66 0,85* 1,16* -1,63
GB² 0,0052 0,0025 0,051* 0,011 -0,063* -0,039 0,511*
PF² 0,0032 0,0010 0,0012 0,0081 -0,011* -0,014* 0,015
GBxPF -0,0019 -0,0012 -0,007 -0,0009 0,0095 0,011 -0,035
Mínimo GB² 0 0 22,5 22,5 11,2
PF³ 38,66 39,5 64 42,37 64
Máximo GB² 22,5 22,5
PF³ 47,85 12,95
Sela GB²
PF³
Valor da Variável 12,29 12,46 64,77 41,08 860,36 753,35 73,50
P modelo <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001
R² 0,96 0,95 0,88 0,82 0,77 0,91 0,42
51
apresentou valor mínimo estimado de 41,08 g/kg MS no nível de glicerina de 22,5% e
no período de fermentação de 42,37 dias. As reduções nos teores de EE não eram
esperadas, pois a glicerina bruta apresenta em sua composição um teor médio de
lipídeos totais de 7,8%, como descrito por Oliveira et al. (2013). Contudo, na análise do
EE de materiais como o milho, podem ocorrer perdas de pigmentos, como caroteno, que
são extraídos com éter e superestimam os valores de gordura, como ocorrido para o
tratamento com 0% de glicerina (BERGAMASCHINE et al., 2006).
No entanto, os valores de CHOT e CNF apresentaram ponto de máximo com a
inclusão de glicerina bruta e ao longo do período de fermentação. Os valores máximos
de 860,36 e 753,35 g/kg de MS para CHOT e CNF, respectivamente, foram estimados
com a inclusão de 22,5% de glicerina bruta, e aos 47,85 dias para CHOT. Os aumentos
nestes teores refletem os efeitos negativos sobre os teores de PB e EE, uma vez que os
mesmos são obtidos por diferença.
Os teores de CS também apresentaram ponto de mínima de acordo com o modelo
de superfície de resposta, apresentando valor mínimo de 73,5 g/kg MS com a adição de
11,2% de glicerina bruta e no período de fermentação de 64 dias. Alterações nos teores
de CS estão relacionadas à utilização destes carboidratos pelas bactérias do processo de
fermentação, como substrato para seu crescimento levando a síntese de ácido lático
(MUCK, 2010). Outro fator que contribuiu para a redução nos teores de CS são as
perdas por efluente que carreiam para fora do silo substâncias altamente digestíveis,
como estes carboidratos. Os valores de CS deste experimento são menores do que os
observados por Phillip & Fellner (1992) que obtiveram valores de 44 a 30 g/kg de MS
para silagem de grão úmido de milho (25% de umidade) com diferentes inoculantes
como Lactobacillus plantarum, Serratia rubidae, Streptococcus thermophilus e suas
combinações.
Todas as perdas analisadas neste experimento foram influenciadas pelo inoculante
microbiano e as variáveis com pontos de sela apresentam as equações ajustadas
correspondentes ao efeito que foi significativo (Tabela 11).
As PEFLT sem inoculante microbiano apresentaram ponto de sela segundo o
modelo de superfície de resposta, assim foi realizado o estudo dos parâmetros que se
apresentaram significativos neste modelo e o ajuste do modelo de regressão linear
simples foi realizado em função dos níveis de glicerina bruta, apresentando um aumento
de 2,44 g/kg de MS de perdas por efluente para cada 1% de inclusão de glicerina bruta.
Entretanto, as PEFLT com a adição de inoculante apresentaram ponto de mínimo
52
segundo o modelo de superfície de resposta ajustado (Figura 4), com o valor mínimo
estimado com a adição de 1,78% de glicerina bruta no período de fermentação de 21,5
dias. Valor este, muito próximo do nível zero de inclusão de glicerina.
Tabela 11. Estimativa dos parâmetros dos modelos de superfície de resposta em função
da glicerina bruta (GB - % MN) e períodos de fermentação (PF - Dias) para perda de
efluente (PEFLT), perda por gás (PGAS) e perda de matéria seca total (PMST) da
silagem de grão de milho reidratado.
Parâmetros PEFLT¹+ PEFLT¹++ PGAS¹+ PGAS¹++ PMST¹+ PMST¹++
Intercepto -4,30* -0,22* 9,76* 5,79* 2,15* 29,26*
GB 2,40* 0,75* -1,67* -0,76* 7,01* -2,37*
PF 0,12 -0,13 0,50 0,26 1,45 1,03
GB² 0,0070 0,073* -0,051* 0,020 -0,23* 0,24
PF² -0,0003 0,0026 -0,0046 -0,0016 -0,016 -0,016
GBxPF -0,0043 0,0011 -0,0070 -0,0009 -0,025 0,021
Mínimo GB² 1,78
PF³ 21,5
Máximo GB² 13,26
PF³ 34,20
Sela GB² 0 19,08 20,03 3,36
PF³ 42 40,02 62,50 34,96
Valor da Variável 0 0 3,87 6,48 73,40 43,32
P modelo <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,005 <0,0001
R² 0,88 0,93 0,61 0,49 0,27 0,48
Variável Níveis de GB (% MN)
Equação P-valor R² 0 7,5 15 22,5
PEFLT¹+ 1,34 8,73 43,70 51,04 Y= -1,914+2,441*G <0,0001 0,88
PGAS¹+ 16,98 5,18 1,97 1,22 Y= 17,958- 1,962*G+0,055*G² <0,0001 0,51
PGAS¹++
10,32 5,14 3,44 2,74 Y= 9,082-0,327*G 0,0002 0,22
PMST¹++
41,52 45,69 75,86 103,38 Y= 24,499+3,493*G <0,0001 0,37
+Sem inoculante; ++Com inoculante; ¹- g/kg de MS; ²- % da MN; ³- Dias; *-Significativo
a 5% de probabilidade pelo teste F.
53
Observa-se no modelo que o maior nível de glicerina bruta (22,5%) apresentou
PEFLT próximo a 55 g/kg MS para o tratamento inoculado, valor este muito próximo
ao valor de 51,04 g/kg de MS, obtido para o tratamento sem inoculante. Desta forma, a
inoculação não alterou os níveis máximos de perdas por efluente na ensilagem do milho
grão seco triturado e reidratado com água, nos diferentes níveis de inclusão de glicerina.
Basso et al. (2012) encontraram valores de perda por efluente variando de 4,19 a 5,45
g/kg MS para silagem de milho com 37,78% de umidade inoculada com diferentes
doses de Bacillus subtilis.
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Efl
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S)
Períod
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Fer
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(Dia
s)
Nível de Glicerina Bruta
(% da Matéria Natural)
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60
Figura 4. Superfície de resposta para efeito de perda de efluente da silagem de grão de
milho reidratado com inoculante com diferentes níveis de glicerina bruta e períodos de
fermentação.
O aumento das PEFLT, sem e com inoculante microbiano, com o incremento nos
níveis de glicerina bruta provavelmente ocorrem pela forma física como se apresenta a
glicerina bruta e ao alto teor de MS desse composto, o que facilita o carreamento da
umidade contida no milho acarretando em maiores PEFLT.
As PGAS apresentaram ponto de sela segundo os modelos de superfície de
resposta ajustados, assim foi realizado o estudo dos parâmetros que se apresentaram
significativos nestes modelos e o ajuste dos modelos de regressão quadrático e linear
simples foram realizados em função dos níveis de glicerina bruta, para os tratamentos
sem e com a adição de inoculante microbiano, respectivamente. Sem a adição de
54
inoculante microbiano foi obtido valor mínimo para a PGAS de 3,87 g/kg MS, o qual
ocorreu com a adição de 19,80% de glicerina bruta. Porém, as PGAS com a adição de
inoculante microbiano apresentaram comportamento linear decrescente em função dos
níveis de glicerina bruta, com valor mínimo de 2,74 g/Kg de MS para o nível de 22,50%
de glicerina bruta, muito próximo ao nível de 19,80 % de inclusão de glicerina sem a
adição de inoculante. Assim, de forma geral o nível de inclusão de glicerina reduziu a
PGAS na ensilagem de do milho grão seco triturado e reidratado com água, nos
diferentes níveis de inclusão de glicerina.
Os menores valores de glicerina bruta resultaram nas maiores PGAS, mas ainda
permaneceram dentro do limite considerado aceitável para silagens (1 a 2% das perdas
totais de energia), já que este tipo de perda é considerado inevitável durante o processo
de ensilagem (McDONALD et al., 1991). Os valores de PGAS deste experimento são
menores do que os verificados por Ribeiro et al. (2009) que encontraram valores de 6,3
e 3,6% para a silagem controle de capim marandu (25,4% umidade) e contendo L.
plantarum e Pediococcus acidilactici, respectivamente.
As PMST apresentaram ponto de sela e de máximo segundo os modelos de
superfície de resposta ajustados para os tratamentos com e sem a adição de inoculante
microbiano, respectivamente. Assim foi realizado o estudo dos parâmetros que se
apresentaram significativos para o tratamento com a adição de inoculante microbiano e
o modelo de regressão linear simples foi ajustado em função dos níveis de glicerina. Os
valores de PMST apresentaram ponto de máximo para o tratamento sem a adição de
inoculante, com valor máximo de 73,40 g/kg MS estimado com a adição de 13,26% de
glicerina bruta e 34,5 dias de fermentação (Figura 5).
Houve aumento linear nas PMST com a adição de inoculante microbiano em
função dos incrementos nos níveis de glicerina bruta. Com o maior valor 103,33 g/kg de
MS para a adição de 22,5% de glicerina bruta. Os aumentos nas PMST sem e com
inoculante são justificados pelas PEFLT e PGAS, uma vez que estas perdas influenciam
as PMST. Morais et al. (2012) verificaram valores de perdas de MS de 1,18 e 1,19% na
MS, para a silagem de grão úmido de milho (34,21% de umidade) não inoculada e
inoculada com inoculante microbiano composto de L. plantarum, Pediococcus acidófilo
e Propionibacterium acidófilo, respectivamente.
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(Dia
s)
Nível de Glicerina Bruta
(% da Matéria Natural)
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100
120
Figura 5. Superfície de resposta para efeito de perda de matéria seca da silagem de grão
de milho reidratado sem inoculante com diferentes níveis de glicerina bruta e períodos
de fermentação.
Observa-se na Tabela 12 que somente a variável N-NH3 foi influenciada pelo
inoculante. As demais variáveis do perfil fermentativo não foram influenciadas.
O pH apresentou ponto de sela segundo o modelo de superfície de resposta, assim
foi realizado o estudo dos parâmetros que se apresentaram significativos nestes modelos
e o ajuste do modelo de regressão linear simples foi realizado em função dos níveis de
glicerina bruta. Foi obtido um valor máximo 6,86 com a inclusão de 22,5% de glicerina
bruta o que provavelmente ocorreu devido ao elevado teor de pH da glicerina bruta
(Tabela 7), menor produção de ácidos, evidenciado pela acidez titulável (AT), e também
pelos maiores valores de poder tampão (PT) nas silagens com maiores teores de
glicerina bruta (Tabela 12). Os valores de pH deste experimento são inferiores ao valor
de 4,04 encontrado por Ítavo et al. (2010) para a silagem de capim-elefante (65% de
umidade) inoculada com L. plantarum e menores do que os observados por Lopes et al.
(2005) que verificaram valores de pH variando de 4,25 a 4,29 para silagens de grão de
milho (33% de umidade) submetidas a diferentes tratamentos de reconstituição.
Tabela 12. Estimativa dos parâmetros dos modelos de superfície de resposta em função
da glicerina bruta (GB - % MN) e períodos de fermentação (PF - Dias) para pH, acidez
56
titulável (AT), poder tampão (PT) e nitrogênio amoniacal (N-NH3) da silagem de grão
de milho reidratado.
Parâmetros pH AT¹ PT² N-NH33+ N-NH3
3++
Intercepto 5,93* 1,20* 7,58* 0,68* 3,66*
GB 0,05* -0,08* -0,47* 0,39 0,25
PF -0,07 0,19 0,29 0,23* 0,09*
GB² -0,0002 0,0023 0,014* -0,013 -0,011
PF² 0,0007 -0,0009 -0,0021 -0,0006 0,0007
GBxPF 0,0007 -0,0056 -0,0067 -0,0074 -0,0047
Mínimo GB
4
PF5
Máximo GB
4
PF5
Sela GB
4 22,5 22,5 22,5 22,5 11,32
PF5 4 7,5 15 4 4
Valor da Variável 6,86 1,03 6,14 2,79 5,06
P modelo <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001
R² 0,74 0,78 0,90 0,79 0,79
Variável Níveis de GB (% MN)
Equação P-valor R² 0 7,5 15 22,5
pH 5,13 5,16 6,08 6,10 Y= 4,919+0,061*G <0,0001 0,43
AT1 3,81 3,55 1,11 1,03 Y= 4,813-0,173*G <0,0001 0,33
PT2 10,69 8,19 6,16 6,14 Y= 12,635-0,667*G+0,014*G² <0,0001 0,61
Variável PF (dias) Equação P-valor R²
4 8 16 32 64
N-NH33+
2,15 3,95 4,84 5,79 9,01 Y= 2,798+0,098*PF <0,0001 0,46
N-NH33++
3,97 5,00 5,59 5,90 9,65 Y= 3,938+0,085*PF <0,0001 0,49
+Sem inoculante; ++Com inoculante; 1- Expresso em mL de NaOH 0,1N até atingir pH 7,0;
2-
e.mg HCl/100 g MS; 3- % do NT;
4- % da MN;
5- Dias.; *-Significativo a 5% de
probabilidade pelo teste F.
Os valores de AT também apresentaram ponto de sela segundo o modelo de
superfície de resposta, sendo realizado o estudo dos parâmetros que se apresentaram
significativos nestes modelos e o ajuste do modelo de regressão linear simples foi
57
realizado em função dos níveis de glicerina bruta. Observa-se que os valores de AT
reduziram linearmente com a inclusão de glicerina bruta com valor mínimo de 1,03 g/kg
de MS com a adição de 22,5% de glicerina bruta. As reduções na produção de ácidos
podem estar relacionadas com uma menor população de microrganismos com o
aumento da glicerina bruta.
Os valores de PT apresentaram ponto de sela segundo os modelos de superfície
de resposta ajustados, assim foi realizado o estudo dos parâmetros que se apresentaram
significativos nestes modelos e o ajuste dos modelos de regressão quadrático e linear
simples foram realizados em função dos níveis de glicerina bruta, com valor mínimo de
6,14 obtido com a adição de 22,5% de glicerina bruta. As reduções nos valores de PT
podem ser explicadas pela redução dos teores de N-NH3 (Tabela 12), considerado um
dos principais fatores que influenciam o PT, juntamente com aminoácidos livres e bases
inorgânicas como K e P (Van Soest, 1994). Contudo, os valores obtidos neste
experimento são menores do que os 25 e.mg/100g de MS da silagem do milho,
considerada como silagem padrão (McDONALD, 1981). Ítavo et al. (2006)
encontraram valores de PT de 22,52 e 22,67 e.mg/100 g MS para silagens de grão
úmido de milho (36% umidade) com e sem inoculante (L. plantarum), respectivamente.
E Silva et al. (2010) verificaram valores de PT variando de 42 a 44 e.mg/100 g MS para
silagens de grãos úmidos de milho (com 47% de umidade) com diferentes inoculantes
bacterianos.
Os teores de N-NH3 apresentaram ponto de sela segundo os modelos de superfície
de resposta ajustados, assim foi realizado o estudo dos parâmetros que se apresentaram
significativos nestes modelos e o ajuste dos modelos de regressão lineares foram
realizados em função dos períodos de fermentação, para os tratamentos sem e com a
adição de inoculante microbiano. Foram obtidos teores mínimos para os tratamentos
sem e com inoculante microbiano de 2,15 e 3,97 %NT, respectivamente, com 4 dias de
período de fermentação. Os aumentos nos teores de N-NH3 com em função dos períodos
de fermentação indicam que houve a atuação de proteases, que agem em meios cujo pH
é maior do que 5,0, como neste trabalho e acabam degradando a proteína com a
liberação de amônia. Verifica-se que a degradação foi mais intensa no tratamento com
22,5%, mas a degradação está abaixo do limite de 10% considerado adequado para
silagens (VAN SOEST, 1994). Os dados do nosso experimento diferem dos observados
por Rodrigues et al. (2004) que verificaram valores de N-NH3 variando de 4,01 a 4,29%
58
NT para a silagem de milho tratada com diferente inoculantes microbianos comerciais
após 106 dias de ensilagem.
As populações de microrganismos não foram influenciadas pelo inoculante
microbiano. Observa-se na Tabela 13 que a população de bactérias ácido lático (BAL)
apresentou ponto de sela segundo o modelo de superfície de resposta. Assim foi
realizado o estudo dos parâmetros que se apresentaram significativos neste modelo e o
ajuste do modelo de regressão linear simples foi realizado em função dos níveis de
glicerina bruta com valor mínimo estimado de 1,01 UFC/g silagem com a inclusão de
22,5% de glicerina bruta e com 64 dias de período de fermentação.
Tabela 13. Estimativa dos parâmetros dos modelos de superfície de resposta em função
da glicerina bruta (GB - % MN) e períodos de fermentação (PF - Dias) para bactérias
ácido lático (BAL), enterobactérias (ENT) e fungos e leveduras (MOFO) na silagem de
grão de milho reidratado.
Parâmetros BAL¹ ENT¹ MOFO¹
Intercepto 8,74* 8,06* 5,50*
GB -0,31* -0,22* -0,0005*
PF -0,06 -0,07 -0,0020
GB² 0,00005 0,0026 -0,0032*
PF² -0,0004 -0,0008 -0,0004
GBxPF 0,0023 0,0020 0,0018
Mínimo GB²
PF³
Máximo GB² 0
PF³ 4
Sela GB² 22,5 22,5
PF³ 64 4
Valor da Variável 1,01 3,34 5,5
P modelo <0,0001 <0,0001 <0,0001
R² 0,56 0,65 0,63
Variável Níveis de GB (% MN)
Equação P-valor R² 0 7,5 15 22,5
59
BAL1 6,24 5,99 2,60 1,10 Y= 6,829-0,249*G <0,0001 0,39
ENT1 4,99 4,94 3,36 3,34 Y= 5,357-0,107*G 0,0009 0,09
¹- Log UFC/g silagem; ²- % da MN; ³- Dias; *-Significativo a 5% de probabilidade pelo
teste F.
O efeito inibitório sobre a população de BAL ocorreram provavelmente pelo
aumento do pH com o incremento nos níveis de glicerina bruta (Tabela 12) ou pela
influência negativa de algum composto da glicerina bruta sobre seu desenvolvimento.
De acordo com Pahlow et al. (2003) as espécies de BAL requerem para o seu
crescimento estéres de ácido oleico. O’Leary (1962) afirma que bactérias gram-
positivas são mais sensíveis a todos os tipos de ácidos graxos do que bactérias gram-
negativas, mas os ácidos graxos de cadeia longa (C12 a C18), na sua forma cis, são
estimuladores do crescimento. Não há relatos sobre a composição de ácidos graxos
presentes na glicerina, mas talvez há a presença de algum que possa afetar o
desenvolvimento destas bactérias. Silva et al. (2010) ao avaliarem a influência do
inoculante microbiano (L. casei e Streptococcus faecalis) e o complexo enzimático (α-
galactosidase e β-mananase) sobre a microbiota da silagem de grão úmido de milho
(47% de umidade), observaram que a silagem inoculada apresentou quantidade de
bactérias totais (7,4 UFC/g amostra), valores superiores a este experimento.
Contudo, este efeito inibitório da glicerina bruta não é tão evidente para a
população de ENT que também apresentaram ponto de sela segundo o modelo de
superfície de resposta, sendo realizado o estudo dos parâmetros que se apresentaram
significativos neste modelo e o ajuste do modelo de regressão linear simples foi
realizado em função dos níveis de glicerina bruta, apresentando redução de 0,11 UFC/g
de silagem para cada 1% de inclusão de glicerina bruta. A redução nas populações de
ENT podem ser explicadas também pelo elevado teor de pH com o aumento da inclusão
de glicerina bruta.
Os valores observados neste experimento para ENT são superiores ao valor de
aproximadamente 5 log UFC/g encontrado por Santos et al. (2013) para a silagem de
milho inoculada com cepas de BAL após 60 dias de ensilagem e superior ao valor
aproximado de 3,3 log UFC/g encontrado por Penteado et al. (2007) para a silagem de
capim-mombaça inoculada com L. plantarum epifítico (106 UFC/g) após 28 dias de
ensilagem.
60
As populações de MOFO apresentaram ponto de máxima segundo o modelo de
superfície de resposta com valores máximos estimados de 5,5 UFC/g silagem sem a
adição de glicerina bruta e com 4 dias de fermentação. Uma justificativa para a redução
na população de MOFO é a competição com as BAL e ENT por carboidratos solúveis,
já que fungos e leveduras não são fortemente influenciados pelo pH.
Os resultados na literatura para a quantidade de fungos e leveduras variam muito
em função do material. Jobim et al (1999) avaliando a silagem de grão úmido (34,3%
umidade) após 65 dias de ensilagem, encontrou valores de 6,4 e 0,6 log UFC/g silagem
para leveduras e fungos, respectivamente. Esses valores são superiores ao encontrado
neste experimento. Já Hassanat et al. (2007) verificaram valores para leveduras e fungos
inferiores a 2 log UFC/g forragem na silagem de milheto (75% de umidade) inoculada
com inoculante comercial Pioneer (L. plantarum e Enterococcus faecium) após 45 dias
de ensilagem.
4. CONCLUSÕES
Independente do uso do inoculante microbiano, o aumento no nível de inclusão de
glicerina bruta nas silagens de milho grão seco reidratado aumentam as perdas e o pH
no processo de ensilagem, reduz a população de bactérias ácido lático e promove poucas
alterações sobre a composição química da mesma.
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